KR790001475B1 - 단세포 단백질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

단세포 단백질의 제조방법

본 발명은 단세포 단백질의 제조에 관한 것이다.

세계적인 단백질 부족을 해결하려는 노력으로서는 생화학 적으로 얻어질 단세포 단백질(SCP)이 여러가지 함-탄소 기계상에서의 여러가지 미생물 성장으로 얻어지는 광범위한 생합성 공정이 있다. 기제로서 사용되는 탄소와 에너지원은 널리 취득용이한 것으로서 비교적 저렴하고, 균일하며 또한 미생물 전환으로 종국적으로 얻어진 단백질 생성물내에 유해한 잔유물을 남기지 않는다는 점에서 안전하여야 한다. 석유탄화수소가 탄소와 에너지원으로서 사용되어 왔으나, 이것은 수용성이 부족하다는 점과 미생물 전환을 돕는 산소의 소모가 크다는 점과 단백질 생성물에 고착되었거나 도입되는 석유 원류에 흔적량의 잠재적 암종(癌腫) 유발 물질이 들어있다고 주장되는 점에서 실제적인 난점에 당면하여 왔다.

기타의 공정은 원료로서 산화된 탄화수소 유도체를 사용하는 점에 증접을 두어왔다. 왜냐하면 미생물 전환 공정은 주로 수용성 조건하에서 수행됨으로 상기 원료의 수용성과 이에 따른 취급용이성 때문이었다. 이와 같은 원료는 석유원, 천연깨스원, 여러가지 패기공정 및 메탄의 전환 등으로부터, 또한 여러가지 곡물 발효등과 목재의소각 증류등으로부터 용이하게 얻을 수 있다. 이들의 산화된 탄화수소는 이의 공급원이 무엇이든지 간에 널지 취득할 수 있으며, 발효 공정에 대하여 비교적 같이 저렴한 원료이다. 이들 원료는 부분 산화되어 있다는 점에 이점이 있으며, 따라서 미생물 전환-생장 공정에 대하여는 실질적으로 분자상 산소 소요량이 감소된다. 그러나 단세포 단백질 공정의 시장성에 있어서의 기타 난점과 제한인자는 약 20-50℃의 비교적 중간온도, 더욱 바람직하게는 약 35℃이하의 온도에서 작용하여야 하는 필요성이 되어 왔다. 미생물 전환은 다량의 열이 생성되는 높은 발열 산화 반응이며 이 열은 연속적으로 일관성 있게 제거되어야 하며, 그렇지 않으면 시스팀이 과열되어(미생물이 죽게되고, 또는 온도가 상승함에 따라 당면하게 되는 성장이 있고 적어도 심한 제한을 받으며, 따라서 효율이 심히 감소된다. 여러가지 공정은 미생물로서 하나 또는 기타 여러가지 취득 용이한 효모의 이용에 집중하여 왔다. 여러가지 효모가 이용가능하며, 효모세포는 일반적으로 박테리아 세포보다 약간 커서 발효공정에서 종종 분리하기 용이하다.

그러나 일반적으로 효모로부터 얻을 수 있는 생성물에 비하여 박테리아로부터 얻어진 세포의 조단백 성분 함량이 높고, 효모는 그들 세포에 높은 비율의 비단백 구조물질을 갖고 있기 때문에 박테리아가 더욱 이롭다. 박테아는 일반적으로 진단백 함량이 상당히 높고, 영양학적으로 중요한 유황 아미노산과 터진함량이 종종 높다.

신속한 성장이 가능하며 비교적 높은 발효공정 온도에서 높은 생산온도가 가능한 박테리아의 발견은 확실히 이로운 것이다. 높은 온도의 성장 조작이란 보다적은 양의 열이 제거되고 냉각장치가 덜 요구되며 종국적으로 살균과 응집과 분리공정에 비교적 적은 양의 열이 요구된다는 것을 의미한다. 다른 미생물로 오염될 위험도 역시 상당히 감소된다. 단세포 단백 공정의 상업화에는 친열성 또는 내열성 박테리아가 요구된다.

본 발명자는 대단히 바람직하고 유용한 성질을 갖는 대단히 독특한 친열성 박테리아 종을 발견하였는바, 프로토피타(Protophyta)부, 스키조마이세 테스(Schizomycetes)류, 유박테리아(Eubacteriales)목, 바실리아쎄(Bacillaceae)과 바실루스(Bacillus) 속의 박테리아이다. 이들 독특한 친열성 박테리아종은 통상의 온도에서 보다 높은 온도에서 더욱 잘 성장한다. 이들 두 독특한 종은 친열성으로서 산화된 탄화수소 원료상에서 특히 가장 바람직하기로는 메타놀이나 에타놀의 저급 알콜에서, 다른 공지된 바실루스(Bacillus)종이 비교적 비생산성이거나 또는 단순히 내성이 없거나 또는 산화된 탄화수소 원료에 대하여 비생산적이거나 내성이 없는 온도에서 높은 생산속도로 유효하게 성징한다. 본 발명자가 발명하여 본 공정에 이용한 독특한 종의 박테리아는 다음과 같다.

명칭 NRRL B-8066과 NRRL B-8065는 본 발명자가 친열성 바실루스(Bacillus)sp. 종족 72와 바실루스(Bacillus)sp. 종족 47을 미국 농무성, 농업연구소(Northern Region Research Lab peoria, I11. 61604)에 공탁하고, 각각 30개의 고압냉동 건조 시킨 제제를 공탁함으로서 상기 공탁소로부터 각각 NRRL 종족의 명칭을 받은 것이다. 바실루스(Bacillus) 종족은 비교적 높은 발효온도에서 다단성이 소단 있어서 바람직한 아미노산 형과 균형성의 높은 단백 함량을 갖는 적당 하고 가치있는 단세포 단백생성물을 생성한다. 이들 특유한 친고온 바실루스(Bacillus)종은 단세포 단백의 생성 속도를 증진시키며, 산화된 탄화수소 바람직하게는 저급알콜로서 더욱 적당하로는 메타놀이나 에타놀, 현재 적당한 것은 메타놀이나 실질적인 함-메타놀 기질의 탄소 및 에너지 기질상에서 성장하는 경우 냉각의 필요성을 감소시킨다. 또한 예측컨데 이들 친고온의 신규한 바실루스(Bacillus) 종은 포말-충전의 발효기에서의 특별한 용도가 발견될 것이다.

배양제 72호 NRRL B-8066은 좁은 봉쌍 외관의 포자-형성 미생물로서 그람 양성의 바실루스(Bacillus)종이다.

세포내에는 아무런 착색 색소도 관찰되지 않았다.

배양체 번호 47 NRRL B-8065는 두꺼운 봉상 외관의 포자-형성 미생물로서 그람 양성의 바실루스(Bacillus)종이다.

세포내에는 아무런 착색 색소도 관찰되지 않았다.

본 발명은 두 종의 새로운 미생물 종에 속하는 산화된 탄화수소 동화 미생물 세포를 배양하는 공정을 제공하는 것과 마찬가지로 탄소와 에너지원으로서 산화된 탄화수소를 함유하는 매체내에서 비교적 높은 발효 온도로 호기 배양시킴으로서 세포가 신속하게 번식되도록 꾀하는 것이다.

세포 분리된 신규하고 독특한 미생물은 몇개의 공지된 바실루스(Bacillus) 배양체의 성질과 함께 다음표에 나타낸 성상으로서 특징 지을수 있다.

[바실루스(Bacillus) 배양]

비고;

+=육안으로 성장을 확인할 수 있는것으로서, 출발혼합물의 현탁도 증가로서 결정하였다.

-=성장하지 않음; 성장을 육안으로 확인할 수 없는 것.

±=자체는 유지되나 부가적인 성장을 육안으로 확인할 수 없는 것.

상기의 비교는 모두 가능한한 종류를 직접 비교하도록 한 것이다. 물론 모든 미생물에 대하여서와 같이 몇가지 특징은 매제와 특수조건에 따라 약간의 변화를 받을 수 있다.

본 발명의 신규하고 특유한 종의 박테리아를 이용하는 본 발명 발효공정에 대한 탄소와 에너지원 물질이나 기질은 함 탄소-산소-수소의 수용성 화합물 및 화합물류이다. 산화된 탄화수소란 용어는 사용가능한 화합물에 대한 일반적인 용어이며 반드시 기질 원을 나타내는 제한 용어는 아니다. 산화된 탄화수소에는 알콜, 케톤, 에스텔, 에텔, 산 및 알데하이드가 포함되며, 이것은 실질적으로 수용성인 성질을 가지며, 이와 같은 성질상 분자당 10개 까지의 탄소원자를 갖도록 제한을 받는다.

이들 탄화수소의 실예를 들면; 메타놀, 에타놀, 푸로파놀, 부타을, 펜타올, 헥사놀, 1,7-헵탄디올, 2-헵타놀, 2-메틸-4-펜타놀, 펜타노인산, 2-메틸부타노인산, 2-펜타놀, 2-메틸-4-부타놀, 2-메틸-3-부타놀, 2-부타놀, 2-메틸-1-푸로파놀, 2-메틸-2-푸로파놀, 2-푸로파놀, 개미산, 식초산, 푸로파노인산, 포름 알데하이드, 아세트알데하이드, 푸로파날, 부타날, 2-메틸푸로파날, 부타노인산, 2메틸푸르파노인산, 펜타노인산, 글루타린산, 헥사노인산, 2-메틸펜타노인산, 헵탄티오인산, 헵타노인산, 4-헵타논, 2-헵타논, 옥타노인산, 2-에틸헥사노인산, 글리세린, 에틸렌글리콜, 푸로필렌글리콜, 2-푸로피논, 2-부타논, 디에틸에텔, 메틸에틸에텔, 디메틸에텔, 디-n-푸로필 에텔, n-푸로필 이소푸로필 에텔 등과 이들 화합물 둘 또는 3종의 혼합물이 포함된다.

이와 같은 탄소와 에너지원 물질의 바람직한 부류는 수용성에 따라 수용성의 지방족 1가 탄화수소 알콜이며, 더욱 바람직한것은 상업상 분자당 1-4개의 탄소원자를 갖는 저급알콜이고, 더욱 바람직한 것은 에타놀과 메타놀로서, 현재로는 원료의 상대적인 저렴성에 따라 메타놀이 가장 바람직하다.

요구에 따라 또는 편의상 이들 산화된 탄화수소의 혼합물을 이용할 수 있다. 예컨데 "메틸연료"라는 명칭을 가진 시판되는 물질(C. ＆E.N. 1973년 8월 17일판, 23페이지)은 메타놀과 분자당 4개의 탄소원자를 갖는 조절된 비율의 다가 알콜과의 혼합물로서 적당한 기질이다.

메탄, 에탄등과 같은 석유깨스도 산화시켜 이용할 수 있으며, 이것은 여러가지 케톤, 알데하이드 에텔, 산등과 같이 주로 상응하는 알콜의 혼합물을 이루고, 여러 석유원으로부터의 탄화수소분별물도 이 목적에 이용될 수 있다.

산화된 탄화수소 원료에 의한 특유하고 신규한 종의 박테리아 배양은 약 45-65℃범위의 온도에서, 더욱 바람직하기는 50-60℃의 온도에서 수행될 수 있으며, 현재 가장 바람직한 최적성장 속도는 약 55℃이다.

수용성 광염매제와 탄소 및 에너지원 물질과 문자상 산소 및 사용될 특수종의 출발 접종물로 구성되는 성장 매제내에서 배양이 수행된다.

메타놀이나 포름 알데하이드와 같은 몇몇의 상기 탄소 및 에너지 기제의 높은 농도는 만족스러운 미생물 성장을 방해하며 또는 신규한 바실루스(Bacillus) 종을 이용하는 발효중의 미생물에 대하여 독성이 있기까지 하다. 이와 같이 비교적 높은 농도의 기재는 피하여야 하며, 따라서 성장속도를 저지하거나 굶어죽게하지 않도록 발효기내의 기제 농도를 0.01-5%(용적/용적), 바람직하게는 0.01-0.5%(용적/용적)수준으로 유지하는 것이 바람직하다.

산소는 접종 미생물에 의하여 용이하게 흡수될 수 있는 어떠한 형태로도 발효매제 또는 비양액에 공급할 수 있다. 따라서 분자상의 산소는 대기압이나 고기압에서의 공기와 같은 분자상 함-산소 깨스로서 공급되며, 또는 SCP 공정조작의 특수상황에 따라 공급원으로부터 편리하게 이용할 수 있는 경우 산소를 다량 함유하는 공기로서도 공급된다. 실제로 산화된 탄화수소 기제를 사용할때에는 미생물 성장에 요구되는 일부의 산소가 기제의 산소함량에 의하여 공급되다. 그러나 부가적인 분자상 산소는 성장을 위하여 공급되어야 한다. 왜냐하면 기제의 흡수와 이에 상응하는 미생물의 성장은 실제로 연소공정이기 때문이다. 일반적으로 매분 발효기내 액체 용적당 약 0.1-10, 바람직하게는 약 0.7-2.5 용적의 정상적인 산소함량의 공기가 반응기에 공급되며, 또는 산소에 따라서 상기 각각의 범위가 약 0.02-2.1 및 0.14-0.55이다.

미생화학적 전환에 이용되는 압력은 널리 변화할 수 있으며, 약 0.1-100 기압의 압력, 바람직하게는 1-30기압, 더욱 바람직 하게는 대기압보다 약간 높은 압력이 장비가 가격에 대한 이루어진 산소용해도의 균형에 따라 이용된다. 대기압 이상의 압력이 유리하다. 왜냐하면 상기의 압력이 수용성 발효 혼합물 내에 용해된 산소 농도를 증가시키게 되며, 이에 따라 세포질의 성장속도를 증가시킬수 있기 때문이다. 산소 용해도가 감소하는 경향이 있는 경우에는 높은 발효온도에서의 대기압 이상의 압력이 바람직하다. 포말-충전된 발효기구는 높은 세포 밀도와 신속한 성장속도에 필요한 산소의 전미를 돕는 경향이 있다.

상기 두가지 특유한 바실루스(Bacillus) 종은 상기한 바와 같이 산소 및 탄소와 에너지원에 부가적으로 광물성 영양물과 동화성 질소원을 요구한다. 질소원은 유기체에 의한 대사용도에 적당한 형태로 질소를 방출할 수 있는 것이면 어떠한 함 질소 화합물도 가능하다. 기타 단백질, 요소등과 같은 여러가지 유기질소원 화합물도 이용될 수 있으나, 일반적으로 무기 질소원 물질이 더욱 경제적이고 실질적이다. 적당한 함 질소 무기화합물에는 암모니아, 수산화암모늄, 여러가지 암모늄염 즉 구연산 암모늄, 인산암모늄, 황산암모늄, 파이로인산암모늄이 포함되며, 여러가지 기타 화합물도 이용될 수 있다. 암모니아 깨스가 편리하며 적당한 양으로 수용성 발효매제에 기포통과 시킴으로서 이용 할수 있다.

수용성 미생물 발효 혼합물내의 pH범위는 예컨대 5-9, 더욱 바람직하게는 약 6-8이다. 본 발명자의 발명 공정에서의 특유한 미생물은 약 6-7.5 범위의 pH를 좋아하는 것으로 보였다. 이들 미생물은 본인이 명명한 IM₂매제 내에서 NRRL B-8065에 대하여는 약 6.2-6.8 범위의 pH를, NRRL B-8066에 대하여는 6.2-6.5의 pH를 특히 좋아하였다. 미생물에 대한 pH 범위 기호도는 이용되는 매제에 의함으로, 이와 같은 변화는 매제내의 변화에 따라 어느정도 변한다.

탄소와 에너지원이 유기체에 대하여 잠재적인 독성의 양으로 알데하이드를 함유하거나 알데하이드인 경우에는 우선 적당한 앙의 함질소화합물, 바람직하게는 암모니아, 수산화암모눔 또는 기타 암모늄화합물을 1몰의 알데하이드에 대하여 약 0.01-10 몰당량의 비율로 기제를 처리함으로서 독성인 알데하이드 영향을 제거할 수 있다. 이와 같이 처리된 기제는 다음에 탄소와 에너지 원일 뿐만 아니라 전체적으로 또는 부분적으로 필요한 질소원을 함유한다.

산소, 질소 및 탄소와 에너지원에 부가하여 미생물의 적당한 성장속도를 확실히 하고 미생물 전환 공정중 세포에 의한 산화된 탄화수소의 동화를 최대로 하기위하여 원료 매제내에 선택된 광물성 영양물을 적당한 비율의 필요양으로 공급할 필요가 있다.

인산염이나 기타 아린산염원, 막네슘, 칼슘, 나토륨, 망간, 몰리브덴, 동이온 등도 필수적인 광물성분을 제공하는 것으로 보인다. 다음에 나타낸 처방은 본 발명의 새로운 바실루스(Bacillus) 종을 배양하는데 사용될 수 있으나, 이들은 함메타놀 기재 이외의 기재상에서도 성장한다. 다음 처리법은 본 분야의 숙련자에게 지도가 될 것으로 기술한 것이다.

[매제 IM₂(고체)]

(a) 다음의 처리법을 참조

(b) 사용하기 직전에 가한다.

액체매제에 대하여는 상기한천만을 생략하기만 하면된다.

[흔적량의 광물성 용액]

기타 물질, 예컨데 효모 추출물, 비타민, 비오틴등 이나 기타 성장인자를 발효분야에 공지된 흔적량으로 가할 수 있다.

상기 신규한 바실루스(Bacillus) 종의 배양은 불연속적으로서, 더욱 바람직하게는 연속 공정으로서 발효분야에 공지된 방법으로 수행할 수 있으나, 가장 바람직하게는 포말-충전된 발효기내에서 수행된다. 확실히 연속공정은 대량의 미생물세포를 생성하는 상업적인 조작으로서 많은 이점을 가지며, 이것은 본 발명을 수행하는 바람직한 형태이다.

불연속적이거나 바람직한 연속조작에 있어서나 모든 장치, 반응기 또는 발효기, 용기, 관, 부수적인 순환 또는 냉각기구등은 일반적으로 수분동안 즉 약 15분간 약 250°F에서의 증기를 사용함으로서 살균시킨다. 살균한 반응기는 산소와 산화된 탄화수소원료를 포함하는 요구되는 모든 양분의 존재하에 특수한 미생물의 배 양물로 접종시킨다.

모든 연속공정에 있어서는 배양물이 성장함에 따라 공기, 양분매제, 별도로 가해지는 경우에는 질소원 및 알콜과 같은 산화된 원료등의 연속공급을 계속한다. 여러가지 액류의 부가속도는 산화된 탄화수소 주입을 유효하게 이용하도록 일관성있게 가능한한 신속한 세포성장을 얻도록 변화시킬 수 있으며, 이에따라 장입된 탄소와 에너지원 물질의 중량당 최고 수율의 세포중량을 얻는 목적이 달성된다. 탄소와 에너지원 물질의 공급속도는 특히 미생물의 성장을 저지하거나 치사시킬수도 있는 알콜이나 알데하이드와 같은 독성물질의 초과 공급을 피하기 위하여 발효기에 공급되는 양이 실질적으로 유기체에 의한 소모속도와 실질적으로 동일하게 되도록 조정되어야 한다. 만족스러운 조건은 일반적으로 발효기로부터 배출되는 유출물내에 탄소 및 에너지원 물질이 존재하지 않는것으로 나타나지만, 만족스러운 검사는 발효기 유출물의 탄소 및 에너지원 물질 함량을 관찰하고 이 함량을 약 0.1-0.5 용적/용적%와 같은 바람직한 저수준에 유지시킴으로서 얻을 수 있다. 물론 어떠한 원료액도 필요나 편의에 따라 증가하면서 또는 연속적으로 가할 수 있다.

세포밀도, pH, 용해된 산소함량, 알콜 또는 발효기내의 기타 원료농도, 온도, 원료의 공급속도와 배출액 속도등을 측정하도록 장치를 장비하여야 한다. 발효기에 공급되는 물질은 발효기에 도입되기전에 살균되는 것이 바람직하다. 어떤 경우 산화된 탄화수소 원료가 메타놀, 에타놀 또는 포름 알데하이드와 같이 다른 물질을 살균할 수 있는 물질인 경우에는 이 성분을 광물성 매제와 같은 다른 액류에 살균양으로 가하고, 이에 따라서 가열에 의하여서와 같이 광물성 매제를 별도로 살균하는 필요성이 없이 여러 목적을 수행하는 것이 편리하다.

상기 종을 이용하는 본 발명의 발효공정을 수행함에 있어서 이용되는 발효기의 형태는 제한된 것은 아니지만, 현재로 바람직한 것은 포말-충전 발효기에서의 조작이다. 산화된 탄화수소 원료로도 본 발명의 특유한 친열성 미생물을 순수하게 배양시킬 때의 높은 생산성은 공정이 포말-충전된 시스팀에서 수행될 때 연속공정에서 가장 잘 이루어진다. 본 발명인이 제안한 발효온도에서의 순수배양은 높은 생산속도를 이루어서 대단히 안정한 포말이 생성되게 한다. 물론 액체 용적을 낮추어 발효기 내용물의 손실을 초래할지도 모르는 발효기로부터 나오는 포말을 피하기 위하여 성장속도를 조절하도록 관찰을 계속하여야 한다. 가능한한 포말방지제의 부가를 피하여야 한다. 왜냐하면 실리콘과 같은 포말방지제는 제안된 고온에서 용해된 산소함량에 해로워서 유기체가 느린속도로 성장하게 하여 생산성을 낮추거나 또는 치사시키기 까지 한다. 본 발명의 종으로 생성된 포말은 생장에 해롭지 않으며, 유기체를 높은 용해산소 시스팀내에 유지시킴에 결정적으로 이롭다. 생성된 포말을 조장하고 유지하도록 설계된 발효기내에서 이와 같은 포말 공정을 장력 조작하면 이들 친열성 유기체가 요구하는 높은 세포밀도와 신속한 성장 속도를 유지하는데 필요한, 증가된 산소 이송을 수행하는 공정에 이롭다. 실질적인 포말을 생성하는 본 발명 특유의 산화된 탄화수소-소모성의 친열성 포말-충전발효기를 사용하는 공정은 SCP가 가장 유효하게 생성되도록 한다.

발효기의 포말-충전조작은 다량의 까스가 액상과 긴밀히 접촉되도록 유지되어야 하는 발효공정을 수행함에 특히 적당하며, 따라서 비교적 큰 면적의 접촉 경계에 따르는 반응을 얻는다.

이와 같이하여 발효가 개량되고 제어와 균일성과 열점의 제거등에 대한 열의 전이가 개량된다.

현재로 바람직한 형태의 발효기는(Process Biochem 제 1 도, 37페이지, 1972년 6월)에서 찾아볼 수 있으며, 여기에 편리한 지점에서, 바람직하게는 폐기관 내부와 혼합기 바로위에서, 용기에 분자상 산소를 함유하는 깨스를 도입시키는 도관을 부가할 수 있다. 왜냐하면 용기의 내용물에 공기 도입을 도울때에 혼합기의 흡입작용을 유리하게 이용할 수 있기 때문이다. 이와 같은 형태의 발효기는 그의 내용물이 실질적으로 완전하게 포말이나 저밀도의 유탁액으로 전환되면서 유효하게 조작되어, 대단히 높은 후차적인 산소 전이속도가 이루어지게 된다.

이용할 수 있는 또다른 형태의 발효기는 공수발효기로서, 이것은(Proceedings Eighth World Petroleum Congress, Wang, 5권, 페이지 149-156, 1971년도판, Applied Science Publishers Ltd, London, England)에 설명되어 있다.

사용될 수 있는 또다른 형태의 발효기는(Chem. Engineering, (63페이지, 1월 7일, 1974)에 기술된 가압순환 발효기이다.

마지막으로, 적당한 또다른 형태의 발효기는 잘 공지된 탱크형태의 것으로서, 칼날교반기와 잠입 공기 유입 기구가 장비된 것이다. 이러한 형태의 발효기는 미국특허로서 공지되어 있다.

포말-충전된 발효형이 이용되지 않는 경우에는 본 발명의 발효공정을 수행함에 있어서 포말방지제를 사용할 필요가 있다. 적당한 포말 방지제와 이의 사용방법은 발효분야에서 잘 공지되어 있으나, 이와 같은 형태는 본 발명의 특유한 종에 대해서는 덜 바람직하다.

본 발명에 따르는 기제상에서 신규의 바실루스(Bacillus) 종을 배양함으로서 생성된 세포질 및 초세포질의 생성물은 모두 통상의 방법으로 회수될 수 있다. 세포는 원심분리, 여과등에 의하여 발효기 유출물로 부터 분리될 수 있다. 다음에 세포를 함유하지 않는 유출물은 메타놀이나 에타놀과 같은 저급 알콜이나 아세톤으로 처리할 수 있어서 생성된 모든 중합체 물질을 초세포적으로 침전시킨다. 세포를 함유하지 않는 유출물도 역시 용제추출과/또는 염기 추출로 처리할 수 있어서, 요구에 따라 안료, 비타민 또는 배양공정중에 생성된 유기산을 회수하게 된다. 미생물 세포는 일반적으로 열이나 화학적인 방법으로 치사되며, 이것은 발효기 유출물로부터 세포를 분리하기 전후에 행하여 진다. 박테리아 세세포는 사람은 물론 동물에 대하여 가치있는 질소원이다. 인간의 소모용으로는 핵산 함량을 감소시키도도록 세포를 처리할 수 있으나, 동물의 먹이용도로서는 이와 같은 처리가 불필요한 것으로 보인다.

다음의 실시예는 본 발명의 특수한 구체예를 설명하는 것이다.

[실시예 1]

두 배양물 공탁소, 즉 미농부성, Northern Regional Research Lab (Peoria, Illinois와 American Type Culture Collection ATCC(Washington, D.C.)로부터 공지된 친열성 미생물의 배양물을 수종 얻었다. 이들 배양물은 고압 냉동 건조시킨 상태로 얻었다. 이들 배양물을 여러가지 상이한 매제내에서 55℃로 성장 시험을 하였다.

이들 결과가 다음 표 I에 나타나 있다. 이용된 배양물은 다음과 같다.

[표 Ⅰ]

매제 NO. (성장+또는-)

비고; (a) 영양 배양액(NB)

(b) NB+1% 메타놀

(c) NB(1/2강도)+1%메타놀

(d) NB(1/4강도)+1% 메타놀

(e) IM₂매제+0.5%메타놀

위에서 사용된 영양배양물은 3g/ℓ의 쇠고기 추출물과 5g/ℓ의 펩톤을 갖는 통상의 배양매제이다.

매제 IM₂는 액상 매제를 사용하는 본 실시예에서 한천이 없는 것을 제외하고는 위에서 설명한 것과 동일하다, ATCC 10744는 메타놀(매제 2)의 존재하에서는 성장하지 않을 것이다. 기타의 배양물은 메타놀의 존재하에 성장할 것이지만 이들은 확실히 이들 성장을 위한 단독의 탄소와 에너지원으로서 메타놀을 사용할 수 없었다. 이들 결과는 본 발명 공정에서 사용한 특유한 바실루스(Bacillus) 종으로부터 얻은 바람직한 결과와는 대조적으로 대단히 극적이다. 왜냐하면 상기 독특한 바실루스(Bacillus) 종은 메타놀을 탄소와 에너지의 단독 공급원으로 유효하게 사용할 수 있었기 때문이다.

[실시예 2]

본 발명 공정에 따라 연속 발효공정을 수행하였다. 본 공정에 대한 접종물은 배양물 No. 72, NRRL B-8066 세포의 수용성분산액 500ml이었으며, 이것은 1.5 용적%메타놀로서 매제 BH-M 상에서 24 시간동안 성장시킨 것이었다.

[매제 BH-M]

*흔적량의 광물성 용액은 다음 물질로서 구성된 것이었다.

상기한 접종물을 교반기와 공기통과 기구가 장비되고 그안에 다음에 기술하는 수도물로 제조한 매제 2ℓ를 갖는 발효기에 가하였다.

[FM-12 매제]

*이 흔적량의 광물성 용액은 다음에 나타낸 처방대로 제조한 것이었다.

[흔적량의 광물성 용액]

처음의 메타놀 함량은 1.5%(V/V), pH는 약 6.7, 온도는 약 55℃이었다. 내용물의 교반속도는 약 1,000rpm이었고, 공기는 약 2ℓ/분으로 도입시켰다. 수산화칼늄을 계속가하여 pH를 약 6.7-6.9의 범위에 유지시키고 또한 질소원으로서 공급하였다.

접종물의 양호한 성장이 관찰된 후, 5%(용적)의 메타놀을 함유하는 영양매제의 연속첨가를 시작하고, 상응하는 용적의 발효기 유출액을 제거하였다. 영양 혼합물의 공급속도는 약 500시간의 시험과정중 약 150-800ml 시간으로 변화하였다. 발효기 내의 세포에 대한 평균 보유시간은 약 2.4-5시간으로 변하였다. 발효기 유출액을 때때로 시료로 취하여 세포의 약간을 회수하고, 이것을 건조, 평량 후 단백분석을 행하였다. 유출물 시료는 세포만을 회수하도록 처리하였다. 즉 가용물은 분석하지 않았다. 세포 농도치는 시험의 초기(25시간)에는 약 12g/ℓ(건조 세포), 190시간 때문 18g/ℓ, 시험 말기에는 약 24g/ℓ로 변하였다. 회수가능성 세포로의 메타놀 전환은 장입된 것의 44%이었다.

본 시험 과정중 취해진 세포시료에 대한 단백함량은 생성물 회수를 논한 상기 설명에서 기술하였다.

상기의 결과는 신규의 바실루스(Bacillus)종 NRRL B-8-66이 에너지와 탄소원으로서 메타놀을 사용하여 55℃에서 용이하게 연속적으로 배양될 수 있음을 나타낸다. 더욱이 이들 종의 세포는 높은 단백 함량을 나타내었다.

[실시예 3]

실시예 2의 배양물 NRRL B-8066을 사용하여 또 다른 연속 발효기 공정을 행하였다. 본 공정에서는 M₂매제+1.5용정%의 메타놀 상에서 26시간동안 성장한 500ml의 배양물 분산 수용액으로 발효기를 접종시켰다.

[IM₂매제]

*흔적량의 광물성 용액은 1ℓ의 수용액에 대하여 다음의 물질로서 구성되었다.

[흔적량의 광물성 용액]

상기한 배양물은 실시예 2에서 기술한 동일한 형태의 발효기에 가하였다. 이 발효기는 1ℓ당 5ml반의 상기 흔적량인 광물성 용액을 매제에 가한것을 제외하고는 실시예 2의 발효시험에서 기술한 동일한 매제 FM-12 2ℓ를 함유하였다.

처음에 메타놀 함량은 약 1.5% V/V에, pH는 약 7.1에, 온도는 약 53℃로 제한하였다. 처음 2시간동안은 교반은 서서히 800rpm까지, 공기용적은 2ℓ1분으로 각각 증가시켰다. 수산화 암모늄을 실시예 2에서 기술한것과 같이 가하여 pH를 약 7.0-7.2 범위에 유지시키고 질소원을 공급하였다.

처음 24시간동안 접종물의 양호한 성장이 이루어진 후 7.5용적%의 메타놀과 0.05g/ℓ의 MnS0₄ㆍH₂O를 포함하는 영양매제의 연속첨가를 시작하고, 상응하는 용적의 발효기 유출액을 제거하였다. 영양매제 혼합물에 대한 공급 속도는 약 94시간의 시험과정중 약 200-400ml/시간이었다. 발효기내의 평균 보유시간은 약 3-5시간으로 변화하였다. 발효기 유출액은 때때로 시료로서 취하며 세포를 회수, 건조후 평량하였다.

유출물은 세포만을 회수하도록 처리하였다. 즉 가용물은 분석하지 않았다. 24시간후의 세포농도는 17-26g/ℓ(건조세포)의 범위에 있었다. 메타놀의 회수가능한 세포로의 전환은 장입된 것의 약 43%이었다.

상기의 결과는, 높은 발효온도에서 에너지와 탄소의 단독 공급원으로서 메타놀을 사용함으로서 신규한 바실루스(Bacillus)종으로 부터의 양호한 미생물 세포 수율이 얻어질 수 있다는 것을 나타낸다.

[실시예 4]

배양물 47 NRRL B-8065로서 연속 발효를 수행하였다.

상기한 것과 동일한 형태의 발효기를 사용하였다. 발효기는 이 경우 탈이온수로 제조된, 실시예 3에서 기술한 것과 같은 FM-12매제 2ℓ를 함유하였고, 여기에 실시예 3에서 기술한 것과 같이 1.5용적%의 메타놀로 동일한 접종물 IM₂매제상에서 11시간동안 성장시킨 배양물 47 NRRL B-8065분산수용액 500ml를 장입시켰다. 메타놀 함량은 처음에 1.5%(V/V)이었고 pH는 약 6.45이었으며, 온도는 약 54℃에 유지시켰다. 실시예 2와 3에서와 같이 수산화암모늄을 가하여 pH를 약 6.3-6.6에 유지시킴과 아울러 질소원을 공급하였다. 교반과 공기 용적 비율은 약7시간에 걸쳐서 각각 400rpm과 0.5ℓ/분으로 점차 증가시켰다. 약 11시간후 수도물로 제조하고 2.5용적%의 메타놀을 함유하는 영양매제 FM-12와 부가적으로 1g/ℓKH₂P0₄, 1g/ℓK₂HP0₄및 소량의 포말방지제의 연속첨가를 시작하였다. 28시간후 원료내 그의 농도의 배만큼 MnS0₄ㆍH₂O를 가하여 원료를 변화시켰다. 이와 같은 조정은 어느정도 세포에 의한 산소의 소모를 촉진시켰다. 이들 특유한 종은 최적 성장때에 비교적 높은 Mn⁺⁺요구를 나타내는 것으로 보았다.

101.5시간의 시험과정중 기타 흔적량의 광물성분을 부가적으로 가하였으나, 세포 성장속도에는 촉진효과가 없는 것으로 보였다. 공기이외에도 28시간후 0.12-0.4ℓ/분의 증가 속도로 발효기에 공기를 장입시켰다. 이 기간중 교반속도는 400rpm으로부터 800rpm으로 상승하여 증가시켰다. 유출액으로부터 시료를 때때로 취하여 세포를 회수, 건조 및 평량하였다.

매제의 공급속도는 28시간일때에 약 300ml/hr, 71시간 일때에 850ml/hr, 95시간일때, 1,070ml/hr의 범위이있었다. 체류시간은 마지막 30시간동안 약 1.8-2.5시간의 범위에 있었다. 세포농도의 범위는 7-1Og/ℓ(건조세포)이었고, 메타놀의 회수가능한 세포로의 전환은 장입된 것의 약50%이었다.

상기의 결과는 배양물 No. 47 NRRL B-8065도 역시 비교적 높은 발열온도에서 단독의 탄소와 에너지원으로서 메타놀 상에서 성장할때 미생물세포의 좋은 수율을 제공하다는 것을 나타낸다.

[실시예 5]

본 발명의 신규한 바실루스(Bacillus) 종 세포의 조단백함량은 약 70-85중량%이었다. 조단백가는 건조세포의 N중량%(킬달분석)에 인자 6.25을 곱한 값이다. 이들 건조된 세포를 가수분해한 다음 깨스 크로마토그라피로 아미노산을 분석한 결과 단백 함량이 약 55-70중량%이었다. 배양물 No. 72 NRRL B-8066을 사용하여 본 발명에 따라 제조한 박테리아세포 일개 시료에 대한 아미노산 분포는 다음과 같다.

함-유황 아미노산 즉 치스틴과 메티오닌의 함량은 비교적 낮다는 것을 알수 있다. 실제로 상기 바실루스(Bacillus) 종으로부터 취한 세포시료는 100g의 건조세포에 대하여 0.00g의 치스틴을 나타내었다. 이와같은 상태는 단세포단백의 SCP 공정에서 비상한 것이아니며, 상기 SCP를 이용하는 공급 규정식에 적당한 양의 합성 치스틴이나 메티오닌을 단순히 첨가해 줌으로서 조정할 수 있다.

Claims (1)

1. 본문에 상술한 바와 같이, 호기성 발효조건하에 탄소 및 에너지원으로서 산화된 탄화수소를 사용하는 배양기 내에서 바실루스(Bacillus) 미생물의 종(NRRL B-8066)이나 NRRL B-8065)을 배양시킴을 특징으로 하여 단세포 단백물질을 제조하는 방법.