CN106290336A - 藻类和水生植物中生物有效磷的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及藻类和水生植物中生物有效磷的分析方法，分别通过液态31P‑NMR技术和酶水解法分析湖泊藻类和水生植物中的详细磷组分并进行对比分析，发现两种方法检测出的磷组分具有类似性，其中液态31P‑NMR技术检测出藻类和水生植物含有超过15种以上磷组分，而酶水解法发现水解能力较强的是植酸磷和活性单酯磷组分，分别占总可水解有机磷的50.2％和43.5％；再添加各种酶培养来研究湖泊藻类和水生植物中的生物有效磷，发现二者有机磷中的大部分单酯磷和焦磷酸盐均不同程度的水解为生物可直接利用的正磷酸盐，为藻类再次暴发提供了充足的营养物质，待外界环境条件适宜时，藻类将循环往复暴发，为湖泊生态系统以及人类饮水安全带来巨大隐患。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物有效磷的分析方法，具体涉及藻类和水生植物生物有效磷的液态31P-NMR和酶水解分析方法。
背景技术
有机磷在湖泊水体、沉积物以及水生植物均存在，其可以通过一系列氧化还原环境以及酶水解过程中转化为生物有效磷(即生物可直接吸收利用的磷，如正磷酸盐等)。Zhu[1]报道沉积物中有机磷含量平均为454mg/kg，水生植物和藻类的有机磷浓度分别沉积物的1.8倍和12.9倍。尽管湖泊内源有机磷在富营养化过程中发挥着重要作用，但是研究藻类和水生植物中有机磷的组成结构及其在湖泊内源磷中的循环过程还鲜有报道。
液态磷核磁共振光谱技术(31P-NMR)作为一种有效的表征手段应用于沉积物等水环境样品中。在水生系统中主要有三大类有机磷组分，即单酯磷、二酯磷和膦酸盐。31P-NMR光谱技术还可以将单酯磷进一步表征为详细的磷组分，如糖磷(葡萄糖6磷酸、葡萄糖1磷酸等)、肌醇磷酸盐(IHP)、磷脂、DNA以及RNA等。
除此以外，酶水解法是另外一种表征有机磷的方法，一般在动物肥料、土壤以及其他陆地样品中均有应用。该方法添加各种酶后可以将有机磷水解为无机磷。在湖泊生态系统中，该方法一般应用于沉积物中。例如，这种方法把沉积物中的磷分为活性单酯磷、二酯磷和类植酸磷。在湖泊生态系统中，酶水解分析方法应用于湖泊藻类和水生植物中还鲜有报道。
也有研究把31P-NMR光谱技术和酶水解法结合起来应用于动物肥料、土壤以及沉积物[22]中。但是将此两种方法相结合应用于藻类和水生植物中，以此来分析富营养化湖泊内源磷循环机理以及生物可利用性还未见报道。因此，在该研究中，将藻类和水生植物样品利用这两种手段进行深入的研究，并且比较这两种手段在湖泊藻类和水生植物中有机磷组成结构中的差异，并且利用31P-NMR光谱技术分析在酶解前后湖泊藻类和水生植物有机磷的生物可利用性，为更好的探索内源磷在富营养化湖泊中的循环过程提供科学依据。
[1]Zhu，Y.；Zhang，R.；Wu，F.，et al.Phosphorus fractions andbioavailability in relation to particle size characteristics in sedimentsfrom Lake Hongfeng，Southwest China[J].Environmental Earth Sciences，2013，68(4)：1041-1052.
发明内容
本发明针对现有技术中存在的缺陷，提供一种藻类和水生植物生物有效磷的31P-NMR和酶水解分析方法，该方法可以准确、快捷的分析湖泊藻类和水生植物中的生物有效磷。
本发明的技术方案为：一种藻类和水生植物生物有效磷的分析方法，包括以下步骤：
(一)酶水解法
(1)酶溶液的制备
碱性磷酸酶(APase)溶液由0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液配置，活性为1U/mL；
碱性磷酸酶和磷酸二酯酶(PDEase)组合溶液由0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液配置，活性为0.02U/mL；
碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合溶液由0.1mol/L，pH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液配置，活性为0.06U/mL；
(2)培养液的制备
取藻类或水生植物浸提液于比色管中，加入盐酸调节所述浸提液的pH值至中性，再加入50倍所述浸提液体积的超纯水和0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液，再加入2.5倍所述浸提液体积的所述碱性磷酸酶溶液，得培养液1；
取藻类或水生植物浸提液于比色管中，加入10倍所述浸提液体积0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液，再加入5倍所述浸提液体积的所述碱性磷酸酶和磷酸二酯酶(PDEase)组合溶液，然后加入50倍所述浸提液体积的超纯水，得培养液2；
取藻类或水生植物浸提液于比色管中，加入50倍所述浸提液体积的超纯水，再加入10倍所述浸提液体积0.1mol/L，pH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液，再加入5倍所述浸提液体积的所述碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合溶液，得培养液3；
所述配制好的培养液1、培养液2和培养液3，分别培养在37℃恒温培养箱中，转速为220r/min；
(3)培养16h后，向培养液中加入显色剂，10min后，采用磷钼蓝比色法测酶培养前后的磷酸盐；
(4)显色后使用紫外可见分光计分析，培养后测定的磷酸盐与培养前测定的磷酸盐的差值为有机磷水解量，即生物有效磷量；
(二)31P-NMR分析法
(1)取100mg冷干后的藻类或水生植物NaOH-EDTA提取液粉末用1mL 1mol/LNaOH-0.1mol/LEDTA重新溶解；
(2)加入重水，在室温条件下静置30min，再用10000r/min转速离心30min；
(3)转移至核磁管中，贮存在4℃条件下，24h之内测定液态31P-NMR；
(4)对步骤(3)中得到的谱图进行积分得到生物有效磷量。
进一步地，所述藻类或水生植物浸提液采用0.5mol/LNaOH+25mmol/LEDTA提取剂进行提取，所述藻类或水生植物粉末与所述提取剂的质量体积为1∶60。用0.5mol/LNaOH+25mmol/LEDTA作为提取剂，水生植物TP和Po的提取率分别是92.4％和88.1％，藻类TP和Po的提取率分别是96.4％和90.8％，较高的提取率不需要HCl等溶液进行二次提取。
进一步地，所述植酸酶由粗品植酸酶(Phytase)提纯后得到，提纯方法为：
a.取粗品植酸酶，用pH＝5.0-5.5，8-12mmol/LNaAc-HAc缓冲溶液进行溶解，转移至透析管中，悬浮在pH＝5.0-5.5，8-12mmol/LNaAc-HAc缓冲溶液中透析，每隔2～4h更换烧杯中透析液一次，连续更换5～7次；
b.透析后的酶溶液在8000-12000r/min转速下离心5-15min；
c.提纯后的植酸酶溶液保存在4℃环境中，一周内使用。
更进一步地，对所述提纯后植酸酶进行活性测试，所述活性测试的方法包括以下步骤：
取两支离心管，分为检验组和对照组，往两组离心管中均加入0.5mL的1mmol/L硝基苯磷酸二钠盐(PNPP)溶液，再向检验组中加入0.2mL的1U/mL提纯后的植酸酶溶液和1mL0.01mol/L pH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液，向对照组中只加入1.2mL0.01mol/L pH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液，等待3-5分钟，若检验组中的溶液变黄色，而对照组中的溶液仍为无色，则说明提纯后的植酸酶仍具有活性，可以继续下一步的实验操作。
进一步地，所述培养液还含有0.5-2％的十二烷基硫酸钠(Sodium DodecylSulfate，SDS)，优选为1％的十二烷基硫酸钠，以防止在测定过程中可能因为酸化而产生酶蛋白沉淀等干扰磷的测定。
进一步地，所述31P-NMR分析采用BRUKER标准腔5mmBBO探头，31P的共振频率为161.98Hz，测定温度为20℃，谱峰宽度为5Hz，获取时间AQ为0.2102s，NMR参数中延迟时间D1的设置为5s，分析测试时间为15h。
本发明优选活性为1U/mL的碱性磷酸酶溶液，活性为0.02U/mL的碱性磷酸酶和磷酸二酯酶组合溶液，活性为0.06U/mL的碱性磷酸酶和磷酸二酯酶和植酸酶溶液组合溶液，在此活性下，藻类和水生植物中的有机磷中的各种组分最大程度的水解出来，即为生物有效磷。生物有效磷可以被湖泊水体中的生物直接吸收利用，可以为它们的正常生长繁殖提供物质来源。
藻类或水生植物添加酶溶液培养后，水解出四类有机磷，分别为(1)活性单酯磷，是添加碱性磷酸酶溶液后水解出来的有机磷；(2)二酯磷，是添加碱性磷酸酶和磷酸二酯酶后水解出来的有机磷；(3)类植酸磷，是添加碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶后水解出来的有机磷；(4)稳定态磷，是添加三种酶后仍未被水解出来的有机磷。
31P-NMR表征出来的磷组分概括为6种磷组分，其分别是正磷酸盐、植酸磷、活性单酯磷(除植酸磷以外的单酯磷)、二酯磷、焦磷酸盐和膦酸盐。在水生植物中，主要的磷组分是正磷酸盐(占总磷27.3～56.6％)，活性单酯磷(10.8～33.5％)，焦磷酸盐(0.9～18.8％)和二酯磷(1.6～6.2％)，类似的，藻类正磷酸盐(27.1～67.5％)，活性单酯磷(8.6～44.3％)，植酸磷(5.6～41.9％)，焦磷酸盐(1.8～2.3％)和二酯磷(1.3～14.4％)。膦酸盐只有极小部分(0～0.7％)。在水生植物和藻类中均没有检测出来多聚磷酸盐。
湖泊藻类和水生植物单酯磷中的大部分和全部焦磷酸盐均转化为正磷酸盐，添加碱性磷酸盐酶后，6种藻类和水生植物平均18.9％的植酸磷和20.7％的活性单酯磷以及6.6％的焦磷酸盐转化为正磷酸盐；添加碱性磷酸酶和磷酸二酯酶后，藻类和水生植物平均12.3％的植酸磷和20.8％的活性单酯磷以及7.0％的焦磷酸盐转化为正磷酸盐；添加碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶后，藻类和水生植物平均22.8％和17.7％的活性单酯磷以及7.0％的焦磷酸盐转化为正磷酸盐。这些数据表明在湖泊藻类和水生植物腐解过程中大部分单酯磷和焦磷酸将转化为生物可直接吸收利用的正磷酸盐等无机磷。
利用酶水解法和液态31P-NMR技术比较藻类和水生植物主要磷组分的分布模式有一定的相似性(r＝0.712，p＜0.05)。液态31P-NMR技术提供比较详细的磷组分信息，但是测试价格较贵，测试时间相对较长。酶水解能够估算可水解的有机磷量，即生物可利用性的磷含量，但是只能检测出几类磷组分。因此，本发明采用这两种方法来研究富营养化湖泊藻类和水生植物中详细磷组分化学特征及其生物有效性，本发明的分析方法可以准确、快捷的分析湖泊藻类和水生植物生物有效磷，以进一步研究湖泊藻类和水生植物中内源磷的循环机制具有重要意义。
附图说明
图1；各种生物酶作用下藻类和水生植物NaOH-EDTA提取液中31P-NMR谱图
图2；利用液态31P-NMR技术和酶水解法对湖泊藻类和水生植物中磷组分的比较
图3；添加各种酶培养后湖泊藻类和水生植物磷组分降解特征
图4；添加各种酶培养后湖泊藻类和水生植物各磷组分转化比例
其中A1、A2、A3分别代表水生植物中的狐尾藻、芦苇和轮叶黑藻，B1、B2、B3分别代表藻类中的微囊藻、小球藻和螺旋藻。
现结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
具体实施方式
实施例1
一种藻类和水生植物生物有效磷的分析方法，包括以下步骤：
(一)酶水解法
(1)酶溶液的制备
活性为1U/mL的碱性磷酸酶(APase)溶液配置方法是：取3.33mg从Sigma公司购买的碱性磷酸酶(编号为EC3.1.3.1，活性为30U/mg)固体粉末，用0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液定容至100mL。
活性为0.02U/mL的碱性磷酸酶和磷酸二酯酶(PDEase)组合溶液配置方法是：取10mg从Sigma公司购买的磷酸二酯酶固体粉末(编号EC3.1.4.1，活性为0.02U/mL)，用10mL活性为1U/mL碱性磷酸酶溶液去溶解即可。
活性为0.06U/mL的碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶(Phytase)组合溶液配置方法是：取600mg从Sigma公司购买的粗品植酸酶固体粉末(编号EC3.1.3.26，活性为0.03U/mL)，用1mol/LHAc-NaAc溶液定容至100mL，则提纯好的植酸酶活性为0.18U/mL，取5mL提纯好的植酸酶溶液，加入5mL0.1mol/L，pH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液，此时植酸酶溶液活性为0.045U/mL，取20mg磷酸二酯酶固体粉末，加入10mL0.045U/mL的植酸酶溶液，再加入10mL1U/mL的碱性磷酸酶溶液，即配置好了碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合溶液。
(2)培养液的制备
取0.5g藻类或水生植物粉末，加入30mL0.5mol/LNaOH+25mmol/LEDTA提取剂进行提取，提取后取0.1mL浸提液置于10mL比色管中，做3个平行并设对照处理，加入0.025mLHCl，调节溶液至中性，向对照组、实验组均加入5mL超纯水和1mL 0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液，再向实验组中加入0.25mL配好的活性为1U/mL的碱性磷酸酶溶液，同时向对照组中加入等量(即0.25mL)的0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液，得培养液1；
取0.5g藻类或水生植物粉末，加入30mL0.5mol/LNaOH+25mmol/LEDTA提取剂进行提取，提取后取0.1mL浸提液置于10mL比色管中，做3个平行并设对照处理，向实验组中加入1mL0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液和0.5mL配置好的活性为0.02U/mL的碱性磷酸酶和磷酸二酯酶组合溶液，同时向对照组中加入1.5mL0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液，再分别向实验组和对照组中加入5mL超纯水，得培养液2；
取0.5g藻类或水生植物粉末，加入30mL0.5mol/LNaOH+25mmol/LEDTA提取剂进行提取，提取后取0.1mL浸提液置于10mL比色管中，做3个平行并设对照处理，向实验组和对照组中均加入5mL超纯水，向对照组中加入1.5mL0.1mol/L，pH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液，向实验组中加入1.0mL0.1mol/L，pH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液和0.5mL配置好的碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合溶液，得培养液3；
所述配制好的培养液1、培养液2和培养液3，分别培养在37℃恒温培养箱中，转速为220r/min；每次实验对应的处理方式的样品组均制备标准曲线，且所有的标准曲线均同步进行实验，以纠正基质引起的干扰。其中标准曲线的绘制方法是：取7支10mL比色管，分别加入0，0.3，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL磷酸盐标准溶液(磷酸盐标准溶液的配置方法是吸取2mL磷标准储备液，用超纯水定容至100mL，此时磷酸盐标准溶液含磷浓度为0.12μmol/mL，需现配现用；其中磷标准储备液的配置方法是：将优级纯的磷酸二氢钾于110℃干燥2h，在干燥器中冷却，称取0.816g溶于超纯水，移入1L容量瓶中，加入1∶1硫酸19mL，用超纯水稀释至标线1L，此时磷标准储备液含磷浓度为6μmol/mL，可储存6个月)。
(3)分别向培养液和标准曲线溶液中加入1.6ml显色剂，摇匀后加入0.5mL 20％的十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS)溶液，用超纯水定容至10mL，10min后，采用磷钼蓝比色法测酶培养前后的磷酸盐；
(4)显色后使用紫外可见分光计分析，培养后测定的磷酸盐与培养前测定的磷酸盐的差值为有机磷水解量，即为生物有效磷量；
(二)31P-NMR分析法
(1)取100mg冷干后的藻类或水生植物NaOH-EDTA提取液粉末用1mL1mol/LNaOH-0.1mol/LEDTA重新溶解；
(2)加入重水，在室温条件下静置30min，再用10000r/min转速离心30min；
(3)转移至核磁管中，贮存在4℃条件下，24h之内测定液态31P-NMR；31P-NMR分析采用BRUKER标准腔5mm BBO探头，31P的共振频率为161.98Hz，测定温度为20℃，谱峰宽度为5Hz，获取时间AQ为0.2102s，NMR参数中延迟时间D1的设置为5s，分析测试时间为15h；
(4)对步骤(3)中得到的谱图进行积分得到生物有效磷量。
其中，植酸酶由粗品植酸酶(Phytase)提纯后得到，提纯方法为：
a.取粗品植酸酶，用pH＝5.0-5.5，8-12mmol/L NaAc-HAc缓冲溶液进行溶解，转移至透析管中，悬浮在pH＝5.0-5.5，8-12mmol/L NaAc-HAc缓冲溶液中透析，每隔2～4h更换烧杯中透析液一次，连续更换5～7次；
b.透析后的酶溶液在8000-12000r/min转速下离心5-15min；
c.提纯后的植酸酶溶液保存在4℃环境中，一周内使用。
对提纯后植酸酶进行活性测试，所述活性测试的方法包括以下步骤：
取两支离心管，分为检验组和对照组，往两组离心管中均加入0.5mL的1mmol/L硝基苯磷酸二钠盐(PNPP)溶液，再向检验组中加入0.2mL的1U/mL提纯后的植酸酶溶液和1mL0.01 mol/L pH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液，向对照组中只加入1.2mL0.01 mol/L pH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液，等待3-5分钟，若检验组中的溶液变黄色，而对照组中的溶液仍为无色，则说明提纯后的植酸酶仍具有活性，可以继续下一步的实验操作。
显色剂的配置方法为：50mL5mol/LH2SO4溶液+15mL钼酸铵溶液+30mL0.1mol/L抗坏血酸溶液+5mL1 mg Sb/mL酒石酸锑钾溶液，试剂在4℃环境下贮存，最多可保持24h，按需配置，过期则弃去重新配置，其中5mol/LH2SO4溶液配置方法是70mL浓硫酸用超纯水稀释至500mL，4℃保存；钼酸铵溶液是取4g分析纯钼酸铵，溶解于100mL超纯水中充分溶解摇匀，室温保存即可，不可放入4℃环境中以防结晶；0.1mol/L抗坏血酸溶液是取1.76g抗坏血酸于100mL超纯水中充分溶解摇匀，4℃保存；1mg Sb/mL酒石酸锑钾溶液是取0.2743g酒石酸锑钾，溶解于100mL超纯水中充分溶解摇匀，4℃保存。
结果分析
1、利用31P-NMR分析湖泊藻类和水生植物磷形态
如图1所示，湖泊藻类和水生植物的液态31P-NMR图谱，通过对图1的液态31P-NMR图谱进行各磷组分的积分，详细的磷组分见表1、表2，利用液态31P-NMR技术，有超过15种以上的磷组分表征出来，其中正磷酸盐(6.0ppm)为所有图谱中最大的峰信号，藻类正磷酸盐的浓度在2646-5094mg/kg之间，水生植物正磷酸盐的浓度在670-990mg/kg之间，虽然藻类和水生植物的正磷酸盐浓度有较大的差异，但是这些样品的NaOH-EDTA提取液中正磷酸盐占总磷的百分比是类似的，即藻类和水生植物正磷酸盐分别占其相应总磷的42.5％和43.2％(表1、表2)。焦磷酸盐在所有的样品均检测出，总单酯磷(即植酸磷和活性单酯磷的和)是最大的有机磷组分，在这些生物样品中植酸磷占总磷的百分比为5.6～41.9％，单酯磷包含果糖类、甘油酯、核苷酸、腺苷酸(AMP)等，其中果糖类包含果糖6磷酸，葡萄糖1磷酸和葡萄糖6磷酸，甘油酯包括α甘油酯和β甘油酯，其一般认为是磷脂在碱性水解条件下的降解产物，核苷酸包括2′鸟苷酸(guanosine 2′monophosphate)和5′胞苷酸(cytidine 5′monophosphate)，其一般认为是DNA和RNA的降解产物。除此以外，单酯磷中还有磷脂酸(3-sn phosphatidic acid)，磷酸乙醇胺(O-phosphorylethanolamine)，在酶的作用下，这些单酯磷较容易发生水解(表1、表2)，二酯磷占总磷的比例比其他磷组分占总磷的比例要低(低于6％)(图1，表1)。
为了与酶解产生的磷组分进行比较，把31P-NMR表征出来的15种磷组分概括为6大类磷组分，其分别是正磷酸盐、植酸磷、活性单酯磷(除植酸磷以外的单酯磷)、二酯磷、焦磷酸盐和膦酸盐。在水生植物中(表1)，主要的磷组分是正磷酸盐(占总磷27.3～56.6％)，活性单酯磷(10.8～33.5％)，焦磷酸盐(0.9～18.8％)和二酯磷(1.6～6.2％)，类似的，藻类正磷酸盐(27.1～67.5％)，活性单酯磷(8.6～44.3％)，植酸磷(5.6～41.9％)，焦磷酸盐(1.8～2.3％)和二酯磷(1.3～14.4％)。膦酸盐只有极小部分(0～0.7％)。在水生植物和藻类中均没有检测出来多聚磷酸盐。
2、利用酶水解法分析湖泊藻类和水生植物磷形态
如表3所示，利用酶水解法把藻类和水生植物分为无机磷、活性单酯磷、二酯磷、类植酸磷以及稳定态磷5个组分。如表3，藻类中有3033mg/kg(占藻类Po的54.6％)的Po可被水解，水生植物中有584mg/kg(占水生植物Po的58.1％)的Po可被水解。藻类中可水解的磷组分：活性单酯磷＞类植酸磷＞二酯磷，其分别占藻类总可水解Po组分的51.6％、40.7％和7.7％；水生植物中可水解的磷组分：类植酸磷＞活性单酯磷＞二酯磷，其分别占水生植物总可水解Po组分的65.1％、30.8％和4.1％。除此以外，藻类和水生植物中的稳定态磷(不可水解Po)分别占NaOH-EDTA提取态TP的31.2％和25.7％。
水生植物和藻类中磷的分布模式为无机磷＞稳定态磷＞类植酸磷＞活性单酯磷＞二酯磷。湖泊藻类稳定态磷占提取态总磷的百分比比水生植物的略高，表明，不是所有的有机磷均能够在酶的作用下水解。
3、31P-NMR与酶水解法分析湖泊藻类和水生植物磷形态的比较
利用液态31P-NMR技术和酶解法分析湖泊藻类和水生植物磷组成得到四类相似的磷组分，分别为正磷酸盐或无机磷、植酸磷或类植酸磷、活性单酯磷以及二酯磷。这两种方法检测芦苇(A2)、小球藻(B2)、螺旋藻(B3)这几种样品中的无机磷浓度相差不大，其余的样品(A1、A3、B1)中的无机磷浓度有一定的差异(图2)。从整体上来讲，用液态31P-NMR技术检测藻类和水生植物无机磷占提取态总磷的百分比(平均值为49.8％)比用酶解法检测的无机磷百分比(43.3％)略高。用两种方法检测的植酸磷六种样品中有四种均类似，但对于芦苇(A2)和小球藻(B2)样品来说，用酶解法检测的植酸磷浓度比液态31P-NMR光谱技术偏低。从图2可以看出，用酶解检测出来的其他单酯磷浓度比用液态31P-NMR光谱技术偏低。类似的，用酶解检测出来的二酯磷浓度比用液态31P-NMR光谱技术也偏低，这可能与二酯磷的不稳定性有关，其很容易降解为单酯磷。总之，不是所有的磷组分(如稳定态磷)均可以被酶水解，在水生植物和藻类中分别大约有25.7％和31.2％的稳定态磷(表3)。
4、31P-NMR结合酶水解法分析藻类和水生植物有机磷生物有效性
图3中可以清楚的看到各种酶(APase，APase+PDEase，APase+PDEase+Phytase)培养前后的磷组分变化。图3中，横坐标以下的柱状图表示酶培养后比培养前下降的磷组分含量，横坐标以上的柱状图表示酶培养后比培养前升高的磷组分含量。从图3中看总体趋势，无论添加哪种酶，在焦磷酸盐和单酯磷区域(包括植酸磷和其他单酯磷)除极个别以外均有下降的柱状图，表示添加酶后，单酯磷组分含量下降，而正磷酸盐组分含量均在横坐标以上，表示正磷酸盐在添加酶培养后，其组分含量升高。从图1的液态31P-NMR谱图也可以得到相应的验证，图1中，添加各种酶后的液态31P-NMR谱图中单酯磷区域(3～6ppm)的谱峰和焦磷酸盐酸区域的谱峰(-4～-5ppm)与对照组相比较，均有不同程度的下降或者消失趋势，这表明了添加各种酶后单酯磷和焦磷酸盐均有不同程度的水解。
以6种藻类和水生植物样品中的狐尾藻(A1)为例，进行酶培养前后磷组分详细的数据分析(表1)。在狐尾藻样品中，添加碱性磷酸酶后正磷酸盐含量增加了1014mg/kg(46.9％)，与此同时，有机磷和焦磷酸盐分别下降了44.5％和2.4％，其中44.5％的有机磷组分有35.9％的植酸磷和9.3％的其他单酯磷下降。从表1和图3还可以看出，添加碱性磷酸酶后二酯磷略有升高(0.7％)，而chiro-IHP，neo-IHP、2′鸟苷酸，AMP和DNA这些磷组分没有显著的变化。除此以外，酶培养后在化学位移4.6ppm处出现了一个新的峰信号，这个峰被鉴定为磷酸乙醇胺。
在狐尾藻样品中，添加碱性磷酸酶和磷酸二酯酶后，焦磷酸盐和单酯磷组分含量完全降解(图3)，焦磷酸盐和单酯磷的峰信号(化学位移3.5～6.0ppm)完全消失(表1、表2)。添加碱性磷酸酶和磷酸二酯酶后有机磷组分显著下降，下降了39.8％，其中包括31.5％的植酸磷、8.9％的其他单酯磷和0.7％的二酯磷，与此同时，正磷酸盐的含量显著增加，增加了861mg/kg(表1、图3)。添加碱性磷酸酶和磷酸二酯酶后，二酯磷含量降解(图3)，二酯磷的峰信号(化学位移-1～2.5ppm)消失(表1)，而只添加碱性磷酸酶时则不会使二酯磷含量降解，这显示了酶的特异性，二酯酶将二酯磷水解成正磷酸盐。
添加碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶后，狐尾藻样品中的正磷酸盐含量显著增加，增加了1078mg/kg，同时，二酯磷也略有增加，增加了44mg/kg(2.1％)，与此同时，也有磷组分的显著降低，降低了52.1％，其中包含38.9％的植酸磷、10.8％的其他单酯磷和2.4％的焦磷酸盐降低。除此以外，植酸磷也称肌醇磷酸盐(IHP)，其有很多同分异构体，但在环境样品中通常可见的有四种同分异构体，分别是chiro-IHP，neo-IHP，myo-IHP和scyllo-IHP。在该研究中，利用液态31P-NMR技术可以检测到藻类和水生植物中含有chiro-IHP和neo-IHP物质(表1、表2、图3)，但在添加酶后，该组分发生了降解。
5、藻类暴发及其内湖内源磷的生物地球化学循环过程
如图4，湖泊藻类和水生植物单酯磷中的大部分和全部焦磷酸盐均转化为正磷酸盐，添加碱性磷酸盐酶后，6种藻类和水生植物平均18.9％的植酸磷和20.7％的活性单酯磷以及6.6％的焦磷酸盐转化为正磷酸盐；添加碱性磷酸酶和磷酸二酯酶后，藻类和水生植物平均12.3％的植酸磷和20.8％的其他单酯磷以及7.0％的焦磷酸盐转化为正磷酸盐；添加碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶后，藻类和水生植物平均22.8％和17.7％的活性单酯磷以及7.0％的焦磷酸盐转化为正磷酸盐。这表明在湖泊藻类和水生植物腐解过程中单酯磷和焦磷酸将转化为生物可直接吸收利用的正磷酸盐等无机磷。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (5)
1.藻类和水生植物生物有效磷酶水解和液态31P-NMR分析方法，包括以下步骤：
(一)酶水解法
(1)酶溶液的制备
碱性磷酸酶溶液由0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液配置，活性为1U/mL；
碱性磷酸酶和磷酸二酯酶组合溶液由0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液配置，活性为0.02U/mL；
碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合溶液由0.1mol/L，pH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液配置，活性为0.06U/mL；
(2)培养液的制备
取藻类或水生植物浸提液于比色管中，加入盐酸调节所述浸提液的pH值至中性，再加入50倍所述浸提液体积的超纯水和10倍0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液，再加入2.5倍所述浸提液体积的所述碱性磷酸酶溶液，得培养液1；
取藻类或水生植物浸提液于比色管中，加入10倍所述浸提液体积0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液，再加入5倍所述浸提液体积的所述碱性磷酸酶和磷酸二酯酶组合溶液，然后加入50倍所述浸提液体积的超纯水，得培养液2；
取藻类或水生植物浸提液于比色管中，加入50倍所述浸提液体积的超纯水，再加入10倍所述浸提液体积0.1mol/L，pH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液，再加入5倍所述浸提液体积的所述碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合溶液，得培养液3；
所述配制好的培养液1、培养液2和培养液3，分别培养在37℃恒温培养箱中，转速为220r/min；
(3)培养16h后，向培养液中加入显色剂，10min后，采用磷钼蓝比色法测酶培养前后的磷酸盐；
(4)显色后使用紫外可见分光计分析，培养后测定的磷酸盐与培养前测定的磷酸盐的差值为有机磷水解量，即生物有效磷量；
(二)31P-NMR分析法
(1)取100mg冷干后的藻类或水生植物的NaOH-EDTA提取液粉末用1mL1mol/L NaOH-0.1mol/LEDTA重新溶解；
(2)加入重水，在室温条件下静置30min，再用10000r/min转速离心30min；
(3)转移至核磁管中，贮存在4℃条件下，24h之内测定液态31P-NMR；
(4)对步骤(3)中得到的谱图进行积分得到生物有效磷量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述藻类和水生植物浸提液采用0.5mol/LNaOH+25mmol/LEDTA提取剂进行提取，所述藻类和水生植物粉末与所述提取剂的质量体积为1：60。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植酸酶由粗品植酸酶提纯后得到，提纯方法为：
a.取粗品植酸酶，用pH＝5.0-5.5，8-12mmol/LNaAc-HAc缓冲溶液进行溶解，转移至透析管中，悬浮在pH＝5.0-5.5，8-12mmol/L NaAc-HAc缓冲溶液中透析，每隔2～4h更换烧杯中透析液一次，连续更换5～7次；
b.透析后的酶溶液在8000-12000r/min转速下离心5-15min；
c.提纯后的植酸酶溶液保存在4℃环境中，一周内使用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养液中还含有0.5-2％的十二烷基硫酸钠。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述31P-NMR分析采用BRUKER标准腔5mmBBO探头，31P的共振频率为161.98Hz，测定温度为20℃，谱峰宽度为5Hz，获取时间AQ为0.2102s，NMR参数中延迟时间D1的设置为5s，分析测试时间为15h。
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