KR20250004938A - 생합성 인체구조성 재료의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생합성 인체구조성 재료의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 아미노산 서열이 n(n은 1 이상의 정수)개의 반복 서열을 포함하는 재조합 IV형 인간화 콜라겐으로서, 상기 반복 서열이 인간 천연 IV형 콜라겐의 기능영역 서열인 재조합 IV형 인간화 콜라겐을 제공한다. 본 발명은 아미노산 서열이 천연 인간 IV형 콜라겐에서 유래하여 인체에 투여해도 유해한 면역 반응을 일으키지 않고 인비트로에서 정확하게 발현될 수 있으며, 인비트로에서 생합성에 성공한 재조합 인간화 IV형 콜라겐의 아미노산 서열을 제공한다. 본 발명에서 제조된 재조합 IV형 인간화 콜라겐은 상품화된 인간 유래 콜라겐보다 높은 세포 접착 효과를 갖는다. 또한 본 발명에 의해 제공되는 제조방법은 간편하며 재조합 IV형 인간화 콜라겐을 저비용으로 고수율로 제조할 수 있다.

Description

생합성 인체구조성 재료의 제조방법

우선권 및 관련 출원

본원은 2022년 6월 1일에 중국특허청에 제출된, 출원번호가 202210619454.1이고 발명의 명칭이 "생합성 인체구조성 재료의 제조방법"인 중국특허출원의 우선권을 주장하고 그 모든 내용을 인용하여 여기에 원용한다.

본 발명은 바이오 기술 분야에 속하며, 구체적으로는 생합성 인체구조성 재료의 제조방법에 관한 것이다.

인체의 구조 재료는 주로 콜라겐을 포함하는 구조 단백질이고, 이러한 단백질은 세포나 조직에 대해 접착 기능이나 지지 기능을 가지며, 세포외 기질의 주요 구성 성분이다.

콜라겐은 인간의 결합 조직에 널리 분포하는 단백질로, 인체에 가장 다량으로 존재하는 단백질이기도 하며 전체 단백질의 25% 내지 35%를 차지한다. 현재, 인체에는 최소 28종의 콜라겐 서브 타입이 있으며, 각각 다른 조직·기관에 존재하는 것으로 알려져 있다. 그 중 IV형 콜라겐은 주로 간문맥 혈관영역, 중심 정맥 주위에 존재하는 것으로, 간의 굴모양혈관을 따라 분포하며 기저막 골격을 이루는 중요한 성분이고, 비섬유성 그물망 모양의 콜라겐 삼중 나선 구조로 세포외 기질 역할을 하며 세포를 지탱하는 기능을 갖는다. 콜라겐은 다른 고분자 재료에는 없는 생체조직 적합성을 갖춘 천연 생물 자원이기 때문에 중요한 인체 구조 재료로 이용할 수 있으며 하이엔드 의약업계에서 널리 사용되고 있다.

그러나 현재 콜라겐의 원료는 주로 동물 조직에서 추출되고 있으며, 안타깝게도 동물의 체내에서는 IV형 콜라겐 함유량이 낮아 IV형 콜라겐의 단일 성분을 추출하기가 불가능하다. 또한 동물 유래에 따른 면역 반응도 콜라겐의 용도가 한정되는 중요한 이유이다. 중국의 콜라겐 산업이 성장함에 따라 콜라겐을 얻기 위해 생합성 경로를 이용하는 것이 점점 성숙해지고 있으며, 특히 인간화 콜라겐은 이미 세계 최전선에 있다. 2021년 국가의약품감독관리국은 생합성 콜라겐의 명명 및 분류를 실시하였는데, 그 중 재조합 인간화 콜라겐이란, DNA 재조합 기술로 합성된 인간 콜라겐의 특정 유전자형에 의해 코딩된 아미노산 서열 전장 또는 일부 단편, 또는 인간 콜라겐의 기능성 단편을 포함하는 조합을 말한다.

생체에서 IV형 콜라겐은 비섬유상 삼중 나선 구조이며, 유전적으로 다른 6개의 α사슬 α1(IV) 내지 α6(IV)가 존재하고, 조직 내에서 3개의 다른 분자 형태, 즉 α1α1α2(IV), α3α4α5(IV), α5α5α6(IV)를 형성할 수 있으며, 이들은 서로 다른 단계의 특정 조직 내에서 선택적으로 다른 막 안에서 발현될 수 있다. 구조적 관점에서 볼 때, 인체의 천연 IV형 콜라겐은 구조가 매우 복잡하기 때문에 종래 수단으로는 인간화 콜라겐을 발현시켜 대량 제조하기가 매우 어렵다. 콜라겐의 합성 및 변형은 트로포콜라겐에서 시작해서 수산화, 글리코실화, 가교 등 많은 화학적 변화를 거쳐 다양한 생체 효소에 의해 복잡하게 제어된다. 트로포콜라겐에는 콜라겐 사슬 외에, 구(球)형 머리와 꼬리도 포함되어 있다. 이 머리와 꼬리가 없으면 콜라겐 사슬은 올바른 삼중 나선으로 접히지 않아 콜라겐으로서의 생물학적 활성이 결여된다. 따라서, 원래의 유전자 서열에 따라 제조된 콜라겐은 인비트로에서 자발적으로 조직화하여 올바른 공간 구조를 형성할 수 없다. 이러한 어려움은 인간화 콜라겐의 연구 개발 및 생산을 현저하게 저해하고 있다.

종래의 콜라겐 제조방법은 동물 유래 조직을 산, 알칼리, 효소 분해법으로 처리하여 콜라겐 유도체를 추출하는 방법이다. 이러한 방법으로 추출된 콜라겐 자체는 이미 본래의 생물학적 활성을 상실하여 생물의학 분야에 적용하여 본래의 기능을 발휘할 수 없다. 현대 생명공학의 발전에 따라, 동물, 식물, 미생물의 발현 시스템으로 재조합 인간 콜라겐을 제조하기 위해 트랜스제닉 기술을 이용하는 시도가 계속해서 이루어지고 있으며, 이로 인해 종래 추출 과정의 많은 단점이 해결되고 있다. 그러나 일부 연구 기관은 인간 B 세포에서 발현될 수 있는 수용체가 마우스에서는 발현되지 않는 점을 지적하며, 인간화 모델이 종래 마우스에서 얻지 못했던 발현을 제공할 수 있음을 시사하고 있다. 따라서, 이러한 단점을 극복하여 인체 구조 재료로 널리 사용할 수 있는 인간화 IV형 콜라겐 생합성 방법이 시급히 요구되고 있다.

본 발명은 천연 인간 IV형 콜라겐이 인비트로에서 제대로 발현되지 못해 대량 제조되지 못하는 문제를 해결하여, 인간화 콜라겐의 제조 및 적용에 새로운 가능성을 제공하기 위한 재조합 IV형 인간화 콜라겐 및 이의 생합성 제조방법, 그리고 이의 의약 분야에서의 사용을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 제1 양태는 재조합 IV형 인간화 콜라겐을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 인간 천연 IV형 콜라겐의 기능영역 서열을 스크리닝하여 이를 반복 서열로 하고, 상기 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 아미노산 서열이 n(n은 1 이상의 정수)개의 반복 서열, 즉 인간 천연 IV형 콜라겐의 기능영역 서열을 포함하도록 한다. 재조합 IV형 인간화 콜라겐은 인간 천연 IV형 콜라겐의 기능영역 서열로 이루어진다.

또한 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 수 있고, n이 2 이상의 정수인 경우, 각 반복 서열끼리 직접 연결되어 있다. 이에 따라, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3에 표시된 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 재조합 IV형 인간화 콜라겐을 얻을 수 있다.

또한 본 발명에서 제공되는 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 아미노산 서열은 실제 제조 공정에서 발현 및 정제를 용이하게 하기 위해 SEQ ID NO. 7에 표시된 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열을 더 포함해도 되고, 임의로 상기 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열은 상기 반복 서열에 직접 연결되어도 된다. TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열은 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 N 말단에 위치하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 상기 아미노산 서열을 코어 영역으로 하는 재조합 IV형 인간화 콜라겐을 제공한다.

본 발명의 제2 양태는 본 발명의 제1 양태에 기재된 재조합 IV형 인간화 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한 상기 폴리뉴클레오티드의 서열은 SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6에 표시된 서열, 또는 그 인위적 설계 및 코돈 최적화된 유도체를 포함해도 된다.

본 발명의 제3 양태는 본 발명의 제2 양태에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일련의 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 발명에서 선택되는 발현 벡터는 당업계의 종래 플라스미드(pET 시리즈), 셔틀 벡터 PNV 18.1, 파지 또는 바이러스 벡터 등과 같이, 원핵 세포 또는 진핵 세포의 다양한 숙주 내에서 안정적으로 존재하며 자율적으로 복제할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 벡터에 효소 소화나 라이게이션 등 분자생물학적 조작을 통해 본 발명의 제2 양태에 기재된 뉴클레오티드 서열을 벡터에 클로닝함으로써 구축된다.

본 발명의 제4 양태는 본 발명의 제3 양태에 기재된 재조합 발현 벡터를 포함하는 일련의 재조합 숙주 세포로서, 원핵 세포, 효모 또는 진핵 세포에서 선택되고, 또한 대장균, 로도코쿠스 러버(Rhodococcus rubber), 고초균, 효모균에서 선택될 수 있는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 제3 양태에 기재된 재조합 발현 벡터를 숙주 세포로 형질 전환시켜, 이러한 유전자 공학균이 얻어진다.

본 발명의 제5 양태는 본 발명의 제1 양태에 기재된 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 제조방법으로서, 아래의 공정이 포함될 수 있는 제조방법을 제공한다.

S1: 본 발명의 제4 양태에 기재된 재조합 숙주 세포를 발효 배양하여 단백질 발현을 유도하는 공정; 이 공정에서, 상기 발효 배양은 회전 속도 200~240rpm, 온도 35~38℃, 바람직하게는 회전 속도 220rpm, 바람직하게는 온도 37℃의 쉐이커 내에서 이루어질 수 있다. 또한 상기 단백질 발현 유도의 구체적인 절차는 16~30℃까지 온도를 낮추고 IPTG를 첨가해도 되며, 임의의 IPTG 사용 농도는 0.3~0.7mM, 바람직하게는 0.5mM이다.

S2: 상기 단백질을 채집하는 공정; 이 공정에서, 상기 단백질을 채집하는 구체적인 절차는 S1 공정에서 얻어진 혼합물을 4℃ 환경하에 5,000~7,000rpm으로 10~15분간 원심 분리하고, 20~30mM Tris, 150~250mM 염화나트륨 및 15~25mM 이미다졸을 포함하는 수용액을 이용해서 침전물을 재현탁하고, 고압으로 균질화하거나, 초음파로 세포를 파쇄한 후, 4℃ 환경하에 15,000~18,000rpm으로 20~40분간 원심 분리할 수 있다. 바람직하게는, 상기 단백질을 채집하는 구체적인 절차는 S1 공정에서 얻어진 혼합물을 4℃ 환경하에 6,000rpm으로 12분간 원심 분리하고, 25mM Tris, 200mM 염화나트륨 및 20mM 이미다졸을 포함하는 수용액을 이용해서 침전물을 재현탁하고, 15℃ 이하까지 온도를 낮추어 고압으로 균질화하거나, 초음파로 세포를 파쇄한 후, 4℃ 환경하에 17,000rpm으로 30분간 원심 분리할 수 있다.

S3: 상기 단백질을 정제하는 공정; 바람직하게는, 상기 공정은 Ni 친화 크로마토그래피 칼럼 및/또는 이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 이용해서 상기 단백질을 정제하는 것이 바람직하고, 임의로 상기 단백질을 효소 소화하는 것을 포함한다. TEV 프로테아제를 이용해서 상기 단백질을 효소 소화하는 것이 바람직하고, 상기 단백질과 상기 TEV 프로테아제의 질량비가 (15~25):1인 것이 보다 바람직하다.

또한 상기 S1 공정 전에, 상기 제조방법은 인간 천연형 IV 콜라겐의 기능영역을 스크리닝하는 공정, 재조합 발현 벡터 구축 공정, 재조합 숙주 세포 구축 공정을 더 포함해도 된다. 구체적으로, 상기 인간 천연 IV형 콜라겐의 기능영역을 스크리닝하는 공정의 구체적인 절차는 인간 천연 IV형 콜라겐의 헬릭스 영역에서 비(非)하전성 아미노산 모티브를 제외한 후, 컴퓨터 지원 단백질 구조 예측법을 통해 사슬 간 수소 결합 구조가 가장 많고 삼량체 응집 형태를 가장 안정화할 수 있는 잠재적인 헬릭스 기능영역을 스크리닝하고, 이어서 단백질 발현 특성 예측법을 통해 단백질 발현량이 가장 높고 정제가 용이하며 안정성이 좋은 인간 천연 IV형 콜라겐 기능영역을 스크리닝하고, 스크리닝을 통해 얻어진 인간 천연 IV형 콜라겐 기능영역의 아미노산 서열을 반복적으로 연결시키고, 필요에 따라 TEV 프로테아제로 절단 가능한 아미노산 서열을 부가함으로써, 본 발명의 제1 양태에 기재된 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 아미노산 서열을 얻은 후, 목적물인 코돈 우선성에 따라 상기 재조합 IV형 인간화 콜라겐을 코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 인위적으로 설계하여 최적화함으로써, 본 발명의 제2 양태에 기재된 뉴클레오티드 서열을 얻어 벡터로 클로닝하여 본 발명의 제3 양태에 기재된 재조합 발현 벡터를 구축하고, 상기 벡터를 숙주 세포로 형질 전환시켜 본 발명의 제4 양태에 기재된 재조합 숙주 세포를 얻을 수 있다.

본 발명의 제6 양태는 의료기기, 화장품, 건강식품 또는 의약품을 포함하는 제품의 제조에 있어서 본 발명의 제1 양태에 기재된 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 사용을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 다음과 같다.

[1] 아미노산 서열이 n(n은 1 이상의 정수)개의 반복 서열을 포함하는 재조합 IV형 인간화 콜라겐으로서,

상기 반복 서열이 인간 천연 IV형 콜라겐의 기능영역 서열이고,

바람직하게는, 상기 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이며, 여기서 n이 2 이상의 정수인 경우, 각 반복 서열끼리 직접 연결되어 있고,

보다 바람직하게는, 상기 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 아미노산 서열이 하기 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나를 포함하는, 재조합 IV형 인간화 콜라겐.

(i) SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3에 표시된 아미노산 서열,

(ii) SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3에 표시된 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수 개의 아미노산 잔기가 부가, 치환, 결실 또는 변형된 아미노산 서열이면서 인간 천연 IV형 콜라겐의 세포 접착 효과를 유지하고 있는 아미노산 서열,

(iii) 하기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, 인간 천연 IV형 콜라겐의 세포 접착 효과를 유지하고 있는 아미노산 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3에 표시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 엄격성 조건하에 혼성화되고, 상기 엄격성 조건이 중(中) 엄격성 조건, 중-고 엄격성 조건, 고(高) 엄격성 조건 또는 초고(超高) 엄격성 조건인, 아미노산 서열.

[2] 아미노산 서열이 추가로 SEQ ID NO. 7에 표시된 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 IV형 인간화 콜라겐으로서,

바람직하게는, 상기 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열과 상기 반복 서열이 직접 연결되어 있고,

바람직하게는, 상기 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열이 상기 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 N 말단에 위치하는, [1]에 기재된 재조합 IV형 인간화 콜라겐.

[3] [2]에 기재된 재조합 IV형 인간화 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서,

바람직하게는, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 6에 표시된 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.

[4] [3]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로서,

바람직하게는, 상기 재조합 발현 벡터가 pET 시리즈 벡터, 셔틀 벡터, 파지 또는 바이러스 벡터를 포함하고,

보다 바람직하게는, 상기 재조합 발현 벡터가 pET-28a-Trx-His인, 재조합 발현 벡터.

[5] [4]에 기재된 재조합 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포로서,

바람직하게는, 상기 재조합 숙주 세포가 원핵 세포, 효모 또는 진핵 세포이고,

보다 바람직하게는, 상기 숙주 세포가 대장균 BL21(DE3)인, 재조합 숙주 세포.

[6] [1] 또는 [2]에 기재된 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 제조방법으로서,

S1: [5]에 기재된 재조합 숙주 세포를 발효 배양하여 단백질 발현을 유도하는 공정;

S2: 상기 단백질을 채집하는 공정; 및

S3: 상기 단백질을 정제하는 공정을 포함하고,

Ni 친화 크로마토그래피 칼럼 및/또는 이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 이용해서 상기 단백질을 정제하는 것이 바람직하고,

임의로 상기 단백질을 효소 소화하는 것을 포함하며, TEV 프로테아제를 이용해서 상기 단백질을 효소 소화하는 것이 바람직하고, 상기 단백질과 상기 TEV 프로테아제의 질량비가 (15~25):1인 것이 보다 바람직한, 제조방법.

[7] 상기 S1 공정에서, 상기 발효 배양은 회전 속도 200~240rpm, 온도 35~38℃의 쉐이커 내에서 이루어지는, [6]에 기재된 제조방법.

[8] 상기 S1 공정에서, 상기 단백질 발현을 유도하는 구체적인 절차는 16~30℃까지 온도를 낮추어 IPTG를 첨가하고, 바람직하게는, 상기 IPTG의 사용 농도가 0.3~0.7mM인, [6] 또는 [7]에 기재된 제조방법.

[9] 상기 S2 공정에서, 상기 단백질을 채집하는 구체적인 절차는 S1 공정에서 얻어진 혼합물을 4℃ 환경하에 5,000~7,000rpm으로 10~15분간 원심 분리하고, 20~30mM Tris, 150~250mM 염화나트륨 및 15~25mM 이미다졸을 포함하는 수용액을 이용해서 침전물을 재현탁하고, 고압으로 균질화하거나, 초음파로 세포를 파쇄한 후, 4℃ 환경하에 15,000~18,000rpm으로 20~40분간 원심 분리하는, [6] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 제조방법.

[10] [1] 또는 [2]에 기재된 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 의료기기, 화장품, 건강식품 또는 의약품을 포함한 제품 제조에서의 사용.

상기 양태의 실시에 의해, 본 발명은 아미노산 서열이 천연 인간 IV형 콜라겐에서 유래하여 인체에 투여해도 유해한 면역 반응을 일으키지 않고, 인비트로에서 정확하게 발현될 수 있으며, 인비트로에서 생합성에 성공한 재조합 인간화 IV형 콜라겐의 아미노산 서열을 제공한다. 본 발명에서 제조된 재조합 IV형 인간화 콜라겐은 상품화된 인간 유래 콜라겐보다 높은 세포 접착 효과를 갖는다. 또한 본 발명에 의해 제공되는 제조방법은 간편하고, 재조합 IV형 인간화 콜라겐을 저비용으로 고수율로 제조할 수 있다.

도 1은 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C007의 발현 및 정제 과정에서의 전기 영동 검출 결과이다.
도 2는 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C4P7C6의 발현 및 정제 과정에서의 전기 영동 검출 결과이다.
도 3은 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C4P7E5의 발현 및 정제 과정에서의 전기 영동 검출 결과이다.
도 4는 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C4P7C6과 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C007의 발현 정제에 있어서 안정성을 비교한 결과이다.
도 5는 각 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐의 세포 접착 활성을 비교한 결과이다.
도 6은 pET-28a-Trx-His 발현 벡터의 벡터 맵이다.

이하, 본 발명의 실시형태에 대해 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서, "해도 된다"라는 용어는 어떠한 처리를 하는 경우와 하지 않는 경우 둘 다를 포함하는 의미이다.

본 발명에서, "임의의" 또는 "임의로"란, 다음에 설명하는 사태 또는 상황이 발생해도 되고 발생하지 않아도 되는 것을 의미하며, 이러한 설명은 이러한 사태가 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우 둘 다를 포함한다.

본 발명에서, "포함하다", "가지다" 또는 "함유하다"라는 용어는 포괄적이고 오픈 형식이며, 추가 열거되지 않은 요소 또는 방법 공정을 배제하는 것은 아니다. 한편, "포함하다", "가지다" 또는 "함유하다"는 추가 열거되지 않은 요소 또는 방법 공정을 배제하는 클로즈드 형식을 의미할 수도 있다.

본 발명에서, "수치 A~수치 B", "수치 A 이상", "수치 A 이하"로 표시되는 수치 범위는 한계값 A, B를 포함하는 범위를 의미한다.

본 발명에서, 임의의 수치는 그 값을 측정하는 데 사용되는 장치 또는 방법의 오차의 표준 편차를 포함한다. 본 발명을 정의하는 데 사용되는 수치 범위 및 파라미터는 모두 근사값이지만, 구체적인 실시예에 따른 수치를 가능한 한 정확하게 재현하고 있다. 그러나 모든 수치에는 본질적으로 상기 측정장치 또는 방법에 의한 표준 편차가 반드시 포함된다.

본 발명에서, "폴리펩티드", "단백질"이라는 용어는 호환적으로 공유 결합(예를 들면, 펩티드 결합)을 통해 연결된 일련의 적어도 2개의 아미노산 잔기를 의미하며, 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 직쇄상 또는 분기상일 수도 있고, 변형 아미노산을 포함할 수도 있고, 비(非)아미노산에 의해 중단될 수도 있다. 이 용어에는 예를 들면 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 표지 성분과의 컨쥬게이션 등, 다른 임의 조작을 통해 변형된 아미노산 폴리머도 포함된다.

본 발명에서, "아미노산"이라는 용어에는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및 이들의 D 및 L 입체 이성질체 모두가 포함될 수 있다.

본 발명에서, 아미노산 결실이란, 변경 후 서열이 본래 아미노산 서열의 활성을 전부 또는 부분적으로 유지하고 있다면, 아미노산 서열로부터 1개, 2개 또는 3개 이상의 아미노산을 결실시키는 것을 의미할 수 있다.

본 발명에서, 아미노산 부가란, 변경 후 서열이 본래 아미노산 서열의 활성을 전부 또는 부분적으로 유지하고 있다면, 아미노산 서열의 C 말단, N 말단, 또는 C 말단과 N 말단 사이 임의의 위치에 1개, 2개 또는 3개 이상의 아미노산을 부가하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명에서, 아미노산 치환이란, 변경 후 서열이 본래 아미노산 서열의 활성을 전부 또는 부분적으로 유지하고 있다면, 아미노산 서열의 임의 위치에서 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 것을 의미할 수 있다. 아미노산 치환이란, 보존적 아미노산 치환일 수도 있고, 원래 아미노산 서열과 비교하여 일부 아미노산이 동일한 특성을 갖는 아미노산으로 치환되어 펩티드(보존적 변이 펩티드)를 형성하는 것을 말한다. 예를 들면, 이러한 보존적 변이 펩티드는 아래의 아미노산 치환에 의해 생성될 수 있다: Val, Leu 또는 Ile에 의한 Ala의 치환, Lys, Gln, Asn 또는 His에 의한 Arg의 치환, Gln, His, Lys 또는 Arg에 의한 Asn의 치환, Glu 또는 Asn에 의한 Asp의 치환, Ser 또는 Ala에 의한 Cys의 치환, Asn 또는 Glu에 의한 Gln의 치환, Asp 또는 Gln에 의한 Glu의 치환, Ala에 의한 Gly의 치환, Asn, Lys, Gln 또는 Arg에 의한 His의 치환, Leu, Met, Ala, Val 또는 Phe에 의한 Ile의 치환, Ile, Met, Ala, Val 또는 Phe에 의한 Leu의 치환, Asn, Gln 또는 Arg에 의한 Lys의 치환, Ile, Leu 또는 Phe에 의한 Met의 치환, Leu, Val, Ile, Ala 또는 Tyr에 의한 Phe의 치환, Ala에 의한 Pro의 치환, Thr에 의한 Ser의 치환, Ser 또는 Val에 의한 Thr의 치환, Phe 또는 Tyr에 의한 Trp의 치환, Trp, Phe, Thr 또는 Ser에 의한 Tyr의 치환, 및 Phe, Ala, Met, Ile 또는 Leu에 의한 Val의 치환. 아미노산 치환은 비보존적 아미노산 치환이어도 된다.

본 발명에서, 아미노산 변형은 작용기의 변형, 분자 내 공유 결합(예를 들면, 측쇄 간의 고리 형성), 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 인산화, 아미노헥산화, 비오틴화와 같은 천연형 서열로의 변형을 포함할 수 있다.

본 발명에서, "혼성화"란, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 엄격성 조건하에 거의 상보적인 서열에 결합하면서, 이러한 조건하에 비상보적인 상대와의 사이에서 비특이적인 결합을 일으키지 않는 능력을 의미한다. 따라서, 상기 서열은 90~100% 상보적인 것이 바람직하다. 서로 특이적으로 결합할 수 있는 상보적 서열의 특성은 예를 들면 노던 블롯(northern blot)이나 서던 블롯(southern blot) 기술 또는 PCR이나 RT-PCR에서 프라이머 결합에 이용된다. 본 발명에 따르면, 혼성화는 중 엄격성 조건, 중-고 엄격성 조건, 고 엄격성 조건, 또는 초고 엄격성 조건하에 실행된다. 이러한 혼성화 조건은 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1~6.3.6에 기재되어 있다. 예를 들면, 구체적인 혼성화 조건은 아래와 같다. (1) 저(低) 엄격성 혼성화 조건이란, 6×염화나트륨/구연산나트륨(SSC)으로 약 45℃에서, 이어서 적어도 50℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS로 2회 세척하는 조건이다(저 엄격성 조건에서는 세척 온도를 55℃까지 상승시킬 수 있다); (2) 중(中) 엄격성 혼성화 조건이란, 6×SSC, 약 45℃에서, 이어서 60℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS로 1회 또는 복수회 세척하는 조건이다; (3) 고(高) 엄격성 혼성화 조건이란, 6×SSC, 약 45℃에서, 이어서 65℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS로 1회 또는 복수회 세척하는, 바람직한 조건이다; (4) 초고(超高) 엄격성 혼성화 조건이란, 0.5M 인산나트륨, 7% SDS로 65℃에서, 이어서 65℃에서 0.2×SSC, 1% SDS로 1회 또는 복수회 세척하는 조건이다.

본 발명에서, 적절한 벡터는 프로모터의 선택 및 인핸서 엘리먼트 등 다른 조절 엘리먼트를 포함하는, 벡터 구축 분야에서 알려져 있는 것이다. 본 발명에 따른 벡터는 세포 내 도입에 적합한 서열을 포함한다. 예를 들면, 벡터는 단백질의 코딩 서열이 그 자체의 시스 작용성 조절 엘리먼트에 의해 제어되는 발현 벡터일 수 있고, 숙주 세포에서 유전자 통합 또는 유전자 치환 등을 용이하게 하도록 설계된다. 당업자라면, 본 발명에서 "벡터"는 하나 또는 복수 개의 이종 또는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 플라스미드, 파지, 바이러스 또는 다른 벡터 등의 DNA 분자를 포함하는 것임을 이해할 것이다. 적절한 파지 및 바이러스 벡터는 λ-파지, EMBL 파지, 시미안 바이러스(simian virus), 소 유두종 바이러스, Epstein-Barr 바이러스, 아데노 바이러스, 헤르페스 바이러스, 마우스 육종 바이러스, 마우스 유방암 바이러스, 렌티바이러스 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서, 숙주 세포는 진균 및 효모 등의 진핵 세포일 수도 있고, 장내세균과 세균 등의 원핵 세포일 수도 있다.

본 발명에서, "인간 천연 IV형 콜라겐의 기능영역"이란, 인간 천연 IV형 콜라겐 α1에서, 콜라겐의 아미노산 서열이 갖는 세포 접착 활성 등의 기능을 갖는 서열 단편을 말한다.

본 발명에서 제공된 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐의 적용 분야는 생체 붕대, 인체 모방 재료, 성형외과 재료, 오가노이드 배양, 심혈관 스텐트, 코팅, 조직 주입 충전, 안과용 재료, 산부인과용 생체 재료, 신경 수복 재생, 간 조직 및 혈관 수복 재생, 3D 프린트 인공장기 생체 재료 등 하이엔드 의료기기의 제조; 하이엔드 화장품 원료, 하이엔드 건강식품 및 하이엔드 의약품용 첨가제 등을 포함한다.

실시예

본 발명은 아래 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 어떠한 실시예 또는 이들의 조합도 본 발명의 범위 또는 실시형태를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 규정된다. 당업자는 본 명세서 및 당업계의 상식에 기초하여, 특허청구범위에 의해 규정된 범위를 명확하게 이해할 수 있을 것이다. 당업자는 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않는 범위에서 본 발명의 기술적 해결책에 임의의 수정이나 변경을 가할 수 있으며, 이러한 수정 및 변경도 본 발명의 범위에 포함된다.

실시예에 구체적인 조건이 기재되지 않은 경우에는 일반적인 조건 또는 제조사가 권장하는 조건에 따라 실시된다. 제조사가 표시되지 않은 시약이나 기기는 모두 시중에서 구입할 수 있는 통상적인 제품이다. 본 발명을 보다 잘 설명하기 위해, 아래의 구체적인 실시형태에 수많은 구체적 세부사항이 기재되어 있다. 당업자라면, 이러한 세부사항 없이도 본 발명이 실시될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 다른 실시형태에서는 본 발명의 요지를 명확히 하기 위해 당업자에게 주지의 방법, 수단, 장치 및 공정에 대해 상세하게 설명하지 않는다.

특별히 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 특별히 언급하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 단위는 모두 국제 표준 단위이며, 본 발명에 표시된 수치 및 수치 범위에는 불가피한 계통적 오차가 포함되는 것으로 이해해야 한다.

실시예 1: 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐의 구축 및 발현

1. 대규모 단백질 기능영역 스크리닝 실시

1) 서열 스크리닝: 천연 IV형 콜라겐의 헬릭스 영역의 Gly-X-Y 반복 서열에는 대량의 하전 아미노산이 포함되어 있으며, 이러한 전하가 상호작용을 통해 세포에 결합하므로 이러한 중요한 전하 모티브들을 포함하지 않는 영역을 제외하였다. 2) 컴퓨터 지원 단백질 구조 예측법을 통해, 사슬 간 수소 결합 구조가 가장 많고 삼량체 응집 형태를 가장 안정화할 수 있는 잠재적인 헬릭스 기능영역을 스크리닝하였다. 3) 단백질 발현 특성 예측법을 통해, 단백질 발현량이 가장 많고 정제가 용이하며 안정성이 좋은 인간 IV형 콜라겐 기능영역을 스크리닝하였다. 4) 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 분자량이 일정 범위 내에 있고 정제 및 안정화가 용이하도록, 스크리닝을 통해 얻어진 영역에 있는 아미노산 단편을 n회 반복하여 직접 연결시켜 최적화함으로써, 최종적으로 다음과 같은 각 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 목적 단편을 얻었다.

(1) 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C007의 아미노산 서열:

GQKGDQGEKGQIGPIGEKGSRGDPGTPGVPGKDGQAGQPGQPGPKGDPGISGTPGAPGLPGPKGSVGGMGLPGTPGEKGVPGIPGPQGSPGLPGDKGAKGEKGQAGPPGIGIPGLRGEKGDQGIAGFPGSPGEKGEKGSIGIPGMPGSPGLKGSPGSVGYPGSPGLPGEKGDKGLPGLDGIPGVKGEAGLPGTPGPTGPAGQKGEPGSDGIPGSAGEKGEPGLPGRGFPGFPGAKGDKGSKGEVGFPGLAGSPGIPGSKGEQGFMGPPGPQGQPGLPGSPGHATE(SEQ ID NO. 1)；

(2) 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C4P7C6의 아미노산 서열:

GFPGFPGAKGDKGSKGEVGFPGLAGSPGIPGSKGEQGFMGPPGPQGQPGLPGSPGHAGFPGFPGAKGDKGSKGEVGFPGLAGSPGIPGSKGEQGFMGPPGPQGQPGLPGSPGHAGFPGFPGAKGDKGSKGEVGFPGLAGSPGIPGSKGEQGFMGPPGPQGQPGLPGSPGHAGFPGFPGAKGDKGSKGEVGFPGLAGSPGIPGSKGEQGFMGPPGPQGQPGLPGSPGHAGFPGFPGAKGDKGSKGEVGFPGLAGSPGIPGSKGEQGFMGPPGPQGQPGLPGSPGHAGFPGFPGAKGDKGSKGEVGFPGLAGSPGIPGSKGEQGFMGPPGPQGQPGLPGSPGHA(SEQ ID NO. 2)；

(3) 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C4P7E5의 아미노산 서열:

GLPGTPGPTGPAGQKGEPGSDGIPGSAGEKGEPGLPGRGFPGFPGAKGDKGSKGEVGFPGLAGSPGIPGSKGEQGFMGLPGTPGPTGPAGQKGEPGSDGIPGSAGEKGEPGLPGRGFPGFPGAKGDKGSKGEVGFPGLAGSPGIPGSKGEQGFMGLPGTPGPTGPAGQKGEPGSDGIPGSAGEKGEPGLPGRGFPGFPGAKGDKGSKGEVGFPGLAGSPGIPGSKGEQGFMGLPGTPGPTGPAGQKGEPGSDGIPGSAGEKGEPGLPGRGFPGFPGAKGDKGSKGEVGFPGLAGSPGIPGSKGEQGFM(SEQ ID NO. 3).

본 발명의 재조합 IV형 인간화 콜라겐은 발현 시 그 N 말단에 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열 ENLYFQ(SEQ ID NO. 7)를 부가할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열과, 상기 인간 천연 IV형 콜라겐의 기능영역 서열이 직접 연결되어 있다.

2. 합성된 폴리뉴클레오티드 단편을 각각 pET-28a-Trx-His 발현 벡터(벡터 맵은 도 6에 도시)에 삽입하여, 대응하는 재조합 발현 플라스미드를 얻었다. 여기서, 각 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐의 폴리뉴클레오티드 단편은 아래와 같다.

(1) N 말단에 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열을 부가한 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C007의 폴리뉴클레오티드 서열:

GAAAACCTGTATTTCCAGGGTCAGAAAGGAGATCAAGGAGAAAAAGGACAGATAGGACCAATAGGAGAAAAAGGGAGCCGGGGAGATCCGGGAACACCGGGAGTGCCGGGAAAAGATGGACAGGCAGGCCAGCCGGGACAGCCGGGTCCTAAAGGAGATCCGGGTATAAGCGGAACACCGGGTGCACCGGGATTACCTGGTCCGAAAGGGAGCGTAGGGGGAATGGGACTGCCGGGAACACCTGGTGAAAAAGGCGTACCTGGTATTCCGGGTCCTCAGGGGTCCCCGGGACTGCCTGGTGATAAAGGTGCAAAAGGGGAAAAAGGGCAAGCAGGTCCGCCGGGTATTGGTATACCGGGTCTGCGTGGGGAAAAAGGTGATCAGGGTATTGCCGGTTTTCCGGGTAGCCCGGGTGAGAAAGGTGAAAAAGGAAGTATAGGAATACCGGGTATGCCTGGTAGTCCGGGTCTGAAAGGTAGCCCGGGAAGCGTGGGGTATCCGGGTAGCCCTGGTCTGCCTGGGGAAAAAGGCGATAAAGGTCTGCCGGGTCTGGACGGTATTCCTGGTGTTAAAGGGGAAGCAGGTCTGCCGGGGACCCCGGGTCCAACAGGTCCTGCAGGGCAGAAAGGTGAACCAGGTAGCGATGGTATTCCGGGGTCTGCGGGGGAAAAAGGAGAACCGGGTCTGCCGGGAAGAGGTTTTCCGGGCTTTCCGGGTGCAAAAGGAGATAAGGGTAGCAAAGGCGAAGTGGGTTTTCCGGGACTGGCAGGTAGTCCGGGAATCCCTGGTAGCAAAGGTGAACAGGGTTTTATGGGGCCGCCGGGTCCGCAGGGTCAGCCTGGTTTACCGGGTAGCCCAGGTCATGCGACAGAG(SEQ ID NO. 4)；

(2) N 말단에 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열을 부가한 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C4P7C6의 폴리뉴클레오티드 서열:

GAAAATCTATATTTCCAAGGATTTCCCGGGTTCCCGGGTGCAAAAGGCGACAAGGGTTCGAAAGGCGAAGTTGGCTTCCCGGGATTAGCGGGTAGCCCAGGTATCCCGGGTTCTAAGGGTGAACAGGGTTTCATGGGTCCGCCCGGCCCACAGGGTCAACCGGGCCTGCCTGGTAGCCCGGGTCATGCGGGCTTTCCAGGTTTCCCGGGCGCGAAAGGCGACAAAGGTAGCAAGGGCGAAGTCGGTTTTCCGGGCCTTGCTGGCAGCCCGGGCATCCCGGGGTCCAAGGGCGAGCAAGGATTCATGGGTCCGCCTGGCCCACAAGGCCAACCGGGTTTGCCGGGCTCTCCGGGTCACGCCGGTTTTCCGGGATTCCCGGGAGCGAAAGGTGATAAGGGCTCCAAAGGTGAGGTGGGTTTTCCGGGCTTGGCTGGCAGCCCGGGTATTCCGGGTAGCAAGGGCGAGCAGGGTTTTATGGGCCCGCCTGGTCCGCAGGGCCAACCGGGGCTGCCGGGCTCCCCGGGCCACGCAGGCTTCCCAGGTTTTCCGGGTGCGAAAGGCGATAAAGGTAGTAAGGGTGAAGTGGGCTTCCCGGGTCTCGCGGGTAGCCCGGGTATTCCGGGCTCGAAGGGCGAACAGGGCTTTATGGGCCCACCGGGTCCGCAGGGTCAGCCGGGCCTGCCGGGTAGCCCGGGCCACGCGGGTTTCCCGGGCTTCCCGGGTGCCAAAGGCGATAAAGGTTCAAAGGGGGAGGTGGGTTTTCCGGGTCTGGCAGGCAGCCCGGGCATCCCGGGCAGCAAGGGCGAACAAGGTTTTATGGGTCCGCCTGGACCGCAAGGTCAGCCGGGCCTGCCGGGTAGTCCGGGCCATGCCGGCTTCCCGGGTTTTCCGGGTGCGAAAGGGGACAAAGGCAGCAAGGGAGAGGTTGGTTTCCCAGGCCTGGCTGGTAGCCCGGGTATTCCGGGCTCCAAGGGTGAGCAGGGTTTCATGGGTCCGCCTGGCCCACAGGGTCAACCTGGCCTGCCGGGTTCTCCGGGTCATGCG(SEQ ID NO. 5)；

(3) N 말단에 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열을 부가한 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C4P7E5의 폴리뉴클레오티드 서열:

GAAAATTTATATTTTCAAGGGCTACCCGGAACGCCAGGTCCAACTGGTCCGGCGGGCCAAAAAGGCGAGCCGGGGTCGGACGGCATCCCGGGTAGCGCAGGCGAAAAAGGTGAACCGGGCCTGCCGGGCCGTGGCTTCCCGGGCTTCCCGGGAGCGAAAGGCGATAAAGGCAGCAAGGGCGAGGTGGGTTTTCCGGGATTGGCTGGTAGCCCGGGGATTCCGGGCTCCAAGGGCGAGCAGGGTTTTATGGGTCTGCCGGGAACCCCAGGTCCGACCGGTCCGGCGGGTCAGAAAGGTGAACCGGGTAGCGACGGCATTCCGGGCAGCGCGGGTGAAAAAGGTGAACCGGGTTTGCCGGGTCGCGGTTTTCCGGGTTTCCCGGGTGCTAAAGGCGACAAAGGTTCCAAGGGTGAAGTTGGTTTTCCGGGACTGGCGGGCAGCCCGGGCATCCCAGGCTCCAAGGGCGAACAAGGCTTTATGGGTCTGCCGGGCACCCCGGGTCCGACCGGTCCTGCGGGTCAAAAGGGTGAGCCGGGTAGCGATGGTATTCCGGGCTCTGCTGGCGAGAAAGGTGAGCCGGGCCTGCCGGGCCGTGGTTTCCCGGGATTCCCTGGTGCCAAGGGTGACAAGGGTTCGAAGGGCGAGGTTGGTTTTCCGGGCCTGGCGGGTTCTCCGGGTATCCCGGGTAGCAAGGGGGAGCAGGGTTTTATGGGCTTACCGGGAACCCCGGGCCCAACGGGTCCGGCAGGTCAGAAAGGGGAACCGGGCAGCGATGGTATCCCGGGCAGTGCCGGTGAGAAGGGCGAGCCGGGCCTGCCCGGCCGTGGTTTCCCTGGTTTCCCGGGTGCAAAAGGTGATAAAGGTTCCAAGGGCGAAGTGGGTTTCCCGGGTCTCGCGGGCAGCCCGGGCATTCCGGGGTCTAAGGGTGAGCAGGGTTTCATG(SEQ ID NO. 6).

3. 성공적으로 구축된 발현 플라스미드를 대장균 컴피턴트 세포 BL21(DE3)로 형질 전환하였다. 구체적인 절차는 아래와 같다. (1) 초저온 냉장고에서 대장균의 컴피턴트 세포 BL21(DE3)을 꺼내 얼음 위에 두고, 반해동한 상태로 형질 전환될 플라스미드 2μL를 취해 대장균 컴피턴트 세포 BL21(DE3)에 첨가하여 2~3회 가볍게 섞었다. (2) 혼합물을 얼음 위에서 30분간 빙욕(ice bath)에 둔 다음, 42℃의 수욕에서 45~90초간 히트 쇼크하여 꺼낸 후, 얼음 위에서 2분간 빙욕에 두었다. (3) 바이오 세이프티 캐비닛으로 옮겨 액체 LB 배지 700μL를 첨가한 후, 37℃, 220rpm의 조건으로 60분간 배양하였다. (4) 균액을 200μL 취하여 황산 카나마이신을 포함하는 LB 플레이트에 균일하게 도포하였다. (5) 균일한 크기의 콜로니가 자랄 때까지 플레이트를 37℃의 인큐베이터에서 15~17시간 배양하였다.

4. 형질 전환된 LB 플레이트에서 5~6개의 싱글 콜로니를 픽업하여 항생물질 원액(황산 카나마이신 100mg/L)이 들어 있는 진탕 플라스크로 옮겨 220rpm, 37℃의 항온 쉐이커에서 안개 상태가 될 때까지 일정 시간 배양하였다. 다음으로 배양 후 진탕 플라스크를 16~30℃까지 식히고 IPTG(최종 농도 0.5mM)를 첨가하여 일정 기간 발현을 유도한 뒤, 균액을 원심병에 분주하여 6,000rpm, 4℃에서 12분간 원심 분리한 뒤, 균체를 회수하여 균의 무게를 기록하고 샘플을 채취하여 전기 영동 측정을 실시하였다(샘플명은 "균액"으로 기재).

5. 회수한 균체를 평형화 용액(200mM 염화나트륨, 25mM Tris, 20mM 이미다졸)으로 재현탁시켜 균액을 15℃ 이하로 온도를 낮추고 2회 균질화하거나 초음파로 세포를 파쇄한 후 균액을 회수하여 전기 영동 측정을 실시하였다(샘플명은 각각 "균일(均一)", "균이(均二)" 또는 "초음파"라고 기재). 세포 파쇄 후의 균액을 원심병에 분주하고 17,000rpm, 4℃에서 30분간 원심 분리하여 상청액을 회수하고, 상청액과 침전을 취하여 전기 영동 측정을 실시하였다(샘플명은 각각 "상청액"과 "침전"으로 기재).

6. 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐을 정제 및 효소 소화하였으며, 구체적인 절차는 아래와 같다.

(1) 크루드 정제:

a. 칼럼 충전재의 평형화: 칼럼 충전재의 평형화 용액(200mM 염화나트륨, 25mM Tris, 20mM 이미다졸)을 이용해서 유속 10mL/min로 평형화하였다.

b. 샘플 주입: 액체가 다 흐를 때까지 유속 5mL/min로 원심 후의 상청액을 칼럼 충전재에 첨가하고, 플로우 스루를 취하여 전기 영동 측정을 실시하였다(샘플명은 "플로우 스루"로 기재).

c. 불순 단백질 세척: 액체의 흐름이 끝날 때까지 세척액 100mL(200mM 염화나트륨, 25mM Tris, 20mM 이미다졸)를 유속 10mL/min로 첨가하고 불순물 세척의 플로우 스루를 취하여 전기 영동 측정을 실시하였다(샘플명은 "불순물 세척"으로 기재).

d. 목적 단백질 회수: 용출액 20mL(염화나트륨 200mM, Tris 25mM, 250mM 이미다졸)를 유속 10mL/min로 첨가하여 플로우 스루액을 회수하고, 자외가시분광광도법으로 단백질 농도를 측정하여 식(C(mg/mL)=A280×희석배수×소쇠 계수)으로 단백질 농도를 산출하고 전기 영동 측정을 실시하였다(샘플명은 "용출"로 기재).

e. 1M 이미다졸 작업액을 이용해서 칼럼 충전재를 유속 10mL/min로 세척하고, 플로우 스루에 대해 전기 영동 측정을 실시하였다(샘플명은 "1M 세척"으로 기재).

(2) 효소 소화: 단백질의 총 질량과 TEV 효소의 총 질량비가 20:1이 되도록 TEV 효소를 첨가하고 16℃에서 2시간 동안 효소 소화한 후, 소화 전후 샘플을 채취하여 전기 영동 측정을 실시하였다(샘플명은 각각 "소화 전" 및 "소화 후"로 기재). 효소 소화 후의 단백질액을 투석백에 넣고 4℃에서 2시간 투석한 후, 새로운 투석액(20mM 염화나트륨, 20mM Tris)으로 옮겨 4℃에서 하룻밤 투석하고, 단백질액 샘플을 채취하여 전기 영동 측정을 실시하였다(샘플명은 "액 교체 후"로 기재).

(3) 정제:

a. 칼럼 충전재의 평형화: A액(20mM Tris, 20mM 염화나트륨)을 이용해서 칼럼 충전재를 유속 10mL/min로 평형화하였다.

b. 샘플 주입: 유속 5mL/min로 샘플을 주입하여 플로우 스루를 회수하고 전기 영동 측정을 실시하였다(샘플명은 "FL"로 기재).

c. 구배 용출: 각각 0~15% B액 수용액을 2분간 설정한 후 3CV 유지하고, 15~30% B액 수용액을 2분간 설정한 후 3CV 유지하고, 30~50% B액 수용액을 2분간 설정한 후 3CV 유지하였다. 여기서 B액은 1M 염화나트륨과 20mM Tris를 포함하며, 상기 비율은 체적분율이다. 피크를 수집하여 전기 영동 측정을 실시하였다(샘플명은 "B 용출"로 기재).

d. 칼럼 충전재를 세척하였다.

e. 목적 단백질 함유량을 측정하여 단백질 수율을 계산하고 단백질을 4℃ 환경에서 보관하였다.

(4) 물 교체: 회수한 단백질액을 10kDa의 한외여과 농축 튜브에 넣고 3,500rpm으로 15분간 원심 분리하는 것에 기초한 농축·물 교체를 3회 반복하여 전기 영동 측정을 실시하였다(샘플명은 "물 교체"로 기재).

7. 시험 결과: 각 재조합 단백질 제조 과정에서의 전기 영동 검출 결과를 도 1 내지 도 3에 도시하였다. 도 4는 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C4P7C6과 C007의 발현 정제에 있어서 안정성을 비교한 결과이다.

여기서 도 1 및 도 4의 일부는 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C007의 전기 영동 검출 결과로, 정제 및 효소 소화 효과가 양호함을 알 수 있었다.

도 2 및 도 4의 일부는 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C4P7C6의 전기 영동 검출 결과로, 정제 및 효소 소화 효과가 양호함을 알 수 있었다.

도 3은 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C4P7E5의 전기 영동 검출 결과로, 정제 및 효소 소화 효과가 양호함을 알 수 있었다.

실시예 2: 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐의 생물 활성 측정

콜라겐 활성 측정방법은 문헌 Juming Yao, Satoshi Yanagisawa, Tetsuo Asakura, Design, Expression and Characterization of Collagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived from Native Collagens, J Biochem. 136, 643-649(2004)를 참조할 수 있다. 구체적인 방법은 아래와 같다.

(1) 자외 흡수법을 이용해서, 상품화된 인간 콜라겐(Sigma, C7774)(양성 대조), 본 발명에서 제공된 정제 및 효소 소화 효과가 양호한 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐 C4P7C6, C4P7E5, C007을 포함하는 대상 단백질 샘플의 농도를 측정하였다.

구체적으로는 샘플의 215nm 및 225nm에서의 자외 흡수를 각각 측정하고 경험식 C(μg/mL)=144×(A215-A225)로 단백질 농도를 계산하였다. 한편, A215<1.5일 때 검출해야 한다. 이 방법의 원리는 원자외광하에 펩티드 결합의 특징적 흡수를 측정하는 것으로, 발색단 함유량의 영향을 받지 않고 간섭 물질이 적으며 조작이 간단하고 쿠마시 브릴리언트 블루 발색이 불가능한 인간 콜라겐 및 그 유사체 검출에 적합하다(참고문헌: Walker JM. The Protein Protocols Handbook, second edition. HumanaPress. 43-45.). 단백질 농도를 측정한 후, PBS로 모든 측정 대상의 단백질 농도를 0.5mg/ml로 조정하였다.

(2) 96-웰 플레이트에 각종 단백질 용액 및 블랭크 PBS 대조 용액을 100μL 첨가하고 실온에서 60분간 정치하였다.

(3) 각 웰에 배양 상태가 좋은 3T3 세포를 10⁵개씩 넣고 37℃에서 60분간 인큐베이션하였다.

(4) 각 웰을 PBS로 4회 세척하였다.

(5) LDH 검출 키트(Roche, 04744926001)를 이용해서 OD_492nm의 흡광도를 검출하였다. 블랭크 대조의 수치로부터 세포 접착률을 계산할 수 있다. 계산식은 세포 접착률=(시험 웰-블랭크 웰)×100%/(양성 웰-블랭크 웰)이다. 세포 접착률은 콜라겐의 활성을 반영할 수 있다. 단백질 활성이 높을수록 단시간에 세포 벽에 접착하는 데 도움이 되는 좋은 외부 환경을 제공할 수 있다.

결과를 도 5에 도시하였다. 본 발명의 재조합 IV형 인간화 콜라겐은 상품화된 인간 콜라겐에 비해 보다 우수한 생물 접착 활성을 가진다. 즉, 재조합 IV형 인간화 콜라겐 C4P7C6>C007>C4P7E5>인간 콜라겐임을 알 수 있었다.

실시예 3: 재조합 Ⅳ형 인간화 콜라겐의 질량 분석에 의한 검출

단백질 샘플을 DTT 환원 및 요오드아세트아미드알킬화 처리한 후, 트립신을 첨가하여 하룻밤 효소 분해시켰다. 효소 분해 후 얻어진 펩티드 단편을 추가로 C18ZipTip으로 탈염한 후, 플레이트 상에서 매트릭스의 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)와 혼합하였다. 마지막으로 매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화-비행시간형 질량분석장치 MALDI-TOF/TOF UlraflextremeTM, Brucker, Germany를 이용해서 분석하였다(펩티드 매스 핑거프린팅 기술에 대해서는 Protein J. 2016; 35: 212-7을 참조).

데이터베이스 검색은 로컬 mascot 사이트의 MS/MS Ion Search 웹 페이지에서 처리되었다. 단백질 식별 결과는 효소 분해 후에 생성된 펩티드 단편의 1차 질량 분석을 기반으로 얻어진 것이다. 검색 파라미터: Trypsin 효소 분해, 2개의 결락된 절단 부위를 설정하였다. 시스테인의 알킬화는 규정 변형, 메티오닌의 산화는 임의 변형으로 하였다. 식별에 이용한 데이터베이스는 NCBprot이다.

검출 결과, 폴리펩티드 단편의 피복률은 75.08%였으며, 매우 신뢰성이 높은 검출 결과였다.

검출 결과, 폴리펩티드 단편의 피복률은 100%였으며, 매우 신뢰성이 높은 검출 결과였다.

검출 결과, 폴리펩티드 단편의 피복률은 100%였으며, 매우 신뢰성이 높은 검출 결과였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

1. 아미노산 서열이 n(n은 1 이상의 정수)개의 반복 서열을 포함하는 재조합 IV형 인간화 콜라겐으로서,
   상기 반복 서열이 인간 천연 IV형 콜라겐의 기능영역 서열이고,
   바람직하게는, 상기 n이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, 여기서 n이 2 이상의 정수인 경우, 각 반복 서열끼리 직접 연결되어 있고,
   보다 바람직하게는, 상기 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 아미노산 서열이 하기 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 IV형 인간화 콜라겐:
   (i) SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3에 표시된 아미노산 서열,
   (ii) SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3에 표시된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산 잔기가 부가, 치환, 결실 또는 변형된 아미노산 서열이면서, 인간 천연 IV형 콜라겐의 세포 접착 효과를 유지하고 있는 아미노산 서열,
   (iii) 하기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, 인간 천연 IV형 콜라겐의 세포 접착 효과를 유지하고 있는 아미노산 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3에 표시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 엄격성 조건하에 혼성화하고, 상기 엄격성 조건이 중(中) 엄격성 조건, 중-고 엄격성 조건, 고(高) 엄격성 조건 또는 초고(超高) 엄격성 조건인, 아미노산 서열.
2. 청구항 1에 있어서,
   아미노산 서열이 추가로 SEQ ID NO. 7에 표시된 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 IV형 인간화 콜라겐으로서,
   바람직하게는, 상기 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열과 상기 반복 서열이 직접 연결되어 있고,
   바람직하게는, 상기 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열이 상기 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 N 말단에 위치하는 것을 특징으로 하는, 재조합 IV형 인간화 콜라겐.
3. 청구항 2에 기재된 재조합 IV형 인간화 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서,
   바람직하게는, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 또는 SEQ ID NO. 6에 표시된 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
4. 청구항 3에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로서,
   바람직하게는, 상기 재조합 발현 벡터가 pET 시리즈 벡터, 셔틀 벡터, 파지 또는 바이러스 벡터를 포함하고,
   보다 바람직하게는, 상기 재조합 발현 벡터가 pET-28a-Trx-His인 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
5. 청구항 4에 기재된 재조합 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포로서,
   바람직하게는, 상기 재조합 숙주 세포가 원핵 세포, 효모 또는 진핵 세포이고,
   보다 바람직하게는, 상기 재조합 숙주 세포가 대장균 BL21(DE3)인 것을 특징으로 하는, 재조합 숙주 세포.
6. 청구항 1 또는 2에 기재된 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 제조방법으로서,
   S1: 청구항 5에 기재된 재조합 숙주 세포를 발효 배양하여 단백질 발현을 유도하는 공정;
   S2: 상기 단백질을 채집하는 공정; 및
   S3: 상기 단백질을 정제하는 공정을 포함하고,
   Ni 친화 크로마토그래피 칼럼 및/또는 이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 이용해서 상기 단백질을 정제하는 것이 바람직하고,
   임의로 상기 단백질을 효소 소화하는 것을 포함하며, TEV 프로테아제를 이용해서 상기 단백질을 효소 소화하는 것이 바람직하고, 상기 단백질과 상기 TEV 프로테아제의 질량비가 (15 내지 25):1인 것이 보다 바람직한, 제조방법.
7. 청구항 6에 있어서,
   상기 S1 공정에서, 상기 발효 배양은 회전 속도 200 내지 240rpm, 온도 35 내지 38℃의 쉐이커 내에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
8. 청구항 6 또는 7에 있어서,
   상기 S1 공정에서, 상기 단백질 발현을 유도하는 구체적인 절차는 16 내지 30℃까지 온도를 낮추어 IPTG를 첨가하고, 바람직하게는 상기 IPTG의 사용 농도가 0.3 내지 0.7mM인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
9. 청구항 6 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 S2 공정에서, 상기 단백질을 채집하는 구체적인 절차는 S1 공정에서 얻어진 혼합물을 4℃ 환경하에 5,000 내지 7,000rpm으로 10 내지 15분간 원심 분리하고, 20 내지 30mM Tris, 150 내지 250mM 염화나트륨 및 15 내지 25mM 이미다졸을 포함하는 수용액을 이용해서 침전물을 재현탁하고, 고압으로 균질화하거나 초음파로 세포를 파쇄한 후, 4℃ 환경하에 15,000 내지 18,000rpm으로 20 내지 40분간 원심 분리하는, 제조방법.
10. 청구항 1 또는 2에 기재된 재조합 IV형 인간화 콜라겐의 의료기기, 화장품, 건강식품 또는 의약품을 포함하는 제품 제조에서의 사용.