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KR900005958B1 - B형 간염 바이러스 항체 진단시약제조방법 - Google Patents

B형 간염 바이러스 항체 진단시약제조방법 Download PDF

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KR900005958B1
KR900005958B1 KR1019860000766A KR860000766A KR900005958B1 KR 900005958 B1 KR900005958 B1 KR 900005958B1 KR 1019860000766 A KR1019860000766 A KR 1019860000766A KR 860000766 A KR860000766 A KR 860000766A KR 900005958 B1 KR900005958 B1 KR 900005958B1
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ayw
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Abstract

내용 없음.

Description

B형 간염 바이러스 항체 진단시약 제조방법
제1도는 유전자 재조합기술에 의해 B형 간염 바이러스의 표면항원, 아종 adw 및 ayw를 발현하는 포유동물세포(Chinese Hamster Ovary : 이하 CHO 세포라 함)로부터 순수정제된 표면항원의 15% 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴 아마이드 전기영동법(15% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, 15% SDS-PAGE)실험결과 및 항체 항원의 결합특이성을 분석한 웨스턴 분석(Western analysis)결과를 나타낸 도면으로서 Lane M는 표준단백질 분자량이고, Lane1은 NIH(National Institute of Health)의 인체 B형 간염 바이러스 표면항원(subtype ayw)을 실버(silver)염색으로 발색한 것이고, Lane2는 NIH의 인체 B형 간염 바이러스 표면항원(subtype ayw)을 실버염색 방법으로 발색한 것이고, Lane3는 CHO세포로부터 분리정제된 표면항원(adw)이고, Lane4는 CHO세포로부터 분리정제된 표면항원(ayw)이고, Lane5 및 6은 전기영동분석후 단백질을 니트로 셀루로우즈 페이피에 흡착시킨 후 표면항원에 대한 단일세포군항체(KIE9-adw) 및 염소-안티-쥐-서양고추냉이 페록시다제(Goat-Anti-mouse IgG-Horseradish peroxidase)에 의해 웨스턴(Western)분석 결과이고, Lane7 및 8은 표면항원에 대한 다세포군항체(Guineapig-D2-Horseradish peroxidase)에 의한 웨스턴 분석결과도이다.
제2a도는 4-(N-말레이미드메틸)싸이클로헥산-1-카르복실산-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(SMCC)와 N-숙신이미딜-3-(2-피리디티오)프로피오네이트(SPDP)의 연결에 의해 제조된 B형 간염 바이러스 표면항원과 서양고추냉이 페록시다제의 중합체를 세파덱스-G-200 칼럼 크로마토그라피로 분리정제한 기록도로서, 403nm는 서양고추냉이 페록시다제 효소의 활성을 각 분획마다 U.V스펙트로 포토메터로 측정기록한 결과도이고, (b)는 제2a도에서 분리된 분획의 15% SDS-PAGE분석후 실버스테이닝(silver staining)으로 발색한 도이고, (c)는 정제, 농축된 B형 간염 바이러스 표면항원-서양고추냉이 페록시다제 중합체의 중합효율을 알기 위해 U.V스펙트로 포토메터로 측정한 250nm에서 500nm까지의 흡광도 분석결과도이다.
제3도는 효소표지 중합체의 배양시간에 따른 감도 발현 시험결과도이다.
제4a도는 본 발명의 B형 간염 바이러스 표면항원-서양고추냉이 페록시다제 중합체의 효소활성의 안정성 시험결과이도이고, (b)는 본 발명의 B형 간염 바이러스 표면항원-서양고추냉이 페록시다제 중합체의 면역활성의 안정성 시험결과이다.
본 발명은 이형복관능기(異型複官能基)시약을 이용한 고감도의 B형 간염 바이러스 표면항원과 서양고추냉이 페록시다제의 중합체 제조방법에 관한 것이다.
최근 B형 간염 바이러스의 감염 또는 면역백신에 의해 생성되는 B형 간염 바이러스에 대한 저항성을 진단 하기 위한 B형 간염 바이러스항체의 검진방법이 많이 연구되어 임상에 응용되고 있다. 재래적인 혈액으로부터 분리된 B형 간염 바이러스 표면항원을 이용한 방사성 동이원소 표지 및 효소 표지에 의해 항체를 검사하는 방법이 보고되어 있다. (참고문헌 : Lander, J., et al., J. Immunol. 106 : 1166, 1971 ; Walsh, J.et al., J.Infect. Dis. 121 : 550, 1970 : Peters, R.L. et al., J. Clin. Microbiol. 10 : 595, 1979 ; U.S.Patent. 4,343, 896 AUG. 10, 1982).
최근 아보트 라보러터리(ABBOTT LABORATORIES : North Chicago.I11)에서 개발시판되고 있는 AVSAB(RIA)와 AVSAB(EIA)는 고도의 감도로 B형 간염 바이러스 항체 진단하는 방법으로 널리 이용되고 있으며, 10,000명의 환자 채취 혈액의 분석에서 1.4%의 분석치만이 오판될 정도의 특이성을 가지고 있다. 그러나 상기의 방법들은 첫째, 재래적인 인체 혈액으로부터 분리된 B형 간염 바이러스 표면항원을 이용하였기 때문에 안정성이 문제시 되고 있으며, 둘째 현재까지의 B형 간염 표면원의 표지방법으로는 고감도의 안정한 중합체를 제조하는데 어려움이 있어 오판의 가능성이 높았다.
그러나 최근 문헌(참고문헌 : Brotman, B. et al., J.Infect Dis. 150 : 714-720, 1984)에서 지적한 바와 같이 AVSAB B형 간염 바이러스 항체 진단시약의 경우 인체, B형 간염 바이러스 표면항원을 이용하기 때문에 이 항원이 가지고 있는 상단량의 폴리삭카라이드를 함유한 구성 단일항원이 혈액중 비특이성 결합물질과의 반응에 의해 오판의 가능성이 높은 것으로 보고되어 있다. 특히 이 진단시약의 B형 간염 바이러스 표면항원의 효소표지방법은 바이오틴과 아비딘 단백질의 결합력을 이용하여 표면항원을 바이오틴으로 표지하고, 아비딘을 서양고추냉이 페록시다제와 중합시키는 방법을 이용하고 있는데 아비딘 단백질은 다음문헌(참고문헌 : Chaiet, L. and Wolf, F.J., Arch. Biochem. Biophy. 106 : 1-5, 1964 : Chaiet, L. et al., Antimierob. Agents Chemother 3 : 28-32, 1963 ; Hofmann, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77 : 4666-4668, 1980)에 보고된 바와 같이 등전점이 10.5이고 글리코프로테인(당단백질)성질에 의해 혈장내 막성분 및 카보하이드레이트(탄수화물)에 대한 비특이성 결합을 배제하기 위한 문제점이 대두되고 있다.
한편, 바이오틴 및 아비딘의 결합특이성을 이용한 효소표지 방법은 B형 간염 표면항원에 공유결합을 이용한 직접 표지방법에 비해 배양시간에 따른 표면항원의 항체와의 결합, 표지된 효소중합체의 결합이 두단계로 이루어지므로 시간에 대응하는 감도 발현이 상대적으로 약하다.
또한, 효소표지된 아비딘-서양고추냉이 페록시다제의 안정도 및 아비딘 단백질이 4개의 단일 단백질의 다중체로 형성되어 있기 때문에 문제가 많음을 발견하였다.
상기의 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에서는 유전자 제조합기술에 의하여 포유동물세포인 중국산 햄스터 난소세포(Chinese hamster ovary cell)에서 발현된(HBsAg) B형 간염 바이러스 표면항원, 아종 adw 및 syw를 원심분리시켜 상충액을 얻은 후 이를 adw 항원에 대한 단일세포군항체(KIE9-adw)와 adw항원에 대한 기니-피그 폴리크로날항체(GP-D2-ayw)가 결합된 어피니티 칼럼(Affinity Column)으로 각각 분리한 다음 NH4SCN으로 유출시켜 CsCl2농도 경사 초원심분리로 순수분리시킨 표면항원에 이형복관능기(異型複官能基)시약인 4-(N-말레이미도메틸)싸이크로헥산-카복실산-N-하이드록시실신이미드 에스테르(이하 SMCC라 함) 및 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜리티오)프로피오네이트(이하 SPDP라 함)를 연결하는 공유결합을 이용 B형 감연 바이러스 표면항원 입자의 결합성 아민기(-NH2)에 SMCC를 부가하여 면역성을 그대로 보유하는 4-(N-말레이미도메틸)싸이크로헥산-1-카르복실린-HBsAg아종 adw 및 ayw를 각기 제조하고 한편으로는 결합성-SH 기가 없는 서양고추냉이 페록시다제(Horseradish peroxidase)에 SPDP를 부가하여 3-(2-피리릴디티오)프로피오닐 서양고추냉이 페록시다제를 제조한 후 이를 디티오트레이톨(Dithiothreitol)로 환원하여 이 효소에 결합성 -SH기를 도입하였다.
그런다음 이를 상기의 변형된 HBsAg와 티오에테르(Thioether)결합으로 안정한 공유결합을 도입하여 효소표지 B형 간염 바이러스 표면항원을 제조하였다.
현재까지 알려진 글루타알데히드, 퍼리오데이트(Glutaraldehyde, periodate)를 이용한 항원, 항체의 효소표지 방법들은 효소 및 항원, 항체의 면역학적 결합력 및 효소활성이 제조과정중 상당히 손실되며 최종수율도 50% 이상을 유지하기가 어려웠다. (참고문헌 ; Avrameas, S. et al., Scan. Immunol, 8 : 7-23, 1978 ; Nakane, P.K. et al., J.Histochem. Cytochem. 22 : 1084-1091, 1974 ; schuurs, A.H.et al., Clin. Chim. Acta 81 : 1-40 1977).
더욱이 과잉의 효소다중체가 형성되어 분리 정제에도 많은 문제점이 있어 결과적으로 음성결과의 유의성을 판정하기 어려움이 많았다.
그러나 본 발명에서는 활성의 손실을 저하할 수 있는 pH가 중성인 수용액중에서 정량적으로 티오에테르의 공유결합을 형성시켰으므로 고도의 활성을 갖는 70% 이상의 수율을 얻었다.
이 발명에서 사용한 B형 간염 바이러스 유전자, 아종 adw는 미국의 균주 보관 기관인 ATCC(American Type Culture Collection)의 캐털로그 No. 45020으로 쉽게 구입할 수 있고, 이 간염 바이러스 DNA를 잘 알려진 포유동물 세포벡터[구입처 ; 미국 클론테크 래보 도리(Clontech Lab.) 캐털로그 No. 6104-1 또는 6100-1이나 미국 파머시아(Pharmacia)사 No. 27-4926-01]에 클로닝한 후 CHO세포[구입처 ; 미국 ATCC CCL61., 미국 한나 바이오로직(Hana Bio-logics)사, 캘리포니아, 알라메다]를 숙주로 하여 잘 알려진 트랜스펙션(transfection)방법으로 B형 간염 바이러스 유전자를 클로닝하여 당업계의 통상의 지식을 가진 자라면 쉽게 제조할 수 있다. 이때의 클로닝이나 트랜스펙션 방법은 이미 잘 알려져 있다. (참고문헌 : Mani-atis, T. et al., Molecular Cloning-A Labratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N.Y., U.S.A., 1982 ; Graham, F.L. and Vander Eb, A.J., Virology 52, 456, 1978 ; Wigler, M.et.al., Cell 14, 725, 1978)
또 B형 간염 바이러스 표면 항원은 안티바디 어소시 에이트 리미티드(Antibody Associates, Ltd. ; 미국, 텍사스 76021, 베드포드, 피오박스 (22)나 바이오 메디컬 리소시즈(Bio Medical Resources ; 미국, 펜실바이나 19040, 하트보로, 노스요크 로드 31)등에서 쉽게 구입할 수 있다.
본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.
[실시예 1]
유전자 제조합 기술에 의해 제조된 포유동물세포 중국산 쥐난소세포(Chinese Hamster Ovary Cell)로부터 발현된 B형 간염 바이러스 표면항원의 분리정제.
CHO세포를 배양액(0.1μM Methotrexate 함유)에서 로울러보틀(Roller Bottle)로 배양하여 배양액 1L를 벡맨(Beckmann)원심분리기로서 JA 4.2로 3,500rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하였다.
이 상등액에 6.5%(W/V) PEG-6,000(Sigma Co) 20%(W/V)으로 미리 제조된 덱스트란 설페이트 소듐염(sigma Co) 1%(W/V)과 0.9%(W/V) NaCl을 완전 용해시킨 후 4℃에서 18시간 보존하여 JA4.2로부터로 3,500rpm에서 원심분리하였다. 이 때 분리된 2액상중 하부액상을 취하여 4M NaCl용액과 진탕하여 최종 1M NaCl농도가 되도록 조정한 후 JS-13 Rotor로 원심분리하여 상등액상을 회수 4℃에 보관하였다. 이를 B형 간염 바이러스 표면항원, 아종 adw 및 ayw에 대해 퀼러과 밀스테인 방법(참고문헌 : Kohler & Milstein Eurp. J. Immunol. 6 : 511-519, 1976)에 의해 제조된 adw항원에 대한 단일 세포군항체(KIE-adw) 및 다세포군항체 제조기술에 의해 제조된 ayw항원에 대한 기니피그 폴리크로날(Guineapig polyclonal)항체(GP-D2-ayw)를 각각 결합시킨 세포로스 CL-4B(Pharmacla co. U.S.A.)어피니티 칼럼(특이성결합 column)을 이용하여 분리하였다. 어피니티 칼럼의 제조는 15㎎의 단이세포 군항체(KIE-adw) 및 기니피그 폴리크로날항체(GP-D2-ayw)를 각각 1g의 건조된 CNBr-활성-세파로스 CL-4B(Pharmacia Co)에 파마시아(Pharmacia)가 권장하는 방법에 따라 결합시켰다.
분리실험은 아형 adw 및 ayw에 대한 각 어피니티 칼럼을 10mM Tris pH 7.5, 1M NaCl완충액으로 충분히 세척하여 활성화 시킨 후 표면항원이 함유된 위의 상등액상을 10ml/시간의 속도로 칼럼에 걸은(loading)후 다시 10mM Tris pH 7.5, 1M NaCl 완충액으로 A280이 0에 도달할때까지 세척한후 다시 비특이성(non-specific)단백질을 제거하기 위해 10mM Tris pH 7.5세척하여 A280이 0에 오도록 하고 나서 3M NH4SCN, 50mM Tris pH 7.5 완충액으로 표면항원을 유출하였다.
이 표면항원을 함유한 분획 20ml을 얻은 후 즉시 4℃에서 41의 50mM Tris pH 7.5완충액에서 2회 24시간 투석하였다. 그런후 YM 30막(Amicon U.S.A.)을 이용하여 가압 투석하여 1ml로 농축시킨 후 원심분리하여 불순물을 제거하고 100mM인산염 완충액 pH 6.8로 세척된 세척된 세파로스 CL-4B(1.5×90㎝, pharmacia Co.)에 걸은 다음 50ml/시간의 속도로 세척하여 2ml씩 각각의 시험관에 회수하였다.
이 각 시험관을 아보트 라보러터리(ABBOTT LABORATORIES : U.S.A.)의 HBsAg분석 진단시약인 오우스자임(AUSZYME) EIZ II를 이용하여 정량하였다. B형 간염 바이러스 표면항원의 활성이 있는 시험관을 합하여 여기에 1.2g/cm3가 되도록 CsCl2를 가하여 녹인 후 벡맨(Beckmann)초원심분리기로 로터 SW4lTi를 이용하여 35,000rpm에서 24시간 원심분리한 후 1ml/tube가 되도록 분획하여 각 분획을 4℃에 보관하였다. 상기 분획을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 라엠의 방법(참고문헌 : Laemmli. et al., Nature 227 : 680-685, 1972)을 이용 분리동정하였고 동시에 브라포드프로테인 정량법 및 오우스자인 EIA II로 정량하였다.
최종 정제된 표면항원은 특이성(Specific activity) 98% 이상의 활성을 얻었다. 상기 분리정제된 B형 간염 표면항원의 면역학적 활성을 검토하기 위해 NIH표준 아종 adw 및 ayw인체 B형 간염 바이러스 표면항원과 같이 본 실험실에서 제조된 단일세포군항체 KIE9-adw 및 GP-D2-ayw 다세포군항체를 이용하여 항체, 항원의 특이적결합 반응을 웨스턴 분석방법(참고문헌 : Bowen et al., Nucleic Acids Res.8 : 1, 1980)에 의하여 동정하였다.
즉 라엠리방법으로 15% SDS-PAGE로 20mA에서 3시간 건후 분리된 단백질을 니트로세루로우스 페이퍼에 흡착히킨 후 B형 간염 표면항원(adw)에 대해서는 KIE9-adw, 마우스 모노크로날항체(Mouse monoclonal antibody)로 일차 2시간 배양하고 다시 염소-안티-쥐-IgG-서양고추냉이 페록시다제로 이차 2시간 배양하여 표지효소를 도입한 후 4-CL-나프톨을 기질로 발색시켰다.
ayw에 대해서는 기니-피그-폴리크로날 항체를 서양고추냉이 페록시다제와 중합시킨 후 이를 이용하여 같은 방법으로 동정하였다.
제1도에서도 볼수 있듯이 표면항원은 주로 p-22(22,000 dalton)과 p-27(27,000 dalton) 그리고 이중체(dimer)에 해당하는 p-45(45,000 dalton)으로 분석됨을 알 수 있으며 그 면역활성도 상응하는 단백질임을 알 수 있었다.
[실시예 2]
이형복관기능이 시약 SMCC 및 SPDP를 이용한 공유결합에 의한 B형 간염 표면항원 및 서양고추냉이 페록시다제 중합체의 제조.
가) 서양고추냉이 페록시다제에 SPDP[(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트)]의 부가. 10㎎의 서양고추냉이 페록시다제(RZ 3.0, Sigma Co.U.S.A.)를 800μl의 10mM 인산염 완충액 pH8.0, 0.15M NaCl에 용해시키고 여기에 미리 제조한 32mM SPDP용액(Ethanol에 용해) 200μl를 첨가하여 실온에서 한시간 반응했다.
이 반응액 1ml을 10mM 인산염 완충액 pH8.0, 15M NaCl로 세척된 세파텍스 G-25(lx25㎝, Sigma Co.U.S.A.)칼럼에 걸은 후 첫 번째 적색분획을 회수하여 -20℃에 보관했다.
나) B형 간염 바이러스 표면항원(아형 adw와 ayw)에 SMCC(4-(N-말레이미도메틸)싸이클로헥산-1-카르복실산-N-하이드록시숙신이미드 에스테르)의 부가. 1㎎의 B형 간염 바이러스 표면항원을 1ml의 10mM 인산염 완충액 pH6.8, 0.15M NaCl에 용해시킨후 10㎎의 SMCC를 디옥산에 용해시킨 용액 16μl를 넣고 실온에서 한시간 반응시킨 후 같은 완충액으로 세척된 세파텍스 G-25(1.0×25㎝)칼럼에서 첫번째 피크 분획을 회수하여 4℃에 보관하였다.
다) SPDP가 부가된 서양고추냉이 페록시다제의 환원 가)에서 조제된 SPDP-HRP를 브라포드 단백질 정량법으로 정량하여 2.5㎎을 취하고 이에 최종 50mM이 되도록 DTT(Dithiothreitol)을 첨가하여 실온에서 15분간 반응시킨 후 세파덱스 G-25(1.0×25㎝)칼럼에 걸은 후 첫번째 적색 분획을 회수했다.
라) SMCC-부가 B형 간염 바이러스 표면항원가 SPDP-환원-HRP의 중합 및 정제 실시예 2 나),다)의 회수된 분획을 즉시 혼합하여 실온에서 16시간 반응시킨 후 YM10막(Amicon Co.U.S.A.)으로 가압 투석하여 농축시키고 이를 원심분리하여 불순물을 제거하고 세파텍스 G-200(1.5×100㎝)칼럼을 인산염 완충액으로 세척한 후 칼럼에 걸어 효소 활성이 있는 첫번째 피크 분획을 회수하였다. (제2a도). 그리고 이 각 분획을 15% SDS-PAGE를 분석하여 순도를 확인하였다. (제2c도). 이 분획을 농축하여 0.1% BSA(Bovine serum albumin, Sigma Co.U.S.A.) 및 0.002% 티메로 잘(thimerosal)을 안정제로 첨가하여 4℃에 보관하였다.
[비교실시예 1]
본 발명에 의한 B형 간염 바이러스 표면항원의 효소표지방법과 기존방법들에 의한 결과를 비교분석하기 위하여 아브라미스(Avrameas, S.et al., Scan. J. Immunol. 8 : 7-23, 1978)의 2단계 글루타알데히드 중합법 및 나카니의 퍼리오데이트 중합방법을 병행실시하여 수율 및 중합효율을 분석하여 그 결과를 다음 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure kpo00001

Claims (3)

  1. B형 간염 바이러스 표면항원 아종 adw 및 ayw의 결합성 -NH2에 4-(N-말레이미도메틸)싸이크로헥산-1-카복실산-N-하이드록시 숙신 이미드 에스테르를 반응시켜 제조한 4-(N-말레이미도메틸)-싸이클로헥산-1-카르복실릭-HBsAg 아종 adw 및 ayw와 서양고추냉이 페록시다제(Horser ish perox-idase)에 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트를 반응시킨 후 디티오 트레이톨(Dithioth-reitol)로 환원시켜 제조한 결합성 -SH-3-(2-피리딜디티오)프로피오닐-고추냉이 페록시다제를 공유결합시킴을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 표면항원 효소표지 중합체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, B형 간염 바이러스 표면항원 아종 adw 및 ayw는 포유동물 난소세포를 원심분리시켜 상층액을 얻은 후 이를 adw 항원에 대한 단일세포군항체(KIE9-adw)와 ayw항원에 대한 기니-피그폴리 클로날항체(GP-D2-ayw)가 결합된 어피니티 칼럼(Affinity column)으로 각각 분리한 다음 NH4SCN으로 유출시켜 CsCl2농도 경사 초원심분리 시킨 것임을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 표면항원 효소표지 중합체의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 공유결합을 pH가 중성인 수용액중에서 티오에테르 결합시킴을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 표면항원 효소표지 중합체의 제조방법.
KR1019860000766A 1986-02-04 1986-02-04 B형 간염 바이러스 항체 진단시약제조방법 Expired KR900005958B1 (ko)

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