MX2008002596A - Proceso para la preparacion de interferon beta glicosilado. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un proceso para la produccion de interferon beta, y a una composicion de interferon beta que tiene un patron de glicosilacion unico.

Description

PROCESO PARA LA PREPARACIÓN DE INTERFERON BETA GLICOSILADO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los procesos para producir interferón beta humano recombinante bajo condiciones de cultivo libres de suero, procesos de purificación de interferón beta humano recombinante y a una proteína interferón beta que tiene un patrón de glicosilación único.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas se han vuelto comercialmente importantes como fármacos que también son llamados generalmente "biológicos". Uno de los mayores desafíos es el desarrollo de costo efectivo y procesos eficientes para la producción de proteínas recombinantes en una escala comercial. La industria de la biotecnología hace un amplio uso de células de mamíferos para la fabricación de glicoproteínas recombinantes para terapia humana. Las células adecuadas que se usan ampliamente para la producción de polipéptidos resultaron ser células de hámster chino (CHO) . Las células CHO se cultivaron primero por Puck (1958) de una biopsia de un ovario de un hámster chino hembra. De estas células originales un número de sub-líneas se prepararon con varias características. Una de estas líneas celulares CHO, Ref.: 189980 CH0-K1, requiere prolina y es diploide para el gen de reductasa de dihidrofolato (DHFR) . Otra línea celular derivada de esta línea celular es una línea celular CHO deficiente de DHFR (CHO DUK Bll) (PNAS 77, 1980, 4216-4220), la cual se caracteriza por la pérdida de función DHFR como una consecuencia de una mutación en un gen DHFR y la pérdida posterior del otro gen. Las células adicionales que se usan frecuentemente para la producción de proteínas destinadas para la administración a humanos son líneas celulares humanas tales como la línea celular de fibrosarcoma humana HT1080 o la línea celular de riñon embriónica humana 293, una línea celular derivada del retinoblasto embriónica humana tal como por ejemplo PER.C6, una línea celular derivada de la célula amniótica o una línea celular derivada de las neuronas. Las células de una línea celular adecuada son transfectadas establemente con un vector de expresión que comprende la secuencia codificada de la proteína de interés para ser producida, junto con la secuencia reguladora tal como promotores, aumentadores, o señales polyA que aseguran la expresión estable y correcta de la proteína de interés. Los genes adicionales que usualmente se presentan en los vectores de expresión son genes marcadores tales como por ejemplo marcadores de selecciones positivas (por ejemplo gen neo) que selecciona las células establemente transfectadas de las células transfectadas transitoriamente y no transfectadas. Los genes amplifiables tales como el gen DHFR se usan para la amplificación de las secuencias codificadas. Una vez que el clon que expresa la proteína de interés se ha establecido, un proceso de fabricación a partir de este clon debe establecerse para permitir la producción en altas cantidades y de calidad tal como se requiere para proteínas destinadas para administración humana. Tales procesos de fabricación son generalmente llevados a cabo en bioreactores . Hay diferentes modos de operación. Actualmente, los cultivos de perfusión y alimentados por lote son los dos modos dominantes de operación industrial para los procesos de cultivo de células mamíferas que requieren cantidades grandes de proteínas (Hu and Aunins 1997). Cualquier que sea la tecnología de producción de elección, se desarrollan esfuerzos que tienen por objeto la obtención de procesos de producción que garanticen alta productividad volumétrica, consistencia lote a lote, calidad de producto homogénea a bajo costo. La decisión entre modo de producción de perfusión o alimentados por lotes es dictada principalmente por la biología del clon y de la propiedad del producto, y se da en una base caso por caso durante el curso del desarrollo de un producto de fármaco nuevo (Kadouri and Spier 1997). Cuando la selección es un proceso de perfusión, uno de los sistemas de cultivo de elección es bioreactor de lecho empaquetado estacionariamente en el cual las células se inmovilizan en portadores sólidos. Este sistema es fácil de operar y con portadores y condiciones de cultivo apropiadas pudiendo lograr una densidad celular muy alta (de - 107— 108 célula-ml-1) . Una consecuencia de esta alta densidad celular es la necesidad para una relación de perfusión media intensiva (alimentación y cosecha) que deberá usarse con objeto de mantener las células viables y productivas. Parece que la relación de perfusión es uno de los parámetros centrales de tal proceso: conduce la productividad de proteína volumétrica, la calidad del producto de la proteína y tiene un impacto muy fuerte en la economía general del proceso. Para el proceso de cultivo de celular, en el medio de cultivo anterior se complementó con suero, el cual sirve como un nutriente universal para el crecimiento y mantenimiento de todas las líneas celulares del mamífero que producen productos biológicamente activos. El suero contiene hormonas, factores de crecimiento, proteínas portadoras, factores de enlace y difusión, nutrientes, microelementos, etc. Los medios de cultivo usualmente contienen hasta alrededor de 10% de suero animal, tal como suero bovino fetal (FBS), también llamado suero de ternera fetal (FCS) . Aunque se usa ampliamente, el suero tiene muchas limitaciones. Contiene niveles altos de numerosas proteínas que interfieren con las cantidades limitadas de la proteína deseada de interés producida por las células. Estas proteínas derivadas del suero deben separarse del producto durante el proceso en dirección descendente tal como la purificación de la proteína de interés, el cual complica el proceso e incrementa el costo. La llegada del BSE (Encefalopía Espongiforme Bovina) , una enfermedad transmisible neurodegenerativa de ganado con larga latencia o periodo de incubación, ha planteado inquietudes reguladoras acerca de usar suero derivado de animales en la producción de productos biológicamente activos. Hay por lo tanto una gran demanda para el desarrollo de medios de cultivo celular alternativos libres de fuentes animales que apoyan el crecimiento celular y mantienen células durante la producción de productos biológicamente activos. Generalmente, los medios de cultivo de células comprenden muchos componentes de diferentes categorías, tales como aminoácidos, vitaminas, sales, ácidos grasos, y compuestos adicionales: -Aminoácidos: Por ejemplo, US 6,048,728 (Inlow et al.) describe que los siguientes aminoácidos se pueden usar en un medio de cultivo celular: Alanina, Arginina, Ácido aspártico, Cisteína, Ácido glutámico, Glutamina, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, fenialanina, Prolina, Serina, Triptofano, Tirosina, Treonina, y Valina. -Vitaminas: US 2003/0096414 (Ciccarone et al.) o US 5,811 ,299 (Renner et al.) por ejemplo describe que las siguientes vitaminas se pueden usar en un medio de cultivo celular: Biotina, Pantotenato, Cloruro de colina, Ácido fólico, Mio-inositol, Niacinamida, Piridoxina, Riboflavina, Vitamina B12, Tiamina, Putrescina. -Sales: Por ejemplo, US 6,399,381 (Blum et al.) describe un medio que comprende CaCl2, KCl, MgCl2, NaCl, Fosfato de sodio monobásico, Fosfato de sodio dibásico, Selenito de sodio, CuSO-i, ZnCl2. Otro ejemplo para un documento que describe las sales inorgánicas que se pueden usar en un medio de cultivo es US 2003/0153042 (Arnold et al.), que describe un medio que comprende CaCl2, KCl, MgCl2, NaCl, Fosfato de sodio monobásico, Fosfato de sodio dibásico, CuCl2.2H20, ZnCl2. -Ácidos grasos: Los ácidos grasos que se conocen para ser usados en medio son Ácido Araquidónico, Ácido linoleico, Ácido Oleico, Ácido Láurico, Ácido mirístico, así como Metil-beta-Ciclodextrina, ver por ejemplo US 5,045,468 (Darfler) . Debe notarse que la ciclodextrina no es un lípido en sí, pero tiene la capacidad para formar un complejo con lípidos y así se usa para solubilizar lípidos en el medio de cultivo celular.

-Componentes adicionales, en particular usados en la estructura de medio de cultivo celular libre de suero, son compuestos tales como glucosa, glutamina, Na- piruvato, insulina o etanolamina (por ejemplo EP 274 445), o un agente protector tal como Pluronic F68. El Pluronic® F68 (también conocido como Poloxamero 188) es un copólimero de bloqueo de óxido de etileno (EO) y óxido de propileno (PO) . Los "medios básicos" son también conocidos por la persona de habilidad en el arte. Estos medios ya contienen varios de los componentes de medio mencionados anteriormente. Los ejemplos de tales medios que se aplican ampliamente son Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), Medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMl) , o medio Ham. Después de la producción de la proteína de interés en el bioreactor, la proteína de interés necesita ser purificada de la cosecha de cultivo celular. La cosecha de cultivo celular puede por ejemplo ser extractos de células para proteínas intracelular, o sobrenadantes de cultivo celular para proteínas de secreción. Mientras muchos métodos ya están disponibles para preparación de proteínas a gran escala, los productos crudos, tales como cosecha de cultivo celular, contienen no solamente el producto deseado sino también impurezas las cuales son difíciles de separar del producto deseado.

Las autoridades de la salud solicitan altos estándares de pureza para proteínas destinadas para administración humana. Como una dificultad adicional, muchos métodos de purificación pueden contener etapas que requieren aplicación de pH alto o bajo, concentraciones de sal altas u otras condiciones extremas que pueden poner en peligro la actividad biológica de una proteína dada. Así, para cualquier proteína es un desafío para establecer un proceso de purificación permitiendo suficiente pureza mientras se mantiene la actividad biológica de la proteína. Los sistemas de cromatografía de intercambio de iones se han usado ampliamente para la separación de proteínas principales en base a las diferencias en la carga. En la cromatografía de intercambio de ion, parches cargados en la superficie del soluto se atraen por cargas opuestas enlazadas a una matriz de cromatografía, proporcionando que la fuerza iónica de la solución amortiguadora circundante sea baja. La elución generalmente se alcanza al incrementar la fuerza iónica (esto es conductividad) de la solución amortiguadora para competir con el soluto durante los sitios cargados de la matriz de intercambio de ion. Al cambiar el pH y así alterar la carga del soluto, es otro medio para lograr la elución del soluto. El cambio en la conductividad o pH puede ser gradual (gradiente de elución) o por etapas (etapa de elución) . Las resinas que se pueden usar en cromatografía de intercambio de ion pueden contener grupos funcionales diferentes: dietilaminoetilo (DEAE) o dietil- (2-hidroxi-propil) aminoetilo (QAE) tienen cloruro como contador de iones, mientras que carboximetilo (CM) y sulfopropilo (SP) tienen sodio como contador de iones, por ejemplo. Los sistemas de cromatografía que tienen una fase estacionaria hidrofóbica ofrecen una base alternativa para separaciones y también se han empleado ampliamente en la purificación de proteínas. Incluidas en estas categorías están la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) y cromatografía líquida de fase inversa (RPLC) . La base fisicoquímica para la separación por HIC y RPLC es el efecto hidrofóbico, las proteínas se separan en una fase estacionaria hidrofóbica basada en diferencias de hidrofobicidad. La cromatografía de fase inversa es un método de purificación de proteína estrechamente relacionado con HIC, ambos se basan en interacciones entre grupos no polares accesibles al solvente en la superficie de biomoléculas y ligandos hidrofóbicos de la matriz. Sin embargo, los ligandos usados en cromatografía de fase inversa son más altamente substituidos con ligandos hidrofóbicos que con ligandos HIC. Aunque el grado de substitución de absorbentes HIC puede estar en el rango de 10-50 µmoles/mL de matriz de ligandos de arilo C2-C8, varios cientos de µmoles/mL de matriz de ligandos de alquilo C4-C8 se usan usualmente para adsorbentes de cromatografía de fase inversa. La columna Source 30RPC es una matriz de fase inversa polimérica. Se basa en perlas de poliestireno/divinil benceno de 30 micrones de diámetro monotamaño, rígidas. Sus características se pueden resumir como sigue: Rango de pH excepcionalmente amplio (1-12), selectividad alta, resistencia química alta, capacidad alta y resolución alta a relaciones de flujo altos. La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) , también llamada cromatografía de permeación en gel (GPC) , usa partículas porosas para separar moléculas de diferentes tamaños. Generalmente se usa para separar moléculas biológicas y para determinar pesos moleculares y distribuciones de peso molecular de polímeros. Las moléculas que son más pequeñas que el tamaño del poro pueden entrar en las partículas y por lo tanto tienen un camino más largo y un tiempo de tránsito más largo que las moléculas más grandes que no entran en las partículas. Todas las moléculas más grandes que el tamaño del poro no se mantienen y se eluyen en conjunto. Las moléculas que pueden entrar en los poros tienen un tiempo de residencia promedio en las partículas que dependen del tamaño y forma de las moléculas. Las diferentes moléculas por lo tanto tienen tiempos de transito totales diferentes a través de la columna.

La sefarosa azul es una resina cromatográfica basada en una matriz de afinidad ligada del pigmento. El ligando, F3G-A azul de cibacron, es acoplado covalentemente a sepharose™ a través del anillo de clorotriazina (Clonis et al., 1987). La sefarosa azul se ha usado para la purificación de interferón beta (Mory et al., 1981). El interferón beta (interferón-ß o IFN-ß) es una glicoproteína que se presenta naturalmente que pertenece a la clase de citoquinas. Los interferones (IFNs) tienen un rango amplio de actividades biológicas, tales como propiedades antivirales, anti-proliferativas y inmunomoduladoras. Los tres interferones principales se refieren como IFN-alpha, IFN-beta e IFN-gamma. Estos interferones se clasificaron inicialmente de acuerdo a sus células de origen (leucocitos, fibroblastos o células T) . Sin embargo, se puso de manifiesto que varios tipos pueden producirse por una célula. Por lo tanto el interferón de leucocito ahora se llama IFN-alpha, el interferón de fibroblasto es IFN-beta y interferón de célula T es IFN-gamma. También hay un cuarto tipos de interferón, linfoblastoide IFN, producido en la línea celular "Namalwa" (derivado del linfoma Burkitt) , el cual parece producir una mezcla de ambos leucocitos y fibroblasto IFN. El interferón de fibroblasto humano (IFN-beta) tiene actividad antiviral y también se conoce para inhibir la proliferación de células. Es un polipéptido de alrededor de 20,000 Da inducido por virus y ARN de hebras dobles. De la secuencia de nucleótido del gen para interferón de fibroblasto, clonado por tecnología de ADN recombinante, Derynck et al., 1980 deduce la secuencia de aminoácido completa de la proteína, la cual es de 166 aminoácidos de largo. El interferón-ß también se ha clonado. La Patente EU No. 5,326,859 describe la secuencia de ADN de IFN-ß humano y un plásmido para su expresión recombinante en bacterias tales como E. coli. La Patente Europea No. 0 287 075 describe una línea celular CHO (Ovario de Hámster Chino) , transfectada con la secuencia que codifica el interferón-ß y capaz de producir interferón-ß recombinante. La proteína se describe como glicosilada con un oligosacárido biantenario (dos ramificados), con una porción de fucosa sencilla. El interferón beta se han expresado en varias líneas celulares, tales como células CHO, células BHK 21 (células de riñon de crías de hámster) y LTK (L-timidina cinasa negativa de ratón) (Reiser and Hauser, 1987). Las células CHO negativas de DHFR también se han usado para la expresión de interferón beta (Innis and McCormick, 1982), (Chemajovsky et al., 1984).

Los interferones se conocen por ser glicosolados, a menudo con diferentes glicoformas. Por ejemplo, la estructura sacárida de IFN-ß se mostró para incluir una estructura bi-antenaria, presentando un sacárido de fucosa sencillo y sialitación de galactosa terminal (Conradt et al., 1987). La glicosilación se mostró para también ser importante durante la solubilidad, ya que el IFN-ß se precipita después de la desglicosilación con glicopéptidasa F. Además, el IFN-ß producido por E. coli muestra problemas de plegado, debido a la falta de glicosilación en el sistema de expresión bacterial . La Patente Europea No. 0 529 300 describe un interferón-ß recombinante que tiene un patrón de glicosilación específica, especialmente la glicosilación con estructuras de carbohidrato que caracteriza una fucosa por unidad de oligosacárido. Estas estructuras de carbohidrato son biantenarias, triantenarias y tetraantenarias (dos, tres y cuatro ramificaciones, respectivamente) . La solicitud PCT No. WO 99/15193 también describe la glicosilación de interferón-ß recombinante que presenta oligosacáridos biantenarios, triantenarios y tetraantenarios . Los monosacáridos constituyentes incluyen mañosa, fucosa, N-acetilglucosamina, galactosa y ácido siálico. Varios estudios han demostrado la importancia de la glicosilación para la estabilidad. Por ejemplo, formas no glicosiladas de interferón-ß recombinante se mostraron para tener estabilidad significativamente baja y también actividad biológica baja (Runkel et al., 1998). Otros estudios han mostrado que las proteínas de interferón-ß naturales y recombinantes tienen diferente patrones de glicosilación (Kagawa et al., 1988). El interferón beta se usa como un fármaco de proteína terapéutica, también llamado biológico, en un número de enfermedades, tales como por ejemplo esclerosis múltiple, cáncer, o enfermedades virales tales como por ejemplo SARS o infecciones del virus de hepatitis C. Por lo tanto, existe una necesidad para procesos para la producción y purificación eficiente de interferón beta, y de células que expresan el interferón beta en altas cantidades.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el desarrollo de un proceso para producir interferón humano recombinante beta en un medio libre de suero. Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a un proceso para la fabricación de interferón-ß glicosilado recombinante, preferiblemente humano, que comprende la etapa de cultivar la célula que produce el interferón-ß en un medio libre de suero, el medio libre de suero comprende: -alrededor de 10 hasta alrededor de 30 mM HEPES, preferiblemente 20 mM de HEPES; -alrededor de 0.5 hasta alrededor de 3 mM de Prolina, preferiblemente alrededor de 1 mM de Prolina; y -alrededor de 5500 hasta alrededor de 7000 mg/L de cloruro de sodio, preferiblemente alrededor de 6100 mg/L de cloruro de sodio. La presente invención se basa además en el desarrollo de un proceso para purificar interferón beta recombinante de un fluido, en particular de la cosecha de cultivo celular derivada de las células que producen interferón beta. Por lo tanto, en un segundo aspecto, la invención se refiere a un proceso para la purificación de interferón humano recombinante de un fluido, que comprende las etapas de: -Someter el fluido a cromatografía de afinidad; -Someter el eluido de la cromatografía de afinidad a cromatografía de intercambio de cationes; -Someter el eluido de la cromatografía de intercambio de catión a cromatografía hidrofóbica por RP-CLAR. El análisis del interferón beta producido por el proceso la invención revela que es una composición de interferón beta glicosilado diferencialmente, esto es un interferón beta que tiene un patrón o perfil de glicosilación único. Por lo tanto, en un tercer aspecto, la invención se refiere a una composición de interferón beta que comprende una estructura de oligosacárido que comprende dos o tres sacáridos de fucosa. Los usos del interferón-ß humano recombinante producido de acuerdo con el proceso de la invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento contra tumores, esclerosis múltiple, infecciones virales, y usos del medio de cultivo libre de suero de la invención para la producción de interferón beta, son aspectos adicionales de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIG. 1 muestra un diagrama de flujo del método usado para generar un interferón beta que produce la línea celular. FIG. 2 muestra un diagrama de flujo del nuevo proceso de purificación de iFN-ß-la. FIG. 3 muestra el espectro transformado ES-EM de lotes IFN-ß-la en donde un dibujo esquemático de la estructura de oligosacáridos se muestra en la parte superior. FIG. 4 muestra el espectro transformado ES-EM de IFN-ß-la obtenido por el nuevo proceso en donde: P= proteína (IFN-ß); Fue Biant = oligosacárido del tipo complejo biantenario fucosilado; Fue Triant = oligosacárido del tipo complejo triantenario fucosilado; Fue Tetrant = oligosacárido del tipo complejo tetrantenario fucosilado; SA = ácido siálico. FIGS. 5A-5C muestran estructuras de oligosacárido en IFN-ß-la; en donde: Fig 5A muestra los oligosacáridos principales: I. Binantenario Disialilado (NeuAc2-Hex5. HexNAc4. Fue) II. Binantenario Monosialilo (NeuAcHex5-HexNAc4 Fue) Fig. 5B muestra los oligosacáridos menores, en donde: I. Biantenaro no sialilado (Hex5. HexNAc4. Fue) II. Estructura triantenaria Mono y Disialilada o biantenaria disialilada con estructura repetida de N-acetil lactosamina (NeuAc2 Hex6. HexNAcs. Fue) III. triantenario Trisialilado con estructura repetida de N-acetil lactosamina o estructura tetrantenaria Trisialilada (NeUAc3-HeX7-HeXNAc6-Fuc) Fig. 5C muestra los oligosacáridos menores con dos o tres residuos de Fucosa: I. La estructura biantenaria monosialilo con dos fucosa (NeuAc.Hex5.HexNAc4. FuC2) II. La estructura binantenaria disialilada con dos Fucosa (NeuAc2.Hex5.HexNAc4. FuC2) III. La estructura biantenaria disialilada con tres Fucosa (NeuAc2. Hex5. HexNAc4. FuC3) FIG. 6 muestra el espectro MALDI del nuevo IFN-ß-la con glicanos permetilados .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El primer aspecto de la presente invención se basa en el desarrollo de un proceso para la producción de interferón beta bajo condiciones de cultivo celular libre de suero. De acuerdo con la presente invención, el proceso para la fabricación del interferón beta recombinante glicosilado comprende la etapa de cultivar un interferón beta que produce células en un medio libre de suero, el medio libre de suero comprende: - alrededor de 10 hasta alrededor de 30 mM de HEPES, preferiblemente 20 mM de HEPES; - alrededor de 0.5 hasta alrededor de 3 mM de prolina, preferiblemente alrededor de 1 mM de prolina; y alrededor de 5500 hasta alrededor de 7000 mg/l de cloruro de sodio, preferiblemente alrededor de 6100 mg/l de cloruro de sodio. El medio libre de suero puede por ejemplo comprender solución amortiguadora 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 mM de HEPES (ÁCIDO 2- (4- (2-HIDROXIETIL) -1-PIPERAZINIL) ETANOSULFONICO) . Puede también por ejemplo comprender 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3,l mM de Prolina. Las concentraciones de cloruro de sodio en el medio libre de suero de la invención pueden por ejemplo ser de alrededor de 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900, 6000, 6100, 6200, 6300, 6400, 6500, 6600, 6700, 6800, 6900, 7000, 7100 mg/L. En una modalidad preferida, el medio libre de suero comprende además alrededor de 10 hasta alrededor de 20, preferiblemente alrededor de 15 mg/L de fenol rojo. La concentración de fenol rojo puede por ejemplo ser de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 mg/L. En el marco del proceso de la presente invención, los componentes identificados anteriormente se pueden usar en cualquier medio libre de suero adecuado conocido. Los ejemplos de tales medio libres de suero se enlistan a continuación: Medio Fabricante No. Cat EX-CELL 302 JRH 14312-100OM EX-CELL 325 JRH 14335-1 OOOM CHO-CD3 Sigma C-1490 CHO III PFM Gibco 96-0334SA CHO-S-SFM Gibco 12052-098 CHO-DHFR Sigma C-8862 ProCHO 5 Cambrex BE12-766Q SFM4CHO HyClone SH30549.01 Ultra CHO Cambrex 12-724Q HyQ PF CHO HyClone SH30220.01 HyQ SFX CHO HyClone SH30187.01 HyQ CDM4CHO HyClone SH30558.01 IS CHO-CD Irvine Scientific #91119 IS CHO-V Irvine Scientific #9197 La célula que produce el interferón beta que se puede cultivar de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier célula de mamífero, incluyendo células animales o humanas, tales como por ejemplo células 3T3, células COS, células de osteosarcoma humano, células MRC-5, células BHK, células VERO, células CHO, células CHO-S, células HEK 293, células HEK 293, células de fibroblasto humanas normales, células de estroma, células de hepatocitos y células PER.C6 que han sido modificadas para expresar, y preferiblemente secretar interferón beta. La célula para ser usada en el proceso de la invención es preferiblemente un clon CHO que expresa interferón beta tal como por ejemplo la línea celular descrita por Reiser and Hauser (1987) o las células descritas por Innis and McCormick (1982) . El término "interferón beta", como se usa en la presente, es también llamado IFN beta, o IFN-ß, y abarca interferón beta derivado de cualquier especie y preferiblemente interferón beta humano, una glicoproteína de 166 aminoácidos con un peso molecular . de aproximadamente 22,500 daltones. El término "interferón beta", como se usa en la presente, también abarca derivados funcionales, muteínas, análogos, o fragmentos de IFN-beta. El término "interferón beta 1 a" se refiere a interferón beta glicosilado. La actividad del interferón beta puede, por ejemplo, medirse usando una referencia estándar calibrada contra estándares de interferón beta de la Organización Mundial de la Salud (Second International Standard for interferon, Human Fibroblast GB 23 902 531) . La unidad se expresa en unidades internacionales (IU) de actividad antiviral por mg de interferón beta-la determinado en un bioensayo de efecto citopático in vitro usando células WISH y virus de estomatitis vesicular.

Tabla de conversión para MIU y mcg de IFN-beta Las "variantes" o "muteínas", como se usa en el marco de la presente invención, se refiere a análogos de IFN-beta, en el cual uno o más de los residuos de aminoácido de IFN-beta natural se reemplazan por diferentes residuos de aminoácido, o se eliminan, o uno o más residuos de aminoácidos se agregan a la secuencia natural de IFN-beta, sin disminuir considerablemente la actividad de los productos resultantes en comparación con el IFN-beta de tipo silvestre. Estas muteínas se preparan por síntesis conocidas y/o por técnicas de mutagénesis dirigidas al sitio, o cualquier otra técnica conocida adecuada para ello. Los términos "variante" o "muteína" de acuerdo con la presente invención incluye proteínas codificadas por un ácido nucleico, tal como ADN o ARN, que hibridizan al IFN-beta que codifica ADN o ARN como se describe por ejemplo en US 4,738,931 bajo condiciones severas. El término "condiciones severas" se refiere a condiciones de hibridización y de lavado posteriores, las cuales aquellos de habilidad ordinaria en el arte refieren convencionalmente como "severas". Ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 and 6.4 (1987, 1992). Sin limitación, los ejemplos de condiciones severas incluyen condiciones de lavado 12-20°C debajo del Tm calculado del híbrido bajo estudio en, por ejemplo, 2 x SSC y 0.5% de SDS durante 5 minutos, 2 x SSC y 0.1% de SDS durante 15 minutos; 0.1 x SSC y 0.5% de SDS a 37°C durante 30-60 minutos y luego, a 0.1 x SSC y 0.5% de SDS a 68°C durante 30-60 minutos. Aquellos de habilidad ordinaria en este arte entenderán que las condiciones severas también dependen en la longitud de las secuencias de ADN, sondas de oligonucleótidos (tales como 10- 40 bases) o mezclas de sondas de oligonucleótidos. Si las sondas mezcladas se usan, se prefiere usar cloruro de tetrametil amonio (TMAC) _ en lugar de SSC. Ver Ausubel, supra.

La identidad refleja una relación entre dos o más secuencias de polípéptido o dos o más secuencias de polinucleótido, determinadas al comparar las secuencias. En general, la identidad se refiere a un nucleótido exacto para el nucleótido o aminoácido para el aminoácido, que corresponde a las dos secuencias de polinucleótido o las dos secuencias de polipéptido, respectivamente, sobre la longitud de las secuencias a compararse. Para las secuencias donde no hay una correspondencia exacta, un "% de identidad" se puede determinar. En general, las dos secuencias a compararse se alinean para dar una correlación máxima entra las secuencias. Esto puede incluir la inserción de "huecos" en ya sea una o ambas secuencias, para aumentar el grado de alineación. Un % de identidad se puede determinar sobre la longitud completa de cada una de las secuencias a compararse (también llamado alineación global) , que es particularmente adecuada para secuencias de la misma o muy similar longitud, o sobre longitudes definidas, más cortas (también llamada alineación local) , que es más adecuada para secuencias de longitud desiguales. Los métodos para comparar la identidad y homología de dos o más secuencias son bien conocidos en el arte. Así por ejemplo, los programas disponibles en el Paquete de Análisis de Secuencia Wisconsin, versión 9.1 (Devereux J et al., 1984), por ejemplo el programa BESTFIT y GAP, se pueden usar para determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y el % de identidad y el % de homología entre dos secuencias de polipéptido. El BESTFIT usa el algoritmo "homología local" de Smith and Waterman (1981) y encuentra la mejor región sencilla de similitud entre dos secuencias. Otros programas para determinar identidad y/o similitud entre secuencias son también conocidos en el arte, por ejemplo la familia BLAST de programas (Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, accesible a través de la pagina de inicio de NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson W R, 1990) . Cualesquiera de tales variantes o muteína preferiblemente tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicada de la de IFN-beta, tal como para tener actividad substancialmente similar para IFN-beta. Un ensayo funcional para evaluar sí cualquier variante o muteína tiene una actividad similar como IFN-beta es, por ejemplo, el ensayo para medir la actividad de interferón en el efecto citopático del virus de estomatitis vesicular en células WISH, por ejemplo descritas por Youcefi et al., 1985. Así, se puede determinar sí cualquier muteína dada tiene substancialmente la misma actividad como IFN-beta por medio de experimentación de rutina. Cualesquiera de tales variante o muteína puede tener al menos 40% de identidad u homología con la secuencia de IFN-beta como se describe por ejemplo en US 4,738,931. Más preferiblemente, tiene al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o, más preferiblemente, al menos 90% de identidad u homología con esta. Las muteínas de IFN-beta, que se pueden usar de acuerdo con la presente invención, o ácido nucleico que codifica esto, incluye un conjunto finito de secuencias substancialmente correspondientes como péptidos o polinucleótidos de substitución los cuales se pueden obtener rutinariamente por una persona de habilidad ordinaria en el arte, sin experimentación indebida, con base en las enseñanzas y guías presentadas en la presente. Los cambios preferidos para muteínas de acuerdo con la presente invención son los que se conocen como substituciones "conservadoras". Las substituciones de aminoácido conservadoras de polipéptidos IFN-beta pueden incluir aminoácidos sinónimos dentro de un grupo el cual tiene propiedades fisicoquímicas suficientemente similares con substitución entre miembros del grupo que preserva la función biológica de la molécula (Grantham, 1974). Es claro que las inserciones y eliminaciones de aminoácidos también pueden hacerse en las secuencias antes definidas sin alterar su función, particularmente si las inserciones o eliminaciones solamente involucran algunos aminoácidos, por ejemplo, menos de treinta, y preferiblemente menos de diez, y no remover o desplazar aminoácidos los cuales son críticos para la conformación funcional, por ejemplo, residuos de cisteína. Las proteínas y muteínas producidas por tales eliminaciones y/o inserciones entran en el punto de vista de la presente invención. Los ejemplos de substituciones de aminoácidos en proteínas las cuales se puede usar para obtener muteínas de IFN-beta para uso en la presente invención incluyen cualesquiera de las etapas de métodos conocidos, tales como las presentadas en las Patentes EU 4,959,314, 4,588,585 y 4,737,462, para Mark et al; 5,116,943 para Koths et al., 4,965,195 para Ñamen et al; 4,879,111 para Chong et al; y 5,017,691 para Lee et al; y proteínas substituidas con lisina en Patente EU No. 4,904,584 (Shaw et al). Un tipo especial de variante de interferón se ha descrito recientemente. Los llamados "interferones de consenso" son variantes que no se presentan naturalmente de IFN (US 6,013,253). Los interferones de consenso también se pueden producir de acuerdo a la invención. Los "derivados funcionales" de IFN-beta como se usa en la presente cubren derivados los cuales se pueden preparar de los grupos funcionales que se presentan como cadenas laterales en los residuos o los grupos de terminal N o C, por medios conocidos en el arte, y se incluyen en la invención siempre y cuando se mantengan farmacéuticamente aceptables, esto es, que no destruyan la actividad biológica de las proteínas como se describen anteriormente, esto es, la capacidad para enlazar el receptor correspondiente e iniciar la señalización del receptor, y no confiere propiedades tóxicas en composiciones que las contengan. Los derivados pueden tener porciones químicas, tales como residuos de carbohidrato o fosfato, con la condición de que tal derivado mantenga la actividad biológica de la proteína y se mantenga farmacéuticamente aceptable. Los derivados de interferón beta pueden, por ejemplo, incluir cadenas laterales de polietilen glicol, las cuales pueden mejorar otras propiedades de la proteína, tales como la estabilidad, semivida, biodisponibilidad, tolerancia por el cuerpo humano, o inmunogenicidad. Para lograr este objetivo, el IFN-beta se puede ligar por ejemplo al polietilenglicol (PEG) . La PEGilación se puede llevar a cabo por métodos conocidos, descritos en WO 92/13095, por ejemplo. En particular, PEG-IFN se puede preparar de acuerdo con la enseñanza de WO 99/55377. Un derivado funcional de IFN-beta puede comprender al menos una porción enlazada a uno o más grupos funcionales, los cuales se presentan como una o más cadenas laterales en los residuos de aminoácido. Una modalidad en la cual la porción es un polietilen glicol (PEG) es altamente preferida. De acuerdo con la presente invención, varias porciones PEG se pueden también enlazar al IFN-beta. Otros derivados incluyen esteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por reaccionar con amonio o con aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo de grupos amino libres de los residuos de aminoácido formados con las porciones de acilo (por ejemplo grupos alcanoil o carbocíclico) o derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo los de residuos de serilo o treonilo) formados con porciones de acilo. Un "fragmento" de conformidad a la presente invención se refiere a cualquier subconjunto de IFN-beta, que es, un péptido más corto, el cual mantiene la actividad biológica deseada como medible, por ejemplo, en el bioensayo descrito anteriormente. Los fragmentos se pueden preparar fácilmente al remover aminoácidos de cualquiera de los extremos de la molécula y probar el resultante para sus propiedades como un agonista receptor. Las proteasas para remover un aminoácido a un tiempo de ya sea la terminal N o la terminal C de un polipéptido se conocen, y así determinar fragmentos, los cuales mantienen la actividad biológica deseada, se pueden determinar por ejemplo en la prueba descrita por Youcefi et al., 1985, e involucra solamente experimentación de rutina. El proceso para la producción de interferón beta de la invención se puede llevar a cabo a una temperatura constante, o a temperaturas variadas. Se puede por ejemplo llevar a cabo a 37°C durante todo el proceso. También se puede llevar a cabo a una temperatura que es inicialmente, por ejemplo durante la fase de crecimiento, a 37°C y luego disminuida hasta 35°C, 33°C o 30°C para la fase de producción. En una modalidad preferida, el proceso de la invención comprende una fase de crecimiento I, una fase de crecimiento II y una fase de producción, en donde la fase de crecimiento I se lleva a cabo a alrededor de 37°C, la fase de crecimiento II se lleva a cabo a alrededor de 35°C, y la fase de producción se lleva a cabo a alrededor de 33°C. La determinación del final de las fases está bien dentro del conocimiento de la persona de habilidad en el arte y se determina por ejemplo con la base de la densidad celular, consumo de glucosa o cualquier otra indicación metabólica. Generalmente, la fase de crecimiento I puede ser por ejemplo de 10 hasta 12 días. La fase de crecimiento II es generalmente corta y sirve principalmente para adaptar las células a una temperatura menor. La fase de crecimiento II puede por ejemplo ser de 1 hasta 2 días. El proceso de la invención se puede llevar a cabo como un proceso alimentado al lote o de perfusión. De acuerdo con la presente invención, la perfusión se prefiere. Preferiblemente, el proceso es un proceso de perfusión con una relación de dilución en el rango de alrededor de 1 hasta alrededor de 10, preferiblemente de alrededor de 1.5 hasta alrededor de 7 por día. El término "porcentaje de dilución", como se define en la presente, se refiere a el porcentaje de dilución D, calculado como litros de medio por litros de sistema total trabajando volumen por día (volumen total = cama empaquetada + volumen de tanque condicionado) . De acuerdo con la presente invención, el porcentaje de dilución puede estar en el rango de, por ejemplo 0.5, 1, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, .5, 6, 6.5, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, . 5. Más preferiblemente, la relación de dilución se incrementa dentro de las primeras dos o tres semanas de cultivo celular de un valor inicial de alrededor de 1 hasta 2 por día hasta un valor de alrededor de 7 hasta 10 por día, particularmente durante la fase de producción. La etapa de cultivo del proceso de la invención se puede llevar a cabo en cualquier ambiente adecuado, tales como platos Petri, matraces T o botellas de rodillo, pero preferiblemente en recipientes que tienen volúmenes mayores tales como, por ejemplo, un bioreactor. Cuando la selección es un proceso de perfusión, el sistema puede, por ejemplo, ser un bioreactor de lecho empaquetado estacionario en el cual las células se inmovilizan en portadores sólidos. Este sistema es fácil de operar y con portadores y condiciones de cultivo apropiados se puede alcanzar densidad celular muy alta (de ~ 107-108 célula ml-1) .

Un portador sólido que se pueden usar de acuerdo con la presente invención puede por ejemplo ser un microportador. Los microportadores son partículas sólidas pequeñas en las cuales las células se pueden hacer crecer en cultivo de suspensión.

Las células son capaces de adherirse y propagarse en la superficie de microportadores. Típicamente, los microportadores consisten de perlas, el diámetro de las cuales comprende de entre 90 µm y 300 µm. Los microportadores se pueden hacer de varios materiales que han dado buenos resultados para enlace y propagación de células tales como, por ejemplo, vidrio, poliestireno, polietileno, dextrano, gelatina y celulosa. Además, la superficie de microportadores se pueden recubrir con un material que promueve el enlace y crecimiento de la célula tal como, por ejemplo, por ejemplo, N, N-dietilaminoetilo, vidrio, colágeno o proteínas recombinantes. Existen microportadores tanto macroporosos como no porosos. Las superficies macroporosas dan a las células fácil acceso al interior del microportador después de la inoculación, y una vez dentro del microportador, las células se protegen de las fuerzas de cizallamiento generadas por agitación y aireación mecánica en el bioreactor. Un portador sólido adicional que se pueden usar de acuerdo con la presente invención puede, por ejemplo, ser un disco, tal como un disco compuesto de fibra no tejida de poliéster unido a una lámina de malla de polipropileno (ver, por ejemplo, patente E.U.A. No. 5,266,476). Tales discos son usualmente tratados electroestáticamente para facilitar la suspensión de células adheridas a los discos y atraparse en el sistema de fibra, donde se mantiene en todo el proceso de cultivo. La densidad y productividad celular lograda con células que crecen en discos pueden ser arriba de diez veces mayor que con crecimiento celular en microportadores.

El proceso para la producción de interferón beta glicosilado preferiblemente además comprende una etapa de colectar el interferón beta que contiene el cultivo celular cosechado. En una modalidad preferida, el cultivo celular cosechado se somete además para un proceso de purificación. El proceso de purificación puede ser cualquier proceso que conduzca al interferón beta de la pureza requerida y pueden contener cualquier combinación de etapas de purificación con base en la cromatografía o cualquier otra tecnología de purificación tal como fraccionamiento con sal o similares. La purificación es preferiblemente llevada a cabo de acuerdo al segundo aspecto de la presente invención. En un segundo aspecto, la invención se refiere a un proceso para la purificación de interferón recombinante de un fluido, que comprende las etapas de: a) Someter el fluido a cromatografía de afinidad; b) Someter el eluyente de la cromatografía de afinidad a cromatografía de intercambio de cationes; c) Someter el eluyente de la cromatografía de intercambio de cationes a cromatografía hidrofóbica por RP-CLAR. La etapa (a) es preferiblemente llevada a cabo en Sefarosa azul, por ejemplo en una columna de flujo rápido de sefarosa azul. La etapa (b) es preferiblemente llevada a cabo en una resina de carboximetilo, por ejemplo en un flujo rápido de sefarosa CM. En una modalidad preferida, el proceso de purificación de la invención comprende además, antes de la etapa (a) , una etapa de clarificar el fluido por microfiltración. En aún una modalidad adicional preferida, el proceso de purificación de conformidad además comprende las etapas de: d) realizar ultrafiltración y diálisis, e) someter el dializado a cromatografía de exclusión de tamaño, f) someter el eluyente de la cromatografía de exclusión de tamaño a filtración. La Etapa (f) se puede llevar a cabo por ejemplo por micro o nanofiltración. La ultrafiltración es útil para remover los componentes de peso molecular pequeño en los eluyentes que resultan de etapas de cromatografías anteriores. La ultrafiltración por ejemplo permite remover el solvente orgánico, el TFA y sales de la etapa anterior, para equilibrar el interferón beta en la solución amortiguadora requerida, o para concentrar la molécula a la concentración deseada. Tal ultrafiltración se puede, por ejemplo, realizarse en medio de ultrafiltración excluyendo componentes que tienen pesos moleculares debajo de 5 kDa. Si la proteína purificada de acuerdo al proceso de la invención se destina para la administración a humanos, es ventajoso para incluir etapas adicionales de eliminación de virus. Una etapa de filtración de eliminación de virus puede, por ejemplo, llevarse a cabo entre las etapas (d) y (e) , o después de la etapa (e) . Más preferiblemente, el proceso comprende dos etapas de eliminación de virus. La pureza que se puede obtener con el proceso de purificación de conformidad con la invención es preferiblemente > 80%, más preferiblemente > 90 % y más preferiblemente > 98%. El proceso de purificación del interferón beta de acuerdo con la presente invención preferiblemente comprende además la etapa de formular el interferón beta purificado en una composición farmacéutica, opcionalmente junto con un portador farmacéuticamente aceptable. El interferón beta a producirse o purificarse de acuerdo con la presente invención se puede expresar por cualquier línea celular o clon. Sin embargo, se prefiere usar una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) , designada DUKX-B11, la cual carece de actividad DHFR (dihidrofolato reductasa) , como la célula hospedera para la preparación de interferón beta glicosolado. La secuencia de ADN que codifica el interferón-ß humano es, por ejemplo, descrita en la Patente EUA no. 5,326,859. Una modalidad preferida de la presente invención se refiere a un método para producir interferón-ß humano recombinante en células transfectadas capaces de producir al menos alrededor de 100000 IU de interferón-ß humano recombinante en productividad celular específica (IU/106 células/24 horas) . Preferiblemente, las células son capaces de producir al menos alrededor de 200000 IU o al menos alrededor de 200000 IU o al menos alrededor de 300000 IU o al menos alrededor de 400000 IU o al menos alrededor de 500000 IU o al menos alrededor de 600000 IU de productividad celular específica de interferón beta humano recombinante. Preferiblemente el interferón beta que produce células es una célula CHO la cual se transfecta con un constructo de ácido nucleico que comprende al menos un elemento promotor/aumentador funcionalmente ligado al gen IFN-ß humano. Más preferiblemente, al menos un elemento promotor/aumentador comprende un promotor/aumentador SV40. Más preferiblemente, el constructo de ácido nucleico comprende al menos una primera unidad de transcripción compuesta del promotor/aumentador SV40 funcionalmente ligado al gen IFN-ß humano, el gen IFN-ß humano siendo ligado funcionalmente a la región de poliadenilación temprana de SV40 T Ag. Es también altamente preferido el constructo de ácido nucleico que comprende además al menos una segunda unidad de transcripción compuesta de un promotor/aumentador SV40, un gen DHFR de ratón y una región de poliadenilación temprana que contiene de SV40 T Ag polyA. Otra modalidad de la presente invención se refiere a un constructo de ácido nucleico que comprende al menos un elemento promotor/aumentador funcionalmente ligado al gen IFN-ß humano para transfectarse en células, caracterizado porque las células transfectadas son capaces de producir al menos alrededor de 100000 IU, al menos alrededor de 200000 IU o al menos alrededor de 300000 IU o al menos alrededor de 400000 IU o al menos alrededor de 500000 IU o al menos alrededor de 600000 IU de interferón-ß humano recombinantes en productividad celular específica (IU/106 células / por 24 horas) . Preferiblemente, al menos un elemento promotor/aumentador comprende un promotor/aumentador SV40. Más preferiblemente, el constructo del ácido nucleico comprende al menos una primera unidad de transcripción compuesta del promotor/aumentador SV40 funcionalmente ligado al gen IFN-ß humano, el gen IFN-ß humano siendo funcionalmente ligado a la región poliadenilación temprana de SV40 T Ag. Más preferiblemente, el constructo del ácido nucleico además comprende al menos una segunda unidad de transcripción compuesta de un promotor/aumentador SV40, un gen DHFR de ratón y una región de poliadenilación temprana que contiene SV40 T Ag polyA. La invención además se refiere a un interferón beta que se obtiene por un proceso de acuerdo a la presente invención. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición de interferón beta que tiene un perfil de glicosilación único. Tal interferón beta es preferiblemente producido por un proceso de acuerdo a la presente invención. En una modalidad, la proteína de interferón-ß humana recombinante glicosilada contiene una estructura oligosacárida que tiene dos o tres sacáridos de fucosa. En una modalidad preferida, la estructura oligosacárida comprende además un glicano trifucosilado biantenario disialilo (Neu2Ac.Hex5.HexNAc4. Fuc3) . En una modalidad adicional preferida, el patrón de glicosilación único además comprende una estructura biantenaria no sialilada (Hexs. HexNAc4. Fue) ; estructura triantenaria disialilada o biantenaria disialilada con estructura repetida de lactosamina N-acetilo (NeuAc2. Hex6. HexNAc5. Fue) ; la estructura triantenaria trisialilada (NeuAc3. Hex6. HexNAc5. Fue) ; estructura triantenaria trisialilada con estructuras repetidas de lactosamina N-acetilo o tetrantenaria trisialilada (NeuAc3-HeX7-HeXNAC6~FuC) ; estructura biantenaria disialilada y mono sialilada con dos unidades de fucosa (NeuAc. Hex5.HexNAc4. Fuc2,NeuAc2-Hexs-HexNAc .FuC2) . Preferiblemente, el patrón de glicosilación único comprende glicanos con un nivel similar de ácido N-acetilneuramínico : ácido N-Glicolilneuramínico como para patrones de glicosilación de proteína humana natural. En una modalidad adicional preferida, la composición de interferón beta de la invención se caracteriza por un perfil de sialilación que comprende alrededor de 1 hasta alrededor de 5% de glicanos N no sialilados, alrededor de 5 hasta alrededor de 25% de glicanos mono-sialilados, alrededor de 55 hasta alrededor de 75% de glicanos N disialilatados, alrededor de 10 hasta alrededor de 25% de glicanos N tri-sialilatados . Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso del interferón beta de acuerdo con la presente invención para la elaboración de un medicamento para tratamiento contra enfermedades humanas, en particular esclerosis múltiple, cáncer, o infecciones virales. La esclerosis múltiple se puede seleccionar del grupo que consiste de esclerosis múltiple a temprana edad, con recaídas y sin recaídas. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para tratar a un sujeto que necesita del tratamiento con interferón-ß de conformidad con la invención, que comprende en administrar al sujeto proteína de interferón-ß humana recombinante como se describe en la presente. Preferiblemente, el tratamiento es contra esclerosis múltiple. Más específicamente, la esclerosis múltiple se puede seleccionar del grupo que consiste de esclerosis múltiple a temprana edad con recaídas y sin recaídas. Alternativamente, el tratamiento es un tratamiento anti-tumor.

En una alternativa adicional, el tratamiento es un tratamiento anti-viral. En un aspecto adicional de la presente invención, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende, como un ingrediente activo, una composición de interferón-ß humano recombinante purificada, aislada, como se describe en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable para administración de la composición farmacéutica. Preferiblemente, la composición farmacéutica que tiene actividad anti-tumor o anti-viral, o actividad contra esclerosis múltiple, que comprende, como un ingrediente activo, una proteína de interferón-ß humana recombinante, purificada, asilada, como se describe en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable para administración de la composición farmacéutica. En aún un aspecto adicional de la presente invención, la invención se refiere a un articulo de fabricación que comprende un material empaquetado y una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de interferón-ß recombinante, purificada, aislada, en donde el material empaquetado comprende una etiqueta o inserto de empaque que indica que la proteína de interferón-ß humana recombinante como se describe en la presente se puede administrar a un humano para tratamiento del mismo. La proteína de interferón-ß humana recombinante, purificada, aislada o composición farmacéutica como se describe en la presente se usa preferiblemente para la elaboración de un medicamento para tratamiento contra esclerosis múltiple a temprana edad con recaídas y sin recaídas. Los regímenes de dosificación para un sujeto particular (paciente) se pueden fácilmente determinar por alguien de habilidad ordinaria en el arte, ya que estos regímenes son bien conocidos en el arte. Ahora se hace referencia para los siguientes ejemplos, los cuales junto con la descripción anterior, ilustran la invención en una manera no limitada. Generalmente, la nomenclatura usada en la presente y los procedimientos de laboratorios utilizados en la presente invención incluyen técnicas de ADN recombinante microbiológicas y moleculares. Tales técnicas se explican a fondo en la literatura. Ver, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Mariland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologías como se establecen en las Pat. E.U.A. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" por Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J. , ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J. , eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J. , eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996) ; todas las cuales se incorporan para referencia como se establece en su totalidad en la presente. Teniendo ahora descrita en su totalidad esta invención, se apreciará por aquellos de habilidad en el arte que la misma se puede realizar dentro de un amplio rango de parámetros, concentraciones y condiciones equivalentes sin apartarse del espíritu y alcance de la invención y sin experimentación indebida. Mientras esta invención ha sido descrita en conexión con modalidades específicas de la misma, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales. Esta solicitud se destina para cubrir cualesquiera de las variaciones, usos o adaptaciones de la invención siguiente, en general, los principios de la invención e incluyendo tales salidas de la presente descripción que están dentro de la práctica conocida o habitual dentro del arte a la cual la invención pertenece y como se puede aplicar a la características esenciales en la presente anteriormente establecidas como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo artículos de revistas o resúmenes, solicitudes de Patentes E.U.A. o extranjeras publicadas o no publicadas, Patentes emitidas E.U.A o de patentes extranjeras o cualquier otra referencia, se incorporan en su totalidad en la presente para referencia, incluyendo todos los datos, tablas, figuras y texto presentado en las referencias citadas. Adicionalmente, los contenidos completos de las referencias citadas dentro de las referencias citadas en la presente también se incorporan en su totalidad para referencia. La referencia para etapas de métodos conocidos, etapas de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales no es de ninguna manera una admisión de que cualquier aspecto, descripción o modalidad de la presente invención se describa, enseñe o sugiera en el arte relevante.

La descripción anterior de las modalidades específicas revela completamente la naturaleza general de la invención que otras pueden, al aplicar los conocimientos dentro de la habilidad de el arte (incluyendo los contenidos de las referencias citadas en la presente) , modificar fácilmente y/o adaptar para varias aplicaciones tales modalidades específicas, sin experimentación indebida, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, tales adaptaciones y modificaciones se pretende que estén dentro del rango medio de equivalentes de las modalidades descritas, con base en la enseñanza y orientación presentada en la presente. Se entenderá que la fraseología o terminología en la presente es para el propósito de descripción y no de limitación, de tal manera que la terminología o fraseología de la presente especificación sea interpretada por los técnicos de habilidad a la luz de la enseñanza y orientación presentada en la presente, en combinación con el conocimiento de alguien de habilidad ordinaria en el arte.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 - PREPARACIÓN DE UN CLON DE OVARIO DE H MSTER CHINO (CHO) QUE PRODUCE IFN-BETA A NIVELES ALTOS Este Ejemplo describe la generación de un clon CHO que produce el interferón beta. El procedimiento básico, particularmente con respecto a la preparación del plásmido de expresión, se describe en Mory et al. (1981). Una visión general sobre el proceso de generar el clon se representa en la Fig. 1. Un fragmento de ADN que comprende el interferón-ß humano que codifica la región se aisló de una colección de ADN genómica de células sanguíneas periféricas humanas. Una línea celular CHO deficiente en DHFR se transfectó con un plásmido recombinante que contiene tanto la secuencia que codifica IFN-ß humana como el gen DHFR de ratón, como un marcador seleccionable y amplificable . Después de la selección en medio libre de timidina, la amplificación del gen con metotrexato (MTX) , y clonado, se aisló una célula que produce IFN-ß-la en niveles altos. Las células se sometieron a caracterización genotípica y fenotípica.

Construcción del plásmido de expresión que porta los genes hlFN-ß y mDHFR Se construyó un vector de expresión que contiene ambos, la secuencia que codifica IFN-ß humana genómica y el gen resistente DHFR de ratón. Esta construcción elimina la necesidad de co-transfección de las células hospederas CHO con dos plásmidos separados, una comprende la secuencia que codifica IFN-ß y la segunda comprende la secuencia DHFR de ratón, conocida, por ejemplo, de Chemajovsky et al., 1984. El vector de expresión que contiene la secuencia que codifica IFN-ß careció del IFN-ß 3 'UTR y así de la región de polídenilación IFN-ß. El vector de expresión de la invención por lo tanto contienen dos unidades de transcripción, una primer unidad de transcripción IFN-ß compuesta del promotor/aumentador SV40, la secuencia que codifica IFN-ß humana y la región de poliadenilación temprana SV40 T Ag, y una segunda unidad de transcripción DHFR compuesta del promotor/aumentador SV40, el gen DHFR de ratón y la región de poliadenilación temprana que contiene polyA SV40 T Ag. Estas unidades de transcripción se siguieron por secuencias del plásmido pBR322 que porta la bacteria original CoIEI de replicación y gen de resistencia a ampicilina . La estructura del vector de expresión se verificó por análisis de mapa de restricción y por secuencia completa (secuenciado automatizado de hebra doble) . La secuencia correcta de los fragmentos usados para su construcción se confirmó en ambas direcciones.

Descripción de la célula hospedera Una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) , designada DUKX-B11, que carece de actividad DHFR (dihidrofolato reductasa), se usó como la célula hospedera. La línea celular se aisló de la línea celular CHO-K1, que requiere prolina (Kao and Puck, 1968) para mutagénesis con metansulfato de etilo seguido por irradiación gamma. Los mutantes deficientes de DHFR se seleccionaron por la exposición a actividad específica alta [3H] -deoxiuridina (Urlaub and Chasin, 1980) . Los mutantes completamente deficientes requieren glicina, hipoxantina y timidina para crecimiento. El papel central de DHFR en la síntesis de precursores de ácido nucleico, junto con la sensibilidad de células deficientes de DHFR a análogos tales como metotrexato (MTX), presentan dos ventajas mayores. Primeramente, la transfección de tales células deficientes de DHFR con plásmidos que contienen un gen DHFR permite la selección de células recombinantes que crecen en medio libre de timidina. En segundo lugar, el cultivo de estas células en medio selectivo que contiene concentraciones incrementadas de MTX resulta en la amplificación del gen DHFR y el ADN asociado (Kaufman and Sharp 1982, and Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , Molecular Cloning : A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) .

Generación del clon Como se indica en la Fig. 1, las células CHO deficientes de DHFR, dependientes del anclaje, se transfectaron por el procedimiento de precipitación de fosfato de calcio (Graham FL and Van Der EB, 1973; Busslinger, et al., 1981) con el plásmido que contienen tanto la secuencia que codifica h-IFN-ß como el gen marcador mDHFR descrito anteriormente. Para amplificar el gen transfectado, clones seleccionados se sometieron a un tratamiento MTX (metotrexato) . Los clones se aislan después de la selección MTX.

Transfección Xa línea celular deficiente de DHFR de CHO DUKX-B11 se cultivó en Mezcla Nutriente Ham F12 complementada con FBS al 10%, a 37°C, C02 al 5%. El día antes de la transfección, las células CHO DUKX-B11 se sembraron a 5xl05 células/9 cm placa. Los co-precipitados CaP04-ADN se prepararon al mezclar el ADN vector, disuelto en 0.45 ml de Tris-HCl lOmM pH 7.9, EDTA O.lmM, con 0.05 ml de una solución CaCl2 2.5M. A continuación, 0.5 ml de Na2HP04 280 mM, HEPES 50 mM pH 7.1 se agregó con agitación suave y la mezcla se mantuvo durante 30-40 minutos a temperatura ambiente, para permitir la precipitación. Después de agregar el ADN CaP04 a las células durante 30 minutos, 9 ml de medio de cultivo celular se agregaron y las células nuevamente se pusieron en el incubador durante 4 horas. Posteriormente, el medio se removió y las células osmóticamente sacudidas con glicerol al 10% en medio, durante 4 minutos. Las células luego se tripsinizan y subcultivan a 1:4 hasta 1:10 de relación de división en medios selectivos que consiste de Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) que carece de timidina pero complementado con 150 µg/ml de prolina y FBS al 10% dializado. Los cultivos se mantuvieron a 37°C y C02 al 8% y el medio selectivo se cambio cada 3-4 días .

Aislado de una línea celular que produce el hlFN-ß consti tutivo Las células que producen el interferón beta se aislaron después de 10-12 días por tripsinización con discos de papel empapados con tripsina de 3mm. Los cuarenta y tres clones se recogieron, los clones individuales se hicieron crecer y los sobrenadantes del cultivo celular se probaron durante la producción de hlFN-ß por ELISA. Tres clones que produjeron más de 30,000 IFN-ß IU/106 células/24 horas se seleccionaron para la amplificación de gen. Cada uno de los clones se sometió a cultivo con concentraciones bajas de MTX. La población celular completa que sobrevivió al tratamiento se sometió a concentraciones MTX más altas. El subclonado y la selección de clones se realizó solamente después de la última etapa de amplificación. Los productores superiores seleccionados (más de 400,000 IU/106 células /24 horas) se sometieron a estudios de estabilidad de clon. Un clon productor superior relativamente estable se seleccionó y subclonó. De los clones resultantes, se seleccionó un clon estable productor superior.

La amplificación incrementa los niveles de producción (productividad específica) de IFN-ß-la de 30,000 hasta 500,000 IU/106 células/24 horas, como se determina por ELISA. El análisis de inmunotransferencia Northern se realizó después del aislado inicial de los clones de productividad IFN-ß-la alta. Un hlFN-ß mARN de alrededor de 0.9 kb, como se espera del constructo de expresión, se expresó (datos no mostrados) . Para el análisis de inmunotransferencia Northern del ARN total de los clones primarios, la inmunotransferencia se preparó como sigue. Veinte µg del ARN total se separaron por electroforesis en gel de formaldehído de agarosa. El ARN se transfirió a una membrana de nylon e hibridizó a una sonda de ADN IFN-ß. Los marcadores de tamaño (M) son rARN de 28S y 18S, los cuales corresponden a 4700 y 1900 nucleótidos, respectivamente (no se muestra) .

Productividad La productividad celular luego se probó como sigue. El medio de cultivo de tejido (crecimiento) fue DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco), complementado con prolina (150mg/l) y FBS al 10% (suero bovino fetal) o en medio libre de suero, por ejemplo Ex-Cell 302 de JRH. Las células del interferón que producen el clon se sembraron en matraces TC80 (2 x 106 células /matraces) en 30 ml de medio de crecimiento (ya sea DMEM y FBS, o medio libre de suero) . Cuando se alcanzó la confluencia inicial, como se determina por examen con microscopio, el medio de crecimiento se reemplazó con 20 ml de medio fresco y los cultivos se incubaron a alrededor de 32°C durante 24 horas. Las muestras del medio de cultivo se obtuvieron de cada matraz. El nivel IFN-ß-la se determinó por ELISA del medio de cultivo con un kit ELISA comercial (por ejemplo, el kit ELISA Toray de Toray, Japón) . La productividad celular específica se calculó al multiplicar el IU/ml de IFN-ß-la producido por 24 horas por el volumen por matraz TC80 y dividir por el número celular completo (en millones) por matraz.

Resultados y conclusiones El clon de célula que produce el interferon beta fue una línea celular estable, que tiene una capacidad de producción alta para el interferon-ß humano recombinante en el rango de alrededor de 100,000 IU en productividad celular específica (IU/106 células/24 horas) y alrededor de 600,000 IU en productividad celular específica. La productividad media de la nueva línea celular fue 556,000 ± 119,000 IU/106 células /24 hrs . La morfología celular general también se examinó por microscopía de contraste de fase uno hasta cuatro días después de sembrarse. La morfología se documentó con fotomicrógrafos (no se muestran) . Los resultados muestran que una densidad inferior (24 hasta 48 hrs después del sembrado) las células muestran morfología en forma de aguja redondeada (los resultados no se muestran) . En confluencia, las células forman monocapas densas que comprenden células tipo epiteliales, empacadas herméticamente, más pequeñas, y en forma de aguja alargadas (los resultados no se muestran). Las características morfológicas mostradas por estas células fueron típicas de células CHO.

Determinación de secuencia de ADN de la región que codifi ca hlFN-ß en células del clon Los productos de ADN PCR derivados del ARN mensajero hlFN-ß (mARN) se usaron para determinar las secuencias de nucleótido de región codificada como la secuencia mARN que proporciona protección directa de los transcriptos ARN se procesan correctamente.

Procedimiento para procesado por secuencia de ADN Reacciones cADN y PCR El ARN celular total se preparó de las células en la etapa exponencial de crecimiento de cultivos de matraz T (Chomczynski and Sacchi, 1987). De manera complementaria el ADN (cADN) se sintetizó de las muestras del mARN en una reacción la cual contiene 2 microgramos (µg) de ARN total, 0.5 µM de hexámeros aleatorios, MgCl2 2.5 mM, solución amoritiguadora IX PCR II [Tris-HCl 10 mM (pH 8.3), KCl 50 mM] , 0.5 mM cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP, 40 unidades de inhibidor RNasa, y 200 unidades de Transcriptasa inversa en un volumen final de 100 µl . La plantilla de ARN, agua libre de nucleasa y cebador se combinaron e incubaron a 65°C durante 10 minutos y luego se colocaron en un baño de hielo. Los componentes restantes se agregaron y la reacción se incubó a 42°C durante 60 minutos, luego 70 °C durante 15 minutos y luego se mantuvo a 4°C indefinidamente. Los productos RT (cADN) se almacenaron a -20°C hasta su uso adicional. Como un control, una reacción con todos los componentes excepto con la transcriptasa inversa se preparó. El control "no RT" es para excluir la posibilidad de que no es posible de que las preparaciones de ARN tengan contaminación de ADN. La amplificación PCR se dio usando cebadores SRB1 API y AP2 para las plantillas de cADN. Las secuencias para estos cebadores son como siguen: SRB1 API: CCTCGGCCTCTGAGCTATTC (SEQ ID NO: 1) SRB1 AP2: CACAAATAAAGCATTTTTTT (SEQ ID NO: 2) Las reacciones de PCR consisten de lo siguiente: 4.0 µl de mezcla de reacción cADN, 50 pmol de cada uno del par cebador, y 25 µl HotStarTaq™ Master Mix en un volumen de reacción de 50 µl . Las reacciones se calentaron a 95°C durante 15 minutos después de 30-35 ciclos de: (a) 94°C durante 30 segundos, (b) 55°C durante 30 segundos, y (c) 72°C durante 1 minuto. Luego se dio un ciclo final, idéntico a los primeros 30-35, pero con el tiempo de incubación a 72°C extendido a 10 minutos . Los productos hlFN-ß PCR se purificaron por electroforesis en gel de agarosa (LMP) por punto de fusión inferior (LMP) seguido por extracción usando el kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen) .

Procesado por secuencia de ADN amplificado Los productos PCR se procesaron por secuencia directamente con el Kit de reacción de secuenciado rápido de ciclo terminador Big Dye™ con polimerasa de ADN AmpliTaq®. Todas las reacciones de secuencia se analizaron en geles al 5.75% Long Ranger™ en procesadores de secuencia de ADN automatizados ABI373-S. Los datos crudos se alinearon y analizaron usando software de análisis ABD.

Resultados La amplificación PCR resulta en la generación del fragmento 815 bp aproximado predicho. Los productos sin PCR se observaron para el control "no RT" no para los otros controles negativos.

Los datos de secuencia completos se obtuvieron para la región que codifica la proteína del gen hlFN-ß; todos los nucleótidos se leyeron en dos o más electroferogramas (los datos no se muestran) . Cuando las secuencias se compararon con el vector de expresión, no se encontraron diferencias (los datos no se muestran) .

Conclusiones Los datos de secuencia demuestran que el gen hlFN-ß integrado en las células del genoma del clon se transcribe correctamente en hlFN-ß mARN.

Determinación del número de copias del gen El número de copias del gen se determinó por análisis de inmunotransferencia Southern de digestión BamHl. Los cebadores específicos usados para construir las sondas del análisis del número de copias del gen son los siguientes : (i) 5': PR221626: ATGACCAACAAGTGTCTCCTCC (SEQ ID NO: 3) (ii) 3': PR231217 ACTTACAGGTTACCTCCGAAAC (SEQ ID NO: 4) Procedimientos para la prepacación de ADN genómico e inmunotransferencia Southern El ADN genómico se aisló de cultivo de matraz T que crecen exponencialmente de las células usando una modificación del método de desalado (Martínez et al., 1998). Brevemente, las células se volvieron a suspender en una solución amortiguadora Tris-NaCl-EDTA y luego se usaron con una solución amortiguadora Tris-NaCl-EDTA-SDS. Esta suspensión se trató durante la noche con proteinasa K. Después de la adición y centrifugación de una solución de sal saturada, el ADN genómico se precipitó por la adición de isopropanol a la fase acuosa. Después de un lavado de etanol al 70%, el peletizado de ADN se volvió a suspender en una solución TE/RNase A (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 20 µg/ml RNaseA) . Las alícuotas de todas las preparaciones de ADN genómico se digirieron con AflIII, Bbsl, Bgll, Dral, Hindi, PstI, y Xmnl . Los estándares se prepararon por digestión de la muestra de ADN del vector de expresión con la misma restricción de endonucleasas usada para las muestras genómicas. El ADN se fraccionó en tamaño por electroforesis en geles de agarosa y luego se transfieren en 10X SSC a las membranas de nylon por acción capilar. La cantidad de ADN genómico cargado fue 0.5 µg . Las inmunotransferencias se prepararon por hibridización a un fragmento hlFN-ß etiquetado con 32P que se amplificó por PCR del plásmido usando los cebadores indicados arriba. La prehibridización e hibridización se dio a 65°C. Las determinaciones de tamaño se hicieron con base en la migración de las bandas como se visualiza por 32P en un autoradiógrafo. El vector de expresión se usó como el control.

Las determinaciones del número de copias se basan en los niveles 32P relativos en las bandas como cuantificados en un Phospholmager™ modelo 445SI (Molecular Dynamics; Sunnyvale, CA) . Los autoradiógrafos se fotografiaron para proporcionar un registro de los resultados (los datos no se muestran) .

Resultados Las determinaciones de tamaño de los fragmentos generados por las células que producen el interferón beta del clon se compilaron para todas las digestiones. La digestión de enzima del ADN extraído de la línea celular que produce interferón beta resulta en la producción de bandas prominentes que acompañan a aquellas predichas del vector de expresión para las digestiones BamHl, Bgll, Dral e Hindi. Una banda muy tenue (-1.77 kb) se observó con los ADN genómicos que digieren Bgll, más probablemente un resultado de digestión incompleta. Estas enzimas de restricción flanquean la unidad de expresión hlFN-ß que indica que una unidad de longitud completa, funcional, intacta se ha integrado en el genoma. En las digestiones restantes, las diferencias en los patrones de bandas se observaron entre el vector de expresión y los ADN genómicos. Esto no se espera como alguna reconfiguración que debe ocurrir cuando los integrantes del vector circular en el genoma de célula CHO.

Los niveles del número de copias determinados para las células del clon fueron unas 96-105 copias promedio por célula. Por ejemplo, para un grupo de células, el número de copia del gen promedio (n=3) fue 105, con una desviación estándar de 23 y un CV (%) de 22.

Determinación de tamaño mARN El ARN total se aisló de células que producen el interferón beta que crecen exponencialmente y células CHO DUKX no transfectadas (Chomczynski and Sacchi, 1987). Las sondas usadas incluyen una sonda hlFN-ß etiquetada con 32P preparada como se describe en la sección "Determinación del número de copias del gen" y una sonda G3PDH cADN de control (Clontech; Palo Alto, CA) .

Procedimien to El ARN total, 5 µg por carril, se fraccionó en tamaño por electroforesis en geles de agarosa que contienen formaldehído como un desnaturalizante. Las muestras se cargaron en conjuntos duplicados. El ARN se transfirió en 10X SSC a membranas de nylon por acción capilar. La prehibridización e hibridización se dieron a 65°C en la solución Church y Gilbert modificada descrita en la sección "análisis de mapa de endonucleasa de restricción". Las inmunotransferencias se hibridizaron a una sonda hlFN-ß etiquetada con 32P y una sonda G3PDH cADN de control. Los tamaños de la banda se estimaron de un autoradiógrafo de las inmunotransferencias .

Resultados y conclusiones Una especie IFN-ß mARN mayor se observó para las células. El tamaño del mARN se estimó para ser 0.9 kb de mARN. Este tamaño se correlaciona bien al tamaño para un mARN partiendo del sitio de inicio de transcripción SV40 y resultando en un transcripto de alrededor de 800 nucleótidos sin considerar la extremidad polyA.

Conclusiones y resumen general Los estudios fenotípicos y genotípicos en las células que producen interferón beta confirman la identidad y consistencia de las células. La integración cromosómica del gen hlFN-ß en el genoma de células CHO se demostró por estudios de hibridación in-situ. En comparación con los patrones de mapeo de endonucleasa de restricción, las secuencias de ADN y el análisis mARN de células no muestra evidencia de reconfiguraciones de ADN grueso o mutaciones de punto del gen hlFN-ß. Los niveles de número de copia del gen hlFN-ß se midieron por análisis de inmunotransferencia Southern de ADN extraído de las células del clon de acuerdo a la presente invención. Los resultados muestran que los niveles del número de copias del gen están en los mismos rangos para todas las células, independientemente de los niveles de duplicado de la población. El análisis de inmunotransferencia Northern de ARN preparado de las células muestra una banda sencilla de aproximadamente 0.9 kb en tamaño Los análisis de secuencia del cADN de las células confirma las correcciones de la secuencia mARN, mientras que las secuencias de ADN genómicas de las regiones de control 5' y 3' del gen hlFN-ß verificaron la integración de la unidad de transcripción IFN-ß completa. En conclusión, se demostró que las células que producen interferón beta de los transcriptos hiFN-ß mARN sintetizados con la secuencia de región que codifica la proteína correcta, indican que las células que producen interferon beta producen IFN-ß (IFN-ß-la) recombinante humano con la secuencia de aminoácido primario correcto. Para la caracterización genotípica, el análisis de mapa de restricción se llevó a cabo en las células que producen interferón beta. Las digestiones múltiples se separaron por electroforesis en gel de agarosa, se transfieren a las membranas de nylon y se hibridizan a sondas etiquetadas específicas para el hlFN-ß. Los perfiles de fragmento de restricción consistentes, indican la integración de una unidad de expresión hlFN-ß funcional intacta, en todos los bancos de células . Los números de copias del gen hlFN-ß se determinaron por análisis de inmunotransferencia Southern de ADN extraído de las células que producen interferón beta (los datos no se muestran) . Los resultados muestran los números de copias del gen para ser alrededor de 100 copias por célula, las cuales son alrededor de cuatro veces mayor que el clon descrito en la literatura (Chernajovsky et al., 1984). Por análisis de inmunotransferencia Northern, un mARN de alrededor de 0.9 kb, codificado para el gen hlFN-ß, se identificó para las células del clon (los datos no se muestran) . Los hlFN-ß cADN preparados de las células mARN se procesaron por secuencia y los resultados muestran que para las células, la secuencia del gen hlFN-ß fue 100% idéntico a las secuencias esperadas. Así, el gen hlFN-ß se transcribió correctamente en mARN. La secuencia de ADN genómico de las regiones 5' y 3' que flanquean el gen hlFN-ß se determinó para las células del clon y se encontró para ser 100% idéntico a las secuencias correspondientes del vector de expresión y la secuencia publicada del gen hlFN-ß. La integración cromosómica sencilla del gen hlFN-ß también se demostró por hibridización in-situ fluorescente (FISH, los resultados no se muestran) .

El análisis presentado arriba también demuestra la estabilidad de la línea de producción. Así se puede asumir que el gen transfectado se integra establemente en el genoma de las células que producen interferón beta.

EJEMPLO 2 - PROCESOS PARA LA PRODUCCIÓN DE INTERFERON BETA El objetivo general de este experimento fue desarrollar un proceso para producir IFN-beta-la del clon descrito en el ejemplo 1 bajo condiciones libres de suero. El proceso libre de suero se desarrolló a una escala de bioreactor 75L con portadores Fibra-Cel® de lecho con empaque interno. Las células se descongelaron y expandieron durante 21 días en un medio libre de suero comercialmente disponible que tiene las siguientes modificaciones: Tabla 1 Modificaciones de medio libre de suero x 109 células se sembraron en el bioreactor 75L (sembrado superior) . Las corridas se dividieron en las siguientes fases: - una fase I de crecimiento a 37°C (hasta el día de trabajo 2 ó el día de trabajo 4 o cuando la relación de consumo de glucosa (GCR) fue >2.0±1.0 g.L_1.d_1) - una fase II de crecimiento a 35°C (hasta el día de trabajo 7 o cuando GCR>8.0±0.5 g.L_1.d_1) - una fase de producción a 33°C Esta estrategia de temperatura resulta en una productividad de alrededor de 6.0 x 106 IU/ml bio por día. Esta productividad es alrededor de cinco veces mayor que la productividad del clon descrito en la literatura (Chernajovsky et al., 1984) en medio que contiene suero. Se probó además sí la adición de N-Acetil-Cisteína (NAC) solo o en combinación con Zinc (NAC+Zn) tiene un efecto benéfico en la productividad. La adición de NAC o NAC + Zn incrementa la productividad alrededor de 12 x 106 IU /ml bio por día al final de la corrida. Una densidad de célula sembrada inferior al 66% (1.3.109 células) también se probó con objeto de evaluar su impacto en la duración de la fase en crecimiento, metabolismo y productividad. El metabolismo y productividad no se afectaron por el sembrado inferior. El único impacto del sembrado inferior fue la adición de dos días a la fase de crecimiento. En resumen, las condiciones finales usadas para la producción de interferón beta fueron como sigue: EJEMPLO 3 - PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE PROTEINA DE INTERFERON El proceso de purificación de la IFN-ß-la del sobrenadante de cultivo celular incluye cuatro etapas cromatográficas y cuatro de filtración, como se muestra en la Fig. 2. Las etapas de purificación se llevaron a cabo en el siguiente orden: • Etapa I: Clarificación de cosecha por filtración • Etapa II: Cromatografía de afinidad en una columna de flujo rápido Blue Sepharose 6 (6 FF) ; • Etapa III: Ultrafiltración • Etapa IV: Cromatografía de intercambio de catiiones usando preferiblemente una columna CM Sepharose FF; • Etapa V: Cromatografía hidrofóbica RP-CLAR; • Etapa VI: Ultrafiltración y diálisis; • Etapa VII: Cromatografía de exclusión de tamaño (SE); • Etapa VIII: Microfiltración.

La purificación del ingrediente activo inicia con la cromatografía de afinidad de pigmento en Blue Sepharose 6 FF (BS 6 FF) , la cual fue la etapa de purificación principal. La cantidad de proteínas derivadas de células hospederas así como ADN de la ruptura de células CHO se redujo por varios ordenes de magnitud y por lo tanto IFN-ß-la en el BS 6 FF eluido se enriqueció de manera importante. Antes el eluido se cargó en la siguiente columna de ultrafiltración y se llevó a cabo para reducir el volumen de solución y excluir el material de peso molecular inferior. Para obtener INF-ß-la altamente purificado, se han elegido tres tipos principales de las separaciones de proteína con base en la columna. La cromatografía de intercambio de iones en resina CM-sefarosa FF remueve el ácido nucleico y proteínas derivadas de FBS/CHO. La CLAR de fase inversa reduce los pirógenos, proteínas derivadas de célula hospedera de residuo y degrada las formas de IFN-ß-la. Una etapa de pulido final de filtración en gel se llevó a cabo usando resina Sephacryl S-100 HR. El eluido se microfiltró (0.22 µm) y se almacena a -70°C o debajo. Todos los materiales de partida usados para la preparación de soluciones amortiguadoras y soluciones de limpieza cumplen con el Ph. Eur. y/o USP o son de un grado analítico o reactivo.

EJEMPLO 4: ANÁLISIS DE SIALILACION El IFN-beta purificado se sometió a análisis del perfil de sialilación por ER-EM (Electro Rocío-Espectrometría de masa), con los siguientes resultados: EJEMPLO 5 - ANÁLISIS DE GLICOFORMA Con objeto de analizar además el IFN-ß-la obtenido de los nuevos procesos, las glicoformas de la proteína se analizaron. Como se describe previamente, las proteínas glicosiladas a menudo se presentan como una mezcla de glicoformas diferentes, o proteínas que tienen estructuras de sacárido diferentes en su glicosilación. Varias técnicas se usaron para analizar estas glicoformas, como se describe en mayor detalle a continuación, incluyendo espectroscopia de masa por electrorocío, FAB-MS, MALDI-MS, espectroscopia de masa tándem (EM/EM) y GC-EM (estudios de ligadura) . Estas técnicas diferentes todas muestran que las estructuras de sacárido diferentes estudiadas, tal estructura se presentó nuevamente en el IFN-ß-la obtenido del clon.

Determinación de la distribución de glicoforma por espectroscopia de masa por electrorocio Método Las muestras de volumen IFN-ß-la del interferón beta por el clon usando espectrometría de masa por electroroció (ES-EM) . El método por ejemplo se describe por Fenn, et al., (1989) . EM/EM de glicanos. Esta técnica permite el monitoreo rápido de la distribución de glicoforma de las muestras de volumen en el nivel de masa molecular. Este método por ejemplo se describe por Domon, B. and Costello, CE (1988) .

Resultados Los resultados se presentan en las Figuras 3-5C. Para todas las figuras, los dibujos esquemáticos de los diversos oligosacáridos se muestran en la parte superior de cada pico. Las figuras 3 y 4 muestran el espectro transformado ES-EM de varios lotes IFN-ß-la del interferón beta obtenido por los nuevos procesos. En todos las pruebas de lote, las glicoformas mayores fueron las estructuras de disialil fucosilada del núcleo (pico C) y carbohidrato biantenaria de (pico B) monosialilo y las glicoformas menores que corresponden a las estructuras biantenaria no sialilada fucosilada del núcleo (pico A) , la triantenaria trisialilada fucosilada del núcleo (pico E) y otras 2 estructuras de complejo menores focosiladas del núcleo (picos D y F) . Las señales menores a 22524 Da ± 0.01%m se atribuye a los glicanos difucosilados biantenarios de disialilo (NeuAc2. Hex5. HexNAc4. Fuc2) , se detectaron por ES-EM en muestra de IFN-ß-la derivados de interferón beta obtenido por los nuevos procesos. Esta glicoforma también se puede definir como glicano biantenaria con antena de sialilo Lewis X (Lex) . Deberá notarse que el glicano Lewis x (Lex) , está compuesto de Hex. La estructura HexNAc.Fuc, se encuentra comúnmente en las glicoproteínas en las superficies de tanto linfocitos (L-selectina) como células endoteliales especializadas (Cummings, 1999; Dell and Morris, 2001) . Otra glicoforma menor centrada a un valor de peso molecular medio de 22670 Da ± 0.01%, con cantidad promedio de 4% de todas las glicoformas y que se atribuye a un glicano trifucosilado biantenario de disialilo (Neu2Ac.Hex5. HexNAc4. Fuc3) se detectó por ES-EM en los lotes IFN-ß-la del interferón beta obtenido por los nuevos procedimientos, independientemente de la escala de producción. La cantidad promedio de esta glicoforma menor es de 4%, con un SD de 0.90.

Conclusiones El patrón de glicoforma de IFN-ß-la derivado del interferón beta obtenido por los nuevos procesos se analizó por ES-EM. Las señales menores, que se atribuyen a glicanos difucosilados, encontradas por ES-EM en IFN-ß-la de interferón beta obtenidas por los nuevos procesos, se detectaron por MALDI-EM. Una glicoforma menor adicional (promedio de 4% de glicoformas totales) , que se atribuye a una estructura trifucosilada, se detectó por ES-EM en el producto de interferón beta obtenido de los nuevos procesos.

Análisis de carbohidrato por FAB-EM, MALDI-EM, espectroscopia de masa (EM/EM) y GC-EM (estuidos de ligadura) Las muestras de volumen IFN-ß-la derivados de interferón beta obtenido por los nuevos procesos se sometieron a estudios de caracterización de carbohidrato extensivo. La composición de carbohidrato de IFN-ß-la se obtuvo usando FAB-EM, MALDI-EM, análisis Nanorocío-EM/EM y estudios de ligadura (GC-EM) de IFN-ß-la permetilado después de tríptico y digestión de péptido N-glicosidasa F. La determinación del sitio de glicosilación se realizó por análisis FAB-EM de péptido quimiotrípticos previamente digeridos con tripsina y N-glicosidasa F.

Método La mezcla de glicopéptido de péptido desdoblado trípticamente del IFN-ß-la se trató con la enzima de péptido-N-glicosidasa F (por ejemplo como se describe por Tarentino et al.1985) . Después de detener la reacción (al secarse por congelación) , la digestión resultante se purificó por cartucho Sep-pka C18. Los carbohidratos eluidos en la fracción de ácido acético al 5% se permetilaron usando NaOH/yoduro de metilo, como se describe por ejemplo, por Costello (1997). Una porción del glicano permetilado se analizó por FAB-EM de ion positivo (obtenido en rangos de masa inferiores por iones de fragmento y rangos de masa altos para iones moleculares), como se describe por ejemplo, por Barber, et al. (1981) and Taylor (1983) . La espectrometría de masa MALDI se llevó a cabo por ejemplo como se describe por Hillenkamp, et al., 1991. La espectrometría de nanorocío-masa se llevó a cabo como se describe por ejemplo, por Wilm and Mann 1996. El resto de los oligosacáridos permetilados se usaron para análisis por ligadura por derivación seguida por cromatografía líquida de gas/espectrometría de masa (GC/EM) , como se describe por ejemplo, por Gray, 1990. Finalmente, con objeto de observar el péptido que contiene el sitio de glicosilación potencial Asn 80, los péptidos trípticos se digieren con péptido N-glicosidasa F y se purifican por Sep-pak. Las fracciones de propanol (20%-40%) del Sep-pak se sub-digirió con quimiotripsina y se analiza por FAB/EM.

Resultados MALDI y FAB-EM de l os ca rbohi dra tos perme ti l a dos El estudio se condujo en proteína del interferón beta obtenido por los nuevos procesos. Un espectro MALDI representativo se presenta en la Figura 6. La lista correspondiente de señales m/z observadas en el espectro permetilado (MALDI-EM y FAB-EM) se presenta en la Tabla 3. Los resultados de todos los lotes indican la presencia de una estructura biantenaria disialilada predominante que tiene la composición de NeuAc2. Hexs . HexNAc . Fue, y una estructura biantenaria de monosialilo que tiene la composición de NeuAc . Hex5. HexNAc4. Fue . Los glicanos no fucosilados no se observaron . Las señales menores posiblemente corresponden a las siguientes estructuras de oligosacáridos también se observaron en todos los lotes: • Estructura biantenaria no sialilado (Hex5. HexNAc4. Fue) • Estructura triantenaria disialilado o biantenario disialilado con estructuras repetidas de N-acetil lactosamina (NeuAc2. Hex6.HexNAc5. Fue) • Estructura triantenaria trisialilado (NeuAc3. Hex6.HexNAc5. Fue) • Estructura triantenaria trisialilado con estructuras repetidas de N-acetil lactosamina o tetrantenaria trisialilado (NeUAc3-Hex7-HexNAc6-FuC) • Estructura biantenaria disialilada y mono sialilada con dos unidades de fucosa (NeuAc . Hex5. HexNAc4. Fuc2, NeuAc2. Hex5. HexNAc4. Fuc2 ) • Cantidades menores de estructuras trifucosiladas (NeuAc2. Hex5. HexNAc4. Fuc3) también se observaron en los lotes derivados del interferón beta obtenido por los procesos de acuerdo a la invención, pero estaban ausentes en referencia a IFN-ß-la. • Cantidad menor de ácido N-glicolilneuraminico como parte de los ácido siálicos de los glicanos.

Con relación a la abundancia de ácido N-glicolilneuraminico se calculó de los pesos de pico de señales en los datos MALDI-TOF y FAB del glicano ligado a N permetilado.

Como se espera las glicoformas IFN-ß-la contienen principalmente ácido N-Acetilneuramínico tipo la mayoría de glicoproteínas humanas.

Nanorocío EM/EM Con objeto de confirmar además las estructuras de las cantidades residuales de estructuras de oligosacárido multi-fucosilado ligado a N, el análisis EM/EM se llevó a cabo en los oligosacáridos permetilados de señales a m/z 919, 1040 y 1098 que son consistentes con los iones triplemente cargados ([M+3H]3+) para NeuAc . Hex5. HexNAc4. Fuc2, NeuAc2. Hex5. HexNAc . Fuc2 y NeuAc2-Hex5. HexNAc4. Fuc3 respectivamente. Los iones tipo A observados en el espectro EM/EM confirman las siguientes atribuciones de estructura: Tabla 2 EM IFN Beta Señal de nuevo Atribución pro EM/EM (m/z) proceso 919 No NeuAc . Hexs . HexNAc4. Fuc2 observado* 1040 + NeuAc2. Hexs . HexNAc . Fuc2 1098 NeuAc2. Hex5. HexNAc4. Fuc3 *Se observó una señal correspondiente por MALDI Análisis de ligadura por GC/EM Se obtuvieron cromatogramas de complejo GC para todos los lotes probados de interferon beta obtenidos por el proceso nuevo con algunos picos de impureza que se originan de los reactivos derivados. La comparación del tiempo de retención GC con una mezcla estándar de acetatos de aditol parcialmente metilado corre bajo las mismas condiciones GC lo que permite asignaciones provisionales de los picos que contienen azúcar. Los resultados de los análisis de ligadura de todas las muestras fueron esencialmente los mismos, lo que muestra la presencia de N-acetilglucosamina ligada a 4 (4-GlcNAc), N-Acetilglucosamina ligada a 4,6 (4,6-Glc-NAc), Mannosa ligada a 3,6 (3,6-Man), Mannosa ligada a 2 (2-Man), Galactosa terminal (t-Gal), Galactosa ligada a 3 (3-GaI) y Fucosa terminal (t-Fuc), que soportan fuertemente los datos FAB-EM. La Mannosa ligada a 2,6 se observó como un componente menor en todas las muestras, lo que indica la presencia de algunas estructuras triantenarias . Las estructuras de oligosacáridos principales postuladas observadas en las muestras de volumen IFN-ß-la se presentan en las Figuras 5A-5C. Estos datos sugieren que la porción de carbohidrato principal es una estructura biantenaria fucosilada de núcleo con uno y dos residuos de ácido siálico . Sitio de N-glicosilación por FAB-EM de los digeridos cimotrípticos Para todos los lotes IFN-ß-la probados, se observó una señal FAB-MS menos que se asignó a los residuos de péptido con sodio 80-88 ( D . E . T . I . V . E . N . L . L + Na+) con Asn-80 convertido al ácido aspártico después de la liberación del carbohidrato con péptido N-glicosidasa F. Este experimento proporciona evidencia de respaldo que Asn-80 efectivamente se glicosila. La Figura 6 muestra el espectro MALDI de IFN-ß-la con glicanos permetilados (lista de señales en la Tabla 3) . Nuevamente, como se muestra en la Tabla y la Figura acompañante, el IFN-ß-la obtenido del proceso de acuerdo con la presente invención contiene la estructura de trifucosa, NeuAc2-Hex5. HexNAc4. Fuc3 como se describe previamente.

Tabla 3 La lista de señales en el espectro permetilado de IFN-ß-la obtenido por el proceso nuevo después de digestión de N-glicosidasa F de péptido y triptica Conclusiones Los análisis MALDI-EM y FAB-EM de N-glicanos permetilados de muestras de volumen IFN-ß-la obtenidas por el proceso nuevo que muestra las siguientes estructuras de carbohidrato flucosiladas al núcleo (no se observaron glicanos no fucosilados) : Glicoformas mayores: • Estructura biantenaria monosialilada (NeuAc Hex5. HexNAc4. Fue) • Estructura biantenaria disialilada (NeuAc2 Hex5.HexNAc4. Fue) Glicoformas menores: • Estructuras biantenarias no sialiladas (Hexs. HexNAc . Fue) • Estructura triantenaria disialilada o biantenaria disialilada con estructuras de repetición de N-acetil lactosamina (NeuAc2 Hex6. HexNAc5. Fue) • Estructura triantenaria trisialilada (NeuAc3. Hex6. HexNAc5- Fuc) • Triantenaria trisialilada con estructuras de repetición de N-acetil lactosamina o estructuras tetranatenarias trisialiladas (NeUAc3-Hex7-HexNAc6-Fuc) • Estructura biantenaria diasialilada y monosialilada con dos unidades de fucosa (NeuAc. Hexs . HexNAc4. Fuc2, y NeuAc2- Hex5. HexNAc . FuC2) • Estructura biantenaria diasililada con tres unidades de fucosa (NeuAc2-Hex5. HexNAc4. FuC3) Los EM/EM de nanorocío de los glicanos permetilados confirman la detección de niveles residuales de oligosacáridos NeuAc2Hex5. HexNAc . Fuc2 en todas las muestras mientras que los residuos de NeuAc2. Hexs. HexNAc . Fuc3 se observaron sólo en IFN- ß-la del proceso de la presente invención. Los análisis de ligadura conforma los monosacáridos esperados detectados con los datos FAB-EM. Finalmente, en el producto IFN-ß-la obtenido del proceso nuevo, el análisis FAB-EM detallado del péptido tríptico y quimiotríptico indica la presencia de ligadura N-glicano en Asn-80. La abundancia relativa de ácido N-glicolilneuramínico se calculó de las alturas pico de señales en los datos FAB y MALDI-EM de glicano ligado a N permetilado. La relación de ácido N-acetilneurámico: ácido N-glicolilneurámico fue 31.7:1.0 en una muestra y sugiere que el 3.1% del ácido siálico es ácido N-glicolilneurámico. Estos resultados están de acuerdo con niveles similares (5%) obtenidos para interferón humano natural producido por fibroblastos humanos. Como se espera, las glicoformas IFN-ß-la contienen principalmente ácido N-acetilneurámico tipo la mayoría de las glicoproteínas humanas.

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Claims (32)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un proceso para la fabricación de interferón beta humano recombinante glicosilado, caracterizado porque comprende la etapa de cultivar una célula que produce interferón beta humano en un medio libre de suero, el medio libre de suero comprende: - alrededor de 10 hasta alrededor de 30 mM de HEPES, preferiblemente 20 mM de HEPES; - alrededor de 0.5 hasta alrededor de 3 mM de Prolina, preferiblemente alrededor de 1 mM de Prolina; y - alrededor de 5500 hasta alrededor de 7000 mg/L de cloruro de sodio, preferiblemente alrededor de 6100 mg/L de cloruro de sodio.
2. 2. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el medio libre de suero comprende además alrededor de 10 hasta alrededor de 20 mg/L de Fenol Rojo, preferiblemente alrededor de 15 mg/L Fenol Rojo.
3. 3. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende una fase I de crecimiento, una fase II de crecimiento y una fase de producción, en donde la fase I de crecimiento se lleva a cabo a alrededor de 37°C, la fase II de crecimiento se lleva a cabo a alrededor de 35°C, y la fase de producción se lleva a cabo a alrededor de 33°C.
4. 4. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el proceso es un proceso de perfusión con una relación de dilución en el rango desde alrededor de 1 hasta alrededor de 10, preferiblemente desde alrededor de 1.5 hasta alrededor de 7 por día.
5. 5. El proceso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la relación de dilución se incrementa dentro de las primeras dos o tres semanas del cultivo celular desde un valor inicial de alrededor de 1 hasta 2 por día hasta un valor de alrededor de 7 hasta 10 por día.
6. 6. Un proceso para la purificación de interferón beta humano recombinante de un fluido, preferiblemente un sobrenadante de cultivo celular, caracterizado porque comprende las etapas de: a) Someter el fluido a cromatografía de afinidad; b) Someter el eluido de la cromatografía de afinidad a cromatografía de intercambio de cationes; c) Someter el eluido de la cromatografía de intercambio de cationes a cromatografía hidrofóbica por RP-CLAR.
7. 7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende, antes de la etapa (a) , clarificar el fluido por filtración.
8. 8. El proceso de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque comprende además las etapas de: d) realizar ultrafiltración y diálisis, e) someter el dialisado a cromatografía de exclusión de tamaño, f) someter el eluido de la cromatografía de exclusión de tamaño a microfiltración.
9. 9. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 6 hasta 8, caracterizado porque la etapa (a) se lleva a cabo en Sefarosa Azul y la etapa (b) se lleva a cabo en Carboximetil Sefarosa.
10. 10. Un proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque es seguido por un proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 6 a 9.
11. 11. Un proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende además la etapa de formular el interferón beta purificado en una composición farmacéutica, opcionalmente junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
12. 12. Una composición de interferón beta recombinante glicosilada, caracterizada porque se obtiene por un proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes .
13. 13. La composición de interferón beta de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende una estructura de oligosacárido que comprende dos o tres sacáridos de fucosa.
14. 14. La composición de interferón beta de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, caracterizada porque la estructura de oligosacárido comprende un glicano trifucosilado biantenario de disialilo (Neu2Ac.Hex5. HexNAc4. FuC3) .
15. 15. La composición de interferón beta de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizada porque comprende además una o más de las siguientes estructuras de oligosacáridos: una estuctura biantenaria no sialilada (Hexs . HexNAc4. Fue) ; - una estructura triantenaria disialilada o biantenaria disialilada con estructuras de repetición de lactosamina de N-acetilo (NeuAc2. Hex6. HexNAc5. Fue) ; una estructura triantenaria trisialilada (NeuAc3. Hex6. HexNAc5. Fue) ; una estructura triantenaria trisialilada con estructuras de repetición de lactosamina de N-acetilo o tetrantenarias triasialiladas (NeUAc3-HeX7-HeXNAC6-FuC) ; - una estructura biantenaria disialilada y mono sialilada con dos unidades de fucosa (NeuAc . Hex5. HexNAc4. Fuc2, NeuAc2. Hex5. HexNAc4. FuC2 ) .
16. 16. La composición de interferón beta de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizada porque por un perfil de sialilación que comprende alrededor de 1 hasta alrededor de 5% de N-glicanos no sialilados, alrededor de 5 hasta alrededor de 25% de glicanos mono-sialilados, alrededor de 55 hasta alrededor de 75% de N-glicanos di-sialilados, alrededor de 10 hasta alrededor de 25% de N-glicanos tri-sialilados .
17. 17. El uso del interferón beta humano recombinante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 12 a 16 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento contra la esclerosis múltiple.
18. 18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde la esclerosis múltiple se selecciona del grupo que consiste de esclerosis múltiple recidivante, no recidivante y de inicio temprano.
19. 19. El uso de interferón beta humano recombinante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 12 a 16 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento contra el cáncer.
20. 20. El uso de interferón beta humano recombinante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 12 a 16 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento contra infecciones virales.
21. 21. El uso de un medio de cultivo celular libre de suero que comprende - alrededor de 10 hasta alrededor de 30 mM de HEPES, preferiblemente 20 mM de HEPES; - alrededor de 0.5 hasta alrededor de 3 mM de Prolina, preferiblemente alrededor de 1 mM de Prolina; y - alrededor de 5500 hasta alrededor de 7000 mg/L de cloruro de sodio, preferiblemente alrededor de 6100 mg/L de cloruro de sodio, para el cultivo de una célula que produce interferón beta humano recombinante.
22. 22. Un artículo de fabricación, caracterizado porque comprende material de empacado y una cantidad terapéuticamente efectiva de un interferón beta recombinante purificado, aislado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 12 a 16, u obtenido en un proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el material de empacado comprende una etiqueta o inserto de empaque que indica que el interferón beta humano recombinante puede administrarse a un humano para el tratamiento del mismo.
23. 23. Un ácido nucleico, caracterizado porque comprende la secuencia que codifica el interferón beta humano ligado funcionalmente a la región de poliadenilación temprana SV40 T Ag, en donde el ácido nucleico no comprende la señal de poliadenilación de interferón beta.
24. 24. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el gen interferon beta humano no comprende el interferón beta 3' UTR.
25. 25. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 23 ó 24, caracterizado porque comprende además el promotor/aumentador SV40 ligado funcionalmente a la secuencia que codifica el interferón beta.
26. 26. El ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23 a 25, caracterizado porque comprende además un gen DHFR de ratón.
27. 27. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el gen DHFR de ratón se liga funcionalmente a una región de poliadenilación temprana que contiene SV40 T Ag polyA.
28. 28. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26 ó 27, caracterizado porque además comprende el promotor/aumentador SV40 ligado funcionalmente al gen DHFR de ratón.
29. 29. Un plásmido, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23 hasta 28.
30. 30. Una célula hospedera, caracterizada porque se transforma con el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 29.
31. 31. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque es una célula de ovario de hámster chino (CHO) .
32. 32. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la célula que produce el interferón beta es una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 30 ó 31.