MX2010010867A

MX2010010867A - Composicion farmaceutica.

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Publication number: MX2010010867A
Application number: MX2010010867A
Authority: MX
Inventors: Paul Bingham; Zuzana Zachar; Lakmal W Boteju
Original assignee: Robert Shorr
Priority date: 2008-04-04
Filing date: 2008-04-04
Publication date: 2011-05-25
Also published as: EP2268278A1; IL208387A0; CA2720396A1; CN102056605A; KR20110025168A; BRPI0821894A2; EP2268278A4; WO2009123597A1; AU2008354009A1; JP2011516473A

Abstract

Un modulador farmacéuticamente aceptable de la regulación o perturbación de la estructura, expresión y/o actividad de al menos una enzina y/o complejo enzimático o subunidad del mismo, tal como a través del metabolismo modificado de la energía mitocondrial del complejo piruvato deshidrogenasa (PDH) de animales de sangre caliente, incluyendo humanos, y métodos para utilizar el miesmo, comprende una cantidad efectiva de al menos un derivado de ácido lipóico y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo para afecar el estado de fosforilación del complejo. Al incrementar la actividad de la PDH cinasa y/ó disminuir la actividad de la PDH fosfatasa, el modulador evita la desintoxicación anaeróbica de los metabolitos tóxicos glicolíticos a través de la inhibición de la actividad de la subunidad Ela del complejo PDH, obligando a la actividad de fosforilación oxidativa mitocondrial incrementada. Ya que las células caracterizadas por la hiperproliferación, tal como las células tumorales, no pueden generar acetil CoA ni NADH debido a la acción adicional del modulador para inhibir la acción de la subunidad E2 del complejo PDH, se pierde la polarización de la membrana mitocondrial, facilitando la muerte celular.

Description

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA Campo de la Invención Esta invención se refiere a composiciones terapéuticas y de diagnóstico y más particularmente a composiciones farmacéuticas y a métodos de uso de las mismas, que demuestran la absorción selectiva en células caracterizadas por la hiperproliferación, incluyendo células cancerosas, y las que modulan la regulación o la perturbación de la estructura, la expresión y/o la actividad de las enzimas, facilitando asi la detección y el tratamiento o la destrucción de estas células. Más específicamente, estos agentes se dirigen y perturban la actividad o regulación en las mismas, del metabolismo energético mitocondrial modificado observado en tales escenarios como el complejo piruvato deshidrogenasa (PDH) modificado, asociado con la mayoría de los cánceres.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las mitocondrias son los principales centros de control para la producción de energía y procesos de vida y muerte celular en las eucariotas. Aunque existen diversos mecanismos de comunicación con el resto de la célula, la fosforilación reversible es un medio importante para regular las funciones mitocondriales . (Pagliarini D.J. y Dixon J.E. (2006). Modulación Mitocondrial: ¿La Fosforilación Reversible Toma el Escenario Central? TENDENCIAS en Biochem.

SCI. 31:26-34, passim, incorporado en la presente mediante la referencia) el constantemente creciente número de cinasas, fosfatasas y fosfoproteinas mitocondriales reportadas sugiere que la fosforilación es probable que surja como un tema común en la regulación de procesos mitocondriales. Los cambios patológicos o genéticos asociados con la estructura, función y regulación de la actividad de la enzima mitocondrial contribuyen y pueden ser objetivos importantes para el tratamiento de enfermedades.

De acuerdo con su papel tanto como un punto de convergencia como regulador de las diversas funciones celulares, las mitocondrias tienen papeles cruciales en la apoptosis, la producción de especies reactivas al oxigeno (ROS) y numerosos procesos metabólicos, incluyendo la producción de más del 90% de ATP celular. Además, a medida que las células crecen y se dividen, tienen que hacerse nuevas mitocondrias, este proceso en si mismo requiere cuidadosa coordinación de la transcripción y traducción del ADN nuclear y mitocondrial. Finalmente, a medida que cambian las necesidades de energía de las células, las mitocondrias deben responder con rapidez ajusfando su salida de ATP. Por lo tanto, las mitocondrias requieren un complejo sistema de comunicación con las funciones celulares. Como es evidente a partir de la Figura 1, las moléculas de señal hacia y desde las mitocondrias incluyen iones, gases, metabolitos, hormonas, factores de transcripción y proteínas. Consecuentemente, el reconocimiento de las mitocondrias como centros de recepción, integración y transmisión de señales celulares es un avance importante en el diseño y experimentación de productos farmacéuticos.

La piedra angular en la señalización en la regulación mitocondrial es la fosforilación reversible. Sin embargo, aunque la primera demostración de un evento de proteína cinasa se reportó en 1954, y el hecho de que una función mitocondrial central puede regularse por la fosforilación reversible se descubrió hace casi cuatro décadas, informes de eventos de fosforilación mitocondrial son escasos. Esto es así a pesar del reconocimiento en la década de 1980 y 1990 de numerosas cascadas de fosforilación de transducción de señal que atraviesan la membrana plasmática y se extienden a través del citosol hacia el núcleo. Tal escasez de conocimientos puede deberse en parte al hecho de que la mayor parte de la maquinaria de las proteínas mitocondriales se encuentra detrás de dos bicapas de lípidos, las cuales aparentemente colocan las proteínas mitocondriales fuera del alcance de las cascadas de señalización citosólicas. En cualquier caso, no se ha aceptado ampliamente que la mitocondria regule la señalización por fosforilación reversible en una manera clave para el manejo de enfermedades. No obstante, como se observa en la Tabla 1, para el año 2006, más de 60 proteínas en todos los compartimentos mitocondriales (es decir, la matriz, la membrana interna, el espacio intermembrana y la membrana externa, incluyendo la superficie externa orientada al citoplasma) se habían identificado como fosfoproteínas implicadas en una amplio espectro de funciones mitocondriales. Adicionales datos de soporte demuestran la importancia de la fosforilación reversible de objetivos mitocondriales y el uso de composiciones dirigidas a los mismos para el tratamiento del cáncer.

Tabla 1. Fosfoproteinas Mitocondriales No. Proteína LocalizaSitio P Fuente Función Refs. ción 1 PDC E1 a M Ser Varios Formación acetil-CoA [11 ] 2 PDC ?1 ß M Tyr Esperma Formación acetil-CoA [81 humano 3 PDC E3 M Tyr Esperma de Regulación del PDC [8] hámster 4 PDK ¡soform 2b M Ser/Thr Rata TCA [27] 5 Aconitasa M ? Bobino/papa TCA [22] 6 NAD-isocitrato M 7 Bobino/papa TCA [22] deshidrogenase 7 NAD-malato M ? Papa TCA [22] deshidrogenasa 8 NAD-enzima mélica M ? Papa TCA [22] 9 Subunidad succinil M ? Rata/papa TCA [22,47] CoA-ligasa a 10 Subunidad succinil M ? Rata/papa TCA [22,47] CoA-ligasa ß Proteína LocalizaSitio P Fuente Función Refs. ción Formato M Ser/Thr Papa TCA [22,23] deshidrogenasa Aconitasa M Tyr Sinaptosomas TCA [8] de conejillo de Indias BCKAD M Ser Varios Metabolismo AA [31] BCKAD cinasab M Ser Rata Metabolismo AA [54] HSP22 M Ser Maíz Chaperona [39] HSP 90 M ? Papa Chaperona [22] Chaperonina 60- M ? Papa Chaperona [22] mthsp75 M Tyr Células de Chaperona [29] hepatoma de rata TRAP-1 M Tyr Esperma Chaperona [8] humano CYP2E1C M/I ? Ser COS Desintoxicación [43] CYP2B10 M/IM? Ser COS Desintoxicación [18] GSTA 4-4 M Ser/Thr COS Desintoxicación [44] DBP M ? Levadura Rotación de RNAm [38] MnSOD M ? Papa Defensa de estrés [22] oxidativo EF-Tu M Thr? Corazón de Síntesis de proteínas [32] conejo creatina cinasa M Bovino Sintesis de [45] fosfocreatina MTERF M Rata Terminación de la [42] transcripción Abf2p M Ser/Thr? Levadura mantenimiento DNAmt [26] MtTBP M ? Levadura mantenimiento DNAmt [50] NDK M/IMS Ser/His Pisum sativum equilibrio de [49] Nucleósido trifosfato Proteína LocalizaSitio P Fuente Función Refs. ción StAR IMS Ser COS-1 Síntesis de hormonas [19] esteroides Axmitoc M? Tyr Rata Regulación de PLAs? [53] SSATb M? Ser? Rata Acetilación de [21 ] espermidina Sab OM Ser Miocitos Dominio SH3-proteína [28] cardíacos de de unión rata CPT-I OM Ser Rata ß-?? [35] MtGAT0 OM Ser/Thr? Rata biosíntesis de [41 ] Glicerolípido BADC OM Ser FLS.12 células Apoptosis [30] Bcl-2 OM Ser Jurkat Apoptosis [17,52] BCI-XL OM Thr células U-937 Apoptosis [36] CREB M/IM Ser? Rata transcripción de [24] ADNmt? VDAC OM Tyr Sinaptosomas transporte [8,45] de conejillo de Indias Cl: ESSS IM Ser Bovino OXPHOS [25] Cl: 10kDa IM Ser Bovino OXPHOS [25] Cl: 42 kDa (2 sitios) IM Ser y Thr Bovino OXPHOS [45,55] Clll núcleo 1 IM Tyr Esperma OXPHOS [8] humano Clll núcleo II IM ? Bovino OXPHOS [45] CI I IM Tyr Bovino OXPHOS [37] CIV II IM Tyr Osteoclastos OXPHOS [40] CIV IIl" IM SerH"hr? Bovino OXPHOS [34] CIV IV IM ? Rata OXPHOS [46] No. Proteina LocalizaSitio P Fuente Función Refs. ción 51 CIV Vbb I Ser/Thr? Bovino OXPHOS [34] 52 CVa I ? Bovino/papa OXPHOS [22] 53 cv IM Thr Muse esq de OXPHOS [33] humano /bovino 54 CV6 IM ? Papa OXPHOS [48] 55 CVb IM ? Papa OXPHOS [48] 56 ScIRP IM ? Rata OXPHOS [20] 57 SDH-Fp IM ? Bovino/papa OXPHOS [22] 58 Complejo bd , IM ? Papa OXPHOS [22] subunidad ß-??? 59 Clll núcleo I IM Tyr Esperma OXPHOS [8] humano 60 NAD(P)transhidroge IM ? Bovino Bomba de H+ [45] nasa 61 ANT IM ? Bovino Transporte [45] 62 Proteína IM ? Bovino Transporte [45] transportadora de fosfato 63 Aldosa reductasa0 ? S T? Varias lineas Osmoregulación [51] celulares Abreviaturas: AA, aminoácido (S, senna; T, treonina; Y, tirosina) ; ANT, transportador de nucleótidos de adenina; Axrnito, anexina mitocondrial ; ß-??, ß-oxidación; BCKAD, cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada; Cl-CV, complejos de la cadena respiratoria 1-5; CPT, palmitoiltransferasa de canlitina, CREB, elemento de respuesta AMPc (CRE) -proteina c e unión; CYP, citocromo P450; DBP, dodecámero-proteina de unión; EF, factor de alargamiento; GST, glutatión S-transferasa; HSP , proteina de choque térmico; IM, membrana interior; IMS, espacio intermembranas ; M, matriz; MnSOD, dismutasa de superóxido de manganesa; mTERF, factor de traducción, terminación mitocondrial; mtGAT, glicerol 3-fosfatasa acetil transferasa mitocondrial; mthsp, HSP mitocondrial; mtTBP, telómero mitocondrial-proteina de unión; NDK, difosfato cinasa de nucleósido, OM, membrana externa; OXPHOS, Fosforilación oxidativa; sitio P, sitio de fosforilación; PDC El/3, subunidad El/3 del complejo piruvato deshidrogenasa ; PDK, piruvato deshidrogenasa cinasa; PLA, fosfolipasa A, ScIRP, subunidad c- péptido inmunoreactivo; SSAT, espermidina/ espermina acetiltransferasa; StAR, proteina reguladora esteroidogénica aguda; TCA, ciclo del ácido tricarboxilico; TRAMPA-1 , proteina asociada al receptor de tumor-factor de necrosis tipo 1; VDAC, canal de anión dependiente de voltaje. b Se observa fosforilación sólo in vitro en la proteina recombinante . c Translocación de proteina a las mitocondrias (es decir, la proteina no reside en la proteina mitocondrial) .

Las familias más grandes de cinasas y fosfatasas en el genoma humano, las proteina cinasas (PKs) y las proteina tirosina fosfatasas (PTPs) poseen más de 500 y más de 100 miembros, respectivamente. Junto con las familias más pequeñas de cinasas y fosfatasas, estas moléculas de señalización comprenden casi tres por ciento de todas las proteínas codificadas en el genoma humano. Similares a las mencionadas fosfoproteínas, las cinasas y fosfatasas se han implicados en funciones mitocondriales en un sorprendente número de estudios, y hasta ahora por lo menos 25 cinasas y ocho fosfatasas se han reportado en localizar a las mitocondrias , como se observa en la Figura 2. Estas cinasas y fosfatasas claramente no se limitan a un grupo o familia; más bien, representan casi todo el subgrupo de cinasas y fosfatasas de mamífero conocidas, que reflejan el rango de trayectorias de señalización que probablemente influencien la mitocondria. Estas moléculas de señalización incluyen cinasas y fosfatasas que varían en especificidad de sustrato, (e.g., tirosina cinasa, subgrupos clásicos de PTP, serina/treonina cinasas y PTPs dual-específicas) ; en mecanismos catalíticos (e.g., PTPs basadas en cisteína, PTPs basadas en ácido aspártico y fosfatasas dependientes de metal); y en la conservación evolutiva (e.g., las piruvato deshidrogenasas cinasas (PDKs) bacterialmente relacionadas y las fosfatasas (PDPs), la cetoácido deshidrogenasa cinasa de cadena ramificada (BCKD ) y fosfatasa (BCKDP) y muchas de las enzimas específicas de mamíferos) .

La mayoría de estas moléculas de señalización poseen otras funciones no mitocondriales en la célula y principalmente se encontró que existen fuera de las mitocondrias . El impulso, o mecanismo de su translocación a las mitocondrias no se ha entendido completamente respecto a la mayoría de las proteínas. Sin embargo, lo que está claro es que las cinasas y fosfatasas, como las fosfoproteínas enumeradas anteriormente, se encuentran presentes en todos los compartimentos de la mitocondria, como es evidente en la Figura 3, y que sus actividades inciden en diversas funciones mitocondriales .

Sin embargo, algunas moléculas de señalización parecen localizar principalmente a las mitocondrias. Además de PDKs y PDPs, este grupo incluye la cinasa inducida por PTEN PINK1, la PTP dual-específica dirigida a la mitocondria PTPMTl y la fosfatasa basada en ácido aspártico/ATPasa Tim50. Aunque los sustratos para muchas de estas proteínas son actualmente desconocidos, es claro a partir de datos biológicos y genéticos que poseen funciones cruciales en las mitocondrias. Por ejemplo, aunque su localización submitocondrial está por determinarse, PINK1 se dirige a las mitocondrias mediante una secuencia de señal N-terminal. Esta cinasa, que comparte alta homología de secuencia con la familia de cinasas reguladas por CA+2/calmodulina, parece estar involucrada en actividades pro-supervivencia. Del mismo modo, PTPMTl se identificó recientemente como la primera PTP que se localiza principalmente dentro de la mitocondria y al igual que PINK1 está dirigida a la mitocondria mediante un péptido de señal N-terminal y se encuentra estrechamente asociado con la superficie de matriz de la membrana mitocondrial interna. PTP T1 se expresa altamente en células ß pancreáticas, cuyas mitocondrias tienen la importante función de acoplar el metabolismo de la glucosa a la secreción de insulina. Finalmente, Tim50, un componente clave del complejo TIM (translocasa de la membrana interna), tiene homología de secuencia a la familia CTD de fosfatasas/ATPasas basadas en ácido aspártico. Tim50, al igual que otros miembros de esta familia, puede funcionar como una ATPasa, pero también se ha demostrado que poseen actividad fosfatasa contra el fosfato de para-nitrofenilo análogo de fosfotirosina in vitro. Dado lo anterior, se puede observar que no sólo las cinasas y las fosfatasas se reclutan en las mitocondrias desde otros lugares en la célula, sino que la mitocondria en sí parece poseer un contingente de moléculas de señalización residentes.

Aunque el efecto de fosforilación en las fosfoproteínas mitocondriales más conocidas es poco claro, permaneciendo algunas veces no identificadas las cinasas y fosfatasas responsables, se han caracterizado parcialmente algunos eventos de fosforilación. Estos ejemplos, como las fosfoproteínas y las moléculas de señalización tratadas anteriormente, no se limitan a un área de la mitocondria.

La fosforilación en la membrana externa mitocondrial tiene una función crucial en la regulación de la apoptosis. Un evento particularmente bien definido es la fosforilación de BAD, un miembro proapoptótico de la familia BCL-2. Se ha demostrado que PKA, después del tratamiento con la citoquina interleucina-3 pro-supervivencia, se transloca a la membrana externa. Una vez anclada a una proteina de anclaje A-cinasa (AKAP) en la membrana externa, PKA fosforila BAD en Ser 112, contribuyendo a la inactivación y disociación de BAD de las mitocondrias , un proceso representado en la Figura 3A. La fosforilación de BAD en Ser 136 por p70S6 cinasa y en Ser 155 por una cinasa no identificada también se ha implicado en la inactivación de BAD.

El ejemplo más bien establecido de fosforilación reversible, que actúa como un mecanismo regulador en las mitocondrias celulares sanas es el del complejo PDH en la matriz, del cual se ilustra un dibujo simplificado en la Figura 3B. Este complejo cataliza la conversión de piruvato derivado de glicólisis a acetil-coenzima A (CoA) , el principal precursor para el ciclo de ácido tricarboxilico (TCA) . Como el enlace entre estas dos principales trayectorias de producción de energía, el complejo PDH debe regularse debidamente para el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa celular.

Desde su identificación como la primera fosfoproteína mitocondrial, el complejo PDH y su regulación por fosforilación reversible han sido estudiados exhaustivamente. La fosforilación y desfosforilación del complejo PDH se llevan a cabo por PDKs y el PDPs, respectivamente. Al menos, se conocen cuatro isoformas PDK y dos isoformas PDP, todas los cuales se asocian con la subunidad E2 del complejo PDH. Los eventos de fosforilación ocurren en tres residuos de serina separados de la subunidad El, cada uno llevando a la inactivación significativa de este complejo. De manera notable, existe ahora al menos un informe de una PDK siendo en si misma fosforilada. Esta fosforilación, llevada a cabo por PKC, ha demostrado inactivar la PDK, demostrando potencialmente un' nivel adicional de regulación del complejo PDH por fosforilación reversible. Por lo tanto, el complejo PDH es un principal ejemplo de las mitocondrias que utilizan la fosforilación para agregar un nivel de regulación a un proceso de otro modo conservado .

Como se indica por las tirosina cinasas y fosfatasas mitocondriales enumeradas anteriormente, la fosforilación dentro de este organelo no se limita a residuos de serina y treonina. Un ejemplo de fosforilación de tirosina que afecta a los energéticos mitocondriales se observa en la regulación del citocromo c oxidasa (COX) en la membrana interna, representado en la Figura 3C. COX, como la enzima terminal en la cadena respiratoria, reduce coordinadamente el oxigeno a agua mientras bombea protones a través de la membrana interna. Al igual que el complejo PDH, COX ese regula aloestéricamente por ATP y ADP, asi como la hormona tiroidea T2 y posiblemente iones CA+2. Además de estas formas de regulación, se ha demostrado que COX se fosforila de manera dependiente de cAMP tanto in vitro como en células de HepG2 in vivo. COX comprende trece subunidades y se ha cristalizado como un dimero. El sitio de fosforilación se ha identificado como Tyr 304 de la subunidad 1, que se localiza en la interfaz de dimero en la intermembrana . El evento de fosforilación inhibe marcadamente la actividad de COX, quizás por interrumpir la formación de dimeros.

En un segundo ejemplo de fosforilación de tirosina de COX, una porción de la tirosina cinasa c-Src, no-receptora similar a la tirosina cinasa de Lyn se localiza dentro de las mitocondrias y conduce a la fosforilación de tirosina de COX en un sitio no identificado de la subunidad II en osteoclastos . El resultado del evento de fosforilación es opuesto al que se observa para la subunidad I, conduciendo a la actividad de COX mejorada.

Un aspecto importante de la señalización mitocondrial es cómo las cinasas y las fosfatasas se regulan a si mismas. Numerosas cinasas que principalmente residen en otros lugares en la célula, pero se dirigen a la mitocondria, tales como Abl, Akt, GSK3I3 y PKC , parecen hacerlo asi sólo en su estado activo. Por lo tanto, el grado de algunas actividades de la cinasa dentro de las mitocondrias simplemente pudiera dictarse por el número de enzimas que se importan hacia el organelo.

Sin embargo, para las moléculas de señalización residentes, deben existir medios de regulación diferentes. Aunque estos procesos permanecen por determinarse, es probable que los segundos mensajeros tendrán una función clave. Se conocen las actividades de las isoformas PDK y PDP por controlarse por iones y moléculas pequeñas tales como Mg2+, Ca2+, K+ y ADP. La caracterización de sintasas mitocondriales de óxido nítrico y el reciente descubrimiento de una adenilato ciclasa soluble en las mitocondrias proporcionan nuevas oportunidades para que los segundos mensajeros contribuyan a la regulación de las moléculas de señalización mitocondriales. Finalmente, ROS, que se ha establecido como un medio para regular las moléculas de señalización en otras partes de la célula, casi seguramente estará involucrada en la regulación de las cinasas y fosfatasas en las mitocondrias, en donde se produce la mayor parte de especies reactivas del oxígeno. Los niveles de expresión relativa de las isoformas de cinasa y fosfatasa pueden desempeñar una función importante en la patología y enlazarse a otros eventos de transducción de señal asociados con la enfermedad. Los cambios en el gen y el nivel de expresión también pueden correlacionar con tales cambios.

Incluso después de varios estudios exhaustivos proteómicos, se estima que sólo se conocen dos tercios del proteoma mitocondrial de mamífero. Es probable que gran parte del tercio restante se componga de proteínas de baja abundancia, tales como las proteínas de señalización, que estuvieron por debajo del nivel de detección de estos análisis espectrométricos de masa. Lo que también está claro de estos estudios es la alta variabilidad en contenido de proteínas entre las mitocondrias de tejidos diferentes. Por ejemplo, se ha encontrado que sólo alrededor del 50% de las proteínas en su esfuerzo proteinómico se conservaron a través de los cuatro tejidos examinados (es decir, cerebro, corazón, hígado y músculo esquelético) . Es probable que diferentes trayectorias de señalización mitocondriales no sólo variarán de tejido a tejido de la misma manera, sino que muy bien pudieran contribuir a esta diversidad mitocondrial observada.

Sin embargo, existe más que suficiente evidencia para concluir que la fosforilación reversible se encuentra involucrada en la regulación de los procesos mitocondriales. Con más de 60 fosfoproteínas reportadas, 30 cinasas y fosfatasas y varias proteínas de señalización auxiliares, la mitocondria es sin duda, un sitio subestimado para la señalización por fosforilación reversible, y de hecho tal regulación puede ser útil para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas, tales como el cáncer.

La gran mayoría de las células tumorales de crecimiento rápido exhibe profundas diferencias genéticas, bioquímicas e histológicas con respecto a las células no transformadas. Muchas de ellas se asocian con el metabolismo de energía modificado en comparación con el tejido de origen. La alteración más notoria y más conocida del metabolismo de energía en células tumorales es un aumento de la capacidad glicolítica, incluso en la presencia de una alta concentración de 02/ un fenómeno conocido como el efecto arburg .

Warburg propuso inicialmente que la fuerza impulsora de la glicólisis mejorada en células tumorales fue la deficiencia de energía causada por un daño irreversible de la función mitocondrial en la cual, al igual que el músculo anaeróbico, la glucosa se convierte a través de la glicólisis en lactato, que más tarde se secreta. Se ha propuesto que este aumento en el flujo glicolítico en células tumorales es una estrategia metabólica para asegurar la supervivencia y el crecimiento en ambientes con bajas concentraciones de 02, tales como la hipoxia parcial observada en tumores sólidos deficientemente oxigenados. En particular, si la concentración de O2 es inferior a 20 µ? en muchos tumores hipóxicos humanos, la fosforilación oxidativa se limita en los mismos. En consecuencia, la glicólisis parece ser la trayectoria principal de energía en los tumores sólidos (e.g., melanomas de lento crecimiento y adenocarcinoma mamario) .

Se ha establecido una relación proporcional entre la tasa de proliferación celular y la tasa de suministro de ATP para las células tumorales de rápido crecimiento. Algunos autores han propuesto que la actividad glicolítica se correlaciona con el grado de malignidad del tumor, por lo que la tasa glicolítica es mayor en tumores altamente desdiferenciados y de rápido crecimiento que en tumores de crecimiento más lento o en células normales. De hecho, un alto nivel de lactato se ha propuesto como un predictor de malignidad. Es probable que estos eventos estén vinculados a adicionales eventos de transducción de señal y cambios genéticos y los ejemplos incluyen el factor inductor de hipoxia y la producción y liberación de factores angiogénicos .

Como se muestra en la Figura 4, durante años, el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) fue considerado sólo biológicamente significativo únicamente por su función en la producción de ATP como una fuente de energía para el organismo. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la actividad del ciclo de TCA afecta también las funciones de trayectoria de transduccion de señal, incluyendo el crecimiento celular y las decisiones de la apoptosis y que las enzimas del ciclo glicolitico y TCA pertinente sean capaces de sobrerregularse o subregularse . También existe una correlación directa entre la progresión del tumor y las actividades de las enzimas glicoliticas hexocinasa y fosfofructocinasa (PFK) 1, que se incrementan grandemente en células tumorales de rápido crecimiento. En consecuencia, se ha postulado que las células tumorales que presentan deficiencias en su capacidad oxidativa son más malignas que las que tienen una fosforilación oxidativa activa. No importa si es bajo condiciones hipóxicas o aerobias, la dependencia del tejido de cáncer de la glicólisis se asocia con el aumento de malignidad.

Se ha estudiado bien del ácido lipóico en el complejo PDH de células sanas. El complejo PDH tiene tres subunidades centrales, El, E2 y E3 (piruvato deshidrogenasa, dihidrolipoil transacetilasa y dihidrolipoamida deshidrogenasa, respectivamente) . Estos complejos tienen un núcleo central E2, con las otras subunidades rodeando este núcleo para formar el complejo. En el espacio entre estas dos subunidades, el dominio lipoilo transporta a los intermedios entre los sitios activos. El dominio lipoilo se une en si mismo por un enlazador flexible al núcleo E2. A la formación de un hemitioacetal por la reacción de piruvato y tiamina pirofosfato, este anión ataca el SI de una especie de lipoato oxidada que se une a un residuo de lisina . En consecuencia, el lipoato S2 se desplaza como un sulfuro o una fracción de sulfhidrilo, y el subsiguiente colapso del hemitioacetal tetrahédrico expulsa el tiazol, liberando el cofactor TPP y generando un tioacetato sobre el SI del lipoato. En este punto, la funcionalidad del lipoato-tioéster se transloca hacia el sitio activo E2, en donde una reacción de transacilación transfiere el acetilo desde el "brazo oscilante" de lipoato al tiol de coenzima A. Esto produce acetil-CoA, que se libera del complejo de enzima y posteriormente entra al ciclo TCA. El dihidrolipoato aún enlazado a un residuo de lisina del complejo, migra después al sitio activo E3, en donde experimenta una oxidación mediada por flavina de regreso a su estado de reposo de lipoato, produciendo FADH2 (y finalmente, NADH) y regenerando el lipoato de regreso a un receptor de acilo competente. Si esta especie de lipoato se interrumpe, entonces no habría flujo de electrones hacia FADH2 o la generación de acetil-CoA, y como consecuencia habría una acumulación tóxica de piruvato dentro de la célula. En las células cancerosas se ha sugerido que la producción de acetoina es un requisito para la desintoxicación celular y la supervivencia Como se indicó anteriormente, la actividad del complejo PDH en las mitocondrias se regula altamente por una variedad de efectores alostéricos y por la modificación covalente. La actividad de PDH se regula por su estado de fosforilación, siendo más activa en el estado desfosforilado . La fosforilación de PDH se cataliza por PDK. La actividad de PDK se mejora por un aumento en el nivel de ATP, NADH y acetil-CoA. Los efectores negativos de PDK son ADP, NAD+, CoA-SH y piruvato, cuyos niveles se incrementan cuando los niveles de ATP disminuyen. Aunque la regulación de PDP, la enzima que activa PDH a través de la desfosforilación, no se entiende completamente, se sabe que la Mg+2 y CA+2 activan PDP .

Dos productos del complejo, NADH y acetil-CoA, son efectores alostéricos negativos de PDH-a, la forma activa desfosforilada de PDH. Estos efectores reducen la afinidad de la enzima para piruvato, limitando asi el flujo de carbono a través del complejo PDH. Además, NADH y acetil-CoA son poderosos efectores positivos de PDK, la enzima que inactiva PDH convirtiéndolo en la forma fosforilada de PDH-b. Ya que NADH y acetil-CoA se acumulan cuando la carga de energía de la célula es alta, no es sorprendente que altos niveles de ATP también sobreregulen la actividad de PDK, reforzando la sub-regulación de la actividad de PDH en células ricas en energía. Sin embargo, ya que el piruvato es un potente efector negativo de PDK, cuando se elevan los niveles de piruvato, PDH-a se favorecerá aún con altos niveles de NADH y acetil-CoA.

Las concentraciones de piruvato que mantienen PDH-a son suficientemente altas a fin de que, en células ricas en ATP, la forma km alta alostéricamente sub-regulada de PDH, es sin embargo capaz de convertir piruvato a acetil-CoA. Con grandes cantidades de piruvato en células que tienen altos niveles de ATP y NADH, el carbono de piruvato se dirigirá a las dos principales formas de almacenamiento de carbono (glucógeno a través de gluconeogénesis y a la producción de grasa través de la síntesis de ácidos grasos) en donde el acetil-CoA es el principal donante de carbono. Aunque la regulación de PDP-b no se entiende bien, es bastante probable que se regule para maximizar la oxidación de piruvato en virtud de la disminución de las concentraciones de ATP y reducir al mínimo la actividad de PDH bajo altas concentraciones de ATP.

Las células tumorales no pueden acumular indefinidamente piruvato y los aldehidos asociados y los radicales, tales como el acetaldehído, superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo, ya que estas moléculas son citotóxicas a niveles elevados a través de mecanismos tales como reducir drásticamente el pH celular. Se ha descrito así, para AS-30D y los hepatomas de Ehrlich, que una fracción significativa del piruvato mitocondrial se descarboxila a un acetaldehído activo por el componente El del complejo PDH a través de pirofosfato de hidroxietiltiamina enlazado. Este acetaldehído activo es a su vez condensado con un segundo acetaldehído, desacidificando o reduciendo finalmente el piruvato original, al utilizar ya sea el aminoácido glutamina o el ácido lipóico, para generar acetoina ( 3-hidroxibutanona) , un compuesto que tanto inhibe competitivamente PDH como es menos tóxico a la célula que su precursor de piruvato (e.g., al mantener la homeostasis del pH dentro de la célula) . A pesar de la importancia de acetoina en la trayectoria de- la desintoxicación de células tumorales como resultado de la acumulación de piruvato debido a la dependencia de las células tumorales de la glicólisis como fuente de producción de ATP, sin embargo, existen pocas referencias en la técnica anterior a los efectos del bloqueo de la producción de acetoina sobre la viabilidad de células tumorales.

Estudios recientes sugieren que obligar a las células cancerosas a un metabolismo más aeróbico suprime el crecimiento del tumor. Por lo tanto, la transición al metabolismo Warburg requiere cerrar el complejo PDH. En esta transición, existe señalización mejorada por el factor inductor de hipoxia (HIF) en células cancerosas, sin sorprender la importante función de HIF en el metabolismo de la glucosa, como se muestra en la Figura 5. Las mutaciones que directa o indirectamente promueven la señalización de HIF de hecho parecen ser un mecanismo común en el desarrollo del cáncer. HIF induce la sobreexpresión de PDK1, que actúa entonces, para disminuir la actividad del complejo PDH. La fosforilación por PDK1 puede ser especialmente eficaz para mantener un complejo PDH inactivo ya que esta isoforma fosforila únicamente tres residuos de serina en la subunidad alfa de El, la primera subunidad del complejo PDH. La reactivación de El requiere la eliminación de todos los tres grupos de fosfato. Además, la activación del complejo PDH puede conducir a la producción mejorada de ROS, que a su vez puede conducir a la apoptosis. Sin embargo, las alteraciones en PDK1 observadas en el cáncer pueden no sólo deberse a los cambios en su concentración sino también a los cambios en su actividad y posiblemente en su secuencia de aminoácidos, incluso entre un tipo de tumor o de un paciente a otro. Además, PDK1 pueden formar distintos complejos con varias moléculas asociadas con tumores según el tipo de tumor. Por lo tanto, la inhibición de PDK puede ser un objetivo potencial en la generación de apoptosis en los tumores. Sin embargo, hasta la fecha, los inhibidores de PDK1 conocidos han demostrado causar sólo un máximo de 60% de inhibición de este isoenzima.

Aunque la quimioterapia tradicional se dirige a dividir, las células proliferativas , todos los tratamientos quimioterapéuticos clínicamente aceptados utilizan grandes dosis de fármacos que también inducen un profundo daño a las células huésped normales proliferativas . Por lo tanto, se requiere dirigirse de manera más selectiva para el tratamiento del cáncer. Otro problema asociado con la quimioterapia es que en muchos tipos de tumor, existe resistencia ya sea inherente o adquirida a los medicamentos antineoplásicos . En general, la quimioterapia tradicional ofrece actualmente pocos beneficios a largo plazo para los tumores más malignos y con frecuencia se asocian con efectos secundarios adversos que disminuyen la duración o la calidad de la vida. Por lo tanto, se requieren nuevos y radicales enfoques que puedan proporcionar el manejo a largo plazo de los tumores mientras permiten una calidad de vida decente.

Sin duda, la eficacia, el suministro y los efectos secundarios de los medicamentos son problemas que deben resolverse desarrollando nuevas quimioterapias. En tumores sólidos, el suministro en una región hipóxica puede ser difícil cuando el fármaco no se impregna fácilmente a través de las diferentes capas celulares. Para eliminar estas incertidumbres , seria pertinente diseñar a los agentes anticancerigenos teniendo constantes de inhibición metabólica en al menos, el rango submicromolar . Puede argumentarse que las células cancerosas son genética y fenotipicamente heterogéneas de una linea a otra linea. Sin embargo, todas las lineas celulares tumorales dependen de la glicólisis y la fosforilación oxidativa para el suministro de ATP. Concentrándose en el efecto de arburg permite diseñar fármacos basados en las diferencias energéticas físicas y bioquímicas entre células tumorales y normales para facilitar el diseño del suministro y estrategias terapéuticas que afectan selectivamente únicamente el metabolismo y el crecimiento del tumor, sin afectar tejido huésped sano y la funcionalidad del órgano.

Las patentes de E.U. 6,331,559 y 6,951,887 de Bingham et al., así como la Solicitud Provisional de E.U. No. 60/912,598 por Bingham et al., todas incorporadas en la presente mediante la referencia, revelan una nueva clase de agentes terapéuticos derivados de ácido lipóico que selectivamente se dirigen y eliminan tanto células tumorales como ciertos otros tipos de células enfermas. Estas patentes revelar además composiciones farmacéuticas y métodos de uso de las mismas, que comprenden una cantidad efectiva de tales derivados de ácido lipóico junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, si bien estas patentes describen las estructuras y el uso general para estos derivados de ácido lipóico, no existen indicios en cualquier patente de que estos derivados sean útiles para modular el nivel de estructura y/o de expresión y/o regulación de la actividad, del complejo PDH.

Como se ha demostrado que la estructura y/o la actividad del complejo PDH es un determinante fundamental de actividad tumoral, entonces, seria benéfico proporcionar un modulador farmacéuticamente aceptable de la estructura y/o actividad o incluso el nivel de expresión, del complejo PDH y los métodos de uso del mismo.

OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN Y APLICABILIDAD INDUSTRIAL Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica para utilizarse en el tratamiento o el diagnóstico de una enfermedad, condición o síndrome que se caracteriza por la hiperproliferación celular, tal como el cáncer, que exhibe actividad selectiva en las células tumorales.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica para utilizarse en el tratamiento o diagnóstico de tal enfermedad, condición o síndrome antes mencionado que ocasione mínimos efectos secundarios al administrarse.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica para utilizarse en el tratamiento o diagnóstico de tal enfermedad condición o síndrome antes mencionado, que se elabore fácilmente al menor costo posible y sea capaz de almacenarse durante el periodo más largo posible.

Es aún un objeto adicional de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica para utilizarse en el tratamiento o diagnóstico de tal enfermedad condición o síndrome antes mencionado, que module el metabolismo energético mitocondrial, especialmente a través de la estructura, la actividad y/o nivel de expresión del complejo PDH en las mitocondrias de células tumorales.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Para lograr los objetivos antes mencionados, la presente invención proporciona ampliamente una composición farmacéutica útil para el tratamiento, diagnóstico, o prevención de una enfermedad, condición o síndrome que se caracteriza por una alteración del estado de fosforilación de al menos una enzima o complejo de enzimas o subunidad de los mismos, tales como el complejo PDH, incluyendo las caracterizadas por hiperproliferación celular, tales como el cáncer, o los síntomas de éste, en animales de sangre caliente, incluyendo humanos, en donde la composición farmacéutica comprende una cantidad efectiva de al menos un derivado de ácido lipóico, incluyendo los que se describe en las Patentes de E.U. 6,331,559 y 6,951,887 y la Solicitud Provisional de E.U. No. 60/912,598, todas incorporadas en la presente mediante la referencia y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo.

Al inhibir el metabolismo energético mitocondrial, los derivados de ácido lipóico de la presente invención ocasionan tanto la pérdida de potencial de la membrana mitocondrial como otras consecuencias mitocondriales en las células enfermas, dando como resultado el inicio irreversible de la muerte celular. Los derivados de ácido lipóico de la presente invención también pueden inhibir el metabolismo energético mitocondrial mediante la activación de PDKs y/o la inhibición de PDPs o al inhibir la conversión de piruvato a la acetoina de la molécula menos tóxicos a través de la inhibición de la actividad de la subunidad El del complejo PDH. La inhibición de la síntesis de acetoina distorsionará otros procesos, incluyendo el equilibrio redox y también puede ocasionar la producción de subproductos tóxicos, incluyendo acetaldehído superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales de hidroxilo, causando consecuentemente estos subproductos por sí mismos, daños irreversibles a la mitocondria de la célula enferma.

La composición farmacéutica de la presente invención puede modular los efectos de PDKl, PDK2, PDK3, PDK4 y los mutantes o isoformas de cada uno de los mismos. El compuesto farmacéutico también puede modular los efectos de PDP1, PDP2 y las isoformas de cada uno de los mismos.

La composición farmacéutica de la presente invención también puede modular el nivel de expresión de la fosforilasa, cinasa y los constituyentes de la enzima deshidrogenasa encontrados en el complejo PDHs. Esta modulación puede ocurrir en la etapa de transcripción, de traducción o post-traducción, incluyendo el silenciamiento epigenético de los genes apropiados.

Como un compuesto derivado de una molécula fundamentalmente asociada con el ciclo TCA, y mediante la glicólisis de extensión, la composición farmacéutica de la presente invención demuestra la absorción selectiva en células tumorales. Además, tal absorción selectiva de células tumorales minimiza los efectos secundarios que la administración de esta composición farmacéutica tendría en células sanas no transformadas y el tejido.

En una modalidad de la presente invención, los derivados de ácido lipóico tienen la fórmula general (I) : en donde Ri y R2 se seleccionan independiente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo CnH2n+i/ alqueno CnH2n, alquenilo CnH2n-i, alquino CnH2n 2, alquinilo CnH2n-3, sulfuro de alquilo CH3 (CH2) n-S-, bisulfuro alquilo CH3CHt—S—S—, éster tiocarbámico (CH2)nC NH—, y semitioacetal CH3CH(OH)—S—, en donde n es 1-10 y t es 0-9, aromáticos, acilo definido como R4C(0)-, heteroarilo, imidoilo, definido como RsC(=NH)-, arilo organometálico, alquilo-arilo organometálico, semiacetal R6CH(0H)-S-, aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, lipidos y multimeros y combinaciones de los mismos; en donde Ri y R2 como se definió anteriormente pueden ser no sustituidos o sustituidos; en donde R3 se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, lipidos y multimeros de los mismos. en donde R4 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, heteroarilo, alquilheteroarilo y arilo organometálico, cualquiera de los cuales puede ser sustituido o no sustituido; en donde R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, heteroarilo y alquilheteroarilo, cualquiera de los cuales puede ser sustituido o no sustituido; en donde R6 es CC13, CF3 o COOH; y en donde x es 0-16; o sales del mismo En una segunda modalidad de la presente invención, los derivados de ácido lipóico se definen por una segunda fórmula general (II): en donde M es un enlace covalente, - [C (Ri) ( R2 > ] z - , o un quelato de metal u otro complejo de metal en donde el metal no es paladio; en donde Ri y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, acilo R3C(0)-, alquilo CnH2n+ií alquenilo definido como CraH2m-i, alquinilo definido como CmH2m-3 / arilo, heteroarilo, sulfuro de alquilo CH3( CH2 ) n ~ S-, imidoilo, definido como R3C(=NH)-, hemiacetal definido como R4CH(OH)-S-, aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, lipidos y multimeros y combinaciones de los mismos; en donde Ri y R2 como se definió anteriormente pueden ser no sustituidos o sustituidos; en donde R3 se selecciona de un grupo que consiste de los aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, lipidos y multimeros de los mismos; en donde R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, heteroarilo y heterociclilo, cualquiera de los cuales puede ser sustituido o no sustituido; en donde R5 se selecciona del grupo que consiste de CCI3, CF3 o COOH; y en donde x es 0-16, z es 0-5, n es 0-10 y m es 2- 10; o sales de los mismos Además, como cualquiera o todas estas estructuras generales pueden metabolizarse dentro de la célula o la mitocondria, expresamente se pretende que los metabolitos de las estructuras antes referidas se encuentren dentro del ámbito de la presente invención.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para diagnosticar, tratar o prevenir una enfermedad, condición, síndrome o los síntomas de los mismos, que incluye la alteración del estado de fosforilación de al menos una enzima y/o complejo de enzimas o subunidad de los mismos, tales como el complejo PDH, incluyendo los caracterizados por hiperproliferación celular, tales como el cáncer, en animales de sangre caliente, incluyendo humanos, en donde el método comprende la administración a tal animal, de una cantidad efectiva de la composición farmacéutica descrita en la presente.

En aún un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método de diagnóstico y predicción en beneficio en un paciente que presenta los síntomas de una enfermedad, condición o síndrome, o los síntomas de los mismos, el cual incluye una alteración del estado de fosforilación de al menos una enzima o complejo de enzimas o subunidad de los mismos, tales como el complejo PDH, incluyendo las caracterizadas por la hiperproliferación celular, tales como el cáncer, que comprende obtener una muestra de células del paciente, administrar una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de la presente invención a las células in vitro y obtener los resultados derivados del mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Los dibujos siguientes son ilustrativos de las modalidades de la invención y no se presentan para limitar el alcance de la aplicación como se comprende por toda la especificación y las reivindicaciones.

La Figura 1 representa en general las moléculas de transducción de señal dirigidas tanto hacia dentro como afuera de las mitocondrias y sus efectos.

La Figura 2 muestra una lista de cinasas y fosfatasas mitocondriales y las ubicaciones dentro de la mitocondria de las mismas.

La Figura 3A ilustra la fosforilación de BAD por PKA en la membrana mitocondrial externa y los efectos de la fosforilación reversible después de la misma.

La Figura 3B presenta la conversión de piruvato en acetil-CoA en la matriz mitocondrial por la acción del complejo PDH y los efectos de la fosforilación reversible después de la misma.

La Figura 3C muestra la acción de COX en la reducción de oxigeno a agua y el bombeo de protones a través de la membrana mitocondrial interna y los efectos de la fosforilación reversible después de la misma.

La Figura 4 ilustra las estructuras de los sustratos y los productos en la producción glicolitica de piruvato, mostrando también la generación de ATP y NADH y las enzimas asociadas.

La Figura 5 muestra la regulación del metabolismo de la glucosa por HIF-1.

La Figura 6A ilustra la diferencia en el metabolismo energético entre el tejido normal y el tejido canceroso in vivo.

La Figura 6B describe las diferencias entre las formas biogénicas del ácido lipóico en el complejo PDH y los derivados de ácido lipóico que forman parte de la composición farmacéutica de la presente invención.

La Figura 6C presenta la regulación del complejo PDH mediante los efectos del residuo de lipoilo sobre PDK.

La Figura 7 muestra los efectos de la composición farmacéutica de la presente invención sobre el crecimiento del tumor de xenoinjerto.

La Figura 8 muestra el efecto del tratamiento con la composición farmacéutica de la presente invención sobre tres tipos de células tumorales y una celda no transformada.

La Figura 9A muestra los niveles de ATP en células de cáncer pulmonar después del tratamiento con la composición farmacéutica de la presente invención en o por encima del umbral letal.

La Figura 9B compara la composición farmacéutica de la inhibición de la presente invención de la síntesis de ATP en medios que contiene el piruvato versus medios que contiene glucosa.

La Figura 9C compara la composición farmacéutica de la inhibición de la síntesis de ATP de la presente invención en células de cáncer de mama con células de mama normal.

La Figura 9D compara la composición farmacéutica de la inhibición de la síntesis de ATP de la presente invención con la de ácido lipóico y una forma inactiva de la presente invención en células de cáncer de pulmón.

La Figura 10 ilustra la composición farmacéutica de los efectos de la presente invención sobre los niveles mitocondrial de células tumorales del complejo PDH y las actividades enzimáticas de alfa-cetoglutarato deshidrogenasa ( KDH) .

La Figura 11A muestra los análisis Western de geles bidimensionales de extractos de células cancerosas de pulmón tratadas o simuladamente tratadas con la composición farmacéutica de la presente invención.

Figura 11B muestra ampliaciones de muestras de gel bidimensional pareadas tratadas y simuladamente tratadas con la composición farmacéutica de la presente invención.

La Figura 12A representa la función reguladora de PDKs según se modulada por lipoato endógeno covalentemente enlazado a la subunidad E2 del complejo PDH.

La Figura 12B representa un posible mecanismo de la inactivación diferencial de células tumorales del complejo PDH mediante la composición farmacéutica de la presente invención .

La Figura 13 presenta los efectos de la composición farmacéutica de la presente invención sobre el potencial de la membrana mitocondrial en las células de cáncer de pulmón H460.

La Figura 14 muestra los resultados del inmunoanálisis Western en donde se observan las trayectorias de muerte celular en diversos tipos de células tumorales mediante la composición farmacéutica de la presente invención .

DETALLADA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige en general a composiciones farmacéuticas para el tratamiento, diagnóstico, o prevención de una enfermedad, condición o síndrome o los síntomas de los mismos, que incluyen una alteración del estado de fosforilación de al menos una enzima y/o complejo enzimático o subunidad de los mismos, tales como el complejo PDH, incluyendo aquellos caracterizados por hiperproliferación celular, tales como cáncer, o los síntomas del mismo, en animales de sangre caliente. Tales animales incluyen aquellos de la clase mamífero, tales como humanos, caballos, ganado, animales domésticos incluyendo perros y gatos y lo similar, sujetos a enfermedad y otras condiciones patológicas y síndromes que se caracterizan por hiperproliferación celular, incluyendo cáncer. La composición farmacéutica de la presente invención comprende una cantidad efectiva de al menos un derivado del ácido lipóico, incluyendo los descritos en las Patentes de E.U. 6,331,559 y 6,951,887 y la Solicitud Provisional de E.U. No. 60/912,598, conocida también como un tioctan y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable del mismo. Como la molécula que no sólo es un derivado de una que normalmente se encuentra dentro de las mitocondrias, sino también una que es instrumento para la actividad glicolítica incrementada de células tumorales como se observa en el efecto arburg, los derivados del ácido lipóico de la presente invención son particularmente muy apropiados para el suministro selectivo y en la concentración efectiva dentro de las mitocondrias de células y tejidos caracterizados por hiperproliferación, tales como las tumorales, excepcionando así las células y tejidos normales de los efectos de la composición.

La composición farmacéutica de la presente invención puede modular los efectos de PDKl, PDK2, PDK3, PDK4 y las isoformas de cada uno de ellos a través de fosforilación reversible. La composición farmacéutica también puede modular los efectos de PDP1, PDP2 y las isoformas y/o mutantes de cada uno de ellos también mediante la fosforilación reversible. Tal modulación puede ocurrir a través de la promoción o inhibición de la actividad de cinasa o fosfatasa.

Al inhibir el metabolismo energético mitocondrial, los derivados del ácido lipóico de la presente invención causan tanto la pérdida del potencial de la membrana mitocondrial como otras consecuencias mitocondriales en las células enfermas, dando como resultado el inicio irreversible de la muerte celular. Los derivados del ácido lipóico de la presente invención también pueden inhibir el metabolismo energético mitocondrial mediante la activación de PDKs y/o la inhibición de PDPs o al inhibir la conversión de piruvato a la acetoina molecular menos tóxica a través de la inhibición de la actividad de la subunidad El del complejo PDH. La inhibición de la síntesis de acetoina distorsionará otros procesos, incluyendo el equilibrio redox y también puede causar la producción de subproductos tóxicos, incluyendo acetaldehído, superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales de hidroxilo, estos subproductos por sí mismos, causan consecuentemente daños irreversibles a las mitocondrias de la célula enferma.

En una primera modalidad de la presente invención, los derivados del ácido lipóico se definen por una primera fórmula general (I): en donde Ri y R2 se seleccionan independiente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo CnH2n+: alqueno CnH2n, alquenilo CnH2n-i, alquino CnH2n 2, alquinilo CnH2n_3, sulfuro de alquilo CH3 (CH2) n-S-, bisulfuro alquilo CH3CHt—S—S—-, éster tiocarbámico (CH2)nC NH—, y semitioacetal CH3CH(OH)—S—, en donde n es 1-10 y t es 0-9, aromáticos, acilo definido como R4C(0)-, heteroarilo, imidoilo, definido como R5C(=NH)-, arilo organometálico, alquilo-arilo organometálico, semiacetal R6CH(OH)-S-, aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, lipidos y multimeros y combinaciones de los mismos; en donde Ri y R2 como se definió anteriormente pueden ser no sustituidos o sustituidos; en donde R3 se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, lipidos y multimeros de los mismos. en donde R se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, heteroarilo, alquilheteroarilo y arilo organometálico, cualquiera de los cuales puede ser sustituido o no - - sustituido; en donde R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, heteroarilo y alquilheteroarilo, cualquiera de los cuales puede ser sustituido o no sustituido; en donde R6 es CC13, CF3 o COOH; y en donde x es 0-16; o sales del mismo En una segunda modalidad de la presente invención, los derivados de ácido lipóico se definen por una segunda fórmula general (II): en donde M es un enlace covalente, - [C (Ri) (R2)]z-/ o un quelato de metal u otro complejo de metal en donde el metal no es paladio; en donde Ri y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, acilo R3C(0)-, alquilo CnH2n+i, alquenilo definido como CnH2n-i, alquinilo definido como CnH2n-3 , arilo, heteroarilo, sulfuro de alquilo CH3(CH2)n-S-, imidoilo, definido como R3C(=NH)-, hemiacetal definido como R4CH(OH)-S-, aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, lipidos y multímeros y combinaciones de los mismos; - - en donde Ri y R2 como se definió anteriormente pueden ser no sustituidos o sustituidos; en donde R3 se selecciona de un grupo que consiste de los aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, lipidos y multimeros de los mismos; en donde R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, heteroarilo y heterociclilo, cualquiera de los cuales puede ser sustituido o no sustituido; en donde R5 se selecciona del grupo que consiste de CCI3, CF3 o COOH; y en donde x es 0-16, z es 0-5, n es 0-10 y m es 2- 10; o sales de los mismos Además, como cualquiera o todas estas estructuras generales pueden metabolizarse dentro de la célula o la mitocondria, expresamente se pretende que los metabolitos de las estructuras antes referidas se encuentren dentro del ámbito de la presente invención.

La composición farmacéutica de la presente invención también puede modular los niveles de expresión de los constituyentes de la enzima fosfatasa, cinasa y deshidrogenasa encontrados en el complejo PDHs . Esta modulación puede ocurrir en la etapa de transcripción, - - traducción o post-traducción, incluyendo silenciamiento epigenético de los genes apropiados.

Las composiciones de la presente invención pueden incluir además un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son muy conocidos en la técnica e incluyen los utilizados convencionalmente en composiciones farmacéuticas, tales como, pero sin limitarse a, antioxidantes, amortiguadores, agentes quelantes, saborizantes, colorantes, conservadores, promotores de absorción para mejorar la biodisponibilidad, agentes antimicrobianos y combinaciones de los mismos. La cantidad de tales aditivos depende de las propiedades deseadas, que puede determinarse fácilmente por un experto en la materia.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener rutinariamente sales, agentes de amortiguamiento, conservadores y vehículos compatibles, opcionalmente en combinación con otros ingredientes terapéuticos. Cuando se utiliza en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables, pero pueden utilizarse convenientemente sales no farmacéuticamente aceptables de las mismas para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas y no se excluyen del alcance de la invención. Tales sales farmacológica y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, las preparados de los - - siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, palicílico, p-tolueno sulfónico, tartárico, cítrico, metano sulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftaleno-2-sulfónico y benceno sulfónico. También, las sales farmacéuticamente aceptables pueden prepararse como sales de metal alcalino o alcalinotérreo, tales como sales de sodio, potasio o calcio del grupo ácido carboxílico.

La presente invención proporciona además métodos para tratar o diagnosticar a un paciente con agentes terapéuticos o de diagnóstico, al suministrar una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico o de diagnóstico a las células para implementar la prevención, diagnosis o tratamiento de una enfermedad, condición o síndrome o síntomas de las mismas, que incluye una alteración del estado de fosforilación de al menos una enzima y/o complejo enzimático, o subunidad de los mismos, incluyendo las caracterizadas por hiperproliferación celular. Se contempla especialmente modular el complejo PDH como un tratamiento mejorado de cáncer, incluyendo el tratamiento de tumores primarios mediante el control de la proliferación de' células tumorales, angiogénesis, crecimiento metastásico, apoptosis y tratamiento del desarrollo de micrometástasis después o concurrentes con extirpación quirúrgica; y radiológico u otro tratamiento quimioterapéutico de un tumor primario. La - - composición farmacéutica de la presente invención es útil en tales tipos de cáncer como melanoma primario o metastásico, linfoma, sarcoma, cáncer pulmonar, cáncer de hígado, de linfoma de Hodgkin y no de Hodgkin, leucemias, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de riñon, cáncer de colon y adenocarcinomas tales como cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario y cáncer pancreático .

Para aplicaciones de diagnóstico y terapéutico, la composición farmacéutica puede administrarse directamente a un paciente cuando se combina con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Este método puede practicarse al administrar al agente terapéutico o de diagnóstico solo o en combinación con una cantidad efectivo de otro agente terapéutico o de diagnóstico, que puede ser, pero no se limita a, un inhibidor glicolítico, un agente de interacción en microtúbulos, un agente citostático, un inhibidor de ácido fólico, un agente de alquilación, un inhibidor de topoisomerasa, un inhibidor de tirosina cinasa, podofilotoxina o derivados e los mismos, un antibiótico antitumoral, un agente quimioterapéutico, un agente de inducción de apoptosis, un agente anti-angiogénico, mostazas de nitrógeno, agentes de intercalación de ácido nucleico y combinaciones de los mismos. Tales agentes terapéuticos pueden incluir además otros reactivos de inhibición metabólica. Muchos de tales agentes terapéuticos son conocidos en la técnica. El método de tratamiento de combinación se proporciona para uso simultáneo, secuencial o separado en el tratamiento de tales condiciones según sea necesario para amplificar o garantizar una respuesta el paciente al método de tratamiento.

Los métodos de la presente invención pueden practicarse utilizando cualquier modo de administración que es médicamente aceptable, y produce niveles efectivos de los compuestos activos sin causar efectos clínicamente adversos inaceptables. Aunque se prefieren las formulaciones específicamente adecuadas para la administración parenteral, las composiciones de la presente invención también se pueden formular para inhalación, oral, tópica, transdérmica, nasal, ocular, pulmonar, rectal, transmucosal , intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intratorácica , intrapleural , intrauterina, intratumoral, o metodologías de infusión o administración, en la forma de aerosoles, rocíos, polvos, geles, lociones, cremas, supositorios, ungüentos y lo similar. Si se desea tal formulación, pueden incluirse otros aditivos conocidos en la técnica para impartir la consistencia deseada y otras propiedades para la formulación.

Los expertos en la técnica reconocerán que el modo particular de administrar al agente terapéutico o de diagnóstico depende del agente especial seleccionado, si la - - administración es para el tratamiento, diagnóstico o prevención de una enfermedad, afección, síndrome o los síntomas de las mismas; siendo tratada o diagnosticada la gravedad del trastorno médico, y la dosis de eficacia para la eficacia terapéutica. Por ejemplo, un modo preferido de administrar un agente anticanceroso para el tratamiento de leucemia implicaría administración intravenosa considerando que los métodos preferidos para el tratamiento de cáncer de la piel podrían implicar la administración tópica o intradérmica .

Como se utiliza en el presente, "cantidad efectiva" se refiere a la dosis o múltiples dosis del agente terapéutico o de diagnóstico en el que se logra el efecto terapéutico o de diagnóstico deseado. Por lo general, una cantidad efectiva del agente terapéutico o de diagnóstico puede variar con la actividad del agente específico empleado; la estabilidad metabólica y la duración de la acción de ese agente; las especies, edad, peso corporal, salud general, estado de dieta, sexo y dieta del individuo; el modo y el tiempo de administración; tasa de excreción; combinación de fármacos, si los hubiese; y grado de presentación o gravedad de la situación particular que se está tratando. La dosis exacta puede determinarse por un experto de habilidad ordinaria en la técnica sin experimentación indebida, . en una o varias administraciones por día, para producir los - - resultados deseados, y la dosis puede ajustarse por el practicante individual para lograr un efecto terapéutico deseado, o en caso de cualquier complicación. Lo que es importante, cuando se utiliza para tratar cáncer, la cantidad de dosis del agente terapéutico utilizado debe ser suficiente para inhibir o destruir las células tumorales dejando las células normales sustancialmente sin daño.

El agente terapéutico o de diagnóstico incluido en las composiciones farmacéuticas de la presente invención puede prepararse en cualquier cantidad deseada hasta la máxima cantidad que puede administrarse de manera segura a un paciente. La cantidad del agente de diagnóstico o agente terapéutico puede variar desde menos de 0.01 mg/ml a más de 1000 mg/ml, preferiblemente aproximadamente de 50 mg/ml.

Por lo general, la composición farmacéutica de la presente invención se suministrará de manera suficiente para administrar al paciente una cantidad efectiva para modular la estructura y/o actividad del complejo PDH. Por lo tanto, la cantidad de dosis, puede variar de aproximadamente 0.3 mg/m2 a 2000 mg/m2, preferiblemente aproximadamente 60 mg/m2. La cantidad de dosis puede administrarse en una dosis única o en forma de dosis divididas individuales, tales como de uno a cuatro o más veces al día. En caso de que la respuesta en un individuo sea insuficiente en cierta dosis, incluso dosis altas (o dosis efectivas más altas por una ruta de suministro diferente, más localizada) pueden emplearse en el grado de tolerancia del paciente. Se contemplan múltiples dosis diarias para lograr niveles apropiados sistémicos o de destino del agente terapéutico o de diagnóstico.

En aún otra modalidad de la presente invención, los derivados del ácido lipóico de la presente invención pueden utilizarse como agentes diagnósticos y predictivos in vitro. Como se estableció anteriormente, dependiendo de la célula tumoral especifica o del tipo de célula en cuestión, diferentes derivados del ácido lipóico pueden ser más o menos efectivos en la inhibición de distintas clases de tumor a través de la modulación del complejo PDH. Asi, por ejemplo, en casos donde el diagnóstico o selección de una estrategia quimioterapéutica adecuada puede ser difícil, pruebas de un cultivo de células tumorales in vitro con derivados de ácido lipóico conocidos para tipos de células tumorales específicos de destino proporcionan un enfoque alternativo para identificar tipos de tumor y tratamientos eficaces.

Volviendo a la Figura 6A ilustra una de las muchas diferencias probables en el metabolismo de la energía en tejidos normales y células tumorales en vivo. Las células tumorales con frecuencia dependen más fuertemente de glucólisis citoplasmática que del metabolismo mitocondrial de energía para la generación de ATP que las células normales en las condiciones correspondientes. Los cambios en la expresión y regulación del complejo PDH aparentemente forman parte de esta adaptación especifica del tumor. La disminución en los niveles de componentes catalíticos de PDH y/o el incremento en los niveles de PDKs inhibitorios que producen estos efectos pueden volver a las células tumorales mucho más vulnerables a los agentes que atacan el complejo PDH que las células normales.

La Figura 6B describe las estructuras de ácido lipóico a medida que cataliza las reacciones normales implicadas en la síntesis de acetil-CoA de piruvato en el complejo PDH. El ácido lipóico in vivo se une a través de su terminal carboxilo en un enlace amida no de péptido a un grupo amino épsilon de una lisina en los sitios de activos de dominio E2 lipoílo. Nótese también que el estado de oxidación/reducción/acetilación del lipoato enlazado a la PDH E2 se monitorea por las cinasas y fosfatasas que controlan la actividad de la PDH al controlar la inactivación de fosforilación de la subunidad El PDH. Esta figura también representa la estructura de los tres derivados del ácido lipóico representativos que pueden utilizarse en la presente invención. Aunque CPI-613 y CPI-045 tienen alta potencia anticancerígena, CPI-157 tiene poca o ninguna actividad en cultivo celular y es útil como un control en varios experimentos .

La Figura 6C presenta la relación entre los - - componentes del complejos PDH, incluyendo E2 con su lipoatos enlazados, El y el PDK regulador. Los altos niveles de acetil-lipoato o dihidrolipoato (no representado) activan PDKs que, a su vez, suprimen el flujo adicional a través del complejo PDH al inactivar El , la subunidad catalizar la primera etapa en la catálisis del complejo PDH. Este proceso actúa como un regulador para el flujo de carbono/energia a través del complejo PDH, y este proceso regulador aparentemente se modifica de manera sustancial para apoyar el metabolismo de energía variante de las células tumorales, como se ve en la Figura 3A.

La Figura 7 muestra los efectos de la composición farmacéutica de la presente invención en el crecimiento del tumor de xenoinjerto. Las células se implantaron de manera subcutánea en el flanco dorsal como se describe en el ejemplo 2. Los ratones se inyectaron con el fármaco (o vehículo solo; "simulación") por vía intraperitoneal iniciando en los días como se indica en la figura. El panel de la izquierda muestra un modelo de tumor pancreático inyectado tres veces por semana con la presente invención a 1 mg/kg o del vehículo control. Este experimento es representativo de dos realizados con células BxPC-3 y de dos realizado con células AsPC-1. A la derecha tres paneles muestran un modelo de tumor pulmonar H460 inyectado con las concentraciones indicadas ya sea una vez por semana (círculos), tres veces por semana (triángulos invertidos) , o cinco veces por semana (triángulos para tratamiento de vehículo y cuadros para el tratamiento de fármaco) . Este experimento es representativo de cuatro realizados con células H460.

La Figura 8 muestra el efecto del tratamiento con la composición farmacéutica de la presente invención en tres tipos de células tumorales y un tipo de células no transformado (MDCK) en 200-300 m ("Tratadas") o tratamiento simulado ("simulación tratada"). Las células se trataron en medios de cultivo de tejido adecuado conteniendo suero al 10% por 48 horas. La extensa muerte de celular por apoptosis o vías de apoptosis similares (ver también Figura 11) en las tres líneas de células de cáncer se observa a través de la metodología descrita en el ejemplo 2. En contraste, las células MDCK no transformadas aparentemente no se afectan por el tratamiento del fármaco en esta dosis.

La Figura 9A muestra los niveles de ATP en células de cáncer pulmonar H460 después del tratamiento con la composición farmacéutica de la presente invención en o por arriba del umbral letal (200 m en suero al 10%) . Las líneas discontinuas representan el tratamiento en las concentraciones indicadas. Las líneas sólidas de textura correspondiente representan el tratamiento durante el tiempo indicado, seguido por el retiro del fármaco y 60 minutos de recuperación en el medio libre de fármaco. Flechas en bloque indican intervalos de recuperación de ATP.

La Figura 9B compara la inhibición de la síntesis de ATP en medios en que el piruvato (en forma de metil-piruvato) es la fuente primaria de carbono (líneas discontinuas) y en la que la glucosa es la fuente primaria de carbono (líneas continuas) . Obsérvese que la composición farmacéutica de la presente invención en última instancia produce muerte celular en las mismas concentraciones de umbral en ambos medios; sin embargo, el temprano agotamiento de los niveles de ATP celulares totales es alto en medios que contiene piruvato y ausente en medios que contiene glucosa. También, la aparición de muerte celular es más rápida en concentración de 300 m que la de fármaco de 200 m.

La Figura 9C compara la composición farmacéutica de la inhibición de la presente invención de la síntesis de ATP en células de cáncer de mama SK-Br-3 y células de mama normal HMEC . En contraste con los experimentos cuyos resultados se representan en las Figuras 6A y 6B, estos experimentos se realizaron en medio libre de suero (MEBM) . Como resultado, el umbral letal del fármaco es menor, aproximadamente 50 m. Obsérvese que la pequeña depresión en los niveles de ATP en las muestras de células normales de 22 horas no está relacionada con la dosis del fármaco y refleja la variación experimental normal.

La Figura 9D compara la inhibición de la síntesis de ATP en las células de cáncer pulmonar H460 por la composición farmacéutica de la presente invención (gráfica izquierda), ácido lipóico (gráfica central) y una forma inactiva de la presente invención (gráfica derecha) . Como en la Figura 9C, estos experimentos se realizan en medio libre de suero para que umbral letal del fármaco es aproximadamente de 50 m.

La Figura 10 ilustra los efectos de la composición farmacéutica de la presente invención (en 400 m en DMEM con suero al 10%) en niveles mitocondriales de células tumorales de las actividades enzimáticas (PDC) y ( KDH) de PDH. Obsérvese que PDH se inhibe fuertemente mientras KDH no lo hace. Los niveles de actividad enzimática se miden en extractos de las mitocondrias purificadas utilizando la reducción de resazurina en respuesta a la fuente de carbono adicional, como se describe en el Ejemplo 2. La linea de fondo corresponde a la reducción de resazurina en ausencia de la fuente de carbono agregada.

A continuación, en la Figura 11A, el análisis Westwrn de geles bidimensionales de extractos de las células de cáncer pulmonar H460 tratados (+) o simulados tratadas (-) se realizaron con la composición farmacéutica de la presente invención (a 400 m durante 120 minutos en medio RPMI con suero al 10%). Las transferencias Western se probaron con un cóctel de anticuerpos monoclonales contra subunidades El y - - E2 del complejo PDH. Las transferencias Western se alineen en E2. Obsérvense los niveles sustancialmente mayores de hiper-fosforilación y los niveles reducidos de formas de hipo-fosforilación de El en la muestra tratada con fármaco. La linea blanca vertical ilustra uno de los criterios para alinear los geles, la movilidad de la subunidad E2. La linea blanca vertical derecha pasa a través de la forma El menos fosforilada, el componente presumiblemente activo de manera enzimática .

Figura 11B muestra amplificaciones de muestras de gel bidimensional en pares tratados y tratados simulados con la composición farmacéutica de la presente invención. El elemento A es una amplificación de una porción de la Figura 8Á. El elemento B es células de cáncer de mama SK-Br-3 tratadas simuladas (-) y tratados (+) durante 180 minutos con 80 m de la composición en medio de célula epitelial de mama MEBM libres de suero. El elemento C es células de cáncer de mama SK-Br-3 tratadas simuladas (-) y tratados (+) durante 240 minutos con 80 m de la composición en medio de célula epitelial de mama libre de suero MEBM. El elemento D es células epiteliales de la mama normal HMEC tratadas simuladas (-) y tratados (+) durante 240 minutos con 80 m de la composición en medio de célula epitelial de mama libre de suero MEBM. La linea blanca vertical pasa a través de la forma El menos fosforilado, el componente presumiblemente activo de manera enzimática.

Las Figuras 12A y 12b representan una hipótesis de trabajo para los efectos anticancerigenos fuertes y selectivos de la composición farmacéutica de la presente invención in vivo. La Figura 12A, por ejemplo, muestra la función reguladora de PDKs según se modulada por el lipoato endógeno covalentemente unido a la subunidad de PDC E2. PDKs normalmente inactivar el PDC en respuesta a los altos niveles de lipoato reducido y/o acetilado, un proceso que se modifica aparentemente de manera sustancial en las células tumorales.

Simultáneamente, la Figura 12B muestra la gran diferencia cuantitativa en la relación del PDK a su sustrato PDC-E1 en el PDC, considerado para distinguir las células normales y tumorales in vivo. En las células normales el bajo nivel del PDK se considera que "camina" de la mano (a través de sus dos subunidades diméricas) alrededor del complejo PDH, fosforilando gradualmente El. Esta fosforilación está en equilibrio estacionario con la desfosforilación de PDP (no representada) . En la hipótesis de trabajo diagramada en la presente, los tioctanos estimular PDKs a través de los mismos lugares que normalmente enlazan acetil-lipoato y/o dihidrolipoato, estimulando artificialmente asi una o más isoformas PDK para inactivar. En células cancerosas, los niveles mucho más altos de PDK podrían hacer esta estimulación por tioctanos mucho más efectiva en el cierre de la actividad enzimática de PDC y del metabolismo energético mitocondrial.

Se proporcionan los siguientes ejemplos no limitantes para facilitar la comprensión de las composiciones farmacéuticas de la presente invención.

EJEMPLO 1 SÍNTESIS QUÍMICA DE TIOCTANOS Se sintetizaron los derivados del ácido lipóico (i.e., tioctanos) CPI-613 y CPI-157 utilizando un procedimiento modificado descrito en US 6,331,559 Bl y US 6,951,887 B2 con ácido 6, 8-bismercaptooctanoico como el material de inicio. El tioctan CPI-045 se sintetizó como se describe en US 6,331,559 Bl .

A continuación se encuentran los análisis de la estructura de los tres tioctanos. Las múltiples síntesis independientes de CPI-045 y CPI-613 fueron indistinguibles en sus propiedades anti-cancerígenas . La pureza de CPI-613 utilizado en el xenoinjerto (Figura 7) y las mediciones de ATP (Figura 9) era más del 99%. Todos los otros preparativos fueron mayores que 98% de pureza.

CPI-613: Ácido 6, 8-bis-bencilsulfaniloctánoico : sólido blanco cristalino, m.p. 65-66°C (lit.1 67.5-69°); XH-NMR (250 MHz, CDCI3) : d 7.15-7.4 (m, 10H) , 3.66 (s, 2H) , 3.64 (s, 2H) , 2.52-2.62 (m, 1H) , 2.50 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.29 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.2-1.8 (m, 8H) ; 1C-N R (62.9 MHz, - - CDC13) : d 179.6, 138.6, 138.5, 128.9, 128.8, 128.5, 128.4, 126.9, 44.1, 36.4, 35.1, 34.4, 33.8, 28.7, 26.0, 24.4.

CPI-157: Ácido 6, 8-bis-etilsulfaniloctánoico : aceite incoloro; TLC (EtAc : Hexanos : HAc, 200:200:1 v/v) : Rf = 0.60; 1H-NMR (300 MHz, CDC13) : d 2.64-2.76 (m, 1H) , 2.65 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 2.52 (q, J = 7.5 Hz, 2H) , 2.49 (q, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H) , 1.40-1.85 (m, 8H) , 1.25 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.22 (t, J = 7.5 Hz, 3H) ; 13C-NMR (75 MHz, CDC13) : d 180.0, 44.3, 34.6, 33.9, 28.9, 26.2, 25.9, 24.5, 24.2, 14.9, 14.7; IR (film): 2963, 1708, 1449, 1423, 1283, 1263 cm"1.

CPI-045: ácido 6, 8-bis-benzoilsulfaniloctánoico : aceite incoloro, viscoso; TLC (Hexanos : EtAc : HAc, 100:50:1 v/v): Rf = 0.30; 1H-NMR (250 MHz, CDC13) : d 7.9-8.1 (m, 4H) , 7.38-7.60 (m, 6H) , 3.8-4.0 (m, 1H) , 3.0-3.3 (m, 2H) , 2.34 (t, J = 7.1 Hz, 2H) , 1.4-2.2 (m, 8H) ; 13C-NMR (62.9 MHz, CDC13): d 191.7, 191.5, 179.7, 137.0, 136.9, 133.3, 128.5, 127.3, 127.1, 43.6, 35.0, 34.6, 33.8, 26.4, 26.2, 24.3; IR (film): 2973, 1710, 1704, 1667, 1665, 1662, 1448, 1207, 1175, 911, 773, 757, 733, 688, 648 cm"1 EJEMPLO 2 MÉTODOS UTILIZADOS PARA DETERMINAR LOS EFECTOS ANTICANCEROSOS DE TIOCTAN Células: Las lineas de células tumorales humanas se obtuvieron de ATCC y se propagaron de acuerdo con las - - recomendaciones de ATCC. Las células primarias humanas de Células Epiteliales de Mama (HMEC) , Células Epiteliales de de Vías Aéreas Pequeñas (SAEC) y los Queratinocitos Epiteliales Humanos Normales (NHEK) se obtuvieron de LONZA Walkersville, Inc (Walkersville, MD) . Cada linea celular se mantuvo y propagó en medios apropiados desarrollado y adquiridos del proveedor de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los experimentos reportados en la presente utilizan células normales en el paso tres a seis.

Estudios de inhibición de crecimiento tumoral: Ratones hembra CDl-Nu/Nu se implantaron con células tumorales pancreático humanas BxPC-3 o AsPC-1 o H460 CPCNP por inyección subcutánea de (SC) . Aproximadamente 8-12 días después los ratones se inyectan por vía intraperitoneal (IP) a dosis y programación, como se indica en la leyenda de la figura. Se inyectó fármaco o vehículo a 2 mi por 25 g de peso corporal. La concentración aprox. del fármaco se 1.25 mg/ml (aprox. 3.1 mmol) o menos. El vehículo o solvente consistió de trietanolamina en agua a 25 mmol o menos. El vehículo inyectado en animales tratados simulados siempre se idéntico al del solvente en el cual se inyectó la mayor dosis de fármacos de ese experimento. Los ratones se monitorearon diariamente para la condición física y la mortalidad. El peso corporal y el volumen del tumor se evaluaron diariamente antes del tratamiento y aproximadamente tres veces a la - - semana durante y después del tratamiento. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, fueron la alimentación se ad libitum y se alojaron en la Instalaciones para Animales de la Universidad de Stony Brook de acuerdo con los lineamientos institucionales.

Ensayos de muerte celular: Para la mayoría de las evaluaciones de viabilidad celular se utilizaron ensayos CellTiter-Glo (Promega) a veces no lo suficientemente largos para ser confundido por inhibición temprana de tioctan de la síntesis de ATP. (Figura 9) . En un experimento típico, las células se emplacaron en placas negra de fondo claro, de 96 pozos a 5,000 células por pozo. 18-25 horas más tarde, el medio se reemplazó con el solvente del fármaco conteniendo medio fresco (trietanolamina en agua a 2.8 mmol en medio conteniendo suero y 0.7 mmol en medio libre de suero) o tioctan CPI-613 en el mismo solvente. El ensayo se realizó a 24 o 48 horas después de la adición del fármaco, dependiendo de la dosis de fármaco, según las instrucciones del fabricante .

En algunos casos, las células se emplacaron en placas de 48 pozos a 10, 000 células por pozo y el medio se reemplazó 18-25 horas más tarde con el solvente del fármaco conteniendo medio fresco (— il% concentración final de EtOH) o diferentes concentraciones de tioctan CPI-045 en el mismo solvente. Las células se mantuvieron en solvente o medio conteniendo el fármaco por el resto del experimento. Las placas se inspeccionaron 24, 48 y 72 horas después de la adición del fármaco, y el número de célula se calculó como un porcentaje de confluencia. En estas condiciones, la muerte celular inducida por tioctan es altamente apoptósica a dosis cercanas al umbral, y las estimaciones del número de células son indicadores muy confiables de la muerte. (Figura 10) La integridad de las células restantes a 72 horas, si las hubiere, se probó por la exclusión de azul tripán.

La tabla 2 proporciona datos con respecto a la acción de tioctanos contra células tumorales in vitro. Se enumeran los tumores humanos y de las células humanas primarias se investigaron por sensibilidad a la eliminación por CPI-613 o CPI-045. indica que las células sufrieron apoptosis o muerte celular similar a necrosis a dosis de aproximadamente 200-300 m (en presencia de suero al 10%) y aproximadamente 50 m en medio libre de suero. (Figuras 8 y 9) "—" indica que estas células requieren aproximadamente dosis cinco veces mayor del fármaco para inducir la muerte celular en el medio correspondiente. "nt" indica combinación no probada. Todas las líneas tumorales se analizaron en los medios apropiados con suero al 10%, como se en las células normales de MDCK en la Figura 8. Además, las células humanas primarias HMEC, SAEC, NHKC y líneas de tumor de SK-BR-3, A549 y H460 también se analizaron en los medios idóneos libre de - - suero. Células primarias se inhibieron de contacto y las células transformadas estuvieron en densidades comparables.

Ensayo de ATP: Las células se emplacaron en placas de 96 pozos en 5,000 células por pozo de fondo negro, claro. 18-25 horas más tarde, el medio se reemplazado con el solvente de fármaco conteniendo medio fresco ( trietanolamina) o tioctan (CPI-613 o CPI-157) o ácido lipóico para el intervalo de tiempo y en la concentración del fármaco como se indica. La viabilidad e integridad celular se evaluó por recuperación después del retiro del fármaco por la exclusión de azul tripán. El ATP se medido utilizando análisis de luminiscencia CellTiter-Glo (Promega), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las mediciones se realizaron por duplicado y mostraron alta consistencia. El error estándar de la media varió de 0.1-2% del valor medido. Como resultado, se omitieron las barras de error de la Figura 9. El medio de piruvato de metilo en la Figura 9 consistió en RPMI sin glucosa ( Invitrogen) , complementado con un 10% de suero bovino fetal dializado, 5mmol HEPES (pH 7.4) y metilpiruvato lOmmol ( Sigma-Aldrich) y el medio de glucosa coincidente se RPMI convencional (Invitrogen).

Análisis enzimático PDH . y KDH: Las células tumorales se desarrollaron hasta la confluencia de 80% en placas de 15 cm y se trataron con CPI-613, como se indica. Las mitocondrias se aislaron de acuerdo con el método de Moreadith y Fiskum.1 Las mitocondrias se Usaron en maltosida de lauril de 0.4%. 50µ1 de lisado mitocondrial se agregó a placas de 96 pozos. 50 µ? de la mezcla de reacción (50 mmol Tris, pH 7.5, 2 mmol -NAD+, 225uMv TPP, 2 mmol piruvato o -cetoglutarato, 150µ coenzima ?, 2.6 mmol cisterna,' 1 mmol MgCl2) se añadió al lisado mitocondrial,' y la mezcla se incubó durante 45 minutos a 37 °C. En este momento, resazurina de 15µ? y 0.5U/ml de diaforasa se agregó a la mezcla y se incubó durante otros cinco minutos. La producción de NADH se monitoreó al medir la fluorescencia utilizando una longitud de onda de excitación de 530nm y una longitud de onda de emisión de 590nm en un lector de microplaca (Fluorostar) . Todas las mediciones se realizaron por duplicado y mostraron alta consistencia. El error estándar de la media varió de 0.3-4% del valor medido. Como resultado, barras de error se omitieron de la Figura 10.

Fosforilación El : Lisados celulares para geles de 2-D: Las células se cultivan a confluencia de 95% en platos de 60 mm y trataron con fármaco o disolvente, según se indica. Las células se succiona in situ con amortiguador de lisis de 450 µ? A [solubilizador de proteina 455µ1 zoom 2D 1 (Invitrogen) , 2.5µ1 1M Tris base, cóctel inhibidor de la proteasa 5µ1 100X, (mínimo completo, libre de EDTA, Roche) ; 5µ1 2M TDT] . El lisado celular se transferido a tubos de microfuga de 1.5 mi - - y se sónico sobre hielo durante 15 pases a 50% de potencia. Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, se agregaron 2.5µ1 de dimetilacrilamida (DMA, Sigma-Aldrich) , y SE incubaron los Usados durante 10 minutos adicionales. Se agregaron 5µ1 de TDT 2M para neutralizar el exceso de DMA. Los lisados se centrifugaron a ?ß,???? g durante 15 minutos. geles 2-D: Se utilizó un sistema de proteómicos Zoom Benchtop (Invitrogen) de acuerdo con las directrices del fabricante. Brevemente, se mezclaron 30-50µ1 de lisado con anfolitos 0.8µ1 pH 3-10, 0.75µ1 2 M TDT y se llevaron hasta 150 µ? con solubilizador de proteina 1 Zoom 2D. Se cargaron 150µ1 de muestra en corredera IPG, y se agregaron tiras de pH 3-10NL IPG. Las tiras se remojaron durante la noche a temperatura ambiente. Se utilizó un protocolo de etapa para enfoque isoeléctrico (250V, 20 minutos; 450V, 15 min; 750V, 15 minutos; 2000V, 30 minutos) . Las tiras se trataron durante 15 minutos en amortiguador de carga IX, seguido por 15 minutos en amortiguador de carga IX más ácido yodoacétatico 150 mM. Las tiras se electroforaron en geles NuPAGE de 4-12% Bis Tris ZOOM (Invitrogen) .

Tabla 2: Efectos de tioctanos contra tumor y células primarias in vitro glioblastoma cerebral U-87 MG + + glioblastoma cerebral LN-229 + nt élldéll Ct Caseumoruasu adenocarcinoma de mama SK-Br-3 + + iiasprmar adenocarcinoma de mama MCF7 nt + osteosarcoma de hueso Saos-2 nt + adenocarcinoma cervical HeLa + + adenocarcinoma colorrectal SW480 nt + carcinoma hepatocelular Hep G2 + + carcinoma de riñon A-498 + nt carcinoma de pulmón ?459 + + carcinoma de pulmón H460 + + rabdomiosarcoma de músculo RD nt + carcinoma de ovario SKOV-3 + nt adenocarcinoma pancreático AsPC-1 + nt adenocarcinoma pancreático BxPC-3 + nt carcinoma de próstata LnCaP nt + sarcoma uterino Mes SA + + sarcoma uterino, MDR Mes-SA/dx5 + + células epiteliales mamarias HMEC — — células epiteliales de vías aéreas SAEC nt pequeñas queratinocitos NHKC nt — Westerns: Las proteínas se borraron en membranas PVDF 4.5µp?. Se detectaron El y E2 de PDH utilizando mAbs ( Invitrogen) .

Desdoblamiento de caspasa-3 y PARP: Se detectó caspasa-3 desdoblada en inmunoanálisis Western de acuerdo con a Roy y Nicholson.2 Brevemente, después de exfoliar las células tratadas con fármaco o solvente y la mezcla de medio/célula/cuerpos apoptóticos se centrifugaron a 6000x g. Los gránulos se Usaron con solución amortiguadora de lisis C (4 M urea, glicerol al 10%, SDS al 2%, 0.003% BPB; 2-mercaptoetanol al 5%) . Se cargaron 30 g de lisado total de proteínas por pozo en geles Bis-Tris de 12%. Las proteínas se inmunoensayaron en membranas PVDF 4.5µp?. La caspasa-3 pro y activa se detectó con mAb anti-caspasa-3 (ratón monocolonal [31A1067]; abcam) . Se detectó el desdoblamiento de PARP utilizando anticuerpos de polimerasa (ADP-ribosa) anti-poli monoclonal, clon C-2-10 (Sigma-Aldrich) .

Detección de CA+2 mitocondrial : Se sembraron células en placas de fondo de vidrio de 35 mm (BD Biosciences) en 3xl05, desarrolladas durante la noche y se trataron con fármaco o disolvente, como se indica. Las células se cargaron entonces con tinte de calcio Fluo-4, X-Rhod-1 o Rhod-2 (4 µ?, Invitrogen) en medios libres de rojo de fenol y se incubaron en 37 °C durante 10 minutos. Las células se lavaron de una vez con PBS, y se capturaron imágenes utilizando un microscopio de deconvolución Axiovert 200M, (Zeiss) en un tiempo de exposición fijo, utilizando el filtro FITC. La cuantificación de fluorescencia se realizó utilizando el software proporcionado por el fabricante. X-Rhod-1 y Rhod-2 dieron resultados similares (Figura 13), indicando que estos colorantes fueron mediciones de signal3"4 - - de Ca+2 mitocondrial .

Referencias : 1. Moreadith RW y G. Fiskum Aislamiento de Mitocondrias de Células de Tumor de Ascitis, Permeabilizado con Digitonina. Analytical Biochemistry 137, 360-367 (1984). 2. Roy S y Nicholson DW. Criterios para identificar los sustratos de caspasa auténtica durante la apoptosis. Apoptosis 322,110-125 (2000). 3. Gerencser AA y Adam-Vizi V. Imágenes de fluorescencia de alta resolución, selectiva de concentración de Ca2+ mitocondrial. Calcio Celular 30, 311-321 (2001) . 4. Gyorgy H, Gyorgy C, Das S, Garcia-Perez C, Saotome M, Roy SS y Yi MQ. Señalización de calcio mitocondrial y muerte celular: criterios para valorar la función de absorción de Ca2+ mitocondrial en la apoptosis. Cell Calcium 40, 553-560 (2006).

EJEMPLO 3 TIOCTANOS PERTURB MEMBRANA MITOCONDRIAL POTENCIAL DE Y DE CA+2 ABSORCIÓN Los efectos del sustrato sobre la inhibición por tioctan de la síntesis de ATP (Figura 9) indican que el fármaco interfiere con el ciclo TCA en la matriz mitocondrial. Si este es el caso, anticipamos que el potential1 de membrana mitocondrial podría verse comprometido en dosis umbral letal y categorías superiores. Utilizando el - - colorante TMRE sensible al potencial observamos el efecto esperado. (Figura 13) El potencial de la membrana mitocondrial disminuye rápidamente con el inicio del tratamiento farmacológico. Las cinéticas de disminución del potencial de membrana son muy similares a la pérdida de la síntesis de ATP en presencia de sustratos mitocondriales . (Figura 9) Agotamiento de ATP en las mitocondrias se conoce para provocar una respuesta homeostática que incluye la absorción de CA+2 liberado de depósitos citoplasmáticos, incluyendo el retículo.2 endoplásmico . Además, la importación de este CA+2 en la matriz mitocondrial se considera que requiere el potencial de la membrana mitocondrial. Por lo tanto, anticipamos que el tratamiento de tioctan en o por arriba del umbral letal puede producir una liberación citoplasmática sostenida del CA+2 con absorción mitocondrial transitoria de los iones en vista del potencial de membrana progresivamente comprometido. Utilizando X-Rhod-1 y Rhod-2 para medir Ca+2 mitocondrial y Fluo-4 para medir Ca+2 citoplasmático, observamos estos efectos esperados. (Figura 13) Por aproximadamente dos horas a dosis de CPI y ligeramente por arriba del umbral letal (comparar Figuras 9 y 13), a medida que el potencial membrana mitocondrial declina, esto transitorio Ca+2 mitocondrial inicial decae. Después de 4 a 6 horas por un segundo gran pico de Ca+2 mitocondrial presumiblemente se asocia con el inicio de las trayectorias3 de muerte de célula dependiente de calcio.

Referencias : 1. Garrett R y Grisham CM. Biochemistry. Thomson Brooks/Cole, Southbank, Vic, Australia; Belmont, CA. (2007). 2. Graier WF, Frieden M, y Malli R. Señalización de mitocondrias y Ca2+: viejos huéspedes, nuevas funciones. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology 455, 375-396 (2007) . 3. Gyorgy H, Gyorgy C, Das S, Garcia-Perez C, Saotome M, Roy SS y Yi MQ. Señalización de calcio mitocondrial y muerte celular: criterios para valorar la función de absorción de Ca2+ mitocondrial en la apoptosis. Cell Calcium 40, 553-560 (2006) .

EJEMPLO 4 TIOCTANOS INDUCE DIVERSOS PROGRAMAS DE MUERTE CELULAR La reducción en el metabolismo de energía mitocondrial se conoce por correlacionarse con la decisión de introducir una trayectoria de muerte celular en algunas circunstancias, aunque los mecanismos detallados permanecen sin comprenderse-1"3 completamente. En dosis de tioctan por arriba del umbral pero dentro de ~2 veces esta dosis mínima de eliminación, todos los tipos de células cancerígenas probados experimentan la muerte celular morfológicamente similar a apoptosis predominantemente. (Figura 8) La muerte apoptótica se confirmada bajo estas condiciones por inmunotinción convencional Annexin y ensayos de etiquetado final de ADN de TUNEL (resultados no mostrados) .

A dosis mayores de fármaco (más de ~~ 2 veces el umbral) , los tioctanos activos inducir la muerte celular (como se valora por ensayos de viabilidad en re-cultivo en placas y exclusión de azul tripán o propidio) sin correlacionar la morfológica de la apoptosis, sugiriendo una trayectoria similar a necrosis (resultados no mostrados) .

Estos datos confirman que el metabolismo de energía mitocondrial por inhibición de tioctan CPI-613 se correlaciona de manera precisa con la inducción de muerte celular .

Es sorprendente la observación de que diversas células tumorales, se sabe o se presume que contienen mutaciones de inactivación para distintos trayectorias4 de diversas muertes celulares y son eliminadas en dosis muy similares de tioctan (Figura 8 y Tabla 2) . Esta observación sugiere que este fármaco induce una señal maestra que es capaz de emplear múltiples trayectorias5 de ejecución, potencialmente redundantes de muerte celular a distancia.

Consistente con esta posibilidad, encontramos que el inhibidor genérico de caspasa Z-VAD-FMK sutilmente altera la morfología de la muerte celular en células tratadas con - - tioctan, pero no tiene ningún efecto perceptible en la dosis umbral letal del fármaco.

Para probar aún más la posibilidad de que la muerte celular inducida por tioctan puede proceder a través de múltiples mecanismos de ejecución terminal examinamos el desdoblamiento de caspasa-3 y PARP-1, diagnóstico de distintas trayectorias5 de muerte celular. Encontramos que ambos tioctanos CPI-613 y CPI-045 inducen a niveles altamente variables de estos eventos de desdoblamiento en diferentes células. (Figura 14) Colectivamente, estos resultados indican que los tioctanos son capaces de inducir un compromiso estratégico para la eliminación que, dependiendo de la dosis del fármaco y tipo de células, es independiente sobre la ejecución táctica, terminal de esa decisión.

Referencias : 1. Watabe M y Nakaki T. El agotamiento de ATP no cuenta para la apoptosis inducida por la inhibición de la cadena de transporte de electrones mitocondrial en las células dopaminérgicas humanas. Neuropharmacology 52, 536-541 (2007). 2. Yuneva M, Zamboni N, Oefner P, Sachidanandam R y Lazebnik Y. La deficiencia de glutamina pero no de glucosa induce apoptosis dependientes de MYC en células humanas. Journal of Cell Biology 178, 93-105 (2007) . - - 3. Skulachev VP. Aspectos bioenergéticos de apoptosis, necrosis y mitoptosis. Apoptosis 11, 473-485 (2006) . 4. Johnstone R , Ruefli AA y Lowe SW. Apoptosis: Un enlace entre la genética del cáncer y quimioterapia. Cell 108, 153-164 (2002) . 5. Cregan SP, Dawson VL y Slack RS . Función de AIF en muerte celular dependientes de caspasa e independiente de caspasa. Oncogene 23, 2785-2796 (2004) .

EJEMPLO 5 ESTRUCTtJRAS ANÁLOGAS DE DERIVADOS DE ÁCIDO LIPÓICO Varios ejemplos no limitantes de análogos de derivados de ácido lipóico se han fabricados y se presentan a continuación - - La exposición anterior revela y describe modalidades solamente ejemplares de la presente invención. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente de tal exposición y de las reivindicaciones acompañantes, que pueden hacerse varios cambios, modificaciones y variaciones en ésta sin apartarse del espíritu y alcance de la invención como se define en las siguientes reivindicaciones. Además, mientras las modalidades ejemplares se han expresado en la presente, - - otros practicadas en la técnica pueden percatarse de otros diseños o usos de la presente invención. Asi, aunque la presente invención se ha descrito en relación con modalidades ejemplares de la misma, se entenderá que muchas modificaciones en el diseño y uso serán evidentes para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica, y esta aplicación se pretende que cubra cualquier adaptación o variación de las mismas. Por lo tanto, se pretende de manera manifiesta que esta invención se limite sólo por las reivindicaciones y los equivalentes de las mismas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un modulador farmacéuticamente aceptable del estado de fosforilación de al menos un enzima y/o complejo enzimático, o subunidad de los mismos, en las mitocondrias de células enfermas de animales de sangre caliente, incluyendo humanos, en donde el modulador se selecciona del grupo que consiste de: en donde Ri y R2 se seleccionan independiente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo CnH2n+: alqueno CnH2r alquenilo CnH2n-i, alquino CnH2n i, alquinilo CnH2n-3, sulfuro de alquilo CH3 (CH2) n-S-, bisulfuro alquilo CH3CHt—S—S—, éster tiocarbámico (CH2)nC NH—, y semitioacetal CH3CH(OH)—S—, en donde n es 1-10 y t es 0-9, aromáticos, acilo definido como R4C(0)-, heteroarilo, imidoilo, definido como R5C(=NH)-, arilo organometálico, alquilo-arilo organometálico, semiacetal RgCH(OH)-S-, aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, lipidos y multimeros y combinaciones de los mismos; en donde Ri y R2 pueden ser no sustituidos o sustituidos; en donde R3 se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, lipidos y multimeros de los mismos. en donde R se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquenilo, alquinilo, alquilarilo, heteroarilo, alquilheteroarilo y arilo organometálico, cualquiera de los cuales puede ser sustituido o no sustituido; en donde R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, heteroarilo y alquilheteroarilo, cualquiera de los cuales puede ser sustituido o no sustituido; en donde R6 es CC13, CF3 o COOH; y en donde x es 0-16; metabolitos del mismo; o sales del mismo (II) en donde M es un enlace covalente, - [C (Ri) (R2) ] z~ , un quelato de metal u otro complejo de metal en donde el metal no es paladio; en donde Ri y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, acilo R4C(0)-, alquilo CnH2n+i, alquenilo definido como CraH2m-i, alquinilo definido como CmH2m_3, arilo, heteroarilo, sulfuro de alquilo (¾(<¾) n-S-, imidoilo, definido como R4C(=NH)-, hemiacetal definido como R6CH(0H)-S-, aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, lipidos y multimeros y combinaciones de los mismos ; en donde Ri y í pueden ser no sustituidos o sustituidos ; en donde R3 se selecciona de un grupo que consiste de los aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, lipidos y multimeros de los mismos; en donde R y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, alquilarilo, heteroarilo y heterociclilo, cualquiera de los cuales puede ser sustituido o no sustituido; en donde R5 se selecciona del grupo que consiste de CCI3, CF3 o COOH; y en donde x es 0-16, z es 0-5, n es 0-10 y m es 2- 10; metabolitos de los mismos; o sales de los mismos.

2. El modulador de reivindicación 1, en donde la modulación comprende fosforilación reversible o desfosforilación .

3. El modulador de reivindicación 2, en donde la fosforilación reversible o desfosforilación se produce en una cinasa, fosfatasa, y/o deshidrogenasa de una enzima o complejo enzimático o subunidad de los mismos.

4. El modulador de reivindicación 3, en donde el modulador promueve o inhibe la actividad de la cinasa.

5. El modulador de reivindicación 4, en donde la cinasa se selecciona de un grupo que comprende piruvato deshidrogenasa cinasa (PDK)l, PDK2, PDK3 , PDK4 y sus isoformas de cada una.

6. El modulador de reivindicación 3, en donde el modulador promueve o inhibe la actividad fosfatasa.

7. El modulador de reivindicación 6, en donde la fosfatasa se selecciona de un grupo que comprende piruvato deshidrogenasa fosfatasa (PDP)l, PDP2 y sus isoformas de cada una .

8. El modulador de reivindicación 3, en donde el modulador promueve o inhibe la actividad deshidrogenasa.

9. El modulador de reivindicación 2, en donde se produce la fosforilación reversible o desfosforilación en el complejo piruvato deshidrogenasa (PDH) .

10. El modulador de reivindicación 9, en donde se produce la modulación en la subunidad El del complejo PDH.

11. El modulador de reivindicación 10, en donde se produce la modulación por inactivación de PDP y sus isoformas y formas mutantes.

12. El modulador de reivindicación 11, en donde se produce la inactivación de PDP por la supresión de la expresión de PDP.

13. El modulador de reivindicación 10, en donde la modulación se produce mediante la activación del PDK y sus isoformas y formas mutantes.

14. El modulador de reivindicación 1, en donde las células enfermas muestran sensibilidad o insensibilidad al tratamiento con el modulador de la reivindicación 1.

15. El modulador de reivindicación 14, en donde las células enfermas insensibles al tratamiento pueden inducirse para expresar al menos una enzima o complejo enzimático modificado o subunidad de los mismos, a fin de volverlas sensibles al tratamiento.

16. El modulador de reivindicación 15, en donde la expresión se induce por manipulación genética.

17. El modulador de reivindicación 16, en donde la inducción se logra mediante manipulación transcripcional .

18. El modulador de reivindicación 16, en donde la inducción se logra mediante la manipulación de la traducción.

19. El modulador de reivindicación 16, en donde la inducción se logra mediante la manipulación post-traducción .

20. El modulador de reivindicación 15, en donde la expresión se induce por manipulación epigenética.

21. El modulador de reivindicación 15, en donde la expresión se induce por manipulación fenotipica.

22. El modulador de reivindicación 14, en donde las células enfermas expresan al menos una enzima o complejo enzimático modificado en el tratamiento con el modulador de la reivindicación 1.

23. El modulador de reivindicación 1, en donde el modulador afecta el nivel de expresión del PDK y sus isoformas y formas mutantes.

24. El modulador de reivindicación 1, en donde el modulador afecta el nivel de expresión del PDP y sus isoformas y formas mutantes.

25. El modulador de reivindicación 23 o 24, en donde se modifica el nivel de expresión al nivel de transcripción, traducción o post-traducción .

26. El modulador de reivindicación 25, en donde la modificación es epigenética.

27. El modulador de reivindicación 9, en donde el modulador inhibe la creación de metabolitos tóxicos.

28. El modulador de reivindicación 9, en donde el modulador promueve la desintoxicación de metabolitos tóxicos.

29. El modulador de las reivindicaciones 27 o 28, en donde los metabolitos se seleccionan de un grupo que consiste de acetaldehído, superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo.

30. El modulador de reivindicación 28, en donde se observa el efecto de modulación por la disminución en la producción de acetoina.

31. El modulador de reivindicación 9, en donde la fosforilación reversible o desfosforilación se convierte en irreversible .

32. El modulador de reivindicación 31, en donde el efecto de la fosforilación o desfosforilación da como resultado la muerte celular.

33. El modulador de reivindicación 32, en donde el efecto es la apoptosis.

34. El modulador de reivindicación 32, en donde el efecto es la necrosis.

35. El modulador de reivindicación 1, en donde el modulador se utiliza en el tratamiento y diagnóstico de una enfermedad, condición o síndrome, o sus síntomas, los cuales incluyen una alteración del estado de fosforilación de al menos un enzima y/o complejo enzimático o subunidad de los mismos .

36. El modulador de reivindicación 35, en donde el al menos un complejo enzimático es el complejo PDH.

37. El modulador de reivindicación 35, en donde la enfermedad, condición o síndrome se caracteriza además por la hiperproliferación celular.

38. El modulador de reivindicación 37, en donde la enfermedad, condición o síndrome es cáncer.

39. Un método para modular al menos un enzima y/o complejo enzimático o subunidad de estos, en un paciente que presenta una enfermedad, condición o síndrome que incluye una alteración del estado de fosforilación de al menos una enzima y/o complejo enzimático, o subunidad de los mismos, que comprende la administración de una cantidad efectiva del modulador de reivindicación 1.

40. El método de reivindicación 39, en donde al menos un complejo enzimático es el complejo PDH.

41. El método de reivindicación 39, en donde la enfermedad, condición o síndrome se caracteriza además por la hiperproliferación celular.

42. El método de reivindicación 41, en donde la enfermedad, condición o síndrome es cáncer.

43. Un método de diagnóstico y predicción para beneficio de un paciente que presenta síntomas de una enfermedad, condición o síndrome que incluye la alteración del estado de fosforilación de al menos una enzima y/o complejo enzimático o subunidad de éstos, que comprende obtener una muestra de células del paciente, administrar una cantidad efectiva del modulador de reivindicación 1 a las células in vitro y obtener los resultados derivados de esto.

44. El método de reivindicación 43, en donde al menos un complejo enzimático es el complejo PDH.

45. El método de reivindicación 43, en donde la enfermedad, condición o síndrome se caracteriza además por la hiperproliferación celular.

46. El método de reivindicación 45, en donde la enfermedad, condición o síndrome es cáncer.