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KR20230175235A - 17β-하이드록시스테로이드 탈수소효소 유형 13을 표적화하는 siRNA 및 siRNA 접합체 - Google Patents

17β-하이드록시스테로이드 탈수소효소 유형 13을 표적화하는 siRNA 및 siRNA 접합체 Download PDF

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KR20230175235A
KR20230175235A KR1020237039205A KR20237039205A KR20230175235A KR 20230175235 A KR20230175235 A KR 20230175235A KR 1020237039205 A KR1020237039205 A KR 1020237039205A KR 20237039205 A KR20237039205 A KR 20237039205A KR 20230175235 A KR20230175235 A KR 20230175235A
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KR
South Korea
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sirna
seq
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antisense strand
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Pending
Application number
KR1020237039205A
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English (en)
Inventor
진위 후앙
옌펀 후앙
민 루오
팡 장
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투오지에 바이오텍 (상하이) 컴퍼니 리미티드
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Publication date
Application filed by 투오지에 바이오텍 (상하이) 컴퍼니 리미티드 filed Critical 투오지에 바이오텍 (상하이) 컴퍼니 리미티드
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Abstract

17β-하이드록시스테로이드 탈수소효소 유형 13을 표적화하는 siRNA 및 siRNA 접합체가 개시된다. 또한, siRNA를 함유하는 약학 조성물, 세포 또는 키트, 및 HSD17B13-관련 질병(예컨대 만성 섬유-염증성 간 질환)을 앓는 대상의 치료 및/또는 예방에 siRNA를 사용하는 방법이 개시된다.

Description

17β-하이드록시스테로이드 탈수소효소 유형 13을 표적화하는 siRNA 및 siRNA 접합체
본 발명은 2021년 4월 22일에 출원된 CN202110435243.8을 우선권 주장하고, 이는 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.
본 발명은 17β-하이드록시스테로이드 탈수소효소(degydrogenase) 유형 13을 표적화(targeting)하는 siRNA(HSD17B13) 및 siRNA 접합체(conjugate), 및 이의 용도에 관한 것이다.
HSD17B13은 17β-하이드록시스테로이드 탈수소효소(17β-HSD) 과의 구성원인 스테로이드 탈수소효소이다. 현재, 17β-HSD 과의 14개의 구성원이 포유동물에서 보고되어 있다. 스테로이드 호르몬, 프로스타글란딘, 지질, 헤테로비오틴 및 레티노이드와 관련된 효소들과 마찬가지로, 상기 14개의 구성원은 상이한 조직 분포, 아세포 위치(subcell localization) 및 기능을 갖고, 신체의 일련의 생리학적 및 병태생리학적 과정, 예컨대 생식, 발달 및 비만에 주로 관여한다.
단순 지방간을 앓는 인간 대상에서, HSD17B13 단백질 발현이 지방간 지방구(lipid droplet, LD)에서 상당히 상향조절되는 것이 밝혀졌고, LD의 표면에 우세하게 위치하는 것으로 판단된다. HSD17B13 단백질이 과발현될 때, 이는 간세포 내의 LD의 개수 및 크기의 증가 및 간의 지방생성 및 트라이글리세리드(TG) 함량의 상당한 증가를 야기한다(문헌[Su W, Wang Y, Jia X, et al., Comparative proteomic study reveals 17β-HSD13 as a pathogenic protein in nonalcoholic fatty liver disease [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111 (31): 11437]).
최근의 연구는 HSD17B13 유전자 발현이 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 및 비알코올성 지방간염(NASH)의 발병기전에 중요한 열할을 하는 것을 추가로 보였다. HSD17B13(rs72613567:TA) 기능-손실 돌연변이(loss-of-function mutant)는 글루탐산 피루브산 트랜스아미나제(ALT) 및 글루탐산 옥살로아세트산 트랜스아미나제(AST)의 수준을 감소시키는 한편, 지방간 질환을 앓는 환자에서 염증 및 간 손상을 감소시킨다(문헌[Abul-Husn N S, Cheng X, Li A H, et al., A Protein-Truncating HSD17B13 Variant and Protection from Chronic Liver Disease. [J]. N Engl J Med, 2018, 378 (12): 1096-1106]).
NAFLD는 비만, 인슐린 저항성, 2형 당뇨병, 고혈압증, 고지혈증 및 대사 증후군과 관련되어 있다. NAFLD를 앓는 환자는 미국 내 총 인구의 대략 25%를 차지하고, 이 중 거의 1/4은 간 염증, 간세포 손상 및 간 섬유증을 특징으로 하는 NASH로 진행되고 있다. HSD17B13(rs72613567:TA) 돌연변이 보유체에서, 몇몇 주요 염증 인자의 발현 수준이 감소되는 것, 특히 인터루킨(IL-6)의 혈장 농도가 비-보유체에서보다 상당히 더 낮은 것이 밝혀졌고, 한편, 환자에서, 혈청 ALT 및 소아 NAFLD 섬유증 지수 둘 다가 감소하여, HSD17B13 기능-손실 돌연변이가 NASH 및 진행성 간 손상의 위험을 감소시킬 수 있음을 입증하였다(문헌[Luukkonen P K, Tukiainen T, Juuti A, et al., Hydroxysteroid 17-β dehydrogenase 13 variant increases phospholipids and protects against fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease [J]. JCI Insight, 2020, 5 (5)]).
현재, NASH에 대한 임상적으로 효과적인 치료는 없다. 따라서, HSD17B13에 대한 연구 결과는 NAFLD 및 관련된 간 질환의 치료에 대한 조기의 경각심 및 새로운 치료 전략을 제공한다.
RNA 간섭(siRNA)은 유전자 발현을 침묵시키는 효과적인 방식이고, 이는 전사 후 조절 메커니즘을 통해 표적 유전자의 mRNA를 특이적으로 퇴행시킬 수 있다.
만족스럽게도, 인간에서 질환과 관련된 단백질의 약 80% 이상은, 이들이 통상적인 소분자 약물 및 생체거대분자 제형에 의해 표적화될 수 없으므로 비-약물가능(non-druggable) 단백질이다. NAFLD 진행 동안 HSD17B13의 과발현은 지방간을 유도하고, 간 내 지방의 축적을 증가시키고, 간 TG의 수준을 증가시킨다. HSD17B13에 의해 전사되는 mRNA 생성물에 대해 siRNA를 설계함으로써, 기능 손실을 야기하는 HSD17B13에서의 자연적으로 발생하는 유전자적 변경이 모방될 수 있고, 이는 NAFLD가 NASH로 추가 진행되는 것을 예방하고 NASH를 앓는 환자에서 간경변 및 간암으로 추가 발달을 예방함으로써, 치료 목적을 성취한다.
본 발명은 HSD17B13을 표적화하는 siRNA를 제공한다.
일부 양태에서, HSD17B13 표적 유전자(Genbank accession 번호 NM_178135.5)를 표적화하는 siRNA가 제공된다.
일부 양태에서, 본 발명은 이중가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA을 제공하고, 상기 센스 가닥은 15개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, NM_178135.5의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드로 상이하고, 상기 안티센스 가닥은 15개 이상의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고 NM_178135.5에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드로 상이하다.
일부 양태에서, 본 발명은 이중가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA를 제공하고, 상기 센스 가닥은 15개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드로 상이하고, 상기 안티센스 가닥은 15개 이상의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드로 상이하다.
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA의 센스 가닥은 15개 이상의(예컨대 16, 17, 18, 19, 20, 21, 및 22) 인접 뉴클레오티드를 포함하고 서열번호 3 내지 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드로 상이하다.
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA의 안티센스 가닥은 15개 이상(예컨대 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 및 24개)의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고 서열번호 25 내지 서열번호 46의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드로 상이하다.
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA의 센스 가닥은 19개의 인접 뉴클레오티드이거나 이를 포함하고 서열번호 3 내지 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드로, 일부 양태에서, 1개 이하의 뉴클레오티드로 상이하고; 일부 양태에서, 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에서의 위치 1은 서열번호 3 내지 서열번호 24 중 어느 하나의 것과 동일하거나 상이하다.
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA의 안티센스 가닥은 21개의 인접 뉴클레오티드이거나 이를 포함하고 서열번호 25 내지 서열번호 46의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드로, 일부 양태에서, 1개 이하의 뉴클레오티드로, 상이하고 일부 양태에서, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에서의 위치 1은 서열번호 25 내지 서열번호 46 중 어느 하나의 것과 동일하거나 상이하다.
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA의 센스 가닥은 서열번호 3 내지 서열번호 24 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열이거나 이를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA의 안티센스 가닥은 서열번호 25 내지 서열번호 46 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열이거나 이를 포함한다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 이의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8) 중 하나 이상에서 하기 화학식 (I)의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함한다:
(I)
상기 식에서, Y는 O, NH, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X은 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5, 및 NH-CO로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4, R4' 및 R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
J2는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 0, 1 또는 2이고;
m은 0, 1 또는 2이고;
s는 0 또는 1이고;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)pR6으로 이루어진 군으로부터 선택되고, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, p는 1, 2 또는 3이고;
Q1은 이고, Q2는 R2이거나; Q1은 R2이고, Q2는 이고;
[상기 식에서,
R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일 및 (CH2)qR7로 이루어진 군으로부터 선택되고, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, q는 1, 2 또는 3이고;
J1은 H 또는 C1-C6 알킬이고;
R2는 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)rR8로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, r은 1, 2 또는 3이고;
임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성한다];
B는 염기이고;
상기 식에서, 화학식 (I)의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은
이 아니다.
일부 양태에서, X는 NH-CO이고, R1은 H가 아니다.
일부 양태에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 이의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8) 중 하나 이상에서 하기 화학식 (I-1)의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함한다:
(화학식 I-1)
상기 식에서, Y는 O, NH, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X은 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5, 및 NH-CO로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4, R4' 및 R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 0, 1 또는 2이고; m은 0, 1 또는 2이고; s는 0 또는 1이고;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)pR6으로 이루어진 군으로부터 선택되고, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, p는 1, 2 또는 3이고;
R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일 및 (CH2)qR7로 이루어진 군으로부터 선택되고, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, q는 1, 2 또는 3이고;
R2는 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)rR8로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, r은 1, 2 또는 3이고;
임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하고;
B는 화학식 (I)에 정의된 바와 같다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 이의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8) 중 하나 이상에서 하기 화학식 (I-2)의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함한다:
(I-2)
상기 식에서,
Y는 O, NH, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X은 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5, 및 NH-CO로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4, R4' 및 R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 0, 1 또는 2이고; m은 0, 1 또는 2이고; s는 0 또는 1이고;
J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)pR6으로 이루어진 군으로부터 선택되고, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, p는 1, 2 또는 3이고;
R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일 및 (CH2)qR7로 이루어진 군으로부터 선택되고, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, q는 1, 2 또는 3이고;
R2는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노, 및 (CH2)rR8로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, r은 1, 2 또는 3이고;
임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하고;
B는 화학식 (I)에 정의된 바와 같다.
일부 양태에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 전술한 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 가 아니다.
일부 양태에서, 각각의 X은 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5, 및 NH-CO로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4, R4' 및 R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이고;
n은 0, 1 또는 2이고; m은 0, 1 또는 2이고; s는 0 또는 1이고;
J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이고;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C3 알킬, C1-C3 알콕시, C2-C4 알켄일, C2-C4 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노, 및 (CH2)pR6로 이루어진 군으로부터 선택되고, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, p는 1, 2 또는 3이고;
R1은 H, C1-C3 알킬, C1-C3 알콕시, C2-C4 알켄일, C2-C4 알킨일, 및 (CH2)qR7로 이루어진 군으로부터 선택되고, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C4 알켄일, 및 C2-C4 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, q는 1, 2 또는 3이고;
R2는 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C3 알킬, C1-C3 알콕시, C2-C4 알켄일, C2-C4 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노, 및 (CH2)rR8로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C4 알켄일, 및 C2-C4 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, r은 1, 2 또는 3이고;
임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성한다.
B는 화학식 (I)에 정의된 바와 같다.
일부 양태에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 각각의 X은 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5, 및 NH-CO로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4, R4' 및 R5는 각각 독립적으로 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 또는 이소프로필이고;
n은 0, 1 또는 2이고; m은 0, 1 또는 2이고; s는 0 또는 1이고;
J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 메틸이고;
R3은 H, OH, F, Cl, NH2, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, 비닐, 알릴, 에틴일, 프로파르그일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-메틸아미노, -O-에틸아미노, 및 (CH2)pR6으로 이루어진 군으로부터 선택되고, R6은 OH, F, Cl, 메톡시, 에톡시, N3, 비닐, 알릴, 에틴일, 및 프로파르그일로 이루어진 군으로부터 선택되고, p는 1 또는 2이고;
R1은 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, 비닐, 알릴, 에틴일, 프로파르그일, 및 (CH2)qR7로 이루어진 군으로부터 선택되고, R7은 OH, F, Cl, 메톡시, 에톡시, N3, 비닐, 알릴, 에틴일, 및 프로파르그일로 이루어진 군으로부터 선택되고, q는 1 또는 2이고;
R2는 H, OH, F, Cl, NH2, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, 비닐, 알릴, 에틴일, 프로파르그일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-메틸아미노, -O-에틸아미노, 및 (CH2)rR8로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8은 OH, F, Cl, 메톡시, 에톡시, N3, 비닐, 알릴, 에틴일, 및 프로파르그일로 이루어진 군으로부터 선택되고, r은 1 또는 2이고;
임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성한다.
B는 화학식 (I)에 정의된 바와 같다.
일부 양태에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 화학식 (I-1)에서, Y는 O 또는 NH이고; 각각의 X은 독립적으로 NH-CO, CH2 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n는 0 또는 1이고; m은 0 또는 1이고; s는 0 또는 1이고;
J1 및 J2는 각각 독립적으로 H이고;
R1은 H, 메틸 및 CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 H, OH, NH2, 메틸 및 CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, OH, NH2, 메틸 및 CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하고;
B는 화학식 (I)에 정의된 바와 같다.
일부 양태에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 화학식 (I-2)에서, Y는 O 또는 NH이고; 각각의 X은 독립적으로 NH-CO, CH2 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n는 0 또는 1이고; m은 0 또는 1이고; s는 0 또는 1이고;
J1 및 J2는 각각 독립적으로 H이고;
R1은 H, 메틸 및 CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 H, 메틸 및 CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, OH, NH2, 메틸 및 CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하고;
일부 양태에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 화학식 (I)의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
,
상기 식에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 화학식 (I)의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
상기 식에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명은 이중가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA를 제공하고, 상기 센스 가닥은 15개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드로 상이하고; 안티센스 가닥은 15개 이상의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드로 상이하고; 대문자 C, G, U, 및 A는 뉴클레오티드의 성분이다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 이의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8) 중 하나 이상에서 하기 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함한다:
(I')
상기 식에서,
Y는 O, NH, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X은 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5, 및 NH-CO로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4, R4' 및 R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
J2는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 0, 1 또는 2이고; m은 0, 1 또는 2이고; s는 0 또는 1이고;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)pR6으로 이루어진 군으로부터 선택되고, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, p는 1, 2 또는 3이고;
Q1'은 이고, Q2'은 R2이고; 또는 Q1'은 R2이고, Q2'은 이고;
[상기 식에서,
R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일 및 (CH2)qR7로 이루어진 군으로부터 선택되고, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, q는 1, 2 또는 3이고;
J1은 H 또는 C1-C6 알킬이고;
R2는 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)rR8로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, r은 1, 2 또는 3이고;
임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성한다];
B는 염기이고;
M은 O 또는 S이고;
상기 식에서, 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 가 아니다.
일부 양태에서, X는 NH-CO이고, R1은 H가 아니다.
일부 양태에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 안티센스 가닥은 이의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8) 중 하나 이상에서 하기 화학식 (I'-1)의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함한다:
(I'-1)
상기 식에서,
Y는 O, NH, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X은 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5, 및 NH-CO로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4, R4' 및 R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 0, 1 또는 2이고; m은 0, 1 또는 2이고; s는 0 또는 1이고;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)pR6으로 이루어진 군으로부터 선택되고, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, p는 1, 2 또는 3이고;
R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일 및 (CH2)qR7로 이루어진 군으로부터 선택되고, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, q는 1, 2 또는 3이고;
R2는 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)rR8로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, r은 1, 2 또는 3이고;
M은 O 또는 S이고;
임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하고;
B는 화학식 (I')에 정의된 바와 같다.
일부 양태에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 안티센스 가닥은 이의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8) 중 하나 이상에서 하기 화학식 (I'-2)의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함한다:
(I'-2)
상기 식에서,
Y는 O, NH, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 X은 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5, 및 NH-CO로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4, R4' 및 R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 0, 1 또는 2이고; m은 0, 1 또는 2이고; s는 0 또는 1이고;
J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)pR6으로 이루어진 군으로부터 선택되고, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, p는 1, 2 또는 3이고;
R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일 및 (CH2)qR7로 이루어진 군으로부터 선택되고, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, q는 1, 2 또는 3이고;
R2는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노, 및 (CH2)rR8로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, r은 1, 2 또는 3이고;
임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하고;
M은 O 또는 S이고;
B는 화학식 (I')에 정의된 바와 같다.
일부 양태에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 전술한 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 가 아니다.
일부 양태에서, X는 NH-CO이고, R1은 H가 아니다.
일부 양태에서, 각각의 X은 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5, 및 NH-CO로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4, R4' 및 R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이고;
n은 0, 1 또는 2이고; m은 0, 1 또는 2이고; s는 0 또는 1이고;
J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이고;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C3 알킬, C1-C3 알콕시, C2-C4 알켄일, C2-C4 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노, 및 (CH2)pR6로 이루어진 군으로부터 선택되고, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, p는 1, 2 또는 3이고;
R1은 H, C1-C3 알킬, C1-C3 알콕시, C2-C4 알켄일, C2-C4 알킨일, 및 (CH2)qR7로 이루어진 군으로부터 선택되고, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C4 알켄일, 및 C2-C4 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, q는 1, 2 또는 3이고;
R2는 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C3 알킬, C1-C3 알콕시, C2-C4 알켄일, C2-C4 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노, 및 (CH2)rR8로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C4 알켄일, 및 C2-C4 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, r은 1, 2 또는 3이고;
임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성한다.
일부 양태에서, 각각의 X은 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5, 및 NH-CO로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4, R4' 및 R5는 각각 독립적으로 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 또는 이소프로필이고;
n은 0, 1 또는 2이고; m은 0, 1 또는 2이고; s는 0 또는 1이고;
J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 메틸이고;
R3은 H, OH, F, Cl, NH2, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, 비닐, 알릴, 에틴일, 프로파르그일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-메틸아미노, -O-에틸아미노, 및 (CH2)pR6으로 이루어진 군으로부터 선택되고, R6은 OH, F, Cl, 메톡시, 에톡시, N3, 비닐, 알릴, 에틴일, 및 프로파르그일로 이루어진 군으로부터 선택되고, p는 1 또는 2이고;
R1은 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, 비닐, 알릴, 에틴일, 프로파르그일, 및 (CH2)qR7로 이루어진 군으로부터 선택되고, R7은 OH, F, Cl, 메톡시, 에톡시, N3, 비닐, 알릴, 에틴일, 및 프로파르그일로 이루어진 군으로부터 선택되고, q는 1 또는 2이고;
R2는 H, OH, F, Cl, NH2, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, 비닐, 알릴, 에틴일, 프로파르그일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-메틸아미노, -O-에틸아미노, 및 (CH2)rR8로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8은 OH, F, Cl, 메톡시, 에톡시, N3, 비닐, 알릴, 에틴일, 및 프로파르그일로 이루어진 군으로부터 선택되고, r은 1 또는 2이고;
임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성한다.
일부 양태에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 화학식 (I'-1)에서, Y는 O 또는 NH이고; 각각의 X은 독립적으로 NH-CO, CH2 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n는 0 또는 1이고; m은 0 또는 1이고; s는 0 또는 1이고;
J1 및 J2는 각각 독립적으로 H이고;
R1은 H, 메틸 및 CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 H, OH, NH2, 메틸 및 CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, OH, NH2, 메틸 및 CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성한다.
일부 양태에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 화학식 (I'-2)에서, Y는 O 또는 NH이고; 각각의 X은 독립적으로 NH-CO, CH2 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n는 0 또는 1이고; m은 0 또는 1이고; s는 0 또는 1이고;
J1 및 J2는 각각 독립적으로 H이고;
R1은 H, 메틸 및 CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 H, 메틸 및 CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 H, OH, NH2, 메틸 및 CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성한다.
일부 양태에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
상기 식에서,
M은 O 또는 S이고;
B는 화학식 (I')에 정의된 바와 같다.
일부 양태에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
상기 식에서, M은 O 또는 S이고;
B는 화학식 (I')에 정의된 바와 같다.
일부 양태에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
상기 식에서, M은 O 또는 S이고;
B는 화학식 (I')에 정의된 바와 같다.
일부 양태에서, B는 염기이고; 예컨대, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, C2-개질된 퓨린, N8-개질된 퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 사이토신, 5-메틸사이토신, 이소사이토신, 슈도사이토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5-개질된 피리미딘, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8(예컨대 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8)에서의 천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 비제한적으로 하기 및 구조 내의 아데닌이 구아닌, 사이토신, 우라실, 또는 타이민으로 치대체된 것을 포함한다:
.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 이의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8, 3 내지 8, 4 내지 8, 5 내지 8, 또는 5 내지 7 중 하나 이상에서 전술한 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA의 안티센스 가닥은 이의 5' 영역의 위치 5, 6 또는 7에서 전술한 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함한다.
일부 특정 양태에서, 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 이의 5' 영역의 위치 5에 있고; B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택되고; 일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 및 우라실로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 이의 5' 영역의 위치 6에 있고; B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택되고; 일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 및 우라실로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 이의 5' 영역의 위치 7에 있고; B는 아데닌, 구아닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-다이메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 사이토신, 우라실, 타이민, 인돌, 5-니트로인돌, 및 3-니트로피롤로 이루어진 군으로부터 선택되고; 일부 양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 및 우라실로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 16 내지 35, 16 내지 34, 17 내지 34, 17 내지 33, 18 내지 33, 18 내지 32, 18 내지 31, 18 내지 30, 18 내지 29, 18 내지 28, 18 내지 27, 18 내지 26, 18 내지 25, 18 내지 24, 18 내지 23, 19 내지 25, 19 내지 24, 또는 19 내지 23개의 뉴클레오티드를 갖는다.
일부 양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 길이가 동일하거나 상이하고; 센스 가닥은 길이가 19 내지 23개의 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥은 길이가 19 내지 26개의 뉴클레오티드이다. 그 자체로, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA의 안티센스 가닥의 길이에 대한 센스 가닥의 비율은 19/20, 19/21, 19/22, 19/23, 19/24, 19/25, 19/26, 20/20, 20/21, 20/22, 20/23, 20/24, 20/25, 20/26, 21/20, 21/21, 21/22, 21/23, 21/24, 21/25, 21/26, 22/20, 22/21, 22/22, 22/23, 22/24, 22/25, 22/26, 23/20, 23/21, 23/22, 23/23, 23/24, 23/25, 또는 23/26일 수 있다. 일부 양태에서, siRNA의 안티센스 가닥의 길이에 대한 센스 가닥의 비율은 19/21, 21/23, 또는 23/25이다. 일부 양태에서, siRNA의 안티센스 가닥의 길이에 대한 센스 가닥의 비율은 19/21이다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 표적 서열에 적어도 부분적으로 역 상보적(reverse complementary)임으로써 RNA 간섭을 매개한다. 일부 양태에서, 안티센스 가닥과 표적 서열 사이에 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 미스매치(mismatch)가 존재한다. 일부 양태에서, 안티센스 가닥은 표적 서열에 대해 완전히 역 상보적이다.
일부 양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에 적어도 부분적으로 역 상보적임으로써 이중가닥 영역을 형성한다. 일부 양태에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 미스매치 가 존재한다. 일부 양태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에 대해 완전히 역 상보적이다.
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA는 1 또는 2개의 평활 말단(blunt end)을 포함한다.
일부 특정 양태에서, siRNA는 1 내지 4, 예컨대 1, 2, 3, 또는 4개의 페어링(paring)되지 않은 뉴클레오티드를 갖는 오버행(overhang)을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA는 siRNA의 안티센스 가닥의 3' 말단에서 오버행을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA의 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 47 내지 서열번호 68 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열이거나 이를 포함하고, W'은 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함하는 뉴클레오티드를 나타낸다.
일부 특정 양태에서, W'은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
, , 및
상기 식에서, B는 구아닌, 아데닌, 사이토신, 및 우라실로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, W'은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
, , 및
상기 식에서, B는 표 12에서 서열번호 47 내지 서열번호 68 및 서열번호 25 내지 서열번호 46의 5' 영역의 위치 7에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 예컨대, 서열번호 47은 서열번호 25에 상응하고, 서열번호 68은 서열번호 46에 상응하고, 서열번호 52은 서열번호 30에 상응한다.
일부 특정 양태에서, 본 발명의 siRNA의 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 47 내지 서열번호 68 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열이거나 이를 포함하고, W'은 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함하는 뉴클레오티드를 나타낸다.
일부 특정 양태에서, W'은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
, , 및
상기 식에서, M은 O 또는 S이고; 상기 식에서, B는 구아닌, 아데닌, 사이토신, 및 우라실로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, M은 S이다. 일부 특정 양태에서, M은 O이다.
일부 특정 양태에서, W'은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
, , 및
상기 식에서, M은 O 또는 S이고; 상기 식에서, B는 표 12에서 서열번호 47 내지 서열번호 68 및 서열번호 25 내지 서열번호 46의 5' 영역의 위치 7에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 예컨대, 서열번호 47은 서열번호 25에 상응하고, 서열번호 68은 서열번호 46에 상응하고, 서열번호 52은 서열번호 30에 상응한다.
일부 특정 양태에서, M은 S이다. 일부 특정 양태에서, M은 O이다.
또한, 본 발명은 변형을 갖는 전술한 siRNA인 siRNA를 제공하고, 전술한 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 갖는 뉴클레오티드에 추가로, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 내의 하나 이상의 추가적인 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 전술한 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 갖는 뉴클레오티드에 추가로, 추가적인 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 추가적인 변형된 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 데옥시-뉴클레오티드, 3'-말단 데옥시-타이민(dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸-개질된 뉴클레오티드, 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-개질된 뉴클레오티드, 라킹된(locked) 뉴클레오티드, 라킹되지 않은 뉴클레오티드, 구조적으로 강제된(conformationally constrained) 뉴클레오티드, 강제된 에틸 뉴클레오티드, 무염기성(abasic) 뉴클레오티드, 2'-아미노-개질된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴-개질된 뉴클레오티드, 2'-C-알킬-개질된 뉴클레오티드, 2'-하이드록시-개질된 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸-개질된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬-개질된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 비-천연 염기-포함 뉴클레오티드, 테트라하이드로피란-개질된 뉴클레오티드, 1,5-무수헥시톨-개질된 뉴클레오티드, 사이클로헥센일-개질된 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 기-포함 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트 기-포함 뉴클레오티드, 5'-포스포에스터-포함 뉴클레오티드, 및 5'-포스포에스터 모방체(mimic)-포함 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-알콕시-개질된 뉴클레오티드, 2'-치환된 알콕시-개질된 뉴클레오티드, 2'-알킬-개질된 뉴클레오티드, 2'-치환된 알킬-개질된 뉴클레오티드, 2'-아미노-개질된 뉴클레오티드, 2'-치환된 아미노-개질된 뉴클레오티드, 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드, 2'-데옥시뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드, 3'-데옥시-타이민(dT) 뉴클레오티드, 이소뉴클레오티드, LNA, ENA, cET, UNA, 및 GNA 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-메톡시-개질된 뉴클레오티드, 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드, 및 2'-데옥시-개질된 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 맥락에서, 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 리보실 기의 2'-위치에서의 하이드록시 기가 불소로 치환된 뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 양태에서, 2'-알콕시-개질된 뉴클레오티드는 2'-메톡시-개질된 뉴클레오티드(2'-OMe)이다. 일부 양태에서, 2'-치환된 알콕시-개질된 뉴클레오티드는, 예컨대, 2'-O-메톡시에틸-개질된 뉴클레오티드(2'-MOE)일 수 있다.
일부 양태에서, 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로, 안티센스 가닥의 위치 2, 6 및 14에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-데옥시뉴클레오티드 또는 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로, 안티센스 가닥의 위치 2, 6, 14, 및 16에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-데옥시뉴클레오티드 또는 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로, 안티센스 가닥의 위치 2, 6, 9, 12, 및 14에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-데옥시뉴클레오티드 또는 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로, 안티센스 가닥의 위치 2, 6, 10, 12, 및 14에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-데옥시뉴클레오티드 또는 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로, 안티센스 가닥의 위치 2, 4, 6, 9, 12, 14, 및 18에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-데옥시뉴클레오티드 또는 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로, 안티센스 가닥의 위치 2, 4, 6, 10, 12, 14, 및 18에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-데옥시뉴클레오티드 또는 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로, 안티센스 가닥의 위치 2, 4, 6, 9, 12, 14, 16, 및 18에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-데옥시뉴클레오티드 또는 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로, 안티센스 가닥의 위치 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 및 18에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-데옥시뉴클레오티드 또는 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로, 안티센스 가닥의 위치 2, 4, 6, 9, 10 12, 14, 16, 및 18에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-데옥시뉴클레오티드 또는 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로, 안티센스 가닥의 위치 2, 6 및 14에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로, 안티센스 가닥의 위치 2, 6, 14, 및 16에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로, 안티센스 가닥의 위치 2, 6, 12, 및 14에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로, 안티센스 가닥의 위치 2, 4, 6, 12, 14, 16, 및 18에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로, 안티센스 가닥의 위치 2, 4, 6, 9, 12, 14, 16, 및 18에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 5'-말단으로부터 3'-말단 방향으로, 안티센스 가닥의 위치 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 및 18에서의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 siRNA의 센스 가닥은 하기 제시된 화학식의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
5'-NaNaNaNaXNaNbNbNbNaNaNaNaNaNaNaNaNaNa-3'
상기 식에서, Na 및 Nb는 각각 독립적으로 변형된 뉴클레오티드 또는 변형되지 않은 뉴클레오티드를 나타내고, Na 및 Nb 에서의 변형은 상이하고; 각각의 X는 독립적으로 Na 또는 Nb이다.
일부 양태에서, 안티본원에 기재된 siRNA의 센스 가닥은 하기 제시된 화학식의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
5'-Na'Nb'Na'X'Na'Nb'W'Na'X'Y'Na'X'Na'Nb'Na'X'Na'X'Na'Na'Na'-3';
상기 식에서, Na' 및 Nb'는 각각 독립적으로 변형된 뉴클레오티드 또는 변형되지 않은 뉴클레오티드를 나타내고, Na' 및 Nb'에서의 변형은 상이하고; 각각의 X'은 독립적으로 Na' 또는 Nb'이고; Y'은 Na' 또는 Nb'이고; W'은 본 발명의 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형 중 어느 하나를 포함하는 뉴클레오티드를 나타낸다.
일부 양태에서, X' 및 Y'에서의 변형은 상이하다.
일부 양태에서, Na는 2'-메톡시-개질된 뉴클레오티드이고, Nb는 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드 또는 2'-데옥시-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, Na'은 2'-메톡시-개질된 뉴클레오티드이고, Nb'은 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드 또는 2'-데옥시-개질된 뉴클레오티드 이다.
일부 특정 양태에서, Na는 2'-메톡시-개질된 뉴클레오티드이고, Nb'은 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 특정 양태에서, Na'은 2'-메톡시-개질된 뉴클레오티드이고, Nb'은 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 안티본원에 기재된 siRNA의 센스 가닥은 하기 제시된 화학식의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
5'-Na'Nb'Na'Nb'Na'Nb'W'Na'X'Y'Na'Nb'Na'Nb'Na'Nb'Na'Nb'Na'Na'Na'-3'
상기 식에서, 각각의 X'은 독립적으로 Na' 또는 Nb'이고, Y'은 Na' 또는 Nb'이고, X' 및 Y'에서의 변형은 상이하고; Na'은 2'-메톡시-개질된 뉴클레오티드이고, Nb'은 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이고; W'은 본 발명의 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형 중 어느 하나를 포함하는 뉴클레오티드를 나타낸다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 siRNA의 센스 가닥은 하기 제시된 화학식의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
5'-NaNaNaNaNaNaNbNbNbNaNaNaNaNaNaNaNaNaNa-3'; 또는
5'-NaNaNaNaNbNaNbNbNbNaNaNaNaNaNaNaNaNaNa-3'
상기 식에서, Na는 2'-메톡시-개질된 뉴클레오티드이고, Nb는 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 안티본원에 기재된 siRNA의 센스 가닥은 하기 제시된 화학식의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
5'-Na'Nb'Na'Nb'Na'Nb'W'Na'Na'Nb'Na'Nb'Na'Nb'Na'Nb'Na'Nb'Na'Na'Na'-3'; 또는
5'-Na'Nb'Na'Nb'Na'Nb'W'Na'Nb'Na'Na'Nb'Na'Nb'Na'Nb'Na'Nb'Na'Na'Na'-3',
상기 식에서, Na는 2'-메톡시-개질된 뉴클레오티드이고, Nb는 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이고; 및/또는 Na'은 2'-메톡시-개질된 뉴클레오티드이고, Nb'은 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드이다.
W'은 본 발명의 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형 중 어느 하나를 포함하는 뉴클레오티드를 나타낸다.
일부 특정 양태에서, W'은 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함하는 뉴클레오티드를 나타내고; 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
, , 및
상기 식에서, B는 구아닌, 아데닌, 사이토신, 및 우라실로 이루어진 군으로부터 선택되고; 일부 특정 양태에서, B는 안티센스 가닥의 5' 영역의 위치 7에서의 염기로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, W'은 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함하는 뉴클레오티드를 나타내고; 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
, , 및
상기 식에서, M은 O 또는 S이고; 상기 식에서, B는 구아닌, 아데닌, 사이토신, 및 우라실로 이루어진 군으로부터 선택되고; 일부 특정 양태에서, B는 안티센스 가닥의 5' 영역의 위치 7에서의 염기로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, M은 S이다. 일부 특정 양태에서, M은 O이다.
일부 양태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 내의 하나 이상의 포스포에스터 기는 생물학적 샘플 또는 환견에서 증가된 안정성을 갖는 siRNA를 제공하는 변형을 갖는 포스포에스터 기다. 일부 양태에서, 변형을 갖는 포스포에스터 기는 포스포로티오에이트 기다. 구체적으로, 포스포로티오에이트 기는 하나의 비-가교 산소 원자를 황 원자로 대체함에 의해 치환된 포스포다이에스터 기를 지칭한다.
일부 양태에서, 포스포로티오에이트 기는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치 중 하나 이상에 존재한다:
센스 가닥의 5' 말단의 제1 및 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
센스 가닥의 5' 말단의 제2 및 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
센스가닥의 3' 말단의 제1 뉴클레오티드의 말단;
센스가닥의 3' 말단의 제1 및 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
센스가닥의 3' 말단의 제2 및 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 5' 말단의 제1 및 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 5' 말단의 제2 및 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 3' 말단의 제1 뉴클레오티드의 말단;
안티센스 가닥의 3' 말단의 제1 및 제2 뉴클레오티드 사이의 위치; 및
안티센스 가닥의 3' 말단의 제2 및 제3 뉴클레오티드 사이의 위치.
일부 양태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 하기에 존재하는 다수의 포스포로티오에이트 기를 포함한다:
센스 가닥의 5' 말단의 제1 및 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
센스 가닥의 5' 말단의 제2 및 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 5' 말단의 제1 및 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 5' 말단의 제2 및 제3 뉴클레오티드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 3' 말단의 제1 및 제2 뉴클레오티드 사이의 위치;
안티센스 가닥의 3' 말단의 제2 및 제3 뉴클레오티드 사이의 위치; 및
임의적으로, 센스가닥의 3' 말단의 제1 뉴클레오티드의 말단; 및/또는
임의적으로, 센스가닥의 3' 말단의 제1 및 제2 뉴클레오티드 사이의 위치.
일부 양태에서, 센스 가닥은 하기 화학식의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된다:
5'-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3', 또는
5'-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3', 또는
5'-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNms-3', 또는
5'-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNms-3', 또는
5'-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNm-3', 또는
5'-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNm-3', 또는
5'-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNms-3', 또는
5'-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNms-3'
상기 식에서, Nm은 임의의 2'-메톡시-개질된 뉴클레오티드, 예컨대 2'-메톡시-개질된 C, G, U, A, 또는 T를 나타내고; Nf는 임의의 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드, 예컨대 2'-플루오로-개질된 C, G, U, A, 또는 T를 나타내고;
소문자 s는 문자 s의 어느 한 쪽에 인접한 2개의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 기에 의해 연결됨을 나타내고; 소문자 s는 3' 말단에서 처음 나타날 때, 소문자 s에 인접한 업스트림(upstream) 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 기에서 종결됨을 나타낸다.
일부 양태에서, 안티센스 가닥은 하기 제시된 화학식의 뉴클레오티드 서열을 갖는다:
5'-Nm'sNf'sNm'Nf'Nm'Nf'W'Nm'Nm'Nf'Nm'Nf'Nm'Nf'Nm'Nf'Nm'Nf'Nm'sNm'sNm'-3', 또는
5'-Nm'sNf'sNm'Nf'Nm'Nf'W'Nm'Nf'Nm'Nm'Nf'Nm'Nf'Nm'Nf'Nm'Nf'Nm'sNm'sNm'-3'
상기 식에서, Nm'는 임의의 2'-메톡시-개질된 뉴클레오티드를 나타내고, 예컨대 2'-메톡시-개질된 C, G, U, A, 또는 T; Nf'는 임의의 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드, 예컨대 2'-플루오로-개질된 C, G, U, A, 또는 T를 나타내고;
소문자 s는 문자 s의 어느 한 쪽에 인접한 2개의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 기에 의해 연결됨을 나타내고, 소문자 s는 3' 말단에서 처음 나타날 때, 소문자 s에 인접한 업스트림 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 기에서 종결됨을 나타낸다;
W'은 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 갖는 뉴클레오티드를 나타내고; 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
, , 및
상기 식에서, B는 구아닌, 아데닌, 사이토신, 및 우라실로 이루어진 군으로부터 선택되고; 일부 양태에서, B는 안티센스 가닥의 5' 영역의 위치 7에서의 염기로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, W'은 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함하는 뉴클레오티드를 나타내고; 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
, , 및
상기 식에서, M은 O 또는 S이고; 상기 식에서, B는 구아닌, 아데닌, 사이토신, 및 우라실로 이루어진 군으로부터 선택되고; 일부 특정 양태에서, B는 안티센스 가닥의 5' 영역의 위치 7에서의 염기로부터 선택된다.
일부 특정 양태에서, M은 S이다. 일부 특정 양태에서, M은 O이다.
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA의 센스 가닥은 서열번호 69 내지 서열번호 110 중 어느 하나이거나 이를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA의 안티센스 가닥은 서열번호 111 내지 서열번호 172 중 어느 하나이거나 이를 포함한다.
또한, 본 발명은 전술한 siRNA 및 siRNA에 연결된 표적화 리간드 중 어느 하나를 포함하는 siRNA 접합체를 제공한다.
일부 양태에서, siRNA 및 표적화 리간드는 공유결합적으로 연결되거나 비-공유결합적으로 연결된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 siRNA의 센스가닥의 3' 말단에 연결된다.
일부 양태에서, siRNA의 세포로의 진입을 촉진하기 위해, 친지성 기, 예컨대 콜레스테롤이 siRNA의 센스 가닥의 말단에 도입될 수 있고, 친지성 기는 소형의 간섭 핵산에 공유결합되고; 예컨대, 콜레스테롤, 지단백질, 비타민 E 등이 말단에 도입되어 지질 이중층으로 이루어진 세포막을 통해 진행하는 것 및 세포 내의 mRNA와 상호작용하는 것을 용이하게 한다. 한편, 또한, siRNA는 안정성 및 생물학적 활성을 증가시키기 위해 비-공유 결합, 예컨대 소수성 결합 또는 이온성 결합에 의한 인지질 분자, 폴리펩티드, 양이온성 중합체 등에 대한 결합에 의해 변형될 수 있다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 포스포에스터 기, 포스포로티오에이트 기, 또는 포스폰산 기에 의해 siRNA의 말단에 연결된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 포스포에스터 기, 포스포로티오에이트 기, 또는 포스폰산 기에 의해 siRNA의 말단에 간접적으로 연결된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 포스포에스터 기, 포스포로티오에이트 기, 또는 포스폰산 기에 의해 siRNA의 말단에 직접적으로 연결된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 포스포에스터 기 또는 포스포로티오에이트 기에 의해 siRNA의 말단에 직접적으로 연결된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 포스포에스터 기 또는 포스포로티오에이트 기에 의해 siRNA의 센스가닥의 3' 말단에 직접적으로 연결된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 하기 제시된 화학식 (II)의 구조를 갖는다:
상기 식에서, T는 표적화 모이어티이고, E는 분지 기이고, L1은 링커 모이어티(linker moiety)이고, L2는 표적화 모이어티와 분지 기 사이의 테더(tether) 모이어티이고, i는 1 내지 10의 정수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10으로부터 선택된다.
일부 양태에서, i는 2 내지 8의 정수로부터 선택된다.
일부 양태에서, i는 3 내지 5의 정수로부터 선택된다.
일부 양태에서, L1은
이고,
상기 식에서, R9 및 R10는 각각 독립적으로 -S-, -NH-, -O-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)O-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -CH2O-, -NH-C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-NH-, -NH(CO)NH-, 및 3- 내지 12-원 헤테로사이클일 로 이루어진 군으로부터 선택되고, -CH2-는 할로겐, 알킬, 알콕시, 및 알킬아미노로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환기로 임의적으로 치환되고, 알킬은 하이드록시, 아미노, 및 할로겐로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환기로 임의적으로 추가 치환되고;
R11은 중수소, 할로겐, 알킬, 아미노, 시아노, 니트로, 알켄일, 알킨일, 카복실, 하이드록시, 설프하이드릴, 알킬설프하이드릴, 알콕시, 알킬아미노, -C(O)-알킬, -C(O)-O-알킬, -CONH2, -CONH-알킬, -OC(O)-알킬, -NH-C(O)-알킬, -S(O)O-알킬, -S(O)ONH2, 및 -S(O)ONH-알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 알킬, 알켄일, 알킨일, 알킬설프하이드릴, 알콕시, -C(O)-알킬, -C(O)-O-알킬, -CONH-알킬, -OC(O)-알킬, -NH-C(O)-알킬, -S(O)O-알킬, 및 -S(O)ONH-알킬은 할로겐, 하이드록시, 아미노, 및 설프하이드릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환기로 임의적으로 추가 치환되고;
k은 0, 1, 2, 3, 및 4로 이루어진 군으로부터 선택되고;
j는 1 내지 20(예컨대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)의 정수로부터 선택된다.
일부 양태에서, L1은
이고, 상기 식에서, R11은 중수소, 할로겐, 알킬, 아미노, 시아노, 니트로, 알켄일, 알킨일, 카복실, 하이드록시, 설프하이드릴, 알킬설프하이드릴, 알콕시, 알킬아미노, -C(O)-알킬, -C(O)-O-알킬, -CONH2, -CONH-알킬, -OC(O)-알킬, -NH-C(O)-알킬, -S(O)O-알킬, -S(O)ONH2, 및 -S(O)ONH-알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 알킬, 알켄일, 알킨일, 카복실, 알킬설프하이드릴, 알콕시, -C(O)-알킬, -C(O)-O-알킬, -CONH-알킬, -OC(O)-알킬, -NH-C(O)-알킬, -S(O)O-알킬, 및 -S(O)ONH-알킬은 할로겐, 하이드록시, 아미노, 및 설프하이드릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환기로 임의적으로 추가 치환되고;
k은 0, 1, 2, 3, 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, L1은
또는 이고, 상기 식에서, R11은 중수소, 할로겐, 알킬, 아미노, 시아노, 니트로, 알켄일, 알킨일, 카복실, 하이드록시, 설프하이드릴, 알킬설프하이드릴, 알콕시, 알킬아미노, -C(O)-알킬, -C(O)-O-알킬, -CONH2, -CONH-알킬, -OC(O)-알킬, -NH-C(O)-알킬, -S(O)O-알킬, -S(O)ONH2, 및 -S(O)ONH-알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 알킬, 알켄일, 알킨일, 카복실, 알킬설프하이드릴, 알콕시, -C(O)-알킬, -C(O)-O-알킬, -CONH-알킬, -OC(O)-알킬, -NH-C(O)-알킬, -S(O)O-알킬, 및 -S(O)ONH-알킬은 할로겐, 하이드록시, 아미노, 및 설프하이드릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환기로 임의적으로 추가 치환되고; k은 0, 1, 2, 3, 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, L1은 이다.
일부 양태에서, L1은 또는 이다.
일부 양태에서, L1은 이다.
일부 양태에서, L1은 또는 이다.
일부 양태에서, L1은 이다.
일부 양태에서, 표적화 리간드에서 E는 이고,
상기 식에서, R12, R13, R14, 및 R15는 각각 독립적으로 -C(O)NH- 및 -C(O)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 카본일은 알킬로 임의적으로 치환되고, 알킬은 알킬, 하이드록시, -C(O)O-, -C(O)O-알킬-, 및 -C(O)NH-로 이루어진 군으로부터 선택되는 기로 임의적으로 추가 치환되고;
X2, X3, X4, 및 X5는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수(예컨대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)로부터 선택된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드에서 E는 이고,
상기 식에서, R12, R13, R14, 및 R15는 각각 독립적으로 -C(O)NH- 및 -C(O)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, -C(O)NH- 또는 -C(O)-는 알킬로 임의적으로 추가 치환되고, 알킬은 알킬, 하이드록시, -C(O)O-, -C(O)O-알킬-, 및 -C(O)NH-로 이루어진 군으로부터 선택되는 기로 임의적으로 추가 치환되고;
X2, X3, X4, 및 X5는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수(예컨대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)로부터 선택된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드에서 E는 이고,
상기 식에서, R12, R13, R14, 및 R15는 각각 독립적으로 -C(O)NH- 및 -C(O)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, -C(O)NH- 또는 -C(O)-는
, , , , , , , 및 로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환기로 추가 치환되고; X2, X3, X4, 및 X5는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수(예컨대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)로부터 선택된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드에서 E는 이다.
일부 양태에서, 표적화 리간드에서 E는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
.
일부 양태에서, 표적화 리간드에서 E는 로부터 선택된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드에서 E는 로부터 선택된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드에서 E는 이고, L1은 하기 구조로 이루어진 군으로부터 선택된다:
, , , , , 및
상기 식에서, R9 및 R10는 각각 독립적으로 -S-, -NH-, -O-, -S-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)O-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -CH2-, -CH2NH-, -CH2O-, -NH-C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-NH-, -NH(CO)NH-, 및 3- 내지 12-원 헤테로사이클일 로 이루어진 군으로부터 선택되고, -CH2-는 할로겐, 알킬, 알콕시, 및 알킬아미노로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환기로 임의적으로 치환되고, 알킬은 하이드록시, 아미노, 및 할로겐로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환기로 임의적으로 추가 치환되고;
R11은 중수소, 할로겐, 알킬, 아미노, 시아노, 니트로, 알켄일, 알킨일, 카복실, 하이드록시, 설프하이드릴, 알킬설프하이드릴, 알콕시, 알킬아미노, -C(O)-알킬, -C(O)-O-알킬, -CONH2, -CONH-알킬, -OC(O)-알킬, -NH-C(O)-알킬, -S(O)O-알킬, -S(O)ONH2, 및 -S(O)ONH-알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 알킬, 알켄일, 알킨일, 알킬설프하이드릴, 알콕시, -C(O)-알킬, -C(O)-O-알킬, -CONH-알킬, -OC(O)-알킬, -NH-C(O)-알킬, -S(O)O-알킬, 및 -S(O)ONH-알킬은 할로겐, 하이드록시, 아미노, 및 설프하이드릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환기로 임의적으로 추가 치환되고;
k은 0, 1, 2, 3, 및 4로 이루어진 군으로부터 선택되고;
j은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드에서 E는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고: 및 , L1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 및 .
일부 양태에서, 표적화 리간드에서 E는 로부터 선택되고, L1은 로부터 선택되고, 즉, E-L1은 이다.
일부 양태에서, 표적화 리간드에서 E는 로부터 선택되고, L1은 로부터 선택되고, 즉, E-L1은 이다.
일부 양태에서, 표적화 리간드에서 E는 로부터 선택되고, L1은 로부터 선택되고, 즉, E-L1은 이다.
일부 양태에서, 표적화 리간드에서 E는 로부터 선택되고, L1은 로부터 선택되고, 즉, E-L1은 이다.
본 발명에서, L2는 표적화 모이어티와 분지 기 사이의 테더 모이어티이고, L2는 표적화 모이어티와 분지 기를 연결하고 간격을 생성한다.
일부 양태에서, L2의 한 말단은 표적화 리간드에 직접 연결되고, 다른 말단은 분지 기 E에 직접 연결된다.
일부 양태에서, L2의 한 말단은 표적화 리간드에 직접 연결되고, 다른 말단은 분지 기 E에 간접 연결된다.
일부 양태에서, L2의 한 말단은 표적화 리간드에 간접 연결되고, 다른 말단은 분지 기 E에 간접 연결된다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 표적화 리간드는 2개의 L2 및 2개의 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 표적화 리간드는 3개의 L2 및 3개의 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 표적화 리간드는 4개의 L2 및 4개의 표적화 모이어티 를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 표적화 리간드는 다수의 L2 및 다수의 표적화 모이어티를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명에서 L2는 공유결합적으로 연결된 하기 기로부터 임의적으로 선택되는 1 내지 20개(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)개의 기의 조합으로부터 임의적으로 선택된다:
, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬(예컨대 사이클로헥실, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헵틸, 또는 사이클로옥틸), 치환된 또는 비치환된 사이클로알켄일(예컨대 사이클로헥센일, 사이클로부텐일, 사이클로펜텐일, 사이클로헵텐일, 사이클로옥텐일, 사이클로헥사다이엔일, 사이클로펜타다이엔일, 사이클로헵타다이엔일, 또는 사이클로옥타다이엔일), 치환된 또는 비치환된 아릴(예컨대 페닐, 나프틸, 바이나프틸, 또는 안트라센일), 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예컨대 피리딜, 피리미딘일, 피롤, 이미다졸, 퓨란, 벤조퓨란, 또는 인돌), 및 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클일(예컨대 테트라하이드로퓨란, 테트라하이드로피란, 피페리딘, 또는 피롤리딘).
일부 양태에서, 본 발명에서 L2는 공유결합적으로 연결된 하기 기로부 이루어진 군으로부터 임의적으로 선택되는 1 내지 20개(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개)의 기의 조합이다:
.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 하기 제시된 구조를 갖는 L2를 포함한다:
상기 식에서, x6은 1 내지 20의 정수(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)이다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 하기 제시된 구조를 갖는 L2를 포함한다:
.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 하기 제시된 구조를 갖는 L2를 포함한다:
.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 하기 제시된 구조를 갖는 L2를 포함한다:
.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 하기 제시된 구조를 갖는 L2를 포함한다:
.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 하기 제시된 구조를 갖는 L2를 포함한다:
.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 하기 제시된 구조를 갖는 L2를 포함한다:
상기 식에서, x7은 1 내지 20의 정수(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)이고, Z는 이다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 하기 제시된 구조를 갖는 L2를 포함한다: .
일부 양태에서, 표적화 리간드는 하기 제시된 구조를 갖는 L2를 포함한다:
상기 식에서, x8은 1 내지 20의 정수(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)이고, Z는 이다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 하기 제시된 구조를 갖는 L2를 포함한다:
상기 식에서, x9 및 X10는 각각 독립적으로 1 내지 20의 정수(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)로부터 선택되고, Z는 이다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 하기 제시된 구조를 갖는 L2를 포함한다: .
일부 양태에서, 표적화 리간드는 하기 제시된 구조를 갖는 L2를 포함한다:
상기 식에서, x7 및 X8는 각각 독립적으로 1 내지 20의 정수(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)로부터 선택되고, Z는 이다.
일부 특정 양태에서, 표적화 리간드는 하기 구조를 갖는다:
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일부 특정 양태에서, 표적화 리간드는 하기 구조를 갖는다:
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일부 특정 양태에서, 표적화 리간드는 하기 구조를 갖는다:
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일부 특정 양태에서, 표적화 리간드는 하기 구조를 갖는다:
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일부 양태에서, 표적화 리간드의 표적화 모이어티 T는 하나 이상의 표적화 모이어티로 이루어지고, 이에 연결된 치료제를 표적화 리간드는 목적하는 표적 위치에 전달하는 것을 보조한다. 일부 경우, 표적화 모이어티는 세포 또는 세포 수용체에 결합하고 치료제가 세포로 진입하는 것을 촉진하는 내포작용을 개시한다. 표적화 모이어티는 세포 수용체 또는 세포 표면 분자 또는 항체에 대한 친화성을 갖는 화하물을 포함할 수 있다. 표적화 모이어티를 포함하는 다양한 표적화 리간드는 치료제, 및 세포 및 특정 세포 수용체에서의 상기 치료제를 표적으로 하는 기타 화합에 연결될 수 있다.
일부 양태에서, 표적화 모이어티 T의 유형은 탄수화물, 콜레스테롤 및 콜레스테롤 기, 또는 스테로이드를 포함한다. 세포 수용체에 결합할 수 있는 표적화 모이어티는 당류, 예컨대 갈락토스, 갈락토스 유도체(예컨대 N-아세틸-갈락토스아민, N-트라이플루오로아세틸갈락토스아민, N-프로피온일갈락토스아민, N-n-부티르일갈락토스아민, 및 N-이소부티르일갈락토스아민), 만노스, 및 만노스 유도체를 포함한다.
아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 결합하는 표적화 모이어티는 특히 올리고머 화합물(예컨대 siRNA)을 간으로 전달하는 것을 유도하는 데 사용될 수 있는 것으로 알려져 있다. 아시알로당단백질 수용체는 간 세포(간세포)에서 크게 발현된다. ASGPR을 표적화하는 세포 수용체의 표적화 모이어티는 갈락토스 및 갈락토스 유도체를 포함한다. 구체적으로, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 4 N-아세틸-갈락토스아민(GalNAc 또는 NAG)으로 이루어진 클러스터(cluster)를 비롯한 갈락토스 유도체의 클러스터는 간세포 내의 특정 화합물의 흡수를 촉진할 수 있다. 올리고머 화합물에 커플링된 GalNAc 클러스터는 조성물을 간으로 유도하는 데 사용되고, 여기서, N-아세틸-갈락토스아민 당류는 간 세포 표면 상의 아시알로당단백질 수용체에 결합할 수 있다. 아시알로당단백질 수용체에 대한 결합은 수용체-매개되는 내포작용을 개시함으로써, 화합물이 세포의 내부에 진입하는 것을 촉진할 것으로 여겨진다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 2, 3, 4개, 또는 4개 초과의 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 표적화 리간드는 L2에 의해 분지 기에 연결된 1, 2, 3, 4개, 또는 4개 초과의 표적화 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 갈락토스 클러스터의 형태이다.
일부 양태에서, 각각의 표적화 모이어티는 갈락토스아민 유도체(이는 N-아세틸-갈락토스아민임)를 포함한다. 표적화 모이어티로서 사용되고 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화성을 가질 수 있는 기타 당류는 갈락토스, 갈락토스아민, N-포름일-갈락토스아민, N-아세틸-갈락토스아민, N-프로피온일-갈락토스아민, N-n-부티르일-갈락토스아민, N-이소부티르일-갈락토스아민 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명에서 표적화 리간드는 N-아세틸갈락토스아민을 표적화 모이어티로서 포함한다:
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일부 양태에서, 표적화 리간드는 3개의 말단 갈락토스아민 또는 갈락토스아민 유도체(예컨대 N-아세틸-갈락토스아민)를 포함하고, 이들 각각은 아시알로당단백질 수용체에 친화성을 갖는다. 일부 양태에서, 표적화 리간드는 3개의 말단 N-아세틸-갈락토스아민(GalNAc 또는 NAG)을 표적화 모이어티로서 포함한다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 4개의 말단 갈락토스아민 또는 갈락토스아민 유도체(예컨대 N-아세틸-갈락토스아민)를 포함하고, 이들 각각은 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화성을 갖는다. 일부 양태에서, 표적화 리간드는 4개의 말단 N-아세틸-갈락토스아민(GalNAc 또는 NAG)을 표적화 모이어티로서 포함한다.
3개의 말단 N-아세틸-갈락토스아민을 지칭할 때 당업계에 통상적으로 사용되는 용어는 3-안테너리(tri-antennary), 3가, 및 삼량체를 포함한다.
4개의 말단 N-아세틸-갈락토스아민을 지칭할 때 당업계에 통상적으로 사용되는 용어는 4-안테너리, 4가, 및 사량체를 포함한다.
일부 특정 양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 표적화 리간드는 하기 제시되는 구조를 갖는다:
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일부 특정 양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 표적화 리간드는 하기 제시되는 구조를 갖는다:
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일부 특정 양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 표적화 리간드는 하기 제시되는 구조를 갖는다:
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일부 특정 양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 표적화 리간드는 하기 제시되는 구조를 갖는다:
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일부 양태에서, 본 발명의 siRNA는 본 발명의 표적화 리간드에 연결되어 하기 제시되는 siRNA 접합체를 형성한다:
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상기 식에서, T는 표적화 모이어티이고, E는 분지 기이고, L1은 링커 모이어티이고, L2는 표적화 모이어티와 분지 기 사이의 테더 모이어티이고, 상기 식에서, x는 1 내지 10의 정수로부터 선택되고, D는 HSD17B13을 표적화하는 siRNA이다.
일부 양태에서, D는 HSD17B13을 표적화하는 siRNA이다.
일부 양태에서, D는 본 발명의 siRNA 중 어느 하나이다. 일부 양태에서, L1은 siRNA의 센스가닥의 3' 말단에 연결된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 포스포에스터 기, 포스포로티오에이트 기, 또는 포스폰산 기에 의해 siRNA의 말단에 연결된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 포스포에스터 기, 포스포로티오에이트 기, 또는 포스폰산 기에 의해 siRNA의 말단에 간접적으로 연결된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 포스포에스터 기, 포스포로티오에이트 기, 또는 포스폰산 기에 의해 siRNA의 말단에 직접적으로 연결된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 포스포에스터 기 또는 포스포로티오에이트 기에 의해 siRNA의 말단에 직접적으로 연결된다.
일부 양태에서, 표적화 리간드는 포스포에스터 기 또는 포스포로티오에이트 기에 의해 siRNA의 센스가닥의 3' 말단에 직접적으로 연결된다.
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA의 센스 가닥은 서열번호 194 내지 서열번호 212 중 어느 하나이거나 이를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA의 안티센스 가닥은 서열번호 111 내지 서열번호 172 중 어느 하나이거나 이를 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 전술한 접합체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 담체, 비히클, 희석제, 및/또는 전달 중합체를 포함하는 조성물 을 제공한다.
본 발명의 또다른 양상은 접합체 또는 전술한 접합체를 포함하는 조성물의, 대상의 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 용도를 제공하고; 일부 양태에서, 질환은 간 질환으로부터 선택된다.
본 발명의 또다른 양상은 전술한 접합체 또는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상의 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 양상은 전술한 접합체 또는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상의 mRNA 발현을 억제하는 방법 을 제공한다.
본 발명의 또다른 양상은 전술한 접합체 또는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, siRNA, siRNA 접합체, 또는 약학 조성물을 간에 생체내 전달하는 방법을 제공한다.
접합체, 본원에 개시된 조성물, 및 방법은 표적 세포, 세포 집단, 조직, 또는 대상의 수준을 감소시킬 수 있고, 이는 하기를 포함한다: 표적화 리간드에 연결된 치료 효과량의 본원에 기재된 siRNA, siRNA 접합체, 또는 약학 조성물을 대상에게 투여함으로써, 대상의 표적 mRNA의 발현을 억제하는 것.
일부 양태에서, 대상은 표적화된 세포 또는 조직에서 병원성 상향조절을 갖는 것으로 확인된 대상이다.
본원에 기재된 대상은 표적 mRNA의 감소 또는 억제로부터 유익을 얻을 수 있는 질환 또는 병태를 갖는 대상을 지칭한다.
전달은 국소 투여(예컨대 직접 주사, 임플란트, 또는 국소 적용), 전신 투여에 의해, 또는 피하, 정맥내, 복강내, 또는 비경구 경로(두개내(예컨대 뇌실내, 실질내, 및 경막내) 포함), 근육내, 경피, 통기로(airway)(에어로졸), 비강, 경구, 직장, 또는 국소(협측 및 설하 포함) 투여를 통해 수행될 수 있다.
임의적인 양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 siRNA, siRNA 접합체, 또는 약학 조성물은 주사, 예컨대, 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 십이지장내, 또는 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
다양한 전달 시스템이 공지되어 있고 본 발명의 siRNA, siRNA 접합체, 또는 약학 조성물에 사용될 수 있고, 이의 예는 리포좀 내 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개되는 내포작용, 및 레트로 바이러스의 일부 또는 다른 벡터로서 핵산의 구축이다.
임의적인 양태에서, 표적화 리간드 및 siRNA가 접합체에 연결된 후, 접합체는 키트에 포장될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 siRNA 또는 siRNA 접합체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 보조 물질 및/또는 어드주번트(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있고; 보조 물질은 당업계에 통상적으로 사용되는 다양한 제형 또는 화합물 중 하나 이상일 수 있다. 예컨대, 약학적으로 허용되는 보조 물질은 pH 완충제, 보호제, 및 삼투압 조절제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 표적 유전자-발현 세포와 접촉할 때 전술한 siRNA, siRNA 접합체, 또는 약학 조성물은 표적 유전자의 발현을, 예컨대, psiCHECK 활성 스크리닝 및 루시페라제 리포터 유전자 검정, 및 기타 방법, 예컨대 PCR 또는 분지된 DNA(bDNA)-기반 방법에 의해 측정 시 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 억제한다.
일부 양태에서, 표적 유전자-발현 세포와 접촉할 때 전술한 siRNA, siRNA 접합체, 또는 약학 조성물은, 예컨대, psiCHECK 활성 스크리닝 및 루시페라제 리포터 유전자 검정, 및 기타 방법, 예컨대 PCR 또는 분지된 DNA(bDNA)-기반 방법에 의해 측정 시 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 또는 10% 이하의 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA의 %를 야기한다.
일부 양태에서, siRNA, siRNA 접합체, 또는 약학 조성물이 표적 유전자-발현 세포와 접촉할 때, siRNA 또는 siRNA 접합체는 표적-이탈(off-target) 활성을, 예컨대, psiCHECK 활성 스크리닝 및 루시페라제 리포터 유전자 검정, 및 기타 방법, 예컨대 PCR 또는 분지된 DNA(bDNA)-기반 방법에 의해 측정 시 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70%, 또는 75% 이상 감소시키는 한편, 표적-해당(on-target) 활성을 유지한다.
일부 양태에서, 표적 유전자-발현 세포와 접촉할 때 siRNA, siRNA 접합체, 또는 약학 조성물은, 예컨대, psiCHECK 활성 스크리닝 및 루시페라제 리포터 유전자 검정, 및 기타 방법, 예컨대 PCR 또는 분지된 DNA(bDNA)-기반 방법에 의해 측정 시, 표적-외 활성을 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상 감소시키는 한편, 표적-해당 활성을 20% 이하, 19% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 초과 감소시킨다.
일부 양태에서, siRNA, siRNA 접합체, 또는 약학 조성물이 표적 유전자-발현 세포와 접촉할 때, siRNA 또는 siRNA 접합체는 표적-이탈 활성을, 예컨대, psiCHECK 활성 스크리닝 및 루시페라제 리포터 유전자 검정, 및 기타 방법, 예컨대 PCR 또는 분지된 DNA(bDNA)-기반 방법에 의해 측정 시 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상 감소시키는 한편, 표적-해당 활성을 1% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 또는 80% 이상 증가시킨다.
또한, 본 발명은 본 발명의 siRNA 또는 siRNA 접합체를 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 완전한 동물 및 식물 개체(individual)로 발달될 수 없다.
또한, 본 발명은 본 발명의 siRNA 또는 siRNA 접합체를 포함하는 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 siRNA, siRNA 접합체, 및/또는 약학 조성물을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 세포에서 표적 유전자 또는 표적 유전자의 mRNA를 침묵시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 siRNA, siRNA 접합체, 및/또는 약학 조성물을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 생체내 또는 시험관내에서 표적 유전자 또는 표적 유전자의 mRNA를 침묵시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 효과량 또는 효과 용량의 본 발명에 따른 siRNA, siRNA 접합체, 및/또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 표적 유전자 또는 표적 유전자의 mRNA를 억제하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 투여는 근육내, 기관지내, 흉강내, 복강내, 동맥내, 림프관, 정맥내, 피하, 또는 뇌척수 투여, 또는 이들의 조합을 포함하는 투여 경로를 통해 수행된다.
일부 양태에서, siRNA, siRNA 접합체, 및/또는 약학 조성물의 효과량 또는 효과 용량은 약 0.001 mg/kg 체중 내지 약 200 mg/kg 체중, 약 0.01 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중, 또는 약 0.5 mg/kg 체중 내지 약 50 mg/kg 체중이다.
일부 양태에서, 표적 유전자는 HSD17B13 유전자이다.
본 발명은 대상의 HSD17B13 유전자 발현과 관련된 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 전술한 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 제공한다. 일부 양태에서, HSD17B13 유전자 발현과 관련된 질환은 만성 섬유-염증성 간 질환이다. 일부 양태에서, 만성 섬유-염증성 간 질환은 간에서 지방구의 축적 및 확장과 관련된다.
본 발명은 간염, 간 섬유증, 비알코올성 지방간염(NASH), 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 간경변, 알코올성 지방간염(ASH), 알코올성 지방간 질환(ALD), HCV-연관 간경변, 약물-유도된 간 손상, 및 간 괴사로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 전술한 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 제공한다. 일부 양태에서, 질환은 HSD17B13 유전자 발현과 관련된다.
본 발명은 지방간을 앓는 개체의 만성 간 질환 발달의 위험을 감소시키는 데 사용하고/하거나, 지방간을 앓는 개체의 지방간의 지방 간염으로의 진행을 억제하는 데 사용하고/하거나, 간 내의 지방구의 축적을 억제하는 데 사용하기 위한 전술한 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 제공한다.
본 발명은 전술한 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 대상의 HSD17B13 유전자 발현과 관련된 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제를 제조함에 있어서의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, HSD17B13 유전자 발현과 관련된 질환은 만성 섬유-염증성 간 질환이다. 일부 양태에서, 만성 섬유-염증성 간 질환은 간에서 지방구의 축적 및 확장과 관련된다.
본 발명은 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 접합체의, 간염, 간 섬유증, 비알코올성 지방간염(NASH), 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 간경변, 알코올성 지방간염(ASH), 알코올성 지방간 질환(ALD), HCV-연관 간경변, 약물-유도된 간 손상, 및 간 괴사로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제를 제조함에 있어서의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 질환은 HSD17B13 유전자 발현과 관련된다.
본 발명은 전술한 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 접합체의, 지방간을 앓는 개체의 만성 간 질환 발달의 위험을 감소시키고/시키거나 지방간을 앓는 개체에서 지방간의 지방간염으로의 진행을 억제하고/하거나 간 내의 지방구의 축적을 억제하기 위한 약제를 제조함에 있어서의 용도를 제공한다.
본 발명은 17β-하이드록시스테로이드 탈수소효소 유형 13(HSD17B13) 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공하고, 이는 효과량 또는 효과 용량의 전술한 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 대상에서 HSD17B13 유전자 발현과 관련된 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하고, 효과량 또는 효과 용량의 전술한 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, HSD17B13 유전자 발현과 관련된 질환은 만성 섬유-염증성 간 질환이다. 일부 양태에서, 만성 섬유-염증성 간 질환은 간에서 지방구의 축적 및 확장과 관련된다.
본 발명은 간염, 간 섬유증, 비알코올성 지방간염(NASH), 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 간경변, 알코올성 지방간염(ASH), 알코올성 지방간 질환(ALD), HCV-연관 간경변, 약물-유도된 간 손상, 및 간 괴사로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하고, 이는 효과량 또는 효과 용량의 전술한 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 질환은 HSD17B13 유전자 발현과 관련된다.
본 발명은 지방간을 앓는 개체의 만성 간 질환 발달의 위험을 감소시키고/시키거나 지방간을 앓는 개체에서 지방간의 지방간염으로의 진행을 억제하고/하거나 간 내의 지방구의 축적을 억제하는 방법을 제공하고, 이는 효과량 또는 효과 용량의 전술한 siRNA 및/또는 약학 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 생체내 간에 대한 HSD17B13 유전자의 발현 및/또는 복제를 억제하는 siRNA를 전달하는 방법을 제공하고, 이는 효과량 또는 효과 용량의 약학 조성물 및/또는 siRNA 전술한 접합체를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 siRNA 또는 siRNA 접합체를 제공하고, 본 발명의 siRNA 또는 siRNA 접합체 중 어느 하나의 안티센스 가닥 내의 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 2'-메톡시 변형으로 대체된다.
또한, 본 발명은 siRNA 또는 siRNA 접합체를 제공하고, 본 발명의 siRNA 또는 siRNA 접합체 중 어느 하나의 안티센스 가닥 내의 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 화학적 변형은 2'-메톡시 변형이다.
또한, 본 발명은 siRNA 또는 siRNA 접합체를 제공하고, 발명의 siRNA 또는 siRNA 접합체 중 어느 하나의 하나 이상의 염기 U, 예컨대 1, 2, 3, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 염기 U는 염기 T로 대체된다.
본원에 기재된 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 무기 염 및 유기 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에 기재된 화합물은 산성 또는 염기성 물질과 반응하여 상응하는 염을 형성할 수 있다.
달리 특정이 없는 한, 본 발명의 "siRNA", "siRNA 접합체", "화학적 변형" 및 "표적화 리간드"는 각각 독립적으로 염, 혼합된 염, 또는 비-염(예컨대 자유 산 또는 자유 염기)의 형태로 존재할 수 있다. 염 또는 혼합된 염으로서 존재할 때, 이는 약학적으로 허용되는 염일 수 있다.
본원에 기재된 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 무기 염 및 유기 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에 기재된 화합물은 산성 또는 염기성 물질과 반응하여 상응하는 염을 형성할 수 있다.
"산성 물질과 반응하여 형성된 상응하는 염"은 어떠한 부작용도 갖지 않고 자유 염기의 생체이용성을 유지할 수 있고 무기 산 또는 무기 산에 의해 형성된 염을 지칭한다. 무기 산 염은 비제한적으로 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 설페이트, 니트레이트, 포스페이트 등을 포함하고; 무기 산 염은 비제한적으로 포르메이트, 아세테이트, 2,2-다이클로로아세테이트, 트라이플루오로아세테이트, 프로피오네이트, 카프로에이트, 카프릴레이트, 카프레이트, 운데세네이트, 글리콜레이트, 글루코네이트, 락테이트, 세바케이트, 아디페이트, 글루타레이트, 말로네이트, 옥살레이트, 말리에이트, 숙시네이트, 푸마레이트, 타르테이트, 시트레이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 올리에이트, 신나메이트, 라우레이트, 말레이트, 글루타메이트, 파이로글루타메이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 메탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 살리실레이트, 4-아미노살리실레이트, 나파다이실레이트 등을 포함한다. 이러한 염은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
"염기성 물질과 반응하여 형성된 상응하는 염"은 어떠한 부작용도 갖지 않고 자유 염기의 생체이용성을 유지할 수 있고 무기 염기 또는 무기 염기에 의해 형성된 염을 지칭한다. 무기 염기로부터 유도된 염은 비제한적으로 나트륨 염, 칼륨 염, 리튬 염, 암모늄 염, 칼슘 염, 마그네슘 염, 철 염, 아연 염, 구리 염, 망간 염, 알루미늄 염 등을 포함한다. 바람직한 무기 염은 암모늄 염, 나트륨 염, 칼륨 염, 칼슘 염 및 마그네슘 염이고; 나트륨 염이 바람직하다. 무기 염기로부터 유도된 염은 비제한적으로 하기의 염을 포함한다: 1차, 2차 및 3차 아민, 치환된 아민, 자연적으로 나타나는 치환된 아민, 환형 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대 암모니아, 이소프로필아민, 트라이메틸아민, 다이에틸아민, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민, 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트라이에탄올아민, 다이메틸에탄올아민, 2-다이메틸아미노에탄올, 2-다이에틸아미노에탄올, 다이사이클로헥실아민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 콜린, β인, 에틸렌다이아민, 글루코스아민, 메틸글루크아민, 테오브롬, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민 수지 등. 바람직한 무기 염기는 이소프로필아민, 다이에틸아민, 에탄올아민, 트라이메틸아민, 다이사이클로헥실아민, 콜린, 및 카페인을 포함한다. 이러한 염은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명의 화합물은 특정 기하 이성질체 또는 입체 이성질체 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 모든 이러한 화합물, 예컨대 시스 또는 트랜스 이성질체, (-)- 및 (+)-거울상 이성질체, (R)- 및 (S)-거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체, 및 이들의 라세미 혼합물 및 기타 혼합물, 예컨대 거울상 이성질체적으로 또는 부분입체 이성질체적으로 풍부화된(enriched) 혼합물을 포괄하고, 이들 모두는 본 발명의 범주에 속한다. 추가적인 비대칭 탄소 원자는 치환기, 예컨대 알킬 기 내에 존재할 수 있다. 모든 이러한 이성질체 및 이들의 혼합물은 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명의 화합물 및 중간체는 상이한 호변 이성질체 형태로 존재할 수 있고, 모든 이러한 형태는 본 발명의 범주에 포함된다. 용어 "호변 이성질체" 또는 "호변 이성질체 형태"는 낮은 에너지 장벽을 통해 상호변환될 수 있는 상이한 에너지의 구조적 이성질체를 지칭한다. 예컨대, 양성자 호변 이성질체(양성자 전달 호변 이성질체로도 공지되어 있음)는 양성자 이동을 통한 상호변환, 케토-엔올 및 이민-엔아민, 락탐-락팀 이성질체화를 포함한다. 락탐-락팀 평형의 예는 하기 제시되는 A와 B 사이에 존재한다.
본 발명에서 모든 화합물은 형태 A 또는 형태 B로서 도시될 수 있다. 모든 호변 이성질체 형태는 본 발명의 범주에 속한다. 화합물의 명명법은 어떠한 호변 이성질체도 포함하지 않는다.
본 발명의 화합물은 비대칭일 수 있고; 예컨대, 화합물은 하나 이상의 입체 이성질체를 가질 수 있다. 달리 특정이 없는 한, 모든 입체 이성질체는, 예컨대, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체를 포함한다. 비대칭 탄소 원자를 포함하는 본 발명의 화합물은 광학적으로 활성인 순수 형태 또는 라세미체 형태로 단리될 수 있다. 광학적으로 활성인 순수 형태는 키랄 출발 물질 또는 키랄 시약을 사용하여 라세미 혼합물로부터 단리되거나 합성될 수 있다.
광학적으로 활성인 (R)- 및 (S)-거울상 이성질체, 및 D- 및 L-이성질체는 키랄 합성, 키랄 시약 또는 기타 통상적인 기법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 특정 화합물의 하나의 거울상 이성질체를 목적하는 경우, 이는 키랄 보조제에 의한 비대칭 합성 또는 유도체화에 의해 제조될 수 있고, 생성되는 부분입체 이성질체의 혼합물이 단리되고 보조 기가 절단되어 순수한 목적하는 거울상 이성질체가 제공된다. 다르게는, 분자가 염기성 작용기(예컨대 아미노) 또는 산성 작용기(예컨대 카복실)를 함유할 때, 부분입체 이성질체의 염은 적절한 광학적으로 활성인 산 또는 염기에 의해 형성된 후, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 부분입체 이성질체가 분리되고, 순수한 거울상 이성질체가 회수에 의해 수득된다. 또한, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체의 분리는 일반적으로 키랄 고정상을 사용한 크로마토그래피(임의적으로 화학적 유도체화(예컨대 아민으로부터의 카바메이트 형성)와 조합됨)에 의해 수행된다.
또한, 본 발명은 제시되는 것과 동일하되 하나의 원자가 자연에서 통상적으로 발견되는 원자량 또는 원자수와 상이한 원자량 또는 원자수를 갖는 원자로 대체된 방사성-표지된 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물에 혼입될 수 있는 동위원소의 예는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소, 요오드, 및 염소의 동위원소, 예컨대 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F, 123I, 125I, 및 36Cl을 포함한다.
달리 특정이 없는 한, 위치가 특정히 배정된 중수소(D)일 때, 상기 위치는 중수소의 자연존재비보다 1000배 이상 큰 존재비(이는 0.015%임)를 갖는 중수소(즉, 10% 이상의 중수소 혼입)로서 해석되어야 한다. 화합물의 예는 자연 존재비보다 1000배 이상 큰, 자연 존재비보다 2000배 이상 큰, 자연 존재비보다 3000배 이상 큰, 자연 존재비보다 4000배 이상 큰, 자연 존재비보다 5000배 이상 큰, 자연 존재비보다 6000배 이상 큰 존재비를 갖는 중수소를 포함한다. 또한, 본 발명은 다양한 화학식 I 및 화학식 II의 화합물의 중수소로 치환된 형태를 포함한다. 탄소 원자에 연결된 각각의 이용가능한 수소 원자는 독립적으로 중수소 원자로 대체될 수 있다. 당업자는 관련 문헌을 참고하여 화학식 I 및 화학식 II의 화합물의 중수소로 치환된 형태를 합성할 수 있다. 시판되는 중수소로 치환된 출발 물질은 화학식 I 및 화학식 II의 화합물의 중수소로 치환된 형태를 제조하는 데 사용될 수 있거나, 중수소로 치환된 시약, 예컨대 비제한적으로 중수소로 치환된 보란, 테트라하이드로퓨란중 삼중수소로 치환된 보란, 중수소로 치환된 리튬 알루미늄 하이드라이드, 중수소로 치환된 요오도에탄, 중수소로 치환된 요오도메탄 등에 의한 통상적인 기법을 사용하여 합성될 수 있다.
"임의적으로" 또는 "임의적인"은 후속으로 기재된 사건 또는 상황이 일어나되 필수적으로 일어나지는 않음 및 상기 기재가 상기 사건 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않는 경우를 포함함을 의미한다. 예컨대, "할로겐 또는 시아노로 임의적으로 치환된 C1-6 알킬"은 할로겐 또는 시아노가 존재할 수 있되 필수적으로 존재하지는 않음 및 상기 기재가 알킬이 할로겐 또는 시아노로 치환된 경우 및 알킬이 할로겐 또는 시아노로 치환되지 않은 경우를 포함함을 의미한다.
본 발명의 화학적 구조에서, 결합 ""은 비특정된 배열을 나타내고; 즉, 키랄 이성질체가 화학적 구조 내에 존재하는 경우, 결합 ""은 "" 또는 ""이거나, "" 및 ""의 배열 둘 다를 함유할 수 있다. 상기 구조적 화학식 모두가 간단함을 위해 특정 이성질체 형태로 도시되었지만, 본 발명은 모든 이성질체, 예컨대 호변 이성질체, 회전 이성질체, 기하 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미체 및 거울상 이성질체를 포함할 것이다. 본 발명의 화학적 구조에서, 결합 ""은 배열을 특정하지 않고; 즉, 결합 ""에 대한 배열은 E 배열 또는 Z 배열이거나, E 배열 및 Z 배열 둘 다를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 표적 유전자 HSD17B13의 NM_178135.5 의 참조 서열, 즉, 서열번호 1(5'-3')의 서열은 하기와 같다:
ACACAAGGACUGAACCAGAAGGAAGAGGACAGAGCAAAGCCAUGAACAUCAUCCUAGAAAUCCUUCUGCUUCUGAUCACCAUCAUCUACUCCUACUUGGAGUCGUUGGUGAAGUUUUUCAUUCCUCAGAGGAGAAAAUCUGUGGCUGGGGAGAUUGUUCUCAUUACUGGAGCUGGGCAUGGAAUAGGCAGGCAGACUACUUAUGAAUUUGCAAAACGACAGAGCAUAUUGGUUCUGUGGGAUAUUAAUAAGCGCGGUGUGGAGGAAACUGCAGCUGAGUGCCGAAAACUAGGCGUCACUGCGCAUGCGUAUGUGGUAGACUGCAGCAACAGAGAAGAGAUCUAUCGCUCUCUAAAUCAGGUGAAGAAAGAAGUGGGUGAUGUAACAAUCGUGGUGAAUAAUGCUGGGACAGUAUAUCCAGCCGAUCUUCUCAGCACCAAGGAUGAAGAGAUUACCAAGACAUUUGAGGUCAACAUCCUAGGACAUUUUUGGAUCACAAAAGCACUUCUUCCAUCGAUGAUGGAGAGAAAUCAUGGCCACAUCGUCACAGUGGCUUCAGUGUGCGGCCACGAAGGGAUUCCUUACCUCAUCCCAUAUUGUUCCAGCAAAUUUGCCGCUGUUGGCUUUCACAGAGGUCUGACAUCAGAACUUCAGGCCUUGGGAAAAACUGGUAUCAAAACCUCAUGUCUCUGCCCAGUUUUUGUGAAUACUGGGUUCACCAAAAAUCCAAGCACAAGAUUAUGGCCUGUAUUGGAGACAGAUGAAGUCGUAAGAAGUCUGAUAGAUGGAAUACUUACCAAUAAGAAAAUGAUUUUUGUUCCAUCGUAUAUCAAUAUCUUUCUGAGACUACAGAAGUUUCUUCCUGAACGCGCCUCAGCGAUUUUAAAUCGUAUGCAGAAUAUUCAAUUUGAAGCAGUGGUUGGCCACAAAAUCAAAAUGAAAUGAAUAAAUAAGCUCCAGCCAGAGAUGUAUGCAUGAUAAUGAUAUGAAUAGUUUCGAAUCAAUGCUGCAAAGCUUUAUUUCACAUUUUUUCAGUCCUGAUAAUAUUAAAAACAUUGGUUUGGCACUAGCAGCAGUCAAACGAACAAGAUUAAUUACCUGUCUUCCUGUUUCUCAAGAAUAUUUACGUAGUUUUUCAUAGGUCUGUUUUUCCUUUCAUGCCUCUUAAAAACUUCUGUGCUUACAUAAACAUACUUAAAAGGUUUUCUUUAAGAUAUUUUAUUUUUCCAUUUAAAGGUGGACAAAAGCUACCUCCCUAAAAGUAAAUACAAAGAGAACUUAUUUACACAGGGAAGGUUUAAGACUGUUCAAGUAGCAUUCCAAUCUGUAGCCAUGCCACAGAAUAUCAACAAGAACACAGAAUGAGUGCACAGCUAAGAGAUCAAGUUUCAGCAGGCAGCUUUAUCUCAACCUGGACAUAUUUUAAGAUUCAGCAUUUGAAAGAUUUCCCUAGCCUCUUCCUUUUUCAUUAGCCCAAAACGGUGCAACUCUAUUCUGGACUUUAUUACUUGAUUCUGUCUUCUGUAUAACUCUGAAGUCCACCAAAAGUGGACCCUCUAUAUUUCCUCCCUUUUUAUAGUCUUAUAAGAUACAUUAUGAAAGGUGACCGACUCUAUUUUAAAUCUCAGAAUUUUAAGUUCUAGCCCCAUGAUAACCUUUUUCUUUGUAAUUUAUGCUUUCAUAUAUCCUUGGUCCCAGAGAUGUUUAGACAAUUUUAGGCUCAAAAAUUAAAGCUAACACAGGAAAAGGAACUGUACUGGCUAUUACAUAAGAAACAAUGGACCCAAGAGAAGAAAAGGAAGAAAGAAAGGUUUUUUGGUUUUUGUUUUGUUUUGUUUUGUUUUUUGUUUUUUUGAGAUGGAGUCUCACUCUUUCGCCCAGGCUGGAGUGCAGUGGUAUGAUCUCAGCUCACUGCAAGCUCCACCUCCCGGGUUCACGCCAUUCUCCUGCCUCAGCCUCCUGAGUAGCUGGGACUACAGGCGCCCGCCACCACACCCGGCUAAUUUUUUGUAUUUUUUGUAGAGACGGGGUUUCACCAUGUUAGCCAAGAUGGUCUCGAUCUCCUGACCUCGUGAUCCACCUGCCUCGGCCUCCCAAAGUGCUGGGAUUACGGGUGUGAGCCACCGUGCCCAGCCUUUUUUUUUUUAAUAGAAAAAAUAAUCCGACUCCCACUACAUCAAGACUAAUCUUGUUUUGUGUGUUUUUCACAUGUAUUAUAGAAUGCUUUUGCAUGGACUAUCCUCUUGUUUUUAUUAAAAACAAAUGAUUUUUUUAAAAGUCACAAAAACAAUUCACUAAAAAUAAAUAUGUCAUUGUGCUUUAAAAAAAUAACCUCUUGUAGUUAUAAAAUAAAACGUUUGACUUCUAAA;
본 발명에서, 서열번호 2(5'-3')의 서열은 하기와 같다:
UUUAGAAGUCAAACGUUUUAUUUUAUAACUACAAGAGGUUAUUUUUUUAAAGCACAAUGACAUAUUUAUUUUUAGUGAAUUGUUUUUGUGACUUUUAAAAAAAUCAUUUGUUUUUAAUAAAAACAAGAGGAUAGUCCAUGCAAAAGCAUUCUAUAAUACAUGUGAAAAACACACAAAACAAGAUUAGUCUUGAUGUAGUGGGAGUCGGAUUAUUUUUUCUAUUAAAAAAAAAAAGGCUGGGCACGGUGGCUCACACCCGUAAUCCCAGCACUUUGGGAGGCCGAGGCAGGUGGAUCACGAGGUCAGGAGAUCGAGACCAUCUUGGCUAACAUGGUGAAACCCCGUCUCUACAAAAAAUACAAAAAAUUAGCCGGGUGUGGUGGCGGGCGCCUGUAGUCCCAGCUACUCAGGAGGCUGAGGCAGGAGAAUGGCGUGAACCCGGGAGGUGGAGCUUGCAGUGAGCUGAGAUCAUACCACUGCACUCCAGCCUGGGCGAAAGAGUGAGACUCCAUCUCAAAAAAACAAAAAACAAAACAAAACAAAACAAAAACCAAAAAACCUUUCUUUCUUCCUUUUCUUCUCUUGGGUCCAUUGUUUCUUAUGUAAUAGCCAGUACAGUUCCUUUUCCUGUGUUAGCUUUAAUUUUUGAGCCUAAAAUUGUCUAAACAUCUCUGGGACCAAGGAUAUAUGAAAGCAUAAAUUACAAAGAAAAAGGUUAUCAUGGGGCUAGAACUUAAAAUUCUGAGAUUUAAAAUAGAGUCGGUCACCUUUCAUAAUGUAUCUUAUAAGACUAUAAAAAGGGAGGAAAUAUAGAGGGUCCACUUUUGGUGGACUUCAGAGUUAUACAGAAGACAGAAUCAAGUAAUAAAGUCCAGAAUAGAGUUGCACCGUUUUGGGCUAAUGAAAAAGGAAGAGGCUAGGGAAAUCUUUCAAAUGCUGAAUCUUAAAAUAUGUCCAGGUUGAGAUAAAGCUGCCUGCUGAAACUUGAUCUCUUAGCUGUGCACUCAUUCUGUGUUCUUGUUGAUAUUCUGUGGCAUGGCUACAGAUUGGAAUGCUACUUGAACAGUCUUAAACCUUCCCUGUGUAAAUAAGUUCUCUUUGUAUUUACUUUUAGGGAGGUAGCUUUUGUCCACCUUUAAAUGGAAAAAUAAAAUAUCUUAAAGAAAACCUUUUAAGUAUGUUUAUGUAAGCACAGAAGUUUUUAAGAGGCAUGAAAGGAAAAACAGACCUAUGAAAAACUACGUAAAUAUUCUUGAGAAACAGGAAGACAGGUAAUUAAUCUUGUUCGUUUGACUGCUGCUAGUGCCAAACCAAUGUUUUUAAUAUUAUCAGGACUGAAAAAAUGUGAAAUAAAGCUUUGCAGCAUUGAUUCGAAACUAUUCAUAUCAUUAUCAUGCAUACAUCUCUGGCUGGAGCUUAUUUAUUCAUUUCAUUUUGAUUUUGUGGCCAACCACUGCUUCAAAUUGAAUAUUCUGCAUACGAUUUAAAAUCGCUGAGGCGCGUUCAGGAAGAAACUUCUGUAGUCUCAGAAAGAUAUUGAUAUACGAUGGAACAAAAAUCAUUUUCUUAUUGGUAAGUAUUCCAUCUAUCAGACUUCUUACGACUUCAUCUGUCUCCAAUACAGGCCAUAAUCUUGUGCUUGGAUUUUUGGUGAACCCAGUAUUCACAAAAACUGGGCAGAGACAUGAGGUUUUGAUACCAGUUUUUCCCAAGGCCUGAAGUUCUGAUGUCAGACCUCUGUGAAAGCCAACAGCGGCAAAUUUGCUGGAACAAUAUGGGAUGAGGUAAGGAAUCCCUUCGUGGCCGCACACUGAAGCCACUGUGACGAUGUGGCCAUGAUUUCUCUCCAUCAUCGAUGGAAGAAGUGCUUUUGUGAUCCAAAAAUGUCCUAGGAUGUUGACCUCAAAUGUCUUGGUAAUCUCUUCAUCCUUGGUGCUGAGAAGAUCGGCUGGAUAUACUGUCCCAGCAUUAUUCACCACGAUUGUUACAUCACCCACUUCUUUCUUCACCUGAUUUAGAGAGCGAUAGAUCUCUUCUCUGUUGCUGCAGUCUACCACAUACGCAUGCGCAGUGACGCCUAGUUUUCGGCACUCAGCUGCAGUUUCCUCCACACCGCGCUUAUUAAUAUCCCACAGAACCAAUAUGCUCUGUCGUUUUGCAAAUUCAUAAGUAGUCUGCCUGCCUAUUCCAUGCCCAGCUCCAGUAAUGAGAACAAUCUCCCCAGCCACAGAUUUUCUCCUCUGAGGAAUGAAAAACUUCACCAACGACUCCAAGUAGGAGUAGAUGAUGGUGAUCAGAAGCAGAAGGAUUUCUAGGAUGAUGUUCAUGGCUUUGCUCUGUCCUCUUCCUUCUGGUUCAGUCCUUGUGU.
도 1은 뮤린 1차 간세포 mTTR에 대한 GalNAc-접합된 siRNA의 억제 활성을 도시한다.
도 2는 뮤린 mTTR 유전자에 대한 생체내 GalNAc-접합된 siRNA의 억제 활성을 도시한다.
본 발명의 이해를 돕기 위해, 일부 기술적 및 과학적 용어는 하기 구체적으로 정의된다. 본원에 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 다른 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
RNA-매개되는 유전자 침묵화의 맥락에서 본원에 사용되는, siRNA의 센스 가닥(SS 또는 SS 가닥으로도 지칭됨)은 표적 mRNA 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 가닥을 지칭하고; siRNA의 안티센스 가닥(AS 또는 AS 가닥으로도 지칭됨)은 표적 mRNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 가닥을 지칭한다.
용어 "상보적" 및 "역 상보적"은 상호대체가능하게 사용되고 당업자에게 주지된 의미를 갖고, 즉, 이중가닥화된 핵산 분자에서, 하나의 가닥의 염기는 다른 가닥의 염기와 상보적 방식으로 페어링된다. DNA에서, 퓨린 염기 아데닌(A)은 피리미딘 염기 타이민(T)(또는 RNA의 우라실(U))과 페어링되고, 퓨린 염기 구아닌(C)은 피리미딘 염기 사이토신(G)과 페어링된다. 각각의 염기 쌍은 퓨린 및 피리미딘을 포함한다. 하나의 가닥의 아데닌이 다른 가닥의 타이민(또는 우라실)과 페어링되고 구어닌이 항상 사이토신과 페어링될 때, 2개의 가닥은 서로 상보적인 것으로 간주되고, 가닥의 서열은 이의 상보적 가닥의 서열로부터 추론될 수 있다. 따라서, 당업계에서 "미스매치"는 이중가닥화된 핵산에서, 상응하는 위치에서의 염기가 상보적 방식으로 페어링되지 않음을 의미한다.
용어 "염기"는 임의의 공지된 DNA 및 RNA 염기 및 염기 유사체, 예컨대 퓨린 또는 피리미딘을 포함하고, 또한, 천연 화합물 아데닌, 타이민, 구아닌, 사이토신, 우라실, 및 이노신 및 천연 유사체를 포함한다.
용어 "염기 유사체"는 변형된 뉴클레오티드에서 뉴클레오티드 당 모이어티의 1'-위치에 위치하는 헤테로환형 모이어티를 지칭하고, 이는 핵산 듀플렉스(duplex)(또는 핵산 듀플렉스에 혼입될 수 있는 뉴클레오티드 당 모이어티 치환의 등가 위치)에 혼입될 수 있다. 본 발명에서, 염기 유사체는 일반적으로 공통 염기를 제외한 하기 퓨린 또는 피리미딘 염기이다: 구아닌(G), 사이토신(C), 아데닌(A), 타이민(T), 및 우라실(U). 염기의 비제한적인 예는 하이포잔틴(I), 잔틴(X), 3β-D-리보퓨라노실-(2,6-다이아미노피리미딘)(K), 3-β-D-리보퓨라노실-(1-메틸-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5,7(4H,6H)-다이온)(P), 이소사이토신(이소-C), 이소구아닌(이소-G), 1-β-D-리보퓨라노실-(5-니트로인돌), 1-β-D-리보퓨라노실-(3-니트로피롤), 5-브로모우라실, 2-아미노퓨린, 4-티오-dT, 7-(2-티엔일)-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds) 및 피롤-2-카발데히드(Pa), 2-아미노-6-(2-티엔일)퓨린 (S), 2-옥소피리딘(Y), 다이플루오로톨일, 4-플루오로-6-메틸벤즈이미다졸, 4-메틸벤즈이미다졸, 3-메틸하이드록시이소퀴놀린, 5-메틸하이드록시이소퀴놀린 및 3-메틸-7-프로핀일 하이드록시이소퀴놀린, 7-아자인돌일, 6-메틸-7-아자인돌일, 이미다조피리딘일, 9-메틸-이미다조피리딘일, 피롤로피라진일, 하이드록시이소퀴놀린, 7-프로핀일 하이드록시이소퀴놀린, 프로핀일-7-아자인돌일, 2,4,5-트라이메틸페닐, 4-메틸인돌일, 4,6-다이메틸인돌일, 페닐, 나프틸, 안트라센일, 페난트렌일, 파이렌일, 스틸벤질, 테트라센일, 및 펜타센일 및 이들의 구조적 유도체를 포함한다. 염기 유사체는 또한 유니버셜(universal) 염기일 수 있다.
용어 "유니버셜 염기"는 변형된 뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드 당 모이어티의 1'-위치, 또는 뉴클레오티드 당 모이어티 치환에서 등가 위치에 위치하는 헤테로환형 모이어티를 지칭하고, 헤테로환형 모이어티는, 핵산 듀플렉스에 존재할 때, 이중 나선 구조(예컨대, 포스페이트 골격의 구조)를 변경함 없이 염기의 하나 이상의 유형과 페어링될 수 있다. 또한, 유니버셜 염기는 표적 핵산에 의해 듀플렉스를 형성하는 단일 가닥화된 핵산을 파괴하지 않는다. 표적 핵산에 의해 듀플렉스를 형성하는 유니버셜 염기를 함유하는 단일 가닥화된 핵산의 능력은 당업자에게 명확한 방법(예컨대 UV 흡광도, 원형 이색성(circular dichroism), 겔 이동, 단일 가닥화된 뉴클레아제 민감성 등)을 사용하여 측정될 수 있다. 또한, 듀플렉스 형성이 관찰되는 조건, 예컨대 듀플렉스 안정성과 관련된 온도, 예컨대 융점(Tm)은 듀플렉스 안정성 또는 형성을 측정하기 위해 변경될 수 있다. 표적 핵산에 대해 정확히 상보적인 참조 단일 가닥화된 핵산과 비교하여, 유니버셜 염기를 함유하는 단일 가닥화된 핵산은 상보적 핵산에 의해 형성된 듀플렉스보다 낮은 Tm을 갖는 표적 핵산을 갖는 듀플렉스를 형성한다. 그러나, 유니버셜 염기가 단일 미스매치를 생성하는 염기로 대체된 참조 단일 가닥화된 핵산과 비교하여, 유니버셜 염기를 함유하는 단일 가닥화된 핵산은 미스매칭된 염기를 갖는 핵산에 의해 형성된 듀플렉스 보다 높은 Tm을 갖는다.
일부 유니버셜 염기는 염기 페어링 조건하에 유니버셜 염기와 염기 구아닌(G), 사이토신(C), 아데닌(A), 타이민(T), 및 우라실(U) 모두 사이에 수소 결합을 형성함으로써 염기 페어링을 할 수 있다. 유니버셜 염기는 단 하나의 상보적 염기에 의해 염기를 형성하는 염기가 아니다. 듀플렉스에서, 유니버셜 염기는 수소 결합을 전혀 형성하지 않거나, 하나의 수소 결합, 또는 듀플렉스의 대응(opposite) 가닥에서 이에 대응하는 각각의 G, C, A, T, 및 U에 의한 하나 이상의 하나 이상의 수소 결합을 형성할 수 있다. 일부 양태에서, 유니버셜 염기는 듀플렉스의 대응 가닥에서 이에 대응하는 염기와 상호작용하지 않는다. 듀플렉스에서, 유니버셜 염기에 의한 염기 페어링은 포스페이트 골격의 이중 나선 구조를 변경하지 않을 것이다. 또한, 유니버셜 염기는 적층(stacking) 상호작용에 의해 동일한 핵산 가닥에서 인접 뉴클레오티드 내의 염기와 상호작용할 수 있다. 이러한 적층 상호작용은, 특히 유니버셜 염기가 듀플렉스의 대응 가닥에서 이에 대응하는 염기에 의해 어떠한 수소 결합도 형성하지 않는 경우, 듀플렉스를 안정화할 수 있다. 유니버셜 결합 뉴클레오티드의 비제한적인 예는 이노신, 1-β-D-리보퓨라노실-5-니트로인돌, 및/또는 1-β-D-리보퓨라노실-3-니트로피롤을 포함한다.
용어 "평활 말단" 및 "평활 말단부"는 상호대체가능하게 사용되고, 페어링된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 갖지 않는, 즉, 뉴클레오티드 오버행을 갖지 않는 소정 siRNA의 말단을 지칭한다. 대부분의 경우에서, 말단 둘 다가 평활 말단인 siRNA는 이의 전체 길이에 걸쳐 이중가닥화될 것이다.
본 발명에서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 "5' 영역", 즉, "5' 말단" 및 "5' 말단부"는 상호대체가능하게 사용된다. 예컨대, 안티센스 가닥의 5' 영역의 위치 2 내지 8에서의 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 5' 말단의 위치 2 내지 8에서의 뉴클레오티드로 대체될 수 있다. 유사하게, 센스 또는 안티센스 가닥의 "3' 영역", "3' 말단부" 및 "3' 말단" 또한 상호대체가능하게 사용된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "화학적 변형" 또는 "변형"은 화학적 방법, 예컨대 화학적 모이어티의 첨가 또는 제거, 또는 하나의 화학적 모이어티의 또다른 하나로의 치환에 의해 달성되는 모든 변화를 의미한다.
용어 "2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 리보실 기의 2'-위치에서의 하이드록시 기가 불소로 치환된 뉴클레오티드를 지칭한다. "비-불화된 변형된 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 리보실 기의 2'-위치에서의 하이드록시 기가 비-불소 기로 치환된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 지칭한다. "뉴클레오티드 유사체"는 핵산 내의 뉴클레오티드를 대체할 수 있되, 아데닌 리보뉴클레오티드, 구아닌 리보뉴클레오티드, 사이토신 리보뉴클레오티드, 우라실 리보뉴클레오티드, 또는 타이민 데옥시리보뉴클레오티드와는 상이한 구조를 갖는 기, 예컨대 이소뉴클레오티드, 가교된 핵산(줄여서 BNA), 또는 비환형 뉴클레오티드를 지칭한다. 메톡시-개질된 뉴클레오티드는 리보실 기의 2'-하이드록시 기가 메톡시 기로 치환된 뉴클레오티드를 지칭한다. 이소뉴클레오티드는 뉴클레오티드에서 리보스 고리에서 염기의 위치를 변경함으로써 형성된 화합물을 지칭한다. 일부 양태에서, 이소뉴클레오티드는 리보소 고리의 1'-위치로부터 2'-위치 또는 3'-위치로 염기를 이동시킴으로써 형성된 화합물일 수 있다. BNA는 강제된 또는 접근불가능한 뉴클레오티드를 지칭한다. BNA는 C3'-엔도(endo) 당 퍼커링(puckering)에 의해 "고정된" 5-원, 6-원, 또는 7-원 고리 가교된 구조를 함유할 수 있다. 가교는 일반적으로 리보스의 2'- 및 4'-위치에서 혼입되어 2',4'-BNA 뉴클레오티드를 생성한다. 일부 양태에서, BNA는 LNA, ENA, cET BNA 등이다. 비환형 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 당 고리가 열린 뉴클레오티드의 부류이다. 일부 양태에서, 비환형 뉴클레오티드는 라킹되지 않은 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA)일 수 있다.
용어 "억제하다"는 "감소시키다", "침묵시키다", "하향조절하다", "억압하다" 및 기타 유사 용어는 상호대체가능하게 사용되고, 임의의 억제 수준을 포함한다. 억제는 대조군 수준에 대한 상기 변수들 중 하나 이상의 절대적 또는 상대적 수준의 감소의 용어로 평가될 수 있다. 대조군 수준은 당업계에서 사용되는 임의의 유형의 대조군 수준, 예컨대 사전-용량(pre-dose) 기준선 수준 또는 미처리된 또는 대조군(예컨대 완충액 대조군 또는 불활성제 대조군) 처리된 대상, 세포, 또는 샘플로부터 측정된 수준일 수 있다. 예컨대, mRNA의 잔류 발현 수준은 siRNA에 의한 표적 유전자 발현의 억제 정도를 특성규명하는데 사용될 수 있고; 예컨대, mRNA의 잔류 발현 수준은 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 또는 10%이다. 표적 유전자 발현의 억제율은 이중-Glo® 루시페라제 검정 시스템을 사용하여 측정될 수 있다: 반딧불 화학발광값(Fir) 및 레닐라 화학발광값(Ren)이 각각 판독되고, 상대적인 값의 비 = Ren/Fir 및 억제율(%) = 1 - (비 + siRNA/비(리포터 단독)) Х 100%가 계산되고; 본 발명에서, mRNA의 잔류 발현 수준(또는 잔류 활성 %)의 비율 = 100% - 억제(%)이다.
용어 "효과량" 또는 "효과 용량"은 임의의 하나 이상의 유익한 또는 목적하는 치료 결과를 수득하는 데 필요한 약물, 화합물 또는 약학 조성물의 양을 지칭한다. 예방적 사용을 위해, 유익한 또는 목적하는 결과는 질병(질병의 생화학, 조직학 및/또는 거동적 증상, 이의 합병증, 및 징병의 진행 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형 포함)의 위험의 제거 또는 감소, 중증도의 감소, 또는 개시의 지연을 포함한다. 치료적 적용을 위해, 유익한 또는 목적하는 결과는 환자의 임상적 결과, 예컨대 본 발명의 표적 유전자, 표적 mRNA, 또는 표적 단백질과 관련된 다양한 질병의 발생률을 감소시키는 것, 또는 질병의 하나 이상의 증상을 완화하는 것, 질병을 치료하는 데 필요한 기타 제제의 용량을 감소시키는 것, 또다른 제제의 치료 효과를 향상시키는 것, 및/또는 본 발명의 표적 유전자, 표적 mRNA, 또는 표적 단백질과 관련된 질병의 진행을 지연시키는 것을 포함한다.
용어 "환자", "대상" 및 "개체"는 상호대체가능하게 사용되고, 인간 또는 비-인간 동물, 예컨대 포유동물, 예컨대 인간 또는 원숭이를 포함한다.
본 발명에 의해 제공되는 siRNA는 당업계의 통상적인 제조 방법(예컨대 고체-상 합성 및 액체-상 합성)에 의해 수득될 수 있다. 고체 상 합성은 소비자 서비스로서 시판되어 왔다. 변형된 뉴클레오티드 군은 상응하는 변형을 갖는 뉴클레오시드 단량체를 사용하여 siRNA로 도입될 수 있다. 상응하는 변형을 갖는 뉴클레오시드 단량체를 제조하고 변형된 뉴클레오티드 군을 siRNA에 도입하는 방법 또한 당업자에게 공지되어 있다.
용어 "약학 조성물"는 본원에 기재된 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적으로 약학적으로 허용되는 염 또는 전구 약물, 및 기타 화학적 성분, 예컨대, 생리학적으로 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 함유하는 혼합물을 지칭한다. 약학 조성물은 유기체에 대한 투여를 촉진하도록 의도되고, 이는 활성 성분의 흡수를 용이하게 함으로써 생물학적 활성을 발휘한다.
용어 "약학적으로 허용되는 부형제"는 비제한적으로 인간 또는 가축 동물에게 허용가능한 것으로 FDA에 의해 승인된 임의의 어드주번트, 담체, 부형제, 유동화제(glidant), 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등장성 제제, 용매 또는 유화제를 포함한다.
용어 "효과량" 또는 "치료 효과량"은 의학적 질병의 증상 또는 질병을 완화 또는 예방하기에 충분한 양을 포함한다. 또한, 효과량은 진단을 허용 또는 용이하게 하기에 충분한 양을 지칭한다. 특정 대상 또는 수의학적 대상에 대한 효과량은 요인, 예컨대 치료될 질병, 대상의 일반적 건강, 투여의 방법, 경로 및 용량, 및 부작용의 중증도에 따라 다를 수 있다. 효과량은 상당한 부작용 또는 독성 효과를 피하기 위한 최대 용량 또는 투여 요법일 수 있다.
용어 "알킬"은 1 내지 20 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 기인 포화 지방족 탄화수소 기를 지칭한다. 일부 양태에서, 알킬은 1 내지 12 탄소 원자를 함유하는 알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 비제한적인 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, sec-부틸, n-펜틸, 1,1-다이메틸프로필, 1,2-다이메틸프로필, 2,2-다이메틸프로필, 1-에틸프로필, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, n-헥실, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트라이메틸프로필, 1,1-다이메틸부틸, 1,2-다이메틸부틸, 2,2-다이메틸부틸, 1,3-다이메틸부틸, 2-에틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2,3-다이메틸부틸, n-헵틸, 2-메틸헥실, 3-메틸헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실, 2,3-다이메틸펜틸, 2,4-다이메틸펜틸, 2,2-다이메틸펜틸, 3,3-다이메틸펜틸, 2-에틸펜틸, 3-에틸펜틸, n-옥틸, 2,3-다이메틸헥실, 2,4-다이메틸헥실, 2,5-다이메틸헥실, 2,2-다이메틸헥실, 3,3-다이메틸헥실, 4,4-다이메틸헥실, 2-에틸헥실, 3-에틸헥실, 4-에틸헥실, 2-메틸-2-에틸펜틸, 2-메틸-3-에틸펜틸, n-논일, 2-메틸-2-에틸헥실, 2-메틸-3-에틸헥실, 2,2-다이에틸펜틸, n-데실, 3,3-다이에틸헥실, 및 2,2-다이에틸헥실 및 이의 다양한 분지형 이성질체 등을 포함한다. 일부 양태에서, 알킬은 1 내지 6 탄소 원자를 함유하는 알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되고; 비제한적인 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, sec-부틸, n-펜틸, 1,1-다이메틸프로필, 1,2-다이메틸프로필, 2,2-다이메틸프로필, 1-에틸프로필, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, n-헥실, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트라이메틸프로필, 1,1-다이메틸부틸, 1,2-다이메틸부틸, 2,2-다이메틸부틸, 1,3-다이메틸부틸, 2-에틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2,3-다이메틸부틸 등을 포함한다. 알킬은 치환되거나 비치환될 수 있고, 치환될 때, 치환기는 임의의 접근가능한 연결 부위에서 치환될 수 있고, 일부 양태에서, 치환기는 알킬, 알켄일, 알킨일, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 설프하이드릴, 하이드록시, 니트로, 시아노, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알콕시, 헤테로사이클로알콕시, 사이클로알킬티오, 헤테로사이클로알킬티오, 옥소, 카복실, 및 카복실레이트 기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어 "알콕시"는 -O-(알킬) 및 -O-(비치환된 사이클로알킬)을 지칭하고, 상기 알킬은 상기 정의된 바와 같다. 알콕시의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 사이클로프로필옥시, 사이클로부톡시, 사이클로펜틸옥시, 및 사이클로헥실옥시. 알콕시는 임의적으로 치환되거나 비치환될 수 있고, 치환될 때, 일부 양태에서, 치환기는 하기 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알켄일옥시, C2-6 알킨일옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3- 내지 6-원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알켄일옥시, 및 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 기 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알켄일옥시, C2-6 알킨일옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3- 내지 6-원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알켄일옥시, 및 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 및 시아노로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기로 임의적으로 치환된다. 유사하게, "알킨일옥시", "알켄일옥시", "사이클로알콕시", "헤테로사이클로알콕시" 및 "사이클로알켄일옥시"는 상기 "알콕시"에 대해 정의된 바와 같다.
용어 "알켄일"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하고 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 비-방향족 탄화수소 기를 지칭한다. 5개 이하의 탄소-탄소 이중 결합이 상기 기에 존재할 수 있다. 예컨대, "C2-C6" 알켄일은 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알켄일 기로서 정의된다. 알켄일의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 에텐일, 프로펜일, 부텐일, 및 사이클로헥센일. 알켄일의 선형, 분지형, 또는 환형 모이어티는 이중 결합을 함유할 수 있고 정상 원자가에 의해 허용됨에 따라 임의의 위치에서 임의적으로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환, 또는 오치환된다.
용어 "사이클로알켄일"은 특정된 개수의 탄소 원자 및 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 일환형 탄화수소 기를 지칭한다.
용어 "알킨일"은 2 내지 10개의 탄소 원자를 함유하고 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 선형 또는 분지형 탄화수소 기를 지칭한다. 5개 이하의 탄소-탄소 삼중 결합이 존재할 수 있다. 따라서, "C2-C6 알킨일"은 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킨일 기를 지칭한다. 알킨일 기의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 에틴일, 2-프로핀일, 및 2-부틴일. 선형 또는 알킨일의 분지형 모이어티는 정상 원자가에 의해 허용되는 삼중 결합을 함유할 수 있고, 정상 원자가에 의해 허용됨에 따라 임의의 위치에서 임의적으로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환, 또는 오치환된다.
용어 "케톤"은 카본일 가교를 통해 연결된 본원에 기재된 임의의 알킬, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 헤테로사이클일, 헤테로아릴, 또는 아릴 기를 지칭한다. 케톤 기의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 알카노일(예컨대 아세틸, 프로피온일, 부티르일, 펜타노일, 및 헥사노일), 에노일(예컨대 아크릴로일), 알키노일(예컨대 에틴일아실, 프로피노일, 부티노일, 펜티노일, 및 헥시노일), 아로일(예컨대 벤조일), 및 헤테로아로일(예컨대 피롤일, 이미다졸일, 퀴놀리노일, 및 피콜리노일).
용어 "알콕시카본일"는 카본일 가교(즉, -C(O)O-알킬)를 통해 연결된 상기 정의된 임의의 알콕시 기를 지칭한다. 알콕시카본일의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 메톡시카본일, 에톡시카본일, 이소프로폭시카본일, n-프로폭시카본일, tert-부톡시카본일, 벤질옥시카본일, 또는 n-펜톡시카본일.
용어 "아릴옥시카본일"는 옥시카본일 가교(즉, -C(O)O-아릴)를 통해 연결된 상기 정의된 임의의 아릴 기를 지칭한다. 아릴옥시카본일의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 펜옥시카본일 및 나프틸옥시카본일.
용어 "헤테로아릴옥시카본일"는 옥시카본일 가교(즉, -C(O)O-헤테로아릴)를 통해 연결된 상기 정의된 임의의 헤테로아릴 기를 지칭한다. 헤테로아릴옥시카본일의 예는 비제한적으로 하기를 포함한다: 2-피리딜옥시카본일, 2-옥사졸일옥시카본일, 4-티아졸일옥시카본일, 또는 피리미딜옥시카본일.
용어 "사이클로알킬" 또는 "탄소환"은 포화 또는 부분 불포화 일환형 또는 다환형 환형 탄화수소 치환기를 지칭하고, 사이클로알킬 고리는 3 내지 20개의 탄소 원자를 함유한다. 일부 양태에서, 사이클로알킬은 3 내지 7개의 탄소 원자를 함유하는 사이클로알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일환형 사이클로알킬의 비제한적인 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜텐일, 사이클로헥실, 사이클로헥센일, 사이클로헥사다이엔일 등을 포함한다. 다환형 사이클로알킬은 스피로 사이클로알킬, 융합된사이클로알킬, 및 가교된 사이클로알킬를 포함한다. 사이클로알킬은 치환되거나 비치환될 수 있고, 치환될 때, 치환기는 임의의 접근가능한 연결 부위에서 치환될 수 있고; 일부 양태에서, 치환기는 하기 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알켄일옥시, C2-6 알킨일옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3- 내지 6-원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알켄일옥시, 및 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 기 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알켄일옥시, C2-6 알킨일옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3- 내지 6-원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알켄일옥시, 및 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 및 시아노로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기로 임의적으로 치환된다.
사이클로알킬 고리는 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 융합될 수 있고, 모 구조에 부착된 고리는 사이클로알킬이다. 사이클로알킬 고리의 비제한적인 예는 인단일, 테트라하이드로나프틸, 벤조사이클로헵틸 등을 포함한다. 사이클로알킬은 임의적으로 치환되거나 비치환될 수 있고, 치환될 때, 일부 양태에서, 치환기는 하기 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알켄일옥시, C2-6 알킨일옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3- 내지 6-원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알켄일옥시, 및 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 기 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알켄일옥시, C2-6 알킨일옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3- 내지 6-원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알켄일옥시, 및 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 및 시아노로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기로 임의적으로 치환된다.
용어 "헤테로사이클로알킬", "헤테로환" 또는 "헤테로사이클일"은 3 내지 20개의 고리 원자를 함유하는 포화 또는 부분 불포화 일환형 또는 다환형 사이클로탄화수소 치환기를 지칭하고, 고리 원자 중 하나 이상은 질소, 산소, 및 S(O)m(m은 0 내지 2의 정수임)로 이루어지되, -O-O-, -O-S-, 또는 -S-S-의 환형 모이어티는 배제되는 군으로부터 선택되는 헤테로원자이고, 나머지 고리 원자는 탄소 원자이다. 일부 양태에서, 헤테로사이클로알킬은 3 내지 12개의 고리 원자(이 중 1 내지 4개는 헤테로원자임)를 함유하는 헤테로사이클로알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 헤테로사이클로알킬은 3 내지 7개의 고리 원자를 함유하는 헤테로사이클로알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일환형 헤테로사이클로알킬의 비제한적인 예는 피롤리딘일, 이미다졸리딘일, 테트라하이드로퓨란일, 테트라하이드로티엔일, 다이하이드로이미다졸일, 다이하이드로퓨란일, 다이하이드로피라졸일, 다이하이드로피롤일, 피페리딘일, 피페라진일, 모르폴린일, 티오모르폴린일, 호모피페라진일 등을 포함한다. 다환형 헤테로사이클로알킬은 스피로 헤테로사이클일, 융합된헤테로사이클일, 및 가교된 헤테로사이클로알킬을 포함한다. "헤테로사이클로알킬"의 비제한적인 예는 하기를 포함한다:
헤테로사이클로알킬 고리는 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 융합될 수 있고, 모 구조에 부착된 고리는 헤테로사이클로알킬이다. 헤테로사이클로알킬 고리의 비제한적인 예눈 비제한적으로 하기를 포함한다:
, , , 등.
헤테로사이클로알킬은 임의적으로 치환되거나 비치환될 수 있고, 치환될 때, 일부 양태에서, 치환기는 하기 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알켄일옥시, C2-6 알킨일옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3- 내지 6-원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알켄일옥시, 및 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 기 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알켄일옥시, C2-6 알킨일옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3- 내지 6-원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알켄일옥시, 및 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 및 시아노로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기로 임의적으로 치환된다.
용어 "아릴"는 공액된 π-전자 시스템을 갖는 6- 내지 14-원 all-탄소 일환형 또는 융합된 다환형(즉, 인접한 탄소 원자의 쌍을 공유하는 고리) 기를 지칭한다. 일부 양태에서, 아릴은 6- 내지 12-원 아릴 기, 예컨대 페닐 및 나프틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아릴 고리는 헤테로아릴, 헤테로사이클로알킬 또는 사이클로알킬 고리에 융합될 수 있고, 모 구조에 부착된 고리는 아릴 고리이다. 비제한적인 예는 비제한적으로 하기를 포함한다:
, , , , , , , , , , , 및 .
아릴은 치환되거나 비치환될 수 있고, 치환될 때, 일부 양태에서, 치환기는 하기 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알켄일옥시, C2-6 알킨일옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3- 내지 6-원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알켄일옥시, 및 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 기 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알켄일옥시, C2-6 알킨일옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3- 내지 6-원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알켄일옥시, 및 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 및 시아노로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기로 임의적으로 치환된다.
용어 "헤테로아릴"는 1 내지 4개의 헤테로원자 및 5 내지 14개의 고리 원자를 함유하는 헤테로방향족 시스템을 지칭하고, 헤테로원자는 산소, 황, 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 헤테로아릴은 6- 내지 12-원 헤테로아릴 기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 추가 양태에서, 5- 및 6-원 헤테로아릴 기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 이미다졸일, 퓨릴, 티엔일, 티아졸일, 피라졸일, 옥사졸일, 이속사졸일, 피롤일, 테트라졸일, 피리딜, 피리미딘일, 티아다이아졸, 피라진일, 트라이아졸일, 인다졸일, 벤즈이미다졸일, , , 등.
헤테로아릴 고리는 아릴, 헤테로사이클로알킬, 또는 사이클로알킬 고리에 융합될 수 있고, 모 구조에 부착된 고리는 헤테로아릴 고리이다. 헤테로아릴 고리의 비제한적인 예는 하기를 포함한다:
, , , , , , , , 및 .
헤테로아릴은 임의적으로 치환되거나 비치환될 수 있고, 치환될 때, 일부 양태에서, 치환기는 하기 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알켄일옥시, C2-6 알킨일옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3- 내지 6-원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알켄일옥시, 및 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 기 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C2-6 알켄일옥시, C2-6 알킨일옥시, C3-6 사이클로알콕시, 3- 내지 6-원 헤테로사이클로알콕시, C3-8 사이클로알켄일옥시, 및 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴은 할로겐, 중수소, 하이드록시, 옥소, 니트로 및 시아노로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기로 임의적으로 치환된다.
용어 "하이드록시"는 -OH 기를 지칭한다.
용어 "할로겐"는 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드를 지칭한다.
용어 "할로알킬"는 할로겐으로 치환된 알킬 기를 지칭하고, 알킬 기는 상기 정의된 바와 같다.
용어 "시아노"는 -CN을 지칭한다.
용어 "니트로"는 -NO2를 지칭한다.
용어 "옥소"는 =O 군을 지칭한다. 예컨대, 탄소 원자는 이중 결합에 의해 산소 원자에 연결되어 케톤 또는 알데히드 기를 형성한다.
용어 "아미노"는 -NH2를 지칭한다.
용어 "카복실"는 -C(O)OH 를 지칭한다.
용어 "알데히드"는 -CHO 를 지칭한다.
본 발명의 화학 구조식에서, "" 또는 는 본원에 기재된 본 발명의 범주에 따라 임의의 하나 이상의 기를 연결할 수 있고; 별표 "*"는 키랄 중심을 나타낸다.
본 발명에서, 용어 "포함하는"은 "...로 이루어진"으로 대체될 수 있다.
본 발명에서, "포스페이트 기", "포스포에스터 기" 및 "포스포에스터 결합"은 상호대체가능하게 사용되고 포스포모노에스터 기, 포스포다이에스터 기, 또는 포스포트라이에스터 기를 포함한다. 달리 특정이 없는 한, 자연의 뉴클레오티드간 연결 포스페이트 기는 포스포다이에스터 기이다.
본 발명에서, 포스포로티오에이트 기는 하나의 비-가교된 산소 원자가 황 원자로 대체됨에 의해 변형된 포스포다이에스터 기를 지칭하고, 및 (M은 S 원자임)과 상호대체가능하게 사용된다.
본 발명의 맥락에서, 기 에서 모이어티 는 인접한 뉴클레오티드에 연결될 수 있는 임의의 기로 대체될 수 있다..
용어 "연결하다"는, 2개의 분자 사이의 관계를 언급할 때, 상기 2개의 분자가 공유 결합에 의해 연결됨, 또는 상기 2개의 분자가 비-공유 결합(예컨대 수소 결합 또는 이온 결합)을 통해 회합됨을 의미한다.
용어 "직접 연결된"은 제1 화합물 또는 기가 제2 화합물 또는 기에 이들 사이에 개입된 임의의 원자 또는 원자단 없이 연결됨을 의미한다.
용어 "간접 연결된"은 제1 화합물 또는 기가 중간기, 화합물, 또는 분자(예컨대 연결기)에 의해 제2 화합물에 연결됨을 의미한다.
용어 "치환된"은 지칭되는 원자(일반적으로 탄소, 산소, 또는 질소 원자)가 본원에 정의된 임의의 기로 대체되되, 지칭되는 원자의 통상적인 원자가가 초과되지 않고, 치환이 안정한 화합물을 생성함을 의미한다. 치환기의 비제한적인 예는 C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, 시아노, 하이드록시, 옥소, 카복실, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 헤테로사이클일, 헤테로아릴, 아릴, 케톤, 알콕시카본일, 아릴옥시카본일, 헤테로아릴옥시카본일, 및 할로겐(예컨대 F, Cl, Br, 또는 I)을 포함한다. 치환기가 케톤 또는 옥소(즉, =O)일 때, 원자 상의 두(2)개의 수소 원자가 대체될 수 있다.
"하나 이상의 ...로 치환된"은 단일 치환기 또는 다수 치환기로 치환될 수 있음을 의미한다. 다수 치환기로 치환의 경우, 다수의 동일한 치환기, 또는 상이한 치환기의 하나의 조합 또는 다수의 조합이 존재할 수 있다.
본 발명에서 일부 약어가 하기와 같이 정의된다:
DCE: 다이클로로에탄;
Sc(OTf)3: 스칸듐 트라이플루오로메탄설포네이트;
TFH: 테트라하이드로퓨란;
Pd/C: 탄소 상 팔라듐;
TFA: 트라이플루오로아세트산;
DMF: 다이메틸포름아미드;
DIPEA: N-에틸다이이소프로필아민;
HoBt: 1-하이드록시벤조트라이아졸;
EDCI: 1-에틸-(3-다이메틸아미노프로필)카본일다이이민 하이드로클로라이드;
DMTrCl: 4,4'-다이메톡시트라이틸 클로라이드;
DIEA: N,N-다이이소프로필에틸아민;
HATU: O-(7-아자벤조트라아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트;
LiOH: 리튬 하이드록사이드;
DMAP: 4-다이메틸아미노피리딘;
HBTU: O-(벤조트라아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트;
DMTrCl: 1-[클로로(4-메톡시페닐)벤질]-4-메톡시벤젠;
CF3SO3H: 트라이플루오로메탄설폰산;
BnBr: 벤질 브로마이드;
DEPBT: 3-(다이에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트라이아진-4-온;
Bz: 벤조일 보호기;
MMTr: 메톡시페닐 다이페닐메틸; 및
DMTr: 다이메톡시트라이틸 보호기.
실시예
본 발명은 실시예를 참조하여 하기 추가 기재되지만, 본 발명을 제한하고자 함이 아니다. 본 발명의 실시예에서 지시되는 특정 조건이 없는 실험 방법은 일반적으로 통상적인 조건(예컨대, 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual and Molecular Cloning: A Laboratory Manual by Cold Spring Harbor Laboratory])하에, 또는 출발 물질 또는 제품의 제조사에 의해 권장되는 조건하에 수행된다. 특정 출처(origin)가 없는 시약은 시판되는 통상적인 시약이다.
I. 화학식 (I)의 화학적 변형의 제조 및 활성 평가
실시예 1. 화학적 변형의 제조
1.1 화합물 1-1a 및 화합물 1-1b의 합성
화합물 1(500 mg, 3.42 mmol) 및 트라이에틸아민(Et3N, 692 mg, 6.84 mmol, 0.95 mL)을 다이클로로메탄(DCM, 10 mL)에 용해시켰다. 다이클로로메탄(10 mL) 중 4-톨루엔설폰일 클로라이드(TsCl, 717 mg, 3.76 mmol)의 용액을 빙 욕에서 적가하였다. 적가 후, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 물에 의해 ??칭(quenching)하였다. 수성 상을 다이클로로메탄(15 mL)에 의해 3회 추출하였다. 합친 무기 상을 먼저 나트륨 바이카보네이트 포화 수용액(10 mL)에 이어서 포화 염수(20 mL)에 의해 세척한 후, 감압하에 농축하여 용매를 증발시켜 미정제 생성물 2(820 mg, 80%)를 수득하고, 이를 바로 후속 단계에 사용하였다. MS m/z: C14H21O5S, [M+H]+ 계산치: 301.10, 실측치: 301.2.
화합물 3(239 mg, 1.22 mmol)을 다이메틸포름아미드(DMF, 10 mL)에 용해시켰다. NaH(미네랄 오일 중 60%, 93 mg, 2.33 mmol)의 용액을 빙 욕에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반한 후, 화합물 2(350 mg, 1.16 mmol)를 적가하였다. 적가 후, 혼합물을 60℃에서 5시간(5 h) 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 물에 의해 ??칭하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트(15 mL)에 의해 3회 추출하였다. 합친 무기 상을 먼저 물(10 mL)에 의해 3회 세척한 후, 포화 염수(10 mL)로 세척한 후, 감압하에 농축하여 용매를 증발시키고, 역상 분취 HPLC(C18, 조건: 5% 내지 50%(A: H2O, B: CH3CN), 유속: 70 mL/분)에 의해 정제하고, 동결건조하여 화합물 4(220 mg)를 수득하였다. MS m/z: C19H21N5O3Na, [M+Na]+ 계산치: 390.16, 실측치: 390.3.
화합물 4(1.50 g, 4.08 mmol)를 아세트산 및 물(4:1)의 20 mL의 혼합된 용액에 실온에서 용해시켰다. 혼합물을 60℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 증발시키고, 역상 분취 HPLC(C18, 조건: 5% 내지 25%(A: H2O, B: CH3CN), 유속: 70 mL/분)에 의해 정제하고, 동결건조하여 화합물 5(1.10 g)를 수득하였다. MS m/z: C16H18N5O3, [M+H]+ 계산치: 328.13, 실측치: 328.4.
화합물 5(1.00 g, 3.05 mmol)를 피리딘(Py, 10 mL)에 용해시켰다. 피리딘(5 mL) 중 4,4'-다이메톡시트라이틸 클로라이드(DMTrCl, 1.50 g, 4.58 mmol)의 용액을 빙 욕에서 적가하였다. 적가 후, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 물에 의해 ??칭하고, 감압하에 농축하여 용매를 증발시키고, 역상 분취 HPLC(C18, 조건: 5% 내지 80%(A: H2O, B: CH3CN), 유속: 70 mL/분)에 의해 정제하고, 동결건조하여 화합물 6(1.00 g)을 수득하였다. MS m/z: C37H36N5O5, [M-H]+ 계산치: 630.26, 실측치: 630.5. 라세미체 화합물 6을 키랄 컬럼(Daicel ChiralPAK® IE 250 Х 4.6 mm, 5 μm, A: n-헥산, B: 에탄올)을 사용하여 into 6A(-)(410 mg) 및 6B(+)(435 mg)로 분리하였다.
화합물 6A(-)(200 mg, 0.32 mmol), 테트라졸(11 mg, 0.16 mmol), N-메틸이미다졸(5 mg, 0.06 mmol), 및 3A 분자 체(500 mg)를 10 mL의 아세토니트릴에 용해시켰다. 화합물 7(144 mg, 0.48 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 분자 체를 여과해 내고, 다이클로로메탄(30 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 나트륨 바이카보네이트 포화 수용액(10 mL)에 의해 3회에 이어서 포화 염수(20 mL)에 의해 세척하였다. 여과물을 회전식 증발에 의해 농축 건조하고, 역상 분취 HPLC(C18, 조건: 5% 내지 100%(A: 물, B: CH3CN), 유속: 70 mL/분)에 의해 정제하고, 동결건조하여 화합물 1-1a(200 mg)를 수득하였다. MS m/z: C40H39N6O7P, [M-다이이소프로필 + OH]+ 계산치: 747.26, 실측치: 747.6.
1H NMR(400 MHz, 아세토니트릴-d 3 ) δ 7.56, 7.54(2s, 1H), 7.36-7.27(m, 2H), 7.24-7.21(m, 7H), 6.83-6.80(m, 4H), 4.12-4.10(m, 2H), 3.75-3.68(m, 10H), 3.20-2.80(m, 2H), 2.68-2.54(m, 4H), 1.22-1.04(m, 18H).
화합물 6B(+)(200 mg, 0.32 mmol), 테트라졸(11 mg, 0.16 mmol), N-메틸이미다졸(5 mg, 0.06 mmol), 및 3A 분자 체(500 mg)를 10 mL의 아세토니트릴에 용해시켰다. 화합물 7(144 mg, 0.48 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 분자 체를 여과해 내고, 다이클로로메탄(30 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 나트륨 바이카보네이트 포화 수용액(10 mL)에 의해 3회에 이어서 포화 염수(20 mL)에 의해 세척하였다. 여과물을 회전식 증발에 의해 농축 건조하고, 역상 분취 HPLC(C18, 조건: 5% 내지 100%(A: 물, B: CH3CN), 유속: 70 mL/분)에 의해 정제하고, 동결건조하여 화합물 1-1b(200 mg)를 수득하였다. MS m/z: C40H39N6O7P, [M-다이이소프로필 + OH]+ 계산치: 747.26, 실측치: 747.5.
1.2 화합물 1-2의 합성
화합물 1(2 g, 8.36 mmol)을 DMF(20 mL)에 용해시키고, NaH(0.37 g, 9.2 mmol, 미네랄 오일 중 60%)를 아르곤 대기하에 실온에서 서서히 첨가하였다. 2시간 동안 실온에서 교반한 후, 화합물 2(3.3 g, 16.72 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 12시간 동안 실온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 농축하였다. 잔사를 에탄올(EtOH, 50 mL)로부터 재결정화하여 표적 생성물 3A(1.3 g, 수율: 44.0%)(다이클로로메탄:에틸 아세테이트 = 2:1, Rf = 0.2) 및 표적 생성물 3B(0.6 g, 화합물 1의 혼합물)(다이클로로메탄:에틸 아세테이트 = 2:1, Rf = 0.18)를 수득하였다.
화합물 3A(1.3 g, 3.68 mmol)를 트라이플루오로아세트산(TFA, 4 mL) 및 DCM(20 mL)의 혼합물에 용해시킨 후, 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축한 후, 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, H2O + 아세토니트릴)에 의해 정제하여 표적 생성물 4(1 g, 수율: 91.44%)를 수득하였다. MS m/z: C39H38N6O6, [M+H]+: 687.5.
화합물(D-트레오닌올 5, 1.2 g, 11.4 mmol)을 피리딘(10 mL)에 용해시킨 후, 피리딘(15 mL) 중 DMTrCl(4.64 g, 13.70 mmol)의 용액을 서서히 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 H2O(10 mL)에 의해 ??칭하고 농축하였다. 반응 혼합물을 농축한 후, 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, H2O + 아세토니트릴)에 의해 정제하여 표적 생성물 6(4.0 g, 수율: 86.0%)을 수득하였다. MS m/z: C25H29NO4, [M+Na]+: 430.4.
화합물 6(600 mg, 2.02 mmol), 화합물 4(822.5 mg, 2.02 mmol), 및 다이하이드로퀴놀린(EEDQ, 998.2 mg, 4.04 mmol)을 DCM(10 mL) 및 메탄올(MeOH, 5 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 고체를 여과해 내고, 여과물을 DCM(100 mL)에 의해 희석하였다. 무기 상을 H2O(30 mL)에 의해 3회 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, H2O + 아세토니트릴)에 의해 정제하여 표적 생성물 7(780 mg, 수율: 56.3%)을 수득하였다. MS m/z: C39H38N6O6, [M+H]+: 687.5.
화합물 7(780 mg, 1.13 mmol), 테트라졸(39.8 mg, 0.57 mmol), 및 N-메틸이미다졸(18.7 mg, 0.23 mmol)을 CH3CN(10 mL)에 용해시키고, 3A 분자 체(700 mg)를 첨가하였다. 실온에서 아르곤 대기하에 5분 동안 교반한 후, 화합물 8(513.5 g, 1.70 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 분자 체를 여과해 내고, 고체를 DCM(30 mL)에 의해 3회 헹궜다. 여과물을 순차적으로 포화 수성 NaHCO3 용액(30 mL Х 4) 및 H2O(30 mL Х 4)에 의해 세척하였다. 무기 상을 30℃에서 농축하였다. 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, H2O + 아세토니트릴, 아세토니트릴 90%)에 의해 정제하고 동결건조하여 표적 화합물 1-2(700 mg, 수율: 69.5%)를 수득하였다. MS m/z: C48H55N8O7P, [M-시아노에틸-다이이소프로필 + OH]-: 749.3.
1.3 화합물 1-3의 합성
화합물 1(2 g, 8.36 mmol)을 DMF(20 mL)에 용해시키고, NaH(0.37 g, 9.2 mmol, 미네랄 오일 중 60%)를 아르곤 대기하에 실온에서 서서히 첨가하였다. 2시간 동안 실온에서 교반한 후, 화합물 2(3.3 g, 16.72 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 12시간 동안 실온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 농축하였다. 잔사를 EtOH(50 mL)로부터 재결정화하여 표적 생성물 3A(1.3 g, 수율: 44.0%)(다이클로로메탄:에틸 아세테이트 = 2:1, Rf = 0.2) 및 표적 생성물 3B(0.6 g, 화합물 1의 혼합물)(다이클로로메탄:에틸 아세테이트 = 2:1, Rf = 0.18)을 수득하였다.
화합물 3A(1.3 g, 3.68 mmol)를 TFA(4 mL) 및 DCM(20 mL)의 혼합물에 용해시킨 후, 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축한 후, 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, H2O + 아세토니트릴)에 의해 정제하여 표적 생성물 4(1 g, 수율: 91.44%)를 수득하였다. MS m/z: C39H38N6O6, [M+H]+: 687.5.
화합물 L-트레오닌올 5(1.2 g, 11.4 mmol)를 피리딘(10 mL)에 용해시킨 후, 피리딘(15 mL) 중 DMTrCl(4.64 g, 13.70 mmol)의 용액을 서서히 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 H2O(10 mL)에 의해 ??칭하고 농축하였다. 반응 혼합물을 농축한 후, 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, H2O + 아세토니트릴)에 의해 정제하여 표적 생성물 6(4.0 g, 수율: 86.0%)을 수득하였다. MS m/z: C25H29NO4, [M+Na]+: 430.4.
화합물 6(600 mg, 2.02 mmol), 화합물 4(822.5 mg, 2.02 mmol), 테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU, 1.15 g, 3.03 mmol), 및 다이이소프로필에틸아민(DIEA, 1 mL, 6.05 mmol)을 DMF(10 mL)에 용해시켰다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 DCM(100 mL)에 의해 희석하였다. 무기 상을 H2O(30 mL)에 의해 3회 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, H2O + 아세토니트릴, 아세토니트릴 60%)에 의해 정제하고 동결건조하여 표적 화합물 7(1.0 g, 수율: 72.1%)을 수득하였다. MS m/z: C39H38N6O6, [M+H]+: 687.5.
화합물 7(1.2 g, 1.75 mmol), 테트라졸(61.2 mg, 0.87 mmol), 및 N-메틸이미다졸(28.7 mg, 0.35 mmol)을 CH3CN(10 mL)에 용해시키고, 3A 분자 체(700 mg)를 첨가하였다. 실온에서 아르곤 대기하에 5분 동안 교반한 후, 화합물 8(0.79 g, 2.62 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 분자 체를 여과해 내고, 고체를 DCM(30 mL)에 의해 3회 헹궜다. 여과물을 순차적으로 포화 수성 NaHCO3 용액(30 mL Х 4) 및 H2O(30 mL Х 4)에 의해 세척하였다. 무기 상을 30℃에서 농축하였다. 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, H2O + 아세토니트릴, 아세토니트릴 90%)에 의해 정제하고 동결건조하여 표적 화합물 1-3(1.2 g, 수율: 77.4%)을 수득하였다. MS m/z: C48H55N8O7P, [M-시아노에틸-다이이소프로필 + OH]-: 749.3.
1.4 화합물 1-4a 및 화합물 1-4b의 합성
화합물 1A(6.73 g, 28.14 mmol)를 건조 DMF(80 mL)에 용해시키고, NaH(60%, 1.24 g, 30.95 mmol)를 아르곤 대기하에 서서히 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 테트라하이드로퓨란(THF, 60 mL) 중 테트라키스(트라이페닐포스핀)팔라듐(0)(Pd(PPh3)4, 1.95 g, 1.69 mmol), 트라이페닐포스핀(PPh3, 0.74 g, 2.81 mmol), 및 화합물 1(4.0 g, 28.14 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 55℃에서 16시간 동안 교반한 후, 고체를 여과해 내고, DCM(60 mL)에 의해 3회 세척하였다. 여과물을 농축하였다. 생성된 잔사를 정상 컬럼(먼저 에틸 아세테이트에 의해 이어서 에틸 아세테이트:메탄올(12:1)에 의해 용리)에 의해 정제하여 표적 생성물 2(7 g, 미정제 생성물)를 수득하였다.
화합물 2(8 g, 미정제 생성물) 및 DMTrCl(12.65 g, 37.34 mmol)을 피리딘(10 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 물(80 mL)에 의해 ??칭하고 농축하였다. 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, 물 + 아세토니트릴)에 의해 정제하고 동결건조하여 표적 화합물 3(13 g, 수율: 83.7%)을 수득하였다.
화합물 3(5 g, 8.02 mmol)을 메탄올(MeOH, 20 mL) 및 암모니아수(6 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 농축하였다. 생성된 잔사를 정상 컬럼(DCM:MeOH = 20:1)에 의해 정제하여 표적 화합물 4(4 g, 수율: 96.0%)를 수득하였다.
테트라하이드로퓨란(1.0 M in THF, 38.54 mL, 38.54 mmol) 중 보란(BH3)의 용액을 THF(12 mL) 중 화합물 4(4.00 g, 7.71 mmol)의 용액에 0℃에서 아르곤 대기하에 적가하였다. 화합물을 0℃에서 아르곤 대기하에 6시간 동안 교반한 후, H2O(27 mL)를 적가하였다. 이어서, 3 M 수성 NaOH 용액(52 mL, 156 mmol)을 반응 혼합물에 0℃에서 적가한 후, 30% 수성 H2O2(106 mL)를 반응 혼합물에 적가하고, EtOH(10 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반한 후, 기포가 형성되지 않을 때까지, 포화 Na2S2O3을 0℃에서 서서히 첨가하였다. H2O(300 mL)를 반응 혼합물에 첨가하고 혼합물을 DCM(4 Х 200 mL)에 의해 추출하였다. 무기 상을 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, 아세토니트릴 + H2O, 50%)에 의해 정제하고 동결건조하여 표적 생성물 5a(730 mg, 수율: 17.6%) 및 표적 생성물 5b(1.1 g, 26.6%)를 수득하였다.
화합물 5a(730 mg, 1.36 mmol)를 피리딘(8 mL)에 용해시키고, TMSCl(0.67 g, 6.14 mmol)을 실온에서 아르곤 대기하에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, BzCl(0.29 mL, 2.46 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 H2O(10 mL)에 의해 ??칭하고 농축하였다. 생성된 잔사를 THF(30 mL)에 용해시키고, 테트라부틸암모늄 플루오라이드(TBAF, 1 mL)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 암모니아수(0.5 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에탄올(EA, 100 mL)에 의해 희석하고 포화 염수(30 mL)에 의해 5회 세척하였다. 무기 상을 농축하였다. 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, H2O + 아세토니트릴, 아세토니트릴 60%)에 의해 정제하고 동결건조하여 표적 생성물 6a(480 mg, 수율: 74.8%)를 수득하였다. MS m/z: C38H35N5O5, [M+H]+: 642.6.
화합물 5b(1.1 g, 2.05 mmol)를 피리딘(20 mL)에 용해시키고, TMSCl(1.34 g, 1.28 mmol)을 실온에서 아르곤 대기하에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 벤조일 클로라이드(BzCl, 0.59 mL, 5.92 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 H2O(10 mL)에 의해 ??칭하고 농축하였다. 생성된 잔사를 THF(30 mL)에 용해시키고, TBAF(2 mL)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 암모니아수(0.5 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EA(100 mL)에 의해 희석하고 포화 염수(30 mL)에 의해 5회 세척하였다. 무기 상을 농축하였다. 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, H2O + 아세토니트릴, 아세토니트릴 60%)에 의해 정제하고 동결건조하여 표적 생성물 6b(1.4 g, 수율: 82.1%)를 수득하였다. MS m/z: C38H35N5O5, [M+H]+: 642.5.
화합물 6a(700 mg, 1.04 mmol), 테트라졸(26.2 mg, 0.37 mmol), 및 N-메틸이미다졸를 CH3CN(10 mL)에 용해시키고, 3A 분자 체(500 mg)를 첨가하였다. 실온에서 아르곤 대기하에 5분 동안 교반한 후, 화합물 7(470.4 mg, 1.56 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 분자 체를 여과해 내고, 고체를 DCM(50 mL)에 의해 3회 헹궜다. 여과물을 순차적으로 포화 수성 NaHCO3 용액(50 mL Х 4) 및 H2O(50 mL Х 4)에 의해 세척하였다. 무기 상을 30℃에서 농축하였다. 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, H2O + 아세토니트릴, 아세토니트릴 90%)에 의해 정제하고 동결건조하여 표적 화합물 1-4a(600 mg, 수율: 66.1%)를 수득하였다. MS m/z: C47H52N7O6P, [M-시아노에틸-다이이소프로필 + OH]-: 704.3.
화합물 6b(1.3 g, 2.03 mmol), 테트라졸(71.0 mg, 1.01 mmol), 및 N-메틸이미다졸(33.3 mg, 0.41 mmol)을 CH3CN(20 mL)에 용해시키고, 3A 분자 체(700 mg)를 첨가하였다. 실온에서 아르곤 대기하에 5분 동안 교반한 후, 화합물 7(0.92 g, 3.04 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 분자 체를 여과해 내고, 고체를 DCM(50 mL)에 의해 3회 헹궜다. 여과물을 순차적으로 포화 수성 NaHCO3 용액(50 mL Х 4) 및 H2O(50 mL Х 4)에 의해 세척하였다. 무기 상을 30℃에서 농축하였다. 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, H2O + 아세토니트릴, 아세토니트릴 90%)에 의해 정제하고 동결건조하여 표적 화합물 1-4b(1.4 g, 수율: 82.1%)를 수득하였다. MS m/z: C47H52N7O6P, [M-시아노에틸-다이이소프로필]-: 704.3.
1.5 화합물 1-5의 합성
화합물 1A(6.73 g, 28.14 mmol)를 건조 DMF(80 mL)에 용해시키고, NaH(60%, 1.24 g, 30.95 mmol)를 아르곤 대기하에 서서히 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 THF(60 mL) 중 테트라키스(트라이페닐포스핀)팔라듐(0)(Pd(PPh3)4, 1.95 g, 1.69 mmol), 트라이페닐포스핀(PPh3, 0.74 g, 2.81 mmol), 및 화합물 1(4.0 g, 28.14 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 55℃에서 16시간 동안 교반한 후, 고체를 여과해 내고, DCM(60 mL)에 의해 3회 세척하였다. 여과물을 농축하였다. 생성된 잔사를 정상 컬럼(먼저 에틸 아세테이트에 의해 이어서 에틸 아세테이트:메탄올(12:1)에 의해 용리)에 의해 정제하여 표적 고체 2(7 g, 미정제 생성물)를 수득하였다.
화합물 2(8 g, 미정제 생성물) 및 DMTrCl(12.65 g, 37.34 mmol)을 피리딘(10 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 물(80 mL)에 의해 ??칭하고 농축하였다. 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, 물 + 아세토니트릴)에 의해 정제하고 동결건조하여 표적 화합물 3(13 g, 수율: 83.7%)을 수득하였다.
화합물 3(1 g, 1.60 mmol), KHCO3(0.48 g, 4.81 mmol) 및 에틸렌 글리콜(0.40 g, 6.41 mmol)을 아세톤(50 mL)에 용해시키고, KMnO4(40% in 물, 0.67 g, 1.68 mmol)를 -30℃에서 서서히 첨가하였다. -30℃에서 1시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 나트륨 티오설페이트 포화 수용액(30 mL)에 의해 ??칭하였다. 혼합물을 DCM(30 mL)에 의해 4회 추출하였다. 무기 상을 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 잔사를 역상 컬럼(C18, H2O + 아세토니트릴, 아세토니트릴 60%)에 의해 정제하고 동결건조하여 표적 생성물 4(600 mg, 수율: 56.9%)를 수득하였다. MS m/z: C38H35N5O6, [M+H]+: 658.5.
250 mL 환저 플라스크에, 반응물 4(5.0 g, 7.601 mmol), NaIO4, 및 1,4-다이옥산/물(50 mL/5 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거하여 백색 고체(6.0 g)를 수득하였다. 이어서, 고체를 메탄올(50 mL)에 용해시키고, 나트륨 보로하이드라이드(1.62 g, 38 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 10% 암모늄 클로라이드 용액(10 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거하였다. 잔사를 C18 컬럼 크로마토그래피(물/아세토니트릴: 5% 내지 95%)에 의해 정제하여, 생성물 P1을 무색 오일 5(2.0 g, 3.0315 mmol, 39%)로서 수득하였다. LCMS, MS+, [M+H]+: 660.
화합물 5(1.7 g, 2.58 mmol) 및 DBU(0.77 mL, 5.15 mmol)를 DCM(20 mL)에 용해시키고, BzCl(DCM 중 0.5 M, 0.8 mL)을 반응 혼합물에 -70℃에서 아르곤 대기하에 적가하였다. 반응 혼합물을 -70℃에서 1시간 동안 방치하고 에탄올(5 mL)에 의해 ??칭하였다. ??칭된 반응 혼합물을 DCM(100 mL)에 의해 희석하고 물(30 mL)에 의해 3회 세척하였다. 무기 상을 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 생성된 잔사를 정상 컬럼(DCM:EA = 1:1)에 의해 정제하여 6을 백색 고체(80 mg, 수율: 4.14%)로서 수득하였다. MS m/z: C45H41N5O7, [M+H]+: 764.5.
화합물 6(380 mg, 0.50 mmol), 테트라졸(17.43 mg, 0.25 mmol), 및 N-메틸이미다졸(8.17 mg, 0.10 mmol)을 CH3CN(10 mL)에 용해시키고, 3A 분자 체(500 mg)를 첨가하였다. 실온에서 아르곤 대기하에 5분 동안 교반한 후, 화합물 7(224.95 mg, 0.75 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 분자 체를 여과해 내고, 고체를 DCM(50 mL)에 의해 3회 헹궜다. 여과물을 순차적으로 포화 수성 NaHCO3 용액(50 mL Х 4) 및 H2O(50 mL Х 4)에 의해 세척하였다. 무기 상을 30℃에서 농축하였다. 생성된 잔사를 역상 컬럼(C18, H2O + 아세토니트릴, 아세토니트릴 90%)에 의해 정제하고 동결건조하여 표적 생성물 1-5(330 mg, 수율: 68.8%)를 수득하였다. MS m/z: C54H58N7O8P, [M-시아노에틸-다이이소프로필]-: 826.3.
1.6 화합물 1-6a의 합성
화합물 1(10 g, 68.404 mmol), 화합물 2(15 g, 62.186 mmol), 및 트라이페닐포스핀(32.62 g, 124.371 mmol)을 건조 THF(30 mL)에 용해시키고, DIAD(24.656 mL, 124.371 mmol)를 서서히 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 반응시켰다. LCMS가 반응 완료를 나타낸 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(200 mL) 및 물(200 mL)에 의해 추출하였다. 무기 상을 건조하였다. 여과물을 농축하였다. 생성된 잔사를 정상 컬럼(DCM/MeOH = 10/1)에 의해 정제하여 표적 생성물 3(20 g)을 수득하였다.
화합물 3(20 g, 28.585 mmol)을 아세트산(24 mL, 426.016 mmol) 및 H2O(12 mL)에 용해시키고, 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 회전식 증발에 의해 농축 건조하고 THF(12 mL) 및 H2O(12 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 7시간 동안 교반하였다. LCMS가 반응 완료를 나타낸 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(200 mL) 및 물(100 mL)에 의해 추출하였다. 다양의 고체가 수성 상으로부터 침전되어 나올 때까지 고체 나트륨 카보네이트를 수성 상에 첨가하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고 물에 의해 세척하였다. 필터 케이크를 오일 펌프에 의해 건조하여 표적 화합물 5(9 g)를 수득하였다.
화합물 5(6.8 g, 18.581 mmol)를 질소 대기하에 피리딘(80 mL)에 용해시키고, TMSCl(14.250 mL, 111.489 mmol)을 0℃에서 서서히 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 이소부티르일 클로라이드(2.044 mL, 19.511 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS가 반응 완료를 나타낸 후, 반응 혼합물을 다이클로로메탄(200 mL) 및 물(200 mL)에 의해 추출하였다. 무기 상을 건조하고 회전식 증발에 의해 농축 건조하여 정제될 샘플을 제조하였다. 샘플을 정상 컬럼(DCM:MeOH = 10:1에 의해 용리, 4.8%에서의 피크)에 의해 정제하여 표적 화합물 6(12 g)을 수득하였다.
화합물 6(5.5 g, 12.392 mmol)을 피리딘(30 mL)에 질소 대기하에 용해시켰다. 분자 체 4A 1/16(7 g, 12.392 mmol)을 첨가한 후, 고체 DMTrCl(5.04 g, 14.870 mmol)을 뱃취에 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. TLC(PE:EtOAc = 1:1, Rf = 0.69)가 반응 완료를 나타낸 후, 반응 혼합물 및 TJN200879-040-P1를 합치고 함께 처리하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(200 mL) 및 물(200 mL)에 의해 추출하였다. 무기 상을 건조하고 회전식 증발에 의해 농축 건조하여 정제될 샘플을 제조하였다. 샘플을 정상 컬럼(PE:EtOAc에 의해 용리, 84%에서의 피크)에 의해 정제하여 표적 화합물 7(12 g)을 수득하였다.
화합물 7(12 g, 15.389 mmol)을 EtOAc(140 mL)에 용해시키고, 습윤(wet) 탄소 상 팔라듐 Pd/C(7 g, 15.389 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(15 Psi)하에 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. TLC(PE:EtOAc = 0:1, Rf = 0.09)가 반응 완료를 나타낸 후, 반응 혼합물을 여과하였다. 필터 케이크를 에틸 아세테이트(30 mL)에 의해 3회 헹구고, 여과물을 수집하였다. 여과물을 회전식 증발에 의해 농축 건조하고 50 mL의 다이클로로메탄 및 2 mL의 트라이에틸아민을 첨가하여 정제될 샘플을 제조하였다. 샘플을 정상 컬럼(DCM:MeOH = 10:1에 의해 용리, 0.5%에서의 피크)에 의해 정제하여 9 g(황색 포말성 고체)을 수득하였다. 생성된 라세미 화합물을 SFC에 의해 분리하여 표적 화합물 7A(-)(3.9 g) 및 표적 화합물 7B(+)(3.8 g)를 수득하였다.
화합물 7A(-)(3.30 g, 5.40 mmol), 테트라졸(190 mg, 2.70 mmol), 1-메틸이미다졸(90 mg, 1.10 mmol), 및 3A 분자 체(500 mg)를 30 mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 화합물 8(2.50 g, 8.10 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 분자 체를 여과해 내고, DCM(150 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 나트륨 바이카보네이트 포화 수용액(30 mL Х 3)에 이어서 포화 염수(30 mL)에 의해 세척하였다. 여과물을 회전식 증발에 의해 농축 건조하고, 역상 분취 HPLC(C18, 조건: 5% 내지 100%(A: 물, B: CH3CN), 유속: 70 mL/분)에 의해 정제하고, 동결건조하여 화합물 1-6a(2.9 g, 66%)를 수득하였다. MS m/z: C43H55N7O7P [M+H]+, 계산치: 812.38, 실측치: 812.5. 1H NMR(400 MHz, 아세토니트릴-d3) δ 7.56, 7.54(2s, 1H), 7.36-7.27(m, 2H), 7.24-7.21(m, 7H), 6.83-6.80(m, 4H), 4.12-4.10(m, 2H), 3.75-3.68(m, 10H), 3.20-2.80(m, 2H), 2.68-2.54(m, 4H), 1.22-1.04(m, 18H).
1.7 화합물 1-7a의 합성
화합물 1(5 g, 23.1272 mmol), 화합물 2(6.76 g, 46.254 mmol), 및 트라이페닐포스핀(7.28 g, 27.753 mmol)을 30 mL의 다이옥산에 질소 대기하에 용해시켰다. DEAD(5.502 mL, 27.753 mmol)를 서서히 0℃에서 적가하였다. 적가 후, 반응 혼합물을 25℃로 서서히 가열하고 1시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 100 mL의 H2O 및 100 mL의 EtOAc에 의해 추출하였다. 무기 상을 합치고, 건조하고, 여과하고 농축하여 정제될 샘플을 제조하였다. 샘플을 정상 컬럼(PE:EtOAc에 의해 용리 = 1:1)에 의해 정제하여 표적 생성물(4 g)을 수득하였다.
화합물 3(3.3 g)을 HOAc(16 mL) 및 H2O(4 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 60℃에서 0.5시간 동안 오일 욕에서 가열하였다. 반응 혼합물을 회전식 증발에 의해 농축 건조하였다. 생성된 잔사를 정상 컬럼(PE:EtOAc에 의해 용리 = 0:1)에 의해 정제하여 표적 생성물 4(3 g)를 수득하였다.
화합물 4(3 g, 8.873 mmol)를 5 mL의 피리딘에 용해시키고, 10 mL의 피리딘 중 DMTrCl(3.91 g, 11.535 mmol)의 용액을 서서히 0℃에서 적가하고 질소 대기하에. 적가 후, 반응 혼합물을 25℃로 가열하고 1시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 50 mL의 물 및 100 mL의 에틸 아세테이트에 의해 추출하였다. 수성 상을 100 mL의 에틸 아세테이트에 의해 3회 추출하였다. 무기 상을 합치고, 건조하고, 여과하고, 농축하고 정상 컬럼(PE:EtOAc = 2:1에 의함)에 의해 정제하여 표적 생성물 5(4 g)를 수득하였다.
화합물 5(4 g, 5.769 mmol)를 메탄올(10 mL)에 용해시키고, 메탄올(40 mL) 중 포화 NH3의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 회전식 증발에 의해 농축 건조하고 정상 컬럼(PE:EtOAc = 0:1)에 의해 정제하여 라세미 화합물(2.4 g)을 수득하였다. 화합물을 SFC에 의해 분리하여 표적 생성물 6A(750 mg, 100% 순도) 및 표적 생성물 6B(400 mg, 99.16% 순도)를 수득하였다.
화합물 6A(-)(700 mg, 1.40 mmol), 테트라졸(50 mg, 0.70 mmol), 1-메틸이미다졸(23 mg, 0.28 mmol), 및 3A 분자 체(500 mg)를 10 mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 화합물 7(630 mg, 2.10 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 분자 체를 여과해 내고, DCM(50 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 나트륨 바이카보네이트 포화 수용액(10 mL Х 3)에 이어서 포화 염수(20 mL)에 의해 세척하였다. 여과물을 회전식 증발에 의해 농축 건조하고, 역상 분취 HPLC(C18, 조건: 5% 내지 100%(A: 물, B: CH3CN), 유속: 70 mL/분)에 의해 정제하고, 동결건조하여 화합물 1-7a(700 mg, 72%)를 수득하였다. MS m/z: C38H47N4O7PNa [M+Na]+, 계산치: 725.32, 실측치: 725.5.
1.8 화합물 1-8a의 합성
화합물 1(8.5 g, 76.508 mmol) 및 화합물 2(30.64 g, 91.809 mmol)를 DMF(150 mL)에 용해시키고, CS2CO3(29.91 g, 91.809 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 90℃에서 12시간 동안 질소 대기하에 반응시켰다. LCMS에 의해 검출하여 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 여과하고, 회전식 증발에 의해 농축하고 오일 펌프에 의해 건조하고 분리하고 정상 컬럼(80 g, DCM/MeOH = 10/1 내지 5/1)에 의해 정제하여 표적 생성물 3(13.5 g, 80% 순도)을 수득하였다.
화합물 3(10.5 g, 35.105 mmol)을 피리딘(65 mL) 및 CH3CN(65 mL)에 용해시키고, BzCl(4.894 mL, 42.126 mmol)을 용액에 적가하였다. 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. LCMS에 의해 검출하여 출발 물질이 대부분 반응한 후, 반응 혼합물을 H2O(100 mL)에 의해 ??칭하고, EtOAc(100 mL Х 3)에 의해 추출하고, 회전식 증발에 의해 농축 건조하고 분리하고(TJN200872-101과 합치고) 컬럼 크로마토그래피(80 g, PE/EtOAc = 10/1 내지 0/1, DCM/MeOH = 10/1)에 의해 정제하여 표적 생성물 4(14 g, 90% 순도)를 수득하였다.
화합물 4(14 g, 36.694 mmol)를 HOAc(56 mL, 314.796 mmol) 및 H2O(14 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 반응시켰다. LCMS가 반응 완료를 나타낸 후, 반응 혼합물을 오일 펌프에 의해 농축하고 분리하고 정상 컬럼(40 g, DCM/MeOH = 1/0 내지 5/1)에 의해 정제하여 표적 생성물 5(8.4 g, 90% 순도 & 2.4 g, 80% 순도)를 수득하였다.
화합물 5(7.4 g, 21.957 mmol), DMAP(0.54 g, 4.391 mmol), 및 분자 체 4A(11.1 g, 2.967 mmol)를 피리딘(60 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 10분 동안 빙 욕에서 교반한 후, DMTrCl(8.93 g, 26.348 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1.8시간 동안 교반하였다. LCMS에 의해 약 19%의 출발 물질이 남은 후, 약 60%의 표적 MS를 수득하였다. 혼합물을 합치고 TJN200872-105&106과 합치고 함께 정제하였다. H2O(50 mL)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 DCM(50 mL Х 3)에 의해 추출하고, 건조하고, 회전식 증발에 의해 농축 건조하고 분리하고 컬럼 크로마토그래피(120 g, PE/(EA:DCM:TEA = 1:1:0.05) = 1/0 내지 0/1 내지 DCM/MeOH = 10/1)에 의해 정제하여 표적 생성물 6(11 g, 89% 순도, TJN200872-105&106&107)을 수득하였다. 출발 물질(3.0 g, 70% 순도)을 회수하였다.
화합물 6(15 g, 22.041 mmol)을 SFC(DAICEL ChiralPAK AD(250 mm Х 50 mm,10 μm); 0.1% NH3H2O·EtOH, B: 45% 내지 45%; 200 mL/분)에 의해 분리하여 표적 생성물 6A(5.33 g, 94.29% 순도) 및 표적 생성물 6B(6.14 g, 97.91% 순도)를 수득하고, 1.0 g의 화합물 6을 회수하였다.
화합물 6B(-)(5.4 g, 8.92 mmol), 테트라졸(312 mg, 4.46 mmol), 1-메틸이미다졸(146 mg, 1.78 mmol), 및 3A 분자 체(500 mg)를 40 mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 화합물 7(4 g, 13.4 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 분자 체를 여과해 내고, DCM(200 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 나트륨 바이카보네이트 포화 수용액(30 mL Х 3)에 이어서 포화 염수(50 mL)에 의해 세척하였다. 여과물을 회전식 증발에 의해 농축 건조하고, 역상 분취 HPLC(C18, 조건: 5% 내지 100%(A: 물, B: CH3CN), 유속: 70 mL/분)에 의해 정제하고, 동결건조하여 화합물 1-8a(5.8 g, 80%)를 수득하였다. MS m/z: C45H51N5O7P, [M+H]+, 계산치: 804.36, 실측치: 804.4.
실시예 2. siRNA의 합성
siRNA의 합성은 통상적인 포스포라미다이트 고체-상 합성과 동일하되, 예외적으로 AS 가닥의 5' 말단의 위치에서의 변형을 갖는 뉴클레오티드의 합성에서, 모 서열의 원래 뉴클레오티드를 상기 합성된 포스포라미다이트 단량체로 대체하였다.
합성 과정은 하기와 같이 요약된다: 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체를 유니버셜 CPG 지지체에서 출발하는 Dr. Oligo48 합성장치(Biolytic)에서의 합성 프로그램에 따라 하나씩 연결하였다. 전술한 AS 가닥의 5' 말단의 위치 7에서의 포스포라미다이트 단량체 외에도, 다른 뉴클레오시드 단량체 출발 물질 2'-F RNA, 2'-O-메틸 RNA, 및 다른 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체를 Hongene, Shanghai 또는 Genepharma, Suzhou로부터 구입하였다. 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)을 활성화제(아세토니트릴 중 0.6 M 용액)로서 사용하고, 0.22 M 1:1 부피 비의 아세토니트릴 및 콜리딘 중 PADS의 용액(Kroma, Suzhou)을 황화제로서 사용하고, 요오도피리딘/물 용액(Korma)을 산화제로서 사용하였다.
고체-상 합성을 완료한 후, 올리고리보뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 절단하고 28% 암모니아수 및 에탄올(3:1)의 용액에서 50℃ 16시간 동안 적셨다. 혼합물을 원심분리하고, 상청액을 또다른 원심분리 튜브로 옮겼다. 상청액을 증발에 의해 농축 건조한 후, 이동상으로서 0.1 M TEAA 및 아세토니트릴을 사용하여 C18 역상 크로마토그래피에 의해 정제하고, DMTr을 3% 트라이플루오로아세트산 용액을 사용하여 제거하였다. 표적 올리고뉴클레오티드를 수집하고, 동결건조하고, LC-MS에 의해 표적 생성물인 것을 확인하고, UV(260 nm)에 의해 정량분석하였다.
생성된 단일 가닥화된 올리고뉴클레오티드를 상보적 방식으로 등몰비로 페어링하고 어닐링(annealing)하였다. 최종 이중가닥화된 siRNA를 1Х PBS에 용해시키고, 용액을 추후 사용을 위해 실험에 필요한 농도로 조정하였다.
실시예 3. psiCHECK 활성 스크리닝
Huh7 세포를 5% CO2로 37℃에서 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 고-글루코스 배지에서 배양하였다. 형질감염 18시간 전에, Huh7 세포를 각각의 웰에 100 μL의 배지로 10,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다.
형질감염 전, 웰에서 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 고-글루코스 배지를 피페팅에 의해 버리고 80 μL의 Opti-MEM에 의해 대체하고 세포를 1.5시간 동안 단식시켰다. 이어서, 세포를 siRNA 및 상응하는 플라스미드에 의해, 상응하는 지침서에 따라 Lipofectamine2000(ThermoFisher, 11668019)을 사용하여 공동-형질감염시켰다. 0.2 μL의 Lipofectamine2000을 함유하는 20 μL의 Opti-MEM, 20 ng의 플라스미드, 및 2.2 μL의 siRNA(최대 농도: 40 nM, 3-배 구배 희석, 총 11개의 농도점, 각가의 농도에 대해 2반복(duplicate) 웰)를 96-웰 플레이트의 각가의 웰에 첨가하였다. 인큐베이터에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션 후, 20% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 고-글루코스 배지를 첨가하였다. 24시간 동안 추가 배양 후, 루시페라제 활성을 이중-Glo® 루시페라제 검정 시스템(Promega Cat. # E2940) 검정 키트의 실험 프로토콜에 따라 검정하였다. 상대적 값(비 = Ren/Fir(레닐라/반딧불 비)) 및 억제율(%)(1 - (비 + siRNA/비리포터 단독) Х 100%)을 검출된 신호로부터 계산하였다. 본 발명에서, 잔류 활성 %(mRNA의 잔류 발현 수준 % 또는 mRNA의 잔류 발현 비율로도 지칭됨) = 100% - 억제율(%)을 수득하였다. IC50 값을 Graphpad Prism 소프트웨어(4개의 매개변수 로지스틱 방정식)을 사용하는 분석에 의해 계산하였다.
실시예 4. 상이한 화학적 변형을 포함하는 siRNA의 표적-해당 및 표적-외 활성 실험
표 1에서의 siRNA를 실시예 1의 화합물을 사용하여 실시예 2의 방법에 의해 합성하고, siRNA의 표적-해당 활성 및 표적-외 활성을 실시예 3의 방법에 의해 확인하였다. 하기와 같이 안티센스 가닥의 5' 말단의 위치 7에서, siRNA는 동일한 센스 가닥을 갖고 하기 변형된 뉴클레오티드/화학적 변형을 포함하였다:
.
상기 식에서, 출발 물질로서 2-하이드록시메틸-1,3-프로판다이올을 사용하여 합성된 뉴클레오티드를 hmpNA로서 정의하고;
TJ-NA019(A)를 실시예 섹션 1.1의 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 1-2를 사용하여 고체-상 합성에 의해 수득하고;
TJ-NA020(A)를 실시예 섹션 1.1의 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 1-3을 사용하여 고체-상 합성에 의해 수득하고;
TJ-NA026(A)를 실시예 섹션 1.1의 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 1-4a를 사용하여 고체-상 합성에 의해 수득하고;
TJ-NA027(A)를 실시예 섹션 1.1의 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 1-4b를 사용하여 고체-상 합성에 의해 수득하고;
(+)hmpNA(A)를 실시예 섹션 1.1의 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 1-1b를 사용하여 고체-상 합성에 의해 수득하고;
(-)hmpNA(A)를 실시예 섹션 1.1의 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 1-1a를 사용하여 고체-상 합성에 의해 수득하고;
TJ-NA038(A)를 실시예 섹션 1.1의 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 1-5를 사용하여 고체-상 합성에 의해 수득하고;
(+)hmpNA(A)를 실시예 섹션 1.1의 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 1-1b를 사용하여 고체-상 합성에 의해 수득하고, 이의 절대 배열은 (S)-hmpNA(A)였고;
(-)hmpNA(A)를 실시예 섹션 1.1의 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 1-1a를 사용하여 고체-상 합성에 의해 수득하고, 이의 절대 배열은 (R)-hmpNA(A)였다.
유사하게, 하기 구조를 hmpNA의 염기 종을 변경함으로써 고체-상 합성에 의해 수득하고, 이의 절대 배열은 하기와 같이 측정되었다:
(+)hmpNA(G), (S)-hmpNA(G)의 절대 배열을 가짐;
(-)hmpNA(G), (R)-hmpNA(G)의 절대 배열을 가짐;
(+)hmpNA(C), (S)-hmpNA(C)의 절대 배열을 가짐;
(-)hmpNA(C), (R)-hmpNA(C)의 절대 배열을 가짐;
(+)hmpNA(U), (R)-hmpNA(U)의 절대 배열을 가짐; 및
(-)hmpNA(U), (S)-hmpNA(U)의 절대 배열을 가짐.
절대 배열 (S)-hmpNA(G), (R)-hmpNA(G), (S)-hmpNA(C), (R)-hmpNA(C), (S)-hmpNA(U), 및 (R)-hmpNA(U)를 이의 중간체 또는 유도체로부터 X-선 회절에 의해 측정하였다.
중간체 또는 유도체의 구조는 하기와 같았다:
TJ -NA067: 무색 대형 결정인 것으로 측정됨(0.30 Х 0.10 Х 0.04 mm3), P21 공간군을 갖는 단사정계 결정 시스템에 속함. 격자 매개변수 = 16.0496(5) Å, b = 4.86260(10) Å, c = 16.4686(5) Å, α = 90°, β = 118.015(4)°, γ = 90°, V = 1134.65(7) Å3, Z = 4. 계산된 밀도 Dc = 1.389 g/cm3; 단위 셀 내 전자의 개수 F(000) = 504.0; 단위 셀의 선형 흡광 계수 μ(Cu Kα) = 0.840 mm-1; 회절 실험 온도 T = 150.00(11) K.
6A(+): 무색 대형 결정인 것으로 측정됨(0.30 Х 0.20 Х 0.10 mm3), P21 공간군을 갖는 단사정계 결정 시스템에 속함. 격자 매개변수 = 22.6688(7) Å, b = 8.5595(2) Å, c = 23.3578(5) Å, α = 90°, β = 113.876(3) °, γ = 90 °, V = 4144.3(2) Å3, Z = 2. 계산된 밀도 Dc = 0.999 g/cm3; 단위 셀 내 전자의 개수 F(000) = 1318.0; 단위 셀의 선형 흡광 계수 μ(Cu Kα) = 0.570 mm-1; 회절 실험 온도 T = 100.01(18) K.
TJ -NA048: 무색 침상 결정인 것으로 측정됨(0.30 Х 0.04 Х 0.04 mm3), P1 공간군을 갖는 단사정계 결정 시스템에 속함. 격자 매개변수 = 7.6165(4) Å, b = 11.3423(5) Å, c = 17.3991(8) Å, α = 85.007(4)°, β = 88.052(4)°, γ = 70.532(4)°, V = 1411.75(12) Å3, Z = 2. 계산된 밀도 Dc = 1.366 g/cm3; 단위 셀 내 전자의 개수 F(000) = 620.0; 단위 셀의 선형 흡광 계수 μ(Cu Kα) = 0.856mm-1; 회절 실험 온도 T = 150.00(13) K.
TJ -NA092: 무색 각주(prismatic) 결정인 것으로 측정됨(0.30 Х 0.10 Х 0.10 mm3), P1 공간군을 갖는 삼사정계 결정 시스템에 속함. 격자 매개변수 = 5.17960(10) Å, b = 8.0667(2) Å, c = 12.4077(2) Å, α = 93.146(2)°, β = 101.266(2)°, γ = 96.134(2)°, V = 503.993(18) Å3, Z = 2. 계산된 밀도 Dc = 1.412 g/cm3; 단위 셀 내 전자의 개수 F(000) = 228.0; 단위 셀의 선형 흡광 계수 μ(Cu Kα) = 0.945 mm-1; 회절 실험 온도 T = 100.00(10) K.
HBV-S-표적화 siRNA 서열 및 변형
서열번호 SS 가닥 5'-3'
213 UmsGmsAmCmAfAmGfAfAfUmCmCmUmCmAmCmAmAmUm
이중 가닥 코드 AS 가닥 5'-3'
TRD4389모 서열 214 AmsUfsUmGmUmGfAmGmGmAmUmUmCmUfUmGfUmCmAmsAmsCm
TRD5252 215 AmsUfsUmGmUmGf GNA(A) GmGmAmUmUmCmUfUmGfUmCmAmsAmsCm
TRD5812 216 AmsUfsUmGmUmGf Abasic GmGmAmUmUmCmUfUmGfUmCmAmsAmsCm
TRD5813 217 AmsUfsUmGmUmGf Id GmGmAmUmUmCmUfUmGfUmCmAmsAmsCm
TRD5816 218 AmsUfsUmGmUmGf TJ-NA009(A) GmGmAmUmUmCmUfUmGfUmCmAmsAmsCm
TRD5817 219 AmsUfsUmGmUmGf TJ-NA019(A) GmGmAmUmUmCmUfUmGfUmCmAmsAmsCm
TRD5818 220 AmsUfsUmGmUmGf TJ-NA020(A) GmGmAmUmUmCmUfUmGfUmCmAmsAmsCm
TRD5821 221 AmsUfsUmGmUmGf TJ-NA027(A) GmGmAmUmUmCmUfUmGfUmCmAmsAmsCm
TRD5822 222 AmsUfsUmGmUmGf(+)hmpNA(A)GmGmAmUmUmCmUfUmGfUmCmAmsAmsCm
TRD5823 223 AmsUfsUmGmUmGf(-)hmpNA(A)GmGmAmUmUmCmUfUmGfUmCmAmsAmsCm
TRD5825 224 AmsUfsUmGmUmGf TJ-NA038(A) GmGmAmUmUmCmUfUmGfUmCmAmsAmsCm
표적-해당 활성에 대한 실험 결과는 표 2에 제시되고, 표적-외 활성에 대한 실험 결과는 표 3에 제시된다. 상기 실험 모두의 화합물에 의한 시험 서열은 모 서열과 비교하여 필적하거나 약간 더 나은 활성을 나타냄으로써, 변형이 표적-해당 활성에 영향을 주지 않았음을 나타낸다. GNA/Abasic/Id, TJ-NA019(A), TJ-NA020(A), (+)hmpNA(A), 및 (-)hmpNA(A)를 포함하는 siRNA가 가장 우수한 활성을 가졌다. 또한, 모 서열은 현저한 표적-외 활성을 가졌고, 모든 변형은 표적-외 활성에 대해 현저한 억제 효과를 나타냈다. 특히, TJ-NA027(A), (+)hmpNA(A), 및 (-)hmpNA(A)를 포함하는 siRNA에서, 표적-외 활성이 관찰되지 않았다.
HBV-S-표적화 siRNA의 표적-해당 활성에 대한 결과
이중 가닥 코드 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA %(표적-해당 활성)(평균)
40nM 13.3
nM		 4.44
nM		 1.48
nM		 0.493
nM		 0.16
4nM		 0.05
4nM		 0.018
2nM		 0.006
09nM		 0.002
03nM		 0.000
67nM		 IC50
(nM)
TRD
4389		 5.4% 4.1% 4.8% 4.8% 8.4% 21.7% 53.0% 82.5% 104.9% 99.4% 95.2% 0.0589
TRD5252 3.4% 3.1% 3.1% 3.6% 5.7% 11.1% 22.1% 44.7% 72.8% 92.2% 86.6% 0.0162
TRD5812 3.8% 3.0% 3.4% 3.6% 7.3% 9.8% 23.5% 44.8% 63.9% 90.4% 81.4% 0.0158
TRD
5813		 5.1% 3.8% 4.4% 4.3% 6.1% 13.2% 33.5% 53.8% 74.5% 80.8% 96.4% 0.0214
TRD
5816		 3.9% 3.8% 3.4% 4.9% 6.9% 16.1% 39.8% 71.8% 96.3% 92.9% 108.1% 0.0389
TRD5817 4.8% 4.2% 4.5% 3.7% 6.6% 13.7% 31.0% 61.0% 81.8% 92.9% 103.7% 0.0251
TRD5818 3.7% 3.3% 3.1% 3.7% 6.1% 10.9% 26.3% 55.8% 69.1% 87.4% 88.8% 0.0195
TRD5821 6.8% 5.2% 5.7% 6.1% 8.7% 19.7% 39.3% 69.9% 102.8% 92.9% 97.9% 0.0398
TRD5822 4.4% 4.5% 4.1% 3.7% 5.3% 13.2% 24.6% 51.2% 82.3% 84.9% 101.9% 0.0200
TRD5823 3.6% 3.8% 3.4% 3.4% 5.2% 11.0% 29.7% 58.3% 71.4% 84.7% 100.7% 0.0200
TRD
5825		 4.3% 3.6% 3.4% 4.2% 7.1% 18.0% 32.7% 66.0% 88.7% 93.8% 103.2% 0.0302
HBV-S-표적화 siRNA의 표적-외 활성에 대한 결과
이중 가닥 코드 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA %(표적-외 활성)(평균)
40nM 13.3
nM		 4.44
nM		 1.48
nM		 0.493
nM		 0.164
nM		 0.054
nM		 0.0182
nM		 0.006
09nM		 0.002
03nM		 0.000
67nM
TRD
4389		 57.4% 55.9% 65.5% 73.3% 89.2% 92.8% 105.3% 102.4% 107.6% 96.0% 101.2%
TRD
5252		 97.3% 100.4% 104.0% 108.1% 107.3% 102.9% 108.7% 94.9% 101.2% 101.8% 97.7%
TRD
5812		 98.2% 107.0% 99.1% 100.7% 110.1% 125.2% 113.7% 105.3% 105.5% 99.5% 93.8%
TRD5813 100.5% 105.2% 95.9% 112.1% 102.3% 104.3% 101.5% 97.2% 110.7% 100.6% 93.6%
TRD5816 108.3% 101.5% 97.2% 109.5% 116.7% 122.8% 108.5% 113.2% 121.6% 112.9% 106.8%
TRD5817 104.5% 106.7% 110.0% 109.3% 119.4% 120.9% 127.3% 113.6% 117.7% 112.2% 105.0%
TRD5818 83.7% 89.7% 83.0% 91.0% 117.5% 79.4% 99.1% 103.4% 89.2% 92.9% 98.7%
TRD5821 102.9% 99.3% 98.3% 99.6% 106.8% 106.4% 108.7% 108.1% 104.5% 95.4% 107.8%
TRD5822 106.1% 93.8% 81.6% 100.4% 100.4% 96.9% 105.3% 101.9% 94.6% 101.4% 94.0%
TRD5823 91.8% 89.1% 92.9% 99.8% 97.8% 101.1% 90.7% 92.6% 97.9% 95.9% 87.1%
TRD
5825		 84.9% 89.7% 97.7% 106.7% 103.9% 104.7% 100.0% 100.9% 90.2% 112.7% 98.3%
실시예 5. 상이한 화학적 변형을 포함하는 siRNA의 서열-의존성 실험
염기성 변형은 siRNA 서열-의존성인 것으로 알려져 있고, 따라서, 본 발명자들은 다수의 상이한 서열에 대해 본 발명의 실험 화합물을 시험하였다. 상이한 유전자의 mRNA(HBV-S 및 HBV-X)를 표적화하는 siRNA(이들의 서열은 표 4에 제시되어 있음)를 사용하고 실시예 1의 화합물에 의해 AS 가닥의 5' 말단의 위치 7에서 변형하고(서열은 표 5에 제시되어 있음): TJ-NA020(A), TJ-NA027(A), (+)hmpNA(A), (-)hmpNA(A), GNA(A)(대조군), 및 Id 화합물, 이어서, 표적-해당 활성 및 표적-외 활성에 대해 모 서열과 비교하였다.
상이한 유전자를 표적화하는 siRNA의 서열
siRNA 표적 유전자 SS 가닥 5'-3' AS 가닥 5'-3'
HBV-S(siRNA2) CmsCmsAmUmUfUmGfUfUfCm
AmGmUmGmGmUmUmCmsGm
(서열번호 225)		 UmsGfsAmAmCmCfAmCmUmGmAmAmCmAfAmAfUmGmGmsCmsAm(서열번호 226)
HBV-X(siRNA3) CmsAmsCmCmUfCmUfGfCfAm
CmGmUmCmGmCmAmUmsGm
(서열번호 227)		 UmsAfsUmGfCmGfAmCmGfUmGmCfAmGfAmGfGmUfGmsAmsAm(서열번호 228)
상이한 유전자를 표적화하고 화학적 변형을 포함하는 siRNA의 서열
표적 mRNA AS 가닥 변형
HBV-S TRD5847 UmsGfsAmAmCmCfAmCmUmGmAmAmCmAfAmAfUmGmGmsCmsAm(서열번호 229)
TRD5848 UmsGfsAmAmCmCfGNA(A)CmUmGmAmAmCmAfAmAfUmGmGmsCmsAm(서열번호 230)
TRD5849 UmsGfsAmAmCmCfIdCmUmGmAmAmCmAfAmAfUmGmGmsCmsAm(서열번호 231)
TRD5850 UmsGfsAmAmCmCfTJ -020(A)CmUmGmAmAmCmAfAmAfUmGmGmsCmsAm(서열번호 232)
TRD5851 UmsGfsAmAmCmCfTJ -027(A)CmUmGmAmAmCmAfAmAfUmGmGmsCmsAm(서열번호 233)
TRD5852 UmsGfsAmAmCmCf(+)hmpNA (A)CmUmGmAmAmCmAfAmAfUmGmGmsCmsAm(서열번호 234)
TRD5853 UmsGfsAmAmCmCf(-)hmpNA (A)CmUmGmAmAmCmAfAmAfUmGmGmsCmsAm(서열번호 235)
HBV-X TRD5854 UmsAfsUmGfCmGfAmCmGfUmGmCfAmGfAmGfGmUfGmsAmsAm(서열번호 236)
TRD5855 UmsAfsUmGfCmGfGNA(A)CmGfUmGmCfAmGfAmGfGmUfGmsAmsAm(서열번호 237)
TRD5856 UmsAfsUmGfCmGfIdCmGfUmGmCfAmGfAmGfGmUfGmsAmsAm(서열번호 238)
TRD5857 UmsAfsUmGfCmGfTJ -020(A)CmGfUmGmCfAmGfAmGfGmUfGmsAmsAm(서열번호 239)
TRD5858 UmsAfsUmGfCmGfTJ -027(A)CmGfUmGmCfAmGfAmGfGmUfGmsAmsAm(서열번호 240)
TRD5859 UmsAfsUmGfCmGf(+)hmpNA (A)CmGfUmGmCfAmGfAmGfGmUfGmsAmsAm(서열번호 241)
TRD5860 UmsAfsUmGfCmGf(-)hmpNA (A)CmGfUmGmCfAmGfAmGfGmUfGmsAmsAm(서열번호 242)
표적-해당 활성에 대한 실험 결과는 표 6에 제시된다. GNA (A) 는 현저한 서열 의존성을 나타냈고, 상이한 서열은 현저하게 상이한 표적-해당 활성을 가졌다. 본 발명의 실험 화합물은 현저한 서열 의존성을 나타내지 않음으로써, 보다 통용적으로 적용가능함을 나타냈다.
상이한 표적 서열에 대한 siRNA의 표적-해당 활성에 대한 결과
이중 가닥
코드		 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA %(표적-해당 활성)(평균) 　
40nM 13.3
nM		 4.44
nM		 1.48
nM		 0.493
Nm		 0.164
nM		 0.054
nM		 0.0182
nM		 0.006
09nM		 0.002
03nM		 0.000
67nM		 IC50 값(nM)
TRD
5847		 9.3% 7.2% 6.3% 8.5% 17.9% 47.2% 80.6% 94.7% 100.5% 106.1% 110.6% 0.1380
TRD5848 46.5% 35.1% 26.6% 36.0% 67.3% 76.3% 88.4% 104.1% 91.6% 95.1% 98.1% 0.7943
TRD5849 24.8% 16.7% 13.7% 20.9% 41.0% 71.6% 95.5% 98.2% 93.1% 104.3% 113.3% 0.3311
TRD5850 19.7% 14.2% 12.8% 15.5% 29.3% 54.3% 84.2% 87.6% 86.6% 90.0% 95.2% 0.2042
TRD5851 22.9% 15.5% 12.6% 20.2% 38.6% 70.0% 88.4% 102.3% 106.6% 101.0% 101.9% 0.3020
TRD5852 24.7% 17.5% 13.1% 21.1% 40.5% 64.1% 84.3% 94.5% 88.4% 100.2% 95.1% 0.2951
TRD5853 17.5% 11.5% 9.9% 13.5% 30.3% 54.5% 74.6% 86.3% 90.3% 91.0% 84.1% 0.1905
TRD5854 37.9% 32.4% 35.3% 50.3% 70.6% 89.7% 98.8% 101.1% 106.1% 99.6% 114.7% 1.3804
TRD5855 41.3% 40.7% 36.9% 73.6% 71.7% 87.0% 89.0% 85.8% 94.9% 104.4% 101.6% 4.2658
TRD5856 38.6% 37.8% 35.8% 59.5% 72.7% 92.3% 92.5% 85.2% 102.1% 93.1% 102.1% 2.0417
TRD5857 38.5% 34.4% 35.6% 45.6% 66.8% 81.4% 82.7% 84.7% 85.6% 95.0% 103.3% 1.1749
TRD5858 25.0% 24.3% 26.0% 38.1% 59.3% 75.4% 86.5% 104.8% 93.8% 92.4% 94.7% 0.7244
TRD5860 43.5% 37.1% 34.1% 50.8% 77.6% 88.5% 86.6% 100.0% 95.1% 97.8% 110.8% 1.5488
siRNA2 및 siRNA3의 표적-외 활성에 대한 결과는 표 7에 제시된다. 본 발명의 실험 화합물은 모 서열에 비해 siRNA의 표적-외 활성이 현저하게 감소하였다.
상이한 표적 서열에 대한 siRNA의 표적-외 활성에 대한 결과
이중 가닥
코드		 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA %(표적-외 활성)(평균)
40nM 13.3
nM		 4.44
nM		 1.48
nM		 0.493
nM		 0.164
nM		 0.054
nM		 0.0182
nM		 0.006
09nM		 0.002
03nM		 0.000
67nM
TRD
5847		 51.2% 47.6% 47.5% 66.7% 77.8% 81.8% 93.2% 93.3% 93.1% 96.5% 85.7%
TRD5848 99.9% 96.7% 101.6% 100.6% 91.6% 107.0% 96.7% 100.7% 95.4% 101.9% 113.0%
TRD5849 77.3% 77.6% 69.3% 87.2% 90.7% 83.1% 85.4% 95.2% 94.1% 94.0% 108.0%
TRD5850 86.3% 90.2% 92.1% 92.9% 89.8% 99.3% 98.6% 96.0% 95.8% 98.0% 103.5%
TRD5851 84.9% 85.0% 87.7% 84.8% 86.8% 88.7% 92.1% 83.2% 91.5% 84.8% 104.1%
TRD
5852		 81.8% 83.1% 79.0% 89.9% 91.3% 98.2% 99.3% 96.7% 109.6% 94.0% 99.8%
TRD
5853		 86.4% 87.2% 91.4% 92.9% 91.9% 99.7% 87.0% 81.0% 89.0% 86.8% 91.3%
TRD5854 36.9% 32.7% 36.1% 39.8% 62.9% 81.3% 87.6% 87.0% 95.8% 93.6% 99.8%
TRD5855 71.1% 78.2% 81.6% 92.0% 91.0% 94.1% 87.3% 93.6% 99.4% 119.9% 96.6%
TRD5856 89.7% 100.1% 96.5% 106.1% 112.7% 124.4% 117.5% 122.3% 117.5% 120.1% 112.6%
TRD5857 84.9% 69.5% 86.0% 79.6% 87.1% 91.1% 96.1% 87.8% 104.8% 95.1% 95.2%
TRD5858 73.9% 82.8% 92.5% 95.4% 107.5% 97.5% 99.1% 96.1% 94.1% 101.8% 99.8%
TRD5859 79.8% 81.0% 86.0% 96.4% 101.9% 98.8% 99.8% 118.4% 101.3% 93.3% 103.2%
TRD
5860		 78.4% 75.6% 80.6% 86.1% 83.2% 95.9% 91.6% 91.5% 95.6% 97.3% 98.6%
II. 표적화 리간드의 제조 및 활성 평가
주요 계기 모델, 및 표적화 리간드를 제조하기 위한 출발 물질의 공급원
주요 계기 모델 및 출발 물질의 공급원
명칭 회사 카탈로그 번호/모델
고체-상 합성장치 Dr.Oligo 48 Biolytic
HPLC Agilent 1260 Infinity II Agilent
질량 스펙트럼 측정기 Waters Acquity UPLC Waters
뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 출발 물질 Hongene Biotech
실시예 6. 고체-상 지지체에 연결된 갈락토스아민 화합물 1-t
합성 경로는 하기와 같았다:
1) 화합물 1-g의 합성 경로
2) 화합물 1-h의 합성 경로
3) 화합물 1-l의 합성 경로
4) 화합물 1-q의 합성 경로
5) 고체-상 지지체에 연결된 갈락토스아민 화합물 1-t의 합성
.
단계 1
출발 물질 1-a(297 g, 763 mmol) 및 출발 물질 1-b(160 g, 636 mmol)를 960 mL의 DCE에 용해시키고, Sc(OTf)3(15.6 g, 31.8 mmol)을 15℃에서 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 85℃로 가열하고 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 1.5 L의 포화 NaHCO3을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 무기 상을 단리하고, 1.5 L의 포화 염수에 의해 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고 여과하였다. 여과물을 감압하에 증류하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(석유 에터:에틸 아세테이트 = 5:1 내지 0:1)에 의해 정제하여, 생성물 1-c(328 g, 544 mmol, 수율: 85.5%, 순도: 96.4%)를 연황색 오일로서 수득하였다.
1HNMR:(400 MHz, CDCl3) δ 7.44-7.29(m, 5H), 5.83(d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.40-5.23(m, 2H), 5.18-5.06(m, 2H), 4.86(s, 1H), 4.66(d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.21-4.07(m, 2H), 4.04-3.77(m, 3H), 3.51-3.45(m, 1H), 3.31-3.11(m, 2H), 2.18(d, J = 2.0 Hz, 1H), 2.14(s, 3H), 2.06(s, 3H), 2.03-1.99(m, 3H), 1.95(s, 3H), 1.64-1.46(m, 4H), 1.43-1.29(m, 4H).
MS, C28H40N2O11, 실측치: M+ 581.3.
단계 2
단계 1에서 수득한 화합물을 평행 반응을 위해 2개의 부로 분할하고, 이들 각각을 하기와 같이 처리하였다: 화합물 1-c(72.0 g, 124 mmol)를 432 mL의 THF에 첨가하였다. Pd/C(20.0 g, 10% 순도)를 아르곤 대기하에 첨가한 후, TFA(14.1 g, 124 mmol, 9.18 mL)를 첨가하였다. 수소 기체를 반응 용액에 도입하고, 기압을 30 Psi로 유지하였다. 혼합물을 30℃로 가열하고 16시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 2개의 평행 반응으로부터의 반응 혼합물을 합치고 여과하고 여과물을 감압하에 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 의해 희석하고 감압하에 농축하고; 과정을 3회 반복하였다. 잔사를 감압하에 건조하여 표적 화합물 1-d(139 g)를 수득하였다.
1HNMR(400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.85(d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.74(s, 3H), 5.21(d, J = 3.6 Hz, 1H), 4.97(dd, J = 2.8, 10.8 Hz, 1H), 4.48(d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.06-3.98(m, 3H), 3.93-3.82(m, 1H), 3.73-3.68(m, 1H), 3.63-3.56(m, 1H), 3.43-3.38(m, 1H), 2.82-2.71(m, 2H), 2.13-2.09(m, 3H), 2.01-1.97(m, 3H), 1.91-1.87(m, 3H), 1.77(s, 3H), 1.76-1.73(m, 1H), 1.52-1.44(m, 4H), 1.28(s, 4H).
단계 3
화합물 1-d(139 g, 247 mmol) 및 화합물 1-e(75.3 g, 223 mmol)를 DMF 용액(834 mL)에 첨가한 후, DIPEA(41.6 g, 322 mmol, 56.1 mL), HOBt(36.8 g, 272 mmol), 및 EDCI(52.2 g, 272 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 다이클로로메탄(400 mL)에 의해 희석한 후, 순차적으로 포화 암모늄 클로라이드 용액(1 L), 포화 NaHCO3(1.00 L), 및 포화 염수에 의해 세척하였다. 무기 상을 단리하고, 무수 나트륨 설페이트로 건조하고, 여과하고 감압하에 증류하여 용매를 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(석유 에터:에틸 아세테이트 = 5:1 내지 0:1)에 의해 정제하여 표적 화합물 1-f(108 g, 수율: 56.8%)를 수득하였다.
1HNMR(400 MHz, DMSO-d 6)δ 7.89-7.78(m, 2H), 7.41-7.27(m, 6H), 5.21(d, J = 3.2 Hz, 1H), 5.08-4.92(m, 3H), 4.48(d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.07-3.99(m, 3H), 3.97-3.81(m, 2H), 3.75-3.64(m, 1H), 3.42-3.37(m, 1H), 3.13-2.93(m, 2H), 2.20(t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.10(s, 3H), 1.99(s, 3H), 1.89(s, 3H), 1.87-1.79(m, 1H), 1.76(s, 3H), 1.74-1.64(m, 1H), 1.48-1.41(m, 2H), 1.38(s, 12H), 1.29-1.20(m, 4H), 1.19-1.14(m, 1H).
MS, C37H55N3O14, 실측치: M+766.4.
단계 4
상기 수득한 화합물 1-f를 평행 반응을 위해 2개의 부로 분할하고, 이들 각각을 하기와 같이 처리하였다: 화합물 6(47.0 g, 61.3 mmol)을 280 mL의 THF에 첨가하였다. Pd/C(15.0 g, 10% 순도)를 아르곤 대기하에 첨가한 후, TFA(7.00 g, 61.3 mmol, 4.54 mL)를 첨가하였다. 수소 기체를 반응 용액에 도입하고, 기압을 30 Psi로 유지하였다. 혼합물을 30℃로 가열하고 16시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 2개의 평행 반응으로부터의 반응 혼합물을 합치고 여과하고 여과물을 감압하에 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 의해 희석하고 감압하에 농축하고; 과정을 3회 반복하였다. 잔사를 감압하에 건조하여 표적 화합물 1-g(94.0 g, 미정제 생성물)를 수득하였다.
1HNMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.38(s, 1H), 8.10(s, 3H), 7.83(d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.21(d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.96(dd, J = 3.6, 11.2 Hz, 1H), 4.47(d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.06-3.98(m, 3H), 3.92-3.82(m, 1H), 3.75-3.67(m, 2H), 3.60(s, 1H), 3.43-3.37(m, 1H), 3.18-3.04(m, 2H), 2.30-2.24(m, 2H), 2.10(s, 3H), 2.00(s, 3H), 1.95-1.90(m, 2H), 1.89(s, 3H), 1.78-1.75(m, 3H), 1.49-1.41(m, 3H), 1.40(s, 9H), 1.26(s, 4H).
단계 5
상기 수득한 화합물 1-f를 평행 반응을 위해 2개의 부로 분할하고, 이들 각각을 하기와 같이 처리하였다: 화합물 1-f(46.0 g, 60 mmol)를 HCl-EtOAc(2.00 M, 276 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 2개의 반응으로부터의 반응 용액을 합치고, 감압하에 증류하고, 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 의해 희석하고 감압하에 농축하고; 과정을 3회 반복하였다. 잔사를 감압하에 건조하여 연적색 화합물 1-h(91.0 g, 미정제 생성물)를 수득하였다.
1HNMR(400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.91-7.80(m, 2H), 7.42-7.26(m, 6H), 5.21(d, J = 3.2 Hz, 1H), 5.07-4.92(m, 4H), 4.48(d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.06-3.98(m, 3H), 3.98-3.82(m, 3H), 3.73-3.65(m, 1H), 3.44-3.35(m, 1H), 3.12-2.94(m, 2H), 2.22(t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.10(s, 3H), 2.01-1.97(m, 4H), 1.94-1.90(m, 1H), 1.89(s, 3H), 1.87-1.79(m, 2H), 1.76(s, 3H), 1.74-1.67(m, 1H), 1.49-1.40(m, 2H), 1.40-1.32(m, 2H), 1.24(d, J = 4.0 Hz, 4H), 1.19-1.13(m, 1H).
MS, C33H47N3O14, 실측치: M+710.3.
단계 6
2개의 반응을 하기와 같이 평행으로 수행하였다: 화합물 1-g(45.0 g, 60.3 mmol) 및 화합물 1-h(38.5 g, 54.3 mmol)를 270 mL의 DMF에 첨가하였다. 이어서, DIPEA(10.1 g, 78.4 mmol, 13.6 mL)를 0℃에서 첨가하고, HOBt(8.97 g, 66.3 mmol) 및 EDCI(12.7 g, 66.3 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 2개의 평행 반응으로부터의 반응 용액을 합치고, 300 mL의 DCM에 의해 희석하고, 순차적으로 포화 암모늄 클로라이드(800 mL), 포화 NaHCO3(800 mL), 및 포화 염수(800 mL)에 의해 세척하였다. 무기 상을 무수 Na2SO4로 건조하였다. 여과 후, 여과물을 증압하에 증발시킴으로써 농축하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(석유 에터:에틸 아세테이트 = 5:1 내지 0:1)에 의해 정제하여 백색 화합물 1-i(66.0 g, 47.4 mmol, 수율: 39.3%, 순도: 95.1%)를 수득하였다.
1HNMR(400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.96-7.78(m, 5H), 7.41-7.25(m, 6H), 5.21(d, J = 3.6 Hz, 2H), 5.05-4.92(m, 4H), 4.48(d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.22-4.12(m, 1H), 4.02(s, 6H), 3.94-3.80(m, 3H), 3.74-3.64(m, 2H), 3.45-3.35(m, 2H), 3.11-2.92(m, 4H), 2.20-2.12(m, 4H), 2.10(s, 6H), 1.99(s, 6H), 1.89(s, 6H), 1.82-1.79(m, 2H), 1.76(s, 6H), 1.74-1.63(m, 2H), 1.44(d, J = 6.0 Hz, 4H), 1.37(s, 12H), 1.24(s, 9H).
MS: C62H94N6O25, 실측치: m/z 1323.8.
단계 7
본 단계를 11개의 반응을 통해 수행하고, 이들 각각을 하기와 같이 처리하였다: 화합물 1-i(5.00 g, 3.78 mmol) 및 톨루엔(300 mL)을 첨가하고, 실리카겔(45.0 g)을 첨가하였다. 혼합물을 100℃에서 40시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 11개의 반응으로부터의 반응 혼합물을 합쳤다. 반응 혼합물을 감압하에 증류하여 용매를 제거하고, 이소프로판올 및 다이클로로메탄을 잔사에 첨가하였다. 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 불용성 물질을 여과에 의해 제거하고, 생성물이 이소프로판올에 용해되지 않을 때까지, 필터 케이크를 이소프로판올에 의해 세척하였다. 생성된 용액을 농축하여 용매를 제거하고 감압하에 건조하여 연황색 화합물 1-j(43.2 g, 34.0 mmol, 수율: 82.0%)를 수득하였다.
1HNMR:(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.01(d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.93-7.79(m, 2H), 7.39-7.27(m, 3H), 5.21(d, J = 3.2 Hz, 1H), 5.06-4.91(m, 2H), 4.48(d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.07-3.97(m, 3H), 3.94-3.82(m, 2H), 3.73-3.65(m, 1H), 3.45-3.36(m, 2H), 3.10-2.94(m, 2H), 2.15(d, J = 7.6 Hz, 2H), 2.10(s, 3H), 1.99(s, 3H), 1.89(s, 3H), 1.86-1.79(m, 1H), 1.77(s, 3H), 1.74-1.65(m, 1H), 1.44(s, 2H), 1.37(d, J = 5.2 Hz, 2H), 1.24(s, 4H).
MS: C58H86N6O25, 실측치: m/z = 1267.8.
단계 8
본 단계를 평행으로 2개의 반응 반응을 통해 수행하였다: 이들 각각을 하기와 같이 처리하였다: 화합물 1-d(11.8 g, 21.0 mmol) 및 화합물 1-j(21.3 g, 16.8 mmol)를 첨가하여 70 mL의 DMF. 이어서, DIPEA(3.54 g, 27.3 mmol, 4.77 mL)를 0℃에서 첨가하고, HOBt(3.13 g, 23.1 mmol) 및 EDCI(4.44 g, 23.1 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 2개의 평행 반응으로부터의 반응 용액을 합치고, 500 mL의 DCM에 의해 희석하고, 순차적으로 포화 암모늄 클로라이드(1.5 L), 포화 NaHCO3(1.5 mL), 및 포화 염수(1.5 mL)에 의해 세척하였다. 무기 상을 무수 Na2SO4로 건조하였다. 여과 후, 여과물을 증압하에 증발시킴으로써 농축하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(다이클로로메탄:메탄올 = 50:1 내지 10:1)에 의해 정제하여 연황색 화합물 1-k(54.0 g, 31.8 mmol, 수율: 75.6%)를 수득하였다.
1HNMR(400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.91(d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.87-7.78(m, 5H), 7.73(t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.42-7.24(m, 6H), 5.21(d, J = 3.6 Hz, 3H), 5.06-4.92(m, 5H), 4.48(d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.19-4.09(m, 2H), 4.07-3.97(m, 10H), 3.94-3.80(m, 4H), 3.76-3.64(m, 3H), 3.42-3.37(m, 4H), 3.08-2.94(m, 6H), 2.20-2.12(m, 2H), 2.10(s, 9H), 2.08-2.01(m, 2H), 1.99(s, 9H), 1.89(s, 9H), 1.87-1.79(m, 2H), 1.77(s, 9H), 1.74-1.63(m, 2H), 1.44(d, J = 5.6 Hz, 6H), 1.40-1.31(m, 6H), 1.24(s, 13H).
MS: C78H118N8O33, 실측치: m/z = 1696.1.
단계 9
상기 단계를 평행으로 3개의 반응에 의해 수행하고, 이들 각각을 하기와 같이 처리하였다: 화합물 1-k(17.0 g, 10.0 mmol) 및 THF(100 mL)를 첨가하였다. 이어서, Pd/C(5.0 g, 10% 순도)를 첨가하였다 아르곤 대기하에, 및 TFA(1.14 g, 10.0 mmol, 742 μL)를 첨가하였다. 수소 기체를 반응 용액에 도입하고, 기압을 15 Psi로 유지하였다. 혼합물을 30℃로 가열하고 4시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 3개의 평행 반응으로부터의 반응 혼합물을 합치고 여과하고 여과물을 감압하에 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 의해 희석하고 감압하에 농축하고; 과정을 3회 반복하였다. 잔사를 분취 액체 크로마토그래피(C18, 이동상 A: 0.1% TFA-물, 이동상 B: 10% 내지 40% ACN, 20분)에 의해 정제하여 백색 화합물 1-l(17.3 g, 10.2 mmol, 수율: 34.0%)을 수득하였다.
1HNMR:(400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.45(t, J = 5.2 Hz, 1H), 8.14(d, J = 5.2 Hz, 3H), 7.97(t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.90-7.77(m, 4H), 5.21(d, J = 2.8 Hz, 3H), 4.96(dd, J = 3.2, 11.6 Hz, 3H), 4.47(d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.20-4.10(m, 1H), 4.02(s, 8H), 3.87(q, J = 9.6 Hz, 3H), 3.75-3.61(m, 4H), 3.46-3.34(m, 3H), 3.21-2.93(m, 6H), 2.21(s, 2H), 2.14-2.02(m, 11H), 1.99(s, 9H), 1.96-1.82(m, 12H), 1.80-1.65(m, 10H), 1.44(d, J = 5.6 Hz, 8H), 1.36(d, J = 6.4 Hz, 4H), 1.30-1.17(m, 12H).
MS: C70H112N8O31, 실측치: m/2z = 781.8.
단계 10
화합물 1-m(2 g, 12.64 mmol)을 피리딘(10 mL)에 용해시키고, 피리딘(10 mL) 중 DMTrCl(4.71 g, 13.90 mmol)의 용액을 실온에서 적가하였다. 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 메탄올에 의해 ??칭하고 감압하에 농축하여 미정제 생성물을 수득하였다. 미정제 생성물을 실리카겔 컬럼(석유 에터:에틸 아세테이트 = 10:1에 의해 용리)에 의해 정제하였다. 생성된 용리액을 수집하고 감압하에 농축하여 용매를 증발시켜 화합물 1-n(4 g)을 수득하였다.
MS m/z: C29H32O5, [M+H]+ 실측치: 461.3.
단계 11
화합물 1-n(2 g, 4.34 mmol), N,N-다이이소프로필에틸아민(DIEA, 1.43 mL, 8.68 mmol), 및 HATU(2.47 g, 6.51 mmol)를 DMF(10 mL)에 용해시키고, DMF(5 mL) 중 화합물 1-o의 용액을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 물에 의해 ??칭하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트에 의해 추출하였다. 합친 무기 상을 먼제 물에 이어서 포화 염수(20 mL)에 의해 세척하고, 감압하에 농축하여 용매를 증발시키고, 역상 분취 HPLC(컬럼: Boston Green ODS 150 Х 30 mm Х 5 μm, 조건: 25% 내지 80%(A: 물 0.075% NH3·H2O, B: CH3CN), 유속: 55 mL/분)에 의해 정제하고, 동결건조하여 화합물 1-p(2.4 g)를 수득하였다.
MS m/z: C33H39NO7, [M+H]+ 실측치: 562.4.
단계 12
화합물 1-p(2.4 g, 4.27 mmol)를 메탄올 및 물(2:1)의 15 mL의 혼합된 용액에 용해시키고, LiOH(0.36 g, 8.54 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 증발시키고, 역상 분취 HPLC(컬럼: Boston Green ODS 150 Х 30 mm Х 5 μm, 조건: 25% 내지 75%(A: 물, 0.075% NH3·H2O, B: CH3CN), 유속: 55 mL/분)에 의해 정제하고, 동결건조하여 화합물 1-q(2 g)를 수득하였다.
MS m/z: C32H37NO7, [M+H]+ 실측치: 548.6.
단계 13
화합물 1-q(0.37 g, 0.69 mmol), DIEA(0.19 mL, 1.15 mmol), 및 HATU(0.32 g, 0.86 mmol)를 2 mL의 DMF에 용해시키고, DMF(2 mL) 중 화합물 1-l(0.9 g, 0.69 mmol)의 용액을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 다이클로로메탄(10 mL)에 의해 희석하고 순차적으로 포화 NaHCO3(20 mL) 및 포화 염수(20 mL)에 의해 세척하였다. 무기 상을 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하였다. 잔사를 역상 분취 HPLC(컬럼: Boston Green ODS 150 Х 30 mm Х 5 μm, 조건: 25% 내지 65%(A: 물, 0.075% NH3·H2O, B: CH3CN), 유속: 45 mL/분)에 의해 정제하고 동결건조하여 화합물 1-r(0.5 g)을 수득하였다.
MS m/z: C102H147N9O37, [M-H]+ 실측치: 2088.5.
단계 14
화합물 1-r(300 mg, 0.14 mmol) 및 숙신 무수물(28.70 mg, 0.28 mmol)을 테트라하이드로퓨란에 용해시키고, DMAP(3.50 mg, 0.028 mmol)를 용액에 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 메탄올(18.8 mg)을 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 다이클로로메탄(3 mL)에 의해 희석하고 포화 NaHCO3(5 mL)에 의해 2회 세척하였다. 무기 상을 감압하에 농축 건조하고 역상 분취 HPLC(컬럼: Boston Green ODS 150 Х 30 mm Х 5 μm, 조건: 25% 내지 65%(A: 물, 0.075% NH3·H2O, B: CH3CN), 유속: 35 mL/분)에 의해 정제하고 동결건조하여 화합물 1-s(140 mg)를 수득하였다.
MS m/z: C106H151N9O40, [M-H]+ 실측치: 2189.4.
단계 15
이전 단계에서 수득된 화합물 1-r(140 mg, 64 μmol)을 아세토니트릴(5 mL)에 첨가하였다. 이어서, HBTU(48.7 mg, 128 μmol)를 첨가하고, 표면 상에 아미노 변형을 갖는 고체-상 지지체(CPG-NH2, 2.3 g)를 첨가하고, DIEA(41.5 mg, 320 μmol, 55 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 16시간 동안 진탕에 의해 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 여과하고 순차적으로 메탄올(8 mL Х 4) 및 다이클로로메탄(8 mL Х 4)에 의해 세척하였다. 고체를 피리딘:아세트산 무수물(v:v = 4:1, 10.0 mL)에 첨가하고, 혼합물을 30℃에서 다시 16시간 동안 진탕에 의해 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 여과하고 순차적으로 메탄올(8 mL Х 4) 및 다이클로로메탄(8 mL Х 4)에 의해 세척하여 고체 상 지지체에 연결된 화합물 1-t(2.1 g)를 수득하였다.
실시예 7. 고체-상 지지체에 연결된 갈락토스아민 화합물 2-e
합성 경로는 하기와 같았다:
1) 화합물 2-b의 합성
2) 화합물 2-e의 합성
단계 1
화합물 2-a(1.00 g, 2.37 mmol)를 THF(7.5 mL) 및 H2O(7.5 mL)에 첨가한 후, LiOH·H2O(109 mg, 2.60 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 16℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 증발시켰다. 잔사를 동결건조하여 표적 화합물 2-b(960 mg, 2.32 mmol, 수율: 97.8%)를 수득하였다.
1HNMR:(400 MHz, DMSO-d6) δ 7.44(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.34-7.23(m, 6H), 7.22-7.15(m, 1H), 6.86(d, J = 8.0 Hz, 4H), 3.73(s, 6H), 3.66(d, J = 6.4 Hz, 1H), 3.32(d, J = 12.0 Hz, 1H), 3.11(dd, J = 2.0, 9.2 Hz, 1H), 2.85(t, J = 8.8 Hz, 1H).
MS m/z: C24H24O6, 실측치: m/z: 407.2.
단계 2
화합물 1-l(500 mg, 0.30 mmol)을 다이클로로메탄(3 mL)에 첨가하였다. 이어서, 화합물 2-b(0.14 g, 0.34 mmol)를 혼합물에 15℃에서 첨가하고, HBTU(142 mg, 375 μmol) 및 DIEA(115 mg, 895 μmol)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 다이클로로메탄(10 mL)에 의해 희석하고 순차적으로 포화 NaHCO3(20 mL) 및 포화 염수(20 mL)에 의해 세척하였다. 무기 상을 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하였다. 잔사를 분취 액체 크로마토그래피(컬럼: Welch Xtimate C18 250 Х 70 mm #10 μm; 이동상: [물-ACN]; B%: 40% 내지 66%,18분)에 의해 정제하여 화합물 2-c.
MS m/z: C94H134N8O36, [M-H]+ 실측치: 1952.1.
단계 3
화합물 2-c(230 mg, 0.12 mmol) 및 숙신 무수물(23.5 mg, 0.26 mmol)을 다이클로로메탄 용액(2 mL)에 용해시키고, DMAP(43.1 mg, 0.35 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 메탄올(18.8 mg)을 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 다이클로로메탄(3 mL)에 의해 희석하고 포화 NaHCO3에 의해 2회 세척하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축 건조하여 화합물 2-d(240 mg, 미정제 생성물)를 수득하였다.
MS m/z: C106H151N9O40, [M-H]+ 실측치: m/2z: 2070.2.
단계 4
이전 단계에서 수득된 화합물 2-d(240 mg, 116 μmol)를 아세토니트릴(8 mL)에 첨가하였다. 이어서, HBTU(88.7 mg, 233 μmol)를 첨가하고, 표면 상에 아미노 변형을 갖는 고체-상 지지체(CPG-NH2, 4 g)를 첨가하고, DIEA(75.5 mg, 584 μmol, 101 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 16시간 동안 진탕에 의해 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 여과하고 순차적으로 메탄올(8 mL Х 4) 및 다이클로로메탄(8 mL Х 4)에 의해 세척하였다. 고체를 피리딘:아세트산 무수물(v:v = 4:1, 10.0 mL)에 첨가하고, 혼합물을 30℃에서 다시 16시간 동안 진탕에 의해 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 여과하고 순차적으로 메탄올(8 mL Х 4) 및 다이클로로메탄(8 mL Х 4)에 의해 세척하여 고체 상 지지체에 연결된 표적 생성물 화합물 2-e(3.7 g)를 수득하였다.
실시예 8. 고체-상 지지체에 연결된 갈락토스아민 화합물 3-n
합성 경로는 하기와 같았다:
1) 화합물 3-d의 합성
2) 화합물 3-g의 합성
3) 화합물 3-n의 합성
단계 1
출발 물질 3-a(78.8 g, 202 mmol) 및 출발 물질 3-b(40 g, 168 mmol)를 DCE(250 mL)에 용해시키고, CF3SO3H(4.15 g, 8.43 mmol)를 15℃에서 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 가열하여 75℃ 및 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 1 L의 포화 NaHCO3을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 무기 상을 단리하고, 1 L의 포화 염수에 의해 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고 여과하였다. 여과물을 감압하에 증류하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(석유 에터:에틸 아세테이트 = 5:1 내지 0:1)에 의해 정제하여 표적 생성물 3-c(63.2 g, 107 mmol, 수율: 63.5%)를 수득하였다.
1HNMR:(400 MHz, CDCl3) δ 7.35-7.26(m, 5H), 5.88(s, 1H), 5.34-5.25(m, 2H), 4.65(d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.16-4.13(m, 2H), 3.92-3.87(m, 3H), 3.18-3.17(m, 1H), 3.15-3.14(m, 2H), 2.16-1.91(m, 15H), 1.58-1.50(m, 5H), 1.49-1.36(m, 2H).
MS m/z: C24H40N2O11, 실측치: m/z: 567.4.
단계 2
상기 수득한 화합물 3-c(60.0 g, 106 mmol)를 360 mL의 THF에 첨가하였다. 이어서, Pd/C(15.0 g, 10% 순도)를 첨가하였다 아르곤 대기하에, 및 TFA(12.1 g, 106 mmol, 7.84 mL)를 첨가하였다. 수소를 반응 혼합물에 도입하고, 기압을 30 Psi로 유지하였다. 혼합물을 30℃로 가열하고 16시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 감압하에 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 의해 희석하고 감압하에 농축하고; 과정을 3회 반복하였다(500 mL Х 3). 잔사를 감압하에 건조하여 표적 화합물 3-d(44 g, 102 mmol, 수율: 96.1%)를 수득하였다.
단계 3
화합물 3-e(60.0 g, 447 mmol)를 DMF(300 mL)에 용해시켰다. K2CO3(92.7 g, 671 mmol)을 첨가하고, BnBr(115 g, 671 mmol, 79.7 mL)을 0℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 분쇄된 얼음에 부은 후, 에틸 아세테이트(100 mL Х 6)에 의해 추출하였다. 무기 상을 순차적으로 물(100 mL Х 2) 및 포화 염수(100 mL Х 3)에 의해 세척하였다. 무기 상을 무수 나트륨 설페이트로 건조하고 감압하에 증류하여 용매를 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(석유 에터:에틸 아세테이트 = 2:1 내지 0:1)에 의해 정제하여 표적 화합물 3-f(60.3 g, 269 mmol, 수율: 60.1%)를 수득하였다.
1HNMR:(400 MHz, CDCl3) δ 7.37-7.26(m, 5H), 5.18(d, J = 4.4 Hz, 2H), 3.95-3.90(m, 2H), 3.75-3.71(m, 2H), 1.08(s, 1H).
MS m/z: C12H16O4, 실측치: m/z: 223.5.
단계 4
화합물 3-f(50.0 g, 223 mmol)를 다이클로로메탄(300 mL)에 용해시키고, 다이클로로메탄(50 mL) 중 피리딘(73.5 g, 929 mmol, 75 mL) 및 p-니트로페닐 클로로포르메이트(180 g, 892 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 24시간 동안 질소 대기하에 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 다이클로로메탄(250 mL)에 의해 희석하고 순차적으로 NaHSO4 용액(30 mL Х 3) 및 포화 염수(30 mL Х 2)에 의해 세척하였다. 무기 상을 건조하고 over MgSO4, 여과하고 감압하에 농축하여 용매를 증발시켰다. 생성된 미정제 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(석유 에터:에틸 아세테이트 = 3:1)에 의해 정제하여 표적 화합물 3-g(37.0 g, 66.7 mmol, 수율: 29.9%)를 수득하였다.
MS m/z: C26H22N2O12, 실측치: m/z: 553.4.
단계 5
화합물 3-g(22.0 g, 39.7 mmol)를 아세토니트릴(120 mL)에 첨가하고, 트라이에틸아민(24.1 g, 238 mmol, 33.1 mL)을 첨가하였다 질소 대기하에. 반응 혼합물을 0℃로 냉각하고, 아세토니트릴(120 mL) 중 화합물 3-d(42.1 g, 40 mmol)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 25℃로 가열하고 1시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 혼합물을 감압하에 농축하여 용매를 제거한 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(석유 에터:에틸 아세테이트 = 2:1)에 의해 정제하여 표적 화합물 3-h(37.0 g, 12.0 mmol, 수율: 30.2%)를 수득하였다.
MS m/z: C52H76N4O24, 실측치: m/z: 1141.8.
단계 6
화합물 3-h(11.0 g, 9.64 mmol)를 에틸 아세테이트(60 mL)에 용해시키고, Pd/C(2.00 g, 10% 순도)를 첨가하였다. 수소 기체를 반응 혼합물에 도입하고, 기압을 40 Psi로 유지하였다. 혼합물을 25℃에서 8시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 증발에 의해 농축 건조하여 표적 화합물 3-i(10.0 g, 9.42 mmol, 수율: 97.7%)를 수득하였다.
1HNMR:(400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.79(d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.10(s, 2H), 5.74(t, J = 1.6 Hz, 2H), 5.21(d, J = 3.6 Hz, 2H), 4.98-4.95(m, 2H), 4.48(d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.02(d, J = 4.8 Hz, 11H), 3.87-3.84(m, 2H), 3.69-3.67(m, 2H), 3.41-3.39(m, 2H), 2.94-2.90(m, 4H), 2.10(s, 5H), 1.99(s, 7H), 1.89(s, 6H), 1.77(s, 6H), 1.47-1.35(m, 8H), 1.26-1.24(m, 4H), 1.23-1.08(m, 3H).
MS m/z: C45H70N4O24, 실측치: m/z: 1051.4.
단계 7
화합물 3-i(5.00 g, 4.76 mmol)를 다이클로로메탄(30 mL) 및 DMF(30 mL)의 혼합된 용매에 첨가하였다. 이어서, 화합물 33(312 mg, 2.38 mmol)을 첨가하고, HBTU(1.80 g, 4.76 mmol) 및 DIEA(615 mg, 4.76 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(100 mL)에 부었다. 이어서, 혼합물을 포화 염수에 의해 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하여 용매를 증발시켰다. 잔사를 분취 HPLC에 의해 정제하여 표적 화합물 3-k(2.1 g, 956 μmol, 수율: 20.1%)를 수득하였다.
1HNMR:(400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.84-7.81(m, 5H), 7.12-7.07(m, 3H), 5.21(d, J = 3.6 Hz, 4H), 4.99-4.96(m, 4H), 4.49(d, J = 8.4 Hz, 4H), 4.06-4.00(m, 24H), 3.88-3.86(m, 4H), 3.55-3.52(m, 4H), 3.49-3.43(m, 4H), 3.25-3.05(m, 4H), 2.94-2.93(m, 8H), 2.11(s, 12H), 2.00(s, 16H), 1.90(s, 12H), 1.78(s, 12H), 1.46-1.44(m, 8H), 1.38-1.35(m, 8H), 1.26-1.24(m, 8H), 1.18-1.16(m, 6H), 1.09-0.99(m, 2H).
MS m/z: C96H153N11O46, 실측치: m/z: 2197.5.
단계 8
화합물 3-k(100 mg, 45.5 μmol)를 DMF(1 mL)에 첨가하였다. 이어서, 화합물 2-b(21.1 mg, 54 μmol)를 혼합물에 첨가하고, HBTU(21.8 mg, 57.3 μmol) 및 DIEA(17.7 mg, 136 μmol)를 첨가하였다. 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 다이클로로메탄(10 mL)에 의해 희석하고 순차적으로 포화 NaHCO3 및 포화 염수에 의해 세척하였다. 무기 상을 무수 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하였다. 잔사를 분취 액체 크로마토그래피(컬럼: Phenomenex Gemini-NX 150 Х 30 mm Х 5 μm; 이동상: [물-ACN]; B%: 35% 내지 75%,12분)에 의해 정제하여 화합물 3-l을 수득하였다.
MS m/z: C120H175N11O51, 실측치: 2586.9.
단계 9
화합물 3-l(14 mg, 5.4 μmol) 및 숙신 무수물(1.08 mg,10.8 μmol)을 다이클로로메탄 용액(1 mL)에 용해시키고, DMAP(2.0 mg, 16 μmol) 및 TEA(1.1 mg,10.8 μmol,1.5 μL)를 첨가하여 반응 혼합물. 혼합물을 15℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 메탄올(0.9 mg)을 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 다이클로로메탄에 의해 희석하고 포화 NaHCO3에 의해 2회 세척하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축 건조하여 화합물 3-m(18 mg)을 수득하였다.
MS m/z: C124H179N11O54, 실측치: 2687.2.
단계 10
이전 단계에서 수득된 화합물 3-m(18 mg, 6.7 μmol)을 아세토니트릴(3 mL)에 첨가하였다. 이어서, HBTU(5.1 mg, 13.4 μmol)를 첨가하고, 표면 상에 아미노 변형을 갖는 고체 지지체(CPG-NH2, 200 mg)를 첨가하고, DIEA(4.3 mg, 33.5 μmol, 5.8 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 16시간 동안 진탕에 의해 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 여과하고 순차적으로 메탄올(2 mL Х 4) 및 다이클로로메탄(2 mL Х 4)에 의해 세척하였다. 고체를 피리딘:아세트산 무수물(v:v = 4:1, 2 mL)에 첨가하고, 혼합물을 30℃에서 다시 16시간 동안 진탕에 의해 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 여과하고 순차적으로 메탄올 및 다이클로로메탄에 의해 세척하여 고체 상 지지체에 연결된 표적 생성물 화합물 3-n(200 mg)을 수득하였다.
실시예 9. 고체-상 지지체에 연결된 갈락토스아민 화합물 4-c
합성 경로는 하기와 같았다:
화합물 4-c의 합성
단계 1
화합물 3-k(149.5 mg, 68 μmol), DIEA(141.0 mg, 1.09 mmol), 3A 분자 체(500 mg), 및 DEPBT(163.4 mg, 0.55 mmol)를 5 mL의 DCM에 용해시키고, 화합물 1-q(400 mg, 0.18 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료된 후, 분자 체를 여과해 내었다. 여과물을 회전식 증발에 의해 농축 건조하고, 역상 분취 HPLC(컬럼: Boston Green ODS 150 Х 30 mm Х 5 μm, 조건: 5% 내지 50%(A: 물, B: CH3CN), 유속: 45 mL/분)에 의해 정제하고, 동결건조하여 화합물 4-a(118 mg, 32 μmol, 수율: 62.6%)를 수득하였다.
MS m/z: C128H188N12O52, 실측치: [M+HCOO-] = 2770.6.
단계 2
화합물 4-a(110 mg, 4.0 μmol), DMAP(7.4 mg, 40 μmol), 3A 분자 체(100 mg), 및 숙신 무수물(11.9 mg, 120 μmol)을 5 mL의 THF에 용해시켰다. 혼합물을 40℃에서 4시간 동안 아르곤 대기하에 교반하였다. 반응이 완료된 후, 분자 체를 여과해 내었다. 여과물을 회전식 증발에 의해 농축 건조하고, 역상 분취 HPLC(컬럼: Boston Green ODS 150 Х 30 mm Х 5 μm, 조건: 5% 내지 50%(A: 물, B: CH3CN), 유속: 45 mL/분)에 의해 정제하고, 동결건조하여 화합물 4-b(80 mg, 28.3 μmol, 수율: 70.8%)를 수득하였다.
MS m/z: C132H192N12O55, [M-H]+ 실측치: 2824.6.
단계 3
이전 단계에서 수득된 화합물 4-b(71mg, 25 μmol)를 아세토니트릴(5 mL)에 첨가하였다. 이어서, HBTU(19.0 mg, 50 μmol)를 첨가하고, 표면 상에 아미노 변형을 갖는 고체-상 지지체(CPG-NH2, 0.86 g)를 첨가하고, DIEA(16.2 mg, 125 μmol, 21.6 μL)를 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 16시간 동안 진탕에 의해 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 여과하고 순차적으로 메탄올(5 mL Х 4) 및 다이클로로메탄(5 mL Х 4)에 의해 세척하였다. 고체를 피리딘:아세트산 무수물(v:v = 4:1, 6.0 mL)에 첨가하고, 혼합물을 30℃에서 다시 16시간 동안 진탕에 의해 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 여과하고 순차적으로 메탄올 및 다이클로로메탄에 의해 세척하여 고체 상 지지체에 연결된 화합물 4-c(0.74 g)를 수득하였다.
실시예 10. 대조군 화합물 L96의 제조
대조군 화합물을 WO2014025805A1에 기재된 방법에 의해 제조하였다. 화합물 L96을 고체-상 지지체에 대해 전술한 것과 동일한 방법에 의해 CPG 고체-상 지지체에 화합물을 연결함으로써 수득하였다.
실시예 11. 갈락토스아민 분자 클러스터-접합된 siRNA의 합성
시험에 사용된 siRNA, 즉 마우스 TTR 유전자의 mRNA를 표적화하는 siRNA(Molecular Therapy Vol. 26 No 3 March 2018)가 하기 제시된다. 갈락토스아민 분자 클러스터를 SS 가닥의 3' 말단에 연결하였다.
SS 가닥(5'-3'): CmsAmsGmUmGfUmUfCfUfUmGmCmUmCmUmAmUmAmAm-갈락토스아민 분자 클러스터(서열번호 243)
AS 가닥(5'-3'): UmsUfsAmUmAmGfAmGmCmAmAmGmAmAfCmAfCmUmGmsUmsUm(서열번호 244)
siRNA의 합성은 통상적인 포스포라미다이트 고체-상 합성과 동일하되, 예외적으로, siRNA SS 가닥의 합성에서, 통상적인 유니버셜-CPG 지지체를 상기 합성한 갈락토스아민 클러스터와 연결된 CPG 지지체에 의해 대체하였다. 합성 과정은 하기와 같이 요약된다: 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체를 Dr. Oligo48 합성장치(Biolytic)에서의 합성 프로그램에 따라 상기 합성한 갈락토스아민과 연결된 합성된 CPG 지지체에서 출발하여 하나씩 연결하였다. 뉴클레오시드 단량체 출발 물질 2'-F RNA, 2'-O-메틸 RNA, 및 다른 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체를 Hongene, Shanghai 또는 Genepharma, Suzhou로부터 구입하였다. 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)을 활성화제(아세토니트릴 중 0.6 M 용액)로서 사용하고, 0.22 M 1:1 부피 비의 아세토니트릴 및 콜리딘 중 PADS의 용액(Kroma, Suzhou)을 황화제로서 사용하고, 요오도피리딘/물 용액(Korma)을 산화제로서 사용하였다.
고체-상 합성을 완료한 후, 올리고리보뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 절단하고 28% 암모니아수 및 에탄올(3:1)의 용액에서 50℃ 16시간 동안 적셨다. 혼합물을 원심분리하고, 상청액을 또다른 원심분리 튜브로 옮겼다. 상청액을 증발에 의해 농축 건조한 후, 이동상으로서 0.1 M TEAA 및 아세토니트릴을 사용하여 C18 역상 크로마토그래피에 의해 정제하고, DMTr을 3% 트라이플루오로아세트산 용액을 사용하여 제거하였다. 표적 올리고뉴클레오티드를 수집하고, 동결건조하고, LC-MS에 의해 표적 생성물인 것을 확인하고, UV(260 nm)에 의해 정량분석하였다.
생성된 단일 가닥화된 올리고뉴클레오티드를 상보적 방식으로 등몰비로 AS 가닥과 페어링하고 어닐링하였다. 최종 이중가닥화된 siRNA를 1Х PBS에 용해시키고, 용액을 실험에 필요한 농도로 조정하였다.
갈락토스아민 클러스터-접합된 siRNA를 합성하였다. 실험에 사용된 siRNA는 마우스 TTR mRNA를 표적화하였다.
갈락토스아민 분자 클러스터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
NAG1 NAG2
NAG3 NAG4
L96(대조군 화합물).
표적화 리간드의 활성 평가에서 siRNA 개수 및 서열
siRNA 개수 SS 가닥(5'-3') AS 가닥(5'-3')
S-1 CmsAmsGmUmGfUmUfCfUf UmGmCmUmCmUmAmUmAm Am -NAG1(서열번호 245) UmsUfsAmUmAmGfAmGmCm AmAmGmAmAfCmAfCmUm GmsUmsUm(서열번호 250)
S-2 CmsAmsGmUmGfUmUfCfUf UmGmCmUmCmUmAmUmAm Am -NAG2(서열번호 246) UmsUfsAmUmAmGfAmGmCm AmAmGmAmAfCmAfCmUm GmsUmsUm(서열번호 250)
S-3 CmsAmsGmUmGfUmUfCfUf UmGmCmUmCmUmAmUmAm Am -NAG3(서열번호 247) UmsUfsAmUmAmGfAmGmCm AmAmGmAmAfCmAfCmUm GmsUmsUm(서열번호 250)
S-4 CmsAmsGmUmGfUmUfCfUf UmGmCmUmCmUmAmUmAm Am -NAG4(서열번호 248) UmsUfsAmUmAmGfAmGmCm AmAmGmAmAfCmAfCmUm GmsUmsUm(서열번호 250)
S-L96 CmsAmsGmUmGfUmUfCfUf UmGmCmUmCmUmAmUmAm Am -L96(서열번호 249) UmsUfsAmUmAmGfAmGmCm AmAmGmAmAfCmAfCmUm GmsUmsUm(서열번호 250)
실시예 12. 갈락토스아민 분자 클러스터- 접합된 siRNA에 의한 1차 간세포에서 mRNA 발현의 억제
신선한 1차 간세포를 문헌[Severgini et al. (Cytotechnology. 2012; 64(2): 187-195)]에 의해 보고된 방법에 의해 마우스로부터 단리하였다.
단리 후, 1차 간세포를 100,000 세포/웰로 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 시험 접합된 siRNA를 50 nM, 10 nM, 2 nM, 0.4 nM, 0.08 nM, 0.016 nM, 0.0032 nM, 및 0.00064 nM의 최종 농도로 첨가하였다. 순차적으로, 1차 간세포를 37℃에서 5% CO2로 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, mTTR의 mRNA의 발현 수준을 qPCR 방법에 의해 측정하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, S-1, S-2, S-3, 및 S-4 모두는 mTTR 유전자 발현에 대해 뛰어난 억제 효율을 나타냈다. S-1 및 S-4의 IC50 값은 2개의 군의 것보다 낮았다. 대조군 S-L96의 IC50 값은 0.280 nM이고, S-1의 IC50 값은 0.131 nM이고, S-4의 IC50 값은 0.135 nM로, S-1 및 S-4는 대조군보다 시험관내 1차 간세포에 의한 자유 흡수의 높은 효율성을 갖고 S-1 및 S-4 화합물은 siRNA가 1차 간세포로 보다 효율적으로 진입하게 하는 것을 매개할 수 있었음을 나타냈다.
실시예 13. 갈락토스아민 분자 클러스터- 접합된 siRNA에 의한 mRNA 발현의 생체내 억제
8-주령의 C57BL/6 마우스(Joinnbio, SPF, 암컷)에 접합된 전술한 siRNA를 피하 주사하였다. 1일차에, PBS, 또는 PBS 중 제형화된 접합된 상응하는 siRNA의 용량(1 mg/kg(mpk) 또는 0.2 mpk)을 함유하는 100 μL의 용액을 마우스의 목 및 어깨의 느슨한 피부에 피하 주사하였다.
투여 3일 후, 마우스를 자궁 경부 탈구(cervical dislocation)에 의해 희생하고, 마우스의 간 조직 내의 mTTR의 mRNA의 발현 수준을 qPCR에 의해 측정하였다.
도 2에 도시한 바와 같이, S-1, S-2, S-3, 및 S-4 모두는 mTTR 유전자 발현에 대해 뛰어난 억제 효율을 나타냈다. 1 mpk 및 0.2 mpk로 투여될 때, S-2, S-3, S-4, 및 대조군 S-L96은 유사한 활성을 나타냈다. S-1은 1 mpk 및 0.2 mpk로 투여될 때 대조군 S-L96보다 우수한 활성을 나타냈다.
갈락토스아민 분자 클러스터 화합물의 개수
갈락토스아민 분자 클러스터 화합물의 개수 상응하는 접합된 siRNA의 개수
NAG1 S-1
NAG2 S-2
NAG4 S-4
NAG3 S-3
L96 S-L96
III. HSD17B13 및 siRNA 접합체를 표적화하는 siRNA의 스크리닝 및 활성 검증
실시예 14. 인간 HSD17B13 siRNA의 설계 및 합성
siRNA 설계
인간 HSD17B13 유전자(NM-178135.5)를 활성 siRNA의 유전 법칙을 만족하는 조건하에 표적 유전자로서 사용하여 19/21nt siRNA를 설계하였다. 비-변형된 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 서열은 표 11에 상세히 기재되고, 비-변형된 siRNA의 SS 가닥 및 AS 가닥 둘 다는 비-변형된 것이다.
인간 HSD siRNA의 비-변형된 센스 가닥 및 안티센스 가닥
서열번호 센스 가닥(5'-3') 서열번호 안티센스 가닥(5'-3')
3 GCACCAAGGAUGAAGAGAU 25 AUCUCUUCAUCCUUGGUGCUG
4 CACCAAGGAUGAAGAGAUU 26 AAUCUCUUCAUCCUUGGUGCU
5 ACCAAGGAUGAAGAGAUUA 27 UAAUCUCUUCAUCCUUGGUGC
6 CCAAGGAUGAAGAGAUUAU 28 AUAAUCUCUUCAUCCUUGGUG
7 AGGAUGAAGAGAUUACCAA 29 UUGGUAAUCUCUUCAUCCUUG
8 GGGUUCACCAAAAAUCCAA 30 UUGGAUUUUUGGUGAACCCAG
9 GGUUCACCAAAAAUCCAAA 31 UUUGGAUUUUUGGUGAACCCA
10 CACCAAAAAUCCAAGCACA 32 UGUGCUUGGAUUUUUGGUGAA
11 CAAAAAUCCAAGCACAAGA 33 UCUUGUGCUUGGAUUUUUGGU
12 AAAUCCAAGCACAAGAUUA 34 UAAUCUUGUGCUUGGAUUUUU
13 AAUCCAAGCACAAGAUUAU 35 AUAAUCUUGUGCUUGGAUUUU
14 GCACAAGAUUAUGGCCUGU 36 ACAGGCCAUAAUCUUGUGCUU
15 CACAAGAUUAUGGCCUGUA 37 UACAGGCCAUAAUCUUGUGCU
16 ACAAGAUUAUGGCCUGUAU 38 AUACAGGCCAUAAUCUUGUGC
17 CAAGAUUAUGGCCUGUAUU 39 AAUACAGGCCAUAAUCUUGUG
18 CACAAAAUCAAAAUGAAAU 40 AUUUCAUUUUGAUUUUGUGGC
19 CAAAAUCAAAAUGAAAUGA 41 UCAUUUCAUUUUGAUUUUGUG
20 AAAUCAAAAUGAAAUGAAU 42 AUUCAUUUCAUUUUGAUUUUG
21 AUCAAAAUGAAAUGAAUAA 43 UUAUUCAUUUCAUUUUGAUUU
22 UCAAAAUGAAAUGAAUAAA 44 UUUAUUCAUUUCAUUUUGAUU
23 CAAAAUGAAAUGAAUAAAU 45 AUUUAUUCAUUUCAUUUUGAU
24 AAAUGAAAUGAAUAAAUAA 46 UUAUUUAUUCAUUUCAUUUUG
AS 가닥의 5' 말단의 위치에서의 변형을 갖는 뉴클레오티드의 합성에서, 모 서열의 원래 뉴클레오티드를 실시예 1에서 합성된 포스포라미다이트 단량체에 의해 대체하였다. AS 가닥의 5' 말단의 위치 7에서 변형을 갖는 안티센스 가닥의 서열은 표 12에 상세 기재되어 있다.
2'-플루오로, 2'-메톡시 등에 의해 변형된 후의 HSD17B13 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 서열은 표 13에 상세히 기재되고, 위치 7에서 변형을 갖는 안티센스 가닥의 광학적 변화는 표 14에 상세히 기재되고, HSD17B13 siRNA 접합체의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 서열은 표 15에 상세히 기재된다.
인간 HSD siRNA의 위치 7에서 변형을 갖는 비-변형된 안티센스 가닥 및 상응하는 안티센스 가닥
서열번호 비-변형된 안티센스 가닥(5'-3') 서열번호 위치 7(5'-3')에서 변형을 갖는 안티센스 가닥
25 AUCUCUUCAUCCUUGGUGCUG 47 AUCUCUW'CAUCCUUGGUGCUG
26 AAUCUCUUCAUCCUUGGUGCU 48 AAUCUCW'UCAUCCUUGGUGCU
27 UAAUCUCUUCAUCCUUGGUGC 49 UAAUCUW'UUCAUCCUUGGUGC
28 AUAAUCUCUUCAUCCUUGGUG 50 AUAAUCW'CUUCAUCCUUGGUG
29 UUGGUAAUCUCUUCAUCCUUG 51 UUGGUAW'UCUCUUCAUCCUUG
30 UUGGAUUUUUGGUGAACCCAG 52 UUGGAUW'UUUGGUGAACCCAG
31 UUUGGAUUUUUGGUGAACCCA 53 UUUGGAW'UUUUGGUGAACCCA
32 UGUGCUUGGAUUUUUGGUGAA 54 UGUGCUW'GGAUUUUUGGUGAA
33 UCUUGUGCUUGGAUUUUUGGU 55 UCUUGUW'CUUGGAUUUUUGGU
34 UAAUCUUGUGCUUGGAUUUUU 56 UAAUCUW'GUGCUUGGAUUUUU
35 AUAAUCUUGUGCUUGGAUUUU 57 AUAAUCW'UGUGCUUGGAUUUU
36 ACAGGCCAUAAUCUUGUGCUU 58 ACAGGCW'AUAAUCUUGUGCUU
37 UACAGGCCAUAAUCUUGUGCU 59 UACAGGW'CAUAAUCUUGUGCU
38 AUACAGGCCAUAAUCUUGUGC 60 AUACAGW'CCAUAAUCUUGUGC
39 AAUACAGGCCAUAAUCUUGUG 61 AAUACAW'GCCAUAAUCUUGUG
40 AUUUCAUUUUGAUUUUGUGGC 62 AUUUCAW'UUUGAUUUUGUGGC
41 UCAUUUCAUUUUGAUUUUGUG 63 UCAUUUW'AUUUUGAUUUUGUG
42 AUUCAUUUCAUUUUGAUUUUG 64 AUUCAUW'UCAUUUUGAUUUUG
43 UUAUUCAUUUCAUUUUGAUUU 65 UUAUUCW'UUUCAUUUUGAUUU
44 UUUAUUCAUUUCAUUUUGAUU 66 UUUAUUW'AUUUCAUUUUGAUU
45 AUUUAUUCAUUUCAUUUUGAU 67 AUUUAUW'CAUUUCAUUUUGAU
46 UUAUUUAUUCAUUUCAUUUUG 68 UUAUUUW'UUCAUUUCAUUUUG
표 12에서, W'은 본 발명의 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함하는 뉴클레오티드를 나타낸다. 일부 양태에서, W'은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: , , 또는 ; 상기 식에서, m은 O 또는 S이고; 상기 식에서, B는 표 16에서 서열번호 47 내지 서열번호 68 및 서열번호 25 내지 서열번호 46 의 5' 영역의 위치 7에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 예컨대, 서열번호 47은 서열번호 25에 상응하고, 서열번호 68은 서열번호 46에 상응하고, 서열번호 52은 서열번호 30에 상응한다.
인간 HSD17B13 siRNA의 변형된 센스 가닥 및 안티센스 가닥
이중 가닥 코드 서열번호 센스 가닥(5'-3') 서열번호 안티센스 가닥(5'-3')
TRD005305 69 GmsCmsAm CmCfAm AfGfGf AmUmGm AmAmGm AmGmAm Um 111 AmsUfsCm UfCmUf UmCmAf UmCmCf UmUfGm GfUmGf CmsUmsGm
TRD005306 70 CmsAmsCm CmAfAm GfGfAf UmGmAm AmGmAm GmAmUm Um 112 AmsAfsUm CfUmCf UmUmCf AmUmCf CmUfUm GfGmUf GmsCmsUm
TRD005307 71 AmsCmsCm AmAfGm GfAfUf GmAmAm GmAmGm AmUmUm Am 113 UmsAfsAm UfCmUf CmUmUf CmAmUf CmCfUm UfGmGf UmsGmsCm
TRD005308 72 CmsCmsAm AmGfGm AfUfGf AmAmGm AmGmAm UmUmAm Um 114 AmsUfsAm AfUmCf UmCmUf UmCmAf UmCfCm UfUmGf GmsUmsGm
TRD005309 73 AmsGmsGm AmUfGm AfAfGf AmGmAm UmUmAm CmCmAm Am 115 UmsUfsGm GfUmAf AmUmCf UmCmUf UmCfAm UfCmCf UmsUmsGm
TRD005352 74 GmsGmsGm UmUfCm AfCfCf AmAmAm AmAmUm CmCmAm Am 116 UmsUfsGm GfAmUf UmUmUf UmGmGf UmGfAm AfCmCf CmsAmsGm
TRD005353 75 GmsGmsUm UmCfAm CfCfAf AmAmAm AmUmCm CmAmAm Am 117 UmsUfsUm GfGmAf UmUmUf UmUmGf GmUfGm AfAmCf CmsCmsAm
TRD005354 76 CmsAmsCm CmAfAm AfAfAf UmCmCm AmAmGm CmAmCm Am 118 UmsGfsUm GfCmUf UmGmGf AmUmUf UmUfUm GfGmUf GmsAmsAm
TRD005355 77 CmsAmsAm AmAfAm UfCfCf AmAmGm CmAmCm AmAmGm Am 119 UmsCfsUm UfGmUf GmCmUf UmGmGf AmUfUm UfUmUf GmsGmsUm
TRD005356 78 AmsAmsAm UmCfCm AfAfGf CmAmCm AmAmGm AmUmUm Am 120 UmsAfsAm UfCmUf UmGmUf GmCmUf UmGfGm AfUmUf UmsUmsUm
TRD005357 79 AmsAmsUm CmCfAm AfGfCf AmCmAm AmGmAm UmUmAm Um 121 AmsUfsAm AfUmCf UmUmGf UmGmCf UmUfGm GfAmUf UmsUmsUm
TRD005358 80 GmsCmsAm CmAfAm GfAfUf UmAmUm GmGmCm CmUmGm Um 122 AmsCfsAm GfGmCf CmAmUf AmAmUf CmUfUm GfUmGf CmsUmsUm
TRD005359 81 CmsAmsCm AmAfGm AfUfUf AmUmGm GmCmCm UmGmUm Am 123 UmsAfsCm AfGmGf CmCmAf UmAmAf UmCfUm UfGmUf GmsCmsUm
TRD005360 82 AmsCmsAm AmGfAm UfUfAf UmGmGm CmCmUm GmUmAm Um 124 AmsUfsAm CfAmGf GmCmCf AmUmAf AmUfCm UfUmGf UmsGmsCm
TRD005361 83 CmsAmsAm GmAfUm UfAfUf GmGmCm CmUmGm UmAmUm Um 125 AmsAfsUm AfCmAf GmGmCf CmAmUf AmAfUm CfUmUf GmsUmsGm
TRD005397 84 CmsAmsCm AmAfAm AfUfCf AmAmAm AmUmGm AmAmAm Um 126 AmsUfsUm UfCmAf UmUmUf UmGmAf UmUfUm UfGmUf GmsGmsCm
TRD005398 85 CmsAmsAm AmAfUm CfAfAf AmAmUm GmAmAm AmUmGm Am 127 UmsCfsAm UfUmUf CmAmUf UmUmUf GmAfUm UfUmUf GmsUmsGm
TRD005399 86 AmsAmsAm UmCfAm AfAfAf UmGmAm AmAmUm GmAmAm Um 128 AmsUfsUm CfAmUf UmUmCf AmUmUf UmUfGm AfUmUf UmsUmsGm
TRD005400 87 AmsUmsCm AmAfAm AfUfGf AmAmAm UmGmAm AmUmAm Am 129 UmsUfsAm UfUmCf AmUmUf UmCmAf UmUfUm UfGmAf UmsUmsUm
TRD005401 88 UmsCmsAm AmAfAm UfGfAf AmAmUm GmAmAm UmAmAm Am 130 UmsUfsUm AfUmUf CmAmUf UmUmCf AmUfUm UfUmGf AmsUmsUm
TRD005402 89 CmsAmsAm AmAfUm GfAfAf AmUmGm AmAmUm AmAmAm Um 131 AmsUfsUm UfAmUf UmCmAf UmUmUf CmAfUm UfUmUf GmsAmsUm
TRD005403 90 AmsAmsAm UmGfAm AfAfUf GmAmAm UmAmAm AmUmAm Am 132 UmsUfsAm UfUmUf AmUmUf CmAmUf UmUfCm AfUmUf UmsUmsGm
91 CmsAmsCm CmAfAm GfGfAf UmGmAm AmGmAm GmAmUms Um 133 AmsAfsUm CfUmCf(-)hmpNA(U)UmCm AfUmCf CmUfUm GfGmUf GmsCmsUm
92 CmsCmsAm AmGfGm AfUfGf AmAmGm AmGmAm UmUmAms Um 134 AmsUfsAm AfUmCf(-)hmpNA(U)CmUm UfCmAf UmCfCm UfUmGf GmsUmsGm
93 CmsAmsAm AmAfAm UfCfCf AmAmGm CmAmCm AmAmGms Am 135 UmsCfsUm UfGmUf(-)hmpNA(G)CmUm UfGmGf AmUfUm UfUmUf GmsGmsUm
94 AmsAmsAm UmGfAm AfAfUf GmAmAm UmAmAm AmUmAms Am 136 UmsUfsAm UfUmUf(-)hmpNA(A)UmUm CfAmUf UmUfCm AfUmUf UmsUmsGm
95 GmsCmsAm CmCfAm AfGfGf AmUmGm AmAmGm AmGmAm Um 137 AmsUfsCm UfCmUf(-)hmpNA(U)CmAf UmCmCf UmUfGm GfUmGf CmsUmsGm
96 CmsAmsCm CmAfAm GfGfAf UmGmAm AmGmAm GmAmUm Um 138 AmsAfsUm CfUmCf(-)hmpNA(U)UmCf AmUmCf CmUfUm GfGmUf GmsCmsUm
97 AmsCmsCm AmAfGm GfAfUf GmAmAm GmAmGm AmUmUm Am 139 UmsAfsAm UfCmUf(-)hmpNA(C)UmUf CmAmUf CmCfUm UfGmGf UmsGmsCm
98 CmsCmsAm AmGfGm AfUfGf AmAmGm AmGmAm UmUmAm Um 140 AmsUfsAm AfUmCf(-)hmpNA(U)CmUf UmCmAf UmCfCm UfUmGf GmsUmsGm
99 AmsGmsGm AmUfGm AfAfGf AmGmAm UmUmAm CmCmAm Am 141 UmsUfsGm GfUmAf(-)hmpNA(A)UmCf UmCmUf UmCfAm UfCmCf UmsUmsGm
100 GmsGmsUm UmCfAm CfCfAf AmAmAm AmUmCm CmAmAm Am 142 UmsUfsUm GfGmAf(-)hmpNA(U)UmUf UmUmGf GmUfGm AfAmCf CmsCmsAm
101 CmsAmsAm AmAfAm UfCfCf AmAmGm CmAmCm AmAmGm Am 143 UmsCfsUm UfGmUf(-)hmpNA(G)CmUf UmGmGf AmUfUm UfUmUf GmsGmsUm
102 AmsAmsUm CmCfAm AfGfCf AmCmAm AmGmAm UmUmAm Um 144 AmsUfsAm AfUmCf(-)hmpNA(U)UmGf UmGmCf UmUfGm GfAmUf UmsUmsUm
103 GmsCmsAm CmAfAm GfAfUf UmAmUm GmGmCm CmUmGm Um 145 AmsCfsAm GfGmCf(-)hmpNA(C)AmUf AmAmUf CmUfUm GfUmGf CmsUmsUm
104 CmsAmsCm AmAfAm AfUfCf AmAmAm AmUmGm AmAmAm Um 146 AmsUfsUm UfCmAf(-)hmpNA(U)UmUf UmGmAf UmUfUm UfGmUf GmsGmsCm
105 CmsAmsAm AmAfUm CfAfAf AmAmUm GmAmAm AmUmGm Am 147 UmsCfsAm UfUmUf(-)hmpNA(C)AmUf UmUmUf GmAfUm UfUmUf GmsUmsGm
106 AmsAmsAm UmCfAm AfAfAf UmGmAm AmAmUm GmAmAm Um 148 AmsUfsUm CfAmUf(-)hmpNA(U)UmCf AmUmUf UmUfGm AfUmUf UmsUmsGm
107 AmsUmsCm AmAfAm AfUfGf AmAmAm UmGmAm AmUmAm Am 149 UmsUfsAm UfUmCf(-)hmpNA(A)UmUf UmCmAf UmUfUm UfGmAf UmsUmsUm
108 UmsCmsAm AmAfAm UfGfAf AmAmUm GmAmAm UmAmAm Am 150 UmsUfsUm AfUmUf(-)hmpNA(C)AmUf UmUmCf AmUfUm UfUmGf AmsUmsUm
109 CmsAmsAm AmAfUm GfAfAf AmUmGm AmAmUm AmAmAm Um 151 AmsUfsUm UfAmUf(-)hmpNA(U)CmAf UmUmUf CmAfUm UfUmUf GmsAmsUm
110 AmsAmsAm UmGfAm AfAfUf GmAmAm UmAmAm AmUmAm Am 152 UmsUfsAm UfUmUf(-)hmpNA(A)UmUf CmAmUf UmUfCm AfUmUf UmsUmsGm
위치 7에서 상이한 광학적 화학 변형을 갖는 AS 가닥
SEQ ID NO 안티센스 가닥(5'-3') SEQ ID NO 안티센스 가닥(5'-3')
133 AmsAfsUm CfUmCf(-)hmpNA(U)UmCm AfUmCf CmUfUm GfGmUf GmsCmsUm 163 UmsCfsUm UfGmUf(+)hmpNA(G)CmUf UmGmGf AmUfUm UfUmUf GmsGmsUm
134 AmsUfsAm AfUmCf(-)hmpNA(U)CmUmUfCmAf UmCfCm UfUmGf GmsUmsGm 164 AmsUfsAm AfUmCf(+)hmpNA(U)UmGf UmGmCf UmUfGm GfAmUf UmsUmsUm
135 UmsCfsUm UfGmUf(-)hmpNA(G)CmUmUfGmGf AmUfUm UfUmUf GmsGmsUm 165 AmsCfsAm GfGmCf(+)hmpNA(C)AmUf AmAmUf CmUfUm GfUmGf CmsUmsUm
136 UmsUfsAm UfUmUf(-)hmpNA(A)UmUm CfAmUf UmUfCm AfUmUf UmsUmsGm 166 AmsUfsUm UfCmAf(+)hmpNA(U)UmUf UmGmAf UmUfUm UfGmUf GmsGmsCm
137 AmsUfsCm UfCmUf(-)hmpNA(U)CmAf UmCmCf UmUfGm GfUmGf CmsUmsGm 167 UmsCfsAm UfUmUf(+)hmpNA(C)AmUf UmUmUf GmAfUm UfUmUf GmsUmsGm
138 AmsAfsUm CfUmCf(-)hmpNA(U)UmCf AmUmCf CmUfUm GfGmUf GmsCmsUm 168 AmsUfsUm CfAmUf(+)hmpNA(U)UmCf AmUmUf UmUfGm AfUmUf UmsUmsGm
139 UmsAfsAm UfCmUf(-)hmpNA(C)UmUf CmAmUf CmCfUm UfGmGf UmsGmsCm 169 UmsUfsAm UfUmCf(+)hmpNA(A)UmUf UmCmAf UmUfUm UfGmAf UmsUmsUm
140 AmsUfsAm AfUmCf(-)hmpNA(U)CmUf UmCmAf UmCfCm UfUmGf GmsUmsGm 170 UmsUfsUm AfUmUf(+)hmpNA(C)AmUf UmUmCf AmUfUm UfUmGf AmsUmsUm
141 UmsUfsGm GfUmAf(-)hmpNA(A)UmCf UmCmUf UmCfAm UfCmCf UmsUmsGm 171 AmsUfsUm UfAmUf(+)hmpNA(U)CmAf UmUmUf CmAfUm UfUmUf GmsAmsUm
142 UmsUfsUm GfGmAf(-)hmpNA(U)UmUf UmUmGf GmUfGm AfAmCf CmsCmsAm 172 UmsUfsAm UfUmUf(+)hmpNA(A)UmUf CmAmUf UmUfCm AfUmUf UmsUmsGm
143 UmsCfsUm UfGmUf(-)hmpNA(G)CmUf UmGmGf AmUfUm UfUmUf GmsGmsUm 173 AmsAfsUm CfUmCf hmpNA(U)UmCm AfUmCf CmUfUm GfGmUf GmsCmsUm
144 AmsUfsAm AfUmCf(-)hmpNA(U)UmGf UmGmCf UmUfGm GfAmUf UmsUmsUm 174 AmsUfsAm AfUmCf hmpNA(U)CmUmUfCmAf UmCfCm UfUmGf GmsUmsGm
145 AmsCfsAm GfGmCf(-)hmpNA(C)AmUf AmAmUf CmUfUm GfUmGf CmsUmsUm 175 UmsCfsUm UfGmUf hmpNA(G)CmUmUfGmGf AmUfUm UfUmUf GmsGmsUm
146 AmsUfsUm UfCmAf(-)hmpNA(U)UmUf UmGmAf UmUfUm UfGmUf GmsGmsCm 176 UmsUfsAm UfUmUf hmpNA(A)UmUm CfAmUf UmUfCm AfUmUf UmsUmsGm
147 UmsCfsAm UfUmUf(-)hmpNA(C)AmUf UmUmUf GmAfUm UfUmUf GmsUmsGm 177 AmsUfsCm UfCmUf hmpNA(U)CmAf UmCmCf UmUfGm GfUmGf CmsUmsGm
148 AmsUfsUm CfAmUf(-)hmpNA(U)UmCf AmUmUf UmUfGm AfUmUf UmsUmsGm 178 AmsAfsUm CfUmCf hmpNA(U)UmCf AmUmCf CmUfUm GfGmUf GmsCmsUm
149 UmsUfsAm UfUmCf(-)hmpNA(A)UmUf UmCmAf UmUfUm UfGmAf UmsUmsUm 179 UmsAfsAm UfCmUf hmpNA(C)UmUf CmAmUf CmCfUm UfGmGf UmsGmsCm
150 UmsUfsUm AfUmUf(-)hmpNA(C)AmUf UmUmCf AmUfUm UfUmGf AmsUmsUm 180 AmsUfsAm AfUmCf hmpNA(U)CmUf UmCmAf UmCfCm UfUmGf GmsUmsGm
151 AmsUfsUm UfAmUf(-)hmpNA(U)CmAf UmUmUf CmAfUm UfUmUf GmsAmsUm 181 UmsUfsGm GfUmAf hmpNA(A)UmCf UmCmUf UmCfAm UfCmCf UmsUmsGm
152 UmsUfsAm UfUmUf(-)hmpNA(A)UmUf CmAmUf UmUfCm AfUmUf UmsUmsGm 182 UmsUfsUm GfGmAf hmpNA(U)UmUf UmUmGf GmUfGm AfAmCf CmsCmsAm
153 AmsAfsUm CfUmCf(+)hmpNA(U)UmCm AfUmCf CmUfUm GfGmUf GmsCmsUm 183 UmsCfsUm UfGmUf hmpNA(G)CmUf UmGmGf AmUfUm UfUmUf GmsGmsUm
154 AmsUfsAm AfUmCf(+)hmpNA(U)CmUmUfCmAf UmCfCm UfUmGf GmsUmsGm 184 AmsUfsAm AfUmCf hmpNA(U)UmGf UmGmCf UmUfGm GfAmUf UmsUmsUm
155 UmsCfsUm UfGmUf(+)hmpNA(G)CmUmUfGmGf AmUfUm UfUmUf GmsGmsUm 185 AmsCfsAm GfGmCf hmpNA(C)AmUf AmAmUf CmUfUm GfUmGf CmsUmsUm
156 UmsUfsAm UfUmUf(+)hmpNA(A)UmUm CfAmUf UmUfCm AfUmUf UmsUmsGm 186 AmsUfsUm UfCmAf hmpNA(U)UmUf UmGmAf UmUfUm UfGmUf GmsGmsCm
157 AmsUfsCm UfCmUf(+)hmpNA(U)CmAf UmCmCf UmUfGm GfUmGf CmsUmsGm 187 UmsCfsAm UfUmUf hmpNA(C)AmUf UmUmUf GmAfUm UfUmUf GmsUmsGm
158 AmsAfsUm CfUmCf(+)hmpNA(U)UmCf AmUmCf CmUfUm GfGmUf GmsCmsUm 188 AmsUfsUm CfAmUf hmpNA(U)UmCf AmUmUf UmUfGm AfUmUf UmsUmsGm
159 UmsAfsAm UfCmUf(+)hmpNA(C)UmUf CmAmUf CmCfUm UfGmGf UmsGmsCm 189 UmsUfsAm UfUmCf hmpNA(A)UmUf UmCmAf UmUfUm UfGmAf UmsUmsUm
160 AmsUfsAm AfUmCf(+)hmpNA(U)CmUf UmCmAf UmCfCm UfUmGf GmsUmsGm 190 UmsUfsUm AfUmUf hmpNA(C)AmUf UmUmCf AmUfUm UfUmGf AmsUmsUm
161 UmsUfsGm GfUmAf(+)hmpNA(A)UmCf UmCmUf UmCfAm UfCmCf UmsUmsGm 191 AmsUfsUm UfAmUf hmpNA(U)CmAf UmUmUf CmAfUm UfUmUf GmsAmsUm
162 UmsUfsUm GfGmAf(+)hmpNA(U)UmUf UmUmGf GmUfGm AfAmCf CmsCmsAm 192 UmsUfsAm UfUmUf hmpNA(A)UmUf CmAmUf UmUfCm AfUmUf UmsUmsGm
인간 HSD17B13 siRNA 접합체의 변형된 센스 가닥 및 안티센스 가닥
이중 가닥 코드 서열번호 센스 가닥(5'-3') 서열번호 안티센스 가닥(5'-3')
TRD006019 193 GmsCmsAm CmCfAm AfGfGf AmUmGm AmAmGm AmGmAm Um-NAG1 137 AmsUfsCm UfCmUf(-)hmpNA(U)CmAf UmCmCf UmUfGm GfUmGf CmsUmsGm
TRD006020 194 CmsAmsCm CmAfAm GfGfAf UmGmAm AmGmAm GmAmUm Um-NAG1 138 AmsAfsUm CfUmCf(-)hmpNA(U)UmCf AmUmCf CmUfUm GfGmUf GmsCmsUm
TRD006021 195 AmsCmsCm AmAfGm GfAfUf GmAmAm GmAmGm AmUmUm Am-NAG1 139 UmsAfsAm UfCmUf(-)hmpNA(C)UmUf CmAmUf CmCfUm UfGmGf UmsGmsCm
TRD006022 196 CmsCmsAm AmGfGm AfUfGf AmAmGm AmGmAm UmUmAm Um-NAG1 140 AmsUfsAm AfUmCf(-)hmpNA(U)CmUf UmCmAf UmCfCm UfUmGf GmsUmsGm
TRD006023 197 AmsGmsGm AmUfGm AfAfGf AmGmAm UmUmAm CmCmAm Am-NAG1 141 UmsUfsGm GfUmAf(-)hmpNA(A)UmCf UmCmUf UmCfAm UfCmCf UmsUmsGm
TRD006030 198 GmsGmsUm UmCfAm CfCfAf AmAmAm AmUmCm CmAmAm Am-NAG1 142 UmsUfsUm GfGmAf(-)hmpNA(U)UmUf UmUmGf GmUfGm AfAmCf CmsCmsAm
TRD006031 199 CmsAmsAm AmAfAm UfCfCf AmAmGm CmAmCm AmAmGm Am-NAG1 143 UmsCfsUm UfGmUf(-)hmpNA(G)CmUf UmGmGf AmUfUm UfUmUf GmsGmsUm
TRD006032 200 AmsAmsUm CmCfAm AfGfCf AmCmAm AmGmAm UmUmAm Um-NAG1 144 AmsUfsAm AfUmCf(-)hmpNA(U)UmGf UmGmCf UmUfGm GfAmUf UmsUmsUm
TRD006033 201 GmsCmsAm CmAfAm GfAfUf UmAmUm GmGmCm CmUmGm Um-NAG1 145 AmsCfsAm GfGmCf(-)hmpNA(C)AmUf AmAmUf CmUfUm GfUmGf CmsUmsUm
TRD006051 202 CmsAmsCm AmAfAm AfUfCf AmAmAm AmUmGm AmAmAm Um-NAG1 146 AmsUfsUm UfCmAf(-)hmpNA(U)UmUf UmGmAf UmUfUm UfGmUf GmsGmsCm
TRD006052 203 CmsAmsAm AmAfUm CfAfAf AmAmUm GmAmAm AmUmGm Am-NAG1 147 UmsCfsAm UfUmUf(-)hmpNA(C)AmUf UmUmUf GmAfUm UfUmUf GmsUmsGm
TRD006053 204 AmsAmsAm UmCfAm AfAfAf UmGmAm AmAmUm GmAmAm Um-NAG1 148 AmsUfsUm CfAmUf(-)hmpNA(U)UmCf AmUmUf UmUfGm AfUmUf UmsUmsGm
TRD006054 205 AmsUmsCm AmAfAm AfUfGf AmAmAm UmGmAm AmUmAm Am-NAG1 149 UmsUfsAm UfUmCf(-)hmpNA(A)UmUf UmCmAf UmUfUm UfGmAf UmsUmsUm
TRD006055 206 UmsCmsAm AmAfAm UfGfAf AmAmUm GmAmAm UmAmAm Am-NAG1 150 UmsUfsUm AfUmUf(-)hmpNA(C)AmUf UmUmCf AmUfUm UfUmGf AmsUmsUm
TRD006056 207 CmsAmsAm AmAfUm GfAfAf AmUmGm AmAmUm AmAmAm Um-NAG1 151 AmsUfsUm UfAmUf(-)hmpNA(U)CmAf UmUmUf CmAfUm UfUmUf GmsAmsUm
TRD006057 208 AmsAmsAm UmGfAm AfAfUf GmAmAm UmAmAm AmUmAm Am-NAG1 152 UmsUfsAm UfUmUf(-)hmpNA(A)UmUf CmAmUf UmUfCm AfUmUf UmsUmsGm
TRD006941 209 CmsAmsCm CmAfAm GfGfAf UmGmAm AmGmAm GmAmUms Ums-NAG1 133 AmsAfsUm CfUmCf(-)hmpNA(U)UmCm AfUmCf CmUfUm GfGmUf GmsCmsUm
TRD006942 210 CmsCmsAm AmGfGm AfUfGf AmAmGm AmGmAm UmUmAms Ums-NAG1 134 AmsUfsAm AfUmCf(-)hmpNA(U)CmUmUfCmAf UmCfCm UfUmGf GmsUmsGm
TRD006944 211 CmsAmsAm AmAfAm UfCfCf AmAmGm CmAmCm AmAmGms Ams-NAG1 135 UmsCfsUm UfGmUf(-)hmpNA(G)CmUmUfGmGf AmUfUm UfUmUf GmsGmsUm
TRD006947 212 AmsAmsAm UmGfAm AfAfUf GmAmAm UmAmAm AmUmAms Ams-NAG1 136 UmsUfsAm UfUmUf(-)hmpNA(A)UmUm CfAmUf UmUfCm AfUmUf UmsUmsGm
표 12 내지 표 15에서, 출발 물질로서 2-하이드록시메틸-1,3-프로판다이올을 사용하여 합성된 뉴클레오티드를 hmpNA로서 정의하고; hmpNA는 라세미 구조이고;
(-)hmpNA(A)를 실시예 섹션 1.1의 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 1-1a를 사용하여 고체-상 합성에 의해 수득하고; (+)hmpNA(A)는 광학 이성질체였고;
(-)hmpNA(G)를 실시예 섹션 1.6의 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 1-6a를 사용하여 고체-상 합성에 의해 수득하고; (+)hmpNA(G)는 광학 이성질체였고;
(-)hmpNA(C)를 실시예 섹션 1.8의 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 1-8a를 사용하여 고체-상 합성에 의해 수득하고; (+)hmpNA(C)는 광학 이성질체였고;
(-)hmpNA(U)를 실시예 섹션 1.7의 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 1-7a를 사용하여 고체-상 합성에 의해 수득하고; (+)hmpNA(U)는 광학 이성질체였다.
소문자 m은 소문자 m에 인접한 업스트림 뉴클레오티드가 2'-메톡시-개질된 뉴클레오티드임을 나타내고; 소문자 f는 소문자 f에 인접한 업스트림 뉴클레오티드가 2'-플루오로-개질된 뉴클레오티드임을 나타내고;
소문자 s는, 대문자들 사이에 존재할 때, 문자 s의 어느 한 쪽에 인접한 2개의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 기에 의해 연결됨을 나타내고;
소문자 s는 3' 말단에서 처음 나타날 때, 소문자 s에 인접한 업스트림 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 기에서 종결됨을 나타낸다.
실시예 15. 표적-해당 활성에 대한 psiCHECK 스크리닝 ― siRNA 서열의 단일 농도점에서의 억제 활성
단일 농도점(10 nM)에서의 표적-해당 활성에 대한 스크리닝의 시험관내 분자 수준 자극을 Huh7 세포 내의 본 발명의 화합물에 대해 수행하였다.
siRNA의 안티센스 가닥의 경우, 안티센스 가닥과 완전히 상보적인 표적-해당 플라스미드 GSCM을 구축하고 레닐라 루시페라제 유전자 및 반딧불 루시페라제 유전자를 함유하는 psiCHECK 플라스미드에 삽입하였다. 플라스미드는 이중 리포터 유전자 시스템이었다. siRNA의 표적 서열을 레닐라 루시페라제 유전자의 3' UTR 영역에 삽입하였다. 표적 서열에 대한 siRNA의 활성을 반딧불 루피페라제에 의한 칼리브레이션(calibration) 후 레닐라 루시페라제 발현을 측정함으로써 반영하였다. 측정은 이중-루시페라제 리포터 검정 시스템(Promega, E2940)을 사용하여 수행하였다.
Huh7 세포를 5% CO2로 37℃에서 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 고-글루코스 배지에서 배양하였다. 형질감염 24시간 전, Huh7 세포를 각각의 웰에 100 μL의 배지로 10,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다.
세포를 siRNA 및 상응하는 플라스미드에 의해, 상응하는 지침서에 따라 Lipofectamine2000(ThermoFisher, 11668019)을 사용하여 공동-형질감염시켰다. 0.2 μL의 Lipofectamine2000을 각각의 웰에 사용하고, 플라스미드의 형질감염 양은 10 ng/웰이었고, siRNA의 농도는 10 nM이었다. 형질감염 24시간 후, 표적-해당 수준을 이중-루시페라제 리포터 검정 시스템(Promega, E2940)을 사용하여 측정하였다. 시험 서열의 표적-해당 활성은 표 16에 제시된다.
표적-해당 활성에 대한 psiCHECK 스크리닝 ― siRNA 서열의 단일 농도점에서의 억제 활성에 대한 결과
화합물 번호 mRNA의 잔류 발현 수준(10 nM) SD
TRD005305 15.4% 2.4%
TRD005306 14.5% 3.4%
TRD005307 23.1% 1.6%
TRD005308 19.2% 1.7%
TRD005309 13.8% 2.3%
TRD005352 57.5% 12.0%
TRD005353 20.7% 0.2%
TRD005354 37.2% 8.2%
TRD005355 18.4% 3.0%
TRD005356 63.5% 4.5%
TRD005357 13.9% 4.5%
TRD005358 19.9% 2.9%
TRD005359 65.3% 3.8%
TRD005360 29.1% 0.1%
TRD005361 38.2% 0.4%
TRD005397 16.8% 2.4%
TRD005398 15.3% 0.9%
TRD005399 13.7% 0.5%
TRD005400 17.5% 2.2%
TRD005401 11.4% 1.4%
TRD005402 12.0% 1.3%
TRD005403 8.4% 2.0%
실시예 16. siRNA의 5개의 농도점에서의 표적-해당 활성에 대한 psiCHECK 스크리닝 ― 억제 활성
5개의 농도점에서의 표적-해당 활성에 대한 스크리닝의 시험관내 분자 수준 자극을 HEK 293A 세포 내 siRNA에서 수행하였다.
HEK 293A 세포를 5% CO2로 37℃에서 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 고-글루코스 배지에서 배양하였다. 형질감염 24시간 전, HEK 293A 세포를 HEK 293A 세포를 각각의 웰에 100 μL의 배지로 8000 세포/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다.
세포를 siRNA 및 상응하는 플라스미드에 의해, 상응하는 지침서에 따라 Lipofectamine2000(ThermoFisher, 11668019)을 사용하여 공동-형질감염시켰다. 0.2 μL의 Lipofectamine2000을 각각의 웰에 사용하고, 플라스미드의 형질감염 양은 10 ng/웰이었고, 총 5개의 농도점을 siRNA에 대해 설정하였고, 이는 10-배 구배 희석에 의해 수득된 것이되, 최고 농도점의 최종 농도는 10 nM이었다. 형질감염 24시간 후, 표적-해당 수준을 이중-루시페라제 리포터 검정 시스템(Promega, E2940)을 사용하여 측정하였다.
표 17에서의 결과는 siRNA로 처리된 HSD17B13의 mRNA 발현 수준이 용량-의존적으로 감소하고, siRNA가 높은 수준의 시험관내 표적-해당 억제 활성을 가짐을 나타냈다.
siRNA의 5개의 농도점에서의 표적-해당 활성에 대한 psiCHECK 스크리닝 ― 억제 활성의 결과
화합물 번호 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA %(평균) IC50 값(nM)
10nM 1nM 0.1nM 0.01nM 0.001nM
TRD005305 8.4% 7.7% 15.0% 47.0% 89.1% 0.0081
TRD005306 6.3% 6.2% 7.9% 25.7% 69.0% 0.0028
TRD005307 11.6% 9.9% 15.8% 51.0% 88.3% 0.0098
TRD005308 9.6% 4.6% 6.0% 14.9% 51.9% 0.0041
TRD005309 6.4% 6.3% 15.2% 54.4% 84.8% 0.0117
TRD005353 10.0% 7.3% 10.0% 33.1% 78.2% 0.0051
TRD005355 9.5% 7.1% 12.9% 60.2% 111.1% 0.0141
TRD005357 4.5% 4.4% 8.9% 36.1% 92.8% 0.0056
TRD005358 14.9% 8.0% 11.1% 39.1% 90.7% 0.0089
TRD005397 8.2% 4.3% 6.0% 20.6% 62.4% 0.0059
TRD005398 10.6% 4.1% 8.0% 45.3% 86.6% 0.0085
TRD005399 6.0% 3.8% 4.2% 11.3% 40.1% <0.001
TRD005400 7.1% 4.0% 4.7% 22.4% 66.9% 0.0065
TRD005401 6.8% 7.1% 9.7% 35.9% 95.8% 0.0056
TRD005402 3.2% 3.0% 4.4% 12.6% 56.0% 0.0012
TRD005403 2.4% 2.7% 6.8% 33.5% 84.5% 0.0049
실시예 17. 접합된 siRNA의 11개의 농도점에서 표적-해당 활성에 대한 psiCHECK 스크리닝 ― 억제 활성
접합된 siRNA의 변형(안티센스 가닥의 위치 7에서의 변형) 후, 표적-해당 활성에 대한 스크리닝의 시험관내 분자 수준 자극을 11개의 농도점을 사용하여 HEK 293A 세포에서 수행하였다.
HEK 293A 세포를 5% CO2로 37℃에서 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 고-글루코스 배지에서 배양하였다. 형질감염 24시간 전, HEK 293A 세포를 HEK 293A 세포를 각각의 웰에 100 μL의 배지로 8000 세포/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다.
세포를 접합된 siRNA 및 상응하는 플라스미드에 의해, 상응하는 지침서에 따라 Lipofectamine2000(ThermoFisher, 11668019)을 사용하여 공동-형질감염시켰다. 0.2 μL의 Lipofectamine2000을 각각의 웰에 사용하고, 플라스미드의 형질감염 양은 10 ng/웰이었고, 총 11개의 농도점을 접합된 siRNA에 대해 설정하고, 이를 3-배 구배 희석에 의해 수득하되, 최고 농도점의 최종 농도는 20 nM이었다. 형질감염 24시간 후, 표적-해당 수준을 이중-루시페라제 리포터 검정 시스템(Promega, E2940)을 사용하여 측정하였다.
표 18에서의 결과는 접합된 siRNA로 처리된 HSD17B13의 mRNA의 수준이 용량-의존적으로 감소하고, 접합된 siRNA가 높은 수준의 시험관내 표적-해당 억제 활성을 가짐을 나타냈다.
접합된 siRNA의 11개의 농도점에서의 표적-해당 활성에 대한 psiCHECK 스크리닝 ― 억제 활성에 대한 결과
화합물 번호 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA %(평균)
20nM 6.667nM 2.222nM 0.741nM 0.247nM 0.082nM
TRD006019 9.9% 8.9% 8.0% 8.3% 13.4% 26.4%
TRD006020 5.9% 5.8% 6.8% 6.4% 9.2% 15.4%
TRD006021 11.7% 12.3% 13.2% 16.0% 28.7% 48.9%
TRD006022 8.8% 5.1% 4.7% 5.1% 7.4% 14.6%
TRD006023 7.5% 5.4% 6.1% 7.9% 14.2% 31.9%
TRD006030 45.5% 26.9% 19.1% 15.6% 20.5% 38.3%
TRD006031 10.3% 7.6% 6.0% 5.9% 8.8% 22.0%
TRD006032 5.0% 4.9% 5.3% 5.3% 7.0% 12.2%
TRD006033 9.4% 7.1% 5.9% 6.3% 11.0% 24.3%
TRD006051 8.2% 6.9% 7.1% 8.2% 11.8% 21.3%
TRD006052 9.3% 11.2% 17.7% 31.3% 56.7% 72.4%
TRD006053 31.9% 28.5% 27.8% 31.8% 44.3% 61.6%
TRD006054 4.6% 4.0% 5.0% 7.0% 14.5% 37.2%
TRD006055 7.3% 8.8% 9.6% 14.2% 25.1% 48.7%
TRD006056 41.9% 44.3% 46.6% 52.0% 67.6% 86.0%
TRD006057 3.9% 3.6% 3.9% 3.6% 7.4% 17.9%
화합물 번호 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA %(평균) IC50 값 (nM)
0.027nM 0.009nM 0.003nM 0.001nM 0.0003nM
TRD006019 50.9% 72.3% 89.4% 94.6% 86.7% 0.0282
TRD006020 34.2% 57.3% 80.3% 86.5% 89.6% 0.0133
TRD006021 74.7% 92.5% 93.1% 101.8% 99.1% 0.082
TRD006022 32.3% 58.3% 80.1% 88.1% 85.7% 0.0133
TRD006023 60.4% 76.9% 88.1% 89.4% 89.5% 0.0398
TRD006030 63.3% 81.4% 96.1% 97.9% 98.5% 0.041
TRD006031 46.8% 77.4% 95.6% 96.6% 93.7% 0.0251
TRD006032 28.6% 58.7% 81.8% 102.5% 98.5% 0.012
TRD006033 54.6% 79.4% 91.1% 93.5% 100.3% 0.0304
TRD006051 48.3% 78.0% 90.3% 90.0% 96.1% 0.0265
TRD006052 91.9% 97.6% 98.0% 94.1% 95.1% 0.302
TRD006053 80.9% 84.2% 95.4% 97.1% 95.7% 0.1549
TRD006054 62.9% 82.3% 91.7% 94.2% 95.7% 0.0468
TRD006055 72.8% 87.8% 96.7% 95.7% 95.2% 0.0764
TRD006056 83.8% 90.5% 90.7% 88.6% 91.5% 0.955
TRD006057 38.5% 64.5% 84.9% 95.8% 97.0% 0.0167
실시예 18. 접합된 siRNA의 AS 가닥의 psiCHECK 표적-외 수준 검증
표적-외 수준에 대한 스크리닝의 시험관내 분자 수준 자극을 11개의 농도 구배를 사용하여 HEK 293A 세포에서 수행하였다. 실험 결과는 표 19에 제시된다.
상응하는 표적-외 서열을 각각의 siRNA에 대해 구축하였고, 즉, 안티센스 가닥의 5' 말단의 위치 1 내지 8과 완전히 상보적이고 다른 위치에서 완전히 매칭되지 않은(unmatched) 염기를 갖는 표적-외 플라스미드 GSSM에 대해 구축하였다. 염기 미스페어링(mispairing)은 A 대 C 및 G 대 T의 법칙을 기반으로 한다. 검출 민감도를 향상시키기 위해, TTCC를 통해 연결된 5개의 동일한 GSSM 서열로 구성된 GSSM-5hits 표적-외 플라스미드를 구축하고 레닐라 루시페라제 유전자 및 반딧불 루시페라제 유전자를 함유하는 psiCHECK 플라스미드에 삽입하였다. 플라스미드는 이중 리포터 유전자 시스템이었다. siRNA의 표적 서열을 레닐라 루시페라제 유전자의 3' UTR 영역에 삽입하였다. 표적 서열에 대한 siRNA의 활성을 반딧불 루피페라제에 의한 칼리브레이션 후 레닐라 루시페라제 발현을 측정함으로써 반영하였다. 측정은 이중-루시페라제 리포터 검정 시스템(Promega, E2940)을 사용하여 수행하였다.
HEK 293A 세포를 5% CO2로 37℃에서 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 고-글루코스 배지에서 배양하였다. 형질감염 24시간 전, HEK 293A 세포를 HEK 293A 세포를 각각의 웰에 100 μL의 배지로 8000 세포/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다.
세포를 접합된 siRNA 및 상응하는 플라스미드에 의해, 상응하는 지침서에 따라 Lipofectamine2000(ThermoFisher, 11668019)을 사용하여 공동-형질감염시켰다. 0.2 μL의 Lipofectamine2000을 각각의 웰에 사용하였다. 플라스미드의 형질감여 양은 10 ng/웰이었다. 표적-외 플라스미드의 경우, 총 11개의 농도점을 접합된 siRNA에 대해 설정하고, 이를 3-배 구배 희석에 의해 수득하되, 최고 농도점의 최종 농도는 20 nM이었다. 형질감염 24시간 후, 표적-외 수준을 이중-루시페라제 리포터 검정 시스템(Promega, E2940)을 사용하여 측정하였다.
접합된 siRNA(GSSM-5 hits)의 안티센스 가닥의 시드(seed) 영역의 표적-외 활성에 대한 psiCHECK 스크리닝에 대한 결과
이중 가닥
코드		 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA %(GSSM-5hits)(평균) IC50 값(nM)
20
nM		 6.667
nM		 2.222
nM		 0.741
nM		 0.247
nM		 0.082
nM		 0.0274
nM		 0.0091
nM		 0.003
nM		 0.001
nM		 0.0003
nM
TRD006019 91.2% 91.9% 94.6% 93.1% 91.6% 99.1% 95.4% 97.6% 96.3% 97.6% 96.6% 155.9
TRD006020 50.7% 56.0% 67.8% 86.8% 102.5% 103.9% 102.5% 104.4% 102.5% 107.3% 109.4% 10.6
TRD006022 90.9% 88.2% 88.1% 92.4% 100.7% 107.9% 106.7% 106.0% 105.3% 106.7% 109.0% 127.0
TRD006031 117.6% 99.8% 101.4% 101.1% 98.2% 97.2% 96.8% 94.6% 95.5% 101.5% 102.5% NA
TRD006032 65.1% 67.9% 76.3% 86.2% 91.0% 95.6% 95.2% 96.5% 97.1% 99.1% 105.1% 21.9
TRD006033 87.0% 84.2% 87.7% 93.2% 97.2% 100.5% 100.8% 99.8% 99.9% 101.7% 99.7% 87.1
TRD006051 80.9% 69.2% 71.4% 83.2% 83.5% 89.9% 89.5% 94.3% 95.8% 95.3% 97.5% 36.9
TRD006056 68.0% 81.5% 89.7% 102.2% 102.7% 103.7% 107.4% 102.9% 106.2% 105.3% 102.6% 37.6
TRD006057 76.6% 82.4% 89.1% 93.7% 97.2% 98.1% 95.2% 93.6% 104.0% 99.8% 97.8% 50.9
NA는 표적-외 활성이 없을 을 나타냄.
실시예 19. 5개의 농도점에서의 접합된 siRNA에 의한 1차 인간 간세포( PHH )에서의 인간 HSD17B13의 억제 ― 억제 활성
1차 인간 간세포(PHH) 활성 스크리닝을 5개의 농도 구배를 사용하여 1차 인간 간세포(PHH)내의 siRNA에서 수행하였다.
1차 인간 간세포(PHH)를 액체 질소 내에 동결보존하였다. 형질감염 24시간 전, 1차 인간 간세포(PHH)를 해동한 후, 각각의 웰에 100 μL의 배지로 40,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다.
siRNA를 각각의 Lipofectamine RNAi MAX(ThermoFisher, 13778150)로 형질감염시켰다. 총 5개의 농도점을 siRNA에 대해 설정하였고, 이는 10-배 구배 희석에 의해 수득된 것이되, 최고 농도점의 최종 농도는 10 nM이었다. 형질감염 24시간 후, 전체 세포 RNA를 고-출력 세포 RNA 추출 키트(FireGen, FG0417)를 사용하여 세포로부터 추출하고, 역전사를 RNA 역전사 키트(Takara, 6210A)를 사용하여 수행하였다. 인간 HSD17B13의 mRNA 발현 수준을 Taqman 프로브(probe) Q-PCR 키트(ThermoFisher, 4444964)를 사용하여 측정하였다. 실험 절차를 제품의 지침서에 따라 수행하였다. GAPDH를 실험에서 내부 참조 유전자로서 사용하였다. Taqman 프로브 프라이머에 대한 정보는 표 20에 제시되어 있고, 프라이머의 작업 농도는 10 μM이다. 상응하는 Ct 값을 시스템에 의해 자동 설정된 임계값에 따라 획득하여 유전자 발현의 상대적 정량화를 성취하고, 데이터를 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 처리하였다. 결과는 대조군 접합된 siRNA에 의해 처리된 세포에서 인간 HSD17B13의 mRNA의 잔류 발현의 %에 대해 표현된다. 억제율에 대한 IC50 결과는 표 21에 제시된다. ΔΔCt = [(Ct실험군의 표적 유전자 - Ct실험군의 내부 참조) - (Ct대조군의 표적 유전자 - Ct대조군의 내부 참조)]. 억제율(%) =(1 - 표적 유전자의 잔류 발현량) Х 100%.
Taqman 프로브 프라이머에 대한 정보
프라이머 명칭 Brand 카탈로그 번호
HSD17Bl3 인간 프로브 Thermo Hs01068199_ml
인간 GAPDH TaqMan 프로브 Thermo 4326317E
1차 인간 간세포(PHH) 내의 인간 HSD17B13에 대항하는 접합된 siRNA의 5개의 농도점에서 억제 활성에 대한 결과
화합물 번호 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA %(PHH)(평균) IC50 값 (nM)
10nM 1nM 0.1nM 0.01nM 0.001nM
TRD006020 20.1% 16.4% 26.8% 50.5% 74.9% 0.0107
TRD006022 14.8% 14.0% 26.5% 58.8% 71.8% 0.0190
TRD006031 11.1% 17.4% 41.8% 50.4% 77.1% 0.0162
TRD006032 11.2% 14.8% 34.4% 81.4% 132.4% 0.0391
TRD006057 6.7% 10.2% 17.5% 49.3% 59.9% 0.0097
실시예 20. 접합된 siRNA의 SS 가닥의 psiCHECK 표적-외 수준 검증
HEK 293A 세포에서 접합된 siRNA의 표적-외 수준에 대한 스크리닝의 시험관내 분자 수준 자극을 11개의 농도 구배에서 수행하였다. 실험 결과는 표 22 및 23에 제시된다.
상응하는 표적-외 서열을 각각의 siRNA의 SS 가닥에 대해 구축하고, psiCHECK 플라스미드에 삽입하였다. 플라스미드는 레닐라 루시페라제 유전자 및 반딧불 루시페라제 유전자를 함유하였다. 플라스미드는 이중 리포터 유전자 시스템이었다. siRNA의 표적 서열을 레닐라 루시페라제 유전자의 3' UTR 영역에 삽입하였다. 표적 서열에 대한 siRNA의 활성을 반딧불 루피페라제에 의한 칼리브레이션 후 레닐라 루시페라제 발현을 측정함으로써 반영하였다. 측정은 이중-루시페라제 리포터 검정 시스템(Promega, E2940)을 사용하여 수행하였다.
siRNA에 상응하는 표적 플라스미드의 구축 규칙은 하기와 같았다:
SS 가닥과 완전히 상보적인 표적-외 플라스미드 PSCM을 각각의 siRNA의 센스 가닥에 대해 구축하였다. 센스 가닥의 5' 말단의 위치 1 내지 8과 완전히 상보적이고 다른 위치에서 완전히 매칭되지 않은 염기를 갖는 표적-외 플라스미드 PSSM을 구축하였다. 염기 페어링은 A 대 C 및 G 대 T의 법칙을 기반으로 하여야 한다. 검출 민감도를 향상시키기 위해, TTCC에 연결된 5개의 동일한 PSSM 서열로 구성된 PSSM-5hits 표적-외 플라스미드를 구축하였다.
HEK 293A 세포를 5% CO2로 37℃에서 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 고-글루코스 배지에서 배양하였다. 형질감염 24시간 전, HEK 293A 세포를 HEK 293A 세포를 각각의 웰에 100 μL의 배지로 8000 세포/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다.
세포를 접합된 siRNA 및 상응하는 플라스미드에 의해, 상응하는 지침서에 따라 Lipofectamine2000(ThermoFisher, 11668019)을 사용하여 공동-형질감염시켰다. 0.2 μL의 Lipofectamine2000을 각각의 웰에 사용하였다. 플라스미드의 형질감여 양은 10 ng/웰이었다. 표적-외 플라스미드의 경우, 총 11개의 농도점을 접합된 siRNA에 대해 설정하고, 이를 3-배 구배 희석에 의해 수득하되, 최고 농도점의 최종 농도는 20 nM이었다. 형질감염 24시간 후, 표적-외 수준을 이중-루시페라제 리포터 검정 시스템(Promega, E2940)을 사용하여 측정하였다.
결과는 표 22 및 23에 제시되고, 이는 접합된 siRNA가 현저한 표적-외 효과를 나타내지 않았음을 보인다.
접합된 siRNA(PSCM)의 센스 가닥의 표적-외 활성에 대한 psiCHECK 스크리닝의 결과
화합물 번호 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA %(PSCM)(평균)
20nM 6.667nM 2.222nM 0.741nM 0.247nM 0.082nM
TRD006020 80.6% 89.1% 97.4% 98.9% 104.4% 107.6%
TRD006022 74.6% 74.2% 79.3% 91.8% 101.8% 108.2%
TRD006031 99.3% 94.5% 96.1% 96.2% 105.0% 105.1%
TRD006057 92.8% 99.9% 99.9% 107.4% 123.4% 111.7%
화합물 번호 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA %(PSCM)(평균)
0.027nM 0.009nM 0.003nM 0.001nM 0.0003nM IC50 값(nM)
TRD006020 103.6% 100.6% 103.1% 98.8% 96.0% 77.27
TRD006022 105.9% 107.0% 108.8% 104.9% 105.2% 36.87
TRD006031 103.0% 100.5% 103.4% 105.0% 104.2% 695.5
TRD006057 108.4% 112.9% 113.2% 116.1% 108.1% 327.3
접합된 siRNA(PSSM-5hits)의 센스 가닥에 대한 표적-외 활성에 대한 psiCHECK 스크리닝에 대한 결과
화합물 번호 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA %(PSCM)(평균)
20nM 6.667nM 2.222nM 0.741nM 0.247nM 0.082nM
TRD006020 92.9% 95.0% 104.4% 108.5% 105.2% 106.8%
TRD006022 88.9% 75.5% 81.8% 89.4% 99.9% 101.4%
TRD006031 103.4% 97.6% 97.1% 102.5% 100.0% 106.1%
TRD006057 111.6% 110.5% 108.5% 110.4% 99.8% 96.1%
화합물 번호 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA %(PSCM)(평균)
0.027nM 0.009nM 0.003nM 0.001nM 0.0003nM IC50 값(nM)
TRD006020 108.3% 104.3% 105.7% 107.0% 99.9% 268.1
TRD006022 104.5% 102.8% 106.7% 100.6% 96.8% 72.99
TRD006031 108.8% 104.3% 108.1% 101.1% 100.9% NA
TRD006057 98.3% 103.3% 103.8% 101.3% 101.5% NA
표 23에서, NA는 현저한 표적-외 활성이 없음을 나타낸다.
실시예 21. 다수의 농도점에서 접합된 siRNA에 의한 1차 인간 간세포( PHH )에서 인간 HSD17B13의 억제 ― 억제 활성
1차 인간 간세포(PHH) 활성 스크리닝을 다수의 농도 구배를 사용하여 1차 인간 간세포(PHH) 내의 siRNA에서 수행하였다.
1차 인간 간세포(PHH)를 액체 질소 내에 동결보존하였다. 형질감염 24시간 전, 1차 인간 간세포(PHH)를 해동한 후, 각각의 웰에 100 μL의 배지로 100 μL의 배지의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다.
접합된 siRNA를 제품의 지침서에 따라 Lipofectamine RNAi MAX(ThermoFisher, 13778150)를 사용하여 형질감염시켰다. 총 11개 또는 7개의 농도점을 siRNA에 대해 설정하고, 이를 3-배 또는 5-배 구배 희석에 의해 수득하되, 최고 농도점의 최종 농도는 10 nM이었다. 처리 24시간 후, 전체 세포 RNA를 고-출력 세포 RNA 추출 키트를 사용하여 세포로부터 추출하고, RNA 역전사 및 정량적 실시간 PCR 검출을 수행하였다. 인간 HSD17B13의 mRNA 수준을 측정하고 내부 참조 유전자의 수준을 기반으로 보정하였다.
결과는 대조군 siRNA에 의해 처리된 세포에서 인간 HSD17B13의 mRNA의 잔류 발현의 %에 대해 표현된다. 억제율에 대한 IC50은 표 24 및 25에 제시된다.
11개의 농도점에서 1차 인간 간세포(PHH)에서 인간 HSD17B13에 대항하는 접합된 siRNA의 억제 활성
화합물 번호 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA %(PHH)(평균) IC50 값(nM)
10nM 3.333nM 1.111nM 0.370nM 0.123nM 0.0411nM 0.0137nM 0.0046nM 0.0015nM 0.0005nM 0.00017nM
TRD006020 15.0% 12.4% 13.5% 16.0% 25.2% 38.0% 47.3% 62.9% 93.4% 97.8% 112.3% 0.0129
TRD006022 12.2% 12.0% 13.6% 18.5% 27.8% 35.4% 52.8% 63.3% 76.0% 70.3% 91.6% 0.0141
TRD006031 11.5% 11.8% 14.2% 21.0% 32.2% 40.6% 50.3% 59.9% 63.9% 78.0% 97.9% 0.0100
TRD006057 8.9% 11.5% 18.5% 26.0% 41.7% 55.0% 68.4% 79.3% 104.6% 109.9% 81.0% 0.0201
7개의 농도점에서 1차 인간 간세포(PHH)에서 인간 HSD17B13에 대항하는 접합된 siRNA의 억제 활성
화합물 번호 잔류 표적 유전자의 발현의 mRNA %(PHH)(평균) IC50 값(nM)
10nM 2nM 0.4nM 0.08nM 0.016nM 0.0032nM 0.00064nM
TRD006941 15.7% 17.4% 15.8% 27.5% 64.1% 99.6% 103.6% 0.0251
TRD006942 8.2% 10.5% 13.7% 24.3% 71.4% 104.7% 77.6% 0.0324
TRD006944 9.7% 9.1% 14.5% 38.9% 78.7% 87.5% 80.0% 0.0566
TRD006947 5.4% 8.7% 14.2% 35.6% 71.2% 106.6% 86.5% 0.0438
전술한 발명이 이해의 명확성을 위해 도 및 예에 의해 상세히 설명되었지만, 상기 설명과 예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 혼입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Tuojie Biotech (Shanghai) Co., Ltd. <120> SIRNA TARGETING 17beta-HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE TYPE 13 AND SIRNA CONJUGATE <130> 722036CPCT <140> PCT/CN2022/088351 <141> 2022-04-22 <150> CN 202110435243.8 <151> 2021-04-22 <160> 250 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2368 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 acacaaggac ugaaccagaa ggaagaggac agagcaaagc caugaacauc auccuagaaa 60 uccuucugcu ucugaucacc aucaucuacu ccuacuugga gucguuggug aaguuuuuca 120 uuccucagag gagaaaaucu guggcugggg agauuguucu cauuacugga gcugggcaug 180 gaauaggcag gcagacuacu uaugaauuug caaaacgaca gagcauauug guucuguggg 240 auauuaauaa gcgcggugug gaggaaacug cagcugagug ccgaaaacua ggcgucacug 300 cgcaugcgua ugugguagac ugcagcaaca gagaagagau cuaucgcucu cuaaaucagg 360 ugaagaaaga agugggugau guaacaaucg uggugaauaa ugcugggaca guauauccag 420 ccgaucuucu cagcaccaag gaugaagaga uuaccaagac auuugagguc aacauccuag 480 gacauuuuug gaucacaaaa gcacuucuuc caucgaugau ggagagaaau cauggccaca 540 ucgucacagu ggcuucagug ugcggccacg aagggauucc uuaccucauc ccauauuguu 600 ccagcaaauu ugccgcuguu ggcuuucaca gaggucugac aucagaacuu caggccuugg 660 gaaaaacugg uaucaaaacc ucaugucucu gcccaguuuu ugugaauacu ggguucacca 720 aaaauccaag cacaagauua uggccuguau uggagacaga ugaagucgua agaagucuga 780 uagauggaau acuuaccaau aagaaaauga uuuuuguucc aucguauauc aauaucuuuc 840 ugagacuaca gaaguuucuu ccugaacgcg ccucagcgau uuuaaaucgu augcagaaua 900 uucaauuuga agcagugguu ggccacaaaa ucaaaaugaa augaauaaau aagcuccagc 960 cagagaugua ugcaugauaa ugauaugaau aguuucgaau caaugcugca aagcuuuauu 1020 ucacauuuuu ucaguccuga uaauauuaaa aacauugguu uggcacuagc agcagucaaa 1080 cgaacaagau uaauuaccug ucuuccuguu ucucaagaau auuuacguag uuuuucauag 1140 gucuguuuuu ccuuucaugc cucuuaaaaa cuucugugcu uacauaaaca uacuuaaaag 1200 guuuucuuua agauauuuua uuuuuccauu uaaaggugga caaaagcuac cucccuaaaa 1260 guaaauacaa agagaacuua uuuacacagg gaagguuuaa gacuguucaa guagcauucc 1320 aaucuguagc caugccacag aauaucaaca agaacacaga augagugcac agcuaagaga 1380 ucaaguuuca gcaggcagcu uuaucucaac cuggacauau uuuaagauuc agcauuugaa 1440 agauuucccu agccucuucc uuuuucauua gcccaaaacg gugcaacucu auucuggacu 1500 uuauuacuug auucugucuu cuguauaacu cugaagucca ccaaaagugg acccucuaua 1560 uuuccucccu uuuuauaguc uuauaagaua cauuaugaaa ggugaccgac ucuauuuuaa 1620 aucucagaau uuuaaguucu agccccauga uaaccuuuuu cuuuguaauu uaugcuuuca 1680 uauauccuug gucccagaga uguuuagaca auuuuaggcu caaaaauuaa agcuaacaca 1740 ggaaaaggaa cuguacuggc uauuacauaa gaaacaaugg acccaagaga agaaaaggaa 1800 gaaagaaagg uuuuuugguu uuuguuuugu uuuguuuugu uuuuuguuuu uuugagaugg 1860 agucucacuc uuucgcccag gcuggagugc agugguauga ucucagcuca cugcaagcuc 1920 caccucccgg guucacgcca uucuccugcc ucagccuccu gaguagcugg gacuacaggc 1980 gcccgccacc acacccggcu aauuuuuugu auuuuuugua gagacggggu uucaccaugu 2040 uagccaagau ggucucgauc uccugaccuc gugauccacc ugccucggcc ucccaaagug 2100 cugggauuac gggugugagc caccgugccc agccuuuuuu uuuuuaauag aaaaaauaau 2160 ccgacuccca cuacaucaag acuaaucuug uuuugugugu uuuucacaug uauuauagaa 2220 ugcuuuugca uggacuaucc ucuuguuuuu auuaaaaaca aaugauuuuu uuaaaaguca 2280 caaaaacaau ucacuaaaaa uaaauauguc auugugcuuu aaaaaaauaa ccucuuguag 2340 uuauaaaaua aaacguuuga cuucuaaa 2368 <210> 2 <211> 2368 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 uuuagaaguc aaacguuuua uuuuauaacu acaagagguu auuuuuuuaa agcacaauga 60 cauauuuauu uuuagugaau uguuuuugug acuuuuaaaa aaaucauuug uuuuuaauaa 120 aaacaagagg auaguccaug caaaagcauu cuauaauaca ugugaaaaac acacaaaaca 180 agauuagucu ugauguagug ggagucggau uauuuuuucu auuaaaaaaa aaaaggcugg 240 gcacgguggc ucacacccgu aaucccagca cuuugggagg ccgaggcagg uggaucacga 300 ggucaggaga ucgagaccau cuuggcuaac auggugaaac cccgucucua caaaaaauac 360 aaaaaauuag ccgggugugg uggcgggcgc cuguaguccc agcuacucag gaggcugagg 420 caggagaaug gcgugaaccc gggaggugga gcuugcagug agcugagauc auaccacugc 480 acuccagccu gggcgaaaga gugagacucc aucucaaaaa aacaaaaaac aaaacaaaac 540 aaaacaaaaa ccaaaaaacc uuucuuucuu ccuuuucuuc ucuugggucc auuguuucuu 600 auguaauagc caguacaguu ccuuuuccug uguuagcuuu aauuuuugag ccuaaaauug 660 ucuaaacauc ucugggacca aggauauaug aaagcauaaa uuacaaagaa aaagguuauc 720 auggggcuag aacuuaaaau ucugagauuu aaaauagagu cggucaccuu ucauaaugua 780 ucuuauaaga cuauaaaaag ggaggaaaua uagagggucc acuuuuggug gacuucagag 840 uuauacagaa gacagaauca aguaauaaag uccagaauag aguugcaccg uuuugggcua 900 augaaaaagg aagaggcuag ggaaaucuuu caaaugcuga aucuuaaaau auguccaggu 960 ugagauaaag cugccugcug aaacuugauc ucuuagcugu gcacucauuc uguguucuug 1020 uugauauucu guggcauggc uacagauugg aaugcuacuu gaacagucuu aaaccuuccc 1080 uguguaaaua aguucucuuu guauuuacuu uuagggaggu agcuuuuguc caccuuuaaa 1140 uggaaaaaua aaauaucuua aagaaaaccu uuuaaguaug uuuauguaag cacagaaguu 1200 uuuaagaggc augaaaggaa aaacagaccu augaaaaacu acguaaauau ucuugagaaa 1260 caggaagaca gguaauuaau cuuguucguu ugacugcugc uagugccaaa ccaauguuuu 1320 uaauauuauc aggacugaaa aaaugugaaa uaaagcuuug cagcauugau ucgaaacuau 1380 ucauaucauu aucaugcaua caucucuggc uggagcuuau uuauucauuu cauuuugauu 1440 uuguggccaa ccacugcuuc aaauugaaua uucugcauac gauuuaaaau cgcugaggcg 1500 cguucaggaa gaaacuucug uagucucaga aagauauuga uauacgaugg aacaaaaauc 1560 auuuucuuau ugguaaguau uccaucuauc agacuucuua cgacuucauc ugucuccaau 1620 acaggccaua aucuugugcu uggauuuuug gugaacccag uauucacaaa aacugggcag 1680 agacaugagg uuuugauacc aguuuuuccc aaggccugaa guucugaugu cagaccucug 1740 ugaaagccaa cagcggcaaa uuugcuggaa caauauggga ugagguaagg aaucccuucg 1800 uggccgcaca cugaagccac ugugacgaug uggccaugau uucucuccau caucgaugga 1860 agaagugcuu uugugaucca aaaauguccu aggauguuga ccucaaaugu cuugguaauc 1920 ucuucauccu uggugcugag aagaucggcu ggauauacug ucccagcauu auucaccacg 1980 auuguuacau cacccacuuc uuucuucacc ugauuuagag agcgauagau cucuucucug 2040 uugcugcagu cuaccacaua cgcaugcgca gugacgccua guuuucggca cucagcugca 2100 guuuccucca caccgcgcuu auuaauaucc cacagaacca auaugcucug ucguuuugca 2160 aauucauaag uagucugccu gccuauucca ugcccagcuc caguaaugag aacaaucucc 2220 ccagccacag auuuucuccu cugaggaaug aaaaacuuca ccaacgacuc caaguaggag 2280 uagaugaugg ugaucagaag cagaaggauu ucuaggauga uguucauggc uuugcucugu 2340 ccucuuccuu cugguucagu ccuugugu 2368 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 gcaccaagga ugaagagau 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 caccaaggau gaagagauu 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 accaaggaug aagagauua 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 ccaaggauga agagauuau 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 aggaugaaga gauuaccaa 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 ggguucacca aaaauccaa 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 gguucaccaa aaauccaaa 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 caccaaaaau ccaagcaca 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA 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2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 98 ccaaggauga agagauuau 19 <210> 99 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 99 aggaugaaga gauuaccaa 19 <210> 100 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 100 gguucaccaa aaauccaaa 19 <210> 101 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 101 caaaaaucca agcacaaga 19 <210> 102 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 102 aauccaagca caagauuau 19 <210> 103 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 103 gcacaagauu auggccugu 19 <210> 104 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 104 cacaaaauca aaaugaaau 19 <210> 105 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 105 caaaaucaaa augaaauga 19 <210> 106 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 106 aaaucaaaau gaaaugaau 19 <210> 107 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 107 aucaaaauga aaugaauaa 19 <210> 108 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 108 ucaaaaugaa augaauaaa 19 <210> 109 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 109 caaaaugaaa ugaauaaau 19 <210> 110 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 110 aaaugaaaug aauaaauaa 19 <210> 111 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 111 aucucuucau ccuuggugcu g 21 <210> 112 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 112 aaucucuuca uccuuggugc u 21 <210> 113 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 113 uaaucucuuc auccuuggug c 21 <210> 114 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 114 auaaucucuu cauccuuggu g 21 <210> 115 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 115 uugguaaucu cuucauccuu g 21 <210> 116 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 116 uuggauuuuu ggugaaccca g 21 <210> 117 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 117 uuuggauuuu uggugaaccc a 21 <210> 118 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 118 ugugcuugga uuuuugguga a 21 <210> 119 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 119 ucuugugcuu ggauuuuugg u 21 <210> 120 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 120 uaaucuugug cuuggauuuu u 21 <210> 121 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 121 auaaucuugu gcuuggauuu u 21 <210> 122 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 122 acaggccaua aucuugugcu u 21 <210> 123 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 123 uacaggccau aaucuugugc u 21 <210> 124 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 124 auacaggcca uaaucuugug c 21 <210> 125 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 125 aauacaggcc auaaucuugu g 21 <210> 126 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 126 auuucauuuu gauuuugugg c 21 <210> 127 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 127 ucauuucauu uugauuuugu g 21 <210> 128 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 128 auucauuuca uuuugauuuu g 21 <210> 129 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 129 uuauucauuu cauuuugauu u 21 <210> 130 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 130 uuuauucauu ucauuuugau u 21 <210> 131 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 131 auuuauucau uucauuuuga u 21 <210> 132 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 132 uuauuuauuc auuucauuuu g 21 <210> 133 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 133 aaucucuuca uccuuggugc u 21 <210> 134 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 134 auaaucucuu cauccuuggu g 21 <210> 135 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(G), and phosphorothioate <400> 135 ucuugugcuu ggauuuuugg u 21 <210> 136 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(A), and phosphorothioate <400> 136 uuauuuauuc auuucauuuu g 21 <210> 137 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 137 aucucuucau ccuuggugcu g 21 <210> 138 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 138 aaucucuuca uccuuggugc u 21 <210> 139 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(C), and phosphorothioate <400> 139 uaaucucuuc auccuuggug c 21 <210> 140 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 140 auaaucucuu cauccuuggu g 21 <210> 141 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(A), and phosphorothioate <400> 141 uugguaaucu cuucauccuu g 21 <210> 142 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 142 uuuggauuuu uggugaaccc a 21 <210> 143 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(G), and phosphorothioate <400> 143 ucuugugcuu ggauuuuugg u 21 <210> 144 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 144 auaaucuugu gcuuggauuu u 21 <210> 145 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(C), and phosphorothioate <400> 145 acaggccaua aucuugugcu u 21 <210> 146 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 146 auuucauuuu gauuuugugg c 21 <210> 147 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(C), and phosphorothioate <400> 147 ucauuucauu uugauuuugu g 21 <210> 148 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (-)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 148 auucauuuca uuuugauuuu g 21 <210> 149 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 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21 <210> 153 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 153 aaucucuuca uccuuggugc u 21 <210> 154 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 154 auaaucucuu cauccuuggu g 21 <210> 155 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(G), and phosphorothioate <400> 155 ucuugugcuu ggauuuuugg u 21 <210> 156 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic 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positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(C), and phosphorothioate <400> 159 uaaucucuuc auccuuggug c 21 <210> 160 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 160 auaaucucuu cauccuuggu g 21 <210> 161 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(A), and phosphorothioate <400> 161 uugguaaucu cuucauccuu g 21 <210> 162 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 162 uuuggauuuu uggugaaccc a 21 <210> 163 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(G), and phosphorothioate <400> 163 ucuugugcuu ggauuuuugg u 21 <210> 164 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 164 auaaucuugu gcuuggauuu u 21 <210> 165 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(C), and phosphorothioate <400> 165 acaggccaua aucuugugcu u 21 <210> 166 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 166 auuucauuuu gauuuugugg c 21 <210> 167 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(C), and phosphorothioate <400> 167 ucauuucauu uugauuuugu g 21 <210> 168 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 168 auucauuuca uuuugauuuu g 21 <210> 169 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(A), and phosphorothioate <400> 169 uuauucauuu cauuuugauu u 21 <210> 170 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(C), and phosphorothioate <400> 170 uuuauucauu ucauuuugau u 21 <210> 171 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 171 auuuauucau uucauuuuga u 21 <210> 172 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, (+)hmpNA(A), and phosphorothioate <400> 172 uuauuuauuc auuucauuuu g 21 <210> 173 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 173 aaucucuuca uccuuggugc u 21 <210> 174 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 174 auaaucucuu cauccuuggu g 21 <210> 175 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(G), and phosphorothioate <400> 175 ucuugugcuu ggauuuuugg u 21 <210> 176 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(A), and phosphorothioate <400> 176 uuauuuauuc auuucauuuu g 21 <210> 177 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 177 aucucuucau ccuuggugcu g 21 <210> 178 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 178 aaucucuuca uccuuggugc u 21 <210> 179 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(C), and phosphorothioate <400> 179 uaaucucuuc auccuuggug c 21 <210> 180 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 180 auaaucucuu cauccuuggu g 21 <210> 181 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(A), and phosphorothioate <400> 181 uugguaaucu cuucauccuu g 21 <210> 182 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 182 uuuggauuuu uggugaaccc a 21 <210> 183 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(G), and phosphorothioate <400> 183 ucuugugcuu ggauuuuugg u 21 <210> 184 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 184 auaaucuugu gcuuggauuu u 21 <210> 185 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(C), and phosphorothioate <400> 185 acaggccaua aucuugugcu u 21 <210> 186 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 186 auuucauuuu gauuuugugg c 21 <210> 187 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(C), and phosphorothioate <400> 187 ucauuucauu uugauuuugu g 21 <210> 188 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 188 auucauuuca uuuugauuuu g 21 <210> 189 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(A), and phosphorothioate <400> 189 uuauucauuu cauuuugauu u 21 <210> 190 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(C), and phosphorothioate <400> 190 uuuauucauu ucauuuugau u 21 <210> 191 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(U), and phosphorothioate <400> 191 auuuauucau uucauuuuga u 21 <210> 192 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, hmpNA(A), and phosphorothioate <400> 192 uuauuuauuc auuucauuuu g 21 <210> 193 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 193 gcaccaagga ugaagagau 19 <210> 194 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 194 caccaaggau gaagagauu 19 <210> 195 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 195 accaaggaug aagagauua 19 <210> 196 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 196 ccaaggauga agagauuau 19 <210> 197 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 197 aggaugaaga gauuaccaa 19 <210> 198 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 198 gguucaccaa aaauccaaa 19 <210> 199 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 199 caaaaaucca agcacaaga 19 <210> 200 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 200 aauccaagca caagauuau 19 <210> 201 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 201 gcacaagauu auggccugu 19 <210> 202 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 202 cacaaaauca aaaugaaau 19 <210> 203 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 203 caaaaucaaa augaaauga 19 <210> 204 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 204 aaaucaaaau gaaaugaau 19 <210> 205 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 205 aucaaaauga aaugaauaa 19 <210> 206 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 206 ucaaaaugaa augaauaaa 19 <210> 207 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 207 caaaaugaaa ugaauaaau 19 <210> 208 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 208 aaaugaaaug aauaaauaa 19 <210> 209 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 209 caccaaggau gaagagauu 19 <210> 210 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 210 ccaaggauga agagauuau 19 <210> 211 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 211 caaaaaucca agcacaaga 19 <210> 212 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those modified by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 212 aaaugaaaug aauaaauaa 19 <210> 213 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 213 ugacaagaau ccucacaau 19 <210> 214 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 214 auugugagga uucuugucaa c 21 <210> 215 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is GNA(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 215 auugugngga uucuugucaa c 21 <210> 216 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is Abasic, and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 216 auugugngga uucuugucaa c 21 <210> 217 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is Id, and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 217 auugugngga uucuugucaa c 21 <210> 218 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is TJ-NA009(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 218 auugugngga uucuugucaa c 21 <210> 219 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is TJ-NA019(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 219 auugugngga uucuugucaa c 21 <210> 220 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is TJ-NA020(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 220 auugugngga uucuugucaa c 21 <210> 221 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is TJ-NA027(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 221 auugugngga uucuugucaa c 21 <210> 222 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is (+)hmpNA(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 222 auugugngga uucuugucaa c 21 <210> 223 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is (-)hmpNA(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 223 auugugngga uucuugucaa c 21 <210> 224 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is TJ-NA038(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 224 auugugngga uucuugucaa c 21 <210> 225 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 225 ccauuuguuc agugguucg 19 <210> 226 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 226 ugaaccacug aacaaauggc a 21 <210> 227 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 227 caccucugca cgucgcaug 19 <210> 228 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 228 uaugcgacgu gcagagguga a 21 <210> 229 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 229 ugaaccacug aacaaauggc a 21 <210> 230 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is GNA(A) nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 230 ugaaccncug aacaaauggc a 21 <210> 231 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is Id, and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 231 ugaaccncug aacaaauggc a 21 <210> 232 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is TJNA-020(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 232 ugaaccncug aacaaauggc a 21 <210> 233 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is TJNA-027(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 233 ugaaccncug aacaaauggc a 21 <210> 234 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is (+)hmpNA(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 234 ugaaccncug aacaaauggc a 21 <210> 235 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is (-)hmpNA(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 235 ugaaccncug aacaaauggc a 21 <210> 236 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 236 uaugcgacgu gcagagguga a 21 <210> 237 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is GNA(A) nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 237 uaugcgncgu gcagagguga a 21 <210> 238 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is Id, and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 238 uaugcgncgu gcagagguga a 21 <210> 239 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is TJNA-020(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 239 uaugcgncgu gcagagguga a 21 <210> 240 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is TJNA-027(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 240 uaugcgncgu gcagagguga a 21 <210> 241 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is (+)hmpNA(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 241 uaugcgncgu gcagagguga a 21 <210> 242 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n is (-)hmpNA(A), and nucleotides at the other positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 242 uaugcgncgu gcagagguga a 21 <210> 243 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 243 caguguucuu gcucuauaa 19 <210> 244 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 244 uuauagagca agaacacugu u 21 <210> 245 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 245 caguguucuu gcucuauaa 19 <210> 246 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 246 caguguucuu gcucuauaa 19 <210> 247 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 247 caguguucuu gcucuauaa 19 <210> 248 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 248 caguguucuu gcucuauaa 19 <210> 249 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 249 caguguucuu gcucuauaa 19 <210> 250 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> Nucleotides at these positions are those linked by one or more of 2'-fluoro, 2'-methoxy, and phosphorothioate <400> 250 caguguucuu gcucuauaa 19

Claims (20)

  1. 이중가닥 영역을 형성하는 센스 가닥(sense strand) 및 안티센스 가닥(antisense strand)을 포함하는 siRNA로서,
    상기 센스 가닥이 15개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 서열번호 24, 4, 6, 11, 3, 5, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 및 23의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드로 상이하고;
    상기 안티센스 가닥이 15개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 서열번호 46, 26, 28, 33, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 및 45의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드로 상이한, siRNA.
  2. 제1항에 있어서,
    센스 가닥이 서열번호 3 내지 서열번호 24 중 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 인접 뉴클레오티드 17개 이상을 포함하고;
    안티센스 가닥이 서열번호 25 내지 서열번호 46 중 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 인접 뉴클레오티드 19개 이상을 포함하고;
    바람직하게는, 센스 가닥이 서열번호 3 내지 서열번호 24 중 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 안티센스 가닥이 서열번호 25 내지 서열번호 46 중 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, siRNA.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    하기 군 중 어느 하나로부터 선택되는 가닥을 포함하는 siRNA:
    군 1), 서열번호 4에 제시된 센스 가닥 및 서열번호 26에 제시된 안티 센스 가닥;
    군 2), 서열번호 6에 제시된 센스 가닥 및 서열번호 28에 제시된 안티 센스 가닥;
    군 3), 서열번호 11에 제시된 센스 가닥 및 서열번호 33에 제시된 안티 센스 가닥; 및
    군 4), 서열번호 24에 제시된 센스 가닥 및 서열번호 46에 제시된 안티 센스 가닥.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 내의 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인, siRNA.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 가닥이 이의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8 중 하나 이상에서 하기 화학식 (I)의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함하는, siRNA:
    (I)
    상기 식에서,
    Y는 O, NH, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 X은 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5, 및 NH-CO로 이루어진 군으로부터 선택되고, R4, R4' 및 R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고;
    J2는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
    n은 0, 1 또는 2이고;
    m은 0, 1 또는 2이고;
    s는 0 또는 1이고;
    R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)pR6으로 이루어진 군으로부터 선택되고, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, p는 1, 2 또는 3이고;
    Q1은 이고, Q2는 R2이거나;
    Q1은 R2이고, Q2는 이고;
    [상기 식에서,
    R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일 및 (CH2)qR7로 이루어진 군으로부터 선택되고, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, q는 1, 2 또는 3이고;
    J1은 H 또는 C1-C6 알킬이고;
    R2는 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알켄일, C2-C6 알킨일, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)rR8로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알켄일 및 C2-C6 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되고, r은 1, 2 또는 3이고;
    임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성한다];
    B는 염기이고;
    상기 식에서, 화학식 (I)의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형은 이 아니고;
    바람직하게는, X는 NH-CO이고, R1은 H가 아니다.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 가닥이 이의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8 중 하나 이상에서 하기 화학식 (I-1) 또는 화학식 (I-2)의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함하는, siRNA:
    .
  7. 제6항에 있어서,
    화학식 (I-1) 및 화학식 (I-2)에서,
    Y는 O 또는 NH이고;
    각각의 X은 독립적으로 NH-CO, CH2 및 NH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    n는 0 또는 1이고;
    m은 0 또는 1이고;
    s는 0 또는 1이고;
    J1 및 J2는 각각 독립적으로 H이고;
    R1은 H, 메틸 및 CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2는 H, OH, NH2, 메틸 및 CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R3은 H, OH, NH2, 메틸 및 CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    임의적으로, R1 및 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하고;
    바람직하게는, 각각의 B는 독립적으로, 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는, siRNA.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    화학식 (I)의 변형이

    로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 화학식 (I)의 변형이

    로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    보다 바람직하게는, 화학식 (I)의 변형이

    로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    더욱 바람직하게는, 화학식 (I)의 변형이

    로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 각각의 B는 독립적으로 화학식 (I-1)의 화학적 변형을 함유하는 안티센스 가닥의 5' 영역의 뉴클레오티드 위치 2 내지 8에서의 염기로 이루어진 군으로부터 선택되는, siRNA.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 가닥이 이의 5' 영역의 위치 5, 6 또는 7에서 제5항 내지 제8항에 정의된 화학식 (I)의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함하고;
    화학식 (I)의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형이 5' 영역의 위치 5에 있을 때, B가 안티센스 가닥의 5' 영역의 위치 5에서의 염기이고;
    화학식 (I)의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형이 5' 영역의 위치 6에 있을 때, B가 안티센스 가닥의 5' 영역의 위치 6에서의 염기이고;
    화학식 (I)의 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형이 5' 영역의 위치 7에 있을 때, B가 안티센스 가닥의 5' 영역의 위치 7에서의 염기인, siRNA.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열이 서열번호 47 내지 서열번호 68 중 어느 하나이거나 이를 포함하고,
    W'이 화학적 변형 또는 이의 호변 이성질체 변형을 포함하는 뉴클레오티드를 나타내고, 상기 변형이 , 및 로 이루어진 군으로부터 선택되는, siRNA.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 내의 하나 이상의 포스포에스터 기가 변형된 포스포에스터 기, 바람직하게는 포스포로티오에이트 기인, siRNA.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 siRNA; 및
    siRNA의 말단에 연결된 표적화(targeting) 리간드
    를 포함하는 siRNA 접합체(conjugate)로서, 바람직하게는, 상기 표적화 리간드가 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 연결된, siRNA 접합체.
  13. 제12항에 있어서,
    표적화 리간드가 하나 이상의 표적화 모이어티(targeting moiety)를 포함하고,
    상기 표적화 모이어티가 각각 독립적으로 갈락토스, 갈락토스아민, N-포름일-갈락토스아민, N-아세틸-갈락토스아민, N-프로피온일-갈락토스아민, N-n-부티르일-갈락토스아민, 및 N-이소부티르일-갈락토스아민으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 표적화 모이어티가 N-아세틸-갈락토스아민이고;
    보다 바람직하게는, 상기 표적화 리간드가 3개의 표적화 모이어티를 포함하는, siRNA 접합체.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 또는 제12항 또는 제13항에 따른 siRNA 접합체; 및
    약학적으로 허용되는 담체
    를 포함하는 약학 조성물.
  15. 효과량 또는 효과 용량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 또는 제12항 또는 제13항에 따른 siRNA 접합체, 또는 제14항에 따른 약학 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 17β-하이드록시스테로이드 탈수소효소(dehydrogenase) 유형 13(HSD17B13) 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  16. 효과량 또는 효과 용량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 또는 제12항 또는 제13항에 따른 siRNA 접합체, 또는 제14항에 따른 약학 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상에서 HSD17B13 유전자 발현과 관련된 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서,
    바람직하게는, 상기 HSD17B13 유전자 발현과 관련된 질환이 만성 섬유-염증성(fibro-inflammatory) 간 질환이고;
    보다 바람직하게는, 상기 만성 섬유-염증성 간 질환은 간에서 지방구(lipid droplet)의 축적 및 확장과 관련된, 방법.
  17. 효과량 또는 효과 용량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 또는 제12항 또는 제13항에 따른 siRNA 접합체, 또는 제14항에 따른 약학 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서,
    상기 질환이 간염, 간 섬유증, 비알코올성 지방간염, 비알코올성 지방간 질환, 간경변, 알코올성 지방간염, 알코올성 지방간 질환, HCV-연관 간경변, 약물-유도된 간 손상, 및 간 괴사로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 효과량 또는 효과 용량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 또는 제12항 또는 제13항에 따른 siRNA 접합체, 또는 제14항에 따른 약학 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 지방간을 앓는 개체(individual)에서 만성 간 질환의 발달 위험을 감소시키고/시키거나, 지방간을 앓는 개체에서 지방간의 지방간염으로의 진행을 억제하고/하거나 간 내의 지방구의 축적을 억제하는 방법.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 또는 제12항 또는 제13항에 따른 siRNA 접합체, 또는 제14항에 따른 약학 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 생체내에서 siRNA를 간에 전달하는 방법.
  20. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 또는 제12항 또는 제13항에 따른 siRNA 접합체를 합성하는 단계를 포함하는, siRNA 또는 siRNA 접합체의 제조 방법.
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