KR960016560B1 - 인체 과립구 콜로니 자극인자 폴리펩타이드 유도체, 이를 코드화하는 dna, dna를 함유하는 재조합 플라스미드, 플라스미드를 함유하는 미생물 및 폴리펩타이드를 제조하는 방법 - Google Patents
인체 과립구 콜로니 자극인자 폴리펩타이드 유도체, 이를 코드화하는 dna, dna를 함유하는 재조합 플라스미드, 플라스미드를 함유하는 미생물 및 폴리펩타이드를 제조하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
요약없음.
Description
제1도는 플라스미드 pCfTA1의 작제과정을 도시한 도.
제2도는 플라스미드 pCfTB20의 작제과정을 도시한 도.
제3도는 플라스미드 pCfTL23,38,35 및 41의 작제과정을 도시하는 도.
제4도는 플라스미드 pCfTM14, 17 및 113의 작제과정을 도시한 도.
제5도는 플라스미드 pCfWD1의 작제과정을 도시한 도.
제6도는 플라스미드 pCfT95K 19, pCfAA1 및 pCfAB5의 작제과정을 도시한 도.
제7도는 플라스미드 pCfTA3, pCfBB101, pCfBC52, 59, 42B1, 45, 76,77, 93, 95, 97, pCfBD28, 56 및 82의 작제과정을 도시한 도.
제8도는 플라스미드 pCfCB101, pCfCC52, 59, pCfCD28 및 56의 작제과정을 도시한 도.
제9(1)도 및 제9(2)도는 cDNA 합성 및 합성된 DNA-함유 재조합 플라스미드를 작제하기 위한 오까야마-버그법(Okayama-Berg method)에 필요한 작제과정을 도시한 도.
제10도는 플라스미드 pLA1의 작제과정을 도시한 도.
제11도는 플라스미드 pLSA1의 작제과정을 도시한 도.
제12도는 플라스미드 pCfTNS501의 작제과정을 도시한 도.
제13도는 플라스미드 pTrS20의 작제과정을 도시한 도.
제14도는 플라스미드 pCfTNS7 및 pCfTAArg 4S의 작제과정을 도시한 도.
제15도는 플라스미드 pCfTN 205 및 pCfTAArg4의 작제과정을 도시한 도.
제16도는 플라스미드 pCfTNS 301및 pCfTNS 401의 작제과정을 도시한 도.
제17(1)도 및 제17(2)도는 플라스미드 pCfBD28A17 및 pCfB28T17의 작제과정을 도시한 도이다.
본 발명은 신구한 인체 과립구 콜로니 자극인자(hG-CSF) 폴리펩타이드 유도체, 이들 폴리펩타이드 유도체에 대한 코드화 DNA가 삽입된 재조합 플라스미드, 이들 플라스미드를 함유하는 미생물 및 신규한 hG-CSF 폴리펩타이드 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
인체의 과립구 콜로니 자극이자(hG-CSF)는 조혈성 간세포가 증식 및 분화되어 일어나는 여러 가지 혈구 생성에 필수불가결한 폴리펩타이드의 일종이다. 이러한 인자의 주요 작용은 과립구, 특히 호중구(neutrophill)의 수적 증가를 촉진시키는 것이다. 호중구는 감염으로부터 생체를 보호하는데 중요한 역할을 한다.
그러나, 이들 수명은 짧기 때문에 전구체 세포의 증식 및 분화에 의해 끊임 없이 보충해야 하다. 증식성 종양에 대해 최근에 널리 사용된 치료법은 동시에 호중구 전구체의 성장을 저해하므로, 심한 부작용, 즉 암-보유 환자에서 호중구 보호작용의 감소현상을 일으켜, 이들 환자들이 더욱더 감염이 잘 되도록 한다. hG-CSF는 한편으로 호중구의 수적 증가를 촉진시켜 상기한 원치 않는 부작용을 해소시키고, 다른 한편으로는 감염성 질환을 예방하고 치료하는데 효과가 있는 것으로 기대된다. 또한, hG-CSF는 시험관내에서 백혈병 세포주의 분화를 야기시키는데 활성이 있으므로, 백혈병 치료제로서 유용할 수 있다. 본 발명에 따르는 hG-CSF 폴레펩타이드 유도체는 공지의 hG-CSF보다 hG-CSF 활성도가 탁월하여 약제로서 유용하리라 예상된다.
최근에 재조합체 DNA 기술이 급속히 진전됨에 따라, 혈구의 증식 및 분화에 필요한 단백질의 유전자가 잇달아 분리되었다. 그러한 인자는 미생물 또는 동물세포를 사용한 유전 공학기술에 의해 생산되고 있다.
hG-CSF의 유전자는 나가타(Nagata) 등에 의해, 인체의 편평세포 암종 세포주 CHU-Ⅱ로부터 분리되고 그의 염기 서열이 결정되었으며 이의 COS 세포내에서의 발현이 보고되었다[참고 : Nagata et al,. Nature, 319, 415(1986)]. 또한, 사우자(Sauza) 등은 인체 방광암 세포주 5637로부터 cDNA를 분리하여 그의 염기 서열을 결정하고 이것이 에스케리키아 콜라이(이. 콜라이)에서 발현됨을 보고하였다[참고 : Souza et al., Science 232, 61(1986)].
상기 2개의 cDNA에 의해 코드화된 단백질의 아미노산 서열은 본 발명자들의 정상인의 말초혈 대식세포에서 분리한 cDNA에 의해 코드화된 단백질의 아미노산 서열(표 1)과 일치한다.
[표 1]
발명의 목적은 고도의 특히 활성도 및 혈액내에서 고도의 안정성을 갖는 hG-CSF 폴리펩타이드 유도체를 저렴한 비용으로 대량 생산하는 방법에 있다.
본 발명자들은 표 1에 도시된 HG-CSF에 대한 cDNA를 변형시키고 변형된 cDNA가 삽입된 플라스미드를 수용하는 이. 콜라이 균주를 배양하거나, 프로테아제를 사용한 제한 폴리펩타이드 분해에 의해, 고도의 특이 활성도를 갖는 hG-CSF 폴리펩타이드 유도체를 생성할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 따르는 hG-CSF 폴리펩타이드 유도체는 치환 및/또는 결실이 이루어져, 표 1에 도시된 아미노산 서열을 갖는 hG-CSF 폴리펩타이드와 아미노산 서열 일부가 달라진다. 치환된 아미노산(들)은 N-말단 또는 그 부근에 위치하는 아미노산이다. 바람직하게는, N-말단으로부터 첫번째 내지 17번째 아미노산중에서 적어도 하나의 아미노산은 치환의 표적 대상이 되어야 한다. 마찬가지로, 결실될 아미노산들은 N-말단 또는 그 부근에 위치하는 아미노산이다. 바람직하게는, N-말단에서 제1번 내지 제11번 아미노산중의 적어도 하나의 아미노산은 결실되어야 한다.
본 발명에 따르는 재조합 플라스미드 위에서 언급한 hG-CSF 폴리펩타이드 유도체에 대한 코드화 DNA 단편을 DNA 발현능이 있는 적절한 플라스미드 내에 삽입시켜 수득한다.
본 발명의 hG-CSF 폴리펩타이드 유도체를 코드화한 DNA 단편으로는 hG-CSF를 코드화한 DNA의 표 1에 도시된 염기 서열의 제1번 내지 제51번 염기중에서 선택된 적어도 하나의 염기를 치환시킴으로써 생성된 것이 바람직하다.
제1도에 도시된 hG-CSF-코드화 DNA의 예로는 hG-CSF-코드화 전령(messenger) RNA를 재조합 DNA 기술로 역전사하여 수득된 cDNA(hG-CSF cDNA) 또는 염색체 DNA로부터 수득된 hG-CSF-코드화 DNA를 사용할 수 있다.
hG-CSF cDNA가 hG-CSF를 코드화한 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 특정예로는, 본 발명자들에 의해 수득된 플라스미드 pCSF1-2를 사용할 수 있다. pCSF1-2의 제조과정은 참조실시예 1에 기술되어 있다.
pCSF1-2에 함유된 hG-CSF cDNA는, M13 파아지를 사용한 디데옥시 서열 분석방법[J. Messing et al ; Gene, 19, 269(1982)]에 결정된 바와 같이, 표 1에 도시된 염기 서열을 갖는다.
pCSF1-2는 제1도에 도시된 제한효소지도를 갖는 플라스미드이며, 이를 함유하는 이. 콜라이 균주 즉, 이. 콜라이 ECSF1-2는 부다페스트 조약에 따라 1986년 11월 27일 이래로 공업과학 및 공학 기구인 발효 연구소(Fermentation Research Institute, FRI)에 기탁번호 FERM BP-1220[한국기탁기관 : 한국종균협회 : 기탁일 : 1988. 2. 2 ; 기탁번호 : KFCC-10511]으로 기탁되어 있다.
플라스미드내에 hG-CSF 폴리펩타이드 유도체-코드화 DNA를 삽입하는데는 어떠한 플라스미드라도 사용할 수 있으나, 언급한 DNA는 이. 콜라이에서 발현될 수 있어야 한다.
적절한 프로모터, 예를 들면, trp 또는 lac 프로모터의 하부 스트림에 위치한 부위에 외래성 DNA가 삽입되도록 하고 샤인-달가로노 서열(Shine-Dalgarono sequence, 이하에서는 SD 서열이라고 함)과 개시 코돈(ATG)간의 간격이 적절한 간격, 예를 들면, 6 내지 18개 염기쌍으로 조정되도록 하는 플라스미드가 유리하게 사용될 수 있다.
이러한 플라스미드의 적절한 예로는 pKYP10(미합중국 특허 제4,686,191호), pLSA1(참조실시예 3), pGEL1[Sekine et al, : Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)], pKY26[일본국 특허원(OPI) 제48699/87호 ; 용어 "OPI"는 공개되었으나 심사하지 않은 특허원을 의미한다] 및 pBR322[Bolivar et al. : Gene, 2, 95(1977)]가 언급될 수 있다.
hG-CSF 폴리펩타이드 또는 이의 유도체에 대한 코드화 DNA와 벡터 DNA와의 재조합은 양 DNA를 제한효소(들)로 분해하고, 이어서 T4 DNA 리가아제로 연결하는 재조합 DNA 기술로 수행할 수 있다. 연결시키는 경우에는, 제한효소 분해로 생긴 DNA 단편 말단을, 경우에 따라, DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편을 사용한 충전 반응을 이용하거나 T4 DNA 폴리머라제를 사용한 트리밍(trimming) 반응을 이용함으로써 처리할 수 있으며, DNA 링커 기법 또는 적용할 수 있다.
DNA를 내부에 이입하기 위한 플라스미드로서 pCSF1-2(hG-CSF cDNA에 대해), pGEL1, pKYP10, pKYP26, pBR322 또는 pLSA1와, 경우에 따라, 화학적으로 합성된 DNA 링커 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 기법을 사용하여, hG-CSF 폴리펩타이드 유도체-코드화 DNA가 삽입되는 재조합 플라스미드를 작제하는 실례는 이하에 기술하였다.
제1도에 도시한 바와 같이, pCSF1-2[약 4.5 Kilobases(이하에서는 kb라고 하)]를 Apa I 및 BamH I으로 절단하고, 약 1.5kb의 DNA 단편을 겔화 온도가 낮은 아가로즈 겔 전기영동법(low gelling temperature agarose gel electrophoresis ; LGT법)[참고 : L. Wieslander : Analytical Biochemistry, 98, 305(1979)]으로 정제한다.
이어서, pLSA1을 BanⅢ 및 BamHI으로 절단하고, 약 2.8kb의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 이렇게 하여 수득한 양 단편과 제1도에 도시된 합성 DNA를 T4 DNA 리가아제로 연결시킨 pCfTA1을 수득한다.
이어서, 제2도에 도시한 바와 같이, pCfTA1을 BamH I으로 절단하고, 클레노우 단편으로 처리하여 돌출말단을 평활 말단으로 전환시킨 다음, EcoR I으로 추가로 절단하고, 약 2.5kb의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 별도로, pCfTA1을 EcoR I 및 Dra I으로 절단하여 약 1.0kb의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 이렇게 하여 수득한 DNA 단편들은 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결시킴으로써 pCfTB20을 수득한다.
또한, 제3도에 도시한 바와 같이, pCSF1-2를 Apa I 및 BamH I으로 절단하고 약 1.5kb의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 이와는 별도로, HindⅢ, BamH I 및 Pst I를 사용하여 pGEL1을 절단하여, 약 1.7kb의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 또한, pKYP10을 Pst I 및 BanⅢ로 절단하여, 약 1.1kbn의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 이를 3개의 DNA 단편을 제3도에 도시된 합성 DNA와 연결시켜 pCfTL23, pCfTL38, pCfTL35 및 pCfTL41을 수득하는 한편, 상기 3개의 DNA 단편을 제4도에 도시된 합성 DNA와 연결시켜 pCfTM14, pCfTM17 및 pCfTM113을 수득했다.
제5도에 도시한 바와 같이, pCfTA1을 BanⅢ 및 Stu I으로 절단하고 약 1.3kb의 hG-CSF cDNA-함유 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 이와는 별도로, pKY26을 BamH I으로 절단하고, DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편으로 처리하여 돌출 말단을 평활 말단으로 전환시킨후, Pst I으로 추가로 절단하여 약 1.8kb의 DNA를 LGT법으로 정제한다. 또한, 별개로 pGEL1을 BanⅢ 및 Pst I으로 절단하고 약 1.0kb의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 이렇게 하여 수득한 3개의 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 이용하여 함께 연결시켜 pCfWD1을 수득한다.
또한, 제6도에 도시한 바와 같이, pCfTL38을 HindⅢ 및 BglⅢ으로 절단하여, 약 2.6kb의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 이와는 별도로, pCfTL38을 HiNdⅢ, BamH I 및 Dpn I으로 절단하고 약 300bp(염기쌍)의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 또한, 별도로, pCfTB20을 Ava I으로 절단하고 클레노우 단편으로 처리하여 돌출 말단을 제거한 다음, BglⅡ로 추가로 절단하여, 약 480bp의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 이렇게 하여 수득한 3개의 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 이용하여 함께 연결시켜 pCfT95K19를 수득한다. 제6도에 도시한 바와 같이, pCfT95K19를 BanⅢ 및 Bgl I으로 절단하고, 약 1.0kb의 DNA를 LGT법으로 정제하며, 별도로 pCfT95K19를 BglⅠ만으로 절단하여 약 1.8kb의 DNA 단편을 언급한 방법으로 정제한다. 또한 별도로, pCfT95K19를 Bgl I 및 Sau3A로 절단하고 약 350bp의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 수득된 3개의 DNA 단편을 제6도에 도시된 합성 DNA와 합성 DNA의 중간(즉, 중간 아래로)에서 서로 연결시켜 pCfAA1을 수득한다. 이어서, 제6도에 도시한 바와 같이, pCfAA1을 Xho I 및 Bgl I으로 절단하고 약 3.0kb의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 이 단편과, pCfT95K19의 위에서 언급한 Bgl I-Sau 3A 단편(약 350bp) 및 제6도에 도시한 합성 DNA를 함께, 합성 DNA의 하부 스트림에서 T4 DNA 리가아제를 이용하여 연결시켜 pCfAB5 및 pCfAB14를 수득한다.
또한, 제7도에 도시한 바와 같이, pCfAB5를 Ava I 및 Bgl Ⅱ로 절단하고 LGT법으로 약 2.8kb의 DNA 단편을 정제한다. 별도로, Bgl Ⅱ 및 Ava I으로 pCfWD1을 절단하여 LGT법으로 약 1.3kb의 DNA를 정제한다. 이렇게 하여 수득한 2개의 단편을 T4 DNA 리가아제로 힘께 연결시켜 pCfBA8을 수득한다. 한편, pCfAB14를 Ava I 및 Bgl Ⅱ로 절단하고, LGT법으로 약 2.8kb의 DNA 단편을 정제한 다음, 이 단편을, T4 DNA 리가아제를 사용함으로써, 위에서 언급한 BglⅡ 및 Ava I에 절단에 의해 pCfWD1으로부터 유도된 1.3kb의 DNA 단편과 연결시켜 pCfBA32를 수득할 수 있다. 또한, 제7도에 도시한 바와 같이, pCfBA8을 BanⅢ, BglⅡ 및 Xho I으로 절단하고 LGT법으로 약 1.4kb의 DNA 단편 및 약 2.7kb의 DNA 단편을 정제한다. 이렇게 하여 수득한 2개의 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 제7도에 도시한 합성 DNA 링커와 연결시킴으로써 pCfBB101, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD28, pCfBD56, pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97 및 pCfBD82를 수득할 수 있다.
제8도에 도시한 바와 같이, pBR322를 Pst I으로 절단하고 돌출 말단을 T4 DNA 폴리머라제로 잘라낸 다음 T4 DNA 리가아제를 사용하여 BglⅡ 링커를 삽입시키고 EcoR I 및 BglⅡ로 추가로 절단한 후에, LGT법으로 약 3.6kb의 DNA 단편을 정제한다.
상기 방법으로 수득된 플라스미드 pCfBB101, pCfBC52, pCfBC59, pCfB28 및 pCfBD56을 각기 EcoRⅠ 및 BglⅡ로 절단하고 LGT법으로 약 1.8kb의 DNA 단편을 정제한다. 각각의 1.8kb DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 이용하여 pBR322-유도 3.6kb DNA 단편에 연결시킨다. 따라서, 위에서 언급한 각각의 플라스미드에 상응하는 pCfCB101, pCfCC52, pCfCC59, pCfCD28 및 pCfCD56을 수득한다.
한편, pCfBA8을 BanⅢ, BglⅡ으로 절단하고 약 2.7kb의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 별도로, pCfBA8을 Xho I 및 BglⅡ로 절단하고 약 1.4kb의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 수득한 2개의 단편과 제14도에 도시된 합성 DNA 링커를 연결시키면 pCfTNS7 및 pCfTAArg4S가 수득된다. 또한, 제15도에 도시한 바와 같이, pCfTNS7을 Pvu I 및 Xho I으로 절단하고 약 1kb의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 이와는 별도로, pCfBA32를 Pvu I 및 Xho I으로 절단하고, LGT법으로 약 3kb의 DNA 단편을 정제한다. 수득된 2개의 단편을 T4 DNA 리가아제로 함께 연결하여 pCfTN205를 수득한다. 마찬가지로, pCfTAArg4S를 PvuⅠ 및 XhoⅠ으로 절단하고 약 1kb의 단편을 LGT법으로 정제한 다음, 이 단편을, T4 DNA 리가아제를 사용하여 pCfBA32로부터 PvuⅠ 및 XhoⅠ의 절단에 의해 유도된 약 3kb의 DNA 단편에 연결시켜 pCfTAArg4를 수득한다. 또한, pCfBA8을 BanⅢ 및 BglⅡ로 절단하고 약 2.7kb의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 별도로, pCfBA8을 Xho I 및 BglⅡ로 절단하고, 약 1.4kb의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 이렇게 하여 수득한 2개의 단편과 제16도에 도시된 합성 링커를, T4 DNA 리가아제를 사용하여 함께 연결하면 pCfTNS301 및 pCfTNS401이 수득된다. 또한, 제12도에 도시한 바와 같이, pCfBA8을 Xho I으로 절단하고 클레노우 단편 처리에 의해 돌출 말단을 평활 말단으로 전환시킨 다음 pvu I으로 추가로 절단하고 LGT법으로 약 3kb의 DNA 단편을 정제한다. 별도로, ATG 벡터 PTrS20(참조실시예 4)을 Sac I으로 절단한 다음 클레노우 단편 처리에 의해 돌출 말단을 평활 말단으로 전환시킨다. Pvu I으로 더 절단한 후, 약 1kb의 DNA 단편을 LGT법으로 정제하다. 이렇게 하여 수득한 2개의 단편을 T4 DNA 리가아제로 함께 연결시켜 pCfTNS501을 얻는다.
부위-특이적 돌연변이 유발법을 사용하는 실시예에 있어서, pCfBD28을 제17에 도시한 바와 같이, BanⅢ 및 Pst I으로 절단하고, 약 210bp의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 별도로, M13 파아지 벡터 M13mp19RF DNA를 Acc I 및 Pst I으로 절단하고 약 7.24kb의 DNA 단편을 LGT법으로 정제한다. 이렇게 하여 수득한 2개의 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제로 함께 연결시켜 pt19BD28N을 얻는다. 다음에는, 이 pt19BD28N을 이. 콜라이 JM105에 형질감염시키고 수득된 상으로부터 1-본쇄 pt19BD28N을 회수하다. 유사하게, 제17도에 도시한 바와 같이, M13mp19RF DNA를 HindⅢ 및 EcoR I으로 절단하고 LGT법으로 약 7.2kb의 DNA 단편을 정제한다. 이 7.2kb의 DNA 단편을 상기 방법으로 수득된 1-본쇄 pt19BD28N과 합하고, 변성처리한 다음, 아닐링하여 갭(gap)이 있는 2-본쇄 DNA를 생성시킨다. 생성된 갭이 있는 2-본쇄 DNA를 LGT법으로 정제한다. 이어서, 이 DNA를 제17도에 도시된 합성 DNA와 아닐랑하고 클레노우 단편 및 T4 DNA 리가아제를 사용하여 환상으로 만든다. 이 환상 DNA를 이. 콜라이 JM105에 형질 감염시켜, 그 내부에서 부위-특이적 돌연변이유발을 도입시킴에 따라, pt19BD28NA17 및 pt19BD28NT17이 수득된다. 또한, 제17도에 도시된 바와 같이, pt19BD28NA17 및 pt19BD27NT17을 Ava I 및 Xho I으로 절단하고 약 110bp의 DNA 단편 각각을 LGT법으로 정제한다. 별도로, pCfBD28을 Xho I 및 BglⅡ로 절단하여 LGT법으로 약 2.7kb의 DNA 단편을 정제하다. 또한 별개로, pCfBD28을 BglⅡ 및 Ava I으로 절단하고 LGT법으로 약 1.29kb의 DNA 단편을 정제한다. 이렇게 하여 수득된 약 110bp, 약 2.74kb 및 1.29kb의 DNA 단편들을 T4 DNA 리가아제로 연결시켜 pCfBD28A17 및 pCfBD28T17을 각각 수득한다.
상기의 재조합과정의 반응조건은 일반적으로 다음과 같다 :
제한효소(들)의 존재하에서 DNA 분해반응은 일반적으로 2 내지 200mM(바람직하게는 10 내지 40mM)트리스-HCl(pH 6.0-9.5, 바람직하게는 pH 7.8-8.0), 0 내지 200mM NaCl 및 2 내지 20mM(바라직하게는 5 내지 10mM) MgCl2를 함유한 반응 배지중의 DNA 0.1 내지 20㎍을 사용하여 20 내지 70℃(최적온도는 사용된 제한효소(들)에 따라 달라진다)에서 15분 내지 24시간 동안 수행한다. 제한효소들은 각각 DNA ㎍당 0.1내지 100유니트(바람직하게는 1 내지 3유니트)의 양으로 사용한다. 반응 종결은 55 내지 75℃에서 5 내지 30분간 가열함으로써 이루어진다. 또한, 페놀 또는 디에틸 피로카보네이트와 같은 시약으로 제한효소를 불활성화시킬 수도 있다.
제한효소 분해로 생성된 DNA 단편 또는 갭이 있는 2-분쇄 DNA는 다른 여러 방법중에서 LGT법이나 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법[참고 : A.M. Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560(1977)]으로 정제할 수 있다.
DNA 단편 연결반응은 T4 DNA 리가아제 0.3 내지 10유니트를 사용하여, 2 내지 200mM(바람직하게는 10 내지 40mM) 트리스-HCl(pH 6.1 내지 9.5, 바람직하게는 pH 7.8 내지 8.0), 2 내지 20mM(바람직하게는 5 내지 10mM) MgCl2, 0.1 내지 10mM(바람직하게는 0.5 내지 2.0mM) ATP 및 1 내지 50mM(바람직하게는 5 내지 10mM) 디티오스 레이톨을 함유한 반응 배지중, 1 내지 37℃(바람직하게는 3 내지 20℃)에서 15분 내지 72시간(바람직하게는 2 내지 20시간) 동안 수행한다.
연결반응으로 수득한 재조합 플라스미드 DNA는, 경우에 따라, 코헨 등의 형질전환방법[S.N. Cohen et at. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)]에 따라 이. 콜라이에 이입시킬 수 있다.
연결반응에 의해 생성된 재조합 M13 파아지 RF DNA는, 필요에 따라, 공지의 형질감염방법[참고 : Yoshiyuki Kuchino et al., Tanpakushitsu, Kakusan, Koso(Protein, Nucleic Acid and Enzyme), 29, 294(1984)]을 사용하여, 이. 콜라이 JM105(참고 : J. Messing et al. ; Gene, 33, 103(1985)]에 도입한다.
재조합체 플라스미드 DNA 및 재조합체 M13 파아지 RF DNA는 각기 예를들어 버른 보임 등의 방법(참고 : H.C. Birnboim et al. : Nucleic Acids Res., 7, 1513(1973)]에 따라 이. 콜라이 형질전환체로부터 분리할 수 있다.
재조합체 M13 파아지에서 1-본쇄 DNA를 분리하는 반응은 공지의 방법[참고 : Yoshiyuki Kuchimo et al. : Tanpakushitsu, Kakusan Koso, 29, 294(1984)]으로 수행한다.
플라스미드 DNA는 1 내지 10개의 제한효소로 절단한 다음, 아가로즈 겔 전기영동법 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 절단부위를 검사한다. 또한, 경우에 따라, M13 파아지를 사용한 디데옥시 서열 분석방법[참고 : J. Messing et al. : Gene, 19, 269(1982)]으로 DNA 염기 서열 결정을 수행한다.
목적하는 재조합 플라스미드 DNA는 상술한 바와 같은 조건하에서 수득할 수 있다.
본 발명의 hG-CSF 폴리펩타이드 유도체는 다음 방법으로 생성할 수 있다.
이. 콜라이 K-12 HB101에 적절한 플라스미드(예 : pCfBD28)를 형질전환시키고, 플라스미드(예 : pCfBD28)-함유 이. 콜라이 형질전환체를 암피실린 내성(이하에서는 Apr이라 함) 콜리니로부터 선별해낸다. 이. 콜라이의 플라스미드(예 : pCfBD28)-함유 균주를 배지내에서 증식시키면 배양액내에서 hG-CSF 폴리펩타이드 유도체가 생성될 수 있다.
배지로는 합성 배지나 천연 배지 어느 것이나 사용할 수 있으나, 단 배지는 이. 콜라이의 증식 및 hG-CSF 폴리펩타이드 유도체의 생성에 적절해야 한다.
사용가능한 탄소 공급원으로는 글루코즈, 프럭토즈, 락토오즈, 글리세롤, 만니톨 및 소르비톨 등이 있으며, 질소 공급원으로는 NH4Cl, (NH4)2SO4, 카즈아미노산, 효모 추출물, 폴리펩톤, 육즙, 박토트립톤, 옥수수 침지액 등을 사용할 수 있고 K2HPO4, KH2PO4, NaCl, MgSO4, 비타민 B1, MgCl2등을 다른 영양 공급원으로서 사용할 수 있다. 배양은 호기조건하에 pH 5.5 내지 8.5 및 18 내지 40℃의 온도에서 교반하면서 수행 한다. 5 내지 90시간 동안 배양하면 배양 균체중에는 hG-CSF 폴리펩타이드 유도체가 축적된다. 이어서, 배양액으로부터 세포를 수거해, 초음파 처리로 파괴시킨다. 원심분리하여 세포 잔사를 얻는다. 마르스톤 등의 방법[참고. F.A.O. Marston et al. BIO/TECHNOLOGY,2, 800(1984)]에따라, 세포 잔사에서 hG-CSF 폴리펩타이드 유도체를 추출하여 정제, 가용화 및 재생시킨다. 마우스 골수 세포를 언급한 유도체로 처리하고, 연질 한천중에 생성된 다수의 콜로니를 지표로 사용하는 방법으로 hG-CSF 폴리펩타이드 유도체를 분석한다.
본 발명을 실시함에 있어서 hG-CSF 활성도는 다음과 같은 방법으로 측정한다. 생후 8 내지 12주된 C3H/He종 마우스 숫컷(Shizuoka Laboratory Animal Center에서 입수)의 대퇴골에서 골수세포를 무균 채취하야, 태송아지 혈청(FBS) 10%를 보충한 α-최소 필수 배지(Flow laboratories ; 이하에서는 α-MEM 이라 칭함)에 현탁시킨다. 칼럼에 충전된 나일론 울(0.3g ; Wako Pure Chemical Industries의 Nylon fiber 146-04231)에 상기 세포 현탁액(약 5×107세포수) 1.5ml를 주입시키고 37℃의 5% CO2배양기내에서 90분간 반응이 진행되도록 한다. 이어서, 미리 37℃로 가온시킨 α-MEM을 칼럼에 통과시키고, 나일론 울에 흡착되지 않은 골수세포를 유출물 분획으로서 수거한다. 이 세포를 α-MEM으로 1회 세척하고 세포 농도를 조정하여 예정농도가 되도록 만든다.
그후에, 오까베 등의 방법[참고 : T. Okabe, et al. ; Cancer Research, 44, 4503-4506(1986)]으로 조골 수성 간세포 콜로니 형성력을 측정한다. 따라서, 상기 방법으로 제조된 골수세포 현탁액 0.2ml(2×106세포수/ml)를 α-MEM 0.2ml, FBS 0.4ml 및 2배-희석 샘플 0.2ml의 혼합물과 합한다. 42℃로 유지된 0.6% 한천(Difco 제품, 정제한천 0506-01) 용약 동량(1.0ml)을 상기 혼합물과 합하고, 생성된 혼합물은 24-웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc' Multidish #143982)에 0.5ml 분량으로 분주한다(5×104세포수/웰, n=3). 5% CO2배양기내에서 37℃로 7일간 배양한 후, 현미경하(Olympus X40)에서 40 이상의 세포를 포함하는 콜로니의 수를 센다. 게수후에, 각각의 콜로니를 조심스럽게 슬라이드 유리 위로 옮기고, 아세톤-포르말린 혼합용액으로 30분간 정착시킨 다음, 구보따 등의 방법[참고 : K. Kubota et al. ; Exp. Mematology, 8, 339-344(1980)]으로 에스터라제 이중 염색을 수행하여 콜로니를 동정한다.
2배 희석물에 대해 수행된 콜로니 형성 시험의 계수 결과를 바탕으로 다음과 같이 각 샘플의 효능을 산정한다. 표준물로서 사용된 손상되지 않은 상태 그대로의 G-CSF로 수득한 최대 콜로니 형성치 절반으로 수득되는 활성도를 50유니트로 정의한다. 효능(유니트)은 이러한 정의에 따라, 샘플의 희석인수를 또한 고려하여 ml당 활성도로 환산하기 위해 20배 하여 산정한다. 툭이활성도는 단백질 유니트 중량(mg)당 효능으로 환산된다(유니트/mg).
hG-CSF 폴리펩타이드의 N-말단측에 하나 이상의 아미노산이 결실된 hG-CSF 폴리펩타이드 유도체는 또한 효소 분해에 의해 수득될 수 있다.
이 유도체는 물론, 출발물질로서 천연 hG-CSF를 효소분해하여 생성할 수 있다. 그러나, 천연 hG-CSF는 효소(프로테아제)와의 반응성이 낮기 때문에, 고도의 활성도를 갖는 그러한 유도체를 양호한 수율로 생성하기 위해서는 프로테아제에 대한 반응성이 증가된 변형 hG-CSF를 사용하는 것이 바람직하다.
그러한 출발물질로 바람직하게 사용되는 것은 hG-CSF 폴리펩타이드의 N- 말단에서 하나 이상의 아미노산을 치환시켜 생성되는 표 2에 도시된 변형 hG-CSF(a), (b), (c) 및 (d)이다. 변형체(a),(b),(c) 및 (d)는 상응하는 염기 서열을 갖는 플라스미드, 즉, pCfBC59(NC59), pCfBD28(ND28), pCfBC95(NC95) 및 pCfTAArg4S(Arg4S) 각각이 함유된 세균을 배양한 다음, 공지의 방법으로 분리정제하여 수득할 수 있다.
적절한 효소로는 세린 프로테아제 및 티올 프로테아제와 같은 엔도프로테아제가 있으며, 더욱 상세하게는, 예를 들면, 서브틸리신 A, 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 칼스버그, 서브틸리신 노브, 프로테이나제 K, 나가제, 터몰리신, 엔도프로테이나제 Arg-C, 트립신 및 α-키모트립신이 언급될 수 있다. 효소는 출발물질 mg당 3.4×10-6내지 8.5×10-3유니트의 양으로 사용된다.
[표 2]
N0말단 프로테아제-감응성 hG-CSF 유도체의 예
*치환후의 아미노산, 어깨숫자는 해당 아미노산의 N-말단으로부터의 위치 번호를 지시하는 것이다.
출발물질을 트리스-염산염 완충액 또는 인산염 완충액과 같은 수용액에 용해시키고, 효소를 가한 다음, 10 내지 37℃에서 30분 내지 3일간 효소 반응을 수행한다.
전(全) 단백질 정량 및 단백질 정량은 다음 방법으로 수행한다 :
전 단백질 정량은 엠. 엠. 브래드포드의 방법[M.M Bradford : Anal. Biochem, 72, 248(1976)]으로 수행한다.
단백질 정량은 램리의 방법[U.K. Laemmli : Nature, 227, 680(1970)]에 따라 SDS-폴리아크릴 아미드겔 전기영동으로 측정한 다음, 크로마토스캐너(Chromatoscanner ; Shimadzu CS-930)에서 계측하여 수행한다.
효소에 의한 절단으로 수득된 펩타이드의 N-말단 아미노산 서열은 자동 아미노산 서열 결정기, "기체-상 단백질 서열 결정기 모델 470A"(Applied Biosystems)를 스펙트라 피직스(spectra phsics) 고성능 액체 크로마토그라피와 병용하여 결정한다.
다음 실시예는 본 발명을 설명하는 것이다.
실시예 1
hG-CSF 발현 플라스미드 pCfTA1의 작제(제1도 참조)
참조 실시에 1에서 수득한 pCSF1-2 DNA의 일부 2㎍을 10mM 트리스-HCl(pH 7.5) 7mM MgCl2, 6mM 2-머캅토에탄올 및 100mM NaCl이 함유된 용액(이하에서는 "Y-100 완충액"이라고 함) 20μl의 전량에 용해시키고, 제한효소 Apa I(Boehringer Mannheim 제품) 및 BamH I(Takara shuzo 제품 : 이하에서 달리 언급한 바 없다면 사용된 모든 제한효소는 Takara shuzo의 제품임) 각각 10유니트씩을 가하여, 37℃에서 4시간 동안 반응을 수행한다. 반응 혼합물로부터 LGT법으로 1.5kb DNA 단편 0.4㎍을 정제 및 회수한다.
또한, 별도로, 참조실시예 3의 방법으로 제조한 플라스미드 pLSA1 2㎍을 Y-100 완충액 20μl에 용해시키고 제한효소 BanⅢ(Toyobo 제품) 및 BamH I을 각각 10유니트씩 가하여 37℃에서 4시간 동안 반응을 수행한다. 이 반응 혼합물로부터 LGT법으로 2.8kb DNA 단편 0.8㎍을 정제 및 회수한다.
한편, 다음과 같은 DNA 링커를 합성하여 성숙 hG-CSF 폴리펩타이드의 제1번 내지 제5번 N-말단 아미노산을 코드화한 코돈[트레오닌1(ACA 또는 ACT), 프롤린2(CCA 또는 CCT), 로이신3(CTA), 글리신4(GGC) 및 프롤린5(CCC)] 및 발현에 필요한 개시 코돈(ATG)이 제공되도록 하고, 또한 트립토판 프로모터(Ptrp)의 하부 스트림의 위치에 ATG와 SD 서열간의 간격이 6 내지 18bp의 적절한 길이로 조정되도록 한다.
먼저, 포스포트리에스테르 방법[참고 : R. Crea et al. : Proc. Nat. Sci. USA, 75, 5765(1978)]에 따라 26-량체 및 20-량체 1-본쇄 DNA를 합성한다. 26-량체 및 20-량체(각각 2㎍씩)를 50mM 트리스-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl2, 5mM 디티오 스테이톨, 0.1mM EDTA 및 1mM ATP가 함유된 완충액(이하에서는 "T4 키나아제 완충액"이라고 함) 40μl에 용해시키고, T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(Takara shuzo 제품 ; 이하에서는 동종물을 공급해야함) 30유니트를 가하여, 37℃에서 60분간 포스포릴화 반응을 수행한다.
20mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 10mM 디티오 스테이톨, 1mM ATP를 함유하는 완충액(이하에서는 "T4 리나아제 완충액"이라고 함) 25μl에 상기 방법으로 수득한 pCSF1-2-유도된 Apa I-Bam I 단편(1.5kb) 0.4㎍ 및 상기 방법으로 수득한 pLSA1-유도된 BanⅢ-BamH I 단편(2.8kb) 0.2μ을 용해시키고 혼합물에 위에서 언급한 DNA 링커 0.1㎍을 가한다. 이 혼합용액에 T4 DNA 리가아제(Takara shuzo 제품 ; 이하에서는 동종물을 공급할 것) 6유니트를 더 가하여, 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다.
이렇게 하여 수득한 재조합체 플라스미드 혼합물을 코헨 등의 방법[참고 : S.N. Cohen et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972) ; 이하에서 이. 콜라이 형질전환에는 이 방법으로 사용함]에 따라 이. 콜라이 HB101[참고 : Bolivar et al., : Gene, 2, 75(1977)]에 형질전환시킨 다음, Apr콜로니를 수득한다. 이 콜로니의 배양세포로부터 공지방법[참고 : H.C. Birnboim et al. ; Nucleic Acids Res., 7, 1513(1979)](이하에서, 플라스미드 DNA 분리에는 이 방법을 사용함)을 이용하여 플라스미드 DNA를 회수한다. 수득된 플라스미드의 구조는 BanⅢ, Rsa I, Pst I, HindⅢ 및 BglⅡ로 절단한 다음 아가로즈 겔 전기영동으로 확인한다. 이 플라스미드는 pCfTA1이라 칭한다. BanⅢ 및 HindⅢ 부위 근처에서 pCfTA1의 염기 서열은 M13 파아지를 사용한 디데옥시 서열 분석에 의해 다음과 같이 확인되었다 :
hG-CSF cDNA의 3'-비해독 영역 일부가 결실된 플라스미드 pCfTB20의 작제
Y-100 완충액 20μl에 실시예 1에서 수득한 hG-CSF 발현 플라스미드 pCfTA1(4.3kb) 2㎍을 용해시키고, 제한효소 BamH I 4유니트를 가하여, 37℃에서 4시간 동안 분해반응을 수행한다. 페놀 및 클로로포름 동량의 혼합물로 추출(이하에서는 페놀-클로로포름 추출이라고 함)한 후에, 에탄올을 사용하여 침전시킴으로써 DNA 단편 1.8㎍을 회수할 수 있다. 이 DNA 단편을 50mM 트리스-HCl(pH 7.8), 7mM MgCl2및 6mM 머캅토 에탄올이 함유된 완충액(이하에서는 "클레노우 완충액"이라고 함) 20μl에 용해시키고, dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP를 각각 1mM의 농도로 가한 다음 DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편(Takara shuzo 제품 ; 이하에서는 동종물을 공급함) 4유니트를 더 가하고 실온에서 1시간 동안 반응을 수행하여, 돌출 말단이 평활말단으로 전환되도록 한다. 페놀-클로로포름 추출후에, DNA 단편 1.6㎍을 에탄올 침전으로 회수한다. 이 DNA 단편을 Y-100 완충액 20μl중에 용해시키고 EcoR I 10유니트를 가하여, 37℃에서 4시간 동안 절단반응을 수행한다. 이 반응 혼합물로부터, LGT법으로 2.5kb DNA 단편[BamH I(평활)-EcoR I 단편] 1㎍을 수득한다.
이와는 별도로, pCfTA1 2㎍을 Y-100 완충액 20μl에 용해시키고 EcoR I 10유니트를 가하여, 37℃에서 4시간 동안 절단반응이 이루어지도록 한다. 그 후에, NaCl을 가하여 NaCl 농도가 150mM로 되도록 한 다음, Dra I 10유니트를 가하여 37℃에서 4시간 동안 절단반응을 수행한다. 아가로즈 겔 전기영동으로 절단이 완결되었는지를 확인한 후에, LGT법으로 hG-CSF cDNA-함유 1.0kb DNA 단편(EcoR I-Dra I 단편) 0.2㎍을 정제 및 회수한다.
각기 상기 방법으로 수득된 BamH I(평활)-EcoR I 단편(2.5kb) 0.2㎍ 및 EcoR I-Dra I 단편(1.0kb) 0.2㎍을 T4 리가아제 완충액 25μl에 용해시키고 생성된 혼합물에 T4 DNA 리가아제 6유니트를 가하여, 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다.
이렇게 하여 수득한 재조합체 플라스미드 혼합물을 이. 콜라이 HB101로 형질전환시키고 Apr콜로니를 수득한다. 이 콜로니로부터 유도된 배양세포에서 플라스미드 DNA를 회수한다. 수득된 플라스미드의 구조는 HindⅢ 및 Pst I으로 절단한 뒤, 아가로즈 겔 전기영동으로 확인한다. 이 플라스미드는 pCfTB20이라고 한다.
실시예 3
hG-CSF의 N-말단 아미노산의 치환으로 생성되는 폴리펩타이드를 코드화한 플라스미드, 즉 pCfTL23, pCfTL38, pCfTL35 및 pCfTL41의 작제(제3도 참조)
참조실시예 1의 방법으로 수득한 pCSF1-2(4.5kb) 3㎍을 Y-100 완충액 60㎕에 용해시키고 제한효소 Apa I (Boehringer Mannheim 제품) 및 BamH I 각각 8유니트씩을 가하여, 37℃에서 3시간 동안 절단반응을 수행한다. 이 반응 혼합물로부터, hG-CSF 유전자 대부분을 함유하는 약 1.5kb 및 DNA 단편(Apa I - BamH I 단편) 약 0.4㎍을 수득한다.
이와는 별도로, pGEL1[참고 : Sekine et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4306(1985) ; 이. 콜라이 IGEL 1 FERM BP-629의 배양물로부터 통상의 방법으로 수득함 ; 3.4kb] 2㎍을 Y-100 완충액 40㎕에 용해시키고, 제한효소 HindⅢ, BamH I 및 Pst I 각각 4유니트씩을 가하여, 37℃에서 3시간 동안 절단반응이 진행되도록 한다. 반응 혼합물로부터, LGT법으로 지방 단백질-유도된 터미네이터(terminator)를 함유하는 약 1.7kb 의 DNA 단편(Pat I - BamH I 단편) 약 0.5㎍을 수득한다.
또한, 별도로, 일본국 특허원(OPI) 제110600/83호에 기술된 방법으로 제조한 pKYP10 3㎍을 Y-100 완충액 60㎕에 용해시키고 제한효소 BanⅢ(Toyobo 제품) 및 Pst I 각각 6유니트씩을 가하여, 37℃에서 3시간 동안 절단반응을 수행한다. 반응 혼합물로부터, LGT법으로 트립토판 프로모터(Ptrp)를 함유하는 약 1.1kb의 DNA 단편(BanⅢ-Pst I 단편) 약 0.5㎍을 수득한다.
한편, 성숙 hG-CSF의 N-말단 아미노산, 즉 Thr을 Ser, Cys, Arg 또는 Gly로 대치시키고, 발현에 필요한 개시 코돈(ATG)을 제공할 필요가 있으며, 또한 Ptrp로부터 하부 스트립에 있는 SD 서열과 ATG간의 간격을 6 내지 18bp의 적절한 길이로 조정할 필요가 있기 때문에, 또한 다음 이유로 인하여, 다음과 같은 DNA 링커를 합성한다 :
상기식에서, N은 염기 G, A, T 및 C중 하나이다.
먼저, 통상의 포스포트리에스테르 방법으로 26-량체 및 20-량체 1-본쇄 DNA를 합성한다. 26-량체 및 20-량체(각기 20pmole씩)를 T4 키나아제 완충액 40㎕에 용해시키고 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(Takara shuzo 제품) 6유니트를 가하여, 37℃에서 60분간 포스포릴화 반응을 수행한다.
다음에는, 각기 상기한 방법으로 수득된 pCSF1-2-유도된 Apa I - BamH I 단편(약 1.5kb 단편) 0.3㎍, pGEL1-유도된 Pst I -BamH I 단편(약 1.7kb) 0.2㎍ 및 발현용 벡터 pKY10-유도된 BanⅢ-Pst I 단편 (약 1.1kb) 0.2㎍을 T4 리가아제 완충액 30μl의 전량에 용해시키고 약 1pmole의 상기 언급한 DNA 링커를 혼합 용액에 가한다. T4 DNA 리가아제 6유니트를 더 가한 후에, 4℃에서 18시간 동안 연결반응이 이루어지도록 한다.
재조합 플라스미드-함유 반응 혼합물을 이. 콜라이 C600 SF8[FERM BP-1070(한국기탁기관 : 한국종균협회 : 기탁일 : 1988.2.2 : 기탁번호 : KFCC-10510) ; Cameron et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72,3416(1975)]에서 형질전환시키고 Apr콜로니를 수득한다. 이들 형질전환체로부터, 공지의 방법으로 플라스미드 DNA를 분리정제한다. 플라스미드 DNA 각각의 구조는, Pst I , EcoR I 및 BanⅢ으로 절단하고, 이어서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인한다. 이러한 방법으로 수득한 플라스미드는 제3도에 나타낸 바와 같이 pCfTL23, pCfTL38, pCfTL35 및 pCfTL41이라고 한다. 언급한 플라스미드에서 hG-CSF 유도체 유전자 N-말단 부근의 서열은 M13 파아지를 사용한 디데옥시 서열 분석방법으로 확인한 결과, 다음과 같이 나타났다 :
성숙 hG-CSF의 N 말단 Thr의 치환 여부는 pCfTL23-코드화 hG-CSF 유도체(hG-CSF[Gly1]이라고 함)로 확인된다. 마찬가지로, Ser에 의한 N-말단 아미노산 치환은 hG-CSF[Ser1]이라 일컫는 pCfTL38-코드화 hG-CSF 유도체에서, Cys에 의한 치환은 hG-CSF[Cys1]이라 불리워지는 pCfTL35-코드화 hG-CSF 유도체에서, Arg로의 치환은 hG-CSF[Arg1]이라 불리워지는 pCfTL41-코드화 hG-CSF 유도체에서 확인된다.
실시예 4
hG-CSF의 N-말단 및 제3번 아미노산 치환반응으로 생성된 폴리펩타이드를 코드화하는 플라스미드 pCfTM14, pCfTM17 및 pCfTM113의 작제(제4도 참조)
Y-100 완충액 60㎕중에 참조실시예 1의 절차에 따라 수득된 pCSF1-2(4.5kb) 3㎍을 용해시키고 Apa I 및 BamH I 각각 8유니트씩을 가하여, 37℃에서 3시간 동안 절단반응을 수행한다. 반응 혼합물로부터, LGT법으로 hG-CSF 유전자 대부분을 함유하는 약 1.5kb의 DNA 단편(Apa I - BamH I 단편) 약 0.4㎍을 수득한다.
이와는 별도로, PGEL1(3.4kb) 2㎍을 Y-100 완충액 40㎕에 용해시키고 제한효소 HindⅢ, BamH I 및 Pst I 각각 4유니트씩을 가하여, 37℃에서 3시간 동안 절단반응을 수행한다. 반응 혼합물로부터, LGT법으로 지방 단백질-터미네이터를 함유하는 약 1.7kb의 DNA 단편(Pst I - BamH I 단편) 약 0.5㎍을 수득한다.
또한, 별도로 일본국 특허원(OPI) 제110600/83호에 기술된 바와 같이 제조한 PKYP10 3㎍을 Y-100 완충액 60㎕에 용해시키고 제한효소 BanⅢ 및 Pst I 각각 6유니트씩을 가하여, 37℃에서 3시간 동안 절단반응을 수행한다. 반응 혼합물로부터, LGT법으로 약 1.1kb의 Ptrp-함유 DNA 단편(BanⅢ-Pst I 단편) 약 0.5㎍을 얻는다.
성숙 hG-CSF의 N-말단 아미노산 Thr을 Ser로 대치시키고 hG-CSF의 제3번 아미노산 Leu를 Gly, Ser, Cys 및 Arg중의 하나로 대치시키고 발현에 필요한 개시 코돈(ATG)를 제공할 필요가 있기 때문에, 또한 PtrP로부터 하부 스트립에 위치한 SD 서열과 ATG간의 간격을 6 내지 18bp의 적절한 길이로 조정할 필요가 있고, 다른 이유로 인하여 다음과 같은 DNA 링커를 합성한다 :
상기식에서, N은 염기 G, A, T 및 C중의 하나이다.
먼저, 통상의 포스포트리에스테르법으로 26-량체 및 20-량체 1-본쇄 DNA를 합성한다. 26-량체 및 20-량체(각기 20pmole씩)를 T4 키나아제 완충액 40㎕에 용해시키고 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제 6유니트를 가하여, 37℃에서 60분간 포스포릴화 반응을 수행한다.
다음에는, 각기 상기 방법으로 수득된, PCSF1-2-유도된 Apa I - BamH I 단편(약 1.5kb) 0.3㎍, pGEL1-유도된 Pst I - BamH I 단편(약 1.7kb) 0.2㎍ 및 발현 벡터 pKYP10의 BanⅢ-Pst I 단편(약 1.1kb) 0.2㎍을 T4 리가아제 완충제 30㎕에 용해시키고 상기 언급한 DNA 링커 약 1pmole을 혼합 용액에 가한다. 이 용액에 T4 DNA 리가이제 6유니트를 더 가한 후에, 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다.
재조합 플라스미드-함유 반응 혼합물을 사용하여 코헨 등의 방법으로 이. 콜라이 C600 SF8(FERM BP-1070)[한국기탁기관 : 한국종균협회 ; 기탁일 : 1988.2.2 ; 기탁번호 : KFCC-10510]에서 형질전환시킨 다음 APr콜로니를 수득한다. 이들 형질전환체로부터 공지의 방법으로 플라스미드 DNA를 분리정제한다. 언급한 플라스미드 DNA 각각의 구조는 Pst I , EcoR I 및 BamⅢ로 절단한 다음, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인한다. 상기 방법으로 수득된 플라스미드는, 제4도에 도시한 바와 같이, pCfTM14, pCfTM17 및 pCfTM113이라고 한다. hG-CSF 유도체-코드화 유전자의 N 말단 부근의 서열은 M13 파아지를 사용한 디데옥시 서열 분석방법에 의해 다음과 같은 서열로 확인되었다 :
성숙 hG-CSF의 N-말단 Thr 및 제3번 아미노산 Leu의 각각 Ser 및 Cys로의 치환은 hG-CSF[Ser1,Cys3]이라 불리우는 pCfTM14-코드화 유도체로 확인된다.
마찬가지로, N-말단 Thr 및 제3번 아미노산 Leu 각각이 Ser 및 Arg로의 치환되었음은 hG-CSF[Ser1,Arg3]이라 불리우는 pCfTM17-코드화 유도체로 확인되며 N-말단 Thr 및 제3번 아미노산 Leu가 각각 Ser 및 Ser로의 치환된 것은 pCfTM113-코드화 유도체(hG-CSF[Ser1,Ser3]이라 함)에서 확인된다.
실시예 5
(1) 재조합 플라스미드 pCfWD1의 작제(제5도 참조)
Y-100 완충액 50μl에 실시예 1의 절차에 따라 수득한 pCfTA1 5㎍을 용해시키고 제한효소 Stu I 10유니트 및 제한효소 BanⅢ(Toyobo 제품) 10유니트를 가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 반응 혼합물로부터, 약 1.3kb의 hG-CSF cDNA-함유 DNA 단편(BanⅢ-Stu I 단편) 약 0.5㎍을 수득한다.
이와는 별도로, 참조실시예 2의 과정에 따라 수득된 pKYP26 3㎍을 Y-100 완충액 50㎕에 용해시키고 BamH I 6유니트를 가하여, 30℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다.
여기에 10mM 트리스-HC1(pH 7.5) 및 1mM EDTA로 포화된 페놀을 동량 가한다. 세차게 교반시킨 후, 저속 원심 분리(3,300rpm, 10분 ; 이하에서는 동일한 조건을 사용함)로 수층을 모은다. 동량의 클로로포름을 가하고 세차게 교반한 후에, 저속 원심분리로 수층을 수거한다. 3M 나트륨 아세테이트 1/10 용적을 가하고 에탄올 2.5배 용적을 가한 다음, 혼합물을 -20℃에서 1시간 동안 정착시킨다. 저온 원심분리(4℃, 11,000rpm, 10분)에 의해 침전물을 모은다. 이 침전물을 클레노우 완충액 30㎕에 용해시키고 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP를 각각 100μM의 농도로 가한 다음 DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편 2유니트를 가하여, 17℃에서 15분간 반응을 수행한다. DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편을 68℃에서 10분간 처리하여 불활성화시키고, NaCl을 100mM의 농도로 가한 후에 제한효소 Pst I 5유니트를 가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 반응 혼합물로부터, LGT법으로 약 1.8kb의 ℓ pp 터미네이터-함유 DNA 단편[BamH I (평활)-Pst I 단편] 약 0.6㎍을 얻는다. 별도로, pGEL1 4㎍을 Y-100 완충액 40㎕에 용해시키고 제한 효소 BanⅢ(Toyobo 제품) 및 Pst I 각각 10유니트씩을 가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한 다음, LGT법으로 반응 혼합물에서 약 1kb의 트립토판 프로모터-함유 DNA 단편(BanⅢ-Pst I 단편) 0.4㎍을 수득한다.
pCfTA1-유도된 BanⅢ-Stu I 단편(약 1.3kb) 약 0.2㎍, pKYP26-유도된 BamH I (평활)-Pst I 단편(약 1.8kb) 약 0.1㎍ 및 pGEL1-유도된 BanⅢ-Pst I 단편(약 1kb) 약 0.1㎍ 을 T4 DNA 리가아제 완충액 30㎕에 용해시키고 T4 DNA 리가아제 4유니트를 가하여, 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다.
이 반응 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB101에서 형질전환시키고 APr콜로니를 수득한 다음, 이 콜로니로부터 상기 언급한 버른보임 등에 의해 플라스미드 DNA를 회수한다. 이렇게 하여 제5도에 도시된 pCfWD1이 수득된다.
(2) pCfT95K19의 작제(제6도 참조)
Y-100 완충액 50㎕에 실시예 3의 절차에 따라 수득된 pCfTL38 5㎍을 용해시키고 제한효소 HindⅢ 및 BglⅢ 각각 10유니트씩을 가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 이 반응 혼합물로부터 LGT법으로 약 2.6kb의 트립토판 프로모터-함유 DNA 단편(HindⅢ-BalⅢ 단편) 약 0.7㎍을 수득한다. 이와는 별도로, pCfTL38 100㎍을 Y-100 완충액 1.5ml에 용해시키고 제한효소 BamH I 및 HindⅢ 각각 80유니트씩을 가하여, 37℃에서 6시간 동안 분해반응을 수행한다. LGT법으로 반응 혼합물에서 hG-CSF cDNA-함유 DNA 단편을 회수하여, ELUTIPTM-d(Schleicher & Schuell 제품)를 사용하여 정제한다. 이 DNA 단편을 10mM 트리스-HC1(pH 7.5), 7mM MgCl2, 150mM NaCl 및 6mM 2-머캅토에탄올이 함유된 용액(이하에서는 "Y-150 완충액"이라 칭함)의 전량 90㎕에 용해시키고 제한효소 Dpn I (Boehringer Mannheim 제품) 3유니트를 가하여, 37℃에서 15분간 분해반응을 수행한다.
반응 혼합물로부터 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 약 300bp의 hG-CSF cDNA-함유 DNA 단편(HindⅢ-Dpn I 단편) 약 1㎍을 얻는다.
이와는 별도로, 실시예 2의 과정에 의해 수득된 pCFTB20 10㎍을 Y-100 완충액 100㎕에 용해시키고 제한효소 Ava I 10유니트를 가하여 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 진행시킨다.
페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전시켜 분해물로부터 DNA를 회수하여 클레노우 완충액 30㎕에 용해시킨 다음, DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편 2유니트를 가하고, 반응을 17℃에서 30분간 수행한다. DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편을 68℃에서 10분간 처리하여 불활성화시키고 NaCl을 100mM 까지 가하여 제한효소 BglⅡ 10유니트를 가한 후에, 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다.
이 반응 혼합물로부터 LGT법으로 약 480bp의 ℓ pp 터미네이터 부위-함유 DNA 단편[Ava I (평활)-BalⅡ 단편] 약 0.3㎍을 수득한다.
각기 상술한 방법으로 수득된 pCfTL38-유도된 HindⅢ-BglⅡ 단편(약 2.6kb) 약 0.1㎍, pCfTL 38-유도된 HindⅢ-Dpn I 단편(약 300bp) 약 0.2㎍ 및 pCfTB 20-유도된 Ava I (평활)-BglⅡ 단편(약 480bp) 약 0.15㎍을 T4 DNA 리가아제 완충액 30㎕에 용해시키고 T4 DNA 리가아제 4유니트를 가한 후에, 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다. 이 반응 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB101을 형질전환시키고 APr콜로니를 수득한다. 이 콜로니로부터, 버른보임 등의 상기 언급한 방법으로 플라스미드 DNA를 수득한다.
따라서, 제6도에 도시된 pCfT95K19가 수득된다.
(3) pCfAA1의 작제(제6도 참조)
상기 (2)항에서 기술한 바와 같이 수득된 pCfT95K19 5㎍을 Y-100 완충액 50㎕에 용해시킨다. 여기에 제한효소 BanⅢ(Toyobo 제품) 7유니트 및 Bgl I (Nippon Gene 제품) 2유니트를 가하고 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 이 반응 혼합물로부터, LGT법으로 약 1kb의 트립토판 프로모터 부위-함유 DNA 단편(BanⅢ-Bgl I 단편) 약 0.6㎍ 및 약 1.8kb의 ℓpp 테미네이터 부위-함유 DNA 단편(Bgl I -Bgl I 단편) 약 1㎍을 수득한다.
이와는 별도로, pCfT95K19 15㎍을 Y-100 완충액 150㎕에 용해시키고 제한효소 Bgl I (Nippon Gene 제품) 6유니트와 Sau 3A 10유니트를 가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 반응 혼합물을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하면 약 350bp의 hG-CSF cDNA 부위-함유 DNA 단편(Bgl I-Sau3A 단편) 약0.3㎍이 수득된다.
또한 별도로, 다음과 같은 DNA 링커를 합성한다 :
먼저, 통상의 포스포트리에스테르법으로 39-량체 및 41-량체 1-본쇄 DNA를 합성한다. 39-량체 및 41-량체(각기 20pmole)를 T4 DNA 키나아제 완충액의 전량 40㎕에 용해시키고 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(Takara Shuzo 제품) 6유니트를 가하여, 37℃에서 60분간 포스포릴화 반응을 수행한다.
다음에는, 각기 상기 방법으로 수득된 pCfT95K19-유도된 BanⅢ-Bal I 단편(약 1kb) 0.1㎍, Bgl I-Bgl I 단편(약 1.8kb) 0.05㎍ 및 Bgl I-Sau3A 단편(약 350bp) 0.1㎍을 T4 DNA 리가아제 완충액 25㎕에 용해시킨 다음 상기 언급한 DNA 링커 약 2pmole을 가한다. T4 DNA 리가아제 6유니트를 더 가한 후에, 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다.
반응 혼합물을 이. 콜라이 HB101에서 형질전환시키고 Apr콜로니를 수득한 다음, 콜로니로부터 버른보임 등의 상기 언급한 방법으로 플라스미드 DNA를 회수한다. 따라서 제6도에 도시된 pCfAA1이 수득된다. 상기 언급한 디데옥시 서열 분석방법으로 pCfAA1의 링커부분의 염기 서열을 결정한 결과, 제4번 아미노산 Leu를 코드화한 코돈의 3번째 염기는 A인 것으로 나타났다. 이 pCfAA1에서, hG-CSF 의 제10번 아미노산 Pro부터 제23번 아미노산 Lys까지 14개의 아미노산을 코드화한 DNA 부위가 결실된다. 또한, hG-CSF 의 제6번 아미노산을 Ala에서 Asn으로 변화시킴에 따라 그러한 돌연변이가 유발되었으며 새로운 Xho I 부위가 존재한다.
(4) pCfAB5의 작제(제6도 참조)
상기 (3)항에서 수득된 pCfAA1 3㎍을 Y-100 완충액 3㎕에 용해시키고 제한효소 Xho I 5유니트를 가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 아가로즈 겔 전기영동으로 Xho I 절단이 완결되었는지를 확인한 후에 제한효소 Bgl I (Nippon Gene 제품) 1유니트를 가하고 37℃에서 25분간 부분적으로 분해가 이루어지도록 한다. 이 반응 혼합물로부터, LGT법으로 약 3kb의 트립토판 프로모터 부위-및 ℓpp 터미네이터 부위-함유 DNA 단편(Xho I - Bgl I 단편) 약 1㎍을 수득한다. 별도로, 다음과 같은 DNA 링커를 합성한다 :
(N은 G, A, T 또는 C이다)
이 링커 DNA는 hG-CSF의 제10번 아미노산 Pro부터 제23번 아미노산 Lys까지 14개의 아미노산에 대한 코드화 DNA 부위를 함유한다. 이러한 부위는 pCfAA1의 hG-CSF cDNA에서는 결실되어 있다.
먼저, 통상의 포스포트리에스테르법으로 27-량체, 25-량체(2종) 및 23-량체 1-본쇄 DNA를 합성한다. 서로 상보적인 27-량체 및 25-량체 DNA와 서로 상보적인 25-량체 및 23-량체 DNA를 2개씩 짝지어 각각 20pmole씩의 양으로 T4 키나아제 완충액 40㎕의 전량에 용해시키고 각각의 용액에 T4 폴리뉴클레오 타이드 키나아제(Takara Shuzo 제품) 6유니트를 가하여, 37℃에서 60분간 포스포릴화 반응을 수행한다.
다음에는, 상술한 바와 같이 수득된 pCfAA1-유도된 Xho I - Bgl I 단편(약 3kb) 0.1㎍ 및 상기 (3)항에서 기술한 바와 같이 수득한 pCfT95K19-유도된 Bgl I - Sau3A 단편(약 350bp) 0.1㎍을 T4 DNA 리가아제 완충액 30㎕에 용해시키고 상기 언급한 DNA 링커 부위 2pmole씩을 혼합 용액에 가한다. 또한, T4 DNA 리가아제 6유니트를 가하여 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다.
반응 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB101를 형질전환시키고 Apr콜로니를 수득한다. 이들 콜로니로부터, 버른보임 등의 상기 언급한 방법으로 플라스미드 DNA를 회수한다. 이렇게 하여 제6도에 도시된 pCfAB5 및 pCfAB14가 수득된다. pCfAB5 와 pCfAB14의 DNA 링커 잔기의 염기 서열을 디데옥시 서열 분석 방법으로 결정한 결과, 제17번 아미노산에 대한 코드화 코돈의 첫번째 염기는 pCfAB5에서는 A이고 pCfAB14의 경우에는 T인 것으로 나타났으므로, 언급한 코돈은 전자의 경우에 Ser(AGC)이 되거 후자의 경우에는 Cys(TGC)가 되며, 결국 pCfAB5에서 성숙 hG-CSF의 제17번 아미노산 Cys는 Ser로 치환되고 pCfAB14는 치환이 이루어지지 않는다.
실시예 6
(1) pCfBA8 및 pCfBA32의 작제(제7도 참조)
실시예 5의 (4)항에서 기술한 바와 같이 수득된 pCfAB5 3㎍을 Y-100 완충액 40㎕에 용해시키고 제한효소 Ava I 및 Bgl Ⅱ 각각 5유니트씩을 가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 반응 혼합물로부터, LGT법으로 약 2.8kb의 트립토판 프로모터 부위-및 ℓpp 터미네이터 부위-함유 DNA 단편(Ava I - Bgl Ⅱ 단편) 약 1㎍을 수득한다.
또한 별도로, 실시예 5의 (1)항에 기술한 바와 같이 수득된 pCfWD1 6㎍을 Y-100 완충액 50㎕에 용해시키고 제한효소 BalⅡ 5유니트씩을 가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 아가로즈 겔 전기영동으로 Bgl Ⅱ에 의한 절단이 완결되었음을 확인한다. 그후에, 제한효소 Ava I 3유니트를 가하고 37℃에서 20분간 부분절단을 수행한다. 반응 혼합물로부터, LGT법으로 hG-CSF 대부분을 함유하는 DNA 단편(Bgl Ⅱ-Ava I 단편, 약 1.3kb) 0.4㎍을 수득한다.
다음에, 각각 상술한 바와 같이 수득한, pCfAB5-유도된 Ava I - Bgl Ⅱ 단편(약 2.8kb) 0.1㎍ 및 pCfWD1-유도된 BglⅡ-Ava I 단편(약 1.3kb) 0.3㎍을 T4 DNA 리가아제 25㎕에 용해시키고 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다.
반응 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB101 형질전환시키고 Apr콜로니를 얻는다. 이 콜로니로부터, 상기 언급한 버른보임 등의 방법으로 플라스미드 DNA를 수득한다. 이렇게하여 pCfBA8이 얻어진다.
pCfBA8에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체의 아미노산 서열에는 성숙 hG-CSF의 제6번 아미노산 Ala 대신 Asn이, 제17번 아미노산 Cys 대신 Ser가 함유된다. 이하에서는, 이 유도체를 hG-CSF[NA8]이라고 한다.
한편, 실시예 5의 (4)항에서 기술된 바와 같이 수득한 pCfAB14 3㎍을 Y-100 완충액 40㎕에 용해시키고 제한효소 Ava I 및 BglⅡ 각각 5유니트씩을 가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 반응 혼합물로부터, LGT법으로 약 2.8kb의 트립토판 프로모터 부위-및 ℓpp 터미네이터 부위-함유 DNA 단편(Ava I - BalⅡ 단편) 약 1㎍을 수득한다.
이와는 별도로, 실시예 5의 (1)항에서 수득한 pCfWD1 6㎍을 Y-100 완충액 50㎕에 용해시키고 제한효소 BglⅡ 5유니트를 가하여, 분해반응을 37℃에서 1시간 동안 수행한다. 아가로즈 겔 전기영동으로 BglⅡ 절단이 완결되었는지를 확인한 후에, 제한효소 Ava I 3유니트를 가하여 37℃에서 20분간 부분절단이 이루어지도록 한다. 반응 혼합물로부터, LGT법으로 hG-CSF cDNA 대부분이 함유된 DNA 단편(약 1.3kb ; BglⅡ-Ava I 단편) 0.4㎍을 수득한다.
다음에는, 각각 상술한 바와 같이 수득한, pCfAB 14-유도된 Ava I - BglⅡ 단편(약 2.8kb) 0.1㎍ 및 pCfWD1-유도된 BglⅡ-Ava I 단편(약 1.3kb) 0.3㎍을 T4 DNA 리가아제 완충액 25㎕에 용해시키고 T4 DNA 리가아제 3유니트를 가하여, 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다.
이 반응 혼합물을 사용하여, 이. 콜라이 HB101을 형질전환시키고 Apr콜로니를 수득한 다음, 콜로니로부터 상기 언급한 버른보임 등의 방법으로 플라스미드 DNA를 수득한다. 따라서 제7도에 도시된 pCfBA32가 수득된다.
pCfBA32에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체의 아미노산 서열은 성숙 hG-CSF의 제6번 아미노산 Ala 대신에 Asn을 함유한다.
(2) pCfBB101의 작제
상기 (1)항에서 수득한 pCfBA8 6㎍을 Y-100 완충액 50㎕에 용해시키고 제한효소 BanⅢ(Toyobo 제품) 10유니트, BglⅡ 8유니트 및 Xho I 8유니트를 가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 이 반응 혼합물로부터, LGT법으로 약 1.4kb의 hG-CSF cDNA-함유 DNA 단편(Xho I - BglⅡ 단편) 약 0.6㎍ 및 2.7kb의 트립토판 프로모터 부위-함유 DNA 단편(BanⅢ-BglⅡ 단편) 약 0.8㎍을 수득한다.
별도로, 다음과 같은 DNA 링커를 합성한다 :
우선, 통상의 포스포트리에스테르법으로 31-량체 및 33-량체 1-본쇄 DNA를 합성한다. 31-량체 및 33-량체(각기 2㎍)를 T4 키나아제 완충액 40㎕의 전량에 용해시키고 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(Takara Shuzo 제품) 30유니트를 가하여, 37℃에서 60분간 포스포릴화 반응을 수행한다.
이어서, 각기 상술한 바와 같이 수득된, pCfBA8-유도된 BanⅢ-BglⅡ 단편(약 2.7kb 단편) 0.1㎍ 및 pCfBA8-유도된 Xho I-BglⅡ 단편(약 1.4kb 단편) 0.1㎍을 T4 DNA 리가아제 완충액 25㎕에 용해시키고 상기 언급한 DNA 링커 약 2pmole을 혼합 용액에 가한다. T4 DNA 리가아제 6유니트를 더 가한 후에 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다.
이렇게 하여 수득한 재조합체 플라스미드 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB101에 형질전환시킨 다음 Apr콜로니를 수득한다. 이 콜로니로부터 유도된 배양 세포에서 플라스미드 DNA를 회수한다. 따라서 제7도에 도시된 pCfBB101이 수득된다. pCfBB101에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체의 아미노산 서열에는 성숙 hG-CSF의 제1번 아미노산 Thr, 제3번 아미노산 Leu, 제4번 아미노산 Gly, 제5번 아미노산 Pro 및 제17번 아미노산 Cys 대신에 각기 Ala, Thr, Arg, Ser 및 Ser이 함유된다. 이하에서는 이 유도체를 hG-CSF[NB101]이라고 한다.
(3) pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95 및 pCfBC97의 작제(제8도 참조)
먼저, 다음과 같은 DNA 링커를 합성한다 :
(N은 G, A, T 및 C중의 하나이다).
이 합성 DNA 링커에서, N으로 나타낸 3개의 염기는 각각 독립적으로 G, A, T 및 C중의 하나이고 한 염기는 G 또는 A(31-량체의 경우에)이거나 C 또는 T(33-량체의 경우에)이므로, 이 링커는 총 128개의 DNA 링커의 혼합물로서 수득된다. 결과적으로, 이 링커의 모형은 이 링커에 의해 코드화된 N-말단 hG-CSF 아미노산 서열에, Met 바로 다음에 아미노산으로서 16개의 상이한 아미노산이 위치할 수 있고 Pro 다음으로 8개의 상이한 아미노산이 위치할 수 있으므로 전부 128개의 아미노산 서열이 존재하도록 구상된다.
먼저, 통상의 포스포트리에스테르법으로 31-량체 및 33-량체 1-본쇄 DNA를 합성한다. 31-량체 및 33-량체(각기 2㎍씩)를 T4키나아제 완충액 40㎕의 전량에 용해시키고 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(Takara Shuzo 제품) 30유니트를 가하여, 37℃에서 60분간 포스포릴화 반응이 이루어지도록 한다.
이어서, 각기 실시예 6에서 수득된, pCfBA8-유도된 BamⅢ-BalⅡ 단편(약 2.7kb 단편) 0.1㎍ 및 pCfBA8-유도된 Xho I - Bog Ⅱ 단편(약 1.4kb단편) 0.1㎍ 을 T4 DNA 리가아제 완충액 25㎕에 용해시키고 상기 언급한 DNA 링커 약 2pmole을 혼합 용액에 가한다. T4 DNA 리가아제 6유니트를 더 가한 후에, 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다.
이렇게 하여 수득한 재조합체 플라스미드 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB101을 형질전환시키고 Ap2콜리니를 수득한다. 이들 콜로니의 배양 세포로부터 플라스미드 DNA를 회수한다. 따라서, pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95 및 pCfBC97이 얻어진다. 상기 언급한 디데옥시 서열 분석방법에 따라 각각의 DNA 링커의 염기 서열을 결정한 결과, hG-CSF 유도체의 N-말단 측상의 염기 서열은 다음과 같이 나타났다.
각기 성숙 hG-CSF와 비교하여, 이들 플라스미드에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체의 대체 아미노산 잔기는 다음과 같다 :
아미노산 치환 위치(hG-CSF의 아미노산)
*치환 없음
pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95 및 pCfBC97에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체는 각각, 이하에서 hG-CSF[NC42B1], hG-CSF[NC45], hG-CSF[NC52], hG-CSF[NC59], hG-CSF[NC76], hG-CSF[NC77], hG-CSF[NC93], hG-CSF[NC95], 및 hG-CSF[NC97]이라고 한다.
(4) pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82의 작제
먼저, 다음과 같은 DNA 링커를 합성한다 :
(N은 G, A, T 및 C중의 하나이다).
이 DNA 링커에서, N으로 표시된 염기 4개는 각각 독립적으로 G, A, T 또는 C이며, 따라서 링커는 총 256개의 상이한 DNA 링커의 혼합물로서 수득된다. 결과적으로, 이 DNA 링커는 DNA 링커에 의해 코드화된 N-말단 hG-CSF 아미노산 서열에서, 당해 위치 4곳의 각각에 4개의 아미노산이 위치할 수 있도록 계획되므로, 총 256개의 상이한 아미노산 서열이 가능해진다.
우선, 통상의 포스포트리에스테르법으로 31-량체 및 33-량체 1-본쇄 DNA를 합성한다. 총 40㎕의 T4 키나아제 완충액에 31-량체 및 33-량체 각각 2㎍씩을 용해시키고 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(Takara Shuzo 제품) 30유니트를 가하여, 37℃에서 60분간 포스포릴화 반응을 수행한다.
다음에는, 각기 실시예 6에서 수득한, pCfBA8-유도된 BanⅢ-BglⅡ단편(약 2.7kb 단편) 0.1㎍ 및 pCfBA8-유도된 Xho I - BglⅡ 단편(약 1.4kb 단편) 0.1㎍을 T4 DNA 리가아제 완충액 25㎕에 용해시키고 상기 언급한 DNA 링커 약 2pmole을 혼합 용액에 가한다. T4 DNA 리가아제 6유니트를 더 가한 후에, 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다.
수득된 재조합체 플라스미드 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB101을 형질전환시키고 Apr콜리니를 수득한다. 이들 콜로니의 배양 세포로부터 플라스미드를 따로따로 회수한다. 이렇게 하여 pCfBD28, pCfBD56 및 pCfBD82가 얻어진다. 상기 언급한 디데옥시 서열 분석 방법으로 DNA 링커 잔기의 염기 서열을 결정한 결과, hG-CSF 유도체의 N 말단측에서의 염기 서열은 다음과 같이 나타났다 :
이들 플라스미드에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체의 대체 아미노산 잔기는 성숙 hG-CSF와 비교하여 다음과 같다 :
*치환 없음
pCfBD28, pCfBD56 및 pCfBD82에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체는 이하에서는 각각, hG-CSF[ND28], hG-CSF[ND 56] 및 hG-CSF[ND 82]라고 한다. pCfBD56이 함유된 이. 콜라이 균주, 이. 콜라이 ECfBD56 및 pCfBD28이 함유된 이. 콜라이 균주, 이 콜라이 ECfBD28은 부다페스트 조약에 따라 발효 연구기관(Fermentation Research Institute)에 기탁번호 FERM-BP-1221][한국기탁기관 : 한국종균협회 : 기탁일 : 1988.2.2 : 기탁번호 : KFCC-1052] 및 FERM BP-1476[한국기탁기관 : 한국종균협회 : 기탁일 : 1988. 2. 2 : 기탁번호 : KFCC-10513]로 각각 기탁되었다.
(5) pCfTNS7의 작제(제14도 참조)
다음과 같은 DNA 링커를 합성한다.
이러한 DNA 링커의 모형에 따르면, hG-CSF의 N-말단 아미노산 서열중 제1번 아미노산 Thr부터 제4번 아미노산 Gly까지의 아미노산 4개는 링커에 의해 코드화된 N-말단 아미노산 서열에서 결실된다.
먼저 통상의 포스포트리에스테르법으로 18-량체 및 20량체 1-본쇄 DNA를 합성한다. 18-량체 및 20-량체(각기 2㎍씩)를 총 40㎕의 T4 키나아제 완충액에 용해시키고 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(Takara Shuzo 제품) 30유니트를 가하여, 37℃에서 60분간 포스포릴화 반응을 수행한다.
이어서, 각기 실시예 6에서 수득된, pCFBA8-유도된 BanⅢ-BglⅡ단편(약 2.7kb 단편) 0.1㎍ pCfBA8-유도된 Xho I - BglⅡ 단편(약 1.4kb 단편) 0.1㎍을 T4 DNA 리가아제 완충액 25㎕에 용해시키고, 이 혼합 용액에 상기 언급한 DNA 링커 약 2pmole을 가하여 4℃에서 18시간 동안 연결반응이 이루어지도록 한다.
이렇게 하여 수득된 재조합체 플라스미드 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB 101을 형질전환시키고 Apr콜로니를 수득한다. 이 콜로니의 배양 세포로부터 플라스미드를 회수하여, pCfTNS7을 얻는다. pCfTNS7에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체는 이하에서 hG-CSF[△1-4S]라고 한다.
(6) pCfTAArg4S의 작제(제14도 참조)
다음과 같은 DNA 링커를 합성한다 :
이 DNA 링커에서, 2개의 염기는 각각 독립적으로 A 또는 G로 표시되므로, DNA 링커는 총 4개의 DNA 링커의 혼합물로서 수득된다.
따라서, DNA 링커의 모형은 언급한 링커에 의해 코드화된 N-말단 hG-CSF 아미노산 서열의 제4번 아미노산으로서 4개의 아미노산이 위치할 수 있도록 하는 것이다.
먼저, 통상의 포스포트리에스테르법으로 31-량체 및 33-량체 1-본쇄 DNA를 합성한다. 31-량체 및 33-량체(각각 2㎍씩)를 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(Takara Shuzo 제품) 30유니트를 가하여, 37℃에서 60분간 포스포릴화 반응을 수행한다.
다음에는, 각기 (1)항에서 수득된, pCFBA 8-유도된 BanⅢ-BglⅡ 단편(약 2.7kb 단편) 0.1㎍ 및 pCfBA8-유도된 Xho I - BglⅡ 단편(약 1.4kb 단편) 0.1㎕을 T4 DNA 리가아제 완충액 25㎕에 용해시키고, 혼합 용액에 상기 언급한 DNA 링커 약 2pmole을 가한다. T4 DNA 리가아제 6유니트를 더 가하여 4℃에서 18시간 동안 연결 반응이 이루어지도록 한다.
이렇게 하여 수득된 재조합체 플라스미드 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB 101을 형질 전환시키고, Apr콜로니를 얻는다. 이 콜로니의 배양 세포로부터 플라스미드를 회수한다. 따라서 pCfTAArg 4S가 수득된다. 상기 언급한 디데옥시 서열 분석방법으로 DNA 링커 잔기의 염기 서열을 결정하며, hG-CSF 유도체의 N-말단 염기 서열은 다음과 같다 :
pCfTAArg4S에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체는 이하에서 hG-CSF[Arg4,Ser17]이라고 한다.
(7) pCfTN205의 작제(제15도 참조)
K-150 완충액(100mM NaCl 대신 150mM KCl을 사용하는 것을 제외하고는 Y-100 완충액과 동일함) 40㎕에 상기 (5)항에서 수득된 pCfTNS7 3㎍을 용해시키고 제한효소 Pvu 및 Xho I 각각 5유니트씩을 가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 이 반응 혼합물로 부터 LGT법으로 약 1.0kb의 트리토판 프로모터 부위-함유 DNA 단편(Pvu I - Xho I 단편) 약 0.5㎍을 얻는다.
별도로, 상기 (1)항에서 수득된 pCfBA32 3㎍을 K-150 완충액 40㎕에 용해시키고 제한효소 Pvu I 및 Xho I 각각 5유니트씩을 가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 이 반응 혼합물로부터, LGT법으로 hG-CSF cDNA 대부분을 함유하는 약 3.0kb DNA 단편(Xho I - Pvu I 단편) 2㎍을 얻는다.
이어서, 각기 상기 방법으로 수득된 pCfTNS7-유도된 Pvu I - Xho I 단편(약 1.0kb) 0.1㎍ 및 pCfBA32-유도된 Xho I - Pvu I 단편(약 3.0kb) 0.3㎍을 T4 DNA 리가아제 완충액 25㎕에 용해시키고 T4 DNA 리가아제 3유니트를 가하여, 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다.
이 반응 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB101을 형질전환시키고 Apr콜로니를 수득한 다음, 이 콜로니로부터 상기 언급한 버른보임 등의 방법으로 폴라스미드 DNA를 회수한다. 따라서 제15도에 도시된 pCfTN205가 수득된다.
pCfTN205에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체의 아미노산 서열에서, 성숙 hG-CSF의 제1번 아미노산에서 제4번 아미노산은 결실된다.
이하에서는, 이 유도체를 hG-CSF(△1-4)라고 한다.
(8) pCfTAArg4의 작제(제15도 참조)
K-150 완충액 40㎕에 상기 (6)항에서 수득된 pCfTAArg4S 3㎍을 용해시키고 제한효소 Pvu I 및 Xho I 각각 5유니트씩을 가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 이 반응 혼합물로부터, LGT법으로 약 1.0kb의 트리토판 프로모터 부위-함유 DNA 단편(Pvu I - Xho I 단편) 약 0.5㎍을 수득한다.
별도로, 상기 (1)항에서 수득된 pCfBA32 3㎍을 K-150 완충액 40㎕에 용해시키고 제한효소 Pvu I 및 Xho I 각각 5유니트씩을 가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 이 반응 혼합물로부터, LGT법으로 hG-CSF cDNA 대부분을 함유하는 약 3.0kb DNA 단편(Xho I - Pvu I 단편) 2㎍을 수득한다.
다음에는, 각기 상기 방법으로 수득된 pCfTAArg4S-유도된 Pvu I - Xho I 단편(약 1.0kb) 0.1㎍ 및 pCfBA32-유도된 Xho I - Pvu I 단편(약 3.0kb) 0.3㎍을 T4 DNA 리가아제 완충액 25μl에 용해시키고 T4 DNA 리가아제 3유니트를 가하여, 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다.
반응 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB 101을 형질전환시키고 Apr콜로니를 수득한 후, 이 콜로니로부터 상기 언급한 버른보임 등의 방법으로 폴라스미드 DNA를 회수한다. 이렇게 하여 제15도에 도시된 pCfTAArg4가 수득된다.
pCfTAArg4에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체의 아미노산 서열중 제4번 아미노산은 성숙 hG-CSF의 Gly 대신 Arg이 된다. 이하에서는, 이 유도체를 hG-CSF[Arg4]라고 한다.
(9)pCfTNS301 작제(제16도 참조)
Y-100 완충액 50㎕에 상기 (1)항에서 수득된 pCfBA8 6㎍을 용해시키고 제한효소 HindⅢ 10유니트 및 BglⅡ 8유니트를 가한후 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 이 반응 혼합물로부터 LGT법으로 약 1.4kb의 hG-CSF cDNA-함유 DNA 단편(HindⅢ - BglⅡ 단편) 약 0.6㎍을 수득한다.
다음에는, 다음과 같은 DNA 링커를 합성한다 :
이 DNA 링커의 모형은 hG-CSF의 제1번 아미노산 Thr로부터 제11번 아미노산 Gln까지 11개의 아미노산이 언급한 링커에 의해 코드화된 N-말단 아미노산 서열에서 결실될 것이다.
먼저, 통상의 포스포트리에스테르법으로 27-량체 및 29-량체 1-본쇄 DNA를 합성한다. 이 27-량체 및 29-량체(각기 2㎍씩)를 T4 키나아제 완충액 40㎕의 전량에 용해시키고 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(Takara Shuzo 제품) 30유니트를 가하여, 37℃에서 60분간 포스포릴화 반응을 수행한다.
다음에는, 각기 상술한 바와 같이 수득된, pCfBA8-유도된 BanⅢ-BglⅡ 단편(약 2.7kb 단편) 0.1㎍ 및 pCfBA8-유도된 HindⅢ-BglⅡ 단편(약 1.4kb 단편) 0.1㎍을 T4 DNA 리가아제 완충액 25㎕중에 용해시키고 혼합 용액에 상기 언급한 DNA 링커 약 2pmole을 가한다.
T4 DNA 리가아제 6유니트를 더 가하여 4℃에서 18시간 동안 연결반응이 이루어지도록 한다.
이렇게 하여 수득된 재조합체 플라스미드 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB 101을 형질전환시키고 Apr콜로니를 얻는다. 이 콜로니의 배양 세포로부터 플라스미드 DNA를 회수한다. 따라서 pCfTN301이 수득된다. pCfTNS301에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체를 이하에서 hG-CSF[△1-11S]라고 한다.
(10) pCfTNS401의 작제(제16도 참조)
다음과 같은 DNA 링커를 합성한다 :
이 DNA 링커의 모형은 링커에 의해 코드화된 N-말단 아미노산 서열에서 hG-CSF의 제1번 아미노산 Thr부터 제7번 아미노산 Ser까지 7개의 아미노산이 결실된 것이다.
우선, 통상의 포스포트리에스테르법으로 39-량체 및 41-량체 1-본쇄 DNA를 합성한다. 이 39-량체 및 41-량체(각기 2㎍씩)를 T4 키나아제 완충액 총 40㎕에 용해시키고 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(Takara Shuzo 제품) 30유니트를 가하여, 37℃에서 60분간 포스포릴화 반응을 수행한다.
다음에는, 각각 상술한 바와 같이 수득된, pCfBA8-유도된 BanⅢ-BglⅡ 단편(약 2.7kb 단편) 0.1㎍ 및 pCfBA8-유도된 HindⅢ-BglⅡ 단편(약 1.4kb 단편) 0.1㎍을 T4 DNA 리가아제 완충액 25㎕에 용해시키고 이 혼합 용액에 상기 언급한 DNA 링커 약 2pmole을 가한다. T4 DNA 리가아제 6 유니트를 더 가하고 4℃에서 18시간 동안 연결 반응이 진행되도록 한다.
이렇게 하여 수득된 재조합체 플라스미드 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB 101을 형질전환시키고 Apr콜로니를 얻는다. 이 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 회수하여, pCfTNS401을 얻는다. pCfTNS401에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체를 이하에서 hG-CSF[△1-7S]라고 한다.
(11) pCfTNS501의 작제(제12도 참조)
Y-100 완충액 40μl에 상기 (1)항에서 수득된 pCfBA8을 용해시키고 제한효소 Xho I 10유니트를 가하여, 37℃에서 1시간 동안 분해 반응을 수행한다. 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 DNA를 회수하여 클레노우 완충액 30㎕에 용해시키고 DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편 2유니트를 가하여 17℃에서 30분간 반응이 이루어지도록 한다. DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편을 68℃에서 10분간 처리하여 불활성화시키고 KCl을 150mM의 농도가 되도록 가한 후에 제한효소 Pvu I 8유니트를 가하여 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 반응 혼합물로부터, LGT 법으로 약 3kb의 hG-CSF cDNA-함유 DNA 단편[Xho-I(평활)-Pvu I 단편] 약 2㎍을 수득한다.
별도로, 참조실시예 4의 과정으로 수득한 ATG 벡터 pTrS20(3.8kb) 5㎕을 Y-O 완충액(Y-100 완충액중에서 100mM NaCl이 빠진 조성물 갖는 완충액) 50㎕에 용해시키고 제한효소 Sac I 16유니트를 가하여 37℃에서 3시간 동안 절단반응이 이루어지도록 한다. 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 회수한 DNA를 클레노우 완충액 30㎕에 용해시키고 DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편 2유니트트를 가하여 17℃에서 30분간 반응을 진행시킨다. DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편을 68℃에서 10분간 처리하여 불활성화시키고 KCl을 150mM 농도로 가한 후, 제한효소 Pvu I 8유니트를 가하고 37℃에서 1시간 동안 분해 반응을 수행한다. 반응 혼합물로부터, LGT법으로 약 1kb의 Ptrp-함유 DNA 단편[Sac I (평활)-Pvu I 단편] 약 0.5㎍을 수득한다.
다음에는, pCfBA8-유도된 Xho I (평활)-Pvu I 단편(약 3kb) 0.1㎕ 및 PTrS20-유도된 Sac I (평활) - Pvu I 단편(약 1kb) 0.2㎍을 T4 DNA 리가아제 완충액 25㎕에 용해시키고 T4 DNA 리가아제 3유니트를 가하여, 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다.
이 반응 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB 101을 형질전환시키고 Apr콜로니를 수득한 후, 콜로니로부터 상기 언급한 버른보임 등의 방법으로 플라스미드 DNA를 회수한다. 따라서 제12도에 도시된 pCfTNS501이 수득된다.
pCfTNS501에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체에서, 성숙 hG-CSF의 제1번 내지 제6번 N-말단 아미노산이 결실되고 제17번 아미노산 Cys대신 Ser이 위치한다. pCfTNS501에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체는 이하에서 hG-CSF[△1-6S]라고 한다.
실시예 7
(1) pCfCB101, pCfCC52, pCfCC59, pCfCD28 및 pCfCD56의 작제(제8도 참조)
우선, pBR 322[참고 : Bolivar et al. : Gene, 2, 95(1977)] 3㎍을 Y-100 완충액 4㎕에 용해시키고, 제한효소 Pst I 5유니트를 가하여 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 회수된 DNA를 33mM 트리스-아세트산(pH 7.9), 66mM 칼륨 아세테이트, 10mM 마그네슘 아세테이트, 5mM 디티오스레이톨, 및 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP(각기 0.4mM)가 함유된 용액(이하에서는 "T4 DNA 폴리머라제 완충액"이라고 함) 20㎕에 용해시키고 T4 DNA 포릴머라제(Takara Shuzo 제품) 1유니트를 가하여 37℃에서 30분간 반응을 수행한다. 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수하여 T4 DNA 리가아제 완충액 20㎕에 용해시킨다. 여기에 BglⅡ 링커 DNA[Takara Shuzo 제품 ; d(pC-A-G-A-T-C-T-G)] 약 8pmole을 가한다. T4 DNA 리가아제 6유니트를 더 가한후에, 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다. 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 DNA를 회수하여 Y-100 완충액 40㎕에 용해시키고, 제한효소 EcoR I 10유니트 및 BglⅡ 8유니트를 가하여 37℃에서 1시간 동안 분해반응을 수행한다. 반응 혼합물로부터, LGT법으로 약 3.6kb의 테트라사이클린 내성 유전자 부위-함유 DNA 단편(EcoR I - BglⅡ 단편) 약 0.9㎍을 수득한다.
별도로, 실시예 6-(2)에서 수득된 pCfBB101, 실시예 6-(3)에서 수득된 pCfBC52 또는pCfBC59, 또는 실시예 6-(4)에서 수득된 pCfBD28 또는 pCfBD56 3㎍을 10배 농축된 Y-100 완충액에 용해시키고 제한 효소 EcoR I 5유니트 및 BglⅡ 6유니트를 가하여 37℃에서 1시간 동안 분해 반응을 수행단다. 반응 혼합물로부터, LGT법으로 약 1.8kb의 hG-CSF cDNA 부위-함유 DNA 단편(EcoR I - BglⅡ 단편) 약 0.4㎍을 수득한다.
상술한 바와 같이 수득된 pBR322-유도된 EcoR I-BalⅡ 단편(약 3.6kb) 약 0.05㎍을 T4 DNA 리가아제 완충액 20㎕에 용해시킨 용액이 들어 있는 5개의 튜브를 각각 준비한다. 이 튜브에 pCfBB101-, pCfBC52-, pCfBC59-, pCfBD28- 또는 pCfBD56-유도된 EcoR I-BalⅡ 단편(약 1.8kb 단편) 약 0.1㎍을 가하고, T4 DNA 리가아제 4유니트를 더 가한 다음 4℃에서 18시간 동안 연결반응을 수행한다.
수득된 재조합체 플라스미드 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB101을 형질전환시킨 다음 Tcr콜로니를 수득한다. 이들 콜로니 각각의 배양 세포로부터, 플라스미드 DNA를 회수한다. 따라서 pCfCB101, pCfCC42, pCfCC59, pCfCD52 및 pCfCD56이 수득되며, 이들 각각 제8도에 도시하였다. 이들 플라스미드에 의해 코드화된 hG-CSF 유도체의 아미노산 서열은 각각 pCfBB101, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD28 및 pCfBD56에 의해 코드화된 hG-CSF의 유도체의 아미노산 서열과 일치한다.
실실예 8
hG-CSF 유도체의 생성 및 정제
재조합체 플라스미드(실시예 3, 4, 6 및 7에서 수득한) pCfTL23, pCfTL35, pCfTL38, pCfTL41, pCfTM14, pCfTM17, pCfTM113, pCfTBB101, pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97, pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfTNS7, pCfAArg4S, pCfTN301, pCfTN401, pCfTNS501, pCfBD28A17 및 pCfBD28A17을 각각 수용하는 이. 콜라이 W3110 str A-유도된 형질 전환체(ECfTL23, ECfTL35, ECfTL38, ECfTL41, ECfTM14, ECfTM17, ECfTM113, ECfBB101, ECfBC42B1, ECfBC45, ECfBC52, ECfBC59, ECfBC76, ECfBC77, ECfBC93, ECfBC95, ECfBC97, ECfBD28, ECfBC56, ECfBD82, ECfTNS7, ECfTAArg4S, ECfTNS301, ECfTNS401, ECfBD82, ECfTNS7, ECfTAArg4S, ECfTNS301, ECfTNS401, ECfTNS501, ECfBD28A17 및 ECfBD28T17이라고 함)를 각각 LG 배지(박토트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g 및 글루코즈 1g을 물 1ℓ에 용해시키고 NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조정하여 제조함)중, 37℃에서 18시간 동안 배양한다. 배양액 50ml를 트립토판 25㎍/ml 및 암피실린 50㎍/ml가 함유된 MCG 배지(0.6% Na2HPO4,0.3% KH2PO4, 0.5% NaCl, 0.5% 카즈아미노산, 1mM MgSO4, 4㎍/ml 비타민 B1; pH 7.2)100ml에 접종한다. 30℃에서 4 내지 8시간 동안 배양한 후에, 3㎍-인돌아크릴산(이하에서는 IAA라고 함), 즉 트립토판 유도제 10㎍/ml를 가하여 2 내지 12시간 동안 계속 배양시킨다. 배양액을 10분간 8,000rpm으로 원심분리하여 접근한다. 30mM NaCl-30mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)으로 세척한다. 세척된 균체를 상기 언급한 완충액 30ml 중에 현탁시킨 다음 0℃에서 초음파(Branson Sonic Power Company : SONIFIER CELLDISRUPTOR 200, Output Control 2, 10분)로 분쇄한다. 9000rpm에서 30분간 원심분리하여 잔류 균체를 수득한다. 마르스톤 등의 방법[참고 : F. A. O. Marston et al., BIO/TECHNOLOGY, 2800(1984)]을 사용하여, 잔류 균체로부터 hG-CSF 유도체를 추출, 정제, 가용화 및 재생한다.
닛뽕 바이오-래드 래보러토리즈(Nippon Bio-Rad laboratories)의 단백질 분석 키트(표준 분석법)[참조 : M. M. Bradford : Anal. Biochem., 72, 248(1976)]를 사용하여 단백질을 정량한다.
G-CSF 활성도는 다음 방법으로 측정한다. 생후 8 내지 12주된 CH/He 마우스 수컷(Shizuoka laboratory Animal Center에서 구입)의 대퇴골에서 골수 세포를 무균 채취하여 10% 소태자 혈청(FBS)을 보충한 α-MEM에 현탁시킨다. 칼럼에 충전된 나일론 울(Wako Pure Chemical Industries 제품 ; Nylon Fiber 146-04231) 0.3g에 상기 세포 현탁액 1.5ml(약 5×107세포수)를 주입시키고 5% CO2배양기내에서 90분간 37℃로 반응이 이루어지도록 한다. 다음에는, 37℃로 미리 가온시킨 α-MEM을 칼럼에 통과시켜, 나일론 울에 흡착되지 않은 골수 세포를 유출 분획으로서 수득한다. 이들 세포를 α-MEM으로 1회 세척하여 예정 농도로 조정한다.
이어서, 오카베 등의 방법[참고 : Okabe, T. et al. : Cancer Research, 44, 4503-4506(1986)]에 의해 조골수성 간세포 콜로니 형성력을 측정한다. 따라서, 상기한 바와 같이 제조된 골수 세포 현탁액 0.2ml(2×106세포수/ml)를 α-MEM 0.2ml, FBS 0.4ml 및 2-희석 샘플 0.2ml의 혼합물과 합한다. 42℃로 가온된 동량(10.ml)의 0.6% 한천(Difco, Agar purified #0560-01)을 상기 혼합물과 혼합하고 혼합물 전부를 24-디쉬플로에이트(Munc's Multidish #143982)의 접시에 0.5ml씩의 분량으로 분주한다(5×104세포수/접시,n=3), 37℃의 5% CO2배양기에서 7일간 배양한 후에, 현미경(Olympus×40)하에서 각기 40개 이상의 세포수를 갖는 콜로니의 수를 센다. 콜로니의 수를 센 후에, 세포를 조심스럽게 슬라이드 유리 위에 놓고 아세톤-포르말린 혼합 용액으로 30초간 고정시킨다. 구보따 등의 방법[참고 : Kubota,K,et al : Exp.Hematology, 8,339-344(1980)]으로 세포를 에스터라제 2중 염색한 후, 콜로니 각각을 동정한다.
각 샘플의 효율은 다음과 같이, 콜로니 형성 분석시 2-배 희석물에 대해서 계수한 결과를 토대로 산정한다. 표준물로서 사용된 손상되지 않은 상태 그대로의 G-CSF의 최대 콜로니 형성치의 절반으로 주어지는 활성도를 50유니트로 정의한다. ml당 활성도로 환산하기 위해서 각 샘플의 희석인자를 포함하여 20배 함으로써 효율을 유니트로 산정한다.
특히 활성도는 단백질의 유니트 중량당 효율로 표시되며, 따라서 유니트/mg으로 표시된다.
손상되지 않은 상태 그대로의 G-CSF 및 G-CSF 유도체의 효율은 표 3에 기재하였다.
[ 표 3]
실시예 9
사람 골수세포에 대한 hG-CSF 유도체의 활성도 측정
골수액은 20 내지 30세의 정상인 장골(腸骨)로부터 수집한다.
동량의 α-MEM을 골수액에 가한 후 혼합한다. 상기 골수액 4ml를 3ml의 피콜-파크(Ficoll-Paque)용액(Pharmacia Fine Chemicals 제품, 비중 1.077)에 붓고, 400xg로 30분간 원심분리한 다음 중간층에 나타난 세포를 분리한다. 세포를 PBS(물에 NaCl 8g, KCL 0.2g, Na2HPO41.15g과 KH2PO40.2g을 용해시켜 1ℓ 용액이 되게 준비한다)로 2회 세척한 후 10% 소태자 혈청(FBS)을 보충시킨 α-MEM에 현탁시켜 세포 농도를 2×106세포수/ml 정도로 조정한다. 세포 현탁액 10ml 분량을 플라스틱 디쉬(Falcon 3003)에 넣은 후 5% CO2배양기에서 37℃로 90분간 배양한다. 플라스틱 디쉬에 흡착되지 않은 세포를 회수하여 α-MEM으로 1회 세척한 다음, 예정된 수중으로 농도를 조정한 후 사람 조골수성 간 세포 성장 촉진 활성도 및 콜로니 형성 시험을 한다. 10% FBS- 보충된 α-MEM을 96-웰 평면 마이크로플레이트(NUNC, 167008)웰에 10㎕씩 분주한 후 실시예 8의 방법으로 수득된 hG-CSF 및 hG-CSF 유도체의 샘플을 100㎕씩 첫번째 열의 웰에 첨가하여 완전히 혼합한 후 각 혼합물 100㎕를 2배 희석하기 위해 두번째 열의 웰로 이동시킨다. 2배 희석을 동일한 방법으로 12번째 열 (n=3)까지 계속한다. α-MEM만을 사용한 한 군을 음성 대조군으로 사용한다.
이어서, 상기 기술한 방법대로 준비된 골수 세포 현탁액 100㎕(5×104진핵세포수)를 각 웰에 유포한 후, 5% CO2배양기에서 37℃로 3일간 배양한다. 배양 최종 시간 18시간 전 20시간 동안 10㎕의 6-3H-티미딘(Amersham Japan, 코드 TRK61, 107mci/mg)을 첨가한다. 세포들은 세포 수확기(Labo-Science 제품)를 사용하여 유리 여과기 위에서 회수하고, 건조시킨 후 액체 신틸레이션 계수기(Packard, Tricarb 3320)를 사용하여 세포에 의해 흡수된 방사능을 측정한다.
한편, 사람 조골수성 간 세포 콜로니 형성 분석과 콜로니 동정은 실시예 8에서 기술된 것처럼 수행한다.
각 샘플의 효율을 계산하기 위하여 한개의 콜로니를 형성시킬 수 있는 활성도를 1유니트로 정의한다. 그래서 반 최대치(최대 흡수치의 절반)는 2배 희석 열에서 계산한 결과인 비례를 나타내는 용량-반응 곡선에 근거하여 결정하고 각 샘플의 효율을 계산한다.
특히 활성도는 단백질 유니트 중량(mg)당 효율 즉, unit/mg으로 표시한다. 완전한 hG-CSF와 hG-CSF 유도체의 효율은 표 4에서 보는 바와 같다.
[표 4]
실시예 10
N-말단 첫번째부터 7번째 아미노산이 결실되고, 17번째 아미노산이 세린인 hG-CSF 유도체의 생성(이하에서는 "M-7S"라고 한다)
실시예 6에서 수득한 재조합 플라스미드 pCfBC59를 수반하는 이. 콜라이(ECfBC59)를 배양하고 정제하여 수득한 표 2에 나타낸 유도체(a)를 ml당 132㎍ 함유하는 10mM 트리스-HCl-100mM NaCl용액(pH 8.0) 50ml에 서브틸리신 BPN'(8.5유니트/mg 단백질)(Sigma 제품) 0.7㎍을 첨가하여 25℃에서 40시간 배양 시킨다. 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)으로 3배 희석한 후에 배양 혼합물을 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)으로 충전된 DEAE-토요펄(Toyopearl) 650M(Toyo Soda Manufacturing 제품) 칼럼(1.7cm×4.4cm)에 시간당 10ml의 유량으로 적용시킨다. 그런 다음 10mM 트리스-HCl(pH 8.0) 20ml를 시간당 5ml의 유량으로 칼럼을 통과시킨다. 그후 용출은 0M에서 0.4M까지 직선상의 NaCl 농도 구배를 보이는 10mM 트리스-HCl 완충액 시스템을 사용하여 동일한 유속으로 수행한다(총 용출량 50ml). M-7S 유도체는 100 내지 150mM의 NaCl 농도에서 용출된다(생성량 0.7mg, 또는 10%). 순도는 90%이상이다.
실시예 11
M-7S의 생성
실시예 6에서 수득한 재조합 플라스미드 pCfBC59를 수반하는 이. 콜라이(ECfBC59)를 배양한 후 정제하여 얻은 표 2에 나타낸 유도체(b)를 ml당 132㎍ 함유하는 10mM 트리스-HCl-100mM NaCl 용액(pH 8.0) 50ml에 서브틸리신 BPN'(8.5유니트/mg 단백질) 0.7㎍을 첨가하여 25℃에서 14시간 동안 배양시킨다. 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)으로 3배 희석한 후 배양 혼합물을 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)으로 충전된 DEAE-토요펄 650M 칼럼(1.7cm×4.4cm)에 시간당 10ml의 유량으로 적용시킨다. 그런 다음 10mM 트리스-HCl(pH 8.0) 20ml를 시간당 5ml의 유량으로 칼럼을 통과시킨다. 그후 용출은 0M에서 0.4M까지 구배를 형성시킨 총 용출량 50ml인 완충액 시스템을 사용하여 동일한 유속으로 수행한다. M-7S 유도체는 100mM 내지 150mM의 NaCl 농도에서 용출된다(생성량 4.2mg, 또는 63%). 순도는 90%이상이다.
실시예 12
M-7S의 생성
실시예 6에서 수득한 재조합 플라스미드 pCfTAArg4를 수반하는 이. 콜라이(ECfTTArg4)를 배양한 후 정제하여 얻은, 표 2에 나타낸 유도체(b)를 ml당 132㎍ 함유하는 10mM 트리스-HCl-100mM NaCl용액(pH 8.0) 50ml에 서브틸리신 BPN'(8.5유니트/mg 단백질) 0.7㎍을 첨가한 후 25℃에서 40시간 동안 배양시킨다. NaCl의 농도는 0.5M로 조정한 후 배양 혼합물을 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl이 충전된 Zn 킬레이트-세파로우즈(Pharmacia Find Chemicals 제품) 칼럼(1.7cm×2.6cm)에 시간당 6ml의 유량으로 적용시킨다. 이어서, 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl 용액 12ml를 시간당 3ml의 유량으로 칼럼을 통과시킨다. 그후에 용출은 8.0부터 0.6까지 직선상의 pH 구배를 보여주는 총량 30ml의 10mM 트리스-HCl-0.5M NaCl 완충액을 사용하여 동일한 유량으로 수행한다. M-7S 유도체는 pH 7.0 근처에서 용출된다(생성량 0.6mg, 또는 9%). 순도는 90%이상이다.
실시예 13
N-말단 첫번째부터 6번째까지의 아미노산이 결실되고, 17번째 아미노산이 세린인 hG-CSF 유도체의 생성(이하에서는 "M-6S"라고 한다)
표 2에 나타낸 유도체(a)를 ml당 132㎍ 함유하는 10mM 트리스-HCl-100mM NaCl 용액(pH 8.0) 50ml에 서브틸리신 BPN'(8.5유니트/mg 단백질) 0.7㎍을 첨가한 후, 25℃에서 2시간 배양시킨다. 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)으로 3배 희석한 후 배양 혼합물을 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)로 충전된 DEAE-토요펄 650M 컬럼(1.7cm×4.4cm)에 시간당 10ml의 유량으로 적용시킨다. 이어서, 10mM 트리스-HCl(pH 8.0) 20ml를 시간당 5ml의 유량으로 칼럼을 통과시킨다. 그후 용출은 0M에서 0.4M까지 직선상의 NaCl 농도 구배를 보여주는 총량 50ml의 10mM 트리스-HCl(pH 8.0) 완충액을 시스템을 사용하여 동일한 유량으로 수행한다. M-6S 유도체는 100 내지 150mM의 NaCl 농도에서 용출된다(생성량 2.6mg, 또는 40%). 순도는 90% 이상이다.
실시예 14
M-6S 생성
표 2에 나타낸 유도체(a)를 ml당 132㎍ 함유하는 10mM 트리스-HCl-100mM NaCl 용액(pH 8.0) 50ml에 에폴로자임(4120 유니트/mg 단백질)(Kyowa Hakko Kogyo 제품) 0.7㎍을 첨가한 후 25℃에서 20시간 동안 배양시킨다. NaCl의 농도를 0.5M로 조정한 다음 배양 혼합물을 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl로 충전된 Zn 킬레이트-세파로우즈 칼럼(1.7cm×2.6cm)에 시간당 6ml의 유량으로 적용시킨다. 그 다음에 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl 용액 12ml를 시간당 3ml의 유량으로 칼럼을 통과시킨다. 그후에 용출은 8.0부터 6.0까지 직선상의 pH 구배를 갖는 총량 30ml인 10mM 트리스-HCl-0.5M NaCl 완충액을 사용하여 동일한 유속으로 수행한다. M-6S 유도체는 pH 7.0 근처에서 용출된다(생성량 2.5mg, 또는 38%). 순도는 90%이상이다.
실시예 15
M-6S의 생성
표 2에 나타낸 유도체(b)를 ml당 132㎍ 함유하는 10mM 트리스-HCl-100mM NaCl 용액(pH 8.0) 50ml에 서브틸리신 아밀로사카리티쿠스 0.7㎍을 첨가한 후 25℃에서 20시간 동안 배양시킨다. NaCl의 농도를 0.5M로 조정한 후에 배양 혼합물을 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl로 충전된 Zn 킬레이트-세파로우즈 칼럼(1.7cm×2.6cm)에 시간당 6ml의 유량으로 적용시킨다. 그 다음에 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl 용액 12ml를 시간당 3ml의 유속으로 칼럼을 통과시킨다. 그후에 용출은 8.0부터 6.0까지 직선상의 pH 구배를 갖는 총량 30ml인 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl 완충액을 사용하여 동일한 유속으로 수행한다. M-6S 유도체는 pH 7.0 근처에서 용출된다(생성량 2.5mg 또는 38%). 순도는 90%이상이다.
실시예 16
M-6S의 생성
표 2에 나타낸 유도체(d)를 ml당 132㎍ 함유하는 10mM 트리스-HCl-100mM NaCl 용액(pH 8.0) 50ml에 서브틸리신 칼스버그(0.034유니트/mg 단백질)(NoVo 제품) 0.7㎍을 첨가하여 25℃에서 20시간 동안 배양시킨다. NaCl의 농도를 0.5M로 조정한 후, 배양 혼합물을 Zn 킬레이트 세파로우즈 칼럼(1.7cm×2.6cm, Pharmacia Find Chemicals)에 시간당 6ml의 유속으로 적용시킨다. 그 다음에 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl을 시간당 3ml의 유속으로 칼럼을 통과시킨다. 그후 용출은 총량이 30ml이며, 8.0에서 6.0까지의 직선상의 pH 구배를 보이는 10mM 트리스-HCl-0.5M NaCl 완충액 시스템을 사용하여 동일 유속으로 수행한다. M-6S 유도체는 pH 7.0 근처에서 용출된다(생성량 3mg, 또는 45%). 순도는 90%이상이다.
실시예 17
M-6S의 생성
표 2에 나타낸 유도체(a)를 ml당 132㎍ 함유하는 10mM 트리스-HCl-100mM NaCl 용액(pH 8.0) 50ml에 프로테이나제 K(0.027유니트/mg 단백질)(Sigma 제품) 0.7㎍을 첨가한 후 25℃에서 40시간 동안 배양시킨다. 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)으로 3배 희석한 후 배양 혼합물을 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)으로 충전된 DEAE-토요펄 650M 컬럼(1.7cm×4.4cm, Toyo Soda)에 시간당 10ml의 유량으로 적용시킨다. 그 다음에 10mM 트리스-HCl(pH 8.0) 20ml를 시간당 5ml의 유량으로 칼럼을 통과시킨다. 그후에 용출은 0M 에서 0.4M까지 직선상의 NaCl 농도 구배를 보이는 총량 50ml의 10mM 트리스-HCl(pH 8.0) 완충액 시스템을 사용하여 동일한 유량으로 수행한다. M-6S 유도체는 100 내지 150mM의 NaCl 농도에서 용출된다(생성량 2.6mg, 또는 39%). 순도는 90%이상이다.
실시예 18
N-말단 첫번째부터 5번째까지의 아미노산이 결실되고, 17번째 아미노산이 세린인 hG-CSF 유도체의 생성(이하에서는 "M-5S"라고 한다)
표 1에 나타낸 유도체(b)를 ml당 132㎍ 함유하는 10mM 트리스-HCl-100mM NaCl용액(pH 8.0) 50ml에 트립신(267유니트/mg 단백질)(Sigma 제품) 0.5㎍을 첨가한 후 25℃에서 10시간 동안 배양시킨다. NaCl 농도를 0.5M로 조정한 후 반응액을 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl로 충전된 Zn 킬레이트-세파로우즈 칼럼(1.7cm×2.6cm, Pharmacia Find Chemicals)에 시간당 6ml의 유량으로 적용시킨다.
그리고 나서 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl 12ml를 시간당 3ml의 유량으로 칼럼을 통과시킨다. 그후에 용출은 0M에서 0.3M까지 직선상의 이미다졸 농도 구배를 보여주는 총량 30ml의 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl 완충액 시스템을 사용하는 동일한 유량으로 수행한다. M-5S 유도체는 0.1M 이미다졸 농도에서 용출된다(생성량 2.7mg, 또는 41%). 순도는 90%이상이다.
실시예 19
N-말단 첫번째부터 4번째까지의 아미노산이 결실되고, 17번째 아미노산이 세린인 hG-CSF 유도체의 생산(이하에서는 "M-4S"라고 한다)
표 1에 나타낸 유도체(d)를 ml당 132㎍ 함유하는 10mM 트리스-HCl-100mM NaCl용액(pH 8.0) 50ml에 트립신(267유니트/mg 단백질)(Sigma 제품) 5㎍을 첨가한 후 25℃에서 20시간 동안 배양시킨다. NaCl 농도를 0.5M로 조정한 다음 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl로 충전된 Zn 킬레이트-세파로우즈 칼럼(1.7cm×2.6cm, Pharmacia Find Chemicals)에 시간당 6ml의 유량으로 적용시킨다. 그리고 나서 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl 12ml를 시간당 3ml의 유량으로 칼럼을 통과시킨다. 그후에 용출은 0M에서 0.3M까지 직선상의 이미다졸 농도 구배를 보이는 총량 30ml인 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl 완충액 시스템을 사용하여 동일한 유량으로 수행한다. M-4S 유도체는 0.1M 이미다졸 농도에서 용출된다(생성량 2.7mg, 또는 41%). 순도는 90%이상이다.
실시예 20
M-4S의 생성
표 2에 나타낸 유도체(d)를 ml당 132㎍ 함유하는 10mM 트리스-HCl-100mM NaCl 용액(pH 8.0) 50ml에 α-키모트립신(267유니트/mg 단백질)(Sigma 제품) 5㎍을 첨가한 후 25℃에서 20시간 동안 배양시킨다. NaCl 농도를 0.5M로 저정한 다음 배양 혼합물을 10mM 트리스 HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl로 충전된 Zn 킬레이트 세파로우즈 칼럼(1.7cm×2.6cm, Pharmacia Find Chemicals)에 시간당 6ml의 유량으로 적용시킨다. 이어서, 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl 12ml를 시간당 3ml의 유량으로 칼럼을 통과시킨다. 그후 용출은 0M에서 0.3M까지 직선상의 이미다졸 농도 구배를 보이는 총량 30ml의 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)-0.5M NaCl 완충액 시스템을 사용하여 동일한 유량으로 수행한다. M-4S 유도체는 0.1M 이미다졸 농도에서 용출된다(생성량 2.3mg, 또는 35%). 순도는 90%이상이다.
실시예 21
실시예 10 내지 20에서 보여진 것처럼 17번째 아미노산이 세린으로 치환되고 N-말단 아미노산이 4개(M-4S), 5개(M-5S), 6개(M-6S), 7개(M-7S) 결실된 hG-CSF 유도체를 수득할 수 있다. 재조합 DNA 기술의 사용은 일반적으로 N-말단에 메티오닌의 첨가를 초래하게 되는데 이는 재조합 산물의 불리한 특성 중의 하나이다. 반면 본 발명에 따른 효소 절단 기술의 사용은 그러한 산물이 N-말단에 메티오닌 첨가없이 생성될 수 있기 때문에 유리하다.
이같은 방법으로 얻어진 유도체를 비교하기 위하여, G-CSF 활성도에 대하여 분석한다. 그 결과는 표 5에 보여지는 바와 같다.
[표 5]
효소 절단기술에 의해 형성된 G-CSF 유도체간의 활성도 비교
표 5에 나타낸 결과로부터, 상기와 같은 시험관내 평가에서, 4 내지 7개의 N-말단측 아미노산이 결실된 유도체들은 온전한 hG-CSF와 비교했을때 2 내지 4배가 더 큰 활성도를 갖고 있다는 것을 알 수 있다.
그러므로 본 발명에 따라서 생성될 수 있는 N-말단측 아미노산이 결실된 유도체는 N 말단에 첨가된 메티오닌을 갖지 않으며, 온전한 산물 보다 2 내지 4배가 더 큰 활성을 갖는다.
다음의 예들은 N-말단 부위에 돌연변이의 결과로서 가수분해 효소에 의한 절단에 대한 반응성(감수성) 획득을 증명해준다.
시험 실시예 1
온전한 hG-CSF와 hG-CSF의 N-말단 돌연변이체에서의 서브틸리신 칼스버그와의 반응성 비교
표 2에 나타낸 유도체와 온전한 hG-CSF를, G-CSF mg당 서브틸리신 칼스버그(NOVO) 3.6×10-4유니트가 존재하도록 하여, 실시예 16과 동일한 방법으로 25℃에서 14시간 각각 배양시킨다. 표 2에 나타낸 유도체는 M-6S 유도체를 제공하는 반면, 온전한 hG-CSF는 반응을 하지 않은 채 잔류한다. 또한 이 효소가 100배 증가된 양으로 사용된 경우에서 조차(3.6×10-2유니트/mg G-CSF), 온전한 산물은 M-6S를 생산 하지 못하지만, 우선적으로 구형 분해반응을 겪게 된다.
시험 실시예 2
온전한 hG'-CSF와 hG-CSF의 N-말단 돌연변이체에서의 트립신과의 반응성 비교
표 2에 나타낸 유도체(a)와 온전한 hG-CSF를 G-CSF mg당 트립신(Sigma 제품) 0.22유니트가 존재하도록 하여, 25℃에서 20시간 동안 각각 반응시킨다. 표 2에 나타낸 유도체(a)는 M-4S 유도체를 제공하는 반면, 온전한 hG-CSF는 반응하지 않은 채 잔류한다. 또한 이 효소가 100배 증가된 양(22 유니트/mg G-CSF)으로 사용된 경우에서 조차 온전한 hG-CSF는 M-4S를 제공하지 않지만 우선적으로 구형 분해반응을 겪게 된다.
시험 실시예 3
hG-CSF 유도체의 열안정성
표 6에 나타낸 본 발명의 여러 유도체 각 20㎍을 인산연 완충 생리 식염수(PBS)(pH 7.2) 또는 10% 소태자 혈청(FBS)이 보충된 α-MEM 1ml에 용해시킨 다음 56℃에서 배양시키고 샘플을 일정한 시간 간격으로 수집하여 마우스 골수 세포를 사용하는 콜로니 형성 시험에 의하여 CSF 활성도를 분석한다(오카베 등이 전술한 방법).
각 샘플은 40ng/ml로부터 2배 희석 기술을 이용하여 10단계 희석한다. 각 단계에 대해 활성도 분석을 수행하고 잔류 활성도는 가열전(0분)의 활성도와 양호한 용량-반응을 나타내는 농도에서의 활성도와의 비교에 의해 결정한다.
PBS 및 10% FBS 보충된 α-MEM에서 얻어진 잔류 활성도(열안정성에 상응하는) 자료는 표 6(A)와 표 6(B)에 각각 보여지는 바와 같다.
[표 6(A)]
[표 6(B)]
실시예 22
부위-특이성 돌연변이 유발을 이용한 pCfBD28A17과 pCfBD28T17의 작제(제17도 참조)
(a) 1-본쇄 주형 DNA의 작제(1-본체 pt19BD28N)
Y-100 완충액 50㎕에 실시예 6-(4)의 방법에 의해 얻어진 pCfBD28 3㎍을 용해시킨 후, 제한효소 BanⅢ(Toyobo 제품)와 Pst I 을 10유니트를 첨가하여 절단반응을 37℃에서 2시간 동안 수행한다. 반응 혼합물로부터 LGT법으로 hG-CSF 유도체의 N-말단 부위를 코드하는 약 210bp DNA 단편(BanⅢ-Pst I 단편) 약 0.1㎍을 수득한다(ND28).
따로, M13 파아지 벡터 M13mp19RF DNA(Takara Shuzo 제품) 1㎍을 Y-50 완충액 총 50㎕에 용해시킨 후 제한효소 ACCI(Toyobo 제품) 10유니트를 첨가하여 절단 반응을 37℃에서 2시간 동안 수행한다.
그후에 NaCl를 100mM 농도가 되게 첨가하고 제한 효소 Pst I 을 10유니트 가한 후 절단 반응을 37℃에서 2시간 동안 수행한다. 반응 혼합물로부터 LGT법으로 약 7.24kb의 DNA 단편(ACCI-PST I 단편) 약 0.8㎍을 수득한다.
T4 DNA 리가아제 완충액 50㎕ 중에 각각 상기와 같이 수득한 Ban Ⅲ-Pst I 단편(약 210bp) 0.2㎍과 Acc I - Pst I 단편(약 7.24kb) 0.05㎍을 용해시킨 후 T4 DNA 리가아제(10유니트)를 혼합물 용액에 첨가하여 연결 반응을 12℃에서 16시간 동안 수행한다.
이어서, 상기 반응 혼합물을 사용하여 공지의 방법에 따라 이. 콜라이 JM105를 형질감염시켜 재조합 파아지를 수득한다. 재조합 파아지로 감염된 이. 콜라이 JM105 유도된 형질전환체에 배양된 세포로부터 재조합 M13 파아지 RF DNA를 회수한다. 이 RF DNA(이하에서는 "pt19BD28N"이라고 한다)의 구조는, Pst I, EcoR I, Ara I 및 Xho I으로 절단후 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 확인한다. 이어서, 1-본쇄 pt19BD28N를 공지의 방법에 따라 재조합 파아지로부터 회수하고 주형으로 사용한다.
(b) 갭을 지닌 2-본쇄(duplex) DNA의 작제
Y-100 완충액 30㎕에 M13mp19RF DNA(Takara Shuzo 제품)을 용해시킨 다음 제한 효소 EcoR I 과 HindⅢ를 각각 10유니트씩 가하여 37℃에서 2시간 동안 절단반응을 수행한다. LGT법으로 반응 혼합물로부터 약 7.2kb의 DNA 단편(EcoR I -HindⅢ 단편) 약 2.5㎍을 수득한다.
이러한 M13mp19RF DNA에서 유도된 EcoR I -HindⅢ 단편(약 7.2kb)과 전반부에서 기술한 대로 수득된 1-본쇄 주형 DNA인 pt19BD28N 1㎍을 콜레노우 완충액 27㎕에 용해시킨 다음 100℃에서 6분간 끊임으로써 DNA 변성을 야기시킨다. 그후 이 혼합물을 65℃에서 10분간, 37℃에서 40분간, 4℃에서 40분간 그리고 얼음 속에 10분간 정치시킴으로써 아닐링 반응이 이루어지도록 한다. 이렇게 함으로써 그 주형내에 G-CSF 유전자 부분 만인 1-본쇄인, 갭을 지닌 2-본쇄 DNA가 형성된다. 이렇게 형성된 갭이 있는 2-본쇄 DNA를 LGT 방법으로 회수한다.
(c) 돌연변이 유발(pt19BD28NA17 및 pt19BD28NT17의 작제)
실시예 6에서 수득된 hG-CSF 유도체[ND28]의 17번째 아미노산(N-말단으로부터), 즉 세린을 알라닌으로 대치하는데 필요한 1-본쇄 DNA(D-1)과 세린을 트레오인으로 대치하는데 필요한 1-본쇄 DNA(D-2)를 일반적으로 포스포트리에스테르법에 따라 합성한다. D-1(33-량체)과 D-2(33-량체)의 염기 서열은 다음과 같다 :
D-1을 사용한 돌연변이 유발이 새로운 Stu I 부위를 형성시키고 D-2를 사용한 돌연변이 유발이 새로운 Xba I 부위를 형성시킬 수 있도록 상기의 DNA들을 고안되었다. 그러므로 돌연변이체는 이들 제한효소로 절단하여 동정될 수 있다.
D-1과 D-2를 각각 별도로 1㎍의 양으로 T4 키나제 완충액 5㎕에 녹인 다음 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 30유니트를 가하고 37℃에서 60분 동안 포스포릴화 반응을 수행한다.
이어서 포스포릴화 D-1 혹은 D-2 0.2㎍과 전반부에 기술한 대로 수득된 갭을 지닌 2-본쇄 DAN 0.1㎍을 6.5mM 트리스-HCl(pH 7.5), 8mM MgCl2, 1mM 2-머캅토에탄올, 그리고 100mM NaCl을 함유하는 완충액 34㎕에 녹이고, 이 용액을 65℃에서 60분간, 그리고 실온에서 30분간 정치시킴으로써 D-1 혹은 D-2를 갭을 지닌 2-본체 DNA를 아닐링시킨다.
이 용액에 dATP, dTTP, dCTP 그리고 dGTP를 각각 0.5mM의 농도가 되도록 가하낟. DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편 1.5유니트와 T4 DNA 리가제 10유니트를 가하여 4℃에서 16시간 동안 연장반응을 수행한다.
이렇게 수득된 반응 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 JM105를 형질감영시켜 돌연변이 파아지를 수득한다. 돌연변이 파아지에 감염된 이. 콜라이 JM105 형질전환체로부터 RF DNA를 회수하여 Ava I , Xho I 그리고 Stu I (D-1이 사용될때)이나 혹은 Xbal(D-2가 사용될때)으로 절단시키고 폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 실시하여 동정한다. D-1에 의해 도입된 돌연변이를 지니는 RF DNA는 pt19BD28NA17로 명명하고 D-2에 의해 도입된 돌연변이를 지니는 RF DNA는 pt19BD28NT17로 명명한다. pt19BD28NA17과 pt19BD28NT17의 각각 Stul 부위와 Xba I부위 근처에서의 염기 서열은 M13 파아지를 사용한 디데옥시 서열 분석방법에 의해 아래와 같이 확정된다.
(d) pCfBD28A17 과 pCfBD28T17의 작제
위에 기술한 대로 수득된 pt18BD28NA17 혹은 pt19BD28NT17 3㎍을 Y-100 완충액 50㎕에 녹이고, 제한효소 Ava I 과 Xho I 을 각각 10유니트씩 가한 다음, 37℃에서 2시간 동안 절단 반응을 수행한다. LGT법으로 반응 혼합물로부터 전반부에서 기술한 대로 도입된 돌연변이 부위를 포함하는 약 110bp DNA 단편(Ava I -Xho I 단편) 0.05㎍을 수득한다.
별도로, 실시예 6-(4)에서 수득된 pcfBD28 2㎍을 Y-100 완충액 50㎕에 녹이고 제한효소 Xho I과 BglⅡ를 각각 10단위씩 가한 다음 37℃에서 2시간 동안 절단 반응이 이루어지도록 하였다. LGT법으로 반응 혼합물로부터 트립토판 프로모터 부분을 포함하는 약 2.74kb 크기의 DNA 단편(Xho I - BglⅡ 단편) 약 1㎍을 수득한다.
또한 별도로, Y-100 완충액 50㎕에 PCfBD28 2㎍을 녹이고 제한효소 BglⅡ 10 유니트를 가한 다음 37℃에서 2시간 동안 절단 반응이 이루어지도록 하였다. 아가로즈 겔 전기영동에 의하여 BglⅡ 절단이 완성 되었음을 확인한 후에 제한효소 Aval 5 단위를 가하고 37℃에서 10분 동안 부분적인 절단이 이루어지도록 하였다. LGT법으로 반응 혼합물로부터 1pp 터미네이터 부분을 지닌, 대부분 성숙한 hG-CSF cDNA를 포함하는 약 1.29kb 크기의 DNA 단편(BalⅡ-Ava I 단편) 0.4㎍을 수득한다.
이제 pCfBD28-유도된 Xhol-BglⅡ 단편(약 2.74kb) 0.1㎍과 pCfBD28-유도된 BglⅡ-Ava I 단편(약 1.29kb) 0.1㎍과 pt19BD28NA17 혹은 pt19BD28NT17-유도된 Aval-Xho 단편(약 100bp) 0.02㎍을 T4 DNA 리가아제 완충액 60㎕에 녹이고 T4 DNA 리가아제 10 유니트를 가한 다음 12℃에서 16시간 동안 연결반응이 이루어지도록 한다.
이렇게 하여 수득한 반응 혼합물을 이. 콜라이 HB101을 형질전환하는데 사용하여 Apr콜로니를 수득한다. 이. 콜라니의 세포를 배양하여 플라스미드 DNA를 회수한다. pt19BD29NA17을 이용하여 작제된 플라스미드는 pCfBD29A17로 명명한다. pCfBD28A17의 구조는 Aval, Xhol, BglⅡ와 Stul으로 절단한 다음 아가로즈 겔 전기영동으로 확인하고, pCfBD28T17의 구조는 Ava I, Xho I, BglⅡ와 Xba I으로 절단한 다음, 아가로즈 겔 전기영동으로 확인한다.
이들 두 플라스미드에 의해 코드된, hG-CSF 유도체에서 대치된 아미노산 잔기를 성숙 hG-CSF와 비교한 결과는 아래와 같다.
pCfBD28A17과 pCfBD28T17에 의해 코드된 hG-CSF 유도체는, 이후로 각각 hG-CSF[ND28A17]와 hG-CSF[NS28T17]로 명명하도록 한다.
참조실시예 1
hG-CSF cDNA를 수반하는 플라스미드 pCSF1-2의 분리
(1) 정상 사람 말초헐 대식세포부터 폴리(A) RNA의 제조
정상 사람 말초혈을 플라스틱 원심관에 넣어 원심분리하고 수득한 백혈구를 배양하고, 세척하여 비접착성 세포를 제거하여 접착성 세포인 대식세포를 분리한다. 폴리(A)를 지니는 RNA는 아래와 같이 구아니딘 티오시아네이트-염화 리튬법에 의해 대식 세포로부터 제조한다[참조 : 카탈라 등 : DNA,2,329(1983)].
정상 사람 말초혈(400ml)을 히타치 RPR 10로터로 1,800rpm에서 20분동안 원심분리한다. 혈액 세포 침전들을 50ml의 인삼염-완충 식염수[8g/1 NaCl, 0.2g/ ℓ KCl, 1.15g/ ℓ 무수 Na2HPO4, 0.2g/ ℓ KH2PO4(pH 7.2) ; 이후로는 PBS로 축약함]에 현탁시킨다. 이 현탁액중 25ml 분량을 임파구 분리 용액(BIONETICS 제품) 25ml에 충화시키고 전체를 히타치 RPR 10 로터 1,800rpm에서 30분 동안 원심분리한다. 중간층의 백혈구를 모아 동일량의 PBS로 세척하고(히타치 RPR 10 로터 1,500rpm에서 10분 동안) 5% 소태자 혈청(FBS)를 함유한 RPMI 1640배지(Nissui Seiyaku 제품) 20ml에 현탁하고 조직 배양 플라스크(Corning 제품)를 사용하여 배양한다. 37℃에서 1.5시간 성장시킨 후 배양물 상충액을 비접착성 세포와 함께 제거한다. 신선한 동일 배양액 20ml와 이. 콜라이로부터 얻은 리포폴리삭카라이드(LPS)(0.3mg/ml의 농도가 되도록)를 가하고 37℃에서 4시간 동안 계속 배양한다. 4℃에서 1,100xg로 10분간 원심분리함으로써 배양액으로부터 세포를 수거하고 80ml의 PBS로 세척하고 와동 혼합기(vortex mixer)를 사용하여 5M 구아니딘 티오시아네이트, 10mM EDTA, 50mM 트리스-HCl(pH 7)과 8%(v/v) 2-머캅토에탄올을 함유하는 10ml 용액에 용해시킨다. 이러한 용해산물을 원심관으로 옮기고 80ml의 4M LiCl을 가하고 잘 교반한 다음 4℃에서 20시간 동안 정치시킨 후 히타치 RPR10 로터로 9,000rpm에서 90분 동안 원심분리한다. 이렇게하여 RNA 침전물을 회수한다. RNA 침전물을 4M 우레아와 2M 염화리튬을 함유하는 50ml 용액에 현탁시키고 이 현탁액을 히타치 RPR 10 로터로 9,000rpm에서 60분간 원심분리하여 RNA 침전물을 다시 회수한다.
이 RNA 침전물을 0.1% 라우릴 황산나트륨, 1mM EDTA와 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)을 함유하는 용액 10ml에 녹이고 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전에 의하여 RNA를 회수한다. 수득된 RNA(약 0.8mg)을 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)과 1mM EDTA를 함유하는 용액 1ml에 녹이고 65℃에서 5분간 배양 후 5M 염화나트륨 0.1ml을 가한다. 이 혼합물을 올리고(dT)-셀룰로오즈 칼럼(P-L Biochemicals 제품) 크로마토그라피(칼럼 부피 0.5ml)에 적용시킨다. 폴리(A)를 포함하는 흡착된 mRNA는 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)과 1㎍ EDTA를 함유하는 용액으로 용출하고 폴리(A)를 포함하는 mRNA 약 30㎍을 수득한다.
(2) cDNA 합성과 벡터내로의 삽입
cDNA 합성과 수득된 cDNA의 삽입에 의해 재조합 플라스미드 작제를 위하여 오까야마-버그 방법(참고 : Mol. Cell. Biol., 2, 161(1982)]을 사용한다. 그 과정은 제9도에 개략적으로 나타나 있다.
10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 6mM 염화마그네슘, 그리고 10mM 염화나트륨을 함유하는 용액 30㎕에 PCDV 1[참조 : 오까야마 및 버그 : Mol. Cell. Biol., 3,280(1983)] 400㎍을 가하고 Kpn I 500 유니트를 가하여 37℃에서 6시간 동안 반응이 이루어지도록 함으로써 플라스미드는 Kpn I 부위에서 절단시킨다. 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전으로 DNA를 회수한다. 40mM 카코딜 나트륨, 30mM 트리스-HCl(pH 6.8), 1mM 염화칼슘과 0.1ml 디티오스레이톨(이후로는 DTT로 약기)을 함유하는 완충액(이후로는 TdT 완충액으로 약기)에 DTTP를 0.25mM 농도로 가함으로써 조제된 용액 200㎕에 Kpn I에 의해 절단된 DNA 약 200㎍을 가하고 그후 말단 데옥시-뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(이후로는 TDT로 약기)(P-L Biochemicals 제품) 81 유니트를 가한 다음 37℃에서 11분간 반응시킴으로서 약 67dT 잔기를 포함하는 폴리(dT) 사슬을 pCDV1 Kpn I 절단 부위 3' 말단에 각각 첨가한다. 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전에 의해 위의 반응 혼합물로부터 폴리(dT) 사슬 부가 pCDV1 DNA 약 100㎍이 회수된다. 10mM 트리스 -HCl(pH 7.5), 6mM 염화마그네슘과 100mM 염화나트륨을 함유하는 완충액 150㎕에 DNA를 녹이고 그후 EcoR I 360유니트를 가하였고 37℃에서 2시간 동안 반응이 이루어지도록 한다. LGT법으로 반응 혼합물을 처리하고 약 3.1kb의 DNA 단편을 수득한다.
이렇게 함으로 폴리(dT) 사슬을 말단으로 갖는 pCDV1 약 60㎍이 수득된다. 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)과 1mM EDTA를 함유하는 용액 500㎕에 DNA를 녹인 다음, 65℃에서 5분간 배양하고, 얼음으로 냉각시킨후, 5M NaCL 50㎕를 가한다. 혼합물을 올리고(dA)-셀룰로오즈 칼럼(Collaborative Research 제품) 크로마토그라피에 적용시킨다. 충분한 폴리(dT) 사슬 길이를 지닌 분자는 칼럼에 흡착되고 10mM 트리스-HCL(pH 8.0)과 1mM EDTA를 함유하는 용액으로 용출된다. 이렇게 함으로써, 폴리(dT) 사슬을 말단에 지닌 PCDV1(이후로는 벡터 프라이머로 약기) 27㎍이 수득된다.
이제 링커 DNA가 합성되었다. 10mM 트리스-염산(pH 7.5), 6mM 염화마그네슘과 50mM 염화나트륨을 함유하는 완충액 20㎕에 pL1[참고 : 오까야마와 버그 : Mol. Cell. Biol., 3,280(1983)]약 14㎍을 녹이고 Pst I 50 유니트를 가하여 37℃에서 4시간동안 반응이 이루어지도록 함으로 pLI DNA를 Pst I 부위에서 절단 한다. 반응 혼합물을 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 침전으로 Pst I에 절단된 pLI DNA 약 13㎍을 회수한다. 이 DNA(약 13㎍)를 최종 0.25mM 농도로 dGTP가 보충된 TdT 완충액 50㎕에 가하고 TdT(P-L Biochemicals) 54 유니트를 가하고 37℃에서 13분 동안 방치하여 둠으로써 약 14dG 잔기를 포함하는 (dG) 사슬을 pL1의 각 Pst I 절단부위 3' 말단에 첨가한다. 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전으로 DNA를 회수한다. DNA를 10mM 트리스-염산(pH 7.5), 6mM 염화마그네슘과 60mM 염화나트륨을 함유하는 완충액 100㎍에 녹이고 HindⅢ 80 유니트를 가하고 37℃에서 3시간 배양함으로써 pLI DNA가 HindⅢ 부위에서 절단되도록 한다. 아가로즈 젤 전기영동으로 반응 혼합물을 분획하고 DEAE-페이퍼 방법[참조 : 트래트젠 등 : Anal. Biochem., 112, 295(1981)]으로 약 0.5kb 크기의 DNA 단편을 회수한다. 그러므로 올리고(dG) 사슬로 테일링된 링커 DNA가 수득된다(이후로는 단순히 링커 DNA라고 한다).
50mM 트리스-염산(pH 8.3), 8mM 염화마그네슘, 30mM 염화칼륨, 0.3mM DTT, 2mM dNTP(dATP, DTTP, dGTP와 dCTP)와 리보뉴클레아제 억제제(P-L Biochemicals 제품) 10 유니트를 함유하는 용액 22.3㎕에, 위에 기술한 대로 조제된 poly(A) RNA 약 3㎍과 벡터 프라이머 1.4㎍을 녹이고 10 유니트의 역전사효소(Seikagaku kogyo 제품)를 가하여 41℃에서 90분간 혼합물을 배양함으로써 mRNA에 대한 상보성 DNA가 합성되도록 한다. 반응 혼합물을 페놀-클로로포름 추출시키고, RNA-DNA 이중나선을 지닌 벡터 프라이머를 에탄올 침전에 의하여 회수한다. 이 DNA를 60μMdCTP와 0.2㎍ poly(A)를 함유하는 TdT 완충액 20㎕에 녹이고 TdT (P-L Biochemicals) 14유니트를 가하여 37℃에 2분간 배양으므로써 20dC 잔기를 포함하는(dC) 사슬이 cDNA의 3' 말단에 붙도록 한다. 반응 혼합물을 페놀-클로로포름 추출시키고, 에탄올 침전으로(dC) 사슬이 테일링된 cDNA-벡터 프라이머 DNA를 회수한다. 10mM 트리스-염산(pH 7.5), 6mM 염화마그네슘과 60mM 염화나트륨을 함유하는 용액 40㎕에 이 DNA를 녹이고 HindⅢ 20 유니트를 가하여 37℃에서 2시간 동안 배양하여 HindⅢ 부위에서 절단이 이루어지도록 한다. 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 (dC) 사슬이 테일링된 cDNA-벡터 프라이머 DNA 0.5pmole을 수득한다.
10mM 트리스-염산(pH 7.5), 0.1M 염화나트륨과 1mM EDTA를 함유하는 용액 100㎕에 DNA 0.2pmole과 위에서 언급한 링커 DNA 0.4pmole을 녹이고 65℃, 42℃, 그리고 0℃에서 각각 10분, 25분 그리고 30분간 배양한다.
아래의 조성을 지닌 반응 혼합물 총 1,000㎕를 조제한다 : 20mM 트리스-염산(pH 7.5), 4mM 염화마그네슘, 10mM 황산암모늄, 0.1M 염화칼륨과 0.1mM 베타-NAD. 이 반응 배지에 이. 콜라이에서 유도된 DNA 리가아제(New England Bio-Labs 제품) 25 유니트를 가하고 11℃에서 18시간 동안 배양한다. 반응 배지에 각각의 dNTP 40μM, 최종농도가 0.15mM로 되도록 베타-NAD를 가하고 또한 이. 콜라이 DNA 리가아제 10유니트, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I(P-L Biochemicals 제품) 20 유니트와 이. 콜라이 리보뉴 클레아제 H(P-L Biochemicals 제품) 10 유니트를 가하여 12℃에서 1시간, 그리고 25℃에서 1시간 배양한다. 위의 반응 절차에 의하여 cDNA를 포함하는 재조합 DNA의 완형화의 RNA-DNA-2-본쇄중 RNA 부분이 상응하는 DNA로의 대치반응이 이루어진다. 그러므로 완전한 2-0본쇄 DNA 형태의 재조합 플라스미드가 제조된다.
(3) hG-CSF cDNA를 포함하는 재조합 DNA의 선별
(2)에서 기술한 대로 수득한 재조합 플라스미드는 스코트 등의 방법[참고 : 가트수야 쉬게사다 : 사이보 고가쿠(Cell Technology), 2,616(1983)]에 의하여 이. 콜라이 C600SF8을 형질전환하는데 사용한다. 수득된 약 9,200개의 콜로니를 니트로셀룰로오즈 여과지에 고정시킨다. 나가타 등[참고 : 나가타등 : Nature, 319, 415(1986)]이 분리한 대로 성숙한 hG-CSF 단백질의 N-말단에서 9개의 아미노산에 해당하는 27-염기 합성 DNA인 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTG-3'를32p로 라벨함으로써 조제된 프로브와 60℃에서 강하게 결합하는 한 균주를 선별한다[참고 : 그루스테인-흑네스 방법 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961(1975)]. 이러한 균주가 지니고 있는 플라스미드 pCSF 1-2내에 포함된 cDAN의 전체 염기 서열은 M13 파아지(표 1)을 사용한 디데옥시 서열 분석방법으로 결정한다. 결과로써 pCSF 1-2내에 포함된 cDNA가 hG-CSF를 코드함을 밝힐 수 있다. 이러한 균주는 위에 언급한대로 이. 콜라이 ECSF 1-2(FERM BP-1220)[한국기탁기관 : 한국종균협회 : 기탁일 : 1988.2.2 : 기탁번호 : KFCC-10511]의 기탁번호로 FRI에 기탁되었다
참조실시예 2
플라스미드 pKYP 25의 분리 및 정제
pKYP 26을 지닌 이. 콜라이 균주[이. 콜라이 1KYP 26(FERM BP-863)[한국기탁기관 : 한국종료협회, 기탁일 : 1988.2.2 : 기탁번호 : KFCC-10509]를 앰피실린 50㎍/ml를 포함하는 10ml의 L배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨, pH 7.5)에서 37℃에서 18시간 동안 배양시킨다. 전 배양액을, 50㎍/ml의 앰피실린이 포함된 1ℓ의 L배지에 옮기고 37℃에 배양한다. 4시간 후에 클로람페닐콜을 170㎍/ml 농도로 가한후 37℃에서 16시간 더 배양한다. 원심분리(5,000rpm, 10분)하여 세포를 수거하고 0.8% NaCl로 세척하고 50㎍ 트리스-염산(pH 8.0) 20ml에 현탁하고 이 현탁액을 얼음으로 냉각시킨다. 리소자임(10mg/ml, 8ml)을 가하고 얼음에 10분간 정치시킨후 0.5M EDTA 9.5ml을 가한다. 얼음에 10분간 정치시킨 후 2% 트리톤 X-100(Wako Pure Chemicals Industries 제품) 2.3ml를 가하고 얼음에 1시간 더 방치한다. 4℃에서 50,000xg으로 1시간 원심분리하여 40ml의 상충액을 얻고, 이 상충액을 3M 수산화나트륨을 가하여 pH 12.5로 조정하고 실온에서 10분간 부드럽게 교반한다. 2M 트리스-염산(pH 7.5)를 가함으로써 pH를 다시 8.5로 조정하고 이어서 추가로 3분간 교반한다. 이때 상충액의 부피는 약 55ml이다. 5M 염화나트륨을 1/9배 용적으로 가하고 페놀 추출을 수행한다. 5mg/ml RNase A(Sigma 제품) 1/250배 용적으로 가하고 RNA 분해반응이 37℃에서 1시간 동안 진행되도록 하고 5M 염화나트륨을 1/5배 용적으로 0% PEG 6000(Nakarai Chemicals 제품)을 1/3배 용적으로 가한다.
그후 -20℃에 2시간 방치하고 원심분리하여 침전물을 수득하고 10mM 트리스-염산(pH 7.5)과 1mM EDTA 를 포함하는 용액 2ml에 녹이고 나트륨 도데실설페이트(SDS)을 0.5% 농도로, 프로테이나제 K(Sigma 제품)을 50㎍/ml 농도로 가한 다음, 37℃에서 1시간 동안 단백질 분해반응이 이루어지도록 한다. 페놀 추출을 3번 반복한 후 클로로포름 추출과 에탄올 침전으로 DNA를 회수하고, 10mM 트리스-염산(pH 7.5)과 1mM EDTA를 함유하는 용액1ml에 녹여 pKYP26 800㎍을 수득한다. pKYP26의 구조는 EcoR I , Kpn I , BamH I , BalⅡ와 Pst I으로 절단하고 아가로즈 겔 전기영동으로 확인한다.
참조실시예 3
1) 사람 LT cDNA를 지닌 플라스미드 pLT 1의 분리
(1) Luk Ⅱ 세포로부터 폴리(A) RNA의 제조
사람 임파아구 세포주 Luk Ⅱ로부터 폴리(A)를 지닌 RNA를 제조하기 위하여 아래와 같이 구아니딘 티오시아네이트-염화 리튬법[참조 : 카탈라 등 : DNA,2,329 : (1983)]을 실시한다.
사람 임파아구성 LukⅡ 세포[참고 : 배리시 와이. 루빈 등 : Proc. Natl. Acad. USA, 82, 6637(1985)]를 8×105세포수/ml 세포 농도로 5% 소태자 혈청과 1mM N-2-하이드록시에틸 피페라진-N'-에탄설폰산(HEPES)을 함유하는 RPMI 1640 배지(Nissui Seiyaku 제품) 1ℓ에 씨딩하고 배양한다. 스피너 배양병을 사용하여, 37℃에서 48시간 배양하고, 원심분리하여 세포를 수집하여 5% 소태자 혈청과 1mM HEPES를 함유하는 신선한 RPMI 1640 배지 1ℓ에 옮기고 37℃에서 48시간 더 배양한다. 이 세포 현탁액중 250ml를 1,100xg로 4℃에서 10분간 원심분리하여 세포를 회수하고 80ml의 인산염 완충액으로 세척하고 와동 혼합기를 사용하여 5M 구아니딘 티오시아네이트, 10mM EDTA, 폰 50mM 트리스-염산(pH 7)과 8%(v/v) 2-머캅토에탄올을 함유하는 용액 10ml에 가용화시킨다. 용액 산물을 원심관으로 옮기고 4M 염화리튬 80ml를 가하고, 이 혼합액을 교반후 4℃에 20시간 정치한다. 히타치 RPR 10 로터로 9,000rpm에서 90분간 원심분리한 후 RNA 침전물을 회수한다. RNA 침전물을 4M 우레아와 2M 염화리튬을 함유하는 용액 50ml에 현탁하고 히타치 RPR 10 로터 9,000rpm에서 60분간 원심분리하여 RNA 침전물을 다시 회수하고 이를 0.1% 나트륨 라우릴설페이트, 1mM EDTA와 10mM 트리스-염산(pH 7.5)을 함유하는 용액 10ml에 녹이고 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전에 의하여 RNA를 회수한다. 이렇게 수득된 RNA 약 2.5mg에 10mM 트리스-염산(pH 8.0)과 1mM EDTA를 함유하는 용액 1ml에 녹인다. 65℃에서 5분간 배양한 후 5M 염화나트륨 0.1ml를 가한다. 혼합물을 올리고(dT)-셀룰로오즈 칼럼(P-L Biochemicals 제품) 크로마토그라피(칼럼 부피 0.5ml)에 적용시킨다. 흡착된 폴리(A)을 지닌 mRNA는 10mM 트리스-염산(pH 7.5)과 1mM EDTA를 함유한 용액으로 용출하고 약 100㎍의 폴리(A)을 지닌 mRNA을 수득한다.
(2) cDNA 합성과 벡터내 상기 DNA의 삽입
cDNA 합성과 cDNA을 삽입한 재조합 플라스미드는 오카야마-버그 방법[참조 : Mol. Cell. Biol., 2, 161(1982)]에 따라 작게하고, 그 공정은 제9도에 개략적으로 나타나 있다.
10mM 트리스-염산(pH 7.5), 6mM 염화마그네슘과 10mM 염화나트륨으로 이루어진 용액 300μL에 pCDV1[참고 : 오카야마 및 버그 : Mol. Cell. Biol., 3, 280(1983)] 400㎍을 가하고, Kpn I 500유니트를 가하고, 37℃ 6시간 반응시켜 플라스미드를 Kpn I 부이에서 절단한다. 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전으로 DNA를 수득한다. TdT 완충액에 dTTP가 최종 농도로 0.25mM이 되도록 넣은 용액 200㎕에 Kpn I 절단 DNA 약 200㎍을 가하고, TdT 81 유니트를 가하고 37℃에서 11분간 반응시켜 pCDV1의 Kpn I 절단 부위의 각 3' 말단에 폴리(dT) 사슬(약 67dT 잔기)을 첨가시킨다. 폴리(dT) 시슬 테일링된 pCDV1 DNA 약 100㎍을 페놀-클로로포름 추출에 이어 에탄올 침전으로 회수한다. 100mM 트리스-염산(pH 7.5). 6mM 염화마그네슘과 100mM 염화나트륨으로 이루어진 용액 150㎕에 DNA를 가하고, EcoR I 360 유니트를 추가로 가한후, 37℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 반응 혼합물을 LGT법으로 처리하여 약 3.1kb의 DNA 단편을 수득한다. 즉 폴리(dT) 사슬 테일링된 pCDV1 약 60㎍을 수득한다. 이 DNA를 10mM 트리스-염산(pH 8.0)과 1mM EDTA로 이루어진 용액 500㎕에 녹이고, 65℃ 5분간 반응시키고 얼음으로 차갑게 한 후 5M 염화나트륨 50㎕을 가한다. 이 혼합물을 올리고(dA) 셀루로오즈 칼럼(Collaborative Research 제품) 크로마토그라피에 적용시킨다. 충분한 길이의 폴리(dT) 사슬을 지닌 분자들이 칼럼에 흡착되고, 이들을 10mM 트리스-염산(pH 8.0)과 1mM EDTA로 이루어진 용액으로 용출시켜 폴리(dT) 사슬 테일링된 pCDV1(이후 벡터 프라이머라고함) 27㎍을 수득한다.
그리고 링커 DNA을 제조한다. 10mM 트리스-염산(pH 7.5), 6mM 염화마그네슘과 50mM 염화나트륨을 포함하는 완충액 200㎕에 pL1[참고 : 오카야마 -버그 : Mol. Cell. BioL, 3, 280(1983)] 약 14㎍을 가하고, Pst I 50유니트를 가하고, 37℃ 4시간 반응시켜 pL1 DNA의 Pst I 부위에서 절단한다. 반응 혼합물을 페놀 클로로포름 추출시키고, 에탄올 침전시켜 Pst I 절단된 pL1 DNA 약 13㎍을 수득한다. dGTP을 최종 농도가 0.25mM가 되도록 가한 TdT 완충액 50㎕에 상기 DNA 약 13㎍을 가하고, TdT 54 유니트를 추가로 가한후 37℃ 13분간 반응시켜 각 pL1의 Pst I 절단부위 3' 말단에(dG) 사슬(약 14dG 잔기)을 부가시킨다. 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전으로 DNA를 회수한다. 10mM 트리스-염산(pH 7.5), 6mM 염화마그네슘과 60mM 염화나트륨으로 이루어진 완충액 100㎕을 DNA에 가하고, HindⅢ 80유니트를 첨가하여 37℃, 3시간 동안 반응시켜 pL1 DNA의 HindⅢ 부위에서 절단시킨다. 반응 혼합물을 아가로오즈 겔 전기영동으로 분획화하고, DEAE 페이퍼 방법[참고 : 드레첸 등 : Anal, Biochem, 112, 295(1981)]으로 약 0.5kb의 DNA 단편을 수득한다. 따라서 올리고(dG) 사슬 테일링된 링커 DNA(이하 링커 DNA라고 한다)를 수득한다.
폴리(A) RNA 약 2㎍과 벡터 프라이머 약 1.4㎍을 50mM 트리스 염산(pH 8.3), 8mM 염화마그네슘, 30mM 염화칼륨, 0.3mM DTT, 2mM dNTP(dATP, dTTP, dGTP와 dCTP)로 이루어진 용액 22.3㎕에 녹이고, 리보뉴클레아제 억제제(P-L Biochemicals 제품) 10유니트와 역전사효소(Seikagaku kogyo 제품) 10 유니트를 가하고 41℃, 90분간 반응시켜 mRNA가 상보성 DNA를 만들도록 한다. 반응 혼합물을 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전시켜 RNA-DNA 이중쇄를 지닌 벡터 프라이머 DNA을 수득한다. 66μM dCTP와 폴리(A) 0.2㎍을 첨가한 TdT 완충액 20㎕에 DNA을 녹이고, TdT(P-L Biochemicals 제품) 14 유니트를 가하고 37℃에서 2분 반응시켜 cDNA의 3' 말단에(dC) 사슬(dC 잔기 20개)을 부가시킨다. 반응 혼합물을 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전시켜(dC) 사슬 테일링된 cDNA-벡터 프라이머 DNA을 수득한다. 10mM 트리스-염산(pH 7.5), 6mM 염화마그네슘과 60mM 염화나트륨으로 이루어진 용액 400㎕에 DNA을 녹이고, HindⅢ 20 유니트를 가하고 37℃에서 2시간 반응시켜 HindⅢ 부위에서 절단을 수행한다. 반응 혼합물을 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전시켜 (dC)사슬 테일링된 cDNA-벡터 프라이머 DNA 0.5pmole을 수득한다. 10mM 트리스-염산(pH 7.5), 0.1M 염화나트륨과 1mM EDTA로 이루어진 용액 100㎕에 DNA(0.2pmole)을 녹이고, 65℃, 42℃, 0℃에서 각각 10분, 25분, 30분의 순으로 반응시킨다.
반응 배지 총 용적 100㎕을 다음 조성에 따라 제조한다 : 20mM 트리스-염산(pH 7.5), 4mM 염화마그네슘, 10mM황산암모늄, 0.1M 염화칼륨과 0.1mM β-NAD, 이 반응 배지에 이. 콜라이 DNA 리가아제(New England Bio-Labs) 25 유니트를 가하고 11℃, 18시간 동안 배양시킨다. 이 반응 배지에 각 dNTP 40μM 및 β-NAD을 최종 농도가 0.15mM이 되도록 보충시키고, 이. 콜라이 DNA 리가아제 10유니트, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I (P-L Biochemicals) 20유니트와 이. 콜라이 리보뉴클레아제(P-L Biochemicals) H 10유니트를 가한후, 12℃, 1시간, 그리고 25℃, 1시간 배양한다. 이러한 반응조작에 의해 cDNA 함유 재조합 DNA의 환형화 및 해당 DNA에 의한 RNA-DNA 2-본쇄의 RNA 부분의 치환이 일어난다. 이와 같이 하여 완전한 2-본쇄 DNA로 된 재조합 플라스미드를 수득한다.
(3) 사람 LT cDNA 함유 재조합 DNA의 선별
(2)에 의해 수득한 재조합 플라스미드를 사용하여 이. 콜라이 C600 SF8[참고 : Cameron : Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 72, 3416(1975)]를 스코트 등의 방법(Katsuya Shigesada : Saibo Kogaku(Cell Technology), 2, 616(1983)]으로 형질전환시킨다. 니트로 셀루로오즈 필터에 약 30,000 콜로니를 고정시킨다. 제네테크 방법[참고 : patrick W. Gray et al., Nature, 312, 721(1984)]에 따라 분리된 사람 LT cDNA의 5' 비해독 부분의 염기 서열의 일부에 해당되는 17-염기 합성 DNA(5'-GATCCCCGGCCTGCCTG-3')를32P로 라벨하여 프로브(probe)로 사용하였을 때 62℃에서 강하게 반응하는 균주 하나를 선택한다[참고 : 그런스타인-호그니스 방법 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961(1975)]. 이 균이 가지고 있는 플라스미드 pLT1 cDNA의 전체 염기 서열을 M13 파아지를 이용한 디데옥시 서열 분석방법으로 결정한다. 그 결과, pLT1 DNA가 사람 LT을 코드하고 있는 것을 밝혔다.
(4) 재조합 플라스미드 pLA1의 작제
10mM 트리스-염산(pH 7.5), 7mM 염화마그네슘과 6mM 2-머캅토 에탄올로 이루어진 용액(이후 "Y-O 완충액"이라고 한다) 50㎕에 위섹션에서 기술한 조작에 따라 수득한 pLT1(4.7kb) 5㎍을 녹이고, 제한효소 XhoⅢ(Boehringer Mannheim 제품) 10유니트를 가하고, 37°, 2시간 반응시켜 절단시킨다. 그리고 염화나트륨을 최종 농도가 150mM이 되도록 가하고, 제한효소 Nsi I (New England Bio-Labs 제품) 10유니트를 가하고 37℃, 3시간 더 반응시켜 절단한다. 반응 혼합물로부터 LGT법으로 사람 LT DNA 대부분을 함유하는 약 750bp DNA 단편(XhoⅡ-Nsi I 단편) 0.3㎍을 수득한다.
별도로, pLT1 20㎍을 Y-50 완충액 200㎕에 녹이고, 제한효소 haeⅢ 40 단위를 가하고 37℃ 2시간 동안 반응시켜 절단한다. 그리고 염화나트륨을 최종 농도가 150mM이 되도록 가하고, Nsi I 40유니트를 가하고 37°3시간 동안 더 반응시켜 절단한다. 반응 혼합물을 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동하여 사람 LT N-말단 부분을 함유하는 약 50bp의 DNA 단편(HaeⅢ-Nsi I 단편) 약 40ng을 수득한다.
별도로 Y-100 완충액 총 30㎕에 pGEL1(3.4kb) 3㎍을 녹이고, 제한효소 Stu I 와 BglⅡ을 각각 6유니트씩 가하고, 37℃ 3시간 반응시켜 절단한다.
반응 혼합물로부터, LGT법으로 약 2.3kb(Stu I - BglⅡ 단편)의 Apr유전자-함유 DNA 약 1.0㎍을 수득한다.
그리고 T4 리가아제 완충액 20㎕에 pLT1-유도된 XhoⅡ-Nsi I 단편(약 750bp) 0.2㎍, pLT1-유도된 HaeⅢ-Nsi I 단편(약 50bp) 20ng과 pGEL1-유도된 Stu I -BglⅡ 단편(2.3kb) 0.6㎍을 녹이고 T4 DNA 리가아제(Takara Shuzo 제품) 2유니트를 가하고, 4℃ 18시간 동안 반응시킨다.
이와 같이 하여 얻은 재조합 플라스미드 DNA을 사용하여 코헨 등의 방법에 따라 이. 콜라이 KM 430을 형질전환시켜, Apr콜로니를 수득한다. 기지의 방법으로 당해 형질전환체로부터 플라스미드 DNA을 분리정제하고, Stu I과 같은 제한효소로 플라스미드 DNA의 절단에 의하여 플라스미드 구조를 분석한다. 그 결과 목적하는 플라스미드를 수득한 것을 확인하고, 이 재조합 플라스미드를 pLA1이라고 한다.
(5) LT 발현 플라스미드 pLSA1의 작제
전 섹션에서 기술한 방법에 달 얻은 pLA(3.1kb) 함유 이. 콜라이 KM430을 배양하고, 기지의 방법에 따라 배양 세포로부터 pLA1 DNA을 수득한다. pLA1 DNA 3㎍을 Y-100 완충액 30㎕에 녹이고, Stu I 과 BglⅡ 각각 3유니트를 가하고, 37℃ 3시간 동안 반응시켜 절단한다. 반응 혼합물로부터 LGT법으로 사람 LT 유전자의 대부분을 가지고 있는 약 790bp DNA 단편(Stu I - BglⅡ 단편) 약 0.5㎍을 수득한다.
별도로, 미합중국 특허 제4,686,191호에 기술한 방법으로 수득한 pKYL10 3㎍을 Y-100 완충액 300㎕에 녹이고, 제한효소 BanⅢ와 Pst I 각각 6유니트를 가하고 37℃, 3시간 반응시켜 절단한다. 반응 혼합물로부터 LGT법으로 약 1.1kb의 트립토판 프로모터(Ptrp)-함유 DNA 단편(BanⅢ-Pst I 단편)을 수득한다. PGEL1(3.4kb) 2㎍을 Y-100 완충액 20㎕에 녹이고, 제한효소 HindⅢ, BamH I 과 Pst I 을 각각 4유니트를 가하고 37℃, 3시간 반응시켜 절단한다. 반응 혼합물로부터, LGT법으로 약 1.7kb의 리포프로테인 유도된 테미네이터 함유 DNA 단편(Pst I -BamH I 단편)을 약 0.7㎍ 수득한다.
성숙 사람 LT 폴리펩타이드 N 말단, 즉 Leu(CTA)으로부터 발현에 필요한 개시 코돈(ATG)은 물론이고 5번째 아미노산 Gly(GGC)의 2번째 염기(GG)까지의 잔기들을 공급할 목적과 Ptrp로부터 하부 스트림에 있는 SD 서열과 ATG 사이의 거리를 6 내지 18bp의 적당한 길이로 조정할 목적으로, 다음과 같은 DNA 링커를 합성한다.
우선, 27-량체 및 25-량체 1-본쇄 DNA는 통상적인 포스토디 에스테르법으로 합성한다. T4키나제 완충액 40㎕에 27-량체 및 25-량체(각 20pmole)를 녹이고, T4폴리뉴클레오타이드 키나제 6유니트를 가하고, 37℃에서 60분 반응시켜 포스포릴화 반응을 수행하였다.
그리고 위에서 얻은 각각의 pLA1 유도된 Stu I - BalⅡ 단편(약 790bp) 0.3㎍, 발현 벡터 pKYP10의 BanⅢ-Pst I 단편 0.4㎍과 pGEL1 유도된 pst I-BamH I 단편(약 1.7kb) 0.6㎍을 T4리가아제 완충액 25㎕에 녹이고, 위의 DNA 링커 약 1pmole을 상기 혼합 용액에 가한다. 이 혼합물에 T-4 DNA 리가아제 6유니트를 더 첨가하고 4℃에서 18시간 반응시켜 연결시킨다.
재조합 플라스미드를 함유하는 반응 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 KM430을 형질전환시켜 Apr콜로니를 수득한다. 이 콜로니의 배양 세포에서 플라스미드 DNA을 회수한다. 제한효소 EcoR I, BanⅢ, Pst I, HindⅢ와 BglⅡ로 절단하고 아가로오즈 겔 전기영동하여 플라스미드의 구조를 확인한다. 이 플라스미드를 pLASA1이라고 한다. BanⅢ와 HindⅢ 주위의 pLASA1의 염기 서열을 막삼-길버트 방법(참고 : A.M. Maxam et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560(1977)]으로 확인한 결과는 다음과 같다.
참조실시예 4
ATG 벡터 PTrS20의 작제
제13도와 같은 과정에 따라, SD 서열과 개시 코돈 ATG 사이의 거리가 14개 염기이고, ATG 코돈 바로 뒤에 Sac I 부위를 지닌 ATG 벡터 pTrS20을 작제한다.
우선, 미합중국 특허 제4,686,191호에 기술한 방법으로 작제한 pKYP10 3㎍을 Y-100 안충액 30㎕에 녹이고, BanⅢ와 Nru I (New England Bio-Labs 제품) 각각 6유니트를 가하고, 37℃에서 3시간 반응시켜 절단한다. 반응 혼합물로부터 LGT법으로 약 3.8kb의 Ptrp 함유 DNA 단편(BanⅢ - Nru I 단편) 약 0.5㎍을 수득한다.
별도로, Ptrp로부터 하부 스트림에 개시 코돈 ATG을 제공하는 아래와 같은 DNA 링커를 포스포트리에스테르법으로 합성한다.
50mM 트리스-염산(pH 7.5), 10mM 염화마그네슘, 5mM 디티오스레이톨, 0.1mM EDTA와 1mM ATP로 이루어진 용액 20㎕에 19-량체와 17-량체 합성 DNA(각 10pmole)을 녹이고, T4폴리뉴클레오타이드 키나제 3유니트를 가하고, 37℃에서 60분 포스포릴화 반응을 시킨다.
그리고 위에서 얻은 pKYP10 유도된 BanⅢ-Nru I 단편(약 3.8kb) 0.1㎍과 위 DNA 링커 0.5pmole T4리가아제 완충액 20㎕에 녹이고, T4DNA 리가아제 2유니트를 가하고, 4℃에서 18시간 동안 반응시켜 연결시킨다.
얻어진 재조합 플라스미드 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HB101[참고 : Bolivar et al. : Gene, 2, 75(1977)]을 형질전환시켜, Apr콜로니를 수득한다. 이 콜로니의 배양 세포에서 플라스미드 DNA을 회수한다. 제한효소 EcoR I, BanⅢ, HindⅢ, Sac I 과 Nru I로 절단하고 아가로오즈 겔 전기영동으로 얻어진 플라스미드의 구조를 확인한다. 이 플라스미드를 pTrS20(제13도)이라 명명한다. BanⅢ 와 HindⅢ 부위 주위의 pTrS20 염기 서열을 M13 파아지를 이용한 디데옥시 서열 분석법으로 확인한 결과는 다음과 같다.
Claims (22)
- 인체 과립구 콜로니 자극인자(hG-CSF) 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 N 말단부의 1번 내지 17번 아미노산중 하나 이상의 아미노산이 Cys, Ser, Arg, Ala, Thr, Pro, Tyr, Asn, Gly, Lys, Glu, Val 및 Ile을 포함하는 그룹중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산에 의해 독립적으로 치환되는, 인체 과립구 콜로니 자극 인자 폴리펩타이드의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, N 말단부의 1번 내지 6번 아미노산중 하나 이상의 아미노산 및 17번 위치의 아미노산이 hG-CSF 폴리펩타이드의 상응하는 부위에서의 아미노산과 다른 폴리펩타이드.
- hG-CSF 폴리펩타이드의 N 말단부의 1번 내지 17번 아미노산중 하나 이상의 아미노산이 Cys, Ser, Arg, Ala, Thr, Pro, Tyr, Asn, Gly, Lys, Glu, Val 및 Ile을 포함하는 그룹중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산에 의해 독립적으로 치환되는, hG-CSF 폴리펩타이드의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA.
- 플라스미드 DNA와, 그중의 삽입물로서, hG-CSF 폴리펩타이드의 N 말단부의 1번 내지 17번 아미노산중 하나 이상의 아미노산이 Cys, Ser, Arg, Ala, Thr, Pro, Tyr, Asn, Gly, Lys, Glu, Val 및 Ile을 포함하는 그룹중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산에 의해 독립적으로 치환되는, hG-CSF 폴리펩타이드의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드.
- 제4항에 있어서, 플라스미드 DNA가 트립토판 프로모터-함유 플라스미드 DNA이고, DNA 단편이 트립토판 프로모터의 하부 스트림 위치에서 플라스미드 DNA에 삽입된 재조합 플라스미드.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, DNA 단편이, 염기 서열의 1번 내지 51번 위치까지의 염기중의 하나 이상의 염기가 다른 염기에 의해 치환된 서열을 갖는 재조합 플라스미드.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, pCfTL38, pCfTL41, pCfTL23, pCfTL35, pCfBB101, pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97, pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfTM14, pCfTM17, pCfTM113, pCfTAArg4S, pCfTAArg4, pCfBD28A17 및 pCfBD28T17으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 재조합 플라스미드.
- 플라스미드 DNA 와, 그중의 삽입물로서 hG-CSF 폴리펩타이드의 N 말단부의 1번 내지 17번 아미노산중 하나 이상의 아미노산이 Cys, Ser, Arg, Ala, Thr, Pro, Tyr, Asn, Gly, Lys, Glu, Val 및 Ile을 포함하는 그룹중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산에 의해 독립적으로 치환되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드를 함유하는, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)종에 속하는 미생물.
- 제8항에 있어서, 재조합 플라스미드가 pCfTL38, pCfTL41, pCfTL23, pCfTL35, pCfBB101, pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97, pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfTM14, pCfTM17, pCfTM113, pCfTAArg4s, pCfTAArg4, pCfBD28A17 및 pCfBD28T17으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 미생물.
- (a) 플라스미드 DNA와, 그중의 삽입물로서, hG-CSF 폴리펩타이드의 N 말단부의 1번 내지 17번 아미노산중 하나 이상의 아미노산이 Cys, Ser, Arg, Ala, Thr, Pro, Tyr, Asn, Gly, Lys, Glu, Val 및 Ile을 포함하는 그룹중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산에 의해 독립적으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드를 함유하는 에스케리키아 콜라이 종에 속하는 미생물을 배지에서 배양함으로써 폴리펩타이드를 배양액중에 형성 및 축적시키는 단계, 및 (b) 배양액으로부터 상기 폴레펩타이드를 회수하는 단계들을 포함하는, hG-CSF 폴리펩타이드의 아미노산 서열로부터 상기와 같이 유도된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 재조합 플라스미드가 pCfTL38, pCfTL41, pCfTL23, pCfTL35, pCfBB101, pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97, pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfTM14, pCfTM17, pCfTM113, pCfTAArg4s, pCfTAArg4, pCfBD28A17 및 pCfBD28T17으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
- hG-CSF 폴리펩타이드의 N 말단부의 1번 내지 17번 아미노산중 하나 이상의 아미노산 결실로 유도된 폴리펩타이드.
- 제12항에 있어서, hG-CSF 폴리펩타이드의 N 말단부의 1번 내지 4번, 1번 내지 5번, 1번 내지 6번, 1번 내지 7번, 또는 1번 내지 11번 아미노산을 포함하는 펩타이드가 결실된 폴리펩타이드.
- hG-CSF 폴리펩타이드의 N 말단부의 1번 내지 11번 아미노산중 하나 이상의 아미노산이 결실됨으로써 유도된 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA.
- 제14항에 있어서, hG-CSF 폴리펩타이드의 N 말단부의 1번 내지 4번, 1번 내지 5번, 1번 내지 6번, 1번 내지 7번, 또는 1번 내지 11번 아미노산을 포함하는 펩타이드가 결실된 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA.
- 플라스미드 DNA와, 그중의 삽입물로서, hG-CSF 폴리펩타이드의 N 말단부의 1번 내지 11번 아미노산중 하나 이상의 아미노산이 결실됨으로써 유도된 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드.
- 제16항에 있어서, 플라스미드 DNA와 그중의 삽입물로서, hG-CSF 폴리펩타이드의 N 말단부의 1번 내지 11번 아미노산을 포함하는 펩타이드가 결실됨으로써 유도된 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드.
- 제17항에 있어서, 플라스미드 DNA가 트립토판 프로모터-함유 플라스미드 DNA이고, DNA 단편이 트립토판 프로모터의 하부 스트림 위치에서 플라스미드 DNA에 삽입된 재조합 플라스미드.
- 제18항에 있어서, pCfTNS7, pCfTNS301, pCfTNS401 및 pCfTNS501로 이루어진 그룹중에서 선택되는 재조합 플라스미드.
- 제12항에 있어서, 아미노산 결실 이외에, hG-CSF 폴리펩타이드의 17번 아미노산인 시스테인(Cys)이 세린(Ser)으로 치환된 폴리펩타이드.
- 플라스미드 DNA와, 그중의 삽입물로서, hG-CSF 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 N 말단부 1번 내지 11번 아미노산을 포함하는 펩타이드가 결실됨으로써 유도된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA 단편을 포함하는 재조합 플라스미드를 함유하는 에스케리키아 콜라이 종에 속하는 미생물을 배지에서 배양함으로써 폴리펩타이드를 배양액중에 형성 및 축적시키는 단계, 및 배양액으로부터 폴리펩타이드를 회수하는 단계들을 포함하여, hG-CSF 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 N 말단부의 1번 내지 11번 아미노산을 포함하는 펩타이드가 결실됨으로써 유도된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
- hG-CSF 폴리펩타이드의 17번 아미노산(시스테인)이 세린으로 치환되고 이의 N 말단부 1번 내지 6번 아미노산중의 하나 이상의 아미노산이 Cys, Ser, Arg, Ala, Thr, Pro, Tyr, Asn, Gly, Lys, Glu, Val 및 Ile을 포함하는 그룹중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산에 의해 독립적으로 치환됨으로써 유도된 폴리펩타이드를 수정 배지에서 프로테아제로 처리함으로써 반응 혼합물중에서 상기와 같이 유도된 폴리펩타이드를 형성시키는 단계, 및 반응 혼합물로부터 이러한 폴리펩타이드를 회수하는 단계들을 포함하여, hG-CSF 폴리펩타이드의 N 말단부의 4 내지 7개 아미노산이 결실되고 17번 아미노산(시스테인)이 세린으로 치환된 hG-CSF 폴리펩타이드의 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
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