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KR20240144261A - 치료적 rna - Google Patents

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KR20240144261A
KR20240144261A KR1020247028726A KR20247028726A KR20240144261A KR 20240144261 A KR20240144261 A KR 20240144261A KR 1020247028726 A KR1020247028726 A KR 1020247028726A KR 20247028726 A KR20247028726 A KR 20247028726A KR 20240144261 A KR20240144261 A KR 20240144261A
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KR
South Korea
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rna
seq
tumor
protein
identity
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020247028726A
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Inventor
프리데리케 기제케
우구르 사힌
디미트리 지. 위데르셰인
티모시 알. 와게나르
Original Assignee
사노피
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Filing date
Publication date
Application filed by 사노피 filed Critical 사노피
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Abstract

본 개시는 고형 종양 암 치료를 위한 치료적 RNA의 분야에 관한 것이다.

Description

치료적 RNA {THERAPEUTIC RNA}
본 출원은 2017년 2월 28일 출원된 미국 가출원 제62/464,981호; 2017년 12월 12일 출원된 미국 가출원 제62/597,527호; 및 2017년 8월 23일 출원된 유럽 특허출원 제17306089.8호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 포함된다.
본 개시는 고형 종양을 치료하는 치료적 RNA의 분야에 관한 것이다. 국립 암 연구소는 고형 종양을 정상적으로 낭포 또는 액체 영역을 함유하지 않는 비정상적인 조직 덩어리로 정의한다. 고형 종양은 양성 및 악성(암성) 육종, 암종 및 림프종을 포함하고, 뇌, 난소, 유방, 결장 및 기타 조직을 포함한 임의의 조직 또는 기관에 물리적으로 위치할 수 있다. 암은 종종 두 가지 주요 유형인 고형 종양 암과 혈액암으로 나뉜다. 1500만 건 이상의 암이 매년 미국에서 진단되며 미국에서 500,000명 이상이 매년 암으로 사망할 것으로 추정된다.
고형 종양 암은 특히 치료가 어렵다. 현재 치료법은 수술, 방사선요법, 면역요법 및 화학요법을 포함한다. 수술은 단독적으로는 작은 국소형 종양을 위한 적절한 치료법일 수 있지만, 대규모 침습 종양 및 대다수 전이성 악성 종양은 보통 수술에 의해 절제 불가능하다. 방사선요법 및 화학요법과 같은 기타 일반적인 치료법은 원치 않는 부작용 및 건강한 세포에 대한 손상과 관련이 있다.
수술과 현재의 치료법이 때때로 고형 종양의 벌크를 살해할 수 있지만, (잠재적으로 암 줄기세포를 포함한) 추가 세포가 치료법에도 살아남을 수 있다. 이러한 세포들은 시간이 지나면서 새로운 종양을 형성하여 암 재발을 초래할 수 있다. 다중 양식의 통상적인 치료법에도 무병 생존율은 여러 종류의 고형 종양의 경우 25% 미만이다. 다중 양식 치료법에 저항성이거나 치료 후에 재발한 고형 종양은 훨씬 더 치료가 어렵고, 장기간 생존율이 10% 미만이다.
현재의 고형 종양의 치료의 단점을 극복할 수 있는 조성물, 용도 및 방법이 본 명세서에 개시된다. 본 명세서에 개시된 치료적 RNA의 투여는 종양 크기를 감소시킬 수 있고/있거나, 생존 기간을 연장할 수 있고/있거나, 종양의 전이 및/또는 재발로부터 보호할 수 있다.
구현예 1. 서열번호 14의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA 및 서열번호 27의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 서열번호 24의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IL-15 스시(sushi) 단백질을 암호화하는 RNA를 더 포함하는 조성물.
구현예 3. 구현예 1에 있어서, 서열번호 9의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IL-2 단백질을 암호화하는 RNA를 더 포함하는 조성물.
구현예 4. 구현예 1에 있어서, 서열번호 19의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IFNα2b 단백질을 암호화하는 RNA를 더 포함하는 조성물.
구현예 5. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA;
b. 서열번호 27의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA; 및
c. 서열번호 19의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IFNα2b 단백질을 암호화하는 RNA.
구현예 6. 구현예 5에 있어서, 서열번호 24의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA를 더 포함하는 조성물.
구현예 7. 구현예 5에 있어서, 서열번호 9의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IL-2 단백질을 암호화하는 RNA를 더 포함하는 조성물.
구현예 8. 구현예 1 내지 7 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 적어도 하나의 우리딘 대신 개질된 핵염기를 포함하는 것인, 조성물.
구현예 9. 구현예 1 내지 7 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 각각의 우리딘 대신 개질된 핵염기를 포함하는 것인, 조성물.
구현예 10. 구현예 8 또는 9에 있어서, 개질된 핵염기는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)인, 조성물.
구현예 11. 구현예 10에 있어서, 개질된 핵염기는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)인, 조성물.
구현예 12. 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 5' 캡(cap)을 더 포함하는 것인, 조성물.
구현예 13. 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 5' 캡을 더 포함하는 것인, 조성물.
구현예 14. 구현예 12 또는 13에 있어서, 5' 캡은 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G인, 조성물.
구현예 15. 구현예 1 내지 14 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 5' UTR을 더 포함하는 것인, 조성물.
구현예 16. 구현예 1 내지 14 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 5' UTR을 더 포함하는 것인, 조성물.
구현예 17. 구현예 15 또는 16에 있어서, 5' UTR은 서열번호 2, 4, 또는 6의 뉴클레오티드, 또는 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성되는 것인, 조성물.
구현예 18. 구현예 1 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 3' UTR을 더 포함하는 것인, 조성물.
구현예 19. 구현예 1 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 3' UTR을 더 포함하는 것인, 조성물.
구현예 20. 구현예 18 또는 19에 있어서, 3' UTR은 서열번호 8의 뉴클레오티드, 또는 서열번호 8에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성되는 것인, 조성물.
구현예 21. 구현예 1 내지 20 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 것인, 조성물.
구현예 22. 구현예 1 내지 20 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 것인, 조성물.
구현예 23. 구현예 21 또는 22에 있어서, 폴리-A 꼬리는 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 조성물.
구현예 24. 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 조성물.
구현예 25. 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 조성물.
구현예 26. 구현예 24 또는 25에 있어서,
a. 5' 캡은 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G이고;
b. 5' UTR은 서열번호 2, 4, 또는 6의 뉴클레오티드, 또는 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성되고;
c. 3' UTR은 서열번호 8의 뉴클레오티드, 또는 서열번호 8에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성되고;
d. 폴리-A 꼬리는 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 조성물.
구현예 27. 대상체에 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 암 치료 또는 예방, 종양 크기 감소, 관해 중인 암의 재발 방지, 또는 암 전이 방지 방법.
구현예 28. 대상체의 암 치료 또는 예방, 종양 크기 감소, 관해 중인 암의 재발 방지, 또는 암 전이 방지 방법으로,
a. 서열번호 14의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
b. 서열번호 27의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA를 대상체에 투여하여,
대상체의 암을 치료 또는 예방하거나, 종양 크기를 감소시키거나, 관해 중인 암의 재발을 방지하거나, 암 전이를 방지하는 방법.
구현예 29. 구현예 28에 있어서, 서열번호 19의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
구현예 30. 구현예 28에 있어서, 서열번호 24의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
구현예 31. 구현예 28에 있어서, 서열번호 9의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
구현예 32. 구현예 28에 있어서,
a. 서열번호 24의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
b. 서열번호 19의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
구현예 33. 구현예 28에 있어서,
a. 서열번호 9의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
b. 서열번호 19의 아미노산에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일한 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
구현예 34. 구현예 27 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 암은 육종, 암종, 또는 림프종인, 방법.
구현예 35. 구현예 27 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 암은 고형 종양인, 방법.
구현예 36. 구현예 35에 있어서, 고형 종양은 폐, 결장, 난소, 자궁경부, 자궁, 복막, 고환, 음경, 혀, 림프절, 췌장, 뼈, 유방, 전립선, 연조직, 결합조직, 신장, 간, 뇌, 갑상선, 또는 피부에 존재하는 것인, 방법.
구현예 37. 구현예 35에 있어서, 고형 종양은 상피성 종양, 호지킨 림프종(HL), 비 호지킨 림프종, 전립선 종양, 난소 종양, 신장세포 종양, 소화관 종양, 간 종양, 결장직장 종양, 맥관 구조가 있는 종양, 중피종 종양, 췌장 종양, 유방 종양, 육종 종양, 폐 종양, 결장 종양, 뇌 종양, 흑색종 종양, 소세포 폐 종양, 신경모세포종, 고환 종양, 암종, 선암종, 신경아교종 종양, 고환종 종양, 망막모세포종, 또는 골육종 종양인, 방법.
구현예 38. 구현예 27 내지 37 중 어느 한 구현예에 있어서, 조성물은 종양 내 또는 종양 주위로 투여되는 것인, 방법.
구현예 39. 구현예 38에 있어서, 주사된 종양 및 비 주사 종양 모두 제1 종양 또는 그 근처로의 종양 내 또는 종양 주위 주사 후에 크기가 감소되는 것인, 방법.
구현예 40. 구현예 27 내지 39 중 어느 한 구현예에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
구현예 41. 구현예 27 내지 40 중 어느 한 구현예에 있어서, 또 다른 치료법도 투여되는 것인, 방법.
구현예 42. 구현예 41에 있어서, 다른 치료법은 종양을 절개, 절제, 또는 감량하는 수술인, 방법.
구현예 43. 구현예 41에 있어서, 다른 치료법은 면역요법, 방사선요법 또는 화학요법인, 방법.
구현예 44. 구현예 27 내지 43 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 적어도 하나의 우리딘 대신 개질된 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
구현예 45. 구현예 27 내지 43 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 각각의 우리딘 대신 개질된 핵염기를 포함하는 것인, 방법.
구현예 46. 구현예 44 또는 45에 있어서, 개질된 핵염기는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)인, 방법.
구현예 47. 구현예 46에 있어서, 개질된 핵염기는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)인, 방법.
구현예 48. 구현예 27 내지 47 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 5' 캡을 더 포함하는 것인, 방법.
구현예 49. 구현예 27 내지 47 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 5' 캡을 더 포함하는 것인, 방법.
구현예 50. 구현예 48 또는 49에 있어서, 5' 캡은 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G인, 방법.
구현예 51. 구현예 27 내지 50 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 5' UTR을 더 포함하는 것인, 방법.
구현예 52. 구현예 27 내지 50 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 5' UTR을 더 포함하는 것인, 방법.
구현예 53. 구현예 51 또는 52에 있어서, 5' UTR은 서열번호 2, 4, 또는 6의 뉴클레오티드, 또는 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성되는 것인, 방법.
구현예 54. 구현예 27 내지 54 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 3' UTR을 더 포함하는 것인, 방법.
구현예 55. 구현예 27 내지 54 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 3' UTR을 더 포함하는 것인, 방법.
구현예 56. 구현예 54 또는 55에 있어서, 3' UTR은 서열번호 8의 뉴클레오티드, 또는 서열번호 8에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성되는 것인, 방법.
구현예 57. 구현예 27 내지 56 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 것인, 방법.
구현예 58. 구현예 27 내지 56 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 것인, 방법.
구현예 59. 구현예 57 또는 58에 있어서, 폴리-A 꼬리는 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
구현예 60. 구현예 27 내지 59 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 방법.
구현예 61. 구현예 27 내지 59 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 방법.
구현예 62. 구현예 60 또는 61에 있어서,
a. 5' 캡은 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G이고;
b. 5' UTR은 서열번호 2, 4, 또는 6의 뉴클레오티드, 또는 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성되고;
c. 3' UTR은 서열번호 8의 뉴클레오티드, 또는 서열번호 8에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성되고;
d. 폴리-A 꼬리는 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
구현예 63. 서열번호 11에 대해 적어도 83% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 코돈 최적화 DNA.
구현예 64. 구현예 63에 있어서, 서열번호 11에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA.
구현예 65. 서열번호 13에 대해 적어도 83% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 코돈 최적화 RNA.
구현예 66. 구현예 65에 있어서, 서열번호 13에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 RNA.
구현예 67. 구현예 63 또는 64의 DNA로부터 생성된 RNA.
구현예 68. 코돈 최적화 DNA로서,
a. 서열번호 16의 뉴클레오티드 1 내지 984에 대해 적어도 78% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드;
b. 서열번호 16의 뉴클레오티드 1027 내지 1623에 대해 적어도 81% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드; 및
c. a) 및 b)의 뉴클레오티드 사이의 링커를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA.
구현예 69. 구현예 68에 있어서, 링커는 서열번호 16의 뉴클레오티드 985 내지 1026을 포함하는 것인, DNA.
구현예 70. 구현예 68 또는 69에 있어서, 부분 a)는 서열번호 16의 뉴클레오티드 1 내지 984에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하고; 부분 b)는 서열번호 16의 뉴클레오티드 1027 내지 1623에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 것인, DNA.
구현예 71. 코돈 최적화 RNA로서,
a. 서열번호 18의 뉴클레오티드 1 내지 984에 대해 적어도 78% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드;
b. 서열번호 18의 뉴클레오티드 1027 내지 1623에 대해 적어도 81% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드; 및
c. a) 및 b)의 뉴클레오티드 사이의 링커를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 RNA.
구현예 72. 구현예 71에 있어서, 링커는 서열번호 18의 뉴클레오티드 985 내지 1026을 포함하는 것인, RNA.
구현예 73. 구현예 71 또는 72에 있어서, 부분 a)는 서열번호 18의 뉴클레오티드 1 내지 984에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하고; 부분 b)는 서열번호 18의 뉴클레오티드 1027 내지 1623에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 것인, RNA.
구현예 74. 구현예 68 내지 70 중 어느 한 구현예의 DNA로부터 생성된 RNA.
구현예 75. 서열번호 21에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 코돈 최적화 DNA.
구현예 76. 구현예 75에 있어서, 서열번호 21에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA.
구현예 77. 서열번호 23에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 코돈 최적화 RNA.
구현예 78. 구현예 77에 있어서, 서열번호 23에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 RNA.
구현예 79. 구현예 75 또는 76의 DNA로부터 생성된 RNA.
구현예 80. DNA로서,
a. 서열번호 25의 뉴클레오티드 1 내지 321에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드;
b. 서열번호 25의 뉴클레오티드 382 내지 729에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
c. a) 및 b)의 뉴클레오티드 사이의 링커를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA.
구현예 81. 구현예 80의 DNA로부터 생성된 RNA.
구현예 82. RNA로서,
a. 서열번호 26의 뉴클레오티드 1 내지 321에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드;
b. 서열번호 26의 뉴클레오티드 382 내지 729에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
c. a) 및 b)의 뉴클레오티드 사이의 링커를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 RNA.
구현예 83. 서열번호 28에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA.
구현예 84. 구현예 83의 DNA로부터 생성된 RNA.
구현예 85. 서열번호 29에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 RNA.
구현예 86. 구현예 67, 74, 79, 81, 및 84 중 어느 한 구현예에 있어서, RNA는 시험관 내에서 DNA로부터 전사되는 것인, RNA.
구현예 87. 구현예 65 내지 67, 71 내지 74, 78 내지 79, 81 내지 82, 및 84 내지 85 중 어느 한 구현예에서, 적어도 하나의 우리딘은 개질된 핵염기로 교체되는 것인, RNA.
구현예 88. 구현예 65 내지 67, 71 내지 74, 78 내지 79, 81 내지 82, 및 84 내지 85 중 어느 한 구현예에서, 각 우리딘은 개질된 핵염기로 교체되는 것인, RNA.
구현예 89. 구현예 87 또는 88에 있어서, 개질된 핵염기는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)인, RNA.
구현예 90. 구현예 89에 있어서, 개질된 핵염기는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)인, RNA.
구현예 91. 구현예 65 내지 67, 71 내지 74, 78 내지 79, 81 내지 82, 및 84 내지 90 중 어느 한 구현예에서, 5' 캡을 더 포함하는, RNA.
구현예 92. 구현예 91에 있어서, 5' 캡은 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G인, RNA.
구현예 93. 구현예 65 내지 67, 71 내지 74, 78 내지 79, 81 내지 82, 및 84 내지 92 중 어느 한 구현예에 있어서, 5' UTR을 더 포함하는, RNA.
구현예 94. 구현예 93에 있어서, 5' UTR은 서열번호 2, 4, 또는 6의 뉴클레오티드, 또는 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성되는 것인, RNA.
구현예 95. 구현예 65 내지 67, 71 내지 74, 78 내지 79, 81 내지 82, 및 84 내지 94 중 어느 한 구현예에 있어서, 3' UTR을 더 포함하는, RNA.
구현예 96. 구현예 95에 있어서, 3' UTR은 서열번호 8의 뉴클레오티드, 또는 서열번호 8에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성되는 것인, RNA.
구현예 97. 구현예 65 내지 67, 71 내지 74, 78 내지 79, 81 내지 82, 및 84 내지 96 중 어느 한 구현예에 있어서, 폴리-A 꼬리를 더 포함하는, RNA.
구현예 98. 구현예 97에 있어서, 폴리-A 꼬리는 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, RNA.
구현예 99. 구현예 65 내지 67, 71 내지 74, 78 내지 79, 81 내지 82, 및 84 내지 97 중 어느 한 구현예에 있어서, 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는, RNA.
구현예 100. 구현예 99에 있어서,
a. 5' 캡은 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G이고;
b. 5' UTR은 서열번호 2, 4, 또는 6의 뉴클레오티드, 또는 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성되고;
c. 3' UTR은 서열번호 8의 뉴클레오티드, 또는 서열번호 8에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 또는 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성되고;
d. 폴리-A 꼬리는 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, RNA.
구현예 101. DNA로서,
a. 서열번호 11에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 83% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
b. 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA이며, 전사될 때, 부분 a) 및 b)의 뉴클레오티드는 단일 전사체를 형성하는 것인, DNA.
구현예 102. DNA로서,
a. 서열번호 16의 뉴클레오티드 1 내지 984에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80% 또는 78% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드;
b. 서열번호 16의 뉴클레오티드 1027 내지 1623에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80% 또는 81% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
c. 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA이며, 전사될 때, 부분 a), b) 및 c)의 뉴클레오티드는 단일 전사체를 형성하는 것인, DNA.
구현예 103. DNA로서,
a. 서열번호 21에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
b. 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA이며, 전사될 때, 부분 a) 및 b)의 뉴클레오티드는 단일 전사체를 형성하는 것인, DNA.
구현예 104. DNA로서,
a. 서열번호 28에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
b. 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA이며, 전사될 때, 부분 a) 및 b)의 뉴클레오티드는 단일 전사체를 형성하는 것인, DNA.
구현예 105. DNA로서,
a. 서열번호 25의 뉴클레오티드 1 내지 321에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드;
b. 서열번호 25의 뉴클레오티드 382 내지 729에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
c. 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA이며, 전사될 때, 부분 a), b) 및 c)의 뉴클레오티드는 단일 전사체를 형성하는 것인, DNA.
구현예 106. DNA로서,
a. 서열번호 11에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 83% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
b. 서열번호 7에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA이며, 전사될 때, 부분 a) 및 b)의 뉴클레오티드는 단일 전사체를 형성하는 것인, DNA.
구현예 107. DNA로서,
a. 서열번호 16의 뉴클레오티드 1 내지 984에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80% 또는 78% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드;
b. 서열번호 16의 뉴클레오티드 1027 내지 1623에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80% 또는 81% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
c. 서열번호 7에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA이며, 전사될 때, 부분 a), b) 및 c)의 뉴클레오티드는 단일 전사체를 형성하는 것인, DNA.
구현예 108. DNA로서,
a. 서열번호 21에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
b. 서열번호 7에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA이며, 전사될 때, 부분 a) 및 b)의 뉴클레오티드는 단일 전사체를 형성하는 것인, DNA.
구현예 109. DNA로서,
a. 서열번호 28에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
b. 서열번호 7에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA이며, 전사될 때, 부분 a) 및 b)의 뉴클레오티드는 단일 전사체를 형성하는 것인, DNA.
구현예 110. DNA로서,
a. 서열번호 25의 뉴클레오티드 1 내지 321에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드;
b. 서열번호 25의 뉴클레오티드 382 내지 729에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
c. 서열번호 7에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA이며, 전사될 때, 부분 a), b) 및 c)의 뉴클레오티드는 단일 전사체를 형성하는 것인, DNA.
구현예 111. DNA로서,
a. 서열번호 11에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 83% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드;
b. 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
c. 서열번호 7에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA이며, 전사될 때, 부분 a), b) 및 c)의 뉴클레오티드는 단일 전사체를 형성하는 것인, DNA.
구현예 112. DNA로서,
a. 서열번호 16의 뉴클레오티드 1 내지 984에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80% 또는 78% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드;
b. 서열번호 16의 뉴클레오티드 1027 내지 1623에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80% 또는 81% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드;
c. 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
d. 서열번호 7에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA이며, 전사될 때, 부분 a), b), c), 및 d)의 뉴클레오티드는 단일 전사체를 형성하는 것인, DNA.
구현예 113. DNA로서,
a. 서열번호 21에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드;
b. 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드로서, 부분 b)의 뉴클레오티드는 부분 a)의 뉴클레오티드의 발현을 조절하는 것인, 뉴클레오티드; 및
c. 서열번호 7에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA이며, 전사될 때, 부분 a), b) 및 c)의 뉴클레오티드는 단일 전사체를 형성하는 것인, DNA.
구현예 114. DNA로서,
a. 서열번호 28에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드;
b. 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
c. 서열번호 7에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA이며, 전사될 때, 부분 a), b) 및 c)의 뉴클레오티드는 단일 전사체를 형성하는 것인, DNA.
구현예 115. DNA로서,
a. 서열번호 25의 뉴클레오티드 1 내지 321에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드;
b. 서열번호 25의 뉴클레오티드 382 내지 729에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드;
c. 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드; 및
d. 서열번호 7에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된 DNA이며, 전사될 때, 부분 a), b), c), 및 d)의 뉴클레오티드는 단일 전사체를 형성하는 것인, DNA.
구현예 116. 구현예 101 내지 115의 DNA 중 임의의 하나로부터 생성된 RNA.
구현예 117. 구현예 116에 있어서, 적어도 하나의 우리딘은 개질된 핵염기로 교체되는 것인, RNA.
구현예 118. 구현예 116에 있어서, 각 우리딘은 개질된 핵염기로 교체되는 것인, RNA.
구현예 119. 구현예 117 또는 118에 있어서, 개질된 핵염기는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 또는 5-메틸-우리딘(m5U)인, RNA.
구현예 120. 구현예 119에 있어서, 개질된 핵염기는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)인, RNA.
구현예 121. 구현예 116 내지 120 중 어느 한 구현예에 있어서, 5' 캡을 더 포함하는 RNA.
구현예 122. 구현예 121에 있어서, 5' 캡은 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G인, RNA.
구현예 123. 구현예 116 내지 122 중 어느 한 구현예에 있어서, 이중 가닥 RNA가 실질적으로 없는 RNA.
구현예 124. 구현예 116 내지 122 중 어느 한 구현예에 있어서, 이중 가닥 RNA가 RNA로부터 제거된 RNA.
구현예 125. 구현예 123 또는 124에 있어서, HPLC 또는 셀룰로스 기반 크로마토그래피를 통해 정제된 RNA.
구현예 126. 구현예 63 내지 125의 DNA 또는 RNA 중 임의의 하나 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 제형.
구현예 127. 구현예 63 내지 125의 RNA 또는 DNA, 또는 구현예 126의 약학적 제형 중 임의의 하나 이상을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 암 치료 또는 예방, 종양 크기 감소, 관해 중인 암의 재발 방지, 또는 암 전이 방지 방법.
구현예 128. 구현예 63 내지 125 중 어느 한 구현예의 DNA 또는 RNA, 구현예 1 내지 26 중 어느 한 구현예의 조성물, 또는 구현예 126의 약학적 제형 중 하나 이상을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 생체 내에서 IL-2, IL-12sc, IL-15 스시, GM-CSF 및 IFNα2b를 암호화하는 폴리펩티드의 제조 방법.
구현예 129. 적어도 2종의 RNA를 포함하는 조성물로서, 이 RNA는 상이한 단백질을 암호화하고, 이 RNA는 구현예 65 내지 67, 71 내지 74, 78 내지 79, 81 내지 82, 84 내지 100, 및 116 내지 125 중 어느 한 구현예의 RNA로부터 선택되는 것인, 조성물.
구현예 130. 구현예 129에 있어서, GM-CSF 및 IL-12sc를 암호화하는 2종의 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 131. 구현예 129에 있어서, GM-CSF, IL-12sc, 및 IFNα2b를 암호화하는 3종의 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 132. 구현예 129에 있어서, GM-CSF, IL-2, 및 IFNα2b를 암호화하는 3종의 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 133. 구현예 129에 있어서, GM-CSF, IL-12sc, IL-2 및 IFNα2b를 암호화하는 4종의 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 134. 구현예 129에 있어서, GM-CSF, IL-12sc, IL-15 스시 및 IFNα2b를 암호화하는 4종의 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 135. 구현예 130 내지 134 중 어느 한 구현예에 있어서, GM-CSF를 암호화하는 RNA는 구현예 84 또는 85의 RNA로부터 선택되는 것인, 조성물.
구현예 136. 구현예 130 내지 134 중 어느 한 구현예에 있어서, IL-12sc를 암호화하는 RNA는 구현예 71 내지 74 중 어느 한 구현예의 RNA로부터 선택되는 것인, 조성물.
구현예 137. 구현예 131 내지 134 중 어느 한 구현예에 있어서, IFNα2b를 암호화하는 RNA는 구현예 77 내지 79 중 어느 한 구현예의 RNA로부터 선택되는 것인, 조성물.
구현예 138. 구현예 134에 있어서, IL-15 스시를 암호화하는 RNA는 구현예 81 또는 82의 RNA로부터 선택되는 것인, 조성물.
구현예 139. 구현예 132 또는 133에 있어서, IL-2를 암호화하는 RNA는 구현예 65 내지 67 중 어느 한 구현예의 RNA로부터 선택되는 것인, 조성물.
구현예 140. 고형 종양 암의 치료 또는 예방 방법으로, 치료적 유효량의 다음 RNA 중 각각을 종양 내에 직접적으로 투여하는 단계를 포함하며:
a. IL-12sc를 암호화하는 RNA(서열번호 17 또는 18)를 포함하는 RNA;
b. GM-CSF를 암호화하는 RNA(서열번호 29)를 포함하는 RNA; 및
c. IFNα2b를 암호화하는 RNA(서열번호 22 또는 23)를 포함하는 RNA,
이때, 각 RNA는 각각의 우리딘 대신 개질된 핵염기를 포함하고, 각 RNA는 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 방법.
구현예 141. 고형 종양 암의 치료 또는 예방 방법으로, 치료적 유효량의 다음 RNA 중 각각을 종양 내에 직접적으로 투여하는 단계를 포함하며:
a. IL-12sc를 암호화하는 RNA(서열번호 17 또는 18)를 포함하는 RNA;
b. GM-CSF를 암호화하는 RNA(서열번호 29)를 포함하는 RNA;
c. IFNα2b를 암호화하는 RNA(서열번호 22 또는 23)를 포함하는 RNA; 및
d. IL-2를 암호화하는 RNA(서열번호 12 또는 13)를 포함하는 RNA,
이때, 각 RNA는 각각의 우리딘 대신 개질된 핵염기를 포함하고, 각 RNA는 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 방법.
구현예 142. 고형 종양 암의 치료 또는 예방 방법으로, 치료적 유효량의 다음 RNA 중 각각을 종양 내에 직접적으로 투여하는 단계를 포함하며:
a. IL-12sc를 암호화하는 RNA(서열번호 17 또는 18)를 포함하는 RNA;
b. GM-CSF를 암호화하는 RNA(서열번호 29)를 포함하는 RNA;
c. IFNα2b를 암호화하는 RNA(서열번호 22 또는 23)를 포함하는 RNA; 및
d. IL-15 스시를 암호화하는 RNA(서열번호 26)을 포함하는 RNA,
이때, 각 RNA는 각각의 우리딘 대신 개질된 핵염기를 포함하고, 각 RNA는 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 방법.
구현예 143. 각각의 우리딘이 개질된 핵염기로 교체된 서열번호 9의 아미노산에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하며, 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 144. 각각의 우리딘이 개질된 핵염기로 교체된 서열번호 14의 아미노산에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하며, 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 145. 각각의 우리딘이 개질된 핵염기로 교체된 서열번호 27의 아미노산에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하며, 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 146. 각각의 우리딘이 개질된 핵염기로 교체된 서열번호 19의 아미노산에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하며, 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 147. 각각의 우리딘이 개질된 핵염기로 교체된 서열번호 24의 아미노산에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하며, 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 148. 각각의 우리딘이 개질된 핵염기로 교체된 서열번호 17 또는 18에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지며, 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 IL-12sc RNA 조성물.
구현예 149. 각각의 우리딘이 개질된 핵염기로 교체된 서열번호 29에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지며, 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 GM-CSF RNA 조성물.
구현예 150. 각각의 우리딘이 우리딘 유사체로 교체된 서열번호 22 또는 23에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지며, 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 IFNα2b RNA 조성물.
구현예 151. 각각의 우리딘이 개질된 핵염기로 교체된 서열번호 26에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지며, 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 IL-15 스시 RNA 조성물.
구현예 152. 각각의 우리딘이 개질된 핵염기로 교체된 서열번호 12 또는 13에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지며, 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 IL-2 RNA 조성물.
구현예 153. 각각의 우리딘이 개질된 핵염기로 교체된 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지며, 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 IL-12sc RNA 조성물.
구현예 154. 각각의 우리딘이 개질된 핵염기로 교체된 서열번호 29의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지며, 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 GM-CSF RNA 조성물.
구현예 155. 각각의 우리딘이 개질된 핵염기로 교체된 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지며, 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 IFNα2b RNA 조성물.
구현예 156. 각각의 우리딘이 개질된 핵염기로 교체된 서열번호 26의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지며, 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 IL-15 스시 RNA 조성물.
구현예 157. 각각의 우리딘이 개질된 핵염기로 교체된 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어지며, 5' UTR(서열번호 2, 4, 또는 6), 3' UTR(서열번호 8), 5' 캡, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함하는 IL-2 RNA 조성물.
구현예 158. 구현예 143 내지 157 중 어느 한 구현예에 있어서, 개질된 핵염기는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 또는 5-메틸-우리딘(m5U)인, 조성물.
구현예 159. IFNα2b를 암호화하는 RNA를 포함하는 조성물로서, 이 RNA는 변형되어 비변형 RNA와 비교하여 감소된 면역원성을 갖는 것인, 조성물.
구현예 160. 구현예 159에 있어서, 변형은 적어도 하나의 우리딘의 개질된 핵염기로의 치환을 포함하는 것인, 조성물.
구현예 161. 구현예 159에 있어서, 개질된 핵염기는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 또는 5-메틸-우리딘(m5U)인, 조성물.
구현예 162. 구현예 161에 있어서, 개질된 핵염기는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)인, 조성물.
구현예 163. 구현예 159 내지 162 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형은 이중 가닥 RNA 양의 감소를 포함하는 것인, 조성물.
구현예 164. 구현예 163에 있어서, 이중 가닥 RNA의 감소는 HPLC 또는 셀룰로스 기반 크로마토그래피를 통한 정제의 결과인 것인, 조성물.
구현예 165. 구현예 159 내지 164 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형은 비변형 RNA와 비교하여 선천 면역계에 의한 RNA 인식을 감소시키는 것인, 조성물.
구현예 166. 구현예 159 내지 165 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형은 RNA에 대한 5' 캡의 첨가를 포함하는 것인, 조성물.
구현예 167. 구현예 166에 있어서, 5' 캡은 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G인, 조성물.
구현예 168. 구현예 159 내지 167 중 어느 한 구현예에 있어서, 관심 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 제2 RNA를 더 포함하는 조성물.
구현예 169. 구현예 168에 있어서, 관심 펩티드 또는 단백질은 사이토카인, 케모카인, 자살 유전자 생성물, 면역원성 단백질 또는 펩티드, 세포자멸사 유도자, 혈관신생 억제자, 열 충격 단백질, 종양 항원, β-카테닌 억제자, STING 경로 활성인자, 레티노산 유도 유전자(RIG)-I 경로 활성인자, 톨 유사 수용체(TLR) 경로의 효현제, 체크포인트 조절자, 선천 면역 활성인자, 항체, 우성 음성 수용체 및 유인 수용체, 골수 유래 억제자 세포(MDSC)의 억제자, IDO 경로 억제자, 및 세포자멸사 억제자에 결합하는 단백질 또는 펩티드로부터 선택되거나 유래된 펩티드 또는 단백질인, 조성물.
구현예 170. 구현예 168 또는 169에 있어서, 제2 RNA는 변형되어 비변형 RNA와 비교하여 감소된 면역원성을 갖는 것인, 조성물.
구현예 171. 구현예 170에 있어서, 변형은 적어도 하나의 우리딘의 개질된 핵염기로의 치환을 포함하는 것인, 조성물.
구현예 172. 구현예 171에 있어서, 개질된 핵염기는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)인, 조성물.
구현예 173. 구현예 172에 있어서, 개질된 핵염기는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)인, 조성물.
구현예 174. 구현예 168 내지 173 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형은 이중 가닥 RNA 양의 감소를 포함하는 것인, 조성물.
구현예 175. 구현예 174에 있어서, 이중 가닥 RNA의 감소는 HPLC 또는 셀룰로스 기반 크로마토그래피를 통한 정제의 결과인 것인, 조성물.
구현예 176. 구현예 168 내지 173 중 어느 한 구현예에 있어서, 변형은 RNA에 대한 5' 캡의 첨가를 포함하는 것인, 조성물.
구현예 177. 구현예 176에 있어서, 5' 캡은 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G인, 조성물.
구현예 178. 구현예 168 내지 177 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 RNA는 다음을 포함하는 것인, 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
c. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 또는
d. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 179. 구현예 159 내지 178의 조성물 중 임의의 하나를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 암 치료 또는 예방, 종양 크기 감소, 관해 중인 암의 재발 방지, 또는 암 전이 방지 방법.
구현예 180. 구현예 159 내지 178 중 어느 한 구현예에 있어서, 암 치료 또는 예방, 종양 크기 감소, 관해 중인 암의 재발 방지, 또는 암 전이 방지 방법에 사용하기 위한 조성물.
구현예 181. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 182. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 183. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 184. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 185. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 186. IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 조성물로서, 이 RNA는 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 조성물.
구현예 187. GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 조성물로서, 이 RNA는 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 조성물.
구현예 188. IFNα2b 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 조성물로서, 이 RNA는 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 조성물.
구현예 189. IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 조성물로서, 이 RNA는 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 조성물.
구현예 190. IL-2 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 조성물로서, 이 RNA는 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 조성물.
구현예 191. 다음 RNA 중 임의의 2종을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
c. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
d. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
e. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 192. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
b. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 193. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
b. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 194. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
b. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 195. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
b. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 196. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
b. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 197. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
b. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 198. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
b. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 199. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
b. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 200. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
b. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 201. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
b. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 202. 다음 중 임의의 3종을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
c. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
d. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
a. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 203. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
c. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 204. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
c. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 205. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
c. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 206. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
c. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 207. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
c. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 208. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
c. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 209. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
c. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 210. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
c. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 211. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
c. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 212. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
c. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 213. 다음 중 임의의 4종을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
c. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
d. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
e. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 214. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
c. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
d. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 215. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
c. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
d. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 216. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
c. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
d. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 217. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
c. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
d. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 218. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
c. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
d. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 219. 다음을 포함하는 조성물:
a. 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-12sc 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
b. 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 GM-CSF 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 29의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
c. 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IFNα2b 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA;
d. 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-15 스시 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 26의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA; 및
e. 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 IL-2 단백질을 암호화하고/암호화하거나, 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 RNA.
구현예 220. 구현예 181 내지 219의 조성물 중 임의의 하나를 포함하는 약학적 제형.
구현예 221. 구현예 181 내지 219의 조성물 중 임의의 하나 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 제형.
구현예 222. 암 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한, 구현예 181 내지 219 중 어느 한 구현예의 조성물 또는 구현예 220 또는 221의 약학적 제형.
구현예 223. 종양 크기 감소 방법에 사용하기 위한, 구현예 181 내지 219 중 어느 한 구현예의 조성물 또는 구현예 220 또는 221의 약학적 제형.
구현예 224. 관해 중인 암의 재발 방지 방법에 사용하기 위한, 구현예 181 내지 219 중 어느 한 구현예의 조성물 또는 구현예 220 또는 221의 약학적 제형.
구현예 225. 암 전이 예방 방법에 사용하기 위한, 구현예 181 내지 219 중 어느 한 구현예의 조성물 또는 구현예 220 또는 221의 약학적 제형.
구현예 226. 구현예 181 내지 219 중 어느 한 구현예의 조성물 또는 구현예 220 또는 221의 약학적 제형을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 또는 예방 방법.
구현예 227. 구현예 181 내지 219 중 어느 한 구현예의 조성물 또는 구현예 220 또는 221의 약학적 제형을 투여하는 단계를 포함하는, 종양 크기 감소 방법.
구현예 228. 구현예 181 내지 219 중 어느 한 구현예의 조성물 또는 구현예 220 또는 221의 약학적 제형을 투여하는 단계를 포함하는, 관해 중인 암의 재발 방지 방법.
구현예 229. 구현예 181 내지 219 중 어느 한 구현예의 조성물 또는 구현예 220 또는 221의 약학적 제형을 투여하는 단계를 포함하는, 암 전이 방지 방법.
본 발명의 추가 구현예는 다음과 같다:
구현예 A 1. IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA 및 GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 의약 제제.
구현예 A 2. 구현예 A 1에 있어서, IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA를 더 포함하는 의약 제제.
구현예 A 3. 구현예 A 1 또는 2에 있어서, IL-2 단백질을 암호화하는 RNA를 더 포함하는 의약 제제.
구현예 A 4. 구현예 A 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 있어서, IFNα 단백질을 암호화하는 RNA를 더 포함하는 의약 제제.
구현예 A 5. 구현예 A 4에 있어서, IFNα 단백질은 IFNα2b 단백질인, 의약 제제.
구현예 A 6. 구현예 A 2에 있어서, IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 의약 제제.
구현예 A 7. 구현예 A 3에 있어서, IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IL-2 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 의약 제제.
구현예 A 8. 구현예 A 4 또는 5에 있어서, IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IFNα 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 의약 제제.
구현예 A 9. 구현예 A 4 또는 5에 있어서, IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IFNα 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 의약 제제.
구현예 A 10. 구현예 A 4 또는 5에 있어서, IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, IL-2 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IFNα 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 의약 제제.
구현예 A 11. 구현예 A 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, (i) IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IL-12sc 단백질은 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 12. 구현예 A 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, (i) GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) GM-CSF 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열, 또는 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 13. 구현예 A 2 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, (i) IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IL-15 스시 단백질은 서열번호 24의 아미노산 서열, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 14. 구현예 A 3 내지 13 중 어느 한 구현예에 있어서, (i) IL-2 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IL-2 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열, 또는 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 15. 구현예 A 4 내지 14 중 어느 한 구현예에 있어서, (i) IFNα 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IFNα 단백질은 서열번호 19의 아미노산 서열, 또는 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 16. 구현예 A 1 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 적어도 하나의 우리딘 대신 개질된 핵염기를 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 17. 구현예 A 1 내지 16 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 적어도 하나의 우리딘 대신 개질된 핵염기를 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 18. 구현예 A 1 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 각각의 우리딘 대신 개질된 핵염기를 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 19. 구현예 A 16 내지 18 중 어느 한 구현예에 있어서, 개질된 핵염기는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)인, 의약 제제.
구현예 A 20. 구현예 A 19에 있어서, 개질된 핵염기는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)인, 의약 제제.
구현예 A 21. 구현예 A 1 내지 20 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 5' 캡을 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 22. 구현예 A 1 내지 21 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 5' 캡을 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 23. 구현예 A 21 또는 22에 있어서, 5' 캡은 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G인, 의약 제제.
구현예 A 24. 구현예 A 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 5' UTR을 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 25. 구현예 A 1 내지 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 5' UTR을 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 26. 구현예 A 24 또는 25에 있어서, 5' UTR은 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 27. 구현예 A 1 내지 26 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 3' UTR을 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 28. 구현예 A 1 내지 27 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 3' UTR을 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 29. 구현예 A 27 또는 28에 있어서, 3' UTR은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 30. 구현예 A 1 내지 29 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 31. 구현예 A 1 내지 30 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 32. 구현예 A 30 또는 31에 있어서, 폴리-A 꼬리는 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 33. 구현예 A 1 내지 32 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 34. 구현예 A 1 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 35. 구현예 A 33 또는 34에 있어서,
a. 5' 캡은 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G이고;
b. 5' UTR은 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
c. 3' UTR은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
d. 폴리-A 꼬리는 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 36. 구현예 A 1 내지 35 중 어느 한 구현예에 있어서, RNA는 mRNA인, 의약 제제.
구현예 A 37. 구현예 A 1 내지 36 중 어느 한 구현예에 있어서, 추가의 치료제를 포함하는 의약 제제.
구현예 A 38. 구현예 A 37에 있어서, 추가의 치료제는 항암 치료제인, 의약 제제.
구현예 A 39. 구현예 A 37 또는 38에 있어서, 추가의 치료제는 체크포인트 조절자인, 의약 제제.
구현예 A 40. 구현예 A 39에 있어서, 체크포인트 조절자는 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 또는 항-PD1 항체와 항-CTLA-4 항체의 조합물인, 의약 제제.
구현예 A 41. 구현예 A 1 내지 40 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 2개의 용기를 포함하는 키트이며, 각각의 용기는 상기 RNA 중 적어도 1종을 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 42. 구현예 A 41에 있어서, 개별의 용기에 각각의 RNA를 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 43. 구현예 A 41 또는 42에 있어서, 추가의 치료제는 RNA를 포함하지 않는 용기에 존재하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 44. 구현예 A 41 내지 43 중 어느 한 구현예에 있어서, 암 치료 또는 예방을 위한 의약 제제의 사용 설명서를 더 포함하는 의약 제제.
구현예 A 45. 구현예 A 1 내지 40 중 어느 한 구현예에 있어서, RNA를 포함하는 약학적 조성물인 의약 제제.
구현예 A 46. 구현예 A 45에 있어서, 약학적 조성물은 1종 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 더 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 47. 구현예 A 1 내지 46 중 어느 한 구현예에 있어서, RNA는 액체 형태, 고체 형태, 또는 이의 조합으로부터 선택되는 형태로 존재하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 48. 구현예 A 47에 있어서, 고체 형태는 냉동 형태 또는 건조 형태인, 의약 제제.
구현예 A 49. 구현예 A 48에 있어서, 건조 형태는 동결 건조 또는 분무 건조 형태인, 의약 제제.
구현예 A 50. 구현예 A 1 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, 약학적 용도를 위한 의약 제제.
구현예 A 51. 구현예 A 50에 있어서, 약학적 용도는 질병 또는 장애의 치료적 또는 예방적 처치를 포함하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 52. 구현예 A 1 내지 51 중 어느 한 구현예에 있어서, 암 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 의약 제제.
구현예 A 53. 구현예 A 38 내지 52 중 어느 한 구현예에 있어서, 암은 육종, 암종, 또는 림프종인, 의약 제제.
구현예 A 54. 구현예 A 38 내지 53 중 어느 한 구현예에 있어서, 암은 고형 종양인, 의약 제제.
구현예 A 55. 구현예 A 54에 있어서, 고형 종양은 폐, 결장, 난소, 자궁경부, 자궁, 복막, 고환, 음경, 혀, 림프절, 췌장, 뼈, 유방, 전립선, 연조직, 결합조직, 신장, 간, 뇌, 갑상선, 또는 피부에 존재하는 것인, 의약 제제.
구현예 A 56. 구현예 A 54 또는 55에 있어서, 고형 종양은 상피성 종양, 호지킨 림프종(HL), 비 호지킨 림프종, 전립선 종양, 난소 종양, 신장세포 종양, 소화관 종양, 간 종양, 결장직장 종양, 맥관 구조가 있는 종양, 중피종 종양, 췌장 종양, 유방 종양, 육종 종양, 폐 종양, 결장 종양, 뇌 종양, 흑색종 종양, 소세포 폐 종양, 신경모세포종 종양, 고환 종양, 암종 종양, 선암종 종양, 신경아교종 종양, 고환종 종양, 망막모세포종, 또는 골육종 종양인, 의약 제제.
구현예 A 57. 구현예 A 1 내지 56 중 어느 한 구현예에 있어서, RNA는 종양 내 또는 종양 주위 투여를 위한 것인, 의약 제제.
구현예 A 58. 구현예 A 37 내지 57 중 어느 한 구현예에 있어서, 추가의 치료제는 전신 투여를 위한 것인, 의약 제제.
구현예 A 59. 구현예 A 1 내지 58 중 어느 한 구현예에 있어서, 인간에 투여하기 위한 것인, 의약 제제.
구현예 A 60. 구현예 A 44 및 47 내지 59 중 어느 한 구현예에 있어서, 암 치료 또는 예방은 대상체의 종양의 크기 감소, 관해 중인 암의 재발 방지, 또는 암 전이 방지를 포함하는 것인, 의약 제제.
본 발명의 추가 구현예는 다음과 같다:
구현예 B 1. 대상체의 암 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 RNA로서, 이 방법은 IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA 및 GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 2. 구현예 B 1에 있어서, 방법은 IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 더 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 3. 구현예 B 1 또는 2에 있어서, 방법은 IL-2 단백질을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 더 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 4. 구현예 B 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 있어서, 방법은 IFNα 단백질을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 더 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 5. 구현예 B 4에 있어서, IFNα 단백질은 IFNα2b 단백질인, RNA.
구현예 B 6. 구현예 B 2에 있어서, 방법은 IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 7. 구현예 B 3에 있어서, 방법은 IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IL-2 단백질을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 8. 구현예 B 4 또는 5에 있어서, 방법은 IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IFNα 단백질을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 9. 구현예 B 4 또는 5에 있어서, 방법은 IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IFNα 단백질을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 10. 구현예 B 4 또는 5에 있어서, 방법은 IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, IL-2 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IFNα 단백질을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 11. 구현예 B 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, (i) IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IL-12sc 단백질은 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 12. 구현예 B 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, (i) GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) GM-CSF 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열, 또는 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 13. 구현예 B 2 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, (i) IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IL-15 스시 단백질은 서열번호 24의 아미노산 서열, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 14. 구현예 B 3 내지 13 중 어느 한 구현예에 있어서, (i) IL-2 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 12 또는 13의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IL-2 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열, 또는 서열번호 9의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 15. 구현예 B 4 내지 14 중 어느 한 구현예에 있어서, (i) IFNα 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IFNα 단백질은 서열번호 19의 아미노산 서열, 또는 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 16. 구현예 B 1 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 적어도 하나의 우리딘 대신 개질된 핵염기를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 17. 구현예 B 1 내지 16 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 적어도 하나의 우리딘 대신 개질된 핵염기를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 18. 구현예 B 1 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 각각의 우리딘 대신 개질된 핵염기를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 19. 구현예 B 16 내지 18 중 어느 한 구현예에 있어서, 개질된 핵염기는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)인, RNA.
구현예 B 20. 구현예 B 19에 있어서, 개질된 핵염기는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)인, RNA.
구현예 B 21. 구현예 B 1 내지 20 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 5' 캡을 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 22. 구현예 B 1 내지 21 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 5' 캡을 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 23. 구현예 B 21 또는 22에 있어서, 5' 캡은 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G인, RNA.
구현예 B 24. 구현예 B 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 5' UTR을 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 25. 구현예 B 1 내지 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 5' UTR을 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 26. 구현예 B 24 또는 25에 있어서, 5' UTR은 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 27. 구현예 B 1 내지 26 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 3' UTR을 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 28. 구현예 B 1 내지 27 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 3' UTR을 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 29. 구현예 B 27 또는 28에 있어서, 3' UTR은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 30. 구현예 B 1 내지 29 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 31. 구현예 B 1 내지 30 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 32. 구현예 B 30 또는 31에 있어서, 폴리-A 꼬리는 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 33. 구현예 B 1 내지 32 중 어느 한 구현예에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 34. 구현예 B 1 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 각 RNA는 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 35. 구현예 B 33 또는 34에 있어서,
a. 5' 캡은 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G이고;
b. 5' UTR은 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
c. 3' UTR은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
d. 폴리-A 꼬리는 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 36. 구현예 B 1 내지 35 중 어느 한 구현예에 있어서, RNA는 mRNA인, RNA.
구현예 B 37. 구현예 B 1 내지 36 중 어느 한 구현예에 있어서, 방법은 추가의 치료법을 투여하는 단계를 더 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 38. 구현예 B 37에 있어서, 추가의 치료법은 (i) 종양 절개, 절제, 또는 감량 수술, (ii) 면역요법, (iii) 방사선요법, 및 (iv) 화학요법으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 39. 구현예 B 37 또는 38에 있어서, 추가의 치료법은 추가의 치료제 투여를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 40. 구현예 B 39에 있어서, 추가의 치료제는 항암 치료제인, RNA.
구현예 B 41. 구현예 B 39 또는 40에 있어서, 추가의 치료제는 체크포인트 조절자인, RNA.
구현예 B 42. 구현예 B 41에 있어서, 체크포인트 조절자는 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 또는 항-PD1 항체와 항-CTLA-4 항체의 조합물인, RNA.
구현예 B 43. 구현예 B 1 내지 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 암은 육종, 암종, 또는 림프종인, RNA.
구현예 B 44. 구현예 B 1 내지 43 중 어느 한 구현예에 있어서, 암은 고형 종양인, RNA.
구현예 B 45. 구현예 B 44에 있어서, 고형 종양은 폐, 결장, 난소, 자궁경부, 자궁, 복막, 고환, 음경, 혀, 림프절, 췌장, 뼈, 유방, 전립선, 연조직, 결합조직, 신장, 간, 뇌, 갑상선, 또는 피부에 존재하는 것인, RNA.
구현예 B 46. 구현예 B 44 또는 45에 있어서, 고형 종양은 상피성 종양, 호지킨 림프종(HL), 비 호지킨 림프종, 전립선 종양, 난소 종양, 신장세포 종양, 소화관 종양, 간 종양, 결장직장 종양, 맥관 구조가 있는 종양, 중피종 종양, 췌장 종양, 유방 종양, 육종 종양, 폐 종양, 결장 종양, 뇌 종양, 흑색종 종양, 소세포 폐 종양, 신경모세포종 종양, 고환 종양, 암종 종양, 선암종 종양, 신경아교종 종양, 고환종 종양, 망막모세포종, 또는 골육종 종양인, RNA.
구현예 B 47. 구현예 B 1 내지 46 중 어느 한 구현예에 있어서, RNA는 종양 내 또는 종양 주위로 투여되는 것인, RNA.
구현예 B 48. 구현예 B 39 내지 47 중 어느 한 구현예에 있어서, 추가의 치료제는 전신 투여되는 것인, RNA.
구현예 B 49. 구현예 B 1 내지 48 중 어느 한 구현예에 있어서, 대상체는 인간인, RNA.
구현예 B 50. 구현예 B 1 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, RNA는 동시에 투여되는 것인, RNA.
구현예 B 51. 구현예 B 1 내지 50 중 어느 한 구현예에 있어서, RNA는 RNA의 조합물을 포함하는 조성물을 투여함으로써 투여되는 것인, RNA.
구현예 B 52. 구현예 B 1 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, RNA 중 적어도 2종은 상이한 시기에 투여되는 것인, RNA.
구현예 B 53. 구현예 B 1 내지 49 및 52 중 어느 한 구현예에 있어서, RNA는 각 조성물이 상기 RNA 중 적어도 1종을 포함하는, 적어도 2종의 조성물을 투여함으로써 투여되는 것인, RNA.
구현예 B 54. 구현예 B 1 내지 53 중 어느 한 구현예에 있어서, 암 치료 또는 예방은 대상체의 종양의 크기 감소, 관해 중인 암의 재발 방지, 또는 암 전이 방지를 포함하는 것인, RNA.
구현예 B 55. 구현예 B 1 내지 54 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법에서 투여되는 RNA 중 1종 이상이거나 이를 포함하는 RNA.
구현예 B 56. 구현예 B 55에 있어서, IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA, IL-2 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IFNα 단백질을 암호화하는 RNA로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이거나 이를 포함하는 RNA.
구현예 B 57. 구현예 B 55 또는 56에 있어서, IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA이거나 이를 포함하는 RNA.
구현예 B 58. 구현예 B 55 또는 56에 있어서, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA이거나 이를 포함하는 RNA.
구현예 B 59. 구현예 B 55 또는 56에 있어서, IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA이거나 이를 포함하는 RNA.
구현예 B 60. 구현예 B 55 또는 56에 있어서, IL-2 단백질을 암호화하는 RNA이거나 이를 포함하는 RNA.
구현예 B 61. 구현예 B 55 또는 56에 있어서, IFNα 단백질을 암호화하는 RNA이거나 이를 포함하는 RNA.
구현예 B 62. 구현예 B 55 또는 56에 있어서, IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA 및 GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA이거나 이를 포함하는 RNA.
구현예 B 63. 구현예 B 55 또는 56에 있어서, IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA이거나 이를 포함하는 RNA.
구현예 B 64. 구현예 B 55 또는 56에 있어서, IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IL-2 단백질을 암호화하는 RNA이거나 이를 포함하는 RNA.
구현예 B 65. 구현예 B 55 또는 56에 있어서, IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IFNα 단백질을 암호화하는 RNA이거나 이를 포함하는 RNA.
구현예 B 66. 구현예 B 55 또는 56에 있어서, IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IFNα 단백질을 암호화하는 RNA이거나 이를 포함하는 RNA.
구현예 B 67. 구현예 B 55 또는 56에 있어서, IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA, IL-2 단백질을 암호화하는 RNA, 및 IFNα 단백질을 암호화하는 RNA이거나 이를 포함하는 RNA.
도 1a 내지 도 1g는 B16F10 종양 보유 마우스에 제8일, 제10일, 제12일, 제14일에 mRNA를 종양 내 주사하고, 개별적인 종양 성장을 제41일까지 모니터링한 실험 결과를 보여준다. 도 1a 및 도 1d는 IL-2, IL-12sc, 및 GM-CSF (ModA) mRNA 사용 시의 결과를 보여준다. 도 1b 및 도 1e는 IL-2, IL-12sc, 및 GM-CSF (ModB) mRNA를 보여준다. 도 1c 및 도 1f는 루시퍼라아제 mRNA (ModA) 사용 시의 결과를 보여준다. 도 1g는 루시퍼라아제 mRNA (ModB) 사용 시의 결과를 보여준다. (a 내지 c의 경우 군당 N = 마우스 10마리 및 d 내지 g의 경우 군당 N = 마우스 9마리).
도 2a 내지 도 2d는 CT26 종양 보유 마우스에 제19일, 제21일, 제24일, 제26일, 제28일 및 제31일에 mRNA를 종양 내 주사하고, 개별적인 종양 성장을 제48일까지 모니터링한 실험 결과를 보여준다. 도 2a는 GM-CSF, IL-2, IL-12sc (ModA)를 보여준다. 도 2b는 GM-CSF, IL-2, IL-12sc (ModB)를 보여준다. 도 2c는 대조군으로서 루시퍼라아제 mRNA (ModA)를 보여준다. 도 2d는 대조군으로서 링거액을 보여준다.
도 3a 내지 도 3c는 CT26 종양 보유 마우스에 제13일, 제15일, 제18일, 제20일 및 제22일에 mRNA를 종양 내 주사하고, 종양 성장을 제42일까지 모니터링한 실험 결과를 보여준다. 도 3a는 IL-2, GM-CSF, IL-12sc (ModB)를 보여준다. 도 3b는 IL-15 스시, GM-CSF, IL-12sc (ModB)를 보여준다. 도 3c는 대조군으로서 루시퍼라아제 mRNA (ModB)를 보여준다.
도 4a 내지 도 4f는 B16F10 종양 보유 마우스에 제11일, 제13일, 제15일, 제17일에 사이토카인 mRNA 혼합물을 종양 내 주사하고, 개별적인 종양 성장을 제45일까지 모니터링한 실험 결과를 보여준다. 도 4a는 IL-2, IL-12sc, 및 GM-CSF (ModA)를 보여준다. 도 4b는 도 5a에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, IL-2, IL-12sc, 및 GM-CSF (ModB)를 보여준다. 도 4c는 IL-15 스시, IL-12sc, 및 GM-CSF (ModA)를 보여준다. 도 4d는 도 5b에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, IL-15 스시, IL-12sc, 및 GM-CSF (ModB)를 보여준다. 도 4e는 대조군 루시퍼라아제 mRNA (ModA)를 보여준다. 도 4f는 도 5d 및 6d에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, 대조군 루시퍼라아제 mRNA (ModB)를 보여준다. (군당 N = 마우스 8마리).
도 5a 내지 도 5d는 B16F10 종양 보유 마우스에 제11일, 제13일, 제15일, 제17일에 사이토카인 mRNA 혼합물을 종양 내 주사하고, 개별적인 종양 성장을 제45일까지 모니터링한 실험 결과를 보여준다. 도 5a는 도 4b에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, IL-2, IL-12sc, 및 GM-CSF (ModB)를 보여준다. 도 5b는 도 4d에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, IL-15 스시, IL-12sc, 및 GM-CSF (ModB)를 보여준다. 도 5c는 도 6c에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, IL-2, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα (ModB)를 보여준다. 도 5d는 도 4f 및 6d에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, 대조군으로서 루시퍼라아제 mRNA (ModB)를 보여준다. (군당 N = 마우스 8마리).
도 6a 및 도 6b는 CT26 종양 보유 마우스에 제13일, 제15일, 제17일, 제19일, 제21일, 제23일에 사이토카인 mRNA 혼합물을 종양 내 주사하고, 개별적인 종양 성장을 도표화한 실험 결과를 보여준다. 도 6a는 도 7a에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, GM-CSF, IL-2, IL-12sc, IFNα (ModB)를 보여준다. 도 6b는 도 7c에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, 루시퍼라아제 mRNA (ModB)를 보여준다. 군당 N = 마우스 8마리.
도 6c 및 도 6d는 B16F10 종양 보유 마우스에 제11일, 제13일, 제15일, 제17일에 mRNA를 종양 내 주사하고, 개별적인 종양 성장을 도표화한 실험 결과를 보여준다. 도 6c는 도 5c에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, GM-CSF, IL-2, IL-12sc, IFNα (ModB)를 보여준다. 도 6d는 도 4f 및 도 5d에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, 루시퍼라아제 mRNA (ModB)를 보여준다. 군당 N = 마우스 8마리.
도 6e 및 6f는 MC38 종양 보유 마우스에 제11일, 제15일, 제19일, 제23일에 사이토카인 mRNA 혼합물을 종양 내 주사하고, 개별적인 종양 성장을 도표화한 실험 결과를 보여준다. 도 6e는 GM-CSF, IL-2, IL-12sc, IFNα (ModB)를 보여준다. 도 6f는 루시퍼라아제 mRNA (ModB)를 보여준다. 군당 N = 마우스 5마리.
도 7a 내지 도 7f는 CT26 종양 보유 마우스에 제13일, 제15일, 제17일, 제19일, 제21일, 제23일에 사이토카인 mRNA 혼합물을 종양 내 주사하고, 개별적인 종양 성장을 도표화한 실험 결과를 보여준다. 도 7a는 도 6a에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, IL-2, IL-12sc, GM-CSF, IFNα (ModB)를 보여준다. 도 7b는 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF, IFNα (ModB)를 보여준다. 도 7c는 도 6b에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, 루시퍼라아제 mRNA (ModB) 대조군을 보여준다. 유사한 설계의 반복 연구에서, CT26 종양 보유 마우스에 제19일, 제21일, 제23일, 제26일, 제28일 및 제30일에 사이토카인 mRNA 혼합물을 종양 내 주사하고, 개별적인 종양 성장을 도표화하였다. 도 7d는 도 9a에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, IL-2, IL-12sc, GM-CSF, IFNα (ModB)를 보여준다. 도 7e는 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF, IFNα (ModB)를 보여준다. 도 7f는 도 9f에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, 루시퍼라아제 mRNA (ModB) 대조군을 보여준다. 도 a 내지 c의 경우 군당 N = 마우스 8마리 및 d 내지 f의 경우 군당 N = 마우스 10 내지 11마리.
도 8a 내지 도 8h는 CT26 종양 보유 마우스에 제12일, 제15일, 제19일 및 제22일에 mRNA를 종양 내 주사하고, 개별적인 종양 성장을 제35일까지 모니터링하고 도표화한 실험 결과를 보여준다. 도 8a는 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF, IFNα (ModB)를 보여준다. 도 8b는 IL-15 스시, IL-12sc, IFNα (ModB)를 보여준다. 도 8c는 IL-15 스시, GM-CSF, IFNα (ModB)를 보여준다. 도 8d는 GM-CSF, IL-12sc, IFNα (ModB)를 보여준다. 도 8e는 IL-15 스시, GM-CSF, IL-12sc (ModB)를 보여준다. 도 8f는 루시퍼라아제 mRNA (ModB) 대조군을 보여준다. (군당 N = 10). 도 8g 및 도 8h는 도 8a 내지 8f에 나타낸 연구의 종양 성장 동역학을 보여준다. 도 8g는 모든 처리군에 대한 제33일까지의 평균 종양 부피를 보여준다. 도 8h는 종양 성장 억제를 보여준다. T/C(평균 종양 부피를 기초로 한 종양/대조군)를 제19일까지 계산하였다.
도 9a 내지 도 9f는 CT26 종양 보유 마우스에 제19일, 제21일, 제23일, 제26일, 제28일 및 제30일에 mRNA를 종양 내 주사하고, 종양 성장을 제50일까지 모니터링한 실험을 보여준다. 도 9a는 도 7d에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, GM-CSF, IL-2, IL-12sc, IFNα (ModB)를 보여준다. 도 9b는 IL-2, IL-12sc, IFNα (ModB)를 보여준다. 도 9c는 GM-CSF, IL-2, IFNα (ModB)를 보여준다. 도 9d는 GM-CSF, IL-12sc, IFNα (ModB)를 보여준다. 도 9e는 GM-CSF, IL-2, IL-12sc (ModB)를 보여준다. 도 9f는 도 7f에 기술된 바와 동일한 실험의 복제본으로, 대조군으로서 루시퍼라아제 mRNA (ModB)를 보여준다. (도 9a 내지 도 9e의 경우 군당 N = 11; 도 9f의 경우 루시퍼라아제 mRNA 군 N = 10).
도 10a 내지 도 10b는 도 9에 나타낸 연구의 종양 성장 동역학을 보여준다. 도 10a는 모든 처리군에 대한 제36일까지의 평균 종양 부피를 보여준다. 도 10b는 종양 성장 억제를 보여준다. T/C(평균 종양 부피를 기초로 한 종양/대조군)를 제30일까지 계산하였다.
도 11은 종양 부피의 유의미한 감소가 있는 mRNA 혼합물을 보여주는 도 9에 제시된 실험 데이터의 막대 그래프를 보여주는 것으로, 이 실험에서는 종양 부피의 Z 점수 및 종양 부피 변화 및 대조군 평균 사이의 비율을 기초로 각 처리군에서 상당한 종양 감소가 있는 마우스의 수를 루시퍼라아제 대조군과 비교하였다.
도 12a 내지 도 12d는 1) 종양 naive, 또는 2) 이전에 5x105개 B16F10 세포를 피하 주사하였고 종양 내 사이토카인 mRNA 처리 후에 본래의 종양을 거부한 마우스 실험 결과를 보여준다. 두 군 모두에 B16F10 종양을 재접종하였다. 도 12a는 종양 naive 숙주 마우스를 보여준다. 도 12b는 GM-CSF, IL-15스시, IL-12sc, IFNα (ModB)가 있는 종양 내 사이토카인 mRNA 처리 후 이전에 B16F10 종양을 거부했던 마우스를 보여준다. B16F10 주사 후 55일 동안 마우스를 모니터링하였고, 각 마우스에 대한 종양 성장을 도표화하였다. B16F10 세포가 생착된 아홉 마리의 naive 마우스는 모두 종양을 발달시킨 반면(도 12a), 여덟 마리의 무종양 마우스는 모두 B16F10 세포를 거부하였고, B16F10 종양 성장을 나타내지 않았다(도 12b). 도 12b의 그래프는 모든 관찰치가 0이었기에, 즉, 가로축과 중첩되었기에 가시적인 데이터 흔적이 없다. 도 12c는 종양 부위의 국소화된 백반의 예를 보여준다. 도 12d는 종양 naive(삼각형 기호), 또는 이전에 CT26 종양 세포를 피하 주사하였고 종양 내 사이토카인 mRNA 처리 후에 본래의 종양을 거부한(원형 기호) 마우스 실험 결과를 보여준다. 두 군 모두에 CT26 종양 세포(CT26-WT) 또는 gp70-에피토프가 녹아웃된 CT26-Δgp70 종양 세포를 재접종하였다. 종양 세포 주사 후 21일 동안 마우스를 모니터링하였다. CT26-WT 세포가 생착된 한 마리를 제외한 모든 아홉 마리의 naive 마우스 및 CT26-Δgp70 세포가 생착된 모든 naive 마우스가 종양을 발달시킨 반면, 세 마리의 무종양 마우스는 모두 CT26 종양 세포를 거절하였고, 각각 CT26 및 CT26-Δgp70 종양의 성장을 나타내지 않았다.
도 13a 내지 도 13d는 마우스의 우측(주사) 및 좌측 옆구리(비주사)에 제0일에 B16F10 종양 세포를 이식한 실험(도 13a)의 결과를 보여준다. 마우스는 제11일, 제15일, 제19일, 및 제23일에 우측 종양에 ModB 사이토카인 mRNA(IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα) 또는 ModB 대조군 mRNA(루시퍼라아제)로 4회의 종양 내 주사를 놓았다. 주사된 종양(도 13b) 및 반대쪽의 비주사 종양(도 13c)에 대해 평균 종양 부피 +/- SEM(n=12)을 나타내었다. 중간 생존기간은 도 13d에 나타내었다.
도 14a 내지 도 14f는 인간 HEK293(도 14b) 및 흑색종 세포주(A101D(도 14c), A2058(도 14d), A375(도 14e), 및 Hs294T(도 14f))를 다양한 mRNA 용량의 인간 사이토카인 mRNA 혼합물(IL-12sc, GM-CSF, IL-15 스시 및 IFNα2b)로 형질감염시킨 실험 결과를 보여준다. 형질감염 24시간 후에 상청액을 수집하고, 사이토카인 특이적 ELISA로 단백질 농도를 결정하였다. 도 14a는 실험의 개략도를 보여준다.
도 15a 내지 도 15b는 개략도(도 15a) 및 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα2b를 암호화하는 인간 사이토카인 mRNA 혼합물, 또는 개별적인 사이토카인 mRNA들로 HEK293 세포를 형질감염시키고, 조정 배지를 24시간에 수집하고, 희석하여, 인간 PBMC에 첨가한 연구의 결과(도 15b)를 보여준다. 24시간에 PBMC 배양 상청액에서 IFNγ를 측정하였다(N=6명의 공여자, 평균).
도 16a 내지 도 16e는 인간 A375 종양 이종이식편을 보유하는 면역 타협 마우스가 인간 사이토카인((IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα2b; "IL-15 스시 혼합물") 또는 (IL-2, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα2b; "IL2 혼합물"))을 암호화하는 ModB mRNA 혼합물로의 단일 주사를 받은 실험의 결과를 보여준다. 주사 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 48시간, 및 72시간 후에 종양 세포 용해물을 준비하고, 각 사이토카인의 농도를 종양 용해물 중 총 단백질에 대해 측정하였다(n=3마리 마우스/시점, +/- SEM). 도 16a는 IFNα2b를 보여주고, 도 16b는 IL-2를 보여주고, 도 16c는 IL-12sc를 보여주고, 도 16d는 IL-15 스시를 보여주며, 도 16e는 GM-CSF를 보여준다.
도 17a 내지 도 17c는 ModB 사이토카인 mRNA 혼합물((IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF, IFNα2b) 또는 (IL-2, IL-12sc, GM-CSF, IFNα2b)) 주사 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 48시간, 및 72시간 후에 A375 종양으로부터 mRNA를 단리한 실험의 결과를 보여준다. 인터페론 알파 반응 유전자의 발현을 qPCR로 모니터링하였다. 도 17a는 인간 ISG15를 보여주고, 도 17b는 인간 ISG54를 보여주고, 도 17c는 인간 MX1을 보여준다.
도 18a 내지 도 18e는 마우스에 B16F10 종양 세포를 이식하고, IFNα가 있거나 없는 mRNA 혼합물(FLT3L, IL-2, 41BBL, 및 CD27L-CD40L)로 처리한 실험의 결과를 보여준다. 표준 형태(ModA, 도 18b) 및 개질된 형태(ModB, 도 18c)의, IFNα가 없는 mRNA 혼합물을 표준 형태(ModA, 도 18d) 및 개질된 형태(ModB, 도 18e)의, IFNα를 포함한 mRNA 혼합물과 비교하였다. 도 18a는 mRNA가 없는 링거 배지를 제공한 음성 대조군이다.
도 19a 내지 도 19e는 마우스의 한쪽 옆구리에 종양을 이식하고 이 마우스에 폐를 향한 루시퍼라아제 발현 종양 세포의 IV 주사를 놓은 실험(도 19a)의 결과를 보여준다. 처리군의 마우스에 오로지 옆구리의 종양 내로 mRNA 혼합물 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα의 종양 내 주사를 놓았을 뿐, 폐의 종양은 미처리하였다. 도 19b는 폐에서의 전형적인 생물발광 측정 및 그에 따라 동일한 날(제20일)에 채취된 폐의 그림을 보여준다; 종양 결절은 검은색 마크로 선명하다; 도 19c는 캘리퍼 측정으로 결정한 옆구리 종양의 평균 종양 부피를 보여준다; 도 19d는 제20일의 생물발광 측정의 총 유량 분석을 보여준다; 도 19e는 폐 중량을 보여준다.
도 20a 내지 도 20g는 이중 옆구리 종양 모델에서 항체의 전신 투여와 조합한 mRNA 혼합물의 종양 내 주사의 효과를 평가하기 위하여 설계된 실험의 결과를 보여준다. 좌측 및 우측 옆구리에 B16F10 종양을 이식한, 또는 좌측 및 우측 옆구리에 MC38 종양을 이식한 마우스에 한쪽 옆구리 종양에만 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα (Mod B)의 mRNA 혼합물로 종양 내 주사를 놓았고, 다른 쪽 옆구리 종양은 미처리하였다. 마우스에 항-PD1 항체의 복강 내(전신) 주사도 놓았다. 도 20은 B16F10(도 20a) 및 MC38(도 20b) 종양 모델에서의 전체 생존을 보여준다. 도 20c 내지 도 20g는 마우스의 한쪽 옆구리에 B16F10 종양을 이식하고 이 마우스에 폐를 향한 루시퍼라아제 발현 B16F10 종양 세포의 IV 주사를 놓은, 항-PD-1 항체를 평가하는 실험의 결과를 보여준다. 마우스에 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα의 mRNA 혼합물로 3회의 종양 내 주사를 놓았고, 항-PD-1 항체의 복강 내(전신) 주사도 3회 놓았다. SC 종양의 종양 성장을 도 20c 내지 도 20f에 도시하였다. 도 20c는 대조군 mRNA 및 대조 항체를 보여준다; 도 20d는 대조군 mRNA 플러스 항-PD1 항체를 보여준다; 도 20e는 사이토카인 mRNA 혼합물 플러스 이소형 대조 항체를 보여준다. 도 20f는 사이토카인 mRNA 플러스 항-PD-1 항체를 보여준다. 도 20g는 IV 종양 접종 후 제70일까지의 모든 4개 처리군의 생존율(%)을 보여준다; mRNA 플러스 항-PD-1 항체를 받은 처리군은 가장 강한 항종양 활성을 보여주어, 15마리의 마우스 중 6마리가 종양 접종 후 제40일에 무종양이었다.
도 21a 내지 도 21i는 항체 전신 투여와 조합한 mRNA 혼합물의 종양 내 주사의 효과를 평가하기 위하여 설계된 추가 실험의 결과를 보여준다. CT26 종양을 보유한 마우스에 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα의 mRNA 혼합물로의 종양 내 주사를 놓았다. 마우스에 항-CTLA-4 항체의 복강 내(전신) 주사도 놓았다. 도 21a는 종양 내 사이토카인 mRNA 및 IP 주사된 항-CTLA-4의 병용 요법이 가장 강력한 항종양 활성을 가져와, 16마리의 마우스 중 12마리가 종양 접종 후 제55일에 무종양임을 보여준다. 도 21b는 사이토카인 mRNA 혼합물 플러스 이소형 대조 항체를 보여준다; 도 21c는 대조군 mRNA 플러스 항-CTLA-4 항체를 보여준다; 도 21d는 대조군 mRNA 및 대조 항체를 보여준다. 도 21e 내지 도 21i는 B16F10 종양 모델에서 항-CTLA-4 항체와 조합한 mRNA 혼합물의 종양 내 주사의 효과를 평가하기 위하여 설계된 추가 실험의 결과를 보여준다. B16F10 종양을 보유한 마우스에 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα의 mRNA 혼합물로의 종양 내 주사를 놓았다. 마우스에 항-CTLA-4 항체의 복강 내(전신) 주사도 놓았다. 도 21e는 종양 내 사이토카인 mRNA 및 IP 주사된 항-CTLA-4의 병용 요법이 가장 강력한 항종양 활성을 가져와, 9마리의 마우스 중 6마리가 종양 접종 후 제70일에 무종양임을 보여준다. 도 21f는 사이토카인 mRNA 혼합물 플러스 이소형 대조 항체를 보여준다; 도 21g는 대조군 mRNA 플러스 항-CTLA-4 항체를 보여준다; 도 21h는 대조군 mRNA 및 대조 항체를 보여준다. 도 21i는 종양 접종 후 제70일까지의 모든 4개 처리군의 생존율(%)을 보여준다.
도 22a 내지 도 22d는 상이한 인간 암의 인간 종양 이종이식에서 사이토카인 mRNA (Mod B)의 종양 내 주사의 효과를 평가하기 위하여 설계된 실험의 결과를 보여준다. 4종의 mRNA가 암호화한 사이토카인 각각의 종양 내 발현을 다음으로 나타내었다: IL-12sc(도 22a), IFNα2b(도 22b), GM-CSF(도 22c), 및 IL-15 스시(도 22d).
도 23a 내지 도 23d는 암호화된 사이토카인의 발현에 대한 상이한 종양 내 mRNA 용량의 효과를 평가하기 위하여 설계된 실험의 결과를 보여준다: IL-15 스시(도 23a), IL-12sc(도 23b), GM-CSF(도 23c) 및 IFNα2b(도 23d).
도 24a 내지 도 24g는 마우스에 B16F10 종양을 이식하고, IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF, IFNα (ModB)의 사이토카인 mRNA 혼합물 또는 단일 사이토카인을 암호화하는 mRNA의 4회 주사로 처리한 실험의 결과를 보여준다. 대략 제70일까지의 종양 부피를 측정하였다. 도 24a는 루시퍼라아제 대조군을 보여준다; 도 24b는 4종의 사이토카인 혼합물을 보여준다; 도 24c는 IL-12sc mRNA 단독을 보여준다; 도 24d는 GM-CSF mRNA 단독을 보여준다; 도 24e는 IFNα mRNA 단독을 보여준다; 도 24f는 IL-15 스시 단독을 보여준다. 도 24g는 사이토카인 mRNA 혼합물 또는 개별적인 mRNA 암호화 사이토카인으로 처리된 B16F10 종양의 전체 생존을 보여준다. 생존 데이터는 도 24a 내지 도 24f에 제시된 실험의 데이터이다.
도 25는 대조군 mRNA("위약군") 및 사이토카인 mRNA 처리 후 피하 종양에서의 CD8+ 면역세포 침윤물을 보여준다.
도 26a 내지 도 26c는 각각 사이토카인 mRNA 처리 및 대조군 mRNA의 종양 내 투여를 받은 CT26 종양 보유 마우스의 혈액에서 gp70의 gp70 종양 항원에 특이적인 CD8+ T 세포의 측정 결과를 보여준다. 도 26c는 항-마우스 CD8 항체로 염색된 CD8+ T 세포 및 대조군 mRNA를 받은 동물로부터 유래된 gp70 특이적 사량체로 염색된 CD8+ T 세포의 FACS 히스토그램을 예시적으로 보여주며, 도 26b는 사이토카인 mRNA로 처리된 동물 한 마리로부터의 예를 보여준다. 도 26c는 대조군 mRNA 4회 주사를 받은 9마리의 마우스 및 사이토카인 mRNA의 4회 주사를 받은 10마리의 마우스로부터 처리 개시 13일 후 혈액 중의 gp70 특이적 CD8+ T 세포의 백분율 분석을 보여준다.
도 27a 내지 27c는 좌측 및 우측 옆구리에 B16F10 종양을 보유한 마우스가 한쪽 종양에만 사이토카인 mRNA 또는 대조군 mRNA로의 단일 종양 내 mRNA 주사를 받은 실험을 보여준다. mRNA 주사 후 제7일에 좌측 및 우측 종양을 수집하여 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 도 27b는 사이토카인 mRNA 처리 대 대조군 mRNA 처리 종양 사이의 유전자 발현 변화를 비교하는 독창성 경로 분석 결과를 보여준다. 처리 종양측(컬럼 1) 및 미처리 종양측(컬럼 2)에 대한 원인이 되는 네트워크 분석을 수행하였고, 활성화 Z 점수(위의 절반) 및 억제 Z 점수(아래 절반)를 분석하여 각각 상향 및 하향 조절된 경로를 정의하였다. 도 27은 주사된 종양 및 미주사 종양의 군집 분석이 327개의 인터페론 감마 조절된 유전자를 기초로 하여 수행되었음을 보여준다. 사이토카인 mRNA로 처리된 마우스의 주사된 종양 및 미주사 종양 둘 다 대조군 mRNA로 처리된 마우스와 비교하여 다수의 IFN 감마 유전자의 상향 조절을 보여주었다.
도 28a 내지 도 28d는 B16F10 이중 종양 모델로부터의 세포의 형광 현미경 사진을 보여준다. 패널 a는 사이토카인 mRNA로 처리된 주사된 종양을 보여주며, 패널 b는 상응하는 미주사 종양을 보여준다. 패널 c는 대조군 mRNA로 처리된 주사된 종양을 보여주며, 패널 d는 상응하는 미주사 종양을 보여준다. 슬라이드를 CD4+, CD8+, 및 FoxP3+ 세포에 대해 염색하였다.
도 28e 내지 도 28g는 면역형광 영상에서 정량화된 CD4+, CD8+ 및 FOXP3+ 세포의 빈도를 보여준다. mm2당 CD4+ 및 CD8+ 세포의 빈도를 도 28e 및 도 28f에 제시하였다. FOXP3+ 빈도로 나눈 CD8+ 빈도의 비율을 도 28g에 제시하였다.
도 29a 내지 도 29g는 단일 B16F10 종양 마우스가 Thy1.1 세포 표면 단백질을 암호화하는 mRNA 또는 비히클 단독(링거액)으로의 단일 주사를 받았음을 보여준다. 종양 내 주사 대략 16 내지 18시간 후, 종양을 절제하고, 소화시키고, 항체 패널로 염색하고, 유세포 분석법으로 분석하였다. 세포 유형 및 Thy1.1을 발현하는 세포의 빈도의 특징을 분석하였다.
도 30a 내지 도 30f는 실시예 15에 기술된 바와 같이 다양한 용량의 사이토카인 mRNA 또는 루시퍼라아제 대조군 mRNA에 따른 종양 용해물에서 검출된 지시된 단백질의 발현을 보여준다. 도 30e의 "IFNy"는 IFNγ를 나타낸다.
도 31a 내지 도 31b는 실시예 15에 기술된 바와 같이 대조군 또는 사이토카인 mRNA 처리 후 CD8+ 및 FOXP3+ (Treg) 세포에 대한 유세포 분석 결과를 보여준다. Treg 세포에 대한 CD8+의 관찰 비율을 각 패널에 나타내었다.
도 31c 내지 도 31d는 실시예 15에 기술된 바와 같이 대조군 또는 사이토카인 mRNA 처리 후 다기능성 CD8+ T 세포에 대한 유세포 분석 결과를 보여준다. 다기능성 CD8+ T 세포의 비율을 각 패널에 나타내었다.
도 31e는 실시예 15에 기술된 바와 같이 대조군 또는 사이토카인 mRNA 처리 후 침윤성 골수 세포 상에서의 PD-L1의 수준을 보여준다.
도 31f는 실시예 15에 기술된 바와 같이 대조군 또는 사이토카인 mRNA 처리 후 침윤성 CD8+ 세포 상에서의 PD-1의 수준을 보여준다.
도 31g 내지 도 31h는 실시예 15에 기술된 바와 같이 대조군 또는 사이토카인 mRNA 처리 후 종양 내 그랜자임 B CD8+ T 세포의 빈도를 보여준다.
도 32a 내지 도 32b는 실시예 16에 기술된 바와 같이 반딧불이 루시퍼라아제를 암호화하는 50 μg mRNA의 종양 내 주사 후 다양한 조직에서의 루시퍼라아제 발현을 보여준다.
도 33은 본질적으로 도 12에 제시된 바와 같은 실험에 관한 데이터를 보여준다.
도 34는 실시예 17에 기술된 바와 같이 B16F10 종양 보유 마우스에서 생존에 미치는, 사이토카인 mRNA로의 처리 전 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 또는 NK 세포 고갈의 영향을 보여준다.
도 35는 실시예 1에 기술된 바와 같이 B16F10 종양 세포를 이식하고 실시예 18에 기술된 바와 같이 대조군 또는 사이토카인 mRNA로 처리한 WT 및 IFNγ KO 마우스의 생존을 보여준다.
서열의 설명
표 1 및 2는 본 명세서에 언급된 일부 서열의 목록을 제공한다.
I. 정의
용어 "ModB"는 적어도 하나의 (예컨대, 모든) 우리딘 대신 개질된 핵염기를 포함하고, RNA의 5' 말단에 Cap1 구조를 더 포함하는 RNA를 말한다. 일부 구현예에서, ModB RNA의 5' UTR은 서열번호 4 또는 6을 포함한다. ModB RNA는 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 줄이도록 처리되었다. "Cap1" 구조는 효소적 캡핑(capping)에 의한 시험관 내 번역 후에 또는 시험관 내 번역 중에(공동 전사 캡핑) 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, ModB 개질된 RNA를 위한 빌딩 블록 캡은 다음과 같으며, 이는 공동 전사적으로 캡핑될 때 사용된다:
m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG(때때로 m2 7,3`OG(5')ppp(5')m2'-OApG로도 지칭됨), 이는 다음 구조를 갖는다:
아래는 공동 전사 캡핑 후의 예시적인 Cap1 RNA로, 이는 RNA 및 m2 7,3`OG(5')ppp(5')m2'-OApG를 포함한다:
아래는 효소적 캡핑 후의 또 다른 예시적인 Cap1 RNA(무캡 유사체)이다:
용어 "ModA"는 적어도 하나의 우리딘 대신 개질된 핵염기를 포함하지 않는 dsRNA 감소가 없는 RNA를 말한다. ModA RNA는 RNA의 5' 말단에 Cap0 구조를 포함한다. ModA RNA의 5' UTR은 서열번호 2를 포함할 수 있다. "Cap0" 구조는 일 구현예에서, 다음 구조를 갖는 캡 유사체인 항역전 캡(ARCA 캡(m2 7,3`OG(5')ppp(5')G))을 이용한 시험관 내 번역(공동 전사 캡핑) 중에 생성된다:
아래는 RNA 및 m2 7,3`OG(5')ppp(5')G를 포함하는 예시적인 Cap0 RNA이다:
일부 구현예에서, "Cap0" 구조는 다음 구조를 갖는 캡 유사체인 베타-S-ARCA(m2 7,2`OG(5')ppSp(5')G)를 이용한 시험관 내 번역(공동 전사 캡핑) 중에 생성된다:
아래는 베타-S-ARCA(m2 7,2`OG(5')ppSp(5')G) 및 RNA를 포함하는 예시적인 Cap0 RNA이다.
본 명세서에 사용된 용어 "우라실"은 RNA의 핵산에 존재할 수 있는 핵염기 중 하나를 말한다. 우라실의 구조는 다음과 같다:
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본 명세서에 사용된 용어 "우리딘"은 RNA에 존재할 수 있는 뉴클레오시드 중 하나를 말한다. 우리딘의 구조는 다음과 같다:
.
UTP(우리딘 5'-삼인산)는 다음 구조를 갖는다:
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슈도-UTP(슈도우리딘 5'-삼인산)는 다음 구조를 갖는다:
.
"슈도우리딘"은 우리딘의 이성질체인 개질된 뉴클레오시드의 한 예로, 여기서 우라실은 질소-탄소 글리코시드 결합 대신 탄소-탄소 결합을 통해 펜토스 고리에 부착된다. 슈도우리딘은 예를 들어, 문헌[Charette and Gray, Life; 49:341-351 (2000)]에 기술되어 있다.
또 다른 예시적인 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸슈도우리딘(m1ψ)으로, 이는 다음 구조를 갖는다:
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N1-메틸슈도-UTP는 다음 구조를 갖는다:
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본 명세서에 사용된 용어 "폴리-A 꼬리" 또는 "폴리-A 서열"은 전형적으로 RNA 분자의 3' 말단에 위치하는 아데닐산 잔기들의 연속 또는 불연속 서열을 지칭한다. 폴리-A 꼬리 또는 폴리-A 서열은 당업자에게 공지되어 있고, 본 명세서에 기술된 RNA의 3' UTR의 뒤를 이을 수 있다. 연속 폴리-A 꼬리는 연속적인 아데닐산 잔기를 특징으로 한다. 본질적으로, 연속 폴리-A 꼬리가 전형적이다. 본 명세서에 개시된 RNA는 전사 후 주형 독립적 RNA 중합효소에 의해 RNA의 자유로운 3' 말단에 부착된 폴리-A 꼬리 또는 DNA에 의해 암호화되고 주형 의존적 RNA 중합효소에 의해 전사된 폴리-A 꼬리를 가질 수 있다.
약 120 A 뉴클레오티드의 폴리-A 꼬리는 형질감염된 진핵생물 세포에서 RNA의 수준뿐만 아니라, 폴리-A 꼬리의 상류(5')에 존재하는 오픈 리딩 프레임으로부터 번역되는 단백질의 수준에도 유익한 영향을 미침이 증명되었다(Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017).
폴리-A 꼬리는 임의의 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 80개, 또는 적어도 100개 및 최대한 500개, 최대한 400개, 최대한 300개, 최대한 200개, 또는 최대한 150개 A 뉴클레오티드를, 특히, 약 120개 A 뉴클레오티드를 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 이들로 구성된다. 이러한 맥락에서 "필수적으로 구성된다"는, 폴리-A 꼬리의 대부분의 뉴클레오티드, 폴리-A 꼬리의 뉴클레오티드의 개수를 기준으로 전형적으로 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 A 뉴클레오티드이지만, 나머지 뉴클레오티드는 A 뉴클레오티드 이외의 뉴클레오티드, 예컨대, U 뉴클레오티드(우리딜산), G 뉴클레오티드(구아닐산), 또는 C 뉴클레오티드(시티딜산)임을 의미한다. 이러한 맥락에서 "구성된다"는 폴리-A 꼬리의 모든 뉴클레오티드, 즉, 폴리-A 꼬리의 뉴클레오티드의 개수를 기준으로 100%가 A 뉴클레오티드임을 의미한다. 용어 "A 뉴클레오티드" 또는 "A"는 아데닐산을 지칭한다.
일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 암호화 가닥에 대해 상보적인 가닥에서 반복된 dT 뉴클레오티드(데옥시티미딜산)를 포함하는 DNA 주형을 기초로 하여, RNA 전사 중에, 예컨대, 시험관 내 전사된 RNA의 제조 중에, 부착된다. 폴리-A 꼬리를 암호화하는 DNA 서열(암호화 가닥)은 폴리(A) 카세트라 지칭된다.
본 발명의 일 구현예에서, DNA의 암호화 가닥에 존재하는 폴리(A) 카세트는 필수적으로 dA 뉴클레오티드로 구성되나, 4종의 뉴클레오티드(dA, dC, dG, 및 dT)의 무작위 서열에 의해 중단된다. 이러한 무작위 서열은 5 내지 50개, 10 내지 30개, 또는 10 내지 20개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 이러한 카세트는 본 명세서에 참조로 포함된 WO 2016/005324 A1에 개시되어 있다. WO 2016/005324 A1에 개시된 임의의 폴리(A) 카세트는 본 발명에 사용될 수 있다. 필수적으로 dA 뉴클레오티드로 구성되지만, 4종의 뉴클레오티드(dA, dC, dG, dT)의 균등한 분포를 가지며 예컨대, 5 내지 50개 뉴클레오티드 길이를 갖는 무작위 서열에 의해 중단되는 폴리(A) 카세트는 DNA 수준에서, 대장균에서 플라스미드 DNA의 끊임없는 전파를 보여주며, RNA 수준에서, 뒷받침하는 RNA 안정성 및 번역 효율과 관련하여 유익한 특성들과 여전히 관련이 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 본 명세서에 기술된 RNA 분자에 함유된 폴리-A 꼬리는 필수적으로 A 뉴클레오티드로 구성되나, 4종의 뉴클레오티드(A, C, G, U)의 무작위 서열에 의해 중단된다. 이러한 무작위 서열은 5 내지 50개, 10 내지 30개, 또는 10 내지 20개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, A 뉴클레오티드 이외의 어떠한 뉴클레오티드도 3' 말단에서 폴리-A 꼬리 옆에 있지 않다. 즉, 폴리-A 꼬리는 A 이외의 뉴클레오티드에 의해 이의 3' 말단에서 가려지거나 3' 말단에서 A 이외의 뉴클레오티드가 이어지지 않는다.
일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 3' UTR 서열 다음에 표 2에도 표시되어 있는 서열: AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(서열번호 78)을 포함한다.
"RNA"와 "mRNA"는 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
"IFNα"는 본 명세서에서 총칭하여 사용되어 IFNα2b 및 IFNα4를 비롯한 임의의 인터페론 알파 I형 사이토카인을 말한다. 실시예 섹션에 기술된 실험에서는, 인간 IFNα2b 및 마우스 IFNα4가 사용되었다. 임의의 IFNα가 조성물에 포함될 수 있고, 본 명세서에 기술된 방법에 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료"는 대상체의 질병을 위한 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 아우르며, 질병 억제, 이의 발달 저지, 질병의 1종 이상의 증상의 경감, 질병 치유, 또는 질병의 재발 방지를 포함한다. 예를 들어, 고형 종양의 치료는 고형 종양 증상의 완화, 고형 종양 크기의 감소, 고형 종양 제거, 종양의 추가 성장 감소, 또는 치료 후 고형 종양의 재발 감소 또는 제거를 포함할 수 있다. 치료는 또한 바이오마커의 효과성의 변화로서 또는 영상화 또는 방사선 검사 측정의 변화로서 측정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "예방"은 암이 없다고 간주되는 대상체에서 고형 종양을 포함한 암의 억제 또는 암 발달의 중단을 의미한다.
"전이"는 암이 원발성 종양으로서 처음 발생한 장소로부터 신체 내의 다른 위치로 퍼지는 과정을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "종양 내"는 '종양 안으로'를 의미한다. 예를 들어, 종양 내 주사는 종양과 접하는 임의의 위치에 치료제를 주사함을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "종양 주위"는 약 2 mm 폭이며 종양 주변부의 침습성 전면에 인접한 영역이다. 종양 주위 영역은 숙주 조직을 포함한다. 예를 들어, 다음 참조:
"투여"는 대상체에 약제 또는 조성물을 제공함을 의미하며, 의료 전문가에 의한 투여 및 자가 투여를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 개시는 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열(기준 서열)에 대해 각각 일정 정도의 동일성을 갖는 핵산 서열 및 아미노산 서열을 기술하고 있다.
두 핵산 서열 사이의 "서열 동일성"은 이 서열들 사이에 동일한 뉴클레오티드의 백분율을 나타낸다. 두 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"은 이 서열들 사이에 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다.
용어 "% 동일한", "% 동일성" 또는 유사한 용어는 특히, 비교되는 서열들 사이의 최적의 정렬에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 백분율을 지칭하고자 한 것이다. 상기 백분율은 순수하게 통계적이며, 두 서열 사이의 차이점은 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 무작위로 분포될 수 있으나, 반드시 무작위로 분포되지는 않는다. 두 서열의 비교는 보통 상응하는 서열들의 국소적인 부위를 확인하기 위하여 세그먼트 또는 "비교창"에 대하여 최적 정렬 후 상기 서열들을 비교함으로써 수행된다. 비교를 위한 최적 정렬은 수동적으로 또는 문헌[Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482]에 의한 국소 상동성 알고리즘의 도움으로, 문헌[Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443]에 의한 국소 상동성 알고리즘의 도움으로, 문헌[Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444]에 의한 유사성 검색 알고리즘의 도움으로, 또는 상기 알고리즘을 이용한 컴퓨터 프로그램(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA, 미국 위스콘신 주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))의 도움으로 수행될 수 있다.
동일성 백분율은 비교되는 서열들이 상응하는 동일한 위치의 개수를 결정하고, 이 개수를 비교된 위치의 개수(예컨대, 기준 서열에서의 위치의 개수)로 나누고, 이 결과에 100을 곱하여 얻어진다.
일부 구현예에서, 동일성 정도는 기준 서열의 전체 길이의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 영역에 대하여 제공된다. 예를 들어, 기준 핵산 서열이 200개의 뉴클레오티드로 구성된 경우, 동일성 정도는 일부 구현예에서 연속적인 뉴클레오티드에서, 적어도 약 100개, 적어도 약 120개, 적어도 약 140개, 적어도 약 160개, 적어도 약 180개, 또는 약 200개 뉴클레오티드에 대해, 제공된다. 일부 구현예에서, 동일성 정도는 기준 서열의 전체 길이에 대해 제공된다.
각각 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 대해 특정한 동일성 정도를 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 상기 주어진 서열의 적어도 하나의 기능적 특성을 가질 수 있으며, 예컨대, 그리고 일부 예에서, 상기 주어진 서열에 대해 기능적으로 동일하다. 한 가지 중요한 특성으로 특히, 대상체에 투여될 때, 사이토카인으로서 작용하는 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 대해 특정한 동일성 정도를 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 상기 주어진 서열에 대해 기능적으로 동일하다.
II. 조성물 및 의약 제제
A. 인터루킨-2(IL-2)
일부 구현예에서, 조성물은 인터루킨-2(IL-2)를 암호화하는 DNA 서열(서열번호 9)을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2를 암호화하는 DNA 서열은 서열번호 10으로 제공된다.
일부 구현예에서, 조성물은 IL-2를 암호화하는 코돈 최적화 DNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화 DNA 서열은 서열번호 11의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, DNA 서열은 서열번호 11에 대해 83%, 84%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 코돈 최적화 DNA 서열을 포함한다.
천연 IL-2에 대한 코돈 최적화 IL-2의 정렬을 아래에 나타내었으며, 여기서 "Q"는 천연 IL-2(NM_000586.3; 서열번호 10)이고, "S"는 코돈 최적화 IL-2(서열번호 11)이다. 퍼센트 동일성은 82.79%이다.
일부 구현예에서, 조성물은 IL-2를 암호화하는 DNA 서열로부터 전사된 RNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 서열번호 10 또는 11을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 서열번호 12 또는 13을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 서열번호 12 또는 13에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, IL-2 RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다.
일부 구현예에서, IL-2 RNA는 5' 말단에 변경된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 RNA는 5' 캡을 포함한다. 당해 분야에 공지된 임의의 5' 캡이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 5'-5' 삼인산 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 티오인산염 개질을 포함한 5'-5' 삼인산 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 2'-O 또는 3'-O-리보스-메틸화 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 개질된 구아노신 뉴클레오티드 또는 개질된 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 7-메틸구아닐산을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 Cap0 또는 Cap1이다. 예시적인 캡 구조는 m7G(5')ppp(5')G, m7,2`O-mG(5')ppSp(5')G, m7G(5')ppp(5')2`O-mG, 및 m7,3`O-mG(5')ppp(5')2`O-mA를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-2 RNA는 5' 비해독 부위(UTR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 개시 코돈의 상류이다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 RNA의 번역을 조절한다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 안정화 서열이다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 RNA의 반감기를 증가시킨다. 당해 분야에 공지된 임의의 5' UTR이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' UTR RNA 서열은 서열번호 1, 3, 또는 5를 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. 일부 구현예에서, 5' UTR RNA 서열은 서열번호 2, 4, 또는 6을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' UTR RNA 서열은 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
일부 구현예에서, IL-2 RNA는 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 번역 종결 코돈 뒤에 온다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 RNA의 폴리아데닐화, 번역 효율, 국재화, 또는 안정성을 조절한다. 일부 구현예에서, 3' UTR RNA 서열은 서열번호 7을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. 일부 구현예에서, 3' UTR RNA 서열은 서열번호 8을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' UTR RNA 서열은 서열번호 8에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
일부 구현예에서, IL-2 조성물은 5' UTR 및 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 5' UTR만을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 3' UTR만을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-2 RNA는 폴리-A 꼬리를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 50개, 적어도 약 70개, 또는 적어도 약 100개 뉴클레오티드의 폴리-A 꼬리를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 200개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 서열번호 78을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, RNA는 5' 캡, 5' UTR, IL-2를 암호화하는 핵산, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 이 순서대로 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 10 또는 11에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, 서열번호 10 또는 11에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열로부터 전사된, RNA 서열을 포함한다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다. 일부 구현예에서, IL-2 RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 10 또는 11에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, 서열번호 10 또는 11에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열로부터 전사된, RNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 10 또는 11에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, 서열번호 10 또는 11에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열로부터 전사된 RNA 서열을 포함한다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다.
일부 구현예에서, IL-2 RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 12 또는 13에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 8에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
B. 인터루킨-12 단일 쇄(IL-12sc)
일부 구현예에서, 조성물은 인터루킨-12 단일 쇄(IL-12sc)를 암호화하는 DNA 서열(예컨대, 서열번호 14)을 포함하며, 이는 IL-12 p40(때때로 IL-12B로 지칭됨), 링커, 예컨대 GS 링커, 및 IL-12 p35(때때로 IL-12A로 지칭됨)를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-12 p40, 링커, 및 IL-12 p35는 개재 뉴클레오티드 없이 연속적이다. 예시적인 IL-12sc를 암호화하는 DNA 서열은 서열번호 15로 제공된다.
천연 IL-12 p40에 대한 코돈 최적화 IL-12 p40의 정렬을 아래에 나타내었으며, 여기서 "S"는 천연 IL-12 p40(NM_002187.2; 서열번호 15의 뉴클레오티드 1 내지 984)이고, "Q"는 코돈 최적화 IL-12 p40(서열번호 16의 뉴클레오티드 1 내지 984)이다. 퍼센트 동일성은 77%이다.
천연 IL-12 p35에 대한 코돈 최적화 IL-12 p35의 정렬을 아래에 나타내었으며, 여기서 "S"는 천연 IL-12 p35(NM_00882.3; 서열번호 15의 뉴클레오티드 1027 내지 1623)이고, "Q"는 코돈 최적화 IL-12 p35(서열번호 16의 뉴클레오티드 1027 내지 1623)이다. 퍼센트 동일성은 80%이다.
일부 구현예에서, 조성물은 IL-12sc를 암호화하는 코돈 최적화 DNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 IL-12 p40을 암호화하는 코돈 최적화 DNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 IL-12 p35를 암호화하는 코돈 최적화 DNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화 DNA 서열은 서열번호 16을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, DNA 서열은 서열번호 16에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 코돈 최적화 DNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-12 p40을 암호화하는 코돈 최적화 DNA 서열은 IL-12sc-p40을 암호화하는 뉴클레오티드(서열번호 16의 뉴클레오티드 1 내지 984)를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-12 p35를 암호화하는 코돈 최적화 DNA 서열은 IL-12sc-p35를 암호화하는 뉴클레오티드(서열번호 16의 뉴클레오티드 1027 내지 1623)를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-12sc를 암호화하는 코돈 최적화 DNA 서열은 IL-12sc-p40을 암호화하는 뉴클레오티드(서열번호 16의 뉴클레오티드 1 내지 984) 및 서열번호 16의 -p35(서열번호 16의 뉴클레오티드 1027 내지 1623) 부분을 포함하고, p40 및 p35 부분을 연결하는 링커 폴리펩티드를 암호화하는 p40 및 p35 부분 사이의 뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 16의 985 내지 1026)를 더 포함한다. 당업자에게 공지된 임의의 링커가 이용될 수 있다. p40 부분은 p35 부분에 대해 5' 또는 3'일 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, IL-12sc를 암호화하는 DNA 서열로부터 전사된 RNA 서열을 포함한다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 서열번호 15 또는 16을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 서열번호 17 또는 18을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 서열번호 17 또는 18에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 IL-12sc-p40을 암호화하는 뉴클레오티드(서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드 1 내지 984) 및 서열번호 17 또는 18의 -p35(서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드 1027 내지 1623) 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-12sc를 암호화하는 코돈 최적화 RNA 서열은 IL-12sc-p40을 암호화하는 뉴클레오티드(서열번호 18의 뉴클레오티드 1 내지 984) 및 서열번호 18의 -p35(서열번호 18의 뉴클레오티드 1027 내지 1623) 부분을 포함하고, p40 및 p35 부분을 연결하는 링커 폴리펩티드를 암호화하는 p40 및 p35 부분 사이의 뉴클레오티드를 더 포함한다. 당업자에게 공지된 임의의 링커가 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-12sc RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, IL-12sc RNA는 5' 말단에 변경된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 5' 캡을 포함한다. 당해 분야에 공지된 임의의 5' 캡이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 5'-5' 삼인산 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 티오인산염 개질을 포함한 5'-5' 삼인산 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 2'-O 또는 3'-O-리보스-메틸화 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 개질된 구아노신 뉴클레오티드 또는 개질된 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 7-메틸구아닐산을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 Cap0 또는 Cap1이다. 예시적인 캡 구조는 m7G(5')ppp(5')G, m7,2`O-mG(5')ppSp(5')G, m7G(5')ppp(5')2`O-mG, 및 m7,3`O-mG(5')ppp(5')2`O-mA를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-12sc RNA는 5' 비해독 부위(UTR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 개시 코돈의 상류이다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 RNA의 번역을 조절한다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 안정화 서열이다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 RNA의 반감기를 증가시킨다. 당해 분야에 공지된 임의의 5' UTR이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' UTR RNA 서열은 서열번호 1, 3, 또는 5로부터 전사된다. 일부 구현예에서, 5' UTR RNA 서열은 서열번호 2, 4, 또는 6을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' UTR RNA 서열은 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
일부 구현예에서, IL-12sc RNA는 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 번역 종결 코돈 뒤에 온다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 RNA의 폴리아데닐화, 번역 효율, 국재화, 또는 안정성을 조절한다. 일부 구현예에서, 3' UTR RNA 서열은 서열번호 7로부터 전사된다. 일부 구현예에서, 3' UTR RNA 서열은 서열번호 8을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' UTR RNA 서열은 서열번호 8에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
일부 구현예에서, IL-12sc 조성물은 5' UTR 및 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-12sc 조성물은 5' UTR만을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-12sc 조성물은 3' UTR만을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-12sc RNA는 폴리-A 꼬리를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 70개 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 100개 뉴클레오티드의 폴리-A 꼬리를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 200개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 서열번호 78을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, RNA는 5' 캡, 5' UTR, IL-12sc를 암호화하는 핵산, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 이 순서대로 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 15 또는 16에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, 서열번호 15 또는 16에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열로부터 전사된, RNA 서열을 포함한다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다. 일부 구현예에서, IL-12sc RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 15 또는 16에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, 서열번호 15 또는 16에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열로부터 전사된, RNA 서열을 포함한다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다. 일부 구현예에서, IL-12sc RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 15 또는 16에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, 서열번호 15 또는 16에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열로부터 전사된 RNA 서열을 포함한다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다. 일부 구현예에서, IL-12sc RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 17 또는 18에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 8에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-12sc RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다.
C. 인터페론 알파(IFNα)
일부 구현예에서, 조성물은 인터페론 알파(IFNα)를 암호화하는 DNA 서열(예컨대, 서열번호 19)을 포함한다. 이 IFNα를 암호화하는 예시적인 DNA 서열은 서열번호 20으로 제공된다.
천연 IFNα에 대한 코돈 최적화 IFNα의 정렬을 아래에 나타내었으며, 여기서 "S"는 천연 IFNα(NM_000605.3; 서열번호 20)이고, "Q"는 코돈 최적화 IFNα(서열번호 21)이다. 퍼센트 동일성은 79%이다.
일부 구현예에서, 조성물은 IFNα를 암호화하는 코돈 최적화 DNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화 DNA 서열은 서열번호 21의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, DNA 서열은 서열번호 21에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 코돈 최적화 DNA 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, IFNα를 암호화하는 DNA 서열로부터 전사된 RNA 서열을 포함한다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 서열번호 20 또는 21을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 서열번호 22 또는 23을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 서열번호 22 또는 23에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, IFNα RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA의 각각의 우리딘은 개질된다. 일부 구현예에서, RNA의 각각의 우리딘은 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)으로 개질된다.
일부 구현예에서, IFNα RNA는 5' 말단에 변경된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, IFNα RNA는 5' 캡을 포함한다. 당해 분야에 공지된 임의의 5' 캡이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 5'-5' 삼인산 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 티오인산염 개질을 포함한 5'-5' 삼인산 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 2'-O 또는 3'-O-리보스-메틸화 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 개질된 구아노신 뉴클레오티드 또는 개질된 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 7-메틸구아닐산을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 Cap0 또는 Cap1이다. 예시적인 캡 구조는 m7G(5')ppp(5')G, m7,2`O-mG(5')ppSp(5')G, m7G(5')ppp(5')2`O-mG 및 m7,3`O-mG(5')ppp(5')2`O-mA를 포함한다.
일부 구현예에서, IFNα RNA는 5' 비해독 부위(UTR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 개시 코돈의 상류이다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 RNA의 번역을 조절한다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 안정화 서열이다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 RNA의 반감기를 증가시킨다. 당해 분야에 공지된 임의의 5' UTR이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 5’ UTR RNA 서열은 서열번호 1, 3, 또는 5를 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. 일부 구현예에서, 5’ UTR RNA 서열은 서열번호 2, 4, 또는 6을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' UTR RNA 서열은 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
일부 구현예에서, IFNα RNA는 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 번역 종결 코돈 뒤에 온다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 RNA의 폴리아데닐화, 번역 효율, 국재화, 또는 안정성을 조절한다. 일부 구현예에서, 3' UTR RNA 서열은 서열번호 7을 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. 일부 구현예에서, 3' UTR RNA 서열은 서열번호 8을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' UTR RNA 서열은 서열번호 8에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
일부 구현예에서, IFNα 조성물은 5' UTR 및 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 5' UTR만을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 3' UTR만을 포함한다.
일부 구현예에서, IFNα RNA는 폴리-A 꼬리를 포함한다. 일부 구현예에서, IFNα RNA는 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 70개 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 100개 뉴클레오티드의 폴리-A 꼬리를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 200개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 서열번호 78을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, RNA는 5' 캡, 5' UTR, IFNα를 암호화하는 핵산, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 이 순서대로 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 20 또는 21에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, 서열번호 20 또는 21에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열로부터 전사된, RNA 서열을 포함한다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다. 일부 구현예에서, IFNα RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 20 또는 21에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, 서열번호 20 또는 21에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열로부터 전사된, RNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IFNα RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 20 또는 21에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, 서열번호 20 또는 21에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열로부터 전사된 RNA 서열을 포함한다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다. 일부 구현예에서, IFNα RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다. 일부 구현예에서, 조성물은 서열번호 22 또는 23에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 8에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IFNα RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다.
D. IL-15 스시
본 명세서에 사용된 용어 "IL-15 스시"는 가용성 인터루킨 15(IL-15) 수용체 알파 스시 도메인 및 성숙 인터루킨 알파(IL-15)를 융합 단백질로서 포함하는 구성체를 말한다. 일부 구현예에서, 조성물은 IL-15 스시를 암호화하는 DNA 서열(서열번호 24)을 포함하며, 이는 가용성 IL-15 수용체 알파 쇄(스시), 다음으로 글리신-세린(GS) 링커, 다음으로 IL-15의 성숙 서열을 포함한다. 이 IL-15 스시를 암호화하는 DNA 서열은 서열번호 25로 제공된다.
일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, IL-15 스시를 암호화하는 DNA 서열로부터 전사된 RNA 서열을 포함한다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 서열번호 25를 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된다. 일부 구현예에서, 링커를 암호화하는 뉴클레오티드는 완전히 부존재하거나, 적합한 링커를 암호화하는 임의의 뉴클레오티드로 일부 또는 전부 교체될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 서열번호 26을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 서열번호 26에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 스시를 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열은 IL-15 수용체 알파의 스시 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 25 또는 26의 뉴클레오티드 1 내지 321) 및 성숙 IL-15를 암호화하는 뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 25 또는 26의 뉴클레오티드 382 내지 729)를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 스시를 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열은 IL-15 수용체 알파의 스시 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 25 또는 26의 뉴클레오티드 1 내지 321) 및 성숙 IL-15를 암호화하는 뉴클레오티드(예컨대, 서열번호 25 또는 26의 뉴클레오티드 382 내지 729)를 포함하고, 이 부분들을 연결하는 링커 폴리펩티드를 암호화하는 이 부분들 사이의 뉴클레오티드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 서열번호 25 또는 26의 뉴클레오티드 322 내지 381을 포함한다. 당업자에게 공지된 임의의 링커가 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-15 스시 RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, IL-15 스시 RNA는 5' 말단에 변경된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 스시 RNA는 5' 캡을 포함한다. 당해 분야에 공지된 임의의 5' 캡이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 5'-5' 삼인산 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 티오인산염 개질을 포함한 5'-5' 삼인산 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 2'-O 또는 3'-O-리보스-메틸화 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 개질된 구아노신 뉴클레오티드 또는 개질된 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 7-메틸구아닐산을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 Cap0 또는 Cap1이다. 예시적인 캡 구조는 m7G(5')ppp(5')G, m7,2`O-mG(5')ppSp(5')G, m7G(5')ppp(5')2`O-mG 및 m7,3`O-mG(5')ppp(5')2`O-mA를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-15 스시 RNA는 5' 비해독 부위(UTR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 개시 코돈의 상류이다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 RNA의 번역을 조절한다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 안정화 서열이다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 RNA의 반감기를 증가시킨다. 당해 분야에 공지된 임의의 5' UTR이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' UTR RNA 서열은 서열번호 1, 3, 또는 5로부터 전사된다. 일부 구현예에서, 5’ UTR RNA 서열은 서열번호 2, 4, 또는 6을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' UTR RNA 서열은 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
일부 구현예에서, IL-15 스시 RNA는 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 번역 종결 코돈 뒤에 온다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 RNA의 폴리아데닐화, 번역 효율, 국재화, 또는 안정성을 조절한다. 일부 구현예에서, 3' UTR RNA 서열은 서열번호 7로부터 전사된다. 일부 구현예에서, 3' UTR RNA 서열은 서열번호 8을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' UTR RNA 서열은 서열번호 8에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
일부 구현예에서, IL-15 스시 조성물은 5' UTR 및 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 스시 조성물은 5' UTR만을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 스시 조성물은 3' UTR만을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-15 스시 RNA는 폴리-A 꼬리를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 70개 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 100개 뉴클레오티드의 폴리-A 꼬리를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 200개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 서열번호 78을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, RNA는 5' 캡, 5' UTR, IL-15 스시를 암호화하는 핵산, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 이 순서대로 포함한다.
일부 구현예에서, IL-15 스시 조성물은 서열번호 25에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-15 스시 조성물은 예를 들어, 서열번호 25에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열로부터 전사된, RNA 서열을 포함한다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다. 일부 구현예에서, IFNα RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, IL-15 스시 조성물은 서열번호 25에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-15 스시 조성물은 예를 들어, 서열번호 25에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열로부터 전사된, RNA 서열을 포함한다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다. 일부 구현예에서, IFNα RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, IL-15 스시 조성물은 서열번호 25에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-15 스시 조성물은 예를 들어, 서열번호 25에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열로부터 전사된 RNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IFNα RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, IL-15 스시 조성물은 서열번호 26에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 8에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IFNα RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다.
E. 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)
일부 구현예에서, 조성물은 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 암호화하는 DNA 서열(예컨대, 서열번호 27)을 포함한다. 일부 구현예에서, GM-CSF를 암호화하는 DNA 서열은 서열번호 28로 제공된다.
일부 구현예에서, GM-CSF 조성물은 예를 들어, GM-CSF를 암호화하는 DNA 서열로부터 전사된 RNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 서열번호 28로부터 전사된다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 서열번호 29를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, RNA 서열은 서열번호 29에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 RNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, GM-CSF RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다. 일부 구현예에서, GM-CSF RNA는 5' 말단에 변경된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 5' 캡을 포함한다. 당해 분야에 공지된 임의의 5' 캡이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 5'-5' 삼인산 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 티오인산염 개질을 포함한 5'-5' 삼인산 연결을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 2'-O 또는 3'-O-리보스-메틸화 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 개질된 구아노신 뉴클레오티드 또는 개질된 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 7-메틸구아닐산을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡은 Cap0 또는 Cap1이다. 예시적인 캡 구조는 m7G(5')ppp(5')G, m7,2`O-mG(5')ppSp(5')G, m7G(5')ppp(5')2`O-mG 및 m7,3`O-mG(5')ppp(5')2`O-mA를 포함한다.
일부 구현예에서, GM-CSF RNA는 5' 비해독 부위(UTR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 개시 코돈의 상류이다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 RNA의 번역을 조절한다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 안정화 서열이다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 RNA의 반감기를 증가시킨다. 당해 분야에 공지된 임의의 5' UTR이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' UTR RNA 서열은 서열번호 1, 3, 또는 5로부터 전사된다. 일부 구현예에서, 5’ UTR RNA 서열은 서열번호 2, 4, 또는 6을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 5' UTR RNA 서열은 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
일부 구현예에서, GM-CSF RNA는 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 번역 종결 코돈 뒤에 온다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 RNA의 폴리아데닐화, 번역 효율, 국재화, 또는 안정성을 조절한다. 일부 구현예에서, 3' UTR RNA 서열은 서열번호 7로부터 전사된다. 일부 구현예에서, 3' UTR RNA 서열은 서열번호 8을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 3' UTR RNA 서열은 서열번호 8에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
일부 구현예에서, GM-CSF 조성물은 5' UTR 및 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 5' UTR만을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 3' UTR만을 포함한다.
일부 구현예에서, GM-CSF RNA는 폴리-A 꼬리를 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 70개 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 100개 뉴클레오티드의 폴리-A 꼬리를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 200개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 서열번호 78을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, GM-CSF RNA는 5' 캡, 5' UTR, GM-CSF를 암호화하는 뉴클레오티드, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 이 순서대로 포함한다.
일부 구현예에서, GM-CSF 조성물은 서열번호 28에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, GM-CSF 조성물은 예를 들어, 서열번호 28에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열로부터 전사된, RNA 서열을 포함한다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다. 일부 구현예에서, GM-CSF RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, GM-CSF 스시 조성물은 서열번호 28에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, GM-CSF 조성물은 예를 들어, 서열번호 28에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열로부터 전사된, RNA 서열을 포함한다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다. 일부 구현예에서, GM-CSF RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, GM-CSF 조성물은 서열번호 28에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, 서열번호 28에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 1, 3, 또는 5에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 7에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 DNA 서열로부터 전사된 RNA 서열을 포함한다. 이 RNA는 재조합으로 생성될 수도 있다. 일부 구현예에서, GM-CSF RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, RNA는 각 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)이다.
일부 구현예에서, GM-CSF 조성물은 서열번호 29에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 2, 4, 또는 6에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고; 서열번호 8에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된 RNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, GM-CSF RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다.
F. 개질
본 명세서에 기술된 RNA 및 조성물 각각은 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 개질될 수 있다. 일부 구현예에서, 개질은 본 명세서에 기술된 바와 같이 "ModA" 또는 "ModB" 개질된다.
일부 구현예에서, RNA의 1개 이상의 우리딘은 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 개질된 뉴클레오시드는 개질된 우리딘이다.
일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 우리딘은 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다.
일부 구현예에서, RNA의 1개 이상의 시토신, 아데닌 또는 구아닌은 개질된 핵염기(들)로 교체된다. 일 구현예에서, 시토신을 교체하는 개질된 핵염기는 5-메틸시토신(m5C)이다. 또 다른 구현예에서, 아데닌을 교체하는 개질된 핵염기는 N6-메틸아데닌(m6A)이다. 또 다른 구현예에서, 분자의 면역원성을 감소시키기 위하여 당해 분야에 공지된 임의의 기타 개질된 핵염기가 사용될 수 있다.
RNA의 1개 이상의 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 다음 중 임의의 1종 이상일 수 있다: 3-메틸-우리딘(m3U), 5-메톡시-우리딘(mo5U), 5-아자-우리딘, 6-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-우리딘(s2U), 4-티오-우리딘(s4U), 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시-우리딘(ho5U), 5-아미노알릴-우리딘, 5-할로-우리딘(예컨대, 5-요오도-우리딘 또는 5-브로모-우리딘), 우리딘 5-옥시아세트산(cmo5U), 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르(mcmo5U), 5-카르복시메틸-우리딘(cm5U), 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘(chm5U), 5-카르복시하이드록시메틸-우리딘 메틸 에스테르(mchm5U), 5-메톡시카르보닐메틸-우리딘(mcm5U), 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오-우리딘(mcm5s2U), 5-아미노메틸-2-티오-우리딘(nm5s2U), 5-메틸아미노메틸-우리딘(mnm5U), 1-에틸-슈도우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오-우리딘(mnm5s2U), 5-메틸아미노메틸-2-셀레노-우리딘(mnm5se2U), 5-카바모일메틸-우리딘(ncm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-우리딘(cmnm5U), 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우리딘(cmnm5s2U), 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-우리딘(τm5U), 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘(τm5s2U), 1-타우리노메틸-4-티오-슈도우리딘), 5-메틸-2-티오-우리딘(m5s2U), 1-메틸-4-티오-슈도우리딘(m1s4ψ), 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 3-메틸-슈도우리딘(m3ψ), 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘(D), 디하이드로슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, 5-메틸-디하이드로우리딘(m5D), 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시-우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘(acp3U), 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘(acp3 ψ), 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘(inm5U), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오-우리딘(inm5s2U), α-티오-우리딘, 2'-O-메틸-우리딘(Um), 5,2'-O-디메틸-우리딘(m5Um), 2'-O-메틸-슈도우리딘(ψm), 2-티오-2'-O-메틸-우리딘(s2Um), 5-메톡시카르보닐메틸-2'-O-메틸-우리딘(mcm5Um), 5-카바모일메틸-2'-O-메틸-우리딘(ncm5Um), 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸-우리딘(cmnm5Um), 3,2'-O-디메틸-우리딘(m3Um), 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸-우리딘(inm5Um), 1-티오-우리딘, 데옥시티미딘, 2'-F-아라-우리딘, 2'-F-우리딘, 2'-OH-아라-우리딘, 5-(2-카르보메톡시비닐)우리딘, 5-[3-(1-E-프로페닐아미노)우리딘, 또는 당해 분야에 공지된 임의의 기타 개질된 우리딘.
G. 조합 조성물
일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 2종 이상의 RNA를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 2종의 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 3종의 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 4종의 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 5종의 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2, IL-12sc, IL-15 스시, GM-CSF, 또는 IFNα를 암호화하는 임의의 또는 모든 RNA는 예컨대, 본 명세서에 기술된 이들 RNA를 포함하는 임의의 조성물 및 제형에서, IL-2, IL-12sc, IL-15 스시, GM-CSF, 및/또는 IFNα 폴리펩티드로 교체될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-2, IL-12sc, IL-15 스시, GM-CSF, 및/또는 IFNα를 암호화하는 개질된 또는 비개질 RNA는 예컨대, 본 명세서에 기술된 이들 RNA를 포함하는 임의의 조성물 및 제형에서, IL-2, IL-12sc, IL-15 스시, GM-CSF 및 IFNα 폴리펩티드로부터 선택된 2종 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 개질된 또는 비개질 폴리시스트론성 RNA로 교체될 수 있다.
임의의 조합 조성물은 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 부형제 또는 희석제는 대상체에 투여하기 위하여 약학적으로 허용 가능한 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 조합 조성물은 동일한 개질이 있는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조합 조성물은 상이한 개질이 있는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조합 조성물은 ModA 개질이 있는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조합 조성물은 ModB 개질이 있는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조합 조성물은 ModA 및 ModB 개질이 있는 RNA를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-2를 암호화하는 DNA 또는 RNA 및, IL-12sc를 암호화하는 DNA 또는 RNA, IFNα를 암호화하는 DNA 또는 RNA, IL-15 스시를 암호화하는 DNA 또는 RNA, 및 GM-CSF를 암호화하는 DNA 또는 RNA 중 1종 이상을 포함하는 조성물이 포함된다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같이, IL-2 또는 코돈 최적화 IL-2를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 10 내지 13) 및, IL-12sc 또는 최적화 IL-12sc를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 15 내지 18), IFNα 또는 최적화 IFNα를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 20 내지 23), IL-15 스시를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 25 내지 26), 및 GM-CSF를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 28 내지 29) 중 1종 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, 조성물의 RNA 중 1종 이상은 조성물 섹션에서 본 명세서에 기술된 바와 같이 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함한다.
일부 구현예에서, IL-12sc를 암호화하는 DNA 또는 RNA 및, IL-2를 암호화하는 DNA 또는 RNA, IFNα를 암호화하는 DNA 또는 RNA, IL-15 스시를 암호화하는 DNA 또는 RNA, 및 GM-CSF를 암호화하는 DNA 또는 RNA 중 1종 이상을 포함하는 조성물이 포함된다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같이, IL-12sc 또는 코돈 최적화 IL-12sc를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 15 내지 18) 및, IL-2 또는 최적화 IL-2를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 10 내지 13), IFNα 또는 최적화 IFNα를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 20 내지 23), IL-15 스시를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 25 내지 26), 및 GM-CSF를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 28 내지 29) 중 1종 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다.
일부 구현예에서, 조성물의 RNA 중 1종 이상은 조성물 섹션에서 본 명세서에 기술된 바와 같이 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함한다.
일부 구현예에서, IFNα를 암호화하는 DNA 또는 RNA 및, IL-2를 암호화하는 DNA 또는 RNA, IL-12sc를 암호화하는 DNA 또는 RNA, IL-15 스시를 암호화하는 DNA 또는 RNA, 및 GM-CSF를 암호화하는 DNA 또는 RNA 중 1종 이상을 포함하는 조성물이 포함된다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같이, IFNα 또는 코돈 최적화 IFNα를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 20 내지 23) 및, IL-12sc 또는 최적화 IL-12sc를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 15 내지 18), IL-2 또는 최적화 IL-2를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 10 내지 13), IL-15 스시를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 25 내지 26), 및 GM-CSF를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 28 내지 29) 중 1종 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, 조성물의 RNA 중 1종 이상은 조성물 섹션에서 본 명세서에 기술된 바와 같이 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함한다.
일부 구현예에서, IL-15 스시를 암호화하는 DNA 또는 RNA 및, IL-2를 암호화하는 DNA 또는 RNA, IL-12sc를 암호화하는 DNA 또는 RNA, IFNα를 암호화하는 DNA 또는 RNA, 및 GM-CSF를 암호화하는 DNA 또는 RNA 중 1종 이상을 포함하는 조성물이 포함된다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같이, IL-15 스시를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 25 내지 26) 및, IL-12sc 또는 최적화 IL-12sc를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 15 내지 18), IFNα 또는 최적화 IFNα를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 20 내지 23), IL-2 또는 최적화 IL-2를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 10 내지 13), 및 GM-CSF를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 28 내지 29) 중 1종 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, 조성물의 RNA 중 1종 이상은 조성물 섹션에서 본 명세서에 기술된 바와 같이 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함한다.
일부 구현예에서, GM-CSF를 암호화하는 DNA 또는 RNA 및, IL-2를 암호화하는 DNA 또는 RNA, IL-12sc를 암호화하는 DNA 또는 RNA, IFNα를 암호화하는 DNA 또는 RNA, 및 IL-15 스시를 암호화하는 DNA 또는 RNA 중 1종 이상을 포함하는 조성물이 포함된다. 일부 구현예에서, 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같이, GM-CSF를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 28 내지 29) 및, IL-12sc 또는 최적화 IL-12sc를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 15 내지 18), IFNα 또는 최적화 IFNα를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 20 내지 23), IL-2 또는 최적화 IL-2를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 10 내지 13), 및 IL-15 스시를 암호화하는 DNA 또는 RNA(서열번호 25 내지 26) 중 1종 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA의 1개 이상의 우리딘은 본 명세서에 기술된 바와 같이 개질된 뉴클레오시드로 교체된다. 일부 구현예에서, 우리딘을 교체하는 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 또는 5-메틸-우리딘(m5U)이다. 일부 구현예에서, 조성물의 RNA 중 1종 이상은 조성물 섹션에서 본 명세서에 기술된 바와 같이 5' 캡, 5' UTR, 3' UTR, 및 폴리-A 꼬리를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 GM-CSF, IL-2, 및 IL-12sc RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, ModA 또는 ModB로서 개질된다. 일부 구현예에서, IL-12sc RNA는 서열번호 18에 나타난 바와 같이 최적화된다.
일부 구현예에서, 조성물은 GM-CSF, IL-15 스시, 및 IL-12sc RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, ModA 또는 ModB로서 개질된다. 일부 구현예에서, IL-12sc RNA는 서열번호 18에 나타난 바와 같이 최적화된다.
일부 구현예에서, 조성물은 GM-CSF, IL-2, IL-12sc, 및 IFNα RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, ModA 또는 ModB로서 개질된다. 일부 구현예에서, IL-12sc RNA 및 IFNα RNA는 각각 서열번호 18 및 23에 나타난 바와 같이 최적화된다.
일부 구현예에서, 조성물은 GM-CSF, IL-15 스시, IL-12sc, 및 IFNα RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, ModA 또는 ModB로서 개질된다. 일부 구현예에서, IL-12sc RNA 및 IFNα RNA는 각각 서열번호 18 및 23에 나타난 바와 같이 최적화된다.
일부 구현예에서, 조성물은 GM-CSF, IL-15 스시, IL-12sc, 및 IFNα RNA를 포함하며, 이때, RNA는 서열번호 18(IL-12sc), 서열번호 23(IFNα), 서열번호 26(IL-15 스시), 또는 서열번호 29(GM-CSF)에 나타난 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 조성물은 예를 들어, ModA 또는 ModB로서 개질된다.
일부 구현예에서, RNA의 조합물은 동일한 RNA 질량을 기준으로 1:1, 1:1:1, 또는 1:1:1:1 비율로서 투여된다. 예를 들어, 20 μg의 IL-15-스시, 20 μg의 IL-12sc, 20 μg의 IFNα2b 및 20 μg GM-CSF. 일부 구현예에서, 비율이 조정되어 상이한 중량비가 투여된다. 예를 들어, 1:10:1:10 비율(20 μg, 200 μg, 20 μg, 200 μg). 마찬가지로, 일부 구현예에서, 예를 들어, 1:2:3:4(20 μg, 40 μg, 60 μg, 80 μg)의 비율이 사용된다. 대안적으로, RNA의 질량에 대한 비율을 기초로 하기 보다는, 이 비율은 RNA의 몰 농도를 기초로 할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 혼합물은 혼합물의 각 RNA의 동일한 비율로 투여된다.
일부 구현예에서, RNA 혼합물은 혼합물의 각 RNA의 상이한 비율로 투여된다. 일부 구현예에서, 1종 이상의 RNA는 혼합물의 또 다른 RNA보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 더 많은 비율로 투여된다. 일부 구현예에서, 1종 이상의 RNA는 혼합물의 또 다른 RNA보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배 더 적은 비율로 투여된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물은 의약 제제일 수 있다. 일부 구현예에서, 의약 제제는 키트를 포함하며, 이때, 포함된 RNA들은 동일한 바이알 또는 개별 바이알에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 의약 제제는 고형 종양의 치료 또는 예방을 위한 조성물 사용 설명서를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 조성물을 포함하는 키트가 제공되며, 이때, 포함된 RNA들은 동일한 바이알 또는 개별 바이알에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 고형 종양의 치료 또는 예방을 위한 조성물 사용 설명서를 더 포함한다.
H. 개질된 mRNA 처리에 대한 IFNα 첨가의 효과
RNA는 다양한 패턴 인식 수용체(PRR) 자극을 통해 면역계를 활성화하여, (IFNα와 같은) I형 인터페론의 생성을 초래할 수 있다. 다양한 개질된 뉴클레오티드의 도입, 또는 투여되는 dsRNA 양의 감소와 같은 다른 변형은 RNA의 면역 자극 효과를 감소시킬 수 있다. 예상 외로, 실시예에 기술된 바와 같이, 뉴클레오티드가 개질되고 dsRNA가 감소된, 인터페론 알파를 암호화하는 mRNA의 포함은 뉴클레오티드가 개질되지 않고 dsRNA가 감소되지 않은 mRNA와 비교하여 항종양 활성을 개선하였다. 인터페론 알파를 암호화하는 mRNA의 첨가는 개질된 뉴클레오티드의 포함 및 dsRNA 정제에 의해 제거된 면역 자극 효과 일부를 회복시켰다.
일부 구현예에서, (임의의 형태 또는 아형의) IFN을 암호화하는 RNA가 제공되는데, 이때, IFN RNA는 변형되어 비변형 RNA와 비교하여 감소된 면역원성을 갖는다. 특정 구현예에서, 이 IFN의 투여는 비IFN 암호화 RNA의 항종양 반응을 개선한다. 일부 구현예에서, IFNα를 암호화하는 RNA는 다른 RNA들이 면역원성을 감소시키도록 변형되었다면 이 다른 RNA들의 항종양 반응을 개선한다. 일 구현예에서, 면역원성을 감소시키는 변형은 dsRNA 양의 감소이다. 일부 양태에서, 면역원성을 감소시키는 변형은 하나 이상의 우리딘의 개질된 뉴클레오시드로의 교체이다. 일부 양태에서, 면역원성을 감소시키는 변형은 dsRNA 양의 감소 및 하나 이상의 우리딘의 개질된 뉴클레오시드로의 교체 둘 다이다. 일부 구현예에서, IFN은 IFNα이다.
일부 구현예에서, IFN RNA는 개질된 RNA의 항종양 반응을 개선한다. 일부 구현예에서, IFN RNA는 개질된 뉴클레오티드를 포함하는 RNA들의 항종양 반응을 개선한다. 일부 구현예에서, IFN RNA는 슈도우리딘을 포함하는 mRNA의 항종양 반응을 개선한다. 일부 구현예에서, IFN RNA는 ModB 개질이 있는 RNA들의 항종양 반응을 개선한다.
일부 구현예에서, IFN RNA는 IL-2의 RNA(서열번호 12 또는 13), IL-12sc의 RNA(서열번호 17 또는 18), IL-15 스시의 RNA(서열번호 26) 또는 GM-CSF의 RNA(서열번호 29)의 항종양 반응을 개선한다. 일부 구현예에서, RNA들은 ModB 개질을 포함한다.
일부 구현예에서, IFN은 IFNα이다.
일부 구현예에서, IFN RNA 구성체는 서열번호 22 또는 23이다.
III. 방법 및 용도
본 명세서에 기술된 임의의 RNA, 조성물, 의약 제제 및 조합 조성물은 암 또는 고형 종양 치료를 위하여 대상체에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양이다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 낭포 또는 액체 영역을 함유하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 전암성 병변이다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 폐, 결장, 난소, 자궁경부, 자궁, 복막, 고환, 음경, 혀, 림프절, 췌장, 뼈, 유방, 전립선, 연조직, 결합조직, 신장, 간, 뇌, 갑상선, 또는 피부에서 발생한다.
일부 구현예에서, 고형 종양은 육종, 암종, 또는 림프종이다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 상피성 종양, 호지킨 림프종(HL), 비 호지킨 림프종, 전립선 종양, 난소 종양, 신장세포 종양, 소화관 종양, 간 종양, 결장직장 종양, 맥관 구조가 있는 종양, 중피종 종양, 췌장 종양, 유방 종양, 육종 종양, 폐 종양, 결장 종양, 뇌 종양, 흑색종 종양, 기저세포 암종, 편평상피세포 암종, 소세포 폐 종양, 신경모세포종 종양, 고환 종양, 암종 종양, 선암종 종양, 신경아교종 종양, 고환종 종양, 망막모세포종, 또는 골육종 종양이다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 광선 각화증과 같은 전암성 병변이다.
일부 구현예에서, RNA 조성물은 종양 안에(예컨대, 종양 내) 또는 종양 근처에(종양 주위) 주사하여 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 조성물은 종양 제거 부위에 또는 그 근처에 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 조성물은 국소 용액, 연고, 또는 크림을 통해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, RNA 조성물은 바이러스를 통해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 조성물은 종양세포붕괴성 바이러스와 같은, RNA 조성물을 암호화하는 바이러스로의 감염에 의해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 조성물은 종양세포붕괴성 바이러스에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 1회 초과의 투여가 전달된다. 일부 구현예에서, 카테터가 복수 투여를 위하여 종양 부위 내에 또는 그 근처에 놓인다. 일부 구현예에서, 카테터가 복수 투여를 위하여 종양 제거 부위에 놓인다.
일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 비인간 포유동물, 예컨대, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 토끼, 양, 소, 말 및 돼지이다.
일부 구현예에서, RNA 조성물은 또 다른 치료법과 조합된다. 일부 구현예에서, RNA 조성물은 1종 초과의 다른 치료법과 조합된다. 일부 구현예에서, RNA 조성물은 다중 양식 치료법으로 조합된다.
일부 구현예에서, 다른 치료법은 종양을 절개, 절제, 또는 감량하는 수술이다. 일부 구현예에서, 치료적 RNA 조성물은 종양을 절개, 절제, 또는 감량하는 수술 중에 투여된다.
일부 구현예에서, 다른 치료법은 방사선요법이다. 일부 구현예에서, 방사선요법은 외부 빔 방사선 치료 또는 입자 빔 방사선이다. 일부 구현예에서, 방사선요법은 카테터 또는 대구경의 침(large bore needle)을 통해 종양 내로 직접적으로 방사성 동위원소를 일시적 또는 영구적으로 이식하는 것을 수반하는 근접치료법이다. 일부 구현예에서, 방사성 동위원소는 137세슘, 192이리듐, 또는 방사성 요오드이다. 일부 구현예에서, 방사선요법은 정맥 내 투여되는 방사성 동위원소 제제이다. 일부 구현예에서, 방사성 동위원소 제제는 방사성 요오드(131I), 스트론튬(89Sr), 또는 사마륨(153Sm)이다.
일부 구현예에서, 다른 치료법은 화학요법이다. 일부 구현예에서, 화학요법은 알킬화제, 항대사물질, 항미세관제, 국소이성질화효소 억제제, 또는 세포독성 항체이다.
일부 구현예에서, 화학요법은 항침습제(예컨대, 마리마스타트와 같은 금속단백분해효소 억제제 및 우로키나아제 플라스미노겐 활성화인자 수용체 기능의 억제제)를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학요법은 성장 인자 기능(예컨대, 혈소판 유래 성장 인자 및 간세포 성장 인자) 억제제, 성장 인자 항체, 또는 성장 인자 수용체 항체(예컨대, 항-erbb2 항체 트라스투주맙 [허셉틴(Herceptin™)] 및 항-erbb1 항체 세툭시맙(cetuximab™))를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학요법은 파르네실 전달효소 억제제이다. 일부 구현예에서, 화학요법은 티로신 키나아제 억제제, 예컨대, 표피 성장 인자 패밀리의 억제제(예를 들어, EGFR 패밀리 티로신 키타아제 억제제, 예컨대, 게피티닙(이레사(Iressa™)), 엘로티닙(타르세바(Tarceva™)), 및 카네르티닙(CI 1033), 또는 세린/트레오닌 키나아제 억제제)이다.
일부 구현예에서, 화학요법은 항증식제/항신생물제, 예컨대, 항대사제(예를 들어, 항엽산제, 예컨대, 메토트렉세이트, 플루오로피리미딘, 예컨대, 5-플루오로우라실, 테가푸르, 퓨린 및 아데노신 유사체, 시토신 아라비노시드); 항종양 항생제(예를 들어, 안트라사이클린, 예컨대, 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신 및 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티노마이신, 미트라마이신); 백금 유도체(예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴); 알킬화제(예컨대, 질소 머스타드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 니트로소우레아, 티오테파); 항세포분열제(예를 들어, 빈카 알칼로이드, 예컨대, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈, 및 탁소이드, 예컨대, 탁솔, 탁소테레); 국소이성질화효소 억제제(예를 들어, 에피포도필로독신, 예컨대, 에토포시드 및 테니포시드, 암사크린, 토포테칸, 캄프토테신 및 또한 이리노테칸); 또는 티미딜산 합성효소 억제제(예를 들어, 랄티트렉세드)를 포함한다.
일부 구현예에서, 화학요법은 항체-약물 접합체(ADC)이다. 일부 구현예에서, ADC는 세포독성(항암)제에 연결된 항체이다. 일부 구현예에서, ADC는 세포독성제의 종양 세포로의 표적화된 전달을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, ADC는 정상 조직에 대하여 종양 세포로의 세포독성제의 우선 전달을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 화학요법은 상이한 작용제의 조합물과의 병용 요법이다. 일부 구현예에서, 조합물은 상이한 작용 메커니즘 및/또는 상이한, 중첩되지 않는 독성을 나타내는 상이한 작용제를 포함한다.
일부 구현예에서, 다른 치료법은 면역 자극제 또는 면역요법, 예컨대, 체크포인트 조절제/억제제이다. 숙주 면역계가 자신을 공격하는 것을 방지하는 체크포인트 조절제/억제제는 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, CTLA-4, PD1, PDL1, GITR, OX40, LAG-3, 및 TIM-3을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 자극제, 면역요법, 또는 체크포인트 조절제/억제제는 단일클론 항체이다. 일부 구현예에서, 단일클론 항체는 PD1, PDL1, CTLA-4, LAG3, OX40, CD40, CD40L, 41BB, 41BBL, GITR, CD3, CD28, CD38, 또는 TGF베타에 대한 항체이다. 일부 구현예에서, 단일클론 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 면역 자극제는 세포 기반 면역요법이다. 일부 구현예에서, 면역 자극제는 사이토카인 또는 케모카인이다. 일부 구현예에서, 면역 자극제는 암 백신이다. 광범위한 면역 자극제가 당해 분야의 과학자 및 임상의에게 알려져 있으므로, 본 발명은 특정 면역 자극제와의 특수한 조합물에 한정되지 않는다.
일부 예에서, 본 명세서에 기술된 임의의 RNA, RNA 조성물, 의약 제제, 및 RNA 조합 조성물은 면역 자극제, 면역요법, 또는 체크포인트 조절제와 조합하여 투여될 수 있다. 일부 예에서, 본 명세서에 기술된 RNA, RNA 조성물, 및 RNA 조합 조성물은 고형 종양을 포함한 암을 치료하기 위하여 대상체에 항체와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 항체는 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 또는 항-PD1 항체와 항-CTLA-4 항체의 조합물이다. 일부 구현예에서, 항체는 다중특이적 항체, 예컨대, 삼중특이적 또는 이중특이적 항체이다.
일부 구현예에서, 항-PD1 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 단리된 및/또는 재조합 항체이다. 항-PD-1 항체의 예는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 세미플리맙, MEDI0608(과거 AMP-514; 예컨대, WO 2012/145493 및 미국 특허 제9,205,148호 참조), PDR001(예컨대, WO 2015/112900 참조), PF-06801591(예컨대, WO 2016/092419 참조), BGB-A317(예컨대, WO 2015/035606 참조)이다.
일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 WO 2015/112800에 개시된 것들 중 하나이다(예컨대, PCT 공개공보의 표 1에서 H1M7789N, H1M7799N, H1M7800N, H2M7780N, H2M7788N, H2M7790N, H2M7791N, H2M7794N, H2M7795N, H2M7796N, H2M7798N, H4H9019P, H4xH9034P2, H4xH9035P2, H4xH9037P2, H4xH9045P2, H4xH9048P2, H4H9057P2, H4H9068P2, H4xH9119P2, H4xH9120P2, H4xH9128P2, H4xH9135P2, H4xH9145P2, H4xH8992P, H4xH8999P 및 H4xH9008P로 지칭된 것들 및 PCT 공개공보의 표 3에서 H4H7798N, H4H7795N2, H4H9008P 및 H4H9048P2로 지칭된 것들). WO 2015/112800의 개시 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 예를 들어, WO 2015/112800에 개시된 항체 및 관련 항체(이 PCT 공개공보에 개시된 CDR, VH 및 VL 서열, 또는 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항체 및 항원-결합 단편뿐만 아니라, 이 PCT 공개공보에 개시된 항체와 동일한 PD-1 에피토프에 결합하는 항체 및 항원-결합 단편도 포함)는 암 치료 및/또는 예방을 위하여 본 발명의 RNA 조성물과 함께 사용될 수 있다.
관련 구현예에서, 항-PD-1 항체는 아래에서 각각 서열번호 79 및 80으로 나타낸 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열; (이탤릭체로 나타낸) 서열번호 87 및 88의 VH 및 VL 서열, 또는 (굵은 활자체 상자에 나타낸) 서열번호 79 및 80의 1개 이상(예컨대, 6개 전부)의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다음 CDR들을 포함하는 항체가 포함된다:
HCDR1 = GFTFSNFG(서열번호 81)
HCDR2 = ISGGGRDT(서열번호 82)
HCDR3 = VKWGNIYFDY(서열번호 83)
LCDR1 = LSINTF(서열번호 84)
LCDR2 = AAS(서열번호 85)
LCDR3 = QQSSNTPFT(서열번호 86).
(이탤릭체로 나타낸) 서열번호 87 및 88의 VH 및 VL 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 예시적인 항체는 REGN2810(세미플리맙)으로 알려져 있는 완전 인간 항-PD-1 항체이다.
항-PD-1 Mab 중쇄
HCDR1 = GFTFSNFG(서열번호 81)
HCDR2 = ISGGGRDT(서열번호 82)
HCDR3 = VKWGNIYFDY(서열번호 83)
항-PD-1 Mab 경쇄
LCDR1 = LSINTF(서열번호 84)
LCDR2 = AAS(서열번호 85)
LCDR3 = QQ SSNTPFT(서열번호 86)
일부 구현예에서, RNA, RNA 조성물, 및 RNA 조합 조성물은 종양 안으로(예컨대, 종양 내), 종양 근처에(종양 주위), 또는 종양 제거 부위 근처에 주사하여 전달될 수 있고, 항체는 동일한 방식으로 또는 전신으로, 주사, 주입, 및 이식을 통한 것을 포함하여, 예를 들어, 경장 또는 장관 외와 같이, 전달될 수 있다. "조합하여 투여됨"은 동시적 또는 순차적 투여를 포함한다. 순차적인 경우, 투여는 당업자에게 공지된 임의의 순서 및 임의의 적당한 시간 간격으로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 다른 치료법은 호르몬 요법이다. 일부 구현예에서, 호르몬 요법은 유방암 치료를 위한 항에스트로겐제 또는 전립선암 치료를 위한 항안드로겐제이다. 예시적 작용제는 항에스트로겐(예컨대, 타목시펜, 토레미펜, 랄록시펜, 드롤록시펜, 요오독시펜), 에스트로겐 수용체 하향 조절제(예컨대, 풀베스트란트), 프로게스토겐(예컨대, 메게스트롤 아세테이트), 아로마타제 억제제(예컨대, 아나스트로졸, 레트라졸, 보라졸, 엑스메스탄), 항프로게스토겐, 항안드로겐(예컨대, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 시프로테론 아세테이트), LHRH 효현제 및 길항제(예컨대, 고세렐린 아세테이트, 류프롤리드, 부세렐린), 및 5-알파-환원효소 억제제(예컨대, 피나스테리드)를 포함한다.
일부 구현예에서, 다른 치료법은 표적요법이다. 일부 구현예에서, 표적요법은 키나아제 억제제이다. 일부 구현예에서, 표적요법은 원종양유전자의 유전자 산물의 활성을 억제하는 것이다. 일부 구현예에서, 표적요법은 항혈관신생제이다. 일부 구현예에서, 표적요법은 VEGF, BCR-ABL, BRAF, EGFR, c-Met, MEK, ERK, mTOR, 또는 ALK의 활성을 조절하도록 하는 것이다.
일부 구현예에서, 다른 치료법은 줄기세포 이식이다.
일부 구현예에서, 치료적 RNA 조성물은 또 다른 치료법과 동시에 전달된다.
일부 구현예에서, 치료적 RNA 조성물은 또 다른 치료법 이전에 전달된다.
일부 구현예에서, 치료적 RNA 조성물은 또 다른 치료법 이후에 전달된다.
일부 구현예에서, 치료적 RNA 조성물은 또 다른 치료법과 함께 종양 내로 직접, 또는 종양 또는 종양 제거 부위 근처로 전달된다. 일부 구현예에서, 치료적 RNA 조성물은 종양 내로 직접, 또는 종양 또는 종양 제거 부위 근처로 전달되며, 또 다른 작용제는 전신으로 전달된다.
IV. 약학적 제형
일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 임의의 DNA, RNA, 및 조성물은 약학적 제형이다. 일부 구현예에서, 약학적 제형은 희석제, 부형제, 또는 기타 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 따라서, 본 명세서에 제공된 DNA, RNA, 조성물, 또는 이의 조합물, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 본 명세서에 제공된다. 특정 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 수용액이다. 특정 구현예에서, 수용액은 식염수이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 멸균성인 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 투여량 단위 형태로 투여된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 투여량 단위는 정제, 캡슐, 이식 가능한 장치, 또는 볼루스 주사의 형태이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 약학적 조성물은 추가로 약학적 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 보조 구성성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 추가의, 적합한, 약학적 활성 물질, 예컨대, 항가려움제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제를 함유할 수 있다. 조성물은 또한 추가의, 적합한, 약학적 활성 물질, 예컨대, 부형제, 희석제, 및 담체를 함유할 수 있다.
주사를 위한 특정 약학적 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액, 또는 에멀젼이고, 조제용 제제, 예컨대, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 주사용 약학적 조성물에 사용하기에 적합한 특정 용매는 친유성 용매 및 지방산 오일, 예컨대, 참깨 오일, 합성 지방산 에스테르, 예컨대, 에틸 올레산 또는 트리글리세라이드, 및 리포솜을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 선택적으로, 이러한 현탁액은 또한 약제의 가용성을 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 적합한 안정화제 또는 작용제를 함유할 수 있다.
액체 모이어티는 본 명세서에 제공된 RNA를 전달하는 데 사용될 수 있다. 한 가지 방법에서, RNA는 사전 형성된 리포솜 또는 양이온성 지질 및 중성 지질의 혼합물로 제조된 리포플렉스 내로 도입된다. 또 다른 방법에서, 1가 양이온성 또는 다가 양이온성 지질과의 RNA 복합체는 중성 지질의 존재 없이 형성된다. 특정 구현예에서, 지질 모이어티는 특정 세포 또는 조직으로의 약제의 분배를 증가시키기 위하여 선택된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 약학적 조성물은 폴리아민 화합물 또는 본 명세서에 제공된 DNA 또는 RNA와 복합체를 형성한 지질 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 약학적 조성물은 전달 시스템을 포함한다. 전달 시스템의 예는 리포솜 및 에멀젼을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 전달 시스템은 소수성 화합물을 포함하는 것들을 비롯한 특정 약학적 조성물의 제조에 유용하다. 특정 구현예에서, 특정 유기 용매, 예컨대, 디메틸술폭사이드가 사용된다.
주사를 위한 특정 약학적 조성물은 단위 투여량 형태로, 예컨대, 앰플, 또는 다용량 용기에 제공된다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 약학적 조성물은 치료적 유효량의 RNA 또는 RNA의 조합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 치료적 유효량은 치료 받는 대상체의 암 치료 또는 예방에 충분하다.
다음 항은 다수의 구현예를 제공하며, 비제한적이다:
제1항 IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA, IFNα 단백질을 암호화하는 RNA, 및 GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 조성물.
제2항 제1항에 있어서, IFNα 단백질은 IFNα2b 단백질인, 조성물.
제3항 제1항에 있어서, (i) IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IL-12sc 단백질은 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
제4항 제1항에 있어서, (i) IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IL-15 스시 단백질은 서열번호 24의 아미노산 서열, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
제5항 제1항에 있어서, (i) IFNα 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IFNα 단백질은 서열번호 19의 아미노산 서열, 또는 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
제6항 제1항에 있어서, (i) GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) GM-CSF 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열, 또는 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
제7항 제1항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 적어도 하나의 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함하고, 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 5-메틸-우리딘(m5U), 또는 이의 조합인, 조성물.
제8항 제1항에 있어서, 각 RNA는 적어도 하나의 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함하고, 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 5-메틸-우리딘(m5U), 또는 이의 조합인, 조성물.
제9항 제1항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 5' 캡 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG, 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G, 또는 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG, 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G를 포함하는 것인, 조성물.
제10항 제1항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 (i) 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 (ii) 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5' UTR 및/또는 (i) 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열, 또는 (ii) 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 3' UTR을 포함하는 것인, 조성물.
제11항 제1항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 적어도 100개의 뉴클레오티드의 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 조성물.
제12항 제11항에 있어서, 폴리-A 꼬리는 서열번호 78로 나타낸 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 조성물.
제13항 제1항에 있어서, 1종 이상의 RNA는 다음을 포함하는 것인, 조성물:
- m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G를 포함하는 5' 캡;
- (i) 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 (ii) 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5' UTR;
- (i) 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열, 또는 (ii) 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 3' UTR; 및
- 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리-A 꼬리.
제14항 제13항에 있어서, 폴리-A 꼬리는 서열번호 78을 포함하는 것인, 조성물.
제15항 제1항의 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
제16항 필요로 하는 대상체에 제1항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 고형 종양의 치료 또는 고형 종양 가능성 감소 방법.
제17항 고형 종양 치료 또는 고형 종양 가능성 감소 방법으로, 이를 필요로 하는 대상체에 제1 RNA 및 추가 RNA를 투여하는 단계를 포함하며, 이때, 제1 RNA는 IL-12sc 단백질, IL-15 스시 단백질, IFNα 단백질, 또는 GM-CSF 단백질을 암호화하며, 이때,
- 제1 RNA가 IL-12sc 단백질을 암호화하는 경우, 추가 RNA는 IL-15 스시 단백질, IFNα 단백질, 및 GM-CSF 단백질을 암호화하고;
- 제1 RNA가 IL-15 스시 단백질을 암호화하는 경우, 추가 RNA는 IL-12sc 단백질, IFNα 단백질, 및 GM-CSF 단백질을 암호화하고;
- 제1 RNA가 IFNα 단백질을 암호화하는 경우, 추가 RNA는 IL-15 스시 단백질, IL-12sc 단백질, 및 GM-CSF 단백질을 암호화하고;
- 제1 RNA가 GM-CSF 단백질을 암호화하는 경우, 추가 RNA는 IL-15 스시 단백질, IFNα 단백질, 및 IL-12sc 단백질을 암호화하는 것인, 방법.
제18항 제17항에 있어서, 제1 RNA는 추가 RNA와 동시에 대상체에 투여되는 것인, 방법.
제19항 제17항에 있어서, RNA는 종양 내 또는 종양 주위로 투여되는 것인, 방법.
제20항 제17항에 있어서, 대상체는 (i) 종양 절개, 절제, 또는 감량 수술, (ii) 면역요법, (iii) 방사선요법, 또는 (iv) 화학요법을 포함하는 추가 치료법으로 더 치료되는 것인, 방법.
제21항 제17항에 있어서, 대상체는 체크포인트 조절제로 더 치료되는 것인, 방법.
제22항 제21항에 있어서, 체크포인트 조절자는 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 또는 항-PD1 항체와 항-CTLA-4 항체의 조합물인, 방법.
제23항 제21항에 있어서, RNA는 주사를 통해 종양 내 또는 종양 주위로 투여되고, 체크포인트 조절제는 전신으로 투여되는 것인, 방법.
제24항 제17항에 있어서, 고형 종양은 육종, 암종, 또는 림프종인, 방법.
제25항 제17항에 있어서, 고형 종양은 폐, 결장, 난소, 자궁경부, 자궁, 복막, 고환, 음경, 혀, 림프절, 췌장, 뼈, 유방, 전립선, 연조직, 결합조직, 신장, 간, 뇌, 갑상선, 또는 피부에 존재하는 것인, 방법.
제26항 제17항에 있어서, 고형 종양은 상피성 종양, 호지킨 림프종(HL), 비 호지킨 림프종, 전립선 종양, 난소 종양, 신장세포 종양, 소화관 종양, 간 종양, 결장직장 종양, 맥관 구조가 있는 종양, 중피종 종양, 췌장 종양, 유방 종양, 육종 종양, 폐 종양, 결장 종양, 뇌 종양, 흑색종 종양, 소세포 폐 종양, 신경모세포종 종양, 고환 종양, 암종 종양, 선암종 종양, 신경아교종 종양, 고환종 종양, 망막모세포종, 또는 골육종 종양인, 방법.
제27항 제17항에 있어서, 고형 종양 치료 또는 고형 종양 가능성 감소는 대상체의 종양의 크기 감소, 관해 중인 암의 재발 가능성 감소, 또는 암 전이 가능성 감소를 포함하는 것인, 방법.
제28항 필요로 하는 대상체에 RNA 및 추가 치료법을 투여하는 단계를 포함하는, 고형 종양 치료 또는 고형 종양 가능성 감소를 위한 병용치료 방법으로, 이때, RNA는 IL-12sc 단백질, IL-15 스시 단백질, IFNα 단백질, 및 GM-CSF 단백질을 암호화하고, 추가 치료법은 면역요법, 화학요법, 또는 체크포인트 조절제를 포함하는 것인, 병용치료 방법.
제29항 제28항에 있어서, 추가 치료법은 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 또는 항-PD1 항체와 항-CTLA-4 항체의 조합물을 포함하는 것인, 병용치료 방법.
제30항 IL-12sc 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산으로, 이때, IL-12sc 단백질을 암호화하는 서열은 a) 서열번호 16 또는 18의 뉴클레오티드 1 내지 984에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 78% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드, b) 서열번호 16 또는 18의 뉴클레오티드 1027 내지 1623에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 81% 동일성을 갖는 인접한 뉴클레오티드, 및 c) a) 및 b)의 뉴클레오티드 사이의 링커를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 핵산.
제31항 제30항에 있어서, DNA인, 핵산.
제32항 제30항에 있어서, RNA인, 핵산.
제33항 IFNα 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산으로, 이때, IFNα 단백질을 암호화하는 서열은 서열번호 21 또는 23의 뉴클레오티드에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 것인, 핵산.
제34항 제33항에 있어서, DNA인, 핵산.
제35항 제33항에 있어서, RNA인, 핵산.
제36항 고형 종양 치료 또는 고형 종양 가능성 감소 방법으로, 이를 필요로 하는 대상체에 제34항의 RNA를 투여하는 단계를 포함하며, 이때, 대상체는 IL-15 스시 단백질, IFNα 단백질, 및 GM-CSF 단백질을 암호화하는 추가의 RNA로 더 치료되는 것인, 방법.
제37항 고형 종양 치료 또는 고형 종양 가능성 감소 방법으로, 이를 필요로 하는 대상체에 제35항의 RNA를 투여하는 단계를 포함하며, 이때, 대상체는 IL-15 스시 단백질, IL-12sc 단백질, 및 GM-CSF 단백질을 암호화하는 추가의 RNA로 더 치료되는 것인, 방법.
제38항 전사를 가능하게 하는 조건 하에서 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제32항의 핵산을 포함하는 발현 구성체를 RNA 중합효소와 접촉시키는 단계를 포함하는, IL-12sc를 암호화하는 RNA의 제조방법.
제39항 전사를 가능하게 하는 조건 하에서 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제35항의 핵산을 포함하는 발현 구성체를 RNA 중합효소와 접촉시키는 단계를 포함하는, IFNα를 암호화하는 RNA의 제조방법.
제40항 제1항의 조성물을 포함하는 키트.
제41항 IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA, IFNα 단백질을 암호화하는 RNA, 및 GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 키트로서, 이 RNA들은 동일한 용기 내에 존재하지 않는 것인, 키트.
제42항 제41항에 있어서, 각 RNA는 개별 용기에 존재하는 것인, 키트.
제43항 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양의 치료 또는 고형 종양 가능성 감소를 위한 조성물 또는 RNA의 사용 설명서를 더 포함하는 키트.
본 설명 및 예시적인 구현예는 제한적인 것으로 취급되어서는 안 된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위의 목적을 위하여, 달리 지시되지 않는 한, 양, 백분율, 또는 비율을 표시하는 모든 숫자 및 본 명세서 및 청구항에 사용된 기타 수치값은 "약"이라는 용어에 의해 모든 경우에서, 그것들이 이미 그렇게 수정되지 않는 정도까지, 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 표시되지 않는 한, 다음의 명세서 및 첨부된 청구항에 기재된 수치 파라미터는 달성되도록 추구되는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 최소한, 그리고 청구항의 범위에 대한 균등론 적용을 제한하려는 시도로서가 아니라, 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수에 비추어, 그리고 일반적인 반올림 기법을 적용하여 해석되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the") 및 임의의 단어의 임의의 단수적 사용은, 명백히 및 모호하지 않게 하나의 지시 대상에 한정되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "포함한다" 및 이의 문법적 변이형은 비제한적인 것으로 의도되어, 목록에서 항목을 언급할 때, 치환될 수 있거나 나열된 항목에 첨가될 수 있는 다른 유사한 항목을 배제하는 것은 아니다.
실시예
다음의 실시예는 특정한 개시된 구현예를 설명하고자 제공된 것으로, 어떠한 방식으로든 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1 - 재료 및 방법
B16F10 종양 모델: 연구 등록 이전 적어도 3일 동안 6 내지 8주령의 17.0 내지 20.9 g 체중의 암컷 C57BL/6J 마우스(Jackson Laboratory; 미국 메인 주 바 하버 소재)를 순응시켰다. 마우스는 먹이(Harlan 2916 설치류 사료, 미국 매사추세츠 주 소재) 및 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있었고, 상대습도 55% ± 15%의 22℃ ± 2℃에서 12시간 명/암 주기로 수용하였다. B16F10 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC)(미국 버지니아 주 머내서스 소재)(카탈로그 번호 CRL-6475)으로부터 입수하고, 37℃에서 5% CO2 중에서 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(HI FBS)(Life technologies, 카탈로그 번호 10082-147)이 첨가된 둘벨코 변형 이글 배지(DMEM)(Life technologies, 카탈로그 번호 11995) 중에 배양하였다. 0.25% 트립신-EDTA(Life technologies, 카탈로그 번호 25200-056)를 이용하여 세포를 수확하고, 둘벨코 인산염 완충 식염수(DPBS)(Life technologies, 카탈로그 번호 14190-144)에 재현탁시키고, 마우스당 0.5 x 10^6개 세포/200 μl를 암컷 C57BL/6J 마우스의 우측 옆구리에 피하(SC) 이식하였다. 이중 옆구리 종양 모델의 경우, 제0일에, 마우스당 0.5 x 10^6개 B16F10 세포/200 μl를 우측 옆구리에 피하(SC) 이식하고, 마우스당 0.25 x 10^6개 B16F10 세포/200 μl를 좌측 옆구리에 SC 이식하였다. 사이토카인 mRNA의 국소 투여가 원위 효과를 나타낼 수 있는지를 시험하기 위하여(도 19 참조), 연구 등록 이전 적어도 6일 동안 6 내지 8주령의 17 내지 24 g 체중의 암컷 C57BL/6JOlaHsd 마우스(Envigo, 독일 로스도르프)를 순응시켰다. 마우스는 먹이(ssniff M-Z, 오토클레이브 가능, 독일 조스트) 및 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있었고, 상대습도 55% ± 10%의 22℃ ± 2℃에서 12시간 명/암 주기로 수용하였다. B16F10 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC® CRL-6475™)으로부터 입수하고, 37℃에서 7.5% CO2 중에서 10% 소 태아 혈청(FBS)(Biochrom, 카탈로그 번호 S 0115)이 첨가된 DMEM, 고포도당, GlutaMAX™(Life technologies, 카탈로그 번호 31966047) 중에 배양하였다. StemPro® Accutase® 세포 해리 시약(Life technologies, 카탈로그 번호 A1110501)을 이용하여 세포를 수확하고, 둘벨코 인산염 완충 식염수(DPBS)(Life technologies, 카탈로그 번호 14190-169)에 재현탁시키고, 마우스당 0.3 x 10^6개 세포/100 μl를 암컷 C57BL/6J 마우스의 우측의 면도된 옆구리에 피하(SC) 이식하였다. 원위부 폐 종양 시딩의 경우, B16F10_luc-gfp 세포를 사용하였다. 이들 세포는 루시퍼라아제 및 GFP를 암호화하는 플라스미드로의 안정적인 형질감염에 의해 B16F10으로부터 유래되었다. B16F10_luc-gfp 세포를 B16F10과 동일한 조건으로 배양하였다; 0.5 μg/mL 퓨로마이신만 배양 배지에 첨가하였다. SC 이식 1일 후에 0.3 x 10^6개 세포/200 μl의 B16F10_luc-gfp 세포를 마우스당 정맥 내(IV)로 꼬리 정맥에 주사하였다. 종양 SC 접종 10 내지 14일 후에 종양 내 mRNA 주사를 개시하였다. 종양 성장은 2 내지 3일마다 캘리퍼 측정으로 평가하였고, 다음 공식을 이용하여 수직 직경들의 곱으로 표현하였다: a2*b/2(a<b). 폐에서 루시퍼라아제 양성 종양 세포의 생착을 Xenogen IVIS 스펙트럼 영상화 시스템(Caliper Life Sciences)을 이용하여 생체 내 생물발광 영상화에 의해 분석하였다. L-루시페린 수용액(250μl, 1.6 mg; BD Biosciences)을 복강 내로 주사하였다. 살아 있는 동물로부터 방출된 광자를 10분 후에 1분의 노출 시간으로 정량화하였다. 관심 영역(ROI)을 평균 복사조도(Caliper Life Sciences의 리빙 이미지 소프트웨어를 사용하여 마우스의 그레이스케일 사진 상에 중첩된 컬러스케일 이미지로 표현된 광자 s-1 cm-2sr-1)로 정량화하였다. 절대 정량화를 위하여, 생물발광 신호를 총 유량(광자 s1)로 블롯팅하였다. 도 20c 내지 도 20g 및 도 21e 내지 도 21i에 수행된 연구의 경우, 폐 전이의 시딩 없이 위에 기술된 C57BL/6JOlaHsd 마우스(Envigo, 독일 로스도르프)의 모델을 또한 사용하였다.
CT26 종양 모델: 도 2, 도 3, 도 7d 내지 도 7f, 도 8, 도 9, 도 12d 및 도 21에 수행된 연구의 경우, 연구 등록 전에 적어도 6일 동안 6 내지 8주령의 17 내지 24 g 체중의 암컷 Balb/c Rj 마우스(Janvier, 프랑스 Genest-St.-Isle)를 순응시켰다. 마우스는 먹이(ssniff M-Z, 오토클레이브 가능, 독일 조스트) 및 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있었고, 상대습도 55% ± 10%의 22℃ ± 2℃에서 12시간 명/암 주기로 수용하였다. CT26 세포를 (ATCC® CRL-2638™)로부터 입수하고, 37℃에서 5% CO2 중에서 10% 소 태아 혈청(FBS)(Biochrom, 카탈로그 번호 S 0115)이 첨가된 로스웰 파크 메모리얼 연구소 배지(RPMI) 1640 배지, GlutaMAX™(Life technologies, 카탈로그 번호 61870-044) 중에 배양하였다. StemPro® Accutase® 세포 해리 시약(Life technologies, 카탈로그 번호 A1110501)을 이용하여 세포를 수확하고, DPBS(Life technologies, 카탈로그 번호 14190-169)에 재현탁시키고, 마우스당 0.5 x 10^6개 세포/100 μl를 암컷 Balb/c Rj 마우스의 우측의 면도된 옆구리에 SC 이식하였다. 종양 접종 13 내지 19일 후에 종양 내 mRNA 주사를 개시하였다. 종양 성장은 2 내지 3일마다 캘리퍼 측정으로 평가하였고, 다음 공식을 이용하여 수직 직경들의 곱으로 표현하였다: a2*b/2(여기서, b가 두 가지 직경 중 더 긴 직경임(a<b)).
도 6 및 도 7a 내지 도 7c에서 수행된 연구의 경우, 연구 등록 이전 적어도 3일 동안 6 내지 8주령의 17.0 내지 20.9 g 체중의 암컷 BALB/c 마우스(Jackson Laboratory; 미국 메인 주 바 하버 소재)를 순응시켰다. 마우스는 먹이(Harlan 2916 설치류 사료, 미국 매사추세츠 주 소재) 및 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있었고, 온도(22℃ ± 2℃), 상대습도(55% ± 15%)에서 12시간 명/암 주기로 수용하였다. CT26 세포를 ATCC(미국 버지니아 주 머내서스 소재)(카탈로그 번호 CRL-2638)로부터 입수하고, 37℃에서 5% CO2 중에서 10% HI FBS(Life technologies, 카탈로그 번호 10082-147)이 첨가된 RPMI-1640 (Life technologies, 카탈로그 번호 11875-093) 중에 배양하였다. 0.25% 트립신-EDTA(Life technologies, 카탈로그 번호 25200-056)를 이용하여 세포를 수확하고, DPBS(Life technologies, 카탈로그 번호 14190-144)에 재현탁시키고, 마우스당 0.5 x 10^6개 세포/200 μl를 BALB/c 암컷 마우스의 우측 옆구리에 SC 이식하였다.
CT26 종양 모델에서 종양 성장 이외에도 gp70-반응성 CD8+ T 세포를 표시된 혈액 중에서 측정하였다. EDTA 코팅된 튜브를 이용하여 혈액 샘플을 채취하였다. 100 μL의 혈액을 FACS 튜브로 옮기고, T-Select H-2Ld MuLV gp70 사량체-SPSYVYHQF-APC(MBL (TS-M-521-2), 100 μL 혈액의 경우 4 μL), 항-CD8a FITC(life technologies(MCD801), 100 μL 혈액의 경우 1 μL)) 및 항-CD45 V500(BD (561487), 100 μL 혈액의 경우 1 μL))을 함유하는 항체 혼합물을 첨가하였다. 실온에서 20분 인큐베이션 후, 혈액 용해 완충액(BD (349202), 튜브당 300 μL)을 첨가하고, 추가 6분 동안 인큐베이션 하였다. 그 후, 샘플을 PBS-EDTA 완충액으로 2회 세척하였다. FACS Canto II 유세포 분석기에서 FACS 샘플을 분석하였다.
MC38 종양 모델: 연구 등록 이전 적어도 3일 동안 6 내지 8주령의 17.0 내지 20.9 g 체중의 암컷 C57BL/6J 마우스(Jackson Laboratory; 미국 메인 주 바 하버 소재)를 순응시켰다. 마우스는 먹이(Harlan 2916 설치류 사료, 미국 매사추세츠 주 소재) 및 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있었고, 상대습도 55% ± 15%의 22℃ ± 2℃에서 12시간 명/암 주기로 수용하였다. MC38 세포는 S. A. Rosenberg 박사(국립보건원, 미국 메릴랜드 주 베데스다)의 후한 선물이었다. 37℃의 5% CO2에서 10% HI FBS(Gibco, 카탈로그 번호 100082)가 첨가된 L-글루타민 함유 RPMI-1640(Gibco, 카탈로그 번호 11875)에 세포주를 배양하였다. 세포를 수확하고, DPBS(Gibco, 카탈로그 번호 14190)에 재현탁시키고, 마우스당 1 x 10^6개 세포/200 μl를 암컷 C57BL/6J 마우스의 우측 옆구리에 SC 이식하였다.
A375 종양 모델: 연구 등록 이전 적어도 3일 동안 6 내지 8주령의 17.0 내지 20.9 g 체중의 중증 복합 면역 결핍증(SCID) 마우스(Jackson Laboratory; 미국 메인 주 바 하버 소재)를 순응시켰다. 마우스는 먹이(Harlan 2916 설치류 사료, 미국 매사추세츠 주 소재) 및 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있었고, 상대습도 55% ± 15%의 22℃ ± 2℃에서 12시간 명/암 주기로 수용하였다. A375 세포를 ATCC(미국 버지니아 주 머내서스)(카탈로그 번호 CRL-1619)로부터 입수하였다. 37℃의 5% CO2에서 10% HI FBS(Life technologies, 카탈로그 번호 10082-147)가 첨가된 DMEM(Life technologies, 카탈로그 번호 11995)에 세포주를 배양하였다. 0.25% 트립신-EDTA(Life technologies, 카탈로그 번호 25200-056)를 이용하여 세포를 수확하고, DPBS(Life technologies, 카탈로그 번호 14190-144)에 재현탁시키고, 3.0x106/100 μl PBS를 100 ul BD 매트리겔 매트릭스(Matrigel Matrix)(BD, 카탈로그 번호 354234)와 혼합하고, 암컷 SCID 마우스의 우측 옆구리에 SC 이식하였다.
KM12(CRC) 이종이식 모델: 연구 등록 이전 적어도 3일 동안 10주령의 17.3 g 내지 21.9 g 체중의 암컷 NOD.CB17-Prkdcscid/SCID 마우스(Jackson Laboratory, 미국 메인 주 바 하버 소재)를 순응시켰다. 마우스는 먹이(Harlan 2916 설치류 사료, 미국 매사추세츠 주 소재) 및 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있었고, 상대습도 (55 ± 15%)의 (22 ± 2℃)에서 12시간 명/암 주기로 수용하였다. KM-12 세포는 미국 국립 암 연구소(NCI)(카탈로그 번호 507345)로부터 입수하였다. 세포를 10% HI FBS(Gibco, 카탈로그 번호 10082)가 첨가된 L-글루타민 함유 RPMI 배지 1640(Gibco, 카탈로그 번호 11875)에서 성장시키고, 5% CO2의 37℃에서 인큐베이션 하였다. 0.25% 트립신-EDTA(Gibco, 카탈로그 번호 25200)를 이용하여 세포를 수확하고, DPBS(Gibco, 카탈로그 번호 14190)에 재현탁시키고, 각각의 마우스에 대해, 50% 매트리겔(BD, 카탈로그 번호 356234) 함유 200 μl DPBS 중에 5.0 x 10^6개 세포를 암컷 SCID 마우스의 우측 옆구리에 SC 이식하였다.
RPMI8226(골수종) 이종이식 모델: 연구 등록 이전 적어도 3일 동안 12주령의 19.8 g 내지 26.6 g 체중의 암컷 NSG 마우스(Jackson Laboratory, 미국 메인 주 바 하버 소재)를 순응시켰다. 마우스는 먹이(Harlan 2916 설치류 사료, 미국 매사추세츠 주 소재) 및 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있었고, 상대습도 (55 ± 15%)의 (22 ± 2℃)에서 12시간 명/암 주기로 수용하였다. RPMI8226 세포를 ATCC(카탈로그 번호 CCL-155)로부터 입수하였다. 세포를 10% HI FBS(Gibco, 카탈로그 번호 10082)가 첨가된 L-글루타민 함유 RPMI 배지 1640(Gibco, 카탈로그 번호 11875)에서 성장시키고, 5% CO2의 37℃에서 인큐베이션 하였다. 0.25% 트립신-EDTA(Gibco, 카탈로그 번호 25200)를 이용하여 세포를 수확하고, DPBS(Gibco, 카탈로그 번호 14190)에 재현탁시키고, 각각의 마우스에 대해, 50% 매트리겔(BD, 카탈로그 번호 356234) 함유 200 μl DPBS 중에 5.0 x 10^6개 세포를 암컷 NSG 마우스의 우측 옆구리에 SC 이식하였다.
NCI-N87(위) 이종이식 모델: 연구 등록 이전 적어도 3일 동안 11주령의 18.3 내지 22.7 g 체중의 암컷 NOD.CB17-Prkdcscid/SCID(Jackson Laboratory, 미국 메인 주 바 하버 소재)를 순응시켰다. 마우스는 먹이(Harlan 2916 설치류 사료, 미국 매사추세츠 주 소재) 및 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있었고, 상대습도 (55 ± 15%)의 (22 ± 2℃)에서 12시간 명/암 주기로 수용하였다. NCI-N87 세포를 ATCC(카탈로그 번호 CRL-5822)로부터 입수하였다. 세포를 10% HI FBS(Gibco, 카탈로그 번호 10082)가 첨가된 L-글루타민 함유 RPMI 배지 1640(Gibco, 카탈로그 번호 11875)에서 성장시키고, 5% CO2의 37℃에서 인큐베이션 하였다. 0.25% 트립신-EDTA(Gibco, 카탈로그 번호 25200)를 이용하여 세포를 수확하고, DPBS(Gibco, 카탈로그 번호 14190)에 재현탁시키고, 각각의 마우스에 대해, 50% 매트리겔(BD, 카탈로그 번호 356234) 함유 200 μl DPBS 중에 3.0 x 10^6개 세포를 암컷 SCID 마우스의 우측 옆구리에 SC 이식하였다.
NCI-H1975(NSCLC) 이종이식 모델: 연구 등록 이전 적어도 3일 동안 10주령의 18.8 g 내지 26.0 g 체중의 암컷 NSG 마우스(Jackson Laboratory, 미국 메인 주 바 하버 소재)를 순응시켰다. 마우스는 먹이(Harlan 2916 설치류 사료, 미국 매사추세츠 주 소재) 및 멸균수에 자유롭게 접근할 수 있었고, 상대습도 (55 ± 15%)의 (22 ± 2℃)에서 12시간 명/암 주기로 수용하였다. NCI-H1975 세포를 ATCC(카탈로그 번호 CRL-5908)로부터 입수하고, 10% HI FBS(Gibco, 카탈로그 번호 10082)가 첨가된 L-글루타민 함유 RPMI 배지 1640(Gibco, 카탈로그 번호 11875)에 배양하고, 5% CO2의 37℃에서 인큐베이션 하였다. 0.25% 트립신-EDTA(Gibco, 카탈로그 번호 25200)를 이용하여 세포를 수확하고, DPBS(Gibco, 카탈로그 번호 14190)에 재현탁시키고, 각각의 마우스에 대해, 50% 매트리겔(BD, 카탈로그 번호 356234) 함유 200 μl DPBS 중에 5.0 x 10^6개 세포를 암컷 NSG 마우스의 우측 옆구리에 SC 이식하였다.
종양 재접종: 위에 기술된 바와 같이 암컷 C57BL/6J 마우스에 B16F10 세포를 이식하였다. 제11일, 제13일, 제15일, 및 제17일에 ModB 사이토카인 mRNA 혼합물(IL-15스시, IL-12sc, GM-CSF, IFNα)로의 4회 종양 내 주사(80μg mRNA/표적당 20 μg)로 마우스를 처리하였다. 사이토카인 mRNA 처리 후, 8마리의 마우스가 무종양이었다. 마지막 사이토카인 mRNA 처리 4주 후, 무종양 마우스에 마우스당 0.5 x 10^6개 B16F10 세포/200 μl를 SC 주사에 의해 재접종하고, 종양 성장을 모니터링하였다.
종양 모니터링: 최종 희생 시까지 주 2회 캘리퍼로 종양을 측정하였다. 종양이 대략 2000 mm3에 이르거나 동물 건강 문제(궤양화된 종양의 20% 영역)가 있을 때, 동물을 안락사시켰다. 종양 퇴화는 1) 연구 종료 시 종양 부피 < 20 mm3 또는 ii) TF/T0 < 1(TF는 최종 종양 부피이고, T0는 최초 종양 내 mRNA 주사일의 종양 부피임)로 정의되었다.
mRNA 개질 A(ModA): 관심 유전자를 암호화하는 합성 DNA 단편을 5'-UTR(일부 경우 서열번호 1에 해당함), F 및 I라 지칭되는 두 개의 요소로 구성된 3' UTR(일부 경우 서열번호 7에 해당함), 및 총 110개 뉴클레오티드의 폴리(A)-꼬리(A30-링커-A70 구조; 일부 경우 서열번호 78에 해당함)를 포함하는 공통 출발 벡터 내로 클로닝하였다. 클래스 IIS 제한 효소로 폴리(dA:dT)의 하류에서 플라스미드 DNA의 선형화를 수행하여 폴리(dA:dT) 이외의 추가 뉴클레오티드가 없는 주형을 생성하였다(Holtkamp et al., Blood 108(13):4009-172006 (2006) 참조). 이전에 기술된 바와 같이, 7.5 mM ATP, CTP, UTP, GTP 및 6 mM D1, 베타-S-항역전 캡 유사체(베타-S-ARCA, Cap0)(Kuhn AN et al, Gene Ther. 17(8):961-71 (2010) 참조)의 존재 하에 선형화된 플라스미드 DNA를 대상으로 T7 RNA 중합효소(Thermo Fisher)를 이용한 시험관 내 전사를 수행하였다(Grudzien-Nogalska E et al., Methods Mol Biol. 969:55-72 (2013) 참조). 자성 입자를 이용하여 RNA를 정제하고(Berensmeier S. Appl Microbiol Biotechnol. 73(3):495-504 (2006) 참조), RNA 농도 및 품질을 각각 분광분석법으로 평가하고, 모세관 겔 전기영동 시스템으로 분석하였다.
mRNA 개질 B(ModB): 관심 유전자를 암호화하는 합성 DNA 단편을 5'-UTR(일부 경우 담배 에치 바이러스 리더 서열 TEV, 서열번호 3에 해당함), F 및 I라 지칭되는 두 개의 요소로 구성된 3' UTR(일부 경우 서열번호 7에 해당함), 및 총 110개 뉴클레오티드의 폴리(A)-꼬리(A30-링커-A70 구조)를 포함하는 공통 출발 벡터 내로 클로닝하였다. 위에 기술된 바와 같이 플라스미드 DNA의 선형화 후, 곧 T7 RNA 중합효소(Thermo Fisher)로의 시험관 내 전사를 수행하였다. ModA에 대해 기술한 바와 같이 이를 수행하였으나, 캡 구조는 반응물에 첨가하지 않았고, UTP가 N1-메틸-슈도우리딘 삼인산 대신 사용되었다. 그 후, 자성 입자를 이용하여 RNA를 정제하고(Berensmeier 2006), 이후에 백시니아 바이러스 캡핑 효소(NEB)를 기초로 한 상업적으로 이용 가능한 시스템 및 mRNA Cap 2'-O-메틸전달효소(NEB)의 첨가를 이용하여 Cap1 구조를 효소적으로 도입하였다. 그 후, RNA를 대상으로 셀룰로스 기반 크로마토그래피에 의한 추가 정제 절차를 수행하여 이중 가닥 RNA 불순물을 제거하였다(Day PR et al, Phytopathology 67:1393 (1977); Morris TJ et al., Phytopathology 69:854-858 (1979); 및 Castillo A et al., Virol J. 8:38 (2011) 참조). RNA 농도 및 품질을 각각 분광분석법으로 평가하고, 모세관 겔 전기영동 시스템으로 분석하였다. 문헌[Karik et al. Nucleic Acids Res. 39(21):e142 (2011)]에 기술된 바와 같이 dsRNA 특이적 J2 mAb(English & Scientific Consulting)를 이용하여 dsRNA의 존재를 노스웨스턴 도트-블롯 분석으로 평가하였다.
mRNA 코돈 최적화: 단백질의 암호화 서열은 단백질 번역의 효율뿐만 아니라 정확성에도 영향을 미칠 수 있다(Bossi L et al., Nature. 286(5769):123-7 (1980) 및 Irwin et al., J Biol Chem. 270(39):22801-6 (1995) 참조).
따라서, 각 표적의 상이한 코돈 변이체를 설계하고 시험하였다. 각 표적에 대한 상이한 코돈 변이체 설계는 Life Technologies GmbH GeneArt®(독일 레겐스부르크)(Raab D et al., Syst Synth Biol. 4(3):215-25 (2010) 참조) 및 Eurofins MWG Operon(독일 에베르스베르크)의 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어를 이용하였다. 또한, 각각의 코돈을 개별적으로 수동으로 편집하여 코돈 최적화를 수행하였다. 최적화 과정 중 야생형 서열과 비슷한 GC 함량을 유지하였다.
(i) HEK293T/17 세포의 mRNA 리포펙션 및 (ii) K562 세포의 mRNA 전기천공을 이용하여 수행된 시험관 내 발현에 의해 구성체의 평가 및 선택을 결정하였다.
40,000개의 HEK293T/17 세포(ATCC® CRL-11268™)를 0.5% FBS(Biochrom, 카탈로그 번호 S 0115)를 함유하는 DMEM, 고포도당, GlutaMAX™(Life technologies, 카탈로그 번호 31966047) 중의 평판 96-웰 플레이트(VWR International, 카탈로그 번호 734-1794)에 시딩하였다. 96웰 플레이트에 시딩된 세포를 16 내지 18시간 동안 37℃, 7.5% CO2에서 인큐베이션 하였다. RNAse 불포함 1.5 ml 세이프-락 튜브 바이오 푸르(Safe-Lock tube biopur)(독일 에펜도르프, 카탈로그 번호 0030121589) 내의 20 μl의 OptiMEM(Thermo Fisher, 카탈로그 번호 31985070)에 1.2 μl의 형질감염 시약을 첨가하여 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민 메신저 맥스 시약(Lipofectamine Messenger MAX Reagent, Invitrogen, 카탈로그 번호 LMRNA)을 이용하여 RNA로 부착성 HEK293T/17 세포를 형질감염시키고; 제2의 튜브에서, 지시된 RNA를 20 μl의 OptiMEM에 첨가하였다. 10분의 인큐베이션 후, RNA를 함유하는 튜브를 리포펙타민 메신저 맥스를 함유하는 튜브 내로 희석하고, 추가 5분 동안 인큐베이션 한 후, 10 μl의 RNA-지질-복합체를 100 μl 배지 중의 HEK293T/17 세포층을 함유하는 96-웰 플레이트의 한 웰에 적가하였다. 10 μl RNA-지질-복합체는 각각 5 ng, 25 ng 및 100 ng의 표적 RNA를 함유하였다. 플레이트를 3시간 동안 인큐베이터에 위치시킨 후, 추가 140 μl의 신선한 배지(DMEM + 0.5% FBS)를 첨가하였다. 형질감염된 세포를 15 내지 18시간 동안 인큐베이션 하고, 상청액을 수집하고, 본 명세서에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 단백질 함량을 분석하였다.
만성 골수성 백혈병으로부터 유래된 인간 세포주 K562(ATCC® CCL-243™)를 5% FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지, GlutaMAX™(Life technologies, 카탈로그 번호 61870-044)에서 배양하였다. 다음과 같이 96-웰 플레이트 시스템에서 K562를 전기천공하였다. 세포를 X-VIVO15 배지(Lonza, 카탈로그 번호 BE02-060Q) 중에서 1회 세척하고, X-VIVO15 중에 250,000개 세포/150 μl의 최종 농도로 현탁시켰다. 5 ng, 25 ng, 또는 100 ng의 RNA를 함유하는 96-웰 플레이트의 웰당 150 μl의 세포 현탁액을 첨가하였다. 세포와 RNA를 혼합하고, Biorad의 96웰 Gene Pulser MX 세포 전기천공 시스템(250 V, 1 x 30 ms 펄스)에서 전기천공을 수행하였다. 전기천공 직후, 세포를 항생제 불포함 신선한 배지가 들어 있는 새로운 배양 플레이트로 옮기고, 37℃의 인큐베이터에서 1시간 동안 쉬게 하였다. 배지를 0.5% FCS가 첨가된 새로운 RPMI 1640 GlutaMAX로 교체하고, 15 내지 18시간 동안 인큐베이션 하였다. 상청액을 수확하고, 본 명세서에 기술된 바와 같이 ELISA로 단백질 함량을 분석하였다.
제조사의 프로토콜에 따라 RNA 암호화 사이토카인에 특이적인 ELISA에 의해 단백질 농도를 결정하였다. (i) 인간 IL-15 스시/IL-15 스시 R 알파 복합 듀오셋(DuoSet) ELISA (ii) 마우스 IL-12sc 듀오셋 발색 시스템(Duo Set Development System)(DY419-05) (iii) 마우스 GM-CSF 듀오셋 ELISA 발색 시스템(DY415)(모두 RnD systems로부터 입수), 및 마우스 IFNα ELISA 키트(TCM)(PBL assay science, 42120-2).
각각의 mRNA 표적의 경우, WT-서열 및 상이한 코돈 최적화 변이형에 대해 단백질 발현을 평가하였다. 각각 3종의 상이한 양의 개질된 RNA로 시험한 HEK293T/17의 리포펙션 및 K562의 전기천공의 데이터 세트를 단백질 암호화 서열의 선택에 고려하였다. 코돈 최적화 서열은 WT 서열과 비교하여 단백질 발현의 적어도 1.5배 증가가 측정된 경우 선택하였다. 그렇지 않은 경우, WT 서열을 선택하였다. 모든 구성체의 경우, WT 아미노산은 보존하면서, DNA 인식 서열(5'-CTCTTC-3')을 돌연변이시켜 EarI 제한 서열을 제거하였다.
세포주: HEK293(ATCC CRL-1573) 세포주 및 인간 흑색종 세포주 A101D(ATCC CRL-7798), A375(ATCC CRL-1619), A2058(ATCC CRL-11147), 및 Hs294T(ATCC HTB-140)를 ATCC로부터 입수하고, 37℃에서 5% CO2의 가습 분위기에서 10% FBS(HI FBS)(Life Technologies, Cat. 10082)가 첨가된 DMEM(ThermoFisher Scientific, Cat 11885-084) 중에서 배양하였다.
mRNA 형질감염: 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민 메신저맥스 시약(Invitrogen, Cat # LMRNA001)을 이용하여 세포를 형질감염시켰다. 간략하게는, 각 웰의 경우, 0.3 μl의 형질감염 시약을 5 μl의 Opti-MEM 배지(Life Technologies, Cat. 31985062)로 희석하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션 하였다; mRNA 혼합물을 Opti-MEM 배지로 희석하고(웰당 5 μl), 희석된 메신저맥스 시약과 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션 하고, 96-웰 플레이트에 분주하였다. 세포를 완전 성장 배지 중에 희석하고, 웰당 40,000개 세포를 형질감염 혼합물에 첨가하였다. 세포를 CO2 인큐베이터 중 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 한 다음, 배지를 수집하고, 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery; MSD) 분석으로 사이토카인 농도를 결정하였다.
메소 스케일 디스커버리 분석: 사이토카인 농도를 MSD 분석을 이용하여 결정하였다: IL12p70는 전염증 패널 1(인간) MSD 키트(카탈로그 N05049A-1), GM-CSF 및 IL-15 스시는 사이토카인 패널 1(인간) MSD 키트(카탈로그 N05050A-1), 및 IFNα는 인간 IFN-α 2a 울트라 센서티브 키트(카탈로그 N05050A-1). MSD 디스커버리 워크벤치(Discovery Workbench) V. 4.0.12 소프트웨어 및 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) V.6.00 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다.
PBMC 단리 및 처리: 류코팩(leukopak)(Research Blood Components)으로부터 밀도 경사 배지(Ficoll-Paque)에 의해 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 단리하였다. 96-웰 플레이트의 웰당 600,000개 PBMC를 첨가하였다. 24시간 동안 세포를 사이토카인 혼합물로 처리하고, 인간 IFNγ 384-조직 배양 MSD 분석을 이용하여 세포 배양 배지에서 IFNγ 생산을 측정하였다.
CD8 반응 측정: B16F10 종양 보유 마우스에 면역 mRNA((IFNα, IL-15 스시, GM-CSF, 및 IL-12sc, ModB) 또는 대조군 루시퍼라아제 mRNA(위약군)의 단일 종양 내 주사를 놓았다. 종양 내 mRNA 주사 7일 뒤에 종양을 절제하고, 면역형광을 위해 처리하고, CD8에 대한 항체로 염색시켰다(회색). 도 25에 도시된 바와 같이, 사이토카인 mRNA 종양 내 주사 후 CD8 세포가 존재하였다.
생체 내 연구를 위한 mRNA 제조: 물 중 동량(마이크로그램)의 mRNA를 의도했던 용량의 2배로 혼합하여 생체 내 연구를 위한 각각의 mRNA 혼합물을 제조하였다. 종양 내 주사일까지 mRNA 혼합물을 -80℃에서 냉동하였다. 주사일에 mRNA를 해동하고, 동일한 부피의 2배 멸균 링거액과 혼합하였다. 생성된 1X RNA/링거액을 종양 내 주사에 사용하였다.
유전자 발현 분석: Precellys 24 균질기(Bertin Instruments)를 이용하여 RLT 완충액(Qiagen) 중에 A375 종양을 균질화하였다. 총 RNA를 RNeasy-96 키트(Qiagen)로 단리하고, 이어서 DN아제 처리로 스핀 프로토콜을 수행하였다. 뉴클레아제 불포함 물로 RNA를 용출시키고, NanoDrop 8000(Thermo Scientific)을 이용하여 자외선 흡광도로 정량화하였다. 제조사의 권고에 따라 고용량 RNA to cDNA 키트(Applied Biosystems)를 이용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 표준 프로토콜에 따라 ViiATM7(Applied Biosystems)에서 실시간 PCR을 수행하였다. TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스(Applied Biosystems) 및 사전 설계된 Taqman 분석(Applied Biosystems)을 이용하여 증폭을 수행하였다. 내인성 대조군 GAPDH에 대해 유전자 발현을 정규화하였다. 유전자 발현을 평가하기 위하여 비교 ddCT 방법을 사용하였다.
실시예 2 - 3종의 mRNA의 조합물은 생체 내에서 종양 부피를 감소시킨다
GM-CSF, IL-2, 및 IL-12sc를 암호화하는 개질된 mRNA들의 혼합물을 B16F10 종양 보유 마우스 내로 주사하고, 종양 성장을 제41일까지 모니터링하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, ModA를 갖는 GM-CSF, IL-2, 및 IL-12sc를 암호화하는 3종의 mRNA의 조합물(서열번호 32, 38, 및 56; 도 1a), 또는 ModB를 갖는 GM-CSF, IL-2, 및 IL-12sc를 암호화하는 3종의 mRNA의 조합물(서열번호 35, 41, 및 59; 도 1b)의 종양 내 주사는 10마리의 마우스 중 6마리에서 퇴화를 유도한 반면, 루시퍼라아제를 암호화하는 대조군 mRNA(ModA)로 처리한 마우스는 10마리 중 1마리에서 종양 퇴화를 나타냈다(도 1c). 이러한 데이터는 비슷한 설계의 반복 연구에서 확인되었다(도 1d 내지 1g). 반복 실험에서, ModA 또는 ModB를 갖는 사이토카인 mRNA(GM-CSF, IL-2, IL-12sc)의 혼합물은 9마리 마우스 중 5마리에서 종양 퇴화를 초래한 반면, ModA 및 ModB의 대조군 mRNA로의 처리는 각각 9마리 중 2마리 및 9마리 중 0마리의 종양 퇴화를 나타내었다.
사이토카인 mRNA 처리의 효과를 CT26 종양에서 평가하였다. 확립된 CT26 종양을 갖는 마우스에 각각 ModA 및 ModB 형식의 GM-CSF, IL-2, 및 IL-12sc를 암호화하는 사이토카인 mRNA 혼합물을 주사하였다. 2종의 대조군을 포함시켰다: i) mRNA 링거 희석액 및 ii) 반딧불이 루시퍼라아제를 암호화하는 ModA mRNA. 제19일, 제21일, 제24일, 제26일, 제28일 및 제31일에 총 6회의 종양 내 주사를 투여하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, GM-CSF, IL-2, 및 IL-12sc mRNA ModA(서열번호 56, 32, 및 38; 도 2a) 및 ModB(서열번호 59, 35, 및 41; 도 2b)는 둘 다 각각 8마리의 마우스 중 5마리와 6마리에서 종양 퇴화를 초래한 반면, ModA의 대조군 mRNA(도 2c) 또는 링거액(도 2d)으로 처리된 종양은 종양 퇴화를 전혀 보이지 않았다.
IL-15 스시, GM-CSF 및 IL-12sc를 암호화하는 사이토카인 mRNA 혼합물(ModB; 서열번호 53, 59, 및 41) 및 IL-2, GM-CSF 및 IL-12sc를 암호화하는 사이토카인 mRNA 혼합물(ModB; 서열번호 35, 59, 및 41)을 대상으로 CT26 종양 모델에서 항종양 활성을 평가하였다. 종양 접종 후 제13일, 제15일, 제18일, 제20일 및 제22일에 종양에 종양 내 mRNA 주사를 놓았다. 도 3에 도시된 바와 같이, IL-2 혼합물(도 3a) 또는 IL-15 스시 혼합물(도 3b)의 종양 내 주사는 각각 10마리 또는 11마리의 종양 보유 동물 중 5마리에서 종양 퇴화를 초래한 반면(도 3a 및 도 3b), 루시퍼라아제 mRNA(ModB)를 주사한 대조군에서는 어떠한 종양 퇴화도 관찰되지 않았다(도 3c).
IL-2, IL-12sc, 및 GM-CSF(도 4a-ModA [서열번호 32, 38, 및 56], 도 4b-ModB [서열번호 35, 41, 및 59]), 또는 IL-15 스시, IL-12sc, 및 GM-CSF 또는 (도 4c-ModA [서열번호 50, 38, 및 56], 도 4d-ModB [서열번호 53, 41, 및 59])의 mRNA 혼합물의 항종양 활성을 B16F10 종양 모델에서 추가로 평가하였다. 제11일, 제13일, 제15일, 및 제17일에 B16F10 종양을 가진 마우스에 mRNA를 종양 내로 주사하였다. IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF를 암호화한 사이토카인 mRNA 혼합물로 B16F10 종양을 처리하자 각각 ModA 및 ModB에서 8마리의 마우스 중 3마리와 4마리에서 종양 퇴화가 일어났다. IL-2, IL-12sc, 및 GM-CSF(ModA 또는 ModB)의 mRNA 혼합물로 처리된 종양은 8마리 마우스 중 4마리에서 종양 퇴화가 있었으나, 루시퍼라아제를 암호화하는 ModA 또는 ModB mRNA로 처리된 마우스의 경우 종양 퇴화가 전혀 나타나지 않았다(도 4e-ModA, 도 4f-ModB).
실시예 3 - 4종의 mRNA의 조합물은 생체 내에서 종양 부피를 감소시킨다
사이토카인 mRNA 혼합물에 대한 제4의 mRNA의 첨가 효과를 시험하였다. B16F10 종양 보유 마우스에 i) GM-CSF, IL-2, IL-12sc(서열번호 59, 35, 및 41; 도 5a), ii) GM-CSF, IL-15 스시, IL-12sc(서열번호 59, 53, 및 41; 도 5b) 및 iii) GM-CSF, IL-15 스시, IL-12sc, IFNα(서열번호 59, 53, 41, 및 47; 도 5c)를 암호화하는 ModB 사이토카인 mRNA 혼합물의 4회 종양 내 주사를 놓고, 종양 성장을 제45일까지 모니터링하였다. 각각의 사이토카인 mRNA 혼합물은 항종양 효과를 나타내어, GM-CSF, IL-2, 및 IL-12sc 또는 GM-CSF, IL-15 스시, 및 IL-12sc의 사이토카인 mRNA 혼합물의 종양 내 주사 후에는 8마리 중 4마리에서 종양이 퇴화하였고, GM-CSF, IL-15 스시, IL-12sc, 및 IFNα로의 처리 시 8마리 중 7마리에서 종양이 퇴화되었다. 대조군 mRNA(ModB)로 처리한 마우스는 종양 퇴화를 전혀 나타내지 않았다(도 5d).
3종의 상이한 뮤린 생체 내 종양 모델 CT26, B16F10 및 MC38에서 GM-CSF, IL-2, IL-12sc, 및 IFNα의 항종양 활성을 조사하였다. 종양 보유 마우스에 IL-2, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα를 암호화하는 ModB 사이토카인 mRNA(서열번호 35, 41, 59, 및 47) 또는 반딧불이 루시퍼라아제를 암호화하는 대조군 ModB mRNA의 4 내지 6회 종양 내 주사를 놓았다. 각 종양 모델에서 항종양 활성을 평가하였다. 이러한 사이토카인 mRNA 조합물로 처리한 마우스는 각각 CT26(도 6a), B16F10(도 6c) 및 MC38(도 6e) 모델에서 4/8, 7/8 및 5/5의 퇴화하는 종양을 나타내었다. 루시퍼라아제 mRNA로 처리된 비교 종양 보유 마우스에서는 종양 퇴화가 전혀 관찰되지 않았다(도 6b [CT26], 도 6d [B16F10], 및 도 6f [MC38]).
IL-2, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα(ModB, 서열번호 35, 41, 59, 및 47) 또는 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα(ModB, 서열번호 53, 41, 59, 및 47) 각각을 암호화하는 4-구성요소 사이토카인 mRNA 혼합물의 항종양 활성을 CT26 종양 모델에서 평가하였다. 종양 보유 마우스를 6회의 종양 내 주사로 처리하고, 종양 성장을 모니터링하였다. IL-2, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα(도 7a) 및 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα(도 7b)로의 처리는 둘 다 효과적으로 각각 4/8 및 8/8 마우스에서 종양 퇴화를 유도한 반면, 대조군 mRNA로 처리된 마우스의 경우, 종양 퇴화가 전혀 관찰되지 않았다(도 7c). 이러한 데이터는 비슷한 설계의 반복 연구에서 확인되었다(도 7d 내지 도 7f).
IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα(ModB, 서열번호 53, 41, 59, 및 47)의 mRNA 혼합물로부터 개별적인 구성요소를 체계적으로 제거한 CT26 종양 모델에서의 연구를 수행하였다. 접종 후 제12일, 제15일, 제19일, 및 제22일에 CT26 종양에 사이토카인 mRNA를 주사하였다. IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα를 암호화하는 mRNA의 4회 주사로 처리된 종양은 전체 10개의 처리된 종양에서 퇴화를 유도하였다(도 8a). i) IL-15 스시, IL-12sc 및 IFNα, ii) IL-15 스시, GM-CSF 및 IFNα, iii) IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα, iv) IL-15 스시, IL-12sc, 및 GM-CSF의 ModB mRNA 혼합물로 처리된 종양은 각각 10개 종양 중 8개, 6개, 8개, 7개 종양의 퇴화를 초래하였다(도 8b 내지 도 8e). 대조군 mRNA(ModB)로 처리한 종양은 종양 퇴화를 전혀 나타내지 않았다(도 8f). 종양 성장 동역학을 분석하기 위하여, 제33일까지 각 처리군에 대하여 평균 종양 부피를 계산하였다(도 8g). 가장 작은 평균 종양 부피는 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα의 혼합물로 처리된 마우스에서 관찰된 반면, 가장 큰 평균 종양 부피는 루시퍼라아제 처리된 동물에서 관찰되었다. 처리군 각각에 대해 제19일까지 종양 성장 억제 T/C(평균 종양 부피를 기준으로 한 종양/대조군)를 도표화하였다(도 8h). IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα의 4-구성요소 혼합물은 최대의 T/C를 나타내었다.
도 8에 나타낸 연구와 비슷하게, IL-2, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα(ModB; 서열번호 35, 41, 59, 및 47)의 mRNA 혼합물로부터 개별적인 구성요소를 체계적으로 제거한 연구를 수행하였다. CT26 종양에 제19일, 제21일, 제23일, 제26일, 제28일 및 제30일에 6회의 종양 내 mRNA 주사를 놓았다. IL-2, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα의 사이토카인 mRNA 혼합물로의 처리는 10마리 동물 중 4마리에서 종양 퇴화를 초래하였고, 4마리의 동물에서는 완전한 종양 퇴화를 유도하였고, 두 마리 개체에서는 제40일 이후에 안정적인 질병을 유도하였다(도 9a). i) IL-2, IL-12sc, 및 IFNα, ii) IL-2, GM-CSF 및 IFNα, iii) IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα, 및 iv) IL-12sc, GM-CSF 및 IL-2의 ModB 3-구성요소 mRNA 혼합물로 처리된 종양은 각각 2개, 3개, 3개 및 4개 종양의 퇴화를 초래하였고(도 9b 내지 도 9e), 대조군 루시퍼라아제 mRNA로 처리된 CT26 종양은 종양 퇴화를 전혀 나타내지 않았다(도 9f).
종양 성장 동역학을 분석하기 위하여, 제36일까지 각 처리군에 대하여 평균 종양 부피를 계산하였다. 가장 작은 평균 종양 부피는 IL-2, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα의 혼합물로 처리된 마우스에서 관찰된 반면, 가장 큰 평균 종양 부피는 루시퍼라아제 처리된 동물에서 관찰되었다(도 10a). 처리군 각각에 대해 제30일까지 종양 성장 억제 T/C(평균 종양 부피를 기준으로 한 종양/대조군)를 도표화하였다(도 10b). IL-2, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα의 4-구성요소 혼합물은 최대의 T/C를 나타내었다.
도 9의 상이한 사이토카인 mRNA 혼합물로부터의 항종양 반응을 다음과 같이 더 분석하였다: 실험 말 또는 종결 시의 측정(Vt) 및 실험 시작 시의 측정(Vb) 사이의 종양 부피의 차이(ΔV= Vt- Vb)로 정의되는 종양 부피 변화(ΔV)를, 4 구성요소 사이토카인 mRNA 혼합물(IL-2, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα)로 처리된 마우스, 4종 사이토카인 중 하나를 생략한 3 구성요소 혼합물로 처리된 마우스 및 대조군 루시퍼라아제 mRNA로 처리된 마우스를 포함한 여섯 개의 처리군 각각의 모든 마우스에 대해 계산하였다. 종양 부피 변화에 대한 절사된 데이터(본래 데이터의 상위 및 하위 10%를 제거함)의 평균(μ) 및 표준편차(σ)를 대조군 루시퍼라아제군에 대해 계산하였고, 이 절사된 데이터의 Shapiro-Wilk 정규성 검정은 그것이 대략적으로 정규 분포를 따름을 보여주었다. 그런 다음, 모든 처리군의 각각의 개별 마우스에서 종양 부피 변화 데이터에 대하여 Z 점수(Z= (ΔV - μ)/ σ)를 계산하였다. 각 종양 부피 변화값 및 대조군의 절사 평균 사이의 비율(R)을 계산하였다(R= ΔV/μ). 정의를 고려하여, Z 점수를 "종양 부피 감소의 유의성"으로, R을 "종양 부피 감소 정도"로 간주한다. 대조군 루시퍼라아제군에서보다 유의미하게 더 작은 종양 부피 증가(즉, 대조군과 비교하여 "유의미한 종양 감소")를 보여주는 마우스를 확인하기 위하여, Z <= -1.645 (p(Z<=-1.645)=0.05) 및 R <=0.15의 컷오프를 적용하였다. 결과는 대조군보다 유의미하게 더 작은 종양 부피 증가를 나타내는 각 처리군의 마우스 수가 다음과 같음을 보여주었다: i) IL-2, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα (ModB)의 사이토카인 mRNA 혼합물의 경우, 8마리 마우스 중 6마리. ii) IL-2, GM-CSF 및 IFNα (ModB)의 경우, 8마리 마우스 중 2마리, iii) IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα, 그리고 IL-2, IL-12sc, 및 IFNα의 경우 8마리 중 3마리, 및 iv) IL-2, IL-12sc, 및 GM-CSF (ModB)의 사이토카인 mRNA 혼합물로 처리된 8마리 마우스 중 4마리(도 11).
위에 기술된 바와 같이 암컷 C57BL/6J 마우스에 B16F10 세포를 이식하였다. 제11일, 제15일, 제19일, 및 제23일에 ModB 사이토카인 mRNA 혼합물(IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF, IFNα) 또는 대조군 루시퍼라아제 mRNA로의 4회 종양 내 주사(8 μg mRNA/표적당 2 μg)로 마우스를 처리하였다. 사이토카인 mRNA의 4-구성요소 혼합물로의 처리는 10마리의 처리된 마우스 중 6마리에서 종양 거부를 초래하였다. 도 24b 참조. 대조적으로, 단일 mRNA로 처리한 어떠한 군에서도 무종양 마우스가 관찰되지 않았다(도 24c 내지 도 24f). IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF, IFNα의 조합물은 증가된 전체 생존을 초래하였고, 마우스의 60%는 제70일에 무종양인 반면, 단일 사이토카인 mRNA로 처리된 마우스의 모든 종양은 동물을 안락사시킬 필요가 있는 단계까지 진행되었다(도 24g). 루시퍼라아제 대조군을 도 24a에 나타내었다.
실시예 4 - 사이토카인 mRNA는 종양 재접종으로부터 보호한다
면역 기억의 발달에 미치는 사이토카인 mRNA 혼합물의 영향을 평가하기 위하여, 재접종 실험을 수행하였다. 간략하게는, B16F10 종양 보유 마우스를 IL-15스시, IL-12sc, GM-CSF, 및 IFNα(Mod B; 서열번호 53, 41, 59, 및 47)의 사이토카인 mRNA 혼합물로 처리하였다. 사이토카인 mRNA 처리 B16F10 종양 일부는 완전히 퇴화되어 무종양 동물을 초래하였다. 그런 다음, 적응 면역 기억을 평가하는 방법으로 이들 무종양 동물에 B16F10 세포를 재접종하고, 9마리의 naive 마우스에 종양 생착에 대한 양성 대조군으로서 B16F10 종양 세포를 이식하였다(도 12a). B16F10 세포가 생착된 아홉 마리의 naive 마우스는 모두 종양을 발달시킨 반면, 여덟 마리의 무종양 마우스는 모두 B16F10 세포를 거부하였고, B16F10 종양 성장을 나타내지 않았다(도 12b). 이전에 사이토카인 mRNA로 처리된 마우스 일부는 본래의 종양 위치에 국소화된 백반을 발달시킨다(도 12c). 이 실험을 근본적으로 반복하였고, 결과를 도 33에 나타내었다.
면역 기억의 발달에 미치는 사이토카인 mRNA 혼합물의 영향을 평가하기 위하여, CT26 종양 모델을 이용한 재접종 실험을 수행하였다. 따라서, CT26 종양 보유 마우스를 IL-15스시, IL-12sc, GM-CSF, 및 IFNα(Mod B; 서열번호 53, 41, 59, 및 47)의 사이토카인 mRNA 혼합물로 처리하였다. 사이토카인 mRNA 처리 CT26 종양 일부는 완전히 퇴화되어 무종양 동물을 초래하였다. 그 후, 세 마리의 무종양 동물에 CT26 종양 세포를 재접종하였고, 세 마리의 무종양 동물에 gp70 에피토프(CT26-Δgp70)가 넉아웃된 CT26 종양 세포를 재접종하였다. 종양 생착에 대한 양성 대조군으로서 각각 9마리와 10마리의 naive 마우스에 CT26 종양 세포 및 CT26-Δgp70을 이식하였다. 종양 접종 후 제21일에 CT26 종양을 생착시킨 9마리의 naive 마우스 중 8마리가 종양을 발달시켰고, CT26-Δgp70 종양이 생착된 10마리의 naive 마우스가 모두 종양을 발달시킨 반면, 각 군의 모든 세 마리의 무종양 마우스는 CT26 및 CT26-Δgp70 세포를 거부하였고, 각각 CT26 종양 및 CT26-Δgp70의 성장을 나타내지 않았다(도 12d). 이 실험은 CT26 종양 모델에서 사이토카인 mRNA 주사 시 면역 기억이 면역우성 에피토프 gp70에 특이적인 T 세포로 제한되지 않음을 보여준다.
실시예 5 - 사이토카인 mRNA의 전신성 항종양 활성
국소적인 종양 내 사이토카인 mRNA가 전신성 항종양 반응을 나타내는 능력을 평가하기 위하여, 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 B16F10 종양 세포를 생착시켰다(도 13a). 좌우 B16F10 종양을 보유한 마우스에 루시퍼라아제를 암호화하는 대조군 mRNA 또는 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα(ModB; 서열번호 53, 41, 59, 및 47)를 암호화하는 사이토카인 mRNA 혼합물로 4회 종양 내 주사를 놓았다. 우측 종양에는 3가지 상이한 용량 수준(표적당 20 μg, 2 μg 및 0.2 μg mRNA에 해당하는 80 μg, 8 μg, 및 0.8 μg mRNA)의 mRNA를 주사한 반면, 좌측 옆구리의 종양은 미처리되었다. 용량 의존적 항종양 활성은 주사(도 13b) 및 미주사(도 13c) 종양 둘 다에서 관찰되었고, 종양 성장 억제는 미주사 종양에서 88%로부터 주사된 종양에서 95%까지의 범위였다. 사이토카인 mRNA 처리로 처리된 군은 루시퍼라아제 대조군 mRNA로 처리된 군과 비교하여 증가된 중간 생존기간을 나타내었다(도 13d).
국소적인 종양 내 사이토카인 mRNA가 전신성 항종양 반응을 나타내는 능력을 더 평가하기 위하여, 마우스의 우측 옆구리에 B16F10 종양 세포를 생착시키고, 폐에서의 종양 유도를 위하여 루시퍼라아제를 발현하는 B16F10 세포의 IV 주사를 받게 하였다(도 19a). SC 종양 이식 후 제11일, 제14일, 및 제18일에, B16F10 종양을 보유한 마우스에 옆구리 종양 내로만 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα(ModB; 서열번호 53, 41, 59, 및 47)의 사이토카인 mRNA 혼합물로 총 3회 종양 내 주사를 놓았고, 폐의 종양은 미처리하였다. 대조군에는 임의의 암호화 서열이 없는 동량의 대조군 mRNA의 종양 내 주사를 놓았다. 제20일에 종점 분석을 위하여 마우스를 희생시키고, 이 시점에 폐를 채취하여 중량을 측정하였다. 도 19b는 검은색 종양 결절을 시각화하기 위하여 네 마리 동물의 예시적인 생물발광 측정 및 이에 따라 채취된 폐 사진을 보여준다. SC 종양의 종양 성장은 사이토카인 mRNA 혼합물 주사에 의해 강력하게 억제된 반면, 대조군 mRNA가 주사된 종양은 도 19c에 도시된 바와 같이 점진적으로 성장하여, 각 군의 15마리 마우스의 평균 종양 부피를 보여주었다. 대조군 mRNA 처리 동물과 비교하여 SC 종양에 종양 내 사이토카인 mRNA 주사를 받은 동물에서 폐 종양 성장이 억제되었다; 도 19d는 제20일에 군당 모든 15마리 동물의 생물발광 측정의 총 유량 분석을 보여주는데, 이는 루시퍼라아제 발현 종양 세포로 인한 종양 부담에 대한 상관관계를 나타낸다; 선은 중간값을 나타내고, 별표는 T 검정으로 분석한 p < 0.05를 나타낸다. 추가로, 사이토카인 mRNA로 처리한 동물들의 폐는 유의미하게 적은 중량을 나타내었다(도 19e, 선은 중간값을 나타냄). 대조군 mRNA로 처리한 동물의 더 큰 중량의 폐는 더 높은 종양 부담으로 인한 것이었다.
실시예 6 - 인간 사이토카인 mRNA
인간 사이토카인 mRNA의 시험관 내 발현을 평가하기 위하여, 인간 사이토카인 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF, 및 IFNα2b(서열번호 26, 18, 29, 및 23)(ModB)를 암호화하는 mRNA 혼합물을 4종의 흑색종 옹양 세포주(A375, A101D, A2058 및 Hs294T)와 함께 HEK293 세포주 내로 형질감염시켰다(도 14a). 사이토카인 mRNA 혼합물은 5종의 인간 세포주의 패널 전반에 걸쳐 용량 의존적인 발현 및 분비를 나타내었다(도 14b 내지 도 14f).
IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα2b의 인간 mRNA 혼합물의 약물동력학적 효과를 시험관 내에서 인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)로 평가하였다. 요컨대, IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα2b(ModB)의 인간 사이토카인 mRNA 혼합물 또는, IL-12sc, IFNα2b, IL-15 스시 또는 GM-CSF (ModB)를 암호화하는 개별 사이토카인 mRNA들을 HEK293 세포에서 형질감염시키고, 조정 배지를 24시간에 수집하고, 희석하고, 인간 PBMC에 첨가하였다(도 15a). IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα2b의 사이토카인 mRNA 혼합물로 처리된 6명의 공여자로부터의 중간 IFNγ 수준은 5623 pg/mL인 반면, IL-12sc, IFNα2b, IL-15 스시 또는 GM-CSF에 대한 개별 사이토카인 mRNA로의 처리는 각각 534, 67, 17, 및 4 pg/mL의 중간 IFNγ 수준을 유도하였다(도 15b).
IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα2b (ModB), 그리고 IL-2, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα2b (ModB)의 인간 사이토카인 mRNA 혼합물의 생체 내 발현을 A375 인간 흑색종 이종이식에서 모니터링하였다. 종양 보유 마우스에 사이토카인 mRNA의 단일 주사를 놓았고, mRNA 주사 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 48시간 및 72시간 후에 종양 샘플을 수집하였다. 종양 용해물을 제조하고, 개별적인 인간 사이토카인 IFNα2b(도 16a), IL-2(도 16b), IL-12sc(도 16c), IL-15 스시(도 16d), GM-CSF(도 16e)의 발현을 평가하였다.
개별적인 사이토카인 각각에 대해 시간 의존적인 발현이 관찰되었고, 최대 농도(Cmax)는 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα2b(표 4), 그리고 IL-2, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα2b(표 5)의 혼합물의 경우 2 내지 8시간 사이에서 발생하였다.
IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα2b (ModB), 그리고 IL-2, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα2b (ModB)의 사이토카인 mRNA 혼합물의 mRNA 주사 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 48시간 및 72시간 후에 약물동력학 마커로서 인간 인터페론 알파 유전자 ISG15, ISG54 및 MX1의 유도를 A375 종양에서 모니터링하였다. 대조군 처리된 종양과 비교하여, 사이토카인 mRNA로 처리된 A375 종양은 ISG15(도 17a), ISG54(도 17b) 및 MX1(도 17c)의 100배를 초과하는 유도를 나타내었으며, 피크 유도는 종양 내 mRNA 주사 8시간 후에 발생하였다.
실시예 7 - 인터페론 효과
B16F10 종양 보유 마우스에 IL-2, Flt3 리간드(FLT3L), 41BBL(CD137L 또는 종양 괴사 인자 수퍼패밀리 구성원 9로도 알려져 있음), 및 CD27L-CD40L(이는 CD70으로도 알려져 있는 CD27L의 가용성 도메인의 융합 단백질 및 CD40L을 포함한다; CD27L 및 CD40L은 모두 GS-링커 서열에 의해 분리된 CD27L 또는 CD40L의 세 개의 가용성 도메인으로 구성된다)을 암호화하는 ModA ("표준") 사이토카인 mRNA(도 18a, 서열번호 32, 62, 68, 및 74) 또는, IL-2, FLT3L, 41BBL, 및 CD27L-CD40L을 암호화하는 ModB ("개질") 사이토카인 mRNA(도 18b, 서열번호 35, 65, 71, 및 77)의 종양 내 주사를 놓았다. 또한, IFNα를 암호화하는 ModA mRNA(서열번호 44) 또는 IFNα를 암호화하는 ModB mRNA(서열번호 47)를 각각 ModA 또는 ModB mRNA 혼합물에 첨가하였다(도 18d 및 도 18e). 항종양 활성을 평가하였다.
ModA mRNA의 이러한 조합물로 처리한 마우스는 IFNα가 없는 경우에는 9마리 마우스 중 4마리가 무종양이었고(도 18b), IFNα가 있을 경우에는 9마리 마우스 중 3마리가 무종양이었다(도 18d). 따라서, IFNα mRNA로의 처리는 mRNA가 ModA 형태로 투여될 때 사이토카인에 대한 반응을 증가시키는 것으로 보이지 않았다.
대조적으로, ModB mRNA의 조합물로 처리한 마우스는 IFNα가 없는 경우에는 9마리 마우스 중 1마리가 무종양이었고(도 18c), IFNα가 있을 경우에는 9마리 마우스 중 7마리가 무종양이었다(도 18e). 따라서, IFNα mRNA로의 처리는 mRNA가 ModB 형태로 투여될 때 사이토카인 혼합물에 대한 반응을 증가시켰다.
실시예 8 - 항체와 조합한 사이토카인 mRNA
항체의 전신 투여와 조합한 사이토카인 mRNA의 종양 내 주사의 효과를 평가하기 위하여, 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 B16F10 또는 MC38 종양 세포를 생착시켰다. 마우스는 제11일, 제15일, 제19일, 제23일에 옆구리 종양 중 한쪽에만 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα(ModB; 서열번호 53, 41, 59, 및 47)의 사이토카인 mRNA 혼합물로 4회 종양 내 주사를 받은 한편, 다른 옆구리 종양은 미처리한 채로 두었다. 마우스에 제10일, 제13일, 제16일, 제19일, 제22일, 제25일에 항-PD1 항체(5 mg/kg의 랫트 IgG2a 항-마우스 PD-1 클론 RMP1-14의 사노피(Sanofi) 뮤린화 버전)의 복강 내 주사도 놓았다. 그룹은 다음과 같았다: 1) 대조군 mRNA(80 μg 총 mRNA; 1.6 mg/mL의 50 μL 종양 내 주사 플러스 대조 이소형 항체(클론 MOPC-21(BioLegend); 5 mg/kg): 2) 대조군 mRNA 플러스 항-PD1 항체; 3) 사이토카인 mRNA 플러스 대조 이소형 항체; 및 4) 사이토카인 mRNA 플러스 항-PD1. 전체 생존을 B16F10(도 20a) 및 MC38(도 20b) 종양 모델에서 모니터링하였다. 두 종양 모델에서 가장 높은 전체 생존은 사이토카인 mRNA 및 항-PD-1 처리의 조합에서 관찰되었는데, B16F10 보유 마우스의 60% 및 MC38 보유 마우스의 80%가 연구 종료 시 무종양이었다. B16F10 종양 모델에서는, 항-PD-1 또는 사이토카인 mRNA 단독으로 처리된 마우스의 10%가 무종양이었으나, MC38 모델에서는 항-PD-1로 처리된 마우스의 40% 및 사이토카인 단독으로 처리된 마우스의 30%가 무종양이었다. 이 결과는 사이토카인 mRNA 및 PD-1 조합과 관련된 강력한 항종양 활성을 나타낸다.
PD-1 항체와 조합한 국소적인 종양 내 사이토카인 mRNA가 전신성 항종양 반응을 나타내는 능력을 더 평가하기 위하여, 마우스의 우측 옆구리에 B16F10 종양 세포를 생착시키고, 1일 후에 폐 전이 유도를 위하여 루시퍼라아제를 발현하는 B16F10 세포의 IV 주사를 받게 하였다. IV 종양 이식 후 제11일, 제14일, 및 제17일에, B16F10 종양을 보유한 마우스에 옆구리 종양 내로만 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα(ModB; 서열번호 53, 41, 59, 및 47)의 사이토카인 mRNA 혼합물로 총 3회 종양 내 주사를 놓았고, 폐의 종양은 미처리하였다. 같은 날, 마우스에 PD-1 항체(10 mg/kg의 랫트 IgG2a 항-마우스 PD-1 클론 RMP1-14의 사노피 뮤린화 버전)의 복강 내(IP) 주사도 놓았다. 그룹은 다음과 같았다: 1) 대조군 mRNA(40 μg 총 mRNA; 대조 이소형 항체(클론 MOPC-21(BioLegend); 10 mg/kg)의 50 μL 종양 내 주사(도 20c); 2) 대조군 mRNA 플러스 항-PD1 항체(도 20d); 3) 사이토카인 mRNA 플러스 대조 이소형 항체(도 20e); 및 4) 사이토카인 mRNA 플러스 항-PD1(도 20f). SC 종양의 종양 성장(도 20c 내지 도 20f)뿐만 아니라 생존(도 20g)도 모니터링하였다. 이 모델에서 전체 생존을 SC 종양으로 인한 종양 부담 및 폐 거짓전이 종양(이 도면에는 미도시)에 의해 결정하였다; 일부 마우스에서 SC 종양은 거부된 반면, 폐 전이는 점차 커졌다. 가장 높은 전체 생존은 사이토카인 mRNA 및 항-PD-1 처리의 조합에서 관찰되었다. 사이토카인 mRNA 단독으로 처리된 마우스 중 6 내지 7%가 무종양인 반면, 항-PD-1 단독 또는 대조군 mRNA + 이소형 항체를 받았던 마우스는 높은 종양 부담으로 제22일에 모두 희생되었다. 이 결과는 이 폐 거짓전이가 있는 B16F10 종양 모델에서 사이토카인 mRNA 및 PD-1 조합과 관련된 강력한 항종양 활성을 나타내는 반면, 항-PD-1 항체 단독은 어떠한 항종양 활성도 보여주지 않았다.
항체의 전신 투여와 조합한 사이토카인 mRNA의 종양 내 주사의 효과를 더 평가하기 위하여, 마우스의 우측 옆구리에 CT26 종양 세포를 생착시켰다. 마우스에 종양 접종 후 제11일, 제14일, 제18일 및 제21일에 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα(ModB; 서열번호 53, 41, 59, 및 47)의 사이토카인 mRNA 혼합물로 4회 종양 내 주사를 놓았다. 같은 날, 마우스에 항-CTLA-4 항체(마우스당 100 μg/200 μL; InVivoMAb의 클론 9H10) 또는 이소형 대조 항체(마우스당 100 μg/200 μL; BioXCell의 아르메니아 햄스터 IgG)의 복강 내(IP) 주사도 놓았다. 그룹은 다음과 같았다: 1) 사이토카인 mRNA 플러스 항-CTLA-4 항체(도 21a); 2) 사이토카인 mRNA 플러스 이소형 대조 항체(도 21b); 3) 대조군 mRNA 플러스 항-CTLA-4 항체(도 21c) 및 4) 대조군 mRNA 플러스 이소형 대조 항체(도 21d). 종양 내 사이토카인 mRNA 및 IP 주사된 항-CTLA-4의 병용 요법은, 종양 접종 후 제55일에 16마리의 마우스 중 12마리가 무종양으로, 가장 강력한 항종양 활성을 초래하였다(도 21a). 사이토카인 mRNA 플러스 이소형 대조 항체(도 21b) 또는 대조군 mRNA 플러스 항-CTLA-4 항체(도 21c)로의 처리는, 각각 연구 종료 시 5마리와 7마리의 무종양 마우스를 나타내, 더 적은 항종양 활성을 유도하였다. 대조적으로, 대조군 mRNA 플러스 이소형 대조 항체(도 21d)를 받은 그룹에서는, 오로지 한 마리의 무종양 마우스만 연구 종결 시에 남아 있었다.
항-CTLA-4 항체와 조합한 사이토카인 mRNA의 종양 내 주사의 효과를 더 평가하기 위하여, 마우스의 우측 옆구리에 B16F10 종양 세포를 생착시켰다. 마우스에 종양 접종 후 제13일, 제17일, 및 제20일에 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα(ModB; 서열번호 53, 41, 59, 및 47)의 사이토카인 mRNA 혼합물로 3회 종양 내 주사를 놓았다. 종양 접종 후 제13일, 제17일, 제20일 및 제24일에, 마우스에 항-CTLA-4 항체(마우스당 100 μg/200 μL; InVivoMAb의 클론 9H10) 또는 이소형 대조 항체(마우스당 100 μg/200 μL; BioXCell의 아르메니아 햄스터 IgG)의 복강 내(IP) 주사도 놓았다. SC 종양의 종양 성장 및 생존을 모니터링하였다. 그룹은 다음과 같았다: 1) 사이토카인 mRNA 플러스 항-CTLA-4 항체(도 21e); 2) 사이토카인 mRNA 플러스 이소형 대조 항체(도 21f); 3) 대조군 mRNA 플러스 항-CTLA-4 항체(도 21g) 및 4) 대조군 mRNA 플러스 이소형 대조 항체(도 21h). 종양 내 사이토카인 mRNA 및 IP 주사된 항-CTLA-4의 병용 요법은, 종양 접종 후 제60일에 9마리의 마우스 중 6마리가 무종양으로, 가장 강력한 항종양 활성을 초래하였다(도 21e). 사이토카인 mRNA 플러스 이소형 대조 항체로의 처리(도 21f)는 9마리 마우스 중 2마리의 무종양 마우스를 나타내어 더 적은 항종양 활성을 유도하였다. 대조적으로, 대조군 mRNA 플러스 항-CTLA-4 항체(도 21g) 또는 대조군 mRNA 플러스 이소형 대조 항체(도 21h)를 받은 두 그룹에서는, 연구 종결 시 무종양 마우스가 전혀 남아 있지 않았다. 생존율(%)을 도 21i에 도시하였는데, 이는 사이토카인 mRNA 및 항-CTLA-4 처리의 조합에서 연구 종료 시(제70일) 종양 보유 마우스의 67%의 가장 높은 전체 생존율을 보여준 반면, 사이토카인 mRNA 단독으로 처리된 마우스의 33%는 무종양이었다. 이 결과는 이 B16F10 종양 모델에서 사이토카인 mRNA 단독 및 사이토카인 mRNA와 항-CTLA-4 항체와 관련된 강한 항종양 활성을 나타내며, 이때, 항-CTLA-4 항체 단독은 어떠한 항종양 활성도 보여주지 않았다.
실시예 9 - 여러 암 유형에서의 mRNA 사이토카인 주사
다양한 유형의 암에서 사이토카인 mRNA 종양 내 주사의 효과를 평가하기 위하여, 5종의 이종이식 마우스 모델 - KM12(CRC), RPMI8226(골수종), NCI-N87(위), A375(흑색종), 및 NCI-H1975(NSCLC) - 을 실시예 1에 기술된 바와 같이 시험하였다. KM12(CRC), RPMI8226(골수종), NCI-N87(위), A375(흑색종), 및 NCI-H1975(NSCLC) 종양 보유 마우스에 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα(ModB; 서열번호 26, 18, 29, 및 23)의 인간 사이토카인 mRNA 혼합물 8 μg(2 μg/표적)의 단일 종양 내 주사를 놓고, 암호화된 사이토카인을 제24시간에 종양에서 평가하였다. IL-15 스시(도 22d), IL-12sc(도 22a), GM-CSF(도 22c) 및 IFNα(도 22b)의 4종 사이토카인 각각의 발현을 5종의 이종이식 모델 모두에서 검출하였는데, 가장 높은 사이토카인 수준은 NCI-H1975에서 관찰되었고, 이어서 A375, NCI-N87, RPMI8226, 및 KM12이었다.
실시예 10 - 종양 내 mRNA 사이토카인 주사 후 사이토카인의 용량 의존적인 혈청 발현
우측 옆구리에 단일 A375 종양을 생착시킨 마우스의 혈청에서 암호화된 사이토카인의 발현에 미치는 상이한 종양 내 mRNA 용량의 영향을 조사하였다. 마우스에 인간 IL-15 스시, IL-12sc, GM-CSF 및 IFNα(ModB; 서열번호 26, 18, 29, 및 23)의 사이토카인 mRNA 혼합물의 단일 종양 내 주사를 놓았다. 종양 내 mRNA 주사 6시간 후에 혈청을 수집하고, 메소 스케일 디스커버리 분석으로 사이토카인 발현을 분석하였다. mRNA 암호화된 사이토카인 각각의 용량 의존적인 발현은 80 μg(20 μg)의 최고 용량에서부터 0.0256 μg(0.0064 μg)의 최저 용량까지 혈청에서 관찰되었다. 결과를 도 23a 내지 도 23d에 나타내었다.
실시예 11 - 사이토카인 mRNA는 gp70+ CD8 T 세포의 증식을 초래한다
한쪽 옆구리에 단일 CT26 종양을 보유한 마우스에 IL-15 스시, GM-CSF, IFNα, 및 IL-12sc(ModB; 서열번호 53, 41, 59, 및 47)의 사이토카인 mRNA 혼합물의 4회 종양 내 주사를 놓았다. 최초 종양 내 mRNA 투여 13일 후 혈액을 수집하고 gp70 종양 항원에 특이적인 T 세포를 유세포 분석법으로 정량화하였다. 혈액 중 gp70 종양 항원에 특이적인 T 세포의 빈도는 대조군 RNA를 놓은 마우스와 비교하여 mRNA 사이토카인 종양 내 주사 시에 마우스에서 맹렬히 증가되었다.
실시예 12 - 사이토카인 mRNA는 여러 전염증 경로를 유도하고 처리 및 미처리 마우스에서 면역 침윤물을 증가시킨다.
좌측 및 우측 옆구리에 B16F10 종양을 보유한 마우스를 대상으로 80 μg의 mRNA(20 μg/표적)의 단일 종양 내 주사를 우측 종양에 놓았고(우측 종양은 0.5 x 10^6개 세포로 시작되었음(처리)), 0.25 x 10^6개 세포로 시작된 종양은 미처리 상태로 유지되었다. mRNA 종양 내 주사 7일 후, 양쪽 종양을 수집하고, RNA를 단리하여, RNA 시퀀싱 분석을 하였다. 도 27a 내지 도 27c에 도시된 바와 같이, IL-15 스시, GM-CSF, IFNα, 및 IL-12sc(서열번호 59, 53, 41, 및 47)의 사이토카인 mRNA 혼합물로의 처리는 다양한 IFN감마 반응 유전자를 포함한, 여러 전염증 경로를 상향 조절하였다. 전염증/IFN감마 관련 경로의 상향 조절은 처리 및 미처리 종양 둘 다에서 발생하여, 국소적인 종양 내 처리가 전신성 면역 조절 효과를 나타낸다는 통념을 뒷받침하였다.
유전자 발현에서 관찰된 변화를 설명할 수 있는 신호전달 경로의 변화를 확인하기 위하여, 주사된 옆구리의 사이토카인 mRNA 처리군 및 대조군 사이에서 다르게 발현된 3298개 유전자(1699개는 상향 조절되고 1599개는 하향 조절됨) 및 미주사 옆구리의 4973개 유전자(2546개는 상향 조절되고 2427개는 하향 조절됨)에 대해 원인이 되는 네트워크 분석(독창성 경로 분석 도구의 일부)을 수행하였다. 경로의 변화를 나타내고자 Z 점수를 계산하였는데, 점수의 부호는 변화의 방향을 나타낸다(양의 부호는 활성화를 시사하는 반면, 음의 부호는 억제를 시사함).
주사된 종양 및 미주사 종양의 대조군 및 사이토카인 mRNA 처리된 샘플에서 IFNG에 의해 조절된 328개의 유전자(295개 상향 조절 및 33개 하향 조절)의 발현에 대한 계층적 군집화를 수행하였다. 샘플 전체에 걸쳐 각 유전자의 발현을 z 점수 정규화하였다.　유사성 메트릭은 Pearson의 상관 계수를 기반으로 하고, 완전 연관을 이용하여 계통도를 생성한다. 표 6 참조.
침윤된 면역세포의 상대적 풍부도는 면역세포 유형 특이적 유전자 서명의 평균 발현을 계산함으로써 결정된다.
실시예 13 - 사이토카인 mRNA는 처리 및 미처리 종양에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 증가시킨다
좌측 및 우측 옆구리에 B16F10 종양을 보유한 마우스를 대상으로 80 μg의 mRNA(20 μg/표적)의 단일 종양 내 주사를, 종양 중 하나에만, 0.5 x 10^6개 세포로 시작된 우측 종양에 놓았고(처리), 0.25 x 10^6개 세포로 시작된 나머지 종양은 미처리 상태로 유지되었다. 종양 내 mRNA 주사 7일 후에, 양쪽 종양을 수집하고, CD4+, CD8+, 및 FoxP3+ 세포에 대한 항체로 IHC(면역형광 현미경) 염색을 위하여 처리하였다. 도 28a 및 도 28b의 종양의 마우스는 사이토카인 mRNA로 처리한 반면, 도 28c 및 도 28d의 종양의 마우스는 대조군 mRNA로 처리하였다. 패널 a 및 c는 mRNA 주사한 종양의 것이고, 패널 b 및 d는 미주사한 상응하는 반대쪽 종양의 것이다. (도 28a 내지 도 28d). 사이토카인 mRNA 처리군 및 대조군 mRNA 처리군에 대하여, RNA를 주사한 5개의 종양 및 미주사한 상응하는 5개의 반대쪽 종양을 대상으로 CD4+, CD8+, FOXP3+ 세포에 대하여 면역형광 염색을 수행하였다. 세포의 상대적 빈도 및 비율을 도 28e, 도 28f, 도 28g에 도표화하였다. 이 결과는 IL-15 스시, GM-CSF, IFNα, 및 IL-12sc(서열번호 59, 53, 41, 및 47)의 사이토카인 mRNA 혼합물이 CD8+ 및 CD4+ T 세포 침윤을 증가시켜, CD8+/Treg 비율을 변경시킴을 보여준다. 면역 침윤의 증가는 처리 및 미처리 종양 둘 다에서 발생하여, 국소적인 종양 내 처리가 전신성 면역 조절 효과를 나타낸다는 통념을 뒷받침하였다.
실시예 14 - mRNA는 종양 및 침윤성 면역세포에서 발현된다
단일 B16F10 종양 보유 마우스에 Thy1.1 단백질을 암호화하는 mRNA로의 단일 종양 내 주사를 놓았다(도 29a 내지 도 29g). 종양 내 주사 대략 18시간 후, 종양을 분리하고, 항체 패널로 염색하고, 유세포 분석법을 수행하여 Thy1.1 단백질을 발현하는 세포를 정의하였다. 이 결과는 종양 및 면역세포 둘 다 mRNA를 흡수하고 발현함을 나타낸다.
실시예 15 - 종양 내 사이토카인 mRNA 주사 후 용량 의존적 종양 발현 및 PD 반응
B16F10 종양 보유 마우스에 80, 8 또는 0.8 μg의, IL-15 스시, GM-CSF, IFNα, 및 IL-12sc(서열번호 59, 53, 41, 및 47)의 사이토카인 mRNA 혼합물로의 단일 mRNA 주사를 놓았다. 종양 내 주사 대략 6시간 후에, 종양을 제거하고, 용해시키고, IL-15 스시, GM-CSF, IFNα, 및 IL-12sc, IFN감마 및 IP-10의 수준을 종양 용해물에서 정량화하였다. 도 30a 내지 도 30f는 사이토카인 mRNA가 용량 의존적인 방식으로 종양 내에서 발현되었음을 보여준다.
별도의 실험에서, B16F10 종양 보유 마우스에 80, 8 또는 0.8 μg의, IL-15 스시, GM-CSF, IFNα, 및 IL-12sc(서열번호 59, 53, 41, 및 47)의 사이토카인 mRNA 혼합물로의 단일 mRNA 주사를 놓았다. 종양 내 사이토카인 mRNA 주사 7일 후에, 종양을 분리하고, 항체 패널로 염색하고, 유세포 분석법으로 분석하였다. 사용된 항체는 뮤린에 대한 것이었다: CD45, CD4, CD3, CD8, CD279, IFN감마, TNF알파, FOXP3, 그랜자임 B. 이 결과는 사이토카인 mRNA 혼합물로의 처리가 CD8+/Treg 비율을 바꾸었고(도 31a 및 도 31b), 종양 미세환경에서 다기능성 CD8+ T 세포의 빈도를 증가시켰으며(도 31c 및 도 31d), 침윤성 골수 세포에 대해 PD-L1을 증가시켰고(도 31e), 침윤성 CD8+ T 세포에 대해 PD-1 수준을 증가시켰음(도 31f)을 나타낸다.
추가 실험에서, 좌측 및 우측 옆구리에 B16F10 종양을 보유한 마우스에 IL-15 스시, GM-CSF, IFNα, 및 IL-12sc(서열번호 서열번호 59, 53, 41, 및 47)의 사이토카인 mRNA 혼합물 또는 대조군 mRNA의 단일 종양 내 주사를 종양 중 한쪽에만 놓았고(처리), 나머지 종양은 미처리 상태로 유지하였다. 종양 내 mRNA 주사 7일 후, 주사된 종양을 수집하고, CD45+, CD8+, CD3+, 및 그랜자임 B에 대한 항체로 유세포 분석 염색을 위하여 처리하였다. 결과는 사이토카인 mRNA 혼합물이 종양에서 종양 내 그랜자임 B CD8+ T 세포의 빈도를 증가시켰음을 나타내었다(도 31g 및 도 31h).
실시예 16 - 종양 내 주사된 mRNA는 종양에서 일차적으로 발현된다
B16F10 종양 보유 마우스에 반딧불이 루시퍼라아제를 암호화하는 mRNA 50 μg의 단일 종양 내 주사를 놓았다. 6시간 및 24시간의 시점에서 세 마리의 마우스를 희생시키고, 종양, 간, 비장, 종양 배출 림프절(TDLN) 및 비종양 배출 림프절(NDLN)을 대상으로 루시퍼라아제 발현을 생체 외에서 분석하였다. 도 32a 및 도 32b는 루시퍼라아제 발현이 종양에서 가장 높았으며, 이때, 발현은 임의의 다른 조직보다 100배 더 컸음을 보여준다.
실시예 17 - CD4+, CD8+, 및 NK 세포는 B16F10 모델에서 사이토카인 mRNA의 항종양 활성에 기여한다
B16F10 종양 보유 마우스 그룹에 총 4주 동안 주 1회 복강 내 주사에 의해 고갈 항체(항-CD4, 항-CD8, 항-NK1.1) 100 μg을 처리하였다. 항체 매개 세포 고갈은 IL-15 스시, GM-CSF, IFNα, 및 IL-12sc(서열번호 59, 53, 41, 및 47)의 사이토카인 mRNA 혼합물 80 μg으로의 처리 하루 전에 시작되었다. 전체 생존에 미치는 항체 고갈의 영향을 모니터링하였다. 도 34에 도시된 결과는 개별적인 고갈 CD8+, CD4+, 또는 NK 세포가 사이토카인 mRNA의 항종양 활성 및 전체 생존을 다양한 정도로 감소시켰음을 나타낸다.
실시예 18 - 사이토카인 mRNA의 항종양 활성은 IFN 감마 결핍 마우스에서 관찰되지 않는다
WT C57BL6J 마우스 및 뮤린 IFNγ가 결핍된 C57BL6J 마우스(IFNγ KO)에 실시예 1에서 기술된 바와 같이 B16F10 종양 세포를 이식하였다. 마우스를 IL-15 스시, GM-CSF, IFNα, 및 IL-12sc(서열번호 59, 53, 41, 및 47)의 80 μg(20 μg/표적) 사이토카인 mRNA 혼합물 또는 80 μg 대조군 mRNA로 종양 내 주사하여 처리하고, 전체 생존을 모니터링하였다. 도 35에 도시된 결과는 IFNγ가 결여된 마우스는 사이토카인 mRNA로 처리 시 검출 가능한 항종양 반응을 보이지 않았음을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Sanofi BioNTech RNA Pharmaceuticals GMBH <120> Therapeutic RNA <130> 01183-0001-00PCT <150> US 62/464,981 <151> 2017-02-28 <150> US 62/597,527 <151> 2017-12-12 <150> EP 17306089.8 <151> 2017-08-23 <160> 88 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ModA 5' UTR <400> 1 gggcgaacta gtattcttct ggtccccaca gactcagaga gaacccgcca cc 52 <210> 2 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> ModA 5' UTR <400> 2 gggcgaacua guauucuucu gguccccaca gacucagaga gaacccgcca cc 52 <210> 3 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> ModB 5' UTR <400> 3 ggaataaact agtctcaaca caacatatac aaaacaaacg aatctcaagc aatcaagcat 60 tctacttcta ttgcagcaat ttaaatcatt tcttttaaag caaaagcaat tttctgaaaa 120 ttttcaccat ttacgaacga tagcc 145 <210> 4 <211> 145 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> ModB 5' UTR <400> 4 ggaauaaacu agucucaaca caacauauac aaaacaaacg aaucucaagc aaucaagcau 60 ucuacuucua uugcagcaau uuaaaucauu 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caauaucaac guaauaguuc uggaacuaaa gggaucugaa 360 acaacauuca ugugugaaua ugcugaugag acagcaacca uuguagaauu ucugaacaga 420 uggauuaccu uuugucaaag caucaucuca acacugacuu gauga 465 <210> 13 <211> 465 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human optimized IL-2 <400> 13 auguacagaa ugcagcugcu gucuugcauu gcucuuucuc uugcucuugu gacaaauucu 60 gcuccaacau cuucuucaac aaagaaaaca cagcuucagc uugaacaccu ucuucuugau 120 cuucagauga uucugaaugg aaucaacaau uacaaaaauc caaaacugac aagaaugcug 180 acauuuaaau uuuacaugcc aaagaaagca acagaacuga aacaccuuca gugccuugaa 240 gaagaacuga aaccucugga agaagugcug aaucuggcuc agagcaaaaa uuuucaccug 300 agaccaagag aucugaucag caacaucaau gugauugugc uggaacugaa aggaucugaa 360 acaacauuca ugugugaaua ugcugaugaa acagcaacaa uuguggaauu ucugaacaga 420 uggaucacau uuugccaguc aaucauuuca acacugacau gauga 465 <210> 14 <211> 539 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Human IL-12sc <400> 14 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala 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auuuggucca cugauauuuu aaaggaccag 360 aaagaaccca aaaauaagac cuuucuaaga ugcgaggcca agaauuauuc uggacguuuc 420 accugcuggu ggcugacgac aaucaguacu gauuugacau ucagugucaa aagcagcaga 480 gggucuucug acccccaagg ggugacgugc ggagcugcua cacucucugc agagagaguc 540 agaggggaca acaaggagua ugaguacuca guggagugcc aggaggacag ugccugccca 600 gcugcugagg agagucugcc cauugagguc augguggaug ccguucacaa gcucaaguau 660 gaaaacuaca ccagcagcuu cuucaucagg gacaucauca aaccugaccc acccaagaac 720 uugcagcuga agccauuaaa gaauucucgg cagguggagg ucagcuggga guacccugac 780 accuggagua cuccacauuc cuacuucucc cugacauucu gcguucaggu ccagggcaag 840 agcaagagag aaaagaaaga uagagucuuc acggacaaga ccucagccac ggucaucugc 900 cgcaaaaaug ccagcauuag cgugcgggcc caggaccgcu acuauagcuc aucuuggagc 960 gaaugggcau cugugcccug caguggcucu agcggagggg gaggcucucc uggcggggga 1020 ucuagcagaa accuccccgu ggccacucca gacccaggaa uguucccaug ccuucaccac 1080 ucccaaaacc ugcugagggc cgucagcaac augcuccaga aggccagaca aacucuagaa 1140 uuuuacccuu gcacuucuga ggaaauugau caugaagaua ucacaaaaga uaaaaccagc 1200 acaguggagg ccuguuuacc auuggaauua accaagaaug agaguugccu aaauuccaga 1260 gagaccucuu ucauaacuaa ugggaguugc cuggccucca gaaagaccuc uuuuaugaug 1320 gcccugugcc uuaguaguau uuaugaagac uugaagaugu accaggugga guucaagacc 1380 augaaugcaa agcuucugau ggauccuaag aggcagaucu uucuagauca aaacaugcug 1440 gcaguuauug augagcugau gcaggcccug aauuucaaca gugagacugu gccacaaaaa 1500 uccucccuug aagaaccgga uuuuuauaaa acuaaaauca agcucugcau acuucuucau 1560 gcuuucagaa uucgggcagu gacuauugau agagugauga gcuaucugaa ugcuuccuga 1620 uga 1623 <210> 18 <211> 1623 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human optimized IL-12sc <400> 18 augugucacc agcagcuggu gaucucaugg uucucccugg uauuucuggc aucuccucuu 60 gucgcaaucu gggaacugaa gaaagacgug uaugucguug agcucgacug guauccggau 120 gcgccuggcg agaugguggu gcugaccugu gacaccccag aggaggaugg gaucacuugg 180 acccuugauc aauccuccga agugcucggg ucuggcaaga cucugaccau acaagugaaa 240 gaguuuggcg augccgggca guacacuugc cauaagggcg gagaaguucu gucccacuca 300 cugcugcugc ugcacaagaa agaggacgga auuuggagua ccgauauccu gaaagaucag 360 aaagagccca agaacaaaac cuucuugcgg ugcgaagcca agaacuacuc agggagauuu 420 acuuguuggu ggcugacgac gaucagcacc gaucugacuu ucuccgugaa aucaaguagg 480 ggaucaucug acccucaagg agucacaugu ggagcggcua cucugagcgc ugaacgcgua 540 agaggggaca auaaggagua cgaguauagc guugagugcc aagaggauag cgcaugcccc 600 gccgccgaag aaucauugcc cauugaagug augguggaug cuguacacaa gcugaaguau 660 gagaacuaca caagcuccuu cuucauccgu gacaucauca aaccagaucc uccuaagaac 720 cuccagcuua aaccucugaa gaacucuaga cagguggaag ugucuuggga guaucccgac 780 accuggucua caccacauuc cuacuucagu cucacauucu gcguucaggu acagggcaag 840 uccaaaaggg agaagaagga ucgggucuuu acagauaaaa caagugccac cguuauaugc 900 cggaagaaug ccucuauuuc ugugcgugcg caggacagau acuauagcag cucuuggagu 960 gaaugggcca gugucccaug uucaggguca uccgguggug gcggcagccc cggaggcggu 1020 agcuccagaa aucucccugu ggcuacaccu gauccaggca uguuucccug uuugcaccau 1080 agccaaaacc uccugagagc agucagcaac augcuccaga aagcuagaca aacacuggaa 1140 uucuacccau gcaccuccga ggaaauagau cacgaggaua ucacuaagga caaaacaagc 1200 acugucgaag caugccuucc cuuggaacug acaaagaacg agaguugccu uaauucaaga 1260 gaaacaucuu ucauuacaaa cgguagcugc uuggcaagca gaaaaacauc uuuuaugaug 1320 gcccuuuguc ugagcaguau uuaugaggau cucaaaaugu accaggugga guuuaagacc 1380 augaaugcca agcugcugau ggacccaaag agacagauuu uccucgauca gaauaugcug 1440 gcugugauug augaacugau gcaggccuug aauuucaaca gcgaaaccgu uccccagaaa 1500 agcagucuug aagaaccuga cuuuuauaag accaagauca aacuguguau ucuccugcau 1560 gccuuuagaa ucagagcagu cacuauagau agagugaugu ccuaccugaa ugcuuccuga 1620 uga 1623 <210> 19 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys 1 5 10 15 Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 20 25 30 Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser 35 40 45 Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu 50 55 60 Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His 65 70 75 80 Glu Met Ile Gln Gln 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cgccatggcc cctagaacat tgctcctgct 180 gctggccgct gccctggccc ctacacagac aagagctgga cctggatccc accccgagcc 240 ccacaccgcc gaactgcagc tgaacctgac cgtgcccaga aaggacccca ccctgagatg 300 gggagctggc cctgctctgg gcagatcctt tacacacggc cccgagctgg aagaaggcca 360 cctgagaatc caccaggacg gcctgtacag actgcacatc caagtgaccc tggccaactg 420 cagcagccct ggctctaccc tgcagcacag agccacactg gccgtgggca tctgtagccc 480 tgctgctcac ggaatcagcc tgctgagagg cagattcggc caggactgta ccgtggccct 540 gcagaggctg acctatctgg tgcatggcga cgtgctgtgc accaacctga cactgcctct 600 gctgcccagc agaaacgccg acgaaacatt ctttggagtg cagtggattt gtcctggcgg 660 agggtccggg ggaggacacc cagaacctca tacagctgaa ctgcagctga acctgaccgt 720 gcccagaaag gaccccaccc tgagatgggg agctggccct gctctgggca gatcctttac 780 acacggcccc gagctggaag aaggccacct gagaatccac caggacggcc tgtacagact 840 gcacatccaa gtgaccctgg ccaactgcag cagccctggc tctaccctgc agcacagagc 900 cacactggcc gtgggcatct gtagccctgc tgctcacgga atcagcctgc tgagaggcag 960 attcggccag gactgtaccg tggccctgca gaggctgacc 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30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Thr Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Val Val Asp Phe Arg 100 105

Claims (88)

  1. IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA, IFNα 단백질을 암호화하는 RNA, 및 GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 조성물 또는 의약 제제.
  2. 제1항에 따른 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, IFNα 단백질은 IFNα2b 단백질인, 의약 제제 또는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, (i) IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IL-12sc 단백질은 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (i) IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IL-15 스시 단백질은 서열번호 24의 아미노산 서열, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, (i) IFNα 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IFNα 단백질은 서열번호 19의 아미노산 서열, 또는 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, (i) GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) GM-CSF 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열, 또는 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 적어도 하나의 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 각각의 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 각 RNA는 적어도 하나의 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 각 RNA는 각각의 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 및 5-메틸-우리딘(m5U)으로부터 독립적으로 선택되는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  13. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 2가지 이상의 유형의 개질된 뉴클레오시드를 포함하며, 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 및 5-메틸-우리딘(m5U)으로부터 독립적으로 선택되는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)인, 의약 제제 또는 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 5' 캡 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G를 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각 RNA는 5' 캡 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G를 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는, 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5' UTR을 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 각 RNA는, 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5' UTR을 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는, 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 3' UTR을 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 각 RNA는, 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 3' UTR을 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 각 RNA는 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 폴리-A 꼬리는 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 폴리-A 꼬리는 서열번호 78로 나타낸 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 RNA는 다음을 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물:
    a. m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G를 포함하는 5' 캡;
    b. (i) 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 (ii) 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5' UTR;
    c. (i) 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열, 또는 (ii) 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 3' UTR; 및
    d. 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리-A 꼬리.
  26. 제25항에 있어서, 폴리-A 꼬리는 서열번호 78을 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, RNA를 포함하는 약학적 조성물인 의약 제제 또는 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 약학적 조성물은 1종 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 더 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, RNA는 액체, 고체, 또는 이의 조합물로서 제형화되는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 용도를 위한 의약 제제 또는 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 약학적 용도는 질병 또는 장애의 치료적 또는 예방적 처치를 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 의약 제제 또는 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 고형 종양은 육종, 암종, 또는 림프종인, 의약 제제 또는 조성물.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 고형 종양은 폐, 결장, 난소, 자궁경부, 자궁, 복막, 고환, 음경, 혀, 림프절, 췌장, 뼈, 유방, 전립선, 연조직, 결합조직, 신장, 간, 뇌, 갑상선, 또는 피부에 존재하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양은 상피성 종양, 호지킨 림프종(HL), 비 호지킨 림프종, 전립선 종양, 난소 종양, 신장세포 종양, 소화관 종양, 간 종양, 결장직장 종양, 맥관 구조가 있는 종양, 중피종 종양, 췌장 종양, 유방 종양, 육종 종양, 폐 종양, 결장 종양, 뇌 종양, 흑색종 종양, 소세포 폐 종양, 신경모세포종 종양, 고환 종양, 암종 종양, 선암종 종양, 신경아교종 종양, 고환종 종양, 망막모세포종, 또는 골육종 종양인, 의약 제제 또는 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, RNA는 종양 내 또는 종양 주위 투여를 위한 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, RNA는 주사를 위하여 제형화되는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, RNA는 주사에 의한 사용을 위한 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에 투여하기 위한 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  40. 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양의 치료 또는 예방은 대상체의 종양의 크기 감소, 관해 중인 암의 재발 방지, 또는 암 전이 방지를 포함하는 것인, 의약 제제 또는 조성물.
  41. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트.
  42. 제1항 또는 제3항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 의약 제제는 키트인, 의약 제제.
  43. 제42항에 있어서, RNA는 개별 바이알에 존재하는 것인, 의약 제제.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양의 치료 또는 예방을 위한 조성물 사용 설명서를 더 포함하는 키트.
  45. 대상체의 고형 종양의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 RNA로서, 이 방법은 IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA, IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA, IFNα 단백질을 암호화하는 RNA, 및 GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는 것인, RNA.
  46. 고형 종양의 치료를 위한 IL-12sc 단백질, IL-15 스시 단백질, IFNα 단백질, 및 GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA의 용도.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, IFNα 단백질은 IFNα2b 단백질인, 용도.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, (i) IL-12sc 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IL-12sc 단백질은 서열번호 14의 아미노산 서열, 또는 서열번호 14의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, (i) IL-15 스시 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IL-15 스시 단백질은 서열번호 24의 아미노산 서열, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, (i) IFNα 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 22 또는 23의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) IFNα 단백질은 서열번호 19의 아미노산 서열, 또는 서열번호 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, (i) GM-CSF 단백질을 암호화하는 RNA는 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고/포함하거나, (ii) GM-CSF 단백질은 서열번호 27의 아미노산 서열, 또는 서열번호 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  52. 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 적어도 하나의 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  53. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 각각의 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  54. 제45항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 각 RNA는 적어도 하나의 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  55. 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 각 RNA는 각각의 우리딘 대신 개질된 뉴클레오시드를 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ) 및 5-메틸-우리딘(m5U)으로부터 독립적으로 선택되는 것인, RNA 또는 용도.
  57. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 2가지 이상의 유형의 개질된 뉴클레오시드를 포함하며, 개질된 뉴클레오시드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 및 5-메틸-우리딘(m5U)으로부터 독립적으로 선택되는 것인, RNA 또는 용도.
  58. 제56항에 있어서, 개질된 뉴클레오시드는 N1-메틸-슈도우리딘(m1ψ)인, RNA 또는 용도.
  59. 제45항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 5' 캡 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G를 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  60. 제45항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 각 RNA는 5' 캡 m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G를 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  61. 제45항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는, 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5' UTR을 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  62. 제45항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 각 RNA는, 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5' UTR을 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  63. 제45항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는, 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 3' UTR을 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  64. 제45항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 각 RNA는, 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 3' UTR을 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  65. 제45항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 RNA는 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  66. 제43항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 각 RNA는 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 폴리-A 꼬리는 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  68. 제65항 또는 제66항에 있어서, 폴리-A 꼬리는 서열번호 78로 나타낸 폴리-A 꼬리를 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  69. 제45항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 RNA는 다음을 포함하는 것인, RNA 또는 용도:
    a. m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G를 포함하는 5' 캡;
    b. (i) 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 (ii) 서열번호 2, 4, 및 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5' UTR;
    c. (i) 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열, 또는 (ii) 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 또는 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 3' UTR;
    d. 적어도 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리-A 꼬리.
  70. 제69항에 있어서, 폴리-A 꼬리는 서열번호 78을 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  71. 제45항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 추가의 치료법을 투여하는 단계를 더 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  72. 제71항에 있어서, 추가의 치료법은 (i) 종양 절개, 절제, 또는 감량 수술, (ii) 면역요법, (iii) 방사선요법, 및 (iv) 화학요법으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 추가의 치료법은 추가의 치료제 투여를 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  74. 제73항에 있어서, 추가의 치료제는 항암 치료제인, RNA 또는 용도.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 추가의 치료제는 체크포인트 조절자인, RNA 또는 용도.
  76. 제75항에 있어서, 체크포인트 조절자는 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 또는 항-PD1 항체와 항-CTLA-4 항체의 조합물인, RNA 또는 용도.
  77. 제45항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양은 육종, 암종, 또는 림프종인, RNA 또는 용도.
  78. 제45항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양은 폐, 결장, 난소, 자궁경부, 자궁, 복막, 고환, 음경, 혀, 림프절, 췌장, 뼈, 유방, 전립선, 연조직, 결합조직, 신장, 간, 뇌, 갑상선, 또는 피부에 존재하는 것인, RNA 또는 용도.
  79. 제45항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양은 상피성 종양, 호지킨 림프종(HL), 비 호지킨 림프종, 전립선 종양, 난소 종양, 신장세포 종양, 소화관 종양, 간 종양, 결장직장 종양, 맥관 구조가 있는 종양, 중피종 종양, 췌장 종양, 유방 종양, 육종 종양, 폐 종양, 결장 종양, 뇌 종양, 흑색종 종양, 소세포 폐 종양, 신경모세포종 종양, 고환 종양, 암종 종양, 선암종 종양, 신경아교종 종양, 고환종 종양, 망막모세포종, 또는 골육종 종양인, RNA 또는 용도.
  80. 제45항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, RNA는 종양 내 또는 종양 주위로 투여되는 것인, RNA 또는 용도.
  81. 제45항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, RNA는 주사를 위하여 제형화되는 것인, RNA 또는 용도.
  82. 제73항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 치료제는 전신 투여되는 것인, RNA 또는 용도.
  83. 제45항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인, RNA 또는 용도.
  84. 제45항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, RNA는 동시에 투여되는 것인, RNA 또는 용도.
  85. 제45항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, RNA는 주사를 통해 투여되고, 이때, RNA는 주사 전에 액체 용액 중에서 함께 혼합되는 것인, RNA 또는 용도.
  86. 제45항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, RNA는 RNA의 조합물을 포함하는 조성물을 투여함으로써 투여되는 것인, RNA 또는 용도.
  87. 제45항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양의 치료 또는 예방은 대상체의 종양의 크기 감소, 관해 중인 암의 재발 방지, 또는 암 전이 방지를 포함하는 것인, RNA 또는 용도.
  88. 고형 종양 치료 또는 고형 종양 가능성 감소 방법으로, 이를 필요로 하는 대상체에 제1 RNA를 투여하는 단계를 포함하며, 이때, 제1 RNA는 IL-12sc 단백질, IL-15 스시 단백질, IFNα 단백질, 또는 GM-CSF 단백질을 암호화하고, 대상체는 추가 RNA로 더 치료되며, 이때,
    a. 제1 RNA가 IL-12sc 단백질을 암호화하는 경우, 추가 RNA는 IL-15 스시 단백질, IFNα 단백질, 및 GM-CSF 단백질을 암호화하고;
    b. 제1 RNA가 IL-15 스시 단백질을 암호화하는 경우, 추가 RNA는 IL-12sc 단백질, IFNα 단백질, 및 GM-CSF 단백질을 암호화하고;
    c. 제1 RNA가 IFNα 단백질을 암호화하는 경우, 추가 RNA는 IL-15 스시 단백질, IL-12sc 단백질, 및 GM-CSF 단백질을 암호화하고;
    d. 제1 RNA가 GM-CSF 단백질을 암호화하는 경우, 추가 RNA는 IL-15 스시 단백질, IFNα 단백질, 및 IL-12sc 단백질을 암호화하는 것인, 방법.
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