KR20240003562A

KR20240003562A - 엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함하는 유방암의 개선, 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20240003562A
Application number: KR1020220081298A
Authority: KR
Inventors: 김진우; 홍지우; 김소희; 김한아; 이장원
Original assignee: 선문대학교 산학협력단
Priority date: 2022-07-01
Filing date: 2022-07-01
Publication date: 2024-01-09

Abstract

본 발명은 유방암의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함함으로써, 유방암을 개선, 예방 또는 치료할 수 있으므로, 식품 조성물, 나아가 건강기능식품 또는 약학 조성물로 활용될 수 있다.

Description

엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함하는 유방암의 개선, 예방 또는 치료용 조성물{A composition for improving, preventing and treating of breast cancer comprising Cirsium setidens extract}

본 발명은 엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함하는 유방암의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

유방암(breast cancer)은 유방에 발생하는 모든 악성 종양을 통틀어 말하는 것으로, 유방에 비정상적인 세포조직이 계속 자라거나 다른 장기로 퍼지는 치명적인 질병이다. 한국 여성들에게 있어서 유방암 발병률은 갑상선암에 이어서 두 번째이며, 유방암 발병률은 20대 및 30대에서 증가하다가 40대에서 최고에 이른다. 우리나라의 경우, 2000년 이후 유방암 발병 증가율이 연 6.8%로 세계에서 가장 빠른 증가 속도를 보이고 있다(2010년 WHO 보고).

실제 유방암은 2012, 2013년 한국보건산업진흥원 기관의 통계에 의하면, 총 3,232,417명의 검진 환자 중 약 885,735명이 유방암 판정을 받았고, 전국의 암환자 중 두 번째로 많은 진료비를 내고 있다. 우리나라의 유방암 발병 증가율을 고려할 때 유방암의 치료는 대단히 중요하며 의약 조성물의 개발이 요구된다.

유방암의 치료는 조기 진단시 외과적 절제술로 치료가 가능하나 많은 환자에서 폐, 뼈, 간 등 원격적인 전이 형태로 재발된다. 암 세포의 전이(metastasis)는 암 치료를 어렵게 하는데, 이때 세포를 둘러싸고 있는 조직으로 침투해 들어가는 세포 침윤(invasion) 과정이 필수적이며 이는 악성 암세포의 특징 중 하나이다(Aznavoorian et al., Cancer 71,1368-1383, 1993).

암세포의 침윤성에는 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane)을 분해하는 단백질 분해과정과 분해된 매트릭스(matrix)를 통하여 이동하는 세포 이동성(migration)이 관여한다.

상기 외과적 절제술 외에 방사선조사 및 화학요법의 치료법이 있는데, 화학요법은 세포 복제 또는 세포 대사를 붕괴시키며, 흔히 유방, 폐 및 정소의 암을 치료하는데 많이 사용된다. 종양 질병을 치료하는데 사용되는 전신성 화학요법의 부작용은 암 치료를 받는 환자들에게 가장 문제가 된다. 이러한 부작용 중에서 멀미와 구토는 가장 일반적이며 심각한 부작용이다. 화학요법에 의한 부작용은 환자의 생명에 큰 영향을 미치며 치료에 대한 환자의 순응성을 급격하게 변화시킬 수 있다. 또한, 화학치료제와 관련된 부작용으로는 일반적으로 이러한 약물의 투여시 주의해야 하는 용량 제한 독성(DLT)이 있다. 예를 들어, 점막염은 여러 항암제, 예컨대 항대사물질 세포 독소제인 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil), 메토트렉세이트(metotrexate) 및 항종양 항생제(예, 독소루비신) 등에 대한 용량 제한 독성이다.

이러한 화학요법 유래의 부작용 중 대부분은 심한 경우 입원을 요하거나 통증을 치료하기 위해 진통제를 필요로 하기도 한다. 이와 같이 화학치료제 및 방사선 치료에 의한 부작용들은 암 환자의 임상적 처치 시 주요 문제가 되고 있다. 또한, 종래의 항암제들은 정상세포까지 죽이는 경우가 많았기 때문에, 최근에는 정상세포에는 작용하지 않고 암세포에만 작용할 수 있는 새로운 기전의 항암제에 대한 연구가 진행되고 있다.

따라서, 유방암에 대하여 부작용이 적고 치료 효능이 높은 표적 약물의 발굴은 유방암 치료를 위한 약물 개발 시 충족되지 않은 요구사항이며, 그 필요성이 절실하게 대두되고 있다.

대한민국 등록특허 제0909998호 대한민국 등록특허 제2360622호

본 발명의 목적은 엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함하는 유방암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함하는 유방암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 유방암을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물은 엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.

상기 엉겅퀴 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것일 수 있다.

상기 혼합용매는 20 내지 100 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액일 수 있다.

상기 엉겅퀴 추출물은 20 내지 50 kHz의 진동수 및 50 내지 700 W의 파워의 초음파기로 5 내지 60 분 동안 40 내지 90 ℃ 하에서 처리된 것일 수 있다.

상기 엉겅퀴 추출물은 엉겅퀴 줄기와 잎이 1 : 0.3-1의 중량비로 혼합된 혼합물의 추출물일 수 있다.

상기 엉겅퀴 추출물의 지표물질은 클로로겐산(chlorogenic acid)일 수 있다.

또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 유방암을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물은 엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 발명의 고려엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 유방암세포의 세포증식을 억제시키고, 유방암세포의 이동을 억제시킬 뿐만 아니라 암세포에서 세포사멸의 핵심유전자인 AMPK-α, p53 및 Bax의 발현을 증가시키고 Bcl-2의 발현을 감소시키므로 유방암 특이적 항암활성이 있다.

도 1a는 클로로겐산(chlorogenic acid)을 측정한 HPLC 그래프이며, 도 1b는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 고려엉겅퀴 초음파 추출물을 HPLC로 측정한 후 주요 지표물질을 확인한 HPLC 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 고려엉겅퀴 초음파 추출물을 농도별로 처리 시 p53, AMPK-α, Bax 및 Bcl-2의 발현을 나타낸 PCR이며; 도 2b 내지 도 2e는 상기 도 2a에서 측정한 p53, AMPK-α, Bax 및 Bcl-2의 발현량을 각각 정량화한 그래프이다.

구체적으로, 본 발명에서 사용되는 엉겅퀴는 고려엉겅퀴이며, 초음파로 추출한 추출물을 사용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 유방암을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물은 엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함한다.

상기 엉겅퀴는 고려엉겅퀴로서, 고려엉겅퀴(Cirsium setidens)는 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과의 여러해살이풀이다. 상기 고려엉겅퀴는 산과 들에서 높이 약 1 m까지 자라고, 뿌리가 곧으며 가지가 사방으로 퍼진다. 상기 고려엉겅퀴의 뿌리에 달린 잎과 밑부분의 잎은 꽃이 필 때 시든다.

상기 고려엉겅퀴의 줄기에 달린 잎은 타원 모양 바소꼴 또는 달걀 모양으로서 밑쪽 잎은 잎자루가 길고 위쪽 잎은 잎자루가 짧다. 상기 고려엉겅퀴 잎의 앞면은 녹색에 털이 약간 나며 뒷면은 흰색에 털이 없고 가장자리가 밋밋하거나 가시 같은 톱니가 있다. 상기 고려엉겅퀴는 한국 특산종으로 전국에 분포한다.

본 발명에서는 고려엉겅퀴의 줄기와 잎을 혼합하여 사용하며, 바람직하게는 줄기와 잎을 1 : 0.3-1의 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 0.5-0.8의 중량비로 혼합하여 사용한다. 줄기를 기준으로 잎의 함량이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 유방암의 개선, 예방 또는 치료 효과가 낮을 수 있다.

또한, 고려엉겅퀴의 줄기와 잎의 혼합물 대신 꽃 및/또는 뿌리를 사용하는 경우에는 유방암의 개선, 예방 또는 치료 효과가 현저히 낮을 수 있다.

상기 고려엉겅퀴는 추출용매 하에서 초음파처리를 통해 추출되는 것으로서, 구체적으로 고려엉겅퀴와 추출용매가 1 : 5 내지 25의 중량비, 바람직하게는 1 : 8 내지 15의 중량비로 혼합되어 20 내지 50 kHz, 바람직하게는 30 내지 40 kHz의 진동수 및 50 내지 700 W, 바람직하게는 150 내지 400 W 파워의 초음파기로 40 내지 90 ℃, 바람직하게는 50 내지 85 ℃ 하에서 5 내지 60 분, 바람직하게는 15 내지 40 분 동안 처리된다.

고려엉겅퀴를 추출 시 초음파 추출이 아니라 열수 추출, 용매 추출 또는 침지 추출인 경우에는 유효성분이 소량 추출될 뿐만 아니라 유방암의 개선, 예방 또는 치료 효과가 낮을 수 있다.

상기 고려엉겅퀴와 추출용매의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 추출물에 고려엉겅퀴의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있다.

또한, 초음파기의 진동수 및 파워가 상기 하한치 미만인 경우에는 고려엉겅퀴의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 유효물질의 열분해, 중합 또는 유효성분 외에 다른 물질도 다량으로 추출되어 효과가 저하될 수 있다.

또한, 추출온도 및 추출시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 고려엉겅퀴의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 독성물질이 발생할 수 있다.

상기 추출물을 추출하는 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 에틸렌글리콜, 에틸에테르 또는 이들의 혼합용매이다. 상기 저급알코올로는 20 내지 99 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액을 들 수 있으며, 바람직하게는 우수한 유방암의 개선, 예방 또는 치료 효과를 위하여 40 내지 99 부피%의 에탄올 수용액을 들 수 있다.

본 발명의 고려엉겅퀴 추출물은 약학 조성물 외에 식품 조성물에도 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상기 용매를 이용하여 고려엉겅퀴에 포함된 성분을 추출한 추출물, 이들로부터 분획한 분획물, 이들 추출물 또는 분획물을 추가적으로 농축한 농축물, 이를 정제 또는 분리한 정제물도 포함하고, 상기 추출물, 분획물, 농축물 또는 정제물을 건조한 건조물 또는 그를 분쇄한 분말을 포함하는 의미로 사용된다.

상기 정제물의 제조를 위해 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시키거나, 또는 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 부가할 수 있다.

본 발명은 고려엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함하는 유방암의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

상기 ‘식품 조성물’은 유효성분으로 고려엉겅퀴 추출물 이외에, 식품 제조에 통상적으로 사용되는 식품의 기준 및 규격(‘식품공전’)에 기재된 식품으로 사용가능한 식품 원료, 식품첨가물 공전에 기재된 식품첨가물을 포함한다.

특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물은 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 설탕, 유당 등; 올리고당 또는 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 물엿, 사이클로덱스트린 등; 당알코올, 예를 들어 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등을 사용할 수 있다. 상기 향미제는 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

상기 고려엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 식품 조성물을 제조하는 경우에 고려엉겅퀴 추출물은 유방암을 예방 또는 치료할 수 있는 함량이면 특별히 한정할 필요는 없으나, 예를 들어 0.1 내지 99 중량%, 0.5 내지 95 중량%, 1 내지 90 중량%, 2 내지 80 중량%, 3 내지 70 중량%, 4 내지 60 중량%, 5 내지 50 중량%로 포함될 수 있다.

상기 식품 조성물에서 유효성분인 고려엉겅퀴 추출물은 섭취자의 상태, 체중, 질병의 유무나 정도 및 기간에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예들 들어 1일 투여량을 기준으로 1 내지 5,000 mg, 바람직하게는 5 내지 2,000 mg, 더욱 바람직하게는 10 내지 1,000 mg, 더더욱 바람직하게는 20 내지 800 mg, 가장 바람직하게는 50 내지 500 mg일 수 있고, 투여 횟수는 특별히 한정할 필요는 없으나 1일 3회 내지 1주일에 1회의 범위 내에서 통상의 기술자가 조절할 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.

상기 식품 조성물은 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 엑스제, 젤리 제형, 티백 제형 또는 음료 제형일 수 있다.

또한 일반 식품에 유방암의 예방 또는 개선의 기능성을 부여하기 위하여 상기 고려엉겅퀴 추출물을 첨가할 수 있으며, 첨가가 가능한 식품은, 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 식품위생법 제7조에 따른 식품의 기준 및 규격(‘식품공전’)에 예시된 과자류, 빵 또는 떡류, 코코아가공품류 또는 초콜릿류, 식육 또는 알가공품, 어육가공품, 두부류 또는 묵류, 면류, 다류, 커피, 음료류, 특수용도식품, 장류, 조미식품, 드레싱류, 김치류, 젓갈류, 절임식품, 조림식품, 주류, 건포류, 기타 식품류 등에 첨가될 수 있다. 또한 축산물위생관리법 제4조에 따른 축산물의 가공기준 및 성분규격(‘축산물공전’)에 예시된 유가공품, 식육가공품 및 포장육, 알가공품에 첨가될 수 있다.

한편, 상기 고려엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 하는 식품 조성물은 단독으로 “유방암의 예방 또는 개선용 건강기능식품”으로 이용될 수 있다.

상기 ‘건강기능식품’은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 법적 기준에 따라 제조(가공을 포함)한 식품(건강기능식품에 관한 법률 제3조 제1호)을 말한다. 상기 ‘건강기능식품’은 국가마다 용어나 범위에 차이가 있을 수 있으나, 미국의 ‘식이 보충제(Dietary Supplement)’, 유럽의 ‘식품 보충제(Food Supplements)’, 일본의 ‘보건기능식품’ 또는 ‘특정보건용 식품(Food for Special Health Uses, FOSHU)’, 중국의 ‘보건식품’ 등에 해당할 수 있다.

상기 식품 조성물 또는 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 ‘식품첨가물공전’의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 따른다.

또한 본 발명은 인간, 또는 인간을 제외한 동물에게 상기 조성물을 투여하는 유방암의 치료방법을 제공한다.

또한 본 발명은 유방암의 예방 또는 치료용 의약, 또는 동물용 의약 제조를 위한 고려엉겅퀴 추출물의 신규 용도를 제공한다.

상기 ‘약학 조성물’또는 ‘의약’은 유효성분으로 고려엉겅퀴 추출물 이외에, 약학 조성물 등의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 ‘담체’는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물이다. 상기 ‘희석제’는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물이다.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어, 유당, 포도당, 설탕, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.

상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약의 사용량은 환자 또는 치료대상 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 무엇보다도, 치료대상 개체의 상태, 치료 대상 질환의 특정한 카테고리 또는 종류, 투여 경로, 사용되는 치료제의 속성에 의존적일 것이다.

상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약은 체내에서 활성성분의 흡수도, 배설속도, 환자 또는 치료대상 동물의 연령 및 체중, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 1일 0.1 내지 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 내지 500 mg/kg, 더욱 바람직하게는 5 내지 250 mg/kg, 가장 바람직하게는 10 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 바람직하다. 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약은 개별적으로 예방제 또는 치료제로서 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

상기 약학조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 트로키제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다. 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 설탕 또는 유당, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 유방암의 치료방법은 인간, 또는 인간을 제외한 동물, 특히 포유동물에게 상기 조성물을 투여 하는 것으로, 예를 들어 유방암인 치료대상 개체에게 상기 조성물을 투여하는 것이다.

상기 치료를 위한 투여량, 투여 방법 및 투여 횟수는 상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약의 투여량, 투여 방법 및 투여 횟수를 참고할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예 1. 초음파 에탄올 추출물_줄기:잎=1:0.7의 중량비

고려엉겅퀴 혼합물(줄기:잎=1:0.7의 중량비)과 50 부피%의 에탄올 수용액을 1 : 10의 중량비로 혼합하여 초음파기(SD-250H, Mujigae Co., Seoul, Korea)에 투입 후 60 ℃ 하에서 초음파(40 kHz, 250 W)를 이용하여 30 분간 추출한 다음 추출물을 5,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 고려엉겅퀴 초음파 에탄올 추출물을 수득하였다.

비교예 1. 고려엉겅퀴 에탄올 추출물_초음파 생략

고려엉겅퀴 혼합물(줄기:잎=1:0.7의 중량비)과 50 부피%의 에탄올 수용액을 1 : 10의 중량비로 혼합하여 80 ℃ 하에서 50 분 동안 추출한 다음 추출물을 1,000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 고려엉겅퀴 에탄올 추출물을 수득하였다.

비교예 2. 줄기:잎=1:2의 중량비

상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 고려엉겅퀴의 줄기와 잎을 1 : 2의 중량비로 혼합하여 고려엉겅퀴 초음파 에탄올 추출물을 수득하였다.

비교예 3. 줄기:뿌리=1:0.7의 중량비

상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 고려엉겅퀴의 줄기와 뿌리를 1 : 0.7의 중량비로 혼합하여 고려엉겅퀴 초음파 에탄올 추출물을 수득하였다.

비교예 4. 줄기 단독

상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 고려엉겅퀴의 줄기만을 사용하여 고려엉겅퀴 줄기 초음파 에탄올 추출물을 수득하였다.

비교예 5. 잎 단독

상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 고려엉겅퀴의 잎만을 사용하여 고려엉겅퀴 잎 초음파 에탄올 추출물을 수득하였다.

비교예 6. 뿌리 단독

상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 고려엉겅퀴의 뿌리만을 사용하여 고려엉겅퀴 뿌리 초음파 에탄올 추출물을 수득하였다.

<시험예>

시험예 1. HPLC 측정

HPLC 측정: 고려엉겅퀴 초음파 추출물의 지표물질의 정량 및 정성 분석을 위해 고려엉겅퀴 초음파 추출물을 0.45 μm syringe filter (Hyundai Micro Co., Seoul, Korea)로 여과한 후 Poroshell 120 EC-C₁₈ column (4.6 X 150 mm, Agilent technology Inc., California, USA)과 diode array detector (DAD)가 장착된 HPLC (Agilent 1260 series, Agilent technology Inc., California, USA)를 이용하여 분석하였다. 피크 분리를 위해 이동상 A (99.9% acetonitrile)와 이동상 B (1.0% acetic acid)의 혼합비율을 시간에 따라 변경하며 분석을 수행하였다. 분석을 위한 시료 주입량은 10 μL로 0.5 mL/min 유속에서 64 분간 분석을 진행하여 시료의 검출시간(retention time, RT)을 확인하였고 DAD를 이용하여 190 ~ 640 nm에서 흡수 스펙트럼을 확보하고 표준물질의 검출시간과 흡수 스펙트럼을 비교하여 정성평가를 수행하였으며 검출 물질을 표준물질의 피크 면적을 기준으로 검량선과 비교하여 정량분석하였다.

HPLC gradient profile
Time (min)	A (%)	B (%)
0 min	100.0%	0.0%
5 min	85.0%	15.0%
50 min	50.0%	50.0%
60 min	0.0%	100.0%
64 min	100.0%	0.0%

도 1a는 클로로겐산(chlorogenic acid)을 측정한 HPLC 그래프이며; 도 1b는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 고려엉겅퀴 초음파 추출물을 HPLC로 측정한 후 주요 지표물질을 확인한 HPLC 그래프이다.

도 1a 및 도 1b에 도시된 바와 같이, 고려엉겅퀴 초음파 추출물의 주요 피크는 11.3 분에서 확인되었으며, 이를 폴리페놀 표준물질 중의 하나인 클로로겐산(chlorogenic acid)과 비교 시 RT가 일치하였고, 스펙트럼 분석에 있어 325 nm에서 최대 흡수파장을 나타내며 표준물질과 스펙트럼의 양상이 동일한 것을 확인되어 고려엉겅퀴 초음파 추출물의 주요 지표 물질이 클로로겐산(chlorogenic acid)인 것을 확인하였다.

또한, 표준물질의 피크 면적을 기준으로 클로로겐산(chlorogenic acid)의 농도를 산출한 결과, 0.02 mg/g DM으로 확인되었다.

시험예 2. 유방암세포의 세포독성 및 세포 증식 억제 효과 측정

세포배양

시료의 유방암 증식 및 전이 억제 효과를 통한 항암 효과 평가를 위해 유방암 세포인 MDA-MB-231을 사용하였으며 정상 세포에 대한 무독성을 확인하기 위해 인간 신장세포인 HEK-293을 사용하여 두 세포간의 생존율을 비교하였다. 세포배양 시 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM 배지를 사용하였으며 세포 배양기(Panasonic, Osaka, Japan)에서 37 ℃, 5.0% CO₂를 유지하며 배양하였다. 상기 배양된 세포는 72 시간 뒤 PBS를 이용하여 세척한 후 0.05% trypsin-EDTA로 부착된 세포를 분리 및 회수하여 4.0 ℃에서 2,000 rpm으로 2 분간 원심분리하고 상등액을 제거한 다음 부착된 세포에 DMEM 배지를 첨가하여 균일하게 분산 후 5.0 X 10⁴ cells/mL로 분주하여 계대 배양을 수행하였다.

세포독성 및 세포 증식 억제 측정

시료의 세포독성과 암세포 증식억제 효과 확인을 위해 MTT (3-(4, 5-dimethylthiazole-2-yl)-2, 5 diphenyl tetrazolium bromide) 분석법을 측정하였으며 유방암 세포와 정상 세포를 각 5.0 X 10³ cells/mL로 96 well cell culture plate에 180 μL씩 분주하여 세포 배양기에서 24 시간 배양하였다. 시료를 DMEM 배지에 희석하여 농도별로 20 μL씩 분주하였고 대조군에는 추출물 대신 DMEM을 동량 첨가하여 48 시간 추가 배양하였다. 세포독성 실험을 위해 배지를 제거하고 0.25 mg/mL MTT 시약을 각 100 μL씩 처리하여 세포 배양기에서 3 시간 배양 후 마이크로 플레이트 리더(Infinite^ⓡ200, Tecan group Co. Ltd., Zurich, Switzerland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하고 시료의 처리 농도에 따른 세포 생존율을 백분율로 산출하였다.

[수학식 1]

세포 생존율(cell viability, %) = [1-시료 OD/대조군 OD]*100

구분(단위: %)	MDA-MB-234(유방암세포)				HEK-293(정상세포)
구분(단위: %)	0.06 mg/ml	0.25 mg/ml	0.5 mg/ml	2 mg/ml	0.06 mg/ml	0.25 mg/ml	0.5 mg/ml	2 mg/ml
대조군	100±0.0^a				100±0.0^a
실시예 1	97.2±1.4^a	88.3±0.8^b	77.2±1.9^b	71.5±1.3^b	99.8±1.5^a	97.8±1.4^a	97.1±1.4^a	89.6±0.7^a
비교예 1	99.8±2.0^a	98.1±1.6^a	96.3±0.6^a	95.8±1.1^a	99.7±0.8^a	96.3±1.9^a	95.8±1.9^a	83.1±1.5^a
비교예 2	98.6±1.7^a	94.5±2.1^a	88.6±1.5^a	83.2±1.8^b	99.5±1.7^a	96.8±1.1^a	97.2±2.3^a	74.3±1.9^b
비교예 3	99.5±1.9^a	95.9±1.5^a	90.5±2.0^a	86.4±0.9^b	99.2±1.3^a	97.1±1.5^a	96.2±0.4^a	75.6±1.1^b
비교예 4	99.8±0.9^a	99.5±0.7^a	97.2±1.4^a	95.9±1.1^a	99.8±1.7^a	96.3±1.7^a	97.0±1.1^a	73.8±0.8^b
비교예 5	99.7±1.2^a	98.5±1.3^a	97.5±1.9^a	95.1±1.0^a	99.6±1.6^a	96.7±0.8^a	96.1±1.7^a	75.9±2.3^b
비교예 6	99.7±1.1^a	98.0±1.2^a	96.4±1.7^a	94.3±1.4^a	99.7±1.2^a	97.0±1.0^a	96.2±0.9^a	86.6±1.5^a

위 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 고려엉겅퀴 초음파 추출물은 비교예 1 내지 6의 고려엉겅퀴 추출물에 비하여 유방암세포의 세포 생존율을 현저히 감소시키는 것을 확인하였다.

즉, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 고려엉겅퀴 초음파 추출물은 2 mg/ml이하, 특히 0.5 mg/mL이하에서 정상세포에서 성장 저해없이 유방암세포의 성장을 억제시킬 수 있음을 확인하였다.

반면, 비교예 1, 4 내지 6의 고려엉겅퀴 추출물은 모든 농도에서 유방암세포의 세포 생존율이 높으며, 비교예 2 및 3의 고려엉겅퀴 추출물은 2 mg/mL의 농도에서 유방암세포의 세포 생존율이 낮은 편이지만 정상세포의 세포 생존율 역시 낮으므로 유방암의 개선, 예방 또는 치료용 조성물로 적합하지 않다.

시험예 3. 유방암세포의 이동성 평가

시료의 유방암 세포에 대한 전이 억제 효과를 확인하기 위해 추출물이 세포 이동성에 미치는 영향을 평가하였다. 유방암 세포인 MDA-MB-231를 2.5 X 10⁵ cells/mL로 24 well cell culture plate에 분주하고 세포 배양기에서 24 시간 배양하였으며 세포가 부착됨을 확인하고 배지를 제거한 후 0.35 mL PBS를 넣고 멸균된 피펫 팁으로 부착면을 횡단하여 0.9 mm가량의 절개부를 생성하고 PBS를 제거하였다. 이후 시료를 0.0, 0.25, 0.50과 1.0 mg/mL로 배지에 혼합하여 처리하고 도립현미경(Leitz Fluovert FS, Leica, Wetzlar, Germany)을 이용해 절개면에서의 세포이동을 12 시간 간격으로 관찰하였다. 추출물 처리에 의한 MDA-MB-231의 이동능은 36시간 후 관찰된 절개 면적을 이미지 분석 프로그램인 Image J (US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)로 측정하여 아래의 식에 따라 백분율로 산출하였다.

[수학식 2]

세포 이동성(%) = [1-시료 OD/대조군 OD]*100

구분(단위: %)	mg/ml
구분(단위: %)	0.25	0.5
대조군	100±0.0^a
실시예 1	76.9±1.3^b	65.8±1.1^b
비교예 1	98.7±0.8^a	96.6±0.7^a
비교예 2	88.5±1.6^a	87.7±1.8^a
비교예 3	90.5±2.0^a	89.6±2.1^a
비교예 4	96.8±1.1^a	94.3±0.9^a
비교예 5	97.2±0.7^a	95.0±1.3^a
비교예 6	92.9±1.9^a	91.2±1.5^a

위 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 고려엉겅퀴 초음파 추출물은 농도가 증가함에 따라 유방암세포의 이동성이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.

더욱이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 고려엉겅퀴 초음파 추출물은 비교예 1 내지 6의 고려엉겅퀴 추출물에 비하여 유방암세포의 이동성이 현저히 감소되는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 고려엉겅퀴 초음파 추출물은 정상세포에 독성이 없다고 확인된 농도 중에서 0.5 mg/mL 처리 시 유방암세포의 이동성이 대조군에 비하여 약 1.4배 이상 저해된 것을 확인하였다.

시험예 4. 암세포 표적 mRNA 발현

세포사멸 유도에 관련된 유전자 발현을 분석하기 위해 MDA-MB-231을 24 well plate에 1 X 10⁶ cells/mL로 분주한 후 시료를 0.0 ~ 1.0 mg/mL가 되도록 배지와 혼합하여 처리하고 24 시간 배양하였다. 배양 후 세포에 trypsin-EDTA를 처리하고 1,800 rpm으로 5 분간 원심분리하여 세포를 회수한 후 AccuPrep® Universal RNA extraction kit (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 추출된 전체 RNA 농도를 NanoDrop™ 2000 spectrophotometer (ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE, USA)로 측정하였다. 역전사는 AmfiRivert cDNA synthesis platinum master mix (GenDEPOT, Barker, TX, USA)를 이용하여 [표 4]에 따라 p53, AMPK-α, Bax 및 Bcl-2의 cDNA를 주형으로 증폭하였다. 유전자 발현량은 Gel red® nucleic acid gel stain (Komabiotech, Seoul, Korea)을 첨가한 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 Gel Doc™ XR+ System과 Quantity One software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 측정하였다.

Primers	Sequences
Primers	Forward (5’-3’)	Reverse (3’-5’)
p53	CCCATCCTCACCATCATCACAC	GCACAAACACGCACCTCAAAG
AMPK-α	GACACCAGTTTTGCCTCCAGTA	TCCAGAGGCGGAAGTTCTGT
Bcl-2	ATTGGGAAGTTTCAAATCACG	TCTATTCCTCTGTGATGTGT
Bax	GAGCTGCAGAGGATGATGATTCG	AAGTTGCCGTCAGAAAACACG
β-actin	TCACCCACACTGTGCCCATC	CAGCGGAACCGCTCATTGCCA

도 2a는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 고려엉겅퀴 초음파 추출물을 농도별로 처리 시 p53, AMPK-α, Bax 및 Bcl-2의 발현을 나타낸 PCR이며; 도 2b 내지 도 2e는 상기 도 2a에서 측정한 p53, AMPK-α, Bax 및 Bcl-2의 발현량을 각각 정량화한 그래프이다.

도 2a 내지 도 2e에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 고려엉겅퀴 초음파 추출물은 농도 의존적으로 유전자의 발현량이 변화하는 것을 확인하였으며(p < 0.05), 0.5 mg/mL를 기준으로 AMPK-α, p53 및 Bax의 발현이 대조군 대비 각각 1.45배, 1.43배 및 1.68배로 증가한 반면 Bcl-2의 발현은 0.14배 감소한 것을 확인하였다.

세포 내 대사과정에서 DNA 손상에 의해 p53이 p21을 활성화하여 세포주기를 정지시키거나 활성화된 AMPK-α와 세포질 내에서 결합해 암 억제 인자로 작용하며 암세포 성장에 관여하는 Bcl-2 및 Bax 등과 같은 신호분자를 억제하여 세포사멸을 유도한다고 알려져 있어 본 발명의 고려엉겅퀴 초음파 추출물이 유방암세포에서 인산화된 AMPK-α가 증가함에 따라 축적된 p53이 미토콘드리아에서 Bcl-2 활성을 억제시키고 Bax를 증가시켜 세포사멸을 유도시킨 것으로 판단된다.

즉, 본 발명의 고려엉겅퀴 초음파 추출물이 p53, AMPK-α, Bax 및 Bcl-2의 상호작용에 따른 유방암 특이적 항암활성이 있는 것으로 확인된다.

아래에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1: 산제의 제조

실시예 1의 추출물 분말 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2: 정제의 제조

실시예 1의 추출물 분말 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3: 캡슐제의 제조

실시예 1의 추출물 분말 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4: 과립제의 제조

실시예 1의 추출물 분말 1,000 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 5: 음료 제형의 제조

실시예 1의 추출물 분말 1,000 mg

구연산 1,000 mg

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 mL

통상의 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.

Claims

엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 엉겅퀴 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 혼합용매는 20 내지 100 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 엉겅퀴 추출물은 20 내지 50 kHz의 진동수 및 50 내지 700 W의 파워의 초음파기로 5 내지 60 분 동안 40 내지 90 ℃ 하에서 처리된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 엉겅퀴 추출물은 엉겅퀴 줄기와 잎이 1 : 0.3-1의 중량비로 혼합된 혼합물의 추출물인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 엉겅퀴 추출물의 지표물질은 클로로겐산(chlorogenic acid)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
엉겅퀴 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.