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KR20230166104A - 근위 신호전달 분자의 사용을 통한 t 세포 기능의 향상 - Google Patents

근위 신호전달 분자의 사용을 통한 t 세포 기능의 향상 Download PDF

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KR20230166104A
KR20230166104A KR1020237036854A KR20237036854A KR20230166104A KR 20230166104 A KR20230166104 A KR 20230166104A KR 1020237036854 A KR1020237036854 A KR 1020237036854A KR 20237036854 A KR20237036854 A KR 20237036854A KR 20230166104 A KR20230166104 A KR 20230166104A
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KR
South Korea
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pro
cells
cell
polypeptide
ser
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020237036854A
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Inventor
로비 지. 마즈너
에이단 투슬리
마리아 카테리나 로티로티
Original Assignee
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티, 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 filed Critical 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Pending legal-status Critical Current

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Abstract

본 발명의 개시는 일반적으로, 특히, SLP-76 폴리펩티드를 과발현하는 분리된 재조합 세포에 관한 것이다. 본 발명의 개시는 또한 분리된 재조합 세포 및 상응하는 SLP-76 분자를 생산하는데 유용한 조성물 및 방법, 뿐만 아니라 이러한 조성물을 이용한 암과 같은 질병의 치료 방법을 제공한다.

Description

근위 신호전달 분자의 사용을 통한 T 세포 기능의 향상
관련 출원
[001] 본 출원은 2021년 3월 31일에 출원된 미국 가출원 번호 63/168,624호(이의 내용은 그 전체가 본원에 포함됨)의 우선권 및 이익을 주장한다.
참조에 의한 포함
[002] 본 출원은 그 전체가 본원에 참조로서 포함되는 서열 목록을 함유한다. "078430-533001WOSequenceListing_ST25.txt"로 명명된 첨부된 서열 목록 텍스트 파일은 2022년 3월 30일에 생성되었고 239,808 바이트이다.
분야
[003] 본 발명의 개시는 일반적으로 종양학 및 면역-치료제의 분야에 관한 것으로, 특히 표적 항원에 반응하여 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 T-세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포와 같은 세포의 활성화 및 기능을 향상시킬 수 있는 폴리펩티드의 조성물 및 폴리펩티드, 예를 들어, SLP-76을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 개시는 또한 폴리펩티드를 함유하는 재조합 세포의 조성물 및 이러한 재조합 세포를 생산하는데 유용한 방법, 뿐만 아니라 질환, 예를 들어, 질병(예를 들어, 암 또는 자가면역 질병)의 치료를 위해 T 세포 활성을 향상시키는 방법을 제공한다.
[004] 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 T-세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포를 포함하는 것과 같은 현행 T 세포 요법은 CAR 또는 TCR에 의해 인식되는 표적 항원이 저밀도로 발현될 때 한계를 갖는다. 종양 세포가 이들의 표면에서 발현된 종양 항원의 양을 하향조절할 때(일반적으로 CAR 또는 TCR에 대한 표적 항원으로서 설계됨), 현재의 CAR 또는 TCR은 T 세포를 활성화시켜 종양 세포를 억제하거나 사멸시킬 수 없을 수 있다. 다른 시나리오에서, CAR 또는 TCR은 항원 밀도가 정상인 경우에도 T 세포를 파괴할 수 있다. 예를 들어, 일부 CAR 또는 TCR은 이들의 표적 항원에 대해 낮은 친화성을 가질 수 있거나, T 세포 고갈을 야기할 수 있어, T 세포 치료 효과를 결국 약화시키거나 종결시킬 수 있다. 결과적으로, 이러한 요법의 범위를 향상 및/또는 연장하기 위해 이러한 장애를 극복하기 위해 T 세포 활성화를 조절할 필요가 여전히 존재한다.
[005] 본 발명의 개시는 일반적으로 LCP2 또는 SLP-76으로도 공지된 세포질 형태 또는 막-결합 형태의 림프구 세포질 단백질 2(76 kDa의 백혈구 단백질을 함유하는 SH2)와 같은 폴리펩티드 또는 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 세포 또는 재조합 세포의 용해질을 포함하는 면역치료제, 뿐만 아니라, 예를 들어, 다양한 질환, 예를 들어, 질병(예를 들어, 암)을 치료하는데 있어서 면역 요법을 향상시키는데 사용하기 위한 이들을 함유하는 약학적 조성물의 개발에 관한 것이다. 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 상이한 SLP-76 작제물이 제조되었고, 활성화를 향상시키고 항원이 저밀도로 발현되는 경우에도 항원에 반응하여 CAR 및/또는 TCR을 발현하는 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 역가를 증가시키는 극적인 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 일부 구현예에서, SLP-76 작제물은 CAR 및/또는 TCR을 발현하는 T 세포의 막에 결합된다.
[006] 일 양태에서, 본 발명의 개시는 상승된 수준의 SLP-76 폴리펩티드를 과발현하고/하거나 이를 함유하도록 변형된 분리된 재조합 세포를 함유하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 조성물의 분리된 재조합 세포는 저밀도로 발현된 표적 항원에 의해 활성화될 수 있다.
[007] 일부 구현예에서, 분리된 재조합 세포는 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드, 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드, 및/또는 또 다른 수용체 폴리펩티드를 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, TCR 또는 CAR 폴리펩티드는 표적 항원 또는 표적 항원을 특이적으로 인식하는 어댑터 분자에 대한 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 분리된 재조합 세포는 TCR 폴리펩티드를 함유한다. 일부 구현예에서, TCR 폴리펩티드에 대한 표적 항원은 표적 세포에 의해 발현되고 항원-제시 세포(APC)에 의해 TCR 폴리펩티드에 제시된다. 일부 구현예에서, 분리된 재조합 세포는 내인성 또는 고유 TCR 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 분리된 재조합 세포는 CAR 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 폴리펩티드에 대한 표적 항원은 표적 세포에 의해 발현된다.
[008] 일부 구현예에서, 본원에 설명된 표적 세포는, 예를 들어, 증식성 질병(예를 들어, 암 또는 종양), 혈액 악성종양, 고형 종양, 자가면역 질병, 염증, 알레르기 질병, 감염, 및/또는 노쇠/노화를 포함하는 질환과 관련된 세포이다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 암 세포이다.
[009] 일부 구현예에서, 본원에 설명된 CAR 폴리펩티드는,
a) 표적 항원 또는 표적 항원을 특이적으로 인식하는 어댑터 분자에 대한 결합 친화성을 갖는 세포외 리간드-결합 도메인;
b) 막횡단 도메인;
c) 근위 신호전달 분자를 포함하는 세포내 신호전달 도메인; 및
d) 선택적으로, 힌지 도메인 및/또는 공동자극 도메인을 함유한다.
[0010] 일부 구현예에서, 본원에 설명된 CAR 폴리펩티드의 세포내 신호전달 도메인은 숙주 세포 활성화를 유도할 수 있는 단백질 키나제, G 단백질, GTP-결합 단백질, 어댑터 신호전달 단백질, 또는 스캐폴드 단백질의 전장 또는 생물학적 활성 단편을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR 폴리펩티드의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ, CD3-엡실론, CD3-감마, DAP12, ZAP70, PLCG1, PKC, ITK, NCK, VAV1, GRB2, GADS, SOS1, ADAP, SYK, LYN, PI3K, 또는 BLNK, 또는 이의 생물학적 활성 단편, 돌연변이체, 또는 변이체를 함유한다.
[0011] 일부 구현예에서, TCR 폴리펩티드 및/또는 CAR 폴리펩티드는 재조합 세포의 고갈을 유도한다. 일부 구현예에서, 분리된 재조합 세포에서 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드의 과발현은 재조합 세포의 고갈을 향상시키지 않는다. 일부 구현예에서, 분리된 재조합 세포에서 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드의 과발현은 재조합 세포의 고갈을 극복한다.
[0012] 일부 구현예에서, 분리된 재조합 세포는 TCR 폴리펩티드 및/또는 CAR 폴리펩티드의 정상 밀도를 추가로 발현한다. 일부 구현예에서, 분리된 재조합 세포는 고밀도의 TCR 폴리펩티드 및/또는 CAR 폴리펩티드를 추가로 발현한다. 일부 구현예에서, 분리된 재조합 세포는 저밀도의 TCR 폴리펩티드 및/또는 CAR 폴리펩티드를 추가로 발현한다.
[0013] 일부 구현예에서, SLP-76 폴리펩티드는 유리 세포질 형태이다. 일부 구현예에서, SLP-76 폴리펩티드는 재조합 세포 막에 결합된다. 일부 구현예에서, SLP-76 폴리펩티드는 막횡단 도메인을 통해 세포막에 결합된다. 일부 구현예에서, SLP-76 폴리펩티드는,
i) SLP-76 폴리펩티드와 막 단백질 사이의 상호작용;
ii) SLP-76 폴리펩티드와 막의 지방산 사이의 공유 결합; 및/또는
iii) SLP-76 폴리펩티드와 막의 지질 극성 헤드 그룹 사이의 결합을 통해 세포막에 결합된다.
[0014] 일부 구현예에서, SLP-76 폴리펩티드는 전장 SLP-76을 함유한다. 일부 구현예에서, SLP-76 폴리펩티드는 SLP-76의 생물학적 활성 단편, 돌연변이체, 또는 변이체를 함유한다. 일부 구현예에서, SLP-76 폴리펩티드는 야생형 SLP-76 폴리펩티드에 대한 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어, K30R 치환)를 함유한다. 일부 구현예에서, SLP-76 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, 7, 14, 16, 18, 19, 40, 59 또는 60과 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, SLP-76 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, 7, 14, 16, 18, 19, 40, 59 또는 60과 적어도 70% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, 7, 14, 16, 18, 19, 40, 59 또는 60의 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, 7, 14, 16, 18, 19, 40, 59 또는 60의 아미노산 서열로 구성된다.
[0015] 일부 구현예에서, 분리된 재조합 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 분리된 재조합 세포는 비-면역 세포이다. 일부 구현예에서, 분리된 재조합 세포는 T 세포, 조절 T 세포(Treg), 종양-침윤 림프구(TIL), 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 단핵구, 감마 델타 T 세포, 줄기 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)-유래 NK 세포, 또는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)-유래 T 세포이다.
[0016] 일부 구현예에서, 분리된 재조합 세포는 약 10, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1백만, 2백만, 3백만, 4백만, 5백만, 6백만, 7백만, 8백만, 9백만, 또는 1천만개 분자 미만의 표적 항원에 의해 활성화될 수 있다.
[0017] 일부 구현예에서, 표적 항원에 반응한 분리된 재조합 세포의 활성화는 세포 증식, 분화, 사이토카인 생산 및/또는 세포독성을 향상시킨다.
[0018] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 SEQ ID NO: 1, 7, 14, 16, 18, 19, 40, 59 또는 60과 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 SLP-76 폴리펩티드를 함유하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 분리된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, 7, 14, 16, 18, 19, 40, 59 또는 60과 적어도 70%, 75%, 90%, 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 SLP-76 폴리펩티드를 함유한다. 일부 구현예에서, 분리된 폴리펩티드는 본원에 설명된 바와 같은 SLP-76 폴리펩티드 및 막횡단 도메인을 함유한다. 일부 비제한적인 구현예에서, 분리된 폴리펩티드의 막횡단 도메인은 분리된 폴리펩티드를 분리된 재조합 세포의 막(예를 들어, 세포막)에 테더링한다.
[0019] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 설명된 분리된 SLP-76 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구현예에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 설명된 분리된 막-결합된 SLP-76 폴리펩티드를 인코딩한다. 이러한 SLP-76 폴리펩티드는 본원에 설명된 막횡단 도메인 또는 다른 메커니즘을 통해 분리된 재조합 세포의 막에 결합될 수 있다.
[0020] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 설명된 분리된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 발현 프로모터를 함유한다. 일부 구현예에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 설명된 분리된 재조합 세포에서 발현될 발현 프로모터에 컨쥬게이션된다.
[0021] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 설명된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는, 예를 들어, 면역 세포 또는 비-면역 세포를 포함하는 본원에 설명된 재조합 세포이다.
[0022] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는,
i) 본원에 설명된 분리된 폴리뉴클레오티드 및 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드;
ii) 본원에 설명된 발현 벡터 및 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터; 및/또는
iii) 본원에 설명된 분리된 폴리뉴클레오티드 및 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약학적 조성물이다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 추가로 함유한다.
[0023] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 SLP-76 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 조성물을 세포에 도입하는 것을 포함하는, 재조합 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 고유 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 재조합 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 비-면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 환자와 같은 인간으로부터의 생물학적 샘플로부터 유래된다.
[0024] 일부 구현예에서, 세포는 TCR 또는 CAR 분자를 추가로 포함한다. 이러한 TCR 분자는 세포에서 고유 또는 내인성, 또는 외인성일 수 있다.
[0025] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 SLP-76 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 조성물을 세포에 도입하는 것을 포함하는, 재조합 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 고유 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 재조합 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 비-면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 환자와 같은 인간으로부터의 생물학적 샘플로부터 유래된다.
[0026] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 세포에서 SLP-76 폴리펩티드를 과발현시키는 것을 포함하는, 표적 항원에 반응하여 세포의 활성화를 향상시키는 방법을 제공한다. 이러한 과발현은 본원에 설명된 바와 같은 SLP-76 폴리펩티드, SLP-76 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 SLP-76 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 세포에 도입함으로써 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 고유 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 재조합 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 비-면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 환자와 같은 인간으로부터의 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 TCR 또는 CAR 분자를 추가로 포함한다. 이러한 TCR 분자는 세포에서 고유 또는 내인성, 또는 외인성일 수 있다.
[0027] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 SLP-76 폴리펩티드 및 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 세포에서 과발현시키는 것을 포함하는, 표적 항원에 반응한 세포의 활성화를 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 고유 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 재조합 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 비-면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 생물학적 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 환자와 같은 인간으로부터의 생물학적 샘플로부터 유래된다.
[0028] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 약학적 유효량의 본원에 설명된 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 조성물은 본원에 설명된 바와 같은 SLP-76 폴리펩티드, SLP-76 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 SLP-76 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 함유할 수 있다.
[0029] 일부 구현예에서, 대상체의 질병 또는 장애는 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 발현하는 T 세포에 의해 치료될 수 없거나 단지 부분적으로 또는 덜 효과적으로 치료될 수 있는 한편, TCR 또는 CAR 폴리펩티드는 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포(예를 들어, 암 또는 종양 세포)에 의해 발현된 표적 항원 또는 표적 항원을 특이적으로 인식하는 어댑터 분자에 대한 결합 친화성을 갖는다. 예를 들어, 질병 또는 장애는 낮은 수준의(즉, 저밀도를 갖는) 표적 항원을 발현하는 숙주 세포를 포함하여, TCR 또는 CAR 폴리펩티드를 통해 T 세포의 비효율적인 활성화를 제공할 수 있다. 이러한 저밀도의 표적 항원은 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포에서의 돌연변이(들) 또는 전사 또는 번역 조절(들)에 의해 야기될 수 있다. 이러한 숙주 세포는 질병 또는 장애의 형성 및 발달 단계 전반에 걸쳐, 또는 질병 또는 장애의 형성 및 발달 단계의 특정 시점 이후에만 저밀도의 표적 항원을 발현할 수 있다. 예를 들어, 일부 암 또는 종양 세포는 숙주 면역 시스템을 탈출하기 위해 특정 암/종양-관련 항원의 발현을 감소시키는 전략을 채택할 수 있다. 이러한 시나리오에서, 암/종양-관련 항원의 인식을 통한 일반적인 CAR T 또는 TCR 요법은 질병 또는 장애를 치료하는데 효과적이지 않거나 충분하지 않을 수 있다. SLP-76(예를 들어, 막-결합된 SLP-76 작제물)을 과발현시키면 질병 또는 장애를 치료하기 위한 CAR T 또는 TCR-발현 T 세포의 활성화 및 기능을 향상시킬 수 있다.
[0030] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포에 의해 발현된 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CAR 또는 TCR 폴리펩티드를 발현하고, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드(예를 들어, 막-결합된 SLP-76 폴리펩티드)를 추가로 발현하는 약학적 유효량의 T 세포를 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 숙주 세포는 낮은 수준의(즉, 저밀도를 갖는) 표적 항원을 발현할 수 있고, 따라서 CAR 또는 TCR 폴리펩티드만을 발현하고 SLP-76 폴리펩티드를 발현하지 않는 유사한 T 세포를 질병 또는 장애를 치료하기에 불충분하거나 불가능하게 만들 수 있다.
[0031] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포에 의해 발현된 표적 항원을 특이적으로 인식하는 CAR 또는 TCR 폴리펩티드를 발현하고 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드(예를 들어, 막-결합된 SLP-76 폴리펩티드)를 추가로 발현하는 약학적 유효량의 T 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하는 한편, 질병 또는 장애는 CAR 또는 TCR 폴리펩티드만을 발현하고 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드를 발현하지 않는 유사한 T 세포에 의해 치료될 수 없거나 단지 덜 효과적으로 또는 불충분하게 치료될 수 있다. 이러한 숙주 세포는 낮은 수준의(즉, 저밀도를 갖는) 표적 항원을 발현할 수 있고, 따라서 CAR 또는 TCR 폴리펩티드만을 발현하고 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드를 발현하지 않는 유사한 T 세포를 질병 또는 장애를 치료하기에 불충분하거나 불가능하게 만들 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포에서의 표적 항원(들)의 발현 수준을 검출하는 제1 단계를 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, 표적 항원(들)의 이러한 발현 수준은 치료 전에 공지되어 있다.
[0032] 일부 구현예에서, 상기 방법은 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포에서의 표적 항원(들)의 발현 수준을 검출을 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포에서의 표적 항원(들)의 발현 수준을 검출하는 제1 단계, 및 이러한 발현 수준이 대조군 수준(예를 들어, 건강한 대상체 또는 질병 또는 장애와 관련이 없는 숙주 세포에서의 표적 항원(들)의 발현 수준)보다 낮은 경우, 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포에 의해 발현된 표적 항원을 특이적으로 인식하고 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드(예를 들어, 막-결합된 SLP-76 폴리펩티드)를 추가로 발현하는 CAR 또는 TCR 폴리펩티드를 발현하는 T 세포로 대상체를 치료하는 제2 단계를 함유한다. 일부 구현예에서, 치료 전에 대상체에서 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포가 CAR T 또는 TCR 요법에서 사용되는 CAR 또는 TCR 분자에 의해 인식될 수 있는 낮은 수준의 표적 항원(들)을 발현한다는 것이 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 상의 이러한 저밀도의 표적 항원(들)은 CAR T 또는 TCR 요법 단독에 의한 질병 또는 장애의 치료 실패를 초래한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포 상의 이러한 저밀도의 표적 항원(들)은 CAR T 또는 TCR 요법 단독에 의한 질병 또는 장애의 비효과적이거나 불충분한 치료를 초래한다.
[0033] 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 설명된 측정/검출 단계와 치료 단계 사이에 대조군 수준(예를 들어, 건강한 대상체 또는 질병 또는 장애와 관련이 없는 숙주 세포에서 표적 항원(들)의 발현 수준)에 대해 표적 항원의 측정/검출된 발현 수준을 비교하는 선택적 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 설명된 치료 단계 전에, CAR T 또는 TCR-발현 T 세포에서 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드(예를 들어, 막-결합된 SLP-76 폴리펩티드)를 과발현시키는 선택적 단계를 추가로 포함한다. 이러한 과발현은 공지된 방법(예를 들어, 형질도입, 형질감염, 바이러스 감염 등)에 의해 수행될 수 있다.
[0034] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는,
i) 대상체에서 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포에 의해 발현되는 표적 항원의 발현 수준을 검출하는 단계로서, 상기 표적 항원이 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드에 의해 인지될 수 있는, 단계; 및
ii) 표적 항원의 발현 수준이 대조군 수준보다 낮은 경우, T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 발현하고 SLP-76 폴리펩티드를 발현하는 약학적 유효량의 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
[0035] 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 ii) 전에 숙주 세포에 의한 표적 항원의 발현 수준을 대조군 수준과 비교하는 선택적 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 ii) 전에 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 발현하는 T 세포에서 SLP-76 폴리펩티드를 과발현시키는 선택적 단계를 추가로 포함한다.
[0036] 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 막-결합된다.
[0037] 일부 구현예에서, T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 발현하지만 SLP-76 폴리펩티드는 발현하지 않는 T 세포는 질병 또는 장애를 치료할 수 없거나 단지 비효과적으로 또는 불충분하게 치료할 수 있다.
[0038] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포에 의해 발현된 표적 항원을 특이적으로 인식하는 TCR 폴리펩티드를 발현하고 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드(예를 들어, 막-결합된 SLP-76 폴리펩티드)를 추가로 발현하는 약학적 유효량의 T 세포(예를 들어, 대상체 내의 내인성 T 세포)를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하는 한편, 질병 또는 장애는 TCR 폴리펩티드만을 발현하고 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드를 발현하지 않는 유사한 T 세포에 의해 치료될 수 없거나 단지 덜 효과적으로 또는 불충분하게 치료될 수 있다. 이러한 숙주 세포는 낮은 수준의(즉, 저밀도를 갖는) 표적 항원을 발현할 수 있고, 따라서 TCR 폴리펩티드만을 발현하고 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드를 발현하지 않는 내인성 T 세포를 질병 또는 장애를 치료하기에 불충분하거나 불가능하게 만들 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포에서의 표적 항원(들)의 발현 수준을 검출하는 제1 단계를 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, 표적 항원(들)의 이러한 발현 수준은 치료 전에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체로부터 T 세포(예를 들어, 대상체에서 내인성 T 세포)를 분리하는 단계를 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 분리된 T 세포(예를 들어, 내인성 T 세포)에서 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드를 발현시키는 단계를 추가로 함유한다. 이러한 T 세포는, 예를 들어, 조절 T 세포(Treg), 종양-침윤 림프구(TIL), 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 단핵구, 감마 델타 T 세포, 줄기 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)-유래 NK 세포, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)-유래 T 세포, 또는 이들 T 세포의 혼합물을 포함하는 표적 항원을 인식하는 TCR 분자를 발현하는 임의의 T 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포(예를 들어, 대상체에서 내인성 T 세포)는 종양-침윤 림프구(TIL)이다. 일부 구현예에서, T 세포는 질병 또는 장애에 대해 치료될 대상체로부터 분리된다. 일부 구현예에서, T 세포는 상이한 대상체, 예를 들어, 동일한 질병 또는 장애를 갖는 상이한 대상체, 또는 건강한 대상체로부터 분리된다. 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 본원에 설명되거나 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 분리된 T 세포(예를 들어, 대상체에서 내인성 T 세포)에서의 발현을 위해 도입(예를 들어, 바이러스 벡터를 통해)될 수 있다.
[0039] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는,
i) 대상체에서 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포에 의해 발현되는 표적 항원의 발현 수준을 검출하는 단계로서, 상기 표적 항원이 대상체에서 T 세포에 의해 발현된 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드에 의해 인지될 수 있는, 단계;
ii) 단계 i)의 T 세포를 대상체로부터 분리하는 단계; 및
iii) 단계 i)의 표적 항원의 발현 수준이 대조군 수준보다 낮은 경우, 단계 ii)에서 분리된 T 세포에서 SLP-76 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및
약학적 유효량의 SLP-76 폴리펩티드를 발현하는 분리된 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
[0040] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는,
i) 대상체로부터 적어도 하나의 T 세포를 분리하는 단계로서, 적어도 하나의 T 세포가 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 발현하고, 상기 TCR 폴리펩티드 및/또는 CAR 폴리펩티드가 대상체에서 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포에 의해 발현된 표적 항원을 특이적으로 인식하는, 단계;
ii) 분리된 적어도 하나의 T 세포에서 SLP-76 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및
iii) 약학적 유효량의 SLP-76 폴리펩티드를 발현하는 분리된 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
[0041] 일부 구현예에서, TCR 폴리펩티드는 대상체에 대해 내인성이다. 일부 구현예에서, TCR 폴리펩티드 및/또는 CAR 폴리펩티드를 발현하는 적어도 하나의 T 세포는 대상체에 대해 내인성이다. 일부 구현예에서, TCR 폴리펩티드, CAR 폴리펩티드, 및/또는 TCR 폴리펩티드 및/또는 CAR 폴리펩티드를 발현하는 적어도 하나의 T 세포는 외인성이거나 유전적으로 변형된다.
[0042] 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 i) 전에, 숙주 세포에 의한 표적 항원의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
[0043] 일부 구현예에서, 본원에 설명된 방법은 단계 i) 전에 숙주 세포에 의한 표적 항원의 발현 수준을 대조군 수준과 비교하는 선택적 단계를 추가로 포함한다.
[0044] 일부 구현예에서, 숙주 세포에 의해 발현된 표적 항원의 수준은 대조군 수준 미만이다. 이러한 대조군 수준은 질병 또는 장애와 관련이 없는 상이한 숙주 세포에 의한 표적 항원의 발현 수준(예를 들어, 동일한 대상체에서 동일하거나 상이한 조직 또는 기관에서, 또는 동일한 질병 또는 장애를 갖거나 건강한 개체와 같이 질병 또는 장애를 갖지 않는 상이한 숙주에서 동일하거나 상이한 조직 또는 기관에서)을 지칭할 수 있다. 이러한 대조군 수준은 치료 전에 의사 또는 내과의사에게 이미 공지되어 있을 수 있다.
[0045] 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 본원에 설명된 또는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해(예를 들어, 바이러스 벡터를 통해) 분리된 T 세포에서의 발현을 위해 도입된다.
[0046] 일부 구현예에서, SLP-76 폴리펩티드는 막-결합된다.
[0047] 일부 구현예에서, 대상체의 T 세포는 조절 T 세포(Treg), 종양-침윤 림프구(TIL), 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 단핵구, 감마 델타 T 세포, 줄기 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)-유래 NK 세포, 또는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)-유래 T 세포이다. 일부 구현예에서, 대상체의 T 세포는 종양 침윤 림프구(TIL)이다.
[0048] 일부 구현예에서, SLP-76 폴리펩티드를 발현시키는 것은 적어도 하나의 T 세포의 활성을 향상시켜 숙주 세포를 억제하거나 사멸시킨다.
[0049] 일부 구현예에서, 숙주 세포는 암 또는 종양 세포이다.
[0050] 비제한적인 메커니즘 하에, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 표적 항원에 반응하여, 특히 항원이 저밀도로 발현될 때 내인성 또는 외인성인 또 다른 CAR 또는 TCR 분자의 활성을 향상시키고/시키거나, CAR 또는 TCR 분자를 발현하는 세포의 활성화 역치를 감소시킬 수 있다. 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드를 발현시키는 것은 CAR 또는 TCR 분자를 발현하는 T 세포를 사용하여 현재의 T 세포 요법을 향상시킬 수 있다.
[0051] 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 전장 SLP-76 또는 SLP-76의 생물학적 활성 단편, 돌연변이체, 또는 변이체를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, SLP-76 폴리펩티드는 야생형 SLP-76 폴리펩티드에 대한 적어도 하나의 돌연변이를 함유한다. 이러한 돌연변이는 당업자에게 공지된 임의의 돌연변이, 예를 들어, 야생형 SLP-76의 K30 위치에 대한 돌연변이(예를 들어, K30R 치환)일 수 있다. 비제한적인 메커니즘 하에, SLP-76 발현 수준, 안정성 및/또는 생물학적 기능을 감소시키지 않는 임의의 돌연변이가 본원에서 사용될 수 있다. 일부 돌연변이, 예를 들어, K30R 치환은 SLP-76 발현 수준, 안정성 및/또는 생물학적 기능을 향상시킬 수 있다. 이러한 돌연변이를 갖는 SLP-76 돌연변이체는 표적 항원에 결합시 T 세포 활성화를 추가로 향상시킬 수 있고, 따라서 본원에 설명된 질병 또는 장애에 대한 CAR T 또는 TCR 요법의 치료 효과를 추가로 향상시킬 수 있다.
[0052] 도 1은 종양 세포에 반응한 T 세포 활성을 보여주는 그래프 세트이다. FACS 분석의 히스토그램은 T 세포에서의 CD19-표적화 CAR 작제물("CD19-CD8TM-BBZ", 상부 좌측 패널) 또는 HER2-표적화 CAR 작제물("HER-2-CD28TM-BBZ", 상부 우측 패널)의 발현을 제시하는 한편, T 세포는 LCK(SEQ ID NO: 9, 상부 트레이스), LAT(SEQ ID NO: 8, 상부로부터 두 번째 트레이스), SLP-76(SEQ ID NO: 7, 상부로부터 세 번째 트레이스), 또는 근위 신호전달 분자가 없는 대조군(하부 트레이스)을 추가로 과발현한다. 근위 신호전달 분자의 존재 또는 부재하에 상이한 CAR 작제물을 발현하는 T 세포를 대조군("NO TUMOR"), CD19를 발현하지만 HER2를 발현하지 않는 야생형 NALM6 세포("WT NALM6"), 또는 HER2를 발현하지만 CD19를 발현하지 않는 NALM6 세포("HER2+ NALM6")와 함께 인큐베이션하였다. T 세포에 의한 IL-2 생산의 수준을 측정하고 비교하였다(하부 패널). 각 인큐베이션 조건에 사용된 CAR 작제물은 좌측에서 우측으로 CD19-CD8TM-BBZ, CD19-CD8TM-BBZ + SLP-76, CD19-CD8TM-BBZ + LAT, CD19-CD8TM-BBZ + LCK, HER2-CD28TM-BBZ, HER2-CD28TM-BBZ + SLP-76, HER2-CD28TM-BBZ +LAT, 및 HER2-CD28TM-BBZ + LCK이다.
[0053] 도 2는 대조군("ALONE"), 높은 수준의 CD19를 발현하는 야생형 NALM6 세포("WT N6"), 또는 낮은 수준의 CD19를 발현하는 NALM6 세포("CD19 LOW N6")에 반응한 T 세포의 IL-2 생산 수준을 보여주는 막대 그래프이다. T 세포는 SLP-76의 존재 또는 부재하에 도 1에서와 동일한 CD19-표적화 CAR 작제물("CD19-CD8TM-BBZ")을 추가로 발현한다. 각 인큐베이션 조건에서 사용된 CAR 작제물은 좌측에서 우측으로 CD19-CD8TM-BBZ, 및 CD19-CD8TM-BBZ + SLP-76이다.
[0054] 도 3a-3c는 종양 세포에 반응한 T 세포 활성을 보여주는 그래프 세트이다. 도 3a는 LCK(SEQ ID NO: 9; 상부 트레이스), 막-결합된 LCK 작제물(SEQ ID NO: 17; 상부로부터 두 번째 트레이스), SLP-76(SEQ ID NO: 7; 상부로부터의 세 번째 트레이스), 막-결합된 SLP-76(SEQ ID NO: 16; 상부로부터의 네 번째 트레이스), 또는 대조군(하부 트레이스)을 추가로 과발현하는 T 세포 상에서 CD19-표적화 CAR 작제물("CD19-CD8TM-BBZ")의 발현을 검출하는 FACS 히스토그램을 제시한다. 도 3b는 대조군("ALONE"), 야생형 NALM6 세포("WT N6"), 또는 낮은 수준의 CD19를 발현하는 NALM6 세포("CD19 LOW N6")에 반응한 이러한 T 세포의 IL-2 생산 수준을 비교하는 막대 그래프이다. 각 인큐베이션 조건에 사용된 CAR 작제물은 좌측에서 우측으로 CD19-CD8TM-BBZ, CD19-CD8TM-BBZ + SLP-76, CD19-CD8TM-BBZ + 막-결합된 SLP-76, CD19-CD8TM-BBZ + 막-결합된 LCK, 및 CD19-CD8TM-BBZ + LCK이다. 도 3c는 막-결합된 SLP-76의 존재 또는 부재하에 CD19-표적화 CAR 작제물("CD19-CD8TM-BBZ")을 발현하는 T 세포의 IL-2 생산 수준을 비교하는 그래프이다. 도 3c의 실험을 위해, CD19-표적화 CAR의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 항-이디오타입 항체를 연속 희석에 의해 상이한 양(x-축)으로 플레이트에 코팅하였다. T 세포를 각각의 양의 코팅된 항체와 함께 인큐베이션하고, IL-2의 상응하는 생산 수준을 측정하여 T 세포 활성화의 정도를 나타내었다.
[0055] 도 4a-4c는 도 3a-3c에서와 유사하게 종양 세포에 반응한 T 세포 활성을 보여주는 그래프 세트이다. 도 4a는 LCK(SEQ ID NO: 9; 상부 트레이스), 막-결합된 LCK 작제물(SEQ ID NO: 17; 상부로부터 두 번째 트레이스), SLP-76(SEQ ID NO: 7; 상부로부터의 세 번째 트레이스), 막-결합된 SLP-76(SEQ ID NO: 16; 상부로부터의 네 번째 트레이스), 또는 대조군(하부 트레이스)을 추가로 과발현하는 T 세포 상에서 HER2-표적화 CAR 작제물("HER-2-CD28TM-BBZ")의 발현을 검출하는 FACS 히스토그램을 제시한다. 도 4b는 대조군("NO TUMOR"), 초저 수준의 HER2를 발현하는 NALM6 세포("ULTRA LOW HER2+ N6"), 낮은 수준의 HER2를 발현하는 NALM6 세포("LOW HER2+ N6"), 높은 수준의 HER2를 발현하는 NALM6 세포("HIGH HER2+ N6"), 또는 야생형 143B 세포(낮은 수준의 HER2를 발현함)에 반응한 이러한 T 세포의 IL-2 생성 수준을 비교하는 막대 그래프이다. 각 인큐베이션 조건에서 사용된 CAR 작제물은 좌측에서 우측으로 HER2-CD28TM-BBZ, HER2-CD28TM-BBZ + SLP-76, HER2-CD28TM-BBZ + 막-결합된 SLP-76, HER2-CD28TM-BBZ + LCK, 및 HER2-CD28TM-BBZ + 막-결합된 LCK이다. 도 4c는 막-결합된 SLP-76의 과발현이 있거나 없는 동일한 HER2-표적화 CAR 작제물을 발현하는 T 세포의 IL-2 생산 수준을 비교하는 그래프이다. 재조합 Her-2 항원을 연속 희석에 의해 상이한 양(x-축)으로 플레이트에 코팅하였다. T 세포를 각각의 양의 코팅된 재조합 항원과 함께 인큐베이션하고, IL-2의 상응하는 생산 수준을 측정하여 T 세포 활성화의 정도를 나타내었다.
[0056] 도 5a-5f는 종양 세포에 반응하여 CAR T 세포 활성을 향상시키는 막-결합된 SLP-76(SEQ ID NO: 16)의 능력을 보여주는 그래프 세트이다. 도 5a는 T 세포 상에서 CD19-표적화 CAR 작제물("CD19-CD28TM-CD28Z", 좌측 패널) 및 막-결합된 SLP-76(막-결합된 SLP-76에 컨쥬게이션된 작은 세포외 태그 검출을 통함)(우측 패널)의 발현을 검출하는 FACS 히스토그램을 제시한다. 도 5b는 대조군("ALONE"), 야생형 NALM6 세포("WT N6"), 또는 낮은 수준의 CD19를 발현하는 NALM6 세포("CD19 LOW N6")에 반응한 이러한 T 세포의 IL-2 생산 수준을 비교하는 막대 그래프이다. 각 인큐베이션 조건에서 사용된 CAR 작제물은 좌측에서 우측으로 모의, 모의 + 막-결합된 SLP-76, CD19-CD28TM-CD28Z, 및 CD19-CD28TM-CD28Z + 막-결합된 SLP-76이다. 도 5c는 시간 경과에 따른 CD19 LOW N6 세포에 대한 이들 T 세포의 세포독성을 비교하는 그래프이다. 구체적으로, 막-결합된 SLP-76의 존재 또는 부재하에 CD19-표적화 CAR 작제물을 발현하는 T 세포를 GFP를 발현하는 CD19 LOW N6 세포와 인큐베이션하고, 나머지 N6 세포의 수를 이들의 GFP의 발현을 기반으로 하여 3시간 내지 72시간의 인큐베이션 후에 계수하였다. 표적 세포를 억제하거나 사멸시키는 T 세포의 기능을 반영하기 위해 세포독성 지수(기준선 측정으로 표준화된 %GFP 신호)를 계산하였다. 도 5d는 생체내 NALM6 스트레스 시험 모델에서 막-결합된 SLP-76의 효과를 제시한다. 구체적으로, 막-결합된 SLP-76의 존재 또는 부재하에 CD19-표적화 CAR 작제물을 발현하는 T 세포를 야생형 NALM-6 종양을 갖는 동물에 준-치유 용량으로 주사하였다. 종양 부하(y-축으로서 총 플럭스 수로 제시됨)를 측정하고 처리 후 상이한 시점에서 비교하였다. 도 5e는 도 5d에 설명된 실험으로부터 마우스의 생존을 제시한다. 선은 좌측에서 우측으로 모의 + 막-결합된 SLP-76, CD19 28Z, 또는 CD19 28Z + 막-결합된 SLP-76을 발현하는 마우스의 생존을 나타낸다. 도 5f는 잘못 계산된 데이터 포인트의 수정 후, 도 5d의 결과(모의 + 막 SLP-76 처리 제외)를 제시한다.
[0057] 도 6a-6f는 종양 세포에 반응하여 CAR T 세포 활성을 향상시키는 막-결합된 SLP-76의 능력을 보여주는 그래프 세트이다. 도 6a는 T 세포 상에서 CD22-표적화 CAR 작제물("CD22-CD8TM-BBZ", 좌측 패널) 및 막-결합된 SLP-76(막-결합된 SLP-76에 컨쥬게이션된 작은 세포외 태그 검출을 통함)(우측 패널)의 발현을 검출하는 FACS 히스토그램을 제시한다. 도 6b는 대조군("ALONE"), 또는 낮은 수준의 CD22를 발현하는 NALM 6 세포("CD22LOW N6")에 반응한 이러한 T 세포 또는 모의 대조군의 IL-2 생산 수준을 비교한 막대 그래프이다. 각 인큐베이션 조건에서 사용된 CAR 작제물은 좌측에서 우측으로 모의, 모의 + 막-결합된 SLP-76, CD22-CD8TM-BBZ, 및 CD22-CD8TM-BBZ + 막-결합된 SLP-76이다. 도 6c는 막-결합된 SLP-76의 존재 또는 부재하에 CD22-표적화 CAR 작제물("CD22-CD8TM-BBZ")을 발현하는 T 세포의 IL-2 생산 수준을 비교하는 그래프이다. 재조합 CD22를 연속 희석에 의해 상이한 양(x-축)으로 플레이트에 코팅하였다. T 세포를 각각의 양의 코팅된 CD22와 함께 인큐베이션하고, IL-2의 생산 수준을 측정하여 T 세포 활성화를 나타내었다. 도 6d-6f는 생체내 CD22LOW NALM6(저밀도의 CD22를 발현하는 세포) 모델에서 막-결합된 SLP-76의 효과를 제시한다. 구체적으로, 막-결합된 SLP-76을 과발현하거나 과발현하지 않는, CD22-표적화 CAR 작제물을 발현하는 T 세포를 CD22LOW NALM-6 종양을 갖는 동물에 주사하였다. 종양 부하(y-축으로서 총 플럭스 수로 제시됨)를 측정하고 처리 후 22일에서 비교하였다(도 6d). 별도의 실험에서, 종양 부하(y-축으로 총 발광으로 제시됨)를 측정하고 처리 후 상이한 시점에서 비교하였다(도 6e). 도 6f는 도 6e에 설명된 실험으로부터 마우스의 생존을 제시한다.
[0058] 도 7a-7d는 종양 세포에 반응하여 CAR T 세포 활성을 향상시키는 막-결합된 SLP-76의 능력을 보여주는 그래프 세트이다. 도 7a는 T 세포 상에서 B7-H3-표적화 CAR 작제물("B7-H3-CD28TM-BBZ", 좌측 패널) 및 막-결합된 SLP-76(막-결합된 SLP-76에 컨쥬게이션된 작은 세포외 태그 검출을 통함)(우측 패널)의 발현을 검출하는 FACS 히스토그램을 제시한다. 도 7b는 이러한 CAR T 세포의 세포독성을 신경모세포종 세포주 CHLA-255(이는 저밀도의 B7-H3을 발현함)와 비교한 그래프이다. 구체적으로, 막-결합된 SLP-76을 과발현하거나 과발현하지 않는 B7-H3-CD28TM-BBZ를 발현하는 T 세포를 GFP를 발현하는 CHLA-255 세포와 인큐베이션하였다. 나머지 CHLA-255 세포의 수를 GFP의 발현 수준에 기초하여 3시간 내지 78시간의 인큐베이션 후에 계수하였다. 표적 세포를 억제하거나 사멸시키는 T 세포의 기능을 반영하기 위해 세포독성 지수를 계산하였다. 도 7c는 생체내 CHLA-255(이는 저밀도의 B7-H3을 발현함) 전이성 모델에서 종양 부하를 제시한다. 막-결합된 SLP-76을 과발현하거나 과발현하지 않는 B7-H3-CD28TM-BBZ를 발현하는 T 세포를 CHLA-255 종양을 갖는 동물에 주사하였다. 종양 부하(y-축으로서 총 플럭스 수로 제시됨)를 처리 후 상이한 시점에서 측정하였다. 도 7d는 상이한 시점에서 각각의 처리 후 동물 생존을 비교한다.
[0059] 도 8a-8d는 종양 세포에 반응하여 CAR T 세포 활성을 향상시키는 막-결합된 SLP-76의 능력을 보여주는 그래프 세트이다. 도 8a는 T 세포 상의 CD3-제타 신호전달 도메인("CD19-CD28TM-ZAP70", 좌측 패널) 및 막-결합된 SLP-76(막-결합된 SLP-76에 컨쥬게이션된 작은 세포외 태그 검출을 통함)(우측 패널)보다는 ZAP70255-600 단편(ZAP70 신호전달 도메인 함유)을 함유하는 CD19-표적화 CAR 작제물의 발현을 검출하는 FACS 히스토그램을 제시한다. 도 8b는 대조군("NO TUMOR"), 또는 야생형 NALM 6 세포에 반응한 이러한 T 세포, 또는 모의 대조군의 IL-2 생산 수준을 비교한다. 도 8c는 생체내 NALM6 이종이식편 모델에서 종양 부하를 제시한다. 막-결합된 SLP-76을 과발현하거나 과발현하지 않는 CD19-CD28TM-ZAP70을 발현하는 T 세포를 NALM6 종양을 갖는 동물에 주사하였다. 종양 부하(y-축으로서 총 플럭스로 제시됨)를 측정하고 처리 후 상이한 시점에서 비교하였다. 도 8d는 상이한 시점에서 각각의 처리 후 동물 생존을 비교한다.
[0060] 도 9a-9b는 종양 세포에 반응하여 CAR T 세포 활성을 향상시키는 막-결합된 SLP-76의 능력을 보여주는 그래프 세트이다. 도 9a는 T 세포 상의 고친화성(HA) GD2-표적화 CAR 작제물("HA 28Z", 좌측 패널) 및 각각 상이한 힌지-막횡단 도메인(CD8 대 CD28)을 함유하는 2개의 막-결합된 SLP-76 작제물(막-결합된 SLP-76 작제물에 컨쥬게이션된 예시적인 항-HER2 ECD의 검출을 통함)(우측 패널)의 발현을 검출하는 FACS 히스토그램을 제시한다. 도 9b는 GD2를 발현하는 NALM6 세포("GD2 N6"), 야생형 143B 세포, 또는 CHLA-255 세포에 반응한 이들 T 세포의 IL-2 생산 수준(기준선 차감 후)을 비교한다. 각 인큐베이션 조건에서 사용된 CAR 작제물은 좌측에서 우측으로 HA-28Z, HA-28Z + CD8TM-SLP-76, 및 HA-28Z + CD28TM-SLP-76이다.
[0061] 도 10은 CAR T 세포 상에서의 세포 고갈 바이오마커의 발현을 보여주는 그래프 세트이다. FACS 분석을 수행하여 막-결합된 SLP-76을 과발현하거나 과발현하지 않는 B7-H3-CD28TM-BBZ CAR 작제물을 발현하는 T 세포 상에서의 TIM-3(좌측 패널), PD-1(중간 패널), 및 LAG-3(우측 패널)의 발현을 검출하였다.
[0062] 도 11은 CAR T 세포 상에서의 세포 고갈 바이오마커의 발현을 보여주는 그래프 세트이다. FACS 분석을 수행하여 막-결합된 SLP-76을 과발현하거나 과발현하지 않는 HA 28Z CAR 작제물을 발현하는 T 세포 상에서의 TIM-3(좌측 패널), PD-1(중간 패널), 및 LAG-3(우측 패널)의 발현을 검출하였다.
[0063] 도 12a-12b는 종양 세포에 반응하여 CAR T 세포 활성을 향상시키는 막-결합된 SLP-76 대 LAT/SLP-76 키메라(SLP-76에 융합된 LAT 막횡단)의 능력을 비교하는 그래프 세트이다. 도 12a는 막-결합된 SLP-76 작제물(중간 패널, 우측 트레이스), 또는 LAT/SLP-76 키메라 작제물(우측 패널, 우측 트레이스)을 과발현하는 T 세포 상에서의 CD19 28Z CAR 작제물의 발현(좌측 패널)을 검출하는 FACS 히스토그램을 제시한다. 중간 및 우측 패널에서, 좌측 트레이스는 SLP-76 작제물의 과발현이 없는 대조군을 나타낸다. 도 12b는 대조군("ALONE"), 높은 항원(즉, CD19) 밀도를 발현하는 야생형 NALM6 세포("WT N6"), 또는 낮은 항원 밀도를 발현하는 NALM6 세포의 2개의 클론("CLONE F N6" 및 "CLONE Z N6") 중 어느 하나에 반응한 이들 T 세포의 IL-2 생산 수준을 비교한다. 각각의 인큐베이션 조건에서 사용된 CAR 작제물은 좌측에서 우측으로 모의, 모의 + LAT/SLP-76 키메라, 모의 + 막-결합된 SLP-76, CD19-28Z, CD19-28Z + LAT/SLP-76 키메라, 및 CD19-28Z + 막-결합된 SLP-76이다.
[0064] 도 13a-13b는 종양 세포에 반응하여 CAR T 세포 활성을 향상시키는 막-결합된 SLP-76(SEQ ID NO: 16)의 능력을 보여주는 그래프이다. 도 13a는 T 세포에서 CD19-표적화 CAR 작제물("CD19-CD8TM-BBZ")의 발현을 보여주는 FACS 분석의 히스토그램을 함유한다. T 세포를 추가로 형질도입하여 막-결합된 SLP-76 작제물(상부 트레이스), 막-결합된 PLCG 작제물(상부로부터 두 번째 트레이스; SEQ ID NO: 50), 막-결합된 ZAP-70255-600 작제물(상부로부터 세 번째 트레이스; SEQ ID NO: 46), 유리 PLCG 작제물(상부로부터 네 번째 트레이스; SEQ ID NO: 48), 유리 ZAP-70 작제물(상부로부터 다섯 번째 트레이스; SEQ ID NO: 44), 또는 모의 대조군(하부 트레이스)을 과발현시켰다. 도 13b는 종양 세포(야생형 NALM-6)와 공동-배양되는 경우 좌측에서 우측으로 모의 대조군, ZAP-70, PLCg, 막-결합된 ZAP-70255-600, 막-결합된 PLCg, 또는 막-결합된 SLP-76을 과발현하는 CD19-CD8TM-BBZ CAR T 세포에 의한 사이토카인(상부 패널에서 IL-2 및 하부 패널에서 IFNγ) 생산을 보여주는 그래프 세트를 함유한다.
[0065] 도 14a-14e는 CAR 분자에 의해 인식될 수 있는 상이한 수준의 항원을 발현하는 종양 세포에 반응하여 CAR T 세포 활성을 향상시키는 막-결합된 SLP-76(SEQ ID NO: 16)의 능력을 보여주는 그래프이다. 도 14a는 T 세포에서 역형성 림프종 키나제(ALK)-표적화 CAR 작제물("ALK-CD8TM-BBZ")의 발현을 보여주는 FACS 분석의 히스토그램을 함유한다. T 세포를 추가로 형질도입하여 막-결합된 SLP-76 작제물(상부 트레이스) 또는 모의 대조군(상부로부터 두 번째 트레이스)을 과발현시켰다. 하부 트레이스는 CAR 작제물 또는 막-결합된 SLP-76 작제물을 발현하지 않는 대조군 T 세포를 지칭한다. 도 14b는 T 세포에서 막-결합된 SLP-76의 발현(본원에 설명된 바와 같은 이의 표면 마커를 검출함으로써)을 보여주는 FACS 분석의 히스토그램(우측 트레이스)을 함유한다. 도 14c는 높은 수준의 ALK 발현을 갖는 세포(ALKhigh, 상부 트레이스), 중간 수준의 ALK 발현을 갖는 세포(ALKmed, 상부로부터 두 번째 트레이스), 낮은 수준의 ALK 발현을 갖는 세포(ALKlow, 상부로부터 세 번째 트레이스), 또는 ALK를 발현하지 않는 세포(ALK-, 하부 트레이스)를 포함하는 상이한 Nalm-6 세포에서의 ALK의 발현 수준을 나타내는 FACS 분석의 히스토그램을 함유한다. 도 14d는 상이한 항원 밀도를 갖는 종양 세포와 공동-배양될 때, 막 결합된 SLP-76 과발현을 갖거나 갖지 않는 ALK-CD8TM-BBZ CAR T 세포에 의한 사이토카인(상부 패널에서 IL-2, 하부 패널에서 IFNγ) 생산을 나타내는 그래프를 함유한다. 도 14e는 막 결합된 SLP-76 과발현이 없거나(각 패널의 상부 선) 과발현이 있는(각 패널의 하부 선) ALK-CD8TM-BBZ CAR T 세포에 의한 상이한 수준의 ALK 발현을 갖는 ALK Nalm-6의 사멸을 보여주는 그래프를 함유한다. NALM-6과 T 세포 사이의 세포 수의 비율은 각 패널의 상부에 나열되어 있다.
[0066] 도 15a-15c는 종양 세포에 반응하여 T 세포 활성을 향상시키는 막-결합된 SLP-76(SEQ ID NO: 16)의 능력을 보여주는 그래프이다. 도 15a는 T 세포에서 NY-ESO-1 TCR 작제물(좌측 패널) 또는 막-결합된 SLP-76 작제물(본원에 설명된 바와 같은 이의 표면 마커를 검출함으로써; 우측 패널)의 발현을 보여주는 FACS 분석의 히스토그램을 함유한다. 시험된 T 세포를 형질도입하여 TCR 작제물 및 막-결합된 SLP-76 작제물(상부 트레이스), TCR 작제물 단독(상부로부터 두 번째 트레이스), 모의 대조군 및 막-결합된 SLP-76 작제물(상부로부터 세 번째 트레이스), 또는 모의 대조군 단독(하부 트레이스)을 과발현시켰다. 도 15b는 항원 양성 종양 세포(A2+/NY-ESO-1+ Nalm-6 세포, 상부 패널, 또는 A375 세포, 하부 패널) 또는 항원 음성 종양 세포 Mel888(하부 패널)과 공동-배양될 때 NY-ESO-1 TCR T 세포에 의한 IL-2 생산을 보여주는 그래프 세트를 함유한다. 도 15c는 공동-배양 후 기간(x-축, 시간)에 걸친 세포독성 지수(y-축)로 표현된, 막 결합된 SLP-76을 과발현하거나 과발현하지 않는 NY-ESO-1 TCR T 세포에 의한 A2+/NY-ESO-1+ Nalm-6 세포의 사멸을 예시한다.
[0067] 도 16a-16c는 종양 세포에 반응하여 T 세포 활성을 향상시키는 막-결합된 SLP-76(SEQ ID NO: 16)의 능력을 보여주는 그래프이다. 도 16a는 T 세포에서의 B-세포 성숙 항원(BCMA)-표적화 CAR 작제물(좌측 패널) 또는 막-결합된 SLP-76 작제물(본원에 설명된 바와 같은 이의 표면 마커 VSV-G를 검출함으로써; 우측 패널)의 발현을 보여주는 FACS 분석의 히스토그램을 함유한다. 시험된 T 세포를 형질도입하여 CAR 작제물 및 막-결합된 SLP-76 작제물(상부 트레이스), CAR 작제물 단독(상부로부터 두 번째 트레이스), 또는 모의 대조군(하부 트레이스)을 과발현시켰다. 도 16b는 MM1.S 종양 세포에 반응하여 CAR 작제물 및 막-결합된 SLP-76 작제물 둘 모두 또는 CAR 작제물만을 발현하는 T 세포에 의한 IL-2(상부 패널) 또는 IFNγ(하부 패널) 생산을 비교하는 그래프 세트를 함유한다. 도 16c는 루시페라제-발현 MM1.S 종양 세포로 접종되고 T 세포로 처리된 마우스에서, 막 결합된 SLP-76을 과발현하거나 과발현하지 않는 이들 T 세포에 의한 생체내 종양 조절을 비교한다.
[0068] 도 17a-17b는 종양 세포에 반응하여 T 세포 활성을 향상시키는 막-결합된 SLP-76(SEQ ID NO: 16)의 능력을 보여주는 그래프이다. 도 17a는 T 세포에서 B7-H3-표적화 CAR 작제물("B7-H3-CD28TM-BBZ")의 발현을 보여주는 FACS 분석의 히스토그램을 함유한다. 시험된 T 세포를 형질도입하여 CAR 작제물 및 막-결합된 SLP-76 작제물(상부 트레이스), CAR 작제물 단독(상부로부터 두 번째 트레이스), 또는 모의 대조군(하부 트레이스)을 과발현시켰다. 도 17b는 루시페라제-발현 미만성 내재 교뇌 교종 6 이종이식편(DIPG-6)으로 접종된 마우스에서 막 결합된 SLP-76을 과발현하거나 과발현하지 않는 이들 T 세포에 의한 생체내 종양 조절을 비교한다.
[0069] 도 18a-18b는 종양 세포에 반응하여 T 세포 증식을 향상시키는 막-결합된 SLP-76(SEQ ID NO: 16)의 능력을 보여주는 그래프이다. 도 18a는 T 세포에서의 CD19-표적화 CAR 작제물("CD19-CD28TM-CD28Z"; 좌측 패널) 또는 막-결합된 SLP-76 작제물(본원에 설명된 바와 같이 이의 표면 마커 VSV-G를 검출함으로써; 우측 패널)의 발현을 보여주는 FACS 분석의 히스토그램을 함유한다. 시험된 T 세포를 형질도입하여 CAR 작제물 및 막-결합된 SLP-76 작제물 둘 모두(상부 트레이스) 또는 CAR 작제물 단독(하부 트레이스)을 과발현시켰다. 도 18b는 상이한 시점에서 루시페라제-발현 WT Nalm-6으로 접종된 마우스의 비장(상부) 또는 골수(하부)로부터 수확된 막 결합된 SLP-76을 과발현하거나 과발현하지 않는 CD19-CD28TM-CD28Z CAR T 세포의 양을 비교한다.
[0070] 도 19a-19c는 종양 세포에 반응하여 T 세포 증식을 향상시키는 막-결합된 SLP-76(SEQ ID NO: 16)의 능력을 보여주는 그래프이다. 도 19a는 T 세포에서의 CD19-표적화 CAR 작제물("CD19-CD28TM-BBZ"; 좌측 패널) 또는 막-결합된 SLP-76 작제물(본원에 설명된 바와 같이 이의 표면 마커 VSV-G를 검출함으로써; 우측 패널)의 발현을 보여주는 FACS 분석의 히스토그램을 함유한다. 시험된 T 세포를 형질도입하여 CAR 작제물 및 막-결합된 SLP-76 작제물 둘 모두(상부 트레이스) 또는 CAR 작제물 단독(하부 트레이스)을 과발현시켰다. 도 19b는 루시페라제-발현 백혈병 이종이식편(WT Nalm-6)으로 접종된 마우스에서 막 결합된 SLP-76을 과발현하거나 과발현하지 않는 이들 T 세포에 의한 생체내 종양 조절을 비교한다. 도 19c는 기간 동안 각각의 처리 후 마우스 생존을 비교한다.
[0071] 도 20a-20c는 종양 세포에 반응하여 T 세포 활성을 향상시키는 막-결합된 SLP-76 돌연변이체(SEQ ID NO: 60)의 능력을 보여주는 그래프이다. 도 20a-20b는 T 세포에서의 CD19-표적화 CAR 작제물("CD19-CD28TM-BBZ"; 도 20a) 또는 다양한 SLP-76 작제물(본원에 설명된 바와 같은 이의 표면 마커 VSV-G를 검출함으로써; 도 20b)의 발현을 보여주는 FACS 분석의 히스토그램을 함유한다. 시험된 T 세포를 형질도입하여 CAR 작제물 및 막-결합된 SLP-76 K30R 돌연변이체 작제물 둘 모두(상부 트레이스), 막-결합된 SLP-76(야생형) 작제물(중간 트레이스), 또는 CAR 작제물 단독(하부 트레이스)을 과발현시켰다. 도 20c는 낮은 수준의 CD19를 발현하는 NALM-6 세포 또는 대조군("NO TUMOR")과 공동-배양될 때, 이들 T 세포에 의한 IL-2 발현 수준을 비교한다. 각 인큐베이션 조건에서 사용되는 CAR 작제물은 좌측에서 우측으로 CD19BBZ CAR(즉, CD19-CD28TM-BBZ) 단독, CD19BBZ CAR + 막-결합된 SLP-76, 및 CD19BBZ CAR + 막-결합된 SLP-76 K30R 돌연변이체이다.
[0072] 본 발명의 개시는 일반적으로, 특히, 표적 항원에 반응하여 세포[예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 T-세포 수용체(TCR)를 발현하는 면역 세포, 예를 들어, T 세포]의 활성화 및 기능을 향상시킬 수 있고, 예를 들어, 표적 항원을 발현하는 특정 표적 세포(예를 들어, 암 또는 종양 세포)를 표적화, 억제, 및/또는 제거하는 폴리펩티드, 예를 들어, SLP-76의 조성물, 및 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한, 폴리펩티드를 함유하는 재조합 세포의 조성물 및 이러한 재조합 세포를 생산하는데 유용한 방법, 뿐만 아니라 질환, 예를 들어, 질병[예를 들어, 증식성 질병(예를 들어, 암), 혈액 악성종양, 고형 종양, 자가면역 질병, 염증, 알레르기 질병, 감염, 노쇠/노화 등]의 치료를 위한 세포(예를 들어, 면역 세포) 활성을 향상시키기 위한 방법이 또한 본원에 제공된다.
[0073] 본원에 제시된 예시적인 실험 결과는 SLP-76이 세포(예를 들어, CAR T 세포) 활성화를 향상시킬 수 있어, 증가된 T 세포 효과기 기능 및 항-종양 효능(예를 들어, 증가된 사이토카인 생산 및 세포독성)을 초래할 수 있음을 입증한다. 추가로, SLP-76, 예를 들어, 막-결합된 SLP-76은 낮은 항원 밀도에 반응하여 CAR T 세포 활성을 향상시켜, 증가된 T 세포 효과기 기능 및 항종양 효능(예를 들어, 향상된 사이토카인 생산 및 세포독성)을 초래할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, SLP-76은 T 세포 활성화 역치를 낮추고, 면역 세포에서 TCR 또는 CAR 기능을 개선하고, 근위 신호전달을 향상시킴으로써 면역 세포 기능을 개선시킬 수 있다. 도메인 스왑은 SLP-76의 이러한 능력이 CAR 특이성 또는 SLP-76의 구조에 독립적(예를 들어, SLP-76을 막에 테더링하는데 사용되는 막횡단 도메인에 의존적이지 않음)일 수 있음을 확인하기 위해 다양한 CAR 분자 또는 SLP-76 작제물을 조작하는데 사용되었다. SLP-76, 예를 들어, 막-결합된 SLP-76에 대한 다른 이점은, 예를 들어, 면역 세포(예를 들어, T 세포), 예를 들어, CAR, TCR, 또는 긴장성 신호전달을 유발하는 다른 분자를 발현하는 세포에서 세포 고갈을 악화시키지 않는 것을 포함할 수 있다. 특히, SLP-76 분자는 달리 T 세포 고갈의 특징을 나타내는 CAR T 세포의 활성화를 유의하게 향상시킬 수 있다. SLP-76, 예를 들어, 막-결합된 SLP-76은 대부분의 상황에서 CAR, TCR, 또는 다른 수용체 기능 또는 다른 면역 세포 기능을 촉진할 수 있지만, 이는 표적 항원이 저밀도로 발현될 때, CAR, TCR 또는 또 다른 수용체 작제물이 표적 항원에 대한 낮은 친화성을 가질 때, CAR, TCR 또는 다른 수용체가 저밀도로 발현될 때, 및/또는 CAR, TCR, 또는 또 다른 수용체 작제물이 세포 고갈을 유도할 때 특정한 이점을 가질 수 있다.
[0074] 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자 및 이러한 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포가 또한 제공된다. 본 발명의 개시는 또한 SLP-76 폴리펩티드를 함유하는 이러한 재조합 세포를 생산하는데 유용한 조성물 및 방법, 뿐만 아니라 세포 활성화를 향상시키고, 질환, 예를 들어, 증식성 질병(예를 들어, 암), 혈액 악성종양, 고형 종양, 자가면역 질병, 염증, 알레르기 질병, 감염, 노쇠/노화 등을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
[0075] 본 발명의 개시에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
일반 실험 절차
[0076] 본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당업자에게 널리 공지된 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학, 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌, 예를 들어, 문헌[Sambrook, J., & Russell, D. W. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory and Sambrook, J., & Russel, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory (본원에서 공동으로 "Sambrook"으로 지칭됨); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY: Wiley (2014년까지의 보충물 포함); Bollag, D. M. et al. (1996). Protein Methods. New York, NY: Wiley-Liss; Huang, L. et al. (2005). Nonviral Vectors for Gene Therapy. San Diego: Academic Press; Kaplitt, M. G. et al. (1995). Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications. San Diego, CA: Academic Press; Lefkovits, I. (1997). The Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques. San Diego, CA: Academic Press; Doyle, A. et al. (1998). Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. New York, NY: Wiley; Mullis, K. B., , F. & Gibbs, R. (1994). PCR: The Polymerase Chain Reaction. Boston: Birkhauser Publisher; Greenfield, E. A. (2014). Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.). New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Beaucage, S. L. et al. (2000). Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. New York, NY: Wiley, (2014년까지의 보충물 포함); 및 Makrides, S. C. (2003). Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. Amsterdam, NL: Elsevier Sciences B.V.](이들의 개시는 본원에 참조로서 포함됨)에 충분히 설명되어 있다. 적절하게, 상업적으로 입수 가능한 키트 및 시약의 사용을 포함하는 절차는 달리 언급되지 않는 한 일반적으로 제조자가 정의한 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 수행된다.
정의
[0077] 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 과학적 용어 또는 술어는 본 발명의 개시가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되며, 본원에 이러한 정의를 포함하는 것이 반드시 당 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 설명되거나 언급된 많은 기술 및 절차는 당업자에 의해 통상적인 방법을 사용하여 잘 이해되고 통상적으로 사용된다.
[0078] 단수 형태는 문맥에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 언급을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 이들의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 세포를 포함한다. "A 및/또는 B"는 하기 대안 모두를 포함하기 위해 본원에서 사용된다: "A", "B", "A 또는 B", 및 "A 및 B".
[0079] 본원에서 사용되는 용어 "약"은 대략의 통상적인 의미를 갖는다. 근사의 정도가 문맥상 달리 명확하지 않은 경우, "약"은 모든 경우에 제공된 값을 포함하여 제공된 값의 + 또는 - 10% 이내, 또는 가장 가까운 유효 숫자로 반올림됨을 의미한다. 범위가 제공되는 경우, 이는 경계 값을 포함한다.
[0080] 용어 "~로부터 유래된"은 분자의 기원 또는 공급원을 지칭하고, 자연 발생, 재조합, 비정제, 또는 정제된 분자를 포함할 수 있다. 핵산 또는 폴리펩티드 분자는 이들이 기능성 단위를 생산하는 방식으로 조립된 부분 또는 요소를 포함할 때 "~로부터 유래된" 것으로 간주된다. 부분 또는 요소는 진화적으로 보존된 기능을 유지하는 한, 다수의 공급원으로부터 조립될 수 있다. 일부 구현예에서, 유도체 핵산 또는 폴리펩티드 분자는 공급원 핵산 또는 폴리펩티드 분자와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 개시의 유도체 핵산 또는 폴리펩티드 분자는 공급원 핵산 또는 폴리펩티드 분자와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다.
[0081] 본 출원에서 사용되는 용어 "재조합" 핵산 분자, 폴리펩티드, 및/또는 세포는 인간 개입을 통해 변경된 핵산 분자, 폴리펩티드, 및/또는 세포를 지칭한다. 비제한적인 예로서, 재조합 핵산 분자는 1) 예를 들어, 화학적 또는 효소적 기술, 또는 핵산 분자의 재조합을 사용하여 시험관내에서 합성 또는 변형되고/되거나; 2) 자연적으로 결합되지 않는 결합된 뉴클레오티드 서열을 포함하고/하거나; 3) 자연 발생 핵산 분자 서열과 관련하여 하나 이상의 뉴클레오티드가 결여되도록 분자 클로닝 기술을 사용하여 조작되고/되거나; 4) 자연 발생 핵산 서열과 관련하여 하나 이상의 서열 변화 또는 재배열을 갖도록 분자 클로닝 기술을 사용하여 조작된 것일 수 있다. 재조합 단백질의 비제한적인 예는 SLP-76 폴리펩티드, 키메라 항원 수용체(CAR), T-세포 수용체(TCR), 또는 본원에 제공된 바와 같은 다른 수용체이다.
[0082] 용어 "세포", "세포 배양물", "세포주"는 특정 대상체 세포, 세포 배양물, 또는 세포주 뿐만 아니라 배양물에서의 전달 또는 계대 수와 무관하게 이러한 세포, 세포 배양물, 또는 세포주의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭한다. 모든 자손이 모 세포와 정확히 동일한 것은 아님이 이해되어야 한다. 이는 돌연변이(예를 들어, 고의적이거나 부주의한 돌연변이) 또는 환경 영향(예를 들어, 메틸화 또는 다른 후성적 변형)으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있어 자손이 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있기 때문이나, 이는 자손이 원래의 세포, 세포 배양물, 또는 세포주의 것과 동일한 기능성을 유지하는 한 여전히 본원에서 사용되는 용어의 범위 내에 포함된다.
[0083] 본원에서 사용되는 "숙주 세포"는 본원에 설명된 핵산 및/또는 폴리펩티드(예를 들어, SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 분자)의 도입을 위한 세포 및/또는 본원에 설명된 핵산 또는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 형질전환되지 않은 세포 또는 본원에 설명된 적어도 하나의 핵산 분자(예를 들어, SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 분자)가 이미 도입된 세포일 수 있다. "재조합 세포"는 유전적 변형을 갖고/거나 본원에 설명된 핵산 및/또는 폴리펩티드가 도입된 세포를 지칭한다.
[0084] 본원에서 사용되는 "대상체" 또는 "개체"는 인간(예를 들어, 인간 대상체) 및 비-인간 동물과 같은 동물을 포함한다. 일부 구현예에서, "대상체" 또는 "개체"는 의사의 치료를 받는 환자이다. 따라서, 대상체는 관심 질병(예를 들어, 암) 및/또는 질병의 하나 이상의 증상을 갖거나 가질 위험이 있거나 가질 것으로 의심되는 인간 환자 또는 개체일 수 있다. 대상체는 또한 진단 시점 또는 그 이후에 관심 질환의 위험을 갖는 것으로 진단된 개체일 수 있다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스, 및 비-포유동물, 예를 들어, 비-인간 영장류, 예를 들어, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
[0085] 용어 "벡터"는 또 다른 핵산 분자를 전달 또는 수송할 수 있는 핵산 분자 또는 서열을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 벡터는 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 전달된 핵산 분자는 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결, 예를 들어, 이에 삽입된다. 일반적으로, 벡터는 적절한 제어 요소와 회합될 때 복제될 수 있다. 용어 "벡터"는 클로닝 벡터 및 발현 벡터 뿐만 아니라 바이러스 벡터 및 통합 벡터를 포함한다. "발현 벡터"는 조절 영역을 포함하여, 시험관내 및/또는 생체내에서 DNA 서열 및 단편을 발현할 수 있는 벡터이다. 벡터는 세포에서 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 숙주 세포 DNA로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터는, 예를 들어, 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 및 바이러스 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는, 예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 유전자 전달 벡터이다.
[0086] 본원에 설명된 개시의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예를 "포함하는", 이로 "구성되는", 및 이를 "필수적 요소로 하여 구성되는(consisting essentially of)" 것을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)", "함유하는", 또는 "~에 의해 특징지어지는"과 동의어이고, 포괄적이거나 개방적이며, 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본원에서 사용되는 "구성되는"은 청구된 조성물 또는 방법에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용되는 "필수적 요소로 하여 구성되는"은 청구된 조성물 또는 방법의 기본 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 본원에서, 특히 조성물의 성분의 설명 또는 방법의 단계의 설명에서, 용어 "포함하는"의 임의의 언급은 언급된 성분 또는 단계를 필수적 요소로 하여 구성되거나 이로 구성되는 그러한 조성물 및 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
[0087] 표제, 예를 들어, (a), (b), (i) 등은 단지 명세서 및 청구범위를 읽기 쉽게 하기 위해 제시된다. 명세서 또는 청구범위에서 표제의 사용은 단계 또는 요소가 알파벳 또는 숫자 순서 또는 이들이 제시된 순서로 수행될 것을 요구하지 않는다.
[0088] 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 서면 설명을 제공하는 것과 같은 임의의 및 모든 목적을 위해, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위 범위 및 이들의 하위 범위의 조합을 포함한다. 열거된 임의의 범위는 동일한 범위를 적어도 동일한 절반, 1/3, 1/4, 1/5, 1/10 등으로 분류하는 것을 충분히 설명하고 가능하게 하는 것으로 쉽게 인식될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에 논의된 각각의 범위는 하위 1/3, 중간 1/3 및 상위 1/3 등으로 쉽게 분류될 수 있다. 또한, 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, "최대", "적어도", "보다 큰", "보다 작은" 등과 같은 모든 언어는 인용된 수를 포함하고, 상기 논의된 바와 같이 하위-범위로 후속적으로 분류될 수 있는 범위를 지칭한다. 마지막으로, 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1-3개의 물품을 갖는 그룹은 1, 2, 또는 3개의 물품을 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게, 1-5개의 물품을 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 물품을 갖는 그룹 등을 지칭한다.
[0089] 특정 범위는 본원에서 용어 "약"이 앞에 오는 수치 값으로 제시된다. 용어 "약"은 그것이 선행하는 정확한 숫자 뿐만 아니라 상기 용어가 선행하는 숫자에 가까운 숫자 또는 대략적인 그 숫자에 대한 문자 그대로의 지지를 제공하기 위해 본원에서 사용된다. 숫자가 구체적으로 인용된 수에 가깝거나 대략적으로 구체적으로 인용된 수인지의 여부를 결정할 때, 언급되지 않은 수에 가깝거나 이에 근사한 수는 제시된 맥락에서 구체적으로 인용된 수와 실질적으로 등가물을 제공하는 수일 수 있다.
[0090] 명확성을 위해, 별도의 구현예의 맥락에서 설명되는 본 개시의 특정 특징은 또한 단일 구현예에서 조합하여 제공될 수 있음이 이해된다. 반대로, 간결함을 위해 단일 구현예의 맥락에서 설명되는 본 발명의 개시의 다양한 특징은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 제공될 수 있다. 본 발명의 개시에 관한 구현예의 모든 조합은 본 발명의 개시에 의해 구체적으로 포함되며, 마치 각각의 모든 조합이 개별적으로 및 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 또한, 다양한 구현예 및 이의 요소의 모든 하위-조합은 또한 본 발명의 개시에 의해 구체적으로 포함되며, 각각의 모든 이러한 하위 조합이 본원에 개별적으로 및 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
본 발명의 개시의 조성물
[0091] 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 개시는 특히, 세포(예를 들어, 면역 세포, 예를 들어, T 세포) 활성화를 향상시킬 수 있는, 세포 막에 결합되거나 결합되지 않은 SLP-76 폴리펩티드의 조성물을 제공한다. 세포 활성화는 천연/내인성 또는 재조합 T-세포 수용체(TCR), 재조합 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 세포의 표면 상에서 발현되고, 특히 표적 세포(예를 들어, 암 또는 종양 세포)에 의해 발현된 표적 항원에 결합하는 또 다른 천연/내인성 또는 재조합 수용체에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, CAR은 표적 세포의 표면 상에 발현된 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 반면, TCR은 항원-제시 세포(APC)의 표면 상의 주조직적합성 복합체(MHC)에 의해 제시된 표적 항원(표적 세포에 의해 발현됨)에 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 낮은 항원 밀도에 반응하여 (예를 들어, TCR 또는 CAR을 통해) 활성화를 향상시킴으로써 T 세포 활성화 역치를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 재조합 CAR 또는 고유 또는 재조합 TCR과 조합된 SLP-76 폴리펩티드, 예를 들어, 막-결합된 SLP-76 폴리펩티드의 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SLP-76 폴리펩티드, 예를 들어, 막-결합된 SLP-76 폴리펩티드를 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터의 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 재조합 CAR 또는 고유 또는 재조합 TCR을 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터와 조합된 SLP-76 폴리펩티드, 예를 들어, 막-결합된 SLP-76 폴리펩티드를 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터의 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 SLP-76에 대한 폴리뉴클레오티드 및/또는 발현 벡터를 함유하는 재조합 세포의 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 재조합 CAR 또는 고유 또는 재조합 TCR에 대한 폴리뉴클레오티드 및/또는 발현 벡터와 조합된, SLP-76에 대한 폴리뉴클레오티드 및/또는 발현 벡터를 함유하는 재조합 세포의 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 단독의 또는 CAR 또는 TCR에 대한 조성물과 조합된 본원에 설명된 SLP-76에 대한 조성물을 함유하는 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 표적 항원, 특히 저밀도에서 발현된 항원에 반응하여 T 세포 활성화를 향상시키기 위한, T 세포 활성화 역치를 감소시키기 위한, 및/또는 T 세포 고갈을 악화시키지 않기 위한 단독의 또는 CAR 또는 TCR에 대한 조성물과 조합된 SLP-76에 대한 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 표적 항원에 반응하여, 특히 CAR 또는 TCR이 표적 항원에 대한 낮은 친화성을 가질 때 T 세포 활성화를 향상시키기 위한 단독의 또는 CAR 또는 TCR에 대한 조성물과 조합된 SLP-76에 대한 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시는 질환, 예를 들어, 질병을 예방 또는 치료하기 위한, 단독의 또는 CAR 또는 TCR에 대한 조성물과 조합된 SLP-76에 대한 조성물을 제공한다.
SLP-76
[0092] 본 발명의 개시의 폴리펩티드는 본원에 설명된 바와 같은 SLP-76 폴리펩티드를 포함한다. SLP-76은 원래 백혈병 T 세포주 Jurkat에서 T-세포 수용체(TCR) 라이게이션 후 ZAP-70 단백질 티로신 키나제의 기질로서 확인되었다. SLP-76 유전자좌는 인간 염색체 5q33에 국한되었고, 유전자 구조는 마우스에서 부분적으로 특성화되었다. 인코딩된 SLP-76 단백질은 성장 인자 수용체 결합 단백질 2와 회합하고, TCR-매개 세포내 신호 전달 역할을 하는 것으로 생각된다. 마우스에서 유사한 단백질은 정상적인 T-세포 발달 및 활성화에서 역할을 한다. 이 유전자가 결핍된 마우스는 피하 및 복강내 태아 출혈, 혈소판 기능장애 및 손상된 생존력을 나타낸다. 인간 및 뮤린 SLP-76 cDNA는 둘 모두 72% 동일하고 3개의 모듈 도메인으로 구성된 533개의 아미노산 단백질을 인코딩한다. 인간 SLP-76 단백질은 이의 NCBI 참조 서열 번호: NP_005556.1에 의해 접근될 수 있다. 코딩 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA) 서열은 NCBI 참조 서열 번호: NM_005565.5에 의해 접근될 수 있다. SLP-76의 NH2-말단은 PEST 도메인 및 TCR 라이게이션 후에 인산화되는 여러 티로신 잔기를 포함하는 산성 영역을 함유한다. SLP-76은 또한 중심 프롤린-풍부 도메인 및 COOH-말단 SH2 도메인을 함유한다. SLP-76이 어댑터 또는 스캐폴드 단백질로서 기능한다는 개념을 뒷받침하는, 수용체 라이게이션 후에 항시적으로 및 유도적으로 모두 SLP-76과 회합하는 다수의 추가 단백질이 확인되었다. SLP-76-결핍 T 세포주 또는 마우스를 사용한 연구는 SLP-76이 T 세포 발달 및 활성화 뿐만 아니라 비만 세포 및 혈소판 기능을 촉진하는데 긍정적인 역할을 한다는 강력한 증거를 제공하였다. SLP-76은 NK 세포 수용체를 활성화시킴으로써 신호에 대한 통합 지점으로 작용할 수 있다. NK 세포에서, SLP-76은 활성화 수용체의 라이게이션 후 SYK 또는 ZAP70에 의해 인산화될 수 있다.
[0093] 본 명세서에서 폴리펩티드는 SLP-76의 전장 서열, 또는 이의 생물학적으로 기능성인 단편, 및 임의의 돌연변이체, 변이체, 이종상동체, 융합체, 또는 달리 변형된 작제물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 야생형 SLP-76 폴리펩티드에 대한 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어, K30 위치에 대한 돌연변이, 예를 들어, K30R 치환)를 포함한다. 예를 들어, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, 7, 14, 16, 18, 19, 40, 59 또는 60과 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, 7, 14, 16, 18, 19, 40, 59 또는 60의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1, 7, 14, 16, 18, 19, 40, 59 또는 60의 아미노산 서열로 구성된다.
[0094] 본 명세서에서 폴리펩티드는 세포막에 결합하지 않는 유리 세포질 형태의 SLP-76 작제물을 포함할 수 있다. 막에 결합되지 않은 SLP-76의 예시적인 세포질 형태는 전장 SLP-76(예를 들어, SEQ ID NO: 1), SLP-76의 생물학적 활성 단편, 돌연변이체, 또는 변이체, 또는 또 다른 분자(예를 들어, SEQ ID NO: 4 내지 6 중 어느 하나의 서열을 갖는 2A-tNGFR 폴리펩티드 및/또는 HA 태그)에 융합되거나 컨쥬게이션된 SLP-76의 전장, 생물학적 활성 단편, 돌연변이체, 또는 변이체를 함유하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, SLP-76 폴리펩티드는 막에 결합되도록 조작될 수 있다. 예를 들어, SLP-76은 막에 테더링될 또 다른 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 또는 다른 제제에 융합되거나 컨쥬게이션될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서의 SLP-76 폴리펩티드는 SLP-76의 전장 또는 단편에 컨쥬게이션된 막횡단 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 막횡단 도메인은 CAR 분자, TCR 분자, 또는 다른 막횡단 단백질의 막횡단 도메인이거나 이로부터 유래될 수 있다. CAR 분자로부터의 예시적인 막횡단 도메인(TMD)은 CAR 구조에 대한 설명의 하기 섹션에서 발견될 수 있다. 적합한 TMD의 예는 CD28 TMD, CD8 TMD, CD4 TMD, CD3 TMD, CTLA-4 TMD, OX40 TMD, 4-1BB TMD, CD2 TMD, 및 PD-1 TMD를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 추가의 예시적인 TMD는 CD3D, CD3E, CD3G, CD3제타, CD8a, CD8b, CD16, CD25, CD27, CD40, CD79A, CD79B, CD80, CD84, CD86, CD95, CD150 (SLAMF1), CD166, CD200R, CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD272 (BTLA), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), CD300, CD357 (GITR), A2aR, ICAM-1, 2B4, BTLA, DAP10, FcRα, FcRβ, Fyn, GAL9, IL7, IL12, IL15, KIR, KIR2DL4, KIR2DS1, LAG-3, Lck, LAT, LPA5, LRP, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PTCH2, ROR2, Ryk, SLP-76, SIRPα, pTα, T-세포 수용체 폴리펩티드(예를 들어, TCRα 및 TCRβ), TIM3, TRIM, 및 ZAP70으로부터의 TMD를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, TMD는 CD28 TMD, CD8 TMD, CD4 TMD, CD3 TMD, CTLA4 TMD, OX40 TMD, 4-1BB TMD, CD2 TMD, 및 PD-1 TMD로부터 유래된다. 일부 구현예에서, TMD는 CD28 TMD, CD4 TMD, CD8 TMD, CD3 TMD, CTLA4 TMD, OX40 TMD, 4-1BB TMD, CD2 TMD, 및 PD-1 TMD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 SLP-76 폴리펩티드는 CD8로부터 유래된 TMD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 SLP-76 폴리펩티드는 CD8 TMD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 SLP-76 폴리펩티드는 CD28로부터 유래된 TMD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 SLP-76 폴리펩티드는 CD28 TMD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 SLP-76 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 12 또는 13과 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 TMD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 SLP-76 폴리펩티드는 CAR 또는 TCR 분자로부터 유래된 추가적인 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, SLP-76 폴리펩티드는 막횡단 도메인에 추가로 컨쥬게이션된 세포외 도메인 또는 세포외 태그를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드에서 선택적 세포외 도메인 또는 태그는 SLP-76을 세포 막에 테더링하는 것을 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드에서 선택적 세포외 도메인 또는 태그는 (예를 들어, FACS 또는 다른 면역학적 방법에 의해) SLP-76 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택적 세포외 도메인은 CAR 분자에 대한 하기 섹션에 상세히 설명되는 바와 같은 ECD일 수 있다. 일부 구현예에서, 선택적 세포외 도메인은 항원-결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 선택적 세포외 태그는 SEQ ID NO: 11 또는 39와 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 선택적 세포외 태그는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 선택적 세포외 태그는 VSV-G 폴리펩티드를 함유한다. 일부 구현예에서, 선택적 세포외 태그는 SEQ ID NO: 10과 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다. 비제한적인 메커니즘 하에, 선택적 세포외 도메인 또는 태그의 유무에 관계없이, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 표적 항원을 인식하지 않고/않거나 그 자체로 SLP-76 폴리펩티드를 발현하는 세포를 활성화시키지 않는다. 대조적으로, 이들은 표적 항원에 반응하여, 특히 항원이 저밀도로 발현될 때 내인성 또는 외인성인 또 다른 CAR 또는 TCR 분자의 활성을 향상시키고/시키거나, CAR 또는 TCR 분자를 발현하는 세포의 활성화 역치를 감소시킬 수 있다.
[0095] 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 SLP-76의 전장 또는 단편에 컨쥬게이션된 단백질 도메인 또는 어댑터 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 도메인 또는 어댑터 서열은 막 단백질과 (예를 들어, 결합을 통해) 상호작용하여, SLP-76을 막에 테더링할 수 있다.
[0096] 일부 구현예에서, SLP-76의 전장 또는 단편은 SLP-76과 막의 지방산 사이의 공유 결합을 통해 막에 테더링될 수 있다. 일부 구현예에서, SLP-76의 전장 또는 단편은 막에서 지질 극성 헤드 그룹에 대한 결합을 통해 막에 테더링될 수 있다.
[0097] 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 SLP-76의 전장 또는 단편에 컨쥬게이션된 막-결합 도메인을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 막-결합 도메인은 SLP-76을 막에 테더링할 수 있다. 예시적인 막 결합 도메인은 C1, C2, PH, FYVE, PX, ENTH, 및 BAR 도메인, 또는 내용 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Hurley Biochim Biophys Acta. 2006; 1761:805-811]에 설명된 다른 도메인을 포함할 수 있다.
[0098] 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 임의의 막 단백질 또는 막 지방산 또는 지질에 가교되거나 화학적으로 컨쥬게이션될 수 있다.
키메라 항원 수용체(CAR)
[0099] 상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 개시의 SLP-76 폴리펩티드는 표적 항원에 의해 세포(예를 들어, CAR 또는 TCR을 발현하는 T 세포와 같은 면역 세포)의 활성화를 향상시킬 수 있다. 원칙적으로, 본원에 설명된 SLP-76의 향상 기능에 적합한 CAR 분자와 관련하여 특별한 제한은 없다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 CAR 분자는 (i) 표적 항원에 대한 결합 친화성을 갖는 세포외 리간드-결합 도메인(일명, 세포외 항원-결합 도메인, 또는 ECD); (ii) 막횡단 도메인(TMD); 및 (iii) 세포내 신호전달 도메인(일명, 세포질 신호전달 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 리간드-결합 도메인에 대한 표적 항원의 결합은 CAR 폴리펩티드의 세포내 신호전달 도메인을 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 개시된 CAR은 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i)-(iii)에서 상기 열거된 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 개시된 CAR은 X-Y-Z의 형식으로 설명되며, 여기서 X는 세포외 리간드-결합 도메인에 의해 인식 가능한 리간드/항원을 나타내고, Y는 힌지/막횡단(H/TM) 도메인을 나타내고, Z는 세포내 신호전달을 나타낸다. 예를 들어, "CD19-CD28H/TM-CD28-CD3제타", "CD19-CD28TM-CD28Z" 또는 "CD19 28Z"는 CD19에 특이적으로 결합하는 세포외 리간드-결합 도메인, CD28 힌지/막횡단 도메인, CD28 세포내 영역, 및 CD3제타 세포내 신호전달 도메인을 갖는 CAR 분자를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본 출원에서 "TM" 도메인은 선택적 힌지 도메인을 갖거나 갖지 않는 TMD를 포함한다.
[00100] 일부 구현예에서, 세포에서 개시된 CAR은 하나 이상의 힌지 도메인 및/또는 공동자극 도메인을 추가로 포함한다.
[00101] 일부 구현예에서, 개시된 CAR은 CD3제타, ZAP70, PLCG1, PKC, ITK, NCK, VAV1, GRB2, GADS, SOS1, ADAP, SYK, LYN, PI3K, BLNK, 또는 이의 생물학적 활성 단편, 돌연변이체, 또는 변이체와 같은 근위 신호전달 분자를 포함하나 이에 제한되지 않는 본원에 설명된 적어도 하나의 세포내(즉, 세포질) 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 개시된 CAR은 CD3제타, ZAP70, PLCG1, PKC, ITK, NCK, VAV1, GRB2, GADS, SOS1, ADAP, SYK, LYN, PI3K, BLNK, 또는 이의 생물학적 활성 단편, 돌연변이체, 또는 변이체와 같은 근위 신호전달 분자를 포함하나 이에 제한되지 않는 본원에 설명된 하나 초과의 세포내(즉, 세포질) 신호전달 도메인을 함유한다.
세포외 리간드(항원)-결합 도메인(ECD)
[00102] 본원에 설명된 CAR 분자는 하나 이상의 표적 리간드(또는 본 출원에서 상호교환적으로 사용되는 항원)에 대한 결합 친화성을 갖는 적어도 하나의 ECD를 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 세포 표면에서 발현되거나, 그렇지 않으면 세포 표면에 고착되거나, 고정되거나, 제한된다. 적합한 표적 항원 유형의 비제한적인 예는 세포 표면 수용체, 부착 단백질, 탄수화물, 지질, 당지질, 지단백질, 및 표면-결합된 지질다당류, 인테그린, 뮤신, 및 렉틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 단백질이다. 일부 구현예에서, 항원은 탄수화물이다. 일부 구현예에서, 항원은 표적 세포(예를 들어, 암/종양 세포)에 의해 발현된다. 일부 구현예에서, 항원은 표적 세포(예를 들어, 암/종양 세포)를 특이적으로 인식하는 어댑터 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은 특정 질병, 장애, 또는 질환(예를 들어, 암/종양)에 대한 바이오마커이다. 적합한 항원의 비제한적인 예는 CD19, HER2, ROR1, B7-H3 (CD276), CD22, CD2, CD5, CD6, 4-1BB, GD2, FcγR1, 및 인테그린, 뿐만 아니라 하기의 "항원" 제목의 섹션에 설명된 것들을 포함한다.
[00103] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR 폴리펩티드의 ECD는 하나 이상의 표적 항원에 결합하는 항원-결합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 적어도 항체의 리간드-결합 도메인, 항원-결합 단편, 항체 모방체, 수용체, 또는 표적화된 수용체에 대한 리간드를 포함하는 항체 또는 이의 기능적 항원-결합 단편의 하나 이상의 항원-결합 결정인자를 포함한다. 당업자는 본 발명의 개시를 읽을 때 용어 "이의 기능적 단편" 또는 "이의 기능적 변이체"가 단편 또는 변이체가 유래되는 야생형 분자와 공통적인 정량적 및/또는 정성적 생물학적 활성을 갖는 분자를 지칭한다는 것을 용이하게 이해할 수 있다. 예를 들어, 항체의 기능적 단편 또는 기능적 변이체는 기능적 단편 또는 기능적 변이체가 유래된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 동일한 능력을 본질적으로 보유하는 것이다. 예를 들어, 세포 표면 수용체의 에피토프에 결합할 수 있는 항체는 N-말단 및/또는 C-말단에서 트렁케이션될 수 있고, 이의 에피토프 결합 활성의 보유는 당업자에게 공지된 검정을 사용하여 평가된다. 일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 항체, 모노클로날 항체, 항원-결합 단편(Fab), 나노바디, 디아바디, 트리아바디, 미니바디, F(ab')2 단편, F(ab)v 단편, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 단일 도메인 항체(sdAb), VH 도메인, VL 도메인, Fv 단편, VNAR 도메인, 및 VHH 도메인, 또는 이의 기능적 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 모방체는 아피바디(Affibody) 분자, 아필린(Affilin), 아피머(Affimer), 알파바디(Alphabody), 아비머(Avimer), DARPin, 파이노머(Fynomer), 쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩티드, 모노바디, 나노CLAMP, 및 이의 생물학적 활성 단편으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[00104] 항원-결합 모이어티는 자연 발생 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 요망되는 및/또는 개선된 특성, 예를 들어, 결합 친화성을 제공하도록 조작, 설계 또는 변형될 수 있다. 일반적으로, 표적 항원(예를 들어, CD19 항원 또는 HER2 항원)에 대한 항체 또는 항원-결합 모이어티의 결합 친화성은 문헌[Frankel et al., Mol. Immunol, 16: 101-106, 1979]에 설명된 스캐차드(Scatchard) 방법에 의해 계산될 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 친화성은 항원/항체 해리 속도에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 높은 결합 친화성은 경쟁 방사선면역검정에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 친화성은 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 친화성은 흐름세포측정법에 의해 측정될 수 있다. 표적 항원(예를 들어, CD19 또는 HER2)에 "선택적으로 결합하는" 항체는 표적 항원에 높은 친화성으로 결합하고 관련되지 않은 다른 항원에는 유의하게 결합하지 않지만, 예를 들어, 100 nM 이하, 예를 들어, 60 nM 이하, 예를 들어, 30 nM 이하, 예를 들어, 15 nM 이하, 또는 10 nM 이하, 또는 5 nM 이하, 또는 1 nM 이하, 또는 500 pM 이하, 또는 400 pM 이하, 또는 300 pM 이하, 또는 200 pM 이하, 또는 100 pM 이하의 평형 상수(KD)로 높은 친화성으로 항원에 결합하는 항체이다.
[00105] 당업자는 본 발명의 개시의 CAR 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 세포의 원하는 국소화 또는 기능에 기반하여 ECD를 선택할 수 있다. 예를 들어, HER2 항원에 특이적인 항체를 포함하는 ECD를 갖는 CAR 폴리펩티드는 HER2-발현 유방암 세포에 대해 세포를 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR 폴리펩티드의 ECD는 종양-관련 항원(TAA) 또는 종양-특이적 항원(TSA)에 결합할 수 있다. 당업자는 TAA가 종양 세포 및 정상 세포, 또는 많은 정상 세포 상에 존재하지만, 종양 세포보다 훨씬 낮은 농도로 존재하는 분자, 예를 들어, 단백질을 포함한다는 것을 이해할 수 있다. 대조적으로, TSA는 일반적으로 종양 세포에 존재하지만 정상 세포에는 없는 분자, 예를 들어, 단백질을 포함한다.
항원
[00106] 본 출원에서, 용어 "리간드(들)" 및 "항원(들)"은 이 섹션에 설명된 CAR 분자의 세포외 항원-결합 도메인에 의해 또는 하기 섹션에 설명되는 TCR 분자에 의해 특이적으로 인식되는 표적 분자(들)을 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 원칙적으로, 적합한 표적 항원과 관련하여 특별한 제한은 없다. 본 발명의 개시의 일부 구현예에서, ECD의 항원-결합 모이어티는 표적 세포에 의해 발현되거나 인식되는 항원에 존재하는 에피토프에 특이적이다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 질병 또는 장애와 상관관계가 있다. 예시적인 질병 또는 장애는, 예를 들어, 증식성 질병(예를 들어, 암), 혈액 악성종양, 고형 종양, 자가면역 질병, 염증, 알레르기 질병, 감염, 노쇠/노화 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 개시의 일부 구현예에서, CAR의 ECD의 항원-결합 모이어티는 종양 세포, 즉, 종양-관련 항원에 의해 발현되는 항원에 존재하는 에피토프에 특이적이다. 종양-관련 항원은, 예를 들어, 백혈병 세포, 신경모세포종 세포, 골육종 세포, 췌장암 세포, 결장암 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 폐암 세포, 중피종 세포, 유방암 세포, 요로상피암 세포, 간암 세포, 두경부암 세포, 육종 세포, 자궁경부암 세포, 위암(stomach cancer) 세포, 위암(gastric cancer) 세포, 흑색종 세포, 포도막 흑색종 세포, 담관암종 세포, 다발성 골수종 세포, 림프종 세포, 교모세포종 세포, 또는 본 발명의 개시에 설명된 다른 암 세포와 관련된 항원일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 조직-특이적 항원에 존재하는 에피토프에 특이적이다. 일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 질병-관련 항원에 존재하는 에피토프에 특이적이다. 종양은 종종 세포의 제어되지 않은 성장이 기관, 근육, 또는 뼈와 같은 고형 조직에서 발생할 때 암의 서브그룹을 지칭한다. 본 출원에서, 용어 "종양" 및 "암"은 달리 명시되지 않는 한 일반적으로 제어되지 않은 성장을 갖는 세포를 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
[00107] 일부 구현예에서, 항원은 CD19, HER2, ROR1, B7-H3 (CD276), CD22, GD2, CD2, CD5, CD6, 4-1BB, FcγR1, 및 인테그린으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항원은 CD19, HER2, ROR1, B7-H3 (CD276), 인플루엔자 헤마글루티닌(HA), CD22, CD2, CD5, CD6, 4-1BB, FcγR1, GD2, CD22, CD10, CD20, GPC2, GD3, GM2, GM3, 및 인테그린으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[00108] 적합한 표적 항원의 비제한적인 예는 또한 글리피칸 2(GPC2), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2/neu), CD276(B7-H3), PSMA, IL-13-수용체 알파 1, IL-13-수용체 알파 2, 알파-태아단백질(AFP), 암배아 항원(CEA), 암 항원-125(CA-125), CA19-9, 칼레티닌, MUC-1, 상피 막 단백질(EMA), 상피 종양 항원(ETA)을 포함한다. 다른 적합한 표적 항원은 티로시나제, 흑색종-관련 항원(MAGE), CD34, CD45, CD123, CD93, CD99, CD117, 크로모그라닌(chromogranin), 사이토케라틴, 데스민(desmin), 아교 원섬유 산성 단백질(GFAP), 총 낭성 질병 유체 단백질(GCDFP-15), ALK, DLK1, FAP, NY-ESO, WT1, HMB-45 항원, 단백질 멜란-A(T 림프구에 의해 인식되는 흑색종 항원; MART-1), myo-D1, 근육-특이적 액틴(MSA), 신경필라멘트, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE), 태반 알칼리성 포스파타제, 시냅토피신(synaptophysin), 티로글로불린(thyroglobulin), 갑상선 전사 인자-1, CD138, FolR1, LeY, MCSP, 및 TYRP1을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[00109] 본원에 개시된 CAR에 적합할 수 있는 추가 항원은 피루베이트 키나제 동종효소 유형 M2(종양 M2-PK)의 이량체 형태, CD19, CD20, CD5, CD7, CD3, TRBC1, TRBC2, BCMA, CD38, CD123, CD93, CD34, CD1a, SLAMF7/CS1, FLT3, CD33, CD123, TALLA-1, CSPG4, DLL3, 카파 경쇄, 람바 경쇄, CD16/FcγRIII, CD64, FITC, CD22, CD27, CD30, CD70, GD2(강글리오시드 G2), GD3, EGFRvIII(표피 성장 인자 변이체 III), EGFR 및 이의 동변체, TEM-8, 정자 단백질 17(Sp17), 및 메조텔린을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 항원의 추가의 비제한적인 예는 PAP(전립선 산 포스파타제), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 프로스테인(prostein), NKG2D, TARP(T-세포 수용체 감마 대체 리딩 프레임 단백질), Trp-p8, STEAP1(전립선의 6-막횡단 상피 항원 1), 비정상 ras 단백질, 비정상 p53 단백질, 인테그린 β3(CD61), 갈락틴, K-Ras(V-Ki-ras2 Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자), 및 Ral-B를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD19, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2/neu), CD276(B7-H3), 또는 GD-2이다.
[00110] 본원에 개시된 CAR에 적합할 수 있는 항원은 CD1a, CD1b, CD1c, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD12, CD13, CD14, CD15(SSEA-1), CD16(FcγRIII), CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32(FcγRII), CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD43, CD44, CD44V6, CD45, CD45R/B220, CD45RO, CD49b, CD49d, CD49f, CD52, CD53, CD54, CD56 (NCAM), CD57, CD61(인테그린 β3), CD62L, CD63, CD64, CD66b, CD68, CD69, CD70, CD73, CD74, CD79a(Igα), CD79b(Igβ), CD80, CD83, CD85k(ILT3), CD86, CD88, CD93(C1Rqp), CD94, CD95, CD99, CD103, CD105(엔도글린(Endoglin)), CD107a, CD107b, CD114(G-CSFR), CD115, CD117, CD122, CD123, CD129, CD133, CD134, CD138(신데칸-1), CD141, CD146, CD152(CTLA-4), CD158(Kir), CD161(NK-1.1), CD163, CD183, CD191, CD193(CCR3), CD194(CCR4), CD195(CCR5), CD197(CCR7), CD203c, CD205(DEC-205), CD207(랑게린(Langerin)), CD209(DC-SIGN), CD223, CD235, CD244(2B4), CD252(OX40L), CD267, CD268(BAFF-R), CD273(B7-DC, PD-L2), CD276(B7-H3), CD279(PD1), CD282(TLR2), CD284(TLR4), CD294, CD304(뉴로필린-1), CD305, CD314(NKG2D), CD319(CRACC), CD326, CD328(Siglec-7), CD335(NKp46), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), ADGRE2, 알파-태아단백질(AFP), ALK, BCMA, BDCA3, C3AR, 루이스 A(CA19.9), 탄산 탈수효소 IX(CA1X), 칼레티닌, 암 항원-125(CA-125), CCR1, CCR4, CDS, 암배아 항원(CEA), 크로모그라닌(chromogranin), CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염된 세포의 항원(예를 들어, 세포 표면 항원), CS-1, CSPG4, 사이토케라틴, 데스민, DLK1, DLL3, EGFRvIII(표피 성장 인자 변이체 III), EGFR 및 이의 동변체, 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 상피 당단백질2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 막 단백질(EMA), ERBB, 상피 종양 항원(ETA), FAP, 엽산-결합 단백질(FBP), FcγR1, FcεRIα, FITC, FLT3, FOLR1, FOLR3, 갈락틴(galactin), 강글리오시드, 총 낭포성 질병 유체 단백질(GCDFP-15), GD2(강글리오시드 G2), GD3, GM2, GM3, 아교 원섬유 산성 단백질(GFAP), gpA33, 당펩티드, 글리피칸 2(GPC2), 종양태아 항원(h5T4), 인플루엔자 헤마글루티닌(HA), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Her2/neu), HLA-DR, HM1.24, HMB-45 항원, HPV E6, HPV E7, ICAM-1, IgG, IgD, IgE, IgM, IL-13-수용체 알파 1, 인테그린, 인테그린 B7, 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Rα2), 카파 경쇄, 키나제 삽입 도메인 수용체(KDR), 람바 경쇄, LILRB2, 루이스 Y(LeY), LGR5, Ly49, Ly108, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), 흑색종-관련 항원(MAGE), 흑색종 항원 패밀리 A1(MAGE-A1), 단백질 멜란-A(T 림프구에 의해 인식되는 흑색종 항원; MART-1), MCSP, c-Met, MICA/B, 메조텔린, 근육-특이적 액틴(MSA), 메조텔린(MSLN), 피루베이트 키나제 동종효소 유형 M2의 이량체 형태(종양 M2-PK), 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), myo-D1, Necl-2, 뉴로필라멘트, NKCSI, NKG2D, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE), NY-ESO, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 비정상 p53 단백질, PAP(전립선 산 포스파타제), PAMA, P-카드헤린, 태반 알칼리성 포스파타제, PRAIVIE, 프로스테인, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선-특이적 막 항원(PSMA), Ral-B, K-Ras(V-Ki-ras2 Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자), 비정상 ras 단백질, ROR1, SLAMF7/CS1, 수용체 티로신-단백질 키나제 erb-B2,3,4, 정자 단백질 17(Sp17), STEAP1(전립선의 6-막횡단 상피 항원 1), 시냅토피신(synaptophysin), 종양-관련 당단백질 72(TAG-72), TALLA-1, TARP(T-세포 수용체 감마 대체 리딩 프레임 단백질), TEM-8, 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), TIM-3, TLR4, TRBC1, TRBC2, Trp-p8, 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1, TYRP1, 티로시나제, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF-R2), Vα24, 윌름즈 종양 단백질(WT-1), 및 당 분야에 공지된 다양한 병원체 항원 중 하나 또는 이의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 항원은 종양-특이적 항원(TSA) 또는 종양-관련 항원(TAA)이다.
[00111] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR 폴리펩티드는 CD19에 결합하는 항원-결합 모이어티를 포함하는 ECD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR 폴리펩티드는 HER2에 결합하는 항원-결합 모이어티를 포함하는 ECD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR 폴리펩티드는 B7-H3에 결합하는 항원-결합 모이어티를 포함하는 ECD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR 폴리펩티드는 GD2에 결합하는 항원-결합 모이어티를 포함하는 ECD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR 폴리펩티드는 CD22에 결합하는 항원-결합 모이어티를 포함하는 ECD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR 폴리펩티드는 본원에 설명된 임의의 ECD와 적어도 50% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 항원-결합 모이어티를 포함하는 ECD를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 본원에 설명된 임의의 ECD와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. 본원에서 사용되는 동일성 퍼센트는 동일하거나 특정 영역에 걸쳐 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 특정 백분율을 갖는 둘 이상의 서열 또는 서브서열을 지칭한다. 2개 이상의 서열 또는 서브서열은, 예를 들어, BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘에 의해, 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정될 때, 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 일치성을 위해 비교되고 정렬될 수 있다. 예를 들어, NCBI 웹 사이트(ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 참조한다. 이 정의는 또한 서열의 상보체를 지칭하거나 이에 적용될 수 있다. 이 정의는 또한 결실 및/또는 첨가를 갖는 서열 뿐만 아니라 치환을 갖는 서열을 포함한다. 서열 동일성은 공개된 기술 및 널리 이용 가능한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어, GCS 프로그램 패키지(Devereux et al, Nucleic Acids Res. 12:387, 1984), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul et al., J Mol Biol 215:403, 1990)를 사용하여 계산될 수 있다. 서열 동일성은 이의 디폴트 파라미터와 함께 위스콘신 대학교 생명공학 센터(University of Wisconsin Biotechnology Center)(1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705)의 유전학 컴퓨터 그룹의 서열 분석 소프트웨어 패키지와 같은 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정될 수 있다. 아미노산 치환(들)은, 예를 들어, CDR 서열(들)의 비필수 아미노산 잔기에서의 보존적 아미노산 치환일 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 원래의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것으로 이해된다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당 분야에 공지되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.
[00112] 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드의 한 가지 이점은 이들이 표적 항원에 반응하여 세포 활성화를 향상시킬 수 있다는 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 활성화는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포의 표면 상에서 발현된 CAR 또는 TCR 분자에 의해 유도된다. 추가로, SLP-76 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 설명된 막-결합된 SLP-76 폴리펩티드는 표적 항원이 저밀도로 발현될 때 세포 활성화를 향상시키고/시키거나 CAR 또는 TCR 분자를 통해 세포 활성화 역치를 감소시킬 수 있다. 본 발명의 개시의 다른 곳에서 명시되지 않는 한, 용어 "저밀도의 항원"은 일반적으로, CAR 또는 TCR 분자 및 표적 항원(예를 들어, 종양 세포에 의해 발현된 종양 항원, 또는 항원-제시 세포에 의해 제시된 종양 항원)을 발현하는 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세환경에서, 세포 당 표적 항원 분자의 양이 CAR 또는 TCR 분자를 발현하는 세포를 활성화시키는데 필요한 CAR 또는 TCR 분자의 충분한 수를(결합을 통해) 활성화시키는데 충분하지 않은 상황을 지칭한다. 표적 항원의 밀도는 항원, CAR 또는 TCR 구조, 및/또는 표적 항원을 발현하거나 제시하는 표적 세포에 따라 상대적인 용어이다. CD19의 예시적인 낮은 항원 밀도는 이의 미세환경에서 TCR 또는 CAR에 대해 약 1000개 이하의 분자(예를 들어, CAR 활성화의 경우 모든 표적 세포 또는 TCR 활성화의 경우 모든 항원-제시 세포 상의 1000개 분자)를 지칭할 수 있다. 항원에 대한 또 다른 예시적인 저밀도는 약 100개 이하 내지 약 1000만개 이하의 항원 분자를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 낮은 항원 밀도는 약 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, 100000, 150000, 200000, 250000, 300000, 350000, 400000, 450000, 500000, 550000, 600000, 650000, 700000, 750000, 800000, 850000, 900000, 950000, 1백만, 2백만, 3백만, 4백만, 5백만, 6백만, 7백만, 8백만, 9백만, 또는 1천만개 이하의 분자의 표적 항원을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 낮은 항원 밀도는 정상 또는 높은 항원 밀도(예를 들어, 야생형 표적 세포 상에서 발현된 표적 항원의 밀도)와 비교하여 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 이하, 또는 그 미만의 분자의 표적 항원을 지칭할 수 있다. 표적 항원의 밀도 또는 양은 반-정량적 FACS, 면역조직화학, 또는 다른 면역학적 방법과 같은 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. SLP-76 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 설명된 막-결합된 SLP-76 폴리펩티드는 또한 표적 항원이 정상 또는 고밀도일 때 세포 활성화를 향상시킬 수 있다. 비제한적인 예에서, 세포에서 CAR 또는 TCR 분자의 과발현은 세포 고갈을 초래할 수 있다. SLP-76 과발현은 T 세포 고갈을 악화시키지 않으면서 CAR 또는 TCR 능력을 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 상에서 발현된 CAR 또는 TCR 또는 다른 수용체 분자는 이의 표적 항원에 대해 낮은 친화성을 가질 수 있고, 따라서 이의 미세환경에 많은 표적 항원이 있는 경우에도 약한 활성화를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, SLP-76 과발현은 이러한 CAR 또는 TCR 또는 표적 항원에 대해 낮은 친화성을 갖는 다른 수용체의 능력을 향상시켜, 세포 활성화를 향상시킬 수 있다. 일부 비제한적인 구현예에서, 세포 상에서 발현된 CAR 또는 TCR 또는 다른 수용체 분자는 저밀도로 발현될 수 있고, 따라서 이의 미세환경에 많은 표적 항원이 존재하는 경우에도 세포의 약한 활성화를 초래할 수 있다. 일부 비제한적인 구현예에서, SLP-76 과발현은 이러한 CAR 또는 TCR 또는 표적 항원에 대해 낮은 친화성을 갖는 다른 수용체의 능력을 향상시켜, 세포 활성화를 향상시킬 수 있다. 일부 비제한적인 구현예에서, 질병 또는 장애와 관련된 세포(예를 들어, 암 또는 종양 또는 또 다른 표적 세포)는 낮은 수준의 항원을 발현할 수 있고(즉, 낮은 항원 밀도를 가짐), 이는 항원을 인식하는 CAR 또는 TCR 분자를 활성화시키기에는 불충분하여, 이러한 CAR 또는 TCR 분자를 사용하는 통상적인 CAR T 또는 TCR 요법이 질병 또는 장애를 치료하기에 불충분하거나 비효과적이게 만든다. 일부 비제한적인 구현예에서, SLP-76(예를 들어, 막-결합된 SLP-76 작제물) 과발현은 이러한 CAR 또는 TCR 또는 다른 수용체의 활성화 및 기능을 향상시킬 수 있고, 따라서 CAR T 또는 TCR 요법으로 질병 또는 장애를 치료할 수 있게 한다.
힌지 도메인
[00113] 상기 설명된 바와 같이, 본원에 설명된 CAR 폴리펩티드는 선택적 힌지 도메인을 가질 수 있다. 키메라 항원 수용체 내에서, 용어 "힌지 도메인"은 일반적으로 표적화 모이어티(ECD)와 TMD 사이에 배치된 유연성 폴리펩티드 커넥터 영역을 지칭한다. 이러한 서열은 일반적으로 IgG 서브클래스(예를 들어, IgG1 및 IgG4), IgD 및 CD8 도메인으로부터 유래되며, 이 중 IgG1이 가장 광범위하게 사용되었다.
[00114] 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 플랭킹 폴리펩티드 영역에 구조적 유연성을 제공한다. 힌지 도메인은 천연 또는 합성 폴리펩티드로 구성될 수 있다. 최근 몇 년 동안, 힌지 도메인에 대한 여러 연구는 주로 하기 양태에 초점을 맞추었다: (1) Fcγ 수용체에 대한 결합 친화성을 감소시켜 특정 유형의 표적외 활성화를 제거함; (2) 단일-사슬 가변 단편(scFv) 유연성을 향상시켜, 종양 항원을 표적으로 하는 특정 에피토프와 CAR의 항원-표적화 모이어티 사이의 공간적 제약을 완화시킴; (3) scFv와 표적 에피토프(들) 사이의 거리를 감소시킴; 및 (4) 항-Fc 시약을 사용하여 CAR 발현의 검출을 촉진함. 그럼에도 불구하고, CAR T 세포 생리학에 대한 힌지 도메인의 영향은 잘 이해되지 않았다.
[00115] 당업자는 힌지 도메인이 항원-결합 모이어티에 의해 인식되는 항원의 부분과 관련하여 항원-결합 모이어티의 최적 위치결정을 촉진함으로써 본원에 설명된 CAR 폴리펩티드의 기능을 개선할 수 있음을 이해할 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 최적의 CAR 활성에 필요하지 않을 수 있음이 이해될 수 있다. 일부 구현예에서, 짧은 서열의 아미노산을 갖는 유익한 힌지 도메인은, 예를 들어, 그렇지 않으면 항체 결합 동역학을 변경할 수 있는 임의의 입체 제한을 완화함으로써 항원 결합을 촉진함으로써 CAR 활성을 촉진한다. 힌지 도메인을 인코딩하는 서열은 항원 인식 모이어티와 TMD 사이에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 항원-결합 모이어티의 하류 및 TMD의 상류에 작동 가능하게 연결된다. 본원에 설명된 CAR 폴리펩티드가 선택적 힌지 도메인을 갖는 경우, 힌지 도메인 및 TMD 도메인을 설명하기 위한 포맷은 "H/TM" 또는 "H-TM"일 수 있다.
[00116] 힌지 서열은 일반적으로 임의의 적합한 분자로부터 유래되거나 획득된 임의의 모이어티 또는 서열일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 힌지 서열은 인간 CD8 분자 또는 CD28 분자 및 플랭킹 영역에 유연성을 제공하는데 유사한 기능을 제공하는 임의의 다른 수용체로부터 유래될 수 있다. 힌지 도메인은 약 4 아미노산(aa) 내지 약 50 aa, 예를 들어, 약 4 aa 내지 약 10 aa, 약 10 aa 내지 약 15 aa, 약 aa 내지 약 20 aa, 약 20 aa 내지 약 25 aa, 약 25 aa 내지 약 30 aa, 약 30 aa 내지 약 40 aa, 또는 약 40 aa 내지 약 50 aa의 길이를 가질 수 있다. 적합한 힌지 도메인은 용이하게 선택될 수 있고, 1개 아미노산(예를 들어, Gly) 내지 20 aa, 2 aa 내지 15 aa, 3 aa 내지 12 aa, 예를 들어, 4 aa 내지 10 aa, 5 aa 내지 9 aa, 6 aa 내지 8 aa, 또는 7 aa 내지 8 aa와 같은 임의의 다수의 적합한 길이일 수 있고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 aa일 수 있다. 적합한 힌지 도메인의 비제한적인 예는 CD8 힌지 도메인, CD28 힌지 도메인, CD4 힌지 도메인, PD-1 힌지 도메인, CD2 힌지 도메인, CTLA4 힌지 도메인, 또는 IgG4 힌지 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 인간 CD8α(일명 CD8a) 분자 또는 CD28 분자로부터 유래된 영역 및 플랭킹 영역에 유연성을 제공하는데 유사한 기능을 제공하는 임의의 다른 수용체를 포함할 수 있다. 추가의 예시적인 힌지 도메인은 LFA-1(CD11a/CD18), CD5, CD27(TNFRSF7), CD70, 4-1BB, OX40(CD134), ICOS(CD278), IgG1 Fc 영역, IgG2 Fc 영역, IgG3 Fc 영역, IgG4 Fc 영역, IgE Fc 영역, IgM Fc 영역, IgA Fc 영역, 또는 이들의 조합의 힌지 도메인으로부터 유래되거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 CD8 힌지 도메인으로부터 유래된 힌지 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 CD28 힌지 도메인으로부터 유래된 힌지 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD28 힌지 도메인의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 CD4 힌지 도메인으로부터 유래된 힌지 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD4 힌지 도메인의 하나 이상의 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 IgG4 힌지 도메인으로부터 유래된 힌지 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 IgG4 힌지 도메인의 하나 이상의 카피를 포함할 수 있다.
공동자극 도메인
[00117] 상기 설명된 바와 같이, 본원에 설명된 CAR 폴리펩티드는 선택적 공동자극 도메인을 가질 수 있다. 일반적으로, 본원에 개시된 CAR 폴리펩티드에 적합한 공동자극 도메인은 당 분야에 공지된 공동자극 도메인 중 어느 하나일 수 있다. 사이토카인 생산을 향상시킬 수 있는 적합한 공동자극 도메인의 예는 4-1BB(CD137), CD27, CD28, OX40(CD134)로부터 유래된 공동자극 폴리펩티드 서열, 및 공동자극 유도성 T-세포 공동-자극제(ICOS) 폴리펩티드 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 추가의 예시적인 공동자극 폴리펩티드 서열은 CD28, ICOS(CD278), CD27, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD8α, CD8β, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD18, CD19, CD19a, CD29, CD30, CD30L, CD40, CD40L (CD154), CD48, CD49a, CD49D, CD49f, CD58, CD53, ICAM-1(CD54), CD69, CD70, CD80(B7-1), CD82, CD83, CD84, CD86(B7-2), CD90, CD96, CD100, CD103, CD122, CD132, CD150(SLAMF1), CD160(BY55), CD162(DNAM1), CD223(LAG3), CD226, CD229, CD244, CD270(HVEM), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278, LAT, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), LIGHT, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80(KLRF1), B7-H2, B7-H3, CD83 리간드, PD-1, SLP-76, Toll-유사 수용체(TLR, 예를 들어, TLR2), DAP10, DAP12, LAG-3, 2B4, CARD1, CTLA-4(CD152), TRIM, ZAP70, FcERIγ, 4-1BBL, BAFF, GADS, GITR, GITR-L, BAFF-R, HVEM, CD27L, OX40L, TAC1, BLAME, CRACC, CD2F-10, NTB-A, 인테그린 α4, 인테그린 α4β1, 인테그린 α4β7, IA4, ICAM-1, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB1, ITGB2, ITGB7, KIRDS2, LTBR, PAG/Cbp, PSGL1, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAMF7, SLP-76, TNFR2, TRANCE/RANKL, VLA1, VLA-6, BTLA, ikaros, LAG-3, LMIR, CEACAM1, CRTAM, TCL1A, DAP12, TIM-1, 덱틴-1(Dectin-1), PDCD6, PD-1, TIM-4, TSLP, EphB6, TSLP-R, HLA-DR, 또는 이들의 임의의 조합의 공동자극 도메인일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다.
[00118] 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR의 공동자극 도메인은 공동자극 4-1BB(CD137) 폴리펩티드 서열, 공동자극 CD27 폴리펩티드 서열, 공동자극 CD28 폴리펩티드 서열, 공동자극 OX40(CD134) 폴리펩티드 서열, 및 공동자극 유도성 T-세포 공동-자극제(ICOS) 폴리펩티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 공동자극 4-1BB(CD137) 폴리펩티드 서열로부터 유래된 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 공동자극 4-1BB(CD137) 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 공동자극 CD28 폴리펩티드 서열로부터 유래된 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 공동자극 CD28 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 본원에 설명된 임의의 공동자극 도메인의 서열과 적어도 50% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 도메인은 본원에 설명된 임의의 공동자극 도메인의 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다.
막횡단 도메인(TMD)
[00119] 일반적으로, 본원에 개시된 CAR 폴리펩티드에 적합한 막횡단 도메인(또한 막횡단 영역으로 지칭됨)은 당 분야에 공지된 TMD 중 어느 하나일 수 있다. 이론에 국한되지 않고, TMD는 세포막을 횡단하고, CAR을 세포 표면에 고정시키고, ECD를 세포내 신호전달 도메인에 연결시켜, 세포 표면에서 CAR의 발현에 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 적합한 TMD의 예는 CD28 TMD, CD8 TMD, CD4 TMD, CD3 TMD, CTLA-4 TMD, OX40 TMD, 4-1BB TMD, CD2 TMD, 및 PD-1 TMD를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 추가의 예시적인 TMD는 CD3D, CD3E, CD3G, CD3제타, CD8a, CD8b, CD16, CD25, CD27, CD40, CD79A, CD79B, CD80, CD84, CD86, CD95, CD150 (SLAMF1), CD166, CD200R, CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD272 (BTLA), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), CD300, CD357 (GITR), A2aR, ICAM-1, 2B4, BTLA, DAP10, FcRα, FcRβ, Fyn, GAL9, IL7, IL12, IL15, KIR, KIR2DL4, KIR2DS1, LAG-3, Lck, LAT, LPA5, LRP, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2C, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PTCH2, ROR2, Ryk, SLP-76, SIRPα, pTα, T-세포 수용체 폴리펩티드(예를 들어, TCRα 및 TCRβ), TIM3, TRIM, 및 ZAP70으로부터의 TMD를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, TMD는 CD28 TMD, CD8 TMD, CD4 TMD, CD3 TMD, CTLA4 TMD, OX40 TMD, 4-1BB TMD, CD2 TMD, 및 PD-1 TMD로부터 유래된다. 일부 구현예에서, TMD는 CD28 TMD, CD4 TMD, CD8 TMD, CD3 TMD, CTLA4 TMD, OX40 TMD, 4-1BB TMD, CD2 TMD, 및 PD-1 TMD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 CD8로부터 유래된 TMD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR 폴리펩티드는 CD8 TMD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 CD28로부터 유래된 TMD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 CD28 TMD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 CD4로부터 유래된 TMD를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 CD4 TMD를 포함한다.
[00120] 본원에 설명된 바와 같은 예시적인 CAR 분자는 서로 인접한 힌지 도메인 및 TMD 도메인을 함유한다. 다양한 CAR 분자에 대한 예시적인 힌지/막횡단(H/TM 또는 힌지/TM) 도메인에 대한 서열이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR 분자는 본원에 설명된 임의의 TMD 또는 힌지-TMD와 적어도 50% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 H/TM 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR 분자는 본원에 설명된 임의의 TMD 또는 힌지-TMD와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 H/TM 도메인을 포함한다.
세포외 스페이서
[00121] 본원에 개시된 CAR은 ECD와 선택적 힌지 도메인 사이에 위치하는 하나 이상의 개재 아미노산 잔기를 포함하는 선택적 세포외 스페이서 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 ECD의 하류 및 선택적 힌지 도메인의 상류에 작동 가능하게 연결된다. 원칙적으로, 세포외 스페이서의 길이 및/또는 아미노산 조성에는 특별한 제한이 없다. 일부 구현예에서, 약 1 내지 100개의 아미노산 잔기(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 등의 아미노산 잔기)를 포함하는 임의의 단일-사슬 펩티드가 세포외 스페이서로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 스페이서는 약 5 내지 50, 약 10 내지 60, 약 20 내지 70, 약 30 내지 80, 약 40 내지 90, 약 50 내지 100, 약 60 내지 80, 약 70 내지 100, 약 30 내지 60, 약 20 내지 80, 약 30 내지 90개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 스페이서는 약 1 내지 10, 약 5 내지 15, 약 10 내지 20, 약 15 내지 25, 약 20 내지 40, 약 30 내지 50, 약 40 내지 60, 약 50 내지 70개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 스페이서는 약 40 내지 70, 약 50 내지 80, 약 60 내지 80, 약 70 내지 90, 또는 약 80 내지 100개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 스페이서는 약 1 내지 10, 약 5 내지 15, 약 10 내지 20, 약 15 내지 25개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 스페이서의 길이 및 아미노산 조성은 CAR의 요망되는 활성을 달성하기 위해 서로에 대한 ECD 및 선택적 힌지 도메인의 배향 및/또는 근접성을 변화시키도록 최적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 서로에 대한 ECD 및 선택적 힌지 도메인의 배향 및/또는 근접성은 CAR의 효능을 향상시키거나 감소시킬 "조정" 도구 또는 효과로서 변화 및/또는 최적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 서로에 대한 ECD 및 선택적 힌지 도메인의 배향 및/또는 근접성은 CAR의 완전히 기능적인 또는 부분적으로 기능적인 버전을 생성하도록 변화 및/또는 최적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 IgG4 힌지 도메인 및 IgG4 CH2-CH3 도메인에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 예시적인 세포외 스페이서 도메인은 면역글로불린 힌지 영역(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD), 면역글로불린 Fc 도메인(예를 들어, CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이들의 조합)의 전부 또는 일부, 타입 II C-렉틴의 줄기 영역(C-타입 렉틴 도메인과 막횡단 도메인 사이에 위치한 세포외 도메인)으로부터 유래되거나 이를 포함할 수 있다. 유형 II C-렉틴은, 예를 들어, CD23, CD69, CD72, CD94, NKG2A, 및 NKG2D를 포함한다. 또 다른 추가 구현예에서, 세포외 스페이서 도메인은 toll-유사 수용체(TLR) 막근접 도메인으로부터 유래되거나 이를 포함할 수 있다. TLR 막근접 도메인은 류신 풍부 반복부(LRR)와 TLR의 막횡단 도메인 사이에 있는 산성 아미노산을 함유한다. 특정 구현예에서, TLR 막근접 도메인은 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, 또는 TLR9 막근접 도메인이다.
[00122] 당업자는 본 발명의 개시의 CAR 폴리펩티드의 완전한 아미노산 서열이 역-번역된 유전자를 작제하는데 사용될 수 있음을 이해할 수 있다. 예를 들어, 제공된 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머가 합성될 수 있다. 예를 들어, 원하는 CAR 또는 항체의 일부를 코딩하는 여러 개의 작은 올리고뉴클레오티드가 합성된 다음 라이게이션될 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 어셈블리를 위해 5' 또는 3' 오버행을 함유한다.
[00123] 재조합 분자 생물학적 기술에 의해 변경된 핵산 분자의 발현을 통해 원하는 CAR을 생성하는 것 외에도, 본 발명의 개시에 따른 대상체 CAR은 화학적으로 합성될 수 있다. 화학적으로 합성된 폴리펩티드는 당업자에 의해 일상적으로 생성된다.
[00124] 일단 조립되면(합성, 재조합 방법, 부위-특이적 돌연변이유발 또는 다른 적합한 기술에 의해), 본원에 개시된 바와 같은 CAR을 인코딩하는 DNA 서열은 발현 벡터에 삽입될 수 있고, 원하는 형질전환된 숙주에서 CAR의 발현에 적절한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 적절한 조립은 뉴클레오티드 서열분석, 제한 맵핑, 및 적합한 숙주에서 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확인될 수 있다. 당 분야에 공지된 바와 같이, 숙주에서 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 획득하기 위해서는, 유전자가 선택된 발현 숙주에서 기능적인 전사 및 번역 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 해야 한다.
세포내 신호전달 도메인
[00125] 본원에 개시된 CAR은 표적 항원에 대한 ECD 결합으로부터의 신호전달을 전달하고 세포 활성화를 유도하기 위해 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
[00126] 키메라 항원 수용체(CAR) 내에서, 세포내 신호전달 도메인(일명, 세포질 신호전달 도메인)은 일반적으로 세포외 도메인이 상응하는 리간드 또는 항원에 결합한 후 CAR 분자를 발현하는 세포에 활성화 신호를 전달하는 세포질 도메인을 지칭한다. 일부 경우에, 세포내 신호전달 도메인은 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 전통적인 세포내 신호전달 도메인은 거의 항상 T 세포 활성을 유발하는 원형 "마스터 스위치(master switch)"인 CD3제타(Irving and Weiss Cell 1991;64:891-901; Letourneur and Klausner Science 1992;255:79-82) 뿐만 아니라 역가 및 지속성을 향상시키기 위한 다양한 선택적 공동자극 도메인을 포함한다.
[00127] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 근위 신호전달 분자로부터 또는 그로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 갖는 세포내 신호전달 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR은 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)가 없는 세포내 신호전달 도메인을 갖는다. 예시적인 근위 신호전달 분자는, 예를 들어, CD3제타(CD3ζ), CD3-엡실론, DAP12, ZAP70, PLCG1, PKC, ITK, NCK, VAV1, GRB2, GADS, SOS1, ADAP, SYK, LYN, PI3K, BLNK, 또는 이의 생물학적 활성 단편, 돌연변이체, 또는 변이체를 포함할 수 있다.
T-세포 수용체(TCR)
[00128] T-세포 수용체(TCR)는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 펩티드로서 항원의 단편을 인식하는 역할을 하는 T 세포, 또는 T 림프구의 표면에서 발견되는 단백질 복합체이다. TCR과 항원 펩티드 사이의 결합은 비교적 낮은 친화성을 가지며 축퇴된다. TCR은 2개의 상이한 단백질 사슬로 구성된다(즉, 이종이량체로서). 인간에서, T 세포의 95%에서 TCR은 알파(α) 사슬 및 베타(β) 사슬(각각 TRA 및 TRB에 의해 인코딩됨)로 구성되는 반면, T 세포의 5%에서 TCR은 감마 및 델타(γ/δ) 사슬(각각 TRG 및 TRD에 의해 인코딩됨)로 구성된다. 이러한 사슬 내에는 TCR이 결합할 항원을 결정하는 상보적 결정 영역(CDR)이 있다. 항원 제시 세포(APC)는 병원체를 소화하고 이들의 단편을 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 표시한다. 이 MHC/항원 복합체는 TCR에 결합하는 한편, 다른 공동-자극 분자(예를 들어, CD28)는 활성화되어 T 세포 활성화, 증식, 분화, 아폽토시스, 또는 사이토카인 방출을 초래한다. 그러나, MHC/항원 복합체는 TCR과 상호작용할 수 있는 유일한 분자는 아니다. 지질과 같은 비-펩티드 항원은 CD1의 5개 아이소형 중 일부를 통해 TCR과 상호작용할 수 있고, 여러 연구는 분자 MR1과 같은 MHC에 결합된 대사 중간체에 결합하는 TCR을 설명한다.
[00129] T 세포 기능의 자극은 MHC 클래스 I 또는 II 분자(CD8 T 세포의 경우 MHC 1 및 CD4 T 세포의 경우 MHC II)에 의해 제시된 짧은 펩티드와 TCR의 상호작용시 개시될 수 있다. 그러나, TCR 이종이량체는 그 자체로 T 세포 활성화를 개시하기 위해 하류 경로를 활성화시킬 수 없다. TCR 신호전달의 개시는 헬퍼 T 세포의 경우 CD4 및 세포독성 T 세포의 경우 CD8과 같은 공동-수용체를 필요로 한다. 이러한 공동-수용체는 이들의 각각의 MHC 분자에 결합하고 T 세포와 항원 제시 세포의 상호작용을 안정화시키는 세포 부착 분자로서 작용한다.
[00130] TCR은 또한 단백질의 CD3 패밀리(CD3δ, CD3ε, 및 CD3γ) 뿐만 아니라 TCR 제타(ζ) 사슬에 매우 근접하여 위치한다. TCR이 펩티드-MHC 복합체와 적절하게 결합되면, 관련된 CD3 사슬에서 입체형태적 변화가 유도되고, 이는 CAR 분자와의 신호전달과 유사하게, 이들의 인산화 및 근위 신호전달 분자를 통한 신호전달을 초래한다.
[00131] 상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 개시의 SLP-76 폴리펩티드는 항원-제시 세포 상의 MHC 분자에 의해 제시된 표적 항원에 반응하여 TCR(고유 또는 재조합)을 발현하는 세포(예를 들어, T 세포와 같은 면역 세포)의 활성화를 향상시킬 수 있다. 원칙적으로, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드의 향상 기능에 적합한 TCR 분자와 관련하여 특별한 제한은 없다. 비제한적인 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는, 예를 들어, 항원-제시 세포(APC)에 의해 제시된 표적 항원에 반응하여 TCR-발현 세포의 활성화를 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, SLP-76 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 설명된 막-결합된 SLP-76 폴리펩티드는 저밀도의 표적 항원에 반응하여 TCR-발현 세포를 활성화시키거나 이의 활성화를 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, TCR-발현 세포의 활성화는 세포 증식, 분화, 사이토카인 생산 및/또는 세포독성을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 입양 세포 요법(ACT)에서, 환자의 백혈구는 백혈구 성분채집술로 불리는 과정에서 수집된다. 가장 암과 싸우는 효능을 갖는 특정 T 세포의 분리는 세포의 시험관내 배양이 후속될 수 있다. 이 크게 확장된 T 세포 집단은 이후 암에 대항하여 작용하기 위해 환자에게 재주입될 수 있다. 일부 구현예에서, SLP-76 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 설명된 막-결합된 SLP-76 폴리펩티드는 표적 항원이 항원-제시 세포 상에서 저밀도로 발현되는 경우에도 제시된 표적 항원(예를 들어, 종양 항원)에 반응하여 TCR-발현 세포를 활성화시키거나 이의 활성화 및/또는 증식을 향상시킬 수 있다. 따라서, 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드는 표적 항원(예를 들어, 종양 항원)에 대한 특이성 및/또는 역가로 TCR-발현 세포의 증식 및/또는 분리를 선택적으로 향상시키는데 사용될 수 있다.
키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T-세포 수용체(TCR)에 대한 돌연변이
[00132] 다중 돌연변이는 본 발명의 개시의 CAR 또는 TCR 폴리펩티드에 도입될 수 있다. 돌연변이는 적어도 치환, 결실, 삽입, 또는 당 분야에 공지된 다른 방법을 포함한다. 돌연변이의 목적은, 예를 들어, CAR 또는 TCR 폴리펩티드의 역가를 향상시키고, CAR 또는 TCR 폴리펩티드의 안정성(예를 들어, 반감기)을 향상시키고, CAR 또는 TCR 폴리펩티드의 발현을 향상시키고, CAR 또는 TCR 폴리펩티드의 용해도를 향상시키고/시키거나 응집을 감소시키고, 발현 동안 CAR 또는 TCR 폴리펩티드의 변형을 조작하고, CAR 또는 TCR 폴리펩티드의 이의 결합 파트너(들)에 대한 결합을 조작하고, CAR 또는 TCR 폴리펩티드의 정제를 향상시키고, CAR 또는 TCR 폴리펩티드의 유비퀴틴화 및/또는 분해를 감소시키는 등을 포함할 수 있다.
핵산 분자
[00133] 일 양태에서, 숙주 세포 또는 생체외 무세포 발현 시스템에서 SLP-76 폴리펩티드, CAR 폴리펩티드, 또는 TCR 폴리펩티드의 생체 내 발현을 가능하게 하는 이종성 핵산 서열, 예를 들어, 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 개시의 SLP-76 폴리펩티드, CAR 폴리펩티드, 또는 TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 핵산 분자를 함유하는 발현 카세트 및 발현 벡터를 포함하는, 본 발명의 개시의 SLP-76 폴리펩티드, CAR 폴리펩티드, 또는 TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 다양한 핵산 분자가 본원에 제공된다.
[00134] 본 발명의 개시의 핵산 분자는 일반적으로 약 0.5 Kb 내지 약 50 Kb, 예를 들어, 약 0.5 Kb 내지 약 20 Kb, 약 1 Kb 내지 약 15 Kb, 약 2 Kb 내지 약 10 Kb, 또는 약 5 Kb 내지 약 25 Kb, 예를 들어, 약 10 Kb 내지 15 Kb, 약 15 Kb 내지 약 20 Kb, 약 5 Kb 내지 약 20 Kb, 약 5 Kb 내지 약 10 Kb, 또는 약 10 Kb 내지 약 25 Kb인 핵산 분자를 포함하는 임의의 길이의 핵산 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 핵산 분자는 약 1.5 Kb 내지 약 50 Kb, 약 5 Kb 내지 약 40 Kb, 약 5 Kb 내지 약 30 Kb, 약 5 Kb 내지 약 20 Kb, 또는 약 10 Kb 내지 약 50 Kb, 예를 들어, 약 15 Kb 내지 30 Kb, 약 20 Kb 내지 약 50 Kb, 약 20 Kb 내지 약 40 Kb, 약 5 Kb 내지 약 25 Kb, 또는 약 30 Kb 내지 약 50Kb이다.
[00135] 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 SLP-76 폴리펩티드, CAR 폴리펩티드, 또는 TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
[00136] 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 2개의 재조합 핵산을 가지며, 각각은 조합을 형성하기 위해 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드 및 본원에 설명된 CAR 또는 TCR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 적어도 2개의 재조합 핵산은 함께 컨쥬게이션된다. 일부 구현예에서, 이러한 적어도 2개의 재조합 핵산은 재조합 핵산의 단일 사슬에 있다.
[00137] 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 SEQ ID NO: 1, 7, 14, 16, 18, 19, 40, 59 또는 60으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 SEQ ID NO: 1, 7, 14, 16, 18, 19, 40, 59 또는 60으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 SEQ ID NO: 20, 26, 33, 35, 37, 38, 42, 61 및 62로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 SEQ ID NO: 20, 26, 33, 35, 37, 38, 42, 61 및 62로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
[00138] 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다.
[00139] 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 발현 카세트 또는 벡터로서 추가로 정의된다. 발현 카세트는 일반적으로 생체내 및/또는 생체외에서 수용자 세포에서 코딩 서열의 적절한 전사 및/또는 번역을 지시하기에 충분한 조절 정보 및 코딩 서열을 함유하는 유전 물질의 작제물을 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 일반적으로, 발현 카세트는 원하는 숙주 세포 및/또는 개체로의 표적화를 위해 벡터에 삽입될 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 발현 카세트는 발현 조절 요소, 예를 들어, 프로모터, 및 선택적으로, 코딩 서열의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 임의의 다른 서열 또는 다른 핵산 서열의 조합에 작동 가능하게 연결된 본원에 개시된 바와 같은 SLP-76, CAR, 또는 TCR 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다.
[00140] 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 발현 벡터에 혼입된다. 용어 "벡터"는 일반적으로 숙주 세포 사이의 전달을 위해 설계된 재조합 폴리뉴클레오티드 작제물을 지칭하며, 형질전환, 예를 들어, 이종성 DNA의 숙주 세포로의 도입의 목적을 위해 사용될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드, 파지, 또는 코스미드와 같은 레플리콘일 수 있고, 여기에 삽입된 세그먼트의 복제를 야기하기 위해 또 다른 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 통합 벡터일 수 있다.
[00141] 일부 구현예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는 일반적으로 핵산 분자의 전달 또는 세포의 유전체 또는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 입자로의 통합을 촉진하는 바이러스-유래 핵산 요소를 포함하는 핵산 분자(예를 들어, 전달 플라스미드)를 지칭하기 위해 널리 사용된다. 바이러스 입자는 일반적으로 핵산(들) 외에 다양한 바이러스 성분 및 때때로 또한 숙주 세포 성분을 포함한다. 용어 바이러스 벡터는 핵산을 세포 내로 전달할 수 있는 바이러스 또는 바이러스 입자 또는 전달된 핵산 자체를 지칭할 수 있다. 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드는 주로 바이러스로부터 유래된 구조적 및/또는 기능적 유전 요소를 함유한다. 일부 구현예에서, 벡터는 렌티바이러스, 아데노 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 배큘로바이러스, 또는 레트로바이러스로부터 유래된 벡터이다. 용어 "레트로바이러스 벡터"는 주로 레트로바이러스로부터 유래된 구조적 및 기능적 유전적 요소, 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다. 용어 "렌티바이러스 벡터"는 레트로바이러스의 속인 렌티바이러스로부터 주로 유래된 LTR을 포함하는, 구조적 및 기능적 유전 요소, 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 지칭한다.
[00142] 일부 구현예에서, CAR, TCR, 또는 본원에 개시된 또 다른 수용체 폴리펩티드와 적어도 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자가 본원에 제공된다.
[00143] CAR 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 관심 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 서열의 G-C 함량은 숙주 세포에서 발현된 공지된 유전자를 참조하여 계산된 바와 같이 제공된 세포 숙주에 대한 평균 수준으로 조정될 수 있다. 코돈 사용 최적화 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 본원에 개시된 키메라 수용체의 코딩 서열 내의 코돈 사용은 숙주 세포에서 발현을 향상시키도록 최적화될 수 있어, 코딩 서열 내의 코돈의 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 75%, 또는 최대 100%가 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화되었다.
[00144] 제공된 핵산 분자는 자연 발생 서열, 또는 자연 발생 서열과 상이하지만, 유전 코드의 축퇴성으로 인해 동일한 폴리펩티드, 예를 들어, ECD에 대한 항체를 인코딩하는 서열을 함유할 수 있다. 이러한 핵산 분자는 RNA 또는 DNA(예를 들어, 유전체 DNA, cDNA, 또는 포스포라미다이트-기반 합성에 의해 생산된 것과 같은 합성 DNA), 또는 이러한 유형의 핵산 내의 뉴클레오티드의 조합 또는 변형으로 구성될 수 있다. 또한, 핵산 분자는 이중-가닥 또는 단일-가닥(예를 들어, 센스 또는 안티센스 가닥)일 수 있다.
[00145] 핵산 분자는 폴리펩티드(예를 들어, ECD에 대한 항체)를 인코딩하는 서열로 제한되지 않으며; 코딩 서열(예를 들어, 키메라 수용체의 코딩 서열)의 상류 또는 하류에 있는 비-코딩 서열의 일부 또는 모두가 또한 포함될 수 있다. 분자 생물학 분야의 당업자는 핵산 분자를 분리하기 위한 일상적인 절차에 익숙하다. 이들은, 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제로 유전체 DNA를 처리함으로써, 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 수행에 의해 생성될 수 있다. 핵산 분자가 리보핵산(RNA)인 경우, 분자는, 예를 들어, 시험관내 전사에 의해 생산될 수 있다.
재조합 세포 및 세포 배양
[00146] 본 발명의 개시의 핵산 분자는, 예를 들어, T 세포를 포함하는 면역 세포와 같은 세포(즉, 숙주 세포)로 도입되어 핵산 분자를 함유하는 재조합 세포를 생산할 수 있다. 원칙적으로, 본 발명의 개시의 핵산 분자를 발현시키기에 적합한 세포와 관련하여 특별한 제한은 없다. 따라서, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 (a) 단백질 발현이 가능한 숙주 세포를 제공하는 단계; 및 제공된 숙주 세포에 본 발명의 개시의 재조합 핵산을 형질도입시켜 재조합 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 재조합 세포를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 개시의 핵산 분자의 세포 내로의 도입은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, 바이러스 감염, 형질감염, 컨쥬게이션, 원형질체 융합, 리포펙션, 전기천공, 뉴클레오펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리에틸렌이민(PEI)-매개 형질감염, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포솜-매개 형질감염, 입자 총 기술, 칼슘 포스페이트 침전, 직접 미세주입, 나노입자-매개 핵산 전달 등에 의해 달성될 수 있다.
[00147] 일 양태에서, 본 발명의 개시는 상승된 수준의 SLP-76 폴리펩티드를 과발현하고/하거나 이를 함유하도록 변형된 분리된 재조합 세포를 갖는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 저밀도로 발현된 표적 항원에 의해 활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드를 발현하는 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 본원에 설명된 SLP-76 폴리펩티드를 발현하고 이전 섹션에 설명된 바와 같은 CAR 또는 TCR을 추가로 발현하는 세포이다. 예를 들어, SLP-76 작제물은 CAR 또는 TCR을 발현하거나 발현하지 않는 세포에 도입되어 SLP-76을 과발현하는(또는 CAR 또는 TCR을 추가로 과발현하는) 재조합 세포를 생산하고, 이에 따라 근위 신호전달의 촉진 및/또는 세포를 활성화시키는 CAR 또는 TCR 능력의 향상을 통해 세포 활성화를 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 CAR 또는 TCR을 발현하는 세포이다. 일부 구현예에서, SLP-76 작제물은 SLP-76을 과발현시키기 위해 CAR 또는 TCR을 발현하는 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 CAR 또는 TCR을 발현하지 않는 세포이다. 일부 구현예에서, SLP-76 작제물은 CAR 또는 TCR을 발현하지 않는 세포 내로 도입되어 세포 활성화를 향상시킬 수 있다. 비제한적인 구현예에서, SLP-76 작제물은 세포에서 근위 신호전달을 촉진함으로써 CAR 또는 TCR을 발현하지 않는 세포의 활성화를 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, CAR 또는 TCR을 발현하지 않는 세포는 NK 세포이다. 일부 구현예에서, SLP-76 작제물은 CAR 또는 TCR 작제물과 조합하여 (순차적으로 또는 함께) CAR 또는 TCR을 발현하지 않는 세포에 도입되어 SLP-76 및 CAR 또는 TCR을 과발현하는 재조합 세포를 생산하고, 따라서, 세포를 활성화시키는 CAR 또는 TCR 능력을 향상시킬 수 있다. 비제한적인 구현예에서, SLP-76은 과발현을 위해 고유 숙주 세포 또는 재조합 세포에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, SLP-76은 고유 숙주 세포 또는 고유 또는 내인성 TCR을 발현하는 재조합 세포에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 과발현된 SLP-76은 고유 또는 내인성 TCR을 통해 세포 활성화를 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, SLP-76은 재조합 TCR 또는 CAR을 발현하는 재조합 세포에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 과발현된 SLP-76은 재조합 TCR 또는 CAR을 통해 세포 활성화를 향상시킬 수 있다.
[00148] 따라서, 일부 구현예에서, 핵산 분자는 당 분야에 공지된 바이러스 또는 비-바이러스 전달 비히클에 의해 숙주 세포로 도입되어 조작된 세포를 생산할 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 숙주 유전체에 안정적으로 통합될 수 있거나, 에피솜으로 복제할 수 있거나, 안정하거나 일시적인 발현을 위해 미니-서클 발현 벡터로서 재조합 숙주 세포에 존재할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 일부 구현예에서, 핵산 분자는 에피솜 단위로서 재조합 숙주 세포에서 유지되고 복제된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 재조합 세포의 유전체에 안정적으로 통합된다. 안정한 통합은 고전적인 무작위 유전체 재조합 기술을 사용하거나 아연-핑거 단백질(ZNF), 가이드 RNA 지시된 CRISPR/Cas9, DNA-가이드된 엔도뉴클레아제 유전체 편집 NgAgo(나트로노박테리움 그레고리이 아르고나우트(Natronobacterium gregoryi Argonaute)), 또는 TALEN 유전체 편집(전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제)을 사용하는 것과 같은 보다 정밀한 유전체 편집 기술로 완료될 수 있다.
[00149] 핵산 분자는 바이러스 캡시드 또는 지질 나노입자에 캡슐화될 수 있거나, 전기천공과 같은 당 분야에 공지된 바이러스 또는 비-바이러스 전달 수단 및 방법에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 세포 내로 핵산의 도입은 바이러스 형질도입에 의해 달성될 수 있다. 비제한적인 예에서, 배큘로바이러스 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스(AAV)는 바이러스 형질도입을 통해 표적 세포에 핵산을 전달하도록 조작될 수 있다. 여러 AAV 혈청형이 설명되었으며, 모든 공지된 혈청형은 다수의 다양한 조직 유형으로부터의 세포를 감염시킬 수 있다. AAV는 독성의 증거 없이 생체내에서 광범위한 종 및 조직을 형질도입할 수 있고, 비교적 온화한 선천성 및 적응성 면역 반응을 생성한다.
[00150] 렌티바이러스-유래 벡터 시스템은 또한 바이러스 형질도입을 통한 핵산 전달 및 유전자 요법에 유용하다. 렌티바이러스 벡터는 (i) 숙주 유전체로의 안정적인 벡터 통합을 통한 지속적인 유전자 전달; (ii) 분열 세포 및 비분열 세포 둘 모두를 감염시키는 능력; (iii) 중요한 유전자- 및 세포-요법-표적 세포 유형을 포함하는 광범위한 조직 친화성; (iv) 벡터 형질도입 후 바이러스 단백질의 발현 없음; (v) 폴리시스트론 또는 인트론-함유 서열과 같은 복잡한 유전 요소를 전달하는 능력; (vi) 잠재적으로 더 안전한 통합 부위 프로파일; 및 (vii) 벡터 조작 및 생산을 위한 비교적 쉬운 시스템을 포함하는 유전자-전달 비히클로서 여러 매력적인 특성을 제공한다.
[00151] 일부 구현예에서, 숙주 세포는, 예를 들어, 바이러스 벡터 또는 숙주 세포의 유전체의 일부에 상동성인 핵산 서열을 포함하는 상동성 재조합을 위한 벡터일 수 있거나, 관심 SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 벡터일 수 있는 본 출원의 벡터 작제물로 유전적으로 조작(예를 들어, 형질도입되거나 형질전환되거나 형질감염)될 수 있다.
[00152] 일부 구현예에서, 재조합 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 생체내 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 생체외 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 시험관내 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 마우스 세포이다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 비-인간 영장류 세포이다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 면역계 세포, 예를 들어, B 세포, 단핵구, NK 세포, 종양-침윤 림프구(TIL), 자연 살해 T(NKT) 세포, 호염기구, 호산구, 호중구, 수지상 세포, 대식세포, 조절 T 세포(Treg), 헬퍼 T 세포(TH), 세포독성 T 세포(TCTL), 기억 T 세포, 감마 델타(γδ) T 세포, 또 다른 T 세포, 줄기 세포(예를 들어, 조혈 줄기 세포), 줄기 세포 전구체(예를 들어, 조혈 줄기 세포 전구체), 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)-유래 NK 세포, 또는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)- 유래 T 세포이다.
[00153] 일부 구현예에서, 면역계 세포는 림프구이다. 일부 구현예에서, 림프구는 T 림프구이다. 일부 구현예에서, 림프구는 T 림프구 전구체이다. 일부 구현예에서, T 림프구는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, T 림프구는 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 본원에 개시된 조성물 및 방법에 적합한 CD8+ T 세포독성 림프구 세포의 비제한적인 예는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 효과기 기억 CD8+ T 세포, 효과기 CD8+ T 세포, CD8+ 줄기 기억 T 세포, 및 벌크 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, T 림프구는 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 적합한 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 효과기 기억 CD4+ T 세포, 효과기 CD4+ T 세포, CD4+ 줄기 기억 T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[00154] 일부 구현예에서, 본원에 설명된 세포는 비-면역계 세포이다. 예를 들어, 본원에 설명된 SLP-76, CAR, 또는 TCR 분자는 상응하는 세포외 리간드(들)/항원(들)을 인식할 때, 이러한 분자를 발현하는 세포의 활성을 조절하는(예를 들어, 활성화하는) 방법을 제공한다. 이러한 의미에서, 적합한 숙주 세포와 관련하여 특별한 제한은 없다.
[00155] 본원에 설명된 세포는 임의의 유형의 천연 또는 인공 세포 및/또는 임의의 기원일 수 있다. 원칙적으로, 사람들이 활성화를 연구하고자 하는 임의의 유형의 세포는 본원에 설명된 SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 설명된 질병을 예방 또는 치료하기 위해, 질병과 상관된 표적 세포에 대해 세포독성 또는 다른 억제 기능(예를 들어, 사이토카인을 생산하고 분비하는 기능)을 갖는 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어, T 세포와 같은 면역 세포는 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있는데, 이는 세포가 종양 항원을 발현하는 종양 세포에 대한 직접적인 세포독성 능력을 가질 수 있고/있거나 세포가 표적 세포(예를 들어, 종양 세포)를 억제하거나 사멸시키기 위한 적어도 하나의 사이토카인을 생산할 수 있기 때문이다.
[00156] 상기 약술된 바와 같이, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 (a) 단백질 발현이 가능한 숙주 세포를 제공하는 단계; 및 제공된 숙주 세포에 본 발명의 개시의 재조합 핵산을 형질도입시켜 재조합 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 재조합 세포를 제조하기 위한 다양한 방법에 관한 것이다. 재조합 세포를 제조하기 위한 개시된 방법의 비제한적인 예시적인 구현예는 하기 특징 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 대상체로부터 획득된 샘플에 대해 수행된 백혈구 성분채집술에 의해 획득되고, 세포는 생체외에서 형질도입된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 바이러스 캡시드 또는 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 생산된 세포를 분리 및/또는 정제하는 것을 추가로 포함한다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 재조합 세포는 또한 본 발명의 개시의 범위 내에 있다.
[00157] 광범위한 상기 언급된 숙주 세포 및 종을 형질전환시키는 기술은 당 분야에 공지되어 있으며 기술 및 과학 문헌에 설명되어 있다. 예를 들어, DNA 벡터는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 세포를 형질전환시키거나 형질감염시키기 위한 적합한 방법, 예를 들어, 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 형질감염, 미세주사, 양이온성 지질-매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 스크래프 로딩(scrape loading), 탄도 도입, 핵천공, 유체역학적 쇼크, 및 감염은 문헌[Sambrook et al. (2012, 상기)] 및 다른 표준 분자 생물학 실험실 매뉴얼에서 발견될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 형질도입 절차, 전기천공 절차, 또는 바이오리스틱(biolistic) 절차에 의해 숙주 세포로 도입된다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포를 포함하는 세포 배양물도 또한 본 출원의 범위 내에 있다. 세포 배양물을 생성하고 유지하는데 적합한 방법 및 시스템은 당 분야에 공지되어 있다.
[00158] 일부 구현예에서, 재조합 세포는 본원에 개시된 SLP-76 폴리펩티드와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 SLP-76 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 SEQ ID NO: 1, 7, 14, 16, 18, 19, 40, 59 또는 60 중 어느 하나와 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 SEQ ID NO: 20, 26, 33, 35, 37, 38, 42, 61 및 62 중 어느 하나와 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 핵산 분자를 함유한다.
[00159] 관련된 양태에서, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포, 및 배양 배지를 포함하는 세포 배양물에 관한 것이다. 일반적으로, 배양 배지는 본원에 설명된 세포 배양에 적합한 배양 배지 중 어느 하나일 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 세포는 본원에 설명된 SLP-76, CAR, 또는 TCR을 발현한다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 세포를 포함하는 세포 배양물도 또한 본 출원의 범위 내에 있다. 세포 배양물을 생성하고 유지하는데 적합한 방법 및 시스템은 당 분야에 공지되어 있다.
약학적 조성물
[00160] 본 발명의 개시의 SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드, 핵산, 재조합 세포, 및/또는 세포 배양물은 약학적 조성물을 포함하는 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 본원에 설명된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산, 재조합 세포, 및/또는 세포 배양물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 건강 상태, 예를 들어, 증식성 질병(예를 들어, 암)을 치료, 예방, 개선, 감소 또는 개시의 지연을 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 다른 예시적인 건강 상태는, 예를 들어, 혈액 악성종양, 고형 종양, 자가면역 질병, 염증, 알레르기 질병, 감염, 노쇠/노화 등을 포함한다.
[00161] 따라서, 본 발명의 개시의 일 양태는 약학적으로 허용되는 담체 및 (a) 본 발명의 개시의 SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드; (b) 본 발명의 개시의 핵산 분자; 및/또는 (c) 본 발명의 개시의 재조합 세포 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 조성물은 (a) 본 발명의 개시의 재조합 핵산 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 바이러스 캡시드 또는 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 (a) 본 발명의 개시의 재조합 세포 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
[00162] 특정 구현예에서, 본원에 개시된 일부 구현예에 따른 약학적 조성물은 이를 필요로 하는 개체에게 투여하기 전에 세척, 치료, 조합, 보충, 또는 달리 변경될 수 있는 세포 배양물을 포함한다. 또한, 투여는 다양한 용량, 시간 간격 또는 다중 투여의 투여일 수 있다.
[00163] 본원에서 제공되는 약학적 조성물은 조성물이 개체에게 투여될 수 있도록 하는 임의의 형태일 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 인간 투여에 적합하다. 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 동물, 및 보다 특히 인간에서의 사용에 대해 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것을 의미한다. 담체는 약학적 조성물과 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트, 부형제, 또는 비히클일 수 있다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 주사 가능한 용액을 포함하는 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소듐 클로라이드, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 적합한 약학적 담체의 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin]에 설명되어 있다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 개체로의 투여를 위해 멸균 제형화된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다. 당업자는 제형이 투여 방식에 적합해야 함을 이해할 수 있다.
[00164] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 약학적 조성물은 개체에 대한 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 예를 들어, 약학적 조성물은 비경구, 복강내, 결장직장, 복강내, 및 종양내 투여에 적합하도록 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 정맥내, 경구, 복강내, 기관내, 피하, 근육내, 국소, 또는 종양내 투여를 위해 제형화될 수 있다.
조성물의 사용
[00165] 본원에 설명된 조성물, 예를 들어, SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드, 핵산, 재조합 세포, 세포 배양물, 및/또는 약학적 조성물은 세포외 신호( 예를 들어, 리간드/항원)에 반응하는 시스템으로서 다양한 조건에 사용될 수 있다.
[00166] 본원에 설명된 조성물은 또한 특정 리간드/항원에 반응하여 세포 기능을 조작하기 위한 활성화 시스템으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR 또는 TCR 분자의 ECD(들)로 특정 리간드/항원 또는 리간드/항원의 특정 프로파일을 감지함으로써, 숙주가 활성화된다. 이러한 활성화는 숙주 세포의 정상적인 생물학적 기능을 향상시키거나 억제하고/거나 세포 기능을 조작하기 위한 외인성 신호전달 기능을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76 조성물은 CAR 또는 TCR 분자를 통해 이러한 활성화를 향상시킬 수 있다.
[00167] 본원에 설명된 조성물은 또한 특정 리간드/항원에 반응하여 세포의 기능을 조작하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR 또는 TCR 분자의 ECD(들)로 특정 리간드/항원을 감지함으로써, 숙주 세포가 활성화된다. 이러한 활성화는 이러한 리간드(들)/항원(들)을 발현하거나 특정 리간드(들)/항원(들)에 의해 특이적으로 인식되는 표적 세포의 기능을 변화시키기 위해 숙주 세포의 기능을 향상시키거나 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76 조성물은 CAR 또는 TCR 분자를 통해 이러한 활성화를 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 특정 리간드(들)/항원(들)을 발현하는 암 세포는 암 세포의 표면 상의 리간드(들)/항원(들)에 결합하거나, 암 세포에서 발현되는 리간드(들)/항원(들)에 특이적으로 결합하는 일부 리간드(들)/항원(들)에 결합하는 ECD를 통해 본원에 설명된 CAR 분자(들) 또는 CAR 분자 조합(들)에 의해 인식될 수 있다. 활성화된 숙주 세포는 이후 암 세포의 기능을 조작할 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 조성물은 (예를 들어, 사이토카인을 분비하거나 사멸을 지시함으로써) 암 세포를 억제하거나 사멸시키기 위해 숙주 세포(예를 들어, 면역계 세포, 예를 들어, T 세포)를 활성화시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 암 세포는 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 획득된다. 일부 구현예에서, 이러한 암 세포는 대상체의 생물학적 환경(예를 들어, 암 미세환경)에 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 질병 또는 장애와 상관관계가 있다. 예시적인 질병 또는 장애는, 예를 들어, 증식성 질병(예를 들어, 암), 혈액 악성종양, 고형 종양, 자가면역 질병, 염증, 알레르기 질병, 감염, 노쇠/노화 등을 포함할 수 있다.
제조 방법
[00168] 일 양태에서, 본 발명의 개시는 본원에 설명된 바와 같은 재조합 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 본원에 설명된 조성물, 예를 들어, SLP-75, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드 또는 핵산은 본원에 설명된 바와 같이 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, SLP-76 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 단독으로 또는 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 조합하여 세포에 도입될 수 있다.
치료 방법
[00169] 일 양태에서, 본 발명의 개시는 세포에서 SLP-76 폴리펩티드를 과발현시키는 것을 포함하는, 표적 항원에 반응한 세포의 활성화를 향상시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 TCR 및/또는 CAR 분자를 추가로 포함한다.
[00170] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 SLP-76 폴리펩티드 및 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 세포에서 과발현시키는 것을 포함하는, 표적 항원에 반응한 세포의 활성화를 향상시키는 방법을 제공한다.
[00171] 또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 약학적 유효량의 재조합 세포, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 또는 본원에 설명된 다른 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에 설명된 치료 조성물 중 어느 하나, 예를 들어, SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드, 핵산, 재조합 세포, 세포 배양물, 및/또는 약학적 조성물의 투여는 관련 질환, 예를 들어, 증식성 질병(예를 들어, 암), 혈액 악성종양, 고형 종양, 자가면역 질병, 염증, 알레르기 질병, 감염, 노쇠/노화 등의 진단, 예방, 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 바와 같은 SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드, 핵산, 재조합 세포, 세포 배양물, 및/또는 약학적 조성물은 하나 이상의 건강 상태, 예를 들어, 증식성 질병(예를 들어, 암, 예를 들어, 백혈병, 신경모세포종, 또는 골육종)을 갖고 있거나, 가질 것으로 의심되거나, 이들의 발병 위험이 높을 수 있는 개체를 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 요법 및 치료제에 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, 개체는 의사의 관리 하에 있는 환자이다.
[00172] 예시적인 증식성 질병은 혈관형성 질병, 전이성 질병, 종양형성 질병, 신생물성 질병 및 암을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 증식성 질병은 암이다. 일부 구현예에서, 암은 소아암이다. 일부 구현예에서, 암은 췌장암, 결장암, 난소암, 전립선암, 폐암, 중피종, 유방암, 요로상피암, 간암, 두경부암, 육종, 자궁경부암, 위암(stomach cancer), 위암(gastric cancer), 흑색종, 포도막 흑색종, 담관암종, 다발성 골수종, 백혈병, 림프종, 혈액암, 방광암, 신경모세포종, 악성 흉막 중피종, 육종, 및 교모세포종이다. 예시적인 암 유형은 또한 급성 골수성 백혈병, 혈관면역모세포 T-세포 림프종, B-세포 급성 림프모구 백혈병, 스위트 증후군, T-세포 비-호지킨 림프종(자연 살해/T-세포 림프종, 성인 T-세포 백혈병/림프종, 장병증 유형 T-세포 림프종, 간비장 T-세포 림프종 및 피부 T-세포 림프종 포함), T-세포 급성 림프모구 백혈병, B-세포 비-호지킨 림프종(버킷 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 소포 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종 등 포함), 털 세포 백혈병, 호지킨 림프종, 림프모구 림프종, 림프형질세포 림프종, 점막-관련 림프 조직 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 형질 세포 골수종, 원발성 종격동 거대 B-세포 림프종, 만성 골수증식성 장애(예를 들어, 만성 골수성 백혈병, 원발성 골수섬유증, 본태성 혈소판증가증, 진성 다혈구증가증) 및 만성 림프구성 백혈병을 포함한다. 예시적인 암 유형은 또한 급성 림프모구 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 부신피질 암종, AIDS-관련 암, 카포시 육종(연조직 육종), AIDS-관련 림프종, 원발성 CNS 림프종, 항문암, 맹장암, 성상세포종, 소아 뇌암, 비정형 기형/횡문근종 종양, 중추신경계암, 피부암(예를 들어, 기저세포암종), 담관암, 방광암, 골암(유잉 육종, 골육종 및 악성 섬유성 조직구종 포함), 뇌종양, 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 비-호지킨 림프종, 카르시노이드 종양, 심장(열) 종양, 수모세포종 및 기타 CNS 배아 종양, 생식세포 종양, 원발성 CNS 림프종, 자궁경부암, 소아암, 담관암종, 척색종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 골수 증식성 신생물, 결장직장암, 두개인두종, 피부 T-세포 림프종, 균상 식육종, 세자리 증후군, 상피내관암종(DCIS), 배아 종양, 수모세포종, 자궁내막암(자궁암), 상의세포종, 식도암, 감각신경모세포종(두경부암), 유잉 육종, 두개외 생식세포 종양, 소아 생식선외 생식세포 종양, 눈암, 안구내 흑색종, 망막모세포종, 나팔관암, 골육종, 담낭암, 위(위)암, 위장 유암종 종양, 위장 기질 종양(GIST)(연조직 육종), 생식 세포 종양, 생식선외 생식 세포 종양, 난소 생식 세포 종양, 고환암, 임신성 융모성 질환, 털 세포 백혈병, 두경부암, 심장 종양, 소아 간세포(간)암, 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암(두경부암), 안내 흑색종, 섬세포 종양, 췌장 신경내분비 종양, 신장(신장 세포)암, 랑게르한스 세포 조직구증가증, 후두암, 백혈병, 입술 및 구강암, 간암, 폐암(예를 들어, 비소세포암, 소세포암, 흉막폐 모세포종 및 기관지 종양), 림프종, 남성 유방암, 뼈의 악성 섬유성 조직구종 및 골육종, 흑색종, 안내 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 전이성 암, 잠복 원발성을 동반한 전이성 편평경부암, 정중선 암종, 구강암, 다발 내분비 신생물 증후군, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상식육종(림프종), 골수이형성증후군, 골수이형성/골수증식성 신생물, 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 신생물, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 비소세포폐암, 구강암, 입술 및 구강암 및 구강인두암, 골육종, 미분화 다형성 육종, 난소암, 췌장암, 췌장 신경내분비종양(섬 세포 종양), 유두종증(소년 후두종증), 부신경절종, 부비동 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 뇌하수체종양, 형질세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종(폐암), 임신 및 유방암, 원발성 중추신경계(CNS) 림프종, 원발성 복막암 전립선암, 직장암, 재발암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종, 소아 횡문근육종, 소아 혈관종양, 연조직 육종, 자궁 육종, 세자리 증후군, 피부암, 소세포폐암 소장암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 잠복 원발성을 동반한 편평 경부암, 위(위)암, T 세포 림프종, 고환암, 인후암, 비인두암, 구강인두암, 하인두암, 흉선종 및 흉선암종, 갑상선암, 기관지 종양, 신우 및 요관의 이행세포암, 요관 및 신우암종, 이행세포암, 요도암, 자궁암, 자궁육종, 질암, 혈관종양, 외음부암, 윌름즈 종양, 및 기타 소아신장종양을 포함한다.
[00173] 일부 구현예에서, 암은 다중 약물 내성 암 또는 재발성 암이다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 비-전이성 암 및 전이성 암 둘 모두에 적합한 것으로 고려된다. 따라서, 일부 구현예에서, 암은 비-전이성 암이다. 일부 다른 구현예에서, 암은 전이성 암이다. 일부 구현예에서, 대상체에 투여되는 조성물은 대상체에서 암의 전이를 억제한다. 일부 구현예에서, 투여된 조성물은 대상체에서 종양 성장을 억제한다.
[00174] 따라서, 일 양태에서, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은 본 발명의 개시의 SLP-76, CAR, 또는 TCR 폴리펩티드, 본 발명의 개시의 재조합 핵산, 본 발명의 개시의 재조합 세포, 및/또는 본 발명의 개시의 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
[00175] 일부 구현예에서, 투여되는 조성물은 표적 암 세포의 증식을 억제하고/하거나 대상체에서 암의 종양 성장을 억제한다. 예를 들어, 표적 세포의 증식이 감소하는 경우, 이의 병리학적 또는 병원성 거동이 감소되는 경우, 파괴되거나 사멸되는 경우 등이 표적 세포가 억제될 수 있다. 억제는 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 측정된 병리학적 또는 병원성 거동의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 개체에게 유효 수의 본원에 개시된 재조합 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 재조합 세포는 재조합 세포가 투여되지 않은 대상체에서 표적 세포의 증식 및/또는 표적 암의 종양 성장과 비교하여 대상체에서 표적 암 세포의 증식을 억제하고/하거나 표적 암의 종양 성장을 억제한다. 일부 구현예에서, 표적 암 세포는 백혈병 암 세포, 백혈병 암 세포로부터 유래된 세포, 또는 백혈병의 미세환경 내의 세포이다. 일부 구현예에서, 표적 암 세포는 신경모세포종 세포, 신경모세포종 세포로부터 유래된 세포, 또는 신경모세포종의 미세환경 내의 세포이다. 일부 구현예에서, 표적 암 세포는 골육종 세포, 골육종 세포로부터 유래된 세포, 또는 골육종의 미세환경 내의 세포이다.
[00176] 본원에서 사용되는 용어 "투여" 및 "투여하는"은 경구, 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 피하, 근육내, 및 국소 투여, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 투여 경로에 의한 생물활성 조성물 또는 제형의 전달을 지칭한다. 상기 용어는 의료 전문가에 의한 투여 및 자가 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[00177] 본원에 설명된 조성물, 예를 들어, SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드, 핵산, 재조합 세포, 세포 배양물, 및/또는 약학적 조성물의 투여는 면역 반응의 자극에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 바와 같은 SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드, 핵산, 재조합 세포, 세포 배양물, 및/또는 약학적 조성물은 화학요법에 의한 암의 관해 유도 후, 또는 자가 또는 동종이계 조혈 줄기 세포 이식 후에 개체에 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 조성물은 본원에 개시된 치료 조성물 중 하나가 투여되지 않은 대상체에서의 인터페론 감마(IFNγ), TNF-α, 및/또는 인터루킨-2(IL-2)의 생산에 비해 치료된 대상체에서 인터페론 감마(IFNγ), TNF-α, 및/또는 인터루킨-2(IL-2)의 생산을 증가시킬 필요가 있는 개체에게 투여된다.
[00178] 본원에 설명된 조성물, 예를 들어, SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드, 핵산, 재조합 세포, 세포 배양물, 및/또는 약학적 조성물의 유효량은 의도된 목표, 예를 들어, 종양 퇴행에 기반하여 결정된다. 예를 들어, 기존의 암이 치료되는 경우, 투여되는 본원에 개시된 조성물의 양은 조성물의 투여가 암 예방을 위한 것보다 많을 수 있다. 당업자는 본 발명의 개시에 비추어 투여될 조성물의 양 및 투여 빈도를 결정할 수 있을 것이다. 치료 횟수 및 용량 둘 모두에 따라 투여되는 양은 또한 치료될 개인, 개인의 상태, 및 요망되는 보호에 의존한다. 조성물의 정확한 양은 또한 의사의 판단에 의존하며 각 개인에 특유하다. 투여 빈도는 의사의 판단에 따라 1-2일에서 2-6시간, 6-10시간, 1-2주 또는 그 이상까지의 범위일 수 있다.
[00179] 일부 구현예에서, 투여는 볼루스 주사에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 투여는 정맥내 주입에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 재조합 세포를 함유하는 조성물은 하루에 약 1백만 개의 세포/kg 체중 내지 하루에 약 1억 개의 세포/kg 체중의 투여량으로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 재조합 세포를 함유하는 조성물은 하루에 약 1000개의 세포/kg 내지 1억 개의 세포/kg 체중의 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 치료제는 단일 투여로 투여된다. 일부 구현예에서, 치료제는 다중 투여(예를 들어, 1주 이상 동안 주당 1회 이상)로 투여된다.
[00180] 당업자는 본 발명의 개시의 조성물을 개체에게 투여하기 위한 기술에 익숙할 것이다. 또한, 당업자는 개체에게 투여하기 전에 이러한 조성물의 제조에 필요한 기술 및 약학적 시약에 익숙할 것이다.
[00181] 본 발명의 개시의 특정 구현예에서, 본 발명의 개시의 조성물은 본원에 설명된 바와 같은 SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드, 핵산, 재조합 세포, 세포 배양물, 및/또는 약학적 조성물 중 하나 이상을 포함하는 수성 조성물을 함유한다. 본 발명의 개시의 수성 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질에 유효량의 본원에 개시된 조성물을 함유한다. 따라서, 본 발명의 개시의 "약학적 제제" 또는 "약학적 조성물"은 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함할 수 있다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 용도는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 본원에 개시된 재조합 세포와 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 약학적 조성물의 제조에서의 이의 사용이 고려된다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 인간 투여의 경우, 제제는 FDA 생물의약품 센터(FDA Center for Biologics)에서 요구하는 무균, 발열원성, 일반 안전성, 및 순도 표준을 충족해야 한다.
[00182] 당업자는 생물학적 물질이 바람직하지 않은 저분자량 분자를 제거하기 위해 광범위하게 투석되고/거나 적절한 경우, 원하는 비히클로의 보다 용이한 제형화를 위해 동결건조되어야 한다는 것을 이해할 것이다. 본원에 설명된 조성물, 예를 들어, SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드, 핵산, 재조합 세포, 세포 배양물, 및/또는 약학적 조성물은 이후 일반적으로 임의의 공지된 경로, 예를 들어, 비경구 투여에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 투여되는 조성물의 양의 결정은 당업자에 의해 이루어질 수 있고, 부분적으로 암의 정도 및 중증도, 및 재조합 세포가 기존 암의 치료 또는 암의 예방을 위해 투여되는지 여부에 좌우될 수 있다. 본 발명의 개시의 SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드, 핵산, 재조합 세포, 세포 배양물, 및/또는 약학적 조성물을 함유하는 조성물의 제조는 본 발명의 개시의 관점에서 당업자에게 공지될 수 있다.
[00183] 제형화시, 본 발명의 개시의 조성물은 투여 제형과 양립 가능한 방식으로 및 치료적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 조성물은 상기 설명된 유형의 주사 가능한 용액과 같은 다양한 투여 형태로 투여될 수 있다.
[00184] 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드, 핵산, 재조합 세포, 세포 배양물, 및/또는 약학적 조성물은 본원에 개시된 치료 조성물 중 하나가 투여되지 않은 대상체에 비해 상응하는 T 세포 또는 치료된 대상체에서 T 세포 고갈을 극복하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 설명된 SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드, 핵산, 재조합 세포, 세포 배양물, 및/또는 약학적 조성물은 본원에 개시된 치료 조성물 중 하나가 투여되지 않은 대상체에서 이러한 분자의 생산에 비해 치료된 대상체에서 CAR T-세포의 증식 및/또는 사멸 능력을 자극하는데 사용될 수 있다. 인터페론 감마(IFNγ), 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 및/또는 인터루킨-2(IL-2)의 생산은 본원에 개시된 치료 조성물 중 하나가 투여되지 않은 대상체에서의 인터페론 감마(IFNγ), 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 및/또는 인터루킨-2(IL-2)의 생산에 비해 최대 약 20배, 예를 들어, 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 또는 20배 또는 그 초과 중 어느 하나로 생산하도록 자극될 수 있다.
대상체에 대한 재조합 세포의 투여
[00185] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 방법은 유효량 또는 유효 수의 본원에 제공된 재조합 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 투여 단계는 당 분야의 임의의 이식 전달 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 재조합 세포는 대상체의 혈류에 직접 주입되거나 대상체에게 달리 투여될 수 있다.
[00186] 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 원하는 효과(들)가 생성되도록 원하는 부위에 도입된 세포의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 투여를 포함하며, 이 용어는 재조합 세포를 개체에게 "도입", "삽입", 및 "이식"한다는 용어와 상호교환적으로 사용된다. 재조합 세포 또는 이들의 분화된 자손은 투여된 세포 또는 세포의 성분의 적어도 일부가 생존 가능한 상태로 유지되는 개체의 요망되는 위치로의 전달을 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대상체에 투여된 후 세포의 생존 기간은 몇 시간, 예를 들어, 24시간 내지 며칠, 길게는 몇 년만큼 짧을 수 있거나, 심지어 개인의 평생, 즉, 장기 생착일 수 있다.
[00187] 일부 구현예에서, 방법 또는 경로에 의해 대상체로의 재조합 세포 조성물(예를 들어, 본원에 설명된 세포 중 임의의 세포에 따른 복수의 재조합 세포를 포함하는 조성물)의 전달은 원하는 부위에서 세포 조성물의 적어도 부분적인 국소화를 초래한다. 투여 방식은, 예를 들어, 주사, 주입, 및 점적주입을 포함한다. "주사"는 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 심실내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 뇌척수내, 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 경로는 정맥내이다. 세포의 전달을 위해, 주사 또는 주입에 의한 전달은 표준 투여 방식이다.
[00188] 일부 구현예에서, 재조합 세포는, 예를 들어, 주입 또는 주사를 통해 전신 투여된다.
키트
[00189] 또한, 본원에 설명된 방법의 실시를 위한 다양한 키트가 본원에 제공된다. 특히, 본 발명의 개시의 일부 구현예는 대상체에서 질환의 진단을 위한 키트를 제공한다. 일부 다른 구현예는 질환의 예방을 필요로 하는 대상체에서 질환의 예방을 위한 키트에 관한 것이다. 일부 다른 구현예는 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 위한 키트에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 제공되고 설명된 바와 같은 SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드, 재조합 핵산, 조작된 세포, 또는 약학적 조성물 중 하나 이상 뿐만 아니라 이를 제조하고 사용하기 위한 서면 지침서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
[00190] 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 키트는 제공된 SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드, 재조합 핵산, 조작된 세포, 또는 약학적 조성물 중 어느 하나를 개체에 투여하는데 유용한 하나 이상의 수단을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 키트는 제공된 SLP-76, CAR, 및/또는 TCR 폴리펩티드, 재조합 핵산, 조작된 세포, 또는 약학적 조성물 중 어느 하나를 개체에 투여하는 데 사용되는 하나 이상의 주사기(미리 충전된 주사기 포함) 및/또는 카테터(미리 충전된 주사기 포함)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 요망되는 목적, 예를 들어, 질환의 진단, 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환을 진단, 예방 또는 치료하기 위해 다른 키트 성분과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있는 하나 이상의 추가 치료제를 가질 수 있다.
[00191] 일부 구현예에서, 키트는 본원에 개시된 방법을 실시하기 위해 키트의 성분을 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
[00192] 본원에 인용된 임의의 참고문헌이 종래 기술을 구성한다는 것은 인정되지 않는다. 참고문헌의 논의는 이들의 저자가 주장하는 바를 기술하고, 발명자는 인용된 문헌의 정확성 및 적절성에 이의를 제기할 권리를 보유한다. 과학 저널 기사, 특허 문헌, 및 교과서를 포함하는 다수의 정보 출처가 본원에서 언급되지만; 이 참고문헌은 이러한 문헌들 중 어느 것이 당 분야의 일반적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것을 구성하지 않음이 명백히 이해될 수 있다.
[00193] 본원에 제공된 일반적인 방법의 논의는 단지 예시 목적으로 의도된 것이다. 다른 대안적인 방법 및 대안은 본 개시의 검토시 당업자에게 명백할 수 있고, 본 출원의 사상 및 범위 내에 포함되어야 한다.
실시예
[00194] 추가 구현예는 하기 실시예에서 추가로 상세히 개시되며, 이는 예시로서 제공되며 어떠한 방식으로도 본 발명의 개시 또는 청구범위의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1
근위 신호전달 분자에 의한 CAR T 세포 활성화 향상
[00195] 본 실시예는 과발현될 때 CAR T 세포 활성화를 향상시키기 위한 근위 신호전달 분자의 기능을 예시하기 위해 수행된 실험을 설명한다. 상이한 세포외 리간드를 인식하는 예시적인 CAR 분자를 조작하고 이들 분자 및 다양한 근위 신호전달 분자를 발현하는 세포를 활성화시키는 이들의 기능에 대해 시험하였다.
[00196] 근위 신호전달 분자를 시험하여 이들 중 임의의 것이 CAR 분자에 의한 T 세포 활성화를 향상시키기에 충분한지 확인하였다. CAR 작제물은 scFv(예를 들어, CD19 또는 HER2 인식), CD8 또는 CD28 힌지-막횡단 도메인(H/TM), 및 4-1BB 공동자극 도메인을 CD3제타 도메인에 직접 연결함으로써 제조되었다. 조작된 CAR은 일차 T 세포에서 근위 신호전달 분자의 작제물과 공동-발현되었다. CD19 또는 HER2 항원을 발현하는 종양 세포의 존재하에서 T 세포에 의한 사이토카인 생산을 측정하고 비교하였다. 도 1은 T 세포에서 CAR 분자의 발현을 나타내는 CD19(좌측 상단 패널) 또는 HER2(우측 상단 패널)와 같은 각 CAR 분자의 세포외 리간드 결합 도메인을 검출하는 FACS 히스토그램을 제시한다. CD19 CAR 분자를 발현하는 T 세포가 고밀도의 CD19를 발현하는 야생형 NALM6 세포와 함께 인큐베이션되었을 때, 또는 HER2 CAR 분자를 발현하는 T 세포가 고밀도 HER2를 발현하는 NALM6 세포와 인큐베이션되었을 때, CAR 분자는 사이토카인(예를 들어, IL-2)을 생산하기 위해 상응하는 T 세포를 활성화시켰다. 도 1, 하부 패널에 제시된 바와 같이, CAR 작제물 중 어느 하나에 의한 이러한 활성화(IL-2 생산 수준으로 표시됨)는 T 세포에서 SLP-76(예를 들어, SEQ ID NO: 7)의 과발현에 의해서만 향상되었고, LAT(예를 들어, SEQ ID NO: 8) 또는 LCK(예를 들어, SEQ ID NO: 9)와 같은 다른 근위 신호전달 분자의 과발현에 의해서는 향상되지 않았다.
[00197] 현재 CAR T 요법의 한 가지 한계는 종양이 CAR T 세포 상의 CAR 분자에 의한 인식을 위한 표적 항원으로 일반적으로 사용되는 발현된 종양 항원의 양을 하향 조절함으로써 CAR T 세포를 벗어날 수 있다는 것이다. CAR T 세포 활성은 항원 밀도가 낮을 때 제한될 수 있다. 이후, 상기 공동-발현 시스템을 낮은 항원 밀도 실험 설정 하에 시험하였다. 구체적으로, SLP-76(SEQ ID NO: 7)의 과발현과 함께 또는 과발현 없이 CD19 CAR 분자를 발현하는 T 세포를 세포 표면 상에서 야생형 NALM6 세포 또는 저밀도의 CD19를 발현하는 NALM6 세포와 인큐베이션하였다. T 세포의 활성화를 상기와 같이 IL-2 생산에 의해 측정하였다. 도 2에 제시된 바와 같이, SLP-76(SEQ ID NO: 7; 세포막에 결합되지 않음) 과발현은 야생형 NALM6 세포에만 반응하여 CD19 CAR 분자를 통한 T 세포 활성화를 향상시켰지만, 낮은 항원 밀도를 갖는 세포는 그렇지 않았다.
[00198] 대부분의 근위 신호전달 분자는 세포질이고 막횡단 도메인을 갖지 않는다. 낮은 항원 밀도에 반응하여 CAR T 활성을 향상시키는 SLP-76의 기능을 개선하기 위해, 막-결합 작제물을 제조하고 시험하였다. 하나의 예시적인 작제물(VSV-G-CD8TM-SLP-76; SEQ ID NO: 16)은 SLP-76의 N-말단에 컨쥬게이션된 CD8 힌지-막횡단(H/TM) 도메인, 및 FACS에 의한 용이한 검출을 위한 짧은 세포외 태그(VSV-G 폴리펩티드)를 함유한다. 유사한 막-결합된 LCK 작제물(VSV-G-CD8TM-LCK; SEQ ID NO: 17)을 대조군으로서 제조하였다. 도 1 및 2에 제시된 세포질 SLP-76(SEQ ID NO: 7)과 비교하여, 예시적인 막-결합된 SLP-76은 야생형 NALM6 세포(고밀도의 CD19를 발현함)에 반응하여 T 세포 활성을 추가로 향상시켰을 뿐만 아니라, 표적 NALM6 세포 상의 저밀도의 항원에 반응하여 T 세포 활성을 향상시킬 수 있었다(도 3a 및 3b). T 세포를 활성화 또는 자극하기 위해 CD19 CAR의 세포외 도메인을 인식하는 항-이디오타입 항체를 사용하여, 더 적은 양의 이러한 항체가 막-결합된 SLP-76을 과발현하는 T 세포를 활성화시키기에 충분하였다(도 3c). 이러한 데이터는 막-결합된 SLP-76의 과발현이 CAR T 세포 활성화 역치를 감소시킨다는 것을 보여준다.
[00199] HER2-표적화 CAR 분자(HER2-CD28TM-BBZ)를 발현하는 T 세포를 사용하여 실험을 또한 수행하였다. 도 3a-3c와 유사하게, 막-결합된 SLP-76(SEQ ID NO: 16)은 높은 수준의 HER2를 발현하는 야생형 NALM6 세포 또는 HER2를 발현하는 야생형 143B 골육종 세포에 반응하여 T 세포 활성을 추가로 향상시켰을 뿐만 아니라, 낮은 항원 밀도 또는 초저 항원 밀도를 갖는 표적 세포의 클론에 반응하여 T 세포 활성을 향상시킬 수 있었다(도 4a 및 4b). 플레이트를 재조합 Her 2 항원으로 코팅하고, 막-결합된 SLP-76이 과발현될 때 더 적은 양의 코팅된 항원이 T 세포를 활성화시키기에 충분하였다(도 4c).
[00200] 또 다른 실험에서, T 세포를 형질도입하여 유리 ZAP-70 작제물(ZAP-70-2A-tNGFR, SEQ ID NO: 44 ), 유리 PLCγ1(일명, PLCg1 또는 PLCG) 작제물(PLCg1-2A-tNGFR, SEQ ID NO: 48), 막-결합된 ZAP-70 작제물[ZAP-70 인터도메인 B의 단편 및 키나제 도메인을 함유하는 VSV-G-CD8TM-ZAP-70 KIDB(255-600); SEQ ID NO: 46], 막-결합된 PLCγ1 작제물(VSV-G-CD8TM-PLCg1, SEQ ID NO: 50), 또는 상기 설명된 막-결합된 SLP-76 작제물(SEQ ID NO: 16)을 갖거나 갖지 않는 예시적인 CD19-표적화 CAR 작제물("CD19-CD8TM-BBZ")을 과발현시켰다(도 13a). 도 13b에 제시된 바와 같이, 막-결합된 SLP-76 단독은 야생형 NALM-6 세포와 접촉될 때 CD19-표적화 CAR 작제물을 발현하는 T 세포에 의한 사이토카인(예를 들어, IL-2 및 IFNγ) 생산을 유의하게 증가시켰으나, 유리 또는 막-결합된 ZAP-70 또는 PLCγ1 작제물은 그렇지 않았다.
실시예 2
막-결합된 SLP-76은 SLP-76 또는 CAR 구조와 무관하게 CAR T 활성을 향상시킨다
[00201] 본 실시예는 다양한 CAR 분자를 통해 CAR T 활성화를 향상시키는 막-결합된 SLP-76의 능력을 확인하기 위해 수행된 실험을 설명한다.
[00202] 하나의 예시적인 CAR 작제물은 CD19를 인식하기 위한 세포외 도메인, CD28 막횡단 도메인 및 세포내 영역, 및 CD3제타 신호전달 도메인("CD19-CD28TM-CD28Z" 또는 "CD19-28Z")을 함유한다. 막-결합된 SLP-76 작제물(SEQ ID NO: 16)을 과발현하거나 과발현하지 않는 이러한 CAR 작제물을 발현하는 T 세포(도 5a)를 상이한 종양 세포와 함께 인큐베이션하였다. IL-2 생산 수준을 종양 세포와 인큐베이션한 후 이들 T 세포에 대한 ELISA에 의해 측정하였고, 이는 막-결합된 SLP-76이 정상 항원 밀도 또는 낮은 항원 밀도에 반응하여 T 세포 활성을 유의하게 향상시켰음을 보여주었다(도 5b). 세포독성 지수는 또한 T 세포 활성화를 향상시켜 낮은 항원 밀도에서 종양 세포를 사멸시키는 막-결합된 SLP-76의 이러한 능력을 확인시켜 준다(도 5c). 생체내 야생형 NALM6 스트레스 시험 모델에서, 막-결합된 SLP-76은 CAR T 세포에서 발현될 때, 특히 치료 14일 후에 막-결합된 SLP-76을 발현하지 않는 CAR T 세포를 이용한 치료와 비교하여 종양 부하를 유의하게 감소시켰다(도 5d 및 5f). 상응하게, 막-결합된 SLP-76은 CAR T 세포의 기능을 유의하게 향상시켜 동물 생존율을 증가시켰다(도 5e).
[00203] CD22를 인식하는 세포외 도메인, CD8 막횡단 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인, 및 CD3제타 신호전달 도메인을 함유하는 또 다른 예시적인 CAR 작제물("CD22-CD8TM-BBZ")을 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. CD22의 하향조절은 환자에서 CD22 CAR T 세포 요법으로부터 항원 탈출의 공지된 메커니즘이다(Fry et al, Nature Medicine, 2017). 막-결합된 SLP-76 작제물(SEQ ID NO: 16)을 과발현하거나 과발현하지 않는 이러한 CAR 작제물을 발현하는 T 세포(도 6a)를 종양 세포와 함께 인큐베이션하였다. IL-2 생산 수준을 종양 세포와 인큐베이션한 후 이들 T 세포에 대한 ELISA에 의해 측정하였고, 이는 막-결합된 SLP-76이 낮은 항원 밀도에 반응하여 T 세포 활성을 유의하게 향상시켰음을 보여주었다(도 6b). 전술한 바와 같은 재조합 항원 자극 검정으로, 재조합 CD22를 표적 항원으로 사용하여 T 세포를 활성화시켰다. 막-결합된 SLP-76이 과발현될 때 더 적은 양의 이러한 코팅된 항원은 T 세포를 활성화시키기에 충분하였다(도 6c). 생체내 CD22LOW NALM6 모델에서, 막-결합된 SLP-76은 CAR T 세포 상에서 발현될 때, 막-결합된 SLP-76을 발현하지 않는 CAR T 세포와 비교하여 종양 부하를 유의하게 감소시켰다(예를 들어, 도 6d에 제시된 바와 같이 치료 22일 후)(도 6d-6f).
[00204] B7-H3을 인식하는 세포외 도메인, CD28 막횡단 도메인, 4-1BB 세포내 신호전달 도메인, 및 CD3제타 신호전달 도메인을 함유하는 또 다른 예시적인 CAR 작제물("B7-H3-CD28TM-BBZ")을 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 막-결합된 SLP-76 작제물(SEQ ID NO: 16)을 과발현하거나 과발현하지 않는 이러한 CAR 작제물을 발현하는 T 세포(도 7a)를 종양 세포와 함께 인큐베이션하였다. 세포독성 지수는 처리 후 살아있는 표적 종양 세포(저밀도의 B7-H3를 발현하는 신경모세포종 세포주 CHLA-255)를 검출함으로써 계산되었으며, 이는 막-결합된 SLP-76이 표적 종양 세포를 억제하거나 사멸시키는 B7-H3-CD28TM-BBZ를 발현하는 T 세포의 활성을 유의하게 향상시켰다는 것을 보여준다(도 7b). 생체내 CHLA-255(저 밀도의 B7-H3을 발현함) 전이성 모델에서, 막-결합된 SLP-76은 CAR T 세포 상에서 발현될 때, 시간 전반에 걸쳐 종양 부하를 유의하게 감소시킨 반면, 막-결합된 SLP-76을 발현하지 않는 CAR T 세포는 처리 7-14일 후에 종양 부하를 증가시켰다(도 7c). 결과적으로, 막-결합된 SLP-76을 과발현하는 CAR T 세포로 처리된 동물은 막-결합된 SLP-76을 발현하지 않는 CAR T 세포로 처리된 동물보다 훨씬 더 긴 100일 넘게 생존하였다(도 7d).
[00205] 따라서, 막-결합된 SLP-76의 CAR T 활성을 향상시키는 능력은 특정 CAR 작제물에 의해 제한되지 않는다.
[00206] 상이한 근위 신호전달 분자를 갖는 CAR 작제물을 막-결합된 SLP-76의 기능을 시험하기 위해 추가로 사용하였다. 예를 들어, CD3제타 신호전달 도메인을 갖는 이전에 설명된 CAR 분자보다, 예시적인 CAR 작제물이 세포간 신호전달 도메인으로서 ZAP70을 함유하도록 생산되었다(CD19-CD28TM-ZAP70). 막-결합된 SLP-76 작제물(SEQ ID NO: 16)을 과발현하거나 과발현하지 않는 이러한 CD19-표적화 CAR 분자를 발현하는 T 세포(도 8a)를 종양 세포와 함께 인큐베이션하였다. IL-2 생산 수준을 종양 세포와 인큐베이션한 후 이들 T 세포에 대한 ELISA에 의해 측정하였고, 이는 막-결합된 SLP-76이 CAR 분자를 통해 T 세포 활성을 유의하게 향상시켰음을 보여주었다(도 8b). 생체내 NALM6 이종이식편 모델에서, 막-결합된 SLP-76은, CAR T 세포 상에서 발현될 때, 막-결합된 SLP-76을 발현하지 않는 CAR T 세포와 비교하여 종양 부하를 유의하게 감소시켰다(도 8c). 결과적으로, 막-결합된 SLP-76을 과발현하는 CAR T 세포로 처리된 동물은 막-결합된 SLP-76을 발현하지 않는 CAR T 세포로 처리된 동물보다 더 높은 생존율을 가졌다(도 8d).
[00207] 상이한 막-결합된 SLP-76 작제물의 존재 또는 부재하에 고친화성(HA) GD2-표적화 세포외 도메인, CD28 막횡단 및 공동자극 도메인, 및 CD3제타 신호전달 도메인을 함유하는 예시적인 CAR 작제물("HA 28Z")을 발현하는 T 세포를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 예를 들어, 예시적인 막-결합된 SLP-76 작제물은 CD28 막횡단 도메인(SEQ ID NO: 19; "CD28TM SLP-76")을 함유한다. 또 다른 예시적인 막-결합된 SLP-76 작제물은 CD8 막횡단 도메인(SEQ ID NO: 18; "CD8TM SLP-76")을 함유한다. 예시적인 막-결합된 SLP-76 작제물을 과발현하거나 과발현하지 않는 이러한 고친화성 GD2-표적화 CAR 분자를 발현하는 T 세포(도 9a)를 종양 세포와 인큐베이션하였다. IL-2 생산 수준을 다양한 종양 세포와 인큐베이션한 후 이들 T 세포에 대한 ELISA에 의해 측정하였고, 이는 막-결합된 SLP-76이 막-결합된 SLP-76 작제물에서 이용된 막횡단 도메인에 관계없이 CAR T 세포 활성을 유의하게 향상시켰다는 것을 보여준다(도 9b).
[00208] 이 실시예는 어떤 scFv(항원 특이성), 신호전달 도메인(공동자극 또는 기타), 또는 막횡단 도메인이 CAR 작제물에 함유되어 있는지 또는 어떤 막횡단 도메인이 막-결합된 SLP-76 작제물에서 이용되는지에 상관없이 막-결합된 SLP-76이 CAR의 활성을 향상시킨다는 것을 입증한다.
실시예 3
막-결합된 SLP-76의 추가 이점
[00209] 본 실시예는 T 세포 고갈에 대한 막-결합된 SLP-76의 효과를 시험하고 보고된 SLP-76 융합 단백질에 대한 이의 이점을 나타내기 위해 수행된 실험을 설명한다.
[00210] TCR 또는 CAR을 발현하는 T 세포의 지속적인 활성화는 일반적으로 만성 감염 또는 종양 진행으로 인해 고갈된 표현형으로의 점진적인 발달을 초래할 수 있다. 이전 실시예에 설명된 상이한 CAR 작제물을 과발현될 때 T 세포 고갈에 대한 이들의 효과에 대해 시험하였다. 구체적으로, FACS 분석은, 예를 들어, TIM-3, PD-1, 및 LAG-3을 포함하는 T 세포의 표면 상에 발현된 T 세포 고갈 바이오마커를 검출하기 위해 수행되었으며, 이러한 바이오마커의 발현 수준은 T 세포 고갈 정도와 상관관계가 있다. 도 10에 제시된 바와 같이, 이전의 실시예에 설명된 B7-H3-CD28TM-BBZ CAR 작제물의 과발현은 3개의 바이오마커 모두의 중간 발현을 유도하였고, 이는 B7-H3-CD28TM-BBZ CAR 작제물이 중간 정도의 T 세포 고갈을 유도할 수 있음을 보여준다. 놀랍게도, CAR T 활성을 증폭시키고 활성화 역치를 감소시킬 수 있는 막-결합된 SLP-76(CD19-CD8TM-SLP-76, SEQ ID NO: 40)은 막-결합된 SLP-76의 공동-발현이 바이오마커 발현 수준을 증가시키지 않음에 따라 CAR T 세포 고갈을 악화시키지 않았다(도 10). 도 11은 HA 28Z CAR 작제물의 과발현에 의한 보다 심각한 CAR T 고갈을 보여준다. CAR T 세포에서 막-결합된 SLP-76(Her2-CD8H/TM-SLP-76, SEQ ID NO: 18)의 과발현은 또한 세포 고갈을 악화시키지 않았다(도 11). 따라서, T 세포 고갈 문제와 관련하여, 막-결합된 SLP-76은 다른 CAR T 요법을 부스팅하는데 사용하기에 안전하다.
[00211] LAT/SLP-76 키메라 단백질(SLP-76에 융합된 LAT 막횡단)은 내인성 LAT 유전자가 녹아웃된 T 세포에서 TCR 신호전달을 회복시킨다(Boerth et al. J. Exp. Med. 2000, 192:1047-1058). 이러한 키메라를 이전 실시예에 설명된 막-결합된 SLP-76 작제물과 비교하였다. 막-결합된 SLP-76 작제물(VSV-G-CD8TM-SLP-76, SEQ ID NO: 16) 또는 LAT/SLP-76 키메라 작제물을 과발현하는, 이전에 설명된 CD19 28Z CAR 작제물을 발현하는 T 세포(도 12a)를 종양 세포와 함께 인큐베이션하였다. IL-2 생산 수준을 종양 세포와 인큐베이션한 후 이들 T 세포에 대한 ELISA에 의해 측정하였고, 이는 막-결합된 SLP-76이 높은 항원 밀도에 반응하여 T 세포 활성을 향상시키는 키메라보다 더 높은 능력을 가졌음을 보여준다(도 12b, WT N6). 더 중요하게는, 막-결합된 SLP-76은 낮은 항원 밀도에 반응하여 CAR T 활성을 향상시킬 수 있었으나, 키메라는 그렇지 않았다(도 12b, 클론 F N6). 따라서, 막-결합된 SLP-76은 특히 항원 밀도가 낮을 때 CAR 또는 TCR을 사용한 현재의 T 세포 요법을 피하기 위해 종양 세포에 의해 사용되는 LAT/SLP-76 키메라에 비해 이점을 갖는다.
실시예 4
다양한 세포 또는 동물 모델에서의 막-결합된 SLP-76의 추가 연구
[00212] 본 실시예는 다양한 세포 또는 동물 모델에서 T 세포 활성화 및 기능을 향상시키기 위한 막-결합된 SLP-76의 효과를 시험하기 위해 수행된 실험을 설명한다.
[00213] 예시적인 실험에서, T 세포를 형질도입하여 역형성 림프종 키나제(ALK)-표적화 CAR 작제물("ALK-CD8TM-BBZ")을 과발현시켰다. 이러한 ALK-표적화 CAR 작제물은 이전에 T 세포의 표면에서 저조하게(낮은 수준으로) 발현되어 이의 치료적 유용성 및 T 세포를 완전히 활성화시키는 이의 능력을 제한하는 것으로 밝혀졌다(Walker et al, Molecular Therapy, 2017: 25(9):2189-2201; PMID 28676342). ALK-CD8TM-BBZ는 막-결합된 SLP-76 작제물의 존재 또는 부재하의 T 세포 상에서 발현되었고(도 14a-14b), 이후 상이한 수준의 ALK 항원을 발현하는 NALM-6 암 세포와 공동-배양되었다(도 14c). 막-결합된 SLP-76 작제물은 높은 수준의 ALK를 발현하는 NALM-6 세포와 접촉될 때 T 세포에 의한 IL-2 및 IFNγ 둘 모두의 생산을 유의하게 증가시켰고, 중간 또는 낮은 수준의 ALK를 발현하는 NALM-6 세포와 접촉될 때 T 세포에 의한 IFNγ의 생산을 유의하게 증가시켰으나 IL-2는 그렇지 않았다(도 14d). 표적 NALM-6 세포에 대한 T 세포의 세포독성을 측정하였다. 도 14e는 막-결합된 SLP-76 작제물이 상이한 ALK 밀도를 갖는 표적 NALM-6 세포의 3개 라인 모두에 대해 T 세포의 세포독성을 유의하게 증가시켰다는 것을 예시한다.
[00214] 또 다른 예시적인 실험에서, NY-ESO-1 트랜스제닉 TCR 작제물(A2+/NY-ESO-1)을 발현하도록 조작된 T 세포를 막-결합된 SLP-76 작제물의 존재 또는 부재하에 형질도입하고(도 15a), 항원 양성 종양 세포(A2+/NY-ESO-1+ Nalm-6 또는 A375) 또는 항원 음성 종양 세포 Mel888과 함께 공동 배양하였다. 유사하게, 막-결합된 SLP-76 작제물은 항원 양성 NALM-6 또는 A375 세포와 접촉할 때 T 세포에 의한 IL-2 생산을 유의하게 증가시켰지만 항원 음성 Mel888 세포는 그렇지 않았다(도 15b). 막-결합된 SLP-76 작제물은 또한 항원 양성 NALM-6 세포와 공동-배양될 때 T 세포의 세포독성을 증가시켰다(도 15c).
[00215] 또 다른 예시적인 실험에서, B-세포 성숙 항원(BCMA)-표적화 CAR 작제물을 발현하는 T 세포를 막-결합된 SLP-76 작제물의 존재 또는 부재하에 형질도입하고(도 16a), MM1.S 종양 세포와 공동-배양하였다. 유사하게, 막-결합된 SLP-76 작제물은 T 세포에 의한 사이토카인(예를 들어, IL-2 및 IFNγ) 생산을 유의하게 증가시켰다(도 16b). 루시페라제-발현 MM1.S 종양 세포로 접종되고 T 세포로 처리된 마우스에서, 막-결합된 SLP-76 작제물은 종양 성장을 제어하는 T 세포의 능력을 증가시켰다(도 16c).
[00216] 또 다른 예시적인 실험에서, B7-H3-표적화 CAR 작제물("B7-H3-CD28TM-BBZ")을 발현하는 T 세포를 막-결합된 SLP-76 작제물의 존재 또는 부재하에 형질도입하였다(도 17a). 루시페라제-발현 미만성 내재 교뇌 교종 6 이종이식편(DIPG-6)으로 접종되고 T 세포로 처리된 마우스에서, 막-결합된 SLP-76 작제물은 종양 성장을 제어하는 T 세포의 능력을 증가시켰다(도 17b).
[00217] 또 다른 예시적인 실험에서, CD19-표적화 CAR 작제물("CD19-CD28TM-CD28Z")을 발현하는 T 세포는 막-결합된 SLP-76 작제물의 존재 또는 부재하에서 형질도입하였다(도 18a). B 세포 급성 림프모구 백혈병(B-ALL) 모델에서, 마우스에 루시페라제-발현 야생형 Nalm-6 세포를 접종하고 T 세포로 처리하였다. 막-결합된 SLP-76 작제물은 비장 또는 골수에서 T 세포 증식을 증가시켰다(도 18b).
[00218] 또 다른 예시적인 실험에서, CD19-표적화 CAR 작제물("CD19-CD28TM-BBZ")을 발현하는 T 세포를 막-결합된 SLP-76 작제물의 존재 또는 부재하에서 형질도입하였다(도 19a). 스트레스 시험 모델(CAR T 세포의 준-치유 용량)에서, 마우스에 루시페라제-발현 백혈병 이종이식편(WT Nalm-6)을 접종하고 T 세포로 처리하였다. 막-결합된 SLP-76 작제물은 종양 성장을 제어하고(도 19b) 마우스 생존을 개선하는(도 19c) T 세포의 능력을 증가시켰다.
[00219] SLP-76 돌연변이체의 기능을 시험하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 예시적인 실험에서, T 세포를 형질도입하여 CD19-표적화 CAR 작제물("CD19-CD8TM-BBZ")을 단독으로 또는 본원에 설명된 막-결합된 SLP-76 작제물(SEQ ID NO: 16) 또는 K30R 치환을 갖는 막-결합된 SLP-76 돌연변이(SEQ ID NO: 60)와 함께 발현시켰다(도 20a-20b). 이러한 K30R 돌연변이는 이전에 SLP-76의 유비퀴틴화 하향조절을 감소시켜, 하류 T 세포 활성화를 향상시킬 수 있는 것으로 보고되었다. 생성된 T 세포를 낮은 수준의 CD19(표적 항원)를 발현하는 NALM-6 종양 세포와 함께 인큐베이션하면서, T 세포에 의해 생산된 IL-2의 수준을 측정하였다. 도 20c에 제시된 바와 같이, 막-결합된 SLP-76 K30R 돌연변이체는 종양 세포 상의 표적 항원에 반응하여 T 세포 활성을 향상시켰으며(IL-2 발현 수준으로 나타냄), 이는 종양 세포에 낮은 수준의 표적 항원을 갖는 이러한 시나리오에서 막-결합된 SLP-76 야생형 작제물보다 더 높은 능력을 갖는다.
서열 표
[00220] 하기 표는 다양한 분자에 대한 예시적인 서열을 열거한다.
표 1: 비공식 서열 목록
SEQUENCE LISTING <110> The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Majzner, Robbie G. Tousley, Aidan Rotiroti, Maria Caterina <120> Enhancing T Cell Function Throught the Use of Proximal Signaling Molecules <130> 078430-533001WO <150> US 63/168,624 <151> 2021-03-31 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 536 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Met Ala Leu Arg Asn Val Pro Phe Arg Ser Glu Val Leu Gly Trp Asp 1 5 10 15 Pro Asp Ser Leu Ala Asp Tyr Phe Lys Lys Leu Asn Tyr Lys Asp Cys 20 25 30 Glu Lys Ala Val Lys Lys Tyr His Ile Asp Gly Ala Arg Phe Leu Asn 35 40 45 Leu Thr Glu Asn Asp Ile Gln Lys Phe Pro Lys Leu Arg Val Pro Ile 50 55 60 Leu Ser Lys Leu Ser Gln Glu Ile Asn Lys Asn Glu Glu Arg Arg Ser 65 70 75 80 Ile Phe Thr Arg Lys Pro Gln Val Pro Arg Phe Pro Glu Glu Thr Glu 85 90 95 Ser His Glu Glu Asp Asn Gly Gly Trp Ser Ser Phe Glu Glu Asp Asp 100 105 110 Tyr Glu Ser Pro Asn Asp Asp Gln Asp Gly Glu Asp Asp Gly Asp Tyr 115 120 125 Glu Ser Pro Asn Glu Glu Glu Glu Ala Pro Val Glu Asp Asp Ala Asp 130 135 140 Tyr Glu Pro Pro 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Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Pro Ile Leu Ala Met Leu Met Ala Leu Cys Val His Cys His Arg Leu 20 25 30 Pro Gly Ser Tyr Asp Ser Thr Ser Ser Asp Ser Leu Tyr Pro Arg Gly 35 40 45 Ile Gln Phe Lys Arg Pro His Thr Val Ala Pro Trp Pro Pro Ala Tyr 50 55 60 Pro Pro Val Thr Ser Tyr Pro Pro Leu Ser Gln Pro Asp Leu Leu Pro 65 70 75 80 Ile Pro Arg Ser Pro Gln Pro Leu Gly Gly Ser His Arg Thr Pro Ser 85 90 95 Ser Arg Arg Asp Ser Asp Gly Ala Asn Ser Val Ala Ser Tyr Glu Asn 100 105 110 Glu Gly Ala Ser Gly Ile Arg Gly Ala Gln Ala Gly Trp Gly Val Trp 115 120 125 Gly Pro Ser Trp Thr Arg Leu Thr Pro Val Ser Leu Pro Pro Glu Pro 130 135 140 Ala Cys Glu Asp Ala Asp Glu Asp Glu Asp Asp Tyr His Asn Pro Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Val Val Leu Pro Asp Ser Thr Pro Ala Thr Ser Thr Ala Ala 165 170 175 Pro Ser Ala Pro Ala Leu Ser Thr Pro Gly Ile Arg Asp Ser Ala Phe 180 185 190 Ser Met Glu Ser Ile Asp Asp Tyr Val Asn Val Pro Glu Ser Gly Glu 195 200 205 Ser Ala Glu Ala Ser Leu Asp Gly Ser Arg Glu Tyr Val Asn 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sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 26 atggctctga gaaacgtgcc cttcagatcc gaggttctcg gctgggaccc tgatagcctg 60 gccgactact tcaagaagct gaactacaag gactgcgaga aggccgtgaa gaagtaccat 120 atcgacggcg ccagattcct gaacctgacc gagaacgaca tccagaagtt ccccaagctg 180 agagtgccca tcctgagcaa gctgagccaa gagatcaaca agaacgagga acggcggagc 240 atcttcacca gaaagcccca ggtgccaaga ttccccgagg aaacagagag ccacgaggaa 300 gataacggcg gctggtccag cttcgaagag gacgactacg agagccccaa cgacgatcag 360 gatggcgagg atgatggcga ttacgagtcc cctaacgaag aggaagaggc ccctgttgag 420 gacgacgccg attatgagcc tcctcctagc aacgacgaag aagccctgca gaacagcatc 480 ctgcctgcca agccttttcc aaacagcaac agcatgtaca tcgaccggcc tccaagcggc 540 aaaacacctc agcaacctcc agttcctcct cagcgaccta tggctgcatt gcctcctcca 600 ccagccggaa gaaatcactc tccactgcct ccacctcaga ccaatcacga ggaacccagc 660 agaagcagaa accacaagac cgccaagctg cccgctccat ccatcgatag aagcaccaag 720 cctccactgg acagatctct ggcccctttc gatagagagc ccttcacact gggcaagaag 780 cctccattca gcgacaagcc tagcatccct 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Gly Gly Gly Ser Ala 100 105 110 Leu Arg Asn Val Pro Phe Arg Ser Glu Val Leu Gly Trp Asp Pro Asp 115 120 125 Ser Leu Ala Asp Tyr Phe Lys Lys Leu Asn Tyr Arg Asp Cys Glu Lys 130 135 140 Ala Val Lys Lys Tyr His Ile Asp Gly Ala Arg Phe Leu Asn Leu Thr 145 150 155 160 Glu Asn Asp Ile Gln Lys Phe Pro Lys Leu Arg Val Pro Ile Leu Ser 165 170 175 Lys Leu Ser Gln Glu Ile Asn Lys Asn Glu Glu Arg Arg Ser Ile Phe 180 185 190 Thr Arg Lys Pro Gln Val Pro Arg Phe Pro Glu Glu Thr Glu Ser His 195 200 205 Glu Glu Asp Asn Gly Gly Trp Ser Ser Phe Glu Glu Asp Asp Tyr Glu 210 215 220 Ser Pro Asn Asp Asp Gln Asp Gly Glu Asp Asp Gly Asp Tyr Glu Ser 225 230 235 240 Pro Asn Glu Glu Glu Glu Ala Pro Val Glu Asp Asp Ala Asp Tyr Glu 245 250 255 Pro Pro Pro Ser Asn Asp Glu Glu Ala Leu Gln Asn Ser Ile Leu Pro 260 265 270 Ala Lys Pro Phe Pro Asn Ser Asn Ser Met Tyr Ile Asp Arg Pro Pro 275 280 285 Ser Gly Lys Thr Pro Gln Gln Pro Pro Val Pro Pro Gln Arg Pro Met 290 295 300 Ala Ala Leu Pro Pro Pro Pro Ala Gly Arg Asn His Ser Pro Leu Pro 305 310 315 320 Pro Pro Gln Thr Asn His Glu Glu Pro Ser Arg Ser Arg Asn His Lys 325 330 335 Thr Ala Lys Leu Pro Ala Pro Ser Ile Asp Arg Ser Thr Lys Pro Pro 340 345 350 Leu Asp Arg Ser Leu Ala Pro Phe Asp Arg Glu Pro Phe Thr Leu Gly 355 360 365 Lys Lys Pro Pro Phe Ser Asp Lys Pro Ser Ile Pro Ala Gly Arg Ser 370 375 380 Leu Gly Glu His Leu Pro Lys Ile Gln Lys Pro Pro Leu Pro Pro Thr 385 390 395 400 Thr Glu Arg His Glu Arg Ser Ser Pro Leu Pro Gly Lys Lys Pro Pro 405 410 415 Val Pro Lys His Gly Trp Gly Pro Asp Arg Arg Glu Asn Asp Glu Asp 420 425 430 Asp Val His Gln Arg Pro Leu Pro Gln Pro Ala Leu Leu Pro Met Ser 435 440 445 Ser Asn Thr Phe Pro Ser Arg Ser Thr Lys Pro Ser Pro Met Asn Pro 450 455 460 Leu Pro Ser Ser His Met Pro Gly Ala Phe Ser Glu Ser Asn Ser Ser 465 470 475 480 Phe Pro Gln Ser Ala Ser Leu Pro Pro Tyr Phe Ser Gln Gly Pro Ser 485 490 495 Asn Arg Pro Pro Ile Arg Ala Glu Gly Arg Asn Phe Pro Leu Pro Leu 500 505 510 Pro Asn Lys Pro Arg Pro Pro Ser Pro Ala Glu Glu Glu Asn Ser Leu 515 520 525 Asn Glu Glu Trp Tyr Val Ser Tyr Ile Thr Arg Pro Glu Ala Glu Ala 530 535 540 Ala Leu Arg Lys Ile Asn Gln Asp Gly Thr Phe Leu Val Arg Asp Ser 545 550 555 560 Ser Lys Lys Thr Thr Thr Asn Pro Tyr Val Leu Met Val Leu Tyr Lys 565 570 575 Asp Lys Val Tyr Asn Ile Gln Ile Arg Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Val 580 585 590 Tyr Leu Leu Gly Thr Gly Leu Arg Gly Lys Glu Asp Phe Leu Ser Val 595 600 605 Ser Asp Ile Ile Asp Tyr Phe Arg Lys Met Pro Leu Leu Leu Ile Asp 610 615 620 Gly Lys Asn Arg Gly Ser Arg Tyr Gln Cys Thr Leu Thr His Ala Ala 625 630 635 640 Gly Tyr Pro Gly Asn Ser 645 <210> 61 <211> 1629 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 61 ggatccggcg gtggtggatc tgctctgaga aacgtgccct tcagatccga ggttctcggc 60 tgggaccctg atagcctggc cgactacttc aagaagctga actacaggga ctgcgagaag 120 gccgtgaaga agtaccatat cgacggcgcc agattcctga acctgaccga gaacgacatc 180 cagaagttcc ccaagctgag agtgcccatc ctgagcaagc tgagccaaga gatcaacaag 240 aacgaggaac ggcggagcat cttcaccaga aagccccagg tgccaagatt ccccgaggaa 300 acagagagcc acgaggaaga taacggcggc tggtccagct tcgaagagga cgactacgag 360 agccccaacg acgatcagga tggcgaggat gatggcgatt acgagtcccc taacgaagag 420 gaagaggccc ctgttgagga cgacgccgat tatgagcctc ctcctagcaa cgacgaagaa 480 gccctgcaga acagcatcct gcctgccaag ccttttccaa acagcaacag catgtacatc 540 gaccggcctc caagcggcaa aacacctcag caacctccag ttcctcctca gcgacctatg 600 gctgcattgc ctcctccacc agccggaaga aatcactctc cactgcctcc acctcagacc 660 aatcacgagg aacccagcag aagcagaaac cacaagaccg ccaagctgcc cgctccatcc 720 atcgatagaa gcaccaagcc tccactggac agatctctgg cccctttcga tagagagccc 780 ttcacactgg gcaagaagcc tccattcagc gacaagccta gcatccctgc tggaagaagc 840 ctgggcgagc atctgcctaa gatccagaaa cctcctctgc cacctaccac cgagagacac 900 gagagatcta gccctctgcc tggcaagaaa ccacctgtgc ctaaacacgg ctggggccca 960 gacagaaggg aaaacgacga ggacgatgtg caccagaggc cattgcctca acctgctctg 1020 ctgcccatgt ccagcaacac attccccagc aggtccacca aaccttctcc aatgaatccc 1080 ctgcctagca gccacatgcc tggcgccttt agcgagagca atagcagctt tcctcagagc 1140 gccagcctgc ctccttactt tagccaggga cctagcaacc ggccacctat cagagccgag 1200 ggcagaaatt ttcccctgcc actgcctaac aagcccagac ctccatctcc tgccgaggaa 1260 gagaacagcc tgaacgaaga gtggtacgtg tcctacatca ccagacctga agccgaggct 1320 gccctgagaa agatcaacca ggatggcacc tttctcgtgc gggacagcag caaaaagacc 1380 accaccaatc cttacgtgct gatggtgctg tacaaggaca aggtgtacaa catccagatc 1440 cgctaccaga aagaaagcca ggtgtacctg ctcggcaccg gcctgagagg caaagaggat 1500 tttctgagcg tcagcgacat catcgactac tttagaaaga tgcccctgct gctgatcgac 1560 ggcaagaaca gaggcagcag ataccagtgc acactgacac acgctgccgg ctatcccggg 1620 aattcctga 1629 <210> 62 <211> 1941 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 62 atggctcgct cggtgaccct ggtctttctg gtgcttgtct cactgaccgg tttgtatgct 60 gcttacactg atatcgaaat gaaccgcctg ggtaaggccg caaccacgac gccagcgccg 120 cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 180 tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 240 tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 300 ctttactgca aaggatccgg cggtggtgga tctgctctga gaaacgtgcc cttcagatcc 360 gaggttctcg gctgggaccc tgatagcctg gccgactact tcaagaagct gaactacagg 420 gactgcgaga aggccgtgaa gaagtaccat atcgacggcg ccagattcct gaacctgacc 480 gagaacgaca tccagaagtt ccccaagctg agagtgccca tcctgagcaa gctgagccaa 540 gagatcaaca agaacgagga acggcggagc atcttcacca gaaagcccca ggtgccaaga 600 ttccccgagg aaacagagag ccacgaggaa gataacggcg gctggtccag cttcgaagag 660 gacgactacg agagccccaa cgacgatcag gatggcgagg atgatggcga ttacgagtcc 720 cctaacgaag aggaagaggc ccctgttgag gacgacgccg attatgagcc tcctcctagc 780 aacgacgaag aagccctgca gaacagcatc ctgcctgcca agccttttcc aaacagcaac 840 agcatgtaca tcgaccggcc tccaagcggc aaaacacctc agcaacctcc agttcctcct 900 cagcgaccta tggctgcatt gcctcctcca ccagccggaa gaaatcactc tccactgcct 960 ccacctcaga ccaatcacga ggaacccagc agaagcagaa accacaagac cgccaagctg 1020 cccgctccat ccatcgatag aagcaccaag cctccactgg acagatctct ggcccctttc 1080 gatagagagc ccttcacact gggcaagaag cctccattca gcgacaagcc tagcatccct 1140 gctggaagaa gcctgggcga gcatctgcct aagatccaga aacctcctct gccacctacc 1200 accgagagac acgagagatc tagccctctg cctggcaaga aaccacctgt gcctaaacac 1260 ggctggggcc cagacagaag ggaaaacgac gaggacgatg tgcaccagag gccattgcct 1320 caacctgctc tgctgcccat gtccagcaac acattcccca gcaggtccac caaaccttct 1380 ccaatgaatc ccctgcctag cagccacatg cctggcgcct ttagcgagag caatagcagc 1440 tttcctcaga gcgccagcct gcctccttac tttagccagg gacctagcaa ccggccacct 1500 atcagagccg agggcagaaa ttttcccctg ccactgccta acaagcccag acctccatct 1560 cctgccgagg aagagaacag cctgaacgaa gagtggtacg tgtcctacat caccagacct 1620 gaagccgagg ctgccctgag aaagatcaac caggatggca cctttctcgt gcgggacagc 1680 agcaaaaaga ccaccaccaa tccttacgtg ctgatggtgc tgtacaagga caaggtgtac 1740 aacatccaga tccgctacca gaaagaaagc caggtgtacc tgctcggcac cggcctgaga 1800 ggcaaagagg attttctgag cgtcagcgac atcatcgact actttagaaa gatgcccctg 1860 ctgctgatcg acggcaagaa cagaggcagc agataccagt gcacactgac acacgctgcc 1920 ggctatcccg ggaattcctg a 1941

Claims (45)

  1. 상승된 수준의 SLP-76 폴리펩티드를 과발현 및/또는 함유하도록 변형된 분리된 재조합 세포를 포함하는 조성물로서, 상기 재조합 세포가 저밀도에서 발현된 표적 항원에 의해 활성화될 수 있는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 분리된 재조합 세포가 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 상기 TCR 또는 CAR 폴리펩티드가 표적 항원 또는 표적 항원을 특이적으로 인식하는 어댑터 분자에 대한 결합 친화성을 갖는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 분리된 재조합 세포가 TCR 폴리펩티드를 포함하고, 표적 항원이 표적 세포에 의해 발현되고 항원-제시 세포(APC)에 의해 TCR 폴리펩티드에 제공되는, 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 분리된 재조합 세포가 내인성 TCR 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 분리된 재조합 세포가 CAR 폴리펩티드를 포함하고, 표적 항원이 표적 세포에 의해 발현되는, 조성물.
  6. 제3항 또는 제5항에 있어서, 표적 세포가 증식성 질병, 혈액 악성종양, 고형 종양, 자가면역 질병, 염증, 알레르기 질병, 감염, 및/또는 노쇠/노화와 관련된 세포인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 표적 세포가 암 세포인 조성물.
  8. 제5항에 있어서, CAR 폴리펩티드가,
    a) 표적 항원 또는 표적 항원을 특이적으로 인식하는 어댑터 분자에 대한 결합 친화성을 갖는 세포외 리간드-결합 도메인;
    b) 막횡단 도메인;
    c) 근위 신호전달 분자를 포함하는 세포내 신호전달 도메인; 및
    d) 선택적으로, 힌지 도메인 및/또는 공동자극 도메인을 포함하는,
    조성물.
  9. 제8항에 있어서, CAR 폴리펩티드의 세포내 신호전달 도메인이 단백질 키나제, G 단백질, GTP-결합 단백질, 어댑터 신호전달 단백질, 또는 숙주 세포 활성화를 유도할 수 있는 스캐폴드 단백질의 전장 또는 생물학적 활성 단편을 포함하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 CD3ζ, CD3-엡실론, CD3-감마, DAP12, ZAP70, PLCG1, PKC, ITK, NCK, VAV1, GRB2, GADS, SOS1, ADAP, SYK, LYN, PI3K, 또는 BLNK, 또는 이의 생물학적 활성 단편, 돌연변이체, 또는 변이체를 포함하는 조성물.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 폴리펩티드 및/또는 CAR 폴리펩티드가 재조합 세포의 고갈을 유도하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, SLP-76 폴리펩티드의 과발현이 재조합 세포의 고갈을 향상시키지 않는 조성물.
  13. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 재조합 세포가 저밀도의 TCR 폴리펩티드 및/또는 CAR 폴리펩티드를 추가로 발현하는 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, SLP-76 폴리펩티드가 재조합 세포 막에 결합되는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, SLP-76 폴리펩티드가 막횡단 도메인을 통해 세포막에 결합되는 조성물.
  16. 제14항에 있어서, SLP-76 폴리펩티드가,
    i) SLP-76 폴리펩티드와 막 단백질 사이의 상호작용;
    ii) SLP-76 폴리펩티드와 막의 지방산 사이의 공유 결합; 및/또는
    iii) SLP-76 폴리펩티드와 막의 지질 극성 헤드 그룹 사이의 결합을 통해 세포막에 결합되는,
    조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, SLP-76 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1, 7, 14, 16, 18, 19, 40, 59 또는 60과 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 재조합 세포가 면역 세포인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 분리된 재조합 세포가 T 세포, 종양-침윤 림프구(TIL), 조절 T 세포(Treg), 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 단핵구, 감마 델타 T 세포, 줄기 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)-유래 NK 세포, 또는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)-유래 T 세포인 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 재조합 세포가 약 10, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1백만, 2백만, 3백만, 4백만, 5백만, 6백만, 7백만, 8백만, 9백만, 또는 1천만개 분자 미만의 표적 항원에 의해 활성화될 수 있는 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 항원에 반응하여 분리된 재조합 세포의 활성화가 세포 증식, 분화, 사이토카인 생산 및/또는 세포독성을 향상시키는 조성물.
  22. SEQ ID NO: 1, 7, 14, 16, 18, 19, 40, 59 또는 60과 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 SLP-76 폴리펩티드 및 막횡단 도메인을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  23. 제22항의 분리된 막-결합된 SLP-76 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  24. 제23항의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  25. 제24항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  26. i) 제23항의 분리된 폴리뉴클레오티드 및 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드;
    ii) 제24항의 발현 벡터 및 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 및/또는
    iii) 제23항의 분리된 폴리뉴클레오티드 및 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 조성물.
  27. SLP-76 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 재조합 세포를 생산하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 세포가 TCR 또는 CAR 분자를 추가로 포함하는 방법.
  29. SLP-76 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 재조합 세포를 생산하는 방법.
  30. 세포에서 SLP-76 폴리펩티드를 과발현시키는 단계를 포함하는, 표적 항원에 반응한 세포의 활성화를 향상시키는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 세포가 TCR 또는 CAR 분자를 추가로 포함하는 방법.
  32. SLP-76 폴리펩티드 및 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 세포에서 과발현시키는 단계를 포함하는, 표적 항원에 반응한 세포의 활성화를 향상시키는 방법.
  33. 약학적 유효량의 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법.
  34. i) 대상체에서 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포에 의해 발현되는 표적 항원의 발현 수준을 검출하는 단계로서, 상기 표적 항원이 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드에 의해 인지될 수 있는, 단계; 및
    ii) 표적 항원의 발현 수준이 대조군 수준보다 낮은 경우, T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 발현하고 SLP-76 폴리펩티드를 발현하는 약학적 유효량의 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는,
    질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 단계 ii) 전에 숙주 세포에 의한 표적 항원의 발현 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 단계 ii) 전에 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 발현하는 T 세포에서 SLP-76 폴리펩티드를 과발현시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, SLP-76 폴리펩티드가 막-결합되는 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 발현하지만 SLP-76 폴리펩티드는 발현하지 않는 T 세포가 질병 또는 장애를 치료할 수 없거나 단지 비효과적으로 또는 불충분하게 치료할 수 있는 방법.
  39. i) 대상체로부터 적어도 하나의 T 세포를 분리하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 T 세포가 T-세포 수용체(TCR) 폴리펩티드 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 발현하고, 상기 TCR 폴리펩티드 및/또는 CAR 폴리펩티드가 대상체에서 질병 또는 장애와 관련된 숙주 세포에 의해 발현된 표적 항원을 특이적으로 인식하는, 단계;
    ii) 분리된 적어도 하나의 T 세포에서 SLP-76 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및
    iii) SLP-76 폴리펩티드를 발현하는 약학적 유효량의 분리된 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는,
    질병 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 숙주 세포에 의해 발현된 표적 항원의 수준이 대조군 수준 미만인 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 단계 i) 전에 숙주 세포에 의한 표적 항원의 발현 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, SLP-76 폴리펩티드가 막-결합되는 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 적어도 하나의 T 세포가 종양 침윤 림프구(TIL)인 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, SLP-76 폴리펩티드를 발현시키는 것이 숙주 세포를 억제하거나 사멸시키는 적어도 하나의 T 세포의 활성을 향상시키는 방법.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 암 또는 종양 세포인 방법.
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