KR830001258B1 - 미생물에 의한 l-글루타민의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

미생물에 의한 L-글루타민의 제조방법

본 발명은 발효법에 의한 L-글루타민을 제조할 때 토양에서 분리한 코리네박테리움속의 글루타민산 생산균주를 얻고 이 균주를 친주로 변이처리하여 L-로 이신을 생육에 요구하며 알라닌에 의해서 생육이 촉진되는 L-글루타민 생산균주를 분리 당류를 주원료로 하는 배지에 호기적으로 배양하여 다량의 L-글루타민을 축적시켜 이를 회수 분리하는 신균주를 이용한 L-글루타민 제조방법에 관한 것이다.

L-글루타민은 아미노산의 일종으로써 영양제 및 소화기궤양치료제, 알콜중독치료제, 뇌기능개선제등 의약용으로 크게 각광을 받고 있는 물질이다.

종래의 발효에 의한 L-글루타민의 제조방법은 일본특허공보 소 39-7391호에 글루타민산 생산균주를 과잉의 질소원이 함유되어 있는 배지에 배양하는 방법이, 일본 특허공보 소 51-16588호에 항생물질 또는 계면활성제를 배양액 내에 첨가하는 방법이, 또는 일본 특허공보 소 49-81587호에 설파제 내성균주를 분리 배양하는 방법등이 알려져 있으나, 질소과잉의 배지에서는 균주의 정상적인 생육이 불량하므로 다량의 금속염을 첨가시켜 질소과잉에 의한 균의 생육저해를 제거시켜야 할뿐 아니라 설파제 내성균주를 분리하여 배양할때나 항생물질 혹은 계면활성제를 첨가하여 배양할때는 당시 사용균주의 종류나 그 균주의 생육조건, 균주의 생육상태에 따라 약제의 처리시간, 처리농도등의 방법이 달라 공업적으로 여러가지 어려운 문제점들이 있는 방법이었다.

본 발명은 이러한 제문제점을 해결하기 위하여 코리네박테리움속의 영양요구성 변이주를 이용하여 당질을 주원료로 하는 영양배지에 L-글루타민 축적을 위한 발효를 행한결과 L-글루타민 축적이 대당수율 45%이상으로 증가했을 뿐만 아니라 배양시 설파제나 항생물질을 첨가시킬 필요가 없는 새롭고 공업적으로 매우 유용한 방법을 발명한 것이다.

구체적으로 설명하면 본 발명은 미생물에 의하여 L-글루타민을 제조할때에 생육에 L-로 이신을 요구하며 알라닌에 의해 생육이 촉진되는 특성을 가진 코리네박테리움속의 변이주 MWM-791012(KFCC-10032)를 당질을 주원료로 하는 영양배지에 호기적으로 배양하여 배양액내에 다량의 L-글루타민을 축적시키는 것을 특징으로 하는 방법 발명인 것이다.

본 발명의 신균주는 토양에서 분리한 코리네박테리움 NO 462인 글루타민산 생산균주를 친주로 변이처리하여 각종 영양요구주, 항생물질 내성균주, L-글루타민 아날로그 내성균주등을 분리 이들 변이주에 의한 L-글루타민의 발효적인 제조방법을 연구해오던중 생육에 L-로이신을 요구하며 알라닌에 의해서 생육이 촉진되는 새로운 균주 MWM-791012(KFCC-10032)가 L-글루타민 생산축적을 현저히 증가시키는 것을 알고 본 발명을 완성하게 된 것이다.

본 발명에 이용한 신균주의 분리방법은 토양에서 분리한 글루타민산을 생산하는 코리네박테리움속의 균주 NO 462를 친주로 통상의 변이처리 즉, 자외선조사를 하거나 NTG(N-메칠-N'-메칠-N-니트로소구아니딘), DES(디에칠설페이드)등의 화학변이유기제를 처리하여 페니실린농축법이나 리플리카방법등으로 선별된 균주를 분리용 액체배지에 배양한후 L-글루타민의 축적을 분석하여 본 발명의 신균주를 분리하게 된 것이다.

분리배지의 조성은 포도당 10%, 염화암모늄 3%, 제1인산카리 1%, 제2인산카리 1%, 황산마그네슘 500mg/

, 황산망간 10mg/

, 치아민염산염 1mg/

, 육즙 0.5%, L-로이신 50mg/

, 알라닌 50mg/

, pH7.2 탄산칼슘 5%(별도멸균첨가)이다.

분리배지에서의 배양방법은 상기배지 10ml를 50ml삼각후라스크에 분주하여 분리한 변이주를 접종하여 온도 30℃에서 72시간 진탕배양했다.

이와 같은 방법으로 선별 분리한 본 발명 신균주의 균학적성질을 조사한 결과는 다음에 상세히 기재하는 바와 같다.

실험방법은 메뉴얼 오프마이크로바이올로지칼 메소드(Manual of Microbiblogical method : H.J. Conn and M.W. Jennison, Society of American bacteriologist, 1957)에 기재된 방법에 준하여 행하였다.

현미경적 성상

19) 본 발명의 신균주를 그래이와 타텀배지(Gray and Tatum)를 근거한 최소배지에 접종했으나 생육하지 못했으며 최소배지에 로이신을 첨가하여 생육을 했다.

그러므로 본 발명의 신균주는 생육에 로이신을 요구한다는 것을 알게 되었고 또한 로이신과 알라닌을 함께 첨가했을 경우에는 로이신 단독첨가시보다 생육이 촉진되어 본 발명의 신균주는 생육에 로이신을 필요로 하며 알라닌에 의해서 생육이 촉진되는 것이 확실하다.

또한 본 발명 신균주의 친주를 당질을 함유하는 영양배지에 호기적인 방법으로 배양했을 때 글루타민 축적량은 흔적으로 밖에 축적되지 않는 반면 글루타민산의 축적은 현저했다. 그러나 본 발명의 신균주를 동일한 배지에 배양했을 때 글루타민산의 축적이 거의 나타나지 않는 대신 글루타민의 생성이 현저히 증가했다.

20) 유기산의 생성 : 포도당 배지에서 α-케토글루탈산, 젖산이 미량 생성

21) 당자화성

상기와 같은 균학적성질을 갖는 본 발명의 신균주를 버지스메뉴얼(Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology) 7,8판을 이용하여 분류 동정해본 결과 코리네박테리움속에 속하는 것을 알게되어 코리네박테리움 MWM-791012라 명명하고 이를 변이처리전 친주의 균학적성질과 비교해 본 결과 다음표 1에 기재된 바와 같이 균주의 생리학적성질이 상이하게 나타났다.

[표 1]

[친주(코리네박테리움 NO 462)와 변이주(MWM-791012)의 균학적 성질]

주 1) 최소배지 : 그레이와 타텀배지의 변형 : 포도당 5%, 염화암모늄 0.5%, 질산암모늄 0.1%, 황산나트륨 0.2%, 황산마그네슘 0.01%, 제1인산카리 0.1%, 제2인산카리 0.3%, 비오틴 10r/

, 치아민 1mg/

, 미량원소혼합액 1ml (미량원소혼합액 조성 : 소딩움테트라보레이트 90mg, 암모니움멜리보데이트 40mg, 염화철 1g, 황산아연 800mg등을 혼합하여 증류수 1

에 용해한것)

주 2) +++: 생육양호 +: 생육보통± : 생육불량 - : 생육불능

* : 발효배지(후기 실시예 1참조)에서 72시간 배양하여 분석한 것임.

표 1에서 기재된 바와같이 본 발명의 변이주 MWM-791012는 L-로이신 요구성 균주이고 알라닌에 의해 생육이 촉진되며 글루타민을 다량으로 축적시키는 특성을 가지고 있다.

본 발명의 새로운 변이주가 현저하게 L-글루타민을 배양액내에 축적시키는 원인에 대해서 아직 이론적으로 명확히 밝혀지지 않았으나 L-글루타민생합성의 특정한 효소활성에 변화가 있거나 L-글루타민 발효의 부산물로 축적되는 알라닌, L-로이신등의 합성계 효소가 손상을 받아 L-글루타민합성계 효소의 활성에 영향을 주기 때문인 것으로 판단된다.

본 발명에 사용한 발효배지로는 공업적으로 값싼 당질원료 즉, 포도당, 과당, 폐당밀 및 전분가수분해물등이 이용가능하며, 무기질소원으로 암모니아가스, 암모니아수, 염화암모늄, 유안, 요소, 인산암모늄등이, 천연의 영양원으로 콘스팁리커(CSL), 육즙, 효모엑기스, 펩톤, 대두박분해물등이 사용가능하며, 무기염류는 황산마그네슘, 염화아연, 제1인산카리, 제2인산카리, 황산망간등을 혼합첨가한 배지면 이용가능하다.

배양방법은 온도 25-35℃, pH5.5-7.5로 유지하면서 호기적으로 2-3일간 배양하며, 축적된 L-글루타민은 상법에 따라 이온교환수지에 흡착, 용리액을 얻고 여기에 에탄올을 처리 정제하여 조결정을 얻는다.

이하 실험방법은 실시예에서 상세히 기술한다.

[실시예 1]

사용균주 : 코리네박테리움 MWM-791012(KFCC-10032)

종배지 : 포도당 5%, 펩톤 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 요소 0.3%, 비오틴 30r/

,pH7.0

발효배지 : 포도당 10%, 염화암모늄 3.5%, 유안 2%, 콘스팁리커(CSL) 0.5%, 육즙 0.7%, 제1인산칼륨 0.2%, 제2인산칼륨 0.2%, 황산마그네슘 300mg/

, 황산철 10mg/

, 황산망간 10mg/

, 황산아연 10mg/

, 치아민염산염 1mg/

, 요소 0.5%, pH7.0, L-로이신 400mg/

, 알라닌 30mg/

, 탄산칼슘 5%(별도멸균첨가) pH7.2

배양방법 : 상기 종배지 50ml를 500ml진탕후라스크에 분주하여 상법에 따라 가압 멸균한 후 본 발명의 신균주 MWM-791012 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 동안 진탕배양하여 종균배양액으로 한다. 발효배지 20ml를 500ml진탕후라스크에 사입하고 120℃에서 10분간 가압 멸균한 후 미리 준비한 종균배양액을 2ml 접종하여 30℃에서 72시간 배양한다.

발효완료후 배양액내의 L-글루타민 축적량은 49..6mg/ml였다.

[실시예 2]

실시예 1의 발효배지에서 탄산칼슘을 제외한 배지 2

를 사입하여 멸균한 5

소형 발효조에 미리 준비한 종균배양액을 200ml접종하고 600rpm, 1.5vvm의 조건으로 30℃에서 48시간 배양한다. pH조절은 암모니아수로 6.0-7.0으로 조절한다.

배양종료시 L-글루타민축적량은 56.3mg/ml였다.

발효완료액 1

을 균체를 제거한후 상법에 따라 이온교환수지에 흡착 분리하여 용리액을 얻고 여기에 에탄올을 처리 L-글루타민조결정 48.4g을 얻었다.

[실시예 3]

실시예 2의 발효배지중 포도당 대신 페당밀을 포도당으로 10%되게 환산하여 첨가한 발효배지 2

를 5

소형 발효조에 사입하여 120℃에서 15분간 멸균한다.

여기에 미리 준비한 종균배양액 200ml를 접종하여 600rpm, 1.5vvm의 조건으로 30℃에서 48시간 배양한다. 그외 배양방법은 실시예 2와 동일하게 행한다.

발효종료시 배양액내의 L-글루타민축적량은 52.7mg/ml였다.

[실시예 4]

실시예 2의 발효배지중 포도당 대신 전분가수분해물을 포도당으로 10%되게 환산하여 첨가한 발효배지 2

를 5

소형발효조에 사입하여 120℃에서 15분간 멸균한다.

여기에 미리준비한 종균배양액 200ml를 접종하여 600rpm, 1.5vvm의 조건으로 30℃에서 48시간 배양한다. 그외 배양방법은 실시예 2와 동일하게 행한다.

발효종료시 배양액 내의 L-글루타민축적량은 53.4mg/ml였다.

Claims (1)

1. 미생물에 의해 L-글루타민을 제조함에 있어서 생육에 L-로이신을 요구하며 알라닌에 의해 생육이 촉진되는 특성을 가진 코리네 박테리움속의 변이주 MWM-791012(KFCC-10032)를 당질을 주원료로하는 영양배지에 호기적으로 배양하여 배양액내에 다량의 L-글루타민을 축적시키는 것을 특징으로 하는 발효에 의한 L-글루타민의 제조방법.