KR870002073B1

KR870002073B1 - L-카르니틴의 제조방법

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Publication number: KR870002073B1
Application number: KR1019840006883A
Authority: KR
Inventors: 세임 헤르만; 로에스 테트 하인즈; 크라우스 라이네트; 크테베르 한스-페테르; 스트락크 에리크
Original assignee: 시구마-토우 인더스트리 화아마슈티히 티유니잇 에스.피.에이.; 피에트로 아네시이
Priority date: 1983-11-03
Filing date: 1984-11-03
Publication date: 1987-12-03
Also published as: EP0148132A3; DD221905A1; ATE46189T1; CA1244788A; DD221905B1; EP0148132B1; EP0148132A2; US5028538A; KR850004502A; DE3479670D1; JPS60137295A

Abstract

내용 없음.

Description

L-카르니틴의 제조방법

본 발명은 L(-)-카르니틴의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 특히 광학적으로 불활성인 전국물질로부터 광학 활성의 L(-)-카르니틴(R배열)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

L-카르니틴(3-하이드록시-4-트리메틸아미노 부티테이트)는 통상 생체내에 존재하며 사립체막(絲粒體膜)을 통하여 활성화 긴사슬유리 지방산의 운반체로서의 역할을 수행하게 된다. 사립체막은 아실CoA유도체에 대해서는 불투과성인 관계로, L-카르니틴과의 에스테르화 반응이 행해진 경우에 한하여 긴사슬 유리지방산을 통과시킨다.

최근에 치료용으로 L(-)-카르니틴의 사용이 중요한 것으로 알려지고 있다. ("Carnitine biosynthesis, metabolism and funcitions" 출판인 : R.A. Frenkel 및 J.D. Mc Garry; Academic Press 1980).

필요한 양의 L-카르니틴을 손쉽게 입수하기 어렵기 때문에 흔히 L-카르니틴을 총화학 합성법으로 수득할 수 있는 DL-카르니틴 라세메이트로 대치 사용하고 있다.

그러나 D(+)-이성체를 함유하고 있는 DL-카르니틴은 L(-)-카르니틴 사용시에는 야기되지 않는 부작용을 유발하게된다.(Curr. Ther. Res. 28 (1980), 195-198).

또한 L(-)-카르니틴형성에 필요한 트랜스피타제, 즉 카르니틴 아세틸-트랜스피타제(E C 2.3.1.7) 및 카르니틴 팔미토일-트랜스피타제(E C 2.3.1.21)은 L(-)형에 대한 특이성을 갖는데 반하여, D(+)이성체는 이들 2개 트랜스 피타제의 경쟁적 억제인자라는 사실이 공지된 바 있다.

더우기, 동물(기니아-피그) 사용 실험에서 입증된 바와같이 D-카르니틴의 투여는 심장근 또는 골격근에서 L(-)-카르니틴의 감소를 가져왔다(Life Sciences 28 (1981) 2931-2938).

L-카르니틴 처치후에 나타난 인간의 갑상선 기능항진 증상은 D-카르니틴으로 매우 악화되었으며, (Endokrinologie 38, (1959) 218 내지 225), 따라서 현재에는 환자치료용으로 단지 L(-)-카르니틴만이 사용될 수 있다.

이는 또한 D(+)이성체를 적극적으로 체기할 능력이 없는 신장수명이 다된 환자의 경우에 특히 타당성을 갖는다.

혈액투석은 L-카르니틴을 투석물로부터 분리시킨이후로 저분자량을 갖는 관계로 (161.2), L-카르니틴의 2차 결함을 유발시킨다. 투석용액중의 L(-)-카르니틴을 경국투여 또는 첨가는 환자에 있어 카르니틴 감소를 피할 수 있다.

공업국가에서 널리 퍼져있는 과지방 단백질 혈증의 경우에는 L(-)-카르니틴을 사용해서 혈장위험인자, 즉 트리글리 세티드 및 콜레스테롤 함량을 크게 저하시킬 수 있었다(Lancet Ⅱ (1978) 805내지 807).

이와 유사한 효과를 아실카르니틴을 사용해서 얻을수 있었다(DE-OS 2903579).

L(-)-카르니틴은 복잡한 정제과정을 거쳐 육질 추출액으로부터 분리사용하여 왔다. 50개의 화합합성법이 공지되었으나, 단지 DL-카르니틴만을 수득할 수 있었다.

지금까지 이성체 L(-)-카르니틴은 공학활성산과 카르니틴의 염을 분별 결정화방법에 따라 라세메이트 분할시켜 수득하였다, 카르니틴-니트릴, 카르니틴아미드 또는 카르니틴 내부염 그 자체와 같은 각종 카르니틴 유도체를 사용하였다.

광학활성산으로는 바타르산, 캠포트산 및 캠포트설폰산이 사용되었다(예 : DD-PS 23127 ; DD-PS 93347 ; DE-OS 2927672).

DL-카르니틴은 또한 특이성 L(-)-트랜스피타제를 사용해서 분할 사용하였다. 그러나 1몰의 L(-)-카르니틴을 제조하는데 1몰 이상의 아실 CoA가 소요되는 관계로 이 제법을 공업적으로 응용하는데는 너무 과대한 비용이 소요되는 것으로 밝혀졌다.

타세메이트 분할 후속처리를 요하는 기타 모든 화학적 합성방법은 합성 DL-카르니틴으로부터 필요로하는 이성체를 50%이상 분리해 낼수 없다는 단점을 갖고있다.

이같은 문제는 키탈 전국체를 사용한 효소입체특이 합성법으로 극복할 수 있었다.

미합중국 특허 제4,221,869호에서 NADH 재생용으로 글루코즈 디하이드로게나제 또는 알콜 디하이드로 게나제와 같은 이밖의 효소도 필요로 하기는 하지만, 코엔자임으로 NAD를 사용해서 형광균(pseudomonas fluorescens)으로부터 분리해낸 카르니틴 디하이드로게나제(E C 1.1.1.108)를 사용해서 디하이드로 카르니틴으로부터 L(-)-카르니틴을 제조하는 방법이 기술되어 있다. 더우기 디하이드로 카르니틴은 매우 불안정해서 자발적으로 아세토닐트리메틸암모늄과 이상화탄소로 분해된다.

특허출원 DE-OS 제3123975호에는 빵곰팡이(Neurospora crassa)로부터 분리된 γ-부티로베타인 하이드록시라제(E C 1.14.11.1)을 사용해서 γ-부티로베타인으로부터 L(-)-카르니틴을 제조하는 방법이 기술되어 있다.

이같은 하이드록시타제 반응기간중에는 배지에 α-캐토글루타르산과 환원제 (예 : 아스코베이트)를 첨가해 주어야만 한다.

L(-)-카르니틴의 수율을 최대로 하기 위해서는 산화효소(Catalase)가 또한 필요하다. γ-부티로베타인 하이드록시타제는 곰팡이생장, 분리, 세척 및 기계처리 또는 초음파처리를 이용한 포자의 정제 과정을 거쳐 수득된다.

L(-)-카르니틴 생합성의 전국물질은 L(-)-메티오닌 및 L-리신이다.

ε-N,N,N 트리메틸리신, ε- N,N,N 트리메틸 -β-하이드록시-리신과 N,N,N트리메틸아미노 부틸알데히드 중간체를 거쳐서 γ-부티로베타인이 수득된다. 이는 분자산소, α-케노글루타르산, 제1철이온 및 환원제 존재하에서 γ-부티로베타인 하이드록시라제에 의하여 하이드록실화시켜 L-카르니틴을 수득한다. 크로로노베타인은 생합성에서의 중간체가 아니다.

본 발명의 목적은 L(-)-카르니틴 생산의 공지된 방법의 단점을 제기한 제법을 제공하고 또 매우 경제적인 방법으로 목적화합물을 생화학적으로 제조할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 단순한 반응조건하에서 또 중간체 분리방법이 복잡하지 않은 방법으로 구입이 용이한 원료물질로부너 L(-)-카르니틴을 제조할수 있는 기술적으로 가능한 제법을 기술하는데 있다.

현재까지는 단지 다음의 사실이 알려져 있을 뿐이다.

(1) L(-)-카르니틴, D(+)-카르니틴 및 크로토노베타인은 대사(代謝)에 의하여 γ-부티로베타인을 생성한다.

(2) 엔테로박터(enterobacter) 성장자극은 크토토노 베타인 환원으로 수득되는 γ-부티로베타인 형성에 좌우된다(Arvh. Microbiol 132 (1982), 91내지 95).

(3) "클로스트리디움속 박테리아"는 혐기성 조건에서 크로론산을 부티르산으로 환원할 수 있다. (FEBS Lett 109, (1980), 244내지 246).

본 발명에 의하여 놀라웁게도 어떤 종류의 박테리아는 어느 특정조건하에서 크로토노베타인을 입체특이성을 갖고 L(-)-카르니틴으로 가수화시킬 수 있음을 발견하였으며, 이 제법을 사용하는 경우 배지내에는 γ-부티로베타인이 전혀 존재하지 알않다.

본 발명에서 사용되는 박테이라균주의예는 다음을 들수 있다.

에스캐리치아 클리속(Escherichia Coil ; E. coli 044 k74 ; 055 k59 ; 0 111 k58 ; 0 114 k90)

살모넬라속(Salmonella ; S typhimurium LT₂; cottbus; anatum; newington)

프로테우스속(Proteus; P. vulgaris; mirabilis)

이질균속(Shiglla; S. flexneri la)

하프니아속(Hafnia; H. alvei Biotyp A 및 B)

클로스트리디움(Clostridium; C. kluyveri; sporogenes)

시트로박리조속(Cltrobacter; C. freundii).

본 발명에 따라 복합배지 또는 최소배지에서 증식중인 박테리아 또는 휴지기세포에 크로토노베타인(4-N,N,N-트리메틸아미노 크로톤산) 또는 이의 염화물, 요드화물, 과염소산염, 질산염, 인산염등과 같은 염 또는 크로토노베 타인아미드, 니트릴 및 아틸 또는 알킬 에스테르를 첨가해 준다.

일정시간 동안 배양한 후, 생성된 L(-)-카르니틴을 반용배지로부터 분리한다.

배지 중의 크로토노베타인 농도 범위는 10μ몰 내지 5몰/ℓ이다.

표 Ⅴ, Ⅵ, Ⅶ에 수록한 바와같이 생성된 L(-)-카르니틴의 양은 크로토노베타인 농도가 증가하는데 따라 증가하게 되지만, 원료물질에 대한 퍼센트 수율은 감소하게 된다.

크로토노베타인으로부터 L(-)-카르니틴을 분리한후에, 잔존 크로토노베타인은 제사용 할 수 있다.

휴기지세포는 최소 배지내에서 C 또는 N 공급원을 함유하지 않거나 또는 함유된 C 또는 N 공급원이 박테리아에 의해 사용될 수 없는 염용액, 유기 및 무기완충 혼합물과 함께 배양시킨다.

배양시간은 통상 3시간 내지 5일 범위이나, 바람직하게는 12시간 내지 48시간이다.

크로토노베타인을 가수화 시킬 수 있는 박테리아는 고체 또는 액체의 보다 다향한 복합배지에서 증식가능하며, 따라서 육류, 이스트, 맥아 및 전분수 추출액을 함유하는 시판중의 영양배지를 부분적 험기조건에서 수산화암모늄, 우레아, 알콜, 카르보하이드레이트, 지방산을 포함하는 유기산 등과 같은 C 및 N 공급원을 첨가해서 사용할 수 있다. 배양은 험기성 조건하의 눈금부 시험관 내에서 교반없이 행한다.

크로토노베타인을 γ-부티로베타인으로 환원시키는 경우에는 L(-)-카르니틴합성 원료에 손실을 가져오게 된다.

따라서 이 환원반응은 험기성 호흡 및 기타물질의 전자수용체를 첨가해서 억제시킨다.

본 발명에서 사용되는 전자수용체의 예로는 산소, 질산염, 트리메틸아민, N-산화물 및 기타 N-산화물, 티메틸설폭 사이드, 글루코즈, 프럭로즈, 사카로즈, 말토오즈와 푸마레이트, 크로토네이트 및 아크릴레이트 등의 전자 수용체를 들 수 있으며, 그러나 이들예만으로 한정하는 것은 아니다(표 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ).

옥즙 또는 췌장펩프톤으로 보충한 시판 영양배지에서 증식시킨 박테리아는 크로토노베타인은 L(-)-카르니틴으로 가수화 시킬 수 있다. (표 Ⅸ).

L(-)-카르니틴 합성비율은 증대되었으나, 크로토노베타인 하이드록시라제가 생성되어 성장박테리아의 배지에 첨가됨으로서 크로토노베타인, D L-카르니틴, D L-카르니틴의 분획물에는 D(+) (타세메이트의 화학적 분할로 수득됨) 또는 그 유도체(예 : 카르복시 에스테르, O-아실-카르니틴 또는 O-아실카르니틴 에스테르가) 풍부하게 된다.

크로토노베타인, 그 염 또는 유도체는 다음의 공지방법에 따라 제조된다.

(1) D L-카르니틴, D(+)-카르니틴 또는 D(+) 풍부 D L-카르니틴을 황산 또는 아세트산 무수물로 탈수시키거나 또는 이와다르게 상응하는 O-아실 D L-카르니틴을 황산 또는 아세트산 무수물로 탈수시키거나 또는 이와다르게 상응하는 O-아실 D L-카르니틴 또는 O-아실 D-카르니틴으로 부터 산을 제거한다.

(2) 4-아미노 크로토네이트를 메틸할로겐나이드로 배기 메틸화 반응시킨다.

(3) 트리메틸아민을 4-할로겐치환크로트로네이트와 반응시킨다.

미반응 크로토노배타인 또는 수득된 γ-부티로베타인으로 부터 L(-)-카르니틴을 이온교환 크로마토그래피 방법에 따라 잘 분리할 수 있으나, ("Recent research on Carnitine" Ed. G. Wolf, 11-21페이지(1965) ; US-PS 4,221,869 ; DE-OS 3123975), 이 방법은 소량 제조시에만 사용할 수 있다.

L(-)-카르니틴은 하이드록시기를 배지의 아실클로라이트 및 긴사쓸 지방산과 함께반응시킨 후에 다량으로 분리할 수 있다.

생성된 O-카르니틴은 n-부탄올 또는 이소부탄올을 사용해서 수용액상으로 부터 추출할 수 있다(Biochim. Biophys. Acta 280, (1972), 422 내지 433).

O-아실 카르니틴은 유기상을 증발시켜 수득할 수 있다, 이 화합물은 생화학연구에 직접 사용하거나 또는 수산화 암모늄을 사용 L(-)-카르니틴으로 가수분해시킨후 치료용으로 사용할 수 있다.

수용액상에 잔존하는 크로토노베타인은 배지에 다시 환원시킨다.

생성된 L(-)-카르니틴은 아세틸 CoA 첨가후에 DTNB 법에 따라 카르니틴 아세틸트랜스퍼라제를 사용해서 측정한다. 10내지 100% 과잉량의 크로토노베타인은 L(-)-카르니틴 측정에 아무 방해를 일으키지 않는다.

본원 발명제법의 장점은 다음과 같이 열거할 수 있다.

(1) 라세메이트의 화학적 분할에 의해 수득되는 D(+)-카르티닌 또는 D(+)풍부 D L-카르니틴을 탈수시킴으로서 L(-)-카르니틴합성용으로 저렴한 원료물질인 크로토노베타인을 수득한다.

(2) 본 발명 제법에서는 어떠한 생화학물질 또는 기타 효소의 사용도 필요로 하지 않는다.

(3) 배양 비용과 원료물질 비용이 매우 저렴하다.

다음의 실시예로서 본 발명을 상세히 설명한다.

그러나 본 발명을 이들 실시예에 한정하는 것이 아님을 주지해야 한다.

[실시예 1]

크로토노베타인과 함께 다음의 복합배지를 포함하는 500㎖ 반응용기를 5% 혈액아가액으로 사전에 성장시킨 E. Coli 044 k74를 생리학적 용액에 현탁시킨 현탁액을 접종한다.

췌장페프톤 20g/ℓ 2회증류 H₂O

염화나트륨 5g/ℓ 〃

크로토노베타인 50m몰/ℓ 〃

pH7(ΔE₅₄₀=0.050)

반응 플라스크를 바로 파라핀유로 씌우고 또, 37℃에서 배양한다.

표 Ⅰ은 배양시간 및 박테리아 성장과 관련하여 L(-)-카르니틴 생성을 나타내고 있다.

[표 1]

L(-)-카르니틴합성, 배양시간 및 박테리아 성장간의 관계

[실시예 2]

크로토노 베타인 함유 복합배지를 E coli로 접종하여(실시예 1) 24시간 배양한 후에 600rpm으로 원심분리하여 성장 박테리아를 분리한다. 수득한 원심분리 잔존물을 pH7.5에서 소렌센법에 따른 0.01M인산염완충액(0.20g/ℓKH₂PO₄및 3.05g/ℓ Na₂HPO₄·12H₂O)으로 세척하고 5g/ℓ크로토노베타인(34.9m몰/ℓ)을 함유하는 1ℓ소렌센인산염 완충약에 현탁시킨후(ΔE₅₄₀=0.080) 또 37℃로 24시간 동안 유지한다. 이를 바로 재차 원심분리하여 용액중에 9.08m 몰/ℓ의 L(-)-카르니틴이 존재함을 확인하였다.

크로토노베타인에 대하여 26%수율.

[실시예 3]

L(-)-카르니틴을 함유하고 또 실시예 1에서와 같이 접종시킨 복합배지(31m몰/ℓ ; 5g/ℓ의 L-카르니틴에 해당됨)에 수종의 엔테로박테리아 군주와 함께 험기성호흡 및 기타물질 [나트륨 석신에이트, 나트륨푸마레이트 및 글루코즈(10g/ℓ), 질산칼륨, 트리메틸아민, N-산화물(TMO)(5g/ℓ)의 전자수용체를 첨가한다.

표 Ⅱ 에는 사용한 : L(-)-카르니틴에 대한 γ-부티로베타인의 수율을 몰수로 표시하였다.

[표 II]

L(-)-카르니틴의 γ-부티로베타인환원시 전자 수용체 및 기타물질의 영향

[실시예 4]

실시예 1에서 기술된 복합배지(KM)또는 다음 조성을 하유하는 최소배지(MM)에 50몰의 크로토노베타인과 함께 나트륨 푸말에이트(10g/ℓ), 질산칼륨(5g/ℓ)및 트리메틸아민 N-옥사이드(5g/ℓ)를 첨가한다.

NaHPO₄12H₂O 15.0g CaCl₂0.014g

KH₂PO4 3.0g FeCl₂0.0002g

NH₄Cl 1.0g D-리보즈 7.5g

MgSO₄7H₂O 0.15g 증류수를 첨가해 1ℓ 만듬.

이어 이를 37℃의 파라핀증 존재하(험기성조건) 또는 파라핀층 부재화(호기성조건)에서 E. coli 044 k74와 함께 48시간 동안 배양한다.

[표 Ⅲ]

성장 박테리아 중에서 전자수용체가 L-카르니틴 생성에 미치는 영향

[실시예 5]

500몰/ℓ의 크로토노베타인을 함유하는 복합해지(KM) 또는 최소배지(MM)를 E. coli 044 k74로 접종하고 또 48시간 동안 배양한다.

수거해서 2회 세척한 세포(실시예 2)를 실시예 4에서와 같이 전자수용체가 첨가된 50몰/ℓ의 크로토노베타인을 함유하는 소렌센 완충액 중에서 48시간 동안 배양한다.

[표 Ⅳ]

휴지기세포를 이용한 L-카르니틴 제조에서 전자수용체의 영향

[실시예 6]

C공급원으로 D-리보즈를 보충하고(실시예 4) 크로토노베타인농도를 여러가지로 변화시킨 최소배지(MM)을 E. coli 044 k74로 접종하고(실시예 1) 또 37℃에서 48시간 동안 배양한다.

[표 Ⅴ]

각종 크로토노베타인 농도에서 최소배지에서 증식시킨 박테리아를 이용한 L(-)-카르니틴 합성

[실시예 7]

각각 8g/ℓ의 L(-)-카르니틴을 함유하는 실시예 1에서 기술한 것과 같은 복합배지(A)와 실시예 4에서 기술된 것과 같이 D- 리보즈로서 보충된 최소배지(B)를 E. coli 044k74로 접종한다.

48시간후 수기해서 2회 세척한 박테리아를 각종 농도의 크로토노베타인을 함유하는 소텐센 완충액에 현탁시키고 또 37℃에서 48시간 동안 배양한다.

[표Ⅵ]

각종 크로토노베타인 농도에서 L(-)-카르니틴에 의해 유도된 휴지기세포에 의한 L(-)-카르니틴 합성

[실시예 8]

실시예 1에서와 같이 크로토노베타인을 함유하여 E. coli 044 k74로서 접종시킨 복합배지는 48시간 후에 원심분리한다. 원심분리 잔존물을 2회 세척해서 C 및 N 원 없이 각종 농도의 크로토노베타인을 함유하는 최소배지에 분산시키고 또 48시간 동안 배양한다.

[표 Ⅶ]

각종 크로토노베타인 농도에서 크로토노베타인에 의해 유도된 휴지기세포에 의한 L(-)-카르니틴 합성

[실시예 9]

크로토노베타인 대신으로 50m 몰/의 L(-)-카르니틴을 함유하는 실시예 4에서 기술한 바와같은 최소배지를 E. coli 044 k74로 접종하고 또, 48시간동안 배양한다.

이어 수거해서 2회 세척한 박테리아를 C 및 N원은 존재치 않지만 50m몰/ℓ 의 크로토노베타인이 존재하는 최소배지에서 37℃로 배양한다.

배양초기의 광학밀도는 ΔE₅₄₀=0.210이었다.

[표 Ⅷ]

시간 경과에 따른 휴지기 세포의 L(-)-카르니틴 생성

[실시예 10]

표 ⅩⅠ에 표시된 물질을 50m 몰/ℓ농도로 첨가하고 C 공급원이 부재하는 복합배지(KM) 또는 최소배지(MM)를 E. coli 044 k74로 접종하고, 또 48시간동안 배양한다. 이어 수거한 박테리아를 소텐센 완충액으로 2회 세척하고 50m 몰/ℓ 의 크로토노베타인과 함께 소텐센 완충액 중에서 48시간 동안 배양한다.

[표 ⅩⅠ]

성장 배지에 각종 물질 첨가에 따른 휴지기 세포의 L-카르니틴 형성

+D L -γ 아미노 β-하이드록 시부틸산

Claims

이, 콜리 044 k74로 아래물질을 출발물질로 하여 L-카르니틴으로 가수화시킴을 특징으로 하는 L(-)-카르니틴 제조방법.

출발물질 : 크로토노 베타인, 크로토노베타인의 니트릴, 아미드, 아릴 또는 알킬 에스테르유도체, 크로토노베타인의 염소화물, 요도화물, 과염소화물, 질산염 또는 인산염.
제1항에 이어서, 반응배지에서의 크로토노베타인농도 범위가 10μ몰 내지 5몰/ℓ인 L(-)-카르니틴 제조방법.
(정정) 제1항에 있어서, 산소, 질산염, 트리메틸아민 N-산화물 및 기타 N-산화물, 글루코즈, 푸럭토즈, 사카로즈, 말토오즈, 디메틸설폭사이드, 푸마레이트, 크로톤에이트, 아크릴레이트 등과같이 크로토노 베타인의 γ-부티로베타인으로의 환원을 억제시키는 호흡용 전자수용체, 수소수용체 및 기타 기질을 첨가해준 시판 복합영양배지 또는 최소영양배지에서 배양을 행하는 L(-)-카르니틴 제조방법.
제1항에 있어서, L(-)-카르니틴 합성이 유도 휴지기 세포에 의해 행해지며, 또 이같은 유도가 성장 박테리아 배지에 크로토노베타인, L(-)-카르니틴 합성이 유도 휴지기 세포에 의해 행해지며, 또 이같은 유도가 성장 박테리아 배지에 크로토노베타인, L-(-), D(+), D L-카르니틴 유도체(예 : 카르복실산에스테르, O-아실카르니틴 또는 O-아실카르니틴에스테르) 및 그 염을 첨가해서 이루어지는 L(-)-카르니틴 제조방법.
제1항에 있어서, 크로토노베타인이 박테리아 성장의 제1상에서 L(-)-카르니틴 합성용 원료물질로 사용되는 L(-)-카르니틴 제조방법.