ME02002B

ME02002B - Humana monoklonska antitela prema proteinskoj tirozin kinazi 7 (ptk 7) i njihova upotreba

Info

Publication number: ME02002B
Application number: MEP-2013-230A
Authority: ME
Inventors: Li-Sheng Lu; Jonathan Alexander Terrett; Chin Pan
Original assignee: Squibb & Sons Llc
Priority date: 2005-12-08
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2013-10-31
Also published as: EA200801509A1; BRPI0619582A2; EA017812B1; NZ594466A; US20120219557A1; CN101360761B; NO20082559L; DK1957539T3; ES2406063T3; IL191788A; IL191788A0; US9505845B2; AU2006321841B2; US20100034826A1; HK1121174A1; JP2009518039A; SG177194A1; US20120207764A1; PL1957539T3; AU2006321841A1

Description

Opis

Stanje tehnike

Receptor tirozin kinaza (RTKs) čine transmembranski signalizirajući proteini koji prenose biološke signale iz ekstracelularnog okruženja u unutrašnjost ćelije. Regulacija RTK signala je važna za kontrolisanje ćelijskog rasta, diferencijaciju, aksonski rast, epitelijalni rast, razvoj, adheziju, migraciju i apoptozu (Prenzel et al. (2001) Endocr. Relat. Cancer 8:11-31; Hubbard and Tili (2000) Annu. Rev. Biochem. 69:373-98). Zna se da RTKs učestvuju u razvoju i progresiji nekoliko oblika kancera. U većini kancera koji su u vezi sa RTK, pre postoji amplifikacija receptorskog proteina nego mutacija gena (Kobus and Fleming (2005) Biochemistry 44:1464-70).

Proteinska tirozin kinaza 7 (PTK7), član receptorske familije proteinskih tirozin kinaza, prvo je izolovana iz normalnih humanih melanocita i klonirana RT-PCR tehnikom (Lee et al., (1993) Oncogene 8:3403-10; Park et al., (1996) J. Biochem 119:235-9). Nezavisno je kloniran gen iz humanih linija poreklom od karcinoma kolona i nazvan kinaza 4 karcinoma kolona (CCK4) (Mossie et al. (1995) Oncogene 11:2179-84). PTK7 pripada podgrupi RTKs koja nema detektabilnu katalitičku aktivnost tirozin kinaze ali zadržava aktivnost signalne transdukcje i smatra se da mogućno funkcioniše kao ćelijski adhezioni molekul.

Nađeno je da se mRNA za PTK7 različito ekspresuje u ćelijskim linijama poreklom od karcinoma kolona a da se ne ekspresuje u tkivima kolona odraslih ljudi (Mossie et al., supra). PTK7 ekspresija se, takođe, viđa u nekim ćelijskim linijama melanoma i biopsijama melanoma (Easty, et al. (1997) Int. J. Cancer 71:1061-5). Nađeno je da se alternativni povezani oblici ekspresuju u hepatomima i ćelijama kancera kolona (Jung et al. (2002) Biochim Biophys Acta 1579: 153-63). Sem toga, zna se da je PTK7 široko prekomerno ekspresovan u uzorcima akutne mijeloidne leukemije (Muller-Tidow et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10:1241-9). Imunohistohemijom, tumor specifično bojenje PTK7 je zapaženo u kancerima dojke, kolona, pluća, pankreasa, bubrega i mokraćne bešike, kako je opisano u patentu: PCT Publication WO 04/17992. WO 2004/017992 opisuje PTK7, sredstva koja reaguju sa PTK7 ili menjaju ekspresiju ili aktivnost PTK7, kao i njihovu upotrebu za lečenje karcinoma. Kyriakos i saradnici (Cancer Research 52, February 1992, No. 4, pages 835-842) opisuje sudbinu antitela koja se vezuju za površinu tumorskih ćelija in vitro.

Prema tome, opisana su sredstva koja prepoznaju PTK7, kao i postupci za korišćenje takvih sredstava.

Izlaganje suštine pronalaska

Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovana monoklonska antitela, naročito humana monoklonska antitela, koja se vezuju za PTK7 i koja ispoljavaju brojna poželjna svojstva. Ova svojstva obuhvataju visok afinitet vezivanja za humanu PTK7 i vezivanja za ćelije Wilmovog tumora. Isto tako su obezbeđena antitela i smeše pronalaska za upotrebu u postupcima lečenja brojnih bolesti koje su povezane sa PTK7.

Pronalazak se odnosi na izolovana humana monoklonska antitela, ili na njihov antigen-vezujući deo, pri čemu se antitela:

(a) specifično vezuju za humanu PTK7; i

(b) vezuju se za ćelijsku liniju Wilmovog tumora koja je pod brojem ATCC Acc No. CRL-1441 sa EC50 od 4.0 nM ili manjim, u testu koji se sastoji od inkubacije 1 x 101 ćelija sa antitelima pri početnoj koncentraciji od 30 μg/ml i serijskim razblaženjima antitela od 1:10 razblaženju; i

(c) vezuju za isti epitop na humanoj PTK7 kao referentna antitela koja sadrže:

(b) varijabilni region teškog lanca CDR2 sa SEQ ID NO:16;

(c) varijabilni region teškog lanca CDR3 sa SEQ ID NO:20;

(d) varijabilni region lakog lanca CDR1 sa SEQ ID NO:25;

(e) varijabilni region lakog lanca CDR2 sa SEQ ID NO:31; i

(f) varijabilni region lakog lanca CDR3 sa SEQ ID NO:37;

ili

(a) varijabilni region teškog lanca CDR1 sa SEQ ID NO: 14;

(b) varijabilni region teškog lanca CDR2 sa SEQ ID NO:18;

(c) varijabilni region teškog lanca CDR3 sa SEQ ID NO:22;

(d) varijabilni region lakog lanca CDR1 sa SEQ ID NO:28;

(e) varijabilni region lakog lanca CDR2 sa SEQ ID NO:34; i

(f) varijabilni region lakog lanca CDR3 sa SEQ ID NO:40.

ili

(a) varijabilni region teškog lanca CDR1 sa SEQ ID NO:13;

(b) varijabilni region teškog lanca CDR2 sa SEQ ID NO:17;

(c) varijabilni region teškog lanca CDR3 sa SEQ ID NO:21;

(d) varijabilni region lakog lanca CDR1 sa SEQ ID NO:26;

(e) varijabilni region lakog lanca CDR2 sa SEQ ID NO:32; i

(f) varijabilni region lakog lanca CDR3 sa SEQ ID NO:38.

Druga poželjna antitela pronalaska, ili njihovi delovi koji se vezuju za antigen

sadrže:

(a) varijabilni region teškog lanca sa amino kiselinskom sekvencom SEQ ID NO:2; i

(b) varijabilni region lakog lanca sa amino kiseiinskom sekvencom SEQ ID NO:7;

ili

(a) varijabilni region teškog lanca sa amino kiselinskom sekvencom SEQ ID NO:4; i

(b) varijabilni region lakog lanca sa amino kiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 10;

ili

(a) varijabilni region teškog lanca sa amino kiselinskom sekvencom SEQ ID NO:3; i

(b) varijabilni region lakog lanca sa amino kiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8.

Antitela pronalaska mogu biti, na primer, antitela u punoj dužini, na primer lgG1 ili lgG4 izotipa. Alternativno, antitela mogu biti fragmenti antitela, kao što su Fab ili Fab’2 fragmenti, ili jedan lanac antitela.

Pronalazak, isto tako, obezbeđuje imunokonjugat koji sadrži antitela pronalaska, ili njihov antigen-vezujući deo, koji je povezan sa terapeutskim sredstvom, kao što je citotoksin ili radioaktivni izotop.

Isto tako su obezbeđene i smeše koje sadrže antitela, ili njihov antigen-vezujući deo, ili imunokonjugat pronalaska.

Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju antitela pronalaska, ili njihov antigen-vezujući deo, takođe su obuhvaćeni pronalaskom, kao i ekspresioni vektori koji sadrže takve nukleinske kiseline i ćelije domaćina koji sadrže ove ekspresione vektore.

Takođe je obezbeđen i in vitro postupak za proizvodnju antitela pronalaska koji obuhvata ekspresiju antitela pronalaska u ćelijama domaćina i izolovanje antitela iz ćelija domaćina.

Osim toga, ovde je opisan i transgenski miš koji ima humane transgene teškog i lakog lanca imunoglobulina, pri čemu miš ekspresuje antitela pronalaska, kao i hibridomi pripremljeni od takvog miša, gde hibridomi proizvode antitela pronalaska.

U pak drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitela pronalaska, ili njihov antigen-vezujući deo, za korišćenje u postupku lečenja ili prevencije kancera koje karakteriše rast tumorskih ćelija koje ekspresuju PTK7. Kancer može biti kancer kolona (uključujući kancer tankog creva), kancer pluća, kancer dojke, kancer pankreasa, melanom (npr., metastatski maligni melanom), akutna mijeloidna leukemija, kancer bubrega, kancer mokraćne bešike, kancer jajnika ili kancer prostate. Primeri drugih kancera uključuju: kancer bubrega (npr, karcinom bubrežnih ćelija), glioblastom, tumore mozga, hronične ili akutne leukemije koje uključuju akutnu limfocitnu leukemiju (ALL), adultnu leukemiju T-ćelija (T-ALL), hroničnu mijeloidnu leukemiju, akutnu limfoblastnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, limfome (npr., Hodgkinov i ne-Hodgkinov limfom, limfocitni limfom, primarni CNS limfom, limfom T-ćelija, Burkittov limfom, limfomi anaplastičnih velikih ćelija (ALCL), kožni limfomi T-ćelija, limfomi nodularnih malih otcepljujućih ćelija, periferni limfomi T-ćelija, Lennertov limfom, imunoblastni limfom, leukemija T-ćelija/limfom (ATLL), entroblastno/centrocitno (cb/cc) folikularni limfomski kanceri, limfomi difuznih velikih ćelija B loze, limfom T-ćelija sličan angioimunoblastnoj limfadenopatiji (AILD) i limfomi na bazi telesnih šupljina udruženi sa HlV-om), embrionalne karcinome, nediferentovane karcinome rino-farinksa (e.g., Schminckeov tumor), Castlemanovu bolest, Kaposijev sarkom, multipli mijelom, Waldenstromovu makroglobulinemiju i druge limfome B-ćelija, nazofarangealne karcinome, kancer kostiju, kancer kože, kancer glave ili vrata, kožne ili intraokularne maligne melanome, kancer materice, rektalni kancer, kancer analne regije, kancer želuca, kancer testisa, kancer materice, karcinom fallopian tuba, karcinom endometriuma, karcinom cerviksa, karcinom vagine, karcinom vulve, kancer ezofagusa, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer tiroidne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer adrenalne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, solidne tumore u detinjstvu, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega ili uretera, karcinom bubrežne karlice, neoplazmu centralnog nervnog sistema (CNS), tumorske angiogeneze, tumor kičmene moždine, stem gliom mozga, pituitarni adenom, epidermoidni kancer, kancer skvamoznih ćelija, kancere kao posledice okruženja, uključujući one podstaknute azbestozom, npr., mezoteliom i kombinacije navedenih kancera.

Kratak opis slika

Slika 1A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:41) i amino kiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:1) varijabilnog regiona teškog lanca 3G8 i 3G8a humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:11), CDR2 (SEQ ID NO:15) i CDR3 (SEQ ID NO: 19) regioni su podvučeni i naznačeni su V, D i J segmenti zametne linije.

Slika 1B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:45) i amino kiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:5) varijabilnog regiona lakog lanca 3G8 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:23), CDR2 (SEQ ID NO:29) i CDR3 (SEQ ID NO:35) regioni su podvučeni i naznačeni su V i J segmenti zametne linije. Slika 1C prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:46) i amino kiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:6) varijabilnog regiona lakog lanca 3G8a humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:24), CDR2 (SEQ ID NO:30) i CDR3 (SEQ ID NO:36) regioni su podvučeni i naznačeni su V i J segmenti zametne linije. Slika 2A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:42) i amino kiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:2) varijabilnog regiona teškog lanca 4D5 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:12), CDR2 (SEQ ID NO:16) i CDR3 (SEQ ID NO.20) regioni su podvučeni i naznačeni su V, D i J segmenti zametne linije.

Slika 2B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:47) i amino kiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:7) varijabilnog regiona lakog lanca 4D5 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:25), CDR2 (SEQ ID NO:31) i CDR3 (SEQ ID NO:37) regioni su podvučeni i naznačeni su V i J segmenti zametne linije. Slika 3A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:43) i amino kiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:3) varijabilnog regiona teškog lanca 12C6 humanog

monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:13), CDR2 (SEQ ID NO:17) i CDR3 (SEQ ID NO:21) regioni su podvučeni i naznačeni su V, D i J segmenti zametne linije.

Slika 3B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:48) i amino kiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:8) varijabilnog regiona lakog lanca 12C6 humanog

monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:26), CDR2 (SEQ ID NO:32) i CDR3 (SEQ ID NO:38) regioni su podvučeni i naznačeni su V i J segmenti zametne linije. Slika 3C prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:49) i amino kiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:9) varijabilnog regiona lakog lanca 12C6a humanog

monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:27), CDR2 (SEQ ID NO:33) i CDR3 (SEQ ID NO:39) regioni su podvučeni i naznačeni su V i J segmenti zametne linije. Slika 4A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:44) i amino kiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:4) varijabilnog regiona teškog lanca 7C8 humanog

monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:14), CDR2 (SEQ ID NO:18) i CDR3 (SEQ ID NO:22) regioni su podvučeni i naznačeni su V, D i J segmenti zametne linije.

Slika 4B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:50) i amino kiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:10) varijabilnog regiona lakog lanca 7C8 humanog

monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:28), CDR2 (SEQ ID NO:34) i CDR3 (SEQ ID NO:40) regioni su podvučeni i naznačeni su V i J segmenti zametne linije. Slika 5 prikazuje pravac amino kiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog lanca 3G8 (SEQ ID NO:1) i 3G8a (SEQ ID NO: 1) sa humanom amino kiselinskom sekvencom zametne linije VH 3-30.3, (SEQ ID NO:51) (JH4b zametna linija je predstavljena u vidu SEQ ID NO: 59).

Slika 6 prikazuje pravac amino kiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca 4D5 (SEQ ID NO:2) sa humanom amino kiselinskom sekvencom zametne linije VH 3-30.3 (SEQ ID NO:51) (JH4b zametna linija je predstavljena u vidu SEQ ID NO: 60).

Slika 7 prikazuje pravac amino kiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog lanca 12C6 (SEQ ID NO: 3) i 12C6a (SEQ ID NO: 2) sa humanom amino kiselinskom sekvencom zametne linije VH DP44 (SEQ ID NO:52) (3-7, 3-23, i JH4b zametna linija je predstavljena u vidu SEQ ID NOS 61-63).

Slika 8 prikazuje pravac amino kiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca 7C8 (SEQ ID NO: 4) sa humanom amino kiselinskom sekvencom zametne linije VH 3-33 (SEQ ID NO:53) (3H6b zametna linija js predstavljena u vidu SEQ ID NO: 64). Slika 9 prikazuje pravac amino kiselinske sekvence varijabilnih regiona lakog lanca 3G8 (SEQ ID NO:5) i 3G8a (SEQ ID NO: 6) sa humanom amino kiselinskom sekvencom zametne linije Vk L15 (SEQ ID NO:54) (JK1 zametna linija je predstavljena u vidu SEQ ID NO: 65).

Slika 10 prikazuje pravac amino kiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca 4D5 (SEQ ID NO:7) sa humanom amino kiselinskom sekvencom zametne linije Vk A10 (SEQ ID NO:55) (JK5 zametna linija je predstavljena u vidu SEQ ID NO: 66). Slika 11 prikazuje pravac amino kiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca 12C6 (SEQ ID NO:8) sa humanom amino kiselinskom sekvencom zametne linije Vk A27 (SEQ ID NO:56) (JK2 zametna linija je predstavljena u vidu SEQ ID NO: 67). Slika 12 prikazuje pravac amino kiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca 12C6a (SEQ ID NO:9) sa humanom amino kiselinskom sekvencom zametne linije Vk L15 (SEQ ID NO:54) (JK2 zametna linija je predstavljena u vidu SEQ ID NO: 68). Slika 13 prikazuje pravac amino kiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca 7C8 (SEQ ID NO: 10) sa humanom amino kiselinskom sekvencom zametne linije Vk L6 (SEQ ID NO:57) (JK3 zametna linija je predstavljena u vidu SEQ ID NO: 69).

Slika 14 prikazuje rezultate ogleda sa protočnom citometrijom koji pokazuju da se humana monoklonska antitela 7C8, usmerena protiv humane PTK7, vezuju za površinu HEK3 ćelija koje su transfektovane sa humanom PTK7 u punoj dužini.

Slika 15 prikazuje rezultate ogleda sa ELISA tehnikom koji pokazuju da se humana monoklonska antitela usmerena protiv humane PTK7 specifično vezuju za PTK7. Slika 16 prikazuje rezultate ogleda sa protočnom citometrijom koji pokazuju da se antitela usmerena protiv humane PTK7 vezuju za površinu ćelija Wilmovog tumora. Slika 17 prikazuje rezultate ogleda sa protočnom citometrijom koji pokazuju da se antitela usmerena protiv humane PTK7 vezuju za ćelijsku površinu različitih kancerskih ćelijskih linija.

Slika 18 prikazuje rezultate ogleda sa protočnom citometrijom koji pokazuju da se antitela usmerena protiv humane PTK7 vezuju za ćelijsku površinu dendritskih ćelija. Slika 19 prikazuje rezultate ogleda sa protočnom citometrijom koji pokazuju da se antitela usmerena protiv humane PTK7 vezuju za CD4+ i CD8+ T-limfocita, ali ne i za B-limfocite.

Slika 20 prikazuje rezultate eksperimenata Hum-Zap internalizacije koji pokazuju da humana monoklonska antitela protiv humane PTK7 mogu internalizovati u PTK7+ ćelije. (A) Internalizacija humanih antitela 3G8, 4D5 i 7C8 u ćelije Wilmovog tumora.

(B) Internalizacija humanog antitela 12C6 u ćelije Wilmovog tumora.

(C) Internalizacija humanih antitela 7C8 i 12C6 u A-431 tumorske ćelije.

(D) Internalizacija humanih antitela 7C8 i 12C6 u PC3 tumorske ćelije.

Slika 21 prikazuje rezultate testa ćelijske proliferacije iz kojih se vidi da toksin-konjugovana humana monoklonska anti-PTK7 antitela ubijaju ćelijske linije humanog kancera bubrega.

Slika 22 prikazuje rezultate testa ćelijske proliferacije iz kojih se vidi da toksin-konjugovana humana monoklonska anti-PTK7 antitela ubijaju ćelijske linije koje ispoljavaju niske do visokih nivoa ekspresije PTK7.

Slika 23 prikazuje rezultate invazionog testa iz kojih se vidi da anti-PTK7 antitela inhibiraju invazivnu pokretljivost ćelija koje na svojoj ćelijskoj površini ekspresuju PTK7.

Slika 24 prikazuje rezultate in vivo ispitivanja tumorskog ksenografta iz kojih se vidi da anti-PTK7 antitela konjugovana sa toksinom usporavaju progresiju tumorskog rasta kod kancera pankreasa.

Slika 25 prikazuje rezultate in vivo ispitivanja tumorskog ksenografta iz kojih se vidi da anti-PTK7 antitela konjugovana sa toksinom usporavaju progresiju tumorskog rasta kod kancera dojke.

Detaljan opis pronalaska

U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na izolovana monoklonska antitela, posebno humana monoklonska antitela, koja se specifično vezuju za PTK7. U izvesnim ostvarenjima, antitela pronalaska ispoljavaju jedno ili više poželjnih funkcionalnih svojstava, kao što je vezivanje za PTK7 visokim afinitetom i/ili mogućnost inhibisanja rasta tumorskih ćelija in vitro ili in vivo. U izvesnim ostvarenjima, antitela pronalaska su izvedena od naročitih sekvenci teškog i lakog lanca zametne linije i/ili sadrže naročite strukturne karakteristike, kao što su CDR regioni koji obuhvataju naročite aminokiselinske sekvence. Pronalazak obezbeđuje izolovana antitela, postupke za proizvodnju takvih antitela, imunokonjugate i bispecifične molekule koji sadrže ovakva antitela i farmaceutske smeše koje sadrže antitela, imunkonjugate ili bispecifične molekule pronalaska. Pronalazak se, isto tako, odnosi na postupke za upotrebu antitela, kao što je lečenje bolesti kao što je kancer.

U cilju da se ovaj pronalazak lakše shvati, prvo će biti definisani izvesni izrazi. Dodatne definicije su izložene kroz Detaljni opis patenta.

Izrazi "PTK7" i "CCK4" se koriste jedan umesto drugog i obuhvataju varijante, izoforme i vrste homologa humanog PTK7. Prema tome, humana antitela pronalaska mogu, u nekim slučajevima, unakrsno regovati sa PTK7 iz vrsta koje nisu humanog porekla. U nekim ostvarenjima, antitela mogu biti potpuno specifična za jednu ili više humanih PTK7 i, mogu da ne ispoljavaju unakrsnu reaktivnost sa ne-humanim vrstama ili drugim tipovima. Potpuna aminokiselinska sekvenca primera humane PTK7 ima Genbank-dodeljeni broj NM_002821 (SEQ ID NO:58).

Izraz "imuni odgovor" se odnosi na dejstvo, na primer, limfocita, ćelija koje prezentuju antigen, fagocitnih ćelija, granulocita i rastvorljivih makromolekula koje produkuju prethodno navedene ćelije ili jetra (uključujući antitela, citokine i komplement), koje dovodi do selektivnog oštećenja, destrukcije ili eliminacije invazivnog patogena iz organizma čoveka, ćelija ili tkiva koje su/je napadnute(o) patogenom, zatim, kanceroznih ćelija ili, u slučaju autoimunosti ili patološke upale, normalnih ćelija ili tkiva čoveka.

"Signalni put transdukcije" se odnosi na biohemijski odnos između raznih molekula koji učestvuju u prenosu signala, a koji imaju ulogu u prenosu signala od jednog dela ćelije do drugog dela ćelije. Kako je ovde korišćena, fraza "ćelijski površinski receptor" obuhvata, na primer, molekule i komplekse molekula koji mogu da prime signal i prenesu takav signal kroz plazmatsku membranu ćelije. Primer "receptora na površini ćelije" ovog pronalaska jeste PTK7 receptor.

Izraz "antitela", kako je ovde korišćen, uključuje ćela antitela i svaki njihov antigen vezujući fragment (tj., "antigen-vezujući deo") ili njihove pojedinačne lance. "Antitela" se odnosi na glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca koji su međusobno povezani disulfidnim mostovima, ili na njegov deo koji vezuje antigen. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde je korišćena skraćenica: VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde je korišćena skraćenica: VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, CL. VH i VL regioni se dalje mogu podeliti u regione hipervarijabilnosti, nazvane komplementarnim determinišućim regionima (CDR), koji su prošarani sa više konzervisanim regionima, nazvanim gradivnim regionima (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR i četiri FR, koji su organizovani sledećim redom od amino-terminusa do karboksi-terminusa: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji reaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva domaćina ili faktore, uključujući raznovrsne ćelije imunog sistema (npr., efektorne ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.

Izraz "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "deo antitela"), kako je ovde korišćen, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju mogućnost specifičnog vezivanja za antigen (npr., PTK7). Pokazalo se da se funkcija antitela da vezuju antigen može postići fragmentima pune dužine antitela. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih izrazom "antigen-vezujući deo” antitela uključuju: (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab’)2 fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana

disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fab’ fragment, koji je suštinski Fab sa delom zglobnog regiona (vidi: FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) Fd fragment sastavljen od VH i CH1 domena; (v) Fv fragment sastavljen od VL i VH domena jednog kraka antitela, (vi) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VH domena; (vii) izolovani komplementarni

determinišući region (CDR); i (viii) nanotelo, varijabilni region teškog lanca koji sadrži jedan varijabilni domen i dva konstantna domena. Sem toga, iako dva domena Fv

fragmenta, VL i VH, kodiraju zasebni geni, oni se mogu spojiti, korišćenjem

rekombinantnih postupaka, pomoću sintetskog linkera koji im omogućava da budu proizvedeni u vidu jednog proteinskog lanca u kome VL i VH regionski par obrazuju monovalentne molekule (poznati kao jednolančani Fv (scFv); vidi npr., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Ova jednolančana antitela su takođe obuhvaćena izrazom "antigen-vezujući deo" antitela. Ovi fragmenti antitela se dobijaju upotrebom konvencionalnih tehnika poznatih stručnom licu, a fragmenti se skriniraju na upotrebljivost na isti način kao i intaktna antitela.

"Izolovana antitela", kako je ovde korišćeno, treba da se odnosi na antitela koja su suštinski bez prisustva drugih antitela koja imaju različite antigene specifičnosti (npr., izolovana antitela koja specifično vezuju PTK7 suštinski su bez prisustva antitela koja specifično vezuju antigene, koji nisu PTK7). Izolovana antitela koja specifično vezuju PTK7 mogu, međutim, imati unakrsnu-reaktivnost sa drugim antigenima, kao što su PTK7 molekuli drugih vrsta. Osim toga, izolovana antitela mogu biti suštinski bez prisustva drugih ćelijskih komponenti i/ili hemikalija.

Izrazi "monoklonska antitela" ili "smeša monoklonskih antitela" kako su ovde korišćeni, odnose se na preparat molekula antitela jedno-molekularne smeše. Smeša monoklonskih antitela ispoljava specifičnost pojedinačnog vezivanja i afinitet za naročiti epitop.

Izraz "humana antitela", kako je ovde korišćen, treba da obuhvati antitela koja imaju varijabilne regione u kojima su i gradivni i CDR regioni iz imunoglobulinske sekvence humane zametne linije. Dalje, ukoliko antitela sadrže konstantni region, konstantni region je takođe iz imunoglobulinske sekvence humane zametne linije. Humana antitela pronalaska mogu obuhvatiti aminokiselinske ostatke koje ne kodira imunoglobulinska sekvenca humane zametne linije (npr., mutacije uvedene random ii položajno-specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Ipak, izraz "humana antitela", kako je ovde korišćen, ne obuhvata antitela u kojima je CDR sekvenca, poreklom iz zametnih linija drugih vrsta sisara, kao što je miš, nakalemljena u gradivni deo humane sekvence.

Izraz "humana monoklonska antitela" se odnosi na antitela koja ispoljavaju pojedinačnu specifičnost vezivanja, a koja imaju varijabilne regione u kojima su i gradivni deo i CDR regioni poreklom od imunoglobulinske sekvence humane zametne linije. U jednom ostvarenju, humana monoklonska antitela se proizvode pomoću hibridoma koji uključuje B ćelije, dobijene iz transgenskih ne-humanih životinja, npr., transgenski miš, koje imaju genom sa transgenom humanog teškog lanca i transgenom lakog lanca fuzionisanim u besmrtnu ćeliju.

Izraz "rekombinantna humana antitela", kako je ovde korišćen, obuhvata sva humana antitela koja se proizvode, ekspresuju, kreiraju ili izoluju na rekombinantni način, kao što su: (a) antitela izolovana iz životinje (npr., miš) koja je transgenska ili transhromozomna za humane gene imunogiobulina ili hibridoma pripremljenim od njih (opisano dalje u nastavku), (b) antitela izolovana iz ćelija domaćina transformisanih da ekspresuju humana antitela, npr., iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz biblioteke rekombinantnih, kombinatorijalnih humanih antitela i, (d) antitela proizvedena, ekspresovana, kreirana ili izolovana bilo kojim drugim načinom koji obuhvata spajanje genske sekvence humanog imunoglobulina sa drugim DNA sekvencama. Ovakva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne regione u kojima su gradivni deo i CDR regioni poreklom iz imunoglobulinske sekvence humane zametne linije. U nekim ostvarenjima, međutim, ova rekombinantna humana antitela mogu da se podvrgnu in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi transgenska životinja za humanu ig sekvencu, in vivo somatskoj mutagenezi) i, na taj način, aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, uprkos poreklu od i povezanosti sa VH i VL sekvencama humane zametne linije, mogu da prirodno ne postoje u okviru antitela iz repertoara humanih zametnih linija in vivo.

Kako je ovde korišćen, "izotip" se odnosi na klasu antitela {npr., IgM ili IgGI) koja se kodira genima konstantnog regiona teškog lanca.

Izrazi "antitela koja prepoznaju antigen" i "antitela specifična za antigen" su ovde korišćeni jedan umesto drugog i umesto izraza "antitela koja se specifično vezuju za antigen."

Izraz "derivati humanih antitela" se odnosi na svaki modifikovani oblik humanih antitela, npr., konjugat antitela i drugog sredstva ili antitela.

Izraz "humanizovana antitela" se odnosi na antitela u kojima su CDR sekvence koje su izvedene iz zametnih linija drugih vrsta sisara, kao što je miš, nakalemljene u građu humane sekvence. Dodatne modifikacije u građi regiona mogu se napraviti u okviru kostura humane sekvence.

Izraz "himerična antitela" treba da se odnosi na antitela u kojima su sekvence varijabilnog regiona izvedene iz jedne vrste, a sekvence konstantnog regiona su izvedene iz drugih vrsta, kao što su antitela u kojima su sekvence varijabilnog regiona izvedene iz mišijih antitela a sekvence konstantnog regiona su izvedene iz humanih antitela.

Kao što je ovde korišćeno, antitela koja se "specifično vezuju za humanu PTK7" treba da se odnosi na antitela koja se vezuju za humanu PTK7 sa KD od 1x10-7 M ili manjom, bolje 5x10-8 M ili manjom, poželjnije 1x1 CT-8 M ili manjom, najbolje 5x10-9 M ili manjom.

Izraz "suštinski nije vezan" za protein ili ćelije, kako je ovde korišćen, znači da se ne vezuje ili se ne vezuje visokim afinitetom za protein ili ćelije, tj. vezuje se za protein ili ćelije sa KD od 1 x 10-6 M ili većom, bolje 1 x 10-5 M ili većom, još bolje 1 x 10"4 M ili većom, poželjnije 1 x 10-3 M ili većom, i čak još bolje 1 x 10-2 M ili većom.

Izraz "Kassoc" ili "Ka", kako je ovde korišćen, odnosi se na brzinu asocijacije naročite interakcije antitelo-antigen, dok se izraz "Kdis" ili "Kd," kako je ovde korišćen, odnosi na brzinu disocijacije naročite interakcije antitelo-antigen. Izraz "KD", kako je ovde korišćen, odnosi se na konstantu disocijacije, koja se dobija iz odnosa Kd prema Ka {tj,. Kd/Ka) i, izražava se u vidu molarne koncentracije (M). Kd vrednosti za antitela mogu da se odrede dobro poznatim postupcima. Postupak koji ima prednost za određivanje KD antitela jeste onaj koji koristi površinsku plazmon rezonancu, pre svega upotrebom biosenzor sistema, kao što je Biacore® system.

Kako je ovde korišćen, izraz "visoki afinitet" za IgG antitela, odnosi se na antitela koja imaju KD od 10-8 M ili manju, bolje 10-9 M ili manju i najpoželjnije 10-10 M ili manju za ciljni antigen. Ipak, "visoki afinitet" vezivanja može varirati za druge izotipove antitela. Na primer, "visoki afinitet" vezivanja za IgM izotip se odnosi na antitela koja imaju Kd od 10-7 M ili manju, bolje 10-8 M ili manju, i najpoželjnije 10-9 M ili manju.

Kako je ovde korišćen, izraz "ispitanik" obuhvata čoveka ili životinju. Izraz "životinja" obuhvata sve vertebrate, npr., sisare i ne-sisare, kao što su primati koji ne pripadaju čoveku, ovce, psi, mačke, konji, krave, kokoške, amfibije, reptili, i td.

Različiti aspekti pronalaska su dalje detaljno opisani u sledećim pod-poglavljima.

Anti-PTK7 Antitela

Antitela pronalaska su opisana putem posebnih funkcionalnih karakteristika ili svojstava antitela. Na primer, antitela se specifično vezuju za PTK7. Poželjno, antitela pronalaska se vezuju za PTK7 sa visokim afinitetom, na primer sa KD od 1 x 10-7 M ili manjom. Poželjno, antitela se vezuju za humanu PTK7 sa KD od 5 x 10-8 M ili manjom, vezuju se za humanu PTK7 sa Kd od 1 x 10-8 M ili manjom, vezuju se za humanu PTK7 sa KD od 5 x 10-9 M ili manjom, ili se vezuju za humanu PTK7 sa KD od između 1x10-8 M i 1 x 10-10 M ili manjom. Antitela se vezuju za ćelije Wilmovog tumora sa vrednošću EC50 od 4.0 nM ili manjom, ili se vezuju za ćelije Wilmovog tumora sa vrednošću EC50 od 3.5 nM ili manjom. Standardni testovi za ispitivanje sposobnosti vezivanja antitela sa PTK7, koji su u struci poznati, obuhvataju na primer, ELISA tehnike, Western blot tehnike i RIA tehnike. Kinetike vezivanja (npr, afinitet vezivanja) antitela, isto tako, može da se ispita standardnim testovima, koji su u struci poznati, kao što su ELISA tehnika, Scatchardova i Biacore analiza. Kao drugi primer, antitela ovog pronalaska mogu da se vežu za karcinomsku ćelijsku liniju tumora bubrega, na primer, ćelijsku liniju Wilmovog tumora. Prikladni testovi za ispitivanje ma koje od prethodno opisanih karakteristika su opisani detaljnije u delu Primeri.

Monoklonska antitela 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8

Antitela pronalaska obuhvataju humana monoklonska antitela 4D5, 12C6 i 7C8. Druga antitela, koja su ovde izložena, obuhvataju 3G8, 3G8a i 12C6. Sva antitela su izolovana i strukturno opisana kako je opisano u Primeru 1 i 2. Sva stručna lica će shvatiti da antitela 3G8 i 3G8a, kao i antitela 12C6 i 12C6a imaju istu sekvencu teškog lanca, dok se razlikuju po sekvencama svojih lakih lanaca. VH aminokiselinske sekvence : 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 su prikazane kao SEQ ID NOs: 1 (3G8 i 3G8a), 2 (4D5), 3 (12C6 i 12C6a) i 4 (7C8). VL aminokiselinske sekvence : 3G8, 3G8a, 4D5,12C6, 12C6a i 7C8 su prikazane kao SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8, 9 odnosno 10.

Uz to da svako od ovih antitela može da se veže za PTK7, VH i VL sekvence se mogu "pomešati i slagati" kako bi se kreirali drugi anti-PTK7 vezujući molekuli. Vezivanje PTK7 od strane takvih "pomešanih i poslaganih" antitela se može ispitati upotrebom testa vezivanja koji prethodno opisan i u Primerima (npr., ELISA tehnike). Poželjno, kada se VH i VL lanci pomešaju i slože, VH sekvenca naročitog VH/VL para zamenjuje se sa strukturno sličnom VH sekvencom. Slično, poželjno se VL sekvenca naročitog VHA/L para zamenjuje sa strukturno sličnom VL sekvencom.

Prema tome, u jednom aspektu, ovde je prikazano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući deo, koje sadrži:

(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine: SEQ ID NOs: 1, 2, 3 i 4; i

(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8, 9 i 10;

pri čemu se antitelo specifično vezuje za PTK7, pre svega za humanu PTK7.

Antitelo ovog pronalaska, ili njegov antigen vezujući deo, mogu sadržavati:

(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; ili

(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10; ili

(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8.

Druge kombinacije teških i lakih lanaca, koje su ovde opisane, obuhvataju:

(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; ili

(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; ili

(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9.

U drugom aspektu, ovde su izložena antitela koja sadrže CDR1, CDR2 i CDR3 regione teškog i lakog lanca 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8, ili njihovih kombinacija. Aminokiselinske sekvence VH CDR1 regiona 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 su prikazane kao SEQ ID NO: 11 (3G8 i 3G8a), 12 (4D5), 13 (12C6 i 12C6a) i 14 (7C8). Aminokiselinske sekvence VH CDR2 regiona 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 su prikazane kao SEQ ID NO: 15 (3G8 i 3G8a), 16 (4D5), 17 (12C6 i 12C6a) i 18 (7C8). Aminokiselinske sekvence VH CDR3 regiona 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 su prikazane kao SEQ ID NO: 19 (3G8 i 3G8a), 20 (4D5), 21 (12C6 i 12C6a) i 22 (7C8). Aminokiselinske sekvence Vk CDR1 regiona 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 su prikazane kao SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 odnosno 28. Aminokiselinske sekvence Vk CDR2 regiona 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 su prikazane kao SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 odnosno 34. Aminokiselinske sekvence Vk CDR3 regiona 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 su prikazane kao SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39 odnosno 40. CDR regioni su prikazani korišćenjem Kabat sistema (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).

Uz to da svako od ovih antitela može da se veže za PTK7 i da je antigen-vezujuća specifičnost primarno obezbeđena sa CDR1, CDR2 i CDR3 regionima, VH CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence i Vk CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence se mogu "pomešati i slagati" (tj., CDR regioni različitih antitela se mogu pomešati i složiti, iako svako antitelo mora da ima VH CDR1, CDR2 i CDR3 i Vk CDR1, CDR2 i CDR3) kako se kreiraju drugi anti-PTK7 vezujući molekuli pronalaska. Vezivanje PTK7 od strane takvih "pomešanih i poslaganih" antitela se može ispitati upotrebom testa vezivanja koji prethodno opisan i u Primerima (npr., ELISA tehnike, Biacore analiza). Poželjno, kada se VH CDR sekvence pomešaju i slože, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvence iz naročite VH sekvence zamenjuju se sa strukturno slično(i)m CDR sekvencom(ama). Slično, kada se Vk CDR sekvence pomešaju i slože CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvence iz naročite Vk sekvence poželjno se zamenjuju sa strukturno slično(i)m CDR sekvencom(ama). Stručno lice će lako shvatiti da nove VH i VL sekvence mogu da se kreiraju supstitucijom jedne ili više sekvenci VH i/ili VL CDR regiona sa strukturno sličnom sekvencom CDR sekvencama koje su ovde izložene za monoklonska antitela za sledeća antitela 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8.

Prema tome, u drugom aspektu, ovde je priakazano izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koje sadrži:

(a) varijabilni region teškog lanca CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 11, 12, 13 i 14;

(b) varijabilni region teškog lanca CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 15, 16, 17 i18;

(c) varijabilni region teškog lanca CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 19, 20, 21 i 22;

(d) varijabilni region lakog lanca CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu

odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 i 28;

(e) varijabilni region lakog lanca CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu

odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 29, 30, 31,32, 33 i 34; i

(f) varijabilni region lakog lanca CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu

odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39 i 40;

pri čemu se antitelo specifično vezuje za PTK7, pre svega za humanu PTK7.

Antitelo ovog pronalaska, ili njegov antigen vezujući deo, mogu sadržavati

(a) varijabilni region teškog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 12;

(b) varijabilni region teškog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 16;

(c) varijabilni region teškog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:20;

(d) varijabilni region lakog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:25;

(e) varijabilni region lakog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:31; i

(f) varijabilni region lakog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:37;

(a) varijabilni region teškog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 14;

(b) varijabilni region teškog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 18;

(c) varijabilni region teškog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:22;

(d) varijabilni region lakog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:28;

(e) varijabilni region lakog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:34; i

(f) varijabilni region lakog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:40;

ili

(a) varijabilni region teškog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 13;

(b) varijabilni region teškog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 17;

(c) varijabilni region teškog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:21;

(d) varijabilni region lakog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:26;

(e) varijabilni region lakog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:32; i

(f) varijabilni region lakog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:38.

Ovde su, takođe, prikazana antitela koja sadrže:

(a) varijabilni region teškog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:11;

(b) varijabilni region teškog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 15;

(c) varijabilni region teškog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:19;

(d) varijabilni region lakog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:23;

(e) varijabilni region lakog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:29; i

(f) varijabilni region lakog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:35;

(a) varijabilni region teškog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:11;

(b) varijabilni region teškog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 15;

(c) varijabilni region teškog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 19;

(d) varijabilni region lakog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:24;

(e) varijabilni region lakog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:30; i

(f) varijabilni region lakog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:36;

ili

(a) varijabilni region teškog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 13;

(b) varijabilni region teškog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 17;

(c) varijabilni region teškog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:21;

(d) varijabilni region lakog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:27;

(e) varijabilni region lakog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:33; i

(f) varijabilni region lakog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:39;

U struci je dobro poznato da CDR3 domen, nezavisno od CDR1 i/ili CDR2 domena, sam može određivati specifičnost vezivanja antitela za srodni antigen i da se prediktivno mogu generisati multipla antitela sa istom specifičnošću vezivanja na bazi zajedničke CDR3 sekvence. Vidi, na primer, Klimka et al., British J. of Kancer 83(2):252-260 (2000) (opisuje se produkcija humanizovanih anti-CD30 antitela upotrebom samo varijabilnog domena CDR3 teškog lanca mišijeg anti-CD30 antitela Ki-4); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000) (opisuju se rekombinantna epitelialna glikoprotein-2 (EGP-2) antitela korišćenjem samo CDR3 sekvence teškog lanca anti-EGP-2 antitela matičnih miševa MOC-31); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998) (opisuje se panel humanizovanih anti-integrin avp3 antitela uz upotrebu varijabilnih CDR3 domena teških i lakih lanaca mišijih anti-integrin αvβ3 antitela LM609 gde svaki član antitela sadrži različitu sekvencu van CDR3 domena i može da se veže za isti epitop kao i matično mišije antitelo sa afinitetima koji su isti ili veći u odnosu na matično mišije antitelo); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (opisuje da CDR3 domen obezbeđuje najznačajniji doprinos vezivanju za antigen); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (opisuje kalemljenje CDR3 sekvenci teškog lanca tri Fab fragmenta (SI-1, SMO i SI-32) usmerenih protiv humane placentalne DNK na teški lanac Fab anti-tetanusnog toksoida na koji način zamenjuje postojeći CDR3 teki lanac i prikazujući da sam CDR3 domen ima specifičnost vezivanja); i Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996) (opisuje ispitivanja kalemljenja u kome je transfer samo CDR3 teškog lanca matičnog polispecifičnog FabLNA3 na teški lanac monospecifičnog IgG tetanusni toksoid-vezujući Fab p313 antitela bio dovoljan da bi se zadržala specifičnost vezivanja matičnog Fab).

Prema tome, ovde su prikazana monoklonska antitela koja sadrže jedan ili više CDR3 domena teškog i/ili lakog lanca iz antitela poreklom od čoveka ili životinje, pri čemu je monoklonsko antitelo sposobno da se specifično veže za PTK7. Isto tako, ovde su prikazana mnoklonska antitela koja sadrže jedan ili više CDR3 domena teškog i/ili lakog lanca iz antitela životinje, kao što je miš ili pacov, pri čemu je monoklonsko antitelo sposobno da se specifično veže za PTK7. Ovakva antitela, koja sadrže jedan ili više CDR3 domena teškog i/ili lakog lanca iz antitela životinje: (a) sposobna su da se takmiče za vezivanje: (b) zadržala su funkcionalne karakteristike; (c) vezuju se za isti epitop; i/ili (d) imaju slični afinitet vezivanja kao odgovarajuće matično antitelo životinje.

Ovde su, takođe, prikazana antitela koja sadrže jedan ili više CDR3 domena teškog i/ili lakog lanca iz antitela poreklom od čoveka, kao, na primer, humana antitela dobijena od životinja, pri čemu je humano antitelo sposobno da se specifično veže za PTK7. Isto tako, ovde su prikazana mnoklonska antitela koja sadrže jedan ili više CDR3 domena teškog i/ili lakog lanca iz prvog humanog antitela, kao, na primer, humana antitela dobijena iz životinje, pri čemu je prvo humano antitelo sposobno da se specifično veže za PTK7 i pri čemu CDR3 domen iz prvog humanog antitela zamenjuje CDR3 domen u humanom antitelu koje nema specifičnost vezivanja za PTK7 kako bi se stvorilo drugo humano antitelo koje je sposobno da se specifično veže za PTK7. Ovakva antitela, koja sadrže jedan ili više CDR3 domena teškog i/ili lakog lanca iz prvog humanog antitela (a) sposobna su da se takmiče za vezivanje; (b) zadržala su funkcionalne karakteristike; (c) vezuju se za isti epitop; i/ili (d) imaju slični afinitet vezivanja kao odgovarajuće matično prvo humano antitelo. Prvo humano antitelo može biti: 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a ili 7C8.

Antitela koja se vezuju za isti epitop kao anti-PTK7 antitela pronalaska

Pronalazak obezbeđuje antitela koja se vezuju za isti epitop na humanoj PTK7 kao ma koje PTK7 monoklonsko antitelo pronalaska (tj., antitela koja imaju sposobnost unakrsne kompeticije za vezivanje za PTK7 sa ma kojim monoklonskim antitelom pronlaska). Referentno antitelo za ispitivanje unakrsne kompeticije može biti monoklonsko antitelo 4D5 (koje ima VH i VL sekvence kao što su prikazane u SEQ ID NO: 2 odnosno 7), ili monoklonsko antitelo 12C6 (koje ima VH i VL sekvence kao što su prikazane u SEQ ID NO: 3 odnosno 8), ili monoklonsko antitelo 7C8 (koje ima VH i VL sekvence kao što su prikazane u SEQ ID NO: 4 odnosno 10). Ovakva unakrsno kompetitivna antitela se mogu prepoznati na osnovu njihove sposobnosti da se unakrsno takmiče sa 4D5, 12C6 ili 7C8 u standardnom testu vezivanja PTK7. Na primer, mogu se upotrebiti BlAcore analiza, ELISA testovi ili protočna citometrija kako bi se prikazala unakrsna kompeticija sa antitelima ovog pronalaska. Mogućnost ispitivanih antitela da inhibiraju vezivanje, na primer, 4D5, 12C6 ili 7C8, za humanu PTK7 pokazuje da se ispitivana antitela mogu takmičiti sa 4D5, 12C6 ili 7C8 za vezivanje na humanoj PTK7 i time, da se vezuju za isti epitop na humanoj PTK7 kao i 4D5.12C6 ili 7C8. Antitelo koje se vezuje za isti epitop na humanoj PTK7 kao i 4D5, 12C6 ili 7C8 jeste humano monoklonsko antitelo. Takvo humano monoklonsko antitelo se može proizvesti i izolovati na način opisan u Primerima.

Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju antitela pronalaska

Drugi aspekt pronalaska se odnosi na molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju antitela pronalaska. Nukleinske kiseline mogu biti prisutne u celoj ćeliji, u ćelijskom lizatu, ili u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili se "smatra suštinski čistom" kada se očisti od drugih ćelijskih komponenti ili drugih kontaminata, npr., drugih ćelijskih nukleinskih kiselina ili proteina, standardnim tehnikama, uključujući bazno/SDS tretman, CsCI vezivanje, hromatografiju na koloni, elektroforezu na agaroznom gelu i druge dobro poznate u struci. Vidi, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Nukleinska kiselina pronalaska može biti, na primer, DNK ili RNK i može ali i ne mora sadržavati sekvencu introna. U poželjnom ostvarenju, nukleinska kiselina je molekul cDNK.

Nukleinske kiseline mogu da se dobiju upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije. Za antitela koje ekspresuju hibridomi (npr., hibridomi pripremljeni od transgenskih miševa koji nose gene humanih imunoglobulina kako je objašnjeno u nastavku), cDNK koje kodiraju lake i teške lance antitela koje proizvode hibridomi, mogu da se dobiju standardnom PCR amplifikacijom ili tehnikama cDNK kloniranja. Za antitela koja se dobijaju iz biblioteke gena imunoglobulina (npr., korišćenjem tehnike izlaganja faga), nukleinska kiselina koja kodira antitela može da se dobije iz biblioteke.

Poželjni molekuli nukleinskih kiselina su oni koji kodiraju VH i VL sekvence 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a ili 7C8 monoklonskih antitela. DNK sekvenca koja kodira VH sekvencu 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 prikazana je kao SEQ ID NO: 41 (3G8 i 3G8a), 42 (4D5), 43 (12C6 i 12C6a) i 44 (7C8). DNK sekvenca koja kodira VL sekvencu 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 prikazana je kao SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48, 49 odnosno 50.

Jednom kada se dobiju DNK fragmenti koji kodiraju VH i VL segmente, ovi DNK fragmenti mogu dalje biti korišćeni u standardnim tehnikama rekombinovanja DNK, na primer, za prevođenje gena varijabilnog regiona u gene lanaca antitela pune dužine, u gene Fab fragmenta ili u scFv gen. U ovim manipulacijama, VL- ili VH-kodirajući DNK fragment se operativno poveže sa drugim DNK fragmentom koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Izraz "operativno vezan", kako je korišćen u ovom kontekstu, treba da označi da su dva DNK fragmenta spojena tako da aminokiselinska sekvenca koju kodiraju DNK fragmenti ostane u gradivnom okviru.

Izolovana DNK koja kodira VH region može da se prevede u gen teškog lanca pune dužine operativnim vezivanjem VH-kodirajuće DNK sa drugim DNK molekulom koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). U struci je poznata sekvenca gena humanih konstantnih regiona teških lanaca (vidi npr., Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) i DNK fragmenti koji sadrže ove regione mogu da se dobiju standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD konstantni region, ali najpoželjnije je lgG1 ili lgG4 konstantni region. Za gen Fab fragmenta teškog lanca, VH-kodirajuća DNK se može operativno povezati sa drugim DNK molekulom koji kodira samo CH1 konstantni region teškog lanca.

Izolovana DNK koja kodira VL region može da se prevede u gen lakog lanca pune dužine (kao i u gen Fab lakog lanca) operativnim vezivanjem VL-kodirajuće DNK sa drugim DNK molekulom koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. U struci je poznata sekvenca gena humanih konstantnih regiona lakih lanaca (vidi npr., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) i DNK fragmenti koji sadrže ove regione mogu da se dobiju standardnom PCR amplifikacijom.

Konstantni region lakog lanca može biti kappa ili lambda konstantni region, ali najbolje je kada je kappa konstantni region.

Da bi se kreirao scFv gen, VH- i VL-kodirajući DNK fragmenti se operativno povežu sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilan linker, npr., kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4-Ser)3, tako da se VH i VL sekvenca može ekspresovati u vidu susednih jedno-lančanih proteina, sa VL i VH regionima spojenim fleksibilnim linkerom (vidi npr., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).

Produkcija monoklonskih antitela pronalaska

Monoklonska antitela (mAbs) mogu da se proizvedu pomoću raznih tehnika, uključiv konvencionalnu metodologiju monoklonskih antitela npr., standardne tehnike hibridizacije somatske ćelije od Kohlera i Milsteina, (1975) Nature 256: 495. lako prednost imaju procedure hibridizacije somatske ćelije, u principu, mogu se koristiti i druge tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela npr., virusna ili onkogena transformacija B limfocita.

Poželjni životinjski sistem za produkciju hibridoma jeste mišiji sistem. Produkcija hibridoma u mišu je veoma dobro ustanovljena procedura. Protokoli imunizacije i tehnike za izolaciju imunizovanih splenocita za spajanje, dobro su poznati u struci. Takođe su poznati i fuzioni partneri (npr., mišije mijeloma ćelije) i procedure spajanja.

Himerična ili humanizovana antitela mogu da se proizvedu na osnovu sekvence mišijih monoklonskih antitela proizvedenih kako je prethodno opisano. DNK koja kodira imunoglobuline teškog i lakog lanca može da se dobije iz mišijeg hibridoma koji je poželjan i konstruisanjem da sadrži ne-mišije (npr., humane) sekvence imunoglobulina korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Na primer, da se kreira himerično antitelo, mišiji varijabilni regioni mogu da se povežu sa humanim konstantnim regionima korišćenjem u struci poznatih postupaka (vidi npr., U.S. Patent No. 4,816,567 to Cabilly et al.). Da se kreira humanizovano antitelo, mišiji CDR regioni mogu da se insertuju u humani gradivni okvir korišćenjem poznatih postupaka (vidi npr., U.S. Patent No. 5,225,539 to Winter, kao i U.S. Patent Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 and 6,180,370 to Queen et al.).

Antitela pronalaska su humana monoklonska antitela. Ova humana monoklonska antitela usmerena protiv PTK7 mogu da se generišu upotrebom transgenskih ili transhromozomnih miševa koji nose delove humanog imunog sistema više nego mišijeg imunog sistema. Ovi transgenski ili transhromozomni miševi uključuju miševe koji su ovde označeni kao HuMAb miševi i KM miševi™, a zajednički su ovde označeni kao "humani Ig miševi."

HuMAb miš® (Medarex, Ine.) sadrži minilokus gena humanog imunoglobulina koji kodira nerearanžiranu sekvencu teškog (μ i γ) i κ lakog lanca humanog imunoglobulina, zajedno sa targetovanim mutacijama koje inaktiviraju endogeni lokus n i κ lanca (vidi npr., Lonberg, et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859). Prema tome, miševi pokazuju smanjenu ekspresiju mišijeg IgM ili k, a u odgovoru na imunizaciju, uvedeni transgeni humanog teškog i lakog lanca podležu klasičnom okidanju i somatskoj mutaciji kako se generišu monoklonski humani IgGK visokog afiniteta (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revieWed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). Proizvodnja i korišćenje HuMab miševa, kao i modifikacije genoma izvedene takvim miševima, dalje su opisane u: Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International lmmunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International lmmunology 6: 579-591; and FishWild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Dalje pogledati: U.S. Patent Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318;

5,874,299; and 5,770,429; ali to Lonberg and Kay; U.S. Patent No. 5,545,807 to Surani et al.; PCT Publication Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 and WO 99/45962, ali to Lonberg and Kay; and PCT Publication No. WO 01/14424 to Korman et al.

U drugom ostvarenju, humana antitela pronalaska se mogu izgraditi upotrebom miša koji nosi sekvence humanih imunoglobulina na transgenima i transhromozomima, takav je i miš koji nosi transgen humanog teškog lanca i transhromozom humanog lakog lanca. Takvi miševi, nazvani ovde "KM miševi™", detaljno su opisani u: PCT Publication WO 02/43478 od ishida i saradnika.

I još, alternativni transgenski životinjski sistemi koji ekspresuju gene humanih imunoglobulina su dostupni u struci i mogu da se koriste za izgradnju anti-PTK7 antitela pronalaska. Na primer, može da se koristi alternativni transgenski sistem koji se naziva ksenomiš (Xenomouse) (Abgenix, Ine.); takvi miševi su opisani u, na primer, U.S. Patentima No. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 i 6,162,963 od Kucherlapati i saradnika.

Sem toga, alternativni transhromozomni životinjski sistemi koji ekspresuju gene humanih imunoglobulina, dostupni su u struci i mogu da se koriste za izgradnju anti-PTK7 antitela pronalaska. Na primer, miševi koji nose oba, i transhromozom humanog teškog lanca i transhromozom humanog lakog lanca, a nazivaju se "TC miševi" mogu da se upotrebe; ovakve miševe je opisao Tomizuka i saradnici. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Dalje, krave koje nose transhromozome humanog teškog i lakog lanca opisane su u struci (KuroiWa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) i mogu da se koriste za izgradnju anti-PTK7 antitela pronalaska.

Humana monoklonska antitela pronalaska mogu takođe da se proizvedu upotrebom postupaka izlaganja faga za skriniranje biblioteka gena humanih imunoglobulina. U struci su ustanovljeni ovakvi postupci izlaganja faga za izolovanje humanih antitela. Vidi na primer: U.S. Patente No. 5,223,409; 5,403,484; i 5,571,698 od Ladnera i saradnika.; U.S. Patente No. 5,427,908 i 5,580,717 od Dower i saradnika.; U.S. Patente No. 5,969,108 i 6,172,197 od McCafferty i saradnika.; i U.S. Patente No. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731 ;.6,555,313; 6,582,915 i 6,593,081 od Griffiths i saradnika.

Humana monoklonska antitela pronalaska mogu takođe da se proizvedu upotrebom SCID miševa u kojima su rekonstituisane humane imune ćelije na takav način da se imunizacijom može generisati odgovor humanih antitela. Takvi miševi su opisani u, na primer, U.S. Patentima No. 5,476,996 i 5,698,767 od Wilsona i saradnika.

Imunizaciia humanih Ig miševa

Kada se humani Ig miševi koriste za izgradnju humanih antitela pronalaska, takvi miševi se mogu imunizovati sa prečišćenim ili obogaćenim preparatom PTK7 antigena i/ili rekombinantnog PTK7, ili PTK7 fuzionog proteina, kako je opisao Lonberg, N. i saradnici (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature

Biotechnology 14: 845-851; i u: PCT Publication WO 98/24884 i WO 01/14424. Poželjno, miševi će biti 6-16 nedelja starosti po prvoj infuziji. Na primer, prečišćeni ili rekombinantni preparat (5-50 pg) PTK7 antigena može da se koristi intraperitonealno za imunizaciju humanih Ig miševa.

Detaljne procedure za generisanje humanog monoklonskog antitela u punoj dužini prema PTK7 su opisane u Primeru 1, u nastavku. Nakupljeno iskustvo sa raznim antigenima je pokazalo da transgenski miševi odgovaraju kada se inicijalno imunizuju intraperitonealno (IP) sa antigenom u kompletnom Freundovom adjuvansu, a zatim svake sledeće nedelje IP imunizacijom (do ukupno 6) sa antigenom u kompletnom Freundovom adjuvansu. Međutim, nađeno je da su i adjuvansi koji nisu Freundov, isto tako, efikasni. Sem toga, nađeno je i da su ćele ćelije u odsustvu adjuvansa visoko imunogene. Imuni odgovor se može pratiti praćenjem imunizacionog protokola sa uzorcima plazme koja se dobija retroorbitalnim uzorkovanjem. Plazma se može ispitati ELISA tehnikom (kako je opisano u nastavku), a miševi sa dovoljnim titrom anti-PTK7 humanog imunoglobulina mogu da se koriste za spajanja. Miševi se mogu intravenozno pojačati sa antigenom 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine. Očekuje se da je neophodno izvesti 2-3 spajanja za svaku imunizaciju. Za svaki antigen se obično imunizuje između 6 i 24 miša. Obično se koriste oba, i HCo7 i HCo12 soja. Sem toga, oba, i HCo7 i HCo12 transgeni mogu zajedno biti pohranjeni u jednog miša koji onda ima dva različita humana transgena teškog lanca (HCo7/HCo12). Alternativno ili dodatno, može se koristiti soj KM miš™, kako je opisano u Primeru 1.

Generisanje hibridoma koji produkuju humana monoklonska antitela pronalaska

Da bi se generisali hibridomi koji proizvode humano monoklonsko antitelo pronalaska, mogu se izolovati splenociti i/ili ćelije limfnog nodusa iz imunizovanih miševa i, spojiti sa odgovarajućom besmrtnom ćelijskom linijom, kao što je mišija ćelijska linija mijeloma. Dobijeni hibridomi se mogu skrinirati na produkciju antigen-specifičnih antitela. Na primer, suspenzije pojedinačnih ćelija limfocita slezine imunizovanih miševa mogu da se spoje sa jednom šestinom broja P3X63-Ag8.653 nesekretujućih mišijih mijeloma ćelija (ATCC, CRL 1580) sa 50% PEG. Ćelije se postavljaju u ploče otprilike pri 2x105 u mikrotitarske ploče sa ravnim dnom, a zatim sledi dvonedeljna inkubacija u selektivnom medijumu koji sadrži 20% fetalnog klon seruma, 18% "653" kondicioniranog medijuma, 5% origena (IGEN), 4 mM L-glutamina, 1 mM natrijum piruvata, 5mM HEPES, 0.055 mM 2-merkaptoetanola, 50 jedinica/ml penicilina, 50 mg/ml streptomicina, 50 mg/ml gentamicina i 1X HAT (Sigma; HAT se dodaje 24 sata posle spajanja). Posle otprilike dve nedelje, ćelije se mogu uzgajati u medijumu u kome se HAT zamenjuje sa HT. Pojedinačna reakciona mesta se onda skriniraju ELISA tehnikom na humana monoklonska IgM i IgG antitela. Jednom kada se javi intenzivni rast hibridoma, medijum se može posmatrati obično nakon 10-14 dana. Hibridomi koji sekretuju antitela mogu ponovo da se zaseju, ponovo skriniraju i, ukoliko su još uvek pozitivni na humani IgG, monoklonska antitela se mogu subklonirati najmanje dva puta ograničavanjem dilucije. Stabilni subklonovi se onda mogu uzgajati in vitro kako bi se dobile male količine antitela u medijumu kulture tkiva za opisivanje.

Da bi se prečistila humana monoklonska antitela, mogu se uzgojiti izabrani hibridomi u dvo-litarskim spiner-balonima za prečišćavanje monoklonskih antitela. Supernatanti se mogu filtrirati i ukoncentrisati pre afinitetne hromatografije sa protein A-sefarozom (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Eluirani IgG se može proveriti gel elektroforezom i tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom kako bi se osigurala čistoća. Puferski rastvor se može promeniti u PBS, a koncentracija se može odrediti putem OD280 upotrebom 1.43 ekstinkcionog koeficijenta. Monoklonska antitela se mogu podeliti u alkivote i čuvati na -80° C.

Generisanje transfektoma koji proizvode monoklonska antitela pronalaska

Antitela pronalaska se, isto tako, mogu proizvesti u transfektomu ćelije domaćina korišćenjem, na primer, kombinacije rekombinantne DNK tehnike i postupaka genske transfekcije kao što je u struci dobro poznato (npr., Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

Na primer, za ekspresiju antitela, ili njihovih fragmenata antitela, DNK, koje kodiraju lake i teške lance parcijalno ili u punoj dužini, mogu da se dobiju standardnim tehnikama molekularne biologije (npr., PCR amplifikacijom ili cDNK kloniranjem korišćenjem hibridoma koji ekspresuje antitela koja želimo) i DNK se mogu insertovati u ekspresione vektore tako da su geni operativno povezani sa transkripcionim i translacionim kontrolnim sekvencama. U ovom kontekstu, izraz "operativno povezan" treba da označi da je gen antitela povezan u vektor tako da transkripcione i translacione kontrolne sekvence unutar vektora služe svojim predviđenim namenama regulisanja transkripcije i translacije gena antitela. Ekspresioni vektor i kontrolna sekvenca ekspresije se biraju tako da budu kompatibilni sa ćelijom domaćinom koja se koristi za ekspresiju. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu da se insertuju u zasebni vektor ili, što je češće, oba gena se insertuju u isti ekspresioni vektor. Geni antitela se insertuju u ekspresioni vektor standardnim postupcima (npr., ligacijom komplementarnih restrikcionih položaja na fragment gena antitela i vektor, ili ligacijom otvorenog kraja ukoliko nema restrikcionih položaja). Varijabilni regioni lakog i teškog lanca antitela koje je ovde opisano, mogu da se iskoriste za kreiranje gena antitela pune dužine ma kog izotipa antitela, putem njihovog insertovanja u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantni region teškog lanca i konstantni region lakog lanca željenog izotipa, tako da je VH segment operativno povezan sa CH segmentom(ima) unutar vektora i da je VK segment operativno povezan sa CL segmentom unutar vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresioni vektor može kodirati signalni peptid koji olakšava sekreciju antitelskog lanca iz ćelije domaćina. Gen lanca antitela se može klonirati u vektor tako da je signalni peptid povezan unutar građe za amino terminus gena lanca antitela. Signalni peptid može biti imunoglobulinski signalni peptid ili heterologi signalni peptid (tj., signalni peptid iz ne-imunoglobulinskog proteina).

Osim gena lanaca antitela, rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska mogu nositi regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena lanaca antitela u ćeliji domaćina. Izraz "regulatorna sekvenca" treba da obuhvati promotere, pojačivače i druge kontrolne elemente ekspresije (npr., poliadenilacioni signali) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanaca antitela. Ovakve regulatorne sekvence su opisane, na primer, u: Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Stručnom licu će biti jasno da dizajn ekspresionog vektora, uključujući izbor regulatorne sekvence, mogu zavisiti od takvih faktora kao što je izbor ćelije domaćina koju treba transformisati, nivo ekspresije željenog proteina i td. Poželjne regulatorne sekvence za ekspresiju u ćeliju domaćina sisara uključuju virusne elemente koji usmeravaju na visoke nivoe ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promoteri i/ili pojačivači poreklom od citomegalovirusa (CMV), Simian Virusa 40 (SV40), adenovirus, (npr., adenovirus najveći kasni promoter (AdMLP) i poliom. Alternativno, mogu se koristiti ne-virusne regulatorne sekvence, kao što je ubikvitin promoter ili (3-globinski promoter. Sem toga, regulatorni elementi sastavljeni od sekvenci iz različitih izvora, kao što je SRα promoter sistem, koji sadrži sekvence iz SV40 ranog promotera i dugački terminalni ponovak virusa tip 1 humane leukemije T ćelija (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

Osim gena lanaca antitela i regulatorne sekvence, rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska mogu nositi dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr., početak replikacije) i gene selektabilnih markera. Gen selektabilnog markera olakšava izbor ćelija domaćina u koju je uveden vektor (vidi, npr., U.S. Pat. No. 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, svi od Axela i sar.). Na primer, uobičajeni geni selektabilnog markera podržavaju rezistenciju na lekove, kao što je G418, higromicin ili metotreksat, na ćeliji domaćinu u koju je uveden vektor. Poželjni geni selektabilnog markera uključuju gen dihidrofolat reduktaze (DHFR) (za upotrebu u dhfr-ćelijama domaćina sa metotreksat selekcijom/amplifikacijom) i neo gen (za G418 selekciju).

Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodira lake i teške lance se transfektuje u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Razni oblici izraza "transfekcija" treba da obuhvate širok spektar tehnika koje se uobičajeno koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr., elektroporacija, kalcijum-fosfatna precipitacija, DEAE-dekstranska transfekcija i slične, lako je teoretski moguće ekspresovati antitela pronalaska u bilo prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina, ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama, a pre svega u ćelijama domaćina sisara, jeste najpoželjnija, jer će takve eukariotske ćelije, a posebno ćelije sisara, pre nego prokariotske ćelije, sastaviti i sekretovati ispravno presavijena i imunološki aktivna antitela. Zapaženo je da je prokariotska ekspresija gena antitela ne-efektivna za produkciju visokih prinosa aktivnog antitela (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) lmmunology Today 6:12-13).

Poželjne ćelije domaćini sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela pronalaska obuhvataju jajnik kineskog hamstera (CHO ćelije) (uključujući dhfr-CHO ćelije, opisane u: Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, koje se koriste sa DHFR selektabilnim markerom, npr., kako je opisano u: R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), ćelije NSO mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije. Posebno, za upotrebu sa NSO mijeloma ćelijama, još jedan poželjan ekspresioni sistem je GS genski ekspresioni sistem, opisan u: WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338,841. Kada se u ćelije domaćina sisara uvedu rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela, antitela se produkuju uzgajanjem ćelija domaćina u toku vremenskog perioda koje je dovoljno da omogući ekspresiju antitela u ćelijama domaćina ili, poželjnije, sekreciju antitela u medijum kulture u kojoj se uzgajaju ćelije domaćina. Antitela se iz medijuma kulture mogu sakupiti korišćenjem standardnih postupaka prečišćavanja proteina.

Opis antitela koja se vezuju za antigen

Antitela se mogu ispitati na vezivanje sa PTK7 putem, na primer, standardne ELISA tehnike. Ukratko, mikrotitarske ploče se oblože sa prečišćenim PTK7 pri konc. 0.25 µg/ml u PBS, a zatim se blokiraju sa 5% goveđim serum albuminom u PBS. Razblaženja antitela (npr., razblažena plazme od PTK7-imunizovanih miševa) se dodaju u svako rekaciono mesto i inkubira se tokom 1-2 sata na 37°C. Ploče se isperu sa smešom PBS/Tween i zatim inkubiraju sa sekundarnim reagensom (npr.,za humana antitela, kozijim-anti-humanim IgG Fc-specifičnim poliklonskim reagensom) konjugovanim sa alkalnom fosfatazom u toku 1 sata na 37°C. Posle ispiranja, ploče se razvijaju sa pNPP supstratom (1 mg/ml), a zatim analiziraju na OD od 405-650. Poželjno, miševi koji su razvili najviše titre biće korišćeni za fuzionisanje.

ELISA test, kako je prethodno opisan, može se takođe koristiti za skriniranje na hibridome koji pokazuju pozitivnu reaktivnost sa PTK7 imunogenom. Hibridomi koji se sa velikom težnjom vezuju sa PTK7, subklonirani su i dalje opisani. Jedan klon iz svakog hibridoma, koji zadržava reaktivnost matičnih ćelija (pomoću ELISA), može da se izabere za ćelijsku banku 5-10 bočica, koja se čuva na -140°C, kao i za prečišćavanje antitela.

Za prečišćavanje anti-PTK7 antitela, izabrani hibridomi mogu da se uzgajaju u dvo-litarskim spiner-balonima za prečišćavanje monoklonskih antitela. Supernatanti se filtriraju i ukoncentrišu pre afinitetne hromatografije sa protein A-sefarozom (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluirani IgG se može proveriti gel elektroforezom i tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom kako bi se osigurala čistoća. Puferski rastvor se može izmeniti u PBS, a koncentracija se može odrediti pomoću OD2ao korišćenjem 1.43 koeficijenta ekstinkcije. Monoklonska antitela se mogu podeliti u alikvote i čuvati na -80°C.

Da bi se odredilo da li se izabrana anti-PTK7 monoklonska antitela vezuju za jedinstvene epitope, svako antitelo se može biotinizovati korišćenjem komercijalno nabavljivih reagenasa (Pierce, Rockford, IL). Kompetitivna ispitivanja, koja koriste neobeležena monoklonska antitela i biotinizovana monoklonska antitela, mogu da se izvedu upotrebom obloženih ELISA ploča sa PTK7, kako je prethodno opisano.

Vezivanje biotinizovanog mAb se može odrediti probom na strep-avidin-alkalne fosfataze.

Da bi se odredio izotip prečišćenog antitela, mogu se izvesti izotipske ELISA tehnike korišćenjem reagenasa specifičnih za antitela naročitog izotipa. Na primer, da bi se odredio izotip humanih monoklonskih antitela, reakciona mesta mikrotitarskih ploča se mogu obložiti sa 1 µg/ml anti-humanog imunoglobulina preko noći na 4°C. Posle blokiranja sa 1% BSA, ploče reaguju sa 1 µg/ml ili manje test monoklonskog antitela ili prečišćenih kontrola izotipa, na temperaturi sredine tokom jednog ili dva sata. Reakciona mesta zatim reguju sa specifičnim konjugovanim probama alkalne fosfataze ili za humani lgG1 ili za humani IgM. Ploče se razvijaju i analiziraju kako je prethodno opisano.

Anti-PTK7 humani IgG-i mogu dalje da se ispitaju na reaktivnost sa PTK7 antigenom, pomoću Western blotting-a. Ukratko, može se pripremiti PTK7 i podvrći elektroforezi na natrijum dodecil sulfat poliakrilamid gelu. Posle elktroforeze, razdvojeni antigeni se prenose na nitrocelulozne membrane, blokiraju sa 10% fetalnim telećim serumom i, ispituju sa monoklonskim antitelima za testiranje. Vezivanje humanog IgG se može detektovati korišćenjem anti-humane IgG-alkalne fosfataze i razvijanjem sa BCIP/NBT supstrat tabletama (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).

Imunokonjugati

U drugom aspektu, ovaj pronalazak se bavi anti-PTK7 antitelima, ili njihovim fragmentima, konjugovanim za terapeutski deo, kao što je citotoksin, lek (npr., imunosupresiv) ili radiotoksin. Ovakvi konjugati se ovde nazivaju "imunokonjugatima". Imunokonjugati koji uključuju jedan ili više citotoksina se nazivaju "imunotoksinima." Citotoksin ili citotoksično sredstvo uključuje svako sredstvo koje je pogubno (npr., ubistveno) za ćelije. Primeri uključuju: taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidium bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D,1-dehidrotestosteron, glukokortikoidi, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i njihove analoge ili homologe. Terapeutska sredstva, isto tako, obuhvataju, na primer, antimetabolite (npr., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), aikilujuća sredstva (npr.,mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklotosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C i cis-dihlorodiamin platinum(ll)(DDP) cisplatin), antracikline (npr., daunorubicin (prethodno daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr., daktinomicin (prethodno aktinomicin), bleomicin, mitramicin i antramicin (AMC)) i anti-mitotička sredstva (npr., vinkristin i vinblastin).

Drugi poželjni primeri terapeutskih citotoksina koji se mogu konjugovati sa antitelima pronalaska obuhvataju: duokarmicine, kaliheamicine, maitanzine i auristatine, kao i njihove derivate. Primer konjugata antitela sa kaliheamicinom se može komercijalno nabaviti (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst). Primeri terapeutskih citotoksina se mogu naći, na primer, u: US Patentu br: 6548530 i 6281354 i US Patentnoj prijavi br: US 2003/0064984, US 2003/0073852 i US 2003/0050331.

Citotoksini mogu da se konjuguju sa antitelima pronalaska korišćenjem linkerske tehnologije koja je u struci poznata. Primeri vrsta linkera koji se koriste za konjugovanje citotoksina sa antitelima uključuju, ali nisu ovima ograničeni, hidrazone, tioetre, estre, disulfide i linkere koji sadrže peptid. Linker se može tako odabrati da je, na primer, lako otcepljiv pri niskim pH vrednostima u okviru lizozomalnog odeljka ili lako otcepljiv aktivnošću proteaza, kao što su proteaze koje se pre svega ekspresuju u tumorskom tkivu, kao što su katepsini (npr., katepsini B, C, D).

Za dalje razmatranje tipova citotokina, linkera i postupaka za konjugovanje terapeutskih sredstava sa antitelima, vidi takođe: Saito, G. et. al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:99-215; Traii, P.A. et al. (2003) Kancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne; G. (2003) Kancer. Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat Rev Kancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

Antitela ovog pronalaska se, isto tako, mogu konjugovati sa radioaktivnim izotopom da bi se stvorili citotoksični radiofarmaceutici, a takođe se još nazivaju i radioimunokonjugatima. Primeri radioaktivnih izotopa koji se mogu konjugovati sa antitelima za dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu uključuju, ali nisu ovima ograničeni, jod131, indijum111, itrijum90 i tutetijum177. U struci su ustanovljeni postupci za proizvodnju radioimunkonjugata. Primeri radioimunokonjugata koji se mogu kupiti uključuju Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) i Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), a mogu se upotrebiti i slični postupci za proizvodnju radioimunokonjugata korišćenjem antitela pronalaska.

Konjugati antitela pronalaska se mogu koristiti da izmene dati biološki odgovor, a deo koji pripada leku nije za izradu jer je ograničen na klasična hemijska terapeutska sredstva. Na primer, deo koji pripada leku može biti protein ili polipeptid sa željenom biološkom aktivnošću. Takvi proteini mogu obuhvatiti, na primer, enzimski aktivan toksin, ili njegov aktivni deo, kao što je abrin, ricin A, pseudomonas egzotoksin, ili toksin difterije; protein kao što je tumor nekrozis faktor ili interferon-γ; ili, izmenjivače biološkog odgovora kao što su, na primer, limfokini, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), faktor stimulacije granulocitne makrofagne kolonije ("GM-CSF"), faktor stimulacije granulocitne kolonije ("G-CSF"), ili druge faktore rasta.

Tehnike za konjugovanje ovih terapeutskih delova sa antitelima su dobro poznate, vidi, npr., Arnon et al., "Monoclonal Antitela For Immunotargeting Of Drugs In Kancer Therapy", in Monoclonal Antitela And Kancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Ine. 1985); Hellstrom et al., "Antitela For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Ine. 1987); Thorpe, "Antitelima Carriers Of Cytotoxic Agents In Kancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antitela ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antitelima In Kancer Therapy", in Monoclonal Antitela For Kancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antitelima-Toksin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

Farmaceutske smeše

U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje smešu, npr., farmaceutsku smešu, koja sadrži jedno ili kombinaciju monoklonskih antitela ovog pronalaska, ili njihovih antigen-vezujućih delova, koje je formulisano zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Ovakve smeše mogu sadržavati jedno ili kombinaciju {npr., dva ili više različitih) antitela ili imunokonjugata pronalaska. Na primer, farmaceutska smeša pronalaska može sadržavati kombinaciju antitela (ili imunokonjugata) koji se vezuju za različite epitope na ciljnom antigenu ili koji imaju komplementarna dejstva.

Farmaceutske smeše pronalaska, takođe, mogu da se primenjuju u kombinovanoj terapiji, tj., zajedno sa drugim sredstvima. Na primer, kombinovana terapija može obuhvatiti anti-PTK7 antitela ovog pronalaska zajedno sa najmanje jednim drugim anti-inflamatornim ili imunosupresivnim sredstvom. Primeri terapeutskih sredstava koja se mogu koristiti u kombinovanoj terapiji su detaljnije opisana u nastavku, u delu o korišćenju antitela pronalaska.

Kako je ovde korišćen, izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje neki i svaki rastvarač, disperzioni medijum, sredstvo za oblaganje, antibakterijska i antigljivična sredstva, izotona i sredstva koja odlažu apsorpciju i slična, a koja su fiziološki kompatibilna. Poželjno, nosač je pogodan za intravensko, intramuskularno, subkutano, parenteralno, spinalno ili epidermalno primenjivanje (npr., injekciono ili infuziono). U zavisnosti od načina primenjivanja, aktivno jedinjenje, tj., antitelo, imunokonjugat ili bispecifični molekul, može biti obloženo materijalom radi zaštite jedinjenja od dejstva kiseline i drugih prirodnih uslova koji bi mogli jedinjenje inaktivirati.

Farmaceutske smeše pronalaska mogu uključiti jednu ili više farmaceutski prihvatljivih soli. "Farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na so koja zadržava željenu biološku aktivnost matičnog jedinjenja i koja ne ispoljava nikakvo neželjeno toksikološko dejstvo (vidi npr., Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Primeri ovakvih soli uključuju kisele adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli uključuju one koje su izvedene od netoksičnih neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosforasta i slične, kao i od netoksičnih organskih kiselina, kao što su alifatične mono- i di-karboksilne kiseline, fenil-supstituisane alkanske kiseline, hidroksi alkanske kiseline, aromatične-kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline i slične. Bazne adicione soli obuhvataju one koje su izvedene od alkalnih i zemnoalkalnih metala, kao: natrijuma, kalijuma, magnezijuma, kalcijuma i sličnih, kao i od netoksičnih organskih amina, kao: N.N’-dibenziletilendiamina, N-metilglukamina, hloroprokaina, holina, dietanolamina, etilendiamina, prokaina i sličnih.

Farmaceutska smeša pronalaska, isto tako, može uključiti farmaceutski prihvatljiv anti-oksidans. Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanasa obuhvataju: (1) antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što je askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slični; (2) antioksidanse rastvorljive u ulju, kao što su: askorbil palmitat, butilovan hidroksianizol (BHA), butilovan hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol i slični; i (3) sredstva koja heliraju metale, kao limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slična.

Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim smešama pronalaska uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i si.), kao i njihove prikladne mešavine, biljna ulja, kao maslinovo ulje i, injektabilne organske estre, kao što je etil oleat. Odgovarajuća protočnost se može održavati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem zahtevane veličine čestica u slučaju disperzija, kao i upotrebom površinski aktivnih materija.

Ove smeše mogu, takođe, sadržavati adjuvanse, kao konzervanse, sredstva za vlaženje, sredstva za emulgovanje i sredstva za dispergovanje. Sprečavanje prisustva mikroorganizama se može osigurati i procedurama sterilizacije, supra,i uvođenjem različitih antibakterijskih i antigljivičnih sredstava, na primer, parabena, hlorobutanola, fenol sorbinske kiseline i sličnih. U smeše, takođe, može biti povoljno uvesti sredstva za izotonost, kao što su šećeri, natrijum hlorid i slična. Osim ovoga, produžena apsorpcija kod injektabilnih farmaceutskih oblika može da se postigne uvođenjem sredstava koja odlažu apsorpciju, kao što je aluminijum monostearat i želatin.

Farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju sterilne vodene rastvore ili disperzije ili sterilne praškove za extempore izradu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Upotreba ovakvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je poznata u struci. Izuzev kada je neki konvencionalni medijum ili sredstvo inkompatibilno sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njihovo korišćenje za izradu farmaceutskih smeša pronalaska. U smeše se, takođe, mogu ugraditi dodatna aktivna jedinjenja.

Terapeutske smeše obično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i čuvanja. Smeša se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga određena struktura pogodna za visoke koncentracije leka. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično), kao i njihove prikladne mešavine. Odgovarajuća protočnost se može održavati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem zahtevane veličine čestica u slučaju disperzija, kao i upotrebom površinski aktivnih materija. U mnogim slučajevima, biće poželjno u smešu uključiti sredstva za izotonost, na primer, šećeri, polialkoholi kao što su manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija kod injektabilnih smeša može da se postigne uvođenjem sredstava koja odlažu apsorpciju, kao što su soli monostearata i želatin.

Sterilni injektabilni rastvori se mogu proizvesti ugradnjom aktivnog jedinjenja u neophodnu količinu odgovarajućeg rastvarača sa jednim ili kombinacijom gore pobrojanih sastojaka, kako se zahteva, a zatim, sterilizacijom mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se proizvode inkorporacijom aktivnog jedinjenja u sterilni vehikulum koji sadrži bazni disperzioni medijum i neophodne druge sastojke od onih koji su prethodno nabrojani. U slučaju sterilnih praškova za izradu sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni postupak izrade je vakuumsko sušenje i sušenje smrzavanjem (liofilizacija) na koji način se dobija aktivni sastojak u vidu praška sa ma kojim dodatnim neophodnim sastojkom iz njihovih rastvora koji su prethodno sterilisani filtracijom.

Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa nosećim materijalom za proizvodnju jednog doznog oblika će varirati u zavisnosti od ispitanika kog treba lečiti, kao i određenog načina primenjivanja. Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa nosećim materijalom za proizvodnju jednog doznog oblika će generalno biti ona količina smeše koja proizvodi terapeutski efekat. Generalno, od sto procenata, ova količina će biti u opsegu od oko 0.01 procenta do otprilike devedeset devet procenata aktivnog sastojka, poželjno od oko 0.1 procenta do otprilike 70 procenata, najbolje od otprilike 1 procenta do otprilike 30 procenata aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Režimi doziranja su podešeni tako da obezbede optimum željenog odgovora (npr., terapeutski odgovor). Na primer, može da se primeni jedan bolus, može se primeniti nekoliko podeljenih doza tokom vremena ili doza može proporcionalno biti smanjena ili povećana što će odrediti razvoj terapeutske situacije. Posebno je korisno formulisati parenteralne smeše u jediničnom doznom obliku za lako primenjivanje i ujednačeno doziranje. Jedinični dozni oblik, kako je ovde korišćen, označava fizički podeljene jedinice prilagođene pojedinačnom doziranju za ispitanike koji se leće; svaka jedinica sadrži prethodno odmereno aktivno jedinjenje preračunato da proizvede željeni terapeutski efekat u kombinaciji sa neophodnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija za jedinične dozne oblike pronalaska je diktirana i direktno zavisi od: (a) jedinstvenih osobina aktivnog jedinjenja i naročitog terapeutskog efekta kog treba postići i, (b) ograničenja koja su bitna za tehniku sjedinjavanja kao aktivno jedinjenje za lečenje preosetljivosti kod pojedinaca.

Za primenjivanje antitela, doza se kreće od oko 0.0001 do 100 mg/kg, a češće od 0.01 do 5 mg/kg, telesne težine domaćina. Na primer, doze mogu biti 0.3 mg/kg telesne težine, I mg/kg telesne težine, 3 mg/kg telesne težine, 5 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine ili u opsegu od 1-10 mg/kg. Režim tretmana obuhvata na primer primenjivanje jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom svake četiri nedelje, jednom mesečno, jednom svaka 3 meseca ili jednom svaka tri do 6 meseci. Poželjni režimi doziranja za anti-PTK7 antitela pronalaska obuhvataju 1 mg/kg telesne težine ili 3 mg/kg telesne težine putem intravenskog primenjivanja, sa antitelima koja su data korišćenjem jednog od sledećih profila doziranja: (i) svake četiri nedelje za šest doziranja, zatim svaka tri meseca; (ii) svake tri nedelje; (iii) 3 mg/kg telesne težine jednom a zatim, 1 mg/kg telesne težine svake tri nedelje.

U nekim postupcima, istovremeno se primenjuju dva ili više monoklonskih antitela sa različitim specifičnostima vezivanja, u kom slučaju je doza svakog primenjenog antitela manja u odnosu na naznačeni opseg. Antitela se uobičajeno primenjuju za višestruke okolnosti. Intervali između pojedinačnog doziranja mogu biti, na primer, nedeljni, mesečni, svaka tri meseca ili godišnji. Intervali mogu, isto tako, biti iregularni ukoliko se tako odredi na osnovu merenja nivoa antitela u krvi za ciljni antigen za pacijenta. U nekim postupcima, doziranje se podešava kako bi se postigla plazmatska koncentracija antitela od otprilike 1-1000 mg/ml a u nekim postupcima oko 25-300 mg/ml.

Alternativno, antitela se mogu primeniti u vidu formulacije sa produženim oslobađanjem, u kom slučaju je potrebno rede primenjivanje. Doza i učestalost variraju u zavisnosti od polu-života antitela u pacijentu. Uopšteno, humana antitela imaju najduži polu-život, zatim slede humanizovana antitela, himerična antitela i ne-humana antitela. Doza i učestalost primenjivanja mogu varirati u zavisnosti od toga da li je tretman profilaktički ili terapeutski. U profilaktičkim primenjivanjima, primenjuju se relativno niske doze u relativno ne-frekventnim intervalima tokom dužeg vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju da primaju tretman do kraja svojih života. U terapeutskim primenjivanjima, ponekad se zahtevaju relativno visoke doze u relativno kratkim intervalima dok se ne smanji progresija bolesti ili bolest okonča, a poželjno dok pacijent ne pokaže delimično ili potpuno poboljšanje simptoma bolesti. Posle toga, pacijentu se može primeniti profilaktički režim.

Aktuelni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim smešama ovog pronalaska mogu tako varirati da se dobije količina aktivnog sastojka koja je delotvorna u postizanju željenog terapeutskog odgovora za naročitog pacijenta, smešu i način primenjivanja, a da nije toksična za pacijenta. Izabrani dozni nivo će zavisiti od raznovrsnih farmakokinetičkih faktora uključujući aktivnost naročitih smeša ovog pronalaska koje će se upotrebiti, ili njihovih estara, soli ili amida, načina primene, vremena primenjivanja; brzine izlučivanja naročitog jedinjenja koje se koristi, trajanja lečenja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste zajedno sa upotrebljenim naročitim smešama, starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravlja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči, kao i sličnih faktora dobro poznatih medicinskim stručnjacima.

"Terapeutski efektivna doza" anti-PTK7 antitela pronalaska poželjno dovodi do pada težine simptoma bolesti, porasta učestalosti i trajanja perioda bez simptoma bolesti, ili prevencije oštećenja ili onesposobljenosti kao posledice bolesti. Na primer, za lečenje tumora, "terapeutski efektivna doza" poželjno inhibira ćelijski rast ili rast tumora za najmanje oko 20%, još bolje za njamnje oko 40%, čak još poželjnije za najmanje oko 60%, a još bolje za najmanje oko 80% u odnosu na nelečene ispitanike. Sposobnost jedinjenja da inhibira rast tumora može da se ispita sistemom modela na životinjama koji je prediktivan za efikasnost kod humanih tumora. Alternativno, ovo svojstvo smeše se može odrediti ispitivanjem mogućnosti jedinjenja da inhibira, takva inhibicija in vitro pomoću testova poznatih iskusnim stručnim licima. Terapeutski efektivna količina terapeutskog jedinjenja može smanjiti veličinu tumora, ili na drugi način ublažiti simptome kod ispitanika. Stručno lice će biti u mogućnosti da odredi takve količine na osnovu takvih faktora kao što su veličina ispitanika, težina simptoma kod ispitanika i naročito smeša ili izabrani način primenjivanja.

Smeša ovog pronalaska se može primeniti putem jednog ili više načina primenjivanja korišćenjem jednog ili više raznovrsnih postupaka poznatih u struci. Kao što će stručno lice shvatiti, način i/ili put primenjivanja će varirati u zavisnosti od željenih rezultata. Poželjni putevi primenjivanja za antitela pronalaska obuhvataju: intravenski, intramuskularni, intradermalni, intraperitonealni, subkutani, spinalni ili druge parenteralne načine primenjivanja, na primer injekcijom ili infuzijom. Fraza "parenteralno primenjivanje", kako je ovde korišćena, označava način primenjivanja koji nije enteralni niti površinski, a obično se izvodi injekciono, i uključuje, bez ograničavanja, intravenski, intramuskularni, intraarterijalni, intratekalni, intrakapsularni, intraorbitalni, intrakardijačni, intradermalni, intraperitonealni, transtrahealni, subkutani, subkutikularni, intraartikularni, subkapsularni, subarahnoidni, intraspinalni, epiduralni i intrasternalni način pomoću injekcije ili infuzije.

Alternativno, antitela pronalaska mogu da se primenjuju ne-parenteralnim načinom, kao što je površinski, epidermalni ili mukozalni način primenjivanja, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rectalno, sublingualno ili površinski.

Aktivna jedinjenja se mogu pripremiti sa nosačima koji će ih štititi od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere i mikroinkapsulirane sisteme za oslobađanje. Mogu se korstiti biodegradabilni, biokompatibilni polimeri, kao što su: etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktat. Mnogi postupci za izradu ovakvih formulacija su patentirani ili generalno poznati u struci. Vidi, npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Ine., New York, 1978.

Terapeutske smeše se mogu primeniti pomoću u struci poznatih medicinskih uređaja. Na primer, u poželjnom ostvarenju, terapeutska smeša pronalaska može da se primeni pomoću hipodermičkih injekcionih uređaja bez igala, kao što su uređaji izloženi u U.S. Patentima br. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implanata i modula korisnih za ovaj pronalazak obuhvataju: U.S. Patent No. 4,487,603, koji opisuje implantabilnu mikro-infuzionu pumpu za dispenziju leka sa kontrolisanom brzinom; U.S. Patent No. 4,486,194, koji opisuje terapeutski uređaj za primenjivanje lekova kroz kožu; U.S. Patent No. 4,447,233, koji opisuje infuzionu pumpu lekova za oslobađanje leka pri preciznoj brzini infuzije; U.S. Patent No. 4,447,224, koji opisuje infuzioni aparat promenljivog protoka koji se može implantirati za kontinuirano oslobađanje leka; U.S. Patent No. 4,439,196, koji opisuje osmotski sistem za oslobađanje leka koji ima odeljke sa više pregrada; i U.S. Patent No. 4,475,196, koji opisuje osmotski sistem za oslobađanje leka. U struci su poznati i mnogi drugi takvi implanti, sistemi za oslobađanje i moduli.

U nekim ostvarenjima, humana monoklonska antitela pronalaska mogu biti formulisana da osiguraju ispravnu raspodelu in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera (BBB) isključuje brojna visoko hidrofilna jedinjenja. Da bi se osiguralo da terapeutska jedinjenja pronalaska prolaze kroz BBB (ukoliko je potrebno), mogu biti formulisana, na primer, u lipozomima. Za postupke za proizvodnju lipozoma, vidi, npr., U.S. Patente 4,522,811; 5,374,548; i 5,399,331. Lipozomi mogu imati jedan ili više delova koji se selektivno transportuju u specifične ćelije ili organe, čime povećavaju oslobađanje targetovanog leka (see, e.g., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Primeri funkcionalnih grupa za targetovanje uključuju: folat ili biotin (vidi, npr., U.S. Patent 5,416,016 to Low et al.); manozidi (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); antitela (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor surfaktantnog proteina A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); vidi, takođe: K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler(1994) Immunomethods 4:273.

Upotrebe i postupci pronalaska

Antitela, smeše antitela i postupci ovog pronalaska daju brojne in vitro i in vivo dijagnostičke i terapeutske koristi, uključujući dijagnostikovanje i lečenje PTK7 posredovanih poremećaja. Antitela ovog pronalaska su humana antitela. Na primer, ovi molekuli se mogu primeniti na ćelije u kulturi, in vitro ili ex vivo, ili na ljude ispitanike, npr., in vivo, radi lečenja, prevencije ili dijagnostikovanja različitih poremećaja. Kako je ovde korišćen, izraz "ispitanik" treba da uključi i čoveka i životinje. Životinje obuhvataju sve vertebrate, npr., sisare i ne-sisare, kao što su primati koji ne pripadaju čoveku, ovce, psi, mačke, konji, krave, kokoške, amfibije, reptili. Poželjni ispitanici obuhvataju pacijente čoveka koji imaju poremećaje posredovane aktivnošću PTK7. Postupci su posebno pogodni za lečenje ljudi pacijenata koji pate od poremećaja koji su povezani sa nenormalnom ekspresijom PTK7. Kada se antitela prema PTK7 primene zajedno sa drugim sredstvom, mogu da se primenjuju jedno za drugim ili istovremeno.

Uz specifičnost vezivanja antitela pronalaska za PTK7, antitela pronalaska se mogu koristiti za specifično otkrivanje PTK7 ekspresije na površini ćelija i, osim toga, mogu se koristiti za prečišćavanje PTK7 putem imunoafinitetnog prečišćavanja.

Pronalazak dalje obezbeđuje postupke za otkrivanje prisustva humanog PTK7 antigena u uzorku, ili merenje količine humanog PTK7 antigena, što podrazumeva kontakt uzorka, kao i kontrolnog uzorka, sa humanim monoklonskim antitelom, ili njegovim antigen vezujućim delom, koji se specifično vezuju za humanu PTK7, u uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela ili njihovog dela i humane PTK7. Formirani kompleksi se zatim detektuju, pri čemu razlika u formiranju kompleksa između uzorka i u poređenju sa kontrolnim uzorkom ukazuje na prisustvo humanog PTK7 antigena u uzorku.

PTK7 se ekspresuje u ćelijskim linijama poreklom od karcinoma kolona ali nije nađeno da se ekspresuje u tkivima kolona odraslih ljudi (Mossie et al. (1995) Oncogene 11:2179-84). PTK7 ekspresija se, isto tako, viđa u nekim ćelijskim linijama melanoma i biopsijama melanoma (Easty, et al. (1997) Int. J. Kancer 71:1061-5). Sem toga, nađeno je da je PTK7 visoko prekomerno ekspresovana u uzorcima akutne mijeloidne leukemije (Muller-Tidow et al., (2004) Clin. Kancer Res. 10:1241-9). Anti-PTK7 antitela mogu da se koriste sama za inhibiciju rasta kanceroznih tumora. Alternativno, anti-PTK7 antitela mogu da se koriste zajedno sa drugim imunogenim sredstvima, standardnim tretmanima kancera ili drugim antitelima, kako je opisano u nastavku.

Kanceri čiji rast može biti inhibisan upotrebom antitela pronalaska uključuju kancere koji obično odgovaraju na imunoterapiju. Primeri kancera, koji nemaju cilj ograničavanja, koji se mogu tretirati uključuju kancer kolona (uključujući kancer tankog creva), kancer pluća, kancer dojke, kancer pankreasa, melanom (npr., metastatski maligni melanom), akutna mijeloidna leukemija, kancer bubrega, kancer mokraćne bešike, kancer jajnika ili kancer prostate. Primeri drugih kancera koji se mogu tretirati upotrebom postupaka pronalaska uključuju: kancer bubrega (npr., karcinom bubrežnih ćelija), glioblastom, tumore mozga, hronične ili akutne leukemije koje uključuju akutnu limfocitnu leukemiju (ALL), adultnu leukemiju T-ćelija (T-ALL), hroničnu mijeloidnu leukemiju, akutnu limfoblastnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, limfome (npr., Hodgkinov i ne-Hodgkinov limfom, limfocitni limfom, primarni CNS limfom, limfom T-ćelija, Burkittov limfom, limfomi anaplastičnih velikih ćelija (ALCL), kožni limfomi T-ćelija, limfomi nodularnih malih otcepljujućih ćelija, periferni limfomi T-ćelija, Lennertov limfom, imunoblastni limfom, leukemija T-ćelija/limfom (ATLL), entroblastno/centrocitno (cb/cc) folikularni limfomski kanceri, limfomi difuznih velikih ćelija B loze, limfom T-ćelija sličan angioimunoblastnoj limfadenopatiji (AILD) i limfomi na bazi telesnih šupljina udruženi sa HlV-om), embrionalne karcinome, nediferentovane karcinome rino-farinksa (e.g., Schminckeov tumor), Castlemanovu bolest, Kaposijev sarkom, multipli mijelom, Waldenstromovu makroglobulinemiju i druge limfome B-ćelija, nazofarangealne karcinome, kancer kostiju, kancer kože, kancer glave ili vrata, kožne ili intraokularne maligne melanome, kancer materice, rektalni kancer, kancer analne regije, kancer želuca, kancer testisa, kancer materice, karcinom fallopian tuba, karcinom endometriuma, karcinom cerviksa, karcinom vagine, karcinom vulve, kancer ezofagusa, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer tiroidne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer adrenalne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, solidne tumore u detinjstvu, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega ili uretera, karcinom bubrežne karlice, neoplazmu centralnog nervnog sistema (CNS), tumorske angiogeneze, tumor kičmene moždine, stem gliom mozga, pituitarni adenom, epidermoidni kancer, kancer skvamoznih ćelija, kancere kao posledice okruženja, uključujući one podstaknute azbestozom, npr., mezoteliom i kombinacije navedenih kancera.

Sem toga, sa ekspresijom PTK7 na raznim tumorskim ćelijama, humana antitela, smeše antitela i postupci ovog pronalaska mogu da se koriste za lečenje ispitanika sa tumorogenim poremećajem, npr., poremećajem koji se karakteriše prisustvom ekspresije PTK7 na ćelijama tumora uključujući, na primer, kancer kolona (uključujući kancer tankog creva), melanom (npr., metastatski maligni melanom), akutnu mijeloidna leukemiju, kancer pluća, kancer dojke, kancer mokraćne bešike, kancer pankreasa, kancer jajnika ili kancer prostate. Primeri drugih ispitanika sa tumorogenim poremećajem uključuju ispitanike koji imaju: kancer bubrega (npr., karcinom bubrežnih ćelija), glioblastom, tumore mozga, hronične ili akutne leukemije koje uključuju akutnu limfocitnu leukemiju (ALL), adultnu leukemiju T-ćelija (T-ALL), hroničnu mijeloidnu leukemiju, akutnu limfoblastnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, limfome (npr., Hodgkinov i ne-Hodgkinov limfom, limfocitni limfom, primarni CNS limfom, limfom T-ćelija, Burkittov limfom, limfomi anaplastičnih velikih ćelija (ALCL), kožni limfomi T-ćelija, limfomi nodularnih malih otcepljujućih ćelija, periferni limfomi T-ćelija, Lennertov limfom, imunoblastni limfom, leukemija T-ćelija/limfom (ATLL), entroblastno/centrocitno (cb/cc) folikularni limfomski kanceri, limfomi difuznih velikih ćelija B loze, limfom T-ćelija sličan angioimunoblastnoj limfadenopatiji (AILD) i limfomi na bazi telesnih šupljina udruženi sa HlV-om), embrionalne karcinome, nediferentovane karcinome rino-farinksa (e.g., Schminckeov tumor), Castlemanovu bolest, Kaposijev sarkom, multipli mijelom, Waldenstromovu makroglobulinemiju i druge limfome B-ćelija, nazofarangealne karcinome, kancer kostiju, kancer kože, kancer glave ili vrata, kožne ili intraokularne maligne melanome, kancer materice, rektalni kancer, kancer analne regije, kancer želuca, kancer testisa, kancer materice, karcinom fallopian tuba, karcinom endometriuma, karcinom cerviksa, karcinom vagine, karcinom vulve, kancer ezofagusa, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer tiroidne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer adrenalne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, solidne tumore u detinjstvu, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega ili uretera, karcinom bubrežne karlice, neoplazmu centralnog nervnog sistema (CNS), tumorske angiogeneze, tumor kičmene moždine, stem gliom mozga, pituitarni adenom, epidermoidni kancer, kancer skvamoznih ćelija, kancere kao posledice okruženja, uključujući one podstaknute azbestozom, npr., mezoteliom i kombinacije navedenih kancera.

Prema tome, u jednom ostvarenju, pronalazak obezbeđuje antitela pronalaska ili njihov antigen vezujući deo za korišćenje u postupku inhibisanja rasta tumorskih ćelije kod ispitanika, navedeni postupak obuhvata primenjivanje ispitaniku terapeutski efektivne količine navedenih antitela ili njihovog antigen vezujućeg dela.

Antitela (npr., humana monoklonska antitela i smeše) pronalaska mogu da se upotrebe za detektovanje nivoa PTK7 ili nivoa ćelija koje sadrže PTK7 na površini svojih membrana, pri čemu se zatim ti nivoi mogu povezati sa simptomima nekih bolesti. Alternativno, antitela se mogu koristiti za inhibisanje ili blokiranje PTK7 funkcije koja, opet, može da se poveže sa sprečavanjem ili poboljšanjem simptoma nekih bolesti, na koji način se ukazuje daje PTK7 medijator bolesti. Ovo se postiže dovođenjem u kontakt oglednog uzorka i kontrolnog uzorka sa anti-PTK7 antitelima u uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela i PTK7. Svi kompleksi koji se obrazuju između antitela i PTK7 se detektuju i upoređuju u oglednim uzorcima i u kontroli.

Antitela (npr., humana antitela i smeše) pronalaska mogu inicijalno biti testirani na afinitet vezivanja koji je u vezi sa terapeutskim ili dijagnostičkim korišćenjem in vitro. Na primer, smeše pronalaska se mogu ispitati upotrebom testova protočne citometrije koji su opisani u Primerima, u nastavku.

Antitela (npr., humana antitela, imunokonjugati i smeše) pronalaska se mogu sem toga koristiti u terapiji i dijagnozi PTK7-povezanih bolesti. Na primer, humana monoklonska antitela i imunokonjugati mogu da se upotrebe za izazivanje in vivo ili in vitro jedne ili više od sledećih bioloških aktivnosti: inhibisanje rasta i/ili ubijanje ćelija koje ekspresuju PTK7; posredovanje u fagocitozi ili ADCC ćelija koje ekspresuju PTK7 u prisustvu humanih efektornih ćelija; ili blokiranje vezivanja PTK7 liganda za PTK7.

Antitela (npr., humana antitela i smeše) mogu da se upotrebe in vivo za lečenje, prevenciju ili dijagnostikovanje brojnih bolesti koje su povezane sa PTK7. Primeri bolesti koje su povezane sa PTK7 uključuju, između ostalih, kancer kolona (uključiv kancer tankog creva), melanom (npr., metastatski maligni melanom), akutnu mijeloidnu leukemiju, kancer pluća, kancer dojke, kancer mokraćne bešike, pankreasni kancer, kancer jajnika i kancer prostate.

Pogodni putevi primenjivanja smeša antitela (npr., humana monoklonska antitela i imunokonjugati) pronalaska in vivo i in vitro dobro su poznati u struci i stručna lica ih mogu lako odabrati. Na primer, smeše antitela se mogu primeniti injekciono (npr., intravenozno ili subkutano). Pogodna doza upotrebljenih molekula će zavisiti od starosti i težine ispitanika i koncentracije i/ili formulacije smeše antitela.

Kako je prethodno opisano, humana anti-PTK7 antitela pronalaska mogu biti zajedno primenjena sa jednim ili više terapeutskih sredstava, npr., citotoksičnim sredstvom, radiotoksičnim sredstvom ili imunosupresivnim sredstvom. Antitela se mogu povezati sa sredstvom (u vidu imunokompleksa) ili mogu biti primenjena zasebno od sredstva. U ovom drugom slučaju (zasebno primenjivanje), antitela se mogu primeniti pre, posle ili istovremeno sa sredstvom ili mogu biti propisani za primenjivanje zajedno sa drugim poznatim terapijama, npr., anti-kancerska terapija, npr., zračenje. Takva terapeutska sredstva uključuju, između ostalih, anti-neoplastiična sredstva kao što su doksorubicin (adriamicin), cisplatin bleomicin sulfat, karmustin, hlorambucil i ciklofosfamid hidroksiufea koji su, sami, jedino aeloivorni u nivoima koji su toksični ili subtoksični za pacijenta. Cisplatin se intravenski primenjuje kao 100 mg/doza jednom svake četiri nedelje i adriamicin se intravenski primenjuje kao 60-75 mg/ml doza jednom svakih 21 dan. Primenjivanje humanih anti-PTK7 antitela ovog pronalaska ili njihovih antigen vezujućih fragmenata, zajedno sa hemoterapeuticima obezbeđuje dva anti-kancerska sredstva koji deluju putem različitih mehanizama što proizvodi citotoksični efekat na humane tumorske ćelije. Ovakvo zajedničko primenjivanje može rešiti probleme koji nastaju zbog razvoja rezistencije na lekove ili izmene antigenosti tumorskih ćelija što dovodi do njihove nereaktivnosti sa antitelima.

U jednom ostvarenju, imunokonjugati pronalaska se mogu koristiti za obeležavanje jedinjenja (npr., terapeutska sredstva, obeleživači, citotoksini, radiotoksini imunosupresivi i td.) za ćelije koje imaju na ćelijskoj površini receptore za PTK7 povezivanjem takvih jedinjenja sa antitelima. Na primer, anti-PTK7 antitela mogu biti konjugovana sa ma kojim od jedinjenja toksina koji su opisani u US Patentima No. 6,281,354 i 6,548,530, US patentnoj publikaciji No. 20030050331, 20030064984, 20030073852 i 20040087497 ili publikovani u WO 03/022806. Tako, pronalazak, isto tako, obezbeđuje postupke za lokalizovanje ex vivo ili in vivo ćelija koje ekspresuju PTK7 {npr., sa detektabilnim obeleživačem, kao što je radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim ili enzmski ko-faktor). Alternativno, imunokonjugati mogu da se koriste za ubijanje ćelija koje imaju PTK7 receptore na površini ćelija ciljanjem citotoksina ili radiotoksina na PTK7.

Ciljno-specifične efektorne ćelije, npr., efektorne ćelije povezane sa smešama {npr., humana antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) pronalaska, isto tako, mogu da se koriste kao terapeutska sredstva. Efektorne ćelije za targetiranje mogu biti humani leukociti, kao što su makrofagi, neutrofili ili monociti. Druge ćelije uključuju eozinofile, prirodne ćelije ubice i druge ćelije koje nose IgG- ili IgA-receptor. Ukoliko se želi, efektorne ćelije se mogu dobiti od ispitanika kog treba lečiti. Ciljno-specifične efektorne ćelije se mogu primeniti u vidu suspenzije ćelija u fiziološki prihvatljivom rastvoru. Broj primenjenih ćelija može biti veličine od 108-109 ali će varirati u zavisnosti od terapeutske svrhe. Uopšteno, količina će biti dovoljna da se postigne lokalizacija na ciljnoj ćeliji, npr., tumorskoj ćeliji koja ekspresuje PTK7 i time dovede do ćelijskog ubijanja, npr., fagocitozom. Način primene, takođe, može da varira.

Terapija sa ciljno-specifičnim efektornim ćelijama može da se izvede zajedno sa drugim tehnikama uklanjanja ciljnih ćelija. Na primer, anti-tumorska terapija koja koristi smeše (npr., humana antitela) pronalaska i/ili efektorne ćelije naoružane sa ovim smešama mogu da se koriste paralelno sa hemoterapijom. Sem toga, može se koristiti kombinovana imunoterapija da usmeri dve različite citotoksične efektorske populacije u pravcu odbacivanja tumorskih ćelija. Na primer, anti-PTK7 antitela povezana sa anti-Fc-gamma Rl ili anti-CD3 mogu da se koriste zajedno sa IgG- ili IgA-receptor specifičnim vezujućim sredstvima.

Smeše (npr., humana antitela i imunokonjugati) pronalaska koje imaju komplement vezujuće položaje, kao što su delovi od lgG1, -2 ili -3 ili IgM koji vezuje komplement, mogu, isto tako, da se koriste u prisustvu komplementa. U jednom ostvarenju, ex vivo tretman populacije ćelija koje su obuhvatale ciljne ćelije sa vezujućim sredstvom pronalaska i odgovarajućim efektornim ćelijama može biti obogaćen dodatkom komplementa ili seruma koji sadrži komplement. Fagocitoza ciljnih ćelija obloženih sa vezujućim sredstvom pronalaska može se poboljšati vezivanjem proteina komplementa. U drugom ostvarenju, ciljne ćelije obložene sa smešama (npr., humana antitela) pronalaska, takođe mogu biti lizirane pomoću komplementa. U još jednom ostvarenju, smeše pronalaska ne aktiviraju komplement.

Smeše (npr., humana antitela i imunokonjugati) pronalaska mogu, isto tako, da se primene zajedno sa komplementom. Prema tome, u okviru pronalaska su i smeše koje sadrže humana antitela i serum ili komplement. Ovakve smeše imju prednosti jer se komplement nalazi neposredno uz humana antitela. Alternativno, humana antitela pronalaska i komplement ili serum mogu zasebno da se primenjuju.

Prema tome, pacijenti koji se leće sa smešama antitela pronalaska mogu dodatno primiti (pre, istovremeno ili posle primene humanih antitela pronalaska) drugo terapeutsko sredstvo, kao što je citotoksično ili radiotoksično sredstvo, koje uvećava ili poboljšava terapeutsko dejstvo humanih antitela.

U drugim ostvarenjima, ispitanici mogu dodatno biti lečeni sa sredstvom koje menja, npr., uvećava ili inhibira, ekspresiju ili aktivnost Fcγ ili Fcγ receptora putem, na primer, lečenja ispitanika sa citokinom. Poželjni citokini za primenjivanje tokom lečenja sa multispecifičnim molekulom obuhvataju: faktor stimulacije granulocitne kolonije (G-CSF), faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ) i faktor nekroze tumora (TNF).

Smeše (npr., humana antitela) pronalaska mogu, isto tako, da se koriste za ciljanje ćelija koje ekspresuju FcγR ili PTK7, na primer za obeležavanje takvih ćelija. Za ovakvu upotrebu, vezujuće sredstvo može biti povezano sa molekulom koji se može detektovati. Tako, pronalazak obezbeđuje postupke za lokalizaciju ex vivo ili in vitro ćelija koje ekspresuju Fc receptore, kao što su FcγR ili PTK7. Detektibilni obeleživač može biti, npr., radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim ili enzimski kofaktor.

Ovaj pronalazak, isto tako, obuhvata komplete koji sadrže smeše antitela pronalaska (npr., humana antitela ili imunokonjugate) i uputstva za korišćenje. Komplet dalje može sadržavati jedan ili više dodatnih reagenasa, kao što je imunosupresivni reagens, citotoksično sredstvo ili radiotoksično sredstvo ili jedno ili više dodatnih humanih antitela pronalaska (npr., humana antitela koja imaju komplementarnu aktivnost koja se vezuju za epitop na PTK7 antigenu različit od prvih humanih antitela). Kompleti uobičajeno sadrže signaturu na kojoj je naznačena namena sadržaja kompleta. Izraz signatura obuhvata svaki zapis ili snimljeni materijal kojim je komplet snabdeven na ili unutar kompleta, ili pridružen kompletu na neki drugi način.

Ovaj pronalazak je dalje ilustrovan primerima u nastavku koje ne treba uzimati kao neko dalje ograničenje.

Primeri

Primer 1: Stvaranje humanih monoklonskih antitela protiv PTK7

Antigen

Protokoli imunizacije kao antigen koriste i (i) rekombinantni fuzioni protein kojeg čini ekstracelularni deo PTK7 sa oba i, myc i his, tag-a i, (ii) membranski vezan PTK7 u punoj dužini. Oba antigena su proizvedena rekombinantnim transfekcionim postupcima na CHO ćelijskoj liniji.

Kompletna humana monoklonska antitela prema PTK7 su proizvedena korišćenjem HCo7 i HCo12 sojeva HuMab transgenskih miševa i KM soja transgenskih transhromozomnih miševa, od kojih svaki ekspresuje gene humanih antitela. U svakom od ovih mišijih sojeva, gen endogenog mišijeg kappa lakog lanca je homozigotno prekinut na način kako je opisao Chen i saradnici (1993) u: EMBO J. 12:811-820, a gen endogenog mišijeg teškog lanca homozigotno prekinut na način, opisan u Primeru 1 u patentu: PCT Publication WO 01/09187. Svaki od ovih mišijih sojeva nosi transgen humanog kappa lakog lanca, KCo5, kako je opisao Fishwild i saradnici (1996) u: Nature Biotechnology 14:845-851. HCo7 soj nosi transgen HCo7 humanog teškog lanca, kako je opisano u patentu: U.S. Patent brojevi: 5, 770, 429; 5,545,806; 5,625,825; i 5,545,807. HCo12 soj nosi transgen HCo12 humanog teškog lanca, kako je opisano u Primeru 2 u: WO 01/09187 ili Pprimeru 2 u: WO 01/14424. KM soj sadrži SC20 transhromozom kao što je opisano u patentu: PCT Publication WO 02/43478.

HuMab i KM imunizacije:

Da bi se proizvela kompletna humana monoklonska antitela prema PTK7, imunizuju se HuMab miševi i KM miševi™ sa prečišćenim rekombinantnim PTK7 fuzionim proteinom i PTK7-transfektovanim CHO ćelijama kao antigenom. Opšte šeme imunizacije za HuMab miševe su opisane u: Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, kao i u: PCT Publication WO 98/24884. Tokom prve infuzije antigena, miševi su bili između 6-16 nedelja starosti. Korišćeni su prečišćeni rekombinantni preparat (5-50 ptg) PTK7 fuzionog proteinskog antigena i 5-10x106 ćelija za imunizaciju HuMab miševa i KM miševa™ intraperitonealno, subkutano (Sc) ili putem injekcije u šapicu.

Transgenski miševi su imunizovani dva puta sa antigenom u kompletnom Freundovom adjuvansu ili Ribi adjuvansu IP, a zatim 3-21 dana IP (do ukupno 11 imunizacija) sa antigenom u nekompletnom Freundovom ili Ribi adjuvansu. Imuni odgovor je praćen retroorbitalnim krvarenjima. Plazma je skrinirana tehnikom ELISA (kako je opisano u nastavku), a miševi koji su imali dovoljni titar anti-PTK7 humanog imunogolobulina su korišćeni za spajanja. Miševi su intravenski podstaknuti sa antigenom, 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine. Obično se izvodi 10-35 spajanja za svaki antigen. Nekoliko desetina miševa je imunizovano za svaki antigen.

Za izbor HuMab ili KM miševa™ koji produkuju antitela koja vezuju PTK7, ispituje se serum imunizovanih miševa ELISA testom na način kako je opisao Fishwild, D. i saradnici. (1996). Ukratko, mikrotitarske ploče se oblažu sa prečišćenim rekombinantnim PTK7 fuzionim proteinom iz transfektovanih CHO ćelija pri 1-2 µg/ml u PBS, 100 nl/reakcionom mestu se inkubira na 4°C preko noći i zatim blokira sa 200 pl po reakcionom mestu 5%-tnog fetalnog goveđeg seruma u PBS/Tween (0.05%). Razblaženja seruma PTK7-imunizovanih miševa se dodaju u svako reakciono mesto i inkubiraju u toku 1-2 sata na temperaturi sredine. Ove ploče se isperu sa mešavinom PBS/Tween i zatim inkubiraju sa kozijim-anti-humanim IgG poliklonskim antitelima konjugovanim sa “horseradish” peroksidazom (HRP) u toku 1 sata na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, ploče se razvijaju sa ABTS substratom (Sigma, A-1888, 0.22 mg/ml) i analiziraju spektrofotometrijski na OD 415-495. Miševi koji su postigli najviše titre anti-PTK7 antitela su korišćeni za spajanja. Spajanja su izvedena na dole opisani način i ispitani su supernatanti hibridoma na anti-PTK7 aktivnost pomoću ELISA tehnike.

Stvaranje hibridoma koji proizvode humana monoklonska antitela prema PTK7:

Mišiji splenociti, izolovani iz HuMab miševa, fuzionisani su sa PEG na mišiju mijeloma ćelijsku liniju u skladu sa standardnim protokolima. Dobijeni hibridomi su onda ispitani na proizvodnju antigen-specifičnih antitela. Suspenzije pojedinačnih ćelija splenocita imunizovanih miševa su fuzionisane na jednu četvrtinu broja SP2/0 ne-sekretujućih mišijih mijeloma ćelija (ATCC, CRL 1581) sa 50% PEG (Sigma). Ćelije su postavljene u ploče, otprilike 1x105/reakcionom mestu u mikrotitarskim pločama sa ravnim dnom, posle čega sledi oko dve nedelje inkubacije u selektivnom medijumu koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, 10%.P388D1 (ATCC, CRL TIB-63) kondicioniranog medijuma, 3-5% origen (IGEN) u DMEM (Mediatech, CRL 10013, sa visokom glukozom, L-glutaminom i natrijum piruvatom) plus 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-merkaptoetanola, 50 mg/ml gentamicina i 1x HAT (Sigma, CRL P-7185). Posle 1-2 nedelje, ćelije su uzgajane u medijumu u kome je HAT zamenjen sa HT. Pojedinačno reakciono mesto je ispitano pomoću ELISA tehnike (prethodno opisano) na humana anti-PTK7 monoklonska IgG antitela. Kada se jednom javi intenzivan rast hibridoma,

medijum se prati obično posle 10-14 dana. Hibridomi koji sekretuju antitela su ponovo postavljeni u ploče, ponovo ispitivani, ukoliko su pozitivni na humani IgG, anti-PTK7 monoklonska antitela su subklonirana najmanje dva puta ograničavanjem razblaženja. Stabilni subklonovi su zatim uzgajani in vitro da bi se stvorile male količine antitela u medijumu kulture tkiva za dalje opisivanje.

Hibridoma klonovi: 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 su izabrani za dalje

analize.

Primer 2: Strukturni opis humanih monoklonskih antitela 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8

cDNA sekvence koje kodiraju varijabilne regione teškog i lakog lanca 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a i 7C8 monoklonskih antitela dobijene su iz 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a odnosno 7C8 hibridoma, korišćenjem standardnih PCR tehnika i, sekvencionirane su pomoću standardnih DNA sekvencionih tehnika.

Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 3G8 su prikazane na Slici 1A i u SEQ ID NO: 41 odnosno 1.

Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 3G8 su prikazane na Slici 1B i u SEQ ID NO: 45 odnosno 5.

Poređenje imunoglobulinske sekvence teškog lanca 3G8 sa poznatom imunoglobulinskom sekvencom teškog lanca humane zametne linije pokazuje da 3G8 teški lanac koristi VH segment iz humane zametne linije VH 3-30.3, nedeterminisani D segment i JH segment iz humane zametne linije JH 4b. Pravac 3G8 VH sekvence prema sekvenci zametne linije VH 3-30.3 je prikazan na Slici 5. Dalja analiza 3G8 VH sekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona dovodi do opisa CDR1, CDR2 i CD3 regiona teškog lanca kako je prikazano na slikama 1A i 5, kao i u SEQ ID NOs: 11, 15 odnosno, 19.

Poređenje imunoglobulinske sekvence lakog lanca 3G8 sa poznatom imunoglobulinskom sekvencom lakog lanca humane zametne linije pokazuje da 3G8 laki lanac koristi VL segment iz humane zametne linije VK L15 i JK segment iz humane zametne linije JK 1. Pravac 3G8 VL sekvence prema sekvenci zametne linije VK L15 je prikazan na Slici 9. Dalja analiza 3G8 VL sekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona dovodi do opisa CDR1, CDR2 i CD3 regiona lakog lanca kako je prikazano na slikama 1B i 9, kao i u SEQ ID NOs: 23, 29 odnosno, 35.

Nukleotid i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 3G8a su prikazani na Slici 1A i u SEQ ID NO:41 odnosno 1.

Nukleotid i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 3G8a su prikazani na Slici 1C i u SEQ ID NO:46 odnosno 6.

Poređenje 3G8a imunoglobulinske sekvence teškog lanca sa poznatom imunoglobulinskom sekvencom teškog lanca humane zametne linije je pokazalo da 3G8a teški lanac koristi VH segment iz humane zametne linije VH 3-30.3, da je D segment neodređen, a JH segment iz humane zametne linije JH 4b. Pravac 3G8a VH sekvence prema sekvenci zametne linije VH 3-30.3 je prikazan na Slici 5. Dalja analiza 3G8a VH sekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona vodi opisu CDR1, CDR2 i CDR3 regiona teškog lanca kako je prikazano na Slici 1A i 5, i u SEQ ID NO: 11,15 odnosno 19.

Poređenje 3G8a imunoglobulinske sekvence lakog lanca sa poznatom imunoglobulinskom sekvencom lakog lanca humane zametne linije je pokazalo da 3G8a laki lanac koristi VL segment iz humane zametne linije VK L15 i JK segment iz humane zametne linije JK 3. Pravac 3G8a VL sekvence prema sekvenci zametne linije VK L15 je prikazan na Slici 9. Dalja analiza 3G8a VL sekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona vodi opisu CDR1, CDR2 i CDR3 regiona lakog lanca kako je prikazano na Slici 1C i 9, i u SEQ ID NO: 24, 30 odnosno 36.

Nukleotid i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 4D5 su prikazani na Slici 2A i u SEQ ID NO:42 odnosno 2.

Nukleotid i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 4D5 su prikazani na Slici 2B i u SEQ ID NO:47 odnosno 7.

Poređenje 4D5 imunoglobulinske sekvence teškog lanca sa poznatom imunoglobulinskom sekvencom teškog lanca humane zametne linije je pokazalo da 4D5 teški lanac koristi VH segment iz humane zametne linije VH 3-30.3, da je D segment neodređen, a JH segment iz humane zametne linije JH 4b. Pravac 4D5 VH sekvence prema sekvenci zametne linije VH 3-30.3 je prikazan na Slici 6. Dalja analiza 4D5 VH sekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona vodi opisu CDR1, CDR2 i CDR3 regiona teškog lanca kako je prikazano na Slici 2A i 6, i u SEQ ID NO: 12, 16 odnosno 20.

Poređenje 4D5 imunoglobulinske sekvence lakog lanca sa poznatom imunoglobulinskom sekvencom lakog lanca humane zametne linije je pokazalo da 4D5 laki lanac koristi VL segment iz humane zametne linije VK A10 i JK segment iz humane zametne linije JK 5. Pravac 4D5 VL sekvence prema sekvenci zametne linije VK A10 je prikazan na Slici 10. Dalja analiza 4D5 VL sekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona vodi opisu CDR1, CDR2 i CDR3 regiona lakog lanca kako je prikazano na Slici 2B i 10, i u SEQ ID NO: 25, 31 odnosno 37.

Nukleotid i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 12C6 su prikazani na Slici 3A i u SEQ ID NO:43 odnosno 3.

Nukleotid i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 12C6 su prikazani na Slici 3B i u SEQ ID NO:48 odnosno 8.

Poređenje 12C6 imunoglobulinske sekvence teškog lanca sa poznatom imunoglobulinskom sekvencom teškog lanca humane zametne linije je pokazalo da 12C6 teški lanac koristi VH segment iz humane zametne linije VH DP44, da je D segment neodređen, a JH segment iz humane zametne linije JH 4b. Pravac 12C6 VH sekvence prema sekvenci zametne linije VH DP44 je prikazan na Slici 7. Dalja analiza 12C6 VH sekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona vodi opisu CDR1, CDR2 i CDR3 regiona teškog lanca kako je prikazano na Slici 3A i 7, i u SEQ ID NO: 13, 17 odnosno 21.

Poređenje 12C6 imunoglobulinske sekvence lakog lanca sa poznatom imunoglobulinskom sekvencom lakog lanca humane zametne linije je pokazalo da 12C6 laki lanac koristi VL segment iz humane zametne linije VK A27 i JK segment iz humane zametne linije JK 2. Pravac 12C6 VL sekvence prema sekvenci zametne linije VK A27 je prikazan na Slici 11. Dalja analiza 12C6 VL sekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona vodi opisu CDR1, CDR2 i CDR3 regiona lakog lanca kako je prikazano na Slici 3B i 11, i u SEQ ID NO: 26, 32 odnosno 38.

Nukleotid i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 12C6a su prikazani na Slici 3A i u SEQ ID NO:43 odnosno 3.

Nukleotid i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 12C6a su prikazani na Slici 3C i u SEQ ID NO:49 odnosno 9.

Poređenje 12C6a imunoglobulinske sekvence teškog lanca sa poznatom imunoglobulinskom sekvencom teškog lanca humane zametne linije je pokazalo da 12C6a teški lanac koristi VH segment iz humane zametne linije VH DP44, da je D segment neodređen i da je JH segment iz humane zametne linije JH 4b. Pravac 12C6a VH sekvence prema sekvenci zametne linije VH DP44 je prikazan na Slici 7. Dalja analiza 12C6a VH sekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona vodi opisu CDR1, CDR2 i CDR3 regiona teškog lanca kako je prikazano na Slici 3A i 7, kao i u SEQ ID NO: 13, 17 odnosno 21.

Poređenje 12C6a imunoglobulinske sekvence lakog lanca sa poznatom imunoglobulinskom sekvencom lakog lanca humane zametne linije je pokazalo da 12C6a laki lanac koristi VL segment iz humane zametne linije VK L15 i JK segment iz humane zametne linije JK 2. Pravac 12C6a VL sekvence prema sekvenci zametne linije VK L15 je prikazan na Slici 12. Dalja analiza 12C6a VL sekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona vodi opisu CDR1, CDR2 i CDR3 regiona lakog lanca kako je prikazano na Slici 3C i 12, i u SEQ ID NO: 27, 33 odnosno 39.

Nukleotid i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 7C8 su prikazani na Slici 4A i u SEQ ID NO:44 odnosno 4.

Nukleotid i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 7C8 su prikazani na Slici 4B i u SEQ ID NO:50 odnosno 10.

Poređenje 7C8 imunoglobulinske sekvence teškog lanca sa poznatom imunoglobulinskom sekvencom teškog lanca humane zametne linije je pokazalo da 7C8 teški lanac koristi VH segment iz humane zametne linije VH 3-33, D segment iz humane zametne linije 3-10 i JH segment iz humane zametne linije JH 6b. Pravac 7C8 VH sekvence prema sekvenci zametne linije VH 3-33 je prikazan na Slici 8. Dalja analiza 7C8 VH sekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona vodi opisu CDR1, CDR2 i CDR3 regiona teškog lanca kako je prikazano na Slici 4A i 8, kao i u SEQ ID NO: 14, 18 odnosno 22.

Poređenje 7C8 imunoglobulinske sekvence lakog lanca sa poznatom imunoglobulinskom sekvencom lakog lanca humane zametne linije je pokazalo da 7C8 laki lanac koristi VL segment iz humane zametne linije VK L6 i JK segment iz humane zametne linije JK 3. Pravac 7C8 VL sekvence prema sekvenci zametne linije VK L6 sekvence je prikazan na Slici 13. Dalja analiza 7C8 VL sekvence korišćenjem Kabat sistema određivanja CDR regiona vodi opisu CDR1, CDR2 i CDR3 regiona lakog lanca kako je prikazano na Slici 4B i 13, kao i u SEQ ID NO: 28, 34 odnosno 40.

Primer 3: Mutacija mAb 12C6 i korišćenje alternativne zametne linije

Kako je raspravljano u prethodnom Primeru 2, monoklonska antitela 12C6 i 12C6a koriste varijabilni region teškog lanca poreklom od sekvence humane DP-44 zametne linije koja je prisutna u HCo7 transgenu HuMab Mouse® soja. Kako se sekvenca DP-44 zametne linije ne koristi u nativnom repertoaru humanih imunoglobulina, može biti korisno da se VH sekvence 12C6 i 12C6a mutiraju radi smanjivanja moguće imunogenosti. Poželjno, jedan ili više ostataka gradivnog okvira 12C6 ili 12C6a VH sekvence se mutira u ostatak(e) koji se nalaze u gradivnom okviru strukturno srodne VH sekvence zametne linije koja se koristi u nativnom repertoaru humanih imunoglobulina. Na primer, Slika 7 prkazuje pravac 12C6 i 12C6a VH sekvence sa sekvencom DP44 zametne linije i, isto tako, prema dve strukturno srodne sekvence humane zametne linije, VH 3-23 i VH 3-7. Uz datu srodnost ovih sekvenci, može se predvideti da se može selektovati humano antitelo koje se specifično vezuje za humani PTK7 i koje koristi VH region poreklom od VH 3-23 ili VH 3-7 sekvence zametne linije. Osim toga, mogu se mutirati jedan ili više ostataka unutar 12C6 ili 12C6a VH sekvence koji se razlikuju od ostataka na komparabilnom položaju u VH 3-23 ili VH 3-7 sekvenci u ostatke koji su prisutni u VH 3-23 ili VH 3-7, ili njihove supstitute konzervativnim amino kiselinama.

Primer 4: Karakterizacija specifičnosti vezivanja i kinetika vezivanja anti-PTK7 humanih monoklonskih antitela

U ovom primeru, Biacore analizom su ispitani afinitet vezivanja i kinetike vezivanja anti-PTK7 antitela. Specifičnost vezivanja i unakrsna-kompeticija su ispitane protočnom citometrijom.

Specifičnost vezivanja pomoću protočne citometrije

HEK3 ćelijske linije koje ekspresuju rekombinantnu humanu PTK7 na površini ćelije, razvijene su i korišćene za određivanje specifičnosti PTK7 humanih monoklonskih antitela pomoću protočne citometrije. HEK3 ćelije su transfektovane sa ekspresionim plazmidima koji sadrže punu dužinu cDNK koja kodira transmembranske oblike PTK7. Vezivanje 7C8 anti-PTK7 humanog monoklonskog antitela je ispitano inkubacijom transfektovanih ćelija sa anti-PTK7 humanim monoklonskim antitelom u koncentraciji od 10 ng/ml. Ćelije su isprane i vezivanje je detektovano sa FITC-obeleženim anti-humanim IgG Ab. Analiza protočne citometrije je izvedena upotrebom FACScan protočnog citometra (Becton Dickinson, San Jose, CA). Rezultati su prikazani na Slici 14. Anti-PTK7 humano monoklonsko antitelo 7C8 vezuje se za HEK3 ćelije koje su transfektovane sa PTK7 ali ne i za HEK3 ćelije koje nisu transfektovane sa humanom

PTK7. Ovi podaci pokazuju specifičnost anti-PTK7 humanih monoklonskih antitela za PTK7.

Specifičnost vezivanja pomoću ELISA tehnike

Vezivanje anti-PTK7 antitela je, isto tako, ispitano pomoću standardne ELISA tehnike radi utvrđivanja specifičnosti vezivanja za PTK7.

Rekombinantni ekstracelularni domen PTK7 je testiran na vezivanje sa anti-PTK7 humanim monoklonskim antitelima 3G8, 4D5, 12C6 i 12C6a u različitim koncentracijama. Izvedene su standardne ELISA procedure. Anti-PTK7 humana monoklonska antitela su dodata u početnoj koncentraciji od 10 jig/ml i serijskim razblaženjima u 1:2 diluciji. Kozja-anti-humana IgG (specifična za kappa lanac) poliklonska antitela konjugovana sa “horseradish” peroksidazom (HRP) korišćena su kao sekundarna antitela. Rezultati su prikazani na Slici 15. Svako od anti-PTK7 humanih monoklonskih antitela 3G8, 4D5, 12C6 i 12C8a vezuje se za PTK7. Ovi podaci pokazuju specifičnost anti-PTK7 humanih monoklonskih antitela za PTK7.

Mapiranje epitopa anti-PTK7 antitela

Da bi se odredilo grupisanje epitopa anti-PTK7 HuMAbs, korišćena je tehnika protočne citometrije. Ćelije Wilmovog tumora G-401 (ATCC Acc No. CRL-1441) su transfektovane sa ekspresionim plazmidima koji sadrže u punoj dužini cDNK koji kodira transmembranske oblike PTK7. Vezivanje za epitop svakog anti-PTK7 humanog monoklonskog antitela ispitano je inkubacijom 1x105 transfektovanih ćelija sa 10 ng/ml hladnih anti-PTK7 humanih monoklonskih antitela, zatim ispiranjem, i na kraju dodavanjem 10 ng/ml fluorescentno-konjugovanih anti-PTK7 humanih monoklonskih antitela. Vezivanje se detektuje sa FITC-obeleženim anti-humanim IgG antitelom. Analiza protočne citometrije je izvedena upotrebom FACScan protočnog citometra (Becton Dickinson, San Jose, CA). Tokom analiziranja podataka, anti-PTK7 antitela u svrstana u 3 grupe epitopa - grupa A, koja uključuje 7D11, grupa B, koja uključuje 3G8 i 3G8a i grupa C, koja uključuje 7C8, 12C6 i 12C6a.

Primer 5: Opis anti-PTK7 antitela koje se vezuje za PTK7 koji je ekspresovan na površini humanih kancerskih ćelija

Ćelijska linija nefroblastoma Wilmovog tumora G-401 (ATCC Acc No. CRL-1441) je ispitana na vezivanje HuMAb anti-PTK7 humanog monoklonskog antitela 12C6 i 7C8 pri različitim koncentracijama. Vezivanje anti-PTK7 humanog monoklonskog antitela je ispitano inkubacijom 1x105 ćelija sa antitelima u početnoj koncentraciji od 30 ng/ml i serijski razblaženim antitelima u 1:10 diluciji. Ćelije su isprane i vezivanje detektovano sa PE-obeleženim anti-humanim IgG Ab. Analiza protočne citometrije je izvedena upotrebom FACScan protočnog citometra (Becton Dickinson, San Jose, CA). Rezultati su prikazani na Slici 16. Anti-PTK7 monoklonska antitela 12C6 i 7C8 vezivala su se za ćelijsku liniju nefroblastoma Wilmovog tumora na način koji zavisi od koncentracije antitela, mereno putem fluorescentnog intenziteta (MFI) bojenja. Vrednosti EC50 za anti-PTK7 monoklonska antitela 12C6 i 7C8 su bile 4.035 nM odnosno 3.428 nM.

Ovi podaci pokazuju da se anti-PTK7 HuMAbs vezuju za ćelijske linije kancera bubrega.

Primer 6: Vezivanje humanog anti-PTK7 antitela za kancerske ćelijske linije

Anti-PTK7 antitela su putem protočne citometrije ispitana na vezivanje za razne kancerske ćelijske linije.

Vezivanje 3G8, 12C6a, 4D5 i 12C6 anti-PTK7 humanih monoklonskih antitela za panel kancerskih ćelijskih linija je ispitano inkubacijom kancerskih ćelijskih linija sa anti-PTK7 humanim monoklonskim antitelom u koncentraciji od 10 ^g/ml. Kancerske ćelijske linije koje su ispitane su bile : A-431 (ATCC Acc No. CRL-1555), ćelije Wilmovog tumora G-401 (ATCC Acc No. CRL-1441), Saos-2 (ATCC Acc No. HTB-85), SKOV-3 (ATCC Acc No. HTB-77), PC3 (ATCC Acc No. CRL-1435), DMS 114 (ATCC Acc No. CRL-2066), ACHN (ATCC Acc No. CRL-1611), LNCaP (ATCC Acc No. CRL-1740), DU 145 (ATCC Acc No. HTB-81), LoVo (ATCC Acc No. CCL-229) i MIA PaCa-2 (ATCC Acc No. CRL-1420). Kao negativna kontrola, korišćena su izotipska kontrolna antitela. Ćelije su isprane i vezivanje je detektovano sa FITCI-obeleženim anti-humanim IgG Ab. Analiza protočnom citometrijom je izvedena uz upotrebu FACScan protočnog citometra (Becton Dickinson, San Jose, CA). Rezultati su prikazani na Slici 17. Anti-PTK7 monoklonska antitela 3G8, 12C6a, 4D5 i 12C6 vezuju se za kancerske ćelijske linije A-431, ćelije Wilmovog tumora G-401, Saos-2, SKOV-3, PC3, DMS 114, ACHN, LNCaP, DU 145, LoVo i MIA PaCa-2, mereno putem fluorescentnog intenziteta (MFI) bojenja.

Ovi podaci pokazuju da se anti-PTK7 HuMAbs vezuju za razne kancerske ćelije koje ekspresuju PTK7 na površini ćelije.

Primer 7: Vezivanje anti-PTK7 za humane T, B i dendritske ćelije

Anti-PTK7 antitela su protočnom citometrijom ispitana na vezivanje sa CD4+, CD8+ T-ćelijama, CD19+ B-ćelijama i mijeloidnim dendritskim ćelijama humane krvi koje ekspresuju PTK7 na svojoj površini ćelije.

Humane T ćelije su aktivirane sa anti-CD3 antitelima da bi indukovale PTK7 ekspresiju na T ćelijama pre vezivanja sa humanim anti-PTK7 monoklonskim antitelima. Vezivanje 7c8 anti-PTK7 humanog monoklonskog antitela je ispitano inkubacijom ćelija sa anti-PTK7 humanim monoklonskim antitelima u koncentraciji od 10 ng/ml. U nekim eksperimentima, kao pozitivna kontrola su korišćena poznata antitela koja vezuju specifične markere T i B-ćelija. Ćelije su isprane i vezivanje je detektovano sa FITC-obeleženim anti-humanim IgG Ab. Analiza protočne citometrije je izvedena upotrebom FACScan protočnog citometra (Becton Dickinson, San Jose, CA). Rezultati su prikazani na Slici 18 (aktivirane himane T ćelije i B ćelije) i 19 (dendritske ćelije). Anti-PTK7 monoklonsko antitelo 7C8 vezuje se za aktivirane humane CD4+ i CD8+ T ćelije i dendritske ćelije, ali ne i za B-ćelije, mereno putem fluorescentnog intenziteta (MFI) bojenja. Ovi podaci pokazuju da se anti-PTK7 HuMAbs vezuju za humane T-ćelije i dendritske ćelije.

Primer 8: Internalizacija anti-PTK7 monoklonskog antitela

Anti-PTK7 HuMAbs su ispitana na mogućnost da internalizuju u ćelijske linije koje ekspresuju PTK7 korišćenjem Hum-Zap testa internalizacije. Hum-Zap test ispituje na internalizaciju primarnog humanog antitela preko vezivanja sekundarnog antitela sa afinitetom za humani IgG koji je konjugovan sa toksinom saporinom.

Direktno se zaseju kancerske ćelijske linije Wilmovog tumora koje ekspresuju PTK7: G-401 (ATCC Acc No. CRL-1441), A-431 (ATCC Acc No. CRL-1555) i PC3 (ATCC Acc No. CRL-1435) u koncentraciji od 1x104 ćelija/reakcionom mestu u 100 |d. Anti-PTK7 HuMAb antitela 3G8, 4D5, 12C6 ili 7C8 se dodaju u reakciona mesta pri početnoj koncentraciji od 30 nM i titriraju naniže putem serijskih razblaženja 1:3. Kao negativna kontrola su korišćena izotip kontrolna antitela koja nisu specifična za PTK7.

Hum-Zap (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, IT-22-25) se dodaje u koncentraciji od11 nM i ploče se ostavljaju da se inkubiraju tokom 72 sata. Ploče su zatim obeležene sa 1.0 ^Ci 3H-timidina u toku 24 sata, sakupljene i pročitane u Top Count scintilacionom brojaču (Packard Instruments, Meriden, CT). Rezultati su prikazani na Slikama 20A-D. Anti-PTK7 antitela 3G8, 4D5, 12C6 i 7C8 pokazuju pad inkorporacije 3H-timidina u kancerskoj ćelijskoj liniji Wilmovog tumora koja ekspresuje PTK7, koji zavisi od koncentracije antitela. Anti-PTK7 antitela 12C6 i 7C8 pokazuju pad inkorporacije 3H-timidina u kancerskim ćelijskim linijama A-431 and PC3 koje ekspresuju PTK7, koji zavisi od koncentracije antitela. Vrednost EC5o za anti-PTK7 antitela 3G8, 4D5, 12C6 i 7C8 u ćelijama Wilmovog tumora je bila 0.6437 nM, 0.2516 nM, 0.2053 nM odnosno 0.1788 nM. Vrednost EC50 za anti-PTK7 antitela 12C6 i 7C8 u A-431 ćelijama je bila 0.1657 nM odnosno 0.1826 nM. Vrednost EC50 za anti-PTK7 antitela 12C6 i 7C8 u PC3 tumorskim ćelijama je bila 0.3175 nM odnosno 0.2648 nM. Ovi podaci pokazuju da anti-PTK7 antitela 3G8, 4D5, 12C6 i 7C8 internalizuju u ćelije kancera.

Primer 9: Određivanje ubijanja ćelija toksin-konjugovanim anti-PTK7 antitelima ćelijskih linija humanih kancera

U ovom primeru, testom proliferacije ćelija je ispitano anti-PTK7 monoklonsko antitelo konjugovano sa toksinom na mogućnost da ubije PTK7+ linije ćelija humanih kancera.

Anti-PTK7 HuMAb antitelo 12C6a je konjugovano sa toksinom putem linkera, kao što je peptidil, hidrazon ili disulfidni linker. Primeri jedinjenja toksina koja se mogu konjugovati sa antitelima ovog pronalaska su opisana u: WO 2007/038658. G-401 kancerska ćelijska linija Wilmsovog tumora čoveka koja ekspresuje PTK7 (ATCC Acc No. CRL-1441) je zasejana u količini od 104 ćelija/reakcionom mestu u 100(j.l-ska reakciona mesta u toku 3 sata. U reakciona mesta je dodat konjugat anti-PTK7 antitela-toksin pri početnoj koncentraciji od 100 nM i titar je spuštan putem 1:3 serijskih razblaženja. Ploče su ostavljene da se inkubiraju 48 sati. Ploče su zatim obeležene sa 1 M-Ci 3H-timidina tokom 24 sata pre završetka uzgajanja, sakupljene i pročitane na Top Count scintilacionom brojaču (Packard Instruments). Slika 21 pokazuje efekte 12C6a-konjugata na ćelije Wilmsovog tumora. Anti-PTK7 antitela 12C6a ispoljavaju antitelo-toksin koncentracionu zavisnost pada inkorporacije 3H-timidina u kancerskoj ćelijskoj liniji humanog Wilmsovog tumora bubrega koja ekspresuje PTK7.

Ovi podaci pokazuju da anti-PTK7 antitela konjugovana sa toksinom ispoljavaju specifičnu citotoksičnost prema ćelijama humanog kancera bubrega.

Primer 10: Određivanje ubijanja ćelija toksin-konjugovanim anti-PTK7 antitelima ćelijskih linija humanih tumora

U ovom primeru, testom proiiferacije ćelija je ispitano anti-PTK7 monoklonsko antitelo konjugovano sa toksinom na mogućnost da ubije PTK7+ linije ćelija humanih tumora koje imaju bilo nizak, srednji bilo visok stepen ekspresije PTK7 na površini ćelija.

Anti-PTK7 HuMAb antitela 12C6a je konjugovano sa toksinom putem linkera, kao što je peptidil, hidrazon ili disulfidni linker. Primeri jedinjenja toksina koja se mogu konjugovati sa antitelima ovog pronalaska su opisana u: WO 2007/038658. A-431, SKOV3 i LoVo kancerske ćelijske linije humanih tumora koje ekspresuju PTK7-su zasejane u količini 104 ćelija/reakcionom mestu u lOO^I-ska reakciona mesta. Ćelijske linije su prethodno ispitane na ekspresiju PTK7 na površini ćelija standardnim FACS testom. A-431 ćelijska linija je ispoljila najviši nivo ekspresije PTK7 na površini ćelija, a LoVo ćelijksa linija je ispoljila najniži nivo ekspresije PTK7 na površini ćelija. U reakciona mesta je dodat konjugat anti-PTK7 antitela-toksin pri početnoj koncentraciji od 20 nM i titar je spuštan putem 1:2 serijskih razblažena. Kao negativna kontrola su korišćena izotipska kontrolna antitela. Ploče su ostavljene da se inkubiraju 3 sata, a zatim se nevezani (slobodni) konjugati antitela-toksin uklone ispiranjem. Nastavljena je inkubacija ploča još 96 sati i merena je aktivnost ubijanja (FU, fluorescentna jedinica) pomoću CellTiter-Glo® Luminescent testa ćelijske vijabilnosti prema protokolu (Promega, Wl, USA, Technical bulletin No. 288) korišćenjem BIO-TEK čitača (Bio-Tek Instruments, Ine, VT, USA). Rezultati su prikazani na Slici 22. Konjugat anti-PTK7-toksin je pokazao pad u testu proiiferacije koji je zavisio od koncentracije antitela-toksina i to za ekspresiju PTK7 u A431 visok, SKOV3 srednji i LoVo nizak.

Ovi podaci pokazuju da anti-PTK7 antitela konjugovana sa toksinom ispoljavaju specifičnu citotoksičnost prema različitim humanim ćelijama kancera.

Primer 11: Imunohistohemija sa 3G8,12C6a, 2E11

Mogućnost imunohistohemijskog prepoznavanja PTK7 od strane anti-PTK7 HuMAbs 3G8, 12C6a i 2E11, ispitano je korišćenjem kliničkih biopsija kancera pluća, kancera dojke, kancera mokraćne bešike, kancera pankreasa, kancera kolona, kancera jajnika, kancera tankog creva & kancera prostate.

Za imunohistohemiju, korišćeni su 5 |xm-ski zamrznuti isečci (Ardais Ine, USA). Nakon sušenja od 30 minuta, isečci su fiksirani sa acetonom (na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta) i osušeni na vazduhu u toku 5 minuta. Isečci se isperu sa PBS i, zatim pre-inkubiraju sa 10% normalnim kozijim serumom u PBS u toku 20 min i, zatim se inkubiraju sa 10 ng/ml fitcilovanim antitelima u PBS sa 10% normalnim kozijim serumom tokom 30 min na sobnoj temperaturi. Dalje, isečci se isperu tri puta sa PBS i inkubiraju 30 min sa mišijim anti-FITC (lO^g/ml DAKO) na sobnoj temperaturi. Isečci se ponovo isperu sa PBS i inkubiraju sa kozijim antimišijim HRP konjugatom (DAKO) u toku 30 minuta na sobnoj temperaturi. Isečci se ponovo isperu 3x sa PBS. Kao supstrat se koristi diaminobenzidin (Sigma), sto dovodi do smeđeg bojenja. Posle ispiranja sa destilovanom vodom, isečci se boje suprotno sa hematoksilinom tokom 1 min. Potom se isečci ispiraju 10 sekundi sa tekućom destilovanom vodom i postave na površinu glicergela (DAKO). Imunohistohemijsko bojenje kliničkih biopsija pokazuje pozitivno bojenje u isečcima kancera pluća, kancera dojke, kancera mokraćne bešike, kancera pankreasa, kancera kolona, kancera jajnika, kancera tankog creva & kancera prostate. Normalno tkivo je bilo uvek negativno na PTK7 bojenje, dok su u malignim tkivima i kancerom aktivirani fibroblasti i kancerozne epitelijelne ćelije bili pozitivni na PTK7 bojenje. Identitet kancerom aktiviranih fibroblasta je bio potvrđen u isečcima kancera mokraćne bešike i kancera dojke bojenjem sa antitelima proteina aktivacije fibroblasta (FAP, Alexis Biochemicals, San Diego, USA). FAP je poznati marker kancerom aktiviranih fibroblasta (Hofheinz et al. (2003) Oncologie 26:44-48).

Primer 12: Invazioni test

U ovom primeru, antitela usmerena protiv PTK7 su ispitana na mogućnost uticaja na ćelijsku invazivnost u liniji CHO ćelija transfektovanih sa PTK7.

Test je izveden korišćenjem HTS 96-Multiwell Insert sistema (Cat# 351162, BD Biosciences, CA) prema protokolu. CHO matična ćelijska linija, CHO ćelije transfektovane sa punom dužinom PTK7 ili kontrolna HEK293 ćelijska linija, pomešane su ili sa pool-om antiPTK7 HuMabs ili sa izotipom kontrolnih antitela pre dodavanja ćelija u inserte. Mešavina (ćelije+At pool) se doda u insertno reakciono mesto na invazionoj ploči. Posle inkubacije na 37°C sa 5% C02 u toku 24 sata, ćelije se obeleže sa fluorescentnom bojom i kvantifikuju se ćelije koje su prodrle na dno membrane pomoću fluorescentnog čitača ploča. Rezultati su prikazani na Slici 23. Ovi podaci prikazuju da anti-PTK7 antitela inhibiraju invazivnu pokretljivost ćelija koje ekspresuju PTK7 na ćelijskoj površini.

Primer 13: Tretman in vivo kancerskih ćelija pankreasa ksenograft modela korišćenjem golih i citotoksin-konjugovanih anti-PTK7 antitela

Ovaj primer opisuje in vivo lečenje miševa kojima je implantiran tumor kancerskih ćelija pankreasa sa toksin-konjugovanim anti-PTK7 antitelima u cilju ispitivanja in vivo efekata antitela na tumorski rast.

HPAC (humani pankreasni adenokarcinom, ATCC Accession Number CRL-2119) ili ćelije drugih prikladnih kancera pankreasa su razvijene in vitro upotrebom standardnih laboratorijskih procedura. Mužjacima Ncr golih miševa bez timusa (Taconic, Hudson, NY), starosti između 6-8 nedelja, subjutano u desni bok inplantirano je 2.5 x106 HPAC ćelija u 0.2 ml PBS/Matrigel (1:1) po mišu. Nakon implantacije, miševima je dva puta nedeljno merena težina i trodimenzionalno su mereni tumori korišćenjem elektronskog šestara. Zapremine tumora su izračunate kao: visina x širina x dužina/2. Miševi sa HPAC tumorima koji su prosečno bili 90 mm3 randomizovani su u grupe za lečenje. Na 0. dan, miševi su primili jednu intravensku dozu sa PBS vehikulumom, golim anti-PTK7 antitelima ili toksin-konjugovanim anti-PTK7 HuMAb u određenoj dozi (umol/kg). Primeri toksin-jedinjenja koja se mogu konjugovati sa antitelima ovog pronalaska su opisani u patentnoj prijavi na čekanju : U.S. Patent Application Publication number 2006/0024317 A1. Posle doziranja, miševima je praćen rast tumora tokom 61 dana. Kada su tumori dostigli krajnje tačke (2000 mm3) ili ispoljili ulceracije, miševi su podvrgnuti eutanaziji. Toksin-konjugati anti-PTK7 antitela usporavaju napredovanje rasta tumora. Rezultati su prikazani na Slici 24. Antitumorski efekat anti-PTK7 toksin konjugata je bio dozno zavisan, a najveće dejstvo je zapaženo sa dozom od 0.3 l^mol/kg. Lečenje anti-PTK7 toksin konjugatom se dobro podnosilo, a ispitanici nisu nikada imali više od 5% gubitka prosečne telesne mase (podaci nisu prikazani). Prema tome, lečenje toksin konjugovanim anti-PTK7 antitelima ima direktno in vivo inhibitorno dejstvo na rast tumora kancerskih ćelija pankreasa.

Primer 14: Tretman in vivo kancera dojke modela ćelijskog ksenografta korišćenjem golih i citotoksin-konjugovanih anti-PTK7 antitela

Ovaj primer opisuje in vivo lečenje miševa kojima je implantiran tumor karcinoma dojke rezistentan na adriamicin sa toksin-konjugovanim anti-PTK7 antitelima u cilju ispitivanja in vivo efekata antitela na tumorski rast.

MCF7-ađr (ćeiijska iinija humanog karcinoma dojke rezistentna na adriamicin) su razvijene in vitro upotrebom standardnih laboratorijskih procedura. Ženkama CB17.SCID miševa (Taconic, Hudson, NY), starosti između 6-8 nedelja, subkutano je implantirano 1.7 mg kuglica estrogena oslobođenih 90-dan, veličine 3.0 mm (Innovative Research of America, Sarasota, FL) u regionu vrata, dan pre nego što im se u desni bok subkutano implantira 10 x106 MCF7-Adr ćelija u 0.2 ml medijuma PBS/Matrigel (1:1) po mišu. Nakon implantacije, miševima je dva puta nedeljno merena težina i trodimenzionalno su mereni tumori korišćenjem elektronskog šestara. Zapremine tumora su izračunate kao: visina x širina x dužina/2. Miševi sa MCF7- adr tumorima koji su prosečno bili 160 mm3, randomizovani su u grupe za lečenje. Na 0. dan, miševi su primili jednu intravensku dozu od 0.1 ^mol/kg sa PBS vehikulumom, golim anti-PTK7 antitelima ili toksin-konjugovanim anti-PTK7 HuMAb. Primeri toksin-jedinjenja koja se mogu konjugovati sa antitelima ovog pronalaska su opisani u patentnoj prijavi na čekanju : U.S. Patent Application Publication number 2006/0024317 A1. Posle doziranja, miševima je praćen rast tumora tokom 63 dana. Kada su tumori ispoljili ulceracije, miševi su podvrgnuti eutanaziji. Rezultati su prikazani na Slici 25. Toksin-konjugati anti-PTK7 antitela usporavaju napredovanje rasta tumora. Prema tome, lečenje toksin konjugovanim anti-PTK7 antitelima ima direktno in vivo inhibitorno dejstvo na rast tumora kancera dojke.

IZLISTAVANJE SEKVENCI <110> MEDAREX, INC.

<120> HUMANA MONOKLONSKA ANTITELA PREMA PROTEINSKOJ TIROZIN KINAZI 7 (PTK7) I POSTUPCI ZA KORIŠĆENJE ANTI-PTK7 ANTITELA

<130> MXI-345PC

<140> <141 > <150> 60/748,373 <151 >2005-12-08

<160> 69

<170> Patentln Ver. 3.3

<210> 1

<211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens

<210> 2

<211 > 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

<210>3 <211 > 112 <212> PRT <213> Homo sapiens

<210> 4

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>4 <210> 5

<211 > 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 6

<211>107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400 6 <210> 7

<211 > 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210>8

<211>109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400>8 <210>9

<211 > 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 10 <211 > 108 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211>5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Asn Tyr Ala Mefc His 1 5

<210> 12

<211>5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 13

<211 > 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210 14

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400 14

<210> 15

<211 > 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211 > 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400 16

<210 17 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400 17

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20 <211>6 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 20 <210 21

<211>4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400 21 <210> 22

<211 > 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400 22

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

Arg Ala Sez Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 15 10

<210> 24 <211 > 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<210 25 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 25

<210=- 26 <211=- 12 <212> PRT <213=- Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210=* 28 <211=- 11 <212=- PRT <213=* Homo sapiens

<400> 28

c210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 29

<210--* 30

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

<400> 35

Gln Gln Tyr Aan Ser Tyr Pro Arg Thr

1 5

<210 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 36

<220 <221> CDS <222> (1)..(348)

<210> 42

<211> 345

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221 > CDS <222> (1)..(345)

<400> 42

<210> 43

<211> 336

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221 > CDS <222> (1)..(336)

<400> 43

<210> 44

<211> 378

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221 > CDS <222> (1).. (378)

<400> 44

<210> 45

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221 > CDS <222> (1)..(321)

<400> 45

<210> 46

<211 >321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221 > CDS <222> (1)..(321)

<210> 47

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (1)..(321)

<400> 47

<210> 48

<211> 327

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221 > CDS <222> (1)..(327)

<400> 48

<210> 49

<211 >321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221 > CDS <222> (1)..(321).

<400> 49

100 105

<210> 50

<211> 324

<212> DNA

<213> Homo sapiens <220>

<221 > CDS <222> (1)..(324) <210 51

<211 >98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400 51

<210> 52

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

<210> 53

<211 >98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400 53

<210> 54

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

<210> 55

<211 >95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 55

<210> 56

<211> 96

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

<210> 57

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 1070

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58

<210> 59

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10

<210> 60

<211 > 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10 15

<210> 61

<211 >97

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Pho Ser Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ala 35 40 45

Aan Ala Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Aap Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Aan Ala Lya Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg

<210> 62 <211 >97 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 62

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 . 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Aap Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg A3p Asn Ser Lys Aan Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Aan Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ly3

<210> 63 <211> 12 <212> PRT

<213> Homo sapiens • - -

<400> 63

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10

<210> 64 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400 64

Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 15 10 15

Ser Sor

<210> 65

<211 > 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 S 10

<210> 66 <211 > 12 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 66

Ile Thr Ph® Gly Gln Gly Thr Ar<j Leu Glu lle Lys 15 10

<210> 67

<211 > 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10

<210> 68

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 68

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 15 10

<210> 69

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 15 10

Claims

1. Izolovano humano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu se antitelo: (a) specifično vezuje za humani PTK7; i (b) vezuje za ćelijsku liniju VVilmsovog tumora koja ima ATCC Acc No. CRL-1441 sa vrednosšću EC50 od 4.0 nM ili manjom, u testu koji podrazumeva inkubaciju 1 x 10 ćelija sa antitelom u početnoj koncentraciji od 30μg/ml i serijskim razblaženjima antitela od 1:10 diluciji; i (c) vezuje za isti epitop na humanom PTK7 kao i referentno antitelo, imajući: (i) varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; ili (ii) varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8; ili (iii) varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:10.

2. Antitelo, kao u patentnom zahtevu 1, koje je: (a) antitelo u punoj dužini lgG1 ili lgG4 izotip; ili (b) fragment antitela ili jedan lanac antitela.

3. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2, pri čemu se antitelo vezuje za ćelije VVilmsovog tumora sa vrednosšću EC50 od 3.5 nM ili manjom.

4. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, koje sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:12, varijabilni region teškog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:16,varijabilni region teškog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:20, varijabilni region lakog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:25, varijabilni region lakog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:31 and varijabilni region lakog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:37; or (b) varijabilni region teškog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 14, varijabilni region teškog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:18, varijabilni region teškog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:22, varijabilni region lakog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:28, varijabilni region lakog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:34 and varijabilni region lakog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:40; or (c) varijabilni region teškog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 13, varijabilni region teškog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:17, varijabilni region teškog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:21, varijabilni region lakog lanca CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:26, varijabilni region lakog lanca CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:32 and varijabilni region lakog lanca CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:38

5. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koje sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7; ili (b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10; ili (c) varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:8.

6. Imunokonjugat koji se sastoji od antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, koje je povezano sa terapeutskim sredstvom, kao što je citotoksin ili radioaktivni izotop.

7. Smeša koja sadrži antitelo, ili njegovog antigen-vezujući deo, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, ili imunokonjugat, kao u patentnom zahtevu 6, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

8. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5.

9. Ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline, kao u patentnom zahtevu 8.

10. Ćelija domaćina koja sadrži ekspresioni vektor, kao u patentnom zahtevu 9.

11. In-vitro postupak za proizvodnju anti-PTK7 antitelakoji obuhvata ekspresiju antitela u ćeliji domaćina, kao u patentnom zahtevu 10, kao i izolovanje antitela iz ćelije domaćina.

12. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, za korišćenje u postupku lečenja ili prevencije kancera koji je naznačen rastom tumorskih ćelija koje ekspresuju PTK7.

13. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, kao u patentnom zahtevu 12, pri čemu je kancer izdvojen od kancera kolona, kancera pluća, kancera dojke, pankreasnog kancera, melanoma, akutne mijeloidne leukemije, kancera bubrega, kancera mokraćne bešike, kancera jajnika i kancera prostate.