KR910009203B1

KR910009203B1 - 재조합 벡큘로비루스 형질발현 벡터의 제조방법

Info

Publication number: KR910009203B1
Application number: KR1019840002931A
Authority: KR
Inventors: 이. 스미스 게일; 디. 섬머즈 막스
Original assignee: 더 텍사스 에이 앤드 엠 유니버시티 시스템; 아더 지. 한센
Priority date: 1983-05-27
Filing date: 1984-05-28
Publication date: 1991-11-04
Also published as: JPH0779700B2; KR840008818A; EP0127839B1; AU581174B2; MX164250B; IL71906A0; EP0127839A2; DE3485810D1; EP0127839A3; PH25395A; CA1222213A; IL71906A; NO842094L; DK172401B1; NO173944B; ATE78293T1; BR8402666A; AU2871784A; IN160416B; ES8507176A1

Abstract

내용 없음.

Description

재조합 벡큘로비루스 형질발현 벡터의 제조방법

제1도는 전이벡터 pAc101제작 과정에 대한 개요도이다.

제2도는 변형된 전이벡터 pAc311, pAc360, pAc373과 pAc380의 제작과정에 관한 개요도이다.

제3도는 AcMNPV폴리헤드린 유전자의 부분적인 뉴클레오티드 서열과 그 유전자의 바로 상부서열을 개략적으로 나타낸 것이며,

제4도는 재조합 형질발현 벡터 pAc380-IFN-β제작하기 위해 목적한 IFN-β유전자를 전이벡터 pAc380내로 클로닝시키는 방법에 관한 개요도이며,

제5도는 재조합 형질발현 벡터 pAc380-IFN-β를 배양된 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)세포에서 벡큘로비루스와 트랜스펙숀(transfection)시키고, 배양된 에스.프루기페르다 세포를 플래크 정제된 재조합 벡큘로비루스로 연속 감염시키는 과정을 나타낸 개요도이며,

제6도는 AcMNPV게놈의 EcoRI단편의 BamHI클로닝 부위에 IFN-β유전자를 삽입시킨 재조합 전이벡터 pAc380-IFN-β를 나타낸 것이다.

본 발명은 재조합 비루스 형질발현 벡터 제조법에 관한 것이다. 더욱 특별하게 본 발명은 곤충세포내에서 선택유전자를 형질발현할 수 있는 재조합 벡큘로비루스 형질발현 벡터를 제조하기 위해 벡큘로비루스(baculovirus)게놈내로 벡큘로비루스 프로모터와 결합된 선택 유전자를 융합시키는 방법에 관한 것이다.

최근 진보된 재조합 DNA기술은 특정유전자 또는 그것의 일부분을 분리하고 이들을 박테리아, 이스트, 식물 또는 동물 세포 및 이들 유기체를 감염시키는 비루스에로 전이시키는 과정을 용이하게 하고 있다. 그 전이된 유전자물질(또는 변형된 유전자)은 형질전환된 세포 또는 비루스가 복제됨에 따라 복제되고 증식된다. 결과적으로, 형질전환된 세포는 전이된 유전자 서열에 의해 암호되는 생성물을 생산할 수 있는 능력을 얻게된다.

모든 살아 있는 유기체의 DNA는 동일한 네가지의 뉴클레오티드들로 구성되었다는 점에서 화학적으로 유사하기 때문에 비루스, 원핵체와 진핵체 사이에서 유전자 또는 그 일부분의 전이와 형질발현이 가능하다. 기본적인 차이는 유기체의 게놈에서 나타나는 뉴클레오티드 서열에 있다. 코돈(뉴클레오티드 트리플렉트)에 배열된 특정 뉴클레오티드 서열은 특정아미노산 서열을 암호한다. 그러나, 아미노산 서열과 DNA뉴클레오티드 서열 사이의 암호관계는 근본적으로는 모든 유기체에서 동일하다.

게놈성 DNA는 단백질 암호서열(즉, “구조유전자”)과 구조유전자의 형질발현을 조절하는 조절부위(전사시발을 조절하는 DNA서열을 “프로모터”로 통상 언급함)로 구성된다. 일반적으로, 효소 RNA폴리머라제는, 구조유전자를 따라 이동하게 되면 암호된 정보가 mRNA로 전사되는 방식으로 프로모터에 의해 활성화 된다. mRNA는 인지서열, 리보소옴 결합을 나타내는 시그널과 번역개시와 종료의 시그널을 포함한다. 유전자의 프로모토 부위(일반적으로 유전자의 5′측면부위로서 기술됨)에서 중요한 전사 시그널의 역할에 대한 유전자 분석에서 최근의 진보는 형질발현에 있어서 시그널 서열의 기능과 역할을 연구하기 위하여 DNA서열을 선택적으로 제거하거나 또는 수정할 수 있도록 하였고 재조합 DNA숙주-벡터시스템과 같은 이종의 생물학 시스템에서 시그널 서열의 기능을 연구하기 위해 이들 특정 DNA서열을 제거하는 것을 가능케 하였다.

진핵 프로모터는 일반적으로 그 위치 및 구조가 원핵 프로모터 서열과 유사한 두개의 보존된 뉴클레오티드 서열에 의해 특징지워지는데, 이는 전사촉진과 관계있는 것으로 암시되고 있다. (Breathnach Chambon, 50 Ann.Rev.Biochem 349-383(1981)). 두개의 서열중 첫번째는 핵산에서 아데닌과 티민이 풍부한 서열로 (Goldberg-Hogness, “TATA” 또는 “ATA”박스) RNA개시부위의 상부에 위치한 20-30염기쌍이며 (mRNA전사시작부위인 캡 부위), 콘센서스 서열(5′-TATAA-ATA-3′)로 특징지워진다. 두번째 영역은 CCAAT박스 (Efstkatadis, et al 21 Cell 653-668(1980)로, 몇몇 유전자의 캡부위 상부에 위치한 70-90염기쌍으로 표준서열 5′-GG(C/T)CAATCT-3′을 가진다. (Benoist, et al, 8 Nucleic Acids Res 127-142(1980)) 상기 서열들은, 제한 엔도뉴클레아제 사용 및 재조합 DNA분자를 생산하기 위한 클로닝 사용과, 실험관내 또는 특정 부위 돌연변이에 의해 클론화된 뉴클레오티드 서열을 조절 제거 또는 변형에 의해 제거 및 변형될 수 있다. 제한 엔도뉴클레오아제는 DNA분자의 특정부위 절단을 촉매할 수 있는 가수분해 효소이다. 제한 효소의 활성 부위는 특정 뉴클레오티드 서열의 존재로 결정되고, 이는 해당 제한 엔도뉴클레아제에 의한 인지부위로 명명된다. 많은 제한 효소가 분리되고 그들의 인지부위에 따라 분류되었다. 그중 일부의 제한 엔도뉴클레아제는 양쪽의 DNA쇄상의 같은 위치에서 포스포-디에스테르 결합을 가수분해하여 평활말단(blunt end)을 만들고 그외의 다른 엔도뉴클레아제는 서로로부터의 몇개의 뉴클레오티드에 의해 분리된 결합을 가수분해하여 각 DNA분자말단에서 유리된 상태의 단일쇄 부분을 만든다. 상기 단일쇄 말단은 자가상보적이므로 가수분해된 DNA 또는 이종의 DNA서열을 동일한 상보 단일-쇄 서열과 재결합시키는데 사용될 수 있다.

제한 부위는 비교적 희귀하다. 그러나, 제한 엔도뉴클레아제의 일반적인 사용은 원하는 제한부위 서열을 포함하는 화학적 합성의 이본쇄 올리고 뉴클레오티드를 이용함으로써 상당히 향상되고 있다. 사실상 어떠한 자연발생의 클론화되고 유전적으로 변형되었거나 또는 화학적으로 합성된 DNA단편은 적절한 인지 부위를 포함하고 있는 올리고 뉴클레오티드를 그 DNA분자말단에 결합시킴으로써 다른 어떤 단편과 커플링될 수 있다. 이러한 생산물을 적합한 제한 엔도뉴클레아제의 가수분해 작용을 받게하면 DNA분자를 커플링하기 위해 필요한 상보말단을 제공한다.

특정 제한 효소에 대한 인지부위는 일반적으로 불규칙하게 분포되어 있다. 그러므로, 제한 효소에 의한 절단은 코돈내 또는 유전자의 몇몇 임의 부위에서 인접한 코돈사이에 유발될 수 있다. 이러한 개요에 대하여 많은 다양한 변화가 가능하지만, 이들 서열을 형질발현하기 위해서는 프로모터 부위에 대해 적절한 위치와 배향으로 DNA서열을 삽입시키는 유용한 기술을 습득하는 것이 중요하다.

가능하게는 인위적인 재조합분자, 또는 카메라 또는 하이브리드 유전자로 일컬어지는 복합체를 구성하기 위하여 이종의 DNA서열을 클로닝운반자 또는 벡터분자에 삽입하여 DNA서열을 클론화시킬 수도 있다. 대부분의 목적에 대하여, 사용되는 클로닝 운반자는 재조합분자가 박테리아, 이스트, 식물 또는 동물 세포내에 형질변환에 의해 배치될 때 복제될 수 있도록 하기 위해 완전한 리플리콘(replicon)을 포함하는 염색체외의 이종 DNA서열이다. 일반적으로 사용되는 클로닝 운반자는 박테리아, 이스트, 식물과 동물세포에 결합된 비루스와 플라스미드로부터 유래된다.

최근 진보된 생화학 및 재조합 DNA기술은 “이종” DNA를 함유하는 클로닝 운반자 또는 벡터를 제작할수 있게 하였다. “이종”이라는 용어는 세포에 의해 통상적으로 생산되지 않는 폴리펩티드를 암호하는 DNA를 의미한다. 이종 DNA는 세포의 게놈내로 융합되거나 또는 자가복제 플라스미드 또는 비루스 클로닝 운반자상에서 형질전환시킨 세포내에서 유지될 수 있다. 이러한 형질전환된 세포 개체군은 다른 조작, 수정 및 다른 벡터로의 전이를 위한 이종 DNA의 재생 공급원을 제공한다. 이종 유전자를 운반하는 특정한 비루스벡터는 형질 전환된 세포내에서 복제될 것이며 이 형질전환된 세포를 용해시킬 것이다. 복제도중, 이종 유전자는 그 특정세포 형태로 형질발현되거나 또는 형질발현되지 않을 수도 있다. 복제비루스는 분리되어 그밖의 세포들을 감염시키는데 사용될 수 있으므로 다른 용도를 위한 재조합체의 재생 공급원을 제공한다.

유전자 또는 그것의 바람직한 부분은 필요한 방법으로 클론 및 또는 생화학적으로 변형되거나 또는 다른 생화학적으로 변형된 유전자 또는 게놈성 유전자가 그것의 형질발현을 용이한 방식으로 삽입되면, 그들은 이후 형질발현벡터에 전이된다. 유전자 암호의 특성 때문에, 클론화 또는 하이브리드된 유전자 또는 그것의 일부는 유전자가 암호하는 아미노산 서열의 생산을 지시한다. 프로모터 부위에 적합한 고유한 관계로 위치한 클론화 유전자로 형질발현 벡터를 제작하기 위한 일반적 방법은 B. Polisky, et al., 73 Proc, Natl. Acad. Sci. . U. S. A. 3900(1986), K.Itakura, el, at., 198 Science 1056-1063(1977), L.Villa-Komaroff, et al., 75 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 3727-3731(1978)등에 의해 교시되어 있다.

“형질발현”이라는 용어는 하기방식으로 특징지어질 수 있다. 비교적 단순한 원핵유기체에서 일지라도, 세포는 많은 단백질을 합성할 능력을 가진다. 어느 주어진 시점에서는 세포가 합성할 수 있는 많은 단백질이 합성되지 않는다. 주어진 유전자에 의해 암호된 특정 폴리펩티드가 세포에 의해 합성되는 경우, 그 유전자는 형질발현되어진다고 얘기한다. 형질발현되기 위해서는 그 특정 폴리펩티드를 암호하는 DNA서열이 유전자의 조절부위 (control region)에 대하여 적절하게 위치하여야 한다. 조절부위의 기능은 어떤 주어진 시점에서 세포의 변화필요에 반응되도록 조절부위의 조절하에서 유전자를 형질발현하도록 하는 것이다.

본 명세서 전체에서 하기 정의어가 사용된다.

클로닝 운반자란 세포 또는 유기체내에서 형질전환에 의해 복제될 수 있는 완전한 리플리콘을 함유하는 염색체외의 이종 DNA를 말한다.

일반적으로, 클로닝 운반자는 비루스 또는 플라스미드로부터 유래되며, 대부분 원형 DNA형태를 취한다.

유전자라는 용어는 단일 단백질사슬의 합성과 전달에 관여하는 DNA서열을 말한다. 감염이라는 용어는 병원성 비루스 복제와 생장에 양호한 조건을 갖는 세포에 병원성 비루스가 침입한 것을 의미한다.

트랜스펙숀(transfection)이라는 용어는 DNA를 침전시키고, 덱스트란 설페이트와 같은 적당한 작용제 또는 인산염을 함유하는 DNA용액에 염화 칼슘을 부가하여 세포내로 이를 흡수시켜 정제된 핵산으로 세포를 감염시키는 기법을 의미한다.

상기에서 설명한 일반적인 개요와 기술을 이용하는 다수의 숙주-벡터 시스템은 유전적으로 변형된 유기체에 의하여 단백질을 상업적 또는 실험적으로 합성시키는데 사용되도록 개발되었다. 대부분의 이들 숙주-벡터 시스템은 Gilbert등에 의한 미합중국 특허 제4,338,397호에서 설명한 것과 같은 진핵 숙주-벡터 시스템이다. 또한, A.Miyanohara등에 의해 80 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1(1983)에서 설명된 것과 같은 B형 간염의 표면 항원 합성에 사용된 시스템 및 Pitzeman등에 의해 219 Science 620(1983)에서 설명된 이스트내의 인체 인터페론 합성을 위한 시스템과 같은 벡터로서 이스트들은 사용한 시스템들이 사용되어 오고있다.

바람직한 단백질 합성을 위한 원핵 숙주 벡터 시스템의 이용가치는 그러한 시스템에 존재하는 고유한 특정 제한요인으로 인해 감소되고 있다. 예로서, 상기 시스템의 mRNA 전사체 또는 단백질 생성물은 원핵체내에서 불안정할 수 있다. 또한, 원핵세포내에서 단백질이 합성되기전에, 미생물에 유입된 DNA서열은 활성 진핵단백질을 포함하지 않는 폴리펩티드 서열을 암호하는 간섭 DNA서열(Intervening DNASequen-ces), 무의미한 서열(Nonsense Sequence)과 개시 또는 말단 서열로부터 유리되어야만 한다. 또한, 몇가지 진핵 단백질은 생물학적으로 활성화되기 위해서는 합성후에 변형이 필요하며, 원핵세포는 일반적으로 그러한 변형 능력이 없다.

이스트 또는 원핵 숙주-벡터 시스템과 관련된 그밖의 제한요소는 합성된 유전자 생성물을 세포내에서 회수하는 것과 관련된 어려운점을 포함한다. Silhavy등에 의한 미합중국 특허 제4,336,336호는 유전자 생산물의 회수에 대한 문제점을 상세히 설명하고 유전적으로 변형시킨 박테리아에 의해 단백질을 합성하고 분비하는 방법을 제공하였다.

진핵 숙주-벡터 시스템에서 비루스의 사용은 최근의 상당한 양의 연구와 고찰의 주제가 되어 왔다. 그러나, 비루스 벡터 시스템 또한 그들의 유용성을 감소시키는 중요한 단점과 요소를 가진다. 예컨대, 많은 진핵 비루스 벡터는 포유동물 시스템에서 종양원성이든지 아니면, 발암성이므로 따라서 산출된 유전자 생산물과 관련되어 심각한 건강과 안전문제 잠재성과 우발적인 감염을 유발시킨다. 또한, 몇가지 진핵 숙주 비루스벡터 시스템에서, 유전자 생산물 그 자체가 항비루스 작용을 나타냄으로 인해 고 단백질 생산을 감소시킨다. 이러한 것은 D Cheysen과 W.Fiers에 의해 1 J.Molec. Applied Genet. 385-394(1982)에 교시된 진핵 숙주 비루스 벡터 시스템에서 100단위의 인터페론으로만 유발되는 시미안 원숭이 비루스 40의 수율이 80%가 감소되는 경우에서 볼 수 있다.

진핵 숙주-비루스 벡터 시스템의 사용시 일어나는 또 다른 고유한 문제는 비루스의 형태에 있다. 예컨대, 비루스는 매우 적은 제한 부위를 가지기 때문에, 외생 DNA를 특정위치에서 단순한 비루스내로 삽입하기가 용이하다. 그러나, 진핵 유전자는 너무커서, 단순 비루스내로 삽입할 수 없게 되는 것이 자주 일어난다. 따라서, 비루스의 형태 때문에, 단순 비루스내로 팩킹될 수 있는 외생 DNA의 양이 한정된다. 한편, 복합 비루스는 많은 제한 부위를 가지기 때문에 특정 위치에서 복합 비루스내로 외생 DNA를 삽입하는 것이 더욱 어렵다.

본 발명은 진핵 숙주-벡터시스템에서 비루스성 형질발현 벡터를 생산하기 위하여 벡큘로비루스와 벡큘로비루스 게놈내의 프로모터를 사용함으로써 상기에서 설명한 많은 제한 요소를 극복한다. 더욱 특별하게는 벡큘로비루스 오토그래파 캘리포티카[Autographa californica, (AcMNPV)] 및 여기에 포함된 폴리헤드린프로모터가 진핵 숙주 곤충세포내에서 대단히 높은 수준으로 선택 유전자를 형질발현할 수 있는 재조합 비루스 형질발현 벡터를 생산하기 위해 사용될 수 있다는 것이 본 발명에 의해 발견되었다. 산출된 이 시스템의 유전자 생산물은 세포 배지내로 충분히 분비될수 있어 단밸질 생산물의 회수와 관련된 대부분의 어려움을 경감할 수 있다. 또한 더욱 중요하게, 이 시스템은 포유 동물내에서 종양원성 또는 발암성이 아니다. 진핵 숙주-비루스 벡터 시스템에 벡큘로비루스를 이용하는 것과 관련한 이론적인 장점은 L.K.Miller의 “A Virus Vector for Genetic Engineering in/Invertebrates”에 의해 더욱 상세히 설명되어 있다.

(Panopoulos, N.J.(Ed.),Gentic Engineering in the Plant Sciences(New York, Praeger Publishers, 1981) , pp.203-224.

넓은 범위에서, 본 발명은 비루스성 전이벡터, 재조합 비루스성 전이벡터 및 재조합 비루스성 형질발현벡터의 제조방법들을 제공한다. 얻어진 재조합 비루스성 형질발현 벡터는 숙주 곤충 세포내에서 선택 유전자를 형질발현할 수 있다.

본 발명에 의하여, 벡큘로비루스 유전자의 프로모터를 포함하는 벡큘로비루스 유전자 또는 그 일부를 함유하는 벡큘로비루스 DNA단편(분체)을 얻기 위하여 절단된다. 바람직한 방법으로, 바람직한 벡큘로비루스 오토그래피 캘리포니카(AcMNPV)와 같은 적합한 벡큘로비루스의 폴리헤드린 유전자와 측면 DNA서열을 (flanking Dna sequence)포함하는 DNA가 우선 분리된다. 이후 필요한 DNA가 적합한 제한 효소 방법에 의해 절단된다. 이것은 폴리헤드된 프로모터 및 폴리헤드린 단백질 또는 그것의 일부를 암호화한 최소한 하나의 DNA서열로 구성된 DNA단편을 생산한다. 이러한 하나의 상기 DNA단편은 폴리헤드린 프로모터 및 폴리헤드린 단백질을 암호하는 DNA서열로 구성된 EcoR I - I단편이다.

다음에, 상기에서 설명한 DNA단편을 플라스미드 pUC8과 같은 적합한 클로닝 운반자에 삽입시켜 전이 벡터를 제조한다. 따라서, 폴리헤드린 전이벡터로 명명되는 바람직한 전이벡터는 선택유전자가 폴리헤드린 프로모터의 전사 조절하에 있도록 선택 유전자 또는 그것의 일부를 클로닝하기 위한 유용한 부위 및 폴리헤드린 프로모터를 포함하는 적합한 클로닝 운반자를 함유하게 된다. 또한 바람직한 전이벡터는 폴리헤드린 단백질 또는 그것의 일부를 암호하는 DNA서열을 포함하거나 포함하지 않을 수도 있다.

그후 재조합 전이벡터는 선택된 유전자 또는 그것의 일부를 상기 설명한 전이벡터의 유용한 클로닝 부위로 삽입시켜 제조된다. 잠정적으로, 어떠한 유전자 또는 유전자들로 본 발명의 전이벡터내로 클로닝될 수 있고 벡큘로비루스 프로모터 서열과 커플링될 수 있다. 그밖에, 적절한 재조합 DNA기술에 의하여, 폴리헤드린 단백질을 암호하는 DNA서열은 산출되는 클론화 유전자 생산물이 그것만으로도 선택된 단백질이 될 수 있도록 상기 설명의 바람직한 전이벡터로부터 삭제될 수 있다. 그렇지 않고, 폴리헤드린 단백질에 대한 암호서열이 삭제되지 않거나 또는 폴리헤드린 단백질에 대한 최소한 하나의 암호서열이 바람직한 전이벡터로부터 삭제되지 않는다면, 산출된 클론화 유전자 생산물은 선택된 단백질과 폴리헤드린 단백질 또는 그 부분을 함유하는 하이브리드 또는 융합 단백질이 될 것이다.

재조합 형질발현 벡터를 제조하기 위하여, 재조합 전이벡터는 적합한 벡큘로비루스 DNA와 접촉하여 재조합을 유도하고 그럼으로서 필요한 유전 물질을 벡큘로비루스 게놈내로 융합시킨다. 재조합을 완수시키는 바람직한 방법은 트랜스펙숀의 잘 알려진 공지 방법이다. 트랜스펙숀 과정이 비루스에서 100%발생하지 않기 때문에, 그 결과물은 비재조합물과 재조합물의 혼합물이 된다.

이후 숙주 곤충 세포내에서 선택 유전자를 형질발현할 수 있는 재조합 벡큘로비루스 형질발현 벡터는 재조합과 비재조합의 벡큘로비루스 혼합물로부터 적절한 선별법 (scereening) 또는 유전자적 선택 기술에 의해 선택된다. 형질발현 벡터를 선택하는 하나의 방법은 폴리헤드린 유전자의 삽입 불활성에 의하여 감염 세포의 핵내에서 비루스 교합체가 부족한 비루스를 동정분리하는 것이다.

본 발명은 또한 상기 설명의 방법으로 생산된 재조합 벡큘로비루스 형질발현 벡터를 제공한다. 이러한 형질발현 벡터는 비루스 게놈과 결합되고 이것내에서 안정한 최소한 하나의 선택유전자 또는 그 부분을 포함하는 감염성 벡큘로비루스를 포함한다. 곤충세포 또는 곤충에서 형질발현 벡터가 복제되는 동안, 선택 유전자는 벡큘로비루스 전사 시그널의 조절 또는 그 자신의 프로모터의 조절하에서 형질발현될 수 있다. 전형적인 벡큘로비루스 형질발현 벡터는 AcMNPV게놈내에 폴리헤드린 프로모터의 전사 조절하에 있도록 위치하여 삽입된 β-인터페론의 유전자가 포함되어 있는 재조합 AcMNPV비루스이다. 어떠한 벡큘로비루스 프로모터와 곤충세포 주도 사용될 수 있는 가능성이 있다.

본 발명은 또한 상기 설명의 방법으로 전이벡터를 제조할 수 있도록 한다. 바람직한 폴리헤드린 전이벡터는 폴리헤드린 프로모터 서열과 선택유전자가 폴리헤드린 프로모터의 전사 조절하에 있도록 선택 유전자 또는 그 일부를 삽입시키는데 유용한 클로닝 부위를 포함하여 벡큘로비루스의 유전적 조작을 위한 중간 운반자로서 사용된다. 폴리헤드린 전이벡터는 폴리헤드린 단백질을 암호하는 DNA서열 일부 또는 전부를 전혀 포함하지 않을 수 있다.

본 발명은 또한 상기 설명한 방법으로 제조되는 재조합 전이벡터를 제공한다. 본 발명의 바람직한 재조합 전이벡터는 폴리헤드린 프로모터와 커플링된 선택유전자 또는 그것의 일부를 포함하여 필요한 유전 정보를 벡큘로비루스 게놈내로 융합시키는 운반자로서 사용된다.

본 발명은 진핵 숙주 곤충 세포내에서 선택유전자의 형질발현을 촉진하도록 숙주-벡터 시스템에서 벡큘로비루스 프로모터를 사용하는 것에 관해 기술하고 있다. 특히, 폴리헤드린 단백질이 비루스-감염된 진핵 숙주 세포내에서 가장 풍부하게 합성되는 단백질의 하나이기 때문에, 바람직한 방법은 선택유전자를 적합한 벡큘로비루스 게놈내로 융합시켜 선택유전자가 폴리헤드린 프로모터와 커플링되도록 하는 것이다. 이같은 재조합 벡큘로비루스는 선택유전자 생산물의 합성을 위한 효과적인 기작을 제공한다. 따라서, 본 발명은 β-인터페론과 같은 필요한 유전자 생산물이 매우 높은 수준으로 숙주 곤충 세포로부터 합성되고 효과적으로 분비됨에 따라 현저한 실용성을 갖는다.

제1도는 플래크 정제한 균주인 AcMNPV, M3, 플라스미드 pBR325 및 플라스미드 pUC8로부터 출발하여 전이벡터인 pAc101을 제작하는 방법에 관한 개요도이다.

제2도는 플라스미드 pI10,pUC8과 합성 BsmHI링커로부터 출발하여 변형 전이벡터 pAc311, pAc360, pAc373과 pAc380을 제작하는 방법에 관한 개요도이다. 여기에서 “라이브러리”란 폴리헤드린 유전자내의 각각 가능한 위치에서 삭제 돌연변이를 유도함으로써 제작될 수 있는 변형된 pB’Bal플라스미드의 라이브리드를 나타낸다. 플라스미드 pB’Bal 11, pB’Bal 60, pB’Bal 73 및 pB’Bal 80은 전이벡터 pAc311, pAc360, pAc373과 pAc380으로 다시 변화시키기 위해 돌연변이체 플라스미드의 상기 라이브러리로부터 선택된다.

제3도는 AcMNPV의 폴리헤드린 유전자의 부분적인 뉴클레오티드 서열과 그 유전자 바로 상부의 서열을 도식적으로 나타낸 것이다. 유일한 BamHI클로닝 부위 이외에도 전이벡터 pAc101, pAc311, pAc360, pAc373과 pAc380을 제작하기 위해 삭제 돌연변이가 유도되는 위치가 화살표에 의해 표시되었다. 폴리헤드린 유전자의 “TATA”와 “CAAT”박스는 그 서열주위에 그려진 직사각형에 의해 표시되고 유전자의 전사시발 부위는 별표로 표시되어 있다. 제3도는 또한 폴리헤드린 유전자 부근에 위치한 EcoRV와 Hind III제한부위를 나타내고 있다.

제4도는 재조합형질발현 벡터 pAc380-IFN-β를 제작하기 위하여 전이벡터 pAc380내로 바람직한 IFN-β유전자를 클로닝하는 도식을 나타낸다. 제4도는 또한 IFN-β유전자를 포함하는 출발물질 플라스미드 pBRl3을 나타낸다. 플라스미드 p770은 pUC8인 서열과 합성 옥타 뉴클레오티드 BamHI링커에 의해 접합된 767염기쌍의 Hinc II단편을 포함한다. 상기 767염기쌍 단편은 IFN-β의 전체 암호 서열을 포함한다.

제5도는 재조합 형질발현 벡터 pAc380-IFN-β를 배양된 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)세포에서 벡큘로비루스와 트랜스펙숀시키고 배양된 에스.프루기페르다 세포를 플래크 정제된 재조합 벡큘로비루스로 연속 감염시키는 도식을 나타낸다.

제6도는 AcMNPV게놈의 EcoRI단편을 BamHI클로닝 부위에서 삽입시킨 INF-β유전자를 갖는 재조합 전이벡터 pAc380-IFN-β를 나타낸 것이다. 폴리헤드린 프로모터 서열은 굵은 검은색으로 표시되어 있으며 EcoRI - I서열이 플라스미드 pUC8내에 융합된 상태로 나타나 있다.

본 발명의 실시에 사용되는 벡큘로비루스는 오토그래파 캘리포니카[Autographa californica, (AcMNPV)]이다. 이 벡큘로비루스는 하기와 같이 규명된다.

자연 발생적인 감염성 AcMNPV는 일반적인 비루스 교합체에서 발견된다. 이 비루스 교합체는 일반적으로 폴리헤드린 단백질의 서브 유니트 구조 배열을 포함하는 파라 결정 상태의 단백질 매트릭스에 매립되어 있는 몇가지 비루스 입자를 포함한다. 교합체는 적합한 숙주 곤충에 의해 섭취되고 이것이 장의 내강에 도착할 때, 알카리 상태에서는 비루스를 방출하기 위해 교합체 분리가 발생된다.

비루스는 장벽의 세로를 침범하고 그 세포의 핵으로 이동하여 복제된다. 두가지 감염 형태가 이들 세포내에서 나타나는데 즉 교합 상태의 비루스와 세포외 또는 비교합 상태의 비루스가 제조된다. 세포의 비루스는 그 세포 표면으로부터 출아되어 다른 세포를 감염시킨다. 감염 약 12시간후, 세포외 비루스의 출아감소, 폴리헤드린 합성개시, 그리고 교합된 비루스 입자의 제조가 증가된다. 매우 많은 수의 교합체가 감염세포와 조직에서 만들어지고, 결과적으로 곤출을 용해시킨다. 이 교합된 형태의 비루스는 다른 곤충으로의 감염을 만연 시킨다.

세포 배양 배지에서 용이하게 배양되는 세포외 비루스가 본 발명의 전형적인 방법에서 사용된다. 세포외 및 교합비루스는 동일한 게놈을 가지지만 다른 표현형의 특징을 나타낸다.

상기 교합체의 주요 구조적 성분인 폴리헤드린은 약 29,000분자량의 단백질이다. AcMNPV게놈을 규명한 결과 AcMNPV폴리헤드린에 대한 유전자를 DNA제한 지도의 제로 포인트로부터 약 4000염기쌍 하부쪽으로 위치한 EcoR I - I단편내의 약 1200염기쌍에 달하는 인접 DNA서열까지 지도가 그려진다. (참조.G.E.Smith, J.M.Vlak와 M.D.Summers, 45 J.Virol. 215-225(1983)완전한 AcMNPV게놈의 지도는 J.M.Vlak와 G.E.Smith에 의해 4 J.Viorl. 1118-1121(1982)에 나타나 있고, 폴리헤드린 유전자에 대한 DNA서열은 Hooft van Iddekinge, G.E.Smith, 와 M.D.Summers에 의해 Virology 561-565(1983)에 나타나 있다.

폴리헤드린 단백질의 구조와 작용은 이것이 공지된 가장 높은 수준으로 형질발현된 진핵 유전자의 하나이기 때문에 상당한 관심이되고 있다. AcMNPV로 감염된 스포도프테라 프루기페르다 세포에서, 폴리헤드린은 높은 수준으로 축적되는데, 즉 감염된 세포내의 총 단백질량의 50% 이상을 차지하며, 이는 감염된 세포의 리터당 0.2그람 이상의 폴리헤드린 단백질이 제조된 셈이다. 그 유전자는 또한 하기의 이유로 하여 주목된다 :

(1) AcMNPV의 폴리헤드린 유전자는 벡큘로비루스중에서 높게 보존되는 DNA 서열을 포함한다.

(2) 밀접하게 관련된 균주 사이에서의 재조합이 게놈의 이 부위에서 고빈도로 발생되고 따라서 재조합물에서 폴리헤드린 유전자의 차단과 형질발현이 허용되며,

(3) 유전자의 형질발현이 숙주, 조직과 세포주에 의존한다는 것이다.

유전공학의 관점에서는, 비루스가 세포배양체내에서 폴리헤드린 유전자 없이도 복제될 수 있기 때문에 이 폴리헤드린 유전자는 불필요하다. 이 유전자의 고도의 형질발현과 비루스 복제에 이것이 필수적이지 않다는 사실때문에 재조합 유전자의 형질발현을 위한 시스템의 일부로서 폴리헤드린 프로모터와 AcMNPV 유전자를 사용하는 가능성은 상당한 연구의 자료가 되고있다(참조, E. B. Carstens, S.T Tjia W. Doerfler, 99 Virology 386-398(1979) ; P.Dobos M.A. Cochran, 103 Virology 446-464(1980) ; H.A.Wood, 102 Virology 21-27(1980) ; J. E.Maruniak and M.D.Summers, 109 Virology 25-34(1981) ; L.K.Miller, “A Virus Vector for Genetic Engineering in Inver-tebrates, “In : N.J.Panopoulos(Ed.), Genetic Engneering in the plant Sciences (New York, Praeger Publishers, 1981), pp. 203-224; and L. K Miller, et al., 219 Science 715-721(1983) ; G.E.Smith, M.J. Fraser and M.D.Summers, J. Virol. 584-593 (1983)). 그러나, 본 발명 출현이전에는 아무도 상기 시스템을 개발할 수 없었다.

출원인에 의한 실험은 다른 유전자 생산물 10K가 또한 폴리헤드린에 필적하는 고농도로 형질발현된다는 것을 나타내고 있다(G.E.Smith, J. M. Valk와 M.D.Summers, 45 J. Virol 215-225(1983)). 생성된 10K 단백질은 명백히 비구조적이며 감염말기에 생산되고 생산량은 다량이다. 10K. AcMNPV 단백질 유전자의 위치는 Hind III 단편 P와 Q로 지도가 그려진다. 폴리헤드린 프로모터와 구조 유전자처럼 이 프로모터는 재조합유전자의 형질발현을 위해 AcMNPV를 사용하는 시스템의 일부로서 그 유리한 상용에 대해 연구의 주제가 되어왔다. 그러나, 본 발명이전에는, 상기 프로모터의 유리한 이용을 허용하는 시스템이 개발되지 않았었다.

본 발명의 예시된 방명에 의하여, AcMNPV. M3 또는 E2의 특정균주가 이용된다. 그러나 본 발명의 유리함을 알고 있는 본 기술의 숙련된자는 다른 벡큘로비루스 및 다른 벡큘로비루스 균주가 재조합 벡큘로비루스 전이 및 형질발현 벡터들을 제조하는데 적합할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 특히, 밀접하게 관련되고 자연발생적인 벡큘로비루스 균주 Tricho-plusia ni MNPV, Rachiplusia ou MNPV, Galleria mellonella MNPV 및 G.E.Smith와 M.D.Summers에 의한 30 J. Virol. 828-838 (1979), G E.Smith와 M.D.Summers에 의한 33 J.Virol. 311-319 (1980)에서 설명되고 특징지워진 AcMNPV의 E2, R9, S1과 S3 균주같은 플래그-정제균주가 유리하게 이용될 수 있다. 상기와 그 밖의 다른 균주에 대한 보다 더 상세한 설명은 G.E.Smith와 M.D.Summers에 의해 89 Virology 517-527 (1978)에 설명되어 있다.

본 발명의 방법에 의하여, 유리하게 이용되는 것은 폴리헤드린 구조유전자와 프로모터이다. 상기 유전자는 S1 뉴클레아제 실험에 의해 지도가 작성되었다. 폴리헤드린 암호부위의 5′ 말단의 뉴클레오티드 서열과 전사시발 상부의 200염기가 제3도에 나타나 있다. 제3도에서 표시된 부위는 가장 자주 사용되는 폴리헤드린 mRNA에 대한 전사시발 부위이다.

ATG 번역 시발 시그널(+1 위치의 A잔여기)은 전사시발 부위로부터 약 58염기에서 발생하여 HindIII부위를 포함한 255까지의 염기에 오픈리딩이 이어진다. 많은 진핵구조 유전자내의 유사한 위치에서 발견되는 “TATA”와 “CAAT”박스는 각각 전사시발 부위로부터 상부의 25와 35염기사이와 60과 70염기 사이에 위치한다. 전사시발 부위로부터 상부의 78과 90의 염기중심에는 반복된 서열인 “CACAAACT”가 있다. 또한, AcMNPV 폴리헤드린 유전자는 번역시발 코돈의 앞에 위치하는 58염기의 비번역리더 서열을 가지며, AcMNPV 폴리헤드린 mRNA에 대한 적합한 실험과정에 의해 제안된 바와같이 간섭서열이 존재하지 않는다(참조 : Smith, Valk와 Summers, G.F Rohrman, et al., 121 Virology 51-60(1982).

본 발명의 실시에서, 폴리헤드린 유전자를 가지는 DNA는 벡큘로비루스 AcMNPV로부터 분리되고 정제된다. 본 기술에 숙련된자는 폴리헤드린 유전자를 소유하고 있는 다른 벡큘로비루스, 특히 상술된 관련 균주들로부터 상기 유전자를 분리할 수 있다는 것이 매우 유익한 것이라는 점을 인지할 수 있을 것이다.

이후 목적하는 DNA는 적절한 제한효소방법에 의하여 EcoRI제한 엔토뉴클레아제로 분해되어 폴리헤드린 유전자를 포함하는 7.3킬로염기의 EcoRI - I 단편 또는 다른 적합한 단편을 제조한다. 이후 상술한 EcoRI - I 단편은 전이벡터를 제조하기 위하여 적합한 클로닝운반자의 EcoRI 부위로 클론된다.

AcMNPV게놈은 선택유전자가 부위-특정방식에 의해 효과적으로 삽입되는 공지된 독특한 제한부위를 가지고 있지 않으므로, 유전자 전이를 위한 중간 운반자로서 작용하는 키메라성 플라스미드 벡터 (전이벡터)를 제작하는 것이 필요하다. 그러므로, 선택유전자를 폴리헤드린 프로모터 서열에 인접한 비루스 게놈내로 삽입시키기 위하여, 폴리헤드린 전이벡터로 명명된 전이벡터가 제작되는데, 이 폴리헤드린 전이벡터는 폴리헤드린 유전자, 클로닝 부위 그리고 측면 비루스 DNA를 포함하고 있고, 상기 클로닝 부위는 이 부위내로 적절하게 삽입된 유전자가 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 있도록 위치하고 있으며, 상기 측면 비루스 DNA는 상기 폴리헤드린 유전자의 양측쪽중 어느한쪽에 결합되어 있다. 상기 전이벡터의 제작은 제1도와 제2도에 도식적으로 나타나 있다. 또한, 측면 비루스 DNA 존재는 와일드 형태의 벡큘로비루스와의 재조합을 용이케하여 복제성 비루스 게놈내로 선택유전자 전이를 허용케한다.

따라서, 상술한 EcoRI - I 단편은 각각 플라스미드 pBR325와 pUC8로 클론화되고 서브클론화된다.

pAc101로 명명되고 폴리헤드린 유전자의 번역시발 부위로부터 약 220염기의 폴리헤드린 프로모터 서열상부의 3′ 방향으로 위치한 단일 BamHI 클로닝 부위를 가지는 폴리헤드린 전이벡터를 제조하기 위하여 EcoRI - I 단편내의 두개의 BamH I 제한부위를 제거할 수 있다(제3도 참조). 플라스미드 pBR325와 pUC8는 폴리헤드린 전이벡터 제조에 사용되는 플라스이드 이지만, 다른 적합한 클로닝 운반자가 폴리헤드린 유전자와 측면 비루스 DNA가 기능적으로 융합되는 것을 조건으로 하여 사용될 수 있음은 기술에 숙련된 자라면 인지할 수 있을 것이다.

폴리헤드린 전이벡터는 전자시발 부위 부근이나 또는 폴리헤드린 유전자의 약 -58부터 말단부근까지 폴리헤드린 합성의 암호서열 일부 또는 전부를 삭제시킴으로써 선택유전자를 삽입시키기 위해 변형시킬 수 있다.

(제3도 참조). 이후에, BamHI 제한 부위 서열을 포함하고 있는 천연 또는 합성 올리고 뉴클레오티드를 함유하는 DNA 링커는 삭제부위에 삽입되어 그 제한 부위에서 DNA 단편의 커플링을 가능하게 한다. 전이벡터의 변형은 제2도에 도식적으로 나타내었으며, 폴리헤드린 암호서열의 삭제방법은 시험관내 돌연변이를 이용한다. 그러나, 다른 방법이 폴리헤드린 암호서열의 일부 또는 전체를 삭제하기 위해 사용될 수 있고, 다른 합성 또는 천연올리고 뉴클레오티드 링커서열이 삭제부위에 삽입될 수 있으며, 선택유전자 또는 그 일부가 융합될 수 있는 다른 변형된 폴리헤드린 전이벡터가 본 발명에 적합하게 사용될 수 있음은 본 기술에 숙련된 자에 의해 인지되고 있는 사실이다.

표준클로닝 기술에 의해, 인체 β-인터페론 합성을 암호하는 IFN-β 유전자, 클로람페니콜아세틸트랜스퍼라제 합성을 암호하는 CAT 유전자 및 인체 인터루이킨-2합성을 암호하는 IL2 유전자와 같은 선택된 유전자가 재조합 전이벡터를 제조하기 위하여 유용한 제한 부위에서 폴리헤드린 전이벡터내로 삽입된다. 전이벡터 pAc380 내로의 β-인터페론 유전자의 삽입은 제4도에 나타내었다.

또한, IFN-β, CAT와 인터루이킨-2가 폴리헤드린 전이벡터내로 클로닝되고 폴리헤드린 프로머터 서열과 커플링되는 전형적인 유전자이지만, 어떠한 선택유전자라도 본 발명에서 사용될 수 있으며, 또는 상술된 변형형태로 이용될 수 있음을 인지할 수 있을 것이다.

재조합 전이벡터 유전자인 하이브리드 폴리헤드린-선택유전자는 벡큘로비루스 AcMNPV와 같은 적절한 벡큘로비루스의 게놈내로 전이되어 숙주곤충 세포에서 β-인터페론을 암호하는 유전자를 형질발현할 수 있는 재조합 비루스 형질발현 벡터를 생산한다. 상기 하이브리드 유전자의 전이는 스포도프테라 프루기페르다와 같은 숙주곤충 세포에서 트랜스펙숀의 방법에 의해 수행된다. (J.p.Burand, et al., 101 Virology 286-290(1980) 참조). 상기 방법은 재조합 전이벡터 pAc380-IFN-β를 사용한 것으로 이를 제5도에서 도식적으로 나타내었다. 트랜스펙숀후, AcMNPV DNA의 복제중, 하이브리드 유전자는 재조합 전이벡터와 AcMNPV DNA 사이의 재조합에 의하여 AcMNPV DNA로 전이된다. 따라서, 비재조합과 재조합 벡큘로비루스를 함유하는 혼합물이 제조되고, 재조합 벡큘로비루스는 IFN-β 유전자를 형질발현할 수 있다. 트랜스펙숀이 하이브리드유전자를 벡큘로비루스 게놈내로 전이시키기 위한 바람직한 방법이지만, 하이브리드 유전자를 벡큘로비루스 게놈내로 삽입시키는데 다른 방법이 적합할 수도 있다. 또한, 재조합이 일어나기 위하여 하이브리드 유전자 서열과 다른 균주의 상응 서열 사이에서 충분한 상동성이 존재하는 한 재조합이 재조합 전이벡터와 벡큘로비루스의 다른 균주사이에서 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 재조합은 상기 설명된 균주 Trichoplusia ni MNPV, Rachiplusia ou MNPV, Galleria mellonella MNPV 및 AcMNPV 균주 E2, R9, S1과 S3중의 하나로부터 분리된 유전자 사이에서 발생된다. 재조합이 명백하게 동종서열을 함유하지 않는 게놈의 부위에서 발생될 수 있다. 이 기작은 설명되지 않고 있다.

하이브리드 폴리헤드린-선택유전자, AcMNPV게놈내로 삽입된 유전자를 포함하는 AcMNPV 형질발현 벡터는 비재조합 및 재조합 벡큘로비루스 혼합물로부터 선택된다. 선택방식중의 하나는 비루스 교합체를 생산하지 않는 비루스(0^-로서 명명)로 감염된 숙주곤충 세포에 의해 형성된 플래크를 스크리닝하는 것이다.

재조합 비루스는 폴리헤드린 유전자의 삽입 불활성으로 인해 비루스 교합체 생산에 결합을 일으키기 때문에 상기 방식으로 선택이 촉진된다. 트랜스 팩트된 세포의 자손비루스로부터 만들어진 비루스플래크중 평균 0.5%가 추정 재조합 0^-비루스로부터 만들어진다. 따라서, 0^-플래크를 형성하는 재조합 비루스로부터 DNA가 정제되고, 이후 DNA는 적합한 제한 효소로 분석하면 재조합 AcMNPV 벡터가 적정 EcoR I - I위치내로 선택유전자를 삽입하고 있음이 확인된다.

상기 설명된 선택과정은 재조합 벡큘로비루스-선택유전자 형질발현 벡터의 효과적이고 통상적인 선택방법을 제공하지만, 본 발명에 의해 이용되는 다른 선택방법이 사용될 수도 있다. 진핵세포내의 이종 DNA를 원래 위치에서 검출하는 비교적 통상적인 방법 (즉, 라벨된 DNA 프로오브를 감염된 동물세포에서 만들어진 플래크에 존재하는 비루스 DNA에 하이브리드 시킴)은 Villarreal과 Berg의 196 Science 183-186(1977) 및 Hayday, et al의 15 Gene 53-65(1981)에 기술되어 있다.

선택유전자의 형질발현은 스포도프테라 프루기페르다와 같은 민감성 숙주곤충 세포를 적합한 생장 배지에서 재조합 벡큘로비루스-선택유전자 형질발현벡터로 감염시킴으로써 수행된다. 이 AcMNPV 형질발현벡터는 복제 및 감염성 비루스 입자로 조립됨으로써 곤충세포 또는 곤충에서 증식된다. 상기 감염성 AcMNPV 형질발현 벡터는 적합한 곤충세포에서 선택유전자를 제조하기 위하여 사용될 수 있고 그러므로써 감염된 세포에서 선택된 DNA서열의 효율적인 형질발현을 촉진한다.

감염시, 선택유전자의 DNA서열에 상보하는 AcMNPV 형질발현 벡터-특정 mRNA가 제조될 수 있을 것이다. 벡터-특정 mRNA는 일반적으로 감염세포내 번역되어 선택유전자에 의해 완전히 또는 부분적으로 암호되는 단백질을 생산하고 몇가지 경우에서 선택유전자 생산물은 글리코실화 작용, 분비, 포스포릴화 작용, 또는 다른 번역후의 변형(Post-translational modification)과 같은 처리 과정을 거친다.

재조합 AcMNPV 형질발현 벡터에 의해 제조되는 유전자 생산물이 선택 단백질만의 아미노산 서열로 구성된 것인지 또는 AcMNPV 폴리헤드린의 아미노 종단부 말단으로부터 유도된 하나이상의 부가적인 아미노산 잔기를 포함하는 하이브리드 단백질인지 또는 선택단백질과 하이브리드 단백질 생산물 둘 모두를 생산하는지는 폴리헤드린 전이벡터가 변형되는 방법에 의존한다. 만약 선택유전자로부터 유도된 단일 번역 시발 시그널(ATG)이 하이브리드 유전자 서열에 존재하고 선택유전자가 약 -75와 +1 위치 사이의 하이브리드 유전자 서열에 존재한다면, β-인터페론과 같은 선택단밸질만이 생산될 것이다(제3도 참조). 대안으로서, 만일 선택유전자가 폴리헤드린 프로모터에 융합되고 +1에서의 폴리헤드린 ATG 시그널과 폴리헤드린 암호서열의 말단과 +3사이에 있는 선택유전자 ATG 시그널인 두개의 번역 시발 부위를 갖는다면, 하이브리드와 선택단백질이 둘 모두 생산될 수 있다. 그러나, 각기 생산된 단백질의 비율은 2차 ATG 시그널의 위치와 선택유전자 서열의 특성에 따라 변화될 수 있다. 대안으로서, 선택적 유전자가 그 자신의 ATG 시발부위 없이 폴리헤드린 프로모터에 융합된다면 선택유전자에 대한 정확한 번역 리딩 프레임을 유지하는 방식으로 합성 ATG 또는 폴리헤드린 ATG번역시발 시그널중 하나를 상기 단백질 암호서열에 융합시킬 필요가 있다. 제조되는 단백질 생산물은 상기 설명한 인자에 의존된다.

[전이벡터와 재조합 형질발현 벡터의 기탁]

재조합 벡큐로비루스 형질발현 벡터 Ac380-IFN-β는 1983년 5월 13일 ATCC(미합중국, 메릴랜드, 록크빌소재)에 기탁되어 수탁번호 ATCC 40071호로 지정되었다. E.colik-12내의 변형된 폴리헤드린 전이벡터 pAc380 플라스미드와 E.coli K-12내의 재조합 전이벡터 pAc380-IFN-β는 농학연구 배양균협회(Agricultural Research Culture Collection), (미합중국, 일리노이, 페오리아소재)에 1983년 5월 13일 기탁되어 수탁번호 NRRL B-15428와 NRRL B-15427로 각각 수리되었다. 변형된 폴리헤드린 전이벡터 pAc373은 농학연구 배양균 협회에 1984년 5월 7일 기탁되어 수탁번호 NRRL B-15778로 구리되었다. 한편, E.coli pAc380과 E.coli pAc378은 1984년 8월 27일에 한국 종균 협회에 수탁번호, KFCC-10106호와 KFCC-10107호로 각각 기탁되어 있다.

[출발물질 및 방법]

[플라스미드 DNA]

하기 실시예에서 사용되는 플라스미드는 E.coli의 pBR325와 pUC8이며, Bethesda Research Lahs, Life Technologies, Inc. (P.O.Box 6009, Geithersburg, Maryland, 20877 ; (800) 638-4045)로부터 입수되었다. (pBR325는 용이하게 입수될 수 있으며, BRL카타로그 번호 5265SA로 지정되어 있고, pUC8은 상업적으로 쉽게 구입될 수 있고 BRL 카타로그 번호 5359SA로 지정되어 있다).

[비루스성 DNA]

실시예에서 비루스 DNA의 원래 공급원으로서 사용되는 AcMNPV 균주 M3와 AcMNPV 균주 E2와 와일드 형태는 G.E.Smith와 M.D.Summers에 의해 89 Virology 517-520(1978)과 G.E.Smith와 M. D Summers에 의해 39 J.Virol 125-137(1981)에서 설명된 기술에 의하여 본 실험실에서 분리하였다.

[IFN-β DNA]

실시예에서 사용된 IFN-β 유전자를 포함하는 DNA 단편은 플라스미드 pBRl3으로부터 분리되었고, 이 플라스미드는 Dr. John Collins (Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung(GBF), Braunschweig Stockhein, West Germany)로부터 입수되었다(인체 IFN-β가 포함된 DNA 분체는 미국 모식균배양 수집소(American Type Culture Collection, 주소 : 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 ; (800) 638-6597)에 수탁번호 31903으로 기탁된 플라스미드로부터 쉽게 입수될 수 있다).

[CAT DNA]

클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT)를 함유하는 DNA 단편은 Dr. Bernard Moss와 Dr. Mark Cochrand에 의해 National Cancer Institue(미합중국, 메릴랜드 20815, 베테스다소재)에서 제공된 플라스미드 pBR328로부터 분산되었다(pBR328은 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)로부터 쉽게 입수될 수 있으며, 수탁번호 37517로 기탁되어 있다).

[IL2 DNA]

인체 인터루이킨-2(IL2)를 암호하는 유전자를 함유하는 DNA 단편은 Dr.Grace Ju와 Dr.Peter Lomedico에 의해 Hoffmann LaRoche Research Center(미합중국, 뉴저지 07110, 너트리 소재)로부터 얻어진 플라스미드 pIL2-2B로부터 분리되었다(인체 IL2를 암호하는 유전자가 포함된 DNA 단편은 예컨대, 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)로부터 쉽게 입수될 수 있는데, 그 수탁번호는 제39405호이다).

[박테리아 세포]

pUC8 플라스미드를 클로닝하기 위해 실시예에서 사용된 E.coli JM83은 Bethesda Research Labs(미합중국, 메릴랜드 20877, 케터츠버그소재 (800) 638-4045)로부터 제공되었다. (E.coli JM83은 쉽게 입수받을 수 있으며, 그 지정된 BRL 카타로그 번호는 824055이다. E.coli JM83은 또한 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)로부터도 쉽게 입수될 수 있고 그 수탁번호는 35607이다).

pBR325 플라스미드를 클로닝하기 위해 실시예에서 사용된 E.coli RRI는 Dr.Savio L.C.WOO, ph.D., Baylor에 의해 College of Medicine, Depratment of Cell Biology(미합중국 텍사스 77090, 휴스턴 소재)로 부터 제공되었다. (E.coli RRI는 미국 모식균 배양 수집소 (ATCC)로부터 쉽게 입수될 수 있고 그 수탁번호는 31343호이다).

[효소]

하기와 제한 엔도뉴클레아제는 Bethesda Research Laboratories(미합중국, 메릴랜드, 게터츠버그 소재)로부터 얻어졌고 공급자의 권고에 따라 사용되었다: EcoR I, Xho I ,Bam I , Pst I , BstEII, EcoRV, Kpn I 과 HindIII. 하기 효소 또한 Bethesda Research Laboratories로부터 얻어졌다: 송아지장의 알카린 포스페타제(CAP), DNA 리가제, Bal 31 엑소 뉴클레아제, S1뉴클레아제 및 T4폴리뉴클레오티드 키나제.

[방법]

실시예에서 설명하는 클로닝 과정에 따라 사용되는 표준방법은 T.Maniatis, E.F.Fritsch와 J.Sambrook의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982에 설명되어 있다. 상기 설명은 하기의 표준방법의 과정을 포함한다 : E.coli 플라스미드로의 클로닝 과정, E.coli 세포의 형질전환, 플라스미드 DNA 정제, DNA의 페놀추출, DNA의 에탄올침전, 아가로즈겔 전기영동, 아가로즈겔로부터의 DNA 단편의 정제, 제한 엔도뉴클레아제와 다른 DNA-변형 효소반응. 모든 경우에, DNA는 페놀 추출로 정제하고 에탕로 침전시킨다.

실시예에서 사용되는 비루스 원액은 10% 송아지 혈청과 TNM-FH 배지 (W.F.Hink, 226 Nature(London)466-467(1970)에 있는 스포도프테라 루르기페르다에서 제조되고 적정된다. 비루스와 세포의 배양방법은 L.E.Volkman과 M.D.Summers의 19 J.Virol., 820-833(1975) 및 L.E Volkman과 M.D.Summers와 C.H.Hsieh와 19 J.Virol 820-832(1976)에서 설명하고있다. 비루스 생장 키네틱은 상기 Volkman, et al에 의해 설명된 바와같이 에스.프루기페르다와 1.5% 아가로즈를 사용하여 결정한다.

[실시예 1]

[폴리헤드린 전이벡터의 제작]

본 발명에 의한 폴리헤드린 전이벡터를 제작하기 위해 AcMNPV 폴리헤드린 유전자를 포함하는 DNA 단편(fragment)을 플라스미드 pUC8의 EcoR I부위로 클로닝 시킨다. 이것은 비루스 DNA의 원출처(original source)로서 M3(G.E.Smith와 M.D.Summers, 89 Viology 517-527 (1978)라 지칭된 AcMNPV의 플래크정제 균주를 사용하여 이루어진다. 비루스로부터 AcMNPV DNA를 추출하고, Smith와 Summers에 의해 서술된 상기 참고 문헌에서 처럼 염화 세슘 밀도구배에서 평형원심분리법로 정제한다. AcMNPV DNA는 EcoR I 제한 엔도뉴클레아제로 완전히 분해된다. 이 결과 얻는 AcMNPV-EcoRI -I 단편은 먼저 pI10을 형성하기 위해 pBR325내로 클로닝된 후 pI8을 형성하기 위해 표준 클로닝방법을 사용하여 pUC8으로 서브클로닝(Subclone)된다(제1도 참조).

재조합 플라스미드 pI8은 3개의 BamH I 인지부위를 갖는다. (제1도 참조): 하나는 폴리헤드린 유전자의 4210위치에서, 하나는 pUC8의 7300위치에서, 하나는 EcoR I - I 단편의 6160위치에 있다. 6160과 7300위치는 pI8로부터 제거되어 전형적인 CAT, IL2 또는 IFN-β 유전자들과 같은 목적 유전자가 폴리헤드린 프로모터(promoter)에 접한 목적 위치(4210 자리)에서 pI8로 용이하게 클로닝될 수 있다. 폴리헤드린 유전자에 위치하지 않는, pI8의 약 7300위치에 있는 pUCB BamH I 제한부위는 다음과 같은 방법으로 제거한다 : pI8 10μg을 Pst I와 Sma I로 분해하여, DNA를 정제하고 S1뉴클레아제 완충액(0.03M 소듐아세테이트, pH 4.4 0.25M NaCl과 0.0045M ZnCl₂)과 500단위의 S1뉴클레아제 1ml 혼합액에 재현탁시킨다. 반응 혼합물을 37℃에서 15분간 배양한 후 DNA를 0.8%가 로즈겔에서 전기 영동시킨다. 고분자량의 선형 DNA를 겔에서 정제하고, E. coli JM83 세포를 앰피실린내성(am^γ) 갈락토시다제 음성(gal^-)으로 형질전환 시키는데 이용한다.

pUC8 클로닝영역내의 Pst I , BamH I ,Sma I 및 EcoR I 부위를 상실한 플라스미드가 분리된다. 이 플라스티드는 pI8SPS라 지칭한다(제1도 참조).

AcMNPV EcoR I - I (pI8SPS의 일부분)의 위치 6160(Smith, G.E., J, M.Vlak와 M.D.Summers, J.Virol. 45-215225)에서의 BamH I 부위는 다음과 같은 방법으로 제거한다 : pI8SPS 10μg을 BamH I 10단위와 함께 50μg 완충용액내에서 혼합하여 37℃에서 항온 배양시켰다. 3, 6, 12, 20, 30분후마다 10μl씩 표본샘플을 채취하고 EDTA를 10mM까지 첨가하여 반응을 종료시킨다. 10μl씩 채취한 표본 샘플을 모아 0.7% 아가로즈에서 전기영동시킨다. 전체 길이의 선형 DNA를 겔에서 분리하고, 상기의 S1뉴클레아제로 처리한 후 T4 DNA 리가젠로 원형화시킨다. JM 83 세포들을 am^γ,gal^-로 형질전환시키고, 재조합 플라스미드는 6160위치에서 BamH I 제한 부위를 상실했음을 확인한다. 이 플라스미드는 폴리헤드린 유전자의 번역시발 부위로부터 +175염기에 위치한 4210자리에 하나의 BamH I 클로닝 부위를 가지며 (제3도 참조)pAc101, 즉 “모(母)”AcMNPV 폴리헤드린 유전자 전이벡터로 명명한다(제1도 참조).

[실시예 2]

[전이벡터의 변형]

선택유전자의 삽입을 위한 폴리헤드린 유전자내에서 적합한 위치를 결정하기 위해 pAc101외에 많은 수의 전이벡터가 제작되었다(제2도 참조). 이 전이벡터들은 하기한 방법에 의해 폴리헤드린 86아미노 말단 잔기와 5′비전사 폴리헤드린 mRNA서열을 암호하는 DNA서열의 일부 또는 전체를 삭제하고 이 삭제 부위에 DNA인식 부위를 가진 올리고뉴클레오티드 합성 DNA 링커(linker)를 삽입시킴으로써 제작된다.

실시예 1에서 설명한 바와 동일한 방법으로, pI10으로부터 얻어진 EcoR I 내지 BamH I 단편 0에서 4210은 pUC8로 서브 클로닝되고, 결과로 얻은 플라스미드를 pB’라 명명한다(제2도 참조). 이 단편은 폴리헤드린 유전자외에 +175까지의 폴리헤드린 유전자와 AcMNPV DNA 서열의 약 4000개의 염기쌍을 함유한다. 위치 4210에서 BamH I 부위 주변에서의 삭제물들은 다음방법으로 pB’에 도입된다(제2도 참조).

: PB’40μg을 HamH I로 분해시킨 후, DNA를 정제하고(순수 분리하고), 0.7% 아가로즈겔상에서 전기영동시킨다. 겔에서 선형 DNA 단편을 추출하고 Bal31엑소뉴클레아제 0.5단위와 함께 100μl 완충용액에서 30℃, 40분간 항온 배양시킨다. 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40분 간격으로 10μl씩을 취하여 표본 샘플을 만들고 각 표본샘플에 0.25M EDTA 10μl를 가함으로써 반응을 종료시킨다. 각 표본샘플들을 모아서 DNA를 순수분리한다. DNA의 말단은 E.coli DNA 폴리머라제 4단위(클레노우단편)와 함께 100μl의 완충용액에서 23℃, 30분간 배양하여 복귀된다. DNA가 순수분리되고 100μl의 반응 혼합액에서 T4 DNA리가제 20단위에 인산화된 BamH I링커 (5′-pCGGATCCG-3′)1μg을 혼합한다. 상온에서 2시간 항온 배양시킨 후 DNA를 순수 분리한다.

다음에, DNA입자를 100μl의 완충액과 BamH I20단위의 혼합액에 재현탁시키고 37℃에서 4시간 동안 분해시킨다. 분해된 DNA는 0.7% 아가로즈에서 전기영동시키고, 800 염기쌍까지의 삭제부분을 가진 pB’ 절단(불완전한)플라스미드를 겔로 부터 정제한다. DNA는 T4 DNA 리가제로 원형화시키고 JM83세포들을 am^γ, gal^-로 형질전환시키는데 이용한다. 산출된 클론들은 BamH I 인지부위의 위치에 의거하여 pB’Bal 1, 2, 3등으로 명명되는 변이 플라스미드의 “라이브러리”를 구성한다. 몇개의 pB’Bal 삭제변이 플라스미드들을 선택하고, 각각으로부터 XhoI(1900)에서 BamHI 링커 (4000에서 4210사이의 위치에서)까지의 단편을 아가로즈겔에서 순수 분리한다(A 단편)(제2도). XhOI(1900)에서 BamHI(4210)까지의 단편을 pAc101에서 제거하고, 나머지 서열을 아가로즈겔에서 순수분리했다(B단편) (제2도). A 단편 각각의 0.1μg을 B단편 0.1μg와 혼합하여 T4 DNA리가제 1단위와 함께 완충용액 20μl에서 배양시켜 결합시킨뒤 JM83세포들을 am^γ, gal^-로 형질전환시키는데 이용한다. 산출된 플라스미드는 변형된 전이벡터들로서 pB’BaL 11로부터 유도된 것은 pAc311, pB’Bal 60에서 유도된 것은 pAc 360등으로 명명하였다. 이와 같은 방법으로, 일단의 “변형된” 전이벡터들이 폴리헤드린 유전자의 +175와 -100사이의 인치에서 BamHI 클로닝부위 (cloning site)를 갖는 대표격으로 제작되었다. 제3도에서 모전이 벡터(parent transfer vector)인 pAc101에서의 BamHI 인식 부위 위치 4개의 변형된 전이 벡터인 pAc 380, pAc 373, pAc 311 및 pAc 360에서의 BamHI 인지부위 위치를 나타내었다.

[실시예 3]

폴리헤드린-IFN-β 유전자를 포함하는 재조합 전이벡터의 제작]

실시예 1 또는 2의 방법에 따라 제조된 어떠한 전이 벡터라도 사용된 특정 변형 전이벡터에 따라, 목적 유전자를 다양한 위치에서 폴리헤드린 유전자에 연결시킨 재조합 전이벡터의 제작에 이용될 수 있다. pAc380-IFN-β로 명명된 플라스미드를 제작하기 위해 인체의 β-인터페론 합성을 암호하는 IFN-β 유전자를 상술한 표준클로닝 기술을 사용하여 단일 BamHI 클로닝 부위에서 변형 전이벡터인 pAc380에 삽입시키는 과정을 제4도에서 도식적으로 나타내었다.

IFN-β 유전자는 인체의 IFN-β(pBR13으로 명명.참조, H.Hauser, et. al, 297 Nature(London) 650-654(1982)와 G. Gross et al., 9 Nucleic Acids Res. 2495-2507 1981)의 게놈성 클론으로 얻어지고, IFN-β에 대한 전체 단백질 암호서열, ATG 번역출발시그널 앞의 세개의 첨가적 염기, 및 폴리아데닐화를 위한 시그널이 포함된 미번역 3′서열모두를 함유하는 0.767킬로염기 HincII 단편으로서 규명될 수 있다. IFN-β에 대한 뉴클레오티드 서열과 다양한 전사 및 번역 시그널의 위치는 R. Dorynck등에 의해 285 Nature(London) 542-547(1980) : G. Gross, 등에 의해 9 Nucl. Acids., Res 2495-2507(1981) ; 과 Sohno T.Taniguchi, 78 Proc. Natl Acad Sci. USA 3505-3509(1981)에 의해 설명되고 있다.

IFN-β 유전자를 포함하는 HincII DNA 단편은 IFN-β 유전자 단편상의 합성 올리고뉴클레오티드 링커를 이용하여 pAc380의 유용한 BamHI 제한 부위내로 삽입되며, 이러한 삽입은 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터에 인접한 곳에서 이루어지며 폴리헤드린 유전자에서처럼 5′에서 3′로의 배향을 지닌다. 이와 같은 동일한 방법으로 IFN-β 유전자는 각각 pAc311-IFN-β, pAc360-IFN-β, pAc373-IFN-β, pAc101-IFN-β로 명명되는 재조합전이 벡터를 제작하기 위해 모전이벡터인 pAc101과 나머지 변형 전이벡터인 pAc311, pAc360, pAc373으로 클로닝되었다. 잠재적으로 이 유전자 또는 어떤 다른 선택 유전자는 BamHI인지 부위를 갖는 전이벡터, 또는 전이벡터내의 어느 위치에 삽입된 그외의 적절한 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위내로 클로닝될 수 있다. 적절한 억제 엔도뉴를레아제 클로닝 부위가 실시예 1에서 개략한바와 같이 플라스미드내로 도입될 수 있는 AcMNPV 게놈 분체의 어느 위치에서도 유발될 수 있으므로 BamHI인지 부위를 삽입시키기 위해 폴리헤드린 구조서열의 일부 또는 전체를 삭제할 필요는 없다.

[실시예 4]

[폴리헤드린-IFN-β 유전자의 AcMNPV 게놈 에로의 전이]

재조합 벡큘로비루스 형질발현 벡터를 제조하기 위해 IFN-β유전자를 AcMNPV 게놈내로 전이시키기 위해서 실시예 (3)의 방법에 의해 제조된 재조합 전이벡터중 어떤 것이든 이용할 수 있다. 전이는 에스. 프루기페르다와 같은 영향을 받기 쉬운 곤충 숙주세포와 Ca⁺⁺존재하에서 트랜스렉숀시켜 실시한다.

F. L. Graham과 A. J. Van Der Eb에 의해 52 Virology 456-467(1973)에 기술한 방법을 변형하여 다음과 같이 이용한다: 재조합 전이 벡터 DNA, 특히 재조합 전이벡터 pAc380-IFN-DNA 1 내지 10μg을 AcMNPV에서 추출하여 순수 분리한 DNA(1μg)와 혼합하여, 1ml당 15μg의 담체 송아지 흉선 DNA를 갖고 있는 1-HEPRE(N-2-하이드록시에틸피페라진-N′-2-에탄술폰산) -완충염수(pH 7.05)로 950μl까지 만든다. 혼합물이 Vortex 혼합기에서 교반되는 동안 2.5M CaCl₂50ml를 적가하여 상온에서 30분동안 침전을 형성시킨다. 침전된 DNA 1ml를 이 경우 60mm 배양접시에 있는 2ml 배지내에 있는 영향을 받기쉬운 곤충 숙주 세포인 에스. 프루기 페르다에 첨가한다. 4시간 후에 배지와 함께 단일 세포층을 씻어내고 3일간 10% 송아지 혈청 배지 2ml에서 배양한다. 산출된 자손비루스(progeny virus)는 재조합 및 비재조합 AcMNPV 비루스들의 혼합물을 형성한다.

[실시예 5]

[재조합 AcMNPV형질발현 벡터의 선택]

실시예 4에서 설명한 결과로 얻은 비재조합 및 재조한 벡큘로 비루스들의 혼합물에서 AcMNPV 재조합 형질발현 벡터를 분리하는 것이 필요하다. 폴리헤드린 구조 유전자의 전체 또는 일부를 삭제하는 이들 재조합들의 분리 방법은 (1) 어떠한 폴리헤드린도 이들 비루스에 의해 생산되지 않으며 (2) 폴리헤드린 코우트(coat)가 결핍된 비교합 형태는 곤충세포 배양액에서 생존하고 감염성이 있다는 사실을 이용한다.

폴리헤드린 구조 유전자 전부 또는 일부가 삭제된 재조합 AcMNPV 비루스에 있어서, 재조합 전이 벡터인 pAc101-IFN-β, pAC311-INF-β, pAc360-IFN-β, pAc373-IFN-β 및 pAc380-IFN-β로 트란스펙숀하여 얻어진 재조합 AcMNPV 비루스는 다음과 같은 방법으로 분리한다.

트란스펙숀 3일후 배지에 존재하는 세포외 비루스는 L. E. Volkman. M. D. Summers C. H. Hseieh에 의해 19 J. Virol 820-832(1976)에 서술된 표준 AcMNPV 폴리헤드린 플래크 검정법(assay)에 이용된다. 나타난 플래크들은 비루스 교합체를 생산하는 비재조합 AcMNPV로 감염된 세포들로부터 또는 비루스 교합체를 생산하지 않는 재조합 AcMNPV 비루스로 감염된 세포들로부터 얻어진 것이다. 후자 형태의 플래크(0^-플래크)는 저배율 쌍현미경으로 관찰하면 그들의 성상에 있어서 전자(0^-플래크)와 구분된다. 전환상 현미경으로 0^-플래크들을 표시하고 검사하며, 이때 개개의 비루스 교합체가 존재한다면 감염된 세포의 핵내에서 관찰될 수 있다.

0^-플래크에 있는 비루스를 플래크 정제시키고, 재조합 AcMNPV 벡터가 EcoRI-I의 적당한 위치에 이종 유전자의 삽입을 소유함을 확인하기 위해서 적절한 제한효소로 그 DNA를 분석했다. 비루스 게놈에서의 어떠한 변화도 검출되지 않았다. 표준 방법을 이용하여 민감성의 곤충세포를 감염시켜 다량의 목적 재조합 비루스를 얻는다.

[실시예 6]

[AcMNPV 재조합 형질발현 벡터를 이용한 β-인터페론의 제조]

목적 유전자 생산물을 제조하기 위해 민감성 숙주 곤충세포를 재조합 벡큘로비루스로 감염시켜야 한다.

다음과정은 재조합 전이벡터인 pAc101-IFN-β, pAc311-β, pAc360-INF-β, pAc373-IFN-β 및 pAc380-IFN-β와 재조합하여 전형적인 AcMNPV형질발현 벡터를 제조하는데 이용된다(제5도 참조).

우선 현탁 배양액이나 단일층에서 민감성 에스. 프루기페르다 숙주 세포를 1 내지 5×10⁶세포/ml의 농도로 생육한다(최적 형질발현을 위한 세포농도는 각각의 다른 AcMNPV 형질발현벡터에 따라 변화될 수 있다). 생육 배지를 제거하고 23℃에서 약 1시간 동안 세포당 pAc380-IFN-β(제5도)와 같은 재조합비루스 단위를 형성하는 0.1에서 100(최적농도는 가변성이다)까지의 플래크를 함유하는 비지로 대체한다. 접종원은 세포들에 남겨지거나, 제거되거나 또는 적정량의 새 배지로 대체된다.

클론된 IFN-β 유전자로부터의 얻어진 단백질은 감염후 약 12시간으로부터 3일까지의 Ac-380-IFN-β 형질발현벡터로 감염된 에스.프루기페르다 세포내에서 생성된다. 비루스 단백질합성, 비루스 조립 및 세포용해를 포함한 전체 감염 과정은 약 72시간에 완성된다. 감염후 50과 60시간 사이의 단백질 합성에 현저한 감소가 있고, 세포용해는 감염후 약 50시간에 처음 검출된다. IFN-β 유전자의 형질발현에 대한 키네틱은 숙주 세포와 유전자가 폴리헤드린 유전자내로 클로닝되는 위치에 따라 변화한다.

표(1)에 각각의 재조합 비루스에 대한 IFN-β형질발현의 속도를 용약하였다. 상당 농도의 인터페론이 각각의 형질발현 벡터로 감염된 세포내에서 감염후 48시간까지 검출된다. 검출된 형질발현 벡터들 가운데 Ac373-IFN-β와 Ac380-IFN-β가 인터페론 활성의 최고역가를 나타낸다(표 1).

인터페론 활성의 세포내 농도가 또한 측정되었고 이는 표(1)에 나타나 있다. 감염후 48시간에 Ac373-IFN-β와 Ac380-IFN-β 감염된 세포내부에 전체 인터페론 활성의 5%이하가 남아 있는데, 이는 IFN-β 분비시그널이 인지되고 단백질이 감염기간 동안 배지에 효과적으로 방출됨을 입증하고 있다. Ac373-IFN-β와 Ac380-IFN-β 감염된 세포로부터의 배지는 감염후 12시간에 약 10,000IU/ml의 인터페론을 갖고 있으며, 감염후 42시간까지는 거의 최대치인 5×10⁶IU/ml까지 증가한다.

[표 1]

다양한 형질발현 벡터로 감염된 에스. 프루기페르다 세포내에서 인터페론 형질발현 키네틱을 조사했다. 이들 실험 결과는 다음과 같다.

AcMNPV 감염세포에서 폴리헤드린의 합성은 유사한 일시적인 형질발현방식을 따르는 것으로 알려져 있다. Ac360-IFN-β에서 인터페론 생산이 적고, Ac311-IFN-β 비루스가 감염된 세포내에서도 인터페론 생산이 더욱 적기는 하나 95%이상의 활성이 배지내에 존재한다(표 1). 비교적 낮은 농도의 인터페론이 Ac101-IFN-β 감염 세포내에 검출되며, 그들 대부분이 세포내에 있다(표 1).

재조합 비루스 감염 세포의 역가는 배지 1밀리 리터당 최대 3 내지 8×10⁸플래크형성단위에 이르는데 이것은 AcMNPV 감염세포의 전형적인 것이다. 그러므로 IFN-β 유전자를 폴리헤드린 유전자로 삽입시키는 것은 비루스의 복재에 어떠한 중요한 영향도 미치지 않는 것으로 보인다. 이 실험을 위해, 2×10⁶의 에스. 프루기페르다 세포를 인체 인터페론의 국제표준량인 5×10³IU/ml의 인터페론, 또는 Ac380-INF-β 감염된 세포배지내에 생성된 5×10⁶lU/ml정도의 인터페론으로 12시간 동안 처리한다. 처리된 세포들을 AcMNPV 또는 Ac380-IFN-β 100플래크 형성 단위로 감염시킨다. 인터페론에 세포를 노출시키는 것은 발생된 비루스 플래크의 수효에 어떠한 측정할만한 효과도 미치지 않는다.

Vesicular Stomatitis 비루스 공격을 받은 인체의 양막 WISH 세포들에서의 비루스 플래크-감소 분석법이 인터페론 활성분석에 이용된다. 비루스 입자를 원심분리법으로 제거한다면, 배지내에서 AcMNPV 감염세포로부터 어떠한 인터페론 활성도 측정되지 않는다. 그러나, 만일 AcMNPV 비루스를 함유하는 배지가 인터페론 분석중에 사용된다면 인터페론 1000에서 3000국제기준(reference)단위 (lU)/ml가 생산되는데 이는 AcMNPV 비루스입자들이 WISH 세포들내에 내인성 인터페론을 명백하게 유도시킴을 나타내는 것이다. 많은 종의 엔벨로프된 비루스가 인체세포에서 인터페론 생산을 유도시키는 것으로 알려져 있기 때문에 이러한 결과들이 예견되었다. 이러한 효과를 제거하기 위해, 하기의 모든 표본들은 실험전에 원심 분리된다.

Ac380-IFN-β로 감염된 에스. 프루기페르다 세포들에서 IFN-β의 형질발현에 배지[참조. W. F. Hink, 266, Nature(London) 466-467(1970)내에 혈청알부민(6mg/ml)과 송아지 혈청(10%)이 요구되는지의 여부를 결정하기 위해 실험이 실행되었다. 감염후 8시간에, 배지를 0에서 10%의 송아지 혈청을 함유하는 그레이스(Grace)의 배지(혈청알부민을 함유하지 않음, 참조 T. C. C Grace, 195 Nature(London) 788-789(1962)로 대체시킨다. 감염후 48시간에 각각의 변형된 배지에 대해 인터페론 활성을 분석한다. 혈청이 없다면, 인터페론 활성에 약 10배의 감소가 있었다. 0.5% 혈청첨가시, 10% 헐청을 함유하는 대조군에서와 같은 농도의 인터페론 활성이 나타났다.

Ac380-IFN-β 감염세포내의 IFN-β의 특이활성은 0.5% 혈청을 함유하는 그레이스의 배지에서 생성되었을 때는 단백질 1mg당 약 45×10⁶IU이었다. 정제된 β-인터페론의 활성이 2×10⁸IU/ml[참조, E. Knight Jr. 73 Natl. Acad. Sci, U.S.A.520-523(1976)]라고 가정하면 β-인터페론은 배지내에서 전체 단백질의 약 1%에 달할 것이다.

Ac373-IFN-β와 Ac380-IFN-β 감염세포들의 배지에서 측정된 인터페론 활성을 다시 분석하면 17,000(17K)과 20.5K의 분자량을 갖는 두개의 폴리펩티드가 나타난다.

비글리코실레이트된 것과 글리코실레이트된 인체의 IFN-β 단백질의 크기가 각각 17K와 20.5K의 폴리펩티드에 대응될 수 있음이 보고되어 있다. 감염후 30시간에 17K 폴리펩티드가 Ac360-IFN-β 감염세포에서 생성진행중이었고, 감염후 48시간에 17K와 20.5K 폴리펩티드 모두가 검출되었다. 17K 폴리펩티드만이 감염후 30과 48시간에 Ac311-IFN-β 감염세포에서 검출될 수 있었다. 충분하게 생성된 23.5K 단백질이 Ac360-IFN-β 감염세포에서 관찰되었다. 이 크기는 21개의 아미노산 시그널 펩티드와 폴리헤드린 유전자 및 BamHI 링커 (연결자) 서열의 첫번째 10개의 코돈으로부터 유도된 14개의 아미노산을 함유하며 (-13-) 전체 인터페론 단백질을 구성하는 하이브리드 단백질의 크기로 예상된다.

Ac380-IFN-β와 이보다 더욱 작은 규모의 Ac360-INF-β 감염세포에서 형성된 17K와 20.5K 단백질은 인체의 IFN-β 단일 클론의 항체와 반응했다(IFN-β 단일클론 항체는 P.W Trown과 Hoffmann-La Roche Inc.에 의해 제공되었다). 이 항체는 17K 단백질과의 반응에 비해 20.5K 단백질과의 반응이 현저히 감소하는 경향이 있다. 이것은 17K가 20.5K보다 세포내에 더 높은 수준으로 축적하는 데에 부분적으로 기인한다. 또한, 항체는 20.5K 폴리펩티드의 글리코실레이션과 같은 것에 의해 부분적으로 가려질 수 있는 17K 폴리펩티드의 에피토우프에 반응할 수 있다.

추정되고 있는 하이브리드 23.5K와 32K 단백질 또한 IFN-β 항체와 반응했다. 폴리헤드린에 대한 폴리클롤날 항체는 하이브리드 단백질의 N-말단 끝부분에 있는 DNA 서열로부터 예상되는 32K 단백질의 57개의 아미노산과 23.5K 단백질의 10개의 아미노산을 인지하였다.

20.5K IFN-β가 글리코실레이션 되었음을 입증하기 위해 Ac380-IFN-β 감염세포를 감염말기에 [3H]만노오스로 라벨하였다. 20.5K IFN-β과 그외의 3개 단백질들은 주로 Ac380-IFN-β 감염세포에서 라벨된 만노오스함유 글리코프로테인이었다.

[실시예 7]

[클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자와 AcMNPV 재조합 전이벡터의 제작]

E. coli 전위성 요소 Tn9는 클로랄페니콜 아세틸트랜스퍼라제 효소(CAT)의 유전자를 함유하는데, 이것은 항생 클로람페니콜에 대한 내성을 부여한다. 전핵 벡터에서 CAT 형질발현은 동물세포내의 프로모터의 형질발현을 측정하는 수월한 방법으로서 공지되어 있다(참조. Mackett, M., G. Smith와 B. Moss 1984, J. virol 49 : 857-864 및 그안의 참고 논문들).

벡클로비루스 벡터에서 이종 유전자의 생산을 최적화하기 위해 고안된 실험에서 AcMNPV-CAT 형질발현 벡터는 유용하다.

CAT-암호 서열을 함유하는 770염기쌍의 TaqI DNA 단편은 pBR3298로부터 분리되고 pUC7의 AccI 부위로 클로닝된다. CAT-암호서열은 BamHI로 절단되어 pAc373내의 BamHI부위로 삽입된다. 얻어진 플라스미드 전이벡터는 pAc373-CAT로 지칭한다.

[실시예 8]

[인체인터루이킨-2-유전자와 AcMNPV 재조합 전이벡터의 제작]

인체 인터루이킨-2(IL2)는 유사분열물질의 항원에 의해 자극되는 인체 임파구에서 소량 생산된다. IL-2는 원래 배향체내의 T임파구세포의 장기간의 생장유지를 가능하게 하는 인자로서 설명되었다. (Morgan, D. A Ruscetti, F. W.와 Callo, R., Science 193 : 1007-1008(1976)). 이것은 면역반응의 자극과 유지에서 중추적 역할을 나타내며 어떤 인체 질병에서 관련되는 것으로 암시되어 왔다(Altman, A., Theofilopoulos, A.N., Weiner, R., Katz D. H.와 Dixon, F. j., J. Expl. Med. 154 : 1403-1417(1981)). IL-2의 대량 생산을 위한 AcMNPV형질발현 벡터의 사용은 임상진단과 인체면역 시스템의 치료학적 조작을 크게 촉진시킨다. 최근, 여러 실험실이 IL2의 유전자 분리와 플라스미드 벡터를 사용하여 박테리아 세포내에서 생물학적으로 활성이 있는 IL-2의 생산을 보고하고 있다(Rosenberg. et al. Scence 223 : 1412-1415(1984)와 그 참고문헌 참조).

IL2 암호 서열을 포함하는 1000염기쌍의 BamHI(단편)은 pIL2-2B로부터 분리되고 pAc373과 pAc380에서 BamHI 부위내로 삽입된다. 생산된 플라스미드 전이 벡터는 pAc 313-IL2와 pAc380-IL2로 지칭된다.

[실시예 9]

[폴리헤드린-IL2 및 CAT 유전자의 AcMNPV게놈으로의 전이]

폴리해드린-IL2와 CAT 유전자의 AcMNPV 게놈으로의 전이와 재조합 AcMNPV형질발현 벡터의 선택은 실시예 4에서 설명한 것과 같이 수행된다. pAc 373-IL2, pAc 380-IL2와 pAc 373-CAT로부터 제조되는 AcMNPV 형질발현 벡터는 Ac373-IL2, Ac380-IL2 및 Ac373-CAT로 각각 지칭한다.

[실시예 10]

[AcMNPV형질발현 벡터를 사용하여 IL2를 생산하는 방법]

에스. 프루기페르다 세포는 Ac380-IFN-β에 대해 설명한 바와 같이 Ac373-IL2 또는 Ac380-IL2 형질발현 벡터로 감염된다. 감염 48시간 후, 그 배지와 감염세포를 수거하고 인터루이킨의 생물학적 활성수준을 Gillis, et al. J. Immunol, 120 : 3027-2032(1978)에 의해 설명된 분석법을 사용하여 측정했다. 상기 분석법을 사용하여 IL2의 특정활성도가 단백질 1밀리그람당 1×10⁸단위로 측정되었다. 두가지 형질발현 벡터 모두가 높은 수준의 인터루이킨 활성을 생성하지만 Ac373-IL2가 Ac380-IL2보다 약 4배의 인터루이킨을 더 생성한다(표 2참조) 약 80%의 인터루이킨 활성이 배지에 존재하는데, 이는 감염시에 세포로부터 효과적으로 이 단백질에 분비되는 것을 증명하는 것이다. Dr. Grace JU, Hoffmann-La Roche Research Center에 의해 수행된 분리실험에서 에스. 프루기페르다 세포는 Ac373-IL2와 Ac380-IL2로 감염되었으며, 인터루이킨 활성수준은 감염된 후 24시간, 48시간, 72시간째에 배지에서 측정된다. 신선한 배지가 24시간과 48시간째에 적용된다. 실제로 모든 활성은 감염된지 0 내지 24시간과 24 내지 48시간사이에서 생성된다(표 2참조). IL-2의 특정활성으로부터 판단해보면, 최소한 IL-2 단백질 Img이 생산되는 것으로 계산되며 AcMNPV 감염세포 1리터당 상기 만큼이 분비된다.

Ac373-IL2와 Ac380-IL2감염세포에서 합성된 단백질의 분석이 실시된다. 상기 AcMNPV형질발현 벡터에 의하여 풍부하게 제조되는 두개의 단백질은 AcMNPV 감염세포내에서는 제조되지 않는다. 상기의 새로운 단백질은 약 15.5K와 16K 달론크기이다. 이것은 DNA서열로부터 예견되는 인터루이킨의 크기가 약 15.5K이라는 것과 일치한다(단백질의 아미노-말단에서 20개의 아미노산 시그널 펩티드가 제거된 것으로 가정 할때).

^aTexas A M University에서 제조됨.

^bHoffmann-La Roche Research Center에서 제조됨.

상기 표(2)는 AcMNPV형질발현 벡터로 감염된 S. frugiperda 세포중에서 인터루이킨-2 활성도 생산을 기록한 것이다. 감염 번호 제1호에서 배지샘플과 감염된 세포를 감염한지 48시간째에 수거하였다. 감염 번호 제2에서 배지 2개의 샘플을 감염한지 24시간, 48시간 및 78시간째에 수거하고 신선한 배지를 감염한지 24시간 및 48시간째에 적용하였다.

[실시예 11]

[AcMNPV형질발현 벡터를 사용한 CAT의 생산]

Ac380-IFN-β에서 설명한 것과 같이 에스. 프루기페르다 세포를 Ac373-CAT로 감염시키고 감염 24시간 후 CAT 효소 활성을 Mackett, et al., IBID.에 의해 설명되는 것과 같이 세포와 배지에서 측정했다. 비감염세포 또는 AcMNPV로 감염된 세포내에서는 CAT 효소 활성을 검출할 수 없었다; 그러나 그 세포와 배지 물 모두에서 Ac373-CAT에 의해 고수준의 활성이 생성되었다.

Ac373-CAT 감염세포에서 합성된 단백질의 분석이 실시된다. AcMNPV 감염세포에서 만들어지지 않는 27K 달톤의 새로운 단백질에 상기 형질발현 벡터에 의해 제조된다. CAT의 크기는 DNA 서열로부터 약 27K로 예견된다. 풍부한 양의 27K 단백질이 감염세포와 배지 둘 모두에 존재한다. 폴리아크릴아미드 겔상에서 관찰되는 단백질의 양으로부터 약 40mg의 CAT 효소가 Ac373-CAT 감염세포 1리터에 대해 제조되는 것으로 평가되었다.

상기 설명으로부터 설명된 본 발명과 그 장점 및 가능성이 인지되었으며, 이것은 본 발명의 단지 몇가지 바람직한 예를 설명한 것에 불과하다. 사용된 물질, 방법과 물질의 양에서 많은 변화가 본 발명의 범위와 주제 또는 본 발명의 장점에서 벗어나지 않는 상태에서 이루어질 수 있다. 또한 본 발명이 어떠한 종류의 선택 유전자라도 벡큘로비루스 게놈내의 여러위치중 어디에든지 삽입시키기 위해 사용할 수 있다는 유리한 용도를 가지는 것으로 이해할 수 있을 것이다.

예컨대, 폴리헤드린 유전자의 전부 또는 일부가 삭제되지 않은 재조합 AcMNPV 비루스의 분리 방법은 본 발명을 여러가지 방법에서 사용할 수 있도록 한다. 이러한 용도는 AcMNPV 비루스의 교합상태의 폴리헤드린 피복이 외적 영향에 대단히 저항성이 있다는 점을 이용한 것이다.

예컨대, 실시예 3에서 설명된 것과 같이, 선택유전자는 폴리헤드린 유전자외의 위치에서 비루스 게놈내로 클로닝될 수 있다. 특히 선택유전자의 형질발현이 더 높은 수준으로 형질발현되도록 하기 위해 10K 프로모터에 의해 조절될 수 있도록 하는 위치에 크로닝시킬 수 있다. 재조합 AcMNPV 비루스는 안정한 형질발현 벡터로 분리될 수 있고 이용될 수 있다.

상기의 안정한 형질발현 벡터는 적절한 숙주 세포 및 충분한 배지와 함께 재조합 AcMNPV 비루스를 전이시킬 수 있는 안정한 형태로 사용할 수 있다.

형질발현 벡터는 특정 숙주 곤충 또는 광범위한 민감한 숙주 곤충에 독성이 있는 단백질을 생산하는 유전자를 선택하고 그 유전자를 형질발현 벡터내로 클로닝 시킴으로써 해충 구제 시스템에 사용될 수 있다(상기 가능성은 L. K. Miller, et al., 219 Science 715-721(1983)에 논의되어 있다).

재조합 형질발현 벡터는 곤충이 해충인 경우 식물 또는 동물에 적용할 수 있는데, 상술된 바와 같이 해충인 곤충에 의해 분해될때 교합체가 장의 내강에서 분리되어 재조합 비루스가 장벽 세포를 공격하고 복제가 시작되게 된다.

복제중에, 해충 곤충에 독성이 있는 단백질의 유전자가 형질발현되고 곤충이 와일드형태의 AcMNPV 비루스를 섭취하였을때보다 더 짧은 시간내에 곤충의 불능 또는 사멸이 초래되고 그 경우, 곤충은 비루스 감염 정도에 따라 시간은 달라지나 결국 용해된다. 본 실험실과 다른 실험실에서의 실험으로부터 10K 단백질의 형질발현이 감염후 24정도로 바르게 유도되고 약 48시간에서 고수준으로 유도되는 것으로 나타났다. 결과적으로, 10K 프로모터의 조절하에서 AcMNPV 게놈내로 클로닝되는 필요한 곤충독소의 암호 유전자는 상기 시간예정에 따라 형질발현될 것이다. 곤충의 사멸 또는 불능은 상기 선택 유전자의 형질발현 개시후에 곧 기대될 수 있어 와일드 형태의 벡큘로비루스로 곤충을 감염시킨 것과 비교할 때 해충이 침해한 식물과 동물에 대한 피해정도가 감소되게 된다.

유전자는 폴리헤드린 피복이 곤충내장의 알카리성 상태에 의해 분해될때 독성 유전자 생성물이 방출되는 방식으로 폴리헤드린 구조 서열로 융합되어 벡큘로비루스 게놈내로 삽입될 수 있다. 본 발명의 이러한 실행은 곤충의 장세포에서 재조합 유전자가 형질발현되지 않고 곤충에 해독을 유발시킨다.

또한, 상기 실시예에 측정된 유전자 형질발현의 수준보다 더욱 고수준의 유전자 형질발현이 본 발명을 사용하여 가능할 수 있다. 예컨대, IFN-유전자(또는 다른 유전자)가 1회 이상 벡큘로비루스 게놈내로 클로닝될 수 있다. 특히, 형질발현이 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 있도록 복사물이 삽입될 수 있으며, 다른 복사물은 형질발현이 10K 프로모터의 조절하에 있도록 삽입될 수 있고, 그후 여러가지 복사물이 많은 다른제한 부위에서 삽입될 수 있으며 각각의 복사체는 자신의 프로모터 또는 벡큘로비루스에 의해 프로모터로 인식되는 다른 DNA 서열을 포함한다. 민감성 곤충세포내로 감염될때, 생산된 인터페론(또는 다른 폴리펩티드)의 양은 측정된 수준보다 대단히 증가할 수 있다.

본 명세서에 기술된 본 발명의 변형이 본 기술에 숙련된 자에 의해 실시될 수 있으며, 그같은 변형법도 첨부된 특허청구의 범위에 의해 정의된 바대로 본 발명의 범주에 속한다.

Claims

숙주 곤충 세포내에서 선택유전자 또는 그것의 일부분을 형질발현할 수 있는 재조합 벡큘로비루스 형질발현벡터를 제조함에 있어서, (a) 벡큘로비루스 유전자 또는 그 부분을 함유하는 DNA 단편을 제조하기 위하여 벡큘로비루스 DNA를 절단하고; (b) 상기의 선택유전자 또는 그 부분이 상기 벡큘로비루스 유전자의 프로모터 또는 그 자신의 프로모터의 전사조절하에 있도록 상기 DNA 단편을 클로닝운반자내로 삽입 시킨후 최소한 하나의 선택유전자 또는 그 부분을 변형된 클로닝 운반자내로 삽입시겨 재조합 전이벡터를 제조하고; (c) 재조합을 일으키도록 상기 재조합 전이벡터를 벡큘로비루스 DNA와 접촉시켜 재조합과 비재조합의 벡큘로비루스 혼합물을 얻은후 (d) 이 혼합물로부터 재조합 벡큘로비루스 형질발현벡터를 분리시킴을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 선택유전자 또는 그 부분이 최소한 일부분의 벡큘로비루스 유전자를 대신하여 클로닝 운반자내로 삽입되는 방법.
제1항에 있어서, 벡큘로비루스 유전자가 폴리헤드린 프로모터를 포함하는 폴리헤드린 유전자 또는 그 일부분인 방법.
제3항에 있어서, 선택유전자 또는 그 부분이 폴리헤드린 합성을 암호하는 DNA 서열의 최소한 일부분을 대신하여 클로닝 운반자내로 삽입되는 방법.
제1항에 있어서, 벡큘로비루스가 10K 프로모터를 포함하는 10K 유전자 또는 그것의 일부분인 방법.
제1항에 있어서, 벡큘로비루스가 오토그래파 캘리포리카(Autographa Californica), 트리코프루시아 니(Trichoplusia ni), 라치프루시아 오우(Rahiplusia ou), 또는 갈레리아 멜로네라(Galleraia mellonelkla) 인 방법.
제1항에 있어서, 벡큘로비루스가 오토그래파 캘리포니카(Autographa Californica)인 방법.
재조합 벡큘로비루스 형질발현 벡터가 최소한 하나의 선택 포함하는 재조합 벡큘로비루스 게놈이며, 그 선택 유전자 또는 그 부분은 벡큘로비루스 프로모터 또는 그 자신의 프로모터의 전사 조절하에 존재하는 재조합 벡큘로비루스 형질발현 벡터로 민감성숙주 곤충 세포를 감염시키는 것을 특징으로 하는 선택 폴리펩티드의 합성 방법.
제8항에 있어서, 벡큘로비루스 프로모터가 폴리헤드린 프로모터인 방법.
제8항에 있어서, 벡큘로비루스 프로모터가 10K 프로모터인 방법.