KR960010696B1

KR960010696B1 - 2개의 표식물을 이용한 분석물질의 농도 검정방법 및 기기

Info

Publication number: KR960010696B1
Application number: KR1019880700365A
Authority: KR
Inventors: 로저 필립 에킨스
Original assignee: 로저 필립 에킨스
Priority date: 1986-08-06
Filing date: 1987-08-06
Publication date: 1996-08-07
Anticipated expiration: 2007-08-06
Also published as: EP0271974A1; KR880701885A; GB8619206D0; ZA875825B; EP0318491A1; DE3784465D1; ES2039444T3; CA1284620C; DE3784465T2; EP0271974B1; GR3007803T3

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

2개의 표식물을 이용한 분석물질의 농도 검정방법 및 기기

[도면의 간단한 설명]

제1도는 본 발명에 의한 경쟁 및 비경쟁 시스템을 보인 개략도.

제2도는 본 발명에 의한 분석 기구의 부분 사시도.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1 : 수용체 2 : 결합부위

3 : 분석 물질분자 4 : 항분석물질 항체

5 : 항유전형 항체 6 : 레이저 광선

20 : 판 21 : 요홈

22 : 마이크로 비드

[발명의 상세한 설명]

[발명의 분야]

본 발명은 면역 검정 또는 면역거리 측정기술에 의하여 2개의 상이한 표식물(Labelling markers)을 이용하여 액체중의 분석물질(Analyte)농도를 측정하는 방법과 분석기기에 관한 것이다.

[선행기술]

약물이나 호르몬 같은 분석물질을 포함하는 액체를 분자중에 분석물질에 대한 결합부위를 갖는 수용체와 접촉시키고 결합된 분석물질을 함유하는 수용체를 액체로부터 분리하여 분석물질 분자에 의하여 점유된 수용체중의 결합부위의 비율을 나타내는 값(분별 점유율이라 함)을 측정한 다음 그 값을 농도가 알려진 분석물질의 용액으로부터 얻어진 측정값과 대비하므로서 액체중의 약물이나 호르몬 같은 분석물질의 농도를 측정하는 방법은 이미 알려졌다.

출원인 명의의 WO-A-840131호에 의하면 결합된 분석물질을 함유하는 수용체 분자를 분석물질의 표식물과 접촉시키는 역적정 방법에 의하여 미지의 값이 측정되게 되었다. 또한 표식된 분석물질 대신 분석물질에 의하여 실질적으로 점유되지 아니한 수용체 분자내의 결합 부위에 결합되는 다른 표식물을 사용하는 것도 가능하다. 이러한 두 시스템은 표식된 분석물질이나 또는 다른 표식물질이 수용체 분자내의 결합부위를 점유하기 위하여 측정하려는 분석물질과 경쟁하는 것이기 때문에 경쟁 시스템이라 부른다. 또 하나의 다른 시스템의 역적정 방법은 결합된 분석물질이 함유된 수용체 분자를 결합된 분석물질 또는 결합된 분석물질에 의하여 점유된 결합부위에만 결합될 수 있는 물질과 접촉시키는 공정을 포함하는 바, 전술한 물질은 그 자체가 표식된 물질이거나 또는 표식물의 침입에 의하여 표식되게 된다. 이 시스템은 결합부위에 대한 경쟁이 없기 때문에 비경쟁 시스템으로 알려졌다.

전기한 경쟁 및 비경쟁 시스템에서는 역적정시약(분석물질 또는 다른 물질)이 표식물로 표식된다. 표식물로는 예를들면 방사성 동위원성(방사성 면역검정), 효소, 화학발광 물질 및 형광 표식물(형광 검정)등이 사용되는 바, 형광 표식물은 플루오로세인과 같은 통상적인 형광물질일 수도 있고 유로피움이나 기타 란타나이드키레이트와 같은 시간 분해 펄스 형광에 의하여서만 여기 또는 투시되어 형광을 내는 물질일 수도 있다. 이 경우 적당한 파장의 고강도 광선의 주사로 나타나는 형광의 양은 결합된 분석물질을 포함하는 수용체 분자에 있는 표식물질의 양을 나타낸다.

지금까지 알려진 검정방법은 각개 시료중에 존재하는 수용체의 전체 양을 미리 알고있거나 또는 미지의 시료를 표준시료와 비교하므로서 남아있는 수용체의 양을 정확하게 알고있다는 것을 전제로 하고 있다. 또한 전술한 방법들은 WO-A-8401031을 제외하고는 모두 전체 시료 용적을 정확히 알아야 한다. 이러한 요구조건은 시스템에서 측정된 신호(예를들면 형광)가 결합된 표식물질의 전체 양을 나타내는 것이고 표식물이 모두 결합되지 아니한다는 전제하에(이경우 시스템은 존재하는 분석물질의 양의 변화에 대응할 수 없다) 전술한 전체 양은 수용체 분자에 있는 결합부위의 분별점유율 뿐만 아니라 시료중에 존재하는 수용체 분자의 양에도 의존한다는데 기인한다. 즉 공지의 형광 검정 기술에 따르면 방사된 형광 신호는 시스템에 사용한 수용체 분자의 양과 존재하는 분석물질의 전체양에 복합적으로 영향 받는다. 이러한 사실은 시료중의 분석물질 농도를 정확하게 측정하기 위하여는 사용된 수용체의 양과 시료의 용량 모드가 정확하게 표준화되어야 하고 이러한 표준화가 공지의 형광 검정기술, 특히 전술한 바와같은 경쟁 시스템의 검정기술에서는 필수적인 것임을 의미하는 것이다. 이러한 기술에서는 분석물질에 의한 항체의 분별점유(그리고 그에 따라 방사된 형광신호)가 존재하는 수용체의 양에 의존하고 있다는 것이 특히 중요시 된다. 예를들면 주어진 인자에 인하여 수용체 분자가 증가되면 결합될 분석물질 분자의 수도 증가되지만 수용체의 분별 점유율은 다른 인자에 의하여서도 현저하게 변화될 수 있다. 즉 수용체의 결합된 표식물질의 양은 증가하지만 비례적으로 증가하지는 아니한다.

그러나 WO-A-8401031에는 결합 부위의 분별 점유율이 시료용량에 관계없는 역적정 방법이 기재되어 있다.

사용하는 수용체 양의 표준화 필요성(방사성 동위 원소와 같은 다른 표식물을 사용하는 유사한 방법에도 적용되는 공지의 형광 검정기술의 한 형태)은 실험적으로 입증할 수 있을 뿐만 아니라 수용체/배위자 상호작용을 지배하는 질량 작용의 법칙으로부터도 이론적으로 예측할 수 있다. 더구나 이러한 표준화 필요성은 수용체(항체)가 고형 지지체에 지지되고 동일한 양의 수용체가 시료 배양 혼합물속에 삽입된 고체 물질에 정밀하게 결합시키는 것이 기술적으로 곤란한 면역 검사 시스템에서는 품질관리에 심각한 문제점을 야기하는 결점으로 인정되고 있다. 실제적으로 관련 업계에서는 결합된 수용체의 양이 일정하게 되도록 하기 위하여 수용체 자체를 표식하므로서 고체 지지체에 결합될 수용체의 양을 기록하거나 대조하는 경우도 있다. 더구나 관련 업계에서는 필요에 따라서 전술한 수용체 표식기술을 사용하여 결합된 수용체량의 근소한 변화를 공지된 수용체의 표준량으로부터의 편차에 대하여 일부 수정하는 것을 인정하고 있다. 그럼에도 불구하고 항체 결합부위의 분석물질에 의한 점유가 수용체와 분석물질에 관계되는 복합적인 요인과 알려지지 아니한 방법에 따라 일어나기 때문에 정밀한 분석물을 요하는 경우에는 전술한 수정방법을 이용할 수 었었다.

예를들면 국제 특허 출원 WO 80/02076호에는 경쟁 배위자에 결합된 하나의 표식과 수용체 분자에 결합된 또 하나의 표식으로 된 2개의 분리된 표식, 특히 형광 표식을 사용하여 면역 검사의 품질관리를 향상시키는 방법이 기술되어 있다. 전기한 문헌에는 수용체 분자의 직접표식은 수용체 분자가 표식(경쟁) 배위자의 정량적 검출과는 관계없이 면역 검사중에 정량적으로 검정될 수 있어서 면역 검사 자체를 표준화시킬 수 있는 장점이 있다고 기재되어 있다. 전기한 발명의 한 형태에서는 수용체 분자에 있는 형광 표식과 표식(경쟁) 배위자에 있는 형광표식이 수용체와 배위자가 서로 결합되어 있는 중에 검정되고 미지의 시료중에 존재하는 분석물질의 정량은 두 표식물의 정량 측정비율의 함수로서 결정된다.

이러한 방법에서는 WO 80/02076에 기재된 내용으로부터 알수 있는 바와 같이 제2표식물을 사용하지 않고 통상적인 방법으로 면역검사가 진행된다. 통상적으로 경쟁 시스템이라 부르는 방법에서는 30-50%의 표식 배위자와 비표식 분석물질(비표식 분석물질의 농도는 거의 영에 가까움)을 결합시키기에 충분한 양의 수용체를 사용하는 것이 보통이다. 소위 비경쟁 시스템에서는 수용체를 존재하는 분석물질이 100% 가까이 결합될 수 있는 고농도로 사용하는 것이 보통이다.

전술한 두 경우에 있어서 표식된 수용체와 표식된 역적정 표식물에 의하여 방사된 신호의 비율은 수용체의 양이 변하면 일정하게 유지되지 않게 된다. (예를들면 비경쟁 검사 시스템에서는 표식 수용체의 양을 2배로 증가시켜도 결합된 분석물질의 양이 현저하게 증가하지 않는다. 그 비율은 대략 절반 정도이다. 유사한 사항이 WO 80/02076호에 기술된 경쟁 시스템에도 나타난다.)

WO 80/02076호에는 전술한 형태의 검정 시스템에서 존재하는 수용체 량의 미량 변경을 보상하는 방법이 기재되었고, 그 발명의 목적도 그에 한정되어 있다. 요약하면 두 표식 (표식 수용체와 경쟁 배위자 각각의 표식)의 정량 측정 비율은 이론적으로는 물론이고 실험적으로도 나타낼 수 있으나 그 비율 자체가 통상적인 수용체를 기초로한 검정 시스템(면역 검정과 검정 시스템)에서 분석물질의 양을 측정하는 것이 아니므로 변화에 대응하는 이러한 비율의 이용은 분석물질의 정량적인 측정에는 오차를 유발하게 된다. 따라서 WO 80/02076호에는 전술한 바와같은 각개 시료 배양관내에 있는 수용체 량의 미세한 변화를 동시에 감지하는(그리고 근접되게 보상하는) 기술은 제안되었으나(비록 한정된 용도지만), 두 표식의 측정 비율이 시료중의 분석물질 농도가 정확하고 신빙성 있는 측정치로 되는 검정 시스템의 설계나 조작법은 제안되어 있지 않다.

더구나 일반적인 경우에서도 마찬가지지만 수용체의 양이 정확하게 표준화 된다해도(예를들면 각개 배양 관내의 수용체 양이 한계치에 대단히 근접하도록 일정하게 유지될 수 있어서 WO 80/02076호에서와 같은 수용체 양의 보정은 불필요함), 그를 이용한 면역 검정 시스템은 보정을 필요로 하는 것이 보통이고(예를들면 분석물질의 공지된 양을 포함하는 검정 표준물의 셋트를 포함함), 이러한 기술은 업계에 일반화되어 있다. WO 80/02076호의 청구범위에는 수용체의 표식이 면역 검정을 자체 보정하도록 되어있으나 한정된 의미에서는 신호 감지기(예를들면 표식에 따른 방사성 동위원소 카운터, 형광량 측정기등)의 효율의 순간적인 변화가 자동적으로 보정하는 것이라 할 수 있다 (하나의 표식에 대한 검출 효율의 감소는 다른 표식에 대한 검출효율의 비례적인 감소를 수반하는 것으로 기대되기 때문임)

따라서 전술한 내용을 요약하여 보면 WO 80/02076호의 기술내용은 1) 수용체를 기본으로 하는 검정 시스템에 사용되는 수용체 양의 미세한 변경 및 2) 표식 측정기의 신호 검출효율에서의 미세한 순간적인 변화를 대략적으로 보정하는 수단을 제공하고 있다. 이러한 보정은 그 효력이 의문스럽고 용도가 한정될 뿐 아니라 일상적인 검사에는 이용하기 곤란하다.

[발명의 개요]

본 발명은 WO 80/02076호와 전혀 다른 개념의 수용체 검정에 관계되는 것으로서, 본 발명에서는 수용체의 분별 점유율이 매제중의 분석물질 농도(수용체 및/또는 분석물질의 전체 양과는 무관함)의 실질적이고 정확한 측정치로 된다. 이러한 방식은 수용체의 분석물질 점유율을 측정하는데 기초를 둔 것인바 WO 80/02076호에는 나타나지 아니함), 예를들면 전체 수용체 결합부위에 대한 비점유(또는 점유) 비율의 측정 (경우에 따라서는 비점유/점유 결합부위 비율이 동일할 수도 있음)에 기초를 둔 것으로서, 필요에 따라서는 이러한 두종류의 결합부위에 대한 분리된 표식을 필요로 한다. 본 발명자는 그 중에서도 이러한 방식은 수용체와 분석물질간의 상대적인 양 및 그들간의 결합력이 수용체를 시료에 투입하였을때 분석물질의 농도에 현저한 영향을 미치지 않는 사실을 발견하였다.

본 발명은 시료를 분자중에 분석물질과 결합되는 결합부위를 갖고 있고 제1표식물로 표식된 수용체에 시료를 접촉시켜 수용체 분자에 있는 결합부위의 유분이 분석물질에 의하여 점유되도록 하는 공정, 제1표식물과 다른 제2표식물 사용하는 역적정 기술로 분별 점유된 결합부위를 갖는 수용체를 역적정하는 공정, 분석물질에 의하여 점유된 수용체 분자에 있는 결합 부위의 분별 점유율을 나타내는 값을 얻기 위하여 두 개의 표식물에 의하여 생성된 두 신호의 상대적인 강도를 측정하는 공정 및 얻어진 값을 공지의 분석물질 농도를 갖는 하나 또는 그 이상의 표준 액체 시료에 대하여 동일한 방법으로 얻은 하나 또는 그 이상의 해당하는 값과 대비하는 공정으로 구성된 미지 액체중에 있는 분석물질의 농도 측정 방법에서, 미지 및 표준 액체 시료를 분석물질과의 결합정수를 기준으로 분석물질의 무시할 정도의 유분만이 수용체와 결합될 수 있도록 소량의 수용체와 접촉시킴을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

이 명세서에서 분석물질의 무시할 정도의 유분이라함은 분석물질의 최초 농도 변경에 의하여 도입되는 오차가 시료와 시약 조작의 정확성, 신호측정, 표준화, 온도변화 등에 의한 측정 공정중에 도입되는 오차들만큼 적거나 또는 그 보다도 더 적어질 수 있는 정도로 충분히 적은 유분을 의미한다. 일반적으로 전술한 오차들은 전부합쳐서 10% 또는 그 이하이므로 시료에 있는 전체 분석물질의 5% 또는 그 이하의 결합은 시료 측정 오차가 전체에 대하여는 무시할 정도라고 말할 수 있다. 그러나 한계치에서 벗어나도 큰 영향은 없다. 그렇지만 수용체에 결합된 분석물질의 양을 감소시킴으로서 측정 오차를 전체의 1-2%까지 감소시키는것은 바람직한 것이다.

분석물질의 무시할 정도의 유분만이 결합된다는 전제하에 수용체 분자에 있는 결합부위의 분별 점유율(F)은 다음 방정식에 따라(열열학적 평형에서) 시료중의 분석물질 농도에 관계된다.

식중 [A]는 시료중의 분석물질 농도이고, K는 분석물질에 대한 수용체의 결합 정수로서 일정한 온도에서는 일정하다.

본 발명에 의하면 표식물로서는 공지된 어떤 형태의 표식물, 예를들면 방사성 동위원소(예를들면 방사성옥소), 화학반광물질, 형광성 표식물 및 효소와 같은 표식물들도 사용할 수 있다. 이러한 표식물들은 통상적인 방법으로 수용체 분자와 역적정 시약에 결합될 수 있다. 일반적으로는 같은 형태의 두표식물들이 사용되지만 서로 다른 형태의 것을 사용할 수도 있다. 표식물들은 그들의 특성에 적합한 방법, 예를들면 필요에 따라 활성화시킨 후 방사성 표식물의 방사능을 검출하거나 광선을 형광성 표식물에 조사시키는 방법에 의하여 정량적으로 검출될 수 있다. 바람직한 것은 형광성 또는 전위차 형광성 표식물을 사용하는 것이다.

두개의 형광성 표식물에 적당한 파장이 한 광선을 동시에 조사하여 두 형광성 표식물을 여기시키고 두 형광 신호의 상대적인 강도를 측정하는 것도 가능하다. 이 비율은 수용체에 있는 결합부위의 분별 점유율을 직접적으로 나타낸 것으로서, 이러한 조건하에서는 전술한 비율이 존재하는 수용체의 정확한 양과 광선의 조사에 의하여 검정에 이용된 전체양의 비율에 무관하게 된다. 따라서 수용체 량을 변경시킬 필요도 없고 정확하게 알 필요도 없을 뿐 아니라 지지체에 지지된 수용체의 표면 밀도를 균일하게 할 필요도 없게 된다.

본 발명의 다른 형태는 본 발명에 의한 방법에 중간체로 사용되는 표식된 제품과 제조에도 관계되는 바, 이 표식된 제품은 제1표식물, 특히 형광 표식물로 표식되고 분석물질의 분자에 의하여 일부분이 점유되는 결합부위들을 갖고 있는 수용체 분자와 점유된 결합부위 또는 비점유 결합부위에 직접 또는 간접적으로 결합되는 제2표식물, 특히 제1표식물과 다른 형광 표식물로 표식된 물길을 포함한다. 전술한 수용체 분자는 분석물질에 비하여 미량만을 사용하므로 전술한 분석물질에 의하여 점유된 결합부위 부분은 수용체 분자와 접촉하는 시료중의 분석물질 농도를 나타내게 된다.

본 발명의 또 다른 형태에서는 액체 시료중의 분석물질 농도를 검정하는 방법에 사용되는 기구를 제공한다. 이 기구는 제1표식물, 특히 형광 표식물로 표식되고 분석물질을 위한 결합부위를 갖는 수용체 분자가 부착된 고체 지지체, 알려진 농도의 분석물질을 포함하는 일종 또는 그 이상의 표준용액 및 제2표식물, 특히 결합된 분석물질, 결합된 분석물질에 의하여 점유된 결합부위 또는 분석물질에 의하여 점유되지 아니한 결합부위에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있는 제1표식물과 다른 형광 표식물로 표식된 역적정 시약을 포함한다. 이 경우 지지체에 부착되는 수용체의 양은 시료중에 있는 분석물질의 무시할 정도의 양만이 수용체에 결합되도록 액체 시료의 양에 따라 선택한다.

본 발명에 의한 분석기구는 판이나 봉체와 같은 정방형 고체 지지체를 포함하는 바, 이 고체 지지체에는 분석물질을 위한 결합부위를 갖는 여러개의 수용체가 일정한 간격을 두고 배치되었으며 각개 수용체는, 분석물질의 종류에 따라 고유의 결합부위를 갖는 서로 다른 물질을 사용하며, 각개 수용체 분자들은 표식물로 표식되었거나 표식될 수 있는 것들이다.

[도면에 의한 구체적인 설명]

이하 도면에 의하여 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

제1도에는 도시하지 아니한 제1형광체로 표식된 제1항분석물질 항체로 된 수용체(1)가 도시되었다. 수용체(1)는 그 분자중에 결합부위(2)를 갖고 있는 바, 결합부위(2)의 일부는 분석물질 분자(3)에 의하여 점유된다. 비경쟁 시스템(A)에서는 결합된 분석물질 분자(3)가 각각 제2형광체(도시하지 않았음)로 표식된 제2항분석 물질 항체(4)로 된 표식물질에 결합되어 있다. 경쟁 시스템(B)에서는 분석물질(3)에 의하여 점유되지 아니한 제1항분석물질 항체로된 수용체(1)의 결합부위(2)들이 제2형광체 (도시하지 않았음)로 표식된 예를들면 안티이디오타잎 항체(5)에 의하여 점유된다. 완성된 시스템은 레이저 광선(6)에 의하여 조사되면 제1형광체는 α-포톤을, 제2형광체는 α-포톤과 일부의 성질과 효능이 상이한 β-포톤을 방사한다. α-포톤과 β-포톤의 신호는 둘다 결합부위들의 분별 점유율이 변하지 않는다는 전제하에서 제1항분석물질 항체의 전체 양과 표면밀도의 변화에 의하여 동일하게 영향을 받지만 α-포톤의 신호만은 분석물질에 의한 결합부위의 분별 점유율의 변화에 영향을 받는다. 즉 비경쟁 시스템에서는 점유율의 증가에 따라 α-포톤의 신호가 증가하고 경쟁 시스템에서는 점유율의 증가에 따라 α-포톤의 신호가 감소된다. 따라서 두 신호의 비율은 분별 점유율에 따르지만 제1항분석물질 항체의 전체양에 따르지는 않는다.

본 발명은 분자내에 적당한 결합부위를 갖고 있는 분석물질의 평가에 사용할 수 있다. 본 발명은 특히10^-9내지 10^-5몰의 마이크로몰 범위의 고농도 뿐만 아니라 피코몰 또는 나노몰 범위내의 농도를 정확하게 평가하는데도 사용할 수 있다. 본 발명에 의하여 평가될 수 있는 분석물질로는 티로이드호르몬이나 스테로드이드 호르몬 같은 호르몬류(예를들어 코티솔), 비타민류, 프로테인류와 인슐린 같은 프로테인 호르몬류 및 고나도트로핀류. 바이러스류. 약물, 독극물, 및 기타 혈액, 혈청, 타액 및 오줌같은 인간 또는 동물의 정상 또는 비정상 체액등이 포함된다. 이러한 분석물질의 예들은 WO 80/02076호에 기재되어 있는바, 이들의 농도는 본 발명의 방법에 의하여 측정될 수 있다. 음식물 중에 있는 톡신류, 외부 프로테인등과 같은 미량 오염물질 및 물이나 기타 액체 매제중의 생물학적 오염물질도 검사될 수 있다. 검사할 분석물질은 내인성 결합 프로테인과 같은 결합제에 가역적으로 결합된 동일한 분석물질과 함께 시료내에 존재할 수도 있는 바, 본 발명에 의하면 그 중에서 유리 프로테인의 농도만을 측정할 수 있다. 이와달리 시료에는 가역적을 결합된 분석물질을 포함하지 않을수도 있다. 본 발명은 특히 가역적으로 결합된 분석물질을 분리할 수 없고 그에따라 분석물질이 수용체 분자에 부수되어 분석물질의 농도 변화를 완화시킬 수 없도록 된 경우 분석물질을 측정하는데 대단히 중요하게 이용된다.

수용체는 그 분자내에 평가할 분석물질에 대한 결합부위를 갖고 있어야 한다. 이러한 결합부위들은 필수적으로 분자당 그 수가 일정하여야 하며 물리적인 흡착부위가 아닌 화학적인 결합 부위여야 한다. 또한 결합 부위들은 평가할 시료중의 다른 성분들에 비하여 분석물질에 의하여서만 단독으로 점유될 수 있어야 하고, 그에 따라 분석물질에 대한 고유의 결합부위를 갖는 수용체가 바람직하다. 모노클로날 항체와 같은 항체들은 수용체 분자로서 바람직하지만 각개 분석물질의 특성에 따라서는 효소도 수용체 분자로 사용될 수 있다. 각종 분석물질에 대한 항체들은 이미 알려졌고 문헌에도 기재되어 있으며 기타 호르몬 등에 대한 항체들도 공지된 기술에 의하여 제조할 수 있다. 이러한 항체의 제조는 본 발명을 구성하는 것이 아니다. 검사가 최대한으로 정밀하게 이루어지도록 하기 위하여는 미지의 시료에 있는 예상되는 분석물질의 농도에서 수용체에 있는 결합부위의 25-75%가 분석물질에 의하여 점유되는 분석물질과의 결합 정수를 갖고 있는 수용체를 선택하는 것이 바람직하다. 예를들면 수용체가 예상되는 분석물질 농도의 해당치에 대하여 1/3 내지 3배의 결합 정수를 갖는 것이 바람직하다. 분석물질에 대한 수용체의 결합정수는 표준 스캇챠드 분석법에 의하여 결정될 수 있다. (Ann. N.Y Sci., 51, 1949. 660)

면역 형광계측 또는 형광 면역 검정을 위하여 표식되는 단위체는 이들이 항체 (항 분석물질 및 항이디오타잎), 효소 또는 분석물질인 경우에도 플루오로세인 같은 통상적인 형광물질로 표식되거나 또는 유로피움과 란타나이드 키레이트 같은 시간분해 펄스 형광체(따블유, 밧트, 마르셀 데커 인코포레이티드 발행의 1984년 조판 프랙티칼 임무노어쎄이 71-101 페지에 있는 에스. 다쿠부등에 의한 고감도 펄스 광선 시간분해과 형광 면역 검사를 참조하기 바람)로 표식될 수 있다. 전기한 두 형태의 물질은 형광성 표식물의 범주내에 속한다. 적당한(충분히 높은) 특수활성(전체 분자 또는 전체 결합부위에 대한 표식 분자의 비율)을 부여하도록 단위체를 표식하는 방법은 당해 업계에 공지되었고 문헌, 예를들면 존 월리 앤드 손즈 리미티드에 의하여 1985년에 발간된 따블유. 피. 콜린스 저알터나티브 임무노어쎄이 및 그 책에 인용된 소이니 이. 및 헤밀라 아이. 에 의한 형광 면역 검정 : 현재의 상황가 문제점 Clin. Chem., 25,353-361(1979)에 기술되어 있다. 본인이 공동출원인으로 되어있는 유럽 특허 출원 제2,963호와 제64,484호, 영국특허 제1,560,420호 및 국제 특허출원 제WO 86/01064호와 그들의 명세서 및 서치 리포트에 언급된 인용문헌 그리고 전술한 WO 80/02076호들도 참고 문헌의 예들이다. 이러한 기술은 본 발명에 사용되는 수용체를 표식하기 위하여 사용할 수 있다. 또한 재결합 디엔에이 기술에 의하여 형광성 유니트를 적당한 물질에 결합시키므로서 표식을 효과적으로 할 수도 있다. 전술한 바와 같이 방사성 동위원소 및 기타 표식물을 표식하는 것도 본 발명의 범위내에 속한다.

항이디오타잎 항체 또는 표식된 분석물질을 갖는 경쟁 시스템을 사용하거나 또는 항분석물질 항체를 갖는 비경쟁 시스템을 사용하는 역적정 기술에 사용하는데 적당한 시약들도 당해 업계에 공지되었고 이들은 또한 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 시약들은 사용전에 통상적인 공지 기술에 의하여 표식물, 바람직하기로는 형광성 표식물로 표식될 수 있고 또한 이들은 표식물로 표식된 다른 시약과 반응시킬 수도 있다. 이들 시약들은 예를들면 하나의 광선을 동시에 조사하였을때 서로 상이한 두 신호를 발산하는 두 형광성 표식물을 사용하는 경우를 제외하고는 비표식 수용체를 사용하는 통상적인 면역검사 기술에 사용되는 역적정 시약과 다를 필요는 없다. 역적정은 미결합 분석물질을 수용체 분자로부터 분리한 후에 실시하거나(2단 검정) 또는 시료 용량이 공지되었다는 전제하에 미결합 분석물질과 수용체 분자가 접촉하는 상태에서 동시에 실시한다. (제1단계 검정)

두 표식물에 의하여 발산된 신호는 여러 특성, 예를들면 방사된 포톤의 파장, 시간분해 펄스 형광물질의 경시분해(두 표식물 전부 또는 그들중의 하나는 이러한 분해를 나타낸다) 또는 분극에 따라 차이가 날수 있는 신호들일 수도 있다. 파장, 경시분해 형태 및 표식물의 종류등은 문헌에 알려졌고 다른 특성들도 공지기술에 의하여 결정될 수도 있다. 두 표식물은 측정기에 의하여 분해될 수 있을 정도로 충분히 다른 신호를 발산한다. 특정 조건하에서 각종 형광성 표식물에 의하여 발산된 형광성 신호의 특성은 이미 알려졌고 문헌에 기재되어 있으며 다른 특성은 통상적인 방법으로 측정될 수 있다. 따라서, 적당한 표식물의 쌍을 결정하는 것은 당해업계의 숙련된 기술에 속하는 것이다.

비록 원리상으로는 용액중에서 생성되는 신호의 비율을 측정하는 것이 가능하지만 측정을 시작하기전에 예를들면 면역 흡착제를 사용하여 표식된 수용체 분자/결합된 분석물질 시스템에 결합되지 아니한 모든 표식된 역적정 시약을 완전히 제거하는 것이 필요하며, 이러한 제거공정은 용이하지 않다. 따라서 본 발명에서는 표식된 수용체 분자들이 고체 지지체에 단층으로 결합되게 하고 신호 비율을 측정하기전 검정이 시작되는 액체에 존재하는 잔류 미결합 분석물질과 잔류 미결합 표식 적정시약으로부터 수용체들을 분리하였다. 적당한 지지체들은 유리, 플라스틱 등으로 만들어서 본 발명의 목적에 사용할 수 있다. 이러한 지지체들에 대하여는 미국특허 제4,399,217호, 4,381,29 1호, 4,357,311호, 4,343,312호 및 4,260,679호에 기재되어 있다.

본 발명에서는 예를들면 폴리스티렌 같은 불활성 합성수지 물질로 된 판이나 봉상체등 길이가 긴 단일 고체 지지체에 여러가지 서로 다른 표식 수용체 분자들을 일정한 간격으로 배치시킬 수 있다. 이와같은 방법에 의하면 각개 수용체들이 하나의 특정 분석물질을 위한 결합부위를 갖도록 하므로서 각개 수용체에 상이한 분석물질들이 결합되게 된다. 이러한 멀티스포트 기구는 하나의 액체 시료에 함유되어 있는 여러 종류의 분석물질 농도를 평가하는데 이용할 수 있는 바, 이 경우에는 각개 상이한 분석물질에서 나오는 각개 표식들이 서로 차이가 나서 신호들의 강도 비율이 개별적으로 평가되도록 각개 분석물질을 위하여 상이한 역적정 시약들을 사용한다. 이러한 방법은 체액과 같이 그 성분이 관심이 있으면서 각개 성분의 농도를 확인할 필요가 있는 수종의 성분을 동시에 함유하는 액체 특히 인간의 체액을 평가하는데 특히 유리하다. (비록 스포트 및 기구들에 있는 수용체 분자의 양을 일정하게 할 필요가 없으므로 표식된 수용체 분자를 사용하는 것이 멀티-스포트 기구의 제조에는 유리하지만 각개 스포트에 있는 수용체 분자의 양을 다른 방법에 의하여 정확히 알고 각개 기구에 일정하게 되도록 조절하면 비표식 수용체 분자를 사용하여 검정기구를 제조할 수도 있다)

제2도에는 전술한 바와같은 검정기구가 도시되었다. 제2도에 의하면 4각 또는 기타 편리한 형태로 된 판(20)은 폴리스티렌이나 기타 불활성 물질로 제조된다. 각개 판에는 폴리스티렌이나 기타 불활성 물질로 제조된 것과 같은 마이크로비드(22)를 수용하게 된 여러개의 요홈(21)을 형성하는 바, 마이크로비드(22)의 직경의 1mm 또는 그 이하로 되도록 하는 것이 적당하다. 이러한 비드들은 그 표면에 수용체가 단일층으로 피복되도록 공지방법에 따라 항체와 같은 수용체를 함유하는 용액에 침지한다. 각개 비드들은 서로 다른 수용체를 함유하는 다른 용액에 침지하는 바, 수용체들은 평가할 분석물질의 종류에 따라 선택하고 적당한 표식물을 사용하여 임의적으로 표식한다. 마이크로비드(22)는 폴리스티렌용 시판 접착제와 같은 적당한 불활성 접착제를 사용하여 요홈(21)내에 고정시킨다.

판(20)에 표식된 마이크로비드(22)를 갖는 기구를 사용할때는 마이크로비드(22)를 평가할 분석물질을 함유하는 시료와 접촉시키고 이어서 두 표식물의 상대적인 신호강도의 평가에 의하여 적당한 표식을 나타내는 합당한 역적정 시약과 접촉시킨다. 각개 피드들로부터 나타나는 기록이 서로 다르게 되도록 각개 비드에 사용되는 표식물과 역적정 시약은 서로 다르게 선택할 수 있다. 그렇지 않으면 각개 비드들은 개별적으로 광선을 조사할 수도 있는바, 이 경우에는 형광물질이나 발광된 표식물을 사용하는 것이 편리하다

이러한 기구들은 여러가지 방법으로 제조할 수 있다. 예를들면 비드(22)들을 배치시키고 수용체를 용액상태로 요홈(21)에 직접 처리한 다음 필요에 따라 용매를 제거할 수도 있다. 또는 비드를 요홈에 배치한 다음 적당한 방법으로 판의 표면에 수용체를 인쇄방식으로 부착시킬 수도 있다. 판은 봉상체와 같은 다른 형태의 것으로 대치시킬 수도 있다. 하나의 판에 처리되는 수용체의 종류는 적은 경우 2종에서 많은 경우 5 내지 10 또는 그 이상으로 할 수 있는 바 동일한 수용체를 갖는 여러개의 스포트를 사용하면 단일 스포트로부터의 결과를 검사하는 수단을 이용할 수도 있다. 판과 같은 지지체상의 물질로부터 나오는 펄스 형광신호를 측정하는 장치는 이미 알려졌다. 예를들면 카나타, 온타리오, 토론토 소재 시버플루오즈 인코포리에이티드에서 공급하는 것과 같은 기구들이 사용되는 바, 이 장치는 용액속의 신호를 측정하는 형광 측정기이다. 비율의 직접적인 측정을 1단계로 실시할 수 있는 장치를 사용할 수 없는 경우에는 두 신호를 개별적으로 측정하고 적당한 보호수단을 사용하여 측정치들로부터 비율을 산출할 수도 있다.

WO 80/02076호에는 본 발명에 사용할 수 있는 다른 측정 장치들이 기술되어 있다. 조사광선은 고광도 발색광 또는 레이저 광선과 같은 발색 광선이 바람직하다. 조사광선을 사용하는 형광체 여기용 파장은 공지된 원리에 따라서 형광물질의 성질에 의하여 선택하는 바, 두 신호는 단일 파장의 광선에 의하여 여기되는 것이 바람직하다. 시간분해 펄스 형광은 배경장애가 보다 서서히 차폐될 수 있다는 이유 때문에 최소한 하나의 표식물로 사용하는 것이 바람직하다. 그러나 이는 본 발명을 구성하는 것이 아니다. 표식물의 다른 형태가 사용되는 경우에는 적당한 표준 측정기가 평가 기기와 방법들을 사용할 수도 있다.

본 발명은 항체 또는 기타의 수용체 분자를 검사할 분석물질에 대한 결합 정수를 고려하여 시료중에 있는 분석물질 전체량의 무시할 정도의 유분(일반적으로 5% 이하, 특히 1% 이하)만이 수용체 분자에 결합되도록 하는 소량으로 사용하여 작업하기 때문에 시료의 양을 미리 알거나 일정량의 시료를 취하여 정밀한 시험을 거칠 필요도 없다. 그러므로 본 발명의 기구는 공장에서 나오는 것과 같은 다량의 유체에 있는 여러 가지 분석물질의 농도를 검정하는데도 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 이점은 결합된 분석물질과 수용체의 전체양을 알 필요가 없으므로 형광 표식물을 사용하여 광선을 조사하는 경우, 광선이 수용체를 포함하는 전체 스포트에 조사되도록 할 필요가 없고 오직의 일부 스포트에 있는 시료에만 조사되어도 된다는 것이다.

또한 역적정을 위한 경쟁 시스템을 사용하는 경우 분석물질은 미지농도의 분석물질의 액체 시료를 사용한 추정치와 공지 농도의 분석물질을 사용한 표준 시료의 추정치 사이에 일정하게 유지되는 비율로 결합부위에 점유되므로 표식된 항이디오타잎 항체 또는 기타의 표식된 역적정 시약들이 분석물질에 의하여 점유되지 아니한 모든 결합부위에 점유되게 할 필요는 없다. 이러한 사실은 일반적으로 미량의 수용체 분자/결합된 분석물질 시스템에 노출되는 항-이디오타잎 항체 또는 기타 표식된 역적정 시약을 일정한 농도(비교적 높은 농도)로 사용하여야 함을 의미할 뿐 아니라 일정한 용량으로 사용하여야 함을 의미한다. 유사한 이론이 비경쟁 시스템에서 결합된 분석물질과 분석물질-점유 결합부위간의 작용에도 적용된다.

본 발명은 고체 지지체에 지지된 표식 수용체 분자, 분석물질의 표준용액 및 표식된 역적정 용액으로 구성된 기구의 형태로 만들므로서 적당한 형광 측정기를 구비하면 병원등에서 상업적으로 사용할 수 있다. 이러한 기구를 사용하면 적당한 측정기만 있으면 수시로 측정할 수 있는 이점이 있다.

실시예 1

[유효반 표식비교 면역 검사법을 실시하기 위한 시약농도의 선택과 방사성 표식^(l31I)항티록신 항체와 방사성 표식 (¹²⁵I)티록신을 사용한 티록신(T4)의 검사에 대한 방법론적 원리의 설명]

항티록신 항체는 영국, 런던, 모티머스트리트 소재 미들섹스 호스피탈 메티칼 스쿨의 분자 내분비학과에서 통상적인 면역처리 기술과 모노클로날 항체 제조법에 의하여 제조한 상품을 사용한다)

이 실시예에서 사용된 항티록신 항체는 면역원으로서 소의 티로글로부린을 사용한 생쥐의 면역처리에 의하여 제조된 항체중에서 선택하여 제조한 T4 모노클로날 특이 항체이다. 이 항체는 10⁹l/M 정도의 결합 정수를 갖고 있고 그 결합 특성은 일반적인 것이다. 이 항체는 옥소-표식 항체와 기타의 프로테인 제조에 일반적으로 사용되는 통상적인 클로라인-T-기술을 사용하며¹³¹I로 표식하였다. 이 항체는 이어서 통상적인 기술[Clinica Chimica Acta., Vol. 118, (1982) 129-134페지]를 사용하여 시판되는 미세 결정성 셀룰로우스(sigma-cell type 20)에 결합시킨다.

높은 비상사능¹²⁵I 표식 티록신은 벅크스, 아머샴의 아머샴 인터내쇼날에서 구입하였다.

세럼 (1ml)에 존재라는 T4는 시판 음이온 교환수지(BioRad AGlx2, 400-600메쉬)를 사용하여 추출하고 세척한 다음 70% 초산으로 용출시켰다. [엔도크리놀로지,

(198) 1890페지 참조] 회수 실험 (시험용 세럼에 처음에 첨가한 무시할 정도의 미량의¹²⁵I 표식 T4를 사용함)은 70% 정도의 전체 회수율을 나타내었다. 테스트 세럼의 용출액은 표준 헤페스 완충액(50ml)에 용해시켜 0.5-1.5ng/ml(예를들면 10^-9M/I 정도)의 농도 범위에 놓이는 T4 용액을 얻었다. 헤페스 완충액으로 보관중인 T4 용액을 희석하여 농도 범위가 0과 10ng/ml 사이에 놓이는 별도의 표준 T4 용액을 제조한다.

초기 시험들에서는 상이한 량의 고형¹³¹I-표식 항체를 미량이¹²⁵I-표식 항체와 함께 T4를 함유하는 1ml 용량의 표준 용액 및 미량의¹²⁵I-표식 T4와 함께 배양하되 10분 내지 8시간 동안에 걸친 배양 기간동안 합친 T4 농도가 0.1ng/ml로 되도록 조절하였다. 배양후 고형 항체를 원심 분리하여 세척하고 흡착된¹²⁵I-표식 T4를 2중 찬넬 감마 측정기를 사용하여 통상적인 방법으로 측정한다. 항체-흡착¹²⁵I 활성에 관계되는 배양시간과 표식 항체의 양에 대한 커브를 작성한다. 이 데이타에서는 항체의 양과 배양시간이 배양액중에 있는 전체 T4의 약 5% 정도가(예를들면 거의 1000¹²⁵Icpm을 수득하는 약 5pg) 항체에 의하여 흡착된 것으로 측정되었다. (예를들면 항체 수득랑은 약 200¹³¹Icpm이고 전체 배양시간은 4시간 동안임). 이러한 조건하에서는 a) 두 인자에 의하여 항제의 양을 증가시키거나 감소시키는 것은^l25I/¹³¹I의 비율을 현저히 변화시키지 않고 약(2% 범위임), b) 사용된 표준용액의 용량 증가도^l25I/¹³¹I의 비율에 영향을 미치지 않는다는 것이 확인되었다.

이러한 표준량의 항체를 사용하는 면역 시험은 다음과 같이 실시하였다. 표준량의 항체를 전술한 농도의 표준 T4 용액 1ml와 함께 4시간동안 배양한다. 고형분 항체를 원심분리에 의하여 분리하고 완충액으로 세척한 다음 거의 1ng/mg의 T4를 포함하는^l25I-표식 T4의 표준 용액 3ml와 함께 4시간 동안 더 배양시킨다. 고형 항체를 원심분리에 의하여 분리하고 4회 세척하여 잔류하는^l25I-표식 T4 용액을 전부 제거하고 각개 경우 표준 T4 농도에 해당하는^l25I/¹³¹I의 비율을 측정한다. 이 실험에서는 표준량의 항체가 사용되었으므로(거의 200¹³¹Icpm) 각 경우¹³¹I의 수치는 변하지 않았지만^l25I의 수치는 T4 농도가 0인 경우의 200cpm에서 표준 T4 농도가 10ng/ml인 경우의 약 200cts/min까지 변하였다(예론들면^l25I/¹³¹I의 비율은 10:1 내지 1 : 1의 범위임). 이러한 시험 결과에 의하면. a)사용된 고형 항체의 양이 5배 정도 변하여도 투여량에 따른 커브의 형태나 위치에 영향을 미치지 않으며. b) 표준 T4 용액의 용량이 상대적으로 증가하여도 커브에 영향을 미치지 못한다는 것이 또다시 확인되었다. 이러한 결과는 본 발명에 의한 시스템이 시료의 용량이나 항체의 농도에 무관함을 나타내는 것이다. 시스템은 전술한 바와같이 얻어진 T4 추출물을 검정하기 위하여 사용하는 바, 미지의 시료에 대한^l25I/¹³¹I의 비율을 통상적인 방법으로 표준 커브와 비교하고 그 결과를 통상적인 T4 검사공정에서 얻은 결과와 비교한다. 그 결과 거의 근접하게 나타났으며 일반적으로 5% 내로 일치하고 10% 정도의 편차는 없었다.

실시예 2

[2중 형광 T4 검사방법의 설정]

실시예 1은 유효한 2중 표식 비율 결쟁 면역검사 방법에 대하여 설명한 것이다. T4에 대한 표식을^l25I에 대한 플루오로세인 표식과¹³¹I에 대한 로다마인 표식으로 대치하고 유사한 2중 표식 형광 비율 면역 검사법을 설정하였다. 이러한 형광성 표식으로 항체와 T4를 표식하는 것은 블랙웰 사이엔티픽 퍼블리케이션에서 1982년에 발간한 에이, 죤 및 알, 토르프에 의한 유전화학 실습에 기재된 통상적인 방법으로 이루어진다. 그렇지만 정확한 시약농도를 설정하기 위하여 2중-표식항체(예를들면¹³¹I와 로드마인으로 표식된 것)와 2중 표식 T4(예를들면^l25I와 플루오로세인으로 표식된 것)을 사용한 실험을 거쳤다. 더구나 항체는 실시예 1에서와 같이 마이크로 셀루로우스에 결합시키지 않고 폴리스티렌에 피복하는 공지 방법으로 폴리스티렌 디스크에 흡착시켜 피복하였다. 이 실시예에서는 미지 시료중의 T4 농도가 형광 신호를 측정하기 위한 퍼킨엘머형 LF-5 발광 스펙트로메터를 사용하여 로다마인/플루오로세인 형광비율로부터 측정된다. 얻어진 결과는 실시예 1에 기술된 동위원소 측정비율 및 통상적인 T4 검사 공정과 비교한 결과 만족할 만한 결과 얻어졌다.

실시예 3

[시간분해 펄스 형광을 이용하는 이중 형광 T4 면역 검정법의 설정]

실시예 2에서와 같이 플루오로세인과 로다마인으로 T4와 항-T4 항체를 표식하는 대신 이들을 공지방법에 의하여 EDTA(에틸렌 디아민 테트라아세틱애시드)와 함께 각각 테르비움과 유로피움으로 표식한다. 신호 비율은 공지의 시간분해 형광 측정기를 사용하는 공지의 펄스-광선 형광 기술에 의하여 측정한다음 미지의 시료에서 얻어진 결과를 표준 용액에서 얻어진 교정 커브와 비교한다. 다른 방법에 의하여 얻은 결과와 일치하는 만족할 만한 결과 얻어졌다.

실시예 4

본 발명에 의하여 TSH(티로트로핀)의 평가에 사용하는 기구는 다음과 같은 성분으로 구성된다.

a) 실시예 1에 기재된 영국, 런던. 머티머스트리트 소재 미들섹스 외과대약 내분비학과에서 구입한 모노클로날 항-TSH 항체를 고체판에 고정시키고 플루오로세인으로 표식한다.

b) 표준용액은 몰당 0.2, 1.0, 5.0, 20.0 및 100마이크로-인터내쇼날 유니트의 TSH를 포함한다.

c) 역적정 시약은 항-TSH 모노클로날 항체를 사용하는 바, 이 항체는 WO 86/01604에 제안된 방법에 의하여 큐프릭 플루오로아세틸아세톤 및 포름 알데하이드와 함께 유로피움(Ⅲ)키레이트로 표식된다. 제1항체는 영구적인 형광성이고 제2항체는 시간분해 펄스 형광이라 할 수 있다.

이러한 기구는 전술한 실시예 1-3에 기술된 방법에 유사한 방법에 의하여 TSH의 평가에 사용될 수 있는 바, TSH를 포함하는 시료의 용량과 항-TSH 항체의 양은 시료중에 있는 TSH의 5% 또는 그 이하가 판에 있는 항-TSH 항체에 결합될 수 있도록 선택한다. 역적정은 경쟁 시스템이 아닌 비경쟁 시스템을 포함하지만 원리는 동일하다.

Claims

시료중의 분석물질에 대한 결합 부위를 갖고 있는 표식된 수동체 분자를 포함하고 있는 시료를 제1표식물과 접촉시켜 수용체 분자에 있는 결합부위의 일부분이 분석물질에 의하며 점유되도록 하는 공정, 제1표식물과 다른 제2표식물을 함유하는 시스템을 포함하는 역적정 기술에 의하여 분석물질로 분별 점유된 결합부위를 갖는 수용체를 역적정하는 공정, 분석물질에 의한 수용체 분자에 있는 결합부위의 분별 점유율을 나타내는 값을 얻기 위하여 두 표식물에 의하여 생성된 두 신호의 비교강도를 측정하는 공정 및 얻어진 값을 공지의 분석물질 농도를 갖는 하나 또는 그 이상의 표준 객체 시료에서 동일한 방법으로 얻은 하나 또는 그 이상의 해당하는 값과 비교하는 공정을 포함하는 미지의 액체 시료중에 있는 분석물질의 농도를 검정하는 방법에 있어서, 미지 및 공지의 액체 시료들이 분석물질과 수용체의 결합정수를 고려하여 분석물질의 무시할 정도의 유분만이 수용체에 결합될 수 있도록 하는 소량의 수용체와 접촉되도록 함을 특징으로 하는 두 표식물을 이용한 분석물질의 농도 검정방법.
청구범위 1항에서, 표식물들이 형광성 표식물임을 특징으로 하는 방법.
청구범위 1항에서, 역적정 기술이 표식물로 표식된 분석물질로부터 선택된 하나의 역적정 시약 및 수용체 분자에 있는 비점유 결합부위 만을 점유할 수 있고 표식물로 표시된 다른 물질을 포함하는 경쟁 시스템을 포함함을 특징으로 하는 방법.
청구범위 1항에서, 역적정 기술이 결합된 분석물질 또는 분석물질에 의하여 점유된 수용체 분자의 결합부위에만 결합될 수 있고 표식물로 이미 표식되었거나 또는 뒤이어 표식될 수 있는 역적정 시약을 포함하는 비경쟁 시스템을 포함함을 특징으로 하는 방법.
청구범위 1항에서, 분석물질의 무시할 정도의 유분이 존재하는 전체 분석물질 총량의 2% 이하임을 특징으로 하는 방법.
청구범위 1항에서, 수용체가 분석물질에 대한 항체임을 특징으로 하는 방법.
청구범위 1항에서, 분석물질이 호르몬임을 특징으로 하는 방법.
청구범위 1항에서, 분석물질을 함유하는 시료가 결합재에 가역적으로 결합된 분석물질을 포함하지 아니함을 특징으로 하는 방법.
청구범위 2항에서, 표식물들이 활성화에 의하여서만 형광성으로되는 서로 상이한 란타나이드 키레이트이고 형광은 고감도 고감선 광선의 주사를 포함하는 시간분해 펄스 형광에 의하여 측정됨을 특징으로 하는 방법 .
액체 시료중의 분석물질의 농도를 측정하는 기기에 있어서, 이 기기가 제1표식물로 표식되고 분석물질에 대한 결합부위를 갖고 있는 수용체 분자를 시료중에 있는 분석물질의 무시할 정도의 양만이 결합될 수 있는 양으로 부착하고 있는 고체 지지체, 공지된 농도의 분석물질을 포함하는 최소한 하나의 표준 용액 및 제1표식물과 다른 제2표식물로 표식되고 결합된 분석물질, 결합된 분석물질에 의하여 점유된 결합부위와 분석물질에 의하여 점유되지 아니한 결합부위중의 어느하나에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있는 역적정 시약을 포함함을 특징으로 하는 분석물질 농도 검정 기구.
청구범위 10항에서, 이 검정기구가 분자중에 분석물질에 대한 고유의 결합부위를 갖는 여러개의 서로 다른 수용체들이 일정한 간격으로 배치되고 각개 수용체는 서로 다른 분석물질들에 대한 고유의 결합부위를 갖고 있으며, 각개 수용체들은 각각 표식물에 의하여 표식되었음을 특징으로 하는 분석물질의 농도 검정기구.