KR890001245B1 - 트립토판의 정제방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

트립토판의 정제방법

본 발명의 원료물질인 인돌로부터 효소작용에 의해 얻어진 트립토판의 정제방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인돌의 회수방법뿐만 아니라 트립토판에 포함된 인돌을 10ppm 이하로 제한하기 위해서 합성된 트립토판에 포함된 미반응 인돌을 분리함으로써 트립토판을 얻는 방법에 관한 것이다.

트립토판, 특히 L-트립토판은 필수 아미노산중의 하나이며 제약, 건강식품, 사료용등으로 사용되는 유용한 화합물이다. L-트립토판 제조방법으로는, 원료물질로서 글루코스등을 사용한 발효방법, 원료물질로서 안트라닐산등을 사용한 준-발효방법, 그외의 원료물질로서 인돌을 L-세린과 효소화 농축반응를 시켜서 L-트립토판을 얻는방법, 효소를 인돌, 피루브산 및 암모니아 등에 작용시켜 L-트립토판을 얻는 방법등이 공지되어 있다. 원료물질로서 인돌에 효소를 작용시켜 트립토판을 얻는 방법에서는, 트립토판을 포함하는 효소반응액에 포함되어 있는 미반응 인돌의 분리방법이 문제가 된다.

반응액은 보통 100ppm 이상의 인돌을 포함한다.

인돌이 극미량 포함되어 있어도, 그것은 독특한 악취를 발하기 때문에 최종산물의 인돌함유량을 최대 10ppm 이하로 감소시켜야 하며, 특히 생성물이 사료용으로 사용될때는 약 3ppm 이하로 해야 한다.

그러나, 인돌과 트립토판은 모두 인돌골격을 갖고 있으며 화학적 구조가 비슷하여 인돌은 트립토판에 대한 흡착력이 강하기 때문에 최종결정을 수세하는 등의 방법을 이용하더라도 인돌을 허용량 이하로 제거하는 것은 불가능하다.

또, 인돌은 고가의 원료물질이기 때문에 그것을 회수하지 못하면 생성물의 가격은 비싸진다.

따라서, 인돌을 사용한 트립토판의 제조에 있어서, 반응 종료 후 미반응 인돌을 포함하는 트립토판의 정제공정은 다른 불순물을 완전히 제거할 수 있고, 동시에 효율적으로 트립토판으로부터 인돌을 분리, 회수할 수 있는 공정이어야 한다.

보통, 트립토판의 제조방법으로서는, 대략 중성의 수용매에 트립토판 합성효소의 기능을 갖는 효소나 균체의 존재하에서 인돌을 세린과 반응시켜 트립토판을 얻는다. 그러나, 그렇게해서 얻어진 반응액중에 포함되어 있는 효소나 균체를 제거해야 하는데, 효소나 균체를 제거하기 위해서는 통상의 아미노산 처리법에 의해 활성탄, 흡착성 실리카켈등의 고형물질에 이들을 흡착시켜 이 물질들을 분리해내는 방법, 원심분리기로 침전시켜 분리하는 방법, 이러한 분순물을 이온교환수지, 비극성 다공성수지로 제거하여 아미노산을 정제하는 방법등이 이용되어 왔다.

예를들어 일본국 특허출원공개공보 소56-73050에 조공성의 강산성 이온교환수지로 유리시켜 L-트립토판을 정제하는 방법이 개시되어 있다.

그러나, 이러한 방법에 의해서는 트립토판으로부터 인돌을 분리하는 것은 불가능하다.

인돌과 트립토판은 둘다 물에 난용성이다. 예를들면, 반응 종료후의 트림토판 슬러리를 많은양의 물로 희석하여 트립토판 수용액을 제조하고, 이어서 활성탄을 처리하여 흡착에 의해 미반응 인돌을 제거할때 많은양의 트립토판도 인돌과 함께 흡착된다.

또한, 상기 공보에 기술된 바로는 통상적인 겔 형태의 양이온 교환수지를 사용하면 흡착된 방향족 아미노산 혹은 헤테로 방향족 아미노산은 비교적 용리(溶離)시키기 어렵다.

따라서 아미노산을 용리시키기 용이한 다공성 양이온 교환수지가 흡착 및 용리에 의한 트립토판 정제에 사용된다해도, 용리액(溶離液)에는 여전히 인돌이 포함되어 있을 것으로 생각된다. 이 경우에, 용리액으로부터 인돌을 분리하기 위해서, 용리된 트립토판의 수용액에 벤젠, 톨루엔등과 같이 물과 혼화되지않는 유기용매를 첨가하여, 유기용매내로 인돌을 추출하여 그것을 분리해 낸다.

그러나, 이러한 방법으로는 용매회수와 같은 번거로운 조작이 필요하며 인돌의 함유량 약 3ppm의 허용범위까지 감소시키기가 어렵다.

본 발명의 제1목적은 원료물질인 인돌로부터 제조된 것으로 미반응 인돌을 극히 소량 함유하는 트립토판을 제공하는데 있다.

본 발명의 제2목적은 원료물질인 인돌로부터 트립토판의 효소화 제조방법에 있어서, 합성된 트립토판을 미반응 인돌이 거의 포함되지 않는 트립토판으로 정제하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 제3목적은 원료물질인 인돌로부터 효소작용에 의해 제조된 트립토판의 반응액에서 미반응 인돌을 회수하는 방법을 제공하는데 있다.

이러한 목적들을 달성하기 위해, 본 발명의 발명자들의 광범위한 연구를 행한결과, 미반응 인돌을 포함한 트립토판 반응액을 다공성 양이온 교환수지층을 통과시킬때 인돌을 수지와의 친화력이 상당히 크며 수지층의 다공부에만 선택적으로 흡착되고, 이미 트립토판이 이온 교환부에 흡착되었어도 용리되며 용리액에는 인돌이 거의 포함되어있지 않다는 것을 밝혀냈고, 또 사용된 수지는 인돌을 용리시킬때 함수 유기용매를 사용하였기 때문에 인돌 용리후의 수지는 수세만으로도 용이하게 재생할수 있으며 수세한 수지는 트립토판 분리용으로 재사용할 수 있다는 것을 밝혀냈다.

본 발명은 원료물질인 인돌로부터 효소의 작용에 의해 제조된 트립토판의 반응액을 다공성 양이온 교환수지층을 통과시켜, 수지의 이온교환부에 트립토판을 흡착시키는 한편, 수지의 다공부에 인돌을 흡착시키고, 이어서 수지의 이온교환부에 흡착된 트립토판만을 알칼리 수용액 혹은 산 수용액으로 용리시켜 인돌을 거의 포함하지 않는 트립토판을 얻는 것을 특징으로 하는 트립토판 정제방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 이온교환부에 흡착된 트립토판 용리에 이어서, 물과 혼화되기 쉬운 함수 유기용매로써 수지의 다공부에 흡착된 인돌을 용리하는 것을 특징으로 하는 인돌 회수방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 방법에 따르면, 합성된 트리토판은 미반응 인돌을 거의 포함하지 않으며 값비싼 원료물질인 인돌을 효과적으로 회수할 수 있다.

본 발명에서 사용된 트립토판의 반응액은, 예를들어 수용매중에 트립토판 합성효소의 존재하에서 인돌과 L-세린을 효소화 농축반응 시켜서 얻은 반응액, 트립토파나제의 존재하에 인돌을 피루브산과 암모니아를 작용시켜 얻은 반응액등의 반응액과, 균체단백질 제거와 같은 전처리후에 얻은 반응물등이 사용된다.

또한, 유효성분인 L-트립토판으로부터 인돌을 분리하려 할때 반드시 상기 반응액만을 사용해야하는 것이 아니라, 여과액과 같이 정제과정중에 배출된액을 사용할 수도 있다.

반응액, 여과액등과 같이 유효성분을 포함하는 반응액을 실제로 사용하기전에 관을 막은 고형물질들을 제거하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 있어서, 이온 교환수지가 다공성 양이온 교환수지라면 어느것을 사용해도 무방하다. 예를들어 조공성 강산성 양이온 교환수지인 Lewatit SP-112(Bayer 사제조), Amberlite 200C(Rohn and Haas 사제조), Diaion PK-220 (Mitsubishi kasei 사제조)등은 바람직하나, 강산성 양이온 교환수지라도 겔 형태인것은 본 발명의 방법에서는 사용할 수 없다.

수지의 양은 피처리액에 포함되어있는 양이온의 총량, 즉 L-트립토판과 그외에 통상적으로 반응액에 포함되어 있는 아미노산, 암모늄이온, 나트륨이온등의 총몰이 수지의 총교환용량에 해당하도록 사용한다. 트립토판 반응 후 반응액을 처리하는 대표적인 실시예는 다음과 같다. 미반응 인돌을 포함하는 트립토판의 반응액이나 상기 반응액을 여과하여 거기에 포함되어있는 균체를 제거하여 얻어진 여과액(이하, 반응액과 여과액을 합하여 피처리액으로 칭함)을 다공성 양이온교환수지의 층을 통과시킨다.

피처리액을 수지층을 통과시킬때, 그것의 pH는 중성 내지 산성, 온도는 90℃ 이하, 그리고 통과조작은 1 내지 10의 공간속도(이하 SV로 약칭함)로 행하는 것이 바람직하다.

이온 교환부의 트립토판의 흡착 및 용리와 다공부에 흡착된 인돌의 용리를 교대로 행할수도 있으나, 피처리액의 트립토판과 인돌의 농도비율에 큰 차이가있고 그들의 흡착메카니즘이 다르기 때문에 흡착된 인돌의 용리는 트립토판의 흡착 및 용리의 분리조작과 재생을 수회 반복한 후 인돌의 흡착용량에 이르렀을때 행하는 것이 바람직하다. 용리액으로부터 인돌의 분리 및 회수는 상술한 방법에 따라 행하는 것이 유리하다. 따라서 통상적으로 인돌 함유율에 의존하기는 하지만 트립토판의 흡착, 용리 및 재생을 최소한 5회 반복한 후에 인돌의 용리를 행하는 것이 바람직하다.

트립토판은 1회 통과시켜 완전히 흡착되지만, 그것의 분리조작은 반복해서 행하여야 하며, 인돌이 수지의 다공부에 흡착 및 퇴적되어 그것의 농도가 일정치에 도달하면 인돌용리제를 통과시켜 그것의 용리를 행하고, 이러한 처리는 인돌을 고농축시키게 되며, 농축, 결정화등과 같은 종래 방법으로 인돌을 분리함으로써 고순도의 인돌을 용이하게 회수할 수 있으며 그 과정중 트립토판 용리액을 인돌을 거의 포함하지 않게 된다.

수지의 이온교환부에 흡착된 트립토판의 용리는, 피처리액을 수지층을 통과시켜 트립토판을 완전히 흡착시킨후에 행하고 이어서 매번물을 통과시켜 수지를 완전히 세정한다.

트립토판 용리제(溶離劑)로는, 종래에 사용했던 알카리 수용액 혹은 산 수용액을 사용할 수 있으나 암모니아 수용액이 바람직하다. 암모니아 수용액으로 용리하는 경우에 있어서, 5 내지 30중량%의 암모니아 수용액을 1 내지 10의 SV로 관의 상부에서부터 통과시켜 트립토판을 용리시키는 방법, 수지관 내에서 물을 순환시키고 그것에 암모니아 기체를 불어넣는 방법등을 이용할 수 있으며, 관내의 pH는 최소한 10으로 하는 것이 바람직하다.

또한, L-트립토판이 이 조작에 의해 거의 완전하게 용리되었더라도 관내에 남아있는 부분을 회수하기 위해서 밀어내는 것이 바람직하다.

이와같은 종래의 반복조작에 의해, 피처리액에 포함된 95%의 트립토판을 용리액내로 회수시킨다. 또, 피처리액에 포함된 인돌이 용리액내로 미량누출되었더라도 정제가 더 필요하다면, L-트립토판의 용리액은 공지된 유리방법 즉, 농축, 결정화, 고체-액체분리, 건조등과 같은 단위조작을 행하여서 소정의 허용량 이하의 인돌을 포함하는 우수한 질의 L-트립토판을 분리해낼 수 있다.

트립토판 용리후에 수지는 충분히 수세하고 종래의 방법에 의해 염산, 황산등으로 재생시켜 반복해서 사용한다.

한편, 수지의 다공부에 흡착 및 퇴적된 인돌을 용리시키기 위해 함수 용기용매를 용리제로 사용한다.

유기용매는 인돌과의 친화력이 불량하기 때문에 유기용매 하나만 가지고는 완전한 용리가 불가능하다.

유기용매의 대표적인 예로는, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올등과 같은 저급의 지방족 알코올이 있으며 이소프로판올이 특히 좋다.

이러한 알코올로부터 체적비로 10% 이상, 바람직하게는 70% 이상의 알코올을 함유하는 알코올 수용액을 제조하고, 수지양의 1배 이상, 바람직하게는 약 2배의 용액을 1 내지 10의 SV로 관의 상부에서부터 통과시켜 용리를 행한다.

인돌의 용리액은 종래의 방법으로 농축시키고 용매를 회수한 후, 톨루엔, 핵산등과 같은 비수 용기용매로 역추출 및 액의 분리, 냉각, 결정화등을 하고, 여과하여 분리시킨 고체를 얻는다.

또한, 인돌 용리후의 관은 충분히 수세하여 용매를 제거하고 트립토판 분리용으로 재사용 한다.

다음은 실시예에 의거 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

[실시예 1]

대장균을 배양해서 제조한 효소인 트립토판 합성효소의 존재하에 수용매중에서 인돌을 L-세린과 농축시켜 얻은 L-트립토판을 포함하는 반응액에 활성탄과 물을 첨가하고, 이어서 혼합물 pH는 황산을 가하고 4로 만들어서 95~100℃에서 한시간동안 가열하여 균체를 플록으로 변환시킨후, 균체를 활성탄에 흡착시키고 여과하여 제거하였다.

상기 전처리를 하여 얻어진 것으로 L-트립토판(3.8%, 0.9M), 인돌(0.1%), L-세린(0.2%, 0.02M), 암모니아 이온(0.8%, 0.44M) 및 나트륨 이온(0.2%, 0.09M)을 포함하는 수용액(2.580g : 아미노산 및 양이온의 총몰과 등량, 1.9)을 재생처리된 Lewatit SP-112(Bayer사제조, 교환용량 : 1.9mole/l)1l로 채워진 관의 상부에서부터 SV 5로 통과시켰다.

통과가 종료된 후 유하액은 고속액체 크로마토그래피로 L-트립토판을 검출하였으나 검출되지 않았다.

반응수지는 SV 10으로 물(2l)로 세정한 후 SV 2로 10% 암모니아 수용액으로 용리를 행하고 관에 남은 부분을 물(1.000g)로 밀어내어 용리액(1.600g)을 얻었다.

이 용리액은 L-트립토판(5.9% : L-트립토판 94.1g에 해당, 원래의 피흡착액중 L-트립토판에 대한 회수율 : 96.0%)과 인돌(1ppm 이하, 인돌제거율 : 거의 100%)을 함유하였다.

용리액은 감압하에서 약 470g으로 농축시킨 후, 5℃에서 2시간동안 결정화시키고 진공에서 Nutsche로 여과하여 물(100g)로 세정하여 습 케이크(136.8g)을 얻었으며 이 케이크를 건조시켜 비늘모양으로 황백색 결정 80.4g을 얻었다.

전체수율 : 82.0%/원래의 피흡착액.

생성물의 질은 순도가 99.6%, 회전각 : -31.3°인돌함유량 : 1.2ppm, 즉, 인돌을 거의 포함하지 않으며 인돌냄새도 전혀 맡을 수 없었다.

이질은 가축사료용 부가물의 표준치에 충분히 만족할 것이다.

또한, L-트립토판 용리후의 수지는 물(2l)로 세정하고 SV 2로 관의 상부에서 부터 80% 수성 프로필알코올(2.000g)을 통과시켜 인돌의 용리액(2.000g)을 얻었다.

이 용리액의 인돌 함유율은 0.12%였다(원래의 피흡착액중의 인돌에 대한 회수율 : 92.0%)

[실시예 2]

실시예1과 동일한 방법으로 인돌의 용리는 행하지 않고, 트립토판의 흡착용리, 재생만을 8회 반복했고 이 동안 트립토판의 용리시 유하액에 함유된 인돌을 조사하였으나 인돌은 검출되지 않았다.

9회째 L-트립토판의 용리액에서는 일정량의 인돌이 검출되었고, 9회째 L-트립토판의 용리후에 수지를 수세한 후, 관의 상부에서 부터 SV 2로 80% 수성이소프로필알코올(2.000g)을 유화시켜 인돌의 용리를 행함으로써 인돌용리액(2.000g)을 얻었다.

용리액은 인돌 함유율이 3.2%였다.

용리액을 500g으로 농축시킨 후 60℃에서 n-핵산(200g)을 첨가하여 혼합, 추출, n-핵산층의 분리, 냉각 및 5℃에서 2시간동안 결정화하여 Nutsuhe로 여과하고 합성된 습 케이크를 건조시켜 인돌 39.0g을 얻었다.(회수율 : 61.0%, 기체 크로마토그래피에 의한 순도 : 100%)

그 재생된 인돌을 L-트립토판을 위한 효소반응의 원료물질로 재이용했고 그 인돌은 반응에 악영향을 미치지 않음을 확인했다.

또한, 그러한 인돌용리의 종료 후, 수세하여 다시 재생시켜 L-트립토판의 흡착과 용리를 반복하였고 L-트립토판 용리액에서 인돌이 검출되면 수성이 소프로필알코올로 인돌의 용리와 회수를 반복하였다.

L-트립토판 용리액의 결과는, 전체수율이 원래의 피흡착액에 대하여 78.0 ~84.0%였고 인돌 함유량은 3ppm 이하였다. 장시간에 걸쳐 전술한 바와같이 연속적인 조작을 행하였을때 반응생성물은 인돌냄새도 나지 않았고 가축사료용 부가물의 표준치에 충분히 만족할 만한 질을 가졌다.

Claims (4)

1. 원료물질인 인돌로부터 효소작용에 의해 제조된 트립토판의 반응액을 다공성 양이온 교환수지층을 통과시켜서, 수지의 이온교환부에 트립토판을 흡착시키는 한편, 수지의 다공부에 인돌을 흡착시킨 후, 수지의 이온교환부에 흡착된 트립토판만을 알카리 수용액 혹은 산 수용액으로 용리시켜 인돌을 거의 포함하지 않는 트립토판을 얻는 것을 특징으로 하는 트립토판의 정제방법.
2. 제1항에 있어서, 상기의 트립토판 용리제로 사용한 알카리 수용액은 암모니아 수용액인 것을 특징으로 하는 트립토판의 정제방법.
3. 원료물질인 인돌로부터 효소작용에 의해 제조된 트립토판의 반응액을 다공성 양이온 교환수지층을 통과시키고, 수지의 이온교환부에 트립토판을 흡착 및 용리시키는 처리와 재생을 반복해서 행하고, 이어서 수지의 다공부에 흡착된 인돌을 물과 혼화될 수 있는 함수 유기용매로 용리시키고, 얻어진 용리액으로부터 인돌을 유리시키는 것을 특징으로 하는 트립토판 반응액으로부터 인돌을 분리 및 회수하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기의 물과 혼화될수 있는 함수 유기용매는 저급의 지방족 알코올 수용액인 것을 특징으로 하는 트립토판 반응액으로부터 인돌을 분리 및 회수하는 방법.