KR900005960B1 - B형 간염 바이러스 진단방법 - Google Patents
B형 간염 바이러스 진단방법 Download PDFInfo
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제1도는 유전자 재조합기술에 의해 B형 간염 바이러스의 표면항원, 아종 adw 및 ayw를 발현하는 포유동물세포(Chinese Hamster Ovary ; 이하 CHO 세포라함)로부터 순수 정제된 표면항원의 15% 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 전기영동법(15% sodium dodecyl sulfate polyacryl amide gel electrophoresis, 15% SDSPAGE) 실험결과 및 항체 항원의 결합특이성을 분석한 웨스턴 분석(Western analysis) 결과를 나타낸 도면으로서, Lane M는 표준 단백질 분자량이고, Lane 1은 NIH의 (National Institute of Health) 인체 B형 간염 바이러스 표면항원(subtype adw)을 실버(silver) 염색으로 발색한 것이고, Lane 2은 NIH의 인체 B형 간염 바이러스 표면항원(subtype adw)을 실버염색 방법으로 발색한 것이고, Lane 3은 CHO 세포로 부터 분리정제된 표면항원(adw)이고, Lane 4은 CHO 세포로 부터 분리정제된 표면항원(adw)이고, Lane5 및 6은 전기 영동 분석후 단백질을 니트로 셀루로우즈 페이퍼에 흡착시킨 후 단백질을 니트로 셀루로우즈 페이퍼에 흡착시킨후 표면항원에 대한 단일세포군항체(KIE9-adw) 및 염소-안티-쥐-서양고추냉이 페록시다제(Goat-Anti-Mouse IgG-Horse radish peroxidase)에 의해 웨스턴(Western) 분석결과이고, Lane7 및 8은 표면항원에 대한 다세포군 항체(Guineapig-D2-Horseradish peroxidase)에 의한 웨스턴 분석결과도이다.
제2a도는 4-(N-말레이미드메틸) 싸이클로 헥산-1-카르복실산-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(SMCC)와 N-숙신이미딜-3-(2-피리디티오) 프로피오네이트(SPDP)의 연결에 의해 제조된 B형 간염 바이러스 표면항원과 서양고추냉이 페록시다제의 중합체를 세파덱스-G-200 칼럼 크로마토그라피로 분리정제한 기록도로서, 403nm는 서양고추냉이 페록시다제효소의 활성을 각 분획마다 U.V 스펙트로포토메터로 측정기록한 결과도이고, (b)는 제2a도에서 분리된 분획의 15% SDSPAGE 분석후 실버스테이닝(silver staining)으로 발색한 도이고, (c)는 정제, 농축된 B형 간염 바이러스 표면항원-서양고추냉이 페록시다제 중합체의 중합효율을 알기 위해 U.V 스펙트로 포터메터로 측정한 250nm에서 500nm까지의 흡광도 분석결과도이다.
제3도는 효소표지 중합체의 배양시간에 따른 감도 발현 시험결과도이다.
제4a도는 본 발명의 B형 간염 바이러스 표면항원-서양고추냉이 페록시다제 중합체의 효소활성의 안정성 시험결과도이고, (b)는 본 발명의 B형 간염 바이러스 표면항원-서양고추냉이 페록시다제 중합체의 면역활성의 안정성 시험결과도이다.
본 발명은 이형복관능기(異型複官能基) 시약을 이용한 고감도의 B형 간염 바이러스의 진단방법에 관한 것이다. 최근 B형 간염 바이러스의 감염 또는 면역 백신에 의해 생성되는 B형 간염 바이러스에 대한 저항성을 진단하기 위한 B형 간염 바이러스항체의 검진방법이 많이 연구되어 임상에 응용되고 있다.
재래적인 혈액으로부터 분리된 B형 간염 바이러스 표면항원을 이용한 방사성동위원소 표지 및 효소 표지에 의해 항체를 검사하는 방법이 보고되어 있다. (참고문헌 : Lander, J., et al., H. Immunol. 106 : 1166, 1971 ; Walsh, J.et al., J.Infect. Dis. 121 : 550, 1970 : Peters, P.L. et al., J. Clin. Microbiol. 10 : 595, 1979 ; U.S.Patent. 4,343, 896 AUG. 10, 1982), 최근 아보트 라보러터리(ABBOTT LABORATORIES : North Chicago.I11)에서 개발시판되고 있는 AVSAB(RIA)와 AVSAB(EIA)는 고도의 감도로 B형 간염 바이러스 항체를 진단하는 방법으로 널리 이용되고 있으며, 10,000명의 환자 재취 혈액의 분석에서 1.4%의 분석치만이 오판될 정도의 특이성을 가지고 있다. 그러나 상기의 방법들은 첫째, 재래적인 인체 혈액으로부터 분리된 B형 간염 바이러스 표면항원을 이용하였기 때문에 안정성이 문제시 되고 있으며, 둘째 현재까지의 B형 간염 표면항원의 표지방법으로는 고감도의 안정한 중합체를 제조하는데 어려움이 있어 오판의 가능성이 높았다. 그러나 최근 문헌(참고문헌 : Brotman, B. et al., J.Infect Dis. 150 : 714-720, 1984)에서 지적한 바와 같이 AUSAB B형 간염 바이러스 항체 진단시약의 경우 인체, B형 간염 바이러스 표면항원을 이용하기 때문에 이 항원이 가지고 있는 상단량의 폴리삭카라이드를 함유한 구성 단일항원이 혈액중 비특이성 결합물질과의 반응에 의해 오판의 가능성이 높은 것으로 보고되어 있다.
특히 이 진단시약의 B형 간염 바이러스 표면항원의 효소표지방법은 바이오틴과 아비딘 단백질의 결합력을 이용하여 표면항원을 바이오틴으로 표지하고, 아비딘을 서양고추냉이 페록시다제와 중합시키는 방법을 이용하고 있는데 아비딘 단백질은 문헌(Chaiet, L. and Wolf, F.J., Arch. Biochem. Biophy. 106 : 1-5, 1964 : Chaiet, L. et al., Antimierob. Agents Chemother 3 : 28-32, 1963 ; Hofmann, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A77 : 4666-4668, 1980)에 보고된 바와 같이 등전점이 10.5이고 글리코프로테인(당단백질) 성질에 의해 혈장내 막성분 및 카보하이드레이트(탄수화물)에 대한 비특이성 결합을 배제하기 위한 문제점이 대두되고 있다. 한편, 바이오틴 및 아비딘의 결합특이성을 이용한 효소표지 방법은 B형 간염 표면항원에 공유결합을 이용한 직접 표지방법에 비해 배양시간에 따른 표면항원의 항체와의 결합, 표지된 효소중합체의 결합이 두단계로 이루어지므로 시간에 대응하는 감도 발현이 상대적으로 약하다. 또한, 효소표지된 아비딘-서양고추냉이 페록시다제의 안정도 및 아비딘 단백질이 4개의 단일 단백질의 다중체로 형성되어 있기 때문에 문제가 많음을 발견하였다.
상기의 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에서는 유전자 제조합기술에 의하여 포유동물세포인 중국산 햄스터 난소세포(Chinese hamster ovary cell)에서 발현된 (HBsAg) B형 간염 바이러스 표면항원, 아종 adw 및 ayw를 원심분리시켜 상충액을 얻은 후 이를 adw 항원에 대한 단일세포군항체(KIE9-adw)와 adw항원에 대한 기니-피그 폴리크로날항체(GP-D2-ayw)가 결합된 어피니티 칼럼(Affinity Column)으로 각각 분리한 다음 NH4SCN으로 유출시켜 CsCl2농도 경사 초원심분리로 순수분리시킨 표면항원에 이형복관능기(異型複官能基)시약은 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실산-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(이하 SMCC라함) 및 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜리티오)프로피오네이트(이하 SPDP라함)를 연결하는 공유결합을 이용 B형 감염 바이러스 표면항원 입자의 결합성 아민기(-NH2)에 SMCC를 부가하여 면역성을 그대로 보유하는 (N-말레이미도메틸) 싸이크로헥산-1-카르복실린-HBsAg 아종 adw 및 ayw를 각기 제조하고 한편으로는 결합성-SH 기가 없는 서양고추냉이 페록시다제(Horseradish peroxidase)에 SPDP를 부가하여 3-(2-피리릴디티오) 프로피오닐 서양고추냉이 페록시다제를 제조한 후 이를 디티오트레이톨(Dithiothreitol)로 환원하여 이 효소에 결합성 -SH기를 도입하였다. 그런 다음 이를 상기의 변형된 HBsAg와 티오에테르(Thioether) 결합으로 안정한 공유 결합을 도입하여 효소표지 B형 간염 바이러스 표면항원을 제조하였다.
현재까지 알려진 글루타알데히드, 퍼리오데이트(Glutaraldehyde, periodate)를 이용한 항원, 항체의 효소표지 방법들은 효소 및 항원, 항체의 면역학적 결합력 및 효소활성이 제조과정중 상당히 손실되며 최종수율도 50%이상을 유지하기가 어려웠다. (참고문헌 ; Avrameas, S. et al., Scan. J. Immunol, 8 : 7-23. 1978 ; Nakane, P.K. et al., J.Histochem. Cytochem. 22 : 1084-1091, 1974 ; schuurs, A.H.et al., Clin. Chim. Acta 81 : 1-40 1977). 더욱이 과잉의 효소다증체가 형성되어 분리 정제에도 많은 문제점이 있어 결과적으로 음성결과의 유의성을 판정하기 어려움이 많았다. 그러나 본 발명에서는 활성의 손실을 저하할 수 있는 PH가 중성인 수용액중에서 정량적으로 티오에테르의 공유결합을 형성시켰으므로 고도의 활성을 갖는 70%이상의 수율을 얻었다.
본 발명은 상기한 바와같이 포유동물세포에서 발견된 B형 간염 표면항원을 폴리스틸렌 또는 폴리비닐 클로라이드로 된 고형지지체(solid support)에 흡착시킨후 일정량 취하여 배양하고 시험 검체중 B형 간염 바이러스항체를 면역학적 활성을 이용하여 반응시킨 후 상기 제조된 효소표지 간염 표면항원을 부가하여 배양한 후 서양고추냉이 페록시다제의 기질인 O-페닐렌디아민을 이용 H2O2존재하에 발색 반응을 시켜 492nm에서 분광광도계로 흡광도를 측정 정량적으로 환자 혈액중의 B형 간염 바이러스 표면항원에 의한 항체를 진단 할 수 있고 샌드위치형(Sandwich-type)의 고분자 고형 지지체를 이용한 효소면역적 진단방법(Solid Phase enzymeimmunoassay)이다.
이 발명에서 사용한 B형 간염 바이러스 표면항원은 안티바디 어소시에이트 리미티드(Antibody Associates, Ltd. ; 미국, 텍사스 76021, 베드포드, 피오박스 822)나 바이오메디컬 리소시즈(Bio medical Resources ; 미국, 펜실바이나 19040, 하트보로, 노스요크 로드31) 또는 바이털브러드 프러덕츠 인코포릿(Vital Blood Products Inc. ; 미국, 캘리포니아 91302, 캘러버서스, 크래프트맨 로드 23938)등에서 용이하게 구입할 수 있다.
본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.
[실시예 1]
B형 간염 바이러스 표면항원 효소표지 중합체, 아형, adw, ayw를 이용한 B형 간염 바이러스항체의 진단시험.
본 발명자의 선발명인 1986년 특허출원 제766호의 실시예 2에서 제조한 B형 간염 바이러스 표면항원 효소표지 중합체를 이용하여 항체를 진단할 수 있는 진단시약을 다음과 같이 제조하였으며 바이오틴 아비딘을 이용한 기존 진단시약과 감도(sensitivity), 특이성(Specificity) 및 안정성(Stability)를 검토하였다.
우선 정제된 B형 간염 바이러스 표면항원을 고분자고형 지지체에 흡착시키기 위하여 폴리스틸렌 튜브(VWR, 12×7.5mm U.S.A)에 각 아종 adw, ayw 항원 100ng씩 분배되도록 항원을 50mM 트리스, HCl pH 9.5 완충액에 용해하여 300L씩 각튜브에 넣고 실온에서 16시간 배양한후 증류수 12m로 세척하고 65℃에서 30분간 열처리하여 불활성화시킨 염소혈청(Normal Goat Serum) 10%를 100mM 인산염완충액 pH8.0, 0.15M NaCl에 용해한 용액을 300μl씩 분배하여 실온에서 2시간 배양한후 다시 증류소로 세척하여 진공 건조시켰다. 이 폴리스틸렌 튜브에 시료 또는 양성표준시약은 300μL를 넣고 42℃에서 2시간 배양한후 증류수로 세척하고 여기에 1986년 특허출원 제 766호의 실시예 2에서 제조한 B형 간염 바이러스 표면항원 효소표지 중합체를 인산염완충액 PH8.0, 0.5M NaCl, 10% 염소혈청(65℃에서 30분 불활성화), 0.01% 겐타마이신 셀페이트와 0.002% 티머로잘에 0.2μg=±0.05μg/mL로 희석시킨 용액 300μL를 넣고 다시 42℃에서 2차 배양했다. 반응이 끝난 후 증류소로 세척하고 0-페닐디아민 2HCl(Sigma Co.USA) 정(12.8mg/정)을 50mM 소듐 시트레이트 완충액 pH5.5에 100mL 당 40μL의 30% H2O2를 함유한 기질용액에 5mL당 1정을 넣어 용해시킨 기질 반응용액을 300μL씩 첨가하여 30분간 실온에서 반응 시킨후, 1mL, 1N H2SO4를 넣어 반응을 중단시키고 492nm에서 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
감도를 비교하기 위하여 양성표준시약(ABBOTT, AUSAB, EIA) 및 같은 항체희석배수의 양성환자 혈액으로 만든 양성 표준시약을 계열희석후 희석배수에 따른 감도 발현을 측정하여 그 결과를 표 1에 나타내었다.
[표 1]
또한 두 번째 중합체 첨가후 배양시간에 따른 감도발현을 바이오틸 아비딘 효소표지 방법에 의한 중합체의 감도 발현과 비교실험하였다.
(제3도 참조)
제3도에 볼수 있듯이 배양시간에 따른 감도의 발현이 공유결합에 의한 효소표지중합체의 경우 1시간후 약 2배 정도 증가함을 할 수 있었다. 또한 무작위 추출한 환자혈액 100시료의 반복실험에서 기존 EIA 방법에 의한 양성, 음성판정에 100%의 상관정을 가지는 결과를 얻었으며 이 진단시약의 유의성 실험결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
한편 B형 간염 바이러스 표면항원과 서양고추냉이 페록시다제의 공유 결합에 의해 형성된 중합체의 안전성을 제4a도 및 (b)에서 볼 수 있듯이 효소활성 및 면역 반응활성이 매우 안정성이 있는 것을 확인하였다.
Claims (2)
- B형 간염 바이러스 표면항원을 고분자 고형 지지체에 흡착시켜 시험 검체중의 B형 간염 바이러스 표면항체와 반응시킨 다음 표면항원 효소표지 중합체를 부가시켜 H2O2존재하에서 O-페닐렌디아민을 발색시킴을 특징으로 하는 효소면역 진단방법.
- 제1항에 있어서, 고형 지지체가 폴리스틸렌 또는 폴리 비닐클로라이드임을 특징으로 하는 효소면역 진단방법.
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