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CN116478274B - 一种生物合成人体结构性材料的制备方法 - Google Patents

一种生物合成人体结构性材料的制备方法 Download PDF

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CN116478274B CN202210849498.3A CN202210849498A CN116478274B CN 116478274 B CN116478274 B CN 116478274B CN 202210849498 A CN202210849498 A CN 202210849498A CN 116478274 B CN116478274 B CN 116478274B
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Abstract

提供了一种生物合成人体结构性材料的制备方法。本发明的多肽，其包含(重复单元)n或(重复单元)n‑C端区的结构，该重复单元包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列。本发明制备得到的重组Ⅴ型人源化胶原蛋白具有高促进细胞黏附的活性，应用于人体不会产生免疫反应，且其制备方法新颖，可大规模获得重组Ⅴ型人源化胶原蛋白，在人体结构性材料制备方面得到广泛应用。其应用领域包含高端医疗器械制备，如生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养、心血管支架、涂层、组织注射填充、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生、肝脏组织及血管修复再生、3D打印人造器官生物材料等。

Description

一种生物合成人体结构性材料的制备方法
技术领域
本发明属于合成生物技术领域，涉及一种人体结构性材料的生物合成制备方法。
背景技术
人体结构性材料主要是包含胶原蛋白在内的结构性蛋白，这类蛋白对细胞、组织具有黏附、支撑功能，是主要的细胞外基质组成成分。胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体含量最多的蛋白质，可以占到蛋白质总量的25％～35％，目前发现人体至少有28种胶原蛋白亚型，分别位于不同组织器官。其中Ⅴ型胶原蛋白属于纤维状胶原蛋白，常常伴随着Ⅰ型胶原蛋白表达，但含量较少，具有独特的生理功能，如：抑制表皮、内皮、平滑肌、癌细胞的粘附和增值，结合肝素、胰岛素、骨矿化结合素、血管内皮抑制因子、巨噬细胞集落刺激因子等生物活性物质，可用于医药、材料和生物医学领域。
近年来，人们主要从多种水产品或胎盘、肾等组织中提取出Ⅴ型胶原蛋白粗品。遗憾的是，Ⅴ型胶原蛋白在生物体内含量较低，属于次要胶原蛋白，提取过程较为复杂。同时，动物源性免疫反应也是导致胶原蛋白在应用中受限的重要原因。随着我国胶原蛋白产业的日益壮大，利用生物合成路径获得胶原蛋白日趋成熟，尤其是人源化胶原蛋白已经走在世界前列。2021年国家药监局对生物合成胶原蛋白做了命名分类，其中，重组人源化胶原蛋白是指由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。
Ⅴ型胶原蛋白最早于人的胎盘和皮肤中被发现，含有三条不同强度、移动性的α链，会在组织中形成四种不同的亚型，即α1α1α2(Ⅴ)、α1α2α3(Ⅴ)、α3α3α3(Ⅴ)、Ⅴ型胶原蛋白α链和Ⅺ型胶原蛋白的α链的混合。三条不同的α链组成三股绳状的前胶原蛋白分子，经细胞外的酶切处理后组装成细长的胶原纤维。细长的纤维在细胞周围的空间相互交联，交联后形成高强度的成熟Ⅴ型胶原蛋白纤维网；或者与Ⅺ型胶原蛋白等其他类型的胶原蛋白组成异三聚体，分布于角膜、皮肤、韧带、骨骼、肌腱、肌肉等部位。Ⅴ型胶原蛋白具有纤维状胶原蛋白的共同结构特征，在中央区域有一个超过1000个甘氨酸-Xaa-Yaa不间断的序列，其中Xaa-Yaa是任何氨基酸或者亚氨基酸残基。从结构上来说，人体天然的Ⅴ型胶原蛋白的结构非常复杂，所以才导致人源化胶原蛋白难以通过常规的手段表达和大量制备。
目前生产Ⅴ型胶原蛋白主要是通过胃蛋白酶来处理动物来源的组织，提取胶原蛋白衍生物。但是，这些方法提取的胶原蛋白已丧失了原本的生物学活性，无法发挥该胶原蛋白真正的功能。随着现代生物技术的发展，人们通过转基因技术目，已经可以在动物、植物、微生物表达体系中制备重组人源化胶原蛋白，解决了酶解法的缺点。但是目前，还未成功制备得到重组Ⅴ型人源化胶原蛋白。所以，亟需一种重组Ⅴ型人源化胶原蛋白的生物合成方法，使其作为人体结构性材料得到广泛应用。
发明内容
针对现有技术存在的技术问题，发明人首次设计了一种重组Ⅴ型人源化胶原蛋白的功能区筛选和蛋白合成工艺。发明人找到了Ⅴ型胶原蛋白的核心区的氨基酸序列(SEQID NO.1，gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpv)，并且以该核心区为重复单元构建包含多个重复单元的多肽。发明人发现构建的多肽具备促进细胞黏附的活性。发明人还发现在核心区的N端和/或C端可以延长一个或多个氨基酸作为重复单元，构建的包含多个重复单元的多肽也具备促进细胞黏附的活性。进一步，在重复单元外，多肽还可以在重复单元外(例如重复单元构成的多肽的N端和/或C端)包含一定长度的肽段。该肽段可以是重复单元的从第1位起的连续氨基酸段。
在一方面，本发明提供了多肽，其包含(重复单元)n或(重复单元)n-C端区的结构，该重复单元包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列，或者重复单元包含SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.1的N端和/或C端的额外氨基酸残基，该额外氨基酸残基的数目是1-50。本发明的多肽是重组Ⅴ型人源化胶原蛋白。
在一个实施方案中，各重复单元是直接连接的并且重复单元的数目n是4-20，并且C端区是重复单元的从第1位起的连续氨基酸段。
在一个实施方案中，额外氨基酸残基在SEQ ID NO.1的C端，并且是SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列(galglk)或该氨基酸序列的连续氨基酸段。例如，额外氨基酸残基是SEQID NO.7所示的氨基酸序列的从第1位起的连续氨基酸段。
在一个实施方案中，重复单元包含SEQ ID NO.2、3和8-11中任一项的氨基酸序列。
在一个实施方案中，多肽包含选自SEQ ID NO.4-6的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了核酸，其包含本发明的多肽的核苷酸。
在一个实施方案中，核酸还包含编码纯化标签，例如His标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签的核苷酸。
在一个实施方案中，核酸还包含编码前导序列的核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了载体，其包含根据本发明的核酸。
在一个实施方案中，载体包含与核酸可操作连接的表达控制元件，如启动子、终止子和/或增强子。
在另一个方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明的核酸或载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在一个实施方案中，真核细胞是酵母细胞、动物细胞和/或昆虫细胞。在一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞。
在另一个方面，本发明提供了生产本发明的多肽，其包括：
(1)在合适的培养条件下培养本发明的宿主细胞；
(2)收获包含多肽的宿主细胞和/或培养基；和
(3)纯化融合蛋白或三聚体融合蛋白。
在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含本发明的多肽、核酸、载体和/或宿主细胞。
在一个实施方案中，组合物是生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料、3D打印人造器官生物材料、化妆品原料、药用辅料和食品添加剂中的一种或多种。
在另一个方面，本发明提供了本发明的多肽、核酸、载体、宿主细胞和/或组合物在体外促进细胞黏附或者在制备促进细胞黏附的药物中的用途。
在另一个方面，本发明提供了本发明的多肽、核酸、载体、宿主细胞和/或组合物在高端医疗器械制备，如生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养、心血管支架、涂层、组织注射填充、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生、肝脏组织及血管修复再生、3D打印人造器官生物材料等；高端化妆品原料及高端药用辅料；食品添加剂中的应用。
本发明公开了一种重组Ⅴ型人源化胶原蛋白的功能区筛选和合成工艺的具体过程，可用作人体结构性材料制备。本发明属于合成生物技术领域。本发明公开了一种重组Ⅴ型人源化胶原蛋白的功能区筛选和合成工艺的具体过程，可用作人体结构性材料制备。本发明属于合成生物技术领域。本发明中制备重组Ⅴ型人源化胶原蛋白的生物合成方法，具体过程包括：(1)功能区筛选、菌种的构建；(2)生物发酵、诱导和表达；(3)人源化Ⅴ型胶原蛋白的纯化及任选的酶切。本发明制备的重组人源化胶原蛋白氨基酸序列源自人天然Ⅴ型胶原蛋白的功能区，包含该功能区及类似的功能区、对氨基酸序列分别进行突变和修饰后的蛋白。本发明制备得到的重组Ⅴ型人源化胶原蛋白具有高促进细胞黏附的活性，应用于人体不会产生免疫反应，且其制备方法新颖，可大规模获得重组Ⅴ型人源化胶原蛋白，在人体结构性材料制备方面得到广泛应用。其应用领域包含高端医疗器械制备，如生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养、心血管支架、涂层、组织注射填充、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生、肝脏组织及血管修复再生、3D打印人造器官生物材料等；高端化妆品原料及高端药用辅料；食品添加剂等。
本发明提供了以下内容：
1.针对目前的研究现状，本发明提供了一种生物合成重组Ⅴ型人源化胶原蛋白的方法，即人体结构性材料的制备方法，具体过程包括：(1)功能区筛选、菌种的构建；(2)大规模生物发酵培养和蛋白的诱导表达；(3)人源化Ⅴ型胶原蛋白的纯化和任选的酶切。
2.根据项1所述，功能区筛选、菌种的构建可如下进行：(1)大规模功能区筛选，得到目的基因功能区；(2)将得到的目的基因功能区插入pET-32a表达载体中得到重组表达质粒；(3)将重组表达质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌。
3.根据项1所述，大规模生物发酵可如下进行：将筛选得到的阳性大肠杆菌基因工程菌加入抗生素储液的摇瓶中，并在220rpm、37℃恒温摇床中培养7h。
4.根据项1所述，蛋白的诱导表达可如下进行：(1)将培养后的摇瓶降温至16℃；(2)添加IPTG母液，进行诱导表达；(3)将诱导表达后的菌液装于离心瓶中，8000rpm、4℃离心10min后收集菌体。
5.根据项1所述，人源化Ⅴ型胶原蛋白的纯化和任选的酶切可如下进行：(1)在Ni亲和层析柱粗纯人源化Ⅴ型胶原蛋白；(2)按一定比例添加TEV酶酶切；(3)离子交换柱精纯人源化Ⅴ型胶原蛋白。
6.根据项2所述中，筛选出的功能区如下所示：(1)C5V3G1氨基酸序列：gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglkgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglkgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglkgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglkgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglkgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglkgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglkgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglk；(2)C5V3G2氨基酸序列：gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgal；(3)C5V3G3氨基酸序列：gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpv。
7.本发明制备的重组Ⅴ型人源化胶原蛋白氨基酸序列源自人天然Ⅴ型胶原蛋白的功能区，包含该功能区及类似的功能区、对氨基酸序列分别进行突变和修饰后的蛋白。
8.本发明制备得到的重组Ⅴ型人源化胶原蛋白，其应用领域包含高端医疗器械制备，如生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养、心血管支架、涂层、心肌修复、组织注射填充、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生、肝脏组织及血管修复再生、3D打印人造器官生物材料、肿瘤预防、骨修复材料、皮肤修复材料、肾组织修复、胰腺修复等；高端化妆品原料及高端药用辅料；食品添加剂等。
相对于现有技术，本发明的优点包括：
1.本发明提供了重组Ⅴ型人源化胶原蛋白的核心功能区及氨基酸序列；
2.本发明首次成功生物合成了重组Ⅴ型人源化胶原蛋白；
3.本发明制备得到的重组Ⅴ型人源化胶原蛋白具有良好的细胞黏附效果，应用于人体不会产生免疫反应；
4.其制备方法简单，可大规模获得重组Ⅴ型人源化胶原蛋白。
附图说明
图1：重组Ⅴ型人源化胶原蛋白C5V3G1和C5V3G2粗纯后的电泳检测图。显示了各纯化步骤后的电泳图。
图2：重组Ⅴ型人源化胶原蛋白C5V3G3粗纯后的电泳检测图和C5V3G1、C5V3G2、C5V3G3酶切后的电泳检测图。显示了各纯化步骤后的电泳图。
图3：重组Ⅴ型人源化胶原蛋白C5V3G1、C5V3G2、C5V3G3精纯后的电泳检测图。
图4：重组Ⅴ型人源化胶原蛋白C5V3G1的细胞黏附活性。
图5：重组Ⅴ型人源化胶原蛋白C5V3G2的细胞黏附活性。
图6：重组Ⅴ型人源化胶原蛋白C5V3G3的细胞黏附活性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如本文中所用，多肽是指通过肽键连接的多个氨基酸残基。在本文中，多肽包含多个重复单元，该重复单元来自人Ⅴ型胶原蛋白(GenBank:KAI4009058.1)。多肽可以包含含有(重复单元)n或(重复单元)n-C端区的结构，该重复单元包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列，或者重复单元包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.1的N端和/或C端的额外氨基酸残基，该额外氨基酸残基的数目是1-50。例如，该额外氨基酸残基的数目是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49。该额外氨基酸残基可以来自人Ⅴ型胶原蛋白。例如，该额外氨基酸残基可以是重复单元在天然人Ⅴ型胶原蛋白中原位直接相邻的连续氨基酸残基。该额外氨基酸残基可以是SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的连续氨基酸段。优选地，该额外氨基酸残基可以是SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的从第1位起的连续氨基酸段。在本文中，该额外氨基酸残基可以位于C端。
在本文中，各重复单元可以是直接连接的或者可以间隔一个或多个氨基酸残基。重复单元的数目n可以是4-20，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19。多肽可以包含C端区。该C端区可以是重复单元的从第1位起的连续氨基酸段。重复单元可以包含SEQ ID NO.2或3中任一项的氨基酸序列。
如本文中所用，在结合氨基酸使用的表述“段”是指小于指定序列的部分序列。例如，SEQ ID NO.7中的氨基酸段是指小于SEQ ID NO.7的长度的任何长度的部分序列。“连续氨基酸段”是指指定序列中直接相邻的氨基酸构成的氨基酸段。
如本文中所用，就多肽或特定氨基酸序列而言，“C端”和“N端”是指相对于该多肽或特定氨基酸序列的位置，具体指位于多肽或特定氨基酸序列的羧基端或氨基端方向。
如本文中所用，当提及多肽或特定氨基酸序列时，位置是相对于多肽或特定氨基酸序列的C端描述的。例如，当提到“SEQ ID NO.7的氨基酸序列(galglk)的第1位起”时，第1位氨基酸是指G。
在本文中，本发明的重复单元可以包含或者可以是以下序列：
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpv(SEQ ID NO.1)；
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgal(SEQ ID NO.2)；
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglk(SEQ ID NO.3)；
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvg(SEQ ID NO.8)；
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvga(SEQ ID NO.9)；
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalg(SEQ ID NO.10)；
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalgl(SEQ ID NO.11)。
如本文中所用，“核酸”是指通过核苷酸间连接的多个核苷酸。核苷酸间连接可以是例如磷酸二酯键。本文中的核酸可以包含编码本发明的多肽的多核苷酸。为了便于多肽后续处理，本发明的核酸还可以包含编码纯化标签，例如His标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签的核苷酸，以及当需要时编码前导序列的核苷酸。
如本文中所用，术语“载体”是可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白质获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体可以包含本发明的核酸以便于导入细胞进行表达。载体可以包含与所述核酸可操作连接的表达控制元件，如启动子、终止子和/或增强子。
如本文中所用，术语“宿主细胞”是已经通过分子生物学技术将核酸分子引入的细胞。这些技术包括转染病毒载体，用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂转染、和粒子枪加速引入裸DNA。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。例如，真核细胞是酵母细胞、动物细胞和/或昆虫细胞。原核细胞可以是大肠杆菌细胞。
在本文中，本发明的多肽的各个部分，例如重复单元或C端区可以存在一定的突变。例如，这些部分中的一个或多个的氨基酸序列可以存在氨基酸残基的取代、缺失、添加或插入。也就是说，本发明可以使用各个部分的变体，例如重复单元变体或C端区变体，只要变体保留促进细胞黏附的活性。具体而言，变体可以与指定的序列具备一定的百分比同一性，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。指定的序列可以是本发明的任何序列，例如SEQ ID NO.1-6，但是优选的是这些变体保留本发明鉴定的核心序列。
本发明的多肽可以通过任何合适的方式进行制备，例如可以通过合成制备。优选地，本发明的多肽可以通过重组方式制备。作为制备方法，该方法可以包括以下任何一个或多个步骤：(1)在合适的培养条件下培养根据权利要求8所述的宿主细胞；(2)收获包含多肽的宿主细胞和/或培养基；和(3)纯化融合蛋白或三聚体融合蛋白。更具体而言，可以将本发明的多肽的编码序列插入到合适的表达载体，诸如PET-28a中，以得到重组表达载体。可以将重组表达质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌。然后，可以将筛选得到的阳性大肠杆菌基因工程菌进行大规模生物发酵(例如在220rpm、37℃恒温摇床中培养7h)。在培养到合适的细胞密度时，可以诱导细胞表达蛋白质。例如，在大肠杆菌基因工程菌的情况下，(1)将培养后的摇瓶降温至16℃；(2)添加IPTG母液，进行诱导表达；(3)将诱导表达后的菌液装于离心瓶中，8000rpm、4℃离心10min后收集菌体。可以对菌体进行裂解(例如通过高压均质)以得到菌体裂解物，然后离心得到上清液。可以对上清液进行纯化得到纯化的多肽。例如，纯化过程可以包括以下一个或多个步骤：(1)在Ni亲和层析柱粗纯多肽；(2)按一定比例添加TEV酶酶切；和(3)离子交换柱精纯多肽。
本发明的多肽、核酸、载体和/或宿主细胞可以制备成组合物或试剂盒。组合物或试剂盒可以包含生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料、3D打印人造器官生物材料、化妆品原料、药用辅料和食品添加剂中的一种或多种。组合物可以是生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养材料、心血管支架材料、涂层材料、组织注射填充材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料、3D打印人造器官生物材料、化妆品原料、药用辅料和食品添加剂中的一种或多种。该组合物或试剂盒可以用于在体外促进细胞黏附或者在体内促进细胞黏附。
实施例
提供以下实施例来阐述本发明。本领域技术人员应当理解实施例仅仅是例示性的，而非限制性的。本发明仅仅由所附权利要求书的范围限定。
实施例1：重组Ⅴ型人源化胶原蛋白构建及表达
1.进行大规模功能区筛选，得到以下不同的重组Ⅴ型人源化胶原蛋白的目的基因片段：(1)C5V3G1氨基酸序列：
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglk
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglk
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglk
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglk
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglk
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglk
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglk
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglk(C5V3G1氨基酸序列：SEQ IDNO.6；重复序列SEQ ID NO.3,gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgalglk)；(2)C5V3G2氨基酸序列：
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgal
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgal
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgal
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgal
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgal
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgal
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgal
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgal(C5V3G2氨基酸序列SEQ ID NO:5，重复单元SEQ ID NO.2,gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpvgal)；(3)C5V3G3氨基酸序列：gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpv
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpv
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpv
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpv
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpv
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpv
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpv
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpv
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpv
gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpv(C5V3G3氨基酸序列：SEQ ID NO:4，重复单元为SEQ ID NO.1：gkegtkgdpgpaglpgkdgppglrgfpgdrglpgpv)。
将合成的基因片段(C5V3G1碱基序列：
GGGAAAGAAGGAACGAAAGGTGACCCTGGCCCAGCGGGTCTGCCGGGCAAGGACGGTCCACCGGGTCTGCGCGGTTTCCCGGGCGACCGCGGCCTGCCGGGTCCGGTTGGCGCGTTGGGTCTTAAGGGCAAAGAAGGCACCAAAGGAGATCCGGGTCCGGCTGGTTTACCGGGCAAGGATGGTCCGCCGGGTCTGCGTGGTTTTCCGGGTGACCGTGGTCTGCCGGGTCCGGTCGGAGCCCTGGGTTTGAAGGGCAAAGAGGGCACCAAAGGCGACCCAGGACCGGCAGGCCTCCCGGGTAAGGATGGCCCTCCGGGGCTGCGTGGTTTTCCGGGTGATCGCGGCTTGCCGGGACCGGTTGGTGCGCTGGGTCTTAAGGGTAAAGAAGGCACCAAAGGTGACCCGGGCCCGGCGGGTCTGCCGGGCAAAGATGGTCCGCCAGGCCTGAGAGGCTTCCCGGGTGACCGCGGCTTGCCGGGTCCGGTTGGTGCGCTGGGCCTTAAGGGTAAAGAGGGCACCAAAGGCGATCCGGGTCCGGCTGGCCTGCCGGGGAAGGACGGCCCACCGGGCCTGCGTGGTTTTCCGGGCGACCGTGGTTTGCCGGGCCCGGTGGGCGCTCTGGGTCTGAAAGGGAAAGAGGGTACGAAGGGTGATCCGGGTCCGGCAGGCTTGCCGGGCAAGGACGGCCCGCCTGGCCTGCGTGGTTTCCCGGGTGACCGTGGTTTACCGGGTCCCGTGGGCGCGCTGGGTCTGAAAGGTAAGGAAGGCACCAAGGGTGATCCGGGCCCGGCCGGTCTGCCGGGCAAGGACGGTCCGCCCGGATTACGTGGCTTCCCGGGTGATCGTGGTCTGCCGGGTCCTGTAGGTGCGCTGGGTCTCAAGGGCAAAGAGGGTACTAAGGGTGATCCGGGCCCGGCGGGTCTGCCAGGCAAAGACGGCCCACCGGGCTTGCGCGGTTTTCCGGGCGATCGTGGTTTGCCGGGTCCTGTGGGCGCACTGGGCTTGAAGTAA，SEQ ID NO:12；C5V3G2碱基序列：
GGGAAAGAAGGAACCAAGGGTGACCCGGGGCCAGCCGGTTTGCCGGGTAAGGATGGTCCGCCTGGCTTGCGTGGTTTTCCGGGGGACCGTGGTTTGCCGGGTCCGGTTGGTGCGCTGGGTAAAGAAGGCACGAAGGGCGACCCGGGCCCAGCCGGTTTACCGGGGAAAGATGGTCCTCCGGGCCTGCGCGGTTTTCCGGGAGACCGTGGTCTTCCGGGCCCGGTGGGTGCGCTGGGCAAGGAGGGCACCAAAGGTGACCCTGGCCCTGCGGGTCTGCCGGGTAAGGACGGTCCACCGGGTCTGCGTGGCTTTCCGGGCGACCGTGGCTTGCCCGGTCCGGTTGGCGCGCTGGGTAAAGAGGGTACGAAGGGTGACCCGGGTCCTGCGGGCCTGCCGGGCAAGGACGGCCCGCCGGGACTGCGCGGATTCCCGGGCGATCGCGGCCTCCCGGGTCCGGTCGGTGCGCTGGGCAAAGAAGGTACTAAAGGTGATCCGGGCCCGGCGGGCCTGCCGGGCAAGGATGGCCCGCCGGGTTTGCGCGGTTTCCCGGGCGACCGTGGTTTGCCGGGCCCAGTGGGCGCACTGGGTAAGGAGGGCACCAAAGGCGATCCGGGACCAGCTGGTCTGCCGGGCAAGGACGGCCCACCGGGTCTCAGAGGCTTCCCGGGGGACCGCGGTCTGCCGGGCCCGGTAGGCGCACTGGGTAAAGAAGGCACCAAAGGTGACCCGGGTCCGGCTGGTCTGCCGGGTAAGGATGGCCCGCCGGGCCTGCGTGGCTTCCCGGGTGATCGTGGCTTGCCTGGCCCAGTGGGTGCACTGGGCAAAGAGGGCACCAAGGGTGATCCGGGTCCGGCGGGTCTGCCGGGTAAAGATGGTCCACCGGGTTTACGTGGTTTTCCGGGCGATCGTGGTCTCCCGGGCCCGGTTGGCGCTCTGTAA，SEQ ID NO:13；C5V3G3碱基序列：
GGGAAAGAAGGAACGAAAGGCGATCCGGGTCCGGCGGGCCTGCCGGGTAAGGACGGCCCGCCGGGATTACGCGGTTTCCCGGGTGACCGCGGTTTGCCGGGTCCGGTTGGCAAAGAAGGTACTAAGGGTGATCCGGGCCCAGCCGGTCTGCCGGGCAAGGATGGTCCGCCAGGCCTGAGAGGCTTCCCGGGTGACCGCGGGCTGCCGGGCCCGGTTGGTAAGGAGGGCACCAAAGGCGATCCGGGTCCGGCGGGTTTGCCGGGCAAGGATGGCCCGCCAGGCCTGCGTGGCTTTCCGGGTGATCGTGGTCTGCCGGGCCCCGTGGGCAAAGAGGGCACCAAAGGTGATCCGGGTCCAGCGGGTCTGCCAGGTAAGGACGGTCCGCCTGGCCTGCGTGGTTTCCCGGGTGATCGTGGTCTGCCGGGTCCGGTCGGTAAAGAAGGCACCAAGGGCGACCCGGGCCCGGCAGGGCTGCCGGGTAAGGATGGCCCACCGGGTCTGCGTGGTTTTCCGGGCGACCGTGGTCTTCCGGGTCCGGTCGGTAAAGAGGGCACCAAAGGTGACCCGGGTCCCGCGGGTCTGCCGGGTAAGGACGGCCCTCCGGGCCTGCGCGGCTTCCCGGGCGATCGCGGTCTGCCGGGTCCGGTTGGTAAAGAAGGTACGAAGGGCGATCCTGGTCCAGCAGGCTTGCCGGGCAAAGATGGTCCGCCCGGCCTTCGCGGATTCCCGGGCGACCGTGGCCTGCCGGGTCCGGTGGGTAAAGAAGGCACCAAGGGCGACCCGGGTCCTGCTGGCTTGCCGGGCAAGGACGGCCCACCGGGTTTACGCGGTTTTCCGGGCGATCGTGGTTTGCCGGGTCCGGTGGGCAAAGAGGGAACCAAAGGTGACCCTGGCCCAGCTGGCTTGCCGGGCAAAGATGGTCCGCCGGGTCTGCGTGGCTTTCCGGGTGACCGTGGTTTGCCGGGCCCGGTTGGTAAGGAGGGCACCAAAGGCGACCCGGGTCCGGCGGGTCTGCCGGGTAAGGACGGTCCACCGGGCTTACGTGGTTTCCCGGGGGACCGTGGCCTGCCGGGCCCCGTGTAA，SEQ ID NO:14)插入pET-32a表达载体的Kpn I和Xho I酶切位点之间，得到重组表达质粒。
2.将构建成功的表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。具体过程为：(1)在超低温冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)置于冰上，待半融时取2μl待转化的质粒加入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，稍微混匀2-3次。(2)将混合物置于冰上冰浴30min，然后于42℃水浴热激45-90s，取出后置于冰上冰浴2min。(3)转移至生物安全柜中，并加入700μl液体LB培养基，然后于37℃、220rpm条件下培养60min。(4)取200μl的菌液均匀涂布在含有氨苄西林钠的LB平板上。(5)将平板在37℃的培养箱中培养15-17h，待其长出大小均匀的菌落。
3.从转化好的LB平板中挑取5-6个单菌落于含有抗生素储液的摇瓶中，在220rpm，37℃恒温摇床中7h。再将培养后的摇瓶降温至16℃，添加IPTG诱导表达一段时间后，将菌液分装于离心瓶中，于8000rpm、4℃离心10min，收集菌体，并记录菌体重量，取样进行电泳检测(见图1和图2中的“菌体”泳道)。
4.将收集的菌体用平衡工作液重悬，将菌液降温至≤15℃，进行均质，高压均质两次，完成后收集菌液。将均质后的菌液分装至离心瓶中，于17000rpm、4℃离心30min，收集上清液，取上清液和沉淀进行电泳检测(见图1和图2，“均二”为高压均质两次后菌液的电泳图，“上清”和“沉淀”分别为上清液和沉淀的电泳图)。
5.将重组人源化Ⅴ型胶原蛋白的进行纯化和酶切，具体过程是：(1)粗纯：a.水洗柱材。b.平衡柱材。c.上样：将离心后的上清液加入柱材中，直至液体流完后，取流穿进行电泳检验(见图1和图2，“流穿”泳道)。d.清洗杂蛋白：添加洗杂液25mL(200mM氯化钠，25mMTris，20mM咪唑)至液体流完，并取洗杂流穿进行电泳检验(见图1和图2，“洗杂”泳道)。e.收集目的蛋白：添加20mL洗脱液，并收集流穿液，获得含His标签的目的蛋白，采用紫外可见分光光度法检测蛋白浓度，按以下公式(C(mg/ml)＝A280×稀释倍数×消光系数)计算蛋白浓度，并进行电泳检测(见图1和图2，“洗脱”泳道)。f.用1M咪唑工作液清洗柱材。g.纯化水清洗柱材。(2)酶切：按蛋白总量与TEV酶总量比为20：1，添加TEV酶，16℃酶切2h，取样进行电泳检测。将酶切后的蛋白液放入透析袋，于4℃透析2h，再转移至新的透析液中4℃过夜透析(换液后的电泳图见图3)。(3)精纯：a.平衡柱材：使用A液(20mM Tris，20mM氯化钠)将柱材平衡，流速为10ml/min。b.上样：流速为5ml/min，上样并收集流穿(标记FL1，见图3)，获得重组Ⅴ型人源化胶原蛋白C5V3G1、C5V3G2和C5V3G3，并进行电泳检测，如图3。c.洗脱：设置100％B液(20mM Tris，1M氯化钠，pH8.0)洗脱3个CV，出峰收集并进行电泳检测(B液洗脱液见图3的“B液洗”泳道)。d.清洗柱材。e.将蛋白储存在4℃环境中。图3显示了重组Ⅴ型人源化胶原蛋白C5V3G1、C5V3G2和C5V3G3的表观分子量为分别为32kDa、29kDa和34kDa，与预测的分子量相符。
实施例2：重组Ⅴ型人源化胶原蛋白的生物活性检测
胶原蛋白的活性检测方法可以参考文献Juming Yao,Satoshi Yanagisawa,Tetsuo Asakura,Design,Expression and Characterization of Collagen-LikeProteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived fromNative Collagens,J Biochem.136,643-649(2004)。具体实施方法如下：
(1)利用紫外吸收法检测待测蛋白样品的浓度，包括牛Ⅰ型胶原蛋白(中国食品药品检定研究院，编号：380002；0.5mg/mL，阳性孔)、本发明提供的重组Ⅴ型人源化胶原蛋白C5V3G1、C5V3G2、C5V3G3。
具体为分别测定样品在215nm和225nm下的紫外光吸收，利用经验公式C(μg/mL)＝144×(A215-A225)计算蛋白质浓度，注意需在A215<1.5的情况下检测。该方法的原理是：测定肽键在远紫外光下的特征吸收，不受生色团含量的影响，干扰物质少，操作简便，适合检测考马斯亮蓝不显色的人胶原蛋白及其类似物。(参考文献为Walker JM.The ProteinProtocols Handbook,second edition.HumanaPress.43-45.)。检测完蛋白浓度后，用PBS将所有待测蛋白浓度调整到0.25mg/mL、0.5mg/mL、或1mg/ml。
(2)向96孔板中加入100μL各种蛋白溶液和空白PBS溶液对照(见图4-图6中的D-PBS组)，室温静置60min。
(3)每孔中加入105个培养状态良好的3T3细胞，37℃孵育60min。
(4)每孔用PBS清洗4次。
(5)用LDH检测试剂盒(Roche，04744926001)检测OD492nm的吸光度。根据空白对照的数值，可以计算出细胞的贴壁率。计算公式如下：细胞的贴壁率(相对细胞粘附活性)即可以反应胶原蛋白的活性。蛋白的活性越高，越能在短时间给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。
结果如图4、5、6所示，从对比中可知，相比于牛Ⅰ型胶原蛋白(B ColI组，0.5mg/ml)，本发明的重组Ⅴ型人源化胶原蛋白具有更加优秀的生物黏附活性。图4描述了C5V3G1相对于牛Ⅰ型胶原蛋白的相对细胞黏附活性，表明C5V3G1具有细胞黏附活性，并且在0.25、0.5和1mg/ml的浓度比牛Ⅰ型胶原蛋白具有更高的细胞黏附活性。图5显示了C5V3G2相对于牛Ⅰ型胶原蛋白的相对细胞黏附活性，表明0.25mg/ml以上的浓度C5V3G2具有更好的细胞黏附活性。图6显示了C5V3G3相对于牛Ⅰ型胶原蛋白的相对细胞黏附活性，表明C5V3G3具有细胞黏附活性，并且在0.5mg/ml的浓度比牛Ⅰ型胶原蛋白具有更高的细胞黏附活性。
实施例3：重组Ⅴ型人源化胶原蛋白的质谱检测
实验方法
蛋白样品经DTT还原和碘代乙酰胺烷基化处理后，加入胰蛋白酶酶解过夜。酶解后得到的肽段再经C18ZipTip脱盐后，与基质α-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)混合点板。最后用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪MALDI-TOF/TOF UlraflextremeTM，Brucker，Germany进行分析(肽指纹图谱的技术可以参考Protein J.2016；35:212-7)。数据检索是通过从本地masco网站上MS/MS Ion Search页面处理的。蛋白质鉴定结果是根据酶解后所产生的肽段的一级质谱得到的。检测参数：Trypsin酶解，设两个漏切位点。设定半胱氨酸的烷基化为固定修饰。甲硫氨酸的氧化为可变修饰。鉴定所用的数据库为NCBprot。
表1：C5V3G1质谱检出分子量及对应多肽
观察值 Mr(预期值) 肽
1565.7522 1564.7450 GKEGTKGDPGPAGLPGK
2073.0474 2072.0401 EGTKGDPGPAGLPGKDGPPGLR
1657.8545 1656.8472 GDPGPAGLPGKDGPPGLR
711.3766 710.3693 DGPPGLR
1707.8803 1706.8730 GFPGDRGLPGPVGALGLK
1078.6592 1077.6520 GLPGPVGALGLK
检出多肽片段的覆盖率为100％，与理论序列一致，检测结果非常可信。
表2：C5V3G2质谱检出分子量及对应多肽
观察值 Mr(预期值) 肽
1565.7522 1564.7450 EGTKGDPGPAGLPGKDGPPGLR
711.3766 710.3693 GDPGPAGLPGKDGPPGLR
1707.8803 1706.8730 DGPPGLR
1078.6592 1077.6520 GLPGPVGALGK
检出多肽片段与理论序列相比，覆盖率为83％，检测结果非常可信。。
表3：C5V3G3质谱检出分子量及对应多肽
观察值 Mr(预期值) 肽
711.3914 710.3842 DGPPGLR
1353.7538 1352.7465 GFPGDRGLPGPVGK
1657.8985 1656.8912 GDPGPAGLPGKDGPPGLR
2073.1050 2072.0977 EGTKGDPGPAGLPGKDGPPGLR
检出多肽片段与理论序列相比，覆盖率为96.11％，检测结果非常可信。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (30)

1.多肽，其氨基酸序列选自SEQ ID NO. 4-6。
2.根据权利要求1所述的多肽，其是重组Ⅴ型人源化胶原蛋白。
3.核酸，其包含编码权利要求1-2中任一项的多肽的核苷酸。
4.根据权利要求3所述的核酸，所述核酸还包含编码纯化标签的核苷酸。
5.根据权利要求4所述的核酸，其中纯化标签是His标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的核酸，所述核酸还包含编码前导序列的核苷酸。
7.载体，其包含根据权利要求3-6中任一项所述的核酸。
8.根据权利要求7所述的载体，其包含与所述核酸可操作连接的表达控制元件。
9.根据权利要求8所述的载体，其中控制元件是启动子、终止子和/或增强子。
10.宿主细胞，其包含根据权利要求3-6中任一项所述的核酸或根据权利要求7-9中任一项所述的载体。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中真核细胞是酵母细胞或动物细胞，原核细胞是大肠杆菌细胞。
13.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中真核细胞是昆虫细胞。
14.根据权利要求12所述的宿主细胞，其中大肠杆菌是大肠杆菌BL21。
15.生产根据权利要求1-2中任一项所述的多肽的方法，其包括：
(1) 在合适的培养条件下培养根据权利要求10-14中任一项所述的宿主细胞；
(2) 收获包含多肽的宿主细胞和/或培养基；和
(3) 纯化多肽。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述纯化多肽是(1)在Ni亲和层析柱粗纯多肽；(2)按一定比例添加TEV酶酶切；和(3)离子交换柱精纯多肽。
17.组合物，其包含根据权利要求1-2中任一项所述的多肽、根据权利要求3-6中任一项所述的核酸、根据权利要求7-9中任一项所述的载体和/或根据权利要求10-14中任一项所述的宿主细胞。
18.根据权利要求17所述的组合物，其是整形美容材料、心血管支架材料、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料中的一种或多种。
19.根据权利要求17所述的组合物，其是化妆品原料或药用辅料。
20.根据权利要求17所述的组合物，其是3D打印人造器官生物材料或生物敷料。
21.根据权利要求17所述的组合物，其是人体仿生材料。
22.根据权利要求17所述的组合物，其是涂层材料或组织注射填充材料。
23.根据权利要求17所述的组合物，其是类器官培养材料。
24.根据权利要求1-2中任一项所述的多肽、根据权利要求3-6中任一项所述的核酸、根据权利要求7-9中任一项所述的载体、根据权利要求10-14中任一项所述的宿主细胞和/或根据权利要求17所述的组合物在体外促进细胞黏附或者在制备促进细胞黏附的产品或试剂盒中的用途。
25.根据权利要求1-2中任一项所述的多肽、根据权利要求3-6中任一项所述的核酸、根据权利要求7-9中任一项所述的载体、根据权利要求10-14中任一项所述的宿主细胞和/或根据权利要求17所述的组合物在高端医疗器械制备、高端化妆品原料及高端药用辅料中的应用。
26.根据权利要求1-2中任一项所述的多肽、根据权利要求3-6中任一项所述的核酸、根据权利要求7-9中任一项所述的载体、根据权利要求10-14中任一项所述的宿主细胞和/或根据权利要求17所述的组合物在整形美容材料、心血管支架、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生材料、肝脏组织材料及血管修复再生材料中的应用。
27.根据权利要求1-2中任一项所述的多肽、根据权利要求3-6中任一项所述的核酸、根据权利要求7-9中任一项所述的载体、根据权利要求10-14中任一项所述的宿主细胞和/或根据权利要求17所述的组合物在生物敷料或人体仿生材料中的应用。
28.根据权利要求1-2中任一项所述的多肽、根据权利要求3-6中任一项所述的核酸、根据权利要求7-9中任一项所述的载体、根据权利要求10-14中任一项所述的宿主细胞和/或根据权利要求17所述的组合物在涂层或组织注射填充材料中的应用。
29.根据权利要求1-2中任一项所述的多肽、根据权利要求3-6中任一项所述的核酸、根据权利要求7-9中任一项所述的载体、根据权利要求10-14中任一项所述的宿主细胞和/或根据权利要求17所述的组合物在3D打印人造器官生物材料中的应用。
30.根据权利要求1-2中任一项所述的多肽、根据权利要求3-6中任一项所述的核酸、根据权利要求7-9中任一项所述的载体、根据权利要求10-14中任一项所述的宿主细胞和/或根据权利要求17所述的组合物在类器官培养材料中的应用。
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