KR20240167587A

KR20240167587A - Gv1001를 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20240167587A
Application number: KR1020240064462A
Authority: KR
Inventors: 김상재
Original assignee: 주식회사 젬백스앤카엘
Priority date: 2023-05-17
Filing date: 2024-05-17
Publication date: 2024-11-27
Also published as: WO2024237768A1

Abstract

본 발명은 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함함으로써 망막 변성 감소 효과를 나타내고 생체에 안전하여 이상반응을 포함하는 부작용이 적은 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

GV1001를 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating macular degeneration comprising GV1001}

본 발명은 GV1001를 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

노년성 황반변성(age-related macular degeneration, AMD)은 상이 맺히는 망막의 중심부인 황반의 기능이 손상되어 시야의 중심부터 점점 시력이 저하되면서 실명에 이르게 되는 안질환이다. 노년성 황반변성은 드루젠(drusen) 및 아밀로이드 베타(amyloid beta, Aβ)와 같은 세포대사 노폐물들이 쌓여 나타나는 건성 황반변성(dry AMD)과 신생혈관이 생성되어 출혈 혹은 체액 누수에 의해 시력을 잃게 되는 습성 황반변성(wet AMD)으로 나눌 수 있다.

건성 황반변성은 산화스트레스(oxidative stress)와 같은 스트레스 상황에 지속적으로 노출됨에 따라 망막세포(retinal cell) 사멸 및 망막세포 변성(degeneration)이 초래되어 나타난다. 망막세포의 사멸과 변성은 치밀한 구조의 망막층이 헐거워지게 만들고, 분비된 사이토카인(cytokine)과 성장인자(growth factor)에 의한 신생혈관생성(neovascularization)은 습성 황반변성으로 전환되게 하므로 건성 황반변성 단계에서의 치료가 무엇보다 중요하다.

습성 황반변성의 경우, 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)에 의한 신생혈관 생성이 직접적인 원인으로 알려져 있으며, 현재 Eylea®와 같은 VEGF를 표적으로 하는 약물을 치료제로 이용하고 있다.

상용화된 치료제가 많은 습성 황반변성과 달리, 건성 황반변성은 현재까지 FDA가 승인한 약물이 1개에 불과하다. 따라서 노년성 황반변성의 초기 진행단계를 조절할 수 있는 건성 황반변성 치료제 개발이 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 저감하고, 망막색소상피세포(retinal pigment epithelial cell, RPE cell)의 변성을 감소시킴으로써 노년성 황반변성을 치료하고자 예의 연구한 결과 본 발명을 완성하였다.

KR

10-2009-0096442

A

본 발명은 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 노년성 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 황반변성의 예방 또는 치료용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 황반변성의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 노년성 황반변성의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물.

2. 위 1에 있어서, 황반변성은 노년성 황반변성인 약학 조성물.

3. 위 1에 있어서, 약학 조성물은 망막색소상피세포의 변성을 감소시킴으로써 황반변성을 예방 또는 치료하는 것인 약학 조성물.

4. 위 1 내지 3 중 어느 하나의 약학 조성물; 및 황반변성의 예방 또는 치료 방법이 기재된 지시서를 포함하는 황반변성의 예방 또는 치료용 키트.

5. 위 4에 있어서, 황반변성의 예방 또는 치료 방법은 약학 조성물을 황반변성이 발병했거나 발병할 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것인 키트.

6. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 황반변성의 예방 또는 개선용 건강기능식품.

7. 위 6에 있어서, 황반변성은 노년성 황반변성인 건강기능식품.

8. 위 6에 있어서, 건강기능식품은 망막색소상피세포의 변성을 감소시킴으로써 황반변성을 예방 또는 개선하는 것인 건강기능식품.

본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 약학 조성물은 노년성 황반변성 망막색소상피세포 모델에서 세포의 변성을 감소시킬 뿐만 아니라 노년성 황반변성 유도 마우스 모델에서 망막 변성의 억제 및/또는 치료 효과를 나타냈다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 황반변성의 치료, 개선 또는 예방에 효과적일 것으로 기대된다.

본 발명의 약학 조성물 및 건강기능식품은 다수의 임상실험에서 독성 실험을 완료하고 부작용에 대한 안전성을 확인한 바 있는 GV1001을 유효성분으로 포함함으로써 황반변성을 예방, 개선 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 약학 조성물, 키트 및 건강기능식품은 향후 황반변성으로 고통받는 환자 및 그 가족들에게 경제적 또는 인수학적인 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명은 GV1001의 황반변성에 대한 약리효과의 기전을 규명함으로써 황반변성의 발병에 대한 병태생리의 이해를 돕고 향후 새로운 치료제 개발에 원동력이 될 것으로 기대된다.

도 1은 GV1001 단기 투여 효과 평가 시험에 이용한 GV1001 pre-treatment 동물 실험군에 대한 GV1001 투여 시기 및 실험 일정을 나타낸다.
도 2는 GV1001 단기 투여 효과 평가 시험에 이용한 GV1001 post-treatment 동물 실험군에 대한 GV1001 투여 시기 및 실험 일정을 나타낸다.
도 3은 GV1001 단기 투여 효과 평가 시험에 이용한 양성 대조군 약물 투여 시기 및 실험 일정을 나타낸다.
도 4는 GV1001 장기 투여 효과 평가 시험에 이용한 GV1001 pre-treatment 동물 실험군에 대한 GV1001 투여 시기 및 실험 일정을 나타낸다.
도 5는 GV1001 장기 투여 효과 평가 시험에 이용한 GV1001 post-treatment 동물 실험군에 대한 GV1001 투여 시기 및 실험 일정을 나타낸다.
도 6은 GV1001의 활성산소종 저감 효능 확인 결과를 나타낸다.
도 7은 GV1001의 상피-중간엽 전이 저감 효능 확인 결과를 나타낸다.
도 8 및 9는 노년성 황반변성 유도 마우스 모델에서 GV1001의 단기 투여에 의한 효능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 10 및 11은 노년성 황반변성 유도 마우스 모델에서 GV1001의 장기 투여에 의한 효능을 확인한 결과를 나타낸다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 이의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩티드를 의미한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 황반변성의 예방, 개선 또는 치료에 관여하는 활성을 의미한다.

본 발명에서 "황반변성"은 노년성 황반변성, 연령관련 황반변성, 노인 황반변성, 근시성 황반변성 및 황반이영양증을 포함한다.

본 발명에서 "노년성 황반변성"은 건성 황반변성 및 습성 황반변성을 포함한다.

일 실시예에서, 황반변성은 노년성 황반변성일 수 있다.

일 실시예에서, 황반변성은 건성 황반변성일 수 있다.

본 발명에서 "예방"은 황반변성을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 "치료"는 황반변성이 발병한 것으로 의심되거나, 발병한 개체의 증상을 호전시키거나 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.

일 실시예에서, 본 발명의 약학 조성물은 활성산소종을 저감함으로써 황반변성을 예방하거나 치료할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 약학 조성물은 망막색소상피세포의 변성을 감소시킴으로써 황반변성을 예방하거나 치료할 수 있다.

본 발명에서 "개체"는 황반변성이 발병하였거나 발병할 수 있는 가축 및 마우스 등의 모든 동물을 의미하며, 예컨대 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물이 포함할 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제는 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 덱스트린, 말토덱스트린, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 황반변성의 예방 또는 치료 방법이 기재된 지시서를 포함하는 황반변성의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.

일 실시예에서, 황반변성의 예방 또는 치료 방법은 본 발명의 약학 조성물을 황반변성이 발병했거나 발병할 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학 조성물의 투여 경로는 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 실시예에서, 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물을 비경구 투여하는 경우, 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 투여를 위한 고형 제제, 예컨대 정제, 환제, 산제, 과립제 또는 캡슐제일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 투여를 위한 액상 제제, 예컨대 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 제제, 예컨대 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 또는 좌제일 수 있다.

일 실시예에서 황반변성의 예방 또는 치료 방법은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 약학 조성물을 황반변성이 발병했거나 발병할 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 황반변성을 치료하기에 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약학 조성물의 약학적으로 유효한 양은 황반변성의 중증도, 약학 조성물의 활성도, 개체 또는 환자의 약학 조성물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간 및 병용 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있고, 단일 또는 다중 투여될 수 있으며, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 황반변성의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 인체에 유용한 기능성을 제공하기 위하여 다양한 형태로 제조 및/또는 가공된 식품을 지칭한다.

본 발명의 건강기능식품은 당업계에 알려진 여러 가지 식품 또는 의약품 등에 포함될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품이 포함될 수 있는 식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 예를 들어 본 발명의 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등에 포함될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함하며, 이들 유형의 식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 액상의 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화, 구형정제화(환 등) 및 분말화하여 섭취할 수 있으며, 파우더, 캅셀, 연질캅셀, 정제, 껌, 점착 타입 액제 조성물의 형태로 제조하여 섭취할 수도 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예를 들어, 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예를 들어, 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예를 들어, 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예를 들어, 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 전약, 각종 조미료(예를 들어, 된장, 간장, 소스 등) 등이 있다.

본 발명의 건강기능식품은 본 발명의 궁극적인 목적에 벗어나는 범주가 아니라면, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 더 포함할 수 있으며, 예를 들면, 단백질, 탄수화물, 지방, 기타 영양소, 조미제 및 향미제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예

망막색소상피세포 및 노년성 황반변성 마우스 모델을 이용해 GV1001이 망막색소상피층 손상 감소 효과를 갖는 것을 확인하였다. 또한 GV1001의 황반변성 관련 약리효과에 대한 분자적 기전을 규명하기 위한 기초연구를 진행하였다.

1. 실험 방법

1.1 GV1001의 합성

인간 텔로머라제로부터 선별된 하기의 서열번호 1(GV1001)을 가지는 하기 화학식 1의 구조식을 갖는 16개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 합성하였다.

<화학식 1>

서열번호 1의 펩티드 GV1001은 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S(Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

NH₂-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin

NH₂-Ala-2-chloro-Trityl Resin

NH₂-Arg(Pbf)-2-chloro-Trityl Resin

펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-말단이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Mercaptoacetic acid.

커플링 시약(Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] / NMM [4-Methylmorpholine]를 사용하였다. Fmoc 제거는 20 %의 DMF 중 피페리딘(piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩티드를 수지에서 분리하고 잔기의 보호기를 제거하는데 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) / EDT (ethanedithiol) / H₂O=92.5/2.5/2.5/2.5]를 사용하였다.

아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.

GV1001의 구체적인 합성 과정을 설명하면 다음과 같다.

1) 커플링

NH₂-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin에 보호된 아미노산(8당량)과 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량)을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

2) Fmoc 탈보호

20 %의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF)을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩티드 기본 골격을 만들었다.

4) 절단(Cleavage): 합성이 완료된 펩티드 수지에 절단 칵테일(Cleavage Cocktail)을 가하여 펩티드를 수지에서 분리하였다.

5) 얻어진 혼합물에 Cooling diethyl ether를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩티드를 침전시켰다.

6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 분말로 제조하였다.

1.2 GV1001에 의한 망막색소상피세포 변성 감소 검증

1) 노년성 황반변성 세포 모델 확립

망막색소상피세포주 ARPE-19에 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂)를 처리하여 활성산소종을 생성하였다.

노년성 황반변성에 나타나는 변성된 망막색소상피세포를 모델 세포주로 설정하고 망막색소상피세포의 상피성 소실(epithelial loss)을 유도하였다.

2) 약물 용량 및 용법

GV1001의 세포 변성 감소 효능 검증 실험군을 하기 표 1과 같이 설정하였다.

그룹	약물
음성 대조군	생리식염수
H₂O₂(50 μM) 처리군	생리식염수
	GV1001 pre-treatment	0.01 μM
		0.1 μM
		1.0 μM
		10 μM
	GV1001 post-treatment	0.01 μM
		0.1 μM
		1.0 μM
		10 μM
	메트포르민(1 mM)

* GV1001 pre-treatment는 GV1001을 2시간 먼저 처리한 후 H₂O₂를 24시간 동안 처리하였다.

* GV1001 post-treatment는 H₂O₂처리 24시간 후에 GV1001을 2시간 처리하였다.

* GV1001의 양성 대조군 약물로는 H₂O₂를 처리한 망막색소상피세포에서 산화스트레스 개선 효과가 확인된 바 있는 메트포르민(metformin, Met)1 mM을 사용하였다.

* 모든 약물은 0.9% 생리식염수에 희석하여 사용하였다.

3) GV1001에 의한 망막색소상피세포 변성 감소 검증

H₂O₂ 처리 망막색소상피세포주 모델(ARPE-19)을 대상으로 GV1001의 세포 변성 감소 효능을 검증한 연구 내용 및 방법은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.

연구 내용	연구 방법
GV1001에 의한 세포의 상피성 유지 확인	상피세포 마커(epithelial cell marker)인 Cadherin 1(CDH-1)과 간엽세포 마커(mesenchymal cell marker)인 vimentin의 변화를 공초점 현미경(confocal microscope)으로 관찰함으로써 망막색소상피세포의 변성 진행과정인 상피-중간엽 전이(epithelial-mesenchymal transition, EMT) 진행을 확인함
GV1001에 의한 산화스트레스 조절 관찰	활성산소종 염색 시료(dye)인 2',7'-Dichlorofluorescin Diacetate(DCF-DA)를 이용하여 GV1001에 의한 세포 내 활성산소종 레벨 변화를 형광 현미경(fluorescence microscope)으로 확인함

1.3 노년성 황반변성 유도 마우스 모델에서 GV1001 단기 투여에 의한 효능 평가

1) 노년성 황반변성 동물 모델 확립

요오드산나트륨(sodium iodate, NaIO₃)를 주입한 마우스는 대표적인 노년성 황반변성 모델로 사용된다. C57BL/6 마우스에 NaIO₃을 주입하여 망막색소상피세포 특이적으로 산화스트레스를 유도함으로써 손상을 가해 노년성 황반변성 마우스 모델을 확립하였다.

2) 약물 용량 및 용법

GV1001 단기 투여에 의한 망막색소상피 변성 감소 효능 검증 동물 실험군을 하기 표 3과 같이 설정하였다.

그룹	약물		개체 수
음성 대조군	생리식염수		3
NaIO₃처리군	생리식염수		3
	GV1001 pre-treatment	0.01 mg/kg	3
		0.1 mg/kg	3
		0.5 mg/kg	3
		1 mg/kg	3
	GV1001 post-treatment	0.01 mg/kg	3
		0.1 mg/kg	3
		0.5 mg/kg	3
		1 mg/kg	3
	메트포르민(4 mg/mL)		3

* NaIO₃는 20 mg/kg를 꼬리 정맥 주사(intravenous injection, IV injection)로 1회 주입하였다.

* GV1001는 0.01, 0.1, 0.5 또는 1.0 mg/kg를 피하 주사(subcutaneous injection, SC injection)로 주 3회 투여하였다.

* GV1001 pre-treatment에는 도 1에 도시된 바와 같이 GV1001를 NaIO₃ 투여 4일 전부터 2주 동안 주 3회씩 피하 주사하였다.

* GV1001 post-treatment에는 도 2에 도시된 바와 같이 GV1001를 NaIO₃투여 10일 후부터 1주 동안 3회 피하 주사하였다.

* GV1001의 양성 대조군 약물로는 산화스트레스로 인한 망막색소상피층 변성에 대한 개선 효과가 확인된 메트포르민 4.0 mg/mL을 사용하였으며, 도 3에 도시된 바와 같은 일정으로 NaIO₃투여 전 7일 동안 먹는 물에 희석하여 일반 물과 교체하면서 급여하였다.

* 메트포르민을 제외한 약물은 생리식염수에 희석하여 사용하였다.

3) GV1001에 의한 망막색소상피층 손상 감소 효능 확인

NaIO₃ 투여에 의한 망막색소상피층의 밀착연접(tight junction) 붕괴가 GV1001에 의해 저해되는지를 확인하기 위해 망막색소상피층/맥락막(RPE/choroid)을 플랫 마운팅(flat mounting)하고 상피세포 사이의 접합 부위를 팔로이딘(phalloidin) 시료로 염색하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.

1.4 노년성 황반변성 유도 마우스 모델에서 GV1001 장기 투여에 의한 효능 평가

1) 노년성 황반변성 동물 모델 확립

C57BL/6 마우스에 NaIO₃을 주입하여 망막색소상피세포 특이적으로 산화스트레스를 유도함으로써 손상을 가해 노년성 황반변성 마우스 모델을 확립하였다.

2) 약물 용량 및 용법

단기 투여에 의한 효력 평가 시험을 통해 결정한 GV1001 용량을 장기 투여에 의한 효능 평가에 사용하였다.

GV1001 장기 투여(3개월)에 의한 망막색소상피 변성 감소 효능 검증 동물 실험군을 하기 표 4와 같이 설정하였다.

그룹	약물		개체 수
음성 대조군	생리식염수		3
NaIO₃처리군	생리식염수		3
	GV1001 pre-treatment	0.1 mg/kg	3
		1.0 mg/kg	3
그룹	약물		개체 수
음성 대조군	생리식염수		15
NaIO₃처리군	생리식염수		15
	GV1001 post-treatment	0.1 mg/kg	15
		1.0 mg/kg	15

* NaIO₃는 20 mg/kg를 꼬리 정맥 주사로 1회 주입하였다.

* GV1001는 0.1 또는 1.0 mg/kg을 생리식염수에 희석하여 사용하였으며, 피하 주사로 주 3회 투여하였다.

* GV1001 pre-treatment에는 도 4에 도시된 바와 같이 GV1001를 NaIO₃투여 10주 전부터 12주 동안 주 3회씩 피하 주사하였다.

* GV1001 post-treatment에는 도 5에 도시된 바와 같이 GV1001를 NaIO₃투여 2주 후부터 10주 동안 주 3회씩 피하 주사하였다.

3) GV1001에 의한 망막색소상피층 손상 감소 효능 확인

망막색소상피층의 밀착연접 붕괴가 GV1001에 의해 저해되는지 확인하기 위해 망막색소상피층/맥락막을 플랫 마운팅하여 상피세포 사이의 접합 부위를 팔로이딘 염색 시료로 염색하고 공초점 현미경으로 관찰하여 밀착연접 붕괴 정도를 확인하였다.

2. 실험 결과

2.1 GV1001에 의한 망막색소상피세포 변성 감소 검증

1) GV1001에 의한 활성산소종 저감

활성산소종 염색 시료인 DCF-DA를 이용하여 GV1001에 의한 망막색소상피세포(ARPE-19) 내 활성산소종 레벨 변화를 형광 현미경으로 확인하였으며 그 결과는 도 6과 같다. H₂O₂로 산화스트레스가 유도되어 DCF-DA 형광 발현이 증가하였으나, 양성 대조군인 메트포르민 처리에 의해 감소하였다.

산화스트레스 조건 하에서 GV1001을 pre-treatment 시에는 0.01 μM 농도에서, post-treatment 시에는 0.1 μM 및 10 μM 농도에서 DCF-DA 형광 발현이 감소하였다.

망막색소상피세포에 산화스트레스가 가해졌을 때 관찰되는 활성산소종의 증가는 GV1001에 의해 억제 또는 저감될 수 있다. 이를 통해 GV1001이 망막색소상피세포가 산화스트레스에 대항할 수 있게 한다는 것을 확인하였다.

2) GV1001에 의한 망막색소상피세포의 변성 감소

공초점 현미경을 이용하여 상피세포 마커인 cadherin 1과 간엽세포 마커인 vimentin의 변화를 관찰함으로써 망막색소상피세포의 변성을 나타내는 상피-중간엽 전이 정도를 확인하였으며, 그 결과를 도 7에 나타냈다.

H₂O₂로 산화스트레스가 유도되어 상피세포 마커의 발현이 감소하고 간엽세포 마커의 발현이 증가하여 상피-중간엽 전이가 진행됨을 확인하였다. 양성 대조군인 메트포르민 처리 시, 상피-중간엽 전이가 저감되었다.

GV1001을 pre-treatment 시에는 0.01 μM 농도에서, post-treatment 시에는 10 μM 농도에서 상피-중간엽 전이가 저감되었다.

망막색소상피세포에 산화스트레스가 가해졌을 때 관찰되는 상피-중간엽 전이는 GV1001에 의해 진행이 억제되거나 감소될 수 있다. 이를 통해 GV1001이 망막색소상피세포가 상피성을 유지 또는 회복할 수 있게 한다는 것을 확인하였다.

2.2 노년성 황반변성 유도 마우스 모델에서 GV1001 단기 투여에 의한 효능 평가

망막색소상피세포층의 밀착연접 붕괴가 GV1001에 의해 저해되는지 망막색소상피층/맥락막을 플랫 마운팅하여 상피세포 사이의 접합 부위를 팔로이딘 염색하여 공초점 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 8 및 9에 나타냈다.

NaIO₃처리군에서 망막색소상피세포층의 밀착연접 구조가 상당히 망가져 있어 상피성의 소실을 알 수 있으며, 황반변성 마우스 모델이 잘 확립되었음을 알 수 있다. GV1001 양성 대조군인 메트포르민 처리 시, 밀착 연접 구조가 유지되었다.

GV1001을 pre-treatment 시에는 0.1 mg/kg에서, post-treatment 시에는 0.5 및 1.0 mg/kg에서 망막색소상피세포층의 밀착연접 구조가 유지되었다. 이를 통해 노년성 황반변성 마우스 모델에서 GV1001이 망막세포의 상피성을 유지 또는 회복하게 하는 것을 확인하였다.

2.3 노년성 황반변성 유도 마우스 모델에서 GV1001 장기 투여에 의한 효능 평가

망막색소상피층의 밀착연접 붕괴가 GV1001의 장기 투여에 의해 저감되는지 확인하기 위해 망막색소상피층/맥락막을 플랫 마운팅하고 상피세포 사이의 접합 부위를 팔로이딘 염색하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 10 및 11에 나타냈다.

NaIO₃처리군에서 망막색소상피세포층의 밀착연접 구조가 상당히 망가져 있어 상피성의 소실을 알 수 있으며, 황반변성 마우스 모델이 잘 확립되었음을 알 수 있다.

도 10에 도시된 바와 같이, GV1001 pre-treatment의 경우, GV1001을 0.1 mg/kg 또는 1.0 mg/kg로 장기 투여 시 망막색소상피층의 밀착연접 구조가 잘 유지되어 상피층 변성에 의한 세포막 붕괴가 일어나지 않고 폐쇄 연접세포막당 1개의 핵이 관찰되었다.

도 11에 도시된 바와 같이, GV1001 post-treatment의 경우, GV1001을 0.1 mg/kg 또는 1.0 mg/kg로 장기 투여 시 망막색소상피층의 밀착연접 구조가 잘 유지되어 상피층 변성에 의한 세포막 붕괴가 일어나지 않고 폐쇄 연접세포막당 1개의 핵이 관찰되었다.

3. 결론

3.1 GV1001에 의한 망막색소상피세포 변성 감소 검증

(1) GV1001에 의한 활성산소종 저감

망막색소상피세포에 산화스트레스가 가해졌을 때 관찰되는 활성산소종의 증가는 GV1001에 의해 억제 또는 저감될 수 있다. 이는 GV1001이 망막색소상피세포가 산화스트레스에 대항할 수 있게 함을 의미한다.

(2) GV1001에 의한 망막색소상피세포의 변성 감소

망막색소상피세포에 산화스트레스가 가해졌을 때 관찰되는 상피-중간엽 전이는 GV1001에 의해 진행이 억제되거나 저감될 수 있다. 이는 GV1001이 망막색소상피세포의 변성을 감소시키고 상피성을 유지 또는 회복하게 함을 의미한다.

3.2 노년성 황반변성 유도 마우스 모델에서 GV1001 단기 투여에 의한 효능 평가

노년성 황반변성 유도 마우스 모델에 GV1001을 단기 투여로 pre-treatment 또는 post-treatment한 결과, 망막색소상피층의 변성이 감소되고 상피성이 유지 또는 회복되었다. 이를 통해 GV1001의 노년성 황반변성에 대한 우수한 예방 및/또는 치료 효능을 확인하였다.

3.3 노년성 황반변성 유도 마우스 모델에서 GV1001 장기 투여에 의한 효능 평가

노년성 황반변성 유도 마우스 모델에 GV1001을 장기 투여로 pre-treatment 또는 post-treatment한 결과, 망막색소상피층의 변성이 감소되고 상피성이 유지 또는 회복되었다. 이를 통해 GV1001의 노년성 황반변성에 대한 우수한 예방 및/또는 치료 효능을 확인하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 황반변성은 노년성 황반변성인 약학 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학 조성물은 망막색소상피세포의 변성을 감소시킴으로써 황반변성을 예방 또는 치료하는 것인 약학 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 약학 조성물; 및
황반변성의 예방 또는 치료 방법이 기재된 지시서를 포함하는 황반변성의 예방 또는 치료용 키트.
청구항 4에 있어서, 상기 황반변성의 예방 또는 치료 방법은 상기 약학 조성물을 황반변성이 발병했거나 발병할 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것인 키트.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 황반변성의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
청구항 6에 있어서, 상기 황반변성은 노년성 황반변성인 건강기능식품.
청구항 6에 있어서, 상기 건강기능식품은 망막색소상피세포의 변성을 감소시킴으로써 황반변성을 예방 또는 개선하는 것인 건강기능식품.