KR20240094145A

KR20240094145A - 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20240094145A
Application number: KR1020220171934A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김은미; 연정태; 이은주
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2022-12-09
Filing date: 2022-12-09
Publication date: 2024-06-25
Also published as: WO2024122717A1

Abstract

본 출원은 연골 재생 효과를 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 서열번호 1 또는 Arg(R)-Leu(L)-Arg(R)-Ser(S)으로 표기되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 연골 재생용 조성물, 및 상기 연골 재생용 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도 {Peptide for cartilage regeneration and uses thereof}

본 출원은 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

연골 조직의 특성상 넓은 면적이 손상된 경우 자연 치유에 의한 조직 재생이 어렵기 때문에 인공관절, 관절연골 성형술, 미세천공술 등의 외과적 수술을 통한 치료가 이루어져 왔다. 하지만 기존의 방법은 절개로 인한 흉터가 남으며, 내구성이 떨어지는 섬유 연골로의 재생을 초래하는 경우가 많아, 어려운 시술방법에 비해 치료 효과가 떨어지는 문제점을 가지고 있다.

따라서, 수술 과정이 간편하고 빠른 치료 효과를 나타내는, 하이드로겔, 콜라겐 등을 이용한 관절내 투여용 주사액 또는 연골 조직 수복용 조성물 등이 개발되었다(대한민국 공개특허공보 제2013-0028012호). 그러나 상기 방법은 일시적인 통증 감소는 줄 수 있지만, 연골 조직으로의 재생 유도에는 부족한 점이 있다.

또한, 세포를 이용한 치료법의 경우, 체외에서 배양된 세포를 다시 결손 부위에 이식하여 연골 조직의 재생을 유도하는 방법으로서 자가연골세포 또는 줄기세포 등을 이용한 다양한 치료 방법이 개발되었다(대한민국 공개특허공보 제2013-0072983호). 하지만 자가연골세포 치료제의 경우, 손상된 부위가 클 때 환자로부터 채취하여 배양된 세포만으로는 치료에 한계가 있으며, 줄기세포 치료제의 경우, 채취 부위에 따른 세포 수와 분화능의 차이, 체외 배양시 세포의 탈분화로 인한 세포 표현형의 변화, 체내 이식 후 연골세포로의 낮은 분화율과 세포 비후와 관련된 유전자 발현으로 세포 사멸과 함께 혈관 침투 유발로 연골세포의 석회화를 초래하는 등의 문제점이 있다.

이러한 기술적 배경 하에, 줄기세포 또는 연골세포의 연골 분화 또는 연골 형성을 촉진시킴으로써, 보다 효과적인 연골 질환의 치료를 가능하게 하는 유효 인자의 개발이 요구되고 있으나, 아직은 미비한 실정이다.

일 양상은 서열번호 1 또는 Arg(R)-Leu(L)-Arg(R)-Ser(S)으로 표기되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공하는 것이다.

다른 양상은 서열번호 1 또는 Arg(R)-Leu(L)-Arg(R)-Ser(S)으로 표기되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 상기 연골 재생용 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

일 양상은 서열번호 1 또는 Arg(R)-Leu(L)-Arg(R)-Ser(S)으로 표기되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미할 수 있다. 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술 또는 액상 합성 기술 (US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다. 본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 펩타이드를 개발하고자 예의 노력한 결과, 서열번호 1 또는 Arg(R)-Leu(L)-Arg(R)-Ser(S)으로 표기되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 규명하였다. 여기서, 상기 생물학적으로 유효한 활성은 (a) 글리코사미노글리칸 생성 유도; (b) COL2A1, COMP (Cartilage oligomeric matrix protein), COL11A, PCP(Proteoglycan coreprotein), 또는 아그레칸(aggrecan) 생성 유도; (c) 조절인자 SOX5, SOX6 또는 SOX9의 생성 유도; 및 (d) 조절인자 SOX9의 상위 활성인자(upstream activator)의 활성화와 같은 특성으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 나타내는 것일 수 있다. 따라서, 상기 펩타이드는 연골 재생을 위한 용도로 활용될 수 있다.

상기 펩타이드는 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group), 부톡시카르보닐기(butoxycarbonyl group), 아릴옥시카르보닐기(allyloxycarbonyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있고; 및/또는 상기 펩타이드의 C-말단은 아미노기(amino group, -NH₂), 삼차 알킬기(tertiary alkyl group) 및 아자이드(azide, -NHNH₂)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 선택적으로, 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 펩타이드는 인위적으로 합성되거나(Artificially synthesized), 또는 비-천연 발생 또는 조작(Non-naturally occurring or engineered)된 것이며, 상기 “비-천연 발생 또는 조작”은 자연 상태에서 일어나는 존재 그대로의 상태가 아닌, 인위적인 변형을 가하여 생성된 상태를 의미한다. 여기서, 상기 인위적인 변형은 복수 개의 아미노산 구조를 모방하여 인위적으로 아미노산 서열을 합성하는 것 또는 전술한 바와 같이 화학적 안정성, 강화된 약리 특성, 변경된 특이성, 또는 감소된 항원성을 획득하기 위하여 조작된 것을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "안정성"은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 상기 펩타이드를 보호하는 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성 (예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미할 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1 또는 Arg(R)-Leu(L)-Arg(R)-Ser(S)으로 표기되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 조성물을 제공한다.

상기 펩타이드에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "연골 재생"은 손상된 연골조직을 복원하거나 또는 부족한 연골조직의 생성을 유도하여 연골조직을 개선시키는 것일 수 있다. 상기 "개선"은 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

상기 연골은 유리연골(hyaline cartilage), 섬유연골(fibrocartilage) 또는 탄성연골(elastic cartilage)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 상기 연골은 관절연골(articular Cartilage), 귀 연골, 비연골, 팔꿈치 연골, 반월상연골(meniscus), 무릎연골, 늑연골, 발목연골, 기관연골, 후두연골 및 척추 연골로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

종래의 기능성 펩타이드는 유효한 생물학적 활성에도 불구하고 펩타이드 자체의 크기로 인해, 표적 조직 또는 세포에 효과적으로 유입되지 못하거나 반감기가 짧아 단기간에 체내에서 소멸되는 단점을 보여 주었다. 반면, 일 실시예에 따른 연골 재생용 조성물은 약 10개 이하의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하며, 이에 따라, 유효 성분의 피부 침투율 등이 매우 우수하고, 예를 들어, 국소적으로 투여하는 경우, 유효한 연골 재생 효과를 얻을 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 연골과 관련된 물질인 글리코사미노글리칸, COL2A1, COMP, COL11A, PCP, 아그레칸, 조절인자 SOX5, SOX6 또는 SOX9의 발현을 유의하게 증가시킬 수 있는 바, 상기 펩타이드는 연골 재생용 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다(Orthop Res Rev. 2010 September 1; 2010(2): 85-94. doi:10.2147/ORR.S7194, JOSPT Volume 28 Number 4 October 1998).

또 다른 양상은 서열번호 1 또는 Arg(R)-Leu(L)-Arg(R)-Ser(S)으로 표기되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 펩타이드 또는 조성물에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.

본 명세서에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여로 질병의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 용어, "치료"는 질병을 앓거나 또는 질병이 발병할 위험이 있는 개체에게, 상기 개체의 상태(예를 들면, 하나 이상의 증상)의 개선, 질병 진행의 지연, 증상 발생의 지연 또는 증상 진행의 둔화 등을 포함한 효과를 제공하는 임의의 형태의 치료를 의미한다. 따라서, 상기 "치료" 및 "예방"은 증상의 치유 또는 완전한 제거를 의미하도록 의도되지 않는다.

상기 "개체"는 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "연골 질환"은 연골 분화 또는 재생을 필요로 하는 연골에 관련된 모든 질환을 의미한다. 상기 연골 질환은 연골손상, 연골결손, 퇴행성 추간판 질환, 추간판 탈출증, 퇴행성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상, 골연화증 및 연골연화증으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 연골 질환은 턱 관절, 어깨 관절, 팔꿈치 관절, 팔목 관절, 손가락 관절, 척추 관절, 엉덩이 관절, 무릎 관절, 발목 관절 또는 발가락 관절에서 발생할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 상기 펩타이드의 약제학적 유효량(pharmaceutically effective amount); 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 유효량"은 상기 약제학적 조성물의 연골 재생 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미할 수 있다.

상기 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체간 중량비는 예를 들어, 500:1 내지 1:500일 수 있으며, 일례로서, 상기 중량비는 450:1 내지 1:450, 400:1 내지 1:400, 350:1 내지 1:350, 300:1 내지 1:300, 250:1 내지 1:250, 200:1 내지 1:200, 150:1 내지 1:150, 100:1 내지 1:100, 80:1 내지 1:80, 60:1 내지 1:60, 40:1 내지 1:40, 20:1 내지 1:20, 10:1 내지 1:10, 8:1 내지 1:8, 6:1 내지 1:6, 4:1 내지 1:4, 또는 2:1 내지 1:2일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 제조 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

상기 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥 내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약제학적 조성물의 투여량은 1 일당 0.0001 내지 1000 ug(마이크로그램), 0.001 내지 1000 ug, 0.01 내지 1000 ug, 0.1 내지 1000 ug, 또는 1.0 내지 1000 ug일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 투여될 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

상기 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나, 연고, 크림, 겔, 경피흡수제, 카타플라스마제, 첩부제, 페이스트제, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 및/또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 펩타이드는 피부 투과 문제 또는 안정성 문제를 보다 개선시키기 위하여 나노좀 또는 나노파티클에 함유될 수 있다. 예를 들어, 상기 나노좀은 레시틴을 원료로 사용하여 마이크로플루다이져로 제조될 수 있고, 레시틴 입자 내에 함유될 수 있다. 상기 나노좀의 제조 방법은 공지의 것이라면 어떠한 방법이라도 사용될 수 있다. 상기 나노좀 입자의 크기는 30 내지 200 nm인 것이 바람직하다. 상기 나노좀 입자의 크기가 30 nm 미만인 경우에는 피부 침투가 매우 빨리 진행되어 피부 부작용이 발생할 수 있고, 200 nm를 초과하는 경우에는 피부 침투가 용이하지 않아 나노좀 구조를 사용하는 효과를 얻기 어려울 수 있다.

또 다른 양상은 치료학적 유효량의 서열번호 1 또는 Arg(R)-Leu(L)-Arg(R)-Ser(S)으로 표기되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 연골 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 펩타이드, 조성물 등에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "적용하는", "투여하는", 및 "도포하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 실시예에 따른 조성물을 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 것, 또는 투여 경로에 의해 개체 내로 일 실시예에 따른 조성물의 배치하는 것을 의미할 수 있다.

또 다른 양상은 서열번호 1 또는 Arg(R)-Leu(L)-Arg(R)-Ser(S)으로 표기되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화장료 조성물은 상기 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및/또는 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 양상은 서열번호 1 또는 Arg(R)-Leu(L)-Arg(R)-Ser(S)으로 표기되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 연골을 재생시키는 방법을 제공한다.

일 양상에 따른 펩타이드에 의하면, 글리코사미노글리칸, 콜라겐, COMP, 아그레칸 등의 다양한 연골 성분들을 유의하게 증가시킴으로써, 우수한 연골 재생 효과를 나타낸다.

일 양상에 따른 펩타이드에 의하면, 글리코사미노글리칸, 콜라겐, COMP, 아그레칸 등의 다양한 연골 성분들을 유의하게 증가시킴으로써, 연골 질환을 예방 또는 치료하고 연골 재생을 촉진시키는데 적용할 수 있다.

도 1은 Peptide-1을 AD-MSC 세포에 처리한 후, SRB 염색에 의해 세포 형태 변화를 확인한 결과이다.
도 2는 Peptide-2를 AD-MSC 세포에 처리한 후, SRB 염색에 의해 세포 형태 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 Peptide-1을 AD-MSC 세포에 처리한 후, CCK-8 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 Peptide-2를 AD-MSC 세포에 처리한 후, CCK-8 활성을 확인한 결과이다.
도 5는 Peptide-1을 AD-MSC 세포에 처리한 후, 글리코사미노글리칸의 생성 증가를 확인한 결과이다.
도 6은 Peptide-2를 AD-MSC 세포에 처리한 후, 글리코사미노글리칸의 생성 증가를 확인한 결과이다.
도 7은 Peptide-1을 AD-MSC 세포에 처리한 후, ECM 성분들의 mRNA 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 8은 Peptide-2를 AD-MSC 세포에 처리한 후, ECM 성분들의 mRNA 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 9는 Peptide-1을 AD-MSC 세포에 처리한 후, ECM 조절인자인 SOX9의 생성 증가를 확인한 결과이다.
도 10은 Peptide-2를 AD-MSC 세포에 처리한 후, ECM 조절인자인 SOX9의 생성 증가를 확인한 결과이다.
도 11은 Peptide-1을 AD-MSC 세포에 처리한 후, ECM 조절인자인 SOX5, SOX6 및 SOX9의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 12는 Peptide-2를 AD-MSC 세포에 처리한 후, ECM 조절인자인 SOX5, SOX6 및 SOX9의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 13은 Peptide-1을 AD-MSC 세포에 처리한 후, 연골성분 아그레칸 및 COL2A1의 발현을 증가를 확인한 결과이다.
도 14는 Peptide-2를 AD-MSC 세포에 처리한 후, 연골성분 아그레칸 및 COL2A1의 발현을 증가를 확인한 결과이다.
도 15는 Peptide-2를 AD-MSC 세포에 처리한 후, 연골세포의 ECM 조절인자 SOX9의 상위 활성인자를 활성화시킴을 확인한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 펩타이드의 합성

자동 펩타이드 합성기(Milligen 9050, Millipore, 미국)를 이용하여 하기의 표 1에 기재된 Peptide-1 또는 Peptide-2를 합성하고, C18 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)(Waters Associates, 미국)를 이용하여 이들 합성된 펩타이드를 순수 분리하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1 ㎜ X 100 ㎜, 1.7㎛, Waters Co, 미국)을 이용하였다.

[표 1]

실시예 2. 세포 독성 여부 확인

지방 유래 중간엽 줄기세포 (AD-MSC, Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell)에서 Peptide-1 또는 Peptide-2의 첨가에 의한 세포 형태 변화 및 세포 독성을 각각 SRB 염색 및 CCK-8 어세이를 통해 분석하고자 하였다.

구체적으로, AD-MSC 세포를 1.5 x 10³세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후 24 시간 동안 10 % FBS가 첨가된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양하였다. 그런 다음, 5% FBS가 첨가된 DMEM 배지로 교체한 후 Peptide-1 또는 Peptide-2를 각각 농도별로 처리하였다. 이어서, 배지를 3 일마다 교체하고 Peptide-1 또는 Peptide-2를 각각 농도별로 처리하였다. CCK-8 활성을 확인하기 위해, 7 일 후 CCK-8 (Dojindo, CCK-8 kit) 용액을 배양액의 1/10 부피로 첨가한 후, 2 시간 동안 인큐베이션 하였다. 배양액을 샘플링하여 마이크로플레이트 리더기로 450 nm 파장에서 CCK-8 활성을 확인하였다.

또한, SRB 염색을 위해, 플레이트에서 배지를 석션 (suction)한 후, 3.7 % 포르말린 60 μL를 염색할 96-웰 플레이트에 첨가하여 1 분 동안 고정시켰다. 3.7 % 포르말린을 석션한 후, SRB 염색 용액 (설포로다민 B 소듐 염 (sigma, S9012): 100 mL DDW 중 0.2 g)을 70 μL 첨가하여 염색하였다. 은박지로 플레이트를 덮고, 빛을 차단하여 실온에서 밤새 인큐베이션 하였다. 1 % 아세트산 100 μL으로 멀티피펫을 이용하여 세척한 후 건조하고 현미경으로 관찰하였다. 한편, 본 실시예에서 양성대조군 (CM)으로는 덱사메타손 (100 nM), 아세트산 (50 μM), 프롤린 (40 μM), TGFβ1(10 ng/ml) 및 1X ITS를 첨가한 것을 사용하였다.

그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, Peptide-1 또는 Peptide-2는 지방 유래 중간엽 줄기세포에 처리하더라도 SRB 염색에서 세포 형태의 변화는 나타나지 않음을 알 수 있었다. 또한, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, Peptide-1 또는 Peptide-2는 지방 유래 중간엽 줄기세포에 대해 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.

실시예 3. 글리코사미노글리칸 생성 효과 확인

지방유래 중간엽줄기세포에서 Peptide-1 또는 Peptide-2의 첨가에 의한 글리코사미노글리칸의 생성 증가 효과를 확인함으로써, 상기 펩타이드의 연골생성 유도 및 세포외기질 (ECM) 생성 촉진 효과를 확인하고자 하였다.

구체적으로, AD-MSC 세포를 1.5 x 10³세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후 24 시간 동안 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 그런 다음, 5% FBS가 첨가된 DMEM 배지로 교체한 후 Peptide-1 또는 Peptide-2를 각각 농도별로 처리하였다. 이어서, 배지를 3 일마다 교체하고 Peptide-1 또는 Peptide-2를 각각 농도별로 처리하였다. 14일 후 배지를 석션 (suction)하고 3.7 % 포르말린 60 μL를 염색할 96-웰 플레이트에 첨가하고 1 분 동안 고정시켰다. 3.7 % 포르말린을 석션한 후 알시안 블루 염색 용액 (3 % 아세트산 50 mL + 1 % Alcian blue 8GX 0.5 g, pH 2.5) 70 μL를 분주하였다. 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션 한 후, 염색 용액을 석션하고 3 차 증류수로 세척 및 건조하여 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 글리코사미노글리칸의 생성을 증가시켜 연골 생성을 유도하고 세포외기질 생성을 촉진시킴을 알 수 있었다.

실시예 4. ECM의 mRNA 발현 증가 확인

지방 유래 중간엽 줄기세포에서 Peptide-1 또는 Peptide-2의 처리에 의한 ECM 성분의 mRNA 발현 증가 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, AD-MSC 세포를 1.5 x 10³ 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후, 24 시간 동안 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 그런 다음, 5 % FBS가 첨가된 DMEM 배지로 교체한 후 Peptide-1 또는 Peptide-2를 각각 농도별로 처리하였다. 이어서, 배지를 3 일마다 교체하고 Peptide-1 또는 Peptide-2를 각각 농도별로 처리하였다. 3, 7 및 14 일 후, 배지를 석션한 다음 세포를 수거하고 RNA를 단리시켰다. cDNA synthesis kit & PCR pre-mix (Intron, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성한 후 하기 표 2에 나타낸 hCOL2A1, COMP, hCOL 11A, PCP 및 ACAN 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 하기 표 2에서 hCOL2A1는 콜라겐 타입 Ⅱ 알파 1을 코딩하고, hCOMP는 Cartilage oligomeric matrix protein를 코딩하고, hCOL11A는 콜라겐 타입 ⅩⅠ의 알파 사슬을 코딩하고, hPCP는 프로테오글리칸 코어 단백질을 코딩하고, hACAN는 아그레칸을 코딩하고, hGAPDH는 글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제를 코딩하는 것이다.

[표 2]

그 결과, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 ECM의 성분인 COL2A1, COMP, COL 11A, PCP 및 ACAN의 생성을 유도함을 알 수 있었다.

실시예 5. ECM 조절인자 SOX9의 mRNA 발현 유도 효과 확인

지방 유래 중간엽 줄기세포에서 Peptide-1 또는 Peptide-2의 처리에 의한 ECM 조절인자 SOX9의 mRNA 발현 증가 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, AD-MSC 세포를 1.5 x 10³ 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후, 24 시간 동안 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 그런 다음, 5% FBS가 첨가된 DMEM 배지로 교체한 후 Peptide-1 또는 Peptide-2를 각각 농도별로 처리하였다. 이어서, 배지를 3 일마다 교체하고 Peptide-1 또는 Peptide-2를 각각 농도별로 처리하였다. 3, 7 및 14 일 후 배지를 석션한 다음, 세포를 수거하고 RNA를 단리시켰다. cDNA synthesis kit & PCR pre-mix (Intron, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성한 후 하기 표 3에 나타낸 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 하기 표 3에서 SOX9는 (sex determining region Y)-box 9를 의미한다.

[표 3]

그 결과, 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 ECM 조절인자인 SOX9의 생성을 촉진시킴을 알 수 있었다.

실시예 6. ECM 조절인자 SOX5, SOX6 및 SOX9의 발현 유도 효과 확인

지방 유래 중간엽 줄기세포에서 Peptide-1 또는 Peptide-2의 처리에 의한 ECM 조절인자 SOX5, SOX6 및 SOX9의 발현 증가 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, AD-MSC 세포를 1.5 x 10³ 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후, 24 시간 동안 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 그런 다음, 5 % FBS가 첨가된 DMEM 배지로 교체한 후 Peptide-1 또는 Peptide-2를 각각 농도별로 처리하였다. 이어서, 배지를 3 일마다 교체하고 Peptide-1 또는 Peptide-2를 각각 농도별로 처리하였다. 3, 7 및 14 일 후 배지를 석션한 다음, 세포를 수거하고 용해물을 제조한 후 웨스턴블롯을 수행하였다. 검출을 위한 항체로는 SOX5에 대해 sc-293215 (Santa Cruz, USA), SOX6에 대해 sc-393314 (Santa Cruz, USA) 및 SOX9에 대해 82630S (Cell Signaling, USA)를 사용하였다.

그 결과, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 ECM 조절인자인 SOX5, SOX6 및 SOX9의 발현을 증가시킴을 알 수 있었다.

실시예 7. 아그레칸 및 COL2A1의 발현 유도 효과 확인

지방 유래 중간엽 줄기세포에서 Peptide-1 또는 Peptide-2의 처리에 의한 연골 성분 아그레칸 및 COL2A1의 발현 증가 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, AD-MSC 세포를 1.5 x 10³ 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후, 24 시간 동안 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 그런 다음, 5% FBS가 첨가된 DMEM 배지로 교체한 후 Peptide-1 또는 Peptide-2를 각각 농도별로 처리하였다. 이어서, 배지를 3 일마다 교체하고 Peptide-1 또는 Peptide-2를 농도별로 처리하였다. 3, 7 및 14 일 후 배지를 석션한 다음, 세포를 수거하고 용해물을 제조한 후 웨스턴블롯을 수행하였다. 검출을 위한 항체로는 아그레칸에 대해 sc-33695 (Santa Cruz, USA) 및 COL2A1에 대해 sc-518017 (Santa Cruz, USA)를 사용하였다.

그 결과, 도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 COL2A1의 발현을 증가시켰으며, Peptide-2는 아그레칸의 발현도 증가시킴을 알 수 있었다.

실시예 8. ECM 조절인자 SOX9의 상위 활성인자 활성 유도 효과 확인

지방 유래 중간엽 줄기세포에서 Peptide-2의 처리에 의한 ECM 조절인자 SOX9의 상위 활성인자 (upstream activator)의 활성 유도 효과를 확인하고자 하였다.

구체적으로, AD-MSC 세포를 1.5 x 10³ 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후, 24 시간 동안 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 그런 다음, 5% FBS가 첨가된 DMEM 배지로 교체한 후 Peptide-2를 농도별로 처리하였다. 15 분 후 배지를 석션한 다음 세포를 수거하고 용해물을 제조한 후 웨스턴블롯을 수행하였다. 검출을 위한 항체로는 Smad 2/3에 대해 # 8685S (Cell Signaling, USA) 및 p-Smad 2/3에 대해 # 8828S (Cell Signaling, USA)을 사용하였다.

그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, Peptide-2는 ECM의 조절인자 SOX9의 상위 활성인자의 활성을 유도함을 알 수 있었다.

상기 실험 결과를 종합하면, 일 실시예에 따른 Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 연골 재생을 유도하는 효과를 지니고 있음을 알 수 있었다.

제형예 1. 펩타이드 나노좀의 제조

상기 실시예 1의 펩타이드 50 mg을 증류수 500 ml로 충분히 교반하여 용해하였다. 배합체 용액을 레시틴 5 g, 소듐 올리에이트(sodium oleate) 0.3 ml, 에탄올 50 ml 그리고 약간의 유상과 함께 혼합한 후， 총량이 1 L가 되도록 증류수로 양을 맞춰 준 다음， 마이크로플루다이저로 고압을 이용하여 유화시켜 사이즈 100 nm 정도의 펩타이드 나노좀을 제조하였다.　

제형예 2. 약학적 제제

2-1. 산제의 제조

하기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

본 발명의 펩타이드 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

2-2. 정제의 제조

하기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

본 발명의 펩타이드 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

2-3. 캡슐제의 제조

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 하기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

본 발명의 펩타이드 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

2-4. 주사제의 제조

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 하기의 성분 함량으로 제조한다.

본 발명의 펩타이드 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄·2H₂O 26 mg

2-5. 액제의 제조

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 하기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 100 ml로 조절한 후, 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

본 발명의 펩타이드 10 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1 또는 Arg(R)-Leu(L)-Arg(R)-Ser(S)으로 표기되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group), 부톡시카르보닐기(butoxycarbonyl group), 아릴옥시카르보닐기(allyloxycarbonyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합된 것인, 펩타이드.
청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드의 C-말단은 아미노기(amino group, -NH₂), 삼차 알킬기(tertiary alkyl group) 및 아자이드(azide, -NHNH₂)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합된 것인, 펩타이드.
청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 하기와 같은 특성으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 나타내는 것인, 펩타이드:
(a) 글리코사미노글리칸 생성 유도;
(b) COL2A1, COMP, COL11A, PCP 또는 아그레칸 생성 유도;
(c) 조절인자 SOX5, SOX6 또는 SOX9의 생성 유도; 및
(d) 조절인자 SOX9의 상위 활성인자(upstream activator)의 활성화.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 조성물.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
청구항 6에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 펩타이드는 나노좀의 형태로 제형화된 것인, 약제학적 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 연골 질환은 연골손상, 연골결손, 퇴행성 추간판 질환, 추간판 탈출증, 퇴행성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상, 골연화증 및 연골연화증으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인, 약제학적 조성물.