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KR20250008765A - 핵산 백신에 대한 신호 서열 - Google Patents

핵산 백신에 대한 신호 서열 Download PDF

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KR20250008765A
KR20250008765A KR1020247040271A KR20247040271A KR20250008765A KR 20250008765 A KR20250008765 A KR 20250008765A KR 1020247040271 A KR1020247040271 A KR 1020247040271A KR 20247040271 A KR20247040271 A KR 20247040271A KR 20250008765 A KR20250008765 A KR 20250008765A
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KR
South Korea
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sequence
nucleic acid
transmembrane domain
signal peptide
tmb
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020247040271A
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English (en)
Inventor
이브 지레드-샴바즈
빈센트 파보
셀린 시바
코린 피옹
Original Assignee
사노피
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Publication date
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Abstract

바이러스 분비 신호 펩티드 및 막횡단 도메인 중 하나 또는 둘 모두에 연결된 적어도 하나의 항원성 원핵 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 메신저 RNA) 백신이 본원에 제공된다. 또한, 본원에 기재된 핵산을 사용한 원핵 감염에 대한 백신접종 방법이 제공된다.

Description

핵산 백신에 대한 신호 서열
관련 출원
본 출원은 2022년 5월 6일에 출원된 유럽 우선권 출원 제22305680.5호, 2022년 8월 16일에 출원된 유럽 우선권 출원 제22306227.4호 및 2023년 3월 2일에 출원된 미국 출원 제63/449,573호와 관련되며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
원핵 감염(예를 들어, 박테리아 감염)은 전 세계적으로 인간 건강에 대한 상당한 위협을 나타낸다. 의료 시스템에 대한 부담 증가와 함께 매년 약 5 백만 명의 사람들이 항생제 내성 박테리아 감염으로 사망한다(Antimicrobial Resistance Collaborators. The Lancet. 399(10325): 629-655. 2022). 원핵 감염에 대한 백신이 존재하지만, 보다 일반적인 항-바이러스 백신에 비해 수가 적다.
핵산-기반 백신, 보다 구체적으로 mRNA 백신은 특히 바이러스 병원체에 대해 신속하고 안전하며 비용 효율적인 생산 공정을 갖는 추가 백신 유형으로 최근 등장하였다. 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS CoV-2)에 대한 mRNA 백신은 주로 스파이크 바이러스 단백질을 항원으로 사용한다. 전달 비히클, 예컨대, 지질 나노입자(LNP)와 종종 조합되는 COVID-19 mRNA 백신은 높은 효능을 달성할 수 있다. 그렇기는 하지만, 원핵 감염에 대한 보다 효과적인 RNA 기반 백신이 필요하다.
원핵 항원(즉, 원핵 세포의 항원으로부터 유래된 항원)을 포함하는 핵산 기반 백신, 예컨대, RNA(예를 들어, mRNA)-기반 백신을 생성하는 것은 원핵 항원이 진핵 세포에 의해 자연적으로 발현되지 않기 때문에 난관이 있다. 특히, 원핵 세포와 진핵 세포는 상이한 분비 시스템을 갖는다. 적절한 조작이 없다면, 이들 백신에 사용되는 원핵 항원은 진핵(예를 들어, 인간) 세포의 세포내 구획에 축적될 것이고, 이는 이들 백신의 면역원성을 저하시킬 수 있다.
본 발명은 핵산(예를 들어, mRNA)-기반 백신을 통해 발현되는 원핵 항원의 면역원성을 개선함으로써 이러한 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다. 본원에 기재된 바와 같이, 이는 원핵 항원이 세포 표면에서 발현될 수 있게 하기 위해 세포외 구획 및/또는 막횡단 도메인에서 분비될 수 있도록 분비 신호를 부가함으로써 달성된다. 그렇게 함으로써, 면역 세포는 항원에 더 잘 접근할 수 있고, 궁극적으로 핵산(예를 들어, mRNA)-기반 백신의 면역원성을 개선할 수 있다.
본 개시내용은 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)을 포함하는 핵산을 제공하며, ORF는 - 적어도 하나의 항원성 원핵 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 - 적어도 하나의 바이러스 분비 신호 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, ORF는 적어도 하나의 막횡단 도메인(TMB)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 인간을 감염시킬 수 있는 바이러스의 바이러스 서열로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 서열로부터 유래된다: 인플루엔자 분비 신호 펩티드 서열, 및 SARS CoV-2 분비 신호 펩티드 서열, 수두-대상포진 바이러스(varicella-zoster virus; VZV) 분비 신호 펩티드 서열, 홍역 분비 신호 펩티드 서열, 풍진 분비 신호 펩티드 서열, 볼거리 분비 신호 펩티드 서열, 에볼라 분비 신호 펩티드 서열, 두창 분비 신호 펩티드 서열, 및 광견병 분비 신호 펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-인플루엔자 분비 신호 펩티드 서열.
특정 구현예에서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 분비 신호 펩티드 서열, SARS CoV-2 스파이크 분비 신호 펩티드 서열, VZV gB 분비 신호 펩티드 서열, VZV gE 분비 신호 펩티드 서열, VZV gI 분비 신호 펩티드 서열, VZV gK 분비 신호 펩티드 서열, 홍역 F-단백질 분비 신호 펩티드 서열, 풍진 E1 단백질 분비 신호 펩티드 서열, 풍진 E2 단백질 분비 신호 펩티드 서열, 볼거리 F-단백질 분비 신호 펩티드 서열, 에볼라 GP 단백질 분비 신호 펩티드 서열, 두창 6 kDa IC 단백질 분비 신호 펩티드 서열, 및 광견병 G 단백질 분비 신호 펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 바이러스 분비 신호 펩티드는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B로부터의, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A로부터의 HA 분비 신호 펩티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 아미노산 서열 MKX1X2LX3VX4LX5TFX6X7X8X9A(SEQ ID NO: 145)를 포함하며, X1은 A 및 V로부터 선택되고; X2는 I 및 K로부터 선택되고; X3은 V 및 L로부터 선택되고; X4는 L 및 M으로부터 선택되고; X5는 Y 및 C로부터 선택되고; X6은 T 및 A로부터 선택되고; X7은 T 및 A로부터 선택되고; X8은 A 및 T로부터 선택되고; X9는 N 및 Y로부터 선택된다.
특정 구현예에서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 SEQ ID NO: 95 내지 109로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 아미노산 서열 MKX1IIALSX2ILCLVFX3(SEQ ID NO: 146)을 포함하며, X1은 T 및 A로부터 선택되고; X2는 Y, N, C 및 H로부터 선택되고; X3은 T 및 A로부터 선택된다.
특정 구현예에서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 SEQ ID NO: 110 내지 131로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 아미노산 서열 MKAIIVLLMVVTSX1A(SEQ ID NO: 147)를 포함하며, X1은 S 및 N으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 아미노산 서열 MX1AIIVLLMVVTSNA(SEQ ID NO: 148)를 포함하며, X1은 K 및 E로부터 선택된다.
특정 구현예에서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 SEQ ID NO: 132 내지 144로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:.
Figure pct00001
특정 구현예에서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 MKAKLLVLLCTFTATYA(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 항원성 원핵 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다.
특정 구현예에서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 항원성 원핵 폴리펩티드의 C-말단에 위치한다.
특정 구현예에서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 링커에 의해 항원성 원핵 폴리펩티드에 부착된다.
특정 구현예에서, TMB는 (a) 15 개 내지 50 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 15 개 내지 30 개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 18 개 내지 25 개의 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 이루어지고/지거나; (b) 바람직하게는 알라닌, 이소류신, 류신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 50%의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고/하거나; (c) 적어도 하나의 알파 나선을 포함한다.
특정 구현예에서, TMB는 통합 막 단백질로부터, 바람직하게는 단일 막 관통 단백질로부터, 더욱 바람직하게는 바이토프성 막 단백질로부터, 더욱 더 바람직하게는 타입 I의 바이토프성 막 단백질로부터 유래된다.
특정 구현예에서, TMB는 비-인간 서열로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 원핵 막횡단 단백질로부터 유래되고, TMB는 원핵 막횡단 단백질의 TMB이다.
특정 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 원핵 막횡단 단백질로부터 유래되지 않는다.
특정 구현예에서, TMB는 바이러스 서열로부터 유래된다.
특정 구현예에서, TMB는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 막횡단 도메인 서열로부터 유래된다: 인플루엔자 막횡단 도메인 서열, 및 SARS CoV-2 막횡단 도메인 서열, 수두-대상포진 바이러스(VZV) 막횡단 도메인 서열, 홍역 막횡단 도메인 서열, 풍진 막횡단 도메인 서열, 볼거리 막횡단 도메인 서열, 에볼라 막횡단 도메인 서열, 및 광견병 막횡단 도메인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 비-인플루엔자 막횡단 도메인 서열.
특정 구현예에서, TMB는 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 막횡단 도메인 서열, SARS CoV-2 스파이크 막횡단 도메인 서열, VZV gB 막횡단 도메인 서열, VZV gE 막횡단 도메인 서열, VZV gI 막횡단 도메인 서열, VZV gK 막횡단 도메인 서열, 홍역 F-단백질 막횡단 도메인 서열, 풍진 E1 단백질 막횡단 도메인 서열, 풍진 E2 단백질 막횡단 도메인 서열, 볼거리 F-단백질 막횡단 도메인 서열, 에볼라 GP 단백질 막횡단 도메인 서열 및 광견병 G 단백질 막횡단 도메인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 TMB는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B로부터의, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A로부터의 HA 막횡단 도메인 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, TMB는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00002
특정 구현예에서, TMB는 ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, TMB는 링커에 의해 항원성 원핵 폴리펩티드에 부착된다.
특정 구현예에서, TMB는 항원성 원핵 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다.
특정 구현예에서, TMB는 항원성 원핵 폴리펩티드의 C-말단에 위치한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 핵산을 제공하며, ORF는 - 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드, 바람직하게는 항원성 원핵 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 - 적어도 하나의 막횡단 도메인(TMB)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로써, TMB는 항원성 폴리펩티드에 대해 이종성인, 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
선택적으로, ORF는 적어도 하나의 분비 신호 펩티드, 바람직하게는 바이러스 분비 신호 펩티드, 더욱 바람직하게는 선행 청구항들 중 임의의 하나에 기재된 바와 같은 바이러스 분비 신호 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 핵산을 제공하며, ORF는 - 적어도 하나의 항원성 원핵 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 - 적어도 하나의 막횡단 도메인(TMB)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, TMB는 (a) 15 개 내지 50 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 15 개 내지 30 개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 18 개 내지 25 개의 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 이루어지고/지거나; (b) 바람직하게는 알라닌, 이소류신, 류신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 50%의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고/하거나; (c) 적어도 하나의 알파 나선을 포함한다.
특정 구현예에서, TMB는 통합 막 단백질로부터, 바람직하게는 단일 막 관통 단백질로부터, 더욱 바람직하게는 바이토프성 막 단백질로부터, 더욱 더 바람직하게는 타입 I의 바이토프성 막 단백질로부터 유래된다.
특정 구현예에서, TMB는 비-인간 서열로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 항원성 폴리펩티드는 막횡단 단백질로부터 유래되지 않는다.
특정 구현예에서, TMB는 바이러스 서열로부터 유래된다.
특정 구현예에서, TMB는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 막횡단 도메인 서열로부터 유래된다: 인플루엔자 막횡단 도메인 서열, 및 SARS CoV-2 막횡단 도메인 서열, 수두-대상포진 바이러스(VZV) 막횡단 도메인 서열, 홍역 막횡단 도메인 서열, 풍진 막횡단 도메인 서열, 볼거리 막횡단 도메인 서열, 에볼라 막횡단 도메인 서열, 및 광견병 막횡단 도메인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 비-인플루엔자 막횡단 도메인 서열.
특정 양태에서, TMB는 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 막횡단 도메인 서열, SARS CoV-2 스파이크 막횡단 도메인 서열, VZV gB 막횡단 도메인 서열, VZV gE 막횡단 도메인 서열, VZV gI 막횡단 도메인 서열, VZV gK 막횡단 도메인 서열, 홍역 F-단백질 막횡단 도메인 서열, 풍진 E1 단백질 막횡단 도메인 서열, 풍진 E2 단백질 막횡단 도메인 서열, 볼거리 F-단백질 막횡단 도메인 서열, 에볼라 GP 단백질 막횡단 도메인 서열 및 광견병 G 단백질 막횡단 도메인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 TMB는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B로부터의, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A로부터의 HA 막횡단 도메인 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, TMB는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00003
특정 구현예에서, TMB는 ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, TMB는 링커에 의해 항원성 원핵 폴리펩티드에 부착된다.
특정 구현예에서, TMB는 항원성 원핵 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다.
특정 구현예에서, TMB는 항원성 원핵 폴리펩티드의 C-말단에 위치한다.
특정 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 아세토박터(Acetobacter), 아시네토박터(Acinetobacter), 액티노마이세스(Actinomyces), 아에로코쿠스(Aerococcus), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아나플라즈마(Anaplasma), 아조히조비아(Azorhizobia), 아조토박터(Azotobacter), 바실러스(Bacillus), 박테로이데스(Bacteroides), 바르토넬라(Bartonella), 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 부르콜데리아(Burkkolderia), 칼리마토박테리움(Calymmatobacterium), 캄필로박터(Campylobacter), 클라미디아 (Chlamydia), 클라미도필라(Chlamydophila), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 콕시엘라(Coxiella), 큐티박테리움(Cutibacterium), 에를리키아(Ehrlichia), 엔테로박터(Enterobacter), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 에쉬리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 가드넬라(Gardnerella), 헤모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코쿠스(Lactococcus), 레지오넬라(Legionella), 리스테리아(Listeria), 메타노박테리움(Methanobacterium), 마이크로박테리움(Microbacterium), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 모락셀라(Moraxella), 마이코박테리움(Mycobacterium), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 나이세리아(Neisseria), 파스퇴렐라(Pasteurella), 페디오코쿠스(Pediococcus), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 슈도모나스(Pseudomonas), 라이조비움(Rhizobium), 리케치아(Rickettsia), 로칼리메아(Rochalimaea), 로티아(Rothia), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 시겔라(Shigella), 사르키나(Sarcina), 스피릴룸(Spirillum), 스피로카에테스(Spirochaetes), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 스트렙토바실러스(Streptobacillus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 테트라게노코쿠스(Tetragenococcus), 트레포네마(Treponema), 비브리오(Vibrio), 비리단스(Viridans), 볼바키아(Walbachia), 및 예르시니아(Yersinia)로 이루어진 군으로부터 선택된 속의 박테리아로부터, 바람직하게는 아세토박터 아우란티우스(Acetobacter aurantius), 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 악티노미세스 이스라엘리이(Actinomyces israelii), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아나플라스마 파고시토필룸(Anaplasma phagocytophilum), 아조리조비움 카울리노단스(Azorhizobium caulinodans), 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 푸시포르미스(Bacillus fusiformis), 바실루스 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페네트란스(Mycoplasma penetrans), 미코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 네이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스테우렐라 툴라렌시스(Pasteurella tularensis), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 멜라니노게니카(Prevotella melaninogenica), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter), 리케치아 프로와제키이(Rickettsia prowazekii), 리케치아 프시타시(Rickettsia psittaci), 리케치아 퀸타나(Rickettsia quintana), 리케치아 리케치이(Rickettsia rickettsii), 리케치아 트라코마(Rickettsia trachomae), 로칼리마에아 헨셀라에(Rochalimaea henselae), 로칼리마에아 퀸타나(Rochalimaea quintana), 로티아 덴토카리오사(Rothia dentocariosa), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 쉰겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae), 스피릴룸 볼룬탄스(Spirillum volutans), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 아비움(Streptococcus avium), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스 크리세투스(Streptococcus cricetus), 스트렙토 코쿠스 파케이움(Streptococcus faceium), 스트렙토코쿠스 파에칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 페루스(Streptococcus ferus), 스트렙토코쿠스 갈리나룸(Streptococcus gallinarum), 스트렙토코쿠스 락티스(Streptococcus lactis), 스트렙토코쿠스 미티오르(Streptococcus mitior), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 라투스(Streptococcus rattus), 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 스트렙토코쿠스 산구이스(Streptococcus sanguis), 스트렙토코쿠스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 비브리오 콤마(Vibrio comma), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비리단스 스트렙토코키(Viridans streptococci), 울바키아(Wolbachia), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 및 예르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis)로 이루어진 군으로부터 선택된 종의 박테리아로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 바람직하게는 종 비. 부르그도르페리(B. burgdorferi), 아프젤리이(afzelii), 가리니이(garinii), 바바리엔시스(bavariensis), 마이오니이(mayonii), 스피엘마니이(spielmanii), 루시타니아에(lusitaniae), 비세티이(bissettii) 및/또는 발라이시아나(valaisiana)로부터 선택되는 속 보렐리아의 박테리아로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 OspA 또는 이의 단편 또는 변이체이고, OspA 또는 이의 단편 또는 변이체는 적어도 5 개의 아미노산을 포함하고, 바람직하게는 항원성 원핵 폴리펩티드는 하기를 포함한다: (a) 바람직하게는 서열
Figure pct00004
와 적어도 85% 동일성을 갖는 OspA ST1로부터 유래된 아미노산 서열; (b) 바람직하게는 서열
Figure pct00005
Figure pct00006
와 적어도 85% 동일성을 갖는 OspA ST2로부터 유래된 아미노산 서열; (c) 바람직하게는 서열
Figure pct00007
와 적어도 85% 동일성을 갖는 OspA ST3으로부터 유래된 아미노산 서열; (d) 바람직하게는 서열
Figure pct00008
와 적어도 85% 동일성을 갖는 OspA ST4로부터 유래된 아미노산 서열; (e) 바람직하게는 서열
Figure pct00009
와 적어도 85% 동일성을 갖는 OspA ST5로부터 유래된 아미노산 서열; (f) 바람직하게는 서열
Figure pct00010
와 적어도 85% 동일성을 갖는 OspA ST6으로부터 유래된 아미노산 서열; (g) 바람직하게는 서열
Figure pct00011
Figure pct00012
와 적어도 85% 동일성을 갖는 OspA ST7로부터 유래된 아미노산 서열; (h) (a) 내지 (g)의 임의의 조합; (i) (a)에 따른 OspA ST1로부터 유래된 서열 및 (b)에 따른 OspA ST2로부터 유래된 서열, 또는 (j) (a)에 따른 OspA ST1로부터 유래된 서열, (b)에 따른 OspA ST2로부터 유래된 서열, (c)에 따른 OspA ST3으로부터 유래된 서열, (d)에 따른 OspA ST4로부터 유래된 서열, (e)에 따른 OspA ST5로부터 유래된 서열, (f)에 따른 OspA ST6으로부터 유래된 서열 및 (g)에 따른 OspA ST7로부터 유래된 서열.
특정 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이된 글리코실화 부위, 바람직하게는 적어도 하나의 돌연변이된 N-연결 글리코실화 부위를 포함한다.
특정 구현예에서, 핵산의 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다.
특정 구현예에서, ORF의 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 바이러스 분비 신호 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 TMB를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다.
특정 구현예에서, 핵산은 DNA이다.
특정 구현예에서, 핵산은 메신저 RNA(mRNA)이며, 특히 mRNA는 비-복제 mRNA, 자기-복제 mRNA 또는 트랜스-복제 mRNA일 수 있다.
특정 구현예에서, mRNA는 적어도 하나의 5' 비번역 영역(5' UTR), 적어도 하나의 3' 비번역 영역(3' UTR), 및/또는 적어도 하나의 폴리아데닐화(폴리(A)) 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, mRNA는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함한다.
특정 구현예에서, mRNA에서 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형된다.
특정 구현예에서, ORF에서 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형된다.
특정 구현예에서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-l-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-l-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-l-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 및 2'-O-메틸 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 5-메틸시토신, 5-메톡시우리딘, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 화학적 변형은 N1-메틸슈도우리딘이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 조성물은 지질 나노입자(LNP)를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산은 LNP에 캡슐화된다.
특정 구현예에서, LNP는 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 생분해성이다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 생분해성이 아니다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 절단 가능하다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 절단 가능하지 않다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 OF-02, cKK-E10, OF-Deg-Lin, GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1, GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14, SM-102, 및 ALC-0315로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, LNP는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 컨쥬게이션된(PEG화된) 지질, 콜레스테롤계 지질 및 헬퍼 지질을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 - 35% 내지 55%의 몰비의 양이온성 지질; - 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 컨쥬게이션된(PEG화된) 지질; - 20% 내지 45%의 몰비의 콜레스테롤계 지질; 및 - 5% 내지 35%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함하며, 모든 몰비는 LNP의 총 지질 함량에 상대적이다.
특정 구현예에서, LNP는 - 40%의 몰비의 양이온성 지질; - 1.5%의 몰비의 PEG화된 지질; - 28.5%의 몰비의 콜레스테롤계 지질; 및 - 30%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 - 45% 내지 50%의 몰비의 양이온성 지질; - 1.5% 내지 1.7%의 몰비의 PEG화된 지질; - 38% 내지 43%의 몰비의 콜레스테롤계 지질; 및 - 9% 내지 10%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함한다.
특정 구현예에서, PEG화된 지질은 디미리스토일-PEG2000(DMG-PEG2000) 또는 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159)이다.
특정 구현예에서, 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤이다.
특정 구현예에서, 헬퍼 지질은 1,2-디올레오일-SN-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다.
특정 구현예에서, LNP는 - 40%의 몰비의 OF-02, cKK-E10, GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1, GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, 및 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14로 이루어진 군으로부터 선택된 양이온성 지질; - 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000; - 28.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 - 30%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 - 50%의 몰비의 SM-102; - 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000; - 38.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 - 10%의 몰비의 DSPC를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 - 46.3%의 몰비의 ALC-0315; - 1.6%의 몰비의 ALC-0159; - 42.7%의 몰비의 콜레스테롤; 및 - 9.4%의 몰비의 DSPC를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 - 47.4%의 몰비의 ALC-0315; - 1.7%의 몰비의 ALC-0159; - 40.9%의 몰비의 콜레스테롤; 및 - 10%의 몰비의 DSPC를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 30 nm 내지 200 nm의 평균 직경을 갖는다.
특정 구현예에서, LNP는 80 nm 내지 150 nm의 평균 직경을 갖는다.
특정 구현예에서, 조성물은 1 mg/mL 내지 10 mg/mL의 LNP를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 1 개 내지 20 개의 핵산 분자, 바람직하게는 mRNA 분자를 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내 투여용으로 제형화된다.
특정 구현예에서, 조성물은 인산염 완충 식염수를 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 약학적 조성물, 예를 들어, 면역원성 조성물 또는 백신, 특히 mRNA 백신이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 데 사용하기 위한 핵산 또는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 원핵 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 원핵 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 핵산 또는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 항원성 원핵 폴리펩티드를 분비하는 방법을 제공하며, 방법은 상기 기재된 핵산 또는 조성물을 숙주 세포에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포의 표면 상에 항원성 원핵 폴리펩티드를 표시하는 방법을 제공하며, 방법은 상기 기재된 핵산 또는 조성물을 숙주 세포에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 핵산 또는 조성물의 1회용 또는 다회용 투여량을 포함하는 용기를 포함하는 키트를 제공하며, 선택적으로 용기는 바이알 또는 사전충전형 주사기 또는 주입기이다.
도 1은 외표면 단백질 A(OspA) 혈청형 1(ST1) 및 혈청형 2(ST2) mRNA 작제물의 구조를 도시한 것이다. 상이한 mRNA 서열들이 헤마글루티닌 분비 신호(HA SS) 및/또는 HA 막횡단 도메인(HA TMB)에 대한 융합 없이 또는 융합과 함께 OspA 서열을 사용하여 OspA의 세포내 발현, 분비된, 또는 막횡단을 유도하도록 설계되었다. OspA 네이티브 서열뿐만 아니라 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 글리코실화를 막기 위한 글리코실화 부위 돌연변이(Gly-)를 갖는 서열이 사용되었다.
도 2a 및 도 2b는 HEK293T 세포의 상청액에서 OspA ST1 및 ST2 mRNA의 시험관내 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 이미지를 도시한 것이다. HA 분비 신호의 부재 또는 존재, 및 글리코실화 부위 돌연변이의 부재 또는 존재에서 mRNA-OspA ST1(도 2a) 및 mRNA-OspA ST2(도 2b)가 도시되어 있다. 음성 대조군(완충액) 및 양성 대조군(재조합 OspA)을 또한 사용하였다. HEK293 세포를 백신 mRNA로 형질감염시켰다. 48시간 후, 상청액을 수집하고 웨스턴 블롯 상에서 러닝시켰다. 블롯팅된 단백질을 OspA를 인식하는 다클론 토끼 항체로 검출하였다.
도 3의 A 내지 도 3의 C는 HEK293 세포에서 글리코실화 부위 돌연변이의 부재 또는 존재 하에 HA SS 및 HA TMB를 함유하는 OspA ST1 mRNA의 시험관내 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 이미지를 도시한 것이다. 세포의 상청액(도 3의 A), 미정제 추출물(도 3의 B) 및 세포내 구획(도 3의 C)이 도시되어 있다. 48 시간 또는 72 시간 후, 상청액 및 세포를 수집하고 웨스턴 블롯에서 러닝시켰다. 블롯팅된 단백질을 OspA를 인식하는 다클론 토끼 항체로 검출하였다.
도 4의 A 내지 도 4의 C는 HEK293 세포에서 글리코실화 부위 돌연변이의 부재 또는 존재에서 HA SS 및 HA TMB를 함유하는 OspA ST2 mRNA의 시험관내 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 이미지를 도시한 것이다. 세포의 상청액(도 4의 A), 미정제 추출물(도 4의 B) 및 세포내 구획(도 4의 C)이 도시되어 있다. 48 시간 또는 72 시간 후, 상청액 및 세포를 수집하고 웨스턴 블롯에서 러닝시켰다. 블롯팅된 단백질을 OspA를 인식하는 다클론 토끼 항체로 검출하였다.
도 5는 HEK293 세포에서 mRNA에 의해 전달된 OspA ST1 항원의 항원성을 도시한 것이다. 형질감염된 세포 상청액을 사용하여 기능성 단클론 항체 LA-2, 857-2 및 221-7로 샌드위치 ELISA를 수행하였다.
도 6은 HEK293 세포에서 mRNA에 의해 전달된 OspA ST2 항원의 항원성을 도시한 것이다. 형질감염된 세포 상청액을 사용하여 기능성 단클론 항체 857-2 및 221-7로 샌드위치 ELISA를 수행하였다.
도 7a 및 도 7b는 용량 1 후(20 일차)(도 7a) 및 용량 2 후(35 일차)(도 7b)의 항-OspA ST1 IgG ELISA로부터의 IgG 역가 값을 도시한 것이다. HA-SS = 분비 신호 헤마글루티닌; TMB = 막횡단 도메인; Gly(-) = 글리코실화 부위 돌연변이; 점선 = 정량 한계.
도 8은 mRNA 작제물의 확장된 패널에 포함된 요소의 개략도이다. 패널은 개략도의 좌측에 나타나 있는 바와 같이 3 개의 상이한 원핵 항원: OspA ST1, CAMP2, 및 PITP로 이루어졌다. 개략도의 우측은 항원이 하기 바이러스 패밀리로부터 유래된 당단백질의 신호 서열("SS"로 표지됨)에 융합되었음을 보여준다: 인플루엔자(아형 A 또는 B), 광견병, 수두(VZV), 또는 에볼라 바이러스. 패널 작제물 중 일부는 각각의 당단백질 막횡단 도메인("TMB"로 표지됨)을 추가로 함유하였다. "플루(Flu)"는 "인플루엔자" 바이러스를 나타낸다.
도 9는 HEK Expi293F 세포에서 형질감염 후 이들의 각각의 당단백질 TMB 도메인의 존재 또는 부재에서 인플루엔자(아형 A 또는 B), 광견병, 수두(VZV), 또는 에볼라 바이러스로부터 유래된 당단백질로부터의 SS를 함유하는 OspA ST1 mRNA의 시험관내 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 이미지를 도시한 것이다. OspA ST1(예상 크기 약 28 kDa 내지 34 kDa)을 1:2000 희석으로 OspA에 대한 토끼 다클론 항체(ABCAM ab106081)를 사용하여 검출하였다. 대조군은 임의의 SS 또는 임의의 지질화 서열이 없는 OspA ST1 작제물(모든 겔의 첫 번째 레인, "SS 없음"으로 표지됨)과 재조합 OspA ST1(모든 겔의 마지막 레인)을 포함하였다. 미정제 추출물(총 용해물), 세포 상청액, 및 세포내 또는 막횡단 구획을 함유하는 분획화된 세포 샘플로부터 48 시간 시점에 샘플을 수집하였다.
도 10은 HEK Expi293F 세포에서 형질감염 후 이들의 각각의 당단백질 TMB 도메인의 존재 또는 부재에서 인플루엔자(아형 A 또는 B) 및 광견병(좌측 겔) 및 수두(VZV) 및 에볼라(우측 겔) 바이러스로부터 유래된 당단백질로부터의 SS를 함유하는 OspA ST1 mRNA의 시험관내 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 이미지를 도시한 것이다. 세포 상청액을 48 시간 시점에 수집하고 7 배 농축하였다. 생성된 샘플 부피의 절반을 탈글리코실화하여(겔 상에서 "D"로 표시됨) 효소 처리 전 및 후에 웨스턴 블롯에 의해 단백질을 분석하였다. OspA ST1(예상 크기 약 28 kDa 내지 34 kDa)을 1:2000 희석으로 OspA에 대한 토끼 다클론 항체(ABCAM ab106081)를 사용하여 검출하였다. 대조군은 형질감염 대조군(mRNA 없이 형질감염된 세포), 임의의 SS가 없는 OspA ST1 작제물("SS 없음"으로 표지됨)뿐만 아니라 재조합 OspA ST1(모든 겔의 마지막 레인)을 포함하였다.
도 11은 HEK Expi293F 세포에서 형질감염 후 이들의 각각의 당단백질 TMB 도메인의 존재 또는 부재에서 인플루엔자(아형 A 또는 B), 광견병, 수두(VZV), 또는 에볼라 바이러스로부터 유래된 당단백질로부터의 SS를 함유하는 CAMP2 mRNA의 시험관내 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 이미지를 도시한 것이다. CAMP2(예상 크기 약 26 kDa 내지 32 kDa)를 1:1500 희석으로 CAMP2에 대한 토끼 다클론 항체를 사용하여 검출하였다. 대조군은 임의의 SS가 없는 CAMP2 작제물(모든 겔 상의 첫 번째 레인, "SS 없음"으로 표지됨)뿐만 아니라 재조합 CAMP2(모든 겔 상의 마지막 레인)를 포함하였다. 미정제 추출물(총 용해물), 세포 상청액, 및 세포내 또는 막횡단 구획을 함유하는 분획화된 세포 샘플로부터 48 시간 시점에 샘플을 수집하였다.
도 12는 HEK Expi293F 세포에서 형질감염 후 이들의 각각의 당단백질 TMB 도메인의 존재 또는 부재에서 인플루엔자(아형 A 또는 B), 광견병, 수두(VZV), 또는 에볼라 바이러스로부터 유래된 당단백질로부터의 SS를 함유하는 PITP mRNA의 시험관내 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 이미지를 도시한 것이다. PITP(예상 크기 약 42 kDa 내지 48 kDa)를 1:1000 희석으로 PITP에 대한 마우스 다클론 항체를 사용하여 검출하였다. 대조군은 임의의 SS 또는 임의의 TMB가 없는 PITP 작제물(모든 겔의 첫 번째 레인, "SS 없음"으로 표지됨)뿐만 아니라 재조합 PITP(모든 겔의 마지막 레인)를 포함하였다. 미정제 추출물(총 용해물), 세포 상청액, 및 세포내 또는 막횡단 구획을 함유하는 분획화된 세포 샘플로부터 48 시간 시점에 샘플을 수집하였다.
도 13의 좌측 표는 HEK Expi293F 세포에서 형질감염 후 이들의 각각의 당단백질 TMB 도메인의 존재 또는 부재에서 인플루엔자(아형 A 또는 B), 광견병, 수두(VZV), 또는 에볼라 바이러스로부터 유래된 당단백질로부터의 SS를 함유하는 OspA ST1, CAMP2, 및 PITP mRNA 작제물로부터의 단백질 발현 및 국소화의 웨스턴 블롯 분석을 요약한 것이다. 도 13의 표 우측은 SignalP로부터 유래된 인실리코 신호 서열 예측 점수이다.
본 개시내용은 특히 바이러스 분비 신호 펩티드 서열 및 막횡단 도메인(TMB) 중 하나 또는 둘 모두에 연결된 항원성 원핵 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA) 조성물, 및 이를 사용한 백신접종 방법에 관한 것이다.
I. 정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 예시적인 방법 및 물질이 아래에 기재되지만, 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질도 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 상충되는 경우에는, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다. 일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 바이러스학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 의학 및 약 화학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 이들의 기법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 흔히 사용되는 것이다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조사의 사양서에 따라 수행되거나, 당업계에서 일반적으로 달성되는 바와 같이, 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 또한, 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 명세서 및 구현예 전반에 걸쳐, 단어 "가지다" 및 "포함하다", 또는 "갖다", "가지고 있는", "포함한다", 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수군을 포함하되, 임의의 기타 정수 또는 정수군을 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 기타 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 여러 문헌이 본원에 인용되지만, 상기 인용은 임의의 이들 문헌이 당업계의 통상의 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것으로 간주되지 않는다.
단수형("a" 또는 "an") 엔티티는 그 엔티티 중 하나 이상을 지칭한다는 것에 유의해야 하며, 예를 들어 "뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 단수형 용어("a" (또는 "an")), 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
추가로, 본원에 사용되는 "및/또는"은 다른 것의 유무와 상관없이 2 개의 명시된 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시내용으로서 간주되어야 한다. 그러므로, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하기 위한 것이다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 하기 양태 각각을 포괄하기 위한 것이다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
본원의 양태가 "포함하는(comprising)"이라는 말을 사용하여 기재되는 경우, "이루어진(consisting of)" 및/또는 "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"이라는 측면에서 기재된 다른 유사한 양태도 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용과 관련된 분야의 당업자가 흔히 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 당업자에게 본 명세서에 사용된 많은 용어의 일반 사전을 제공할 수 있다.
단위, 접두사, 및 기호는 그에 관한 국제 단위계(SI)에서 허용된 형식으로 표시된다. 숫자 범위는 해당 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 배향으로 좌측에서 우측으로 기재된다. 본원에 제공된 표제는 본 개시내용의 다양한 양태를 제한하는 것이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 본 명세서 전체를 참조하여 더욱 완전하게 정의된다.
용어 "대략" 또는 "약"은 대략, 거의, 가량 또는 '~의 부근'을 의미하기 위해 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 제시된 수치값의 위와 아래로 경계를 확장하여 그 범위를 수식한다. 일반적으로, 용어 "약"은, 예를 들어 10 퍼센트, 위 또는 아래(더 높거나 더 낮게)로의 변동만큼 명시된 값의 위와 아래로 수치값을 수식할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 용어는 표시된 수치값으로부터 ±10%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, ±1%, ±0.9%, ±0.8%, ±0.7%, ±0.6%, ±0.5%, ±0.4%, ±0.3%, ±0.2%, ±0.1%, ±0.05%, 또는 ±0.01%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±10%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±5%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±4%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±3%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±2%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±1%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.9%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.8%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.7%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.6%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.5%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.4%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.3%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.1%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.05%만큼의 편차를 나타낸다. 일부 구현예에서, "약"은 표시된 수치값으로부터 ±0.01%만큼의 편차를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "메신저 RNA" 또는 "mRNA"는 적어도 하나의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 mRNA는 변형된 RNA 및 변형되지 않은 RNA 둘 모두를 포함한다. mRNA는 하나 이상의 코딩 영역 및 비-코딩 영역을 함유할 수 있다. 코딩 영역은 대안적으로 오픈 리딩 프레임(ORF)로 지칭된다. mRNA에서 비-코딩 영역은 5' 캡, 5' 비번역 영역(UTR), 3' UTR 및 폴리A 테일을 포함한다. mRNA는 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템(예를 들어, 시험관내 전사)를 이용하여 생성되고, 선택적으로 정제되거나, 화학적으로 합성된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "오픈 리딩 프레임", "ORF", 또는 "코딩 영역"은 시작 코돈(예를 들어, ATG)으로 시작하여 정지 코돈(예를 들어, TAA, TAG 또는 TGA)으로 끝나고(이들 사이에 임의의 다른 정지 코돈 없이), 단백질(예를 들어, 항원성 원핵 폴리펩티드)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "바이러스 분비 신호 펩티드" 또는 "SS"는 세포 분비 경로를 통해 부착되는 폴리펩티드 서열을 유도하는 바이러스로부터 유래된 아미노산 서열을 지칭한다. SS 서열을 갖는 폴리펩티드는 분비 소포를 통해 세포 외부에서 분비될 때까지 세포 내 하나 이상의 소기관을 통해 전이된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "막횡단 도메인" 또는 "TMB"는 세포막-스패닝 성질을 갖는 아미노산 서열을 지칭한다. TMB는 세포막에 부착된 폴리펩티드의 고정을 촉발한다.
또한 폴리펩티드의 단편 또는 변이체, 및 이들의 임의의 조합이 본 개시내용에 포함된다. 본 개시내용의 항원성 원핵 폴리펩티드를 지칭할 때 용어 "단편" 또는 "변이체"는 참조 폴리펩티드의 성질 중 적어도 일부(예를 들어, 폴리펩티드의 특이적 항원성 성질 또는 폴리펩티드가 항체 결합의 유도에 기여하는 능력)를 보유하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 단편은 N-말단 및/또는 C-말단 트렁케이션된 단편, 예를 들어, C-말단 단편 및 N-말단 단편뿐만 아니라 결실 단편을 포함하지만, 천연 발생 전장 폴리펩티드(또는 성숙 폴리펩티드)를 포함하지는 않는다. 결실 단편은 전장 폴리펩티드로부터 결실된 1 개 이상의 내부 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드의 변이체는 전술한 바와 같은 단편을 포함하고, 또한 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입으로 인해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 천연 발생적 또는 비-천연 발생적일 수 있다. 비-천연 발생적 변이체는 당업계에 알려진 돌연변이 유발 기법을 사용하여 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 이러한 변이(즉, 트렁케이션 및/또는 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입)는 아미노산 수준에서 또는 이에 상응하여 핵산 수준에서 발생할 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하여 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리은 당업계에 정의되어 있다. 따라서, 폴리펩티드의 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산으로 대체되는 경우, 치환은 보존적인 것으로 간주된다. 다른 구현예에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 군 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로는 유사한 스트링으로 보존적으로 대체될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "연결" 또는 "부착"은 각각 제2 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 항원성 원핵 폴리펩티드 아미노산 서열에 연결된 분비 신호 아미노산 서열 및/또는 막횡단 도메인 아미노산 서열)에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된 제1 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 직접 연결되거나 병치될 수 있거나, 대안적으로 개재 서열이 제1 서열을 제2 서열에 공유 연결할 수 있다. 용어 "연결"은 C-말단 또는 N-말단에서 제1 아미노산 서열이 제2 아미노산 서열에 융합되는 것을 의미할 뿐만 아니라, 전체 제1 아미노산 서열(또는 제2 아미노산 서열)이 제2 아미노산 서열(또는 제1 아미노산 서열)의 임의의 2 개의 아미노산에 삽입되는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 제1 아미노산 서열은 펩티드 결합 또는 링커에 의해 제2 아미노산 서열에 연결될 수 있 있다. 제1 뉴클레오타이드 서열은 포스포디에스테르 결합 또는 링커에 의해 제2 뉴클레오타이드 서열에 연결될 수 있다. 링커는 펩티드 또는 폴리펩티드(폴리펩티드 쇄의 경우) 또는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쇄(뉴클레오티드 쇄의 경우) 또는 임의의 화학적 모이어티(폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 쇄 둘 모두의 경우)일 수 있다. 용어 "연결"은 하이픈(-)으로도 표시된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "글리코실화"는 단백질에 당류 단위를 첨가하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "N-글리칸"은 단백질의 N(아스파라긴) 잔기의 아미드 질소에서 단백질에 부착된 당류 사슬을 지칭한다. 이와 같이, N-글리칸은 N-글리코실화 프로세스에 의해 형성된다. 이 글리칸은 다당류일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 반응"은 항원 또는 백신과 같은 자극에 대한 면역계의 세포, 예컨대 B 세포, T 세포, 수지상 세포, 대식세포 또는 폴리모르포뉴클레오사이트(polymorphonucleocyte)의 반응을 지칭한다. 면역 반응은 예를 들어 인터페론 또는 사이토카인을 분비하는 상피 세포를 포함하여, 숙주 방어 반응에 관련된 신체의 임의의 세포를 포함할 수 있다. 면역 반응은 선천성 및/또는 적응성 면역 반응을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "보호 면역 반응"은 감염으로부터 대상체를 보호하는 (예를 들어, 감염을 예방하거나 감염과 관련된 질환의 발병을 예방하는) 면역 반응을 지칭한다. 면역 반응을 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 림프구(예컨대, B 또는 T 세포)의 증식 및/또는 활성, 사이토카인 또는 케모카인 분비, 염증, 항체 생산 등을 측정하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "항체 반응"은 항체가 생산되는 면역 반응이다.
본원에 사용된 바와 같이, "항원"은 면역 반응을 유발하는 제제, 및/또는 (예를 들어 MHC 분자에 의해 제시될 때) T 세포 수용체에 의해 결합되거나, 유기체에 노출되거나 투여될 때 (예를 들어 B 세포에 의해 생산되는) 항체에 결합되는 제제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 항원은 유기체에서 체액성 반응(예를 들어 항원-특이적 항체의 생산을 포함함)을 유발한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 항원은 유기체에서 (예를 들어 항원과 특이적으로 상호작용하는 수용체를 갖는 T-세포를 수반하는) 세포 반응을 유발한다. 특정 항원은 표적 유기체(예를 들어 마우스, 토끼, 영장류, 인간)의 하나의 또는 몇몇 구성원에서 면역 반응을 유발할 수 있으나, 표적 유기체 종의 모든 구성원에서 그러한 것은 아니다. 일부 구현예에서, 항원은 표적 유기체 종의 구성원의 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%에서 면역 반응을 유도한다. 일부 구현예에서, 항원은 항체 및/또는 T 세포 수용체에 결합하고, 유기체에서 특정 생리학적 반응을 유도할 수 있거나 유도하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 항원은 이러한 상호작용이 생체내에서 발생하는지 여부에 관계없이 시험관내에서 항체 및/또는 T 세포 수용체에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 특정 체액성 또는 세포성 면역의 생성물과 반응한다. 항원은 본원에 기재된 바와 같은 mRNA에 의해 인코딩된 원핵 항원성 폴리펩티드(예를 들어, OspA ST1 및 ST2)를 포함한다. "원핵 항원" 또는 "항원성 원핵 폴리펩티드"는 면역 반응을 유발할 수 있는 원핵 유기체로부터 유래된 임의의 항원성 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아쥬반트"는 항원에 대한 면역 반응을 강화하는 물질 또는 비히클을 지칭한다. 아쥬반트는 항원이 흡착된 미네랄(예를 들어, 명반, 수산화 알루미늄 또는 인산염)의 현탁액; 항원 용액이 미네랄 오일 또는 물에 유화된 유중수형 또는 수중유형 에멀젼(예를 들어, 프로인트(Freund)의 불완전 아쥬반트)를 제한없이 포함할 수 있다. 때때로 사멸된 마이코박테리아가 포함되어(예를 들어, 프로인트(Freund)의 완전 아쥬반트), 항원성을 더욱 향상시킨다. 면역-자극성 올리고뉴클레오티드(예를 들어 CpG 모티프) 또한 아쥬반트로서 사용될 수 있다(예를 들어 미국 특허 제6,194,388호; 제6,207,646호; 제6,214,806호; 제6,218,371호; 제6,239,116호; 제6,339,068호; 제6,406,705호; 및 제6,429,199호 참조). 아쥬반트는 또한 톨-유사 수용체(TLR) 작용제 및 공동자극 분자와 같은 생물학적 분자를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "대상체"는 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 구현예에서, "대상체"는 인간을 지칭한다. 일부 구현예에서, "대상체"는 비인간 동물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 비인간 대상체는 포유류, 예를 들어, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 라마, 말, 개, 고양이, 소, 양, 염소, 영장류, 돼지이다. 일부 구현예에서, 대상체가 인간인 경우, 용어 "개체" 또는 "환자"가 사용되고, "대상체"와 상호교환 가능한 것으로 하고자 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방하다", "예방하는", "예방(prevention)" 또는 "예방(prophylaxis)"(및 이의 문법적 변형어)은 특정 감염, 질환, 장애 및/또는 질병의 하나 이상의 증상 또는 특징의 개시를 부분적으로 또는 완전히 저해하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료하는", "치료", "요법" 또는 "치료적"(및 이의 문법적 변형어)은 감염, 질환, 장애, 및/또는 질병의 하나 이상의 증상 또는 특징의 부분적인 또는 완전한 완화, 호전, 개선, 진정, 이의 진행 저해 및/또는 이의 중증도 저하를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 유익하거나 원하는 결과를 초래하기에 충분한 양(예를 들어, 핵산 또는 조성물)을 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있으며, 특정 제형 또는 투여 경로로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "유효량"은, 예를 들어, "치료적 유효량" 및/또는 "예방적 유효량"을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 어구 "치료적 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 이익/위험 비율로 감염, 질환, 장애 및/또는 질병의 치료에서 일부 요망되는 치료 효과를 생성하는 데 효과적인 양(예를 들어, 핵산 또는 조성물의 양)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 어구 "예방적 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 이익/위험 비율로 감염, 질환, 장애 및/또는 질병의 예방에서 일부 요망되는 예방적 효과를 생성하는 데 효과적인 양(예를 들어, 핵산 또는 조성물의 양)을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "백신접종" 또는 "백신주사"는 예를 들어 질환-유발제에 대한 면역 반응을 생성하도록 의도된 조성물의 투여를 지칭한다. 백신접종은 질환-유발 제제, 및/또는 하나 이상의 증상의 발현에 대한 노출 전, 동안 및/또는 후에, 그리고 일부 구현예에서 제제에 노출되기 전, 동안 및/또는 직후에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 백신접종은 백신접종 조성물의 적절한 시간 간격을 둔 다중 투여를 포함한다.
본 개시내용은 각각 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열(기준 서열)에 대해 특정 정도의 동일성을 갖는 핵산 서열(예를 들어, DNA 및 RNA 서열) 및 아미노산 서열을 기재한다.
2 개의 핵산 서열 사이의 "서열 동일성"은 이러한 서열들 사이에서 동일한 뉴클레오티드의 백분율을 나타낸다. 2 개의 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"은 이러한 서열들 사이에서 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다.
용어들 "% 동일한", "% 동일성" 또는 유사한 용어는 특히 비교될 서열 간의 최적 정렬에서 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 백분율을 지칭하는 것으로 의도된다. 상기 백분율은 순전히 통계적이며, 두 서열 간의 차이는 비교될 서열의 전체 길이에 걸쳐 무작위로 분포될 수 있지만 반드시 그런 것은 아니다. 두 서열의 비교는 일반적으로 상응하는 서열의 국소 영역을 확인하기 위해, 세그먼트 또는 "비교 창"에 대해 최적 정렬 후에 상기 서열을 비교함으로써 수행된다. 비교를 위한 최적의 정렬은 수동으로 수행될 수 있거나, 문헌[Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482]의 국소적 상동성 알고리즘의 도움을 받아, 문헌[Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443]의 국소적 상동성 알고리즘의 도움을 받아, 문헌[Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444]의 유사성 검색 알고리즘의 도움을 받아, 또는 이러한 알고리즘을 이용하는 컴퓨터 프로그램(Wisconsin Genetics Software Package 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA, 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 Genetics Computer Group)의 도움을 받아 수행될 수 있다.
백분율 동일성은 비교될 서열이 대응하는 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 수를 비교된 위치의 수(예를 들어, 참조 서열의 위치 수)로 나누고, 이 결과에 100을 곱함으로써 획득된다.
일부 구현예에서, 동일성의 정도는 참조 서열 전체 길이의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 영역에 대해 제공된다. 예를 들어, 참조 핵산 서열이 200 개의 뉴클레오타이드로 구성되는 경우, 동일성의 정도는 적어도 약 100 개, 적어도 약 120 개, 적어도 약 140 개, 적어도 약 160 개, 적어도 약 180 개, 또는 약 200 개의 뉴클레오타이드에 대해, 일부 구현예에서 연속 뉴클레오타이드에서 제공된다. 일부 구현예에서, 동일성의 정도는 기준 서열의 전체 길이에 대해 제공된다.
주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 대해 각각 특정 정도의 동일성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 상기 주어진 서열의 적어도 하나의 기능적 성질을 가질 수 있고, 예를 들어, 일부 경우에는 상기 주어진 서열과 기능적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 대해 특정 정도의 동일성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 상기 주어진 서열과 기능적으로 동등하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키트"는 하나 이상의 화합물 또는 조성물과 같은 관련 성분 및 용매, 용액, 완충액, 지침 또는 건조제와 같은 하나 이상의 관련 물질의 패키지 세트를 지칭한다.
II. 분비 신호 서열
항원성 원핵 폴리펩티드에 부착된 바이러스 분비 신호 펩티드(SS) 서열의 사용은 백신접종을 위한 많은 이점을 제공할 수 있다. 특히 진핵 세포에서, mRNA로부터 발현될 때, SS-원핵 항원 융합 단백질은 SS 서열이 없는 원핵 항원에 비해 증가된 세포외 발현을 가질 수 있다. 증가된 세포외 발현은 보다 높은 면역원성 및 더 나아가 보다 우수한 백신 효능을 증진시킬 수 있다.
바이러스 SS 서열은 주석화된 바이러스 폴리펩티드 서열을 포함하고 실험적으로 검증된 SS의 시작 및 종료 위치를 확인하는 공개적으로 접근 가능한 데이터베이스(예를 들어, NCBI 또는 UniProt 데이터베이스)에서 찾아볼 수 있다.
특정 구현예에서, SS 서열뿐만 아니라 주어진 공지된 입력 폴리펩티드 서열에 대한 SS 서열 절단 부위의 위치는 SignalP 알고리즘을 사용하여 예측될 수 있다. SignalP 알고리즘(및 보다 구체적으로 SignalP v6.0)은 문헌[Armenteros et al. (Nature Biotechnology. 37: 420-423. 2019), Teufel et al. (Nature Biotechnology. 40: 1023-1025. 2022)], 및 https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/에 보다 상세히 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 예측 강도는 신호 서열의 표준 특징을 검출할 가능성(SS 우도 점수) 및 절단 부위에서의 절단 확률(절단 확률 점수)을 고려하는 누적 순위 점수를 기반으로 평가된다.
특정 구현예에서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 인간을 감염시킬 수 있는 바이러스의 바이러스 서열로부터 유래된다. 어구 "분비 신호 펩티드 서열"의 앞에 있는 어구 "인플루엔자", "SARS CoV-2", "수두-대상포진 바이러스(VZV)", "홍역", "풍진", "광견병", "에볼라" 및 "두창"은 분비 신호 펩티드가 그 명칭에 상응하는 바이러스로부터 유래되었음을 나타낸다.
특정 구현예에서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 서열로부터 유래된다: 인플루엔자 분비 신호 펩티드 서열, SARS CoV-2 분비 신호 펩티드 서열, 수두-대상포진 바이러스(VZV) 분비 신호 펩티드 서열, 홍역 분비 신호 펩티드 서열, 풍진 분비 신호 펩티드 서열, 볼거리 분비 신호 펩티드 서열, 에볼라 분비 신호 펩티드 서열, 광견병 분비 신호 펩티드 서열, 및 두창 분비 신호 펩티드 서열. 이들 특정 신호 펩티드는 강력한 안전성 프로파일이 입증된 백신으로서 인간에게 투여된 바이러스(생약독화, 불활성화 또는 mRNA)의 바이러스 서열로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 분비 신호 펩티드 서열, SARS CoV-2 스파이크 분비 신호 펩티드 서열, VZV gB 분비 신호 펩티드 서열, VZV gE 분비 신호 펩티드 서열, VZV gI 분비 신호 펩티드 서열, VZV gK 분비 신호 펩티드 서열, 홍역 F-단백질 분비 신호 펩티드 서열, 풍진 E1 단백질 분비 신호 펩티드 서열, 풍진 E2 단백질 분비 신호 펩티드 서열, 볼거리 F-단백질 분비 신호 펩티드 서열, 에볼라 GP 단백질 분비 신호 펩티드 서열, 광견병 바이러스 당단백질(광견병 G) 분비 신호 펩티드 서열, 및 천연두 6 kDa IC 단백질 분비 신호 펩티드 서열.
특정 구현예에서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B로부터의, 바람직하게는 인플루엔자 A로부터의 HA 분비 신호 펩티드 서열을 포함한다.
본 개시내용의 예시적인 바이러스 분비 신호 펩티드 아미노산 서열은 하기 표 1에 제시되어 있다. 본 개시내용의 인플루엔자 A 또는 B로부터 유래된 예시적인 바이러스 분비 신호 펩티드 아미노산 서열은 하기 표 2에 제시되어 있다.
[표 1]
바이러스 분비 신호 펩티드(SS) 아미노산 서열
Figure pct00013
Figure pct00014
[표 2]
인플루엔자 바이러스 A 및 B 특이적 바이러스 분비 신호 펩티드(SS) 아미노산 서열
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
III. 막횡단 도메인
SS를 또한 포함할 수 있는 백신 항원으로서 사용되는 작제물, 특히 mRNA 작제물에 막횡단 도메인(TMB)을 포함시켜, SS-항원-TMB 융합 단백질(및 가능하게는 그 후에, 성숙 단백질에서 SS의 절단 후 항원-TMB 단백질)을 생성하는 것은 막에 고정함으로써 항원을 세포 표면에 국소화하는 것을 목적으로 한다. 이는 항원 세포내 국소화를 저하시킬 수 있고, TMB 서열이 없는 항원에 비해 더 높은 면역원성을 추가로 증진시킬 수 있다. TMB의 첨가는 특히 항원에 대한 체액성(B-세포) 반응을 증가시킬 수 있다. 이는 원핵 항원에 유용할 수 있지만, 다른 항원(예를 들어, 바이러스 항원)에도 사용될 수 있다. TMB의 첨가는 막 단백질로부터 유래된 항원 또는 막 단백질이 아닌 단백질로부터 유래된 항원(예를 들어, 분비 단백질 또는 세포내 단백질)과 함께 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 보다 특이적인 TMB 중 임의의 TMB의 첨가는 특히 막 단백질이 아닌 단백질, 즉 TMB를 자연적으로 함유하지 않는 단백질(또는 이와 유사한 단백질)로부터 유래되는 항원에 유용할 수 있다.
TMB는 진핵 막횡단 단백질(예를 들어, 포유류 막횡단 단백질, 예컨대, 인간 막횡단 단백질)로부터의 TMB, 원핵 막횡단 단백질로부터의 TMB, 및 바이러스 막횡단 단백질로부터의 TMB를 포함하나, 이에 제한되지 않는 당업계에 임의의 공지된 TMB로부터의 것일 수 있다. TMB는 추가로, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Krogh et al. (J Mol Biol. 305(3): 567-580. 2001)] 및 https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/에 기재된 TMHMM 예측 방법으로 인 실리코 예측 알고리즘을 통해 확인될 수 있다. TMB의 일부 특징은 본원에 참조로 포함되는 문헌[Albers et al. (Chapter 2 - cell membrane structures and functions. Basic Neurochemistry eighth edition. Pages 26-39. 2012)]에 더 상세히 기재되어 있다. TMB는 전적으로는 아니지만 전형적으로 비극성(소수성) 아미노산 잔기로 주로 구성되지만, 지질 이중층을 1 회 또는 수회 횡단할 수 있다. 당업자는 아미노산의 소수성을 결정하는 방법을 잘 알고 있다. 문헌[Simm et al. (2016), Biol Res., 49(1):31; Wimlet and White (1996), Nat Struct Biol., 3(10): 842-848; https://blanco.biomol.uci.edu/hydrophobicity_scales.html; 및 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/docs/UsersGuide/midas/hydrophob.html을 참조한다.
TMB는 일반적으로 알파 나선을 포함하며, 각각의 나선은 지질 이중층에 걸쳐 있는 18 개 내지 21 개의 아미노산을 함유한다. 따라서, 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 하나 이상의 알파 나선을 포함한다.
특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 이하에 추가로 정의된 바와 같은 통합 막 단백질로부터 유래되고, 문헌[Albers et al.]에서 "통합 막 단백질"(고유 막 단백질로도 알려짐)은 지질막에 영구적으로 부착되는 막 단백질이다. 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 통합 폴리토픽 단백질로부터 유래된다. 통합 폴리토픽 단백질은 전체 막에 걸쳐 있는 단백질이다. 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 단일 막 관통(횡단) 단백질, 보다 구체적으로는, 예를 들어, 타입 I 또는 타입 II의 바이토프성 막 단백질로부터 유래된다. 단일 막 관통 단백질은 막을 한 번만 지나가는 반면(즉, 바이토프성 막 단백질), 다중 막 관통 단백질은 안으로 및 밖으로 직조하여 여러 번 지나간다. 단일 막횡단 관통 단백질은 이들의 카르복실-말단이 세포기질을 향하도록 위치하는 유형 I, 또는 세포기질을 향하는 이들의 아미노-말단을 갖는 유형 II로 분류될 수 있다. 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 통합 모노토픽 단백질로부터 유래된다. 통합 모노토픽 단백질은 한 쪽으로부터만 막과 회합되고 지질 이중층에 완전히 결쳐 있지 않는 단백질이다.
특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 비-인간 서열로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 원핵 막횡단 단백질로부터 유래되고, 막횡단 도메인은 원핵 막횡단 단백질의 막횡단 도메인이다.
특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 바이러스 서열로부터 유래된다. 어구 "막횡단 도메인 서열"의 앞에 있는 어구 "인플루엔자", "SARS CoV-2", "수두-대상포진 바이러스(VZV)", "홍역", "풍진", "광견병", "에볼라", 및 "두창"은 막횡단 도메인 서열이 그 명칭에 상응하는 바이러스로부터 유래되었음을 나타낸다.
특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 막횡단 도메인 서열로부터 유래된다: 인플루엔자 막횡단 도메인 서열, SARS CoV-2 막횡단 도메인 서열, 수두-대상포진 바이러스(VZV) 막횡단 도메인 서열, 홍역 막횡단 도메인 서열, 풍진 막횡단 도메인 서열, 볼거리 막횡단 도메인 서열, 광견병 막횡단 도메인 서열, 및 에볼라 막횡단 도메인 서열. 이들 특정 막횡단 도메인은 강력한 안전성 프로파일이 입증된 백신으로서 인간에게 투여된 바이러스(생약독화, 불활성화 또는 mRNA)의 바이러스 서열로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 막횡단 도메인 서열, SARS CoV-2 스파이크 막횡단 도메인 서열, VZV gB 막횡단 도메인 서열, VZV gE 막횡단 도메인 서열, VZV gI 막횡단 도메인 서열, VZV gK 막횡단 도메인 서열, 홍역 F-단백질 막횡단 도메인 서열, 풍진 E1 단백질 막횡단 도메인 서열, 풍진 E2 단백질 막횡단 도메인 서열, 볼거리 F-단백질 막횡단 도메인 서열, 광견병 바이러스 당단백질(광견병 G) 막횡단 도메인 서열, 및 에볼라 GP 단백질 막횡단 도메인 서열.
특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B로부터의, 바람직하게는 인플루엔자 A로부터의 HA 막횡단 도메인 서열을 포함한다.
본 개시내용의 예시적인 바이러스 막횡단 도메인 아미노산 서열은 하기 표 3에 제시되어 있다.
[표 3]
바이러스 막횡단 도메인(TMB) 신호 아미노산 서열
Figure pct00020
특정 구현예에서, SS 서열은 항원성 원핵 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다.
특정 구현예에서, SS 서열은 항원성 원핵 폴리펩티드의 C-말단에 위치한다.
특정 구현예에서, TMB 서열은 항원성 원핵 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다.
특정 구현예에서, TMB 서열은 항원성 원핵 폴리펩티드의 C-말단에 위치한다.
특정 구현예에서, SS 아미노산 서열은 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다.
특정 구현예에서, TMB 아미노산 서열은 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다.
IV. 링커
본 개시내용의 특정 구현예에서, 바이러스 분비 신호 펩티드(SS) 서열 또는 막횡단 도메인(TMB)은 항원성 원핵 폴리펩티드에 직접 융합된다(즉, SS 서열 또는 TMB를 항원성 원핵 폴리펩티드에 연결하는 아미노산 링커와 같은 링커가 없다).
다른 구현예에서, 본 개시내용의 SS 서열 및 TMB는 선택적으로 링커에 의해 항원성 원핵 폴리펩티드에 부착된다. 특정 구현예에서, 링커는 아미노산 링커이다. 특정 구현예에서, 아미노산 링커는 1 개 내지 10 개의 아미노산 길이이다(예를 들어, 아미노산 링커는 1 개의 아미노산, 2 개의 아미노산, 3 개의 아미노산, 4 개의 아미노산, 5 개의 아미노산, 6 개의 아미노산, 7 개의 아미노산, 8 개의 아미노산, 9 개의 아미노산, 또는 10 개의 아미노산 길이를 가짐).
링커의 예시적인 예는 글리신 폴리머 (Gly)n(여기서, n은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8의 정수임); 글리신-세린 폴리머(GlySer)n(여기서, n은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 정수임); 글리신-알라닌 폴리머; 알라닌-세린 폴리머; 및 당업계에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다.
글리신 및 글리신-세린 폴리머는 상대적으로 구조화되지 않고 가요성이므로 SS 서열 및/또는 TMB와 항원성 원핵 폴리펩티드 사이에서 중성 테더로서 작용할 수 있다. 특정 구현예에서, 링커는 SGS 또는 GSG이다.
다른 예시적인 링커는 하기 아미노산 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: GGG; DGGGS (SEQ ID NO: 81); TGEKP (SEQ ID NO: 82) (Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 5525-5530. 1997); GGRR (SEQ ID NO: 92); (GGGGS)n (SEQ ID NO: 93)(여기서, n = 1, 2, 3, 4 또는 5임) (Kim et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 1156-1160. 1996); EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO: 83) (Chaudhary et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 1066-1070. 1990); KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 84) (Bird et al. Science. 242:423-426. 1988), GGRRGGGS (SEQ ID NO: 85); LRQRDGERP (SEQ ID NO: 86); LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO: 87); 및 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 88) (Cooper et al. Blood. 101(4): 1637-1644. 2003). 바람직한 링커는 더 짧고, 예를 들어 3 개, 4 개 또는 5 개의 아미노산으로 이루어진다.
링커의 추가의 예는 본원에 참조로 포함되는 문헌[Chen et al. (Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357-1369. 2013)]에서 제공된다.
V. 항원성 원핵 폴리펩티드
본 개시내용의 바이러스 분비 신호 펩티드(SS) 및/또는 막횡단 도메인(TMB)은 항원성 원핵 폴리펩티드에 연결된다.
A. 원핵생물 속
특정 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 아세토박터(Acetobacter), 아시네토박터(Acinetobacter), 액티노마이세스(Actinomyces), 아에로코쿠스(Aerococcus), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아나플라즈마(Anaplasma), 아조히조비아(Azorhizobia), 아조토박터(Azotobacter), 바실러스(Bacillus), 박테로이데스(Bacteroides), 바르토넬라(Bartonella), 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 부르콜데리아(Burkkolderia), 칼리마토박테리움(Calymmatobacterium), 캄필로박터(Campylobacter), 클라미디아 (Chlamydia), 클라미도필라(Chlamydophila), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 콕시엘라(Coxiella), 큐티박테리움(Cutibacterium), 에를리키아(Ehrlichia), 엔테로박터(Enterobacter), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 에쉬리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 가드넬라(Gardnerella), 헤모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코쿠스(Lactococcus), 레지오넬라(Legionella), 리스테리아(Listeria), 메타노박테리움(Methanobacterium), 마이크로박테리움(Microbacterium), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 모락셀라(Moraxella), 마이코박테리움(Mycobacterium), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 나이세리아(Neisseria), 파스퇴렐라(Pasteurella), 페디오코쿠스(Pediococcus), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 슈도모나스(Pseudomonas), 라이조비움(Rhizobium), 리케치아(Rickettsia), 로칼리메아(Rochalimaea), 로티아(Rothia), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 시겔라(Shigella), 사르키나(Sarcina), 스피릴룸(Spirillum), 스피로카에테스(Spirochaetes), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 스트렙토바실러스(Streptobacillus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 테트라게노코쿠스(Tetragenococcus), 트레포네마(Treponema), 비브리오(Vibrio), 비리단스(Viridans), 볼바키아(Walbachia), 및 예르시니아(Yersinia)로 이루어진 군으로부터 선택된 속의 박테리아로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 아세토박터 아우란티우스(Acetobacter aurantius), 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 악티노미세스 이스라엘리이(Actinomyces israelii), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아나플라스마 파고시토필룸(Anaplasma phagocytophilum), 아조리조비움 카울리노단스(Azorhizobium caulinodans), 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 푸시포르미스(Bacillus fusiformis), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실루스 미코이데스(Bacillus mycoides), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 투린기엔시스(Bacillus Thuringiensis), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 박테로이데스 긴기발리스(Bacteroides gingivalis), 박테로이데스 멜라니노게니쿠스(Bacteroides melaninogenicus), 바르토넬라 헨셀라에(Bartonella henselae), 바르토넬라 퀸타나(Bartonella Quintana), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 부르크 홀데리아 말레이(Burkholderia mallei), 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 칼림마토박테리움 그라눌로마티스(Calymmatobacterium granulomatis), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 필로리(Campylobacter pylori), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 뉴모니아에(Chlamydophila pneumoniae), 클라미도필라 프시타시(Chlamydophila psittaci), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 푸시포르메(Corynebacterium fusiforme), 콕시엘라 부르네티이(Coxiella burnetii), 쿠티박테리움 아크네스(Cutibacterium acnes), 쿠티박테리움 아비둠(Cutibacterium avidum), 쿠티박테리움 그라눌로숨(Cutibacterium granulosum), 쿠티박테리움 남네텐세(Cutibacterium namnetense), 쿠티박테리움 후메루시이(Cutibacterium humerusii), 에를리키아 샤페엔시스(Ehrlichia chaffeensis), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 엔테로코쿠스 아비움(Enterococcus avium), 엔테로코쿠스 두란스(Enterococcus durans), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 파에시움(Enterococcus faecium), 엔테로코쿠스 갈리나룸(Enterococcus galllinarum), 엔테로코쿠스 말로라투스(Enterococcus maloratus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis), 헤모필루스 두크레이이(Haemophilus ducreyi), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 헤모필루스 파라인플루엔자에(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 페르투시스(Haemophilus pertussis), 하이모필루스 바기날리스(Haemophilus vaginalis), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 메타노박테리움 엑스트로쿠엔스(Methanobacterium extroquens), 미크로박테리움 물티포르메(Microbacterium multiforme), 미크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 미코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 미코박테리움 디프테리아에(Mycobacterium diphtheriae), 미코박테리움 인트라셀룰라레(Mycobacterium intracellulare), 미코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 미코박테리움 레프라에무리움(Mycobacterium lepraemurium), 미코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei), 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코플라스마 페르멘탄스(Mycoplasma fermentans), 미코플라스마 게니탈리움(Mycoplasma genitalium), 미코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 미코플라스마 페네트란스(Mycoplasma penetrans), 미코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 네이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스테우렐라 툴라렌시스(Pasteurella tularensis), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 멜라니노게니카(Prevotella melaninogenica), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter), 리케치아 프로와제키이(Rickettsia prowazekii), 리케치아 프시타시(Rickettsia psittaci), 리케치아 퀸타나(Rickettsia quintana), 리케치아 리케치이(Rickettsia rickettsii), 리케치아 트라코마(Rickettsia trachomae), 로칼리마에아 헨셀라에(Rochalimaea henselae), 로칼리마에아 퀸타나(Rochalimaea quintana), 로티아 덴토카리오사(Rothia dentocariosa), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 쉰겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae), 스피릴룸 볼룬탄스(Spirillum volutans), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 아비움(Streptococcus avium), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스 크리세투스(Streptococcus cricetus), 스트렙토 코쿠스 파케이움(Streptococcus faceium), 스트렙토코쿠스 파에칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 페루스(Streptococcus ferus), 스트렙토코쿠스 갈리나룸(Streptococcus gallinarum), 스트렙토코쿠스 락티스(Streptococcus lactis), 스트렙토코쿠스 미티오르(Streptococcus mitior), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 라투스(Streptococcus rattus), 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 스트렙토코쿠스 산구이스(Streptococcus sanguis), 스트렙토코쿠스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 비브리오 콤마(Vibrio comma), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비리단스 스트렙토코키(Viridans streptococci), 울바키아(Wolbachia), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 및 예르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis)로 이루어진 군으로부터 선택된 종의 박테리아로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 바람직하게는 종 비. 부르그도르페리(B. burgdorferi), 아프젤리이(afzelii), 가리니이(garinii), 바바리엔시스(bavariensis), 마이오니이(mayonii), 스피엘마니이(spielmanii), 루시타니아에(lusitaniae), 비세티이(bissettii) 및/또는 발라이시아나(valaisiana)로부터 선택되는 속 보렐리아의 박테리아로부터 유래된다.
B. 글리코실화
글리코실화는 진핵 세포에서 발생할 수 있다(원핵 세포에서 발생하는 것이 아님). 특히, N-연결된 글리코실화는 단백질의 아스파라긴(Asn; N) 잔기의 아미드 질소에 대한 글리칸의 부착이다. 부착 과정은 글리코실화된 단백질을 생성한다. 글리코실화는 단백질의 번역 후 글리코실화 효소에 의해 접근 가능하고 인식되는 단백질의 임의의 아스파라긴 잔기에서 발생할 수 있으며, NXS/T 모티프의 일부인 접근 가능한 아스파라긴에서 가장 일반적이며, 아스파라긴(X) 다음의 첫 번째 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이며, 아스파라긴 다음의 두 번째 아미노산 잔기는 세린 또는 트레오닌이다. 비-인간 글리코실화 패턴은 항체를 유발하는 데 사용될 때 폴리펩티드를 바람직하지 않게 반응시킬 수 있다. 추가로, 정상적으로 글리코실화되지 않은 폴리펩티드(예컨대, 항원성 원핵 폴리펩티드)의 글리코실화는 그의 면역원성을 변경할 수 있다. 예를 들어, 글리코실화는 단백질 내에서 중요한 면역원성 에피토프를 차폐할 수 있다. 따라서, 글리코실화를 감소시키거나 제거하기 위해, 아스파라긴 잔기 또는 세린/트레오닌 잔기는 예를 들어 또 다른 아미노산으로의 치환에 의해 변형될 수 있다.
특정 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이된 글리코실화 부위, 바람직하게는 적어도 하나의 돌연변이된 N-연결 글리코실화 부위 및/또는 적어도 하나의 O-연결 글리코실화 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드에서 하나 이상의 N-글리코실화 부위가 제거된다. 일부 구현예에서, N-글리코실화 부위의 제거는 항원성 원핵 폴리펩티드의 글리코실화를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 네이티브 항원성 원핵 폴리펩티드에 비해 감소된 글리코실화를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리코실화 부위의 제거는 항원성 원핵 폴리펩티드의 글리코실화를 없앤다.
특정 구현예에서, 변형은 NXS/T 서열 모티프에서 N, S, 및 T 아미노산 중 하나 이상의 치환을 포함하며, X는 프롤린(P)을 제외한 임의의 아미노산에 상응한다. 일부 구현예에서, N, S, 또는 T 아미노산은 보존적 아미노산 치환으로 치환된다. 특정 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다.
C. OspA
특정 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 OspA(외표면 단백질 A)이다. 특정 구현예에서, OspA는 바람직하게는 OspA 혈청형(ST) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 및/또는 7로부터, 더욱 바람직하게는 혈청형 1의 보렐리아 부르그도르페리 균주 B31, 혈청형 2의 보렐리아 아프젤리이 균주 PKO, 혈청형 3의 보렐리아 가리니이 균주 PBr, 혈청형 4의 보렐리아 바바리엔시스, 혈청형 5의 보렐리아 가리니이, 혈청형 6의 보렐리아 가리니이, 또는 혈청형 7의 보렐리아 가리니이로부터 유래된다.
본 개시내용의 OspA 단백질을 인코딩하는 예시적인 아미노산 서열은 하기 표 4에 제시되어 있다.
D. CAMP2
특정 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 기공-형성 독소, 바람직하게는 CAMP2(크리스티-애킨스-뭉크-피터슨 인자 2(Christie-Atkins-Munch-Peterson factor 2))이다.
특정 구현예에서, CAMP2는 바람직하게는 속 큐티박테리움 더욱 바람직하게는 종 큐티박테리움 아크네스(공식적으로 프로피오니박테리움 아크네스로 알려져 있음)의 박테리아로부터 유래된다.
특정 구현예에서, CAMP2 폴리펩티드는 아미노산 서열
Figure pct00021
를 포함한다.
본 개시내용의 씨. 아크네스 CAMP2 인자 단백질을 인코딩하는 예시적인 아미노산 서열은 하기 표 10에 제시되어 있다.
E. PITP
특정 구현예에서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 추정 철-수송 단백질(PITP)이다.
특정 구현예에서, PITP는 바람직하게는 속 큐티박테리움 더욱 바람직하게는 종 큐티박테리움 아크네스(공식적으로 프로피오니박테리움 아크네스로 알려져 있음)의 박테리아로부터 유래된다.
특정 구현예에서, PITP 폴리펩티드는 아미노산 서열
Figure pct00022
를 포함한다.
본 개시내용의 씨. 아크네스 PITP 인자 단백질을 인코딩하는 예시적인 아미노산 서열은 하기 표 10에 제시되어 있다.
VI. 지질 나노입자(LNP)
본 개시내용의 LNP는 4가지 범주의 지질을 포함한다: (i) 이온화 가능한 지질(예를 들어, 양이온성 지질); (ii) PEG화된 지질; (iii) 콜레스테롤계 지질, 및 (iv) 헬퍼 지질.
A. 이온화 가능한 지질
이온화 가능한 지질은 mRNA 캡슐화를 촉진하고, 양이온성 지질일 수 있다. 양이온성 지질은 낮은 pH에서 양전하 환경을 제공하여 음전하 mRNA 약물 물질의 효율적인 캡슐화를 용이하게 한다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 OF-02이다:
[화학식 I]
Figure pct00023
.
OF-02는 OF-Deg-Lin의 비분해성 구조적 유사체이다. OF-Deg-Lin은 디케토피페라진 코어와 이중-불포화 테일을 부착하기 위한 분해가능한 에스테르 결합을 함유하는 반면, OF-02는 동일한 디케토피페라진 코어와 이중-불포화 테일을 부착하기 위한 비분해성 1,2-아미노-알코올 결합을 함유한다(Fenton et al., Adv Mater. (2016) 28:2939; 미국 특허 제10,201,618호). 본원의 예시적인 LNP 제형인, 지질 A는 OF-2를 함유한다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 cKK-E10이다(Dong et al., PNAS (2014) 111(11):3955-60; 미국 특허 제9,512,073호):
[화학식 II]
Figure pct00024
.
본원의 예시적인 LNP 제형인, 지질 B는 cKK-E10을 함유한다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1 (2-(4-(2-((3-(비스((Z)-2-하이드록시옥타덱-9-엔-1-일)아미노)프로필)디설파네일)에틸)피페라진-1-일)에틸 4-(비스(2-하이드록시데실)아미노)부타노에이트)이며, 이는 화학식 III을 갖는 피페라진 코어를 갖는 HEPES-기반 디설파이드 양이온성 지질이다:
[화학식 III]
Figure pct00025
.
본원의 예시적인 LNP 제형인, 지질 C는 GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1을 함유한다. 지질 C는 지질 A 또는 지질 B와 동일한 조성을 갖지만, 양이온성 지질의 차이가 있다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10 (2-(4-(2-((3-(비스(2-하이드록시데실)아미노)부틸)디설파네일)에틸)피페라진-1-일)에틸 4-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)부타노에이트)이며, 이는 화학식 IV를 갖는 피페라진 코어를 갖는 HEPES-기반 디설파이드 양이온성 지질이다:
[화학식 IV]
Figure pct00026
.
본원의 예시적인 LNP 제형인, 지질 D는 GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10을 함유한다. 지질 D는 지질 A 또는 지질 B와 동일한 조성을 갖지만, 양이온성 지질의 차이가 있다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14 (2-(4-(2-((3-(비스(2-하이드록시테트라데실)아미노)프로필)디설파네일)에틸)피페라진-1-일)에틸 4-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)부타노에이트)이며, 이는 화학식 V를 갖는 피페라진 코어를 갖는 HEPES-기반 디설파이드 양이온성 지질이다:
[화학식 V]
Figure pct00027
.
본원의 예시적인 LNP 제형인, 지질 E는 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14를 함유한다. 지질 E는 지질 A 또는 지질 B와 동일한 조성을 갖지만, 양이온성 지질의 차이가 있다.
양이온성 지질 GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1(III), GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10(IV), 및 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14(V)는 반응식 1에 제시된 일반 절차에 따라 합성될 수 있다:
반응식 1: 화학식 III, IV, 및 V의 지질에 대한 일반 합성 반응식
Figure pct00028
.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 화학식 VI을 갖는 MC3이다:
[화학식 VI]
Figure pct00029
.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 화학식 VII을 갖는 SM-102(9-헵타데카닐 8-{(2-하이드록시에틸)[6-옥소-6-(운데실옥시)헥실]아미노}옥타노에이트)이다:
[화학식 VII]
Figure pct00030
.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 화학식 VIII을 갖는 ALC-0315[(4-하이드록시부틸)아잔디일]디(헥산-6,1-디일) 비스(2-헥실데카노에이트)이다:
[화학식 VIII]
Figure pct00031
.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 화학식 IX를 갖는 cOrn-EE1이다:
[화학식 IX]
Figure pct00032
.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 cKK-E10; OF-02; [(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일] 4-(디메틸아미노)부타노에이트 (D-Lin-MC3-DMA); 2,2-디리노레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-KC2-DMA); 1,2-디리노레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 (DLin-DMA); 디((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데칸디오에이트 (L319); 9-헵타데카닐 8-{(2-하이드록시에틸)[6-옥소-6-(운데실옥시)헥실]아미노}옥타노에이트 (SM-102); [(4-하이드록시부틸)아자네디일]디(헥산-6,1-디일) 비스(2-헥실데카노에이트) (ALC-0315); [3-(디메틸아미노)-2-[(Z)-옥타데크-9-에노일]옥시프로필] (Z)-옥타데크-9-에노에이트 (DODAP); 2,5-비스(3-아미노프로필아미노)-N-[2-[디(헵타데실)아미노]-2-옥소에틸]펜탄아미드 (DOGS); [(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-[(2R)-6-메틸헵탄-2-일]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일] N-[2-(디메틸아미노)에틸]카르바메이트 (DC-Chol); 테트라키스(8-메틸노닐) 3,3′,3″,3'"-(((메틸아자네디일) 비스(프로판-3,1 디일))비스 (아자네트리일))테트라프로피오네이트 (306Oi10); 데실 (2-(디옥틸암모니오)에틸) 포스페이트 (9A1P9); 에틸 5,5-디((Z)-헵타데크-8-엔-1-일)-1-(3-(피롤리딘-1-일)프로필)-2,5-디하이드로-1H-이미다졸-2-카르복실레이트 (A2-Iso5-2DC18); 비스(2-(도데실디설파닐)에틸) 3,3′-((3-메틸-9-옥소-10-옥사-13,14-디티아-3,6-디아자헥사코실)아자네디일)디프로피오네이트 (BAME-O16B); 1,1′-((2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸) (2-하이드록시도데실)아미노)에틸) 피페라진-1-일)에틸)아자네디일) 비스(도데칸-2-올) (C12-200); 3,6-비스(4-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)부틸)피페라진-2,5-디온 (cKK-E12); 헥사(옥탄-3-일) 9,9′,9″,9′″,9″″,9'"″- ((((벤젠-1,3,5-트리카르보닐)이리스(아자네디일)) 트리스(프로판-3,1-디일)) 트리스(아자네트리일))헥사노나노에이트 (FTT5); (((3,6-디옥소피페라진-2,5-디일)비스(부탄-4, 1-디일))비스(아자네트리일))테트라키스(에탄-2,1-디일) (9Z,9′Z,9″Z,9′″Z,12Z,12′Z,12″Z,12′″Z)-테트라키스 (옥타데카-9,12-디에노에이트) (OF-Deg-Lin); TT3; N1,N3,N5-트리스(3-(디도데실아미노)프로필)벤젠-1,3,5-트리카르복사미드; N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노프로필)아미노]부틸카르복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤즈아미드 (MVL5); 헵타데칸-9-일 8-((2-하이드록시에틸)(8-(노닐옥시)-8-옥소옥틸)아미노)옥타노에이트 (지질 5); GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1; GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10; GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14; 및 이들의 조합물을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 생분해성이다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 생분해성이 아니다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 절단 가능하다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 절단 가능하지 않다.
양이온성 지질은 문헌[Dong et al. (PNAS. 111(11):3955-60. 2014)]; 문헌[Fenton et al. (Adv Mater. 28:2939. 2016)]; 미국 특허 제9,512,073호; 및 미국 특허 제10,201,618호에 더 상세하게 기재되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
B. PEG화된 지질
PEG화된 지질 성분은 나노입자의 입자 크기 및 안정성에 대한 제어를 제공한다. 그러한 성분의 첨가는 복잡한 응집을 방지할 수 있고, 순환 수명을 증가시키고 표적 조직으로의 지질-핵산 약학적 조성물의 전달을 증가시키는 수단을 제공할 수 있다(문헌[Klibanov et al. FEBS Letters 268(1):235-7. 1990)]. 이들 구성요소는 생체내에서 약학적 조성물로부터 빠르게 교환되도록 선택될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,885,613호 참조).
고려되는 PEG화된 지질은 C6-C20 (예를 들어, C8, C10, C12, C14, C16, 또는 C18) 길이의 알킬 사슬(들)을 갖는 지질에 공유 부착된 최대 5 kDa 길이의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬, 예컨대 유도체화된 세라마이드(예를 들어, N-옥타노일-스핑고신-1-[숙시닐(메톡시폴리에틸렌 글리콜)] (C8 PEG 세라마이드))를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, PEG화된 지질은 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜(DMG-PEG); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜(DSPE-PEG); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜(DLPE-PEG); 또는 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-폴리에틸렌 글리콜(DSG-PEG), PEG-DAG; PEG-PE; PEG-S-DAG; PEG-S-DMG; PEG-cer; PEG-디알콕시프로필카르바메이트; 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159); 및 이들의 조합이다.
특정 구현예에서, PEG는 고분자량, 예를 들어, 2000 내지 2400 g/mol을 갖는다. 특정 구현예에서, PEG는 PEG2000(또는 PEG-2K)이다. 특정 구현예에서, 본원의 PEG화된 지질은 DMG-PEG2000, DSPE-PEG2000, DLPE-PEG2000, DSG-PEG2000, C8 PEG2000, 또는 ALC-0159(2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드)이다. 특정 구현예에서, 본원의 PEG화된 지질은 DMG-PEG2000이다.
C. 콜레스테롤계 지질
콜레스테롤 성분은 나노입자 내의 지질 이중층 구조에 안정성을 제공한다. 일부 구현예에서, LNP는 하나 이상의 콜레스테롤계 지질을 포함한다. 적합한 콜레스테롤계 지질은 예를 들어 DC-Choi(N,N-디메틸-N-에틸카르복사미도콜레스테롤), l,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진(문헌[Gao et al., Biochem Biophys Res Comm. (1991) 179:280; Wolf et al., BioTechniques (1997) 23:139]; 미국 특허 제5,744,335호), 이미다졸 콜레스테롤 에스테르("ICE"; WO2011/068810), 시토스테롤(22,23-디하이드로스티그마스테롤), β-시토스테롤, 시토스타놀, 푸코스테롤, 스티그마스테롤(스티그마스타-5,22-디엔-3-올), 에르고스테롤; 데스모스테롤(3β-하이드록시-5,24-콜레스타디엔); 라노스테롤(8,24-라노스타디엔-3b-올); 7-데하이드로콜레스테롤(Δ5,7-콜레스테롤); 디하이드로라노스테롤(24,25-디하이드로라노스테롤); 자이모스테롤(5α-콜레스타-8,24-디엔-3β-올); 라토스테롤(5α-콜레스트-7-엔-3ß-올); 디오스게닌((3β,25R)-스피로스트-5-엔-3-올); 캄페스테롤(캄페스트-5-엔-3ß-올); 캄페스타놀(5a-캄페스탄-3b-올); 24-메틸렌 콜레스테롤(5,24(28)-콜레스타디엔-24-메틸렌-3ß-올); 콜레스테릴 마가레이트(콜레스트-5-엔-3ß-일 헵타데카노에이트); 콜레스테릴 올레에이트; 콜레스테롤 스테아레이트 및 기타 변형된 형태의 콜레스테롤을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP에 사용되는 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤이다.
D. 헬퍼 지질
헬퍼 지질은 LNP의 구조적 안정성을 향상시키고, 엔도좀 탈출에서 LNP를 돕는다. 이는 mRNA 약물 페이로드의 흡수 및 방출을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 약물 페이로드의 흡수 및 방출을 향상시키기 위한 융해성 특성들을 갖는 쯔비터이온성 지질이다. 헬퍼 지질의 예는 1,2-디올레오일-SN-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS); 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DEPE); 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPOC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), DMPC, 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 및 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE)이다.
다른 예시적인 헬퍼 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-l-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 포스파티딜세린, 스핑고지질, 스핑고미엘린, 세라마이드, 세레브로시드, 강글리오시드, 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, l-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE), 또는 이들의 조합이다. 특정 구현예에서, 헬퍼 지질은 DOPE이다. 특정 구현예에서, 헬퍼 지질은 DSPC이다.
다양한 구현예에서, 본 LNP는 (i) OF-02, cKK-E10, GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1, GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, 또는 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14로부터 선택된 양이온성 지질; (ii) DMG-PEG2000; (iii) 콜레스테롤; 및 (iv) DOPE를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 LNP는 (i) SM-102; (ii) DMG-PEG2000; (iii) 콜레스테롤; 및 (iv) DSPC를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 LNP는 (i) ALC-0315; (ii) ALC-0159; (iii) 콜레스테롤; 및 (iv) DSPC를 포함한다.
E. 지질 성분의 몰비
상기 성분들의 몰비는 mRNA 전달에서 LNP의 유효성에 중요하다. 양이온성 지질, PEG화된 지질, 콜레스테롤계 지질, 및 헬퍼 지질의 몰비는 A: B: C: D이고, 여기서 A + B + C + D = 100%이다. 일부 구현예에서, 전체 지질에 대한 LNP내 양이온성 지질(즉, A)의 몰비는 35~55%, 예컨대 35~50%(예를 들어, 38~42%, 예컨대 40%, 또는 45~50%)이다. 일부 구현예에서, 전체 지질에 대한 PEG화된 지질 성분(즉, B)의 몰비는 0.25~2.75%(예를 들어, 1~2% 예컨대 1.5%)이다. 일부 구현예에서, 전체 지질에 대한 콜레스테롤계 지질(즉, C)의 몰비는 20~50%(예를 들어, 27~30% 예컨대 28.5%, 또는 38~43%)이다. 일부 구현예에서, 전체 지질에 대한 헬퍼 지질(즉, D)의 몰비는 5~35%(예를 들어, 28~32%, 예컨대 30%, 또는 8~12%, 예컨대 10%)이다. 일부 구현예에서, (PEG화된 지질 + 콜레스테롤) 구성요소는 헬퍼 지질과 동일한 몰량을 갖는다. 일부 구현예에서, LNP는 1보다 큰 헬퍼 지질에 대한 양이온성 지질의 몰비를 함유한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 LNP는
35% 내지 55% 또는 40% 내지 50%의 몰비의 양이온성 지질(예를 들어, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41% 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 또는 55%의 몰비의 양이온성 지질);
0.25% 내지 2.75% 또는 1.00% 내지 2.00%의 몰비의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 컨쥬게이션된(PEG화된) 지질(예를 들어, 0.25%, 0.50%, 0.75%, 1.00%, 1.25%, 1.50%, 1.75%, 2.00%, 2.25%, 2.50%, 또는 2.75%의 몰비의 PEG화된 지질);
20% 내지 50%, 25% 내지 45%, 또는 28.5% 내지 43%의 몰비의 콜레스테롤계 지질(예를 들어, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41% 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 또는 50%의 몰비의 콜레스테롤계 지질); 및
5% 내지 35%, 8% 내지 30%, 또는 10% 내지 30%의 몰비의 헬퍼 지질(예를 들어, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 또는 35%의 몰비의 헬퍼 지질)을 포함하고,
모든 몰비는 LNP의 총 지질 함량에 상대적이다.
특정 구현예에서, LNP는 40%의 몰비의 양이온성 지질; 1.5%의 몰비의 PEG화된 지질; 28.5%의 몰비의 콜레스테롤계 지질; 및 30%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 LNP는 45% 내지 50%의 몰비의 양이온성 지질; 1.5% 내지 1.7%의 몰비의 PEG화된 지질; 38% 내지 43%의 몰비의 콜레스테롤계 지질; 및 9% 내지 10%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함한다.
특정한 구현예에서, PEG화된 지질은 디미리스토일-PEG2000(DMG-PEG2000)이다.
다양한 구현예에서, 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤이다.
일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 1,2-디올레오일-SN-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이다.
특정 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비의 OF-02; 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비의 cKK-E10; 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비의 GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1; 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비의 GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10; 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비의 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14; 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비의 DOPE를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비의 SM-102; 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 DMG-PEG2000; 20% 내지 50%의 몰비의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비의 DSPC를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 35% 내지 55%의 몰비의 ALC-0315; 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 ALC-0159; 20% 내지 50%의 몰비의 콜레스테롤; 및 5% 내지 35%의 몰비의 DSPC를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 40%의 몰비의 OF-02; 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000; 28.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 30%의 몰비의 DOPE를 포함한다. 이 LNP 제형은 본원에서 "지질 A"로 명명된다.
특정 구현예에서, LNP는 40%의 몰비의 cKK-E10; 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000; 28.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 30%의 몰비의 DOPE를 포함한다. 이 LNP 제형은 본원에서 "지질 B"로 명명된다.
특정 구현예에서, LNP는 40%의 몰비의 GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1; 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000; 28.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 30%의 몰비의 DOPE를 포함한다. 이 LNP 제형은 본원에서 "지질 C"로 명명된다.
특정 구현예에서, LNP는 40%의 몰비의 GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10; 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000; 28.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 30%의 몰비의 DOPE를 포함한다. 이 LNP 제형은 본원에서 "지질 D"로 명명된다.
특정 구현예에서, LNP는 40%의 몰비의 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14; 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000; 28.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 30%의 몰비의 DOPE를 포함한다. 이 LNP 제형은 본원에서 "지질 E"로 명명된다.
특정 구현예에서, LNP는 50%의 몰비의 9-헵타데카닐 8-{(2-하이드록시에틸)[6-옥소-6-(운데실옥시)헥실]아미노}옥타노에이트(SM-102); 10%의 몰비의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 38.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 1.5%의 몰비의 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(DMG-PEG2000)을 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 46.3%의 몰비의 (4-하이드록시부틸)아잔디일]디(헥산-6,1-디일) 비스(2-헥실데카노에이트)(ALC-0315); 9.4%의 몰비의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 42.7%의 몰비의 콜레스테롤; 및 1.6%의 몰비의 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159)를 포함한다.
특정 구현예에서, LNP는 47.4%의 몰비율의 (4-하이드록시부틸)아잔디일]디(헥산-6,1-디일) 비스(2-헥실데카노에이트)(ALC-0315); 10%의 몰비율의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 40.9%의 몰비율의 콜레스테롤; 및 1.7%의 몰비율의 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159)를 포함한다.
LNP 제형에 투입될 각각의 지질의 실제 양을 계산하기 위해, 양이온성 지질의 몰량은 먼저 원하는 N/P 비에 기초하여 결정되고, 여기서 N은 양이온성 지질에서 질소 원자의 수이고, P는 LNP에 의해 수송되는 mRNA의 포스페이트 기의 수이다. 다음으로, 각각의 다른 지질의 몰량은 선택된 몰비 및 양이온성 지질의 몰량에 기초하여 계산된다. 그런 다음, 이러한 몰량은 각 지질의 분자량을 사용하여 중량으로 변환된다
F. LNP의 활성 성분
본 LNP 백신 조성물의 활성 성분은 항원성 원핵 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA)이다.
필요한 경우, LNP는 다가일 수 있다. 일부 구현예에서, LNP는 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 또는 8 개 항원과 같은 1 개 초과의 항원성 원핵 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 예컨대, mRNA를 운반할 수 있다. 예를 들어, LNP는 각각 상이한 항원성 원핵 폴리펩티드를 인코딩하는 다수의 핵산(예를 들어, mRNA)를 운반할 수 있거나; 하나 초과의 항원성 원핵 폴리펩티드로 번역될 수 있는 폴리시스트론 mRNA를 운반할 수 있다(예를 들어, 각각의 항원-코딩 서열은 2A 펩티드와 같은 자가-절단 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 링커에 의해 분리된다). 상이한 핵산(예를 들어, mRNA)을 운반하는 LNP는 전형적으로 각각의 핵산의 다중 복제본을 포함(캡슐화)한다. 예를 들어, 2 개의 상이한 핵산을 운반하거나 캡슐화하는 LNP는 전형적으로 2 개의 상이한 핵산 각각의 여러 복제본을 운반한다.
일부 구현예에서, 단일 LNP 제형은 여러 종류(예를 들어, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개 이상)의 LNP를 포함할 수 있으며, 각각의 종류는 상이한 핵산(예를 들어, mRNA)를 운반한다.
핵산이 mRNA인 경우, mRNA는 변형되지 않을 수 있거나(즉, 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 천연 리보뉴클레오티드 A, U, C, 및/또는 G만을 함유함), 또는 화학적으로 변형될 수 있다(예를 들어, 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 슈도우리딘(예를 들어, N-1-메틸 슈도우리딘), 2'-플루오로 리보뉴클레오티드, 및 2'-메톡시 리보뉴클레오티드, 및/또는 포스포로티오에이트 결합을 포함함). mRNA 분자는 5' 캡 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
G. 완충액 및 다른 성분들
핵산 및/또는 LNP를 안정화하기 위해 (예를 들어, 백신 제품의 유통기한을 연장하기 위해), LNP 약학적 조성물의 투여를 용이하게 하기 위해, 및/또는 핵산의 생체내 발현을 향상시키기 위해, 핵산 및/또는 LNP는 하나 이상의 담체, 표적 리간드, 안정화 시약(예를 들어, 보존제 및 항산화제), 및/또는 기타 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화될 수 있다. 이러한 부형제의 예는 파라벤, 티메로살, 티오메르살, 클로로부탄올, 염화베잘코늄 및 킬레이트제(예를 들어, EDTA)이다.
본 개시내용의 LNP 조성물은 냉동 액체 형태 또는 동결건조 형태로 제공될 수 있다. 수크로스, 트레할로스, 글루코스, 만니톨, 만노스, 덱스트로스 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 동결방지제가 사용될 수 있다. 동결방지제는 LNP 조성물의 5~30% (w/v)를 구성할 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 조성물은 예를 들어, 5~30%(예를 들어, 10%)(w/v)의 트레할로스를 포함한다. 일단 동결방지제로 제형화되면, LNP 조성물은 -20℃ 내지 -80℃에서 동결(또는 동결건조 및 동결보존)될 수 있다.
LNP 조성물은 완충 수용액으로 환자에게 제공될 수 있다 - 이전에 동결된 경우 해동되거나, 이전에 동결건조된 경우 병상에서 완충 수용액으로 재구성된다. 완충 용액은 바람직하게는 등장성이고, 예를 들어 근육내 또는 피내 주사에 적합하다. 일부 구현예에서, 완충 용액은 인산염-완충 염수(PBS)이다.
VII. RNA
본 개시내용의 본 백신 조성물은 관심 항원(예를 들어, 항원성 원핵 폴리펩티드)을 인코딩하는 RNA 분자(예를 들어, mRNA)를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 RNA 분자는 관심 항원을 인코딩하는 ORF를 포함하는 적어도 하나의 리보핵산(RNA)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RNA는 관심 항원을 인코딩하는 ORF를 포함하는 메신저 RNA(mRNA)이다. 특정 구현예에서, RNA(예를 들어, mRNA)는 적어도 하나의 5' UTR, 3' UTR, 폴리(A) 테일, 및/또는 5' 캡을 추가로 포함한다.
A. 5' 캡
mRNA 5' 캡은 대부분의 진핵 세포에서 발견되는 뉴클레아제에 대한 저항성을 제공하고, 번역 효율을 촉진할 수 있다. 여러 유형의 5' 캡이 알려져 있다. 7-메틸구아노신 캡("m7G" 또는 "캡-0"이라고도 함)은 5' - 5' - 삼인산 결합을 통해 첫 번째 전사된 뉴클레오티드에 연결된 구아노신을 포함한다.
5' 캡은 전형적으로 다음과 같이 추가된다: 첫째, RNA 말단 포스파타제는 5' 뉴클레오티드로부터 말단 포스페이트 기들 중 하나를 제거하여, 2 개의 말단 포스페이트를 남기고; 그런 다음 구아노신 삼인산염(GTP)은 구아닐릴 트랜스퍼라제를 통해 말단 포스페이트에 추가되어, 5 '5 '5 삼인산염 연결을 생성하고; 그런 다음, 구아닌의 7-질소는 메틸트랜스퍼라제에 의해 메틸화된다. 캡 구조의 예는 m7G(5')ppp, (5'(A,G(5')ppp(5')A, 및 G(5')ppp(5')G을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가 캡 구조는 미국 공개 번호 US 2016/0032356 및 미국 공개 번호 US 2018/0125989에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
폴리뉴클레오티드의 5'-캡핑은 하기 화학적 RNA 캡 유사체를 사용하여 시험관내-전사 반응 동안 부수적으로 완료되어 제조업체 프로토콜에 따라 5'-구아노신 캡 구조를 생성할 수 있다: 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G(ARCA 캡); G(5')ppp(5')A; G(5')ppp(5')G; m7G(5')ppp(5')A; m7G(5')ppp(5')G; m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG; m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU; m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG(New England BioLabs, Ipswich, MA; TriLink Biotechnologies). 변형된 RNA의 5'-캡핑은 백시니아 바이러스 캡핑 효소를 사용하여 전사 후 완료되어, 캡 0 구조: m7G(5')ppp(5')G를 생성할 수 있다.캡 1 구조는 백시니아 바이러스 캡핑 효소 및 2'-O 메틸-트랜스퍼라제를 모두 사용하여 생성되어: m7G(5')ppp(5')G-2'-O-메틸을 생성할 수 있다. 캡 2 구조는 2'-O 메틸-트랜스퍼라제를 사용하여 5'-끝에서 세번째 뉴클레오티드의 2'-O-메틸화가 뒤따르는 캡 1 구조로부터 생성될 수 있다. 캡 3 구조는 2'-O 메틸-트랜스퍼라제를 사용하여 5'-끝에서 네번째 뉴클레오티드의 2'-O-메틸화가 뒤따르는 캡 2 구조로부터 생성될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 mRNA는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA 캡), G(5')ppp(5')A, G(5')ppp(5')G, m7G(5')ppp(5')A, m7G(5')ppp(5')G, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU, 및 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG로 이루어진 군으로부터 선택되는 5' 캡을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 mRNA는 하기의 5' 캡을 포함한다:
Figure pct00033
B. 비번역 영역(UTR)
일부 구현예에서, 본 개시내용의 mRNA는 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR)을 포함한다. mRNA에서, 5' UTR은 전사 시작 부위에서 시작하여 시작 코돈까지 계속되지만, 시작 코돈을 포함하지 않는다. 3' UTR은 정지 코돈 바로 다음에서 시작하여 전사 종료 신호까지 계속한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 mRNA의 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소를 포함하는 5' UTR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 약 10 내지 5,000 개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 약 50 내지 500 개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 적어도 약 10 개 뉴클레오티드 길이, 약 20 개 뉴클레오티드 길이, 약 30 개 뉴클레오티드 길이, 약 40 개 뉴클레오티드 길이, 약 50 개 뉴클레오티드 길이, 약 100 개 뉴클레오티드 길이, 약 150 개 뉴클레오티드 길이, 약 200 개 뉴클레오티드 길이, 약 250 개 뉴클레오티드 길이, 약 300 개 뉴클레오티드 길이, 약 350 개 뉴클레오티드 길이, 약 400 개 뉴클레오티드 길이, 약 450 개 뉴클레오티드 길이, 약 500 개 뉴클레오티드 길이, 약 550 개 뉴클레오티드 길이, 약 600 개 뉴클레오티드 길이, 약 650 개 뉴클레오티드 길이, 약 700 개 뉴클레오티드 길이, 약 750 개 뉴클레오티드 길이, 약 800 개 뉴클레오티드 길이, 약 850 개 뉴클레오티드 길이, 약 900 개 뉴클레오티드 길이, 약 950 개 뉴클레오티드 길이, 약 1,000 개 뉴클레오티드 길이, 약 1,500 개 뉴클레오티드 길이, 약 2,000 개 뉴클레오티드 길이, 약 2,500 개 뉴클레오티드 길이, 약 3,000 개 뉴클레오티드 길이, 약 3,500 개 뉴클레오티드 길이, 약 4,000 개 뉴클레오티드 길이, 약 4,500 개 뉴클레오티드 길이 또는 약 5,000 개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 하나 이상의 폴리아데닐화 신호를 포함하는 3' UTR, mRNA의 세포내 위치 안정성에 영향을 미치는 단백질에 대한 결합 부위, 또는 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 50 내지 5,000 개 뉴클레오티드 길이 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 50 내지 1,000 개 뉴클레오티드 길이 또는 그 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 적어도 약 50 개 뉴클레오티드 길이, 약 100 개 뉴클레오티드 길이, 약 150 개 뉴클레오티드 길이, 약 200 개 뉴클레오티드 길이, 약 250 개 뉴클레오티드 길이, 약 300 개 뉴클레오티드 길이, 약 350 개 뉴클레오티드 길이, 약 400 개 뉴클레오티드 길이, 약 450 개 뉴클레오티드 길이, 약 500 개 뉴클레오티드 길이, 약 550 개 뉴클레오티드 길이, 약 600 개 뉴클레오티드 길이, 약 650 개 뉴클레오티드 길이, 약 700 개 뉴클레오티드 길이, 약 750 개 뉴클레오티드 길이, 약 800 개 뉴클레오티드 길이, 약 850 개 뉴클레오티드 길이, 약 900 개 뉴클레오티드 길이, 약 950 개 뉴클레오티드 길이, 약 1,000 개 뉴클레오티드 길이, 약 1,500 개 뉴클레오티드 길이, 약 2,000 개 뉴클레오티드 길이, 약 2,500 개 뉴클레오티드 길이, 약 3,000 개 뉴클레오티드 길이, 약 3,500 개 뉴클레오티드 길이, 약 4,000 개 뉴클레오티드 길이, 약 4,500 개 뉴클레오티드 길이, 또는 약 5,000 개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 mRNA 전사물에 의해 인코딩된 유전자와 구별되는 유전자로부터 유래된 5' 또는 3' UTR을 포함할 수 있다(즉, UTR은 이종 UTR임).
특정 구현예에서, 5' 및/또는 3' UTR 서열은 안정한 mRNA(예를 들어, 글로빈, 액틴, GAPDH, 튜불린, 히스톤 또는 시트르산 사이클 효소)로부터 유래되어 mRNA의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 5' UTR 서열은 CMV 극초기 1(IE1) 유전자의 부분 서열, 또는 이의 단편을 포함하여, 뉴클레아제 저항성을 개선하고/하거나 mRNA의 반감기를 개선할 수 있다. 인간 성장 호르몬(hGH)을 인코딩하는 서열, 또는 이의 단편을 mRNA의 3' 말단 또는 비번역 영역에 포함시키는 것도 고려된다. 일반적으로, 이러한 변형은 비변형 대응물에 비해 mRNA의 안정성 및/또는 약동학적 특성(예를 들어, 반감기)을 개선하고, 예를 들어 생체내 뉴클레아제 소화에 대한 이러한 mRNA 내성을 개선하기 위해 이루어진 변형을 포함한다.
예시적인 5' UTR은 CMV 극초기 1(IE1) 유전자로부터 유래된 서열(미국 공개 번호 2014/0206753호 및 2015/0157565호, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨), 또는 서열 GGGAUCCUACC(SEQ ID NO: 94)(미국 공개 번호 2016/0151409호, 본원에 참고로 포함됨)을 포함한다.
다양한 구현예에서, 5' UTR은 TOP 유전자의 5' UTR로부터 유래될 수 있다. TOP 유전자는 전형적으로 5'-말단 올리고피리미딘(TOP) 트랙트의 존재를 특징으로 한다. 또한, 대부분의 TOP 유전자는 성장-관련 번역 조절을 특징으로 한다. 그러나, 조직 특이적 번역 조절을 하는 TOP 유전자도 알려져 있다. 특정 구현예에서, TOP 유전자의 5' UTR로부터 유래된 5' UTR은 5' TOP 모티프(올리고피리미딘 트랙트)가 결여되어 있다(예를 들어, 미국 공개 번호 2017/0029847호, 2016/0304883호, 2016/0235864호, 및 2016/0166710호, 이들 각각은 본원에 참고로 포함됨).
특정 구현예에서, 5' UTR은 리보솜 단백질 Large 32 (L32) 유전자로부터 유래된다(미국 공개 번호 2017/0029847호, 위와 같음).
특정 구현예에서, 5' UTR은 하이드록시스테로이드(17-b) 데하이드로게나제 4 유전자(HSD17B4)의 5' UTR로부터 유래된다(미국 공개 번호 2016/0166710호, 위와 같음).
특정 구현예에서, 5' UTR은 ATP5A1 유전자의 5' UTR로부터 유래된다(미국 공개 번호 2016/0166710호, 위와 같음).
일부 구현예에서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES)는 5' UTR 대신에 사용된다.
일부 구현예에서, 5' UTR은 SEQ ID NO: 89에 기재되고 하기에 재현된 핵산 서열을 포함한다:
Figure pct00034
일부 구현예에서, 3' UTR은 SEQ ID NO: 90에 기재되고 하기에 재현된 핵산 서열을 포함한다:
Figure pct00035
5' UTR 및 3' UTR은 본원에 참고로 포함된 WO2012/075040에 더 상세히 기재되어 있다.
C. 폴리아데닐화 테일
본원에 사용된 바와 같이, 용어들 "폴리(A) 서열," "폴리(A) 테일," 및 "폴리(A) 영역"은 mRNA 분자의 3' 말단에 아데노신 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 폴리(A) 테일은 mRNA에 안정성을 부여하고 이를 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호할 수 있다. 폴리(A) 테일은 번역을 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 본질적으로 호모폴리머이다. 예를 들어, 100 개의 아데노신 뉴클레오티드의 폴리(A) 테일은 본질적으로 100 개의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리(A) 테일은 아데노신 뉴클레오티드와 상이한 적어도 하나의 뉴클레오티드(예를 들어, 아데노신 뉴클레오티드가 아닌 뉴클레오티드)에 의해 중단될 수 있다. 예를 들어, 100 개 아데노신 뉴클레오티드의 폴리(A) 테일은 100 개 초과의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다(100 개의 아데노신 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 뉴클레오티드, 또는 아데노신 뉴클레오티드와 상이한 뉴클레오티드의 스트레치 포함). 특정 구현예에서, 폴리(A) 테일은 서열
Figure pct00036
를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "폴리(A) 테일"은 전형적으로 RNA에 관한 것이다. 그러나, 본 개시내용의 맥락에서, 용어는 마찬가지로 DNA 분자 내의 상응하는 서열(예를 들어, "폴리(T) 서열")에 관한 것이다.
폴리(A) 테일은 약 10 개 내지 약 500 개 아데노신 뉴클레오티드, 약 10 개 내지 약 200 개 아데노신 뉴클레오티드, 약 40 개 내지 약 200 개 아데노신 뉴클레오티드, 또는 약 40 개 내지 약 150 개 아데노신 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 폴리(A) 테일의 길이는 적어도 약 10 개, 50 개, 75개, 100 개, 150 개, 200 개, 250 개, 300 개, 350 개, 400 개, 450, 또는 500 개 아데노신 뉴클레오티드일 수 있다.
핵산이 RNA인 일부 구현예에서, 핵산의 폴리(A) 테일은 RNA 시험관내 전사 동안 DNA 주형으로부터 얻어진다. 특정 구현예에서, 폴리(A) 테일은 DNA 주형으로부터 전사되지 않고 일반적인 화학적 합성 방법에 의해 시험관 내에서 얻어진다. 다양한 구현예에서, 폴리(A) 테일은 상업적으로 입수가능한 폴리아데닐화 키트 및 상응하는 프로토콜을 사용한 RNA의 효소적 폴리아데닐화(RNA 시험관 내 전사 후)에 의해, 또는 대안적으로, 고정된 폴리(A)폴리머라제를 사용하여, 예를 들어, WO2016/174271에 기재된 바와 같은 방법 및 수단을 사용하여, 생성된다.
핵산은 효소적 폴리아데닐화에 의해 수득된 폴리(A) 테일을 포함할 수 있으며, 대부분의 핵산 분자는 약 100 개(+/-20) 내지 약 500 개(+/-50) 또는 약 250 개(+/-20) 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산은 주형 DNA로부터 유래된 폴리(A) 테일을 포함할 수 있고, 예를 들어, WO2016/091391에 기재된 바와 같이, 효소적 폴리아데닐화에 의해 생성된 적어도 하나의 추가의 폴리(A) 테일을 추가로 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 핵산은 적어도 하나의 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
다양한 구현예에서, 핵산은 적어도 하나의 폴리(C) 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리(C) 서열"은 최대 약 200 개의 시토신 뉴클레오티드의 시토신 뉴클레오티드의 서열인 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 폴리(C) 서열은 약 10 개 내지 약 200 개 시토신 뉴클레오티드, 약 10 개 내지 약 100 개 시토신 뉴클레오티드, 약 20 개 내지 약 70 개 시토신 뉴클레오티드, 약 20 개 내지 약 60 개 시토신 뉴클레오티드, 또는 약 10 개 내지 약 40 개 시토신 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(C) 서열은 약 30 개의 시토신 뉴클레오티드를 포함한다.
D. 화학적 변형
본원에 개시된 mRNA는 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 전형적으로 RNA 안정성을 향상시키는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예시적인 변형은 백본 변형, 당 변형, 또는 염기 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 mRNA는 천연 발생 뉴클레오티드 및/또는 퓨린(아데닌(A) 및 구아닌(G)) 또는 피리미딘(티민(T), 시토신(C), 및 우라실(U))을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 뉴클레오티드 유사체(변형된 뉴클레오티드)로부터 합성될 수 있다. 특정 구현예에서, 개시된 mRNA는 퓨린 및 피리미딘의 변형된 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체, 예컨대, 예를 들어, 1-메틸-아데닌, 2-메틸-아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐-아데닌, N6-메틸-아데닌, N6-이소펜테닐-아데닌, 2-티오-시토신, 3-메틸-시토신, 4-아세틸-시토신, 5-메틸-시토신, 2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-구아닌, 2-메틸-구아닌, 2,2-디메틸-구아닌, 7-메틸-구아닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 슈도우라실 (5-우라실), 디하이드로-우라실, 2-티오-우라실, 4-티오-우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우라실, 5-(카르복시하이드록시메틸)-우라실, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-우라실, 5-메틸-2-티오-우라실, 5-메틸-우라실, N-우라실-5-옥시 아세트산 메틸 에스테르, 5-메틸아미노메틸-우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오-우라실, 5'-메톡시카르보닐메틸-우라실, 5-메톡시-우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 1-메틸-슈도우라실, 퀘오신, β-D-만노실-퀘오신, 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 펩티드 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트, 7-데아자구아노신, 5-메틸시토신, 및 이노신으로부터 합성될 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 mRNA는 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-l-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-l-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-l-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 및 2'-O-메틸 우리딘을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 5-메틸시토신, 5-메톡시우리딘, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 화학적 변형은 N1-메틸슈도우리딘을 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA에서 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형된다.
일부 구현예에서, ORF에서 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%가 화학적으로 변형된다.
이러한 유사체의 제조는 예를 들어, 미국 특허 제4,373,071, 미국 특허 제4,401,796호, 미국 특허 제4,415,732호, 미국 특허 제4,458,066호, 미국 특허 제4,500,707호, 미국 특허 제4,668,777호, 미국 특허 제4,973,679호, 미국 특허 제5,047,524호, 미국 특허 제5,132,418호, 미국 특허 제5,153,319호, 미국 특허 제5,262,530호, 및 미국 특허 제5,700,642호에 기재되어 있다.
E. mRNA 합성
본원에 개시된 mRNA는 임의의 다양한 방법에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 mRNA는 시험관내 전사(IVT)를 통해 합성될 수 있다. 시험관 내 전사를 위한 일부 방법은, 예를 들어, 문헌[Geall et al. (2013) Semin. Immunol. 25(2): 152-159]; 문헌[Brunelle et al. (2013) Methods Enzymol. 530:101-14]에 기재되어 있다. 간단히 말해서, IVT는 전형적으로 프로모터, 리보뉴클레오티드 삼인산염의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충 시스템, 적당한 RNA 중합효소(예를 들어, T3, T7, 또는 SP6 RNA 중합효소), DNase I, 피로포스파타제 및/또는 RNase 저해제를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 주형으로 수행된다. 정확한 조건은 특정 용도에 따라 다를 수 있다. 이들 시약의 존재는 일반적으로 최종 mRNA 생성물에서 바람직하지 않고, 이들 시약은 치료 용도에 적합한 깨끗하고/하거나 균질한 mRNA를 제공하기 위해 정제 또는 제거될 수 있는 불순물 또는 오염물로 간주될 수 있다. 일부 구현예에서 시험관내 전사 반응으로부터 제공된 mRNA가 바람직할 수 있지만, 박테리아, 진균, 식물 및/또는 동물로부터 생성된 야생형 mRNA를 포함하는 mRNA의 다른 공급원이 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다.
VIII. 본 LNP 백신의 제조 방법
본 LNP는 당업계에 현재 공지된 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 다층 소포(multilamellar vesicles, MLV)는 적절한 용매에 지질을 용해시킴으로써 적절한 용기 또는 용기의 내벽에 선택된 지질을 침착시킨 다음, 용매를 증발시켜 용기 내부의 박막을 남기거나 분무 건조와 같은 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 그런 다음 MLV를 형성시키는 보르텍싱 운동으로 수성 상이 용기에 첨가될 수 있다. 그런 다음, 단층 소포(ULV)는 다층 소포의 균질화, 초음파처리 또는 압출에 의해 형성될 수 있다. 또한, 단층 소포는 시약 제거 기술에 의해 형성될 수 있다.
US 2011/0244026, US 2016/0038432, US 2018/0153822, US 2018/0125989, and PCT/US2020/043223(2020년 7월 23일 출원)에 다양한 방법들이 기재되어 있으며, 본 개시내용을 실시하는 데 사용될 수 있다. 하나의 예시적인 프로세스는 US 2016/0038432에 기재된 바와 같이, 지질을 먼저 지질 나노입자로 미리 형성하지 않으면서 mRNA를 지질 혼합물과 혼합함으로써 mRNA를 캡슐화하는 것을 수반한다. 또다른 예시적인 방법은 US 2018/0153822에 기재된 바와 같이, 미리 형성된 LNP를 mRNA와 혼합함으로써 mRNA를 캡슐화하는 것을 수반한다.
일부 구현예에서, mRNA-로드된 LNP를 제조하는 방법은 하나 이상의 용액을 주위 온도보다 높은 온도까지 가열하는 단계를 포함하며, 상기 하나 이상의 용액은 미리 형성된 지질 나노입자를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액 및 LNP-캡슐화된 mRNA를 포함하는 혼합 용액이다. 일부 구현예에서, 방법은 혼합 단계 이전에, mRNA 용액 및 미리 형성된 LNP 용액 중 하나 또는 둘 모두를 가열하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 미리 형성된 LNP를 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액 및 LNP-캡슐화된 mRNA를 포함하는 용액 중 하나 이상을 혼합 단계 동안 가열하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 혼합 단계 후에 LNP-캡슐화된 mRNA를 가열하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용액이 가열되는 온도는 약 30℃, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 또는 70℃이거나, 이보다 높다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용액이 가열되는 온도는 약 25~70℃, 약 30~70℃, 약 35~70℃, 약 40~70℃, 약 45~70℃, 약 50~70℃, 또는 약 60~70℃ 범위이다. 일부 구현예에서, 온도는 약 65℃이다.
본 개시내용에 적합한 mRNA 용액을 제조하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 본원에 기재된 완충 용액에 직접 용해될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 캡슐화를 위해 지질 용액과 혼합하기 전에 mRNA 스톡 용액을 완충 용액과 혼합함으로써 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 캡슐화를 위해 지질 용액과 혼합하기 직전에 mRNA 스톡 용액을 완충 용액과 혼합함으로써 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 mRNA 스톡 용액은 약 0.2 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.8 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.2 mg/ml, 1.4 mg/ml, 1.5 mg/ml, 또는 1.6 mg/ml, 2.0 mg/ml, 2.5 mg/ml, 3.0 mg/ml, 3.5 mg/ml, 4.0 mg/ml, 4.5 mg/ml, 또는 5.0 mg/ml 이상의 농도로 물 또는 완충액에 mRNA를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA 스톡 용액은 펌프를 사용하여 완충 용액과 혼합된다. 예시적인 펌프는 기어 펌프, 연동 펌프 및 원심 펌프를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 완충 용액은 mRNA 스톡 용액보다 더 큰 속도로 혼합된다. 예를 들어, 완충 용액은 mRNA 스톡 용액의 속도보다 적어도 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 또는 20x 더 큰 속도로 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 완충 용액은 약 100~6000 ml/분 (예를 들어, 약 100~300 ml/분, 300~600 ml/분, 600~1200 ml/분, 1200~2400 ml/분, 2400~3600 ml/분, 3600~4800 ml/분, 4800~6000 ml/분, 또는 60~420 ml/분) 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, 완충 용액은 약 60 ml/분, 100 ml/분, 140 ml/분, 180 ml/분, 220 ml/분, 260 ml/분, 300 ml/분, 340 ml/분, 380 ml/분, 420 ml/분, 480 ml/분, 540 ml/분, 600 ml/분, 1200 ml/분, 2400 ml/분, 3600 ml/분, 4800 ml/분, 또는 6000 ml/분 이상의 유속으로 혼합된다.
일부 구현예에서, mRNA 스톡 용액은 약 10~600 ml/분 (예를 들어, 약 5~50 ml/분, 약 10~30 ml/분, 약 30~60 ml/분, 약 60~120 ml/분, 약 120~240 ml/분, 약 240~360 ml/분, 약 360~480 ml/분, 또는 약 480~600 ml/분) 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 스톡 용액은 약 5 ml/분, 10 ml/분, 15 ml/분, 20 ml/분, 25 ml/분, 30 ml/분, 35 ml/분, 40 ml/분, 45 ml/분, 50 ml/분, 60 ml/분, 80 ml/분, 100 ml/분, 200 ml/분, 300 ml/분, 400 ml/분, 500 ml/분, 또는 600 ml/분 이상의 유속으로 혼합된다.
원하는 mRNA를 지질 나노입자에 혼입하는 프로세스를 "로딩"이라고 한다. 예시적인 방법은 문헌[Lasic et al., FEBS Lett. (1992) 312:255-8]에 기재되어 있다. LNP-혼입된 핵산은 지질 나노입자의 이중층 막 내에서 지질 나노입자의 내부 공간에 완전히 또는 부분적으로 위치하거나, 지질 나노입자 막의 외표면과 회합될 수 있다. 지질 나노입자로의 mRNA의 혼입은 본원에서 "캡슐화"라고도 지칭되며, 핵산은 지질 나노입자의 내부 공간 내에 완전히 또는 실질적으로 함유된다.
적합한 LNP는 다양한 크기로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 감소된 크기는 mRNA의 보다 효율적인 전달과 관련이 있다. 적당한 LNP 크기의 선택은 표적 세포 또는 조직의 부위 및 어느 정도 지질 나노입자가 제조되는 용도를 고려할 수 있다.
당업계에 공지된 다양한 방법이 지질 나노입자 집단의 크기결정에 이용가능하다. 본원의 바람직한 방법은 Zetasizer Nano ZS(Malvern Panalytical)를 이용하여 LNP 입자 크기를 측정한다. 한 프로토콜에서, 10 μl의 LNP 샘플이 990 μl의 10% 트레할로스와 혼합된다. 이 용액은 큐벳에 넣은 다음, Zetasizer 기계에 넣는다. z-평균 직경(nm), 또는 누적 평균은 샘플의 LNP에 대한 평균 크기로 간주된다. Zetasizer 기계는 동적 광산란(DLS) 및 자기상관 함수의 누적 분석을 사용하여 다분산 지수(PDI)를 측정하는 데에도 사용될 수 있다. 평균 LNP 직경은 형성된 LNP의 초음파 처리에 의해 감소될 수 있다. 간헐적인 초음파 처리 주기는 준탄성 광 산란(QELS) 평가와 번갈아 가며 효율적인 지질 나노입자 합성을 가이드할 수 있다.
일부 구현예에서, 대부분의 정제된 LNP, 즉, LNP의 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과가 약 70~150 nm (예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 또는 약 80 nm)의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 실질적으로 모든 (예를 들어, 80 또는 90% 초과)의 정제된 지질 나노입자가 약 70~150 nm (예를 들어, 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 또는 약 80 nm)의 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 조성물 중 LNP는 150 nm 미만, 120 nm 미만, 100 nm 미만, 90 nm 미만, 80 nm 미만, 70 nm 미만, 60 nm 미만, 50 nm 미만, 30 nm 미만, 또는 20 nm 미만의 평균 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 조성물 중 LNP의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과가 약 40~90 nm (예를 들어, 약 45~85 nm, 약 50~80 nm, 약 55~75 nm, 약 60~70 nm) 또는 약 50~70 nm (예를 들어, 55~65 nm) 범위의 크기를 가지며, 분무를 통한 폐 전달용으로 특히 적합하다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 의해 제공되는 약학적 조성물 중 LNP의 분산도 또는 분자 크기의 이질성(PDI) 측정치는 약 0.5 미만이다. 일부 구현예에서, LNP는 약 0.5 미만, 약 0.4 미만, 약 0.3 미만, 약 0.28 미만, 약 0.25 미만, 약 0.23 미만, 약 0.20 미만, 약 0.18 미만, 약 0.16 미만, 약 0.14 미만, 약 0.12 미만, 약 0.10 미만, 또는 약 0.08 미만의 PDI를 갖는다. PDI는 상기 기재된 바와 같이 Zetasizer 기계에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물 중 정제된 LNP의 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과는 각 개별 입자 내에서 mRNA를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 실질적으로 모든 (예를 들어, 80% 또는 90% 초과의) 약학적 조성물 중 정제된 지질 나노입자는 각 개별 입자 내에서 mRNA를 캡슐화한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 50% 내지 99%; 또는 약 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98, 또는 99% 초과의 캡슐화 효율을 갖는다. 전형적으로, 본원에서 사용하기 위한 지질 나노입자는 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91, 92, 93, 94, 또는 95%)의 캡슐화 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, LNP는 1 내지 10의 N/P 비율을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 1 초과, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 약 8의 N/P 비율을 갖는다. 추가 구현예에서, 본원의 전형적인 LNP는 4의 N/P 비율을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 약학적 조성물은 적어도 약 0.5 μg, 1 μg, 5 μg, 10 μg, 100 μg, 500 μg, 또는 1000 μg의 캡슐화된 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 약 0.1 μg 내지 1000 μg, 적어도 약 0.5 μg, 적어도 약 0.8 μg, 적어도 약 1 μg, 적어도 약 5 μg, 적어도 약 8 μg, 적어도 약 10 μg, 적어도 약 50 μg, 적어도 약 100 μg, 적어도 약 500 μg, 또는 적어도 약 1000 μg의 캡슐화된 mRNA를 함유한다.
일부 구현예에서, mRNA는 화학적 합성 또는 DNA 주형의 시험관내 전사(IVT)에 의해 제조될 수 있다. mRNA를 제조하고 정제하는 예시적인 방법은 실시예 1에 기재되어 있다. 이 과정에서, IVT 과정에서, cDNA 주형은 mRNA 전사물을 생산하기 위해 사용되고 DNA 주형은 DNase에 의해 분해된다. 전사물은 심층 여과 및 접선 유동 여과(TFF)에 의해 정제된다. 정제된 전사물은 캡과 테일을 첨가하여 추가로 변형되며, 변형된 RNA는 심층 여과 및 TFF에 의해 다시 정제된다.
그런 다음 mRNA는 수성 완충액에서 준비되고, LNP의 지질 성분을 함유하는 양친매성 용액과 혼합된다. LNP의 4가지 지질 성분을 용해시키기 위한 양친매성 용액은 알코올 용액일 수 있다. 일부 구현예에서, 알코올은 에탄올이다. 수성 완충액은 예를 들어 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트 또는 숙신산염 완충액일 수 있고, 약 3.0 내지 7.0, 예를 들어, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 또는 약 6.5의 pH를 가질 수 있다. 완충액은 염(예를 들어, 나트륨, 칼륨 및/또는 칼슘 염)과 같은 다른 성분을 함유할 수 있다. 특정한 구현예에서, 수성 완충액은 1 mM 시트레이트, 150 mM NaCl, pH 4.5를 갖는다.
mRNA-LNP 조성물을 제조하기 위한 예시적이고 비제한적인 방법이 실시예 1에 기재되어 있다. 이 방법은 제어된 균질 방식으로 완충된 mRNA 용액을 에탄올 중의 지질 용액과 혼합하는 단계를 수반하며, 여기서 지질:mRNA의 비율은 혼합 과정 내내 유지된다. 이 예시적인 예에서, mRNA는 시트르산 일수화물, 시트르산 삼나트륨 이수화물 및 염화나트륨을 함유하는 수성 완충액 내에 제시된다. mRNA 용액이 용액(1 mM 시트레이트 완충액, 150 mM NaCl, pH 4.5)에 첨가된다. 네 가지 지질(예를 들어, 양이온성 지질, PEG화된 지질, 콜레스테롤계 지질, 및 헬퍼 지질)의 지질 혼합물이 에탄올에 용해된다. mRNA 수용액과 에탄올 지질 용액은 거의 "무펄스" 펌프 시스템을 갖춘 "T" 혼합기에서 4:1의 부피비로 혼합된다. 그런 다음 생성된 혼합물에는 이후 다운스트림 정제 및 완충액 교환이 가해진다. 완충액 교환은 투석 카세트 또는 TFF 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. TFF는 T-mix 공정을 통한 형성 직후 생성된 초기 LNP를 농축 및 완충액-교환하는 데 사용될 수 있다. 정용여과 공정은 투과 흐름과 동일한 속도로 적절한 완충액을 첨가하여 부피를 일정하게 유지하는 연속 작업이다.
IX. mRNA-LNP 백신의 패키징 및 용도
mRNA-LNP 백신은 비경구(예를 들어, 근육내, 피내 또는 피하) 투여 또는 비인두(예를 들어, 비강내) 투여를 위해 제형화되거나 패키징될 수 있다. 백신 조성물은 즉석 제형의 형태일 수 있고, 여기서 LNP 조성물은 동결건조되고 사용 직전에 생리학적 완충액(예를 들어, PBS)으로 재구성된다. 백신 조성물은 또한 수용액 또는 냉동 수용액의 형태로 운송 및 제공될 수 있고, 재구성 없이 대상체에게 직접 투여될 수 있다(이전에 냉동된 경우, 해동 후).
따라서, 본 개시내용은 단일 용기에 mRNA-LNP 백신을 제공하거나, 하나의 용기에 mRNA-LNP 백신을 제공하고 또 다른 용기에 재구성을 위한 생리학적 완충액을 제공하는 키트와 같은 제조 물품을 제공한다. 용기(들)는 단일-사용 용량 또는 다중-사용 용량을 함유할 수 있다. 용기는 전처리된 유리 바이알 또는 앰플일 수 있다. 제조 물품은 사용 지침도 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, mRNA-LNP 백신은 근육내(IM) 주사에 사용하기 위해 제공된다. 백신은 예를 들어 상완의 삼각근에 대상체에게 주사될 수 있다. 일부 구현예에서, 백신은 미리 채워진 주사기 또는 주입기(예를 들어, 단일 챔버 또는 다중 챔버)에 제공된다. 일부 구현예에서, 백신은 흡입에 사용하기 위해 제공되고, 미리 채워진 펌프, 에어로졸기 또는 흡입기에 제공된다.
mRNA-LNP 백신은 예방적 유효량, 즉 충분한 시간(예를 들어, 1년, 2년, 5년, 10년, 또는 평생) 동안 표적 병원체에 대해 충분한 면역 보호를 제공하는 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 충분한 면역 보호는 병원체에 의한 감염과 관련된 증상의 예방 또는 완화일 수 있다. 일부 구현예에서, 백신의 다중 용량(예를 들어, 2회 용량)은 원하는 예방 효과를 달성하기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 주사된다. 용량(예를 들어, 프라임 및 부스터 용량)은 예를 들어, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 1 년, 2 년, 5 년, 또는 10 년의 간격만큼 분리될 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA-LNP 백신의 단일 용량은 1~50 μg의 mRNA (예를 들어, 1가 또는 다가)를 함유한다. 예를 들어, 단일 용량은 근육내(IM) 주사를 위한 약 2.5 μg, 약 5 μg, 약 7.5 μg, 약 10 μg, 약 12.5 μg, 또는 약 15 μ의 mRNA를 함유할 수 있다. 추가 구현예에서, 다가 단일 용량의 LNP 백신은 각각 상이한 항원에 대한 다중(예를 들어, 2, 3 또는 4) 종류의 LNP를 함유하고, 각 종류의 LNP는 예를 들어, 2.5 μg, 약 5 μg, 약 7.5 μg, 약 10 μg, 약 12.5 μg, 또는 약 15 μg의 mRNA 양을 갖는다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 예시적인 방법 및 물질이 아래에 기재되지만, 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질도 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 상충되는 경우에는, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다. 일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 바이러스학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 의학 및 약 화학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 이들의 기법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고 흔히 사용되는 것이다. 효소 반응 및 정제 기법은 제조사의 사양서에 따라 수행되거나, 당업계에서 일반적으로 달성되는 바와 같이, 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 또한, 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 명세서 및 구현예 전반에 걸쳐, 단어 "가지다" 및 "포함하다", 또는 "갖다", "가지고 있는", "포함한다", 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수군을 포함하되, 임의의 기타 정수 또는 정수군을 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 기타 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 여러 문헌이 본원에 인용되지만, 상기 인용은 임의의 이들 문헌이 당업계의 통상의 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것으로 간주되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략" 또는 "약"은 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 구현예에서, 이 용어는 달리 언급되거나 맥락으로부터 달리 자명하지 않은 한 언급된 참조 값의 (더 크거나 더 작은) 어느 한 방향으로 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다.
X. 벡터
일 양태에서, 본원에 개시된 mRNA 조성물을 포함하는 벡터가 본원에 개시된다. 관심 단백질을 인코딩하는 RNA 서열(예를 들어, 항원성 원핵 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA)은 다양한 유형의 벡터로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 벡터로 클로닝될 수 있다. 특별한 관심 벡터에는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 시퀀싱 벡터 및 시험관내 전사에 최적화된 벡터가 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, 벡터는 숙주 세포에서 mRNA를 발현하는 데 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 벡터는 IVT에 대한 주형으로 사용될 수 있다. 치료 용도에 적합한 최적으로 번역된 IVT mRNA의 작제는 문헌[Sahin, et al. (2014). Nat. Rev. Drug Discov. 13, 759-780]; 문헌[Weissman (2015). Expert Rev. Vaccines 14, 265-281]에 상세하게 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터는 5'에서 3'으로 적어도 다음을 포함할 수 있다: RNA 중합효소 프로모터; 5' UTR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; ORF를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; 3' UTR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 적어도 하나의 RNA 앱타머를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터는 폴리(A) 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
다양한 RNA 폴리머라제 프로모터가 알려져 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터일 수 있다. 다른 유용한 프로모터에는 T3 및 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 공통 뉴클레오티드 서열이 알려져 있다.
또한, 본원에 개시된 벡터 또는 RNA 조성물을 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 포유류 세포, 예를 들어 인간 세포)가 본원에 개시된다.
폴리뉴클레오티드는 임의의 다수의 다양한 방법, 예를 들어 전기천공법(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)), (ECM 830)(BTX)(Harvard Instruments, Boston, MA) 또는 Gene Pulser II(BioRad, Denver, Colo.), Multiporator(Eppendorf, Hamburg, Germany), 리포펙션을 이용한 양이온성 리포솜 매개 형질감염, 폴리머 캡슐화, 펩티드 매개 형질감염, 바이올리스틱(biolistic) 입자 전달 시스템, 예컨대, "유전자 총"(예를 들어, 문헌[Nishikawa, et al. (2001). Hum Gene Ther. 12(8):861-70] 참조), 또는 TransIT-RNA 형질감염 키트(Mirus, Madison, WI)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 상업적으로 이용 가능한 방법을 사용하여 표적 세포로 도입될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단에는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드와 같은 콜로이드 분산 시스템과 수중유 에멀션, 마이셀, 혼합 마이셀 및 리포좀을 비롯한 지질 기반 시스템이 포함된다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포좀(예를 들어, 인공 막 소포)이다.
외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하거나 세포를 본 개시내용의 저해제에 노출시키는 데 사용되는 방법에 관계없이, 숙주 세포에서 mRNA 서열의 존재를 확인하기 위해 다양한 검정이 수행될 수 있다.
XI. 자가 복제 RNA, 트랜스-복제 RNA 및 비-복제 RNA
자가-복제 RNA:
자가-복제(또는 자가-증폭) RNA는 예를 들어 알파바이러스로부터 유래된 복제 요소를 사용하고 구조적 바이러스 단백질을 관심 단백질(예를 들어, 항원성 원핵 폴리펩티드)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체함으로써 생산될 수 있다. 자가-복제 RNA는 전형적으로 세포에 전달된 후 직접 번역될 수 있는 양성 가닥 분자이고, 이 번역은 전달된 RNA로부터 안티센스 및 센스 전사체 둘 모두를 생성하는 RNA 의존성 RNA 중합효소를 제공한다. 따라서, 전달된 RNA는 여러 딸 RNA의 생성으로 이어진다. 이러한 딸 RNA와 동일 선상의 하위 게놈 전사체는 자체적으로 번역되어 인코딩된 항원의 제자리 발현(in situ expression)을 제공할 수 있거나, 전사되어 전달된 RNA와 동일한 의미를 갖는 추가 전사체를 제공할 수 있으며, 이는 번역되어 항원의 제자리 발현을 제공한다. 이러한 서열의 전사의 전체적인 결과로, 도입된 레플리콘 RNA의 수가 크게 증폭되고, 따라서 인코딩된 항원은 세포의 주요 폴리펩티드 생성물이 된다.
이러한 방식으로 자가-복제를 달성하는 데 적합한 시스템 중 하나는 알파바이러스 기반 레플리콘을 사용하는 것이다. 이들 레플리콘은 세포에 전달된 후 복제효소(또는 복제효소-전사효소)의 번역을 유도하는 양성 가닥(양성 센스 가닥) RNA이다. 복제효소는 자동 절단되어 전달된 양성 가닥 RNA의 게놈 가닥 복제본을 생성하는 복제 복합체를 제공하는 다단백질로 번역된다. 이러한 음성(-) 가닥 전사체는 그 자체로 전사되어 양성 가닥 모 RNA의 추가 복제본을 제공하고 또한 항원을 인코딩하는 하위 게놈 전사체를 제공할 수 있다. 따라서 하위 게놈 전사체의 번역은 감염된 세포에 의한 항원의 제자리 발현을 유도한다. 적합한 알파바이러스 레플리콘은 Sindbis 바이러스, Semliki 숲 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 등의 복제효소를 사용할 수 있다. 돌연변이 또는 야생형 바이러스 서열이 사용될 수 있다. 예를 들어, VEEV의 약독화 TC83 돌연변이가 레플리콘에서 사용되었다. 다음의 참조를 참고: WO2005/113782(본원에 참조로 포함됨).
일 구현예에서, 본원에 기재된 각각의 자가-복제 RNA는 (i) 자가-복제 RNA 분자로부터 RNA를 전사할 수 있는 RNA 의존성 RNA 중합효소 및 (ii) 단백질 항원을 인코딩한다. 중합효소는 예를 들어 알파바이러스 단백질 nsP1, nsP2, nsP3 및 nsP4 중 하나 이상을 포함하는 알파바이러스 복제효소일 수 있다. 천연 알파바이러스 게놈은 비구조적 복제효소 다단백질에 더하여 구조적 비리온 단백질을 인코딩하는 반면, 특정 구현예에서 자가-복제 RNA 분자는 알파바이러스 구조 단백질을 인코딩하지 않는다. 따라서, 자가 복제 RNA는 세포 내에서 자신의 게놈 RNA 복제본을 생성할 수 있지만 RNA를 포함하는 비리온을 생성하지는 않는다. 이러한 비리온을 생산할 수 없다는 것은 야생형 알파바이러스와 달리 자가 복제 RNA 분자가 감염 형태로 영속될 수 없음을 의미한다. 야생형 바이러스에서 영속하는 데 필요한 알파바이러스 구조 단백질은 본 개시내용의 자가 복제 RNA에는 없고, 그 자리는 관심 면역원을 인코딩하는 유전자(들)이 차지하여, 하위 게놈 전사체가 구조적 알파바이러스 비리온 단백질보다는 면역원을 인코딩한다. 자가 복제 RNA는 본원에 참고로 포함된 WO 2011005799에 더 상세히 기재되어 있다.
트랜스-복제 RNA:
트랜스-복제(또는 트랜스-증폭) RNA는 상기에 기재된 자가-복제 RNA와 유사한 요소를 가지고 있다. 그러나 트랜스-복제 RNA의 경우 두 개의 별도 RNA 분자가 사용된다. 제1 RNA 분자는 전술한 RNA 복제효소(예를 들어, 알파바이러스 복제효소)를 인코딩하고, 제2 RNA 분자는 관심 단백질(예를 들어, 항원성 원핵 폴리펩티드)을 인코딩한다. RNA 복제효소는 제1 및 제2 RNA 분자 중 하나 또는 둘 모두를 복제함으로써 관심 단백질을 인코딩하는 RNA 분자의 복제 수를 크게 증가시킬 수 있다. 트랜스 복제 RNA는 본원에 참고로 포함된 WO 2017162265에 더 상세히 기재되어 있다.
비-복제 RNA:
비-복제(또는 비-증폭) RNA는 자체 복제 능력이 없는 RNA이다.
XI. 약학적 조성물
본 개시내용에 따른 약학적 조성물은 전형적으로 핵산, 특히 RNA, 및 보다 구체적으로는 mRNA, 및 약학적으로 허용되는 담체, 또는 약학적으로 허용되는 부형제 또는 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하며, 이는 조성물을 치료적 용도에 특히 적합하게 만든다. 어구 "약학적으로 허용되는"은 본원에서, 합리적인 이익/위험비에 상응하는, 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하는 데 적합한, 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 사용된다.
약학적 조성물은, 예를 들어, 면역원성 조성물, 즉, 대상체에게 투여될 때 면역 반응을 유발하는 조성물일 수 있다. 용어 "면역원성 조성물", "백신 조성물" 및 "백신"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 따라서 동등한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시내용의 약학적 조성물은 또한 소분자 면역강화제(예를 들어, TLR 작용제)와 같은 하나 이상의 추가 성분을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 약학적 조성물은 또한 리포솜, 수중유 에멀젼 또는 미세입자와 같은 RNA 전달 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 지질 나노입자(LNP)를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 LNP 내에 캡슐화된 항원 인코딩 핵산 분자를 포함한다.
XII. 백신접종 방법
본원에 개시된 핵산(예를 들어, mRNA) 백신은 항원성 원핵 폴리펩티드에 대해 유도된 면역 반응을 유도하기 위해 대상체에게 투여될 수 있으며, 대상체에서 항-항원 항체 역가는 본원에 개시된 핵산 백신으로 백신접종되지 않은 대상체에서의 항-항원 항체 역가에 비해 또는 원핵 폴리펩티드에 대한 대안적 백신에 비해 백신접종 후 증가된다. "항-항원 항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 혈청 항체이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에게, 선택적으로 근육내로, 비강내로, 정맥내로, 피하로 또는 피내로, 유효량의 본원에 기재된 핵산(예를 들어, mRNA) 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 원핵 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게, 선택적으로 근육내로, 비강내로, 정맥내로, 피하로 또는 피내로, 유효량의 본원에 기재된 핵산 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 원핵 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 데 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기재된 핵산 백신의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 원핵 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 원핵 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기재된 핵산 백신의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 데 사용하기 위한 본원에 기재된 핵산 백신을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 원핵 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 원핵 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 본원에 기재된 핵산 백신을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 항원성 원핵 폴리펩티드를 분비하는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 기재된 핵산 백신을 숙주 세포에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포의 표면 상에 항원성 원핵 폴리펩티드를 표시하는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 기재된 핵산 백신을 숙주 세포에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 하기 구현예를 포함한다.
구현예 1. 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 핵산으로서, ORF는 - 적어도 하나의 항원성 원핵 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 - 적어도 하나의 바이러스 분비 신호 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, ORF는 적어도 하나의 막횡단 도메인(TMB)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 인간을 감염시킬 수 있는 바이러스의 바이러스 서열로부터 유래되는, 핵산.
구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 임의의 하나에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 서열로부터 유래되는, 핵산: 인플루엔자 분비 신호 펩티드 서열, 및 SARS CoV-2 분비 신호 펩티드 서열, 수두-대상포진 바이러스(VZV) 분비 신호 펩티드 서열, 홍역 분비 신호 펩티드 서열, 풍진 분비 신호 펩티드 서열, 볼거리 분비 신호 펩티드 서열, 에볼라 분비 신호 펩티드 서열, 두창 분비 신호 펩티드 서열, 및 광견병 분비 신호 펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 비-인플루엔자 분비 신호 펩티드 서열.
구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 임의의 하나에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 분비 신호 펩티드 서열, SARS CoV-2 스파이크 분비 신호 펩티드 서열, VZV gB 분비 신호 펩티드 서열, VZV gE 분비 신호 펩티드 서열, VZV gI 분비 신호 펩티드 서열, VZV gK 분비 신호 펩티드 서열, 홍역 F-단백질 분비 신호 펩티드 서열, 풍진 E1 단백질 분비 신호 펩티드 서열, 풍진 E2 단백질 분비 신호 펩티드 서열, 볼거리 F-단백질 분비 신호 펩티드 서열, 에볼라 GP 단백질 분비 신호 펩티드 서열, 두창 6kDa IC 단백질 분비 신호 펩티드 서열, 및 광견병 G 단백질 분비 신호 펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 바이러스 분비 신호 펩티드는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B로부터의, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A로부터의 HA 분비 신호 펩티드 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 6. 구현예 5에 있어서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 아미노산 서열 MKX1X2LX3VX4LX5TFX6X7X8X9A(SEQ ID NO: 145)를 포함하고, X1은 A 및 V로부터 선택되고; X2는 I 및 K로부터 선택되고; X3은 V 및 L로부터 선택되고; X4는 L 및 M으로부터 선택되고; X5는 Y 및 C로부터 선택되고; X6은 T 및 A로부터 선택되고, X7은 T 및 A로부터 선택되고; X8은 A 및 T로부터 선택되고; X9는 N 및 Y로부터 선택되는, 핵산.
구현예 7. 구현예 5 또는 6에 있어서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 SEQ ID NO: 95 내지 109로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 8. 구현예 5에 있어서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 아미노산 서열 MKX1IIALSX2ILCLVFX3(SEQ ID NO: 146)을 포함하고, X1은 T 및 A로부터 선택되고; X2는 Y, N, C 및 H로부터 선택되고; X3은 T 및 A로부터 선택되는, 핵산.
구현예 9. 구현예 8에 있어서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 SEQ ID NO: 110 내지 131로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 10. 구현예 5에 있어서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 아미노산 서열 MKAIIVLLMVVTSX1A(SEQ ID NO: 147)를 포함하고, X1은 S 및 N으로부터 선택되는, 핵산.
구현예 11. 구현예 5에 있어서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 아미노산 서열 MX1AIIVLLMVVTSNA(SEQ ID NO: 148)를 포함하고, X1은 K 및 E로부터 선택되는, 핵산.
구현예 12. 구현예 10 또는 11에 있어서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 SEQ ID NO: 132 내지 144로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 13. 구현예 1 내지 12 중 임의의 하나에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 핵산:
Figure pct00037
Figure pct00038
구현예 14. 구현예 13에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 MKAKLLVLLCTFTATYA(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 15. 구현예 1 내지 14 중 임의의 하나에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 항원성 원핵 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는, 핵산.
구현예 16. 구현예 1 내지 14 중 임의의 하나에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 항원성 원핵 폴리펩티드의 C-말단에 위치하는, 핵산.
구현예 17. 구현예 1 내지 16 중 임의의 하나에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 링커에 의해 항원성 원핵 폴리펩티드에 부착되는, 핵산.
구현예 18. 구현예 1 내지 17 중 임의의 하나에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 SignalP 6.0을 사용하여 결정된 바와 같은 적어도 0.8, 적어도 0.85, 적어도 0.90 또는 적어도 0.95의 SignalP 절단 확률 점수를 갖는, 핵산.
구현예 19. 구현예 1 내지 18 중 임의의 하나에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 SignalP 6.0을 사용하여 결정된 바와 같은 적어도 0.8, 적어도 0.85, 적어도 0.90 또는 적어도 0.95의 SignalP 신호 펩티드 우도 점수를 갖는, 핵산.
구현예 20. 구현예 2 내지 19 중 임의의 하나에 있어서, TMB는 (a) 15 개 내지 50 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 15 개 내지 30 개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 18 개 내지 25 개의 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 이루어지고/지거나; (b) 바람직하게는 알라닌, 이소류신, 류신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 50%, 적어도 55%, 또는 적어도 60%의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고/하거나; (c) 적어도 하나의 알파 나선을 포함하는, 핵산.
구현예 21. 구현예 2 내지 20 중 임의의 하나에 있어서, TMB는 통합 막 단백질로부터, 바람직하게는 단일 막 관통 단백질로부터, 더욱 바람직하게는 바이토프성 막 단백질로부터, 더욱 더 바람직하게는 타입 I의 바이토프성 막 단백질로부터 유래되는, 핵산.
구현예 22. 구현예 2 내지 11 중 임의의 하나에 있어서, TMB는 비-인간 서열로부터 유래되는, 핵산.
구현예 23. 구현예 18 내지 22 중 임의의 하나에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 원핵 막횡단 단백질로부터 유래되고, TMB는 원핵 막횡단 단백질의 TMB인, 핵산.
구현예 24. 구현예 18 내지 23 중 임의의 하나에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 원핵 막횡단 단백질로부터 유래되지 않는, 핵산.
구현예 25. 구현예 24에 있어서, TMB는 바이러스 서열로부터 유래되는, 핵산.
구현예 26. 구현예 25에 있어서, TMB는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 막횡단 도메인 서열로부터 유래되는, 핵산: 인플루엔자 막횡단 도메인 서열, 및 SARS CoV-2 막횡단 도메인 서열, 수두-대상포진 바이러스(VZV) 막횡단 도메인 서열, 홍역 막횡단 도메인 서열, 풍진 막횡단 도메인 서열, 볼거리 막횡단 도메인 서열, 에볼라 막횡단 도메인 서열, 및 광견병 막횡단 도메인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 비-인플루엔자 막횡단 도메인 서열.
구현예 27. 구현예 26에 있어서, TMB는 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 막횡단 도메인 서열, SARS CoV-2 스파이크 막횡단 도메인 서열, VZV gB 막횡단 도메인 서열, VZV gE 막횡단 도메인 서열, VZV gI 막횡단 도메인 서열, VZV gK 막횡단 도메인 서열, 홍역 F-단백질 막횡단 도메인 서열, 풍진 E1 단백질 막횡단 도메인 서열, 풍진 E2 단백질 막횡단 도메인 서열, 볼거리 F-단백질 막횡단 도메인 서열, 에볼라 GP 단백질 막횡단 도메인 서열 및 광견병 G 단백질 막횡단 도메인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 TMB는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B로부터의, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A로부터의 HA 막횡단 도메인 서열을 포함한다.
구현예 28. 구현예 18 내지 22 및 24 내지 27 중 임의의 하나에 있어서, TMB는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 핵산:
Figure pct00039
구현예 29. 구현예 28에 있어서, TMB는 ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)의 아미노산 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 30. 구현예 2 및 18 내지 29에 있어서, TMB는 링커에 의해 항원성 원핵 폴리펩티드에 부착되는, 핵산.
구현예 31. 구현예 2 및 18 내지 30 중 임의의 하나에 있어서, TMB는 항원성 원핵 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는, 핵산.
구현예 32. 구현예 2 및 18 내지 30 중 임의의 하나에 있어서, TMB는 항원성 원핵 폴리펩티드의 C-말단에 위치하는, 핵산.
구현예 33. 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 핵산으로서, ORF는 - 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드, 바람직하게는 항원성 원핵생물 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 - 적어도 하나의 막횡단 도메인(TMB)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, TMB는 항원성 폴리펩티드에 이종성이고, 선택적으로 ORF는 적어도 하나의 분비 신호 펩티드, 바람직하게는 바이러스 분비 신호 펩티드, 더욱 바람직하게는 구현예 1 내지 구현예 33 중 임의의 하나에 기재된 바와 같은 바이러스 분비 신호 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
구현예 34. 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 핵산으로서, ORF는 - 적어도 하나의 항원성 원핵 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 - 적어도 하나의 막횡단 도메인(TMB)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 35. 구현예 34에 있어서, TMB는 (a) 15 개 내지 50 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 15 개 내지 30 개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 18 개 내지 25 개의 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 이루어지고/지거나; (b) 바람직하게는 알라닌, 이소류신, 류신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 50%, 적어도 55%, 또는 적어도 60%의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고/하거나; (c) 적어도 하나의 알파 나선을 포함하는, 핵산.
구현예 36. 구현예 34 또는 35에 있어서, TMB는 통합 막 단백질로부터, 바람직하게는 단일 막 관통 단백질로부터, 더욱 바람직하게는 바이토프성 막 단백질로부터, 더욱 더 바람직하게는 타입 I의 바이토프성 막 단백질로부터 유래되는, 핵산.
구현예 37. 구현예 36에 있어서, TMB는 비-인간 서열로부터 유래되는, 핵산.
구현예 38. 구현예 1 내지 32 중 임의의 하나에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 원핵 막횡단 단백질로부터 유래되고, TMB는 이종성 원핵 막횡단 단백질의 막횡단 도메인인, 핵산.
구현예 39. 구현예 35 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 항원성 폴리펩티드는 막횡단 단백질로부터 유래되지 않는, 핵산.
구현예 40. 구현예 35 내지 37 및 39 중 임의의 하나에 있어서, TMB는 바이러스 서열로부터 유래되는, 핵산.
구현예 41. 구현예 33 내지 35, 39, 및 40에 있어서, TMB는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 막횡단 도메인 서열로부터 유래되는, 핵산: 인플루엔자 막횡단 도메인 서열, 및 SARS CoV-2 막횡단 도메인 서열, 수두-대상포진 바이러스(VZV) 막횡단 도메인 서열, 홍역 막횡단 도메인 서열, 풍진 막횡단 도메인 서열, 볼거리 막횡단 도메인 서열, 에볼라 막횡단 도메인 서열, 및 광견병 막횡단 도메인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 비-인플루엔자 막횡단 도메인 서열.
구현예 42. 구현예 41에 있어서, TMB는 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 막횡단 도메인 서열, SARS CoV-2 스파이크 막횡단 도메인 서열, VZV gB 막횡단 도메인 서열, VZV gE 막횡단 도메인 서열, VZV gI 막횡단 도메인 서열, VZV gK 막횡단 도메인 서열, 홍역 F-단백질 막횡단 도메인 서열, 풍진 E1 단백질 막횡단 도메인 서열, 풍진 E2 단백질 막횡단 도메인 서열, 볼거리 F-단백질 막횡단 도메인 서열, 에볼라 GP 단백질 막횡단 도메인 서열 및 광견병 G 단백질 막횡단 도메인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 TMB는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B로부터의, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A로부터의 HA 막횡단 도메인 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 43. 구현예 42에 있어서, TMB는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 핵산:
Figure pct00040
구현예 44. 구현예 43에 있어서, TMB는 ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)의 아미노산 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 45. 구현예 34 내지 44 중 임의의 하나에 있어서, TMB는 링커에 의해 항원성 원핵 폴리펩티드에 부착되는, 핵산.
구현예 46. 구현예 34 내지 44 중 임의의 하나에 있어서, TMB는 항원성 원핵 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는, 핵산.
구현예 47. 구현예 34 내지 44 중 임의의 하나에 있어서, TMB는 항원성 원핵 폴리펩티드의 C-말단에 위치하는, 핵산.
구현예 48. 구현예 34 내지 47 중 임의의 하나에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 아세토박터(Acetobacter), 아시네토박터(Acinetobacter), 액티노마이세스(Actinomyces), 아에로코쿠스(Aerococcus), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아나플라즈마(Anaplasma), 아조히조비아(Azorhizobia), 아조토박터(Azotobacter), 바실러스(Bacillus), 박테로이데스(Bacteroides), 바르토넬라(Bartonella), 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 부르콜데리아(Burkkolderia), 칼리마토박테리움(Calymmatobacterium), 캄필로박터(Campylobacter), 클라미디아 (Chlamydia), 클라미도필라(Chlamydophila), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 콕시엘라(Coxiella), 큐티박테리움(Cutibacterium), 에를리키아(Ehrlichia), 엔테로박터(Enterobacter), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 에쉬리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 가드넬라(Gardnerella), 헤모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코쿠스(Lactococcus), 레지오넬라(Legionella), 리스테리아(Listeria), 메타노박테리움(Methanobacterium), 마이크로박테리움(Microbacterium), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 모락셀라(Moraxella), 마이코박테리움(Mycobacterium), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 나이세리아(Neisseria), 파스퇴렐라(Pasteurella), 페디오코쿠스(Pediococcus), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 슈도모나스(Pseudomonas), 라이조비움(Rhizobium), 리케치아(Rickettsia), 로칼리메아(Rochalimaea), 로티아(Rothia), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 시겔라(Shigella), 사르키나(Sarcina), 스피릴룸(Spirillum), 스피로카에테스(Spirochaetes), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 스트렙토바실러스(Streptobacillus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 테트라게노코쿠스(Tetragenococcus), 트레포네마(Treponema), 비브리오(Vibrio), 비리단스(Viridans), 볼바키아(Walbachia), 및 예르시니아(Yersinia)로 이루어진 군으로부터 선택된 속의 박테리아로부터, 바람직하게는 아세토박터 아우란티우스(Acetobacter aurantius), 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 악티노미세스 이스라엘리이(Actinomyces israelii), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아나플라스마 파고시토필룸(Anaplasma phagocytophilum), 아조리조비움 카울리노단스(Azorhizobium caulinodans), 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 푸시포르미스(Bacillus fusiformis), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실루스 미코이데스(Bacillus mycoides), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 투린기엔시스(Bacillus Thuringiensis), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 박테로이데스 긴기발리스(Bacteroides gingivalis), 박테로이데스 멜라니노게니쿠스(Bacteroides melaninogenicus), 바르토넬라 헨셀라에(Bartonella henselae), 바르토넬라 퀸타나(Bartonella Quintana, 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 부르크 홀데리아 말레이(Burkholderia mallei), 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 칼림마토박테리움 그라눌로마티스(Calymmatobacterium granulomatis), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 필로리(Campylobacter pylori), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 뉴모니아에(Chlamydophila pneumoniae), 클라미도필라 프시타시(Chlamydophila psittaci), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 푸시포르메(Corynebacterium fusiforme), 콕시엘라 부르네티이(Coxiella burnetii), 쿠티박테리움 아크네스(Cutibacterium acnes), 쿠티박테리움 아비둠(Cutibacterium avidum), 쿠티박테리움 그라눌로숨(Cutibacterium granulosum), 쿠티박테리움 남네텐세(Cutibacterium namnetense), 쿠티박테리움 후메루시이(Cutibacterium humerusii), 에를리키아 샤페엔시스(Ehrlichia chaffeensis), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 엔테로코쿠스 아비움(Enterococcus avium), 엔테로코쿠스 두란스(Enterococcus durans), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 파에시움(Enterococcus faecium), 엔테로코쿠스 갈리나룸(Enterococcus galllinarum), 엔테로코쿠스 말로라투스(Enterococcus maloratus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis), 헤모필루스 두크레이이(Haemophilus ducreyi), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 헤모필루스 파라인플루엔자에(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 페르투시스(Haemophilus pertussis), 하이모필루스 바기날리스(Haemophilus vaginalis), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 메타노박테리움 엑스트로쿠엔스(Methanobacterium extroquens), 미크로박테리움 물티포르메(Microbacterium multiforme), 미크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 미코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 미코박테리움 디프테리아에(Mycobacterium diphtheriae), 미코박테리움 인트라셀룰라레(Mycobacterium intracellulare), 미코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 미코박테리움 레프라에무리움(Mycobacterium lepraemurium), 미코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei), 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코플라스마 페르멘탄스(Mycoplasma fermentans), 미코플라스마 게니탈리움(Mycoplasma genitalium), 미코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 미코플라스마 페네트란스(Mycoplasma penetrans), 미코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 네이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스테우렐라 툴라렌시스(Pasteurella tularensis), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 멜라니노게니카(Prevotella melaninogenica), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter), 리케치아 프로와제키이(Rickettsia prowazekii), 리케치아 프시타시(Rickettsia psittaci), 리케치아 퀸타나(Rickettsia quintana), 리케치아 리케치이(Rickettsia rickettsii), 리케치아 트라코마(Rickettsia trachomae), 로칼리마에아 헨셀라에(Rochalimaea henselae), 로칼리마에아 퀸타나(Rochalimaea quintana), 로티아 덴토카리오사(Rothia dentocariosa), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 쉰겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae), 스피릴룸 볼룬탄스(Spirillum volutans), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 아비움(Streptococcus avium), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스 크리세투스(Streptococcus cricetus), 스트렙토 코쿠스 파케이움(Streptococcus faceium), 스트렙토코쿠스 파에칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 페루스(Streptococcus ferus), 스트렙토코쿠스 갈리나룸(Streptococcus gallinarum), 스트렙토코쿠스 락티스(Streptococcus lactis), 스트렙토코쿠스 미티오르(Streptococcus mitior), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 라투스(Streptococcus rattus), 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 스트렙토코쿠스 산구이스(Streptococcus sanguis), 스트렙토코쿠스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 비브리오 콤마(Vibrio comma), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비리단스 스트렙토코키(Viridans streptococci), 울바키아(Wolbachia), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 및 예르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis)로 이루어진 군으로부터 선택된 종의 박테리아로부터 유래되는, 핵산.
구현예 49. 구현예 1 내지 구현예 48 중 임의의 하나에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 바람직하게는 종 비. 부르그도르페리(B. burgdorferi), 아프젤리이(afzelii), 가리니이(garinii), 바바리엔시스(bavariensis), 마이오니이(mayonii), 스피엘마니이(spielmanii), 루시타니아에(lusitaniae), 비세티이(bissettii) 및/또는 발라이시아나(valaisiana)로부터 선택된 속 보렐리아의 박테리아로부터 유래되는, 핵산.
구현예 50. 구현예 49에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 OspA ST1, OspA ST2, OspA ST3, OspA ST4, OspA ST5, OspA ST6, OspA ST7 또는 이의 단편인, 핵산.
구현예 51. 구현예 50에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 OspA 또는 이의 단편 또는 변이체이고, OspA 또는 이의 단편 또는 변이체는 적어도 5 개, 적어도 10 개, 20 개, 30 개, 40 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 110 개, 120 개, 130 개, 140 개, 150 개, 160 개, 170 개, 180 개, 190 개, 200 개, 210 개, 220 개, 230 개, 240 개, 또는 250 개의 아미노산을 포함하며, 바람직하게는 항원성 원핵 폴리펩티드는 (a) 바람직하게는 서열
Figure pct00041
와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 OspA ST1로부터 유래된 아미노산 서열;(b) 바람직하게는 서열
Figure pct00042
와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 OspA ST2로부터 유래된 아미노산 서열; (c) 바람직하게는 서열
Figure pct00043
Figure pct00044
와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 OspA ST3으로부터 유래된 아미노산 서열; (d) 바람직하게는 서열
Figure pct00045
와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 OspA ST4로부터 유래된 아미노산 서열; (e) 바람직하게는 서열
Figure pct00046
와 적어도 85% 동일성을 갖는 OspA ST5로부터 유래된 아미노산 서열; (f) 바람직하게는 서열
Figure pct00047
와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 OspA ST6로부터 유래된 아미노산 서열; (g) 바람직하게는 서열
Figure pct00048
와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 OspA ST7로부터 유래된 아미노산 서열; (h) (a) 내지 (g)의 임의의 조합; (i) (a)에 따른 OspA ST1로부터 유래된 서열 및 (b)에 따른 OspA ST2로부터 유래된 서열, 또는 (j) (a)에 따른 OspA ST1로부터 유래된 서열, (b)에 따른 OspA ST2로부터 유래된 서열, (c)에 따른 OspA ST3으로부터 유래된 서열, (d)에 따른 OspA ST4로부터 유래된 서열, (e)에 따른 OspA ST5로부터 유래된 서열, (f)에 따른 OspA ST6으로부터 유래된 서열 및 (g)에 따른 OspA ST7로부터 유래된 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 52. 구현예 1 내지 48 중 임의의 하나에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 바람직하게는 아크네스(acnes), 아비둠(avidum), 글라눌로숨(granulosum), 남네텐세(namnetense), 및/또는 후메루시이(humerusii)로부터 선택되는 속 큐티박테리움(Cutibacterium)의 박테리아로부터 유래되는, 핵산.
구현예 53. 구현예 52에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 CAMP2인, 핵산.
구현예 54. 구현예 53에 있어서, CAMP2 또는 이의 단편을 인코딩하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 149 또는 SEQ ID NO: 162 내지 172를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한, 핵산.
구현예 55. 구현예 52에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 PITP인, 핵산.
구현예 56. 구현예 54에 있어서, PITP 또는 이의 단편을 인코딩하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 150 또는 SEQ ID NO: 173 내지 183을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한, 핵산.
구현예 57. 구현예 1 내지 56 중 임의의 하나에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이된 글리코실화 부위, 바람직하게는 적어도 하나의 돌연변이된 N-연결 글리코실화 부위를 포함하는, 핵산.
구현예 58. 구현예 1 내지 57 중 임의의 하나에 있어서, 핵산의 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화되는, 핵산.
구현예 59. 구현예 1 내지 58 중 임의의 하나에 있어서, ORF의 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화되는, 핵산 분자.
구현예 60. 구현예 1 내지 59 중 임의의 하나에 있어서, 적어도 하나의 바이러스 분비 신호 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화되는, 핵산.
구현예 61. 구현예 20 내지 60 중 임의의 하나에 있어서, 적어도 하나의 TMB를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화되는, 핵산.
구현예 62. 구현예 1 내지 61 중 임의의 하나에 있어서, 핵산은 DNA인, 핵산.
구현예 63. 구현예 1 내지 61 중 임의의 하나에 있어서, 핵산은 메신저 RNA(mRNA)이고, 특히 mRNA는 비-복제 mRNA, 자기-복제 mRNA 또는 트랜스-복제 mRNA일 수 있는, 핵산.
구현예 64. 구현예 63에 있어서, mRNA는 적어도 하나의 5' 비번역 영역(5' UTR), 적어도 하나의 3' 비번역 영역(3' UTR), 및/또는 적어도 하나의 폴리아데닐화(폴리(A)) 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 65. 구현예 63 또는 64에 있어서, mRNA는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하는, 핵산.
구현예 66. 구현예 63 내지 65 중 임의의 하나에 있어서, mRNA에서 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%는 화학적으로 변형되는, 핵산.
구현예 67. 구현예 63 내지 66 중 임의의 하나에 있어서, ORF에서 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%는 화학적으로 변형되는, 핵산.
구현예 68. 구현예 65 내지 67 중 임의의 하나에 있어서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-l-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-l-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-l-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 및 2'-O-메틸 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산.
구현예 69. 구현예 65 내지 68 중 임의의 하나에 있어서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 5-메틸시토신, 5-메톡시우리딘, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산.
구현예 70. 구현예 65 내지 69 중 임의의 하나에 있어서, 화학적 변형은 N1-메틸슈도우리딘인, 핵산.
구현예 71. 구현예 1 내지 70 중 임의의 하나의 적어도 하나의 핵산을 포함하는 조성물.
구현예 72. 구현예 71에 있어서, 지질 나노입자(LNP)를 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 73. 구현예 72에 있어서, 핵산은 LNP에 캡슐화되는, 조성물.
구현예 74. 구현예 72 또는 73에 있어서, LNP는 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함하는, 조성물.
구현예 75. 구현예 74에 있어서, 양이온성 지질은 생분해성인, 조성물.
구현예 76. 구현예 74에 있어서, 양이온성 지질은 생분해성이 아닌, 조성물.
구현예 77. 구현예 74 내지 76 중 임의의 하나에 있어서, 양이온성 지질은 절단 가능한, 조성물.
구현예 78. 구현예 74 내지 76 중 임의의 하나에 있어서, 양이온성 지질은 절단 가능하지 않은, 조성물.
구현예 79. 구현예 74 내지 78 중 임의의 하나에 있어서, 양이온성 지질은 OF-02, cKK-E10, OF-Deg-Lin, GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1, GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14, SM-102, 및 ALC-0315로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
구현예 80. 구현예 74 내지 79 중 임의의 하나에 있어서, LNP는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 컨쥬게이션된(PEG화된) 지질, 콜레스테롤계 지질 및 헬퍼 지질을 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 81. 구현예 72 내지 80 중 임의의 하나에 있어서, LNP는 - 35% 내지 55%의 몰비의 양이온성 지질; - 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 컨쥬게이션된(PEG화된) 지질; - 20% 내지 45%의 몰비의 콜레스테롤계 지질; 및 - 5% 내지 35%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함하며, 모든 몰비는 LNP의 총 지질 함량에 상대적인, 조성물.
구현예 82. 구현예 72 내지 81 중 임의의 하나에 있어서, LNP는 - 40%의 몰비의 양이온성 지질; - 1.5%의 몰비의 PEG화된 지질; - 28.5%의 몰비의 콜레스테롤계 지질; 및 - 30%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함하는, 조성물.
구현예 83. 구현예 72 내지 82 중 임의의 하나에 있어서, LNP는 - 45% 내지 50%의 몰비의 양이온성 지질; - 1.5% 내지 1.7%의 몰비의 PEG화된 지질; - 38% 내지 43%의 몰비의 콜레스테롤계 지질; 및 - 9% 내지 10%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함하는, 조성물.
구현예 84. 구현예 80 내지 83 중 임의의 하나에 있어서, PEG화된 지질은 디미리스토일-PEG2000(DMG-PEG2000) 또는 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159)인, 조성물.
구현예 85. 구현예 80 내지 84 중 임의의 하나에 있어서, 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤인, 조성물.
구현예 86. 구현예 80 내지 85 중 임의의 하나에 있어서, 헬퍼 지질은 1,2-디올레오일-SN-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)인, 조성물.
구현예 87. 구현예 72 내지 82 및 84 내지 86 중 임의의 하나에 있어서, LNP는 - 40%의 몰비의 OF-02, cKK-E10, GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1, GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, 및 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14로 이루어진 군으로부터 선택된 양이온성 지질; - 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000; - 28.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 - 30%의 몰비의 DOPE를 포함하는, 조성물.
구현예 88. 구현예 72 내지 81 및 83 내지 86 중 임의의 하나에 있어서, LNP는 - 50%의 몰비의 SM-102; - 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000; - 38.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및 - 10%의 몰비의 DSPC를 포함하는, 조성물.
구현예 89. 구현예 72 내지 81 및 83 내지 86 중 임의의 하나에 있어서, LNP는 - 46.3%의 몰비의 ALC-0315; - 1.6%의 몰비의 ALC-0159; - 42.7%의 몰율의 콜레스테롤; 및 - 9.4%의 몰비의 DSPC를 포함하는, 조성물.
구현예 90. 구현예 72 내지 81 및 83 내지 86 중 임의의 하나에 있어서, LNP는 - 47.4%의 몰비의 ALC-0315; - 1.7%의 몰비의 ALC-0159; - 40.9%의 몰비의 콜레스테롤; 및 - 10%의 몰비의 DSPC를 포함하는, 조성물.
구현예 91. 구현예 72 내지 90 중 임의의 하나에 있어서, LNP는 30 nm 내지 200 nm의 평균 직경을 갖는, 조성물.
구현예 92. 구현예 72 내지 91 중 임의의 하나에 있어서, LNP는 80 nm 내지 150 nm의 평균 직경을 갖는, 조성물.
구현예 93. 구현예 72 내지 92 중 임의의 하나에 있어서, 1 mg/mL 내지 10 mg/mL의 LNP를 포함하는, 조성물.
구현예 94. 구현예 72 내지 93 중 임의의 하나에 있어서, LNP는 1 개 내지 20 개의 핵산 분자, 바람직하게는 mRNA 분자를 포함하는, 조성물.
구현예 95. 구현예 71 내지 94 중 임의의 하나에 있어서, 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내 투여용으로 제형화되는, 조성물.
구현예 96. 구현예 71 내지 95 중 임의의 하나에 있어서, 인산염-완충 식염수를 포함하는, 조성물.
구현예 97. 구현예 71 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 약학적 조성물, 예를 들어, 면역원성 조성물 또는 백신, 특히 mRNA 백신인, 조성물.
구현예 98. 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 데 사용하기 위한, 구현예 1 내지 70 중 임의의 하나의 핵산 또는 구현예 71 내지 97 중 임의의 하나의 조성물.
구현예 99. 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법으로서, 유효량의 구현예 1 내지 70 중 임의의 하나의 핵산 또는 구현예 71 내지 97 중 임의의 하나의 조성물을 선택적으로 근육내로, 비강내로, 정맥내로, 피하로, 또는 피내로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 100. 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 데 사용하기 위한 의약의 제조를 위한, 구현예 1 내지 70 중 임의의 하나의 핵산 또는 구현예 71 내지 97 중 임의의 하나의 조성물의 용도.
구현예 101. 원핵 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 원핵 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 구현예 1 내지 70 중 임의의 하나의 핵산 또는 구현예 71 내지 97 중 임의의 하나의 조성물.
구현예 102. 원핵 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 원핵 감염을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 구현예 1 내지 70 중 임의의 하나의 핵산 또는 구현예 71 내지 97 중 임의의 하나의 조성물을 선택적으로 근육내로, 비강내로, 정맥내로, 피하로, 또는 피내로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 103. 원핵 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 원핵 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한, 구현예 1 내지 70 중 임의의 하나의 핵산 또는 구현예 71 내지 97 중 임의의 하나의 조성물의 용도.
구현예 104. 숙주 세포에서 항원성 원핵 폴리펩티드를 분비하는 방법으로서, 구현예 1 내지 70 중 임의의 하나의 핵산 또는 구현예 71 내지 97 중 임의의 하나의 조성물을 숙주 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 105. 숙주 세포의 표면 상에서 항원성 원핵 폴리펩티드를 표시하는 방법으로서, 구현예 1 내지 70 중 임의의 하나의 핵산 또는 구현예 71 내지 97 중 임의의 하나의 조성물을 숙주 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 106. 구현예 1 내지 70 중 임의의 하나의 핵산 또는 구현예 71 내지 97 중 임의의 하나의 조성물의 1회용 또는 다회용 투여량을 포함하는 용기를 포함하는 키트로서, 선택적으로 용기는 바이알 또는 사전충전형 주사기 또는 주입기인, 키트.
본 개시내용이 보다 잘 이해될 수 있도록, 하기 실시예가 제시된다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 임의의 방식으로 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 재료 및 방법
mRNA 생산
이전에 공개된 바와 같이 mRNA를 생성하였다(문헌[Kalnin et al (2021), NPJ Vaccines 6(1):61] 및 WO 2021226436). 간략하게, OspA ST1 또는 ST2를 함유하는 코딩 서열을 혼입하는 mRNA를 비변형 뉴클레오티드를 사용하여 원하는 유전자를 인코딩하는 플라스미드 DNA 주형과 함께 RNA 중합효소를 사용하는 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 생성된 정제된 전구체 mRNA를 겔 전기영동에 의해 결정된 바와 같은, 대략 200개 뉴클레오티드 길이의 5' 캡 구조(캡 1) 및 3' 폴리(A) 테일의 효소적 첨가를 통해 추가로 반응시켰다.
mRNA/지질 나노입자(LNP) 제형의 제조를 위해, 고정된 지질 및 mRNA 비율의 지질 혼합물(양이온성/이온화 가능한 지질, 포스파티딜에탄올아민, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌 글리콜-지질)의 에탄올 용액을 통제된 조건 하에서 산성 pH에서 표적 mRNA의 완충 수용액과 조합하여 균일한 LNP의 현탁액을 생성하였다. 적합한 희석제 시스템으로의 한외여과 및 정용여과 시, 생성된 나노입자 현탁액을 최종 농도로 희석하고, 여과하고, 사용할 때까지 -80℃에서 냉동 보관하였다.
벤치마크 비교기로서 사용되는 항원의 생산
OspA-페리틴 ST1 및 ST2 항원을 이전에 공개된 재료 및 방법(Kamp et al (2020), NPJ Vaccines 5(1):33)에 따라 미국 매사추세츠주 캠브리지에 있는 Sanofi Breakthrough Lab에서 생산하였다.
OspA 융합 ST1-ST2를 위해, OspA 융합 ST1-ST2 C-말단 도메인의 발현을 가능하게 하는 인-하우스 플라스미드 pSP401+LPP-chimer OspA ST1-OspA ST2를 이.콜라이 발현 균주 C43-(DE3)(Lucigen)에 도입하였다. 풍부한 배지 중 37℃에서 2 시간 내지 3 시간의 성장 후, 유도제의 첨가에 의해 관심 단백질의 발현을 유도하고, 유도 3 시간 후 배양을 중단시켰다. 박테리아 펠렛을 가공한 후, 단백질을 특정 항체를 사용하여 SDS-Page 겔 염색된 쿠마시 블루 상에서 또는 웨스턴 블롯에 의해 시각화하였다. 정제에 필요한 충분한 바이오매스를 생성하기 위해 최상의 발현 조건에서 스케일-업을 수행하였다. 박테리아 펠렛을 리소자임으로 처리하여 막 단백질을 추출하였다. 그런 다음, OspA ST1-OspA ST2 융합 단백질을 우레아 2M + 트리톤 X114 2%로 추출하였다. 37℃에서 3 회의 인큐베이션-원심분리 단계 후, 하부 상을 수집하고, Zwittergent 3.14 세제(0.5%)의 존재 하에 Q 세파로스 크로마토그래피로 처리하였다. 400 mM NaCl로 용리된 분획을 세라믹 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로 처리하였다. OspA ST1-OspA ST2 융합 단백질을 트윈 0,05% PO4 NaNa2 180 mM pH 6,7 완충액으로 용리시키고, 최종 완충액으로서 PBS + 트윈 20 0.05% pH 7.3으로 교체하였다.
HEK 세포의 형질감염
현탁액 중 HEK293T 세포(2x106 개 세포/mL에서 5 mL - 진탕기 125 ml)를 2 분 내지 5 분 동안 동일한 부피의 TransIT-mRNA 시약 및 mRNA 부스트 시약 - TransIT-mRNA 형질감염 키트 미러스(Ref MIR 2250)와 혼합된 1 μg/μL의 5 μg 네이키드 mRNA로 형질감염시켰다. 혼합물을 세포에 적가하고 37℃, 100 rpm, 8% CO2에서 48 시간 내지 72 시간 동안 인큐베이션하였다.
mRNA-형질감염된 세포의 웨스턴 블롯 분석
형질감염 후, 세포 및 배지를 수집하고 원심분리하여(500 x g) 상청액을 수집하였다. 세포 펠렛을 800 rpm 하에 20℃에서 10 min 동안 리소자임(즉시 용해 리소자임 용액- Lucigen ref R1804M) + 벤조나제(Sigma-ref E1014) + 프로테아제 저해제 칵테일(Sigma-ref P8340)을 사용하여 용해시켰다. 이어서 세포 펠렛 용해를 원심분리(11,000 x g)하여 상청액 및 미정제 추출물을 수집하였다.
mRNA-형질감염된 HEK293T 세포로부터의 추출물을 변성(95℃)시켜 4% 내지 12% 비스-트리스/MES 겔(Invitrogen)을 사용하여 PAGE에 의해 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 니트로셀룰로스 막(Bio-Rad)으로의 전달을 반건조 전달 시스템(Trans-Blot Turbo 전달 시스템, Bio-Rad)을 사용하여 수행하였다. 블롯팅된 단백질을 OspA(항-OspA 다클론/토끼 - Abcam, ref ab10608 - 1:2000) 및 2차 항체(항-토끼 IgG 염소 항체 DyLight 800 - Rockland, ref 611-145-002 - 1:2000)를 인식하는 다클론(토끼) 항체로 검출하였다. 블롯을 오디세이 적외선 영상기 - LICOR로 영상화하였다.
기능성 단클론 항체(mAb)를 사용하는 샌드위치 ELISA에 의한 mRNA OspA ST1 또는 ST2 항원성의 특성화
ST1-특이적 기능성 mAb LA-2를 사용한 특성화
mab 857-2(R&D Biotech, Internal Order)를 마이크로타이터 플레이트(Greiner Bio-One)에서 PBS 중 2.5 μg/mL로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, RT에서 1 시간 동안 PBS-트윈 0.05%-우유 5%로 차단하였다.
형질감염 상청액을 희석 완충액(PBS-트윈 0.05%-우유 1%)에서 2 배 연속 희석하고, RT에서 1.5 h 동안 인큐베이션하였다. PBS-0.05% 트윈 세척 후, 코팅에 부착된 단백질의 검출을 1:1000에서 mAb LA-2(Absolute Antibody, Cat. Ab01070-3.0-BT)와 RT에서 1.5 h 동안, 및 이어서 염소 항-마우스 IgG HRP(Jackson Laboratories)와 인큐베이션하여 수행하였다. 세척 후, 3,3,5,5-테트라메틸벤지딘(Tebu-bio, cat. TMB100-1000)을 사용하여 현상하고, 1 N HCl(VWR ProLabo)로 정지시켰다. 광학 밀도(OD)를 450 nm 내지 650 nm에서 판독하였다.
교차-특이적 기능성 mAb 857-2 또는 221-7을 사용한 특성화
mAb 221-7 또는 857-2(Wang et al. J. Infect Dis. 214(2): 205-211. 2016)을 마이크로타이터 플레이트(Greiner Bio-one, cat. 655061)에서 PBS 중 5 μg/mL로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, RT에서 1 시간 동안 PBS-트윈 0.05%-우유 5%로 차단하였다.
형질감염 상청액을 희석 완충액(PBS-트윈 0.05%-우유 1%)에서 2 배 연속 희석하고, RT에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-0.05% 트윈 세척 후, 코팅에 부착된 단백질의 검출을 RT에서 1.5 h 동안 항-OspA 마우스 다클론 혈청(내부)의 인큐베이션에 의해 수행하였다. 플레이트를 세척하고 염소 항-마우스 IgG HRP(Jackson Laboratories, cat. 115-036-062)로 RT에서 1.5 h 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 3,3,5,5-테트라메틸벤지딘(Tebu-bio, cat. TMB100-1000)을 RT에서 30 min 동안 암소에서 현상하였다. 1 N HCl(VWR Prolabo, cat 30024290)로 비색 반응을 중단시켰다. 광학 밀도(OD)를 450 nm 내지 650 nm에서 판독하였다.
항원 및 마우스 면역화
OF-1 마우스(Charles River)를 각각 8 마리의 동물의 면역화 군으로 무작위화하였다. 0 일차(D0)(용량 1) 및 21 일차(D21)(용량 2)에 4 개의 상이한 용량으로 mRNA-OspA-LNP를 근육내(50 μL) 투여하였다: 0.2 μg, 1 μg, 5 μg 또는 10 μg. 혈청을 기준선(D0), 용량 2 전 19 일차(D19), 및 35 일차(D35)에 취하였다.
하기 mRNA-OspA 서열을 시험하였다: mRNA-OspA-ST1-네이티브, mRNA-HA-SS-OspA-ST1-네이티브, mRNA-HA-SS-OspA-ST1-Gly(-), mRNA-TMB-OspA-ST1-네이티브, mRNA-TMB-OspA-ST1-Gly(-). TMB를 갖는 mRNA 서열은 또한 도 1에 나타낸 바와 같이 HA SS를 함유한다.
이러한 mRNA 제형을 1 μg/용량(50 μL)의 벤치마크 라임 개 백신 Recombitek®(Merial), 재조합 융합 OspA ST1-ST2(2 μg/용량) + AlOOH 아쥬반트 및 1.7 μg/용량의 OspA-페리틴(ST1 및 ST2) + AF03 아쥬반트와 비교하였다.
OspA-특이적 IgG ELISA
마우스에서의 항체 반응을 ELISA에 의해 결정하였다. 간략하게, 384-웰 마이크로플레이트(Perkin Elmer #6007509)를 PBS 중에 희석된 1 μg/ml의 OspA ST1-His로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. OspA ST1-His를 제거하고, PBS-트윈에 용해된 5% 탈지유로 플레이트를 차단하였다. 차단 시약을 제거한 후, 1차 혈청 샘플을 1% 탈지유-PBS-트윈에서 연속 2 배 희석한 다음 첨가하였다. 1차 혈청 샘플과 함께 실온에서 1.5 h 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS-트윈으로 세척하고, 염소 항-마우스 IgG-HRP(Jackson 115-036-062)와 함께 실온에서 1.5 h 동안 인큐베이션하였다. 2차 항체를 흡인하고 세척하고 플레이트를 TMB 기질(TEBU - TMB100-1000) 및 이어서 동일한 부피의 정지액(HCl 1N)과 함께 인큐베이션하였다. 흡광도를 450 nm 내지 650 nm에서 측정하였다. OspA-특이적 IgG 역가를 내부 항-OspA 마우스 혈청 참조를 통해 정량화하였다. 이 참조의 역가는 1의 OD를 얻도록 이전에 역수 희석으로 계산되었다.
통계 분석
백신 용량 및 이들의 상호작용을 인자로 하는 2원 ANOVA를 수행하였다(시점 당 하나의 모델). 필요한 경우, 군 내 이종성을 고려하였다.
OspA 아미노산 및 mRNA 서열
실시예에서 사용된 OspA 아미노산 서열 및 mRNA 서열은 하기 표에 열거되어 있다.
[표 4]
OspA 단백질의 아미노산 서열
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
[표 5]
5' UTR 및 3' UTR을 포함하는 OspA mRNA에 대한 mRNA 서열
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
하기 mRNA 서열은 동일한 바이러스 분비 신호 펩티드인 MKAKLLVLLCTFTATYA(SEQ ID NO: 1)를 인코딩하는 변이체이다:
Figure pct00072
Figure pct00073
하기 mRNA 서열은 동일한 막횡단 도메인인 ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)를 인코딩하는 변이체이다:
Figure pct00074
Figure pct00075
실시예 2: 신호 서열-함유 항원성 원핵 폴리펩티드의 시험관내 mRNA 발현 및 항원성
보렐리아 속 단백질 외표면 단백질 A(OspA)를 예시적인 항원성 원핵 폴리펩티드로서 사용하여 헤마글루티닌 분비 신호(HA1 SS) 및 HA 막횡단 도메인(TMB) 중 하나 또는 둘 모두를 OspA에 연결하는 효과를 시험하였다. OspA 혈청형 1(ST1) 및 혈청형 2(ST2)를 사용하였다.
OspA ST1 또는 ST2를 발현하는 mRNA를 설계하였다. 상이한 mRNA 서열은 헤마글루티닌 분비 신호(HA1 SS) 및/또는 HA 막횡단 도메인(TMB)에 대한 융합 없이 또는 융합과 함께 OspA 서열을 사용하여 OspA의 세포내 발현, 분비 또는 막횡단을 유도하도록 설계되었다. HA1 SS는 OspA 분비를 유발하고, TMB는 OspA를 막으로 유도하며, HA1 SS 또는 TMB가 없는 OspA는 세포내 존재한다.
mRNA에 의해 전달된 OspA ST1 및 ST2 항원의 발현 및 항원성을 마우스의 백신접종 전에 시험관내에서 확인하였다. mRNA의 형질감염 및 발현 방법은 상기 실시예 1에 기재되어 있다.
도 2a 및 도 2b에 도시된 바와 같이, HEK293T 세포 상청액에서 OspA ST1 및 ST2 mRNA의 시험관내 발현이 달성되었다. mRNA-OspA ST1 및 mRNA-OspA ST2를 HA 분비 신호의 부재 또는 존재에서, 및 글리코실화 부위 돌연변이의 부재 또는 존재에서 시험하였다. 음성 대조군(완충액) 및 양성 대조군(재조합 OspA)을 또한 사용하였다. HEK293T 세포를 각각의 mRNA로 형질감염시키고, 48 시간 후, 상청액을 수집하고 웨스턴 블롯 상에서 실행하였다. 블롯팅된 단백질을 OspA를 인식하는 다클론 토끼 항체로 검출하였다. 결과는 분비 신호의 추가가 OspA의 세포외 발현을 증가시켰다는 것을 입증해 주었다. 글리코실화 부위의 돌연변이는 네이티브(글리코실화된) 단백질에 대한 다중 스폿 대신에 Gly(-)에 대한 단일 스폿의 존재로 OspA의 글리코실화를 효과적으로 회피하였다.
도 3의 A 내지 도 3의 C에 도시된 바와 같이, HEK293T 세포에서 mRNA-TMB-OspA ST1의 시험관내 발현이 달성되었다. 세포 상청액, 미정제 추출물, 및 세포내 구획을 OspA ST1 발현에 대해 시험하였다. 48 시간 내지 72 시간 후, 상청액 및 세포를 수집하고 웨스턴 블롯에서 실행하였다. 블롯팅된 단백질을 OspA를 인식하는 다클론 토끼 항체로 검출하였다. 결과는 막횡단 도메인을 첨가하는 것이 세포막에서 OspA ST1의 국소화를 유도하고 분비 및 세포내 국소화를 저하시킨다는 것을 입증해 준다. 글리코실화 부위의 돌연변이는 OspA ST1의 글리코실화를 효과적으로 회피하였다.
도 4의 A 내지 도 4의 C에 도시된 바와 같이, HEK293T 세포에서 mRNA-TMB-OspA ST2의 시험관내 발현이 달성되었다. 세포 상청액, 미정제 추출물, 및 세포내 구획을 OspA ST2 발현에 대해 시험하였다. 48 시간 내지 72 시간 후, 상청액 및 세포를 수집하고 웨스턴 블롯에서 실행하였다. 블롯팅된 단백질을 OspA를 인식하는 다클론 토끼 항체로 검출하였다. OspA ST1과 마찬가지로, 결과는 막횡단 도메인을 첨가하는 것이 세포막에서 OspA ST2의 국소화를 유도하고 분비 및 세포내 국소화를 저하시킨다는 것을 입증해 준다. 글리코실화 부위의 돌연변이는 OspA ST2의 글리코실화를 효과적으로 회피하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, HEK293T 세포에서 mRNA에 의해 전달된 OspA ST1 항원의 항원성이 나타났다. 형질감염된 세포 상청액을 사용하여 기능성 단클론 항체 LA-2, 857-2 및 221-7로 샌드위치 ELISA를 수행하였다.
mab LA-2는 OspA ST1 단독의 C 말단만을 표적화하며, 임상 연구에서 보호와 상관관계가 있는 것으로 나타났다(Van Hoecke, 위와 같음; Steere, 위와 같음; Embers, 위와 같음). Mabs 221-7 및 857-2를 문헌[Wang et al., 위와 같음]에 제시된 바와 같이 비. 부르그도르페리의 틱-매개 전염에 대해 마우스에서 보렐리아살균 활성 및 보호에 기초하여 리드 후보로 선택하였다.
mRNA에 의해 생성되는 분비된 OspA ST1(HA-SS-OspA ST1)은 3 개의 기능성 mAb에 의해 정확하게 인식되었는데, 이는 항원이 인간 세포(HEK293T)에서 시험관내 발현 후 정확한 입체배좌에 있었음을 보여준다.
글리코실화 부위의 돌연변이는, 아마도 C 말단 에피토프에서의 잘못된 입체형태의 유도로 인해, mAb LA-2의 결합을 저해하였다. 이는 221-7 및 857-2 항체에서는 관찰되지 않았다.
도 6에 도시된 바와 같이, HEK293T 세포에서 mRNA에 의해 전달된 OspA ST2 항원의 항원성이 나타났다. 형질감염된 세포 상청액을 사용하여 기능성 단클론 항체 857-2 및 221-7로 샌드위치 ELISA를 수행하였다. mAb LA-2는 OspA ST1만 인식하기 때문에 OspA ST2와 함께 사용하지 않았다.
mRNA에 의해 생성되는 분비된 OspA ST2(HA-SS-OspA ST2)는 기능성 mAbs 221-7 및 857-2에 의해 정확하게 인식되었는데, 이는 항원이 인간 세포에서 시험관내 발현 후 정확한 입체배좌에 있었음을 보여준다. 글리코실화 부위의 돌연변이는, 아마도 글리코실화에 의한 에피토프의 더 낮은 마스킹으로 인해, 둘 모두의 mAb의 결합을 개선하였다.
실시예 3: 마우스에서 OspA 단백질을 인코딩하는 mRNA의 면역원성
실시예 1에 상기 기재된 바와 같이, OspA에 대한 IgG 역가를 측정함으로써 마우스에서 다양한 OspA-발현 mRNA의 상대적 면역원성을 시험하였다. 각각의 mRNA를 40% 양이온성 지질 cKK-E10, 30% 인지질 DOPE, 1.5% PEG화된 지질 DMGPEG2000, 및 28.5% 콜레스테롤로 구성된 LNP 내로 캡슐화하였다. 대안적으로, LNP 지질은 양이온성 지질: PEG화된 지질: 콜레스테롤: 인지질이 40: 1.5 : 28.5 : 30의 비율로 언급될 수 있다.
0.2 μg, 1 μg, 5 μg, 또는 10 μg의 용량으로 각각의 LNP-mRNA 조성물을 마우스에 투여하였다. 8 마리의 마우스/군으로 하여 총 4 개의 군을 사용하였다.
3 개의 벤치마크 조성물을 사용하였다: AlOOH 아쥬반트("OspA 융합 ST1-ST2")(2 μg(혈청형별로 1 μg)/용량)와의 OspA 융합체; 라임 개 백신 RECOMBITEK®(Merial)(1 μg 용량), 및 AF03 아쥬반트와의 OspA-페리틴 융합체(ST1 또는 ST2)(1.7 μg(이 중 1 μg OspA + 0.7 μg 페리틴)/용량). OspA-페리틴 융합체는 본원에 참고로 포함된 US20210017238A1에 추가로 기재되어 있다.
도 7a에 도시된 바와 같이, 항-OspA ST1 IgG 역가는 용량 1 후(19 일차)에 상승되었다. HA-SS가 IgG 역가를 증가시키는 경향이 관찰되었다. 또한, TMB 도메인을 첨가하면 IgG 역가가 유의하게 증가하였다.
도 7b에 도시된 바와 같이, 항-OspA ST1 IgG 역가는 용량 2 후(35 일차)에 추가로 상승되었다. 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, HA-SS 및/또는 TMB 도메인을 첨가하는 것은 면역원성을 유의하게 개선하였다(p<0.05).
[표 6]
통계 분석, 용량 2 후(35 일차), 조합된 모든 투여량
Figure pct00076
마우스 연구에 대한 결론:
HA-SS 또는 TMB 중 하나 또는 둘 모두를 갖는 OspA ST1에 대한 mRNA 코딩은 면역원성이었고, 용량 1 후와 용량 2 후 둘 모두로 마우스에서 강력한 항-OspA IgG 역가를 유도하였다. 분비 신호(HA-SS) 또는 TMB 도메인을 첨가하는 것이 임의의 HA-SS 또는 TMB가 없는 mRNA OspA에 비해 면역원성을 유의하게 개선한 것으로 밝혀졌다(p<0.05). 용량 효과가 관찰되었다(즉, 용량이 증가함에 따라 IgG 역가가 증가함).
실시예 4: 확장된 mRNA 설계 패널
실시예 3에서, 헤마글루티닌 분비 신호(HA-SS) 및/또는 HA 막횡단 도메인(HA-TMB)의 첨가는 OspA ST1 표적 항원의 면역원성을 향상시켰다는 것이 입증되었다. 이들 결과에 기초하여, 다양한 바이러스 패밀리의 당단백질로부터의 분비 신호(SS) 및 막횡단 도메인(TMB)을 상이한 표적 항원에 연결시킨, 보다 포괄적인 mRNA 작제물 패널을 설계하였다. 이러한 확장된 mRNA 패널에 포함된 요소의 개략도는 도 8에서 제공된다. 패널은 3 개의 상이한 원핵 항원으로 이루어졌다: OspA ST1, CAMP2, 및 PITP(후자의 2 개는 큐티박테리움 아크네스로부터 유래됨). 이들 항원을 인코딩하는 mRNA 서열을 항원의 세포 내 국소화를 유도하거나, 세포외 분비하거나, 세포막에 노출하도록 추가로 조작하였다. 인플루엔자(아형 A 또는 B), 광견병, 수두(VZV), 또는 에볼라와 같은 별개의 바이러스 패밀리로부터의 당단백질로부터 유래된, SS의 존재 또는 부재에서 및 TMB의 존재 및 부재에서 항원 서열을 융합함으로써 이를 달성하였다.
57 개의 별개의 작제물을 SignalP 6.0을 사용하여 인실리코 분석하여 신호 펩티드의 강도를 결정하였다. SignalP는 신호 서열 예측에 사용되는 알고리즘이며, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Armenteros et al. (Nature Biotechnology. 37: 420-423. 2019), Teufel et al. (Nature Biotechnology. 40: 1023-1025. 2022)], 및 https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/에 더 상세히 기재되어 있다. 강도는 신호 서열의 표준 특징을 검출할 가능성(SP 우도 점수로도 알려진, SS 우도 점수) 및 절단 부위에서의 절단 확률(절단 확률 점수)을 고려하는 누적 순위 점수를 기반으로 평가된다. 이 분석에 사용된 서열은 표 7에 나타나 있으며, 이 분석의 결과는 하기 표 8에 제시되어 있다.
[표 7]
SignalP 6.0에서 분석된 서열
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
[표 8]
표 7에 표시된 모든 시험된 서열로부터의 SignalP 6.0 분석의 결과
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
또한, 신호 펩티드 및 이의 절단 부위는 단백질의 성숙 영역보다 덜 보존된다(Nielsen et al. (2019), The Protein Journal, 38:200-216). 따라서, 종 및 아형 수준에서 신호 서열 간의 차이를 이해하기 위해, 여러 헤마글루티닌 신호 서열의 상동성을 분석하였다. 표 2는 인플루엔자 A(아형 H1N1 및 H3N2) 및 인플루엔자 B(빅토리아 및 야마가타 계통)에 대해 시험된 여러 균주를 나타내고, 생성된 컨센서스 헤마글루티닌 신호 서열은 표 2에 제시되어 있다.
이들 인실리코 결과에 기초하여, 패널을 다운스트림 시험을 위해 선택된 작제물로 좁혔다. 각각의 작제물의 각 SignalP 6.0 점수에 의해 달성된 선택된 항원과 신호 서열의 최종 조합은 표 8 및 표 9에 제시되어 있다. 이러한 mRNA 패널 설계에 상응하는 아미노산 서열은 표 7에 제시되어 있다. 표 7에서, 작제물 식별 명칭은 바이러스 당단백질 신호 서열의 간단한 표현 및 막횡단 도메인이 혼입되었는지의 표시("TMB"로 표기됨)와 함께 항원에 대한 정보를 제공한다.
후속적으로, mRNA를 표 7에 나타낸 작제물로부터 생산하였다. mRNA 생산 방법은 실시예 1에 기재된 것과 동일하였다. 캡핑 반응의 효율 및 폴리(A) 테일의 길이를 포함하는 이 패널의 작제물로부터 생산된 mRNA의 파라미터를 결정하였다. 모든 mRNA를 적절하게 캡핑하고 폴리A 테일화하였다.
[표 9]
선택된 신호 서열에 대한 SignalP 6.0 분석의 결과
Figure pct00088
[표 10]
확장된 mRNA 설계 패널의 아미노산 서열 설계
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
실시예 5: 확장된 mRNA 설계 패널로부터의 시험관내 항원 발현
이 실시예는 HEK293T 세포로의 mRNA 패널(실시예 4에 기재됨)의 형질감염 후의 세포 생존력, 단백질 발현 및 국소화의 분석을 개략적으로 나타낸다. 형질감염 및 웨스턴 블롯 분석은 앞서 실시예 1에 기재되었다. 분석된 웨스턴 블롯의 항원은 OspA ST1, CAMP2 및 PITP였다.
형질감염 후 mRNA 작제물 패널을 사용한 2 회의 발현 시험으로부터 생성된 HEK Expi293F 세포 카운트 및 세포 생존율 퍼센트를 측정하였다. 모든 세포 생존율 값은 형질감염 후 24 시간째 및 48 시간째에 80%를 초과하였는데, 이는 상태가 정상이었고 mRNA 작제물 중 어느 것도 표적외 세포 세포독성을 생성하지 않았음을 나타낸다.
OspA
도 9에 도시된 바와 같이, 각각의 막횡단 도메인("TMB")의 존재 또는 부재에서 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 광견병, VZV 및 에볼라 당단백질로부터 유래된 신호 서열(겔에서 "SS"로 표지됨)에 융합된 OspA ST1의 시험관내 발현은 HEK Expi293F 세포에서 형질감염 후 48 시간째에 달성되었다. OspA ST1(예상 크기 약 28 kDa 내지 34 kDa)을 1:2000 희석으로 OspA에 대한 토끼 다클론 항체(ABCAM ab106081)를 사용하여 검출하였다. 대조군은 임의의 SS 또는 임의의 지질화 서열이 없는 OspA ST1 작제물(모든 겔의 첫 번째 레인, "SS 없음"으로 표지됨)뿐만 아니라 재조합 OspA ST1(모든 겔의 마지막 레인)을 포함하였다. OspA 국소화 시험과 관련하여, 미정제 추출물(총 용해물), 세포 상청액, 및 세포내 또는 막횡단 구획을 함유하는 분획화된 세포 샘플로부터 샘플을 수집하였다. 이들 결과는 막횡단 도메인을 첨가하는 것이 세포막에서 OspA ST1의 국소화를 유도하고 분비 및 세포내 국소화를 저하시킨다는 것을 입증해 준다.
또한, 도 9에서 상청액 분획의 대표적인 겔은 희미한 신호(패널의 마지막 컬럼)를 나타냈기 때문에, 상청액 OspA 분획을 7 배 농축시키고, 생성된 부피의 절반을 탈글리코실화시켜(겔 상에서 "D"로 표시됨) 도 10에 도시된 바와 같이 효소 처리 전 및 후에 웨스턴 블롯에 의해 단백질을 분석하였다. OspA ST1은 시험된 모든 OspA 작제물에 대해 상청액 분획에 존재하였지만 발현 수준은 다양하였다. 예를 들어, 에볼라 당단백질 SS에 융합된 OspA ST1 작제물은 다른 작제물과 비교하여 더 낮은 SignalP 절단 점수를 또한 가졌으며, 다른 OspA 작제물에 비해 상청액 분획에서 발현이 저하되었다(도 10, 두 번째 겔, 레인 5 및 레인 6 참조). 또한, 막횡단 도메인에 대한 작제물의 융합은 샘플들 중 일부에서 OspA 상청액 검출을 저하시켰다(그러나 완전히 없애지는 않았다).
CAMP2
도 11에 도시된 바와 같이, 각각의 막횡단 도메인("TMB")의 존재 또는 부재에서 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 광견병, VZV 및 에볼라 당단백질로부터 유래된 신호 서열(겔에서 "SS"로 표지됨)에 융합된 CAMP2의 시험관내 발현은 HEK Expi293F 세포에서 형질감염 후 48 시간째에 달성되었다. CAMP2(예상 크기 약 26 kDa 내지 32 kDa)를 1:1500 희석으로 CAMP2(일반화된 인하우스)에 대한 토끼 다클론 항체를 사용하여 검출하였다. 대조군은 임의의 SS가 없는 CAMP2 작제물(모든 겔 상의 첫 번째 레인, "SS 없음"으로 표지됨)뿐만 아니라 재조합 CAMP2(모든 겔 상의 마지막 레인)를 포함하였다. CAMP2 국소화 시험과 관련하여, 미정제 추출물(총 용해물), 세포 상청액, 및 세포내 또는 막횡단 구획을 함유하는 분획화된 세포 샘플로부터 샘플을 수집하였다. 이들 결과는 막횡단 도메인을 첨가하는 것이 세포막에서 CAMP2의 국소화를 유도하고 분비 및 세포내 국소화를 저하시키는 것을 입증해 준다(마지막 컬럼에서 "상청액"으로 표지된 막횡단 도메인의 존재 또는 부재에서 작제물 비교). 웨스턴 블롯 분석은 CAMP2가 분비 신호 펩티드 또는 막횡단 도메인의 존재에 따라 예상 분획에서 잘 발현되고 국소화됨을 입증해 주었다.
PITP
도 12에 도시된 바와 같이, 각각의 막횡단 도메인("TMB")의 존재 또는 부재에서 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 광견병, VZV 및 에볼라 당단백질로부터 유래된 신호 서열(겔에서 "SS"로 표지됨)에 융합된 PITP의 시험관내 발현은 HEK Expi293F 세포에서 형질감염 후 48 시간째에 달성되었다. PITP(예상 크기 약 42 kDa 내지 48 kDa)를 1:1000 희석으로 PITP(일반화된 인하우스)에 대한 마우스 다클론 항체를 사용하여 검출하였다. 대조군은 임의의 SS 또는 임의의 TMB가 없는 PITP 작제물(모든 겔의 첫 번째 레인, "SS 없음"으로 표지됨)뿐만 아니라 재조합 PITP(모든 겔의 마지막 레인)를 포함하였다. PITP 국소화 시험과 관련하여, 미정제 추출물(총 용해물), 세포 상청액, 및 세포내 또는 막횡단 구획을 함유하는 분획화된 세포 샘플로부터 샘플을 수집하였다. OspA 및 CAMP2 항원 국소화 분석과 같이, 이들 결과는 막횡단 도메인을 첨가하는 것이 세포막에서 PITP의 국소화를 유도하고 분비 및 세포내 국소화를 저하시키는 것을 입증해 준다(마지막 컬럼에서 "상청액"으로 표지된 막횡단 도메인의 존재 또는 부재에서 작제물 비교). 그럼에도 불구하고, PITP 막횡단 함유 작제물은 상청액 분획으로의 일부 탈출을 나타내었다.
이러한 웨스턴 블롯 분석은 PITP가 분비 신호 펩티드 또는 막횡단 도메인의 존재에 따라 예상 분획에서 잘 발현되고 국소화됨을 입증해 주었다.
개요
OspA ST1, CAMP2 및 PITP에 대한 웨스턴 블롯 분석을 비교하기 위해 단백질 발현 및 국소화 결과를 도 13에 표로 작성하였다. 일반적으로, OspA ST1 항원 함유 작제물은 CAMP2 또는 PITP 함유 작제물과 비교하여 잘 발현되지 않는다. 3 개의 단백질 항원 모두는 발현 정도가 다양하지만 이들의 예상 위치에서 발현되고 막횡단 도메인이 도입되었을 때 다양한 정도로 상청액으로의 일부 탈출을 나타내었다. 낮은 SignalP 절단 점수를 갖는 작제물 OspA ST1_SS-에볼라-GP는 상청액 분획에서 더 낮은 발현을 나타냈는데, 이는 이것이 세포내 분획에서 축적될 가능성이 있었음을 나타낸다.
본 개시내용의 다른 구현예는 본 명세서의 고려 및 본원에 개시된 본 개시내용의 실시에 의해 당업자에게 명백해질 것이다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되고 본 개시내용의 진정한 범위 및 사상은 다음의 청구범위에 의해 나타나는 것으로 의도된다.
본원에 인용된 모든 특허 및 간행물은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
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Claims (93)

  1. 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)을 포함하는 핵산으로서, ORF는
    - 적어도 하나의 항원성 원핵 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및
    - 적어도 하나의 바이러스 분비 신호 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
  2. 제1항에 있어서, ORF는 적어도 하나의 막횡단 도메인(TMB)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 인간을 감염시킬 수 있는 바이러스의 바이러스 서열로부터 유래되는, 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 서열로부터 유래되는, 핵산: 인플루엔자 분비 신호 펩티드 서열, 및 SARS CoV-2 분비 신호 펩티드 서열, 수두-대상포진 바이러스(VZV) 분비 신호 펩티드 서열, 홍역 분비 신호 펩티드 서열, 풍진 분비 신호 펩티드 서열, 볼거리 분비 신호 펩티드 서열, 에볼라 분비 신호 펩티드 서열, 두창 분비 신호 펩티드 서열, 및 광견병 분비 신호 펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 비-인플루엔자 분비 신호 펩티드 서열.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 분비 신호 펩티드 서열, SARS CoV-2 스파이크 분비 신호 펩티드 서열, VZV gB 분비 신호 펩티드 서열, VZV gE 분비 신호 펩티드 서열, VZV gI 분비 신호 펩티드 서열, VZV gK 분비 신호 펩티드 서열, 홍역 F-단백질 분비 신호 펩티드 서열, 풍진 E1 단백질 분비 신호 펩티드 서열, 풍진 E2 단백질 분비 신호 펩티드 서열, 볼거리 F-단백질 분비 신호 펩티드 서열, 에볼라 GP 단백질 분비 신호 펩티드 서열, 두창 6kDa IC 단백질 분비 신호 펩티드 서열, 및 광견병 G 단백질 분비 신호 펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 바이러스 분비 신호 펩티드는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B로부터의, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A로부터의 HA 분비 신호 펩티드 서열을 포함하는, 핵산.
  6. 제5항에 있어서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 아미노산 서열 MKX1X2LX3VX4LX5TFX6X7X8X9A(SEQ ID NO: 145)를 포함하고,
    X1은 A 및 V로부터 선택되고;
    X2는 I 및 K로부터 선택되고;
    X3은 V 및 L로부터 선택되고;
    X4는 L 및 M으로부터 선택되고;
    X5는 Y 및 C로부터 선택되고;
    X6은 T 및 A로부터 선택되고;
    X7은 T 및 A로부터 선택되고;
    X8은 A 및 T로부터 선택되고;
    X9는 N 및 Y로부터 선택되는, 핵산.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 SEQ ID NO: 95 내지 109로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 핵산.
  8. 제5항에 있어서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 아미노산 서열 MKX1IIALSX2ILCLVFX3(SEQ ID NO: 146)을 포함하며,
    X1은 T 및 A로부터 선택되고;
    X2는 Y, N, C 및 H로부터 선택되고;
    X3은 T 및 A로부터 선택되는, 핵산.
  9. 제8항에 있어서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 SEQ ID NO: 110 내지 131로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 핵산.
  10. 제5항에 있어서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 아미노산 서열 MKAIIVLLMVVTSX1A(SEQ ID NO: 147)를 포함하고,
    X1은 S 및 N으로부터 선택되는, 핵산.
  11. 제5항에 있어서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 아미노산 서열 MX1AIIVLLMVVTSNA(SEQ ID NO: 148)를 포함하고,
    X1은 K 및 E로부터 선택되는, 핵산.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, HA 분비 신호 펩티드 서열은 SEQ ID NO: 132 내지 144로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 핵산.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 핵산:
    Figure pct00095
  14. 제13항에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 MKAKLLVLLCTFTATYA(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열을 포함하는, 핵산.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 항원성 원핵 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는, 핵산.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 항원성 원핵 폴리펩티드의 C-말단에 위치하는, 핵산.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 분비 신호 펩티드는 링커에 의해 항원성 원핵 폴리펩티드에 부착되는, 핵산.
  18. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, TMB는
    (a) 15 개 내지 50 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 15 개 내지 30 개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 18 개 내지 25 개의 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 이루어지고/지거나;
    (b) 바람직하게는 알라닌, 이소류신, 류신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 50%의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고/하거나;
    (c) 적어도 하나의 알파 나선을 포함하는, 핵산.
  19. 제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, TMB는 통합 막 단백질로부터, 바람직하게는 단일 막 관통 단백질로부터, 더욱 바람직하게는 바이토프성 막 단백질로부터, 더욱 더 바람직하게는 타입 I의 바이토프성 막 단백질로부터 유래되는, 핵산.
  20. 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, TMB는 비-인간 서열로부터 유래되는, 핵산.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 원핵 막횡단 단백질로부터 유래되고, TMB는 원핵 막횡단 단백질의 TMB인, 핵산.
  22. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 원핵 막횡단 단백질로부터 유래되지 않는, 핵산.
  23. 제22항에 있어서, TMB는 바이러스 서열로부터 유래되는, 핵산.
  24. 제23항에 있어서, TMB는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 막횡단 도메인 서열로부터 유래되는, 핵산: 인플루엔자 막횡단 도메인 서열, 및 SARS CoV-2 막횡단 도메인 서열, 수두-대상포진 바이러스(VZV) 막횡단 도메인 서열, 홍역 막횡단 도메인 서열, 풍진 막횡단 도메인 서열, 볼거리 막횡단 도메인 서열, 에볼라 막횡단 도메인 서열, 및 광견병 막횡단 도메인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 비-인플루엔자 막횡단 도메인 서열.
  25. 제24항에 있어서, TMB는 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 막횡단 도메인 서열, SARS CoV-2 스파이크 막횡단 도메인 서열, VZV gB 막횡단 도메인 서열, VZV gE 막횡단 도메인 서열, VZV gI 막횡단 도메인 서열, VZV gK 막횡단 도메인 서열, 홍역 F-단백질 막횡단 도메인 서열, 풍진 E1 단백질 막횡단 도메인 서열, 풍진 E2 단백질 막횡단 도메인 서열, 볼거리 F-단백질 막횡단 도메인 서열, 에볼라 GP 단백질 막횡단 도메인 서열 및 광견병 G 단백질 막횡단 도메인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 TMB는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B로부터의, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A로부터의 HA 막횡단 도메인 서열을 포함하는, 핵산.
  26. 제18항 내지 제20항 및 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, TMB는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 핵산:
    Figure pct00096

    Figure pct00097
  27. 제16항에 있어서, TMB는 ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)의 아미노산 서열을 포함하는, 핵산.
  28. 제2항 및 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, TMB는 링커에 의해 항원성 원핵 폴리펩티드에 부착되는, 핵산.
  29. 제2항 및 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, TMB는 항원성 원핵 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는, 핵산.
  30. 제2항 및 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, TMB는 항원성 원핵 폴리펩티드의 C-말단에 위치하는, 핵산.
  31. 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 핵산으로서, ORF는
    - 적어도 하나의 항원성 폴리펩티드, 바람직하게는 항원성 원핵 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및
    - 적어도 하나의 막횡단 도메인(TMB)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로써, TMB는 항원성 폴리펩티드에 대해 이종성인, 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    선택적으로, ORF는 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 분비 신호 펩티드, 바람직하게는 바이러스 분비 신호 펩티드, 더욱 바람직하게는 바이러스 분비 신호 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
  32. 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 핵산으로서, ORF는
    - 적어도 하나의 항원성 원핵 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및
    - 적어도 하나의 막횡단 도메인(TMB)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
  33. 제32항에 있어서, TMB는
    (a) 15 개 내지 50 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 15 개 내지 30 개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 18 개 내지 25 개의 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 이루어지고/지거나;
    (b) 바람직하게는 알라닌, 이소류신, 류신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 50%의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고/하거나;
    (c) 적어도 하나의 알파 나선을 포함하는, 핵산.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, TMB는 통합 막 단백질로부터, 바람직하게는 단일 막 관통 단백질로부터, 더욱 바람직하게는 바이토프성 막 단백질로부터, 더욱 더 바람직하게는 타입 I의 바이토프성 막 단백질로부터 유래되는, 핵산.
  35. 제34항에 있어서, TMB는 비-인간 서열로부터 유래되는, 핵산.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 폴리펩티드는 막횡단 단백질로부터 유래되지 않는, 핵산.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, TMB는 바이러스 서열로부터 유래되는, 핵산.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, TMB는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 막횡단 도메인 서열로부터 유래되는, 핵산: 인플루엔자 막횡단 도메인 서열, 및 SARS CoV-2 막횡단 도메인 서열, 수두-대상포진 바이러스(VZV) 막횡단 도메인 서열, 홍역 막횡단 도메인 서열, 풍진 막횡단 도메인 서열, 볼거리 막횡단 도메인 서열, 에볼라 막횡단 도메인 서열, 및 광견병 막횡단 도메인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 비-인플루엔자 막횡단 도메인 서열.
  39. 제38항에 있어서, TMB는 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 막횡단 도메인 서열, SARS CoV-2 스파이크 막횡단 도메인 서열, VZV gB 막횡단 도메인 서열, VZV gE 막횡단 도메인 서열, VZV gI 막횡단 도메인 서열, VZV gK 막횡단 도메인 서열, 홍역 F-단백질 막횡단 도메인 서열, 풍진 E1 단백질 막횡단 도메인 서열, 풍진 E2 단백질 막횡단 도메인 서열, 볼거리 F-단백질 막횡단 도메인 서열, 에볼라 GP 단백질 막횡단 도메인 서열 및 광견병 G 단백질 막횡단 도메인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 TMB는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B로부터의, 더욱 바람직하게는 인플루엔자 A로부터의 HA 막횡단 도메인 서열을 포함하는, 핵산.
  40. 제39항에 있어서, TMB는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 핵산:
    Figure pct00098
  41. 제40항에 있어서, TMB는 ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)의 아미노산 서열을 포함하는, 핵산.
  42. 제32항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, TMB는 링커에 의해 항원성 원핵 폴리펩티드에 부착되는, 핵산.
  43. 제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, TMB는 항원성 원핵 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는, 핵산.
  44. 제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, TMB는 항원성 원핵 폴리펩티드의 C-말단에 위치하는, 핵산.
  45. 제32항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 아세토박터(Acetobacter), 아시네토박터(Acinetobacter), 액티노마이세스(Actinomyces), 아에로코쿠스(Aerococcus), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아나플라즈마(Anaplasma), 아조히조비아(Azorhizobia), 아조토박터(Azotobacter), 바실러스(Bacillus), 박테로이데스(Bacteroides), 바르토넬라(Bartonella), 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 부르콜데리아(Burkkolderia), 칼리마토박테리움(Calymmatobacterium), 캄필로박터(Campylobacter), 클라미디아 (Chlamydia), 클라미도필라(Chlamydophila), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 콕시엘라(Coxiella), 큐티박테리움(Cutibacterium), 에를리키아(Ehrlichia), 엔테로박터(Enterobacter), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 에쉬리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 가드넬라(Gardnerella), 헤모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코쿠스(Lactococcus), 레지오넬라(Legionella), 리스테리아(Listeria), 메타노박테리움(Methanobacterium), 마이크로박테리움(Microbacterium), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 모락셀라(Moraxella), 마이코박테리움(Mycobacterium), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 나이세리아(Neisseria), 파스퇴렐라(Pasteurella), 페디오코쿠스(Pediococcus), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 슈도모나스(Pseudomonas), 라이조비움(Rhizobium), 리케치아(Rickettsia), 로칼리메아(Rochalimaea), 로티아(Rothia), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 시겔라(Shigella), 사르키나(Sarcina), 스피릴룸(Spirillum), 스피로카에테스(Spirochaetes), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 스트렙토바실러스(Streptobacillus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 테트라게노코쿠스(Tetragenococcus), 트레포네마(Treponema), 비브리오(Vibrio), 비리단스(Viridans), 볼바키아(Walbachia), 및 예르시니아(Yersinia)로 이루어진 군으로부터 선택된 속의 박테리아로부터, 바람직하게는 아세토박터 아우란티우스(Acetobacter aurantius), 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 악티노미세스 이스라엘리이(Actinomyces israelii), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아나플라스마 파고시토필룸(Anaplasma phagocytophilum), 아조리조비움 카울리노단스(Azorhizobium caulinodans), 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 푸시포르미스(Bacillus fusiformis), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실루스 미코이데스(Bacillus mycoides), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 투린기엔시스(Bacillus Thuringiensis), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 박테로이데스 긴기발리스(Bacteroides gingivalis), 박테로이데스 멜라니노게니쿠스(Bacteroides melaninogenicus), 바르토넬라 헨셀라에(Bartonella henselae), 바르토넬라 퀸타나(Bartonella Quintana), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 부르크 홀데리아 말레이(Burkholderia mallei), 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 칼림마토박테리움 그라눌로마티스(Calymmatobacterium granulomatis), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 필로리(Campylobacter pylori), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 뉴모니아에(Chlamydophila pneumoniae), 클라미도필라 프시타시(Chlamydophila psittaci), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 푸시포르메(Corynebacterium fusiforme), 콕시엘라 부르네티이(Coxiella burnetii), 쿠티박테리움 아크네스(Cutibacterium acnes), 쿠티박테리움 아비둠(Cutibacterium avidum), 쿠티박테리움 그라눌로숨(Cutibacterium granulosum), 쿠티박테리움 남네텐세(Cutibacterium namnetense), 쿠티박테리움 후메루시이(Cutibacterium humerusii), 에를리키아 샤페엔시스(Ehrlichia chaffeensis), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae), 엔테로코쿠스 아비움(Enterococcus avium), 엔테로코쿠스 두란스(Enterococcus durans), 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 파에시움(Enterococcus faecium), 엔테로코쿠스 갈리나룸(Enterococcus galllinarum), 엔테로코쿠스 말로라투스(Enterococcus maloratus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis), 헤모필루스 두크레이이(Haemophilus ducreyi), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 헤모필루스 파라인플루엔자에(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 페르투시스(Haemophilus pertussis), 하이모필루스 바기날리스(Haemophilus vaginalis), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 메타노박테리움 엑스트로쿠엔스(Methanobacterium extroquens), 미크로박테리움 물티포르메(Microbacterium multiforme), 미크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 미코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 미코박테리움 디프테리아에(Mycobacterium diphtheriae), 미코박테리움 인트라셀룰라레(Mycobacterium intracellulare), 미코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 미코박테리움 레프라에무리움(Mycobacterium lepraemurium), 미코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei), 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코플라스마 페르멘탄스(Mycoplasma fermentans), 미코플라스마 게니탈리움(Mycoplasma genitalium), 미코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis), 미코플라스마 페네트란스(Mycoplasma penetrans), 미코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 네이세리아 고노로에아에(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스테우렐라 툴라렌시스(Pasteurella tularensis), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 멜라니노게니카(Prevotella melaninogenica), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter), 리케치아 프로와제키이(Rickettsia prowazekii), 리케치아 프시타시(Rickettsia psittaci), 리케치아 퀸타나(Rickettsia quintana), 리케치아 리케치이(Rickettsia rickettsii), 리케치아 트라코마(Rickettsia trachomae), 로칼리마에아 헨셀라에(Rochalimaea henselae), 로칼리마에아 퀸타나(Rochalimaea quintana), 로티아 덴토카리오사(Rothia dentocariosa), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 쉰겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae), 스피릴룸 볼룬탄스(Spirillum volutans), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 아비움(Streptococcus avium), 스트렙토코쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코쿠스 크리세투스(Streptococcus cricetus), 스트렙토 코쿠스 파케이움(Streptococcus faceium), 스트렙토코쿠스 파에칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 페루스(Streptococcus ferus), 스트렙토코쿠스 갈리나룸(Streptococcus gallinarum), 스트렙토코쿠스 락티스(Streptococcus lactis), 스트렙토코쿠스 미티오르(Streptococcus mitior), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 라투스(Streptococcus rattus), 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 스트렙토코쿠스 산구이스(Streptococcus sanguis), 스트렙토코쿠스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 비브리오 콤마(Vibrio comma), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비리단스 스트렙토코키(Viridans streptococci), 울바키아(Wolbachia), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 및 예르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis)로 이루어진 군으로부터 선택된 종의 박테리아로부터 유래되는, 핵산.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 바람직하게는 종 비. 부르그도르페리(B. burgdorferi), 아프젤리이(afzelii), 가리니이(garinii), 바바리엔시스(bavariensis), 마이오니이(mayonii), 스피엘마니이(spielmanii), 루시타니아에(lusitaniae), 비세티이(bissettii) 및/또는 발라이시아나(valaisiana)로부터 선택된 속 보렐리아(Borrelia)의 박테리아로부터 유래되는, 핵산.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 OspA 또는 이의 단편 또는 변이체이고, OspA 또는 이의 단편 또는 변이체는 적어도 5 개의 아미노산을 포함하고, 바람직하게는 항원성 원핵 폴리펩티드는 하기를 포함하는, 핵산:
    (a) 바람직하게는 서열
    Figure pct00099

    와 적어도 85% 동일성을 갖는 OspA ST1로부터 유래된 아미노산 서열;
    (b) 바람직하게는 서열
    Figure pct00100

    와 적어도 85% 동일성을 갖는 OspA ST2로부터 유래된 아미노산 서열;
    (c) 바람직하게는 서열
    Figure pct00101

    Figure pct00102

    와 적어도 85% 동일성을 갖는 OspA ST3으로부터 유래된 아미노산 서열;
    (d) 바람직하게는 서열
    Figure pct00103

    와 적어도 85% 동일성을 갖는 OspA ST4로부터 유래된 아미노산 서열;
    (e) 바람직하게는 서열
    Figure pct00104

    와 적어도 85% 동일성을 갖는 OspA ST5로부터 유래된 아미노산 서열;
    (f) 바람직하게는 서열
    Figure pct00105

    와 적어도 85% 동일성을 갖는 OspA ST6으로부터 유래된 아미노산 서열;
    (g) 바람직하게는 서열
    Figure pct00106

    와 적어도 85% 동일성을 갖는 OspA ST7로부터 유래된 아미노산 서열;
    (h) (a) 내지 (g)의 임의의 조합;
    (i) (a)에 따른 OspA ST1로부터 유래된 서열 및 (b)에 따른 OspA ST2로부터 유래된 서열, 또는
    (j) (a)에 따른 OspA ST1로부터 유래된 서열, (b)에 따른 OspA ST2로부터 유래된 서열, (c)에 따른 OspA ST3으로부터 유래된 서열, (d)에 따른 OspA ST4로부터 유래된 서열, (e)에 따른 OspA ST5로부터 유래된 서열, (f)에 따른 OspA ST6으로부터 유래된 서열 및 (g)에 따른 OspA ST7로부터 유래된 서열.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 항원성 원핵 폴리펩티드는 적어도 하나의 돌연변이된 글리코실화 부위, 바람직하게는 적어도 하나의 돌연변이된 N-연결 글리코실화 부위를 포함하는, 핵산.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산의 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화되는, 핵산.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, ORF의 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화되는, 핵산 분자.
  51. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 바이러스 분비 신호 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화되는, 핵산.
  52. 제18항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 TMB를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화되는, 핵산.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 DNA인, 핵산.
  54. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 메신저 RNA(mRNA)이고, 특히 mRNA는 비-복제 mRNA, 자기-복제 mRNA 또는 트랜스-복제 mRNA일 수 있는, 핵산.
  55. 제54항에 있어서, mRNA는 적어도 하나의 5' 비번역 영역(5' UTR), 적어도 하나의 3' 비번역 영역(3' UTR), 및/또는 적어도 하나의 폴리아데닐화(폴리(A)) 서열을 포함하는, 핵산.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, mRNA는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하는, 핵산.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA에서 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%는 화학적으로 변형되는, 핵산.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, ORF에서 우라실 뉴클레오티드의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%는 화학적으로 변형되는, 핵산.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-l-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-l-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-l-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 및 2'-O-메틸 우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 5-메틸시토신, 5-메톡시우리딘, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 변형은 N1-메틸슈도우리딘인, 핵산.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 핵산을 포함하는 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 지질 나노입자(LNP)를 추가로 포함하는, 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 핵산 분자는 LNP에서 캡슐화되는, 조성물.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, LNP는 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함하는, 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 양이온성 지질은 생분해성인, 조성물.
  67. 제65항에 있어서, 양이온성 지질은 생분해성이 아닌, 조성물.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 지질은 절단 가능한, 조성물.
  69. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 지질은 절단 가능하지 않은, 조성물.
  70. 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 지질은 OF-02, cKK-E10, OF-Deg-Lin, GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1, GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14, SM-102, 및 ALC-0315로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  71. 제65항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 컨쥬게이션된(PEG화된) 지질, 콜레스테롤계 지질 및 헬퍼 지질을 추가로 포함하는, 조성물.
  72. 제63항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는
    - 35% 내지 55%의 몰비의 양이온성 지질;
    - 0.25% 내지 2.75%의 몰비의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 컨쥬게이션된(PEG화된) 지질;
    - 20% 내지 45%의 몰비의 콜레스테롤계 지질; 및
    - 5% 내지 35%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함하고,
    모든 몰비는 LNP의 총 지질 함량에 상대적인, 조성물.
  73. 제63항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는
    - 40%의 몰비의 양이온성 지질;
    - 1.5%의 몰비의 PEG화된 지질;
    - 28.5%의 몰비의 콜레스테롤계 지질; 및
    - 30%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함하는, 조성물.
  74. 제63항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는
    - 45% 내지 50%의 몰비의 양이온성 지질;
    - 1.5% 내지 1.7%의 몰비의 PEG화된 지질;
    - 38% 내지 43%의 몰비의 콜레스테롤계 지질; 및
    - 9% 내지 10%의 몰비의 헬퍼 지질을 포함하는, 조성물.
  75. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, PEG화된 지질은 디미리스토일-PEG2000 (DMG-PEG2000) 또는 2-[(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-N,N-디테트라데실아세트아미드(ALC-0159)인, 조성물.
  76. 제71항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤인, 조성물.
  77. 제71항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 헬퍼 지질은 1,2-디올레오일-SN-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)인, 조성물.
  78. 제63항 내지 제73항 및 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는
    - 40%의 몰비의 OF-02, cKK-E10, GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1, GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10, 및 GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온성 지질;
    - 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000;
    - 28.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및
    - 30%의 몰비의 DOPE를 포함하는, 조성물.
  79. 제63항 내지 제72항 및 제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는
    - 50%의 몰비의 SM-102;
    - 1.5%의 몰비의 DMG-PEG2000;
    - 38.5%의 몰비의 콜레스테롤; 및
    - 10%의 몰비의 DSPC를 포함하는, 조성물.
  80. 제63항 내지 제72항 및 제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는
    - 46.3%의 몰비의 ALC-0315;
    - 1.6%의 몰비의 ALC-0159;
    - 42.7%의 몰비의 콜레스테롤; 및
    - 9.4%의 몰비의 DSPC를 포함하는, 조성물.
  81. 제63항 내지 제72항 및 제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는
    - 47.4%의 몰비의 ALC-0315;
    - 1.7%의 몰비의 ALC-0159;
    - 40.9%의 몰비의 콜레스테롤; 및
    - 10%의 몰비의 DSPC를 포함하는, 조성물.
  82. 제63항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는 30 nm 내지 200 nm의 평균 직경을 갖는, 조성물.
  83. 제63항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는 80 nm 내지 150 nm의 평균 직경을 갖는, 조성물.
  84. 제63항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 1 mg/mL 내지 10 mg/mL의 LNP를 포함하는, 조성물.
  85. 제63항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, LNP는 1 개 내지 20 개의 핵산 분자, 바람직하게는 mRNA 분자를 포함하는, 조성물.
  86. 제62항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 근육내, 비강내, 정맥내, 피하 또는 피내 투여용으로 제형화되는, 조성물.
  87. 제62항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 인산염-완충 식염수를 포함하는, 조성물.
  88. 제62항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물, 예를 들어, 면역원성 조성물 또는 백신, 특히 mRNA 백신인, 조성물.
  89. 면역 반응의 유발을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유발하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제62항 내지 제88항 중 어느 한 항의 조성물.
  90. 원핵 감염의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 원핵 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제62항 내지 제88항 중 어느 한 항의 조성물.
  91. 숙주 세포에서 항원성 원핵 폴리펩티드를 분비하는 방법으로서, 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제62항 내지 제88항 중 어느 한 항의 조성물을 숙주 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  92. 숙주 세포의 표면 상에서 항원성 원핵 폴리펩티드를 표시하는 방법으로서, 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제62항 내지 제88항 중 어느 한 항의 조성물을 숙주 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  93. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제62항 내지 제88항 중 어느 한 항의 조성물의 1회용 또는 다회용 투여량을 포함하는 용기를 포함하는 키트로서, 선택적으로 용기는 바이알 또는 사전충전형 주사기 또는 주입기인, 키트.
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