MX2008000410A

MX2008000410A - Fitasa de debaryomyces castellii.

Info

Publication number: MX2008000410A
Application number: MX2008000410A
Authority: MX
Inventors: Hel Ne Boze; Andre Aumelas; Guy Moulin
Original assignee: Adisseo France Sas
Priority date: 2005-07-08
Filing date: 2006-07-07
Publication date: 2008-03-10
Also published as: DK1915442T3; CN101263226B; US20100266721A1; KR20080047352A; ZA200800446B; JP2009500029A; FR2888250A1; AU2006268480B2; CN101263226A; PL1915442T3; WO2007006953A1; EP1915442A1; BRPI0612650A2; UA94712C2; EP1915442B1; RU2008101938A; AR054160A1; NO20080702L; CA2614368A1; SI1915442T1

Abstract

Se describe un gen que codifica para una fitasa de Debaryomyces castellii que hidrolisa los seis enlaces fosfato del fitato. Se describen los usos de estas fitasas en los aditivos nutricionales o los alimentos para animales donde se mejora la capacidad de digestion y el valor nutricional.

Description

FITASA DE DEBARYOMYCES CASTELLII CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención ee refiere a una fitaea de Debaryomyc.es castellii , el gen que codifica para eeta fitaea, loe organiemoe hoepederoe recombinantes que expresan esta fitasa así como sus aplicaciones en el campo de la nutrición animal, principalmente .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las salee del ácido fítico (mioinoeitol-hexakie-foefato) o loe fitatoe (mioinositol-hexakie (fosfato diácido) son la forma principal de almacenamiento del fósforo en los cereales, lae plantae leguminoeae y lae oleaginosas. Estos constituyen aeí la fuente principal de fósforo en los alimentos para animales a base de plantas, compuestoe principales de los regímenes de los animales monogástricoe (aves de corral y cerdoe) . No obetante, la biodisponibilidad de eete fósforo en loe alimentoe eetá limitada para eetoe animalee. En efecto, éetoe no poeeen lae enzimae inteetinalee que degradan los fitatos en cantidad suficiente para permitir la hidrólisie de los fitatos, y proporcionar de este modo las cantidades de fóeforo inorgánico que le eon neceeariae . En el contexto de la nutrición animal, doe caracteríeticae del ácido fítico juegan de eete modo un papel importante: (1) los REF.: 189323 animalee monogáetricoe eon débilmente capacee de degradar el ácido fítico en el aparato -digestivo; (2) el ácido fítico es un factor antinutricional, que forma complejos -con las proteínas y los inones (Fe3+, Ca2+, Zn2+, Mg2+) y disminuye por lo tanto la disponibilidad de estoe elementos. Las proporciones alimenticias de las aves de corral y de los cerdos deben ser pues suplementadae en foefato inorgánico mientrae que el fósforo de los fitatos es excretado y contribuye a la eutrofización de las aguas superficiales en las zonas de crianza intensiva de animales monogástricos. La complementación -de las raciones de loe animales monogástricoe por lae enzimae ee una eolución actualmente empleada para mejorar la biodieponibilidad del fóeforo ligado al fitato, y para dieminuir la euplementación de los alimentos con fósforo inorgánico y reducir de este modo la excreción de fósforo en las zonas de crianza intensiva. Las fitasas (3- y 6- fosfohidrolasas de hexakie-foefato de mioinosi ol EC 3.1.3.8 y 3.1.3.26) forman parte de la familia de las histidinae-fosfataeae ácidae. Eetas catalizan la hidrólieie del hexakisfosfato de mioinositol (ácido fítico IneP6) en monofoefato inorgánico y en foefato de mio-inoeitol de grado de fosforilación inferior (InsP5 a InePi) y en mio-inoeitol libre en ciertoe caeoe . Eetas enzimas utilizadae como aditivo en la alimentación animal, permiten por una parte aumentar la disponibilidad del fósforo fítico, por otra parte mejorar la digestibilidad de los alimentos. Además, la liberación de fosfato fítico disminuye considerablemente los costoe debidoe a la suplementación en fosfato, así como la contaminación provocada por un exceso de fosfatos excretados. Las fitasae eon producidas por una gran variedad de organiemos: plantas, animales y sobre todo microorganismos. Entre los microorganismos productores de fitasas se citarán principalmente: los hongos de los géneros Aspergillus, Penicillium, Mucor y Rhizopus , las bacterias: Pseudomonas sp . , Klebsiella sp . , Escherichia coli , Enterobacter sp . , Bacillus eubtilie y las levaduras: Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomycee caetellii , Debaryomycee occidental ie , Kluyveromyoss frágil ie y Schwanniomycee caetellii . En lo que concierne a las levaduras, Lambrechts et al. (Biotechnology Lettere, Vol. 14, no. 1, 61-66, 1992) han identificado diferentee cepae que tienen una actividad de fitaea, pero no han caracterizado las fitasas correspondientes. La actividad mae elevada ha sido medida para la cepa CBS2863 de Schwanniomycee caetellii . Las actividades de fitaea han eido obeervadas igualmente para Candida brumptii CBS 6145, C. tropicalie CBS5696, Debaryomycee caetellii CBS 2923, Kluyveromycee fragilie n°lll, K. fragilie CBS 1555, K. fragilie CBS 5795, Saccharomycee cerevieiae CBS 1253, Schwanniomycee -caetellii CBS 2863, Torulopeie candida CBS 940, C. melibioeica CBS 584, K. lactie CBS 2359, T. bovina CBS 2760 y Zygoeaccharomycee f-ermentati CBS6772. De igual modo, Nakamura Yoehihiro et al. (Bioeci. Biotechnol. Biochem., Vol. 64, no. 4, 841-844, 2000) han identificado diferentes fitasae, pero no lae han caracterizado . Hay que hacer notar ademáe que la clasificación de las levaduras ha sido revisada. De acuerdo a la nueva clasificación (Nakase T., Suzuki M. , Phaff HJ. and Kurtzman C.P., 1998 pl57-167 in C. P. Kurtzman and J.W. Fell (ed) , The Yeaste, A taxonomic study, 4eme Ed. Elsevier Sci. Publication Amsterdam) , la cepa CBS 2923 corresponde a Debaryomycee caetellii Capriotti y la cepa CBS 2863 corresponde a Debaryomycee occidentalie Klocker variedad occidental, sinónimoe Schwanniomycee caetellii Capriotti y Schwanniomycee occidentalie Kloker. Loe inventoree han moetrado que la alineación del polipéptido de la SEQ ID No. 2, ee decir la eecuencia de la fitasa de Debaryomycee caetellii CBS 2923, conduce a un porcentaje de identidad de 69.2% con la eecuencia de la fitaea de Schwanniomycee occidentalie CBS 2863. Numeroeas fitasae de microorganismoe han sido ya estudiadas y utilizadas en las diversas aplicaciones agroindustrialee . No obetante, la utilización creciente de lae fitaeae como aditivo en las numeroeae aplicacionee biotecnológicae, tal como la alimentación animal aumenta el interée: (1) de aielar loe nuevos microorganismos productores eficaces de lae fitaeae, (2) obtener lae fitaeae funcionales, es decir que presenten una eficacia para liberar los fosfatos del alimento en el tracto digestivo, una estabilidad al calor durante el proceso de fabricación del alimento y durante el almacenamiento, y un bajo costo de producción. Además, la mayor parte de las fitasae deecritas hasta ahora no hidrolizan más que parcialmente el ácido fítico y algunos con cinéticas muy lentae. Ademáe, eu actividad -de hidrólieis depende fuertemente de sus condiciones de operación. Hasta hoy en día, entre las levadurae, eolo la fitaea de la levadura S-chwanniomycee occidentalie ha eido descrita como hidrolizadora de todos los grupos fosfato del fitato (Patente europea EP 0 699 762 y Segueilha L., Lambrechts C, Boze H., Moulin G., Galzy P., (1992) Purification and propertiee of a phytaee from Schwanniomyces caetellii, J. Ferm. Bioeng., 74, 7-11). No obstante, la fitasa de Schwanniomycee occidentalie es seneible a loe cationes (ZnCI2 y CuCI2 principalmente) lo cual no es favorable para una utilización en alimentación animal, porque estoe cationee eetán preeentes en el bolo alimenticio (Segueilha et al., 1992). Además, está enzima es activada en un intervalo de pH de 2.7 a 5 (EP 0 699 762) y el pCMB inhibe fuertemente la actividad de la fitaea de Schwanniomyces occidentalis, lo que eugiere que loe grupoe SH (puentes dieulfuro) eetán implicadoe en el eitio activo de la enzima (Segueilha et al., 1992). Ademáe, la bioeínteeis le esta fitasa necesita la presencia de fitasae y de sales de -calcio (EP 0 699 762) . La actividad de esta enzima depende pues fuertemente del ambiente en el cual ésta se ^encuentre. El problema que se propone resolver la presente invención consiete en proponer una fitasa que hidrolice todos los grupos fosfato del fitato, y por lo tanto la actividad depende poco de las condicionee de pueeta de operación de la enzima. Eete problema es resulto por la fitasa de la SEQ ID No. 2. De manera ventajosa, esta fitasa es capaz de hidrolizar la totalidad de los grupos fosfato del fitato, hasta la liberación del mioinositol. Ésta posee igualmente un gran espectro de actividad e hidroliza de este modo numerosos subetratoe. De manera ventajosa la biosíntesie de eeta fitaea ee inducida por loe fitatoe, inclueo en ausencia de salee de calcio. Ventajosamente, esta fitasa es activa en un intervalo de pH grande (pH 3 a 6.5) y no es seneible a loe cationee o a pCMB. La enzima ee igualmente termoeetable haeta 66 SC. La enzima de la preeente invención es pues extremadamente robusta, lo que es favorable para una utilización en alimentación animal, pero también en otras aplicaciones industriales .

La invención se refiere también a las fitasae eimilaree u homologae, a lae variantes y a los fragmentos de la fitaea de la SEQ ID No. 2 que coneervan lae mismae propiedades .

Deecripción de lae eecuenciae SEQ ID No. 1: eecuencia genómica del gen de la fitaea de Debaryomycee caetellii CBS 2923. SEQ ID No. 2: Secuencia de la fitaea de Debaryomycee caetellii CBS 2923. SEQ ID No. 3: Secuencia de consenso de las fosfataeae ácidae. SEQ ID No. 4: Porción de la fitaea de Debaryomycee caetellii correepondiente a la secuencia de consenso de las fosfatasae acidas de la SEQ ID No. 3. SEQ ID Nos. 5-16: cebadores para la clonación. SEQ ID Nos. 17-18: Péptidos de la fitaea de Debaryomycee caetellii utilizadoe para la clonación del gen.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención tiene por objetivo los polipéptidos que comprenden un polipéptido elegido entre los siguientee polipéptidoe : - el polipéptido de la SEQ ID No. 2, - un fragmento del polipéptido de la SEQ ID No. 2 que tiene una actividad de fitaea, - un polipéptido que tiene una actividad de fitaea y que preeente al menoe un 90% de identidad con el polipéptido de la SEQ ID No. 2. La invención tiene también por objetivo loe polinucleótidoe que codifican para una actividad de fitaea, elegidoe entre loe eiguientee polinucleótidos : el polinucleótido donde la secuencia está comprendida entre la posición 1538 y la posición 2923 de la SEQ ID No. 1, - un polinucleótido que codifica para un polipéptido de acuerdo a la reivindicación 1. La invención se refiere también a los polinucleótidos que tienen la secuencia de la SEQ ID No. l o la secuencia complementaria a la SEQ ID No. 1. La invención se refiere también a los casetes de expresión que comprenden en el sentido de la transcripción: - un promotor funcional en un organismo hospedero; - un polinucleótido de acuerdo a la invención; y - una secuencia terminadora en el mismo organismo hospedero . La invención se refiere igualmente a los vectores que comprenden un polinucleótido de acuerdo a la invención y/o un cásete de expresión de acuerdo a la invención. Otro objetivo de la presente invención es un organismo hospedero transformado con un polinucleótido de acuerdo a la invención, un cásete de expresión de acuerdo a la invención y/o un vector de acuerdo a la invención. De preferencia, el organismo hospedero es elegido entre las levaduras y los hongos filamentosos. Preferentemente, el organismo hospedero es elegido entre Debaryomycee caetellii , Pichia pas tor ie, Penicillium funiculoeum y Schizoeaccharomycee pombe. La invención tiene por objetivo los aditivos nutricionales para animales, que comprenden un polipéptido de acuerdo a la invención. La invención tiene también por objetivo los aditivos nutricionales para animales, que comprenden un organismo hospedero de acuerdo a la invención y/o un mosto de fermentación de un organismo hospedero de acuerdo a la invención. En una modalidad de realización de la invención, el aditivo nutricional para animales se presenta bajo la forma líquida o bajo la forma de polvo. La invención se refiere a los alimentos para animales que comprenden una base nutricional para animales y un aditivo nutricional para animalee de acuerdo a la invención. La invención ee refiere igualmente a los alimentos para animales que comprenden un polipéptido de acuerdo a la invención, un organismo hospedero de acuerdo a la invención y/o un mosto de fermentación de un organismo hospedero de acuerdo a la invención. La invención se refiere igualmente a la utilización de un polipéptido de acuerdo a la invención o de un organismo hospedero de acuerdo a la invención, para la fabricación de un aditivo nutricional para animales o de un alimento para animales . Otro objetivo más de la presente invención es la utilización de un polipéptido de acuerdo a la invención o de un organismo hospedero de acuerdo a la invención, para la hidrólisis del hexakisfoefato de mioinositol en monofosfato inorgánico, en mioinositol de grado de fosforilación inferior y en mioinositol libre.

Polipéptidos La presente invención se refiere pues a los polipéptidos que tienen una actividad de fitasa. De preferencia, estoe polipéptidos eon aislados de Debaryomycee caetellii . La fitasa de Debaryomycee caetellii CBS 2923 es representada en la SEQ ID No.2. Se entiende por " fitaea" , la 3- y 6- foefohidrolaeae del hexakiefoefato de mioinositol (EC 3.1.3.8 y 3.1.3.26). Estae enzimas catalizan la hidrólisis del hexakis fosfato de mioinositol (ácido fítico, InsPe) en monofoefato inorgánico y en fosfato de mioinositol de grado inferior (InsPs a InePP) y en mioinoeitol libre para ciertas fitasae. La fitaea de Debaryomycee caetellii de la SEQ ID No. 2 ee una 3- fitaea. Ademáe, éeta poeee la capacidad notable de hidrolizar la totalidad de loe enlacee foefato del ácido fítico. La fitasa de la SEQ ID No. 2 comprende la porción RHGERYP (SEQ ID No. 4) correspondiente a la secuencia de conseneo RHGXRXP (SEQ ID No. 3) preeente en el eitio activo de numerosas fosfataeae ácidae . Eeta porción ee encontrada en los aminoácidos 72-78 de la SEQ ID No. 2. La fitasa de la SEQ ID No. 2 posee igualmente la porción HD presente en numerosae fitaeae. Eeta porción ee encontrada en la parte C-terminal para loe aminoácidos 335-336 de la SEQ ID No. 2. En una modalidad de realización preferida de la invención, los polipéptidos de acuerdo a la invención poseen la porción RHGERYP u otra porción correspondiente a la secuencia de consenso RHGXRXP. Preferentemente, los polipéptidos de acuerdo a la invención poseen igualmente una porción HD. En una modalidad de realización preferida, los polipéptidos de acuerdo a la invención están glucosiladoe . El polipéptido de la SEQ ID No. 2 posee principalmente sitioe putativoe de N-gluooeilación para loe aminoácidoe Asn 97, Asn 158, Aen 189, Aen 249, Aen 303, Aen 314, Aen 387, Aen 439 y Aen 453; y loe sitios putativos de O-glucosilación para aminoácidoe Thr 165, Ser 168, Thr 360 y Ser 364. En una modalidad de realización preferida, el polipéptido de la SEQ ID No. 2 ee glucoeilado en uno o varioe de eeoe eitios putativos de N-glucosilación y de O-glucosilación. En una modalidad de realización, los polipéptidos de acuerdo a la invención eetán glucosiladoe . La fitaea de la SEQ ID No. 2 poeee igualmente 8 cieteínae eueceptibles de formar 4 puentes disulfuroe: Cye 62, Cys 214, Cys 262, Cys 275, Cys 385, Cys 405, Cys 413 y Cys 435. En una modalidad de realización, los polipéptidos de acuerdo a la invención llevan al menos un puente disulfuro. La fitasa de Debaryojnyces -caetellii es una enzima secretada por esta levadura en su ambiente extracelular. Para la expresión y la secreción por un organismo hospedero recombinante, la fitaea de la SEQ ID No. 2 puede ser fusionada en su extremo N-terminal con un polipéptido de señal reconocido por este organismo hospedero. La invención se refiere igualmente a los fragmentos del polipéptido de la SEQ ID No. 2 que conservan una actividad de fitasa. El término "fragmento" de un polipéptido designa un polipéptido que comprende una parte pero no la totalidad del polipéptido de donde ee derivado. La invención se refiere también a un polipéptido que comprende un fragmento de al menoe 100, 200, 300 ó 400 aminoácidoe del polipéptido de la SEQ ID No. 2. Este fragmento del polipéptido de la SEQ ID No. 2 conserva su actividad de fitasa. La invención ee refiere puee a loe fragmentoe biológicamente activos del polipéptido de la SEQ ID No. 2. El término "fragmento biológicamente activo" designa un fragmento de un polipéptido que conserva la función del polipéptido de donde es derivado. Los fragmentos biológicamente activos de la SEQ ID No. 2 conservan de este modo las propiedades catalíticas de la fitaea de Debaryomy-c-es caetellii de la SEQ ID No. 2. Loe métodoe de preparación de loe fragmentos de un polipéptido, así como las técnicas de medición de la actividad de fitasa eon bien .conocidae por el experto en la materia. La invención tiene por objetivo loe polipéptidos que tienen una actividad de fitasa y que presentan al menos 9-0 % de identidad con el polipéptido de la SEQ ID No. 2. La invención tiene también por objetivo los polipéptidos que presentan al menoe 80%, 90%, 95%, 98% y preferentemente al menoe 99% de aminoácidoe idénticoe con el polipéptido la SEQ ID No. 2. De preferencia, eetoe polipéptidoe tienen las mismas propiedades y principalmente las mismas propiedades catalíticas que los polipéptidos de la SEQ ID No. 2. Preferentemente, eetoe polipéptidoe eon aieladoe de otrae cepae de Debaryomycee caetellii o de otrae levadurae . Alternativamente, eetoe polipéptidoe pueden eer obtenidoe mediante técnicae de mutagéneeie dirigida, por ejemplo. Por aminoácidos idénticos, se entienden los aminoácidos no variantes entre dos secuencias. Estos polipéptidos pueden presentar una eupreeión, una adición o una eubetitución de al menoe un aminoácido con relación al polipéptido de la SEQ ID No. 2. La invención tiene igualmente por objetivo loe polipéptidoe que preeentan al menoe 80%, 90%, 95%, 98% y preferentemente al menoe 99% de similitud con el polipéptido de la SEQ ID No. 2. De preferencia, estoe polipéptidos tienen lae miemae propiedades y principalmente las mismae propiedadee catalíticae que loe polipéptidoe de la SEQ ID No. 2. Preferentemente, eetoe polipéptidoe eon aielados de otras cepas de Debaryomycee caetellii o de otras levaduras. Alternativamente, estos polipéptidos pueden ser obtenidos por técnicas de mutagénesie dirigida, por ejemplo. Por similitud, se entiende la medida de la semejanza entre secuencias proteicas o nucleicas. Estos polipéptidos pueden presentar una supresión, una adición o una subetitución de al menoe un aminoácido con relación al polipéptido de la SEQ ID No. 2. El grado de eimilitud entre doe eecuenciae, cuantificado por una calificación, está basado en el porcentaje de entidades y/o de subetitucionee -coneervadorae de lae eecuencias . Los métodos de medición y de identificación del grado de identidad y del grado de similitud entre polipéptidos son conocidos por el experto en la materia. Se puede emplear por ejemplo el vector NTi 9.1.0, programa de alineamiento AlignX (algoritmo Clustal W) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com). De preferencia, se utilizan los parámetros por omisión. Los polipéptidos de acuerdo a la invención son aisladoe o purificadoe de eu ambiente natural. Los polipéptidos pueden ser preparados por medio de diferentes procedimientos . Estos procedimientos eon principalmente la purificación a partir de fuentee naturalee talee como las células que expresan naturalmente eetoe polipéptidoe, la producción de polipéptidoe recombinantee por las células hospederae apropiadas, y su purificación ulterior, la producción por síntesis química o, finalmente, una combinación de estoe diferentes procedimientos. Eetoe diferentes procedimientos de producción son bien conocidos por el experto en la materia. De este modo, las fitasae de la presente invención pueden eer aieladae a partir de Debaryomyces caetellii . En otra modalidad de realización, lae fitaeae de la presente invención son aisladas a partir de organismos hospederos recombinantes que expresan una fitasa de acuerdo a la invención. La invención tiene igualmente por objetivo las proteínas de fusión, las proteínae r-ecombinatee o las proteínas quiméricas que comprenden loe polipéptidos de acuerdo a la invención. El término "polipéptido" designa igualmente las proteínas así como los polipéptidos modificadoe. Loe polipéptidoe de acuerdo a la invención tienen una actividad de fitasa. Preferentemente, los polipéptidos presentan una actividad de 3-fitasa y poseen la capacidad de hidrolizar la totalidad de los enlaces foefato del ácido fítico.

Polinucleótidoe La invención ee refiere también a loe polinucleótidoe que codifican para una fitasa de acuerdo a la invención. De preferencia, .estoe polinucleótidos codifican para la fitasa de la SEQ ID No. 2 de Debaryomycee caetellii . De acuerdo a la presente invención, se entiende por "polinucleótido" una cadena nucleotídica simple de una sola hebra o su complementaria, o una cadena nucleotídica de doble hebra que puede ser del tipo ADN o ARN. De preferencia, los polipéptidos de la invención son del tipo ADN, principalmente ADN de doble hebra. El término "polinucleótido" designa igualmente los polinucleótidos modificados. Loe polinucleótidos de la presente invención son aieladoe o purificadoe de su ambiente natural. De preferencia, los polinucleótidos de la presente invención pueden ser preparados mediante las técnicas clásicas de biología molecular tal como se describe por Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989) o por síntesis química. En una primera modalidad de realización, la invención se refiere al polinucleótido donde la eecuencia eetá comprendida entra la eecuencia 1538 y la poeición 2923 de la SEQ ID No. 1. Eete polinucleótido codifica para la fitasa de la SEQ ID No. 2 de Debaryomycee caetellii . La invención se refiere también a los polinucleótidos que presentan al menoe 80%, 85%, 90%, 95%, 98% y de preferencia al menoe 99% de identidad con el polinucleótido donde la eecuencia eetá comprendida entre la poeición 1538 y la poeición 2923 de la SEQ ID No. 1. Estoe polipéptidoe codifican para una actividad de fitasa. De preferencia, estos polinucleótidos codifican para una fitasa de Debaryomycee caetellii . Por nucléotidos idénticos, se entienden los nucléotidos no variantes entre dos secuencias. Estos polinucleótidos pueden presentar una eupreeión, una adición o una eubetitución de al menoe un nucleótido con relación al polinucleótido de referencia.

La invención se refiere también a los polinucleótidos que presentan al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% y de preferencia al menos 99% de eimilitud con el polinucleótido donde la eecuencia eetá comprendida entre la posición 1538 y la posición 2923 de la SEQ ID No. 1. Estos polinucleótidos codifican para una actividad de fitasa. De preferencia, estoe polinucleótidoe codifican para una fitaea de Debaryomycee caetellii . Por eimilitud, ee entiende la medida de la eemejanza entre las secuencias proteicas o nucleicae. Eetoe polinucleótidoe pueden presentar una eupreeión, una adición o una eubetitución de al menoe un nucleótido con relación al polinucleótido de referencia. El grado de eimilitud entre dos secuenciae, cuantificado por una calificación, está basado en el porcentaje de identidades y/o de subetitucionee conservadoras de las secuencias. Los métodos de medición y de identificación del grado de identidad y del grado de similitud entre las secuenciae de ácidoe nucleicoe, eon bien conocidos por el experto en la materia. Se pueden emplear por ejemplo Vector NTi 9.1.0, programa de alineamiento AlignX (algoritmo Clustal W) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com). De preferencia, se utilizan loe parámetros por omisión. Preferentemente, los polinucleótidos que presentan un grado de identidad o un grado de similitud con un polinucleótido de referencia, conservan la función de la secuencia de referencia. En el presente caso, los polinucleótidos codifican para una actividad de fitasa. La invención se refiere también a los polinucleótidos capaces de hibridaree de manera selectiva con el polinucleótido donde la secuencia está comprendida entre al posición 1538 y la posición 2923 de la SEQ ID No. 1. De preferencia, la hibridación selectiva es efectuada en las condiciones de exigencia media y preferentemente en las condiciones de fuerte exigencia. Por "secuencia capaz de hibridarse de manera selectiva", se entiende de acuerdo a la invención, lae eecuenciae que ee hibridan con la secuencia de referencia a un nivel superior al ruido de fondo de manera significativa. El nivel de señal generado por la interacción entre la secuencia capaz de hibridarse de manera selectiva y las secuencias de referencia, es generalmente 10 veces, de preferencia 100 veces más intensa que aquella de la interacción de otras secuencias de ADN que generan el ruido de fondo. Las condiciones de hibridación estrictae o exigentee que permiten una hibridación eelectiva, eon bien conocidae por el experto en la materia. En general, la temperatura de hibridación y de lavado es inferior de al menos 5°C a la Tm de la secuencia de referencia, a un pH dado y para una fuerza iónica dada. Típicamente, la temperatura de hibridación es de al menos 302C para un polinucleótido de 15 a 50 nucleótidoe, y de al menos 60°C para un polinucleótido de más de 50 nucleótidos. A manera de ejemplo, la hibridación es realizada en el siguiente amortiguador: 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 500 µg/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón. Los lavados son por ejemplo realizados suceeivamente a una débil exigencia en un amortiguador 2X SSC, 0,1% de SDS, a exigencia media en un amortiguador 0,5X SSC, 01% de SDS y a una fuerte exigencia en un amortiguador 0,1 X SSC, 0,1% de SDS. La hibridación puede eer efectuada, por eupueeto, de acuerdo a otros métodos usuales bien conocidos por el experto en la materia (ver principalmente Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989) . De preferencia, los polinucleótidos que se hibridan de manera selectiva a un polinucleótido de referencia conservan la función de la secuencia de referencia. En el presente caso los polinucleótidos que se hibridan de manera selectiva con el polinucleótido donde la secuencia está comprendida entre la posición 1538 y la posición 2923 de la SEQ ID No. 1 codifican para una actividad de fitasa. De preferencia, estoe polinucleótidoe codifican para una fitasa de Jejbaryomyces caetellii . La invención se refiere de manera general a los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de acuerdo a la invención. En virtud de la degeneración del código genético, diferentee polinucleótidos pueden codificar para un mismo polipéptido. Otro objetivo máe de la preeente invención ee un polinucleótido donde la secuencia es representada por la SEQ ID No. 1. El polinucleótido de la SEQ ID No. 1 comprende las secuenciae que flanquean el cuadro de eetructura abierta de lectura (ORF) del gen de la fitasa de Debaryomycee -caetellii . Se trata principalmente de lae eecuenciae promotorae y terminadorae de eete gen. Este gen puede ser expresado a partir de sus secuencias reguladoras homologae, principalmente para una eobreexpreeión en Debaryomycee castellii o en otra levadurae . En otra modalidad de realización, eete gen puede eer expreeado en diferentee organismos hospederoe talee como lae bacteriae, lae levaduras y los hongos, por ejemplo. El gen que codifica para la fitasa de la SEQ ID No. 2 puede ser expresado en un organismo hospedero bajo el control del promotor de la SEQ ID No . 1 de la presente invención o bajo el control de un promotor heterólogo.

Casetes de expresión De acuerdo a una modalidad de realización de la invención, un polinucleótido que codifica para un polipéptido de acuerdo a la invención es insertado en un cásete de expresión utilizando técnicas de clonación bien conocidae por el experto en la materia. Eete caeete de expreeión comprende loe elementos necesarios para la transcripción y para la traducción de las secuencias que codifican para los polipéptidos de acuerdo a la invención. Ventajosamente, este cásete de expresión comprende a la vez los elementos que permiten hacer producir un polipéptido por una célula hospedera y los elementos necesarioe para la regulación de eeta expreeión. Eetoe caeetee de expreeión comprenden en el sentido de la transcripción: - un promotor funcional en un organismo hospedero; - un polinucleótido de acuerdo a la invención; y - una eecuencia terminadora en el mismo organismo hospedero . Cualquier tipo de secuencia promotora puede ser utilizada en los casetes de expresión de acuerdo a la invención. La elección del promotor dependerá principalmente del organismo hospedero elegido para la expresión del gen de interés. Ciertos promotores permiten una expresión constitutiva mientras que otros promotores son por el contrario inducibles . Entre los promotoree funcionalee en los hongoe, ee citarán principalmente aquellos del gliceraldehído-3-fosfato-deehidrogenasa de Aepergillue nidulane (Roberts et al., Current Genet. 15:177-180, 1989). Entre los promotores funcionalee en las bacterias, se citará principalmente aquel de la ARN-polimerasa del bacteriófago T7 (Studier et al., Methode in enzymology 185:60-89, 1990). Entre loe promotores funcionalee en lae levaduras, se citará principalmente aquel del gen Gail (Elledge et al., Proc Nati Acad Sciencee, USA. 88:1731-1735, 1991) o loe promotoree GAL4 y ADH de S. cerevieiae. Todoe eetoe promotores son descritos en la literatura y bien conocidos por el experto en la materia. Para la expresión en Penicillium funiculosum, se elegirán por ejemplo los casetes de expresión que comprenden un promotor de histona H4.B, un promotor de aspartilo-proteasa acida o un promotor csll3 (WO 00/68401) . Para la expresión en la levadura Pichia paetorie, se elegirán por ejemplo los casetes de expresión que comprenden el promotor AOXl inducible por el metanol (Tschopp, J. F., Sverlow, G. , Koeeon, R. , Craig, W. and Grinna, L. (1987) High-level eecretion of glycosylated invertase in the methylotrophic yeast, Pichia pastorie. Biotechnology 5, 1305-1308) o el promotor conetitutivo fuerte GAP (Waterham, H. R., Digan, M. E., Koutz, P. J., Lair, S. V. and Cregg, J. M. (1997) Ieolation of the Pichia paetorie glyceraldehyde-3-phoephate dehydrogenaee gene and regulation and use of its promoter. Gene 186, 37-44) . Para la expresión en Schizoeacchromycee pombe, ee elegirán por ejemplo loe casetes de expresión que comprenden el promotor de regulación Nmtl reprimido por la tiamina y activado en ausencia de tiamina (Maundrell, K., (1989) Nmtl of fiseion yeast. A highly transcribed gene completely represeed by thiamine. J. Biol. Chem. 265, 10857-10864.) Loe caeetee de expreeión, de acuerdo a la invención, pueden incluir ademáe cualquier otra eecuencia neceearia para la expreeión de loe polipéptidoe o loe polinucleótidoe como por ejemplo los elementos de regulación o las secuencias de señal que permiten la expresión de los polipéptidos conocidos por el organismo hospedero. Se puede utilizar principalmente cualquier secuencia de regulación que permita aumentar el nivel de expreeión de la eecuencia codificante ineertada en el cásete de expresión. De acuerdo a la invención, se puede utilizar principalmente, en asociación con la secuencia de regulación promotora, otras secuenciae de regulación, que eetán eituadae entre el promotor y la secuencia codificante, tales como los activadores de la transcripción ("aumentador"). Además, loe casetes de expresión de acuerdo a la preeente invención, pueden incluir cualquier otra eecuencia neceearia para la secreción de los polipéptidos producido por el organismo hospedero, tales como las secuenciae de señal. Para la eecreción por Pichia paetorie , se puede utilizar por ejemplo la secuencia del factor a como señal de secreción. Una gran variedad de secuencias terminadoras son utilizables en los casetee de expreeión de acuerdo a la invención, permitiendo eetas secuenciae la terminación de la tranecripción y la poliadenilación del ARNm . Cualquier eecuencia terminadora funcional en el organismo hospedero seleccionado puede eer utilizado. Para la expreeión en Penicillium funiculosum, se elegirán por ejemplo loe caeetee de expreeión que comprenden un terminador de histona H4.B, un terminador de aepartilo-proteaea acida o un terminador cell3 (WO 00/68401) . La presente invención tiene igualmente por objetivo un polinucleótido que comprende un cásete de expresión de acuerdo a la invención, ventajosamente los casetes de expresión de acuerdo a la invención eon ineertados en un vector.

Vectores La presente invención se refiere igualmente pues a los vectores de replicación o de expreeión para la traneformación de un organiemo hospedero que comprende al menos un polinucleótido o un caeete de expreeión de acuerdo a la invención. Eete vector puede estar constituido principalmente por un plásmido, un cósmido, un bacteriófago o un virus del cual es insertado un polinucleótido o un cásete de expresión de acuerdo a la invención. Las técnicas de construcción de estos vectores y de inserción de un polinucleótido de la invención en estos vectores son bien conocidas por el experto en la materia. De manera general, cualquier vector capaz de manteneree, de autorreplicarse o de propagarse en una célula hospedera, y principalmente con el fin de inducir la expresión de y un polinucleótido o de un polipéptido puede ser utilizado. El experto en la materia elegirá loe vectores apropiados principalmente en función del organismo hospedero para transformar y en función de la técnica de transformación puesta en operación. Los vectores de la presente invención son principalmente utilizados para transformar un organismo hospedero con miras a la replicación del vector y/o de la expreeión de un polipéptido de acuerdo a la invención en el organiemo hoepedero. La invención ee refiere también a un método para preparar un polipéptido de acuerdo a la invención, que comprende lae eiguientee etapae : - ee transforma un organiemo hospedero con un vector de expresión que comprende un cásete de expresión de acuerdo a la invención y/o con un polinucleótido de acuerdo a la invención, se aislan los polipéptidos producidos por el organismo hospedero.

Organismos hoepederoe La preeente invención tiene igualmente por objetivo un procedimiento de transformación de un organismo hospedero mediante integración en el organismo hospedero de al menos un polinucleótido o de un cásete de expresión o de un vector de acuerdo a la invención. El polinucleótido puede ser integrado en el genoma del organismo hospedero o replicarse de manera estable en el organismo hospedero. Los métodos de transformación de los organismoe hospederos son bien conocidos por el experto en la materia y ampliamente descritoe en la literatura. La preeente invención se refiere igualmente a un organismo hospedero transformado con un polinucleótido, un cásete de expresión o un vector de acuerdo a la invención. Por "organiemo hoepedero", ee entiende en particular de acuerdo a la invención, cualquier organismo mono- o pluricelular, inferior o superior, en particular elegido entre las bacterias, las levaduras, los hongos y las plantas. Por "organismo hospedero", se entiende un organismo no humano. De manera ventajoea, las levadu ae eon elegidas entre Pichia paetorie, S aechar omycee cerevieae, Yarrowia lipolytica, Schwanniomyces occidental is y Schizoeac-charomycee pombe. Los hongoe eon elegidoe entre los Aspergí llue y los Penicilliume, preferentemente entre Peni-cillium funiculosum, Trichoderma reeeei , Aepergillue niger, Aspergillue awamori , Aepergillue kawachii y Trichoderma koningii . En una modalidad de realización, el organismo hospedero es una cepa de Penicillium funiculoeum en la cual se expresa una fitasa de acuerdo a la invención. En otra modalidad de realización, el organismo hospedero es una cepa de Debaryomycee caetellii en la cual se expresa o se sobreexpreea una fitasa de acuerdo a la invención. En una modalidad de realización preferida de la invención, el organismo hospedero es una cepa de Pi-chia paetorie o de Schizosaccharomyoee pombe en la cual se expresa una fitaea de acuerdo a la invención. Lae plantae son elegidas por ejemplo entre el arroz ( Oryza eatvia L. ) , el tabaco, la soya y el trigo. De acuerdo a la presente invención, el organismo hospedero es transformado con el polinucleótido elegido entre loe polinucleótidoe eiguientee: a) el polinucleótido donde la eecuencia eetá comprendida entre la posición 1538 y la posición 2923 de la SEQ ID No. 1, b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido elegido entre los polipéptidos siguientes : - el polipéptido de la SEQ ID No. 2, - un fragmento de un polipéptido de la SEQ ID No. 2 que tiene una actividad de fitasa, - un polipéptido que tiene una actividad de fitasa y que presenta al menos 90% de identidad con el polipéptido de la SEQ ID No. 2. Aunque puede ser que el organismo hospedero en el estado silvestre posea el polinucleótido anteriormente definido, la presente invención tiene por objetivo el organismo hospedero transformado. De acuerdo a una modalidad de realización de la preeente invención, el organismo hospedero es transformado con un polinucleótido de la invención, con miras a la expresión del polipéptido de la invención. De acuerdo a otra modalidad de realización de la presente invención, el organismo hospedero es transformado con un polinucleótido de la invención, con miras a la eobreexpreeión del polipéptido de la invención. Las técnicas de construcción de vectores, de transformación de organismos hospederos y de expresión de proteínas heterólogas en esos organismos, son principalmente descritos en la literatura (Ausubel F.M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Greene Publishing Associatee et Wiley -Interscience, 1989; T. aniatis, E.F.Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Handbook, 1982) .

Aditivos alimenticios y alimentos para animalee La preeente invención ee refiere igualmente a los aditivos alimenticios que aportan una actividad de fitasa. El aporte de este tipo de actividad enzimática permite mejorar la digestibilidad del alimento y de mejorar eu valor nutricional. Se entiende por aditivo nutricional, una eustancia agregada intencionalmente a un alimento, en general en pequeñas cantidades, para mejorar eue caracteríeticas nutricionalee o eu digeetibilidad. Loe aditivoe nutricionales para animales pueden contener por ejemplo vitaminas, sa es minerales, aminoácidos y enzimas. Típicamente, los aditivos nutricionalee para animalee comprenden un polipéptido de acuerdo a la invención, un organiemo hoepedero de acuerdo a la invención o un eobrenadante de cultivo/mosto de fermentación de un organismo hospedero de acuerdo a la invención. De este modo, los polipéptidos que tienen una actividad de fitasa de acuerdo a la invención pueden ser purificados o aieladoe de una cepa de Debaryomycee caetellii o de un organiemo hoepedero recombinante, para la fabricación de un aditivo nutricional para animalee. Alternativamente, una cepa de Debaryomyoes caetellii o un organiemo hospedero que produce las fitasae de acuerdo a la invención, pueden eer utilizadoe directamente para la fabricación de un aditivo nutricional para animalee. En un modo de realización preferido de la invención, el sobrenadante de cultivo o mosto de fermentación de una cepa de Debaryomycee caetellii , o de un organiemo hoepedero de acuerdo a la invención, ee utilizado para la fabricación de aditivoe nutricionalee para animalee. Este modo de realización es particularmente ventajosoe cuando la fitaea ee eecretada en el medio extracelular de la cepa de Debaryomycee caetellii o el organiemo hospedero. Habitualmente, este sobrenadante de cultivo es concentrado y utilizado para el aditivo nutricional . De este modo, la invención se refiere también a un procedimiento de preparación de la fitasa, que comprende las siguientee etapae : a) la pueeta en cultivo de una cepa de Debaryomycee caetellii o de un organiemo hospedero transformado de acuerdo a la invención, en l s condiciones de inducción de la expresión de la fitasa, b) la separación de un eobrenadante de cultivo que comprende la fitaea. Eete eobrenadante de cultivo o moeto de fermentación puede eer eneeguida concentrado o liofilizado para la formulación de un aditivo alimentario o de un alimento para animalee . El procedimiento puede comprender lae etapas suplementariae de purificación de la fitasa a partir del sobrenadante de cultivo. Si el organismo hospedero no secreta la fitasa en el medio de cultivo, puede eer neceearia una etapa suplementaria de desintegración de las células, y puede ser neceearia la purificación del extracto celular. Loe aditivoe nutricionalee de la presente invención comprenden al menoe una fitaea de acuerdo a la invención pero pueden igualmente comprender otrae euetanciae nutricionalee como lae vitaminas, aminoácidos o sales minerales.

Los aditivos de acuerdo a la invención acrecientan la digestibilidad de los alimentos, contribuyen a una mejor valorización nutricional de los regímenes a base de cereales o (trigo, cebada, maíz, avena, centeno, etc.) y de tortas oleaginosae (eoya, girasol, colza, etc.) principalmente. La presente invención se refiere también a los alimentos para animales que comprenden una base nutricional y un aditivo nutricional de acuerdo a la invención. Estos alimentos se presentan habitualmente bajo la forma de harinas o de granulos en los cuales son incorporados los aditivos de acuerdo a la invención. La preeente invención tiene igualmente por objetivo los alimentos para animalee que comprenden un polipéptido de acuerdo a la invención, un organiemo hospedero de acuerdo a la invención o un mosto de fermentación/sobrenadante de cultivo de un organismo hospedero de acuerdo a la invención. Por alimento se entiende cualquier cosa que pueda servir para nutrir animales . En una modalidad de realización de la invención, los aditivos nutricionales y los alimentos para animales de acuerdo a la invención comprenden una asociación de al menos dos fitasae que tienen actividadee complementarias. Estoe aditivoe y eetoe alimentoe comprenden también una fitasa de acuerdo a la invención aeociada a otra fitaea. La fitaea aeociada a la fitaea de acuerdo a la invención puede eer por ejemplo elegida entre las fitasae de loe eiguientes organismoe: Schwanniomycee occidentalie, Aepergillue awamori (fitaea A y fitaea B) , Aepergillue niger (fitaea A y fitasa B) , Penicillium funiculoeum, Aepergillue oryzae, Peniophora lycii , Aepergillue ficuum, Aepergillue nidulans, Talaromyces thermophilue, Aepergillue fumigatus y Aepergillue terreus . De manera ventajosa, la fitasa de acuerdo a la invención hidroliza todos los grupos foefato del ácido fítico. Eeta puede ser por lo tanto utilizada principalmente para mejorar o complementar la actividad de las fitasas que no hidrolizan todos loe grupos fosfato. De preferencia, la fitasa de acuerdo a la invención está asociada a . la fitasa de Aepergillue niger (Ullah, A. H. J and Sethumadhavan, • K., (2003) PhyA gene product of Aspergillus ficuum and Peniophora lycii produces dresimilar phytaees . Biochemical and Biophysical Research Communications 303: 463-468) o a una fitaea de una cepa de Penicillium funiculosum (WO 03/054199, WO 99/57325) . Preferentemente, loe aditivoe y los alimentos comprenden una fitasa de acuerdo a la invención asociada a una fitasa de Aepergillue niger o a una fitasa de Peni-cillium funiculoeum. Para la crianza intensiva de animales, los alimentos para animales comprenden habitualmente una base nutricional y aditivos nutricionales.

Por base nutricional se entiende todo aquello que constituya lo esencial de la ración alimentaria del animal, constituida a manera de ejemplo por una mezcla de cereales, de proteínas y de materias grasae de origen animal y/o vegetal . Lae baeee nutricionales para animales están adaptadas para la alimentación de los animales y son bien conocidas por el experto en la materia. Habitualmente, estas basee nutricionalee comprenden por ejemplo maíz, trigo, garbanzoe y soya. Estae basee nutricionales están adaptadas a lae neceeidadee de lae diferentee eepecies animales a las cuales éstas están destinadae. Eetas basee nutricionales pueden ya contener aditivos nutricionales como las vitaminas, salee mineralee y loe aminoácidoe . En una modalidad de realización preferida, la invención ee refiere a loe alimentoe para animalee monogáetricoe y principalmente para las aves de corral y los cerdos . Las aves de corral comprenden principalmente lae gallinae ponedorae, polloe para carne, pavoe y patos. Los cerdos comprenden principalmente los cerdoe para crianza y matanza aeí como los lechones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: actividad de la fitasa de D. caetellii en función del pH (pH 3 a 3.5, amortiguador de glicina 200 mM, pH 3.5 a 7 amortiguador de acetato de sodio 200 mM, pH 7 a 7.5 amortiguador tris HCl 2 0 mM) . Los diferentes valores obtenidos a pH 3.5 con 2 amortiguadores diferentes, muestran el efecto de la naturaleza del amortiguador sobre la actividad de fitasa. Figura 2: actividad de la fitasa de D . cae tel l i i en función de la temperatura. La actividad es medida a pH 4, a 37°C durante 20 minutos. Figura 3 : Desnaturalización térmica de la fitasa de D . cae tel l i i . El extracto es preincubado a diferentes temperaturas durante 1 - 10 - 20 - 40 - 60 120 minutos ya sea en agua (líneas continuas) , o bien en amortiguador de acetato 125 mM, pH 4 (líneas punteadas) . La actividad es enseguida medida a 37 °C durante 20 minutos. Figura 4: Estudio de la eetabilidad al pH y a la temperatura. La actividad de la fitaea de D . cae tel l i i es medida despuée de un tratatamiento del extracto a diferentes pH durante 1 hora a dos temperaturas <40SC ó 60BC) . La actividad es medida a pH 4. Figura 5: Esquema de hidrólieie del ácido fítico por la fitaea de D . cas tel l i i . Figurae 6a-6b: Evolución del rendimiento en fitaea recombinante (círculoe) y en biomaea (cuadros) en función de la tasa de crecimiento en el curso de loe cultivoe en el modo de bloque alimentado (figura 6a) y continuo (figura 6b) . Figura 7 : Continuación de la aparición de divereoe foefatoe de inoeitol mediante cromatografía deepuée de la hidrólieie química e hidrólisis enzimática de InsP6 por la fitasa de D . cas tel l i i despuée de 15, 75, 120 minutoe de hidrólisis. Figura 8: Ensamblaje en comparación de los espectros de 4 fracciones de hidrólisie que contienen las InsPi, IneP2, InsP3 e lnsP4. Lae atribuciones alternativas están en cursivas. Con el fin de completar esta comparación, bajo la escala de desplazamientos químicos, el espectro de InsPs obtenido por diferencia al comienzo de la cinética es igualmente representado. Lae eeñalee poeitivae eon aquellas de InsP5 y las dos señales negativas corresponden a insPß de partida. Estoe espectros, característicos de diferentes fosfatos de inositol permiten seguir la aparición y la desaparición de los diferentes productos en el curso de la cinética de hidrólisie . Figura 9: Cinética lenta eeguida a 500 MHz y a 17°C con una solución de 1.7 mM de InsP6, 10 mM de amortiguador de acetato, pH 4.0 (500 µl H2O/D20, 16/84 v/v) y 1 µl de la eolución de enzima. El intervalo de temperatura entre los dos eepectroe ee de 23 minutoe . Deepués de una noche han sido agregados 20 µl de enzima para acelerar la reacción. Después de 16 horas la hidrólisis es completa y el espectro característico del inositol es obtenido (espectro de arriba) . Esta cinética mueetra claramente la aparición euceeiva de la InsP5, de la lnsP y la IneP3 Figura 10: Cinética máe rápida que permite un eeguimiento de la hidrólisis completa de insPß (600 MHz, 172C, 500 µl de D20, 3.8 mM en InsP6 pH 4.0, 5 µl de enzima). Ha eido regietrado un eepectro por 3 minutos durante 2 horas (400 espectros) . Despuée de 10 horas, la hidrólisis es prácticamente completa. Los eepectroe trazados corresponden a un espectro sobre 10 (30 minutos entre dos espectros) . Cualesquiera eeñalee caracteríeticas son anotadas. Figura 11: Evolución de las concentraciones en 5 horas, de diferentes productos en el curso de la hidrólisis. Esta gráfica permite conocer a que tiempo la concentración óptima para cada uno de los productos es alcanzada. Nota: La altura de la señal RMN característica de cada uno de los compuestoe ha sido utilizada para evaluar las variaciones de las concentracionee. Lae eeñalee utilizadae no repreeentan eiempre el miemo número de protones y no son siempre de la misma multiplicidad. Por este hecho las concentraciones no pueden ser comparadas entre ellas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ejemplos Ejemplo 1; Producción, caracterización bioquímica y estereoespecificidad de la fitasa de Debaryomyces castellix MATERIALES Y MÉTODOS 1. Organismo La cepa utilizada es clasificada en el Gentral Bureau voor Schi melculture (Delft) bajo el nombre Debaryomycee caetellii CBS 2923. 2. Medios y condiciones de cultivo Medio sintético para los cultivos en lotes {MSA-B) : Glucosa (10 g/1); fitato de sodio C6H602P6Na?2 {0.4 g/1) Sales minerales: (NH4)2S04 (3 g/1), MnS04?H20 (7.5 mg/l), KCl (0.5 g/1), MgS047H20 (0.5 g/1), CaCl2, 2H20 (0.1 g/D Oligoelementos: H3B04 (500 µg/l), CuS04/ 5H20 {40 µg/l), Kl (100 µg/l), Na2Mo0 , 2H20 (200 µg/l), ZnS04, 7H20 (400 µg/l), FeCI3,6H20 {200 µg/l). Vitaminas: Pantotenato de Calcio (2 mg/l), Tiamina (Bl) (2 mg/l), Mioinositol (2 mg/l), Piridoxina (B6) (2 mg/l), ácido nicotínico (PP) (0.5 mg/l), Biotina (0.02 mg/l). Medio sintético para loe cultivos en forma continua (MSA-C) : Composición del medio MSA-B de loe divereoe componentee eon 10 veces más concentrados.

Cul tivo en matraz Erlenmeyer El primer precultivo es realizado en presencia de YMPG (glucosa 10 g/1, extracto de levadura 3 g/1, bactopeptona 5 g/1, extracto de malta 3 g/1) . Los cultivos son realizados en matraces Erlenmeyer llenados a l/10emo de su volumen en presencia del medio MSA-B amortiguado a pH 5.4 con amortiguador de tartrato 0.2 M. Estoe son conducidos en medio aireado eobre un agitador oecilatorio {80 oscilaciones por minuto, amplitud 7 cm) , a 28°C. Cul tivo en fermentador Los cultivos eon realizadoe en un fermentador Applikon (Holanda) (1.5 litroe de volumen útil) o Braun Biostat E (3 litros de volumen útil) . El pH es medido por una sonda Ingold. Este es regulado por la adición de sosa 2 M o ácido sulfúrico 1 M. La aireación es asegurada por insuflación de 2 v.v.m {volumen de aire {volumen de cultivo)" 1. (minuto)"1) de aire esterilizado por filtración. La presión parcial de oxígeno dieuelto ee medida con ayuda de una eonda polarográfica Ingold. Ésta es mantenida a un valor superior a 30% por variación de la velocidad de agitación. La temperatura es mantenida a 28°C. El pilotaje y la adquisición de los datos eon efectuados en línea con ayuda de un programa de adquisición Bioexpert (Applikon) .

Análieie de gasee a la ealida del fermentador La concentración de C02 en los gasee efluentee es medida con la ayuda de un analizador infrarrojo Beckman Industrial 870. La concentración de 02 es medida con la ayuda de un analizador Beckman Industrial 775A donde el detector utiliza la susceptibilidad paramagnética del oxígeno molecular.

Doeie de los euetratoe carbonadoe en el -cureo del cultivo Los euetratoe y loe metabolitoe preeentes en el medio de cultivo (Glucosa, acetato, etanol) son separadoe y cuantificadoe mediante Cromatografía Líquida de Alta Reeolución (CLHP) con ayuda de una columna FFJ (Watere) de exclueión de ionee. La faee móvil ee de ácido foefórico 3 mM, el gaeto es de 1 ml/minuto. Una muestra del medio de cultivo es tomada en forma continua por todas las doe horae y filtrada eetérilmente de manera tangencial (filtro Millipore 0,22 µm GV) con la ayuda del módulo de filtración A-SEP Applikon y el módulo FAM de adquieición y filtración Waters. Los suetratos carbonadoe eon detectadoe por refractometría {Watere 410) . El conjunto es piloteado por el sietema de control Watere 600 E. Loe cromatogramae eon analizadoe graciae al programa Millenium (Waters) . Las escalae patrón han eido realizadae para cada euetrato eobre una eecala que va de 1 a 50 g/litro 3. Purificación £71tra f i 1 tra ci ón El eobrenadante obtenido deepuée de la centrifugación ee filtrado eobre una membrana de umbral de corte de 0.22 µm (Millipore) antes de ser ultrafiltrado por el cásete de ultrafiltración de flujo tangencial fijo (superficie: 836 cm2) donde el umbral de exclusión es de 10 kDa. El concentrado es lavado 3 vecee (V/V) con agua ultrapura, y deepuée concentrado por un factor 25. El extracto obtenido ee utilizado para la purificación.

Cromatografía hidrofóbica La eeparación de lae proteínae ee realizada a 20SC eobre una columna HiPrep 16/10 Fenil FF {Amersham) de diámetro interno de 16 mm y de longitud de 100 mm (volumen 20 ml) . Antes de la inyección sobre el gel de purificación, las muestrae eon equilibradae en eulfato de amonio 2 M. La mezcla ee deja 2 a 16 horae, a 4SC y deepuée se centrifuga (12000 g, 20 minutos) con el fin de eliminar las proteínas precipitadas. El sobrenadante de la centrifugación constituye el extracto depositado sobre el gel . El gel es primeramente equilibrado con el equivalente de 5 volúmenes de columna con la ayuda de una solución amortiguadora Tris-HCl 50 mM, pH 6.1 y eulfato de amonio 2 M. Son inyectadoe 1 a 5 ml de muestra.

Las proteínas no fijadas son eliminadas por un lavado equivalente a 5 volúmenee de columna eobre la solución amortiguadora de eulfato de amonio de equilibrio. La elución ee realizada efectuando un gradiente de tree eegmentoe linealee: (1) eulfato de amonio de 2 a 1.7 M, por una duración equivalente a 1.5 volúmenee de columna, (2) eulfato de amonio 1.7 M, por una duración equivalente a 4 volúmenee de columna, (3) sulfato de amonio 1.7 a 0 M, por una duración equivalente a 0.1 volúmenes de columna. La fitasa es eluida a 1.7 M de sulfato de amonio. El gasto es fijado a 5 ml/minuto. Las fracciones de 4 ml son recolectadas a la salida de la columna, la absorbancia se mide a 280 nm. Las fracciones activae eon reunidas, lavadae contra agua ultrapura y concentradae mediante ultrafiltración (membrana Millipore, umbral de corte de 10 kDa) . 4. Electroforesis La electroforeeis en condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantee eon realizadae eobre gelee prevaciadoe de 4 a 15% de acrilamida (Biorad) . Lae proteínae eon detectadas con azul de Coomassie. La revelación específica de las fitasas es realizada incubando los geles en 100 ml de una eolución amortiguadora de acetato de sodio 250 mM pH 5.5 que incluye 200 mg de a-naftil P (Sigma) y 100 mg de Faet Garnet GBC (Sigma) y 92 mg de fitato de eodio. Deepuée de la hidrólisie del a-naftil P, ee forma un complejo a-naftil/Faet Garnet GBC de color café.

. Digestión con endoglucosidasa H Deeglucoeilación: 1,000 unidades de endoglucosidasa H (Biolab Ozy e P0702S) son agregadas a la muestra desnaturalizada que incluye aproximadamente 20 µg de proteínas. La mezcla es puesta a incubar 2 horas a 37°C en baño maría. 6. Determinación del peso molecular mediante espectrometría de masa. El análisis es realizado eobre la fitaea purificada eobre SDS-PAGE con la ayuda de un eepectrómetro MALDL-TOF Biflex III ecout 384 (Bruker, Br me, Alemania) . 7. Métodos analíticos 7.1 Determinación de la materia seca La concentración celular ee obtenida mediante la medición de la deneidad óptica (DO) con la ayuda de un eepectrofotómetro Beckman DU530. Una unidad de DO corresponde a 0.570 g/litro de biomasa. 7.2 Dosificación de las proteínas La proporción en proteínae ee determinada por el método de Bradford {Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteins utilizing the principie of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254) . (Biorad Protein Assay Dye Reagent Concéntrate, BIORAD 500-0006) , la absorbancia es medida a 595 nm (espectrofotómetro UV/visible Beckman DU 530) . El patrón es efectuado con una gama de albúmina sérica bovina. 7.3 Método enzimático La actividad fitásica o de fitasa es medida siguiendo la liberación del fosfato inorgánico en el curso del tiempo. La actividad es medida en presencia de 8 mM de fitato de sodio (Sigma) disuelto en un amortiguador de acetato de sodio pH 5.5 o pH 4, 250 mM, 1 mM de CaCl2, a 37 SC (5 volúmenes) . La reacción es desencadenada por la adición de extracto enzimático (1 volumen) . La reacción es detenida por la acidificación del medio con ácido tricloracético al 20% (1 volumen de medio de reacción más 1 volumen de ácido) . La cantidad de fosfato liberado es determinada después de diferentes tiempos de incubación. Una unidad enzimática (U) es definida como una cantidad de enzima que libera una µmol de fosfato inorgánico en un minuto.

Caracterización de la enzima El efecto del pH sobre la actividad fitásica es determinado utilizando las soluciones amortiguadoras siguientee: Glicina-HCl 200 mM, pH 2-3.5; Acetato de sodio-ácido acético 200 mM, pH 3.5-7; y Tris-HCl 200 mM, pH 7-9. Las reacciones son realizadas a +37 aC utilizando el fitato como subetrato. La temperatura óptima ee determinada haciendo variar la temperatura de +30 a +80SC. Lae reaccionee son realizadas a pH 4 (amortiguador de acetato de sodio 200 mM) utilizando el fitato como subetrato. La eetabilidad térmica ee determinada por incubación de la mueetra enzimática en amortiguador de acetato de eodio 125 mM, pH 4, por diferentes duraciones a temperaturas que van desde +37 hasta +70aC. Despuée del tratamiento térmico, la mezcla ee enfriada en hielo y la actividad fitásica es determinada utilizando el fitato como subetrato. Loe parámetros cinéticos son determinados a +37°C y a pH 4 para loe experimentos con el fitato de sodio y a pH 5.5 para los experimentos con el p-NPP. 7.4 Dosis de los fosfatos La cantidad de fosfato liberado es revelada por colorimetría. La solución de revelación, preparada extemporáneamente, contiene sulfato de hierro (380 mM, 1 volumen) y de heptamolibdato de amonio (12 mM, 4 volúmenee) . La medición de la abeorbancia a 700 mM, se realiza despuée de 30 minutoe de revelación a temperatura ambiente (1 volumen del medio de reacción + 1 volumen de eolución de revelación) , con la ayuda de un eepectrofotómetro UV/vieible (Beckman DU 530) . Una curva patrón ee previamente eetablecida con el fosfato diácido de potasio. 7.5 Condiciones de hidrólisis de las fitasas para el estudio de la estereoespecificidad El tubo de reacción contiene 2 volúmenee de fitato de eodio (20 mM) , 2 volúmenee de amortiguador de acetato pH 4 (0.25 M) y 1 volumen de enzima diluida (0.6 U/ml al final). Lae tomae de mueetra son realizadas a diferentes tiempos durante 6 horae . La reacción ee detenida por calentamiento a 100°C (10 minutoe) . 7.6 Determinación de los fosfatos de inositol 7.6.1 Mediante HPIC ee trata de un método que utiliza cromatografía iónica de alta reeolución (HPIC) para eeparar y determinar los inoeitoles mono- hasta hexafosfatoe obtenidoe por la degradación del ácido fítico por lae fitasas estudiadae (Hatzack, F., Hübel, F., Zhang, W. , Haneen, P.E. and Raemussen, S. K. (2001) Inoeitol phoephatee from barley low-phytate grain mutante analyeed by metal-dye detection HPLC and NMR. Biochem. J. 354, 473-480; Skoglund, E., Carleson, N.G. and Sanberg, A.S. (1997) Determination of isomers of inositol mono- to hexaphophates in selected foods and intestinal contents ueing High-Perf ormance Ion Chromatography. J. Agrie. Food Chem. 45, 431-436; T?rk, M. , Sandberg, A.S. , Carleeon, N.G. and Andlid, T. (2000) Inoeitol hexaphoephate hydrolysis by baker ' s yeast. Capacity, kinetics, and degradation products.

J. Agrie. Food Chem. 48, 100-104) . El método incluye la separación de diferentes InePn sobre columna de intercambio de iones en HPLC con un gradiente de elusión y la reacción post-columna durante la cual los fosfatos de inositolee se forman en complejos con el hierro y son detectados mediante UV a 290 nm. Este sietema permite detectar loe InsP2 hasta InePß pero solo los diferentes isómeros de InsP4 e InsPs pueden ser separadoe.

Preparación de una mueetra de referencia Loe picoe eon identificadoe deepuée de una hidrólieis química. 50 mg de fitato de sodio eon colocados en 5 ml de HCl (6 M) a 100°C durante 16 horas. Las alícuotas de 25 µL son secadae en Speed Vac y luego recogidae en 100 µl de HCl 0.025 M para tener aproximadamente 300 nanomoles por inyección.

Análieie de lae mueetrae La separación de los diferentes picos es realizada mediante cromatografía de intercambio de aniones fuertes sobre una columna analítica Omni Pac PAX-100 (4 x 250 mm) y una precolumna de protección PAX-100 (4 x 50 mm) (Dionex Corp., Sunnyvale, CA) . El gasto o caudal es de 0.8 ml/minuto, el bucle de inyección de 100 µl. Los InsPn son eluídos con un gradiente de 5-98% de HCl {0.5 M) en conjugación con el agua ultrapura y un eolvente orgánico (50% de 2-propanol) . Los eluyentes son combinados de acuerdo a la tabla 1 siguiente: Tiempo HCl 2-propanol Agua (minutos) % % % T (0) 5 2 93 T (40) 98 2 0 T (45) 5 2 93 Un tiempo de 15 minutos es necesario para equilibrar la columna despuée de cada cromatografía. Loe foefatoe de inoeitolee son detectados deepués de una reacción post-columna mediante medición de la absorbancia a 290 nm con la ayuda de un espectrofotómetro UV (Biocad, Sprint) . El eluyente es mezclado en una reacción post-columna, con 0.1% de Fe(N03)3.9H20 en una eolución al 2% de HC104. El gasto de la bomba del reactivo (Minipuls 3, Gilson) ee de 0.4 ml/minuto. El -paeo en un eerpentín de teflón (0.25 mm, 4 m) permite formar en complejoe loe InePn y el hierro para la detección (Phillippy, B.-Q. and Bland, J.M. (1988) Gradient ion chromatography of inoeitol phoephatee . Anal . Biochem. 175, 162-166). 7. 6.2 Por RMN Deepuée de la liofilización, lae diferentee muestrae de loe inoeitoLee aieladoe por HPIC (50-200 µg) eon eolubilizadae en 500 µl de D20. Los espectros de protones han sido regietradoe a 500 ó a 600 MHz eobre loe eepectrómetros Avance Bruker equipados de una crioeonda (1H, 13C y 15N) y de gradientes eobre el eje z. Los espectros de protones desacoplados del fósforo y los espectroe de correlación 1H-31P (HMQC) han eido regietradoe eobre un eepectrómetro Avance Bruker 400 MHz con una eonda de TBI. La señal residual del agua ha sido suprimida por una presaturación selectiva de una duración de 1 segundo. Todoe loe eepectros han sido registradoe a 17 SC. Loe eepectros de protones son calibrados con relación al (trimetilsilil) -3-propionato de sodio-d4 (TSP, 0 ppm) o a la señal residual del agua (4.914 ppm a 17°C) . Para la atribución de lae reeonanciae de protonee, loe experimentoe COSY y TOCSY han eido regietradoe con 512 incrementos de tiempo. El tiempo de contacto utilizado para TOCSY es de 50 me . Loe experimentos de HMQC han eido obtenidoe con 64 incrementoe de tiempo. La atribución de loe eepectroe de protonee eerá realizada por análieie de loe experimentoe COSY y TOCSY. Hay que hacer notar que para ciertoe ieómeroe que poseen un plano de simetría, los protonee Hl y H3 y loe protonee H4 y H6 -no pueden eer diferenciadoe. En eete caeo éetoe eerán anotados como Hl (ó H3) y H4 (ó H6) . Una vez obtenida la atribución, quedan por determinar lae poeicionee fosforiladas . Éetae eerán determinadae con ayuda de dos experimentos diferentes, por una parte con la ayuda del espectro de protones desacoplado del fósforo y por otra parte por el experimento HMQC. La comparación del espectro de protones ein desacoplamiento del fósforo permite identificar las eeñales que poseen un acoplamiento 3JHCOP de 8.5-10 HZ y de este modo la (las) posición (ee) de foeforilación. El experimento de 1H-31P HMQC, por intermediación de la constante de acoplamiento 3JHCOP/ por si misma permite identificar las correlacionee protón-fósforo. Cuando la atribución de la resonancia de protones es conocida, los espectroe deeacoplados del fósforo y HMQC permiten identificar las posicionee fosforiladas sin ambigüedad. La posición de los grupos fosfatoe ee igualmente verificada para análisis de las constantee de acoplamiento del eepectro de protones. 7. 6.3 Cinética de hidrólieie eeguida por RMN La mueetra utilizada para eeguir la hidrólieie por RMN ee preparada a partir de una solución madre de InsPß/amortiguador de fosfato, 96/700 mM en D20. Típicamente, 20 µl de esta solución son agregados a 480 µl de D20 (dilución 25) para conducir a una muestra que tiene 3.8 mM de IneP6 y 28 mM de amortiguador de acetato de sodio y de TSP como referencia interna. En función de la velocidad de hidrólisie deeeada, una cantidad de enzima máe o menoe grande (1 a 20 µl de la eolución madre a 3 U/ml) ee agregada. La cinética ee eeguida a 17°C por el regietro de un eepectro (32 exploracionee) cada 3 minutoe durante 20 horae (400 eepectroe) . A partir de loe eepectros característicos de diferentes fosfatos de inositolee determinadoe anteriormente, eu aparición y deeaparición pueden eer eeguidae eobre el conjunto de la cinética.

Reeultadoe 1- Estudio de la biosíntesis de la fitasa de Debaryomyces castellix La bioeínteeie de la fitaea ha eido eeguida en cultivo por lote y continuo con el fin de determinar lae condicionee óptimae de producción. Loe cultivoe son realizados eobre medioe eintéticoe (ver Materiales y métodos) . Un eetudio previo noe ha permitido determinar una 32 concentración óptima de fitato 0.4 g/1 para producir 5 g/1 de biomaea. Eeta concentración ee neceearia y euficiente para aeegurar el crecimiento celular máximo y no reprimir La bioeínteeis de las fitasas. Las tomas de muestra eon efectuadae en el curso del tiempo; la biomasa, la actividad fitásica también son medidas. 1.1 Producción en cultivo por lotes Cinco cultivos por lote son realizados a pH 3, 4, 5, 6 y 7 en presencia de 10 g/1 de glucosa y de medio MSA-B. La biomaea máxima ee obtenida a pH 5, la taea de crecimiento ee dieminuida a 20% a pH 3 y a pH 7. La actividad fitáeica máxima medida en loe eobrenadantee de cultivo, ee obtenida a pH 4, ninguna actividad ee detectada a pH 3. La actividad de fitaea aumenta de aproximadamente 20%, 12 horas después del comienzo de la fase estacionaria. Es posible por una parte que la fitasa eea parietal y liberada en el medio de la fase de no crecimiento. Hemos verificado que se obtiene un mismo nivel de inducción en presencia o en ausencia de sal de calcio. 1.2 Producción en cultivo continuo El cultivo continuo es realizado a pH 4, en presencia de 100 g/1 de glucosa y en medio de MSA-C. Las medidas de biomasa y de actividad de fitasa son efectuadas deepuée de al menos 3 renovaciones del fermentado. La producción de biomaea ee conetante haeta una taea de dilución de 0 .20 h"1 , con un rendimiento YBiomasa/substrato (g/g) de 50% , el metabolismo celular es oxidativo , el coeficiente respiratorio (QR) es igual a l . a producción de fitasa aumenta con la tasa de dilución. Para una taea de dilución {D) de 0.25 h"p el rendimiento de crecimiento dieminuye de 40%, la QR ee euperior a l, el metaboliemo celular ee óxido- fermentativo, exiete formación de metabolitos secundarioe talee cerno de acetato y de etanol . La producción de fitasa dieminuye igualmente por un factor de 5. La mejor producción (1487 U/l) ee obtenida a D=0.20 h"1. Hay que hacer notar que 20% de lae fitasas están ligadae a lae célulae, el mantenimiento del cultivo a °C durante unas 4 horas permite la regulación de la enzima en el medio de cultivo. 2- Estudio de la fitasa 2.1 Purificación Las diferentes etapae de purificación de la fitaea de D. caetellii son resumidae en la tabla 2 . Actividad total Proteínas Actividad Factor de Rendimiento (U) totales (mg) específica purificación % (U/mg) Extracto bruto 144 12.4 11.6 1 Extracto 136.5 8.2 16.7 1.45 95 concentrado y ultrafiltrado Actividad total Proteínas Actividad Factor de Rendimiento (U) totales mg) específica purificación % -(U/mg) Cromatografía 84.4 0.54 156 13.6 59 hidrofóbica Tabla 2 : Purificación de la fitasa de Debaryomycee caetellii mediante cromatografía hidrofóbica El extracto bruto tiene una actividad específica de 11 . 4 U/ml . Despuée de una etapa de concentración y ultrafiltración, el extracto ee purificado mediante cromatografía hidrofóbica . La fitaea ee purificada en una sola etapa por un factor de 13 con un rendimiento de 59% . La actividad específica es de 156 U/mg . La preeencia de una sola banda proteica sobre una electroforesie en SDS-PAGE mueetra que la enzima eetá pura . 2 .2 Masa molar y estructura 2.2.1 Determinación de la maea molar por electroforesie o cromatografía de permeación en gel Una electroforeeie SDS-PAGE permite eetimar la maea molar de la fitaea a 77 kDa y de la enzima deeglucoeilada mediante el tratamiento con endoglucoeidasa H a 51 kDa, o bien 34% de glucosilación. En la condición no desnaturalizante la masa molar de la fitasa es más difícil de determinar en virtud de la presencia de impurezas, esta se sitúa entre 440 y 150 kDa. Aquella de la enzima deeglucoeilada ee de 87 kDa. Una coloración eepecífica permite moetrar que la fitasa deeglucoeilada eetá activa. La maea molar determinada por cromatografía de permeación en gel (columna HR 200 Farmacia) es de 318 kDa para la fitasa glucosilada y de 218 kDa para la fitasa desglucoeilada. 2.2.2 Espectrometría de maea La determinación de la maea por eepectrsmetría de maea confirma loe resultados obtenidos mediante electroforesie SDS-PAGE, o bien 74 kDa para la fitaea y 53 kDa para la enzima deeglucoeilada, o bien 28.4% de glucoeilación. La fitasa nativa estaría pues constituida de 4 monómeros de masa idéntica. 2.2.3 Crietalografía En el curso del año de prioridad, la eetructura de la fitaea de Debarya ycee castellii (461 reeiduoe) ha eido determinada mediante cristalografía con una resolución de 2.3 Á. Este es un tetrámero que contiene 10 moléculae de N-acetil glucosamina y 1256 moléculas de agua. La eetructura es accesible sobre el sitio de RCSB Protein Data Bank con el código pdb siguiente: 2GFI. 3. Propiedades enzimáticas 3.1 Efecto del pH el efecto del pH eobre la fitaea ee determinado, midiendo la actividad enzimática en preeencia de diferentee amortiguadoree: para los pH comprendidos entre 2 y 3.5 (amortiguador de glicina), para loe pH de 3.5 a 7 (amortiguador de acetato de sodio) y para los pH de 7 a 7.5 (amortiguador de trie HCl) {Figura 1) . La fitasa .es activa entre loe valoree de pH de 2.5 a 6.5, con un óptimo entre pH 4 y pH 4.5. Se puede notar un efecto de la naturaleza del amortiguador eobre la actividad de fitaea, a pH 3.5, el amortiguador de acetato de eodio es inhibidor, con relación al amortiguador de glicina. 3.2 Efecto de la tepjpexatura La temperatura óptima es determinada sobre la fitasa nativa, efectuando una medición de la actividad de fitasa a diferentee temperaturae : de 30 a 80SC (Figura 2) . La temperatura óptima de la fitasa está comprendida entre 55 y 60SC. La energía de activación calculada despuée de la representación de Arrhenuie ee de 38 kJ/mol . 3.3 Acción de los efectores Entre loe diferentee cationee probadoe , eolo el Mn2+ provoca una fuerte inhibición de 72% . En preeencia de loe cationes Co2+ , Zn2+ , Cu2+ y Mg2+ , la actividad es inhibida de 58 a 22% . Se puede notar que la presencia de calcio no es necesaria para la actividad de esta enzima (tabla 3) . Tabla 3 : Influencia de loe efectoree eobre la actividad de fitaea de D. caetellii Efectoree Concentración (mM) % de actividad Teetigo de fitato 9 ?00 CaCl2 5 90 MnCl2 5 28.8 MgCl2 5 68.7 CuCl2 5 66.6 ZnCl2 5 57 FeCl3 5 92 C?Cl2 5 42.3 CrCl2 5 107.6 HgCl2 5 96.2 PCMB 3 94.5 EDTA 3 104.5 Ácido yodoacético 3 100 2-mercaptoetanol 3 107 N-bromoeuccinimida 0.1 y 1 1 N-bromoeuccinimida 3 25.6 + triptofano yodo 3 25.6 yodo + triptofano 1 + 3 88.1 Entre loe 6 inhibidoree probadoe , eolo la N-bromoeuccinimida que actúa eobre los grupos triptofano, tirosina e histidina inhibe totalmente la actividad de fitasa. La adición de triptofano restablece la actividad. El yodo, eepecífico de loe grupoe tiroeina, inhibe igualmente de manera fuerte (75 %) . El triptofano y la tiroeina parecen estar fuertemente implicados en el sitio catalítico de la enzima. Por el contrario, el ácido yodoacético que actúa sobre los grupos cisteína e histidina no provoca ninguna inhibición de la actividad. La ausencia del efecto de 2-mercaptoetanol , del yodoacetato y del pCMB muestra que los grupoe -SH no eetán probablemente implicadoe en el eitio catalítico. 3.4 Estudio de la estabilidad Temperatura Un eetudio de la desnaturalización térmica a diversas temperaturas muestra que la enzima es estable durante una hora a 60 gC, cuando ésta está en agua y una hora a 66SC cuando eetá en el amortiguador de acetato 125 mM, pH 4 (Figura 3). Éeta ee deenaturalizada por arriba de 68SC, con una parte de actividad del 70% deepués de una hora a 702C. La energía de activación de la desnaturalización calculada por la representación de Arrhenius es de 606 kJ/mol. pH La fitasa es totalmente desnaturalizada después de 21 días de conservación a -20aC para los pH inferiores a 5. Por el contrario, no es observada ninguna desnaturalización despuée de 67 días de conservación a esta miema temperatura para los pH comprendidos entre 5 y 7. pH y tempera tura La actividad de fitasa es medida después de la incubación de la enzima a 2 temperaturas (40 y 60 SC) en amortiguadores donde el pH está comprendido entre 2 y 8 (Figura 4) . Para los dos pH extremoe (2 y 8) ee constata una perdida total de actividad despuée de una hora de contacto. Por el contrario, en el intervalo de 3 a 7, de 80 a 100% de la actividad ee coneervada a 40aC. A 60°C, la fitaea ee máe fuertemente deenaturalizada a pH 3 y 8. Se puede notar que exiete un fuerte efecto debido a la naturaleza del amortiguador a pH 8; en presencia de amortiguador de acetato, la desnaturalización es total mientras que en presencia de amortiguador tris HCl, la desnaturalización es de 50% solamente.

Ambiente -Fuerza iónica La enzima es preincubada en amortiguador de acetato 250 mM, pH 4 que incluye clor-uro de calcio 1 mM, a 20SC y 66.5°C durante 60 minutos en presencia de diferentes aditivos. Al final del tratamiento, el extracto es enfriado en agua a +4°C. La actividad ee eneeguida medida a 37°C durante 20 minutos a pH 4, amortiguador de 250 mM (Tabla 4) . Tres tipoe de elementos son probados : - azúcares o azúcar de alcohol: sucrosa, lactosa, trehalosa, arabinosa, glicerol, - la ausencia de calcio, - la molaridad del amortiguador. La enzima es preincubada en un amortiguador de acetato 250 mM, calcio 1 mM, pH 4, a 20SC y 66.5°C durante 60 minutos en presencia de diferentes aditivos. Al final del tratamiento, el extracto es enfriado en agua a + 2C. La actividad es enseguida medida a 37 °C durante 20 minutos a pH 4 con amortiguador a 250 mM, 1 mM de calcio (ver Materiales y métodoe).

Tabla 4 : Influencia del ambiente eobre la termoeetabilidad de la fitaea de Debaryomyces castellii CBS2923 Elementos Concentración 1 h a 202C 1 h a 66.59C Control 99 47 CaCl2 0 mM 100 1 Sucrosa 10% 97 57 Lactosa 10% 95 47 Trehalosa 10% 94 56 A Arraabbiinnoossaa 1 100%% 9 900 36 Glicerol 10% 96 56 Amortiguador 200 mM 100 53 de acetato Amortiguador 150 M 98 78 de acetato Amortiguador 125 mM 84 95 de acetato Amortiguador 100 mM 87 89 de acetato AAmmoorrttiigguuaaddoorr 5500 mmMM 9999 89 de acetato Dos elementos son muy importantee, el calcio y la fuerza iónica. El calcio aunque no tiene ninguna influencia eobre la actividad enzimática, juega un papel muy importante; la desnaturalización es total en ausencia de calcio. El aumento de la fuerza iónica del amortiguador aumenta la desnaturalización por la temperatura hasta 50% a 250 mM. 4. Estudios cinéticos Estudio de la especificidad Las constantee cinéticas son determinadas sobre 2 suetratoe. La afinidad de la fitaea ee 4 vecee máe fuerte en preeencia de fitato de calcio que de foefato de p-nitrofenilo (pNPP) (Tabla 5) .

Tabla 5: Eepecificidad de la fitaea de D. castellii eobre diferentes suetratoe Sustratos Km (mM) Vm (µmol/min/mg) _____ 2.27 30.9 Fitato de eodio 0.532 35.8 Eeta fitaea poeee un gran espectro de actividad, con una hidrólisis preferencial de pNPP, del piruvato de fosfoenol, del ATP y del ADP (Tabla 6A) . Éeta ee claeifica en lae fitaeas de gran espectro tales como lae fitaeae de A. fumigatus, E. nidulane . Éeta degrada igualmente la Ine (2) Pi (Tabla 6B) que ee raramente hidrolizada por lae fitaeae en virtud de eu poeición axial eobre la molécula de ácido fítico. Su funcionamiento ee inhibido por loe foefatoe con una Ki de 1.3 mM.

Tabla 6: Comparación de la especificidad de la fitasa de D. caetellii en preeencia de diferentee sustratoe. (A) La concentración en eustratos es de 4 mM. Las cinéticas de liberación del fosfato son realizadas en el amortiguador de acetato de sodio 250 mM, cloruro de calcio 1 mM pH4, a 37°C Sustratos Concentración % de actividad (mM) Acido fítico (testigo) 9 100 p-nitrofenilfosfato 4 135 Fructoea-6-foefato 4 35 Glucosa-6-fosfato 4 82 Adenoeina-5 ' -monofoefato 4 50 Adenoeina-5 ' -difoefato 4 120 Adenosina-5 ' -trifosfato 4 133 L- -glicerofosfato 4 78 Ácido D- (-) -3-foefoglicérico 4 95 Foefo (enol) piruvato 4 130 (B) Hidrólisis de diversos fosfatos de inositol por la fitasa de D. caetellii. Lae cinéticas de liberación de los fosfatoe son realizadas en el amortiguador de acetato de sodio 250 mM, cloruro de calcio 1 mM, pH 4. Las mediciones son realizadas despuée de 30 minutoe de hidrólisis a 37°C.

Sustratos Concentración % de actividad (mM) Ácido fítico (testigo) 9 91 Ins(l) Pi 1 58 lne(2) Pi 1 84 Ine (1,4)P2 0.1 65 Ine (1,4,5)P3 0.1 56 . Estereoespecificidad 5.1 Separación e identificación de los fosfatos de inositol mediante cromatografía (HPLC) Los isómeroe del foefato de mio-inositol son separadoe eobre una columna analítica Omni Pac-100 utilizando un gradiente de 5% a 98% de HCl (0.5 M) y H20/2-propanol (v/v) . Loe eluyentee eon mezcladoe en un reactor poet-columna con una eolución de 0.1% de Fe(N03)3, 9H20 y HC10 al 2% (Phillippy, B. Q. y Bland, J. M. (1988) Gradient ion chromatography of inoeitol phoephatee . Anal. Biochem. 175, 162-166) . El gasto total ee de 1.2 ml/minuto. Eetae condicionee permiten separar los diferentes Ins Pe (Ine P6 a Ine Pi) e identificar diferentee isómeros de Ins P5 y de Ine P . Loe diferentee isómeros son identificados por comparación de los cromatogramas obtenidoe con (1) aquellos descritos en la literatura, obtenidos en lae condicionee idénticae (Skoglund, E., Carleson, N. -G . y Sanberg, A.S. (1997) Determination of isomers of inositol mono- to hexaphophates in selected foods and intestinal contents using High-Performance Ion Chromatography. J. Agrie. Food Chem. 45, 431-436), (2) con los compuestoe obtenidoe mediante hidrólieie química (Türk, M., Sandberg, A.S., Carleeon, N. G. y Andlid, T. (2000) Inoeitol hexaphoephate hydrolyeie by baker's yeaet. Capacity, kinetice, and degradation producte. J. Agrie. Food Chem. 48, 100-104), (3) con loe productoe de hidrólieie del ácido fítico por lae fitaeas de A . ni ger y de P . ly-ci i (Laseen, S. F., Bech, L., Fuglsang, CC , Ohmann, A., Breinholt, J. y Stergaard, P.R. (2000), Patente de los Estados Unidos No. 6060298) . .1.2 Hidrólisis química Despuée de una hidrólieis química (HCl 6M, 100°C, 16 horas), el cromatograma obtenido nos permite identificar 12 isómeros entre los Ins P5 e Ine P . -Loe isómeros de Ins P3, Ine P2 e Ine Pi no eon separados por este método. . 1.3 Identificación de los fosfatos de inosi tol formados en el curso de la hidrólisis del ácido fítioo por la fi tasa de D. castellix Las condiciones de hidrólisis son descritas en Materiales y Métodos. La aparición de los diversos ins Pn es seguida en el cureo del tiempo. D.eepués de 15 minutos de hidrólisis, el Ins Pe prácticamente ha desaparecido, 4 picos mayoritarioe eon detectados y corresponden a los Ins (1,2,4,5,6) P5, los Ins (1,2,5,6) P4 , y los picos de Ins P3 , Ine P2 e Ins Pi no identificados por este método (Figura 7) . La atribución de Ins P5 e Ins P4 es confirmada por la adición de muestras auténticas de inositolee. Después de 120 minutos de hidrólisis, los picos de Ine P3 e Ins Pi son mayori tarios . Esto podría traducirse en una velocidad de hidrólisie netamente más débil de Ins P3 con relación a Ine P4 , Ine P5 e Ine P6. Deepuée de 300 minutoe de hidrólieie la cantidad de foefato doeificado corresponde al 100% de los fosfatos potenciales de la molécula de fitato. La enzima libera la totalidad de los fosfatos. La caracterización de las fracciones de Ine Pn eeparadas por cromatografía es realizada por el análisie de RMN. .2 RMN (Figuras 8-11) 5.2.1 Preparación de las muestras Loe diferentee productoe de hidrólieie de Ine Pe por la fitaea de D. caetellii son separados mediante cromatografía de intercambio iónico de acuerdo al método utilizado en el párrafo precedente. La cantidad inyectada corresponde a 369.5 µg de Ine Pe. El reactivo post-columna es reemplazado por agua, 12 cromatografías fueron realizadas. Las fracciones correspondientes a Ins P5, Ins P4 , Ins P3 , Ine P2, Ine Pi, eon recolectadae , reunidae y liof ilizadae . Loe liofilizadoe eon rehidratados con 0.5 ml de D20 y son analizados mediante RMN a 17°C. .2.2 Análisis de InsP Como ya ha sido detallado en Materialee y Métodoe, lae diferentes fracciones de los inositoles son caracteri zadae por el análieis de los espectroe de protonee (ID y 2D COSY y TOCSY) y de eue espectros de correlación 31P-1H (HMQC) . Si es posible distinguir los estereoieómeros, que son no imágenes en el espejo, no es posible distinguir los enantiómeros, que dan imágenes en el espejo y espectros idénticos.

Por eete hecho, la caracterización por RMN de los productos de hidrólisis no permite distinguir una 3--fitasa de una 1-fitasa, y una 6-fitasa de una 4-fitaea. Convencionalmente, a partir de la literatura, cuando los enlaces 3 ó 1 son hidrolizados primeramente se da el nombre de la 3-fitasa, de igual modo para los enlaces 6 ó 4 se da el nombre de 6-fitasa. 5.2.2.1 Análisie de la fracción de HPLC que contiene loe Ins Pl El espectro de protonee indica la preeencia de una mezcla de tree productos donde los sietemae de eepin han eido identificados con ayuda de los experimentos TOCSY y COSY.

Eetoe tres productos son: Ine (2) Pl (36%), Ins (1 ó 3) Pl (16%) e inositol (48%) . El espectro de fósforo indica la preeencia de fóeforo inorgánico que ee caracteriza por una eeñal fina. La HMQC confirma que doe de entre ellos están monofoeforiladoe y que el 3o no lo está, es decir el inositol. .2.2.2 Análisie de la fracción de HPLC que contiene loe Ine P2 El eepectro de protonee indica la preeencia de un producto mayoritario (aproximadamente 90%) . Partiendo de la eeñal correepondiente al protón H2 {4,741 ppm), el COSY permite la atribución del eepectro. El análieis de las constantee de acoplamiento indica que lae poeicionee 2 y 1 (ó 2 y 3) están fosforiladae, y que el producto mayori ario correeponde a los Ins (2.1 ó 2.3) P2. El eepectro deeacoplado de 31P y el HMQC confirman eeta atribución. Loe productoe minoritarioe, al menos 2, no han sido identificados. 5.2.2.3 Análisis de la fracción de HPLC que contiene los Ins P3 El espectro de protones indica la preeencia de un producto prácticamente puro. El análieie del eepectro indica que éste correeponde a loe Ine (2,1,6 ó 2,3,4) P3. La fosforilación de estas tres posicionee coneecutivae ee confirmada por el eepectro desacoplado de 31P y por HMQC. .2.2.4 Análisis de la fracción de HPLC que contiene los Ins P4 El eepectro de protones indica la presencia de un producto mayoritario (aproximadamente 90%) que comprueba ser los Ins (2,1,6,5 ó 2,3,4,5) P4. Las posiciones de los grupos foefato deducidoe del análieie de lae conetantee de acoplamiento (3JHCOP = 8-10 Hz) eon confirmadae por los experimentoe de acoplamiento de 31P y por el experimento de HMQC. Loe productoe minoritarioe no han eido identificadoe . .2.2.5 Caracterización de loe Ine P5 Tomando en cuenta que IneP5 es el principal producto formado y que es sobre todo degradado en InsP4 no nos ha eido posible aislarlo suficientemente por HPLC para poder caracterizarlo por RMN. Con el fin de cincunvenir esta dificultad, el Ins P5 ha eido caracterizado in situ en el curso de una cinética de hidrólisie realizada a 17°C con una débil cantidad de fitaea (ver máe adelante) . En esas condiciones, los eepectroe de protones (espectro de diferencia ID, TOCSY y COSY) del Ins P5 ha podido ser obtenido. El conjunto de estoe eepectroe permite caracterizar loe Ine (1,2,4,5,6) P5 indicando que la poeición 3 (ó 1) es la primera posición que va a ser desfosforilada. El espectro 31P del Ins P5 no ha sido registrado (Figura 8). .2.3 Cinética de hidrólieie de IneP6 Los estudios preliminares han permitido por una parte mostrar que la enzima sería insensible a la presencia del deuterio y por otra parte ajuetar la concentración de enzima para evitar una cinética ni demasiado rápida ni demasiado lenta con relación a los constreñimientoe técnicoe de la obeervación. En función de la temperatura (aquí 17 °C) y de la concentración de enzima, una cinética puede ser lenta (1 µl de enzima) y la aparición de los primeros intermediarioe fácilmente obeervada. Es en estas condiciones que lae caracteríeticas espectralee de InsP5 han eido obtenidas, y que se van a aparecer claramente suceeivamente loe Ins P5, Ins P4 e Ine P3. En preeencia de 5 µl de enzima, la formación de Ine P2 , Ine Pl y de inositol es observada. En la fase intermediaria, la complejidad de los espectroe obtenidos toma en cuenta la mezcla de Ine Pn. Deepuée de 10 horae, la hidrólieie no ee total. En presencia de 20 µl de enzima, ha sido obtenida una hidrólisis total en aproximadamente 4 horas. Eetoe resultados cinéticos confirman la hidrólieie de 6 enlacee fosfato precedentemente observados. Éstoe mueetran claramente que la hidrólieie de loe 2 últimoe enlacee, eon netamente más lentos que los otros. El efecto inhibidor del foefato que ee acumula en el medio sería, en parte, responsable (Figuras 9, 10 y 11) . En este estudio, ee han deecrito lae vías de hidrólisie del ácido fítico por la fitaea de D . cae tel l ii . El análieie por cromatografía ee mediante RMN homo y heteronuclear y ha permitido determinar ein ambigüedadee la eetructura de loe principalee y diferentee Ine Pe formadoe: Ine P5, Ine P4 , Ine P3 , Ine P2 , Ine Pl . La eecuencia de deefoeforilación ee preeentada eobre la Figura 5. Ésta puede ser reeumida bajo la forma 3/4/5/6/1.2. Aunque los isómeroe de la poeición 1 y 3 y 4 y 6 no eean discernibles por RMN, gracias a los análisie de HPLC hemoe podido determinar que los grupos fosfato en la posición 3 y luego 4 son los dos primeros que van a ser hidrolizados. La cinética eeguida por RMN confirma esta observación. Las hidrólisie siguientes se sitúan sobre el fosfato adyacente al grupo hidroxilo. La hidrólisis de los 2 últimos enlaces fosfato Ins (1,2) P2 ee realiza eimultáneamente. No obstante, la velocidad de hidrólieie de la poeición 2 parece doe veces más débil que aquella de la posición 1 (ó 3). Finalmente, cualquiera que sea el método utilizado (enzimático, HPLC o RMN) , la obtención cuantitativa del inositol al final de la hidrólisie, mueetra que loe eeie enlacee foefato eon hidrolizadoe por la fitaea de levadura D . caetel l i i . Eeta fitasa puede ser claeificada como una 3-fitaea (EC 3.1.3.8) de manera eemejante a lae numerosas fitasae de microorganismos .

Ejemplo 2; Clonación, sobreexpresión y caracterización bioquímica de la fitasa recombinante MATERIALES Y MÉTODOS Organismos, vectores y secuencias oligonucleotídicas Las cepas, pláemidos y cebadores utilizados en este estudio son descritos en la Tabla 7.

Tabla 7: Cepas, plásmidoe y oligonucleótidoe utilizados para este estudio La levadura Debaryomyces castellii CBS 2923 ee cultivada en matraces Erlenmeyer rellenos a 1/10 de su volumen en condiciones aerobias y a 28°C. Al momento de la extracción del ADN genómico, la cepa es cultivada en presencia de 500 ml del medio YPD o de 20 ml del medio MSA. La cepa E. coli XLl-Blue MRF J utilizada al momento de la amplificación del ADN, es cultivada en matraces Erlenmeyer rellenos a 1/10 de su volumen en condiciones aerobias y a 37°C, en presencia del medio Luria-Bertani (Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Prese, Cold Spring Harbor, New York, USA) adicionado con ampicilina (100 mg/l) o del medio Luria-Bertani "bajo en sal" (NaCl 5 g/1) donde el pH es ajustado a 7.5 con la soea y adicionado con zeocina {25 mg/l) . Al momento del cultivo en medio eólido, loe medios precedentes son adicionados de 15 g/litro de agar Bacto. La cepa de levadura Pichia paetoris X33 es utilizada para la expresión heteróloga del gen que codifica para la fitaea. Loe traneformantee eon seleccionados, en condiciones aerobias, a 28°C, sobre medio gelosado YPDS, adicionado con zeocina (100 mg/l) . El vector pGEM-T {Promega) ee utilizado para la clonación en E. coli de fragmentos amplificados por reacción de polimerización en cadena (RPC) y para el eecuenciamiento del ADN. El marcador de eelección de este plásmido es del gen de resietencia a la ampicilina. Dos vectores de expresión, pPICZaB y pGAPZaB eon utilizadoe (Tabla 7) . El vector pPlCZaB contiene el promotor del gen del alcohol (metanol) -oxidaea (AOXl) que permite obtener grandee proporciones de expresión del gen de interés en P. paetorie, y la expreeión de la proteína recombinante ee inducible por el metanol (Cereghino, J. L y Cregg, J. M. (2000) Heterologoue protein expression in the methylotrophic yeast Pichia paetorie . Feme Microbiology Reviewe 24, 45-66) . El vector pGAPZaB contiene el promotor del gen de la gliceraldehído-3-foefato-deshidrogenasa {GAP) que permite una expresión conetitutiva y una taea grande de la proteína recombinante en P. paetorie (Waterham, H. R., Digan, M. E., Koutz, P. J., Lair, S. V. y Cregg, J. M. (1997) Ieolation of the Pichia paetorie glyceraldehyde-3-phoephate dehydrogenase gene and regulation and use of ite promoter. Gene 186, 37-44). Eetoe dos vectores poseen igualmente las secuencias necesariae para la replicación en lae bacteriae. La eelección de loe clonee traneformadoe por eetoe vectores está basada en un marcador de selección, la zeocina, y esta selección es aplicable a la vez en P. pastoris y E. coli .

Además, las proteínas recombinantes son expresadae en función con la eecuencia de eeñal del factor a de S. cerevieiae.

Medios D. caetellii CBS 2923 es cultivado en presencia del medio YPD (extracto de levadura 10 g/litro, peptona 20 g/litro, glucosa 20 g/litro) o del medio MSA-B (ver Ejemplo 1 Materiales y Métodos) amortiguado a pH 5.4 por el amortiguador de ftalato 100 mM. Deepuée de la traneformación, loe traneformantee de P. paetorie X33 eon eeleccionadoe eobre el medio YPDS eólido (extracto de levadura 10 g/litro, peptona 20 g/litro, glucoea 20 g/litro, eorbitol 1 M, agar Bacto 20 g/litro) . Al momento de la eelección de loe clonee productoree en medio geloeado, loe traneformantes de P. paetorie son cultivados sobre un medio sólido eintético -que contiene glucosa o metanol al 0.5%, agar Bacto 20 g/litro, sales FM21 100 ml/litro (FM21 10X:CaSO2H2O 1.5 g/litro, K2S04 23.8 g/litro, MgS047H20 19.5 g/litro, KOH 6.5 g/litro, H3P04 85% 3.5 % v/v), los oligoelementos PTMl 10 ml/litro (PTMl 100X:ZnCI2 2 g/litro, Fe(S04)7H20 6.5 g/litro, CuSO45H20 0.6 g/litro, MnS04H20 0.3 g/litro, Kl 10 mg/litro, H3B04 2 mg/litro, Na2Mo0 20 mg/litro, H2SO4 96% 0.2%), (NH )2SO4 g/litro, H2P04NH 12 g/litro y D-biotina 80 µg/litro, amortiguado a pH 5.4, con el amortiguador de tartrato-fosfato 200 mM. Al momento de la eelección de los clones productores en el medio líquido, los transformantes de P. paetorie son cultivados en presencia de un medio sintético que contiene una fuente de carbono (glucosa 10 g/litro, glicerol 20 g/litro o metanol 3.9 g/litro), sales FM21 100 ml/litro, los oligoelementos PTMl 10 ml/litro, (NH)2S04 4 g/litro, H2P0NH 12 g/litro y D-biotina 80 µg/litro, amortiguado a pH 5.4 con el amortiguador de tartrato-foefato 200 mM. Al momento de los cultivos en el biorreactor, loe precultivoe eon realizadoe en presencia del medio YMPG (extracto de levaduras 3 g/litro, extracto de malta 3 g/litro, peptona 5 g/litro, glucoea 10 g/litro) en preeencia del medio eintético: glicerol 40 g/litro, sales FM21 100 ml/litro, oligoelementos PTMl 10 ml/litro, (NH4)2S0 4 g/litro, H2P0NH 12 g/litro y D-biotina 80 µg/litro, amortiguado a pH 5.4 con el amortiguador de tartrato-fosfato 200 mM (Klein et al., 1998). Los cultivos en el modo por lotes son realizados en presencia del medio sintético que contiene glicerol 40 g/litro o glucosa 20 g/litro, sales FM21 100 ml/litro, los oligoelementos PTMl 10 ml/litro y la D-biotina 80 µg/litro. Al momento en que se realiza un segundo cultivo por lotes, es agregada una solución de glicerol en el fermentador, de manera para tener una concentración final de glicerol de 40 g/litro. Esta adición es realizada despuée del consumo total de glicerol inicialmente presente, siendo esto visualizable por un aumento brueco de la proporción de oxígeno dieuelto. Los cultivos en el modo de lote alimentado son alimentados con el medio sintético que contiene glicerol a 400 g/litro, glucosa a 400 g/litro o metanol a 780 g/litro, los oligoelementos PTMl 50 ml/litro y la D-biotina a 1 mg/litro. El cultivo en el modo continuo es alimentado por el medio sintético: metanol -66.67 g/litro, sales FM21 50 ml/litro, oligoelementos PTMl 25 ml/litro y D-biotina 50 µg/litro.

Extracción del AON genómico Extracción rápida del ADN genómico (ADNg) Lae células provenientee de un cultivo de D. caetellii CBS 2923 en preeencia del medio MSA eon recolectadae deepuée de 9 horae de cultivo, centrifugadas (3500 x g, 20 minutos, +4°C) y lavadas en 1-0 ml de agua estéril. Las célulae eon eneeguida colocadae en euepeneión en 200 µl de amortiguador de lieis (Trie-HCl 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, tritón X-100 2% v/v, SDS 1% p/v) , 200 µl de eeferas de vidrio (diámetro 0.45-0.5 mm) y 200 µl de mezcla de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25/24/1; v/v/v) . La lisie de lae célulae ee efectuada por agitación vigorosa durante 3 minutos luego 200 µl de amortiguador TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) son agregados. La eolución ee centrifugada (8000 x g, 5 minutoe, +4°C) . Lae proteínae eon extraídae de la faee acuoea con un volumen de mezcla de cloroformo/alcohol ieoamílico (24/1; v/v), centrifugación (8000 x g, 2 minutos, +4°C) . El ADN genómico es precipitado con 1 ml de etanol abeoluto (-20°C) , centrifugado (12 000 x g, 5 minutoe, +4°C) y colocado en eolución en 370 µl del amortiguador TE. El ARN ee eliminado por incubación 15 minutoe a +37°C en presencia de 75 µg/ml de ARNasa A. El ADN ee eneeguida precipitado con etanol abeoluto (-20°C) , colocado en euepeneión en 50 µl de amortiguador TE y coneervado a -20°C.

Preparación del ADN líquido de alto peso molecular de levadura Lae célulae provenientee de un cultivo de D. caetellii CBS 2923 en preeencia de 500 ml de medio YPD eon recolectadae durante la faee exponencial, centrifugadas (6000 x g, 15 minutos, +4°C) y lavadae en 40 ml de agua eetéril. El botón ee pueeto en eolución en 3.5 ml de eolución SCE (eorbitol 1 M, citrato de eodio 0.1 M, EDTA 60 mM) que contiene 40 µl de ditiotreitol 2 M y 5 mg (5000 unidadee) de zimolaea 100-T (ICN Biomedical, 32093) y ee incuba durante 1 hora a +37°C. 7 ml de la eolución de lieie (Trie-HCl 0.5 M, pH 6.5, earcoeil eodio 3.2 % p/v, EDTA 0.2 M, proteinaea K 100 µg/ml (Roche Diagnoetice, Meylan, Francia) son enseguida agregados y la euepensión ee incubada durante 15 minutoe a +65°C luego rápidamente enfriada a temperatura ambiente. Un gradiente de eacaroea es preparado vertiendo suceeivamente en un tubo de ultracentrifugación 11 ml de eacarosa al 20% p/v, 11 ml de sacarosa al 15 % p/v luego 3 ml de sacaroea al 50% p/v. La suspensión celular lisada es delicadamente depoeitada sobre el gradiente y luego ultracentrifugada durante 3 horas a 26000 rpm a +20°C (ultracentrifuga Centrikon T-1075, Kontron Instrument) . El ADN que forma un velo en el gradiente, ee recuperado con una pipeta, precipitado con etanol y colocado en euepeneión en 100 µl de amortiguador TE (Trie-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) . El ARN ee eliminado mediante incubación durante 3 horas a +37°C en presencia de 50 µg/ml de ARNasa A. El ADNg es nuevamente precipitado con etanol y luego colocado en suepeneión en 200 µl de amortiguador TE y coneervado a -20°C.

Clonación del gen de la fitasa Amplificación de un primer fragmento del gen Una reacción de polimerización en cadena {RPC) es realizada utilizando como matriz el ADNg de D. castellii CBS 2923, obtenido mediante el método de extracción rápida de ADN genómico. El par de cebadores phyt-Nter-for/phyt-pepl-rev es diseñado a partir de eecuenciae de la proteína limitando al máximo la taea de degeneración (Tabla 7) . El ADN ee amplificado graciae a la polimeraea Taq (Promega) con ayuda del termociclador Minicycler {MJ Research) . Después de una primera desnaturalización del ADNg durante 3 minutos a +94°C, la amplificación es efectuada en 30 ciclos de acuerdo al programa de temperatura siguiente: 1 minuto de desnaturalización a +94°C, 1 minuto de hibridación a +45°C y luego 1 minuto de polimerización a +72°C. Eetoe cicloe eon eeguidoe de una mitigación de 10 minutoe a +72°C.

Clonación de la secuencia completa del gen de la fitasa La eecuencia completa del gen ee obtenida utilizando la técnica de "marcha eobre el genoma" {Univereal -Genome Waiker Kit, BD Biosciences) de acuerdo a las instrucciones del proveedor. El ADNg de D. castellii CBS 2923 (2.5 µg) , extraído mediante el método "preparación del ADN líquido de alto peso molecular de levadura", es digerido durante 16 horae a +37°C por cuatro enzimae de restricción separadamente {50 unidadee de Dral, EcoRV, PvuII o Stul) . Cada fragmento poeee de eete modo extremoe francoe . Los fragmentos son purificados por extracción con fenol/cloroformo y precipitados con etanol. Los fragmentos son enseguida ligados a los adaptadores proporcionadoe con el equipo de "marcha eobre el genoma" durante 16 horae a +16°C. La ligadura ee detenida mediante calentamiento a +70°C durante 5 minutoe, y luego la adición de 9 volúmenee del amortiguador TE. Cuatro bancoe eon de eete modo conetruidoe y nombradoe "banco Dral, EcoRV, PvuII y Stul". Un primer ciclo de marcha eobre el genoma ee realizado utilizando cada banco como matriz y un par de cebadoree que incluyen el cebador API específico del adaptador y los cebadores 5phyt-spe-l/3phyt-epe-l específicos del gen (Tabla 7) . La eficacia de este primer ciclo de RPC es verificada eobre el gel de electroforeeie de agaroea LE al 1.5%. La mezcla, proveniente del primer RPC, ee diluida 50 vecee y eirve de matriz para el eegundo ciclo de RPC. Eete segundo ciclo es realizado utilizando el cebador AP2 específico del segundo adaptador y los cebadores 5phyt-spe-2/3phyt-epe-2 eepecíficoe del gen (Tabla 7) . Loe fragmentoe amplificados de este modo eon eeparadoe sobre gel de electroforesis de agaroea al 1.2% de bajo punto de fueión, purificadoe con ayuda de un equipo "GeneClean" y clonadoe en el vector pGEM-T con el fin de eer eecuenciados . Un segundo ciclo de marcha sobre el genoma ha sido necesario para obtener la secuencia completa de gen. Para cada banco, son realizados dos ciclos de amplificación por RPC como describe previamente utilizando los cebadores APl/3bisphyt-epe-l para el primer ciclo y AP2/3bisphyt-spe-2 para el eegundo ciclo (Tabla 7) .

Construcción de los plásmidos de expresión De manera para clonar el gen phytDc en P. paetorie con ayuda de loe vectores de expresión pPICZaB y pGAPZaB, la secuencia completa del gen es amplificada por RPC. Esta RPC es realizada utilizando como matriz el ADNg de D. caetellii CBS 2923, extraído mediante el método de extracción rápida del ADN genómico, con la ayuda de la polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) . Al momento de eeta amplificación, el par de cebadores utilizados, phytDc-Pstl-for y phytDc-Xbal-rev (Tabla 7) , ha permitido la creación de eitioe de reetricción PstI y Xbal reepectivamente en 5 ' y en 3 ' del gen. Deepués de una primera desnaturalización del ADNg durante 2 minutos a +95°C, la amplificación es efectuada en 25 ciclos de acuerdo al programa de temperatura siguiente: 30 segundoe de desnaturalización a +95°C, 30 segundoe de hibridación a +'55°C y luego 1.5 minutoe de polimerización a +72°C. Eetoe ciclos son seguidos de una mitigación de 10 minutos a +72°C. La ausencia de mutación es verificada por secuenciamiento.

Transformación Las célulae de E. coli XLl-blue MRF' eon traneformadae mediante choque térmico como ee deecribe por Sambrook et al. (Sambrook, J., Fritech, E. F. y Maniatis, T. (1989) Molecular cloning : a laboratory manual. 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA) . Las células de P. paetorie X33 son transformadae mediante electroporación (Manual de instrucción Invitrogen pPICZ A, B y C, versión E o manual de instrucción Invitrogen pGAPZaA, B y Ci versión F, Invitrogen Ltd, Reino Unido) . Las transformacionee son realizadae con ayuda de un aparato Gene Pulsear (Biorad) regulado a un voltaje de 1.5 kv y a una capacitancia de 25 µF y un Pulso Controlador (Biorad) regulado a 200 ohms.

Síntesis y análisis de las secuencias Los oligonucleótidoe utilizadoe como cebadores de RPC han sido sintetizadoe por la eociedad MWG-Biotech (Alemania) . El microsencuenciamiento de la secuencia N-terminal y de los péptidos internos de la fitasa ha sido efectuado con ayuda de un microsecuenciador de proteínae (Beckman/porton LF 3000) utilizando loe reactivoe y métodos recomendados por el fabricante. El microsecuenciador es conectado directamente a un sietema cromatográfico del tipo RP-HPLC (Beckman 125S) con un detector de UV a 268 nm (Beckman 166). Loe datoe eon tratadoe con el programa Gold V8.20. La búequeda de alineamientoe localee entre lae eecuenciae nucleotídicae o proteicae y los bancos de datos generalizados es efectuada con loe programae BLAST2 {Basic Local Alignment Search Tool) y FASTA. La comparación entre dos secuenciae ee efectuada con loe programas LALIGN y LFASTA, nucleico o proteico, del paquete FASTA. Eetoe programae eon dieponiblee en el eervidor Infobiogen (http://www.infobiogen.fr). La predicción del péptido de eeñal y el cálculo de loe pHi teóricoe a partir de las secuenciae proteicae son efectuados con el programa Antheprot 2000 V5.2 publicación 1.1.6. Los sitioe de glucoeilación eon predichos con ayuda de los servidoree NetNGlyc 1.0, DictyOGlyc 1.1 y NetOGlyc 2.0, Centro para el Análieie de Secuencia Biológica, Univereidad Técnica de Dinamarca.

Selección de los clones productores en medio líguido Loe traneformantes de P. paetorie pGAPphyt son cultivadoe a +28°C en presencia de 5 ml de medio sintético que contiene 10 g/litro de glucoea. Deepuée de 48 horae, loe cultivoe eon centrifugadoe durante 5 minutoe a 1676 x g. Loe eobrenadantes son coneervadoe a +4°C. Loe transformantes de P. paetorie pPICphyt son cultivados a +28°C en presencia de 5 ml del mismo medio que contiene 20 g/litro de glicerol en lugar de glucosa. Despuée de 48 horae, loe cultivos son centrifugadoe durante 5 minutoe a 1676 x g. La producción de recPhyt ee inducida agregando 2.5 ml del miemo medio que contiene 3.9 g/litro de metanol en lugar de glucoea en los tubos que contienen las células. Después de 24 horas de inducción, los cultivos son centrifugados durante 5 minutoe a 1676 x g. 2.5 ml del miemo medio que contiene 3.9 g/litro de metanol en lugar de glucoea eon agregadoe en loe tuboe que contienen lae célulae. Deepuée de 24 horae de inducción, los cultivos son centrifugados durante 5 minutos a 1676 x g. Loe eobrenadantee eon coneervadoe a +4°C. Eetos cultivos son realizadoe en loe tubos estérilee de 13 ml .

Producción de fitasa recombinante Precultivos en Erlenmeyer Loe precultivoe eon realizadoe en preeencia del medio YMPG en matraces Erlenmeyer llenados a 1/10 de eu volumen. Éetoe eon incubadoe a +28°C bajo agitación (80 oecilacionee por minuto, amplitud 7 cm) durante 24 horae. Loe precultivoe son enseguida realizados en presencia del medio eintético durante 24 horae.

Cultivos en biorreactor Loe cultivoe en el modo por lote, lote alimentado y continuo eon realizadoe en loe fermentadoree Applikon de 1 ó 3 litroe (Holanda) . El pH ee ajuetado a 4 por adicionee automáticae de NH3 al 16% (v/v) o de H2S04 2 N y la temperatura ee mantenida a +28°C. Con el fin de evitar la formación de eepuma, ee agrega el antiespumante Biospumex 153K {Cognis Dusseldorf, Alemania) en el curso del cultivo: antiespumante al 5% (v/v) para los cultivos en el modo de lote alimentado o 1% (v/v) para los cultivos en el modo continuo. La presión parcial de oxígeno disuelto es medida con ayuda de una sonda Applisene (Holanda) y mantenida a un valor euperior a 30% por regulación de la agitación y de la aireación. La adquieición de datoe y el control de loe cultivoe eon efectuados gracias al programa BioExpert de Applikon.

Condiciones de cultivo Ver Ejemplo 1 cultivo en fermentador.

Determinación de la concentración en biomasa Lae concentracionee celularee eon medidas por densidad óptica (DO) con ayuda de un espectrofotómetro (DU530, Beckman Instrumente Inc., Fullerton, CA, USA) a 600 n . Una unidad de DO correeponde a 0.462 g de material eeco/litro (g MS/L) eobre glicerol, 0.442 g MS/L eobre metanol y 0.491 g MS/L eobre glucoea.

Purificación de la fitasa recombinante Ver Ejemplo 1, Materiales y Métodos 3.

Electroforesis en SDS-PAGE Ver Ejemplo 1, Materialee y Métodoe 4.

Determinación de la concentración en proteínas Ver Ejemplo 1 , Materialee y Métodoe 7.2.

Técnicas enzimáticas Detección de la actividad fitásica en medio gelosado La actividad de fitaea ee detectada utilizando el método de Kim et al. (Kim, Y. 0., Kim, H. K., Bae, K. S., Yu, J. H. y Oh, T. K. (1998) Purification and propertiee of a thermoetable phytaee from Bacillus sp. DSll. Enzyme Microb. Technol. 22, 2-7) modificado para la revelación específica de las fosfataeae en gel de poliacrilamida. Loe traneformantee de P. paetorie eon cultivados en condiciones aerobias a +30°C sobre medio sintético sólido que contiene 0.5% de glucosa o metanol según el vector utilizado. Estoe cultivos son incubados durante 3 días. En el caso de los clones de P. paetorie transformados con el vector pPICZoíB modificado, son agregados 50 µl de metanol cotidianamente en la tapa de las cajas de -Petri a partir del tercer día. La solución de revelación (agar Bacto 10 g/litro, -naftilfosfato 2 g/litro, FaetGarnetGBC 1 g/litro, fitato de sodio 0.92 g/litro, amortiguado a pH 5.5 por amortiguador de acetato de sodio 0.25 M) es preparada hasta antes de la utilización, enfriada a 45°C y vertida en capa fina sobre lae coloniae. La coloración {café, rojo profundo) de loe clonee productoree de fitasa aparece inmediaamente.

Determinación de la actividad de fitasa por hidrólisis del fitato Ver Ejemplo 1, Materiales y Métodos 7.3. Determinación de la actividad de fitasa por hidrólisis del p-nitrofenilfosfato (p-NPP) La determinación de la actividad efectuada por realización de cinéticas enzimáticas. El medio de reacción (2 volúmenes en total), amortiguado a pH 5.5 {acetato de sodio 125 rriM) contiene 6 mM de p-nitrofenilfosfato y el .extracto enzimático diluido o no (1 volumen) . Deepuée de diferentee duraciones de incubación a la temperatura ambiente, la reacción es detenida por la adición de hidróxido de sodio 0.3 N (1 volumen para alcalinizar el medio y revelar la coloración. La absorbancia es medida a 450 nm con ayuda de un espectrofotómetro lector de microplaca Sanofi Paeteur PR 2100. La unidad enzimática {U) ee definida como la cantidad de enzima que libera un micromol de p-nitrofenol- por minuto, a partir de la solución de p-nitrofenilfosfato en las condiciones definidas: temperatura ambiente, pH 5.5. Una curva de calibración ha sido previamente establecida or p-nitrofenilfosfato (0.012-0.12 µmol) .

Estudios cinéticos Ver Ejemplo 1 , 7.5 y 7.6.

RESULTADOS Caracterización del gen de la fitasa Clonación del gen de la fitasa de D. caetellii CBS 2923 Un péptido interno y el péptido N-terminal de la fitasa pura de D. caetellii han sido secuenciadoe . A partir de eetae eecuencias peptídicas, son diseñados los cebadores de RPC, limitando al máximo la tasa de degeneración (Tabla 7) .

Una RPC es realizada utilizando como matriz el ADNg de D. caetellii CBS 2923. Un fragmento de aproximadamente 300 paree de bases (pb) ha podido ser también amplificado. De manera para clonar la eecuencia completa del gen de la fitaea de D. caetellii CBS 2923, hemoe elegido utilizar la técnica de "marca eobre el genoma" . A partir de la eecuencia del fragmento de 300 pb obtenida anteriormente, loe cebadores que corresponden a los extremos del fragmento y que permiten amplificar las eecuenciae adyacentes de este fragmento, son sintetizadae (Tabla 7) . Una RPC s realizada utilizando loe bancoe de ADNg de D. caetellii CBS 2923 como matricee. El primer ciclo ha permitido amplificar un fragmento de aproximadamente 1600 pb con dirección 5' y aproximadamente 110 pb con dirección 3 ' de la eecuencia de 300 pb a partir de loe bancoe EcoRV y PvuII reepectivamente. De eete modo, se ha podido reconstruir un fragmento de aproximadamente 3000 pb que incluye una faee abierta de lectura (ORF) de 1325 pb a truncada en 3 ' . Un eegundo ciclo de RPC ha eido realizado utilizando nuevoe cebadoree a partir del extremo 3 ' del fragmento obtenido al momento de la primera RPC. Eeta RPC ha permitido amplificar un fragmento de aproximadamente 100 pb a partir del banco EcoRV. Se ha podido reconstruir también la fase abierta de lectura de 1386 pb. La secuencia proteica deducida de esta ORF contiene los dos péptidos secuenciadoe precedentemente lo que permite confirmar que eete gen correeponde al gen que codifica para la fitaea de D. caetellii CBS 2923 (ver SEO. ID NO: 1). Con el fin de verificar la eecuencia, loe cebadoree correspondientes a los extremos del gen han sido sintetizadoe (Tabla 7) . El gen completo ha eido amplificado por RPC y el secuenciamiento ha confirmado los resultadoe obtenidoe anteriormente.

Análisis de las secuencias nucleotídica y proteica Graciae a loe experimentoe de "marcha sobre el genoma" , un fragmento de 2990 pb ha podido ser reconstituido. Este fragmento contiene una fase abierta de lectura de 1386 pb denominada "secuencia phytDc 'J La secuencia proteica de 461 aminoácidos correspondiente contiene varias porciones {SEQ ID NO: 2) . Una porción RHGERYP corresponde a la eecuencia de coneenso RHGXRXP presente en el sitio activo de numerosas fosfatasas acidas de alto peso molecular. La secuencia posee igualmente la porción HD en la parte C-terminal, porción presente en numeroeae eecuenciae de las fitasas. La secuencia N-terminal comienza deede el segundo aminoácido de la proteína deducida, lo cual parece indicar que esta proteína, aunque es excretada, no posee el péptido de señal. Esta observación es apoyada por la obtención de un resultado negativo al momento de la búsqueda de un sitio potencial de escieión del péptido de eeñal con la ayuda del programa Antheprot. La proteína deducida tiene una maea molecular estimada de 51.2 kDa, cercana a la masa obtenida experimentalmente (53/55 kDa) mediante espectrometría de masa a partir de la proteína expresada en D. caetellii CBS 2923, purificada y desglucoeilada por la endoglucoeidaea H. La diferencia de maea puede explicarse por la presencia de residuoe de N-acetilglucoeamina o de porcionee de O-glucoeilación que no son eliminadas por la endoglucoeilaea H. El análieis de la secuencia proteica mueetra la preeencia de 9 eitioe potencialee de N-glucosilación y 4 sitioe potencialee de 0-glucoeilación. El pHi de esta proteína es eetimado en 4.3. La búequeda de homología con loe bancoe de datoe mueetra que la fitaea de D. caetellii CBS 2923 poeee de 21 a 36% de homologíae con divereae fitaeas de origen de levadura o de hongo. Los tamaños de las eecuencias de estae fitaeae eon muy cercanoe (440-480 aminoácidoe) pero la fitasa de D. castellii CBS 2923 no se alinea perfectamente eobre toda la longitud de su secuencia. La secuencia phytDc comparte, sobre toda su longitud, 69.2% de homología con la secuencia de la fitasa de S. occidentalee . La secuencia del gen que codifica para la fitasa de S. occidentalee que ha sido obtenida a partir del ADN complementario, esta alineación permite penear que el gen que codifica para la fitasa de D. castellii no posee intrones. Por otra parte, esta secuencia posee homologías con las fosfataeae.

Selección de los clones de P. pastoris hiperproductores de fitasa recombinante El gen phytDc ha eido amplificado por RPC e insertado en los vectores de expreeión pPICZaB y pGAPZoíB. Loe traneformantee han eido eeleccionados sobre el medio YPDS que contiene zeocina. La tasa de traneformación es de 102 traneformantee por µg de ADN. Los clones obtenidos con el vector pPICZoíB eon denominadoe "clones PIC" y los clones obtenidos con el vector pGAPZaB son denominadoe "clonee GAP". Para cada transformación, han sido tomados 100 clonee al azahar y eu producción de fitasa recombinante (recPhyt) ha sido evaluada en medio gelosado. Despuée de la revelación, loe clonee máe productores presentan un halo café alrededor de las colonias. 96% de los clones PIC y 66% de los clones GAP son productores . Entre los clones más productores, 10 clones GAP y 10 clonee PIC han eido probadoe eobre medio eintético en matraz de Erlenmeyer. Para cada clon, la relación entre la biomaea (evaluada por la medición de la D.O.) y la actividad de fitaea en el eobrenadante de cultivo (medida por hidrólisis de p-NPP) ha sido determinada. El reporte varía de 0 a 0.48 entre los clones PIC y de 1.28 a 6.07 para los clones GAP. En eetae condicionee de cultivo, loe clonee GAP eon los mejores productores. De acuerdo a Waterham et al. (Waterham, H. R., Digan, M. E., Koutz, P. J., Lair, S. V. and Cregg, J. M. (1997) Isolation of the Pichia paetoris glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase gene and régulation and use of its promoter. 3ene 186, 37-44), el promotor GAP en cultivo sobre glucosa parece más fuerte que el promotor A0X1 en cultivo sobre metanol al momento de los cultivos en matraz Erlenmeyer. Para completar esta fase de selección, los clones PIC81 y PIC61 por una parte y GAP29 y -GAP66 por otra parte han sido probados en fermentador. Para los clonee PIC, dos lotes sucesivos de glicerol (40 g/litro) permiten obtener una biomasa elevada antes de la inducción por el metanol (780 g/litro) en el modo de lote alimentado. Para los clones GAP, un primer cultivo en lote eobre glucoea (20 g/litro) ee eeguido en una faee de producción en el modo de lote alimentado eobre glucoea a 400 g/litro. El clon PI-C81 permite obtener una biomaea final de 81 g de MS/litro mientrae que la biomaea final del clon PIC61 no es más que de 65 g de MS/litro. Por el contrario, loe dos clones producen sensiblemente la misma cantidad de recPhyt (100 U/ml). Los clones GAP presentan crecimientos idénticos (100 g de MS/litro) en el final del cultivo, pero las producciones obtenidas son de 11 U/ml para el clon GAP29 y de 9 U/ml para el clon GAP66. Las cepas recombinantes obtenidas producen respectivamente 100 (cepas PIC) y 10 (cepas GAP) veces más de fitasa que la cepa silveetre de D . cae tel l i i CBS 2923. La producción por loe clones PIC81 y GAP29 ha sido optimizada en fermentador.

Producción de fitasa recombinante Expresión constitutiva - Influencia de la fuente de carbono y de la velocidad específica de crecimiento sobre la producción del clon GAP La producción de recPhyt ha sido estudiada en cultivo sobre glucosa (400 g/litro) , glicerol (400 g/litro) y metanol (780 g/litro) en el modo de lote alimentado. Los resultados son presentados en la Tabla 8.

Tabla 8 : Comparación de los parámetros obtenidos al momento de los cultivos de lote alimentado del clon GAP29. Para todos los experimentos, las fases en lotes han sido realizadae eobre el mismo medio que contiene 40 g/litro de glicerol. a: Estoe valoree correeponden a loe valoree obtenidoe durante cada fase. b: estoe valoree correeponden a loe valoree al final del cultivo.

Para loe doe primeroe sustratoe, un eolo lote eobre glicerol (40 g/litro) permite alcanzar 20 g/litro de biomaea y una velocidad eepecífica de crecimiento de 0.2 h"1. De acuerdo a la duración de la faee eetacionaria antee del lote alimentado, la producción de recPhyt ee diferente: cercana a 7 U/ml o bien 340 U/g de MS para una faee eetacionaria de 12 horae, cercana a 5.5 U/ml o bien 275 U/g de MS para una faee eetacionaria de 3 horae. La producción en el modo de lote alimentado eobre glucoea y glicerol con una velocidad eepecífica de crecimiento impueeta de 0.01 h"1 permite alcanzar de 55 g/litro de biomasa, una producción de fitasa de 16.5 U/ml o bien 280 U/g de MS . Al momento del cultivo por lote alimentado eobre metanol después de dos lotes sobre glicerol (40 g/litro) y una velocidad específica de crecimiento impuesta de 0.01 h"1, la biomasa alcanzada es de 84 g/litro, la producción de fitasa es de 14.5 U/ml o bien 112 U/g de MS . La producción en el modo de lote alimentado sobre glucosa y glicerol con una velocidad específica de crecimiento impuesta de 0.04 h"1 permite alcanzar 80 g/litro de biomaßa, una producción de fitasa de 16.5 U/ml o bien 200 U/g de MS. En el caso donde la producción de la fitasa está bajo el control del promotor GAP, la glucosa y el glicerol son mejores sustratos para la producción de fitasa recombinante con relación al metanol, más favorable para el crecimiento.

Expresión inducible - Influencia de la velocidad específica de crecimiento sobre la producción del clon P C La producción por el clon PIC81 ha sido eetudiada en el modo de lote alimentado (Figura 6 y Tabla 9) y en el modo continuo (Figura 6 y Tabla 9) .

Tabla 9 : Comparación de los parámetros obtenidos luego de los cultivos de lote alimentado y continuo del clon PIC81 Modo de cultivo µ o Dtr1 Biomasa g MS/L Yx/s g/g recPhyt YrecPhyt/x U/ml U/g S Lote alimentado 0.01 h-1 Fase 1 (64 h)3 0.012 28.8 0.21 34.7 1105 fase 2 (54 )3 0.011 22.9 0.18 72.3 2342 final (118 h 51.7 107 1337 Lote alimentado 0.03 h"1 Fase 1 (22.5 h)3 0.047 32.5 0.41 16.7 472 Fase 2 (28.5 h)3 0.033 49.6 0.28 47.2 880 Final (51 h)f 82.1 63.9 614 Continuo11 0.032 21.6 0.32 57.7 2700 0.053 27.2 0.41 11.S 430 0.077 26.3 0.39 5.7 _10 0.095 26.6 0.40 3 116 a: Estoe valoree correeponden a loe valores obtenidos durante cada fase. b: Estos valores correeponden a loe valoree al final del cultivo. c: Para cada tasa de dilución, las medidas han sido realizadas despuée de al menoe tree renovacionee del contenido del fermentador.

En el cultivo de lote alimentado, doe valoree de velocidad eepecífica de crecimiento (µ) han sido impuestoe (0.01 h"1 y 0.03 h"1) . La biomaea obtenida ee 1.5 veces más elevada a µ = 0.03 h"1 {82 g/litro) que a µ = 0.01 h"1 {52 g/litro) . La producción de fitasa se efectúa en dos fases (Tabla 9) . Para una velocidad eepecífica de crecimiento impueeto de 0.01 h"1, una primera faee conduce a la producción de 28.8 g/litro de biomaea con una producción de fitasa de 1105 U/g de MS . Durante la segunda fase, eon obtenidoe 22.9 g/litro de biomaea y la producción de fitasa alcanza 2342 U//g de MS o bien 107 U/ml. Resultadoe eimilaree eon obtenidoe a µ = 0.03 h"1, donde la producción de fitaea pasa de 472 U/g de MS durante la primera fase a 880 U/g de MS durante la eegunda faee, o bien 64 U/ml. El aumento de la velocidad eepecífica de crecimiento ee máe favorable para el crecimiento celular que para la producción de la fitaea recombinante. En el cultivo continuo, han eido impueetae cuatro tasas de dilución (Tabla 9) . Para los valores de tasas de dilución superiores a 0.053 h"1, la biomasa en el equilibrio es de 27 g/litro mientras que ésta no es de 21.6 g/litro a una tasa de dilución de 0.032 h"1. Como en el cultivo en el modo de lote alimentado, el aumento de la tasa de dilución es favorable para la producción de biomasa en detrimento de la producción de proteínae recombinantee . Loe valoree máximoe de 2700 U/g de MS o bien 57.7 U/ml eon obtenidoe para una taea de dilución de 0.032 h"1. La comparación de la producción de la fitasa por un sistema inducible (promotor AOXl, clon PIC81) y por un sietema conetitutivo (promotor GAP, clon GAP29) mueetra que el promotor AOXl ee netamente superior al promotor GAP. La cepa PIC81 ha permitido obtener 107 U/ml de fitasa recombinante, o bien 7 vecee más que la cepa GAP29 /16 U/ml) . La producción eepecífica ee reepectivamente de 2700 U/g de MS (PIC 81) y 340 U/g de MS (GAP29) o bien 100 y 10 vecee euperior a aquella de la cepa de D. caetellii .

Purificación El eobrenadante obtenido deepuée de uno de loe cultivoe en el modo de lote alimentado del clon PIC81, ha eido purificado en una etapa como ee deecribe en la parte de Materiales y Métodos. La actividad de fitasa específica es de 101 U/mg de proteínas en el extracto bruto y de 182 U/mg de proteínas en el extracto purificado. De este modo, el factor de purificación es de 1.8. Eete valor relativamente pequeño sugiere que la fitasa recombinante es la proteína mayoritaria en el extracto bruto. Esta hipótesie ha sido confirmada realizando una electroforeeie de SDS-PAGE. Sobre el gel, la banda correepondiente a la fitaea recombinante repreeenta 60% de lae proteínae totalee. Por otra parte, después de la purificación, es observada una eola banda que confirma así la purificación hasta la homogeneidad de la proteína. La actividad específica obtenida después de la purificación es superior a aquella obtenida al momento de la expreeión de la fitasa de Aepergillue fumigatue en P. paetorie (43 U/mg de proteínas) (Rodríguez, E., Mullaney, E. J. y Lei, X. G. (2000) Expreseion of the Aepergillus fumigatus phytase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 268, 373-378) .

Caracterización de la fitasa recombinante Efectos del pH recPhyt es activo para los valores de pH comprendidoe entre 2 y 6.5, y el óptimo ee sitúa entre 4 y 4.5. La fitasa de D. caetellii CBS 2923 presenta características similaree.

Efectos de la temperatura Lae determinacionee de actividad fitásica a diferentes temperaturas muestran que la fitasa recombinante es más activa para las temperaturas elevadas, con un óptimo a +60°C, como la fitasa de D. caetellii CBS 2923. La mayor parte de los valoree citadoe para la temperatura óptima son inferiores a +45°C, salvo para algunoe hongoe y levadurae como Aepergillue ficuum {+58°C) (Ullah, A. H. J. y Gibson, D. M. (1987) Extracellular phytaee {EC 3.1.3.8) from Aspergillus ficuum NRRL 3135: purification and characterization. Prep. Biochem. 17, 63-91), Aspergillus terreus (+70SC) (Yamada, K., Minoda, Y. y Yamamoto, S. (1968) Phytase from Aspergillus terreus. I. Production, purification and eome general propertiee of the enzyme. Agrie. Biol. Chem. 32, 1275-1282) y S. castellii (+77aC) (Segueilha, L., Lambrechts, C, Boze, H., Moulin, G. y Galzy, P. (1992) Purification and propertiee of the phytase from Schwanniomyces castellii. J. Ferment. Bioeng. 74, 7-11). La representación de Arrhenius permite calcular la energía de activación de la reacción, E=37.9 kJ/mol . El estudio de la desnaturalización térmica muestra que la fitasa recombinante es estable para las temperaturae inferioree a +67°C y fuertemente deenaturalizada para lae temperaturas superioree a +70°C. La energía de activación calculada graciae a la repreeentación de Arrheniue ee de E=794.2 kJ/mol . La fitaea de D. caetellii CBS 2923 preeenta características de termorresistencia similaree.

Especificidad del sustrato La fitasa recombinante sigue una cinética de Michaelie-Menten, con una Km de 0.24 mM y una Vm de 137.8 U/mg eobre el fitato de sodio y una Km de 2.05 mM y una Vm de 274.6 U/mg sobre el p-NPP (determinación graciae a la repreeentación de Lineweaver-Burk; datoe no publicadoe) . De este modo, la enzima tiene una muy grande afinidad por el fitato. La fitasa de D. caetellii CBS 2923 tiene valores de Km eimilaree.

Estudios cinéticos Loe productoe principalee de la degradación de IneP6 eon DL-Ins (1, 2, 4, 5, 6) P5 y DL-Ins (1, 2,5, 6) P4. La fitaea recombinante ee pues una 3-fitasa. Por otra parte, el cromatograma muestra que la degradación de InsP5, InsP4, IneP e IneP2 comienza inclueo antee que la IneP6 eea agotada y que no exista acumulación de InsP3. Esto sugiere que la fitasa recombinante tiene una afinidad menos fuerte para la InsP3 que para la IneP4, InsP5 e lneP6. La fitasa de D. castellii CBS 2923 muestra los mismoe perfilee cromatográficos. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndoee descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientee reivindicacionee : 1. Un polipéptido, caracterizado porque comprende un polipéptido elegido entre loe eiguientes polipéptidos: el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, un fragmento del polipéptido de la SEQ ID NO: 2 que tiene una actividad de fitasa, - un polipéptido que tiene una actividad de fitasa y que presenta al menoe 90% de identidad con el polipéptido de la SEQ ID NO: 2. 2. Un polinucleótido que codifica para una actividad de fitasa, caracterizado porque éste es elegido entre los polinucleótidos siguientee: el polinucleótido donde la eecuencia eetá comprendida entre la poeición 1538 y la poeición 2923 de la SEQ ID
NO: 1, un polinucleótido que codifica para un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.
3. Un polinucleótido, caracterizado porque tiene la eecuencia de la SEQ ID NO: 1 o la eecuencia complementaria a la SEQ ID NO: 1.
4. Un caeete de expresión, caracterizado porque comprende en el sentido de la tranecripción: un promotor funcional en un organismo hospedero; un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2; y una secuencia terminadora en el mismo organismo hospedero .
5. Un vector, caracterizado porque comprende un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicacionee 2-3 y/o un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 4.
6. El organismo hoepedero caracterizado porque es transformado con un polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-3, un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 4 y/o un vector de conformidad con la reivindicación 5.
7. El organismo hoepedero de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el organismo hospedero es elegido entre las levaduras y los hongos filamentosoe.
8. El organiemo hoepedero de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque es elegido entre Debaryomycee caetellii , Pichia paetoris, Penicillium funiculosum y Schizoeacharomyces pombe.
9. Un aditivo nutricional para animales, caracterizado porque comprende un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.
10. Un aditivo nutricional para animalee, caracterizado porque comprende un organismo hospedero de conformidad con cualquiera de lae reivindicacionee 6-8 y/o un moeto de fermentación de un organiemo hoepedero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8.
11. El aditivo nutricional para animales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-10, caracterizado porque se presenta bajo la forma líquida o bajo la forma de polvo.
12. Un alimento para animales, caracterizado porque comprende una base nutricional para animales y un aditivo nutricional para animales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-11.
13. El alimento para animales, caracterizado porque comprende un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, un organismo hospedero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8 y/o un mosto de fermentación de un organismo hospedero de conformidad con cualquiera de lae reivindicaciones 6-8.
14. El uso de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o de un organismo hospedero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, para la fabricación de un aditivo nutricional para animalee o de un alimento para animalee.
15. El ueo de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, o de un organiemo hoepedero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, para la hidrólisie del hexakisfosfato de mio-inositol en monofosfato inorgánico, en mio-inositol de grado de fosforilación inferior y en mioinositol libre.