KR810000686B1 - 피페리딘 유도체의 제조법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

피페리딘 유도체의 제조법

본 발명은 혈당저하물질인 모라노린(2-하이드록시메틸-3, 4, 5-트리하이드록시 피페리딘)을 발효법에 의해서 제조하는 방법에 관한 것이다. 혈당저하물질 모라노린은 생약 쌍백피로부터 추출 단리되어 그의 의약품으로서의 유용성은 이미 명백히 되어 있다. (야기(八木)등 「일본농예화학회지」50권 571페이지(1976년) 및 특개소(特開昭) 52-83591호 공보).

본 발명자 등을 이 유용한 혈당저하물질 모라노린의 발효법에 의한 제조법에 대해서 광범위하게 연구한 결과 스트렙토미세스에 속한 균군(菌群)이 모라노린을 산생(産生)한다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명에 있어서의 사용균주는 스트렙토미세스 속에 속한 모라노린 생산균이라면 어느것이나 좋으나 그 대표적인 것의 하나로서 본 발명자 등이 삽뽀로시(札幌市)에서 채취한 토양에서 분리한 SEN-158호 주(株)를 예를들 수 있다. 해(該) SEN-158호 균주는 균학적 검색의 결과 스트렙토 마이세스.

라벤듀레(Streptomyces lavendulae)에 속한 균과으로 동정되고 스트렙토 마이세스. 라벤듀레 SEN-158(Streptomyces lavendulae SEN-158)로 명명되어 공업기술원 미생물 공업 기술연구소에 미공연균기(微工硏菌寄) 제4301호로서 기탁되어 있으며 그 균학적 성상은 다음과 같다. 또한 실험방법으로는 인터내쇼날. 스트렙토미세스. 푸로젝트(I. S. P)의 실험법(E. B. Shirling et al Intern. J. Systematic Bacterial. vol. 16(3) p. 313-340. (1966))에 준했다. 또한, 배지는 상기 문헌 이외에 산업별 심사 기준 응용미생물공업 및 왁쓰만 저(著)(S. A. Waksman; The actinomyces Vo1. 2. 1961)에 예시되어 있는 것을 사용했다. 또한, 색조의 기제는 콘테이나 코-포레이숀. 오브. 아메리카(Container Corporation of America)의 카라-. 하-모니-. 매뉴알(Color Harmony manual)을 참조하면 필요한 경우에는 이것을 부기했다.

(I) ISP의 방법에 의한 기제

(a) 형태학적 특징

현미경하에서 잘 분지(分枝)한 기중균사(基中菌絲)를 다수 신장하고 10개 이상의 단주상(短柱狀)〔(0.8-1.0)×(1.0-1.2)μ정도〕의 포자의 연쇄를 확인할 수 있다. 기생균사의 선단은 훅크상, 루-프상, 칼상을 정(呈)하고 ISP의 기준에 의하면 쌕숀 레티나쿠리아파-티(Section Retinaculiaperti)에 속한다. 또한 동시에 길게 느린 1-2회, 때로는 그 이상의 나선(螺旋)을 확인할 수 있다. 기중균사의 분단은 확인되지 않는다. 전자현미경에 의한 포자 표면구조는 평활형이다. 이 형태는 스타-치 무기염배지, 그리세롤. 아스파라긴 한천배지, 오-트밀 한천 배지로서 관찰된다. 또한 이-스트 맥아 한천배지상에는 직상의 기균사(氣菌)가 대부분이나, 동시에 훅크상, 루프상, 컬상의 혼재(混在)를 확인할 수가 있다.

(b) 코로니-의 색

포자를 충분히 착생한 기균사의 색조는, 이-스트. 맥아 한천배지, 그리세롤. 아스팍타긴 한천배지, 오-트밀 한천배지, 스타-치. 무기염 한천배지에 있어서, 적색계(Tresner Backus wheels)이다. 즉, 배양초기에 있어서 백색이나, 후에 라벤다-(5ec-6ec)를 정(呈)하고 회미(灰味) 적색(5ge)에 이른다.

(c) 영양균사(코로니-이면의 색)

뚜렷한 색소산생을 확인할 수 없다. 즉, 이 -스트. 맥아한천배지상에서는 담갈색. 오-트밀 한천배지상에서는 무색 내지 담갈색, 스타-치무기염 한천배지, 그리세롤. 아스파라긴 한천배지 상에서는 무색-회색-담회색을 정한다. 이들을 색소는 pH인디케이타(pH indicator)는 아니다.

(d) 배의의 색(가용성 색소)

메라노이드 색소의 산생 : 양성

이스트 맥아한천 배지상에서 박다색(縛茶色)으로 되는 이외에 색소 산생은 안한다.

(e) 탄소원의 이용성

ISP 기제당의 이용성

D-그루코-스를 잘 이용한다. L-아라비노스, 슈-크로-스,

D-키시로- 스, D-후락토-스, 라휘노-스, L-이노시톨,

D-만니톨, 람노-스를 이용하지 않는다.

기타의 당의 이용성

만노-스, 말토-스, 사리신을 이용하나, 유당, 가락토-스, 이뉴린을 이용하지 않는다.

(Ⅱ) 기타의 성상

(a) 배양기상의 성상(27℃, 14일간 배양)

기타의 배양기상의 성상

그루코-스. 렙톤. 젤라틴 배지

생육은 양호하며, 라벤다-색의 기균사를 착생하고, 영양균사는 박다(薄茶)로서, 가용성 색소는 갈색-흑갈색, 젤라틴을 약하게 액화한다.

세루로-스

차아펙의 질산염 용액, 쓰아펙의 염화 암모늄 용액의 어느 것이든 생육불량.

트립프톤 이-스트 배양액

생육은 양호하며, 가용성 색소는 담갈색(때로는 흑갈색)을 정(呈)한다.

(b) 생리적 성상

(1) 젤라틴의 액화 : 양성(약함)

(2) 질산염환원성 : 양성(약함)

(3)스타-치의 수해능 : 양성

(4) 밀크의 응고 : 음성

(5) 밀크의 펩프톤화 : 양성(약함)

(6) 유화수소의 산생 : 음성

(7) 메라노이드 색소의 산생 : 양성

(8) 티로시나-제 : 음성

(9) 생육온도 범위 : 5℃, 10℃, 13℃, 17℃, 22℃, 26℃, 30℃, 34℃, 37-38℃, 42℃, 46℃, 50℃ 로 실험 10℃이하. 42℃이상에서는 생육하지 않으며, 13℃, 37-38℃의 생육은 불량, 기타는 어느것이나 생육 양호이나 약 26℃가 최적온도.

(10) 생육 pH 범위 : pH4.5-9.0에서 생육, pH6-pH7.5가 최적

(11) 세루라-제 : 음성

이상의 균학적 성상으로부터 본 발명에 사용하는 균주(SEN-158주)는 스트렙토미세스 속에 속한다.

본 균주는 적색계의 기균사(라벤다-색)를 갖으며, 레티나쿠리아파-티-(Retinaculiaperti)형의 형태적 특징을 갖고, 포자표면은 평활형이며, 영양균사, 가용성 색소는 특징적인 색소산생이 없으며, 메라닌 색소의 생산성은 양성인 점등이 주된 특징이다. 이러한 점을 고려하여 문헌〔Shirling, E. B. and Gott:eb, D, Intern, J. Systematic, Bacteriol., 18(2) 69-189(1968); 18(4) 279-392(1968); 19(4) 391-512(1969); 22(4) 265-394(1972). S. A. Waksman; The actinomyces V012(1961)〕을 검색한 결과 스트렙토미세스.

라벤듀레의 범주에 속한다고 동시에 정하여 졌다. 더욱이 SEN-158주는 혈당저하물질 모라노린을 산생한다고 하는 유용한 특징을 갖고 있다는 것을 발견했기 때문에, 스트렙토마이세스. 라벤듀레 SEN-158(Streptomyces lavendulae SEN-158)이라 명명하고 공지의 균주와 구별했다. 본 발명에 있어서의 사용균으로서는, 상기한 스트렙토미세스 라벤듀레 SEN-158 및 본 균주를 변이(變異)처리한 변이주 뿐만 아니라, 스트렙토미세스 속에 속하고, 모라노린을 생산하는 균이라면 모두 사용할 수가 있다.

본 발명의 실시예에 있어서는 스트렙토미세스. 라벤듀레 SEN-158주를 통상의 미생물의 배양방법으로 배양할 수가 있다. 배지의 영양원으로서는 일반적으로 미생물의 배양에 이용되는 것이 사용된다. 즉 탄소원으로서는 그루코-스, 전분, 그리세린 등이, 질소원으로서는, 대두분, 펩프톤, 육엑키스, 콘. 스티-프리카-등이 사용된다. 기타 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄, 탄산칼륨의 적량을 가하며는 양호한 결과를 얻고 더욱 미량의 철, 마그네슘의 황산염 등을 가하여도 좋다. 배양방법으로서는 정치배양, 진탕배양, 심부교반 통기 배양의 어느 것이든 좋으나 심부 교반 통기배양이 보다 바람직하다. 배양온도는 22-30℃, 바람직하게는 25-27℃, pH6-8로서 배양하며는 통상 48-72시간 동안에 모라노린이 배양액중에 생산된다. 모라노린을 배지중에서 추출, 단리(單離)하는 방법으로서는, 통상의 수용성물질의 추출, 정제를 위한 각종의 조작이 광범하게 채용 가능하다. 예를 들면, 활성탄흡착법, 이온교환법, 포리아미드, 세파덱스, 세루로-스, 시리카겔등의 컬럼을 사용하는 크로마토 분획법(分劃法), 향류(向流) 분배법 등을 모라노린의 추출, 분리, 정제법으로서 이용할 수가 있으며, 그중에서도, 이온교환법, 활성탄을 사용하는 분획법은 가장 유리하게 실시할 수가 있다. 이하 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

[실시예]

그루코-스 1%, 육엑기스 0. 5%, 펩프톤 0. 5%, 염화나트 0. 5%, 탄산칼슘 0. 3% pH7의 조성의 배지 200㎖를 500㎖용(容) 삼각 후라스크에 취하고, 상법에 따라 멸균후 여기에 스트렙토미세스. 라벤듀레 SEN-158주의 사면 배양으로부터 수백금이포자(數白金耳胞子)를 접종하고, 28℃에서 3일간 200회전으로 진탕 배양한다. 얻어진 균액 600㎖를 전분 2%, 대두분 1%, 염화칼륨 0.05%, 황산 마그네슘(7수화물) 0. 05%, 염화나트륨 0. 5%, 질산나트륨 0. 2% 탄산칼슘 0. 35%의 조성의 배지 7ℓ를 14ℓ 용자-. 화-멘타-에 넣고, 여기에 접종한다. 이것을 교반용 펜(Fan)에 매분 300회전, 통기량 매분 6-7ℓ, 온도 28℃로서 48-72시간 배양한다. 여기서 얻은 배양액 12ℓ에 하이후로스-파-셀 3kg을 가하여 여과하고, 여액에 메탄 올 4ℓ를 가한후 활성탄(화광 특급 활성 탄소분말) 500g을 가하고 30분간 교반하여, 활성탄을 여별한 후, 이온 교환수지 다우엑스 1×2(OH^-) 2ℓ의 카람을 통과시킨다. 유출액을 이온 교환수지 다우엑스 50W×4(H⁺) 500㎖의 카람을 통과시켜, 카람을 수세후, 0. 5% 암모니아수로서 흡착물을 용출시킨다.

용출액을 감암하 건고하고 물 100㎖에 용해한 후, 활성탄 2g을 가하여, 30분간 교반한다. 활성탄을 여거하고, 여액을 재차 다우엑스 1×2(OH^­) 200㎖의 카람을 통과시켜, 유출액을 재차 다우엑스 50W×4(H⁺) 200㎖의 카람에 통한다. 카람 수세후 0. 28%의 암모니아수로서 흡착물을 용출시키고, 용출액을 감압하 건고하고 잔류물을 소량의 메탄올에 용해하여 방치하면, 모라노린의 무색결정이 석출한다. 수량 600㎎ 모라노린은 산, 알카리에 안정한 물에 이용(易溶) 알코올에 난용, 에-텔, 벤젠, 클로로포름에 불용인 무색결정으로서 얻어지며 용점은 204-205°,

(물)을 나타낸다.

Claims (1)

1. 스트렙토미세스 속에 속한 모라노린 생산균 스트렙토 마이세스. 라벤듀레 SEN-158(미공연 Ferm-No. 4301)을 영양지배중에서 배양하고, 배지중에 모라노린을 생성시키고, 이것을 채취(採取)함을 특징으로 하는 모라노린의 제조법.