KR920007201B1 - 복막 염증 또는 감염을 검출하는 방법 및 이를 위한 백혈구 검출용 조성물 - Google Patents
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Description
본 발명은 감염성 환자에 대하여 복막의 염증 또는 감염을 초기에 신속히 검출하는 방법 및 이를 위한 백혈구 검출용 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명은 감염성 환자의 복막 세척 샘플에서의 복막 백혈구의 리소좀 효소를 확인함으로써 복막 염증 또는 감염을 검출하는 방법에 관한 것이다.
만성 신장병 또는 신부전증 환자에 대한 연속 이동성 복막 투석(Continuous ambulatory peritonealdialysis ; CAPD)의 기술이 이미 공지되어 있다. 이 기술에서, 신진 대사 노폐물 및 과잉 전해질 및 기타물질을, 복막을 투석막으로서 사용하여 액체를 복강내로 부어 넣으므로써 계속해서 신체로부터 세척해낸다. 투석용 액체를 복부 관통 연결체에 의해 복강내로 주입한다. 복강에 인공 연결체의 도입으로 인해 이들 환자들은 통상적으로 복막염으로 지칭되는 복막 염증 또는 복막 감염의 위험이 증가한다.
게다가, 복막의 고통을 호소하고 감염의 다른 증거를 주장하는 많은 환자들이 응급실에 찾아온다. 이런 환자들에게 있어서는 또한, 다른 복강의 병변으로부터 복막염의 감별 진단이 시기적으로 중요하다.
급성 염증 및 감염은 복막액에서 과립 백혈구의 수가 증가하는 것과 결부되는 것으로 밝혀졌다. 복막 백혈구의 증가된 수준을 감지하기 위한 통상적인 실험실 방법은 고가의 기구 및 기술적 전문지식을 요구하는 현미경 기술을 사용한다. 유사하게, 감염의 존재는 보통 24 내지 48시간의 배양 기간을 필요로 하는 미생물배양에 의해 통상적으로 감지한다. 이 배양 시간 동안, 심각한 합병증 또는 질병 상태의 확대 진행이 발생하여 환자의 상태를 악화시키거나 의사로 하여금 불완전한 정보를 근거로 하여 환자를 치료하도록 만들 수 있다. 그러므로, 기구가 필요치 않고, 비 숙련가에 의해 시행될 수 있으며, 원하는 경우, 침대나 집에서 시행할 수 있어 CAPD환자가 일상적으로 합명증을 검사할 수 있는, 복막 염증 및 감염의 신속하고도 저렴한 시험이 요구된다.
본 발명은 감염을 의미할 수도 있는 복강에서의 급성 염증 증상을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 시험에서 양성 반응은 환자에게 치료가 필요함을 경고하거나 또는 의사에게 치료 지침을 제공한다. 본 발명은 과립 백혈구의 증가된 수준이 감염 특유적 증상의 지침이고, 이들 과립구가 리소좀 효소를 함유하고 있다는 원리를 기초로 한다. 따라서 복막의 투석물 용액 또는 다른 복막 세척 용액에서 리소좀 효소 활성의 검출 및 정량은 감염 또는 복막염의 조기 진단을 위한 예민하고, 신속하며, 비교적 정확한 방법이 될 수 있다. 본 발명 조성물에 의한 검사는 기구를 요하지 않고, 15분 이내에 수행되며, 예민하고, 정확하다. 환자를 집에서 일상적으로 투석함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 환자의 복막 세척 시액을 백혈구 용해제 및 리소좀 효소에 특이적인 색원성 또는 형광성 효소 기질과 혼합한다. 시액은 세척 시액중 리소좀효소 활성의 정도에 따라 다양하게 변한다. 시액은 비숙련가도 단순히 표준화된 반응도와 비교함으로써 측정할 수 있다. 동시에, 자동식 또는 기구적 방법에 의한 본 발명의 수행이 또한 계확될 수 있다. 예견된 바와 같이, 시액 색상의 횹광 분석이 결과의 보다 정확한 측정을 가능게 하고, 시액 제조 및 측정의 자동화가 대량의 시액을 보다 효율적으로 제조할 수 있도록 한다.
가장 단순한 형태에서, 본 발명의 방법은 단지 3가지 성분, 복막 세척 시액, 백혈구 용해제 및 효소 기질만을 필요로 한다. 복막 세척 시액은 편리만 어떠한 방법으로도 수득할 수 있다. 환자가 CAPD환자인 경우, 투석액의 시액은 사용된 액체를 복강으로부터 제거함에 따라 취할 수 있다. 다른 환자에 있어서, 복막의 수세 및 세척은 의사들에게 이미 익숙간 통상의 복부 관통 기술에 의해 수행한다. 후자의 경우, 보통 소량의 액체가 사용되기 때문에 시액의 희석이 적합하고, 만일 반응이 CAPD환자에게 사용된 동일한 색상도로부터 측정되어야 한다면, 회석에서의 차이점 때문에 소량 시액의 사용이 적합하다.
백혈구 리소좀 효소를 검출하기 위해서, 백혈구를 용해시켜 효소를 방출시켜야 한다. 매우 광범위하게 다양한 물질이 백혈구 용해시 사용될 수 있으며 용해제의 선택은 특별히 문제되지 않는다. 예를 들면, 효소적반응 또는 다른 반응을 간섭하지 않고 결과의 측정에 방해되지 않는 청정제가 사용될 수 있다. 이 목적을 위한 바람직한 용해제는 사포닌이다.
"색원성 효소 기질" 및 "형광성 효소 기질"은 리수좀 효소에 의해 반응할 때 각각 색소 생성물 또는 형광생성물을 직접 생성시키는 화합물을 의미한다. 또한 효소에 의해 반응할 때 다른 화합물과 계속 반응하여 원하는 색상 또는 형광을 나타낼 수 있는 생성물을 생성하는 화합물을 포함한다. 따라서, 비록 2-성분 시험 조성물이 용이하게 사용될 수 있지만, 다성분 시험 조성물도 사용될 수 있다. 형광성 기질 시스템을 사용하는 경우, 검은 빛과 같은 형광-촉진 광원을 시액의 측정에 사용할 수 있으며, 또는 좀 더 정확한 측정이 필요하다면 형광 홈광 장치를 사용할 수 있다
소좀 효소를 위해 여러가지의 색원성 및 형광성 기질이 사용될 수 있다. 백혈구 리소좀은 퍼옥시다아제, 실파타아제, 산 포스파타아제, 알카리 포스파타아제, β-글루쿠로니다아제, 산-β-클리세로포스파타아제, 리보뉴클레아제, 카텝신, 리소짐 및 파고사이틴을 포함한 여러가지의 효소를 함유하고 있다. 이들 중어떤 것에 대한 기질이든 사용될 수 있다. 육만으로 검출되고, 세척 시액중의 리소좀 효소의 농도에 따라 층분한 반응 등급을 제공하는 색상 변화 또는 형광을 생성하는 기질을 선택하는 것이 바람직하다. 이 방법에서, 시액을 측정하기 위해 흡광도법 또는 숙련가의 이용은 제의될 수 있다. 이 목적을 위한 바람직한 효소기질은 O-페닐렌디아만이지만 5-티오-2-니토로-벤조산, 3-메틸-2-벤조티아졸리논 하이드로존과 3-(디메틸아미노)벤조산의 혼합물, 4-클로로-1-나프톨, 나프톨 블루, 니트로페닐 구아니디노벤조에이트, 2,3- 아지노-디 -(3-에틸벤조티아졸린 설폰-6)디암모늄염, 5-아미노살리실산, 및 형광 아세테이트 또는 다른 형광 에테르와 같은 다른 기질을 사용할 수 있다.
사용시, 용해제 및 색원성 또는 형광성 기질을 함유하는 효소 점층 조성물을 복막 세척의 분취량에 편리한 방법으로 가한다. 예를 들면, 효소 조성물은 단순히 세척 시액에 가하여 혼합하는 액체 또는 분말일 수 있다. 또는 통상의 뇨분석 시험에서 행하는 것처럼, 조성물을 세척 시액에 침지된 흡착 물질에 합침시킬 수 있다. 또다른 태양으로는, 적당한 반응 용기의 내벽을 검출 조성물로 피복시킬 수 있다. 세척 용액의 분취량을 용기에 가하면 시험 반응이 일어난다. 혼합물을 바람지하게는 실온에서 10분간 반응시킨다.
세척 시액이 용해되고 반응이 완료되면 즉시 측정할 수 있다. 관찰된 색상 변화 또는 형광의 양은 진단범위에 걸쳐, 복막 백혈구의 수에 직접적으로 비례한다. 일반적으로, 세척 시액의 ml당 백혈구 104 내지 105개는 복막염 또는 복막의 염증을 가리키는 것으로 사료된다. 본 기술 및 본 발명의 원리의 특수한 적용이 다음 실시예로서 추가로 설명된다.
[실시예]
복막 염증을 멸균된 티오글리콜레이트 육즙의 복막내의 주사로 마우스에 유발시킨다. 4일 후, 완충 생리식 염수로 세척하여 동일 마우스로부터의 복막의 과립 백혈구를 수거한다. 백혈구를 코울터 세포 측정기(CoulterTMcell counter)를 사용하여 측정하고 공지 농도로 희석한다. 각 백혈구 희석액의 1ml분취량을 pH5.5인 0.15M 시트레이트-포스페이트 완충액중의 0.015% 과산화수소, 200㎍/ml 사포닌, 및 0.4mg/ml O-페닐렌디아민을 함유하는 시험 조성물 1ml와 혼합하여 시험한다.
세척 희석액/시험 용액 혼합물을 25℃에서 10분간 반응시킨다. H2SO41.0ml를 가하여 반응을 정지시키고 490nm(황색 내지 오렌지색)에서 흡광도를 정량적으로 측정한다. 결과는 다음과 같다:
복막 세포/mlA490
1×1030.009
5×1030.058
1×1040.131
5×1040.930
1×1051.939
3×1052.000
Claims (9)
- 백혈구 용해제 및 백혈구 리소좀 효소에 대해 특이적인 색원성 또는 형광성 효소 기질을 함유하는 백혈구 검출용 조성물.
- 제1항에 있어서, 백혈구 용해제가 사포닌인 조성물.
- 제2항에 있어서, 기질이 O-페닐렌디아민, 5-티오-2-니트로벤조산, 3-메틸-2-벤조티아졸리논 하이드로존과 3-(디메틸아미노)벤조산의 혼합물, 4-클로로-1-나트톨, 나프톨 블루, 니트로페닐 구아니디노벤조에이트, 2, 3-아지노-디-(3-에틸벤조티아졸린 설폰-6)디암노늄 염, 5-아미노살리실산, 및 형광 에스테르로 이루어진 그룹중에서 선택된 것인 조성물.
- 제3항에 있어서, 기질이 O-페닐렌디아민인 조성물.
- (a) 환자의 복막 세척 시액을 백혈구 용해제 및 리소좀 효소에 특이적인 색원성 또는 형광성 효소 기질과 혼합하고, (b) 시액의 색상 또는 형광을 측정함을 포함하는 복막의 백혈구 리소좀 효소의 검출에 의해 환자의 복막 염증 및 감염을 검출하는 방법.
- 제5항에 있어서, 백혈구 용해제가 계면활성제인 방법.
- 제6항에 있어서, 계면활성제가 사포닌인 방법.
- 제7항에 있어서, 기질이 O-페닐렌디아민, 5-티오-2-니트로벤조산, 3-메틸-2-벤조티아졸리논 하이드로존과 3-(디메틸아미노)벤조산의 혼합물, 4-클로로-1-나트톨, 나프톨 블루, 니트로페닐 구아니디노벤조에이트, 2, 3-아지노-디-(3-에틸벤조티아졸린 설폰-6)디암모늄 염, 5-아미노살리실산, 및 형광 에스테르로 이루어진 그룹중에서 선택된 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 기질이 O-페닐렌디아민인 방법.
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