KR101804296B1

KR101804296B1 - 식용피 유래 성분을 포함하는 항암용 조성물

Info

Publication number: KR101804296B1
Application number: KR1020150167473A
Authority: KR
Inventors: 김영호; 전도연; 우미희
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2015-11-27
Filing date: 2015-11-27
Publication date: 2017-12-04
Anticipated expiration: 2035-11-27
Also published as: KR20170062077A

Abstract

본 발명은 식용피 유래 단일 성분인 lucidenal 및 echinochlorin B 을 유효성분으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학저 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 식용피 유래의 lucidenal 및 echinochlorin B 는 암세포주에 세포 독성을 나타내며, 자가포식작용 저해제인 chloroquine 또는 LY294002 와 동시에 처리하는 경우 세포 독성을 증가시킬 수 있으므로, 암 예방 또는 치료용 약물, 식품 조성물 및 항암용 어쥬번트로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

식용피 유래 성분을 포함하는 항암용 조성물{Anticancer composition comprising element from edible Barnyard Millets}

본 발명은 식용피 유래 단일 성분인 lucidenal 및 G8-1(echinochlorin B) 을 유효성분으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학저 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.

암 발생의 근본적인 원인은 세포 내 세포주기조절 혹은 세포자살기전의 결함에 의해 초래되는 연속적인 분열증식이다. 이러한 조절되지 않는 연속적인 분열증식능 이외에도 암세포는 자가포식작용(autophagy)능이 증진되어 있는 특징이 있음이 최근의 연구에서 밝혀지고 있다. 자가포식작용은 이중막의 자가포식소체(autophagosomes)의 형성을 통해 세포 내 불필요한 혹은 변성단백질과 같은 기능장애를 일으킨 세포 내 구성성분들을 격리시키고, 이를 리소좀(lysosome)과 융합하여 단일막의 autolysosome을 생성시키는 과정으로 진행되는 일종의 분해대사공정으로 알려져 있다. 최근 연구보고들에 의하면, 종양세포는 정상세포에 비해 자가포식능이 증가되어 있어서, 증가된 자가포식능을 통해 영양원 결핍조건 등과 같은 불리한 조건하에서도 생존을 잘할 수 있는 것으로 알려졌다. 또한 종양세포는 화학요법치료에 수반되는 세포 스트레스에 반응하여 자가포식작용을 활성화시키고 자가포식작용을 통해 항암치료제의 세포독성에 대해 사멸되지 않고 생존하는 내성을 나타낼 수 있으므로, 자가포식작용의 억제가 종양세포에 대한 화학요법제의 항암작용을 가속화시키는 효과적인 수단으로 대두되었다.

한편 다양한 항암제가 종양세포에 대해 에폽토시스(apoptosis)와 함께 자가포식작용을 유도하는 것으로 보고되었다. 그러나 항암제의 처리에 수반되는 암세포의 자가포식작용의 활성화가 어떻게 종양세포의 항암제 내성에 기여하는지는 항암제의 종류에 따라 그 메카니즘이 달라질 것으로 기대된다. 대체로 정상세포에 비해 암세포에서 더 증진되어 있는 자가포식작용을 저해하는 자가포식작용 저해제와 암세포 독성을 지닌 항암제를 암세포에 동시처리하면 에폽토시스(apoptosis)에 의한 암세포의 사멸을 훨씬 더 촉진시킬 수 있는 것으로 보고되고 있다. 따라서 암세포에 단독으로 처리할 경우에 비해, 자가포식작용 저해제와 함께 복합적으로 처리할 경우에 암세포의 사멸을 훨씬 효과적으로 유도할 수 있는 신규 화합물들의 발굴 및 규명은 항암제 개발의 새로운 지평을 여는 긍정적인 시도로 인식되고 있다.

이와 관련하여 여러가지 식물 유래의 신규 화합물에 관하여 연구가 진행되고 있으나, 식용피 유래의 단일 화합물의 유용성 및 질병 치료 효과, 특히 항암 효과에 대해서는 많이 연구된 바 없다.

본 발명자들은 식용식물 유래의 항암 물질을 연구하던 중, 식용피 유래의 단일 성분인 lucidenal 및 echinochlorin B 가 우수한 암 예방 또는 치료 효과를 나타냄을 확인하였으며, 이를 구성으로 하는 신규한 암 예방 또는 치료용 조성물, 식품 조성물 및 항암용 어쥬번트를 제공하고자 한다.

본 발명은 루시데날(lucidenal) 또는 G8-1(echinochlorin B)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 루시데날(lucidenal) 또는 G8-1(echinochlorin B)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 루시데날(lucidenal) 또는 G8-1(echinochlorin B)을 포함하는 항암용 어쥬번트를 제공한다.
또한 본 발명은 에키노클로린 비(echinochlorin B)를 유효성분으로 함유하는 세포사멸(apoptosis) 유도용 시약 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 식용피 유래의 루시데날(lucidenal) 또는 G8-1(echinochlorin B)은 암세포주에 세포 독성을 나타내며, 자가포식작용 저해제인 chloroquine 또는 LY294002 와 동시에 처리하는 경우 세포 독성을 증가시킬 수 있으므로, 암 예방 또는 치료용 약물, 식품 조성물 및 항암용 어쥬번트로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 식용피 밀양3호의 80% EtOH 추출물의 유기용매 분획 방법을 나타낸 도이다.
도 2 식용피 유래 단일 물질의 분자구조 및 분자량을 나타낸 도이다.
도 3은 식용피 유래 단일물질의 인체 혈액암 세포주 Jurkat T 세포에 대한 세포독성 및 자가포식작용 저해제인 LY294002 혹은 chloroquine의 세포독성에 미치는 각 단일물질의 영향을 나타낸 도이다.
도 4는 인체 급성백혈병 세포주 Jurkat T 세포에 있어서 자가포식작용 저해제인 chloroquine 및 LY294002 처리에 위한 apoptotic sub-G1 세포 (A) 및 미토콘드리아 막전위 손실 (B)에 미치는 식용피 유래 단일물질 lucidenal의 시너지 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 Jurkat T 세포주 (J/Neo 및 J/Bcl-xL)에 있어서 식용피 유래 단일물질 lucidenal의 세포독성 (A), 에폽토시스 유도 및 세포주기에 있어서의 G₂/M-arrest 유도 활성 (B)을 나타낸 도이다.
도 6은 Jurkat T 세포주 (J/Neo 및 J/Bcl-xL)에 있어서 식용피 유래 단일물질 lucidenal의 에폽토시스 유도활성 (A) 및 세포 크기에 미치는 영향 (B)을 나타낸 도이다.
도 7은 Jurkat T 세포주 (J/Neo 및 J/Bcl-xL)에 있어서 식용피 유래 단일물질 lucidenal의 처리에 의한 미토콘드리아 막전위 손실 유도 (A) 및 Bak 활성화 (B)를 나타낸 도이다.
도 8은 인체 급성백혈병 세포주 Jurkat T 세포에 있어서 자가포식작용 저해제인 LY294002 및 chloroquine 처리에 의한 apoptotic sub-G1 세포 (A) 및 미토콘드리아 막전위 손실 (B)에 미치는 식용피 유래 단일물질 G8-1(echinochlorin B)의 시너지 효과를 나타낸 도이다.
도 9는 인체 급성백혈병 Jurkat T 세포주 (J/Neo 및 J/Bcl-xL)에 있어서 식용피 유래 단일물질 G8-1(echinochlorin B) 처리에 의한 에폽토시스 유도 (A) 및 미토콘드리아 막전위 손실 (B)을 나타낸 도이다.
도 10은 Jurkat T 세포주 (J/Neo 및 J/Bcl-xL)에 있어서 식용피 유래 단일물질 G8-1 (echinochlorin B)의 에폽토시스 유도활성 (A) 및 세포 크기의 변화에 미치는 영향 (B)을 나타낸 도이다.

본 발명은 루시데날(lucidenal) 또는 G8-1(echinochlorin B)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

상기 루시데날(lucidenal) 또는 G8-1(echinochlorin B)은 단일 화합물 또는 식물로부터 분리 및 정제된 물질일 수 있으며, 바람직하게는 식용피로부터 분리 정제된 단일 물질일 수 있다.

또한 본 발명은 루시데날(lucidenal) 또는 G8-1(echinochlorin B)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 루시데날(lucidenal) 또는 G8-1(echinochlorin B)을 포함하는 항암용 어쥬번트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 상기 항암용 어쥬번트란 항암제와 함께, 동시에, 병용, 또는 연속해서 투여하는 경우 항암제의 효과를 증가시킬 수 있는 물질을 말하며, 바람직하게는 자가포식작용 저해제인 chloroquine 또는 LY294002 와 동시에 처리하는 경우 세포 독성을 증가시킬 수 있는 물질을 말한다.
또한 본 발명은 에키노클로린 비(echinochlorin B)를 유효성분으로 함유하는 세포사멸(apoptosis) 유도용 시약 조성물에 관한 것이다.
상기 세포사멸(apoptosis) 유도용 시약 조성물은 클로로퀸(chloroquine) 또는 LY294002를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 식염수, PBS(phosphate buffered saline) 또는 배지 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명에서 용어 식품은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 식품, 건강기능 식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명의 식품 조성물은 각종 식품류, 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민 복합체, 각종 건강보조 식품류 등에 첨가될 수 있으며, 분말, 과립, 정제, 환제, 캡슐 또는 음료의 형태로 사용될 수 있다.

또한 상기 본 발명의 식품 조성물은 식품학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 lucidenal 및 G8-1(echinochlorin B)을 함유하는 이외에는 특별한 제한이 없으며, 예를 들어, 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본 발명의 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함할 수 있다. 이 외에도 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 증진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

또한, 상기 식품에 있어서, 본원 발명의 lucidenal 및 G8-1(echinochlorin B)의 양은 전체 식품 중량의 0.00001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 식품이 음료인 경우에는 식품 전체의 부피 100 ml 를 기준으로 0.001 g 내지 50 g, 바람직하게는 0.01 g 내지 10 g의 비율로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 제조예 및 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 제조예 및 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 식용피 밀양 3호 유래 단일 물질의 분리

식용피 밀양3호의 80%(v/v) 에탄올 추출물을 확보하고 회전농축기(rotary evaporator)로 농축한 후 물에 다시 녹였으며, 이를 n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate 및 n-butanol로서 단계별로 추출하여 분획하였다. 이의 분획 방법을 도 1에 나타내었다.

식용피 밀양3호의 종자로부터 유기용매 추출 및 분획은 다음과 같이 수행하였다. 즉, 식용피 밀양3호 종자를 Blender 7012 (Dynamics Corporation, USA)로 10분간 파쇄하여 80% 에탄올과 섞은 다음 80℃ 환류냉각장치를 사용하여 추출하였다. 각각의 잡곡의 계통분획과정은 다음과 같다. 종자 250 g을 80℃에서 80% 에탄올 (250 ml x 3 회, 1 회에 3 시간씩 추출)로 추출하고 그 추출액을 10,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액으로서 회수한 다음 회전농축기를 이용하여 감압 농축, 건조하여 80% 에탄올 추출물을 얻었다. 활성측정용으로 80% 에탄올 추출물을 소량 남기고 나머지를 물 200 ml에 녹인 다음, n-hexane (200 ml x 3 회)으로 추출하고 농축하여 hexane 분획을 얻었다. 이어서 수층을 methylene chloride (200 ml x 3 회)로 추출하였으며, methylene chloride 층을 농축하여 methylene chloride 분획을 얻었다. 이어서 수층을 ethyl acetate (200 ml x 3 회)로 추출하고 추출액을 농축하여 ethyl acetate 분획을 얻었다. 이어서 수층을 butanol (200 ml x 3 회)로 추출하여 농축하여 butanol 분획을 얻었다. 최종적으로 남은 수층 또한 농축하여 수층분획을 얻었다. 식용피 밀양 3호의 80% 에탄올 추출물과 유기용매 분획물의 회수량을 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

이어서 각 유기용매 분획들로부터 크로마토그래피 및 기기분석을 통해 단일 물질을 분리 정제하였으며, 식용피 밀양 3호로부터 분리 정제된 단일물질을 하기 표 2에 나타내었으며, 이의 분자구조 및 분자량을 도 2에 나타내었다.

[표 2]

실시예 2. 식용피 유래 단일 물질의 암세포 독성 확인

인체 급성백혈병혈액암 세포주 (human acute leukemia Jurkat T cells)에 대하여 식용피 유래단일물질의 항암활성을 조사하기 위해, 각 단일물질을 25 μg/ml의 농도로써 Jurkat T 세포에 처리하거나 자가포식작용 저해제인 chloroquine (25 μM) 혹은 LY294002 (15 μM)와 함께 각 단일물질을 동시 처리할 때 세포독성이 나타나는 단일물질을 분석하였다.

이때 세포독성은 3-(4,5-dimethythaizol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) MTT 분석을 통한 cell viability를 측정하여 조사하였다. 먼저 96-well plate의 각 well에 7.5x10⁴/well 의 세포를 96 well plate에서 32시간 CO₂ incubator, 37℃에서 배양한 후, MTT용액 (1.1 mg/ml PBS)을 모든 well에 50μl씩 가하고 다시 4 시간 더 배양하였다. 이어서 배양을 종료하고 96-well plate를 2,300 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 생성된 formazan 결정을 pellet으로 가라앉힌 후, 상등액 200μl를 제거하였다. 이어서 150μl의 DMSO를 가하고 formazan 결정을 용해시킨 다음, micro plate reader를 이용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. Cell viability에 대한 실험결과 분석은 실험군의 평균 OD값을 구하여 대조군의 평균 OD값에 대한 백분율 값을 산출하고 이를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 단일물질 5번 (lucidenal)과 단일물질 9번 (echinochlorin B)의 경우는 25μg/ml의 농도에서는 chloroquine 및 LY294002의 존재유무에 상관없이 매우 강력한 암세포독성을 나타내었다.

실시예 3. 자가포식작용 저해제인 chloroquine 및 LY294002 의 암세포 독성에 미치는 식용피 유래 단일물질 lucidenal 의 시너지 효과

자가포식작용 저해제인 chloroquine 및 LY294002의 암세포 독성에 미치는 식용피 유래 단일물질 lucidenal의 시너지 효과를 조사하기 위해, Jurkat T 세포를 0.5x10⁶/ml의 농도로 RPMI160 + 10% Fetal Bovine Serum + 100μg/ml gentamycin이 함유된 배지에 현탁 한 후 chloroquine (15 mM) 혹은 LY294002 (25 mM)를 가하여 24시간 배양하면서 lucidenal을 5 mg/ml의 낮은 농도로 첨가하여 lucidenal의 첨가에 의해 증진되는 chloroquine 및 LY294002의 암세포 독성을 유세포 분석 (flow cytometry)으로 측정하였다. 유세포 분석을 위해, 먼저 세포 (~1x10⁶cells)를 70% 에탄올에 현탁하여 4℃에서 1시간 고정하였다.

고정된 세포를 50 ㎍/ml 농도의 RNase A 용액 250 ㎕에 현탁하여 37℃에서 30 분간 처리하여 세포내 RNA를 제거하고, 50㎍/ml의 propidium iodide/1.12% sodium citrate buffer (pH 8.45) 용액 250 ㎕를 가해 실온에서 20분간 세포 내 DNA를 염색하였다 [Kim et al., 1992]. 이를 Flow cytometer로 분석하여 각 세포내 염색된 DNA의 함량을 기준으로 apoptotic sub-G₁ 및 G₀/G₁, S, G₂/M phase 등의 세포주기 분포를 분석하였으며, 그 결과를 도 4A에 나타내었다.

도 4A에 나타난 바와 같이, chloroquine (15 mM) 혹은 LY294002 (25 mM)의 단독처리에 의해서는 Jurkat T 세포 (J/Neo cells)의 apoptotic sub-G₁ 세포의 비율이 각각 4.1%와 2.9%정도로 낮게 나타났다. 그러나 lucidenal을 5 mg/ml 농도로 동시 처리하였을 경우에는 apoptotic sub-G₁ 세포의 비율이 23.0% 과 18.1%로 현저히 상승되었다. 아울러 이와 같은 조건에서 세포 내에서 에폽토시스 유도에 관련되어 야기되는 미토콘드리아 막전위 손실 (mitochondria membrane potential loss)의 정도를 조사하기 위해, Jurkat T 세포의 mitochondrial membrane potential의 변화를 Flow cytometry로 분석하였다. 이를 위해, 먼저 회수한 세포 (~0.5x10⁶)를 PBS에 현탁하고 50 nM 3,3'dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC₆)로 37℃에서 1 분간 염색한 후, flow cytometry로 분석하였으며 그 결과를 도 4B에 나타내었다.

도 4B에 나타낸 바와 같이, LY294002 (15 mM) 혹은 chloroquine (25 mM)의 단독처리에 의해 유도되는 Jurkat T 세포 (J/Neo cells)의 미토콘드리아 막전위 손실은 각각 4.2%와 2.6%정도로 낮게 나타났으나, lucidenal을 5 mg/ml 농도로 동시 처리하였을 경우에는 미토콘드리아 막전위 손실이 64.9%와 42.4%로 현저히 상승되었다. 이러한 결과는 식용피 유래의 단일물질인 lucidenal은 자가포식작용 저해제의 암세포독성을 현저히 향상시키는 시너지 효능이 있으며 이를 통해 항암제로 활용될 수 있음을 시사한다.

실시예 4. lucidenal 의 인체 급성백혈병 세포주인 Jurkat T 세포에 대한 항암활성 및 기전

인체 급성 백혈병 세포주 Jurkat T 세포주에 대한 lucidenal의 항암활성의 기전을 규명하기 위해, Jurkat T 세포에 empty vector를 stable transfection 시킨 J/Neo 세포주와 J/ Bcl - xL gene의 expression vector을 stable transfection시킨 J/Bcl-xL 세포주를 대상으로 5.0, 7.5 및 10μg/ml 농도의 lucidenal을 처리하고 24시간 배양한 후 MTT assay 및 유세포 분석 (Flow cytometry) 으로 항암활성을 조사하였으며 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같이, lucidenal은 J/Neo 세포와 J/Bcl-xL 세포에 대해 농도 의존적으로 세포생존율을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나 유세포분석의 결과는 J/Neo 세포의 경우 lucidenal 처리에 의해 농도의존적으로 에폽토시스가 유도되지만 J/Bcl-xL 의 경우는 에폽토시스 유도가 관찰되지 않았으며 세포주기의 G₂/M-arrest가 농도의존적으로 일어남을 보여주었다. 이러한 결과는 인체 급성백혈병 세포주 Jurkat T 세포에 대하여 lucidenal (5.0~10 μg/ml)이 에폽토시스 및 G₂/M arrest 유도를 통해 항암활성을 나타냄을 보여준다.

또한 도 6에 나타낸 바와 같이, FITC-Annexin V and PI staining의 분석 결과를 통해서도 J/Neo 세포의 경우 lucidenal 처리에 의해 농도 의존적으로 에폽토시스가 유도됨을 확인하였으며 J/Bcl-xL 세포의 경우는 Bcl-xL의 과발현에 의해 완전히 에폽토시스의 유도가 차단됨을 확인하였다. 한편 lucidenal 처리에 수반되는 J/Neo 세포의 에폽토시스 유도와 함께 세포크기의 변화를 forward scatter (FSC)로 분석한 결과, 세포의 크기는 lucidenal 처리 이후에 감소되는 것으로 나타났다. 에폽토시스가 진행 중인 세포의 크기는 감소하는데 반해 necrosis가 일어나는 세포의 경우는 세포의 크기가 팽윤되어 커지는 특징이 있으므로, 이러한 연구결과는 lucidenal처리에 의해 유도되는 에폽토시스에는 necrosis가 전혀 수반되지 않음을 확인해 준다.

J/neo 세포와 J/Bcl-xL 세포에 있어서 lucidenal 처리에 의해 유도되는 에폽토시스 유도기전을 규명하기 위해서, lucidenal 처리에 의해 농도 의존적으로 에폽토시스 유도와 관련된 미토콘드리아 막전위 손실이 야기되는지를 DiOC₆ staining 및 유세포분석으로 조사하였고 또한 농도 의존적으로 미토콘드리아 막전위 손실의 원인이 되는 Bak activation이 유도되는지를 active Bak-specific antibody를 사용하여 immunofluorescence labeling 한 후 유세포분석으로 조사하였으며 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7A 및 7B에 나타낸 바와 같이, J/Neo 세포에서는 미토콘드리아 막전위 손실과 Bak activation이 lucidenal 처리에 의해 농도의존적으로 유도됨을 확인하였다. 이상의 연구 결과는, 식용피 유래의 단일물질 lucidenal은 인체 급성백혈병 세포주 Jurkat T 세포에 대해 에폽토시스 유도 및 세포주기의 G₂/M-arrest를 통해 세포독성을 발휘할 수있음을 보여준다. 아울러 lucidenal에 의해 유도되는 Jurkat T 세포의 에폽토시스는 pro-apoptotic Bcl-2 family member인 Bak activation 및 이에 수반되는 미토콘드리아 막전위 손상에 의해 야기됨과 lucidenal 처리에 의해 유도되는 에폽토시스에는 necrosis가 수반되지 않을 보여준다.

실시예 5. lucidenal 의 인체 급성백혈병 세포주인 Jurkat T 세포에 대한 항암활성 및 기전

자가포식작용 저해제인 chloroquine 및 LY294002의 암세포 독성에 미치는 식용피 유래 단일물질 G8-1 (echinochlorin B)의 시너지 효과를 조사하기 위해, Jurkat T 세포를 0.5x10⁶/ml의 농도로 RPMI160 + 10% Fetal Bovine Serum + 100 mg/ml gentamycin이 함유된 배지에 현탁한 후 chloroquine (15μM) 혹은 LY294002 (25μM)를 가하여 24시간 배양하면서 G8-1 (echinochlorin B)을 10μg/ml의 낮은 농도로 첨가하여 lucidenal의 첨가에 의해 증진되는 chloroquine 및 LY294002의 암세포 독성을 유세포 분석 (flow cytometry)으로 측정하였다. 유세포 분석을 위해, 먼저 세포 (~1x10⁶cells)를 70% 에탄올에 현탁하여 4℃에서 1시간 고정하였다. 고정된 세포를 50 ㎍/ml 농도의 RNase A 용액 250 ㎕에 현탁하여 37℃에서 30 분간 처리하여 세포내 RNA를 제거하고, 50㎍/ml의 propidium iodide/1.12% sodium citrate buffer (pH 8.45) 용액 250 ㎕를 가해 실온에서 20분간 세포 내 DNA를 염색하였다. 이를 Flow cytometer로 분석하여 각 세포내 염색된 DNA의 함량을 기준으로 apoptotic sub-G₁ 및 G₀/G₁, S, G₂/M phase 등의 세포주기 분포를 분석하였으며, 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8A에 나타난 바와 같이, LY294002 (15μM) 혹은 chloroquine (25μM)의 단독처리에 의해서는 Jurkat T 세포 (J/Neo cells)의 apoptotic sub-G₁ 세포의 비율이 각각 6.3%와 4.8%정도로 낮게 나타났다. 그러나 G8-1 (echinochlorin B)을 10 μg/ml 농도로 동시 처리하였을 경우에는 apoptotic sub-G1 세포의 비율이 31.4% 과 12.7%로 현저히 상승되었다.

아울러 이와 같은 조건에서 세포 내에서 에폽토시스 유도에 관련되어 야기되는 미토콘드리아 막전위 손실 (mitochondria membrane potential loss)의 정도를 조사하기 위해, Jurkat T 세포의 mitochondrial membrane potential의 변화를 Flow cytometry로 분석하였다. 이를 위해, 먼저 회수한 세포 (~0.5x10⁶)를 PBS에 현탁하고 50 nM 3,3'dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC₆)로 37℃에서 1 분간 염색한 후, flow cytometry로 분석하였다.

도 8B에 나타난 바와 같이, chloroquine (15 mM) 혹은 LY294002 (25 mM)의 단독처리에 의해 유도되는 Jurkat T 세포 (J/Neo cells)의 미토콘드리아 막전위 손실은 각각 4.9%와 3.2%정도로 낮게 나타났으나, lucidenal G8-1 (echinochlorin B)을 10 mg/ml 농도로 동시 처리하였을 경우에는 미토콘드리아 막전위 손실이 31.8%와 10.7%로 현저히 상승되었다.

이러한 결과는 식용피 유래의 단일물질인 G8-1 (echinochlorin B)은 자가포식작용 저해제의 암세포독성을 현저히 향상시키는 시너지 효능이 있으며 이를 통해 항암제로 활용될 수 있는 잠재능이 있음을 시사한다.

실시예 6. 식용피 유래 단일물질 G8 -1 ( echinochlorin B)의 인체 급성백혈병 세포주인 Jurkat T 세포에 대한 항암활성 및 기전

인체 급성 백혈병 세포주 Jurkat T 세포주에 대한 G8-1 (echinochlorin B)의 항암활성의 기전을 규명하기 위해, Jurkat T 세포에 empty vector를 stable transfection 시킨 J/Neo 세포주와 J/ Bcl - xL gene의 expression vector을 stable transfection시킨 J/Bcl-xL 세포주를 대상으로 10 및 20μg/ml 농도의 G8-1 (echinochlorin B)을 처리하고 24시간 배양한 후 MTT assay 및 유세포 분석 (Flow cytometry) 으로 항암활성을 조사하였다. Fig. 9A and 9B에서 나타난 바와 같이, G8-1 (echinochlorin B)은 J/Neo 세포와 J/Bcl-xL 세포에 대해 농도 의존적으로 세포생존율을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나 유세포분석의 결과는 J/Neo 세포의 경우 G8-1 (echinochlorin B)처리에 의해 농도의존적으로 apoptosis가 유도되지만 J/Bcl-xL 의 경우는 apoptosis 유도가 관찰되지 않았으며 세포주기의 G₂/M-arrest가 농도의존적으로 일어남을 보여주었다. 이러한 결과는 인체 급성백혈병 세포주 Jurkat T 세포에 대하여 G8-1 (echinochlorin B) (10~20μg/ml)이 에폽토시스 및 G₂/M arrest 유도를 통해 항암활성을 나타냄을 보여준다.

또한 도 10에서 나타난 바와 같이, FITC-Annexin V and PI staining의 분석 결과를 통해서도 J/Neo 세포의 경우 G8-1 (echinochlorin B)처리에 의해 농도 의존적으로 에폽토시스가 유도됨을 확인하였으며 J/Bcl-xL 세포의 경우는 Bcl-xL의 과발현에 의해 완전히 에폽토시스의 유도가 차단됨을 확인하였다. 한편 G8-1 (echinochlorin B)처리에의해 유도되는 J/Neo 세포의 에폽토시스와 함께 세포 크기의 변화를 forward scatter (FSC)로 분석한 하였다. 그결과 세포의 크기는 G8-1 (echinochlorin B) 처리 이후에 감소되는 것으로 나타났다. 에폽토시스가 진행 중인 세포는 그 크기는 감소하는데 반해 necrosis가 진행중인 세포의 경우는 세포의 크기가 팽윤되어 커지는 특징이 있는 것으로 알려져 있다 [Okada and Mak, 2004]. 따라서 이러한 연구결과는 G8-1 (echinochlorin B)처리에 의해 유도되는 에폽토시스에는 necrosis가 전혀 수반되지 않음을 보여주는 것이다.

제제예 1. 의약품의 제조

1.1 산제의 제조

lucidenal 및 echinochlorin B 100mg

유당 100mg

탈크 10mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1.2 정제의 제조

lucidenal 및 echinochlorin B 100mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1.3 캡슐제의 제조

lucidenal 및 echinochlorin B 100mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 정제를 제조한다.

1.4 주사제의 제조

lucidenal 및 echinochlorin B 100mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1.5 액제의 제조

lucidenal 및 echinochlorin B 100mg

설탕 20g

이성화당 20g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 1,00ml로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 2. 식품의 제조

lucidenal 및 echinochlorin B 100mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조(예, 영양캔디 등)에 사용할 수 있다.

제제예 3. 음료의 제조

lucidenal 및 echinochlorin B 100mg

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강기능성 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

에키노클로린 비(echinochlorin B)를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 클로로퀸(chloroquine) 또는 LY294002를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암은 백혈병인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
에키노클로린 비(echinochlorin B)를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품.
에키노클로린 비(echinochlorin B)를 유효성분으로 함유하는 세포사멸(apoptosis) 유도용 시약 조성물.
제5항에 있어서, 클로로퀸(chloroquine) 또는 LY294002를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.