KR20230131204A

KR20230131204A - 암 세포에 결합하여 방사성핵종을 상기 세포에 표적화하는분할 항체

Info

Publication number: KR20230131204A
Application number: KR1020237023297A
Authority: KR
Inventors: 크리스티안 클라인; 알렉산더 하스; 자비네 임호프-융; 소피아 프로스트
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2021-01-12
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2023-09-12
Also published as: TW202241962A; WO2022152656A1; CO2023009153A2; CL2023001989A1; IL304224A; CR20230385A; MX2023008084A; PE20240690A1; EP4277705A1; AR124609A1; US20240082437A1; AU2022207615A1; CA3206466A1; JP2024504931A; CN116829593A

Abstract

본 발명은 표적 세포 상의 항원에 결합하고 이펙터 모이어티를 상기 세포에 표적화하는 항체 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

암 세포에 결합하여 방사성핵종을 상기 세포에 표적화하는 분할 항체

발명의 분야

본 발명은 이중특이성 항체의 새로운 형태(format)에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 또한 표적 세포 상의 항원에 결합하고 방사성 핵종을 상기 세포에 표적화하는 이러한 새로운 형태의 항체 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

배경

개별 세포 또는 특정 세포 유형의 선택적 파괴는 다양한 임상 환경에서 종종 바람직하다. 예를 들어, 건강한 세포와 조직을 온전하고 손상되지 않은 상태로 유지하면서 종양 세포를 특이적으로 파괴하는 것이 암 치료의 주요 목표이다.

이와 관련하여, 표적 세포 상의 표면 항원에 하나의 "팔"로 결합하고 약물과 같은 이펙터 모이어티에 두 번째 "팔"로 결합하는 이중특이성 항체가 설계되었다. 매우 다양한 이중특이성 형태들이 개발되었지만 이중특이성 항체를 개발하는 작업은 결코 사소한 일이 아니다.

사전표적화된 방사면역요법(PRIT)에서, 한편으로는 종양 관련 항원에 대해, 다른 한편으로는 방사성 표지 화합물(radiolabelled compound)에 대해 친화성을 갖는 항체 구조체가 사용된다. 첫 번째 단계에서, 항체가 투여되고 종양에 국재화된다. 이어서, 방사성 표지 화합물이 투여된다. 방사성 표지 화합물이 작기 때문에 종양에 빠르게 전달될 수 있고 결합되지 않은 화합물은 빠르게 제거되어 종양 외부의 방사선 노출을 감소시킨다(Goldenberg 외, Theranostics 2012, 2(5), 523-540). 이미징에도 유사한 절차를 사용할 수 있다. 사전표적화는 아비딘-비오틴을 사용하는 이중특이성 항체 또는 시스템을 사용할 수 있지만 후자는 아비딘/스트렙타비딘이 면역원성이라는 단점이 있다.

사전표적화 방사면역요법 또는 이미징 방법은 일반적으로 제거제 또는 차단제를 사용하는데, 이는 항체 투여 단계와 방사성 표지 화합물 투여 단계 사이에 투여된다. 그 목적은 혈액에서 항체를 제거하고/하거나 방사성 표지 화합물에 대한 순환 항체의 결합 부위를 차단하는 것이다(예를 들어, Karacay 외, Bioconj. Chem., 13(5), 1054-1070(2002) 참조). 제거제 또는 차단제를 사용하면 해로운 독성을 제한하면서 효율적인 치료에 충분한 수준의 방사능을 투여할 수 있지만, 시기와 용량을 신중하게 선택해야 하며 제거제는 유해 효과, 예를 들어, 면역 반응을 초래할 가능성이 있다. 따라서, 제거 단계의 사용은 사전표적화 방법에서 복잡한 양상이다.

요약

본 발명은 이펙터 모이어티에 대한 VH 및 VL 도메인이 두 부분으로 분할되는 이중특이성 항체에 대한 새로운 형태 및 이의 사용 방법을 제공한다.

특히, 본 발명은 다음을 포함하는 항체 세트에 관한 것이다:

i) 다음을 포함하는 제1 항체:

a) 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티;

b) 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 항체 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드; 및

c) 2개의 서브유닛을 포함하는 Fc 도메인,

이 때 (b)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (a)의 항체 결합 모이어티의 C-말단에 그리고 그 C-말단에 의해 (c)의 Fc 도메인의 서브유닛들 중 하나의 N-말단에 융합되며;

이러한 제1 항체는 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 포함하지 않고; 및

ii) 다음을 포함하는 제2 항체:

d) 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티;

e) 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드; 및

f) 2개의 서브유닛을 포함하는 Fc 도메인,

이 때 (e)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (d)의 항원 결합 모이어티의 C-말단에 그리고 그 C-말단에 의해 (f)의 Fc 도메인의 서브유닛들 중 하나의 N-말단에 융합되며;

이러한 제2 항체는 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하지 않으며;

상기 제1 항체의 VH 도메인 및 상기 제2 항체의 VL 도메인은 함께 이펙터 모이어티에 대한 기능적 항원 결합 부위를 형성할 수 있다.

제1 항체도 제2 항체도 이펙터 모이어티에 대한 기능적 항원 결합 부위를 그 자체로 포함하지 않는다. 제1 항체는 이펙터 모이어티에 대한 기능적 결합 부위의 V_H 도메인만을 갖고 V_L도메인은 갖지 않는다. 제2 항체는 V_L 도메인만 있고 V_H 도메인은 없다.

이펙터 모이어티에 대한 기능적 항원 결합 부위는 제1 및 제2 항체의 V_H 및 V_L 도메인이 결합될 때 형성된다. 이는, 예를 들어, 제1 및 제2 항체가 동일한 개별 표적 세포 또는 인접 세포에 결합될 때 발생할 수 있다.

본원에 기재된 제1 및 제2 항체는 본원에서 "단일 도메인 분할 항체", "분할 항체", "SPLIT", "헤미바디" 또는 "데미바디"로 지칭될 수 있다. 이펙터 모이어티에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 함께 형성하는 V_H 및 V_L 도메인은 2개의 항체 사이에서 분할되며, 동일한 항체의 일부로 존재하지 않는다.

분할 도메인 형태는 이펙터 모이어티가 그 자체로 제1 항체에 또는 그 자체로 제2 항체에 결합할 수 없음을 의미한다. 혈액에서, 제1 항체와 제2 항체 사이에는 안정한 결합이 거의 없거나 전혀 없으며, 그리하여 방사성 표지 화합물의 안정한 결합은 거의 또는 전혀 없다.

표적 세포의 표면에서 발현되는 항원은 본원에서 "표적 항원", "표적 세포 항원" 또는 "TA"로 지칭될 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 제1 항체와 제2 항체는 서로 다른 표적항원들에 또는 동일한 표적항원에 결합하는 항원 결합 모이어티를 가질 수 있다. (의심의 여지를 없애기 위해, 항체가 동일한 표적 항원에 결합한다고 언급한 경우, 이는 항체가 동일한 표적 항원에 결합할 수 있는 결합 부위를 가지고 있음을 의미하며 항체가 서로 동일한 2개의 개별 항원 분자에 결합할 수 있는 가능성을 포함한다). 예를 들어, 한 실시형태에서, 제1 및 제2 항체 모두 CEA에 결합한다.

일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항체는 동일한 표적 항원의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다(동일한 에피토프에 대한 결합 부위를 가질 수 있다). 다른 실시형태에서, 제1 및 제2 항체는 동일한 표적 항원의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다(상이한 에피토프에 대한 결합 부위를 가질 수 있다).

일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항체는 표적 항원에 대해 동일한 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들은 V_L 및 V_H 서열을 포함하는 표적 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함할 수 있으며, 이 때 이러한 항원 결합 부위를 형성하는 V_L 및 V_H 서열들은 제1 및 제2 항체에서 동일하다.

"이펙터 모이어티"라는 용어는 표적 세포에 대한 원하는 효과를 담당하는 모이어티를 의미한다. 한 실시형태에서, 원하는 효과는 세포 사멸이다. 예를 들어, 이펙터 모이어티는 표적 세포를 사멸시키는 데 사용되는 방사성 핵종, 약물 또는 독소일 수 있다. 한 실시형태에서, 이펙터 모이어티는 방사선 요법에 적합한 방사성 표지 화합물일 수 있다. 다른 실시형태에서, 원하는 효과는 표지화이고 이펙터 모이어티는 이미징에 적합한 방사성 표지 화합물일 수 있다.

일부 실시형태에서, (a) 및 (d)의 항원 결합 모이어티는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, 교차-Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자(예를 들어, scFv 또는 scFab); 또는 VHH와 같은 단일 도메인 항체(dAbs); 또는 DARPin(설계된 안키린 반복 단백질)과 같은 비-항체 결합 스캐폴드; 아피바디; sso7d; 모노바디 또는 안티칼린일 수 있다.

일부 실시형태에서, (a)의 항원 결합 모이어티 및 (d)의 항원 결합 모이어티는 Fab인 것이 바람직할 수 있다. 이러한 실시형태에서, (b)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (a)의 Fab 단편의 사슬들 중 하나의 C-말단에 융합되고; (e)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (d)의 Fab 단편의 사슬들 중 하나의 C-말단에 융합된다. 마찬가지로, 항원-결합 모이어티가 하나 초과의 사슬을 포함하는 다른 실시형태에서, 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 상기 사슬들 중 하나의 C-말단에 융합될 수 있다.

Fc 영역의 존재는 면역요법 및 이미징의 맥락에서, 예를 들어, 단백질의 순환 반감기를 연장하고/하거나 더 작은 단편들에서 관찰될 수 있는 것보다 종양 흡수를 더 높이는 것과 같은 이점을 갖는다. 본원에 기술된 "분할 도메인" 형태는 이와 관련하여 특히 유리할 수 있는데, 왜냐하면 이는 순환 항체의 장기간 존재로 인해 발생하게 되는 이펙터 모이어티/방사선 표지 화합물과의 더 큰 결합 가능성을 완화시키기 때문이다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 Fc 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하도록 변형된다.

본원에 기재된 형태에 의해 이펙터 모이어티에 대한 VL 및 VH의 오프 타겟 결합이 유의하게 없어진다. 더욱이, 본 발명에 따른 항체는 감소된 항-약물 항체 반응 및/또는 안정성 양상에서 이점을 가질 수 있다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기술된 항체들의 세트를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 각각이 본원에 기재된 항체들 중 하나(즉, 각각 제1 항체 및 제2 항체)를 포함하는 2개의 개별 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

추가 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항체 또는 항체 세트를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 세트에 관한 것이다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들을 포함하는 벡터 또는 벡터 세트, 선택적으로 발현 벡터 또는 발현 벡터 세트에 관한 것이다. 추가 목적에서, 본 발명은 본 발명의 벡터 또는 벡터 세트를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포 또는 숙주 세포 세트에 관한 것이다. 또한 이러한 숙주 세포(들)를 배양하여 항체를 생산하는 단계를 포함하는 항체 생산 방법이 제공된다.

이펙터 분자가 방사성 표지 화합물인 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항체는 사전표적화 방사선 면역요법(PRIT) 방법 또는 사전표적화 방사선 이미징 방법에서 사용된다.

한 양상에서, 본 발명은 다음을 포함하는 사전표적화된 방사선면역요법을 제공한다:

i) 대상체에게 상기 기술된 바와 같이 제1 항체 및 제2 항체를 투여하는 단계; 및

ii) 후속적으로 상기 대상체에게 방사성 표지 화합물을 투여하는 단계.

또 다른 양상에서, 본 발명은, 제1 항체 및 제2 항체를 대상체에게 투여하는 단계, 및 후속적으로 상기 대상체에게 방사성 표지 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법에 사용하기 위한 상기 기술된 제1 항체 및 제2 항체를 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은, 제1 항체를 대상체에게 투여하는 단계, 및 후속적으로 상기 대상체에게 방사성 표지 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법에 사용하기 위한 상기 기술된 제1 항체 및 제2 항체를 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은, 제2 항체를 대상체에게 투여하는 단계, 및 후속적으로 상기 대상체에게 방사성 표지 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법에 사용하기 위한 상기 기술된 제1 항체 및 제2 항체를 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 다음을 포함하는 방사선이미징 방법을 제공한다:

i) 대상체에게 본원에 기재된 제1 및 제2 항체를 투여하는 단계, 이 때 항체는 표적 항원에 결합하여 표적 항원을 발현하는 세포의 표면에 국재화하며;

ii) 후속적으로 방사성 표지 화합물을 투여하는 단계; 그리고 선택적으로

iii) 방사성 핵종이 국재화되어 있는 조직 또는 장기를 이미징하는 단계.

또 다른 양상에서, 본 발명은 인간 또는 동물 신체에서 수행되는 진단 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 제1 및 제2 항체를 제공하며, 이 때 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

이미징 단계 후 진단을 형성하는 단계 및 선택적으로 그 진단을 대상체에게 전달하는 단계가 이어질 수 있다. 일부 실시형태에서 상기 방법은 적절한 치료를 결정하는 단계 및 선택적으로 상기 치료를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

각각의 상기 방법/용도에서, 동일하거나 인접한 표적 세포에 대한 제1 및 제2 항체의 결합은 방사성 표지 화합물에 대한 항원 결합 부위의 V_H 및 V_L 도메인들의 결합 및 방사성 표지 화합물의 기능적 항원 결합 부위의 형성을 초래한다. 따라서, 방사성 표지 화합물의 투여 후, 방사성 표지 화합물은 V_H 및 V_L의 결합에 의해 형성된 기능적 항원 결합 부위에 결합한다.

본원에 기술된 임의의 방법 및 용도에서, 제1 항체 및 제2 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다.

당업계에서 흔히 PRIT 또는 방사선이미징 방법은 제거 단계를 수반한다. 제거 단계는 항체의 투여와 방사성 표지 화합물의 투여 사이에 제제를 투여하는 단계를 포함하며, 이 때 제제는 혈액으로부터 항체의 제거 속도를 증가시키고/시키거나 항체에 대한 방사성 표지 화합물의 결합을 차단한다.

본원에 기재된 방법 및 용도의 실시형태에서, 상기 방법은 제거 단계를 포함하지 않는다. 즉, 제1 및 제2 항체 투여와 방사성 표지 화합물 투여 사이(즉, 항체 투여 후 방사성 표지 화합물 투여 전)에 제거제 또는 차단제를 투여하는 단계를 포함하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 제1 항체 및 제2 항체의 투여와 방사성 표지 화합물의 투여 사이에, 임의로 방사선감작제, 면역요법제 및/또는 화학요법제 이외에 어떠한 제제도 투여되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 제1 항체 및 제2 항체의 투여와 방사성 표지 화합물의 투여 사이에 제제가 투여되지 않는다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항체는 병용 요법의 일부로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 이들은 하나 이상의 방사선감작제, 면역요법제 및/또는 화학요법제와 함께 투여될 수 있다: 방사선감작제, 면역요법제 또는 화학요법제 및 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다.

본원에 기술된 방사선이미징 방법 및 방사선면역요법은 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이 선택적으로 병용될 수 있다.

추가 양상에서, 본 발명은 다음을 포함하는 키트를 제공한다:

i) 본원에 기재된 제1 및 제2 항체;

ii) 제1 항체와 제2 항체의 결합에 의해 형성된 항원 결합 부위에 결합하는 방사성 표지 화합물.

선택적으로 키트는 본원에 기재된 제거제 또는 차단제를 배제할 수 있다(즉, 포함하지 않는다).

선택적으로 키트는 방사선감작제, 면역요법제 또는 화학요법제를 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항체는 동일한 약학 조성물에 존재할 수 있다. 다른 실시형태에서, 제1 및 제2 항체는 별도의 약학 조성물에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방사성 표지 화합물은 항체와 별도의 약학 조성물에 존재한다.

다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항체는, 예를 들어, 암 치료를 위해 표적 세포를 선택적으로 사멸시키는 방법에서 사용된다.

도면의 간단한 설명
도 1은 비교예에 속하는 표적 항원(TA)-DOTAM 이중특이성 항체(TA-DOTAM BsAb) 및 예시적인 TA-분할-DOTAM-VH/VL 항체의 개략적인 구조를 나타낸다.
도 2는 종양 세포 상의 분할-VH/VL DOTAM 결합제의 조립을 보여주는 개략도이다. TA-분할-DOTAM-VH/VL 항체는 DOTAM 바인더의 두 도메인이 조립되는 표적 세포의 종양 항원(TA)에 결합하지 않는 한 212Pb-DOTAM에 유의하게 결합하지 않는다.
도 3은 제거제 사용을 포함하는 3단계 TA-PRIT 개념의 예에 대한 개략도를 나타낸다.
도 4는 제거제가 사용되지 않는 2단계 TA-PRIT 개념의 예에 대한 개략도를 나타낸다.
도 5는 CEA 결합 능력을 입증하기 위한 MKN45 세포에 대한 분할 항체의 결합을 나타낸다. 항체 검출은 인간 IgG 특이적 2차 항체를 사용하여 수행된다.
도 6는 DOTAM 결합 능력을 입증하기 위해 MKN45 세포에 대한 분할 항체의 결합을 나타낸다. 항체 검출은 Pb-DOTAM-FITC를 사용하여 수행된다.
도 7A는 SC BxPC3 종양을 보유한 SCID 마우스에서 수행된, CEA-분할-DOTAM-VH/VL을 사용한 2단계 PRIT에 대한 예시적인 프로토콜을 보여준다(h = 시간, d = 일, w = 주).
도 7B는 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 마우스에서 수행된 3단계 PRIT 대조군에 관한 예시적인 프로토콜을 보여준다(h=시간, d=일, w=주).
도 8은 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 마우스에서 CEA-분할-DOTAM-VH 단독, CEA-분할-DOTAM-VL 단독 또는 두 개의 상보적인 항체 병용, 또는 표준 3단계 PRIT를 사용함으로써 사전 표적된 ²¹²Pb -DOTAM의 주사 6시간 후 사전표적화된 ²¹²Pb-DOTAM의 체내분포를 나타낸다(%ID/g ± SD, n = 4).
도 9는 SCID 마우스에서 IV 주사 후 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 약동학을 나타낸다.
도 10은 SC BxPC3 종양을 보유한 SCID 마우스에서 2단계(위) 또는 3단계(아래) CEA-PRIT를 포함하는 프로토콜 158의 실험 설계를 보여준다. *CEA 분할 DOTAM BsAb 용량은 2/4 구조체들에서 홀/홀 불순물을 보충하도록 조정되었다.
도 11은 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 마우스에서 사전표적화된 ²¹²Pb -DOTAM의 체내분포를 보여준다(6 h p.i.). 이러한 분포는 CEA-DOTAM BsAb 또는 CEA-분할-DOTAM 항체의 이중 파라토프 조합에 의해 사전표적화된, ²¹²Pb -DOTAM 주사 후 6시간에서 종양 보유 SCID 마우스에서의 ²¹²Pb이다. 장기 및 조직의 방사능 함량은 평균 % ID/g ± SD(n = 4)로 표시된다.
도 12는 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 마우스에서 3단계 CEA-PRIT(위), 2단계 CEA-PRIT(중간) 또는 1단계 CEA-RIT의 1주기를 포함하는 프로토콜 160의 실험 일정을 나타낸다. 체내분포(BD) 스카우트는 방사성물질 주사 후 24시간 후에 안락사시킨 반면, 효능 그룹의 마우스는 종료(termination) 기준에 도달할 때까지 유지하고 주의 깊게 모니터링했다.
도 13은 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 마우스에서 사전표적화된 ²¹²Pb -DOTAM 및 ²¹²Pb -DOTAM-CEA-DOTAM의 체내분포를 보여준다(24 h p.i.). 이러한 분포는 CEA-DOTAM-사전표적화된-²¹²Pb-DOTAM 또는 사전 인큐베이션된 ²¹²Pb-DOTAM-CEA-DOTAM 주사 후 24시간에 종양 보유 SCID 마우스에서 ²¹²Pb의 분포이다. 장기 및 조직의 방사능 함량은 평균 % ID/g ± SD(n = 3)로 표시된다.
도 14는 BxPC3 모델(n=10)에서 PRIT-처리 그룹 및 대조군(그룹 A-E)에 대한 종양 성장 평균을 표준 오차와 함께 나타낸다. 곡선은 n<5에서 절두되었다. 점선 수직선은 연구 설계에 따라 일부 또는 모든 그룹에 대해 ²¹²Pb-DOTAM 투여(20 μCi)를 나타낸다.
도 15는 BxPC3 모델(n=10)에서 PRIT-처리 그룹 및 대조군(그룹 A-E)에 대한 종양 성장 평균을 표준 오차와 함께 나타낸다. 점선 수직선은 ²¹²Pb 표지 화합물(20 μCi)의 투여를 나타낸다.
도 16은 BxPC3 모델에서 CEA-PRIT 및 CEA-RIT(그룹 A-E, n=10)로 처리된 마우스의 평균 체중 감소를 나타낸다. 곡선은 n<5에서 절두되었다. 점선 수직선은 연구 설계에 따라 일부 또는 모든 그룹에 대해 ²¹²Pb-표지 화합물들의 투여를 나타낸다.
도 17은 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 마우스에서 2단계 CEA-PRIT를 포함하는 프로토콜 175의 실험 설계를 나타내는데, ²¹²Pb-DOTAM 주사 24시간 후 희생 및 부검이 이루어졌다. CEA-분할-DOTAM-VH-AST 용량은 홀/홀 불순물을 보충하도록 조정되었다.
도 18은 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체에 의해 사전표적화된 ²¹²Pb-DOTAM 주사 24시간 후 종양 보유 SCID 마우스에서 ²¹²Pb의 분포를 나타낸다(프로토콜 175). 장기 및 조직의 방사능 함량은 평균 % ID/g ± SD(n = 4)로 표시된다.
도 19는 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 마우스에서 2단계 CEA-PRIT를 포함하는 프로토콜 185의 실험 설계를 나타내는데, ²¹²Pb-DOTAM 주사 6시간 후 희생 및 부검이 이루어졌다. CEA-분할-DOTAM-VH-AST(CH1A1A) 용량은 홀/홀 불순물을 보충하도록 조정되었다.
도 20은 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체에 의해 사전표적화된 ²¹²Pb-DOTAM 주사 6시간 후 종양 보유 SCID 마우스에서 ²¹²Pb의 분포를 나타낸다(프로토콜 185). 장기 및 조직의 방사능 함량은 평균 % ID/g ± SD(n = 5)로 표시된다.
도 21은 주사 후 7일 후 2개의 선택된 SC BxPC3 종양에서 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍(조합된 VH 및 VL 항체)의 분포를 나타낸다. A 및 B는 T84.66을 표적으로 하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL을 주사한 마우스 A3의 종양 단면을 나타내는데, 여기서 A는 CEA 발현을 나타내고 B는 해당 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 분포를 나타낸다. C 및 D는 CH1A1A를 표적으로 하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL을 주사한 마우스 C5의 종양 단면을 나타내며: C는 CEA 발현을 나타내고 D는 해당 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 분포를 나타낸다.
도 22는 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 마우스에서 2단계 CEA-PRIT를 포함하는 프로토콜 189의 실험 설계를 나타내는데, ²¹²Pb-DOTAM 주사 6시간 후 희생 및 부검이 이루어졌다. CEA-분할-DOTAM-VH-AST(CH1A1A) 용량은 홀/홀 불순물을 보충하도록 조정되었다.
도 23은 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체(T84.66 및 CH1A1A)의 이중 파라토프 쌍에 의해 사전표적화된 ²¹²Pb-DOTAM 주사 6시간 후 종양 보유 SCID 마우스에서 ²¹²Pb의 분포를 양성 대조군(CH1A1A 단독)과 비교하여 나타낸다. 장기 및 조직의 방사능 함량은 평균 % ID/g ± SD로 표시된다.
도 24는 SPLIT 항체에 대해 FACS로 결정된 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다. FACS에 의해 결정된 Pb-DOTA-FITC의 결합은 Pb-DOTA-FITC와 두 SPLIT 항체를 공동 인큐베이션한 경우에 대해서만 나타날 수 있다. 단일 SPLIT 항체는 유의미한 신호를 생성하지 않았다.
도 25A-C는 분할 항체의 예시적인 형태들을 나타낸다.
도 26은 실시예 8, 실험 1로부터 얻은, 칩에 포획된 비오티닐화된 DOTAM에 대한 개별 TA-분할-DOTAM-VH 및 TA-분할-DOTAM-VL 항체의 결합을 평가한 결과를 나타낸다.
도 27은 실시예 8, 실험 2로부터 얻은, 칩에 포획된 개별 TA-분할-DOTAM-VH 및 TA-분할-DOTAM-VL 항체에 대한 DOTAM의 결합을 평가한 결과를 나타낸다.
도 28은 실시예 8, 실험 3으로부터 얻은, 칩에 포획된 TA-분할-DOTAM-VH/VL 항체(항체 쌍)에 대한 DOTAM의 결합을 평가한 결과를 나타낸다.
도 29는 추가의 예시적인 TA-분할-DOTAM-VH/VL 항체의 개략적 구조를 나타낸다. 도 29A는 표적 항원에 대해 1가인 형태를 보여준다. 도 29B는 표적 항원에 대해 2가인 형태를 보여준다.
도 30은 SC BxPC3 종양을 보유한 SCID 마우스에서 2단계 SPLIT PRIT 요법을 포함하는 프로토콜 193의 실험 설계를 나타낸다.
도 31은 N-말단 SPLIT에 의해 사전표적화된 ²¹²Pb-DOTAM 주사 6시간 후 종양 보유 SCID 마우스에서 ²¹²Pb의 분포를 나타낸다(실시예 9로부터 얻은 결과).

I. 정의

본원의 목적과 관련하여 "수용체 인간 프레임워크"는 하기 정의된 바와 같이, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 "유래된" 수용체 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 양상들에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하이다. 일부 양상들에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.

"친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체)와 이의 결합 짝(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 강도를 의미한다. 달리 표시되지 않은 한, 본원에 기재된 "결합 친화도"는 결합쌍(예를 들면, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 의미한다. 분자 X의 그 짝 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(K_D)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 해당 분야에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정 될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적인 설명적 및 예시적 방법은 아래에 기재되어 있다.

"친화도 성숙된" 항체는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)에 하나 이상의 변경을 보유하지 않는 모 항체와 비교하여 이러한 변경이 있는 항체를 지칭하며, 이러한 변경은 항원에 대한 항체의 친화도를 개선한다.

용어 "표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 결합하는 항체"는 항체가 상기 항원을 표적화하는데 진단 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 상기 항원에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 양상에서, 관련없는, 비 항원 단백질에 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정한 항원에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 양상들에서, 표적 세포의 표면 상에서 발현된 항원에 결합하는 항체는 ≤　1μM, ≤　100 nM, ≤　10 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM(예를 들어, 10^-8M 또는 그 미만, 예를 들어, 10^-8M 내지 10^-13M, 예를 들어, 10^-9M 내지 10^-13 M)의 해리 상수(K_D)를 갖는다. 항체의 K_D가 1μM 이하일 때 항체는 표적 세포의 표면상에서 발현된 항원에 "특이적으로 결합"한다고 한다. 특정 양상에서, 항체는 상이한 종들의 상기 항원 사이에서 보존된 상기 항원의 에피토프에 결합한다.

용어 "이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위" 또는 "이펙터 모이어티에 대한 기능적 항원 결합 부위"는 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항원 결합 부위를 말하며, 항체가 이펙터 모이어티를 항체와 결합시키기 위한 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 이펙터 모이어티에 결합할 수 있다. 한 양상에서, 관련없는, 비 항원 화합물에 대한 항원 결합 부위의 결합 정도는, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정한 이펙터 모이어티에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 양상에서, 이펙터 모이어티에 결합하는 항원 결합 부위는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10^-8 M 이하, 예를 들어, 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들어, 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수(K_D)를 가진다. 100pM, 50pM, 20pM, 10pM, 5pM, 1pM 이하, 예를 들어, 0.9pM 이하, 0.8pM 이하, 0.7pM 이하, 0.6pM 이하 또는 0.5pM 이하의 K_D를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 기능적 결합 부위는 K_D of 약 1pM-1nM, 예를 들어, 약 1-10 pM, 1-100pM, 5-50 pM, 100-500 pM 또는 500pM-1 nM로 이펙터 모이어티에 결합할 수 있다. 항원 결합 부위는 항원 결합 부위의 K_D가 1μM 이하일 때 이펙터 부분에 "특이적으로 결합"한다고 한다.

본원에서 용어 “항체”는 가장 넓은 의미로 사용되고, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체 (예를 들면, 이중특이성 항체), 및 항체 단편을 포함하는, 다양한 항체 구조를 포괄한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 개별적인 또한 기능적 항원 결합 부위의 VH 도메인 또는 VL 도메인을 포함하는 개별 반항체들(hemibodies)을 포함한다.

항체 단편은 온전한(intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, 교차-Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예컨대, scFv, 및 scFab); 단일 도메인 항체들 (dAbs); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편들에 대한 검토는, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)를 참조한다. 용어 "Fab 단편"은 면역글로불린의 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 경쇄의 VL 및 CL 도메인으로 구성된 단백질을 의미한다. "Fab' 단편"은 항체 힌지(hinge)의 영역으로부터의 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하여 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 잔기들의 부가에 의해, Fab 단편과 상이하다. 구조 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프 잔기를 포함하고 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')₂ 단편에 대한 논의는 미국 특허 제5,869,046을 참조하라.

본원에서 사용되는 "Fab 단편"에 대한 언급은 교차-Fab 단편 또는 scFab, 뿐만 아니라 통상적인 Fab 단편(즉, VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 경쇄, 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 단편을 포함하는 것)을 포함하는 것으로 한다.

용어 "교차-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "교차 Fab 단편"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환된 Fab 단편을 지칭한다. 교차 Fab 단편은 경쇄 가변 영역(VL)과 중쇄 불변 영역 1(CH1)로 구성된 폴리펩티드 사슬, 및 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 명확성을 위해, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 영역이 교환되는 교차 Fab 분자에서, 중쇄 불변 영역을 포함하는 펩티드 사슬이 본원에서 교차 Fab 분자의 "중쇄"로 지칭된다. 역으로, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 영역이 교환되는 교차 Fab 분자에서, 중쇄 가변 영역을 포함하는 펩티드 사슬이 본원에서 교차 Fab 분자의 "중쇄"로 지칭된다.

본원에 사용된 용어 "단일 사슬"은 펩티드 결합에 의해 선형으로 연결된 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 지칭한다. 단일 사슬 Fab 분자는 Fab 경쇄와 Fab 중쇄가 펩티드 링커에 의해 연결되어 단일 펩티드 사슬을 형성하는 Fab 분자이다. 이러한 특정 실시형태에서, Fab 경쇄의 C-말단은 단일 사슬 Fab 분자에서 Fab 중쇄의 N-말단에 연결된다.

비대칭 Fab 팔은 또한, 하전된 또는 비-하전된 아미노산 돌연변이를 도메인 인터페이스 내로 도입하여 정확한 Fab 페어링을 지시하도록 함으로써 조작될 수 있다. 예를 들어, WO 2016/172485 참조.

“단일 사슬 가변 단편” 또는 “scFv”는 펩티드 링커에 의해 연결된, 항체의 중쇄 (VH)와 경쇄 (VL)의 가변 도메인의 융합 단백질이다. 특히, 링커는 10 내지 25개 아미노산의 짧은 폴리펩티드이고, 그리고 통상적으로, 유연성을 위한 글리신뿐만 아니라 용해도를 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부하고, 그리고 VH의 N 말단을 VL의 C 말단과 연결하거나 또는 그 반대일 수 있다. 이 단백질은 불변 영역의 제거와 링커의 도입에도 불구하고 원래 항체의 특이성을 유지한다. scFv 단편들의 검토에 관하여, 예로써, Pluckth

n, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); WO 93/16185; 그리고 미국 특허 제5,571,894 및 5,587,458을 또한 참조한다.

용어 "차단제"는 이펙터 분자, 특히 방사성 표지 화합물의 이펙터 분자에 대한 기능적 결합 부위에 대한 결합을 차단하는 제제를 지칭한다. 일반적으로 상기 차단제는 이펙터 분자에 대한 기능적 결합 부위에 결합한다, 예를 들어, 상기 기능적 결합 부위에 특이적으로 결합한다.

용어 "제거제"는 대상체의 순환계로부터 항체의 제거율을 증가시키는 제제를 의미한다. 일반적으로 제거제는 항체에 결합한다, 예를 들어, 항체에 특이적으로 결합한다.

본원에서 사용되는 용어 "제거 단계" 또는 "제거 시기(clearing phase)"은 차단제 또는 제거제의 사용을 포함한다. 일부 제제들은 제거 및 차단제로 기능할 수 있다.

용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 단백질성 또는 비단백질성 항원 상의 부위를 나타낸다. 에피토프는 인접한 아미노산 스트레치들 모두(선형 에피토프)로부터 형성될 수 있거나, 예를 들어 항원의 폴딩으로 인해, 즉 단백질성 항원의 3차 폴딩에 의해 공간적으로 근접하게 되는 비연속 아미노산(입체형 에피토프)을 포함할 수 있다. 선형 에피토프는 전형적으로 단백질성 항원이 변성제에 노출된 후에도 여전히 항체에 의해 결합되는 반면, 입체형 에피토프는 전형적으로 변성제로 처리시 파괴된다. 에피토프는 고유한 공간 형태에 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상 또는 8-10개 아미노산을 포함한다.

특정 에피토프에 결합하는 항체(즉, 동일한 에피토프에 결합하는 항체)에 대한 스크리닝은, 예를 들어, 제한 없이, 알라닌 스캐닝, 펩티드 블롯(Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463 참조), 펩티드 절단 분석, 에피토프 절제, 에피토프 추출, 항원의 화학적 변형(Prot. Sci. 9 (2000) 487-496 참조) 및 교차 차단("Antibodies", Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY) 참조)과 같은 당업계의 일상적인 방법을 사용하여 수행할 수 있다.

수정-보조 프로파일링(Modification-Assisted Profiling, MAP)으로도 알려진 항원 구조-기반 항체 프로파일링(ASAP)은 다수의 항체 각각의 결합 프로필을 기반으로 항원에 특이적으로 결합하는 다수의 단클론 항체를 화학적 또는 효소적으로 변형된 항원 표면에 비닝할 수 있다(예를 들어, US 2004/0101920 참조). 각 빈의 항체는 동일한 에피토프에 결합하는데, 이는 또 다른 다른 빈으로 나타내어지는 에피토프와 뚜렷하게 다르거나 부분적으로 중첩되는 독특한 에피토프일 수 있다.

또한 경쟁적 결합은 항체가 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 결합을 위해 경쟁하는지 여부를 쉽게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 분석에서 참조 항체의 그 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하며, 반대로, 참조 항체는 경쟁 분석에서 이러한 항체의 그 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단한다. 또한, 예를 들어, 항체가 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 참조 항체는 포화 조건에서 항원에 결합시킨다. 과량의 참조 항체를 제거한 후, 해당 항체가 항원에 결합하는 능력을 평가한다. 참조 항체의 포화 결합 후 문제의 항체가 항원에 결합할 수 있는 경우, 문제의 항체는 참조 항체 이외의 다른 에피토프에 결합한다고 결론 내릴 수 있다. 그러나 참조 항체의 포화 결합 후 문제의 항체가 항원에 결합할 수 없는 경우, 문제의 항체는 참조 항체가 결합한 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 문제의 항체가 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 입체적인 이유로 인해 결합이 방해를 받는지 확인하기 위해 관례적인 실험을 사용할 수 있다(예를 들어, ELISA, RIA, 표면 플라즈몬 공명, 유세포 분석 또는 당업계에서 이용가능한 기타 정량적 또는 정성적 항체-결합 검정). 이 분석은 두 가지 설정, 즉, 두 항체가 모두 포화 항체인 상태에서 수행되어야 한다. 두 설정 모두에서 제1(포화) 항체만 항원에 결합할 수 있는 경우, 문제의 항체와 참조 항체가 항원에 결합하기 위해 경쟁한다고 결론을 내릴 수 있다.

일부 양상에서, 경쟁적 결합 검정에서 측정하여, 1배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 과량의 한 항체가 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90% 또는 심지어 99% 이상만큼 다른 항체의 결합을 억제하는 경우, 2개의 항체는 동일하거나 중복되는 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다(예를 들어, Junghans 외, Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502 참조).

일부 양상에서, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원 내의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 또한 다른 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2개의 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 아미노산 돌연변이의 하위집합만이 다른 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2개 항체는 "중복되는 에피토프"를 갖는 것으로 간주된다.

용어 “키메라” 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 출처 또는 종으로부터 유래되지만, 중쇄 및/또는 경쇄의 잔부는 상이한 출처 또는 종들로부터 유래한 항체를 지칭한다.

항체의 "분류(class)"란 항체의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체에는 5가지 주요 분류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM가 있으며, 이들 중 몇몇은 하위분류(이소형), 예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁, 및 IgA₂로 더욱 세분될 수 있다. 특정 양상들에서, 항체는 IgG₁ 이소형의 항체이다. 특정 양상에서, 항체는 Fc-영역 이펙터 기능을 감소시키는 P329G, L234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 IgG₁ 이소형이다. 다른 양상에서, 항체는 IgG₂ 이소형이다. 특정 양상에서, 항체는 IgG₄ 항체의 안정성을 개선하기 위해 힌지 영역에 S228P 돌연변이를 갖는 IgG₄ 이소형이다. 상이한 면역글로불린 분류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 차례로 α, δεγ및 μ로 불린다. 항체의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파 (κ및 람다 (λ라고 하는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다.

"Fc 이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하며, 이는 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능들의 예에는 다음이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식균 작용; 세포 표면 수용체들 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 그리고 B 세포 활성화.

제제, 예를 들어, 약학 조성물의 "유효량"은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 그리고 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.

용어 "탠덤 Fab"는 펩티드 링커/테더를 통해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 항체를 의미한다. 일부 실시형태에서, 탠덤 Fab는 펩티드 링커/테더에 의해 연결된 하나의 Fab 단편 및 하나의 교차-Fab 단편을 포함할 수 있다.

본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 본원에서 용어 "Fc 도메인"은 제1 불변 영역을 제외한 2개의 중쇄의 불변 영역을 포함하는 면역글로불린의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 그러므로, Fc 도메인은 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인을 지칭할 수 있다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230에서 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, 숙주 제포에 의해 생성된 항체는 중쇄의 C-말단으로부터 하나 이상, 특히 1개 또는 2개의 아미노산의 번역후 절단을 거칠 수 있다. 따라서, 전장 중쇄를 인코딩하는 특이성 핵산 분자의 발현에 의해 숙주 세포에 의해 생성되는 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있고, 또는 전장 중쇄의 절단된 변이체를 포함할 수 있다. 이는 중쇄의 최종 2개의 C-말단 아미노산이 글리신(G446) 및 리신(K447, EU 색인에 따른 넘버링)인 경우일 수 있다. 따라서, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447), 또는 C-말단 글리신(Gly446) 및 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 양상에서, 본 발명에 따른 항체에 포함되는 본원에 특정된 Fc 영역을 포함하는 중쇄는 또 다른 C-말단 글리신-리신 디펩티드(G446 및 K447, EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 한 양상에서, 본 발명에 따른 항체에 포함되는 본원에 특정된 Fc 영역을 포함하는 중쇄는 C-말단 글리신 잔기(G446, EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 명시적으로 다른 언급이 없는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 EU 넘버링 체계, Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 소위 EU 색인에 따른다. 본원에 사용된 Fc 도메인의 "서브유닛"은 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중 하나, 즉, 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중 다른 하나와 안정한 결합이 가능한 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역들을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, IgG Fc 도메인의 서브유닛은 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.

"프레임워크" 또는 "FR"은 상보성 결정 영역(CDR) 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인들로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, CDR 및 FR 서열들은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 다음의 순서로 나타난다: FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2- CDR-H2(CDR-L2)-FR3- CDR-H3(CDR-L3)-FR4.

용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전 항체 (whole 항체)"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 호환적으로 사용된다.

"융합된"은 구성요소들이 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 펩티드 결합에 의해 연결됨을 의미한다.

용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물"은 호환적으로 이용되며, 외인성 핵산이 도입되어 있는 세포를 지칭하고 이러한 세포들의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 계대 수에 관계없이 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모체 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만 돌연변이를 포함할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.

"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 출처로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 이러한 인간 항체의 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 명확하게 배제한다.

"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선별에 있어서 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터 선택된다. 일반적으로, 서열들의 하위그룹들은 Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에서와 같은 하위그룹이다. 한 양상에서, VL의 경우, 하위그룹은 상기 Kabat 외의 문헌에서와 같은 하위그룹 카파 I이다. 한 양상에서, VH의 경우, 하위그룹은 상기 Kabat 외의 문헌에서와 같은 하위그룹 III이다.

"인간화" 항체는 비인간 CDR들로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR들로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 양상들에 있어서, 인간화 항체는 실질적으로 최소한 하나의, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 이때 CDR들의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비-인간 항체에 대응하며, FRs의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 최소한 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화 형태", 예를 들어, 비-인간 항체는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 “초가변 영역” 또는 “HVR”은 서열에서 초가변적이고, 항원 결합 특이성을 결정하는 항체 가변 도메인 영역들 각각, 예를 들면, "상보성 결정 영역들" ("CDR들")을 지칭한다.

일반적으로, 항체들은 6개의 HVR: VH에 3개(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3), 및 VL에 3개(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)를 포함한다. 본원에서 예시적인 CDR들은 다음을 포함한다:

(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 나타나는 초가변 루프 (Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));

(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에서 나타나는 CDR (Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); 및

(c)아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에서 나타나는 항원 접촉부 (MacCallum 외 J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)).

달리 지시되지 않는 한, CDR들은 상기 Kabat 외의 문헌에 따라 결정된다. 당업자는 CDR 표시가 또한 상기 Chothia, 상기 McCallum의 문헌, 또는 임의의 다른 과학적으로 허용되는 명명법에 따라 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 상기 대신에, 본원에 기재된 CDR-H1의 서열은, 예를 들어, Pb-DOTAM 결합 가변 도메인에 대해 Kabat26으로부터 Kabat35까지 연장될 수 있다.

한 양상에서, CDR 잔기는 서열표 또는 본 명세서의 다른 곳에서 식별된 것들을 포함한다.

달리 명시되지 않는 한, 가변 도메인의 HVR/CDR 잔기 및 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 상기 Kabat 외의 문헌에 따라 넘버링된다.

“면역접합체”는, 비제한적으로 세포독성제를 포함한, 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.

"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물에는 가축 (예컨대, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예컨대, 인간 및 비인간 영장류, 가령, 원숭이), 토끼 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 래트)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 양상에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.

본원에 기재된 분자는 "단리"될 수 있다. "단리된" 항체는 자연 환경의 구성성분에서 분리된 항체이다. 일부 양상들에 있어서, 항체는 예를 들면, 전기영동의 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전초점조절 (IEF), 모세관전기이동) 또는 크로마토그래프 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법들로 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도이상으로 정제된다. 항체 순도 평가 방법의 검토는, 예를 들어, Flatman 외, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)를 참고하라.

용어 "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 각 뉴클레오티드는 염기, 특히 퓨린- 또는 피리미딘 염기 (즉, 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A), 티민 (T) 또는 우라실 (U)), 당 (즉, 데옥시리보스 또는 리보스) 및 포스페이트 기로 구성된다. 종종, 핵산 분자는 염기 서열로 기재되며, 이 염기는 핵산 분자의 1차 구조 (선형 구조)를 나타낸다. 염기들의 서열은 일반적으로 5'으로부터 3'으로 제시된다. 본원에서, 용어 핵산 분자는, 예를 들어, 상보적 DNA (cDNA) 및 게놈 DNA를 비롯한 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 특히, 전령 RNA (mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태들, 그리고 둘 이상의 이러한 분자들을 포함하는 혼합 중합체를 포함한다. 핵산 분자는 선형 또는 원형일 수 있다. 또한, 핵산 분자라는 용어는 센스 및 안티센스 가닥 모두, 뿐만 아니라 단일 가닥 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 더욱이, 본원에 기재된 핵산 분자는 자연 발생 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비-자연 발생 뉴클레오티드의 예에는 유도된 당 또는 포스페이트 골격 링키지 또는 화학적으로 변형된 잔기가 있는 변형된 뉴클레오티드 염기가 포함된다. 핵산 분자는 또한, 시험관내에서 및/또는 생체내에서, 예를 들면, 숙주 또는 환자에서 본원 발명의 항체의 직접적인 발현을 위한 벡터로서 적합한 DNA와 RNA 분자를 포괄한다. 이러한 DNA (예를 들어, cDNA) 또는 RNA (예를 들어, mRNA) 벡터는 비변형 또는 변형될 수 있다. 예를 들면, mRNA는 RNA 벡터의 안정성 및/또는 인코딩된 분자의 발현을 개선하기 위하여 화학적으로 변형될 수 있으며, 이러한 mRNA는 대상체에 주사되어 생체내에서 항체를 생성할 수 있다 (예를 들어, 2017년 6월 12일 온라인으로 공개된 Stadler 등, Nature Medicine 2017, doi:10.1038/nm.4356 또는 EP 2 101 823 B1 참고).

“단리된" 핵산은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 포함하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체외부에 존재한다.

"항체를 인코딩하는 단리된 핵산"은, 단일 벡터 또는 별도의 벡터에 있는 이러한 핵산 분자를 포함하는, 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자, 및 숙주 세포의 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 획득된 항체를 말하는데, 예를 들어, 개별 항체는 동일한 집단 및/또는 같은 에피토프에 결합하는 집단을 포함하는데, 다만, 변이체 항체, 예를 들어, 자연 발생적 돌연변이 또는 단클론 항체 제재를 만드는 동안 발생되는 돌연변이를 가진 변이체 항체 가능성이 있으며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정부위(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정부위에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "단클론(monoclonal)"은 실질적으로 동질성 항체 모집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들면, 본 발명에 따른 단클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법 그리고 인간 면역 글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자삽입 동물을 이용하는 방법들을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이러한 방법 및 단클론 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본원에 기재되어 있다.

“네이키드(naked) 항체”는 이종 모이어티(예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 상기 네이키드 항체는 약학 조성물에 존재할 수 있다.

"천연 항체"는 변하는 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 이종사량체 당단백질로써, 약 150,000 달톤이며, 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄를 포함하며, 이들은 이황화 결합에 의해 연결되어 있다. 도메인 N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 도메인 (VH), 이어서 3개의 불변 중쇄 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 도메인(VL), 이어서 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다.

"약품 설명서"라는 용어는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 상용 패키지에 관례적으로 포함된 지침을 지칭하는 데 사용된다.

참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)"는, 서열들을 정렬하고 필요에 따라 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기들과 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기들의 백분율로 정의되며, 보존적 치환은 정렬 목적에 있어서 서열 동일성의 일부로 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 해당 분야의 기술 범위에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign(DNASTAR) 소프트웨어 또는 FASTA 프로그램 패키지와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 이루어질 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 구현하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열들을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 대안적으로, 동일성 퍼센트 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성될 수 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에서 제작되었으며 소스 코드는 미국 워싱턴 D.C., 20559에 소재한 미국 저작권청에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었으며, WO 2001/007611에 기재되어 있다.

달리 나타내지 않는 한, 본원의 목적을 위해 아미노산 서열 동일성 퍼센트 값은 FASTA 패키지 버전 36.3.8c 이상의 ggsearch 프로그램을 사용하여 또한 이후 BLOSUM50 비교 매트릭스를 사용하여 생성된다. FASTA 프로그램 패키지는 W. R. Pearson 및 D. J. Lipman(1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227- 258; 및 Pearson 외 공저 (1997) Genomics 46:24-36에 의해 개발되었으며 www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml 또는 www. ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta로부터 공중이 이용가능하다. 또는 fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi에서 액세스할 수 있는 공용 서버를 사용하여 ggsearch(글로벌 단백질:단백질) 프로그램 및 기본 옵션(BLOSUM50; 열기: -10; ext: -2; Ktup = 2)을 사용하여 서열들을 비교하여, 로컬이 아닌 글로벌 정렬이 수행되도록 할 수 있다. 아미노산 동일성 퍼센트는 출력 정렬 헤더에 제공된다.

용어 "약학 조성물" 또는 “약학 제형 (pharmaceutical formulation)”이란 이 조성물 안에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 제재를 지칭하며, 약학 조성물이 투여되는 대상체에게 수용불가능한 독성을 주는 추가 성분들은 포함하지 않는다.

"약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외에 약학 조성물 또는 제형 안에 있는 성분을 말하며, 대상체에게 비독성이다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

표적 항원에 대한 지칭은, 달리 지시가 없는 한, 영장류 (예컨대, 인간) 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 출처의 임의의 천연 표적 항원을 지칭한다. 이 용어는 "전장(full-length)의", 가공되지 않은 표적 항원, 뿐만 아니라 세포에서 가공하여 발생하는 모든 형태의 표적 항원을 포함한다. 이 용어는 또한 표적 항원의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예를 들어, 표적 항원 CEA는 인간 CEA의 아미노산 서열, 특히, 암유발배아 항원-관련 세포 부착 단백질 5(CEACAM5)를 가질 수 있으며, 이는 UniProt(www.uniprot.org) accession no. P06731(버전 119) 또는 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004354.2에 제시되어 있다. 표적 항원의 또 다른 예는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP, Fibroblast Activation Protein)이다. 인간 FAP의 아미노산 서열은 UniProt(www.uniprot.org) 수탁 번호 Q12884(버전 149) 또는 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2에 제시되어 있다. 표적 항원의 또 다른 예는 GPRC5D이다(UniProt 번호 Q9NZD1(버전 115), 인간 서열에 대한 NCBI RefSeq 번호 NP_061124.1 참조).

본원에서 언급되는 용어 “분할 항체”, “분할 항체들", “단일 도메인 분할 항체” 또는 “SPLIT PRIT”은 이펙터 모이어티에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 함께 형성하는 VH 및 VL 도메인은 2개의 항체 사이에서 분할되며, (생체에서 조립 전) 동일한 항체의 일부로 존재하지 않음을 의미한다. "CEA-표적화된 SPLIT PRIT"는 CEA를 표적으로 하는 분할 항체를 지칭한다. 용어 "SPLIT PRIT"는 용어 "TA-분할-DOTAM-VH/VL"(예를 들어, "TA" 또는 표적 항원이 CEA, FAP 또는 GPRC5D인 경우)과 상호 교환적으로 사용될 수도 있다. "CEA-표적화 SPLIT PRIT"이라는 용어는 "CEA-분할-DOTAM-VH/VL"이라는 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는 것"과 같은 이의 문법적 변형)는 치료를 받는 개체의 질환의 자연적 과정을 변경하려는 시도에 있어서의 임상적 개입을 의미하며, 예방을 위해 또는 임상 병리학 과정 중에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도 감소, 상기 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 차도 또는 개선된 예후가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 양상들에 있어서, 본 발명의 항체는 질환 또는 질환의 발달을 지연 또는 질환의 진행을 느리게 하는데 이용된다.

“가변 영역” 또는 “가변 도메인”은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각, VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FRs) 및 3개의 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함한다. (예컨대, Kindt 외. Kuby Immunology, 6^th ed., W.H. Freeman and Co., 91 페이지 (2007).참조) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보성 VH 또는 VL 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위하여 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, Portolano 외, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 외, Nature 352:624-628 (1991) 참조.

본원에 사용된 용어 "벡터"는 이것이 연결되는 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어에는 자가-복제 핵산 구조체로서의 벡터 그리고 그것이 도입되는 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터가 포함된다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.

본원에서 사용되는 "Pb" 또는 "납"이라는 용어는 그의 이온, 예를 들어 Pb(II)를 포함한다. 다른 금속에 대한 언급에는 이의 이온도 포함한다. 따라서 숙련된 독자는, 예를 들어, 납, Pb, ²¹²Pb 또는 ²⁰³Pb라는 용어가 원소의 이온 형태, 특히, Pb(II)를 포함하고자 한다는 것을 이해한다.

II. 조성물 및 방법

한 양상에서, 본 발명은 일부는 제1 항체 및 제2 항체를 포함하는 항체 세트에 기초하며, 이 때 각각의 항체는 표적 세포 상의 항원에 결합할 수 있지만, 이펙터 모이어티에 대한 기능적 항원 결합 부위는 1차 항체와 2차 항체가 서로 결합할 때만 형성된다. 한 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체 세트는 세포 사멸/암 치료에 유용하다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 세트는, 예를 들어, 사전표적화 면역요법 및/또는 사전표적화 이미징 방법에 유용하다. 바람직한 양상에서 이러한 방법은 제거제 또는 차단제를 투여하는 단계를 제거한다.

분할 형태는 오프 타겟 효과를 줄이는 데 이점이 있다. PRIT와 관련하여, 본원에서 밝혀진 바와 같이 제거제가 필요하지 않다. 더욱이, 본원에 제시된 특정 형태는 분할 항원 결합 부위의 VH 도메인의 유리 C-말단이 생기지 않게 하므로, 기존 인간 항-VH(HAVH) 자가항체를 포함하는 항-약물 항체 반응 가능성을 감소시킨다. 또한, 이론에 구속됨 없이, 본 발명자들은 본원에 제시된 바와 같은 형태가 DOTAM VH/VL의 소수성 계면을 보호하는 데 도움이 되고 따라서 안정성에 도움이 된다고 믿는다.

A. 항체 형태

상기 설명한 바와 같이, 본 발명은 이펙터 항원에 대한 VH 및 VL 도메인이 두 부분 사이에서 분할되는 이중특이성 항체에 대한 새로운 형태 및 이의 사용 방법을 제공한다.

특히, 본 발명은 다음을 포함하는 항체 세트에 관한 것이다:

i) 다음을 포함하는 제1 항체:

c) 2개의 서브유닛을 포함하는 Fc 도메인,

이 때 (b)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (a)의 항원 결합 모이어티의 C-말단에 그리고 그 C-말단에 의해 (c)의 Fc 도메인의 서브유닛들 중 하나의 N-말단에 융합되며;

ii) 다음을 포함하는 제2 항체:

f) 2개의 서브유닛을 포함하는 Fc 도메인,

이 때 (e)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 항원 결합 모이어티의 C-말단에 그리고 그 C-말단에 의해 (f)의 Fc 도메인의 서브유닛들 중 하나의 N-말단에 융합되며;

융합은, 예를 들어, 직접적이거나 펩티드 링커를 통한 간접적인 것일 수 있다.

일부 실시형태에서, (a) 및/또는 (d)의 항원 결합 부분은 Fab일 수 있다.

(b)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (a)의 Fab 단편의 중쇄의 C-말단에 융합되는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, (a)의 Fab 단편은 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 경쇄 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 단편을 포함하고, (b)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 CH1 도메인의 C-말단에 융합된다.

유사하게 (e)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (d)의 Fab 단편의 중쇄의 C-말단에 융합되는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, (d)의 Fab 단편은 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 경쇄 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 단편을 포함하고, (e)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 CH1 도메인의 C-말단에 융합된다.

폴리펩티드 (b) 및 (e)는 불변 영역(예를 들어, CH1 또는 CL)을 포함하지 않는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, (b)의 폴리펩티드가 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 항체 중쇄 가변 도메인(VH)으로 구성되고/되거나 (e)의 폴리펩티드가 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)으로 구성되는 것이 바람직할 수 있다. 이는 (a) 및 (d)의 Fab 단편들의 일부를 형성하는 경쇄들의 정확한 조립을 돕고/돕거나 이들 두 부분들이 순환에서 결합능 모이어티를 형성하는 경향을 감소시킬 수 있다.

제1 항체와 제2 항체의 결합이 이펙터 모이어티에 대한 단 하나의 기능적 항원 결합을 형성하는 것- 즉, 2개의 결합된 항체가 이펙터 모이어티에 대한 1가 결합을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 제1 항체는 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 하나만 포함할 수 있고, 제2 항체는 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 하나만 포함할 수 있으므로, 종합하면 이들은 이펙터 모이어티에 대한 단 하나의 완전한 기능적 결합 부위를 형성한다.

일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 항체는 표적 항원에 결합하는 또 다른 항원 결합 모이어티, 예를 들어, 표적 항원에 결합하는 또 다른 Fab 단편과 같은 또 다른 항체 단편을 추가로 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서 제1 및/또는 제2 항체(일반적으로 둘 모두)는 각각 표적 항원에 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 2개의 항원 결합 모이어티는 바람직하게는 동일한 표적 항원에 결합할 수 있다. 선택적으로, 제1 및 제2 항체 각각은 표적 항원에 결합할 수 있는 2개 이하의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 다른 실시형태들에서, 제1 및 제2 항체 각각은 표적 항원에 결합할 수 있는 2개 이하의 항원 결합 모이어티를 포함한다.

한 실시형태에서, 이러한 추가 항원 결합 모이어티, 예를 들어, Fab 단편은 그 C-말단에 의해 Fc 도메인의 다른 서브유닛의 N-말단에 융합된다. (Fab 또는 하나 초과의 사슬로 구성된 다른 모이어티의 경우, 그 사슬들, 예를 들어, 그 중쇄 중 하나의 C-말단에 의해 Fc 도메인의 다른 서브유닛의 N-말단에 융합될 수 있다). 따라서, 한 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 항체는 2-팔 항체일 수 있으며, 이 때 각각의 팔은 표적 항원에 대한 결합 부위를 갖는다.

그러므로, 한 실시형태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항체 세트에 관한 것으로:

i) 다음을 포함하는 제1 항체:

a) 표적 세포의 표면에 발현된 항원에 결합하는 제1 Fab 단편;

c) 제1 및 제2 서브유닛을 포함하는 Fc 도메인,

이 때 (b)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (a)의 Fab 단편의 사슬들 중 하나의 C-말단에 그리고 그 C-말단에 의해 (c)의 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되고;

그리고 표적 세포의 표면 상에 발현된 항원에 결합하는 제2 Fab 단편을 추가로 포함하며, 이 때 제2 Fab는 그 사슬들 중 하나의 C-말단에 의해 (c)의 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되고;

ii) 다음을 포함하는 제2 항체:

d) 표적 세포의 표면에 발현된 항원에 결합하는 제1 Fab 단편;

f) 제1 및 제2 서브유닛을 포함하는 Fc 도메인,

이 때 (e)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (d)의 Fab 단편의 사슬들 중 하나의 C-말단에 그리고 그 C-말단에 의해 (f)의 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되고;

그리고 표적 세포의 표면 상에 발현된 항원에 결합하는 제2 Fab 단편을 추가로 포함하며, 이 때 제2 Fab는 그 사슬들 중 하나의 C-말단에 의해 (f)의 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되고;

이러한 제2 항체는 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하지 않으며; 그리고

제1 항체의 제2 Fab 단편은 그 중쇄의 C-말단에 의해 Fc 도메인의 제2 서브유닛에 융합되는 것이 바람직할 수 있다. 제1 항체의 제2 Fab 단편이 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 경쇄 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 단편을 포함하고 이러한 제2 Fab 단편이 그 CH1 도메인의 C-말단에 의해 Fc 도메인의 제2 서브유닛에 융합되는 것이 바람직할 수 있다. 유사하게 제2 항체의 제2 Fab 단편은 그 중쇄의 C-말단에 의해 Fc 도메인의 제2 서브유닛에 융합되는 것이 바람직할 수 있다. 제2 항체의 제2 Fab 단편이 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 경쇄 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 단편을 포함하고 이러한 제2 Fab 단편이 그 CH1 도메인의 C-말단에 의해 Fc 도메인의 제2 서브유닛에 융합되는 것이 바람직할 수 있다.

제1 항체의 제1 및 제2 항원 결합 모이어티(예를 들어, Fab 단편)가 서로 동일한 표적 항원에 결합하는 것, 즉, 제1 항체가 표적 항원에 대해 2가인 것이 바람직할 수 있다. 유사하게 제2 항체의 제1 및 제2 항원 결합 모이어티(예를 들어, Fab 단편)가 서로 동일한 표적 항원에 결합하는 것, 즉, 제2 항체가 표적 항원에 대해 2가인 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항체는 또한 서로 동일한 표적 항원에 결합한다.

일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 항체는 다가(예를 들어, 2가)이고 표적 항원의 에피토프에 대해 단일특이적이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 제1 항체의 제1 및 제2 항원 결합 모이어티(예를 들어, Fab 단편)는 서로 표적 항원의 동일한 에피토프에 결합하고; 및/또는 제2 항체의 제1 및 제2 항원 결합 모이어티(예를 들어, Fab 단편)는 서로 표적 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 바람직하게는 제1 및 제2 항체에 의해 결합된 표적 항원은 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항체는 또한 해당 표적 항체에서 서로 동일한 에피토프에 결합한다. 따라서, 제1 항체의 제1 및 제2 Fab, 또는 제2 항체의 제1 및 제2 Fab, 또는 4개 Fab 모두의 가변 도메인 서열들(VH 및 VL)은 일부 실시형태에서 동일할 수 있다.

다른 실시형태에서, 제1 항체 및 제2 항원은 동일한 표적 항원에 결합하지만 각각은 그 표적 항원 상의 상이한 에피토프에 결합한다 - 예를 들어, 제1 항체의 제1 및 제2 Fab 단편은 표적 항원의 에피토프 A에 결합하고 제2 항체의 제1 및 제2 Fab 단편은 해당 표적 항원의 에피토프 B에 결합한다.

일부 실시형태에서, 제1 항체는 하기 펩티드를 포함할 수 있다:

i) N-말단으로부터 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인; 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드;

ii) (i)의 Fab 중쇄와 쌍을 이루어 표적 항원에 대한 결합 부위를 형성하는 Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL);

iii) N-말단으로부터 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드; 및

iv) (iii)의 Fab 중쇄와 쌍을 이루어 표적 항원에 대한 결합 부위를 형성하는 추가 Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL);

선택적으로 (i)의 Fab 중쇄는 (iii)의 Fab 중쇄와 동일한 서열을 갖고, (ii) 및 (iv)의 Fab 경쇄는 서로 동일한 서열을 갖는다.

제2 항체는 다음 펩티드를 포함할 수 있다:

v) N-말단으로부터 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인; 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드;

vi) (v)의 Fab 중쇄와 쌍을 이루어 표적 항원에 대한 결합 부위를 형성하는 Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL);

vii) N-말단으로부터 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드; 및

viii) (vii)의 Fab 중쇄와 쌍을 이루어 표적 항원에 대한 결합 부위를 형성하는 추가 Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL).

선택적으로 (v)의 Fab 중쇄는 (vii)의 Fab 중쇄와 동일한 서열을 갖고, (vi) 및 (viii)의 Fab 경쇄는 서로 동일한 서열을 갖는다.

선택적으로 (i), (iii), (v) 및 (vii)의 Fab 중쇄는 서로 동일한 서열을 갖고 (ii), (iv) (vi) 및 (viii)의 Fab 경쇄는 서로 동일한 서열을 갖는다.

일부 경우에 바람직할 수 있는 다른 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 항체 각각은 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 항원 결합 모이어티를 갖는다. 따라서, 제1 항체 및/또는 제2 항체는 표적 항원에 대해 단일특이적이고 1가일 수 있다. 바람직하게는 제1 및 제2 항체는 동일하거나 상이한 에피토프에서 서로 동일한 표적 항원에 결합한다.

한 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 항체는 1-팔 항체이다. 이러한 실시형태에서, (b)의 폴리펩티드에 융합되지 않은 제1 항체의 Fc 서브유닛은 또한 임의의 다른 항원 결합 모이어티에 융합되지 않으며; 및/또는 (e)의 폴리펩티드에 융합되지 않은 제2 항체의 Fc 서브유닛은 또한 임의의 다른 항원 결합 모이어티에도 융합되지 않는다. 따라서, Fc 도메인은 Fd가 결여된 서브유닛을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체를 구성하는 폴리펩티드들 중 하나는 Fc 서브유닛으로 구성되거나 본질적으로 구성될 수 있다.

따라서, 일부 실시형태에서, 제1 항체는 다음과 같은 폴리펩티드를 포함할 수 있고:

i) N-말단으로부터 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인; 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 폴리펩티드;

ii) Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL); 및

iii) Fc 서브유닛 폴리펩티드(예를 들어, CH2-CH3);

이 때 (i)의 Fab 중쇄 및 (ii)의 Fab 경쇄는 표적 항원에 결합할 수 있는 Fab 단편을 형성한다.

제2 항체는 다음 펩티드를 포함할 수 있고:

iv) N-말단으로부터 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인; 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 폴리펩티드;

v) Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL); 및

vi) Fc 서브유닛 폴리펩티드(예를 들어, CH2-CH3);

이 때 (iv)의 Fab 중쇄 및 (v)의 Fab 경쇄는 표적 항원에 결합할 수 있는 Fab 단편을 형성한다.

이러한 1-팔 항체의 일부 실시형태에서, (i) 및 (iv)의 Fab 중쇄는 서로 동일한 서열을 가질 수 있고; ii)와 (v)의 Fab 경쇄 폴리펩티드는 서로 동일한 서열을 가질 수 있다.

항체가 상이한 파라토프(예를 들어, 상이한 항원 및/또는 에피토프에 결합함)를 갖는 2개의 Fab 단편을 포함하는 임의의 실시형태에서, Fab 중 하나는 통상적인 Fab(중쇄 VH-CH1 및 경쇄 VL-CL을 포함)이고 다른 하나는 교차-Fab 또는 scFab인 것이 바람직할 수 있다. 제1 특이성/가변 도메인 서열을 갖는 Fab는 통상적인 Fab일 수 있고, 제2 특이성/가변 도메인 서열을 갖는 Fab는 교차-Fab 또는 scFab에서 선택될 수 있다. 이는 경쇄들의 미스페어링 가능성을 줄인다.

상기에서와 같이, 항원 결합 모이어티는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 링커를 통해 또는 직접적으로 서로에 또는 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 펩티드 링커는 해당 분야에 공지이고 본원에 기재된 바와 같다. 링커(예를 들어, Fab 단편과 이펙터 모이어티에 대한 VH/VL 사이 및/또는 이펙터 모이어티에 대한 VH/VL과 Fc 도메인 사이의 링커)는 적어도 5개의 아미노산 또는 적어도 10개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 100개, 예를 들어, 10 내지 70개, 10 내지 60개, 또는 10 내지 50개 아미노산의 펩티드 일 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 15-30개 아미노산 길이, 예를 들어, 15-25개, 예를 들어 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개 또는 24개 아미노산 길이인 것이 바람직할 수 있다. 링커는 단단한 링커 또는 가요성 링커일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이는 Thr, Ser, Gly 및/또는 Ala 잔기를 포함하거나 이들로 구성된 가요성 링커이다. 예를 들어, Gly 및 Ser 잔기를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이것은 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n과 같은 반복 모티프를 가질 수 있으며, 여기서 n은, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 적합한 비면역원성 펩티드 링커는 예를 들어 (G₄S)_n, (SG₄)_n, (G₄S)_n 또는 G₄(SG₄)_n 펩티드 링커를 포함하며, 여기서 "n"은 일반적으로 1 내지 10, 일반적으로 2 내지 4의 숫자이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 펩티드 링커는 (G_xS)_n 또는 (G_xS)_nG_m이고, 이때 G = 글리신, S = 세린이고, (x = 3, n= 3, 4, 5 또는 6이고, m= 0, 1, 2 또는 3임) 또는 (x = 4, n= 2, 3, 4 또는 5이고 m= 0, 1, 2 또는 3임), 예를 들어, x = 4이고 n= 2 또는 3이고, 예를 들어, x = 4, n= 2이다. 일부 실시형태에서, 링커는 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 31) 일 수 있거나 이러한 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서 링커는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG(서열번호 148) 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGS(서열번호 149) 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGG(서열번호 150) 일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 펩티드 링커는 EPKSC(D)-(G₄S)₂이다. (서열번호 151) 추가적으로, 항원 결합 모이어티가 Fc 도메인 서브유닛의 N-말단에 융합되는 경우, 추가 펩티드 링커에 의해 또는 없이 면역글로불린 힌지 영역 또는 이의 일부를 통해 융합될 수 있다.

본 발명자들은 y개 아미노산으로 구성된 펩티드 링커에서 y 위치의 Ser(즉, 이 링커의 마지막/C-말단 아미노산으로서의 Ser)이 y+2 아미노산의 특성에 따라 이러한 y+2 아미노산의 (즉, 이러한 링커의 마지막 아미노산으로부터 C-말단 방향으로 2번째 잔기에 위치한 아미노산의) 당화를 유도할 수 있음을 확인하였다. 따라서 링커의 마지막 세린 잔기가 y-2 또는 y-3 위치에 위치하는 것이 바람직할 수 있다(즉, 링커의 마지막 세린 잔기는 링커의 마지막 아미노산으로부터 N-말단 방향으로 2 또는 3번째 아미노산 위치에 있음). 일부 실시형태에서, 링커는 Gly 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택된 y개의 연속 아미노산 잔기로 구성될 수 있는데, 예를 들어, 이 때 y는 5 이상 또는 10 이상 100 이하, 예를 들어, 5 내지 100, 10 내지 70, 10 내지 60 또는 10 내지 50, 예를 들어, 15 내지 31 또는 15 내지 30, 예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25이며, 이 때 마지막 세린은 y-2 또는 y-3 위치에 있다. (따라서 y-2 위치에 세린이 있고 y-1 및 y 위치에 글리신이 있을 수 있다; 또는 y-3 위치에 세린이 있고 y-2, y-1 및 y 위치에 글리신이 있을 수 있다). 일부 실시형태에서, y=20 또는 21인 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 (GxS)n(GGSGG) 또는 (GxS)n(GGSGGG)이고, 이 때 G = 글리신, S = 세린, x = 4 및 n= 1 내지 20, 예를 들어, 1 내지 10, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9, 예를 들어, n=2 내지 4인 것이 바람직 할 수 있다. 예를 들어, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG (서열번호 148) 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGG (서열번호 150)일 수 있다.

임의의 상기 항체 세트의 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 구체적인 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG₁ Fc 도메인이다. 또 다른 구체적인 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG₄ Fc 도메인이다. 훨씬 더 구체적인 실시예에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 S228P(Kabat 넘버링)를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다.

Fc 영역은 Fc 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하도록 조작되는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 Fc 영역 잔기 234, 235, 238, 265, 269, 270, 297, 327 및/또는 329 중 하나 이상, 예를 들어, 234, 235 및/또는 329 중 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 Pro 329에서 Gly로, Leu 234에서 Ala로 및/또는 Leu 235에서 Ala로의 치환(EU 색인에 따른 넘버링)을 포함하도록 조작될 수 있다. Fc 이펙터 기능을 감소시키기 위한 변형은 아래에서 추가로 논의된다.

또한 다중특이성 항체를 만들기 위해 알려진 기술이 본원에 기술된 임의의 이종이량체를 만들기 위해 사용될 수 있다. 이들 기술에는 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시발현(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983) 참조) 및 “놉-인-홀” 조작(예를 들어, 미국 특허 제 5,731,168, 및 Atwell 외, J. Mol. Biol. 270:26 (1997) 참조)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 방법들에는 항체 Fc-이종이량체 분자를 만들기 위한 조작된 정전기 조정 효과(예를 들어, WO 2009/089004 참조); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합(예를 들어, 미국 특허 제 4,676,980, 및 Brennan 외, Science, 229: 81 (1985) 참조); 류신 지퍼 사용(예를 들어, Kostelny 외, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 및 WO 2011/034605 참조); 및 경쇄 미스페어링 문제를 회피하기 위한 일반적인 경쇄 기술의 사용(예를 들어, WO 98/50431 참조)이 포함된다.

상기 기재된 바와 같은 전장 항체의 CH3 도메인은, 예를 들어, WO 96/027011, Ridgway, JB, 외, Protein Eng 9(1996) 617-621; 및 Merchant, AM 등, Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681에 여러 실시예들로 상세히 기재된 "놉-인투-홀" 기술에 의해 변경될 수 있다. 이 방법에서, 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면은 이들 2개의 CH3 도메인을 함유하는 2개의 중쇄 모두의 이종이량체화를 증가시키기 위해 변경된다. (2개의 중쇄의) 2개의 CH3 도메인 각각은 "놉"일 수 있고, 다른 하나는 "홀"일 수 있다. 예를 들어, EU 색인 넘버링에 따라 하나는 소위 "놉 돌연변이"(T366W 및 선택적으로 S354C 또는 Y349C 중 하나)를 포함하고 다른 하나는 소위 "홀 돌연변이"(T366S, L368A 및 Y407V 및 선택적으로 Y349C 또는 S354C)를 포함한다(예를 들어, Carter, P. 외, Immunotechnol. 2 (1996) 73 참조).

이황화 가교의 도입은 이종이량체를 안정화시키기 위해(Merchant, AM, 외, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., 외, J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) 그리고 수율을 증가시키기 위해 추가로 또는 대안적으로 사용될 수 있다.

따라서 일부 실시형태에서 제1 및/또는 제2 항체는 다음을 추가로 특징으로 한다: 전장 항체의 하나의 중쇄의 CH3 도메인 및 전장 항체의 다른 하나의 중쇄의 CH3 도메인은 각각 항체 CH3 도메인들 사이의 원래 경계면을 포함하는 경계면에서 만나고; 이 때 상기 경계면은 항체의 형성을 촉진하도록 변경되며, 이 때 변경은 다음을 특징으로 한다:

a) 하나의 중쇄의 CH3 도메인이 변경되어, 해당 항체 내 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 원래 경계면과 만나는 다른 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 원래 경계면 내부에서, 아미노산 잔기는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 이에 의해 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내부에, 다른 하나의 중쇄의 CH3 도메인 경계면 내부의 공동에 위치할 수 있는 돌출부를 생성하고,

그리고

b) 다른 하나의 중쇄의 CH3 도메인이 변경되어, 해당 항체 내 제1 CH3 도메인의 원래 경계면과 만나는 제2 CH3 도메인의 원래 경계면 내부에서 아미노산 잔기는 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 이에 의해 제2 CH3 도메인의 경계면 내부에, 제1 CH3 도메인 경계면 내부의 돌출부가 위치할 수 있는 공동을 생성한다.

더 큰 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 선택적으로 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 더 작은 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 선택적으로 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

선택적으로, 일부 실시형태에서, 두 CH3 도메인은 각각의 CH3 도메인의 상응하는 위치들에 아미노산으로서 시스테인(C)을 도입함으로써 추가로 변경되어, 두 CH3 도메인 사이에 이황화 가교가 형성될 수 있다.

일부 실시형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중파라토프) 항체는 경쇄와 비매칭 중쇄의 미스페어링(벤스-존스-유형 부산물)을 감소시키는 데 특히 효율적인 Fab 분자들(교차-Fab 분자 포함)에 포함된 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 상기 미스페어링은 이의 결합 팔들 중 하나(또는 2개 초과의 항원-결합 Fab 분자를 포함하는 분자의 경우 그 이상)에서 VH/VL 교환을 갖는 Fab 기반 이중/다중특이성 항원 결합 분자의 생산 과정에서 발생할 수 있다(또한 PCT 공개 번호 WO 2015/150447, 특히 이의 실시예 참조, 이는 그 전문이 본원에 참조로 통합됨). 바람직하지 않은 부산물, 특히, 결합 팔들 중 하나에서 발생하는 벤스 존스형 부산물 대비 원하는 다중특이성 항체의 비율은 CH1 및 CL 도메인의 특정 아미노산 위치에서 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 도입(본원에서 "전하 변형"이라고도 함)에 의해 개선될 수 있다.

따라서, 일부 실시형태에서, Fab 분자를 포함하는 본 발명의 항체는 본원에 기재된 바와 같은 전하 변형을 포함하는 중쇄 불변 도메인 CH1 도메인 및 본원에 기재된 바와 같은 전하 변형을 포함하는 경쇄 불변 CL 도메인을 갖는 적어도 하나의 Fab를 포함한다.

전하 변형은 본 발명의 항체에 포함된 통상적인 Fab 분자(들) 또는 본 발명의 항체에 포함된 교차 Fab 분자(들)에서 이루어질 수 있다(둘 모두에서는 아님). 특정 실시형태에서, 전하 변형은 본 발명의 항체에 포함된 통상적인 Fab 분자(들)에서 이루어진다.

일부 실시형태에서, 전하 변형을 포함하는 경쇄 불변 도메인 CL 및 전하 변형을 포함하는 중쇄 불변 도메인 CH1을 포함하는 Fab 또는 교차-Fab에서, 경쇄 불변 도메인 CL 내의 전하 변형은 위치 124에 그리고 선택적으로 위치 123에(Kabat에 따른 넘버링) 존재하고, 중쇄 불변 도메인 CH1에서의 전하 변형은 위치 147 및/또는 213에(Kabat EU 색인에 따른 넘버링) 존재한다. 일부 실시형태에서, 경쇄 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 독립적으로 치환되고(Kabat에 따른 넘버링)(한 바람직한 실시형태에서 독립적으로 리신(K)으로 치환됨), 중쇄 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 독립적으로 치환된다(Kabat EU 색인에 따른 넘버링).

B. 표적 항원

표적 세포의 표면에서 발현되는 항원은 본원에서 "표적 항원" 또는 "표적 세포 항원"이라고도 한다. 이러한 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

본 발명이 치료 방법 및 그에 사용되는 제품에 관한 것인 한, 본 발명은 환자의 세포, 예를 들어, 질병 세포를 표적으로 하는 세포독성 활성에 의해 치료될 수 있는 임의의 병태에 적용할 수 있다. 따라서, 표적 세포는 세포독성을 표적화하는 것이 바람직한 임의의 세포, 예를 들어, 임의의 질병 세포이다. 치료는 바람직하게는 종양 또는 암이다. 그러나, 본 발명의 적용가능성은 종양 및 암에 제한되지 않는다. 예를 들어, 치료는 바이러스 감염(감염된 세포를 표적으로 하여) 또는 T 세포 유도 자가면역 질환(T 세포를 표적으로 하여)의 치료일 수도 있다. 감염된 세포 표면에 발현된 바이러스 항원에 대한 면역독소가 HIV, 광견병 및 EBV와 같은 다양한 바이러스 감염에 대해 조사되었다. Cai 및 Berger 2011 Antiviral Research 90(3):143-50은 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스에 감염된 세포의 표적화된 사멸을 위해 PE38을 포함하는 면역독소를 사용했다. 또한, Resimmune®(A-dmDT390-bisFv(UCHT1))은 인간 악성 T세포를 선택적으로 사멸시키고 정상 T세포를 일시적으로 고갈시켜 다발성 경화증, 이식편대숙주병, 뿐만 아니라 임상시험 중인 T 세포 혈액암과 같은 T-세포 유도 자가면역질환의 치료 가능성이 있는 것으로 고려된다. 마찬가지로, 본 발명의 방법은 암 또는 종양 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는, 이미징이 필요한 임의의 세포 유형에 적용될 수 있다.

따라서, 적합한 표적 항원은 암 세포 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원을 포함할 수 있다.

항원은 일반적으로 과발현되거나 비정상적인 시간에 발현되는 정상 세포 표면 항원이다. 이상적으로 표적 항원은 질병 세포(예를 들어, 종양 세포)에서만 발현되지만 실제로는 거의 관찰되지 않는다. 결과적으로, 표적 항원은 일반적으로 병든 조직과 건강한 조직 간의 차등 발현을 기준으로 선택된다.

세포 표면 마커 또는 표적 항원은, 예를 들어, 종양 관련 항원일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "종양 관련 항원" 또는 "종양 특이적 항원"은 종양 세포 및/또는 암 세포에 의해 또는 암 관련 섬유아세포와 같은 종양 간질의 다른 세포에 의해 단독으로 또는 우세하게 발현되거나 과발현되어 항원이 종양(들) 및/또는 암(들)과 결합되는, 임의의 분자(예를 들어, 단백질, 펩티드, 지질, 탄수화물 등)를 지칭한다. 종양 관련 항원은 정상, 비-종양 또는 비-암성 세포에 의해 추가로 발현될 수 있다. 그러나 이러한 경우, 정상, 비-종양 또는 비-암성 세포에 의한 종양 관련 항원의 발현은 종양 또는 암 세포에 의한 발현만큼 강력하지 않다. 이와 관련하여, 종양 또는 암 세포는 정상, 비-종양 또는 비-암성 세포에 의한 항원의 발현과 비교하여 항원을 과발현하거나 상당히 높은 수준으로 항원을 발현할 수 있다. 또한, 종양 관련 항원은 상이한 발달 또는 성숙 상태의 세포에 의해 추가로 발현될 수 있다. 예를 들어, 종양 관련 항원은 일반적으로 성인 숙주에서 발견되지 않는 배아 또는 태아 단계의 세포에 의해 추가로 발현될 수 있다. 대안적으로, 종양 관련 항원은 성인 숙주에서 일반적으로 발견되지 않는 줄기 세포 또는 전구체 세포에 의해 추가로 발현될 수 있다.

종양 관련 항원은 본원에 기재된 암 및 종양을 포함하는 임의의 암 또는 종양의 임의의 세포에 의해 발현되는 항원일 수 있다. 종양 관련 항원은 단지 한 가지 유형의 암 또는 종양의 종양 관련 항원일 수 있으므로, 종양 관련 항원은 단지 한 가지 유형의 암 또는 종양과 관련되거나 이를 특징으로 한다. 대안적으로, 종양 관련 항원은 하나 이상의 유형의 암 또는 종양의 종양 관련 항원일 수 있다(예를 들어, 이를 특징으로 할 수 있음). 예를 들어, 종양 관련 항원은 유방암과 전립선암 세포 모두에서 발현될 수 있으며 정상, 비-종양 또는 비-암세포에서는 전혀 발현되지 않을 수 있다.

본 발명의 항체가 결합할 수 있는 예시적인 종양 관련 항원은 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 뮤신 1(MUCI; 종양 관련 상피 뮤신), 우선적으로 발현되는 흑색종 항원(PRAME), 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), PSCA, EpCAM, Trop2(영양막-2, EGP-1이라고도 함), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 수용체(GM-CSFR), CD56, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2/neu)(erbB-2로도 알려짐), CDS, CD7, 티로시나제 관련 단백질(TRP) I 및 TRP2를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 실시형태에서, 종양 항원은 분화 클러스터(CD) 19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33(시알산 결합 Ig-유사 렉틴 3, 골수 세포 표면 항원), CD79b, CD123(인터루킨 3 수용체 알파), 트랜스페린 수용체, EGF 수용체, 메조텔린, 캐드헤린, 루이스 Y, 글리피칸-3, FAP(섬유아세포 활성화 단백질 알파), GPRC5D(G 단백질-결합 수용체 클래스 C 그룹 5 멤버 D), PSMA(전립선 특이적 막 항원), CA9 = CAIX(탄산 탈수효소 IX), Ll CAM(신경 세포 부착 분자 L 1 ), 엔도시알린, HER3(표피 성장 인자 수용체 패밀리 멤버 3의 활성화된 형태), Alkl/BMP9 복합체(역형성 림프종 키나제 1/골 형태형성 단백질 9), TPBG = 5T4(영양막 당단백질), ROR1(수용체 티로신 키나제-유사 표면 항원), HER1(표피 성장 인자 수용체의 활성화된 형태) 및 CLL1(C형 렉틴 도메인 패밀리 12, 멤버 A)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 메소텔린은, 예를 들어, 난소암, 중피종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 나팔관암, 두경부암, 자궁경부암 및 췌장암에서 발현된다. CD22는, 예를 들어, 털 세포 백혈병, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 전림프구성 백혈병(PLL), 비호지킨 림프종, 소림프구성 림프종(SLL) 및 급성 림프성 백혈병(ALL)에서 발현된다. CD25는, 예를 들어, 털 세포 백혈병 및 호지킨 림프종을 포함하는 백혈병 및 림프종에서 발현된다. 루이스 Y 항원, 예를 들어, 방광암, 유방암, 난소암, 결장직장암, 식도암, 위암, 폐암 및 췌장암에서 발현된다. CD33은, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수단핵구성 백혈병(CML) 및 골수증식성 장애에서 발현된다.

종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 예시적인 항체는 트랜스페린 수용체에 대한 항체(예를 들어, HB21 및 이의 변이체), CD22에 대한 항체(예를 들어, RFB4 및 이의 변이체), CD25에 대한 항체(예를 들어, 항-Tac 및 이의 변이체), 메소텔린에 대한 항체(예를 들어, SS 1, MORAb-009, SS, HN1, HN2, MN, MB 및 이의 변이체) 및 Lewis Y 항원에 대한 항체(예를 들어, B3 및 이의 변이체)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 관련하여, 표적 모이어티(세포 결합제)는 B3, RFB4, SS, SS1, MN, MB, HN1, HN2, HB21 및 MORAb-009로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 및 이의 항원 결합 부분일 수 있다. 본 발명의 키메라 분자에 사용하기에 적합한 추가의 예시적인 표적 모이어티는, 예를 들어, 미국 특허 5,242,824(항-트랜스페린 수용체); 5,846,535(항-CD25); 5,889,157(항-Lewis Y); 5,981,726(항-Lewis Y); 5,990,296(항-Lewis Y); 7,081,518(항-메소텔린); 7,355,012(항-CD22 및 항-CD25); 7,368,110(항-메소텔린); 7,470,775(항-CD30); 7,521,054(항-CD25); 및 7,541,034(항-CD22); 미국 특허 출원 공개공보 2007/0189962(항-CD22); Frankel 외, Clin. Cancer Res., 6: 326-334 (2000), 및 Kreitman 외, AAPS Journal, 8(3): E532-E551 (2006)에 개시?? 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.

다음을 포함한 특정 종양 관련 항원을 표적으로 하는 추가 항체가 생성되었다: Cripto, CD30, CD19, CD33, 당단백질 NMB, CanAg, Her2(ErbB2/Neu), CD56(NCAM), CD22(Siglec2), CD33(Siglec3), CD79, CD138, PSCA, PSMA(전립선 특이적 막 항원), BCMA , CD20, CD70, E-셀렉틴, EphB2, 멜라노트랜스페린, Muc16 및 TMEFF2. 이들 중 어느 하나 또는 이의 항원-결합 단편은 본 발명에서 유용할 수 있다, 즉, 본원에 기재된 항체에 통합될 수 있다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 종양 관련 항원은 암배아 항원(CEA)인 것이 바람직할 수 있다.

CEA는 상대적으로 천천히 내재화되기 때문에 본 발명의 맥락에서 유리하며, 따라서 초기 처리 후 세포 표면에서 방사성 핵종에 결합하기 위한 높은 비율의 항체가 여전히 이용 가능할 것이다. 다른 낮은 내재화 표적/종양 관련 항원이 또한 바람직할 수 있다. 종양 관련 항원의 다른 예에는 CD20 또는 HER2가 포함된다. 또 다른 실시형태에서, 표적은 EGP-1(영양막-2로도 알려진 상피 당단백질-1), 결장-특이적 항원-p(CSAp) 또는 췌장 점액 MUC1일 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 Goldenberg 외, 2012(Theranostics 2(5))를 참조하라. 이 참고문헌은 또한 CSAp에 결합하는 Mu-9(또한 Sharkey 외, Cancer Res. 2003; 63: 354-63 참조), MUC1에 결합하는 hPAM4(또한 Gold 외, Cancer Res. 2008: 68: 4819-26 참조), CD20에 결합하는 발투주맙(또한 Sharkey 외, Cancer Res. 2008; 68: 5282-90 참조) 및 EGP-1에 결합하는 hRS7(또한 Cubas 외, Biochim Biophys Acta 2009; 1796: 309-14 참조)과 같은 항체들을 기재하고 있다. 이들 중 어느 하나 또는 이의 항원-결합 부분들이 본 발명에서 유용할 수 있다, 즉, 본원에 기재된 항체에 통합될 수 있다. CEA에 대해 생성되었던 항체의 한 예는 T84.66(중쇄는 NCBI 등록 번호: CAA36980 및 경쇄는 CAA36979에 제시된 바와 같음, 또는 WO2016/075278의 서열번호 317 및 318에 제시된 바와 같음), 및 이의 인간화 및 키메라 버전, 예를 들어, WO2016/075278 A1 및/또는 WO2017/055389에 기재된 T84.66-LCHA이다. 또 다른 예는 WO2012/117002 및 WO2014/131712에 기재된 항-CEA 항체인 CH1A1a, 및 CEA hMN-14(또한 US 6 676 924 및 US 5 874 540 참조)이다. 다른 항-CEA 항체는 MJ Banfield 외, Proteins 1997, 29(2), 161-171에 기재된 A5B7이다. 뮤린 항체 A5B7로부터 유도된 인간화 항체는 WO 92/01059 및 WO 2007/071422에 개시되어 있다. 동시 계류 중인 출원 PCT/EP2020/067582도 참조하라. A5B7의 인간화 버전의 예는 A5H1EL1(G54A)이다. CEA에 대한 추가의 예시적인 항체는 US7626011 및/또는 동시 계류 중인 출원 PCT/EP2020/067582에 기재된 MFE23 및 이의 인간화 버전이다. CEA에 대한 항체의 추가 예는 28A9이다. 이들 중 어느 하나 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명에서 CEA-결합 모이어티를 형성하는데 유용할 수 있다.

일부 실시형태에서 FAP(섬유아세포 활성화 단백질 알파) 또는 GPRC5D(G 단백질-커플링 수용체 클래스 C 그룹 5 멤버 D)도 바람직할 수 있다. FAP는 다수의 종양 유형, 예를 들어, 췌장암, 유방암 및 폐암의 미세환경에서 광범위하게 발현되기 때문에 이미징 및 치료를 위한 확립된 표적이다(Lindner, T., Loktev, A., Giesel, F. 외,. Targeting of activated fibroblasts for imaging and therapy. EJNMMI radiopharm. chem. 4, 16 (2019)). 본 발명의 한 실시형태에서, 그러므로 표적 항원으로서 FAP를 사용하는 SPLIT PRIT는 활성화된 암 관련 섬유아세포 상에서 ²¹²Pb-DOTAM의 특이적인 축적을 생성할 것으로 예상된다. 결과적으로, 방출된 알파 방사선은 FAP-발현 악성 종양의 면역 억제에 부정적인 영향을 미치고 인접한 종양 세포에 대한 직접적인 종양 사멸 효과가 제한적일 것으로 예상된다. G 단백질 커플링된 수용체 패밀리 C 그룹 5 멤버 D(GPRC5D)는 다발성 골수종 형질 세포에서 과발현되며(Atamaniuk J, Gleiss A, Porpaczy E, Kainz B, Grunt TW, Raderer M, 외,. Overexpression of G protein-coupled receptor 5D in the bone marrow is associated with poor prognosis in patients with multiple myeloma. Eur J Clin Invest. 2012;42:953-60.), 확립된 SC(피하) 생체내 모델은 다발성 골수종 환자에서 발견된 발현, 예를 들어, OPM-2 및 NCI-H929를 반영한다(Kodama T, Kochi Y, Nakai W, Mizuno H, Baba T, Habu K, 외,. Anti-GPRC5D/CD3 bispecific T-cell-redirecting antibody for the treatment of multiple myeloma. Mol Cancer Ther. (2019) 18:1555-64). 따라서 본 발명의 한 실시형태에서, 표적 항원으로서 GPRC5D를 사용하는 SPLIT PRIT는 ²¹²Pb-DOTAM의 종양 특이적 축적 이후 방사선-유도 종양 세포 사멸을 생성할 것으로 예상된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항체는 표적 항원(예를 들어, 본원에서 논의된 임의의 표적 항원)에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들은 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들어, 10^-7M 이하, 예를 들어, 10^-7 내지 10^-13, 10^-8 M 이하, 예를 들어, 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들어, 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수(K_D)로 결합할 수 있다.

한 실시형태에서, 제1 및 제2 항체는 각각 "항원 A"로 명명될 수 있는 동일한 표적 항원에 결합할 수 있다(즉, 이들은 동일한 표적 항원에 대해 결합 특이성을 갖는다). 이들은 각각 항원 A 상의 동일한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다. 대안적으로, 제1 항체는 항원 A 상의 제1 에피토프에 결합할 수 있고 제2 항체는 항원 A 상의 상이한 제2 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, 한 실시형태에서 , 항체 중 하나는 CEA의 T84.66 에피토프에 결합할 수 있고 다른 하나는 CEA의 A5B7 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 항체 및/또는 제2 항체 중 하나 또는 둘 모두는 항원 A에 대해 이중파라토프일 수 있다 - 즉, 각각의 개별 항체는 항원 A의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 제1 항체는 항원 A의 제1 및 제2 에피토프에 각각 결합하는 제1 및 제2 결합 부위를 포함할 수 있으며, 이 때 제1 및 제2 에피토프는 서로 상이하다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제2 항체는 항원 A의 제1 및 제2 에피토프에 결합하는 제1 및 제2 결합 부위를 포함할 수 있으며, 이 때 제1 및 제2 에피토프는 서로 상이하다. 일부 실시형태에서, 제1 항체에 의해 결합된 에피토프 중 하나 또는 둘 모두는 제2 항체에 의해 결합된 에피토프 중 하나 또는 둘 모두와 상이할 수 있다. 다른 실시형태에서, 제1 항체에 의해 결합된 2개의 에피토프는 제2 항체에 의해 결합된 2개의 에피토프와 동일할 수 있다.

또 다른 양태에서, 제1 항체 및 제2 항체 각각은 각각 항원 A 및 항원 B로 명명될 수 있는 상이한 표적 항원에 결합할 수 있다.

C. 이펙터 모이어티

본 발명에 따르면, 제1 및 제2 항체의 결합은 이펙터 모이어티에 대한 기능적 결합 부위를 형성한다.

하나의 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 이펙터 모이어티는 약물, 세포독소, 이미징제 및 방사성 표지 화합물로부터 선택된다.

특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 이펙터 모이어티는 방사성 동위원소를 포함하는 방사성 표지 화합물, 예를 들어, 방사성 표지 합텐이다.

일부 실시형태에서, 이펙터 분자는 킬레이트화된 방사성동위원소를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 이펙터 분자에 대한 기능적 결합 부위는 킬레이트제 및 방사성동위원소를 포함하는 킬레이트에 결합할 수 있다. 다른 실시형태에서, 항체는 킬레이트화된 방사성동위원소, 예를 들어, 히스타민-숙시닐-글리신(HSG), 디곡시게닌, 비오틴 또는 카페인에 접합된 모이어티에 결합할 수 있다.

킬레이트제는, 예를 들어, 아미노폴리카르복실산 또는 아미노폴리티오카르복실산, 또는 이의 염 또는 이의 기능적 변이체와 같은 다배위 분자일 수 있다. 킬레이트제는, 예를 들어, 2배위 또는 3배위 또는 4배위일 수 있다. 적합한 금속 킬레이트제의 예는 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산, 또는 CaNa₂EDTA와 같은 염 형태), DTPA(디에틸렌트리아민 펜타아세트산), DOTA(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), NOTA(2,2',2''-(1,4,7-트리아자노난-1,4,7-트리일)트리아세트산), IDA(이미노디아세트산), MIDA((메틸이미노)디아세트산), TTHA(3,6,9,12-테트라키스(카르복시메틸)-3,6,9,12-테트라-아자테트라데칸디오산), TETA(2,2',2'',2'''-(1,4, 8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라일)테트라아세트산), DOTAM(1,4,7,10-테트라키스(카르바모일메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸), HEHA(1,4,7,10,13,16-헥사아자시클로헥사데칸-1,4,7,10,13,16-헥사아세트산, 미국 텍사스주 플라노 소재 Macrocyclics, Inc.사로부터 구입), NTA(니트릴로트리아세트산) EDDHA(에틸렌디아민-N, N'-비스(2-히드록시페닐아세트산), BAL(2,3-디메르캅토프로판올), DMSA(2,3-디메르캅토숙신산), DMPS(2,3-디메르캅토-1-프로판술폰산), D-페니실라민(B -디메틸시스테인), MAG₃(메르캅토아세틸트리글리신), Hynic(6-하이드라지노프리딘-3-카르복실산), p-이소티오시아나토벤질-데스페리옥사민(예를 들어, 이미징을 위해 지르코늄으로 표지됨), 및 금속을 킬레이트화할 수 있는 이의 염 또는 기능적 변이체/유도체를 포함하는 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 킬레이트제는 DOTA 또는 DOTAM 또는 금속을 킬레이트화할 수 있는 이의 염 또는 기능적 변이체/유도체인 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 킬레이트제는 방사성동위원소가 킬레이트된 DOTA 또는 DOTAM일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.

이펙터 분자는 방사성 핵종과 함께 상기 킬레이트제의 기능적 변이체 또는 유도체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 적합한 변이체/유도체는 일정한 제한된 정도로 상이한 구조를 가지며 킬레이트제로서 기능하는 능력을 유지한다(즉, 본원에 기재된 하나 이상의 목적을 위해 사용되기에 충분한 활성을 유지함). 기능적 변이체/유도체는 또한 소분자, 폴리펩티드 또는 탄수화물을 포함하는 하나 이상의 추가 모이어티 또는 치환기에 접합된 상기 기재된 바와 같은 킬레이트제를 포함할 수 있다. 이러한 부착은, 예를 들어, 킬레이트제의 백본 부분에 있는 구성 탄소 중 하나를 통해 발생할 수 있다. 적합한 치환기는, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 아릴 또는 알키닐과 같은 탄화수소기; 히드록시기; 알콜기; 할로겐 원자; 니트로기; 시아노기; 술포닐기; 티올기; 아민기; 옥소기; 카르복시기; 티오카복시기; 카르보닐기; 아미드기; 에스테르기; 또는 헤테로아릴기를 비롯한 헤테로고리이다. 치환기는, 예를 들어, 하기 "R¹"기에 대해 정의된 것들 중 하나일 수 있다. 소분자는, 예를 들어, 염료(예를 들어, Alexa 647 또는 Alexa 488), 비오틴 또는 비오틴 모이어티, 또는 페닐 또는 벤질 모이어티일 수 있다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 올리고 펩티드, 예를 들어, 2개 또는 3개의 아미노산의 올리고펩티드일 수 있다. 예시적인 탄수화물에는 덱스트란, 선형 또는 분지형 중합체 또는 공중합체(예를 들어, 폴리알킬렌, 폴리(에틸렌-리신), 폴리메타크릴레이트, 폴리아미노산, 폴리- 또는 올리고당류, 덴드리머)가 포함된다. 유도체는 또한 상기 기재된 화합물이 링커 모이어티를 통해 연결된 킬레이트제 화합물의 다량체를 포함할 수 있다. 유도체는 또한 금속 이온을 킬레이트화하는 능력을 보유하는, 상기 화합물의 기능적 단편을 포함할 수 있다.

유도체의 특정 예에는 벤질-EDTA 및 히드록시에틸-티오우리도-벤질 EDTA, DOTA-벤젠(예를 들어, (S-2-(4-아미노벤질)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 테트라아세트산), DOTA-비오틴, 및 DOTA-TyrLys-DOTA가 포함된다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항체의 결합에 의해 형성된 기능적 결합 부위는 DOTAM 및 금속, 예를 들어, 납(Pb)을 포함하는 금속 킬레이트에 결합한다. 상기 언급한 바와 같이, "DOTAM"의 화학명은 다음과 같으며:

1,4,7,10-테트라키스(카르바모일메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸, 이는 다음 화학식의 화합물이다

본 발명은 특정 양상 및 실시형태에서 금속 이온을 혼입시킨 DOTAM의 기능적 변이체 또는 유도체를 사용할 수도 있다. 적합한 DOTAM의 변이체/유도체는 일정한 제한된 정도로 DOTAM의 구조와 상이한 구조를 가지며 기능하는 능력을 유지한다(즉, 본원에 기재된 하나 이상의 목적을 위해 사용되기에 충분한 활성을 유지함). 이러한 양상 및 실시형태에서, DOTAM 또는 DOTAM의 기능적 변이체/유도체는 WO 2010/099536에 개시된 활성 변이체들 중 하나일 수 있다. 적합한 기능성 변이체/유도체는 다음 화학식의 화합물:

또는 이의 약학적으로 허용되는 염일 수 있으며; 이 때

R^N은 H, C_1-6 알킬, C_1-6 할로알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐, C_3-7 시클로알킬, C_3-7 시클로알킬-C_1-4알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬-C_1-4 알킬, 페닐, 페닐-C_1-4-알킬, C_1-7 헤테로아릴, 및 C_1-7헤테로아릴-C_1-4-알킬이고; 이 때 C_1-6 알킬, C_1-6 할로알킬, C_2-6 알케닐, 및 C_2-6 알키닐은 각각 1, 2, 3, 또는 4개의 독립적으로 선택된 R^w기로 선택적으로 치환되고; 그리고 이 때 상기 C_3-7 시클로알킬, C_3-7 시클로알킬-C_1-4알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬, C_2-7 헤테로시클로알킬-C_1-4 알킬, 페닐, 페닐-C_1-4-알킬, C_1-7 헤테로아릴, 및 C_1-7헤테로아릴-C_1-4-알킬은 각각 1, 2, 3, 또는4개의 독립적으로 선택된 R^x기로 선택적으로 치환되고;

L¹은 독립적으로 C_1-6알킬렌, C_1-6 알케닐렌, 또는 C_1-6　알키닐렌이고, 이들 각각은 1, 2, 또는 3개의 독립적으로 선택된 R¹기에 의해 선택적으로 치환되고;

L²는 C_2-4 직쇄 알킬렌이고, 이는 독립적으로 선택된 R¹기로 선택적으로 치환되고; 그리고 C_1-4 알킬 및 C_1-4 할로알킬에서 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 또는 4개 작용기로 선택적으로 치환되고;

R¹은 D¹-D²-D³, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록실, C_1-6 알콕시, C_1-6 할로알콕시, C_1-6 알킬티오, C_1-6　알킬술피닐, C_1-6　알킬술포닐, 아미노, C_1-6　알킬아미노, 디-C_1-6　알킬아미노, C_1-4　알킬카르보닐, 카르복시, C_1-6　알콕시카르보닐, C_1-6　알킬카르보닐아미노, 디-C_1-6　알킬카르보닐아미노, C_1-6　알콕시카르보닐아미노, C_1-6　알콕시카르보닐-(C_1-6 알킬)아미노, 카르바밀, C_1-6 알킬카르바밀, 및 디-C_1-6 알킬카르바밀로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 D¹은 C_6-10 아릴-C_1-4 알킬, C_1-9 헤테로아릴-C_1-4　알킬, C_3-10 시클로알킬-C_1-4　알킬, C_2-9 헤테로시클로알킬-C_1-4　알킬, C_1-8 알킬렌, C_1-8 알케닐렌, 및 C_1-8 알키닐렌로부터 독립적으로 선택되고; 이 때 상기 C_1-8 알킬렌, C_1-8 알케닐렌, 및 C_1-8 알키닐렌은 1, 2, 3, 또는 4개의 독립적으로 선택된 R⁴기들로 선택적으로 치환되고; 그리고 이 때 상기 C_6-10 아릴-C_1-4 알킬, C_1-9 헤테로아릴-C_1-4　알킬, C_3-10 시클로알킬-C_1-4　알킬, C_2-9 헤테로시클로알킬-C_1-4　알킬은 각각 1, 2, 3, 또는 4개의 독립적으로 선택된 R⁵기로 선택적으로 치환되고;

각각의 D²는 독립적으로 존재하지 않거나 C_1-20 직쇄 알킬렌이고, 여기서 상기 C_1-20 직쇄 알킬렌의 1 내지 6개의 인접하지 않은 메틸렌 그룹은 각각 독립적으로 선택된 -D⁴-모이어티로 선택적으로 대체되며, 단, 상기 C_1-20 직쇄 알킬렌의 적어도 하나의 메틸렌 유닛은 -D⁴-모이어티로 선택적으로 대체되지 않고; 이 때 상기 C_1-20　직쇄 알킬렌은 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록실, C_1-4　알킬, C_1-4　할로알킬, C_1-4 알콕시, C_1-4 할로알콕시, 아미노, C_1-4알킬아미노, 디-C_1-4　알킬아미노, C_1-4　알킬카르보닐, 카르복시, C_1-4　알콕시카르보닐, C_1-4　알킬카르보닐아미노, 디-C_1-4　알킬카르보닐아미노, C_1-4　알콕시카르보닐아미노, C_1-4　알콕시카르보닐-(C_1-4 알킬)아미노, 카르바밀, C_1-4 알킬카르바밀, 및 디-C_1-4 알킬카르바밀에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 작용기에 의해 선택적으로 치환되고;

각각의 D³은 H, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록실, C_1-6 알킬, C_1-6 할로알킬, C_2-6　알케닐, C_2-6　알키닐, C_3-14　시클로알킬, C_3-14　시클로알킬-C_1-4　알킬, C_2-14　헤테로시클로알킬, C_2-14　헤테로시클로알킬-C_1-4　알킬, C_6-14　아릴, C_6-14　아릴-C_1-4　알킬, C_1-13　헤테로아릴, C_1-13　헤테로아릴-C_1-4　알킬에서 독립적으로 선택되고; 이 때 상기 C_1-6 알킬, C_1-6 할로알킬, C_2-6　알케닐, C_2-6　알키닐은 각각 1, 2, 3, 또는 4개의 독립적으로 선택된 R⁶기로 선택적으로 치환되고; 그리고 이 때 상기 C_3-14　시클로알킬, C_3-14　시클로알킬-C_1-4　알킬, C_2-14　헤테로시클로알킬, C_2-14　헤테로시클로알킬-C_1-4　알킬, C_6-14　아릴, C_6-14　아릴-C_1-4　알킬, C_1-13　헤테로아릴, C_1-13　헤테로아릴-C_1-4　알킬은 각각 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 선택된 R⁷기로 선택적으로 치환되고;

각각의 D⁴는 -O-, -S-, -NR^aC(=O)-, -NR^aC(=S)-, -NR^bC(=O)NR^c-, -NR^bC(=S)NR^c-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -S(=O)NR^a-, -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=O)O-, -OC(=O)NR^a-, -OC(=S)NR^a-, -NR^a-, -NR^bS(=O)NR^c- 및 NR^bS(=O)₂NR^O-로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 R⁴　 및 R⁶는 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록실, C_1-4 알콕시, C_1-4 할로알콕시, C_1-4　알킬티오, C_1-4　알킬술피닐, C_1-4　알킬술포닐, 아미노, C_1-4알킬아미노, 디-C_1-4　알킬아미노, C_1-4　알킬카르보닐, 카르복시, C_1-4　알콕시카르보닐, C_1-4　알킬카르보닐아미노, 디-C_1-4　알킬카르보닐아미노, C_1-4　알콕시카르보닐아미노, C_1-4　알콕시카르보닐-(C_1-4 알킬)아미노, 카르바밀, C_1-4 알킬카르바밀, 및 디-C_1-4 알킬카르바밀로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 R⁵는 할로겐, 시아노, 시아네이트, 이소티오시아네이트, 니트로, 히드록실, C_1-4　알킬, C_2-4 알케닐, C_2-4　알키닐, C_1-4 알콕시, C_1-4 할로알콕시, C_1-4　알킬티오, C_1-4　알킬술피닐, C_1-4　알킬술포닐, 아미노, C_1-4알킬아미노, 디-C_1-4　알킬아미노, C_1-4　알킬카르보닐, 카르복시, C_1-4　알콕시카르보닐, C_1-4　알킬카르보닐아미노, 디-C_1-4　알킬카르보닐아미노, C_1-4　알콕시카르보닐아미노, C_1-4　알콕시카르보닐-(C_1-4 알킬)아미노, 카르바밀, C_1-4 알킬카르바밀, 및 디-C_1-4 알킬카르바밀로부터 독립적으로 선택되고;

각각의 R⁷은 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록실, C_1-6 알킬, C_2-6　알케닐, C_2-6　알키닐, C_3-7　시클로알킬, C_3-7　시클로알킬-C_1-4　알킬, C_2-7　헤테로시클로알킬, C_2-7　헤테로시클로알킬-C_1-4　알킬, 페닐, 페닐-C_1-4　알킬, C_1-7　헤테로아릴,　C_1-7　헤테로아릴-C_1-4　알킬, -OR^O, -SR^O, -S(=O)R^P, -S(=O)₂R^P, -S(=O)NR^sR^t, -C(=O)R^P, -C(=O)OR^P, -C(=O)NR^sR^t,　-OC(=O)R^P, -OC(=O)NR^sR^t, -NR^sR^t, -NR^qC(=O)R^r, -NR^qC(=O)OR^r, -NR^qC(=O)NR^r, -NR^qS(=O)₂R^r, 및 -NR^PS(=O)₂NR^sR^t로부터 독립적으로 선택되고; 이 때 상기 C_1-6 알킬, C_2-6　알케닐, C_2-6　알키닐은 각각 1, 2, 3, 또는 4개의 독립적으로 선택된 R'기로 선택적으로 치환되고; 그리고 이 때 상기 C_3-7　시클로알킬, C_3-7　시클로알킬-C_1-4　알킬, C_2-7　헤테로시클로알킬, C_2-7　헤테로시클로알킬-C_1-4　알킬, 페닐, 페닐-C_1-4　알킬, C_1-7　헤테로아릴,　C_1-7　헤테로아릴-C_1-4　알킬은 각각 1, 2, 3, 또는 4개의 독??벅으로 선택된 R''기들로 선택적으로 치환되고;

각각의 R^a, R^b, 및 R^c는 H, C_1-6　알킬, C_1-6　할로알킬, C_2-6　알케닐, C_2-6　알키닐, C_3-7　시클로알킬, C_3-7　시클로알킬-C_1-4　알킬, C_2-7　헤테로시클로알킬, C_2-7　헤테로시클로알킬-C_1-4　알킬, 페닐, 페닐-C_1-4　알킬, C_1-7　헤테로아릴,　C_1-7　헤테로아릴-C_1-4　알킬로부터 독립적으로 선택되고; 이 때 상기 C_1-6 알킬, C_1-6　할로알킬, C_2-6　알케닐, C_2-6　알키닐은 각각 1, 2, 3, 또는 4개의 독립적으로 선택된 R^w기로 선택적으로 치환되고; 그리고 이 때 상기 C_3-7　시클로알킬, C_3-7　시클로알킬-C_1-4　알킬, C_2-7　헤테로시클로알킬, C_2-7　헤테로시클로알킬-C_1-4　알킬, 페닐, 페닐-C_1-4　알킬, C_1-7　헤테로아릴,　C_1-7　헤테로아릴-C_1-4　알킬은 각각 1, 2, 3, 또는 4개의 독립적으로 선택된 R^x기들로 선택적으로 치환되고;

각각의 R^o, R^p, R^q, R^r, R^s 및 R^t는 H, C_1-6　알킬, C_1-6　할로알킬, C_2-6　알케닐, C_2-6　알키닐, C_3-7　시클로알킬, C_3-7　시클로알킬-C_1-4　알킬, C_2-7　헤테로시클로알킬, C_2-7　헤테로시클로알킬-C_1-4　알킬, 페닐, 페닐-C_1-4　알킬, C_1-7　헤테로아릴,　C_1-7　헤테로아릴-C_1-4　알킬로부터 독립적으로 선택되고; 이 때 상기 C_1-6 알킬, C_1-6　할로알킬, C_2-6　알케닐, C_2-6　알키닐은 각각 1, 2, 3, 또는 4개의 독립적으로 선택된 R^y기로 선택적으로 치환되고; 그리고 이 때 상기 C_3-7　시클로알킬, C_3-7　시클로알킬-C_1-4　알킬, C_2-7　헤테로시클로알킬, C_2-7　헤테로시클로알킬-C_1-4　알킬, 페닐, 페닐-C_1-4　알킬, C_1-7　헤테로아릴,　C_1-7　헤테로아릴-C_1-4　알킬은 각각 1, 2, 3, 또는 4개의 독립적으로 선택된 R^z기로 선택적으로 치환되고;

각각의 R', R^w 및 R^y는 히드록실, 시아노, 니트로, C_1-4　알콕시, C_1-4　할로알콕시, 아미노, C_1-4　알킬아미노, 및 디-C_1-4　알킬아미노로부터 독립적으로 선택되고; 그리고

각각의 R'', R^x, 및 R^z는 히드록실, 할로겐, 시아노, 니트로, C_1-4　알킬, C_1-4　할로알킬, C_1-4　알콕시, C_1-4　할로알콕시, 아미노, C_1-4　알킬아미노, 및 디-C_1-4 알킬아미노로부터 독립적으로 선택되고;

단, 선택적으로 치환된 모이어티에서 각 원자의 원자가를 초과하지 않아야 한다.

적절하게는, 상기 화학식의 기능적 변이체/유도체는 본 발명의 항체에 대한 친화도가 DOTAM과 비슷하거나 더 크고, Pb에 대한 결합 강도는 DOTAM과 비슷하거나 더 크다("친화도"는 상기 기재된 바와 같이 해리 상수에 의해 측정됨). 예를 들어, 본 발명의 항체 또는/Pb와의 상기 기능적/변이체 유도체의 해리 상수는 동일한 항체/Pb와의 DOTAM의 해리 상수보다 1.1배 이하, 1.2배 이하, 1.3배 이하, 1.4배 이하, 1.5배 이하, 또는 2배 이하일 수 있다.

각각의 R^N은 H, C_1-6 알킬, 또는 C_1-6 할로알킬; 바람직하게는 H, C_1-4 알킬, 또는 C_1-4 할로알킬 일 수 있다. 가장 바람직하게는, 각각의 R^N은 H이다.

DOTAM 변이체의 경우, 1, 2, 3 또는 가장 바람직하게는 각각의 L²는 C₂　알킬렌인 것이 바람직하다. 유리하게는, DOTAM의 C₂ 알킬렌 변이체는 Pb에 대해 특히 높은 친화성을 가질 수 있다. L² 에 대한 선택적 치환기는 R¹, C_1-4 알킬, 또는 C_1-4 할로알킬일 수 있다. 적합하게는, L² 에 대한 선택적 치환기는 C_1-4 알킬 또는 C_1-4 할로알킬 일 수 있다.

선택적으로, 각각의 L²는 치환되지 않은 C₂ 알킬렌 -CH₂CH₂- 일 수 있다.

각각의 L¹은 바람직하게는 C_1-4 알킬렌, 더욱 바람직하게는 C₁ 알킬렌, 예를 들어, -CH₂-이다.

DOTAM의 기능적 변이체/유도체는 다음 화학식의 화합물일 수 있다:

이 때 각각의 Z는 독립적으로 상기 정의된 바와 같은 R¹이고; p, q, r 및 s는 0, 1 또는 2이고; p+q+r+s는 1 이상이다. 바람직하게는, p, q, r 및 s는 0 또는 1이고/이거나 p+q+r+s는 1이다. 예를 들어, 화합물은 p+q+r+s = 1일 수 있으며, 이 때 Z는 p-SCN-벤질 모이어티이다-이러한 화합물은 Macrocyclics, Inc.사(Plano, Texas)에서 구입가능하다.

본 발명에 유용한 방사성 핵종은 납(Pb), 루테튬(Lu) 또는 이트륨(Y)과 같은 금속의 방사성 동위원소를 포함할 수 있다.

이미징 응용 분야에서 특히 유용한 방사성 핵종은 감마 방출체인 방사성 핵종일 수 있다. 예를 들어, 이들은 ²⁰³Pb 또는 ²⁰⁵Bi 중에서 선택될 수 있다.

치료 응용에 특히 유용한 방사성 핵종은 알파 또는 베타 방사체인 방사성 핵종이다. 예를 들어, 이들은 ²¹²Pb, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ²²⁵Ac, ²¹¹At, ²²⁷Th, ²²³Ra로부터 선택될 수 있다.

일부 실시형태에서, DOTAM(또는 이의 염 또는 기능적 변이체)이 Pb 또는 Bi, 예를 들어, 상기 열거된 Pb 또는 Bi 방사성동위원소 중 하나로 킬레이트화되는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시형태에서, DOTA(또는 이의 염 또는 기능적 변이체)는 Lu 또는 Y, 예를 들어, 상기 열거된 Lu 또는 Y 방사성동위원소 중 하나로 킬레이트화되는 것이 바람직할 수 있다.

일부 실시형태에서, 방법 및 용도는 요법과 이미징의 병용 방법을 포함할 수 있으며, 이러한 방법은 방사성동위원소, 예를 들어, 요법에 적합한 방사성동위원소 및 이미징에 적합한 방사성동위원소의 혼합물을 사용한다. 예를 들어, 이들은 동일한 킬레이트제에 의해 킬레이트된 동일한 금속의 상이한 방사성 동위원소일 수 있다. 한 실시형태에서, 상기 방법은 ²⁰³Pb-DOTAM 및 ²¹²Pb-DOTAM을 혼합물로서 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 감마 방출체, 예를 들어, ²⁰³Pb 또는²⁰⁵Bi를 사용하는 제1 선량평가 주기, 이후 알파 또는 베타 방출체, 예를 들어, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ²²⁵Ac, ²¹¹At, ²²⁷Th, 또는 ²²³Ra을 사용하는 1회 이상의 치료 주기를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 아래에 자세히 설명되어 있다.

일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항체의 결합에 의해 형성된 기능적 결합 부위는 Pb-DOTAM 킬레이트에 결합할 수 있다.

일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항체의 결합에 의해 형성된 기능적 결합 부위는 방사성 표지 화합물에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이는 방사성 표지 화합물, 예를 들어, Pb-DOTAM 킬레이트제에 결합할 수 있으며, Pb-DOTAM 및/또는 상기 표적에 대한 해리 상수(K_D)는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들어, 10^-7M 이하, 예를 들어 10^-7 내지 10^-13, 10^-8 M 이하, 예를 들어, 10^-8 M 내지 10^-13 M , 예를 들어, 10^-9M에서 10^-13M로)이다. 일부 실시형태에서, 이는 100pM, 50pM, 20pM, 10pM, 5pM, 1pM 이하, 예를 들어, 0.9pM 이하, 0.8pM 이하, 0.7pM 이하, 0.6pM 이하 또는 0.5pM 이하의 결합 친화도의 K_D 값으로 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 기능적 결합 부위는 약 1pM-1nM, 예를 들어, 약 1-10 pM, 1-100pM, 5-50 pM, 100-500 pM 또는 500pM-1 nM의 K_D로 금속 킬레이트에 결합할 수 있다.

D. DOTA에 대한 예시적인 항원 결합 부위

본 발명의 한 특정 실시형태에서, 제1 및 제2 항체는 결합하여 DOTA(또는 이의 기능적 유도체 또는 변이체), 예를 들어 Lu 또는 Y(예를 들어, 177Lu 또는 90Y)로 킬레이트화된 DOTA에 대한 기능적 결합 부위를 형성한다. 예를 들어, 기능적 결합 부위는 약 1pM-1nM, 예를 들어, 약 1-10 pM, 1-100pM, 5-50 pM, 100-500 pM 또는 500pM-1 nM의 K_D로 방사성표지 화합물에 결합할 수 있다.

C825는 ¹⁷⁷Lu 및 ⁹⁰Y와 같은 방사성 금속과 복합체를 형성하는 DOTA-Bn(S-2-(4-아미노벤질)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 테트라아세트산)에 대해 높은 친화성을 갖는 공지의 scFv이다(예를 들어 Cheal 외, 2018, Theranostics 2018 및 WO2010099536 참조, 이들은 본원에 참조로 포함됨). C825의 CDR 서열 및 VL 및 VH 서열이 본원에 제공된다. 한 실시형태에서, 방사성 표지 화합물에 대한 항원 결합 부위의 일부를 형성하는 중쇄 가변 영역은 (a) 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택된 적어도 1, 2개 또는 3개 CDR 모두를 포함할 수 있다. 대안적 실시형태에서, CDR-H1은 서열 GFSLTDYGVH(서열번호 148)를 가질 수 있다. 방사성 표지 화합물에 대한 결합 부위의 일부를 형성하는 경쇄 가변 영역은 (d) 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2개 또는 3개 CDR 모두를 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, (제1 항체 상의) 방사성 표지 화합물에 대한 기능적 항원 결합 부위의 중쇄 가변 도메인 형성 부분은 서열번호 41의 아미노산 서열, 또는 서열번호 41에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 결합 부위는 Lu 또는 Y와 복합체를 형성하는 DOTA에 바람직하게는 본원에 기재된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 41에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, 상기 항체는 서열번호 41의 VH 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 35의 아미노산 서열 또는 GFSLTDYGVH(서열번호 148)의 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2: 및 (c) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

선택적으로, (제2 항체 상의) 방사성 표지 화합물에 대한 기능적 항원 결합 부위의 경쇄 가변 도메인 형성 부분은 서열번호 42의 아미노산 서열, 또는 서열번호 42에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 결합 부위는 Lu 또는 Y와 복합체를 형성하는 DOTA에 바람직하게는 본원에 기재된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태들에서, 서열번호 42에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 선택적으로, 항체는 서열번호 42의 VL 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 관련된 실시형태는 병용을 명시적으로 고려한다. 따라서, 기능적 항원 결합 부위는 제1 항체 및 제2 항체 각각에서 상기 정의된 중쇄 가변 영역 및 상기 정의된 경쇄 가변 영역으로부터 형성될 수 있다.

임의의 상기 실시형태에서, DOTA 복합체에 대한 결합 부위를 형성하는 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 인간화될 수 있다. 한 실시형태에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 임의의 상기 실시형태에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 하기 추가로 논의되는 바와 같이, 하나 이상의 C-말단 잔기들, 예를 들어, 하나 이상의 C-말단 알라닌 잔기, 또는 CH1 도메인의 N-말단으로부터의 하나 이상의 잔기에 의해 연장될 수 있다.

E. DOTAM에 대한 예시적인 항원 결합 부위

본 발명의 또 다른 특정 실시형태에서, 제1 및 제2 항체는 결합하여 Pb-DOTAM 킬레이트(Pb-DOTAM)에 대한 기능적 항원 결합 부위를 형성한다. 예시적인 항원 결합 부위는 WO2019/201959에 기술되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

특정 실시형태에서, Pb-DOTAM에 결합하는 기능적 항원 결합 부위는 다음 특성들 중 하나 이상을 가질 수 있다:

*jPb-DOTAM 및 Bi-DOTAM에 특이적으로 결합하고;

*jCu-DOTAM과 같은 다른 킬레이트 금속에 비해 Pb-DOTAM(및 선택적으로 Bi-DOTAM)에 선택적이고;

*j매우 높은 친화도로 Pb-DOTAM에 결합하고;

*jWO2019/201959에 기술된 항체, 예를 들어, PRIT-0213 또는 PRIT-0214와 동일한 Pb-DOTAM 상의 에피토프에 결합하고/하거나 상기 항체와 동일한 접촉 잔기를 가진다.

Pb의 방사성동위원소는 진단 및 치료 방법에 유용하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 납의 특정 방사성동위원소는²¹²Pb 및²⁰³Pb를 포함한다.

α-입자 방출체인 방사성 핵종은 짧은 경로 길이와 높은 선형 에너지 전달의 조합으로 인해 β방출체보다 주변 조직에 대한 손상이 적고, 보다 특이적인 종양 세포 사멸 가능성을 가진다. ²¹²Bi는 α 입자 방출체이지만 짧은 반감기로 인해 직접 사용이 어렵다. ²¹²Pb는 ²¹²Bi의 모체 방사성핵종이며 ²¹²Bi의 생체내 생성인자로서 역할할 수 있으므로, ²¹²Bi의 짧은 반감기를 효과적으로 극복할 수 있다(Yong and Brechbiel, Dalton Trans. 2001 June 21; 40(23)6068-6076).

²⁰³Pb는 이미징 동위 원소로 유용하다. 따라서, ²⁰³Pb-DOTAM에 결합된 항체는 방사선면역이미징(RII)에서 유용성을 가질 수 있다.

일반적으로 방사성 금속은 킬레이트 형태로 사용된다. 본 발명의 특정 양상에서, DOTAM은 킬레이트제로 사용된다. DOTAM은 Pb(II)의 안정한 킬레이트제이다(Yong and Brechbiel, Dalton Trans. 2001 June 21; 40(23)6068-6076; Chappell 외, Nuclear Medicine and Biology, Vol. 27, pp. 93-100, 2000). 따라서 DOTAM은 위에서 논의한 ²¹²Pb 및 ²⁰³Pb와 같은 납의 동위원소와 함께 특히 유용하다.

일부 실시형태에서, 항체들은 Pb-DOTAM에 100pM, 50pM, 20pM, 10pM, 5pM, 1pM 이하, 예를 들어, 0.9pM 이하, 0.8pM 이하, 0.7pM 이하, 0.6pM 이하 또는 0.5pM 이하의 결합 친화도의 K_D 값으로 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 기능적 결합 부위는 약 1pM-1nM, 예를 들어, 약 1-10 pM, 1-100pM, 5-50 pM, 100-500 pM 또는 500pM-1 nM의 K_D로 방사성표지 화합물에 결합할 수 있다.

특정 실시형태에서, 항체는 DOTAM에 의해 킬레이트화된 Bi에 추가로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체들은 Bi-DOTAM (즉, 즉, 비스무트와 복합체를 형성한 DOTAM를 포함하는 킬레이트, 본원에서 “Bi-DOTAM 킬레이트”로도 명명됨)에 1nM, 500pM, 200pM, 100pM, 50pM, 10pM 이하, 예를 들어, 9pM, 8pM, 7pM, 6pM, 5pM 이하의 결합 친화도의 Kd 값으로 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 기능적 결합 부위는 약 1pM-1nM, 예를 들어, 약 1-10 pM, 1-100pM, 5-50 pM, 100-500 pM 또는 500pM-1 nM의 K_D로 금속 킬레이트에 결합할 수 있다.

일부 실시형태에서, 항체는 Bi-DOTAM 및 Pb-DOTAM에 유사한 친화도로 결합할 수 있다. 예를 들어, Bi-DOTAM/Pb-DOTAM에 대한 친화도의 비율, 예를 들어, Kd 값의 비율은 0.1-10, 예를 들어, 1-10의 범위에 있는 것이 바람직할 수 있다.

한 실시형태에서, Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 일부를 형성하는 중쇄 가변 영역은 (a) GFSLSTYSMS (서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) FIGSRGDTYYASWAKG (서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) ERDPYGGGAYPPHL (서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택된 적어도 1, 2개 또는 3개 CDR 모두를 포함할 수 있다. Pb-DOTAM에 대한 결합 부위의 일부를 형성하는 경쇄 가변 영역은 (d) QSSHSVYSDNDLA (서열번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) QASKLAS (서열번호 5)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) LGGYDDESDTYG (서열번호 6)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2개 또는 3개 CDR 모두를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 1-6의 아미노산 서열 각각에 비해 치환, 예를 들어, 1, 2 또는 3개 치환을 가지는, CDR-H1, CDR-H2 및/또는 CDR-H3 중 하나 이상, 또는 CDR-L1, CDR-L2 및/또는 CDR-L3 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 항체는 본원에 기술된 것과 동일한 접촉 잔기들을 공유할 수 있다: 예를 들어, 이러한 잔기는 불변일 수 있다. 이러한 잔기들에는 다음이 포함될 수 있으며:

a) 중쇄 CDR2에서: Phe50, Asp56 및/또는 Tyr58, 그리고 선택적으로 또한 Gly52 및/또는 Arg 54;

b) 중쇄 CDR3에서: Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, Tyr99, Ala100C 및/또는 Tyr100D 그리고 선택적으로 또한 Pro100E;

c) 경쇄 CDR1에서: Tyr28 및/또는 Asp32;

d) 경쇄 CDR3에서: Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c 및/또는 Tyr96;

e) 경쇄 CDR2에서: 선택적으로 Gln50;

모두 Kabat에 따라 넘버링된다.

예를 들어, 일부 실시형태에서, CDR-H2는 아미노산 서열 figsrgdtyyaswAKG(서열번호 2), 또는 서열번호 2에서 최대 1, 2 또는 3개의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하고, 이 때 이러한 치환은 Phe50, Asp56 및/또는 Tyr58을 포함하지 않으며, 그리고 선택적으로 Gly52 및/또는 Arg54도 포함하지 않고, 모두 Kabat에 따라 넘버링된다.

일부 실시형태에서, CDR-H2는 아래 나타낸 바와 같이 하나 이상의 위치에서 치환될 수 있다. 여기 그리고 다음의 치환 표에서, 치환은 생식계열 잔기(밑줄)에 기초한 것이거나 이론상 입체적으로 적합하고 해당 부위의 결정화된 레퍼토리에서도 발생하는 아미노산에 의한 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 언급된 바와 같은 잔기는 고정될 수 있고 다른 잔기는 아래 표에 따라 치환될 수 있다: 다른 실시형태에서, 임의의 잔기의 치환은 아래 표에 따라 이루어질 수 있다.

선택적으로, CDR-H3은 아미노산 서열 erdpygggaypphl(서열번호 3), 또는 서열번호 3에서 최대 1, 2 또는 3개의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 이 때 이러한 치환은 Glu95, Arg96, Asp97, Pro98을 포함하지 않고, 그리고 선택적으로 Ala100C, Tyr100D 및/또는 Pro100E도 포함하지 않고/않거나 선택적으로 Tyr99도 포함하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 치환은 Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, Tyr99 Ala100C 및 Tyr100D를 포함하지 않는다.

특정 실시형태에서, CDR-H3은 아래 나타낸 바와 같이 하나 이상의 위치에서 치환될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 언급된 바와 같은 잔기는 고정될 수 있고 다른 잔기는 아래 표에 따라 치환될 수 있다: 다른 실시형태에서, 임의의 잔기의 치환은 아래 표에 따라 이루어질 수 있다.

선택적으로, CDR-L1은 아미노산 서열 qsshsvysdndLA(서열번호 4) 또는 서열번호 4에서 최대 1, 2 또는 3개의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 이 때 이러한 치환은 Tyr28 및/또는 Asp32(Kabat 넘버링)를 포함하지 않는다.

특정 실시형태에서, CDR-L1은 아래 나타낸 바와 같이 하나 이상의 위치에서 치환될 수 있다. 또한, 일부 실시형태에서, 상기 언급된 바와 같은 잔기는 고정될 수 있고 다른 잔기는 아래 표에 따라 치환될 수 있다: 다른 실시형태에서, 임의의 잔기의 치환은 아래 표에 따라 이루어질 수 있다.

선택적으로, CDR-L3은 아미노산 서열 lggyddesdtyg(서열번호 6) 또는 서열번호 6에서 최대 1, 2 또는 3개의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 이 때 이러한 치환은 Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c 및/또는 Tyr96(Kabat)을 포함하지 않는다.

특정 실시형태에서, CDR-L3은 아래 나타낸 바와 같이 다음의 위치에서 치환될 수 있다. (대부분의 잔기들 용매에 노출되고 항원 접촉이 없기 때문에, 많은 치환이 가능하다). 또한, 일부 실시형태에서, 상기 언급된 바와 같은 잔기는 고정될 수 있고 다른 잔기는 아래 표에 따라 치환될 수 있다: 다른 실시형태에서, 임의의 잔기의 치환은 아래 표에 따라 이루어질 수 있다.

항체는 선택적으로 각각 서열번호 1 또는 서열번호 5의 서열을 갖는 CDR-H1 또는 CDR-L2, 또는 이에 비해 적어도 1, 2 또는 3개의 치환, 선택적으로 보존적 치환을 갖는 이의 변이체를 추가로 포함할 수 있다.

따라서, Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 중쇄 가변 도메인 형성 부분은 적어도 다음을 포함할 수 있다:

a) 아미노산 서열 FIGSRGDTYYASWAKG(서열번호 2), 또는 서열번호 2에서 최대 1, 2 또는 3개의 치환(이 때 이러한 치환은 Phe50, Asp56 및/또는 Tyr58을 포함하지 않으며, 그리고 선택적으로 Gly52 및/또는 Arg54도 포함하지 않음)을 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR2;

b) 아미노산 서열 ERDPYGGGAYPPHL(서열번호 3), 또는 서열번호 3에서 최대 1, 2 또는 3개의 치환(이 때 이러한 치환은 Glu95, Arg96, Asp97, Pro98을 포함하지 않고, 그리고 선택적으로 Ala100C, Tyr100D 및/또는 Pro100E도 포함하지 않고/않거나 선택적으로 Tyr99도 포함하지 않음)을 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR3.

일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 선택적으로 다음과 같은 중쇄 CDR1을 추가로 포함한다:

c) 아미노산 서열 GFSLSTYSMS(서열번호 1) 또는 서열번호 1에서 최대 1, 2 또는 3개의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1.

또 다른 실시형태에서, Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 경쇄 가변 도메인 형성 부분은 적어도 다음을 포함한다:

d) 아미노산 서열 QSSHSVYSDNDLA(서열번호 4) 또는 서열번호 4에서 최대 1, 2 또는 3개의 치환(이 때 이러한 치환은 Tyr28 및 Asp32를 포함하지 않음)을 갖는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR1;

e) 아미노산 서열 LGGYDDESDTYG(서열번호 6) 또는 서열번호 6에서 최대 1, 2 또는 3개의 치환(이 때 이러한 치환은 Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c 및 Tyr96을 포함하지 않음)을 갖는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR3.

일부 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인은 선택적으로 다음과 같은 경쇄 CDR2를 추가로 포함한다:

f) 아미노산 서열 QASKLAS(서열번호 5) 또는 서열번호 5에서 적어도 1, 2 또는 3개의 치환을 갖고 선택적으로 Gln50을 포함하지 않는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2.

상기 제시된 CDR을 포함하는 서열(예를 들어, 가변 도메인)의 변이체를 포함하는 본 발명의 임의의 실시형태에서, 상기 단백질은 상기 제시된 바와 같은 하나 이상의 CDR 잔기에서 불변일 수 있다.

선택적으로, (제1 항체 상의) Pb-DOTAM에 대한 기능적 항원 결합 부위의 중쇄 가변 도메인 형성 부분은 서열번호 7 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 결합 부위는 Pb-DOTAM에 바람직하게는 본원에 기재된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. VH 서열은 상기 제시된 불변 잔기를 보유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 7 또는 서열번호 9에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, 상기 항체는 서열번호 7 또는 서열번호 9의 VH 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2: 및 (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

선택적으로, (제2 항체 상의) Pb-DOTAM에 대한 기능적 항원 결합 부위의 경쇄 가변 도메인 형성 부분은 서열번호 8의 아미노산 서열, 또는 서열번호 8에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항-Pb-DOTAM 결합 부위는 Pb-DOTAM에 바람직하게는 본원에 기재된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. VL 서열은 상기 제시된 불변 잔기를 보유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 8에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 나타난다. 선택적으로, 항-Pb-DOTAM 항체는 서열번호 8의 VL 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 관련된 실시형태는 병용을 명시적으로 고려한다. 따라서, Pb-DOTAM에 대한 기능적 항원 결합 부위는 제1 항체 및 제2 항체 각각에서 상기 정의된 중쇄 가변 영역 및 상기 정의된 경쇄 가변 영역으로부터 형성될 수 있다.

선택적으로, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위는 서열번호 7 또는 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 또는 상기 정의된 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 8의 아미노산 서열, 또는 상기 정의된 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인으로부터 형성될 수 있다. 예를 들어, Pb-DOTAM 킬레이트에 특이적인 항원 결합 부위는 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 이의 변이체(이들 서열들의 번역후 변형 포함)를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 이는 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 이의 변이체(이들 서열들의 번역후 변형 포함)를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.

임의의 상기 실시형태에서, 항-Pb-DOTAM 결합 부위를 형성하는 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 인간화될 수 있다. 한 실시형태에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 임의의 상기 실시형태에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역은 임의의 상기 실시형태에서와 같은 CDR을 포함하고, vk 1 39 및/또는 vh 2 26으로부터 유도된 프레임워크 영역을 추가로 포함한다. vk 1 39의 경우, 일부 실시형태에서 역돌연변이가 없을 수 있다. vh 2 26의 경우, 생식계열 Ala49 잔기는 Gly49로 역돌연변이될 수 있다.

F. CEA에 대한 예시적인 항원 결합 부위

상기 논의된 실시형태들과 조합될 수 있는 본 발명의 또 다른 특정 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 항체에 의해 결합되는 표적 항원은 CEA(암배아 항원)일 수 있다. CEA에 대해 생성된 바 있는 항체에는 T84.66 및 이의 인간화 및 키메라 버전, 예를 들어, WO2016/075278 A1 및/또는 WO2017/055389에 설명된 T84.66-LCHA, WO2012/117002 및 WO2014/131712에 설명된 항-CEA 항체인 CH1A1a, 및 CEA hMN-14 또는 라베투지맙(예를 들어, US 6 676 924 및 US 5 874 540에 기재)이 포함된다. CEA에 대한 또 다른 예시적인 항체는 A5B7(예를 들어, MJ Banfield 외, Proteins 1997, 29(2), 161-171에 기재), 또는 WO 92/01059 및 WO 2007/071422에 기재된 뮤린 A5B7로부터 유도된 인간화 항체이다. 동시 계류 중인 출원 PCT/EP2020/067582도 참조하라. A5B7의 인간화 버전의 예는 A5H1EL1(G54A)이다. CEA에 대한 추가의 예시적인 항체는 US 7 626 011 및/또는 동시 계류 중인 출원 PCT/EP2020/067582에 기재된 MFE23 및 이의 인간화 버전이다. 항-CEA 항체의 또 다른 추가 예는 28A9이다. 이들 중 어느 하나 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명에서 CEA-결합 모이어티를 형성하는데 사용될 수 있다.

선택적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 1가 결합을 위해 1nM 이하, 500pM 이하, 200pM 이하 또는 100pM 이하의 Kd 값으로 결합할 수 있다.

일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 항체는 CEA의 CH1A1a 에피토프, A5B7 에피토프, MFE23 에피토프, T84.66 에피토프 또는 28A9 에피토프에 결합할 수 있다.

일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항체 중 적어도 하나는 가용성 CEA(sCEA) 상에 존재하지 않는 CEA 에피토프에 결합한다. 가용성 CEA는 GPI 포스포리파제에 의해 절단되어 혈액으로 방출되는 CEA 분자의 일부이다. 가용성 CEA에서 발견되지 않는 에피토프의 예는 CH1A1A 에피토프이다. 선택적으로, 제1 및/또는 제2 항체 중 하나는 가용성 CEA에 존재하지 않는 에피토프에 결합하고, 다른 하나의 항체는 가용성 CEA에 존재하는 에피토프에 결합한다.

CH1A1a 및 그의 뮤린 모 항체 PR1A3에 대한 에피토프는 WO2012/117002A1 및 Durbin H. 외, Proc. Natl. Scad. Sci. USA, 91:4313-4317, 1994에 기재되어 있다. CH1A1a 에피토프에 결합하는 항체는 CEA 분자의 B3 도메인 및 GPI 앵커 내의 구조적 에피토프에 결합한다. 한 양상에서, 항체는 본원에서 서열번호 25의 VH 및 서열번호 26의 VL을 갖는 CH1A1a 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. A5B7 에피토프는 동시 계류 중인 출원 PCT/EP2020/067582에 기재되어 있다. A5B7 에피토프에 결합하는 항체는 CEA의 A2 도메인, 즉, 서열번호 141의 아미노산을 포함하는 도메인에 결합한다:

PKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGP YECGIQNKLSVDHSDPVILN (서열번호 141).

한 양상에서, 항체는 본원에서 서열번호 49의 VH 및 서열번호 50의 VL을 갖는 A5B7 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.

한 양상에서, 항체는 WO2016/075278에 기재된 T84.66과 동일한 에피토프에 결합한다. 상기 항체는 본원에서 서열번호 17의 VH 및 서열번호 18의 VL을 갖는 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.

MFE23 에피토프는 동시 계류 중인 출원 PCT/EP2020/067582에 기재되어 있다. MFE23 에피토프에 결합하는 항체는 CEA의 A1 도메인, 즉, 서열번호 142의 아미노산을 포함하는 도메인에 결합한다:

PKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTAS YKCETQNPVSARRSDSVILN (서열번호 142).

한 양상에서, 항체는 본원에서 서열번호 127의 VH 도메인 및 서열번호 128의 VL 도메인을 갖는 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.

일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 항체는 본원에 제공된 항체, 예를 들어, P1AD8749, P1AD8592, P1AE4956, P1AE4957, P1AF0709, P1AF0298, P1AF0710 또는 P1AF0711와 동일한 CEA-에피토프에 결합할 수 있다.

일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항체는 CEA의 서로 동일한 에피토프에 결합한다. 그러므로, 예를 들어, 제1 및 제2 항체는 모두 CH1A1a 에피토프, A5B7 에피토프, MFE23 에피토프, T84.66 에피토프 또는 28A9 에피토프에 결합할 수 있다.

일부 실시형태에서, 제1 항체 및 제2 항체는 모두 CH1A1A로부터의 CEA 결합 서열(즉, CDR 및/또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있고; 또는, 제1 및 제2 항체는 모두 A5B7 또는 그의 인간화 버전으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; 또는, 제1 및 제2 항체는 모두 T84.66 또는 이의 인간화 버전으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; 또는 제1 항체 및 제2 항체는 모두 MFE23 또는 이의 인간화 버전으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; 또는 제1 및 제2 항체는 모두 28A9 또는 이의 인간화 버전으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있다. 예시적인 서열은 본원에 개시되어 있다.

다른 실시형태에서, 제1 및 제2 항체는 CEA의 상이한 에피토프에 결합한다. 따라서, 예를 들어, i) 하나의 항체는 CH1A1A 에피토프에 결합할 수 있고 다른 하나는 A5B7 에피토프, T84.66 에피토프, MFE23 에피토프 또는 28A9 에피토프에 결합할 수 있고; ii) 하나의 항체는 A5B7 에피토프에 결합할 수 있고 다른 하나는 CH1A1A 에피토프, T84.66 에피토프, MFE23 에피토프 또는 28A9 에피토프에 결합할 수 있고; iii) 하나의 항체는 MFE23 에피토프에 결합할 수 있고 다른 하나는 CH1A1A 에피토프, A5B7 에피토프, T84.66 에피토프 또는 28A9 에피토프에 결합할 수 있고; iv) 하나의 항체는 T84.66 에피토프에 결합할 수 있고 다른 하나는 CH1A1A 에피토프, A5B7 에피토프, MFE23 에피토프 또는 28A9 에피토프에 결합할 수 있고; 또는 v) 하나의 항체는 28A9 에피토프에 결합할 수 있고 다른 하나는 CH1A1a 에피토프, A5B7 에피토프, MFE23 에피토프 또는 T84.66 에피토프에 결합할 수 있다.

일부 실시형태에서, i) 하나의 항체는 CH1A1A로부터의 CEA 결합 서열(즉, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있고, 다른 하나의 항체는 A5B7 또는 이의 인간화 버전, T84.66 또는 이의 인간화 버전, MFE23 또는 이의 인간화 버전, 또는 28A9 또는 이의 인간화 버전으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; ii) 하나의 항체는 A5B7 또는 이의 인간화 버전으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 다른 항체는 CH1A1A, T84.66 또는 이의 인간화 버전, MFE23 또는 이의 인간화 버전, 또는 28A9 또는 그것의 인간화 버전; iii) 하나의 항체는 MFE23 또는 이의 인간화 버전으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 다른 항체는 CH1A1A, A5B7 또는 이의 인간화 버전, T84.66 또는 이의 인간화 버전, 또는 28A9 또는 이의 인간화 버전으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; iv) 하나의 항체는 T84.66 또는 이의 인간화 버전으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 다른 하나는 CH1A1A, A5B7 또는 이의 인간화 버전, MFE23 또는 이의 인간화 버전, 또는 28A9 또는 인간화 버전으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; v) 하나의 항체는 28A9 또는 이의 인간화 버전으로부터의 CEA-결합 서열을 가질 수 있고, 다른 하나는 CH1A1A, A5B7 또는 이의 인간화 버전, T84.66 또는 이의 인간화 버전, 또는 MFE23 또는 이의 인간화 버전으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있다.

한 특정 실시형태에서, 하나의 항체는 CH1A1A 에피토프에 결합할 수 있고 다른 하나는 A5B7 에피토프에 결합할 수 있다. 제1 항체는 항체 CH1A1A의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 제2 항체는 A5B7(이의 인간화 버전 포함)의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; 또는, 제1 항체는 항체 A5B7(이의 인간화 버전 포함)의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 그리고 제2 항체는 CH1A1A의 CEA 결합 서열을 가질 수 있다.

또 다른 특정 실시형태에서, 하나의 항체는 CH1A1A 에피토프에 결합할 수 있고 다른 하나는 T84.66 에피토프에 결합할 수 있다. 제1 항체는 항체 CH1A1A의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 제2 항체는 T84.66(이의 인간화 버전 포함)의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; 또는, 제1 항체는 항체 T84.66(이의 인간화 버전 포함)의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 제2 항체는 CH1A1A의 CEA 결합 서열을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 항체는 T84.66 에피토프에 결합하고/하거나 아래 (i)에 기재된 바와 같은 항원 결합 부위를 가질 수 있고, 제2 항체는 CH1A1A 에피토프에 결합하고/하거나 아래 (ii)에 기재된 바와 같은 항원 결합 부위를 가질 수 있다.

예시적인 CEA-결합 서열 i)-v)가 아래 개시된다. 이들은 i) T84.66, ii) CH1A1A, iii) A5B7, iv) 28A9 및 v) MFE23(또는 이의 인간화 버전)의 CEA-결합 서열의 예를 제공한다.

i). 한 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR들을 포함할 수 있다.

선택적으로, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열들을 포함할 수 있다.

선택적으로, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열들을 포함한다.

선택적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) (i) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열들을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

또 다른 양상에서, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.

임의의 상기 실시형태에서, 다중특이성 항체는 인간화될 수 있다. 한 실시형태에서, 항-CEA 항원 결합 부위는 상기 실시형태 중 어느 하나와 같은 CDR들을 포함하고, 인간 수용체 프레임워크, 예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다.

또 다른 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 17의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 CEA에 바람직하게는 상기 제시된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 17에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 17의 VH 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2: 및 (c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 18의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 CEA에 바람직하게는 상기 제시된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 18에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, CEA에 대한 항원 결합 부위는 서열번호 18의 VL 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VL을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 항체는 이들 서열의 번역후 변형을 포함하여 각각 서열번호 17 및 서열번호 18의 VH 및 VL 서열을 포함한다.

ii). 추가의 특정 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR들을 포함할 수 있다.

선택적으로, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열들을 포함할 수 있다.

선택적으로, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열들을 포함한다.

선택적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) (i) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열들을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

또 다른 양상에서, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 25의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 CEA에 바람직하게는 상기 제시된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 25에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 25의 VH 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2: 및 (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 26의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 CEA에 바람직하게는 상기 제시된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 26에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, CEA에 대한 항원 결합 부위는 서열번호 26의 VL 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VL을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 항체는 이들 서열의 번역후 변형을 포함하여 각각 서열번호 25 및 서열번호 26의 VH 및 VL 서열을 포함한다.

iii) 추가의 특정 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR들을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR-H1은 서열 GFTFTDYYMN(서열번호 151)을 가질 수 있다.

선택적으로, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열들을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CDR-H1은 서열 GFTFTDYYMN(서열번호 151)을 가질 수 있다.

선택적으로, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열들을 포함한다.

선택적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) (i) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열들을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H1은 서열 GFTFTDYYMN(서열번호 151)을 가질 수 있다.

또 다른 양상에서, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H1은 서열 GFTFTDYYMN(서열번호 151)을 가질 수 있다.

또 다른 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 49의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 CEA에 바람직하게는 상기 제시된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 49에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 49의 VH 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 43의 아미노산 서열 또는 GFTFTDYYMN(서열번호 151)의 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2: 및 (c) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 50의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 CEA에 바람직하게는 상기 제시된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 50에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, CEA에 대한 항원 결합 부위는 서열번호 50의 VL 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VL을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 항체는 이들 서열의 번역후 변형을 포함하여 각각 서열번호 49 및 서열번호 50의 VH 및 VL 서열을 포함한다.

iv) 또 다른 추가의 특정 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR들을 포함할 수 있다.

선택적으로, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열들을 포함할 수 있다.

선택적으로, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열들을 포함한다.

선택적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) (i) 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열들을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

또 다른 양상에서, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 65의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 CEA에 바람직하게는 상기 제시된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 65에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 65의 VH 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2: 및 (c) 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 66의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 CEA에 바람직하게는 상기 제시된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 66에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, CEA에 대한 항원 결합 부위는 서열번호 66의 VL 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VL을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 항체는 이들 서열의 번역후 변형을 포함하여 각각 서열번호 65 및 서열번호 66의 VH 및 VL 서열을 포함한다.

v). 또 다른 추가의 특정 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 117 또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 120, 121 또는 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 123, 124 또는 125의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR들을 포함할 수 있다.

선택적으로, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 다음을 포함할 수 있다:

(a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 117 또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH CDR 서열들; 및/또는

VL 도메인은 (a) 서열번호 120, 121 또는 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 123, 124 또는 125의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL CDR 서열들.

한 실시형태에서, CEA에 대한 항원 결합 부위는 서열번호 127, 또는 (더욱 바람직하게는) 서열번호 129, 130, 131, 132, 133 또는 134로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 128 또는 (더욱 바람직하게는) 서열번호 135, 136, 137, 138, 139 또는 140으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다ㅏ.

특정 양상에서, CEA에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 다음을 포함한다:

(a) 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는

(b) 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는

(c) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는

(d) 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는

(e) 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는

(f) 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는

(g) 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.

또 다른 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 상기 a) 내지 g)에 언급된 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 CEA에 바람직하게는 상기 제시된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다.

또 다른 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 상기 a) 내지 g)에 언급된 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 CEA에 바람직하게는 상기 제시된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다.

또 다른 실시형태에서, CEA에 결합하는 항원 결합 부위는 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VL을 포함한다.

G. GPRC5D 또는 FAP에 대한 예시적인 항원 결합 부위

상기 논의된 실시형태들(예를 들어, DOTA 또는 DOTAM에 대한 결합 부위)과 조합될 수 있는 본 발명의 또 다른 특정 실시형태에서, 제1 및 제2 항체에 의해 결합되는 표적 항원은 GPRC5D 또는 FAP일 수 있다.

선택적으로, GPRC5D 또는 FAP에 결합하는 항원 결합 부위는 1가 결합을 위해 1nM 이하, 500pM 이하, 200pM 이하 또는 100pM 이하의 Kd 값으로 결합할 수 있다.

예시적인 GPRC5D-결합 서열은 아래에 기재되어 있다.

한 실시형태에서, GPRC5D에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR들을 포함할 수 있다.

선택적으로, GPRC5D에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열들을 포함할 수 있다.

선택적으로, GPRC5D에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열들을 포함한다.

선택적으로, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) (i) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열들을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

또 다른 양상에서, GPRC5D에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.

임의의 상기 실시형태에서, 다중특이성 항체는 인간화될 수 있다. 한 실시형태에서, 항-GPRC5D 항원 결합 부위는 상기 실시형태 중 어느 하나와 같은 CDR들을 포함하고, 인간 수용체 프레임워크, 예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다.

또 다른 실시형태에서, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 73의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 GPRC5D에 바람직하게는 상기 제시된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 73에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 73의 VH 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2: 및 (c) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 74의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 GPRC5D에 바람직하게는 상기 제시된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 74에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, GPRC5D에 대한 항원 결합 부위는 서열번호 74의 VL 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, GPRC5D에 결합하는 항원 결합 부위는 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VL을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 항체는 이들 서열의 번역후 변형을 포함하여 각각 서열번호 73 및 서열번호 74의 VH 및 VL 서열을 포함한다.

예시적인 FAP-결합 서열은 아래에 기재되어 있다.

한 실시형태에서, FAP에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR들을 포함할 수 있다.

선택적으로, FAP에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열들을 포함할 수 있다.

선택적으로, FAP에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열들을 포함한다.

선택적으로, FAP에 결합하는 항원 결합 부위는 (a) (i) 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열들을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

또 다른 양상에서, FAP에 결합하는 항원-결합 부위는 (a) 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.

임의의 상기 실시형태에서, 다중특이성 항체는 인간화될 수 있다. 한 실시형태에서, 항-FAP 항원 결합 부위는 상기 실시형태 중 어느 하나와 같은 CDR들을 포함하고, 인간 수용체 프레임워크, 예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다.

또 다른 실시형태에서, FAP에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 81의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 FAP에 바람직하게는 상기 제시된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 81에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, FAP에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 81의 VH 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2: 및 (c) 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, FAP에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 82의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항원 결합 부위는 FAP에 바람직하게는 상기 제시된 친화도로 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 82에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, FAP에 대한 항원 결합 부위는 서열번호 82의 VL 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (b) 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, FAP에 결합하는 항원 결합 부위는 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VL을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 항체는 이들 서열의 번역후 변형을 포함하여 각각 서열번호 81 및 서열번호 82의 VH 및 VL 서열을 포함한다.

H. 예시적인 항체

표적 항원 결합(예를 들어, CEA, GPRC5D 또는 FAP)에 관한 양상 및 실시형태 및 이펙터 모이어티 결합(예를 들어, DOTA, DOTAM)에 관한 양상 및 실시형태는 분명히 조합하여 고려된다. 상기 기재된 임의의 예시적인 표적 항원 결합 부위는 상기 기재된 임의의 이펙터 모이어티 결합 부위와 조합하여 사용될 수 있다.

일부 특정 실시예에서, 표적 항원 결합(예를 들어, CEA, GPRC5D 또는 FAP)에 관한 양상 및 실시형태와 DOTAM 결합에 관한 양상 및 실시형태가 조합된다. 일부 실시형태에서 표적 항원이 CEA인 것이 바람직할 수 있다.

일부 실시형태에서, 제1 항체는 다음을 포함할 수 있고:

a) CEA, GPRC5D 또는 FAP, 선택적으로 CEA로부터 선택된 표적 세포의 표면 상에 발현된 항원에 결합하는 Fab 단편;

b) Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 항체 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드(이 때 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1-3의 중쇄 CDR을 포함하고/하거나 중쇄 가변 도메인은 서열번호 7에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가짐); 및

c) 2개의 서브유닛을 포함하는 Fc 도메인,

이 때 (b)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (a)의 Fab 단편의 사슬들 중 하나의 C-말단에 그리고 그 C-말단에 의해 (c)의 Fc 도메인의 서브유닛들 중 하나의 N-말단에 융합되고;

이러한 제1 항체는 Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 포함하지 않는다.

제2 항체는 다음을 포함할 수 있고:

d) CEA, GPRC5D 또는 FAP, 선택적으로 CEA로부터 선택된 표적 세포의 표면 상에 발현된 항원에 결합하는 Fab 단편;

e) Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드(이 때 경쇄 가변 도메인은 서열번호 4-6의 CDR을 포함하고/하거나 경쇄 가변 도메인은 서열번호 8에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가짐); 및

f) 2개의 서브유닛을 포함하는 Fc 도메인,

이 때 (e)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (d)의 Fab 단편의 사슬들 중 하나의 C-말단에 그리고 그 C-말단에 의해 (f)의 Fc 도메인의 서브유닛들 중 하나의 N-말단에 융합되고;

이러한 제2 항체는 Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하지 않는다.

상기 제1 항체의 VH 도메인 및 상기 제2 항체의 VL 도메인은 함께 Pb-DOTAM에 대한 기능적 항원 결합 부위를 형성할 수 있다.

한 특정 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 항체(예를 들어, 각각의 제1 및 제2 항체)는 CEA, GPRC5D 또는 FAP, 선택적으로 CEA에 결합하는 추가적인 Fab 단편을 포함할 수 있다. 제1 항체의 각각의 표적 항원 결합 Fab는 서로 동일한 표적 항원(예를 들어, 일부 실시형태에서 CEA)에 결합하고, 제2 항체의 각각의 표적 항원 결합 Fab는 서로 동일한 표적 항원(예를 들어, 일부 실시예에서 CEA)에 결합하는 것이 바람직할 수 있으며, 이는 또한 제1 항체에 의해 결합된 것과 동일할 수 있다. 제1 항체의 각각의 표적 항원-결합 Fab가 표적 항원, 예를 들어 CEA의 동일한 에피토프에 결합하고(즉, 제1 항체는 표적 항원에 대해 단일특이성임), 제2 항체의 각각의 표적 항원 결합 Fab가 표적 항원, 예를 들어, CEA의 동일한 에피토프에 결합(즉, 제2 항체는 표적 항원에 대해 단일특이성임)하는 것이 바람직할 수 있다. 에피토프는 이들 2개의 항체에 의해 결합될 수 있고 동일하거나 상이할 수 있다.

i) N-말단에서 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인(이 때 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1-3의 중쇄 CDR을 포함하고/하거나 중쇄 가변 도메인은 서열번호 7에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가짐); 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드;

ii) (i)의 Fab 중쇄와 쌍을 이루어 CEA, GPRC5D, 또는 FAP, 선택적으로 CEA로부터 선택된 표적 항원에 대한 결합 부위를 형성하는 Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL);

iv) (iii)의 Fab 중쇄와 쌍을 이루어 CEA, GPRC5D, 또는 FAP, 선택적으로 CEA로부터 선택된 표적 항원에 대한 결합 부위를 형성하는 추가 Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL);

제2 항체는 다음 펩티드를 포함할 수 있다:

v) N-말단에서 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인(이 때 경쇄 가변 도메인은 서열번호 4-6의 CDR을 포함하고/하거나 경쇄 가변 도메인은 서열번호 8에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가짐); 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드;

vi) (v)의 Fab 중쇄와 쌍을 이루어 CEA, GPRC5D, 또는 FAP, 선택적으로 CEA로부터 선택된 표적 항원에 대한 결합 부위를 형성하는 Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL);

viii) (vii)의 Fab 중쇄와 쌍을 이루어 CEA, GPRC5D, 또는 FAP, 선택적으로 CEA로부터 선택된 표적 항원에 대한 결합 부위를 형성하는 추가 Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL).

선택적으로 (v)의 Fab 중쇄는 (vii)의 Fab 중쇄와 동일한 서열을 갖고, (vi) 및 (viii)의 Fab 경쇄는 서로 동일한 서열을 갖는다. 선택적으로 이들은 또한 제1 항체와 동일하다.

특정 실시형태에서, 제1 항체는 항체 CH1A1A의 CEA 결합 서열(즉, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

예를 들어, (ii) 및 (iv)의 2개의 Fab 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 22-24의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 26에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 이들은 서열번호 34에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, (ii) 및 (iv)의 2개의 경쇄는 서로 동일한 것이 바람직할 수 있다.

(i) 및 (iii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 19-21의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 (i) 및 (iii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 25에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, (i) 및 (iii)의 2개의 Fab 중쇄는 서로 동일한 것이 바람직할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 제1 항체는 항체 A5B7(이의 인간화 버전 포함)의 CEA 결합 서열(즉, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

예를 들어, (ii) 및 (iv)의 2개의 Fab 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 46-48의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 50에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 이들은 서열번호 54에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, (ii) 및 (iv)의 2개의 Fab 경쇄 폴리펩티드는 서로 동일한 것이 바람직할 수 있다.

일부 실시형태에서, (i) 및 (iii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 43-45의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 (i) 및 (iii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 49에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, (i) 및 (iii)의 2개의 Fab 중쇄는 서로 동일한 것이 바람직할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 제1 항체는 항체 T84.66(이의 인간화 버전 포함)의 CEA 결합 서열(즉, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

예를 들어, (ii) 및 (iv)의 2개의 Fab 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 14-16의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 18에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 이들은 서열번호 89에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, (i) 및 (iii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 11-13의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 (i) 및 (iii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 17에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, (i) 및 (iii)의 2개의 Fab 중쇄는 서로 동일한 것이 바람직할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 제1 항체는 항체 28A9(이의 인간화 버전 포함)의 CEA 결합 서열(즉, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

예를 들어, (ii) 및 (iv)의 2개의 Fab 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 62-64의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 66에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 이들은 서열번호 96에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, (i) 및 (iii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 59-61의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 (i) 및 (iii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 65에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, (i) 및 (iii)의 2개의 Fab 중쇄는 서로 동일한 것이 바람직할 수 있다.

일부 실시형태에서, 제2 항체는 항체 CH1A1A의 CEA 결합 서열(즉, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

예를 들어, (vi) 및 (viii)의 2개의 Fab 경쇄는 서열번호 22-24의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 26에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 이들은 서열번호 34에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, (v) 및 (vii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 19-21의 CDR을 포함하고/하거나 (v) 및 (vii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 25에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, (v) 및 (vii)의 2개의 Fab 중쇄는 서로 동일한 것이 바람직할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 제2 항체는 A5B7(이의 인간화 버전 포함)의 CEA 결합 서열(즉, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

예를 들어, (vi) 및 (viii)의 2개의 Fab 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 46-48의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 50에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 이들은 서열번호 58에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, (v) 및 (vii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 43-45의 CDR을 포함하고/하거나 (v) 및 (vii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 49에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, (v) 및 (vii)의 2개의 Fab 중쇄는 서로 동일한 것이 바람직할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 제2 항체는 항체 T84.66(이의 인간화 버전 포함)의 CEA 결합 서열(즉, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

예를 들어, (vi) 및 (viii)의 2개의 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 14-16의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 18에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 이들은 서열번호 89에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, (v) 및 (vii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 11-13의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 (v) 및 (vii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 17에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, (v) 및 (vii)의 2개의 Fab 중쇄는 서로 동일한 것이 바람직할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 제2 항체는 항체 28A9(이의 인간화 버전 포함)의 CEA 결합 서열(즉, CDR 또는 VH/VL 도메인)을 가질 수 있다.

예를 들어, (vi) 및 (vii)의 2개의 Fab 경쇄는 서열번호 62-64의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 66에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 이들은 서열번호 96에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, (v) 및 (vii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 59-61의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 (v) 및 (vii)에서 2개의 Fab 중쇄는 서열번호 65에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, (v) 및 (vii)의 2개의 Fab 중쇄는 서로 동일한 것이 바람직할 수 있다.

일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항체는 CEA의 동일한 에피토프에 결합한다. 그러므로, 예를 들어, 제1 항체 및 제2 항체는 모두 항체 CH1A1A로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; 또는, 제1 및 제2 항체는 모두 A5B7(이의 인간화 버전 포함)으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; 또는, 제1 및 제2 항체는 모두 T84.66(이의 인간화 버전 포함)으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; 또는 제1 항체 및 제2 항체는 모두 28A9(이의 인간화 버전 포함)로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; 또는 제1 및 제2 항체는 모두 MFE23(이의 인간화 버전 포함)으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, (vi) 및 (viii)의 2개의 경쇄 폴리펩티드가 제1 항체의 (ii) 및 (iv)의 경쇄와 동일한 서열을 갖는 것, 예를 들어, 상기 경쇄 모두가 동일한 서열을 갖는 것이 바람직할 수 있다.

일부 실시형태에서, (ii) 및 (iv)에서 제1 항체의 2개의 Fab 경쇄 폴리펩티드 모두는 서열번호 26에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있고; (i) 및 (iii)에서 제1 항체의 2개의 Fab 중쇄 모두는 서열번호 25에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있고; (vi) 및 (viii)에서 제2 항체의 2개의 Fab 경쇄 폴리펩티드 모두는 서열번호 26에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있고; 그리고 (v) 및 (vii)에서 제2 항체의 2개의 Fab 중쇄 모두는 서열번호 25에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.

한 특정 실시형태에서, 제1 항체는 다음을 포함하고:

- 서열번호 146의 제1 중쇄 폴리펩티드;

- 서열번호 147의 제2 중쇄 폴리펩티드;

- 서열번호 143의 제1 및 제2 경쇄 폴리펩티드; 및/또는

제2 항체는 다음을 포함한다:

- 서열번호 145의 제1 중쇄 폴리펩티드;

- 서열번호 147의 제2 중쇄 폴리펩티드;

- 서열번호 143의 제1 및 제2 경쇄 폴리펩티드.

다른 실시형태에서, 제1 및 제2 항체는 상기 논의된 바와 같이 CEA의 상이한 에피토프에 결합한다. 그러므로, 예를 들어, 제1 항체는 항체 CH1A1A의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 제2 항체는 A5B7의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; 또는, 제1 항체는 항체 A5B7의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고, 그리고 제2 항체는 CH1A1A의 CEA 결합 서열을 가질 수 있다.

다른 실시형태에서, 항체는 1-팔 항체이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제1 항체는 다음 폴리펩티드를 포함하고:

i) N-말단에서 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인(이 때 중쇄 가변 도메인은 서열번호 1-3의 중쇄 CDR을 포함하고/하거나 중쇄 가변 도메인은 서열번호 7에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가짐); 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 폴리펩티드;

ii) Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL); 및

iii) Fc 서브유닛 폴리펩티드(예를 들어, CH2-CH3);

이 때 (i)의 Fab 중쇄 및 (ii)의 Fab 경쇄는 CEA, GPRC5D 또는 FAP, 선택적으로 CEA에서 선택된 표적 항원에 결합할 수 있는 Fab 단편을 형성한다.

제2 항체는 다음 펩티드를 포함할 수 있고:

iv) N-말단에서 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; Pb-DOTAM에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인(이 때 경쇄 가변 도메인은 서열번호 4-6의 CDR을 포함하고/하거나 경쇄 가변 도메인은 서열번호 8에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가짐); 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 폴리펩티드;

v) Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL); 및

vi) Fc 서브유닛 폴리펩티드(예를 들어, CH2-CH3);

이 때 (iv)의 Fab 중쇄 및 (v)의 Fab 경쇄는 CEA, GPRC5D 또는 FAP, 선택적으로 CEA에서 선택된 표적 항원에 결합할 수 있는 Fab 단편을 형성한다.

이러한 1-팔 항체의 일부 실시형태에서, (i) 및 (iv)의 Fab 중쇄는 서로 동일한 서열을 가질 수 있고; (ii)와 (v)의 Fab 경쇄 폴리펩티드는 서로 동일한 서열을 가질 수 있다.

예를 들어, (ii) 및 (iv)의 Fab 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 22-24의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 26에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 34에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

(i)에서 Fab 중쇄는 서열번호 19-21의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 (i)에서 Fab 중쇄는 서열번호 25에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다.

예를 들어, (ii) 및 (iv)의 Fab 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 46-48의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 50에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 54에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, (i)에서 Fab 중쇄는 서열번호 43-45의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 (i)에서 Fab 중쇄는 서열번호 49에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다.

예를 들어, (ii) 및 (iv)의 Fab 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 14-16의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 18에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 89에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, (i)에서 Fab 중쇄는 서열번호 11-13의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 (i)에서 Fab 중쇄는 서열번호 17에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다.

예를 들어, (ii) 및 (iv)의 Fab 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 62-64의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 66에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 96에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, (i)에서 Fab 중쇄는 서열번호 59-61의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 (i)에서 Fab 중쇄는 서열번호 65에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다.

예를 들어, (v)의 Fab 경쇄는 서열번호 22-24의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 26에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 34에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, (iv)에서 Fab 중쇄는 서열번호 19-21의 CDR을 포함하고/하거나 (iv)에서 Fab 중쇄는 서열번호 25에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함한다.

예를 들어, (v)의 Fab 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 46-48의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 50에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 58에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, (iv)에서 Fab 중쇄는 서열번호 43-45의 CDR을 포함하고/하거나 (iv)에서 Fab 중쇄는 서열번호 49에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함한다.

예를 들어, (v)의 Fab 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 14-16의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 18에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 89에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, (iv)에서 Fab 중쇄는 서열번호 11-13의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 (iv)에서 Fab 중쇄는 서열번호 17에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다.

예를 들어, (v)의 Fab 경쇄는 서열번호 62-64의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 서열번호 66에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 96에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, (iv)에서 Fab 중쇄는 서열번호 59-61의 CDR을 포함할 수 있고/있거나 (iv)에서 Fab 중쇄는 서열번호 65에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 제1 및 제2 항체는 CEA의 동일한 에피토프에 결합한다. 그러므로, 예를 들어, 제1 항체 및 제2 항체는 모두 항체 CH1A1A로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; 또는, 제1 및 제2 항체는 모두 A5B7(이의 인간화 버전 포함)으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; 또는, 제1 및 제2 항체는 모두 T84.66(이의 인간화 버전 포함)으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; 또는 제1 항체 및 제2 항체는 모두 28A9(이의 인간화 버전 포함)로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있고; 또는 제1 및 제2 항체는 모두 MFE23(이의 인간화 버전 포함)으로부터의 CEA 결합 서열을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, (ii)의 경쇄 폴리펩티드가 (v)의 경쇄와 동일한 서열을 갖는 것이 바람직할 수 있다.

특정 실시형태에서, (ii) 및 (v) 둘 모두의 Fab 경쇄는 서열번호 26에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; (i) 및 (iv)의 Fab 중쇄는 서열번호 25에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 가변 도메인을 포함한다.

한 특정 실시형태에서,

제1 항체는 다음을 포함하고:

- 서열번호 146의 제1 중쇄;

- 서열번호 144의 제2 중쇄;

- 서열번호 143의 경쇄; 및/또는

제2 항체는 다음을 포함한다:

- 서열번호 145의 제1 중쇄;

- 서열번호 144의 제2 중쇄;

- 서열번호 143의 경쇄.

I. 항체 변이체

특정 실시형태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질들을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체들은 상기 항체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열 내부에 적절한 변형을 도입시킴으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구조체가 원하는 특성, 예를 들어, 항원 결합을 보유하는 한, 최종 구조체에 도달하기 위한 어떠한 결실, 삽입 및 치환의 조합이라도 이루어질 수 있다.

치환, 삽입, 및 결실 변이체

특정 실시형태들에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발에 대한 관심 부위는 HVR(CDR) 및 FR을 포함한다. 보존적 치환들을 표 1에서 “바람직한 치환”이라는 제목으로 나타낸다. 더 많은 실질적인 변화가 표 1의 “예시적 치환"이라는 제목하에 제시되며, 이는 아미노산 측쇄 분류를 참조하여 이하에서 추가로 설명된다. 아미노산 치환을 관심 항체에 도입하고 원하는 활성, 예를 들어, 유지/개선 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 감소된 또는 제거된 ADCC 또는 CDC에 대해 생성물을 스크리닝할 수 있다.

표 1

아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같이 그룹화될 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 측쇄 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 이들 분류들 중 하나의 구성원을 또 다른 분류로 바꾸게 될 것이다.

치환성 변이체의 한 가지 유형은 모 항체의 하나 또는 그 이상의 초가변적 영역 잔기의 치환 (예컨대, 인간화된 또는 인간 항체)과 관련된다. 일반적으로, 추가 연구를 위하여 선별된 생성된 변이체(들)은 모 항체와 비교하였을 때, 특정 생물학적 성질들 (예컨대, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형(예컨대, 개선)을 가지거나 및/또는 모 항체의 특정 생물학적 성질들을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙 항체이며, 이는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이 기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게 설명하자면, 하나 또는 그 이상의 CDR 잔기는 돌연변이되며, 변이체 항체는 파지 상에서 디스플레이되며, 그리고 특정 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대하여 스크리닝된다.

예를 들어, 항체 친화도를 개선하기 위해 CDR에서 변경 (예를 들어, 치환)이 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 CDR에서 "핫스팟(hotspot)", 즉, 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이 되는 코돈에 의해 인코드되는 잔기 (즉, Chowdhury Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), 및/또는 항원을 접촉하는 잔기들에서 생성될 수 있고, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대하여 검사된다. 제 2 라이브러리를 구축하고, 재선별함에 의한 친화도 성숙은 예를 들어, Hoogenboom 외. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 외, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에서 설명되어 있다. 친화도 성숙의 일부 양상들에서, 다양성은 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내부로 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 에러-프론 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발)에 의해 도입된다. 이어서 제2 라이브러리가 생성된다. 그런 다음 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화도를 가진 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하는 또다른 방법은 CDR-지시된 접근법을 포함하는데, 이때 몇개 CDR 잔기 (예를 들어, 한번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 CDR 잔기는 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 식별될 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 표적이 되는 경우가 많다.

특정 양상에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변경으로 이 항체가 항원에 결합하는 능력이 실질적으로 감소되지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 CDR들에서 나타날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에서 제공된 보존적 치환)이 CDR들에 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어, CDR들의 항원 접촉 잔기의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 특정 변이체 VH 및 VL 서열들에서, 각각의 CDR은 변경되지 않거나 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.

돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 식별하는데 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 지칭되며, Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 기재되어 있다. 이 방법에서, 표적 잔기 또는 표적 잔기들의 그룹 (예컨대, 하전된 잔기, 예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu)이 식별되고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예컨대, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어, 항원과 항체의 상호작용이 영향을 받았는지를 판단한다. 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 추가 치환이 도입될 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 이용하여 항체와 항원 간의 접촉점을 동정할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 치환 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체들이 원하는 성질을 포함하는지 여부를 결정하기 위해 이들을 스크리닝할 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 1개 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 상기 항체 분자의 다른 삽입 변이체들은 효소(예를 들어, ADEPT (항체 지시된 효소 전구약물 요법)의 경우)에 항체의 N- 또는 C-말단의 융합 또는 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다.

당화 변이체

특정 양상들에서, 본원에서 제공된 항체는 이 항체가 당화되는 정도를 증가 또는 감소시키기 위하여 변경된다. 항체에 대한 당화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 당화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 이루어질 수 있다.

항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 올리고당이 변경될 수 있다. 포유동물 세포들에 의해 만들어지는 천연 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-링키지에 의해 일반적으로 부착된 분지화된, 이촉각성(biantennary) 올리고당을 전형적으로 포함한다. 예를 들어, Wright 외 TIBTECH 15:26-32 (1997) 참조. 상기 올리고당은 다양한 탄수화물, 예로써, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라 상기 이촉각성 올리고당 구조의 "스템(stem)"에 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 항체에서 올리고당의 변형이 이루어질 수 있다.

한 양상에서, Fc 영역에 부착된 (직접적으로 또는 간접적으로) 푸코오스를 결여하는 비-푸코실화된 올리고당류, 다시 말하면 올리고당류 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 이런 비-푸코실화된 올리고당 (“아푸코실화된” 올리고당으로서 또한 지칭됨)는 특히 N-연결된 올리고당인데, 이것은 이촉각성 올리고당 구조의 줄기에서 첫 번째 GlcNAc에 부착된 푸코오스 잔기를 결여한다. 한 양상에서, 선천적 또는 부모 항체와 비교하여 Fc 영역에서 증가된 비율의 비-푸코실화 올리고당을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 비-푸코실화 올리고당의 비율은 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80% 또는 심지어 약 100% (즉, 푸코실화 올리고당이 존재하지 않음) 일 수 있다. 비-푸코실화 올리고당의 백분율은, 예를 들어, WO 2006/082515에 설명되어 있는 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 올리고당 (예컨대, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조들)의 합에 대한 푸코스 잔기가 없는 올리고당의 (평균) 양이다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 항체에서 소수의 서열 변이로 인하여 위치 297의 상류 또는 하류의 약 ± 3의 아미노산, 가령, 위치 294와 300 사이에 또한 위치할 수 있다. Fc 영역에서 증가된 비-푸코실화된 올리고당류를 갖는 이러한 항체는 개선된 Fcγ수용체 결합 및/또는 개선된 이펙터 기능, 특히 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, US 2003/0157108; US 2004/0093621 참조.

푸코실화가 감소된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka 외, Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허출원 US 2003/0157108; 및 WO　2004/056312, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, Yamane-Ohnuki 외, Biotech. Bioeng. 87: 614-622 (2004); Kanda, Y. 외, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO 2003/085107 참조), 또는 GDP-푸코스 합성 또는 수송체 단백질의 활성이 감소되거나 제거된 세포 (예를 들어, US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282 참조)가 포함된다.

한 추가 양상에서, 항체의 Fc 영역의 이촉각성 올리고당이 GlcNAc에 의해 양분되어 있는, 양분된 올리고당을 가진 항체 변이체들이 제공된다. 이러한 항체 변이체는 상기 기재된 바와 같이 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체들의 예들은, 예컨대, Umana 외, Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara 외, Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878에 기재되어 있다.

Fc 영역에 부착된 올리고당에 최소한 한 개의 갈락토스 잔기를 가진 항체 변이체들이 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들면, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 설명되어 있다.

당화 정도를 감소시키기 위해 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 비당화 또는 탈당화될 수 있다. 항체는 N297에서 치환, 예를 들어, N297D/A를 포함할 수 있다.

Fc 영역 변이체

특정 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입되어 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)를 포함할 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 감소된 Fc 이펙터 기능, 예를 들어, CDC, ADCC 및/또는 Fcγ결합이 감소되거나 제거된 항체 변이체를 고려한다. 특정 양상들에서, 본 발명은 모든 Fc 이펙터 기능은 아닌 일부만을 보유하는 항체 변이체를 고려하는데, 이들 변이체는 항체의 반감기도 중요하지만, 특정 Fc 이펙터 기능 (가령, 보체-의존적 세포독성 (CDC) 및 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC))은 불필요하거나 또는 유해한 용도에 바람직한 후보물질이 될 수 있다.

시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 실행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석을 실행하여, 상기 항체는 Fcγ결합 (이로 인하여 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음)은 없지만, 여전히 FcRn 결합 능력은 유지하고 있다는 것을 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인, NK 세포는 오로지 Fcγ만을 발현시키는 반면, 단핵구는 FcγFcγ및 Fcγ를 발현시킨다. 조혈 세포들에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 페이지 464의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적 실시예는 미국 특허 제 5,500,362 (예컨대, Hellstrom, I. 외. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참고) 및 Hellstrom, I 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. 외, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참고)에 설명되어 있다. 대안으로, 비-방사능활성 분석 방법들이 이용될 수 있다 (예를 들면, 유동 세포측정을 위한 ACTI™비-방사능활성 세포독성 분석 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 그리고 CytoTox 96^® 비-방사능활성 세포독성 분석 (Promega, Madison, WI) 참고). 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포들은 말초 혈액 단핵 세포들 (PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포들을 포함한다. 대안으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은, 예컨대, Clynes 외. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에서 공개된 바와 같은 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수 있다. 상기 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 이로 인하여 CDC 활성이 결여된다는 것을 확인하기 위하여 C1q 결합 분석이 또한 실행될 수 있다. 예로써, WO　2006/029879와 WO　2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조하라. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 분석이 실행될 수 있다 (예를 들면, Gazzano-Santoro 외. J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. 외. Blood. 101:1045-1052 (2003); 그리고 Cragg, M.S. 및 M.J. Glennie Blood. 103:2738-2743 (2004) 참고). 또한 FcRn 결합과 생체내 제거율/반감기 결정은 해당 분야에 공지된 방법들을 이용하여 또한 실시될 수 있다 (예컨대, Petkova, S.B. 외. Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) WO 2013/120929 Al 참조).

감소된 Fc 이펙터 기능을 가진 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 또는 그 이상의 치환, 예를 들어, P329G를 가진 것들을 포함한다(미국 특허 제6,737,056). 이런 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 “DANA” Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 두 개 또는 그 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(US 특허 번호 7,332,581).

특정 양상들에서, 항체 변이체는 Fcγ결합을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예컨대 Fc 영역의 위치 234 및 235(잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 치환은 L234A 및 L235A(LALA)이다. 특정 양상들에서, 상기 항체 변이체는 인간 IgG₁ Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에 D265A 및/또는 P329G를 추가로 포함한다. 한 양상에서, 치환은 인간 IgG₁ Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역의 L234A, L235A 및 P329G (LALA-PG)이다. (예를 들어, WO 2012/130831 참조). 또 다른 양상에서, 치환은 인간 IgG₁ Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역의 L234A, L235A 및 D265A (LALA-DA)이다. 다른 치환에는 선택적으로 D265A 및/또는 P329G 및/또는 P331S와 조합된, L234F 및/또는 L235E를 포함한다.

다른 실시형태에서, Fc 이펙터 기능이 감소된 IgG4 또는 IgG2와 같은 IgG 하위유형을 사용하는 것이 가능할 수 있다.

FcR에 대한 결합이 개선된 또는 감소된 특정 항체 변이체들이 기재되어 있다. (예를 들어, 미국 특허 제6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields 외, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 참조.)

일부 실시형태들에 있어서, Fc 영역 안에 예로써, 미국 특허 제6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie 외 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 설명된 바와 같이, 변경된 (예를 들어, 개선된 또는 감소된, 바람직하게는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 초래하는 변경이 만들어진다.

특정 양상들에 있어서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환들, 예로써, Fc-영역의 위치 253, 및/또는 310, 및/또는 435 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 특정 양상들에서, 항체 변이체는 위치 253, 310 및 435에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 이러한 치환은 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 I253A, H310A 및 H435A이다. 예를 들어, Grevys, A., 외, J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508를 참조하라.

특정 양상들에 있어서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환들, 예컨대 Fc 영역의 위치 310, 및/또는 433, 및/또는 436(잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 특정 양상들에서, 항체 변이체는 위치 310, 433 및 436에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 상기 치환은 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 H310A, H433A 및 Y436A이다. (예를 들어, WO 2014/177460 A1 참조). 예를 들어, 일부 실시형태에서, 정상적인 FcRn 결합이 사용될 수 있다.

Fc 영역 변이체들의 다른 예들에 관하여 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 제5,648,260; 미국 특허 제5,624,821; 그리고 WO 94/29351 참조.

본원에 보고된 전장 항체 중쇄의 C-말단은 아미노산 잔기 PGK로 끝나는 완전한 C-말단 일 수 있다. 중쇄의 C-말단은 C 말단 아미노산 잔기 중 1개 또는 2개가 제거된 단축된 C-말단일 수 있다. 중쇄의 C-말단은 PG로 끝나는 단축된 C-말단일 수 있다. 본원에 보고된 모든 양상들 중 한 양상에서, 본원에 명시된 바와 같은 C-말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 C-말단 글리신 잔기(G446, 아미노산 위치의 EU 색인 넘버링)를 포함한다. 이것 또한 본원에서 사용되는 "전장 항체" 또는 "전장 중쇄"라는 용어에 명시적으로 포함된다.

항체 유도체

특정 양상들에서, 본원에서 제공된 항체는 해당 분야에서 공지되고 쉽게 이용가능한 추가 비단백질성 모이어티를 내포하도록 더욱 변형될 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 모이어티들은 수용성 중합체들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체들의 비-제한적 예들에는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로파일렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로파일렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로파일렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이의 혼합물이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서의 안정성으로 인하여 제조에 있어 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 상기 항체에 부착된 중합체의 수는 가변적일 수 있으며, 하나 이상의 중합체가 부착된 경우, 이들은 동일하거나 또는 상이한 분자들일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용된 중합체의 수 및/또는 유형은 개선되는 항체의 특정 성질들 또는 기능들, 상기 항체 유도체가 특정 조건하에서 치료에 이용되는지의 여부를 포함하는 고려사항들에 근거하여 결정될 수 있다.

J. 재조합 방법 및 조성물

항체는 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 한 실시형태에서, 본원에 기재된 항체 세트를 인코딩하는 단리된 핵산 또는 단리된 핵산 세트가 제공된다.

예를 들어, 핵산 세트는 제1 항체를 인코딩하는 다음과 같은 핵산을 포함할 수 있다:

i) N-말단으로부터 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인; 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산;

ii) (i)의 Fab 중쇄와 쌍을 이루어 표적 항원에 대한 결합 부위를 형성하는 Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL)를 인코딩하는 핵산;

iii) N-말단으로부터 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산; 및

iv) (iii)의 Fab 중쇄와 쌍을 이루어 표적 항원에 대한 결합 부위를 형성하는 추가 Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL)를 인코딩하는 핵산.

본 발명에 따른 핵산 세트는 추가로 또는 대안적으로 제2 항체를 인코딩하는 다음과 같은 핵산을 포함한다:

v) N-말단으로부터 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인; 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산;

vi) (v)의 Fab 중쇄와 쌍을 이루어 표적 항원에 대한 결합 부위를 형성하는 Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL)를 인코딩하는 핵산;

vii) N-말단으로부터 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산;

viii) (vii)의 Fab 중쇄와 쌍을 이루어 표적 항원에 대한 결합 부위를 형성하는 추가 Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL)를 인코딩하는 핵산.

일부 실시형태에서, 이들 중 특정한 핵산은 서로 동일할 수 있다. 예를 들어, (ii)의 핵산은 (iv)와 동일할 수 있고/있거나 (vi)의 핵산은 (viii)과 동일할 수 있으므로, 전체 세트는 8개 미만의 별개의 핵산 서열을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 핵산 세트는 제1 항체를 인코딩하는 다음과 같은 핵산을 포함할 수 있고:

i) N-말단으로부터 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인; 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산;

ii) Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL)를 인코딩하는 핵산; 및

iii) Fc 서브유닛 폴리펩티드(예를 들어, CH2-CH3)를 인코딩하는 핵산,

본 발명에 따른 핵산 세트는 추가로 또는 대안적으로 제2 항체를 인코딩하는 다음과 같은 핵산을 포함하고:

iv) N-말단으로부터 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인; 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산;

v) Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL)를 인코딩하는 핵산, 및

vi) Fc 서브유닛 폴리펩티드(예를 들어, CH2-CH3)를 인코딩하는 핵산;

또한, 일부 실시형태에서, 이들 중 특정한 핵산은 서로 동일할 수 있다. 예를 들어, (ii)의 핵산은 (v)에서와 동일할 수 있어서, 전체 세트는 단지 5개의 별개의 핵산 서열을 포함한다.

이러한 핵산들은 하나 이상의 핵산 분자 또는 발현 벡터에 포함될 수 있다.

그러므로, 추가 실시형태에 있어서, 이러한 핵산(들)이 포함된 하나 또는 그 이상의 벡터(예로써, 발현 벡터)가 제공된다. 한 실시형태에서, 각각의 각 중쇄 및 경쇄는 개별 플라스미드로부터 발현된다.

추가 실시형태에서, 이러한 핵산(들) 또는 벡터(들)을 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 세포들의 세트가 제공된다. 한 실시형태에서, 제1 항체를 발현하는 제1 숙주 세포가 제공되고, 제2 항체를 발현하는 제2 숙주 세포가 제공된다.

이러한 한 실시형태에서, 제1 숙주 세포는 제1 항체의 핵산들을 집합적으로 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 제2 숙주 세포는 제2 항체의 핵산들을 집합적으로 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함한다(예를 들어, 이러한 벡터로 형질전환되었다).

한 실시형태에서, 상기 숙주 세포는 진핵, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구양 세포 (예컨대, Y0, NS0, Sp20 세포)다. 한 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체를 제조하는 방법이 제공되는데, 이 때 상기 방법은 상기에서 제공된, 상기 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, 그리고 선택적으로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함한다.

항체의 재조합 생산을 위하여, 예컨대, 상기 기재한 항체를 인코드하는 핵산이 단리되고, 숙주 세포 안에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위하여 하나 이상의 벡터 안으로 삽입된다. 이러한 핵산은 통상적인 과정에 의해(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고, 시퀀싱된다.

항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 당화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편들 및 폴리펩티드 발현과 관련하여 예를 들어, US 5,648,237, US 5,789,199, 및 US 5,840,523호를 참고하라. (또한 대장균에서의 항체 단편들의 발현을 설명하는 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 참조) 발현 후, 항체는 가용성 분획 중의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며 추가로 정제될 수 있다.

원핵세포 이외에도, 진핵 미생물, 예를 들어, 섬유성 곰팡이 또는 효모는 항체-인코딩 벡터의 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 당화 경로가 “인간화되고", 결과적으로 부분적으로 또는 온전하게 인간 당화 패턴을 가진 항체가 생산되는 곰팡이 및 효모 균주가 포함된다. Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H. 외, Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 참조.

(당화된) 항체의 발현에 적합한 숙주 세포들은 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 또한 유도된다. 무척추동물 세포들의 예로는 식물 및 곤충 세포들이 포함된다. 스포도프테라 푸르기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포들의 형질감염을 위하여 곤충 세포들과 병용될 수 있는 많은 베큘로바이러스 균주들이 확인되었다.

식물 세포 배양물 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978, 및 US 6,417,429를 참고하라(유전자삽입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIES^TM 을 설명).

척추동물 세포들 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하도록 개조시킨 포유동물 세포주들이 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, Graham, F.L. 등, J. Gen Virol. 36, (1977) 59-74에 설명된 293 또는 293T 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들면, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252에 설명된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562); (예를 들면, Mather, J.P. 등, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68에 설명된) TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR-CHO 세포를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 (Urlaub, G. 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(1980) 4216-4220); 및 Y0, NS0 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토는 예를 들어, Yazaki, P. 및 Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268을 참고하라.

한 양상에서, 상기 숙주 세포는 진핵, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구양 세포 (예컨대, Y0, NS0, Sp20 세포)다.

K. 분석

본원에 제공된 항체들은 해당 분야에 공지된 다양한 분석법에 의해 그 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인, 스크리닝 또는 특성화될 수 있다.

한 양상에서, 본 발명의 항체는 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법에 의해 이의 항원 결합 활성에 대해 테스트된다.

항체 친화도

특정 실시형태들에서, 본원에 제공된 항체는 표적 항원에 대해 ≤　1μM, ≤　100 nM, ≤　10 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM(예를 들어, 10^-8M 이하, 예를 들어, 10^-8M 내지 10^-13M, 예를 들어, 10^-9M 내지 10^-13 M), 또는 본원의 다른 부분에서 언급된 해리 상수(K_D)를 갖는다.

특정 실시형태에서, 이펙터 모이어티, 방사성 표지 화합물에 대한 항원 결합 부위는 이펙터 모이어티/방사성 표지 화합물에 대해 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10^-8 M 이하, 예를 들어, 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들어, 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수(K_D)를 가진다. 일부 실시형태에서, K_D는 1nM 이하, 500pM 이하, 200pM 이하, 100pM 이하, 50pM 이하, 20pM 이하, 10pM 이하, 5pM 이하 또는 1pM 이하, 또는 본원에서 달리 언급된 바와 같다. 예를 들어, 기능적 결합 부위는 약 1pM-1nM, 예를 들어, 약 1-10 pM, 1-100pM, 5-50 pM, 100-500 pM 또는 500pM-1 nM의 K_D로 방사성표지 화합물/금속 킬레이트에 결합할 수 있다.

한 실시형태에서, K_D는 방사성 표지 항원 결합 분석(RIA)에 의해 측정된다. 한 실시형태에서, RIA는 관심 항체의 Fab 형태 및 이의 항원을 이용하여 수행된다. 예를 들면, 항원에 대한 Fabs의 용액 결합 친화도는 일련의 역가들의 비표지 항원의 존재하에서 최소 농도의 (¹²⁵I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 다음, 항-Fab 항체-피복된 플레이트와 결합된 항원을 포집함으로써 측정된다 (예를 들어, Chen 외, J. Mol. Biol. 293:865-881(1999) 참조). 분석 조건을 설정하기 위해 MICROTITER^® 다중 웰 플레이트 (Thermo Scientific)를 50mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체(Cappel Labs)로 밤새 코팅한 다음, PBS 중 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 실온 (약 23°C)에서 2 내지 5시간 동안 차단시켰다. 비-흡착성 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [¹²⁵I]-항원은 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합된다 (예로써, Presta 외, Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에서의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치). 관심 Fab는 그 다음 하룻밤 동안 배양되고; 그러나, 평형에 확실하게 이를 수 있도록 더 오랜 기간(예로써, 약 65 시간) 동안 배양이 지속될 수 있다. 그 이후, 상기 혼합물을 실온 인큐베이션(예로써, 1 시간 동안)을 위하여 포획 플레이트로 옮긴다. 그런 다음 용액을 제거하고 플레이트를 PBS 중 0.1% 폴리소르베이트 20(TWEEN-20^®) 으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되면 150 μl/웰의 섬광제 (MICROSCINT-20^TM; Packard)를 추가하고 플레이트를 TOPCOUNT™감마 카운터(Packard)에서 10분 동안 계수한다. 경쟁적 결합 분석에 사용하기 위하여 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab 농도가 선택된다.

또 다른 실시형태에 따르면, K_D는 BIACORE^® 표면 플라스몬 공명 분석을 사용하여 측정된다. 예를 들면, BIACORE^®-2000 또는 BIACORE^®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용한 분석은 25℃에서 고정화된 항원 CM5 칩으로 ~10 반응 단위(RU)로 수행한다. 한 실시형태에서, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIACORE, Inc.)은 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로파일)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화된다. 항원은 pH 4.8, 10 mM 소듐 아세테이트로 5 μg/ml (~0.2 μM)까지 희석된 후, 5 μl/분의 유속으로 주사되어 약 10 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질에 도달한다. 항원 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 반응하지 않은 그룹을 차단한다. 동역학 측정을 위하여, Fab의 2-배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)은 25°C에서, 약 25 μl/분의 유속으로 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20^TM) 계면활성제가 있는 PBS (PBST)에서 주사된다. 결합과 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써, 단순 일대일 Langmuir 결합 모델 (BIACORE^® Evaluation Software 버전 3.2)을 이용하여 결합 속도 (k_on)와 해리 속도 (k_off)가 산출된다. 평형 해리 상수(K_D)는 비율 k_off/k_on으로 계산된다. 예를 들어, Chen 등, J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) 참조. 결합 속도가 상기 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 106M-1 s-1을 초과하는 경우, 분광기, 예컨대 정지-유동이 구비된 분광광도계(Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳이 구비된 8000-시리즈 SLM-AMINCO^TM 분광광도계(ThermoSpectronic)에서 측정시 증가하는 항원 농도의 존재하에서 PBS(pH 7.2) 중의 20nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역 통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 퀀칭 기법을 이용함으로써 결합 속도를 결정할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, K_D는 SET(용액 평형 적정) 분석을 사용하여 측정된다. 이 분석에 따르면, 테스트 항체는 일반적으로 일정한 농도로 적용되고 테스트 항원의 연속 희석액과 혼합된다. 평형을 이루기 위한 인큐베이션 후, 유리 항체의 일부는 항원 코팅된 표면에 포획되고 일반적으로 전기화학발광을 사용하여 표지된/태그화된 항-종 항체(anti-species antibody)로 검출된다(예를 들어, Haenel 외, Analytical Biochemistry 339 (2005) 182- 184).

예를 들어, 한 실시형태에서 384-웰 스트렙타비딘 플레이트(Nunc, Microcoat #11974998001)는 20ng/ml의 농도로 PBS-완충액에서 25μl/웰의 항원-비오틴-이성질체 혼합물과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션된다. 유리 항원이 있는 항체 샘플의 평형을 위해: 0.01nM - 1nM의 항체가 2500nM, 500nM 또는 100nM의 항원 농도에서 시작하여 1:3, 1:2 또는 1:1.7 희석 단계에서 관련 항원으로 적정된다. 샘플들은 밀봉된 REMP 보관 폴리프로필렌 마이크로플레이트(Brooks)에서 밤새 4°C에서 배양된다. 밤새 인큐베이션한 후, 스트렙타비딘 플레이트를 웰 당 90μl PBST로 3회 세척한다. 평형 플레이트의 각 샘플 15μl를 분석 플레이트로 옮기고 RT에서 15분 동안 인큐베이션한 다음 PBST 완충액으로 3x 90μl 세척 단계를 수행한다. 검출은 염소 항-인간 IgG 항체-POD 접합체(Jackson, 109-036-088, OSEP에서 1:4000) 25μl를 첨가한 다음 PBST 완충액으로 6x 90μl 세척 단계를 수행하여 실시된다. 25 μl의 TMB 기질(Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호: 11835033001)을 각 웰에 첨가한다. 측정은 Safire2 판독기(Tecan)에서 370/492 nm에서 수행된다.

또 다른 실시형태에서, K_D는 KinExA(동역학 배제) 분석을 사용하여 측정된다. 이 분석법에 따르면, 항원은 일반적으로 일정한 농도의 항체 결합 부위로 적정되고, 샘플들이 평형이 되게 한 다음, 유리 항체 결합 부위는 항원 코팅된 비드에서 포획되는 유동 세포(flow cell)를 통해 신속하게 끌어당겨지는 반면, 항원-포화 항체 복합체는 세척되어 나간다. 이어서, 비드-포획된 항체는 표지된 항-종 항체, 예를 들어, 형광 표지된 것으로 검출된다(Bee 외, PloS One, 2012; 7(4): e36261). 예를 들어, 한 실시형태에서, KinExA 실험은 실행 완충액으로서 PBS pH 7.4를 사용하여 실온(RT)에서 수행된다. 샘플들은 1 mg/ml BSA가 보충된 실행 완충액("샘플 완충액")에서 준비된다. 0.25 ml/min의 유속이 사용된다. 결합 부위 농도가 5pM인 일정한 양의 항체는 100pM(농도 범위 0.049pM - 100pM)에서 시작하여 2배 연속 희석에 의해 항원으로 적정된다. 항원이 없는 하나의 항체 샘플은 100% 신호(즉, 억제 없음) 역할을 한다. 항원-항체 복합체는 평형에 도달할 수 있도록 적어도 24시간 동안 RT에서 인큐베이션된다. 그런 다음 결합되지 않은 항체가 용액의 평형 상태를 교란시키지 않고 비드에 의해 포획될 수 있도록 평형화된 혼합물을 5ml의 부피로 KinExA 시스템의 항원-커플링 비드들의 컬럼을 통해 끌어당긴다. 포획된 항체는 샘플 완충액에서 250ng/ml의 Dylight 650ⓒ접합된 항-인간 Fc-단편 특이적 이차 항체를 사용하여 검출된다. 각 샘플은 모든 평형 실험들에 대해 중복으로 측정된다. KD는 "표준 분석" 방법을 사용하여 KinExA 소프트웨어(버전 4.0.11)에 포함된 단일-부위 균일 결합 모델을 사용하여 데이터의 비선형 회귀 분석으로부터 얻는다.

L. 치료 방법 및 조성물

본원에 기재된 항체들의 세트는 치료 방법에 사용될 수 있다. 한 양상에서, 약제로서 사용하기 위한 본원에 기재된 항체 세트가 제공된다. 특정 양상에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항체 세트가 제공된다.

일부 양상에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 세트는, 예를 들어, 증식성 질환, 예를 들어, 암의 치료에서 면역요법제로서 사용될 수 있다. 이러한 치료는 표적 세포, 특히, 종양 세포의 용해를 유도할 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, 일부 양상에서, 본 발명에 따른 항체 세트는 대상체의 표적 세포에 방사성 핵종을 전달하는 것이 바람직한 치료에 적합하다. 예를 들어, 예컨대, 암 치료를 위한 사전표적화된 방사면역요법에 사용하기 위한 본원에 기재된 항체 세트가 제공된다.

특정 양상들에서, 본 발명은 유효량의 항체 세트를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 면역요법 또는 사전표적화된 방사면역요법에 사용하기 위한 항체 세트를 제공한다. 상기 임의의 양상들에 따른 “개체”는 바람직하게는 인간이다.

상기 언급된 바와 같이, 치료는 환자의 질병 세포를 표적으로 하는 세포독성 활성에 의해 치료가능한 병태의 치료일 수 있다. 치료는 바람직하게는 종양 또는 암이다. 그러나, 본 발명의 적용가능성은 종양 및 암에 제한되지 않는다. 예를 들어, 치료는 또한 바이러스 감염, 또는 또 다른 병원성 유기체, 예를 들어, 원핵생물에 의한 감염일 수 있다. 선택적으로, 표적화는 또한 T-세포 유도 자가면역 질환 또는 T-세포 혈액암의 치료를 위하여 T-세포에 대한 것일 수 있다. 따라서, 치료될 병태는 HIV, 광견병, EBV 및 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스와 같은 바이러스 감염, 및 다발성 경화증 및 이식편대숙주병 약물과 같은 자가면역 질환을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "암"은 고형암 및 혈액암, 예컨대, 림프종, 림프구성 백혈병, 폐암, 비소세포 폐(NSCL)암, 세기관지 폐포 세포 폐암, 골암, 췌장암(췌장관 선암종(PDAC) 포함), 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위암, 위장암, 결장직장암(이는 결장암 및/또는 직장암 일 수 있음), 유방암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질암종, 외음부 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선 암, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신세포암, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담즙 암, 중추 신경계 신생물증(CNS), 척수 축 종양, 뇌간신경아교종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 뇌실막종, 수모세포종, 수막종, 편평세포 암종, 뇌하수체 선종 및 유잉 육종(임의의 상기 암들의 불응성 형태, 임의의 상기 암들의 체크포인트 억제제를 경험한 형태를 포함), 또는 하나 이상의 상기 암의 조합을 포함한다.

치료 방법은 제1 및 제2 항체를 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항체는 병용 요법의 일부로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 이들은 하나 이상의 화학요법제와 함께 투여될 수 있다: 화학요법제 및 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 이들은 하나 이상의 면역요법제와 함께 투여될 수 있다: 면역요법제 및 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 항체(및 임의의 추가 치료제, 예를 들어, 방사성 표지 화합물)는 비경구, 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 국소 치료의 경우 필요에 따라 병변내 투여 될 수 있다. 비경구 주사에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 투약은 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 주사, 가령, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 이루어질 수 있다.

한 예에서, 요법을 위해 방사성동위원소를 세포, 조직 또는 장기에 표적화하는 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:

i) 본원에 기재된 제1 및 제2 항체를 대상체에게 (동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로) 투여하는 단계, (이 때 항체는 표적 항원에 결합하고 표적 항원을 발현하는 세포 표면에 국재화되며; 이 때, 제1 및 제2 항체의 결합은 방사성 표지 화합물에 대한 기능적 결합 부위를 형성하고);

그리고

ii) 후속적으로 방사성 표지 화합물을 투여하는 단계(이 때, 방사성 표지 화합물은 방사성 표지 화합물에 대한 기능적 결합 부위에 결합함).

방사성 표지 화합물은 세포에 세포독성인 방사성 동위원소로 표지된다. 적합한 방사성동위원소는 위에서 논의된 바와 같이 알파 및 베타 방사체를 포함한다.

이중특이성 항체(즉, 본 발명에 따른 "분할" 항체가 아님)를 사용하는 사전표적화된 방사면역요법의 방법에서, 항체의 투여와 방사성 표지 화합물의 투여 사이에 제거제 또는 차단제를 투여하는 것이 일반적이다. 제거제는 항체에 결합하여 신체로부터의 제거율을 향상시킨다. 제거제에는 항이디오타입 항체가 포함된다. 차단제는 전형적으로 방사성 표지 화합물에 대한 항원 결합 부위에 결합하지만 그 자체는 방사성 표지되지 않은 제제이다. 예를 들어, 방사성 표지 화합물이 특정 화학 원소(예를 들어, 금속)의 방사성 동위원소가 로딩된 킬레이트제를 포함하는 경우, 차단제는 동일한 원소(예를 들어, 금속)의 비-방사성 동위원소가 로딩된 동일한 킬레이트제를 포함할 수 있거나, 또는 항원-결합 부위에 의해 여전히 결합될 수 있는 한, 로딩되지 않은 킬레이트제 또는 상이한 비-방사성 모이어티(예를 들어, 상이한 요소의 비-방사성 동위원소)이 로드된 킬레이트제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 차단제는 분자의 크기 및/또는 유체역학적 반경을 증가시키는 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 이들은 분자가 순환계의 항체에 결합하는 능력을 방해하지 않고 분자가 종양에 접근하는 능력을 방해한다. 예시적인 모이어티들은 친수성 중합체를 포함한다. 이러한 잔기는, 예를 들어, 덱스트란, 덱스트린, PEG, 폴리시알산(PSA), 히알루론산, 하이드록시에틸-전분(HES) 또는 폴리(2-에틸 2-옥사졸린)(PEOZ)의 중합체 또는 공중합체일 수 있다. 다른 실시형태에서 이러한 모이어티는 XTEN 폴리펩티드(구조화되지 않은 친수성 단백질 중합체), 호모-아미노산 중합체(HAP), 프롤린-알라닌-세린 중합체(PAS), 엘라스틴-유사 펩티드(ELP), 또는 젤라틴 유사 단백질(GLK)과 같은 구조화되지 않은 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 추가의 예시적인 모이어티는 알부민, 예를 들어, 소 혈청 알부민 또는 IgG와 같은 단백질을 포함한다. 모이어티/중합체에 적합한 분자량은, 예를 들어, 적어도 50kDa, 예를 들어, 50kDa 내지 2000kDa의 범위일 수 있다. 예를 들어, 분자량은 200-800kDa, 선택적으로 300, 350, 400 또는 450kDa 초과, 선택적으로 700, 650, 600 또는 550kDa 미만, 선택적으로 약 500kDa일 수 있다.

본 발명의 특정 양상에 따르면, 대상체에게 제거제 또는 차단제를 투여하는 단계가 없다. 특정 양상에서, 항체의 투여와 방사성 표지 화합물의 투여 사이에 제1 또는 제2 항체에 결합하는 임의의 제제를 투여하는 단계가 없다. 특정 양상에서, 선택적으로 화학요법제, 면역요법제 및 방사선감작제로부터 선택되는 화합물을 제외하고, 항체와 방사성 표지 화합물의 투여 사이에 임의의 제제를 투여하는 단계가 없다. 일부 실시형태에서, 항체의 투여와 방사성 표지 화합물의 투여 사이에 제제가 투여되지 않는다. 일부 실시형태에서 항체의 투여와 방사성 표지 화합물의 투여 사이에 대상체에게 임의의 다른 제제의 주사 또는 주사가 없을 수 있다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 i) 항체 세트를 투여하는 단계(이 때, 제1 및 제2 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있음) 및 ii) 후속적으로 방사성 표지 화합물을 투여하는 단계로 구성된 또는 본질적으로 이러한 단계들로 구성된 사전표적화된 방사선면역요법의 2단계 방법일 수 있다. 치료는 이러한 요법의 다회 주기, 즉, 이들 두 단계의 다회 주기들을 포함할 수 있다. 예시적인 치료 주기 기간은 28일이며, 여기서, 항체 세트는 주기의 1일차에 투여되고 방사성 표지 화합물은 선택적으로 해당 주기의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일차에, 예를 들어 7일차에 투여된다. 치료 주기들의 수는 다를 수 있다. 한 실시형태에서, 4, 5 또는 6회의 치료 주기가 있을 수 있다.

본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 항체를 사용하여 정상 조직에서 방사능의 과도한 축적을 피하면서 방사성 표지 화합물의 종양으로의 치료학적 유효 흡수를 얻을 수 있다는 것을 결정다. 실제로, 비-표적 조직에서의 방사능 축적 수준은 이중특이성 항체 및 제거 단계를 사용하는 3단계 PRIT 방법보다 더 낮으면서도 더 간단한 절차를 사용하는 것으로 밝혀졌다.

일부 실시형태에서, 일단 제1 항체 및 제2 항체가 표적 세포들에 국재화하기에 적합한 기간이 주어졌으면, 방사성 표지 화합물을 대상체에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 방사성 표지 화합물은 제1 및 제2 항체 직후 또는 제1 및 제2 항체 후에 적어도 4시간, 8시간, 1일 또는 2일차에 대상체에게 투여될 수 있다. 선택적으로, 이는 1차 및 2차 항체 후 3일, 5일 또는 7일 이내에 투여될 수 있다. 한 특정 실시형태에서, 방사성 표지 화합물은 제1 및 제2 항체 후 2 내지 7일차에 대상체에게 투여될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항체는 추가로 또는 대안적으로 방사선감작제와 조합하여 투여될 수 있다. 방사선감작제 및 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 선량측정 주기는 전술한 바와 같은 하나 이상의 치료 주기 전에 사용될 수 있다. 선량측정 주기는 i) 항체 세트를 투여하는 단계(이 때 제1 및 제2 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있음) 및 ii) 후속적으로 감마-방출체로 방사성 표지된 이미징에 적합한 화합물을 투여하는 단계(이 때 상기 방사성 표지 화합물은 방사성 표지 화합물에 대한 기능적 결합 부위에 결합함)를 포함할 수 있다. 이러한 화합물은 알파 또는 베타 방출체가 아닌 감마 방출체로 표지된 것을 제외하고는 후속 처리 주기에서 사용되는 화합물과 동일할 수 있다. 예를 들어, 한 실시형태에서, 선량측정 주기에 사용되는 방사성 표지 화합물은 ²⁰³Pb-DOTAM 일 수 있고 치료 주기에 사용되는 방사성 표지 화합물은 ²¹²Pb-DOTAM 일 수 있다. 환자를 이미징하여 종양으로의 화합물의 흡수를 결정하고/하거나 화합물의 흡수된 용량을 추정할 수 있다. 이 정보를 사용하여 후속 치료 단계에서 예상되는 방사선 노출을 추정하고 치료 단계에서 사용되는 방사성 표지 화합물의 용량을 안전한 수준으로 조정할 수 있다.

M. 약학 제형

본원에 기술된 제1 및 제2 항체는 단일 약학 조성물 또는 별도의 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 따라서, 추가 양상에서, 본 발명은 예를 들어, 본원에 기술된 임의의 치료 또는 진단 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 제1 및 제2 항체를 포함하는 약학 조성물, 또는 본 발명의 제1 항체를 포함하는 제1 약학 제형 및 본 발명의 제2 항체를 포함하는 제2 약학 조성물을 제공한다. 한 실시형태에서, 약학 조성물은 약학상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 약학 조성물은, 예를 들어, 하기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가 치료제를 추가로 포함한다.

본원에 기재된 항체의 약학 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 이런 항체를 하나 이상의 임의적인 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed., (1980)) 동결 건조된 제제 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 비독성이며, 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 완충액, 가령, 히스티딘, 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(가령, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부탈 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 가령, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르치놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 그리고 m-크레졸); 낮은 분자량의(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 가령, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 중합체 가령, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 가령, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 그리고 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트 물질 가령, EDTA; 당, 가령, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 가령, 나트륨; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 가령, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 세포간(insterstitial) 약물 분산 물질, 예를 들어, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20(HYLENEX^®, Halozyme, Inc.)을 포함한다. rHuPH20를 포함하는 특정 예시적인 sHASEGP 및 이를 이용하는 방법은 미국 공개 특허 출원 제2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 양상에서, sHASEGP는 하나 또는 그 이상의 추가 글리코사미노글리카나제, 예를 들어, 콘드로이티나제와 조합된다.

예시적인 동결건조된 항체 조성물은 미국 특허 제 6,267,958에 기재되어 있다. 수용액 항체 조성물은 미국 특허 제 6,171,586 및 WO 2006/044908에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 조성물은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.

본원의 제형은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 둘 이상의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 성분을 함유 할 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 바와 같은 화학요법제, 면역요법제 및/또는 방사선감작제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 활성 성분들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 복합물 내에 적절하게 존재한다.

활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 각각 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합, 예를 들어 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 준비된 마이크로캡슐 또는 마크로에멀젼 (macroemulsions)안에 포집될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에서 개시된다.

서방형 제재가 제조될 수 있다. 서방형 제재의 적합한 예들에는 상기 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이러한 매트릭스는 성형된 제품 형태, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐 형태로 존재한다.

생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균이다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 구현될 수 있다.

N. 진단 및 검출 방법 및 조성물

이펙터 제제가 방사성표지 모이어티인 경우, 본원에 기재된 바와 같은 항체 세트는 또한 진단 또는 이미징 방법, 바람직하게는, 사전표적화 방사성면역이미징 방법 또는 이를 포함하는 방법에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 진단 및 이미징 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 본원에 기술된 이미징 방법에서의 항체 세트, 및 대상체에서, 예를 들어, 인간이나 동물의 신체에서 수행되는 진단 방법에 사용하기 위한 본원에 기술된 항체 세트(즉, 본원에 기술된 제1 및 제2 항체)의 용도를 제공한다.

이미징 방법은 신체 내 표적 항원의 존재 및/또는 분포를 이미징하는 데 적합하다. 예를 들어, 상기 방법은 질병, 예를 들어, 위에서 논의된 임의의 질병 상태와 관련된 항원을 발현하는 세포를 이미징하는 방법일 수 있다. 선택적으로 상기 방법은 종양 또는 암을 이미징하기 위한 것이다. 상기 방법은 암과 같은 증식성 질환 또는 감염성 질환에 걸린 것으로 의심되는 대상체를 진단하기 위한 것일 수 있다.

일부 실시형태에서 대상체는 인간인 것이 바람직할 수 있다.

이미징 또는 진단을 위해 방사성동위원소를 조직 또는 장기에 표적화하는 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:

i) 본원에 기재된 제1 및 제2 항체를 대상체에게 (동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로) 투여하는 단계, (이 때 항체는 표적 항원에 결합하고 표적 항원을 발현하는 세포 표면에 국재화되며, 이 때, 제1 및 제2 항체의 결합은 방사성 표지 화합물에 대한 기능적 결합 부위를 형성하고);

그리고

선택적으로, 상기 방법은 다음 단계를 추가로 포함할 수 있다:

iii) 방사성 표지 화합물이 국재화되었거나 국재화될 것으로 예상되는 조직 또는 장기를 이미징하는 단계.

선택적으로, 상기 방법은 진단을 형성하는 단계, 대상체에게 진단을 전달하는 단계, 및/또는 진단에 기초하여 적절한 치료를 결정 및/또는 투여하는 단계 중 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 대상체의 조직 또는 장기를 이미징하는 단계를 포함할 수 있으며, 이 때 대상체는 이전에 다음을 투여받았다:

i) 본원에 기재된 제1 및 제2 항체(동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로)(이 때 항체는 표적 항원에 결합하고 표적 항원을 발현하는 세포 표면에 국재화되며, 이 때, 제1 및 제2 항체의 결합은 방사성 표지 화합물에 대한 기능적 결합 부위를 형성하고) 및;

ii) 제1 항체와 제2 항체의 결합에 의해 형성된, 방사성 표지 화합물에 관한 항원 결합 부위에 결합하는 방사성 표지 화합물.

본원에 기재된 이미징 및/또는 진단 방법에서, 방사성 표지 화합물은 이미징에 적합한 방사성동위원소로 표지된다. 적합한 방사성동위원소는 위에서 논의된 바와 같은 감마 방출체를 포함한다.

전통적인 사전표적화 방사이미징 방법에서, 항체의 투여와 방사성 표지 화합물의 투여 사이에 제거제 또는 차단제를 투여하는 것이 일반적이다.

본 발명의 특정 실시형태에서, 제거제 또는 차단제를 투여하는 단계는 없다. 특정 양상에서, 항체의 투여와 방사성 표지 화합물의 투여 사이에 제1 또는 제2 항체에 결합하는 임의의 제제를 투여하는 단계가 없다. 특정 양상에서, 선택적으로 화학요법제, 면역요법제 및 방사선감작제로부터 선택되는 화합물을 제외하고, 항체와 방사성 표지 화합물의 투여 사이에 임의의 제제를 투여하는 단계가 없다. 일부 실시형태에서, 항체의 투여와 방사성 표지 화합물의 투여 사이에 제제가 투여되지 않는다. 일부 실시형태에서 항체의 투여와 방사성 표지 화합물의 투여 사이에 대상체에게 임의의 다른 제제의 주사 또는 주사가 없을 수 있다.

일부 실시형태에서, 상기 이미징 방법은 i) 항체 세트를 투여하는 단계(이 때, 제1 및 제2 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여될 수 있음), ii) 후속적으로 방사성 표지 화합물을 투여하는 단계, 및 iii) 관심 조직 또는 장기를 이미징하는 단계로 구성된 또는 본질적으로 이러한 단계들로 구성된 사전표적화된 방사이미징의 방법일 수 있다. 진단 방법은 상기 단계에 이어 진단을 형성하는 단계로 구성되거나 본질적으로 이러한 단계로 구성될 수 있으며, 그 후 이는 환자에게 전달될 수 있고 치료 요법의 선택 및/또는 투여를 위한 기초로서 사용될 수 있다.

표적 항원은 본원에서 논의된 임의의 표적 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 항원은 상기 논의된 종양-특이적 항원일 수 있고, 이미징은 종양 또는 종양들을 이미징하는 방법일 수 있다. 개체는 종양이 있는 것으로 알려지거나 의심될 수 있다.

예를 들어, 상기 방법은 폐암, 비소세포 폐(NSCL)암, 세기관지 폐포 세포 폐암, 골암, PDAC를 포함한 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암 및/또는 결장암일 수 있는 결장직장암, 항문암, 위암, 위장암, 결장직장암(이는 결장암 및/또는 직장암 일 수 있음), 유방암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질암종, 외음부 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선 암, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신세포암, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담즙 암, 중추 신경계 신생물증(CNS), 척수 축 종양, 뇌간신경아교종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 뇌실막종, 수모세포종, 수막종, 편평세포 암종, 뇌하수체 선종 및 유잉 육종(임의의 상기 암들의 불응성 형태, 또는 임의의 이들 암들의 체크포인트 억제제를 경험한 형태를 포함), 또는 하나 이상의 상기 암의 조합에 걸린 또는 걸린 것으로 의심되는 개체에서 종양을 이미징하는 방법일 수 있다.

III. 서열

IV. 실시예

다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예들이다. 다양한 다른 실시예가 전술한 일반적인 설명에 따라 실시될 수 있는 것으로 이해된다.

약어 용어집

ADA 항-약물 항체

AST 알라닌, 세린, 트레오닌

BsAb 이중특이성 항체

CA 제거제

CEA 암배아 항원

DOTAM 1,4,7,10-테트라키스(카르바모일메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸

ID 주사 용량

ELISA 효소-결합 면역흡착 분석

FAP 섬유아세포 활성화 단백질

GPRC5D G-단백질 결합 수용체 패밀리 C 그룹 5 멤버 D

IV 정맥내

MW 분자량

PBS 인산염 완충 식염수

p.i. 주사 후

PK 약동학

PRIT 사전표적화 방사면역요법

RIT 방사면역요법

RT 실온

SC 피하

SCID 중증 복합 면역결핍

SD 표준편차

SOPF 특이적인 기회감염 병원체 부재

SPLIT 분리된 v-도메인 연결 기술

TA 표적 학원

TGI 종양 성장 억제

TR 종양 퇴행

실시예 1: CEA-분할-DOTAM VH/VL 항체의 생성

표적 항원에 대한 결합 부위와 방사성 표지 화합물에 대한 결합 부위를 갖는 이중특이성 항체를 사용하는 PRIT(사전표적화 방사면역요법) 방법은 일반적으로 항체와 방사성리간드 투여 사이에 제거제(CA)를 사용하여 효과적인 표적화 및 정상 조직 대비 높은 종양 흡착 용량 비율을 보장한다(도 3 참조). 이러한 방법 중 하나의 예에서, 주사된 BsAb는 종양에 침투하기에 충분한 시간(일반적으로 4-10일)이 허용되며, 그 후 순환하는 BsAb는 Pb-DOTAM-덱스트란-500 CA를 사용하여 중화된다. CA는 ²¹²Pb-DOTAM이 종양에 침투하지 않고 비표적 BsAb에 결합하는 것을 차단하여 사전표적화 부위를 차단한다. 이러한 사전표적화 요법은 후속 투여되는 방사성 표지 킬레이트인 ²¹²Pb-DOTAM이 효율적으로 종양에 축적될 수 있게 한다.

그러나 제거제를 포함하는 방법에서 CA를 사용하면 상기 방법에 비효율적인 추가적인 단계가 도입된다. 또한 CA 투여의 시기와 용량을 신중하게 선택하는 것이 중요할 수 있으며 이는 복잡한 요소이다.

제거제 사용과 관련된 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 DOTAM VL 및 VH 도메인을 분할하여 별도의 항체에서 발견되도록 하는 전략을 제안했다.

예시적인 분할 DOTAM VH/VL 항체의 생성은 아래에서 상세히 논의된다.

항체 중쇄 또는 경쇄의 재조합 발현을 위한 플라스미드 생성

인간 배아 신장 세포(HEK 293)를 일시적으로 형질감염시켜 원하는 단백질을 발현시켰다. 원하는 유전자/단백질(예를 들어, 전장 항체 중쇄, 전장 항체 경쇄 또는 추가 도메인(예를 들어, C-말단에 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인)을 포함하는 전장 항체 중쇄)의 발현을 위해 다음 기능 요소들를 포함하는 전사 단위가 사용되었다:

- 인트론 A를 포함하는 인간 거대세포바이러스(P-CMV)의 초기 인핸서 및 프로모터,

- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),

- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열(SS),

- 발현될 유전자/단백질, 및

- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).

발현시키고자 하는 원하는 유전자를 포함하는 발현 유닛/카세트에 더하여, 기본/표준 포유동물 발현 플라스미드는 다음을 포함하였다:

- 대장균에서 플라스미드의 복제를 가능하게 하는, 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및

- 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자.

a) 항체 중쇄용 발현 플라스미드

완전하고 기능적인 항체 중쇄, 이어서 추가 항체 V-중쇄 또는 V-경쇄 도메인을 포함하는 C-말단 융합 유전자를 포함하는 항체 중쇄 인코딩 유전자는, G4Sx4 링커에 의해 각각 분리된 각각의 서열 요소들(V-중쇄 또는 V-경쇄)을 코딩하는 DNA 단편을 인간 IgG 분자의 CH3 도메인의 C-말단에 융합하여 조립되었다(VH-CH1-힌지-CH2-CH3-링커-VH 또는 VH-CH1-힌지-CH2-CH3-링커-VL). 2개의 CH3 도메인의 C-말단에 각각 1개의 VH 및 1개의 VL 도메인을 보유하는 재조합 항체 분자를 놉-인투-홀 기술을 사용하여 발현시켰다.

HEK293 세포에서 C-말단 VH 또는 VL 도메인을 갖는 항체 중쇄의 일시적인 발현을 위한 발현 플라스미드는, C-말단 VH 또는 VL 도메인 발현 카세트를 갖는 항체 중쇄 단편 이외에도, 대장균에서 이 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함하였다. C-말단 VH 또는 VL 도메인 융합 유전자를 갖는 항체 중쇄 단편의 전사 단위는 다음의 기능적 요소들을 포함한다:

-인트론 A를 포함하는 인간 거대세포바이러스(P-CMV)의 초기 인핸서 및 프로모터,

- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),

- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,

- 항체 중쇄(VH-CH1-힌지-CH2-CH3-링커-VH 또는 VH-CH1-힌지-CH2-CH3-링커-VL) 인코딩 핵산, 및

- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).

b) 항체 경쇄용 발현 플라스미드

완전하고 기능적인 항체 경쇄를 포함하는 유전자를 인코딩하는 항체 경쇄는 각각의 서열 요소를 코딩하는 DNA 단편을 융합하여 조립하였다.

항체 경쇄의 일시적인 발현을 위한 발현 플라스미드는, 항체 경쇄 단편 이외에도, 대장균에서 이 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기점, 및 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함하였다. 항체 경쇄 단편의 전사 단위는 다음의 기능적 요소들을 포함한다:

- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-비번역 영역(5'UTR),

- 뮤린 면역글로불린 중쇄 신호 서열,

- 항체 경쇄 (VL-CL) 인코딩 핵산, 및

- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열(BGH pA).

항체 분자의 일시적 발현

F17 배지(Invitrogen Corp.)에서 배양된 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포(인간 배아 신장 세포주 293-유래)에서 항체 분자를 생성하였다. 형질감염을 위해 "293-Free" 형질감염 시약(Novagen)을 사용했다. 상기 기재된 각각의 항체 중쇄 및 경쇄 분자는 개별 발현 플라스미드로부터 발현되었다. 제조업체의 지침에 명시된 대로 형질감염을 수행했다. 면역글로불린 함유 세포 배양 상청액을 형질감염 후 (3-7)일 후에 수확하였다. 정제할 때까지 상층액을 감소된 온도(예를 들어, -80°C)에서 보관했다.

예를 들어, HEK293 세포에서 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반 정보는 Meissner, P. 외, Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203에 제공되어 있다.

PRIT 반항체(분할 항체)를 MabSelect Sure(친화성 크로마토그래피)로 정제한 다음 Superdex 200(크기 배제 크로마토그래피)으로 정제했다.

예시적인 항체/반항체의 서열이 아래에 요약되어 있다.

DOTAM-VL-P1AD8592를 포함하는 PRIT 분할 항체의 경우, 농도가 1.372mg/mL이고 순도가 분석 SEC 및 CE-SDS를 기준으로 >96%인 5mg이 생성되었다. DOTAM-VH - P1AD8749를 포함하는 PRIT 분할 항체의 경우, 농도가 2.03mg/mL이고 순도가 분석 SEC 및 CE-SDS를 기준으로 >91%인 14mg이 생성되었다.

항체 P1AE4956 및 P1AE4957도 생성되었다. DOTAM-VL -P1AE4957을 포함하는 PRIT 분할 항체의 경우, 농도가 2.6mg/mL이고 순도가 분석 SEC 및 CE-SDS를 기준으로 >81.6%인 19mg이 생성되었다. DOTAM-VH - P1AE4956을 포함하는 PRIT 분할 항체의 경우, 농도가 1.5mg/mL이고 순도가 분석 SEC 및 CE-SDS를 기준으로 >90%인 6.9mg이 생성되었다.PRIT 반항체의 정체를 확인하기 위해 ESI-MS도 사용하였다.

실시예 2: 분할 항체 기능성의 FACS 분석

분할 항체 또는 반항체의 기능을 평가하기 위해, MKN-45 세포를 37°C에서 10분 동안 아큐타제를 사용하여 배양 용기에서 탈착시켰다. 이어서, 세포들을 PBS에서 2회 세척하고, 4x10⁶개 세포/웰의 최종 밀도로 96웰 v-바닥 플레이트에 시딩하였다.

반항체 P1AD8749 및 P1AD8592 및 인간 ISO 대조군을 도 5에 나타낸 바와 같은 농도로 세포에 1:1로 혼합하였다. 이어서, 세포를 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하고 PBS에서 2회 세척하였다. 세포 펠렛을 재현탁하고 40μl/웰의 검출 시약, <human IgG(H+L)> FITC, (10μg/ml) 또는 Pb_Dotam_FITC 1:100 => (10μg/ml) PBS / 5% FCS를 첨가했다. 얼음에서 60분간 인큐베이션한 후, 세포를 PBS에서 2회 세척하고 FACS canto를 사용한 FITC 형광 측정을 위해 200μl PBS/5% FCS에 재현탁했다.

MKN-45 세포의 CEA에 대한 반항체의 결합 능력을 평가하기 위해, 인간 IgG 특이적 2차 항체를 사용하는 항체를 사용하여 반항체를 검출했다(도 5). 예상한 바와 같이, 인간 ISO 대조군의 유의한 결합은 이들 세포에서 관찰되지 않는다. 동일한 IgG 농도로 조정될 때, 두 반항체들 및 이들 둘의 조합은 MKN-45 세포에 대한 용량 의존적 결합을 나타내며, 예상대로 매우 높은 농도에서 뚜렷한 후크 효과를 나타낸다. 이 실험은 CEA 결합이 반항체에서 기능적임을 입증한다.

DOTAM에 대한 반항체의 결합 능력을 평가하기 위해, 인간 ISO 대조군 또는 각각의 분할 항체 짝이 1:1 비율로 존재할 때 반항체를 세포에 결합시켰다. 이들이 MKN-45 세포에 결합한 후, 세포를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거했다. 이어서, Pb-DOTAM-FITC(형광 표지된 Pb-DOTAM)를 첨가하여 DOTAM 결합능 세포 결합 항체를 검출했다(도 6). 예상대로, 분할 항체 짝들 중 하나가 인간 ISO 대조군과 조합될 때, 이들 세포에서 유의한 FITC가 관찰되지 않는다. 1:1 비율의 두 반항체 조합만이 용량 의존적 FITC 신호를 나타낸다. 이 실험은 두 반항체가 하나의 세포상에 모일 때 DOTAM 결합 부위가 기능하게 됨을 보여준다.

실시예 3: 생체내 연구

실시예 3a: 재료 및 방법 - 일반

모든 실험 프로토콜은 지방 당국(Comit

R

gional d'Ethique de l'Exp

rimentation Animale du Limousin [CREEAL], Laboratoire D

partemental d'Analyses et de Recherches de la Haute-Vienne)의 검토 및 승인을 받았다. 암컷 중증 복합 면역결핍(SCID) 마우스(Charles River)는 윤리적 지침에 따라 일일 명암 주기(12시간/12시간)로 특이적인 기회감염 병원체가 없는(SOPF) 조건에서 유지되었다. 동물들이 새로운 환경에 적응할 수 있도록 도착 후 처음 5일 동안 조작을 수행하지 않았다. 임상 증상 및 이상 반응 검출을 위해 동물을 매일 통제하였다.

Corning®Matrigel® 기저막 매트릭스(성장 인자 감소; 카탈로그 번호 354230)와 1:1 혼합된 세포 배양 배지에서 CEA-발현 종양 세포의 피하(SC) 주사에 의해 고체 이종 이식편을 안정화(establish)시켰다. 종양 부피는 매주 3회 수동 캘리퍼링을 통해 추정되었으며 다음 공식에 따라 계산되었다: 부피 = 0.5 × 길이 × 너비 ² . 종양 성장 속도에 따라 필요에 따라 추가 종양 측정을 수행했다.

종양 부담, 주사 부작용 또는 기타 원인으로 인해 참을 수 없는 고통이나 통증의 징후를 보이는 경우 예정된 종점 이전에 마우스를 안락사시켰다. 통증, 고통 또는 불편함의 징후에는 급성 체중(BW) 감소, 지저분한 털, 설사, 구부러진 자세 및 무기력이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 처치된 동물의 BW는 주당 3회 측정되었으며, 건강 상태에 따라 필요에 따라 추가 측정되었다. 방사성물질 주사 다음 날부터 시작하여 7일 동안 또는 모든 개체가 급성 BW 감소에서 충분히 회복될 때까지 젖은 음식을 모든 마우스에게 제공했다. BW 감소가 초기 BW의 20%를 초과하거나 종양 부피가 3000 mm³에 도달한 마우스를 즉시 안락사시켰다. 윤리적 이유로 안락사에 고려된 다른 요인들은 종양 상태(예를 들어, 괴사 부위, 혈액/체액 누출, 자기상해 징후) 및 전반적인 동물의 모습(예를 들어, 털, 자세, 움직임)이었다.

방사성 소변/대변의 재흡수를 최소화하기 위해, 모든 효능 연구 마우스를 ²¹²Pb-DOTAM 투여 후 4시간 동안 그릴 바닥의 우리에 두었다가 표준 깔짚이 있는 새 우리로 옮겼다. 그런 다음 주사 후(p.i.) 24시간에 모든 케이지를 교체했다. 방사성물질 주사 후 24시간 이내에 체내분포 분석을 위해 희생시킨 마우스에 대해서는 이 절차를 수행하지 않았다.

안락사 시점에 마취된 마우스에서 후안와 채혈을 사용하여 정맥동으로부터 혈액을 수집한 다음, 자궁경부 탈구로 종료 후 프로토콜에 규정된 대로 방사능 측정 및/또는 조직학적 분석을 위한 추가 조직 수확을 수행했다. 예기치 않은 또는 비정상적인 병태들을 문서화하였다. 포르말린 고정을 위해 수집된 조직들을 즉시 10% 중성 완충 포르말린(4°C)에 넣고 5일 후에 인산염 완충 식염수(PBS; 4°C)로 옮겼다. 체내분포 분석을 위해 수집된 장기 및 조직들을 계량하고 2470 WIZARD² 자동 감마 계수기(PerkinElmer)를 사용하여 방사능에 대해 측정한 다음, 조직 그램에 대한 주사한 용량 백분율(% ID/g)을 계산하였으며 붕괴 및 배경에 대한 보정을 포함하였다.

GraphPad Prism 7(GraphPad Software, Inc.) 및 JMP 12(SAS Institute Inc.)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 종양 성장 억제(TGI)의 곡선 분석은 평균 종양 부피를 기반으로 다음 공식을 사용하여 수행되었다:

이 때 d는 연구일을 나타내고 0은 기준선 값을 나타낸다. 비히클은 참조 그룹으로 선택되었다. 종양 퇴행(TR)은 다음에 따라 계산되었다:

이 때 양수 값은 종양 퇴행을 나타내고, -1 미만의 값은 이중 기준선 값을 초과하는 성장을 나타낸다.

테스트 화합물

이중특이성 항체, 제거제 및 방사성 표지 킬레이트 각각에 대해 상기 설명된 연구에서 사용된 화합물들을 아래 표에 제시한다.

CEA-DOTAM(RO7198427, PRIT-0213)은 CEA의 T84.66 에피토프를 표적으로 하는 완전히 인간화된 BsAb이다(또한 WO2019/201959 참조). PRIT-0213은 다음과 같이 구성되어 있다:

i) 하기와 같은 제1 중쇄;

i) 하기와 같은 제2 중쇄; 및

iii) 하기와 같은 2개의 항체 경쇄.

DIG-DOTAM(RO7204012)은 음성 대조군으로 사용되는 비-CEA 결합 BsAb이다.

P1AD8749, P1AD8592, P1AE4956 및 P1AE4957은 CEA의 CH1A1A 또는 A5B7 에피토프를 표적으로 하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체이다. 이들의 서열은 상기 기재되어 있다. 모든 항체 구조체들은 주사 당일까지 -80°C에서 보관되었으며, 주사 당일에 정맥내(IV) 또는 복강내(IP) 투여를 위해 이들을 해동시켜 표준 비히클 완충액(20mM 히스티딘, 140mM NaCl; pH 6.0) 또는 0.9% NaCl에서 각각의 최종 농도까지 희석시켰다.

Pb-DOTAM-덱스트란-500 CA(RO7201869)는 주사 당일까지 -20°C에서 보관한 후, 주사 당일에 이를 해동시키고 IV 또는 IP 투여를 위해 PBS에 희석시켰다.

방사성 표지를 위한 DOTAM 킬레이트는 Macrocyclics에서 제공하였으며 Orano Med(Raz

s, 프랑스)에서 방사성 표지를 수행하기 전 -20°C에서 유지시켰다. ²¹²Pb-DOTAM(RO7205834)은 토륨 발생장치로부터 DOTAM으로 용출하여 생성한 다음, 표지한 후 Ca로 퀀칭하였다. ²¹²Pb-DOTAM 용액을 0.9% NaCl로 희석시켜 IV 주사에 바람직한 ²¹²Pb 활성 농도를 얻었다.

비히클 대조군의 마우스에게 BsAb, CA 및 ²¹²Pb-DOTAM 대신에 비히클 완충액을 여러 번 주사했다.

이중특이성 항체

제거제

방사성표지 킬레이트

종양 모델

사용된 종양 세포주 및 마우스 접종을 위한 주사량은 하기 표에 기재되어 있다. BxPC3은 자연적으로 CEA를 발현하는 인간 원발성 췌장 선암종 세포주이다. 세포를 RPMI 1640 배지, GlutaMAX™보충제, 10% 소 태아 혈청(GE Healthcare Hyclone SH30088.03)이 풍부한 HEPES(Gibco, 참조 번호 72400-021)에서 배양했다. Corning®Matrigel® 기저막 매트릭스(성장 인자 감소; 카탈로그 번호 354230)와 1:1 혼합된 RPMI 배지의 세포들을 0 연구일에 오른쪽 옆구리에 피하주사 하여 각 SCID 마우스에 고체 이종 이식편을 안정화시켰다.

종양 세포주

*유럽 세포 배양 은행(European Collection of Authenticated Cell Cultures, 영국 솔즈베리)

실시예 3b: 프로토콜 144

프로토콜 144의 목적은 CEA-분할-DOTAM-VH/VL BsAbs를 사용하여 2단계 PRIT 후 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 마우스에서 사전표적화된 ²¹²Pb-DOTAM의 PK 및 체내분포 데이터를 제공하는 것이었다.

2단계 PRIT는 CEA-분할-DOTAM-VH 및 CEA-분할-DOTAM-VL(P1AD8749 및 P1AD8592)을 개별적으로 또는 함께 주사하고, 7일 후 ²¹²Pb-DOTAM을 주사하여 수행했다. 방사성물질 주사 6시간 후 마우스를 희생시키고 방사능 측정을 위해 혈액 및 장기를 수확하였다. 2단계 방식을 표준 CEA-DOTAM 이중특이성 항체, 7일 후 Ca-DOTAM-덱스트란-500 CA, 그리고 CA 24시간 후 ²¹²Pb-DOTAM를 사용한 3단계 PRIT와 비교했다.

CEA-분할-DOTAM-VH/VL 제거율의 PK 데이터를 항체 주사 후 1시간에서 7일까지 반복된 혈액 샘플링을 통해 수집한 후, ELISA로 분석했다.

연구 개요를 도 7에 나타낸다. 도 7a는 SC BxPC3 종양을 보유한 SCID 마우스에서 CEA-분할-DOTAM-VH/VL PK에 대한 혈액 샘플링을 포함한 2단계 PRIT 요법의 개요를 보여준다. 도 7b는 SC BxPC3 종양을 보유한 SCID 마우스에서 수행된 3단계 PRIT 요법의 개요를 나타낸다(h = 시간, d = 일).

연구 설계

프로토콜 144의 시간 경과 및 설계를 아래 표에 나타낸다.

프로토콜 144의 시간 경과

프로토콜 144의 연구 그룹

각 SCID 마우스에서 연구 0일차에 오른쪽 옆구리에 RPMI/Matrigel의 5x10⁶개 세포(계대 26)를 SC 주사하여 고체 이종이식편을 안정화시켰다. 종양 세포 주사 14일 후, 마우스를 평균 종양 부피가 116 mm³인 실험그룹들로 분류하였다. 접종 후 22일차에 ²¹²Pb-DOTAM을 주사하였다; 평균 종양 부피는 21일차에 140 mm³였다.

CEA-분할-DOTAM-VH/VL 주사 후 1시간(오른쪽 눈), 24시간(왼쪽 눈) 및 168시간(오른쪽 눈, 종료 시점)에 마취 하에 그룹 Aa, Ba 및 Ca의 마우스로부터 혈액을 후안와 채혈을 통해 수집했다. 유사하게, 샘플은 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 주사 후 4시간(오른쪽 눈), 72시간(왼쪽 눈) 및 168시간(오른쪽 눈, 종료 시점)에 Ab, Bb 및 Cb 그룹의 마우스로부터 채취했다.

²¹²Pb-DOTAM 주사 6시간 후 그룹 Aa, Ba, Ca, D의 마우스를 희생시키고 부검하여, 다음과 같은 장기 및 조직들을 방사능 함량 측정을 위해 수확하였다: 혈액, 피부, 방광, 위, 소장, 결장, 비장, 췌장, 신장, 간, 폐, 심장, 대퇴골, 근육, 뇌, 꼬리, 귀 및 종양.

결과

주사 6시간 후 수집된 모든 조직의 평균²¹²Pb 축적 및 제거율이 도 8에 제시되어 있다. CEA-분할-DOTAM-VH 또는 CEA-분할-DOTAM-VL만으로 사전표적화한 결과 종양에서 방사능이 축적되지 않았다. 종합하면, 상기 2개의 상보적 항체는 표준 3단계 PRIT 요법에 대한 87 ± 15% ID/g와 비교하여 2단계 PRIT 후 65 ± 12% ID/g의 종양 흡수를 초래했다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 이원 분산 분석(ANOVA)은 두 PRIT 치료 간 종양 흡수의 차이가 방광의 차이(2단계 및 3단계 PRIT 각각에서 1 ± 2% ID/g 및 38 ± 17% ID/g)와 마찬가지로 유의미한 것으로 나타났으며; 그 외 조직 축적에 있어서의 차이는 이 검정을 사용시 통계적으로 유의하지 않았다(p = 0.05).

효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)으로 분석한 IV 주사된 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 구조체들의 제거율을 도 9에 나타낸다.

이상 반응 및 독성

본 연구와 관련된 이상 반응 또는 독성은 없었다.

결론

연구 결과는 상보적 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체를 사용하여 CA 독립적인 2단계 사전표적화의 개념 증명을 입증했다. 2단계 PRIT 및 표준 3단계 PRIT를 사용하여²¹²Pb-DOTAM의 높고 특이적인 종양 흡수에 도달했으며, 상보적인 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체를 사용하여 정상 조직에서 방사능 축적을 거의 하지 않았다.

실시예 3c: 프로토콜 158

프로토콜 158의 목적은 제거제 비의존적 2단계 CEA-PRIT를 위해 이중 파라토프(CH1A1A 및 A5B7) 쌍의 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체로 사전표적화된 마우스에서²¹²Pb-DOTAM과 피하 BxPC3 종양의 연관성을 평가하는 것이었다. 종양 흡수를 표준 3단계 CEA-PRIT의 흡수와 비교했다.

피하 BxPC3 종양을 보유한 마우스에게 다음 중 하나를 주사했다:

· CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체에 이어 7일 후 방사성 표지²¹²Pb-DOTAM(2단계 PRIT), 또는

· CEA-DOTAM BsAb 이어서 7일 후 CA, 24시간 후 마지막으로 방사성 표지 ²¹²Pb-DOTAM이 후속되었다(3단계 PRIT).

²¹²Pb-DOTAM의 체내분포는 방사성물질 주사 6시간 후에 평가되었다. 연구 개요를 도 10에 나타낸다.

연구 설계

프로토콜 158의 시간 경과 및 설계는 아래 표에 나와 있습니다.

프로토콜 158의 시간 경과

프로토콜 158의 연구 그룹

*35% 홀/홀 불순물을 보충하기 위해 P1AD8749 용량을 154μg로 조정했다. **P1AD8592 용량은 40% 홀/홀 불순물을 보충하기 위해 167μg로 조정되었다.

각 SCID 마우스에서 연구 0일차에 오른쪽 옆구리에 RPMI/Matrigel의 5x10⁶개 세포(계대 27)를 SC 주사하여 고체 이종이식편을 안정화시켰다. 종양 세포 주사 14일 후, 마우스를 평균 종양 부피가 177 mm³인 실험그룹들로 분류하였다. 접종 후 20일차에 ²¹²Pb-DOTAM을 주사하였다; 평균 종양 부피는 21일차에 243 mm³였다.

²¹²Pb-DOTAM 주사 6시간 후 모든 그룹의 마우스를 희생시키고 부검하여, 다음과 같은 장기 및 조직들을 방사능 함량 측정을 위해 수확하였다: 혈액, 피부, 방광, 위, 소장, 결장, 비장, 췌장, 신장, 간, 폐, 심장, 대퇴골, 근육, 뇌, 꼬리 및 종양.

결과

주사 6시간 후 수집된 모든 조직의 평균²¹²Pb 분포 및 제거율이 도 11에 제시되어 있다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 이원 ANOVA는 방광을 제외하고 세 가지 처리 사이에 ²¹²Pb의 정상 조직 흡수에 유의미한 차이가 없음을 보여주었는데, 이 때 이중 파라토프 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍은 둘 다 표준 3단계 PRIT 보다 더 낮은 축적을 나타냈다. 세 가지 처리 모두에서 신장 흡수율은 3-4% ID/g였다. 이중 파라토프 조합은 3단계 PRIT의 경우 67% ID/g에 비해 약 56% ID/g의 종양 축적을 초래했으며; 2단계와 3단계 PRIT의 차이는 통계적으로 유의했다(p < 0.0001).

이상 반응 및 독성

본 연구와 관련된 이상 반응 또는 독성은 없었다.

결론

이 연구는 표준 3단계 PRIT와 비교하여 CA 독립적 2단계 CEA-PRIT에 대한 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체의 이중 파라토프 쌍으로 사전표적화된 마우스에서²¹²Pb-DOTAM과 SC BxPC3 종양의 연관성을 평가했다. 주사 6시간 후,²¹²Pb의 분포는 2단계 및 3단계 PRIT에서 비슷했으며, 종양에 높은 축적이 있었고 건강한 조직에서는 방사능이 거의 없었다. 이것은 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체를 사용한 2단계 CEA-PRIT에 대한 CEA-발현 종양의 이중 파라토프 사전표적화 개념의 증거를 입증하였다.

실시예 3d: 프로토콜 160

프로토콜 160의 목적은 SC BxPC3 종양을 보유한 마우스에서 상보적 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체를 사용한 CA-독립적 2단계 CEA-PRIT 3주기 후 치료 효능을 표준 3단계 CEA-PRIT의 효능과 비교하는 것이었다. 주사 전에 ²¹²Pb-DOTAM과 사전 인큐베이션한 BsAbs를 사용하여 1단계 CEA-RIT와도 비교했다.

SC BxPC3 종양을 보유하는 마우스에게 다음 중 하나를 주사하였다:

· CEA-DOTAM BsAb, 이어서 7일 후 CA, 마지막으로 24시간 후 방사성 표지 ²¹²Pb-DOTAM(3단계 PRIT),

· CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체, 이어서 7일 후 방사성 표지²¹²Pb-DOTAM(2단계 PRIT), 또는

^· ²¹²Pb-DOTAM-CEA-DOTAM BsAb (사전-인큐베이션됨; 1-단계 RIT).

이 요법은 ²¹²Pb-DOTAM 20μCi의 3회 반복 주기로 투여되었으며, 비-CEA 결합 대조군 항체(DIG-DOTAM), 및 치료 없음(비히클)과의 비교 또한 포함하였다. 각 치료 주기에서²¹²Pb-DOTAM 표적화 및 제거를 확인하기 위해 전용 마우스를 체내분포 분석을 위해 희생시켰다. 치료 효능을 TGI 및 TR 양상에서 평가되었고, 치료의 내약성을 평가하기 위해 연구 기간 동안 마우스를 주의 깊게 모니터링했다. 연구 개요는 도 12에 나타낸다.

프로토콜 160의 시간 경과 및 설계를 아래 표에 나타낸다.

프로토콜 160의 시간 경과

프로토콜 160의 연구 그룹

*P1AD8749: 스톡 용액의 35% 홀/홀 불순물을 보충하기 위해 154μg로 조정된 용량; **P1AD8592; ***첫 치료 주기에서 급성 방사선-유발 독성으로 인해 3주기에서 1주기로 조정됨.

SCID 마우스에서 연구 0일차에 오른쪽 옆구리에 RPMI/Matrigel의 5x10⁶개 세포(계대 24)를 SC 주사하여 고체 이종이식편을 안정화시켰다. 종양 세포 주사 15일 후, 마우스를 평균 종양 부피가 122 mm³인 실험그룹들로 분류하였다. 접종 후 23일차에 ²¹²Pb-DOTAM을 주사하였다; 평균 종양 부피는 22일차에 155 mm³였다.

CEA-DOTAM 및 DIG-DOTAM 항체는 상기 표(프로토콜 160의 연구 그룹)에 따라 IP 투여를 위해 200μL당 100μg의 최종 농도로 비히클 완충액에서 희석되었다. CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체들은 200μL당 각 구조체 100μg을 포함하는 IP 투여용 단일 주사 용액으로 함께 혼합되었다. P1AD8749의 경우, 스톡 용액(VH/VL을 운반하지 않는 분자의 양상)에서 35% 홀/홀 불순물을 보충하기 위해 용량을 154μg로 조정했다. Ca-DOTAM-덱스트란-500 CA는 도 12의 실험 일정에 따라 BsAb 주사 7일 후 IP(PBS 200μL당 25μg)를 투여하고, 이어서 24시간 후에 ²¹²Pb-DOTAM(RO7205834)을 투여했다. PRIT-처리된 마우스(2단계 및 3단계)에 100μL의 Ca-퀀칭된 ²¹²Pb-DOTAM 용액(100μL 0.9% NaCl 중 20μCi)을 IV 주사했다.

1단계 RIT로 처리된 마우스는 사전-결합된 ²¹²Pb-DOTAM-CEA-DOTAM(IV 주사의 경우 100μL 0.9% NaCl에서 20μCi/20μg BsAb)을 한 번만 주사했다. 37°C에서 10분 동안 ²¹²Pb-DOTAM을 CEA-DOTAM BsAb와 함께 인큐베이션하여 직접 표지된 항체를 준비했다.

안락사 시점에 그룹 A-E의 마우스에서 혈청, 간, 비장, 신장, 췌장 및 종양과 같은 장기 및 조직을 수확했다. 안락사 전에, 마우스를 후안와 채혈을 위해 마취시켰다. 수집된 혈액 샘플들을 5분 동안 10,000rcf에서 원심분리하고 생성된 혈청 분획들을 단리, 냉동 및 -20°C에서 보관했다. 절제된 조직들을 즉시 10% 중성 완충 포르말린(4°C)에 넣고 24시간 후에 1X PBS(4°C)로 옮겼다. 포르말린 고정 샘플들을 추가 처리 및 분석을 위해 Roche Pharma Research and Early Development, Roche Innovation Center Basel로 배송하였다.

그룹 F, G, J 및 M의 마우스는 첫 번째이자 유일한 ²¹²Pb-DOTAM 또는 ²¹²Pb-DOTAM-BsAb의 주사 24시간 후에 희생되고 부검되었다: 그룹 H와 K는 두 번째 ²¹²Pb-DOTAM 주사 24시간 후에 희생되고 부검되었다: 그룹 I과 L은 세 번째 ²¹²Pb-DOTAM 주사 24시간 후에 희생되고 부검되었다. 안락사 시점에 마취된 마우스에서 후안와 채혈을 사용하여 정맥동으로부터 혈액을 수집한 후, 자궁 경부 탈구로 종료시켰다. 다음 장기 및 조직들도 체내분포 분석을 위해 수확되었다: 방광, 비장, 신장, 간, 폐, 근육, 꼬리, 피부 및 종양.

결과

주사 후 24시간 동안 수집된 모든 조직에서 평균 ²¹²Pb 축적 및 제거율을 도 13에 각 요법 및 치료 주기에 대해 표시한다. 음성 대조군은 종양에서 흡수가 없었다(0.4% ID/g). Tukey의 다중 비교 검정과 함께 이원 분산 분석(ANOVA)은 체내분포가 2단계 및 3단계 PRIT의 어떤 주기에서도 유의하게 다르지 않았음을 보여주었다; 그러나 이러한 차이는 모든 주기에서 음성 대조군 및 1단계 RIT와 비교하여 통계적으로 유의했다(p < 0.05). 종양 흡수율은 3단계 PRIT의 경우 25-45% ID/g, 2단계 PRIT의 경우 25-30% ID/g였으며, 치료 또는 주기 간에 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 1단계 RIT의 경우, 종양 흡수율은 단일 치료 주기에서 99%였다. 정상 조직에서의 흡수는 PRIT 요법 모두에서 매우 낮았지만, 1단계 RIT 후 모든 장기 및 조직에서 유의하게 높았는데, 이는 방사성 표지된 작은 DOTAM 킬레이트에 비해 사전 인큐베이션된 항체의 순환 시간이 훨씬 더 길었기 때문이다.

평균 종양 발달 및 개별 종양 성장 곡선을 각각 도 14 및 도 15에 나타내었다.비처리 비히클 그룹과 DIG-DOTAM 그룹의 종양은 꾸준히 성장했으나, 세 번째 치료 후 후자의 배가율(doubling rate)이 약간 낮았다. 대조적으로, PRIT 및 RIT 그룹의 종양은 첫 번째 치료 주기 후에 크기가 감소했으며 종양 크기가 증가하기 시작한 접종 후 약 10주까지 종양 제어를 유지했다. 2단계 및 3단계 PRIT 치료는 거의 동일한 종양 제어 결과를 가져왔다. 종양은 완전히 퇴행하지 않았다.

연구 83일차에, 모든 치료 그룹들을 평균에 따라 분석할 수 있는 마지막 날에, CEA-DOTAM(3단계) 및 CEA-분할-DOTAM-VH/VL(2-단계)을 사용한 PRIT의 TGI는 비히클 대조군과 비교하여 각각 91.7% 및 88.4%였다. 1단계 RIT의 해당 수치는 72.6%였던 반면, TGI는 비특이적 DIG-DOTAM 대조군의 경우 -59.7%였다. 같은 날, 평균 TR은 3단계 CEA-DOTAM PRIT의 경우 -1.9, 2단계 CEA-분할-DOTAM-VH/VL PRIT의 경우 -2.9, 1단계 RIT의 경우 -4.7, DIG-DOTAM PRIT의 경우 -28.8, 및 비히클 대조군의 경우 -39.3이었다.

아래에 설명된 이상 반응으로 인해, 생존 분석은 통계적으로 관련이 있는 것으로 간주되지 않았다.

이상 반응 및 독성

모든 치료 그룹의 BW 발달은 도 16에 나타낸다. 20 μCi의 ²¹²Pb-DOTAM을 사용한 2단계 및 3단계 PRIT의 여러 주기는 내약성이 좋았지만, 1단계 RIT를 받은 마우스에서 급성 BW 감소가 발생했으며 그룹 E의 8/10마리의 마우스는 첫 번째 RIT 주기 후(²¹²Pb 조사 후 6-11일)에 BW가 20% 이상 감소하여 안락사되었다. 나머지 2마리의 RIT 마우스는 추가로 ²¹²Pb-DOTAM-CEA-DOTAM을 주사하지 않았지만 종양 성장 평가를 위해 지속적으로 추적 관찰했다.

또한, 종양 상태의 악화(decline), 즉, 종양이 열리거나 누출됨으로 인해 윤리적 이유로 다수의 마우스를 희생시켰다. DIG-DOTAM 그룹에서, 9/10마리의 마우스는 이러한 이유로 3000 mm³의 종양 부피에 도달하기 전에 안락사되었다; 비처리 비히클 대조군의 경우, 해당 수치는 5/10마리였다. 문제는 PRIT 및 RIT 그룹에서 덜 두드러졌으며, 이러한 이유로 3단계 PRIT, 2단계 PRIT 및 1단계 RIT 그룹에서 각각 1/10, 2/10 및 2/10마리의 마우스가 안락사되었다. 이것은 도 15의 개별 종양 성장 곡선에 반영된다.

마지막으로, 그룹 C의 마우스 1마리는 항문 아래에 손상된 상처로 인해 안락사되었다.

모든 이상 반응은 아래 표에 나열되어 있다.

프로토콜 160에서의 이상 반응

연구 23일(주기 1), 37일(주기 2) 및 51일(주기 3)차에 ²¹²Pb 조사(irradiation)를 수행하였다.

결론

3단계 방식(CEA-DOTAM BsAb, CA 및 ²¹²Pb-DOTAM)과 2단계 방식(CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체 및 ²¹²Pb-DOTAM)을 사용하는 CEA-PRIT 간에 차이가 보이지 않았고; TGI는 두 치료에서 유의미하고 거의 동일했으며 두 경우 모두 20 μCi 3주기를 안전하게 투여할 수 있었다. 대조적으로, 주사 전 CEA-DOTAM에 사전결합된 ²¹²Pb-DOTAM의 20μCi((1단계 RIT)는 처리된 대부분의 마우스에서 내약성이 없었다.

따라서 본 연구는 개발된 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 구조체들을 사용하여 CA-독립적인 2단계 PRIT의 내약성 및 치료 효능을 입증했다.

실시예 4: 프로토콜 175

프로토콜 175의 목표는 종양 및 건강한 조직에서 후속 ²¹²Pb 축적에 대한 주사된 사전표적화 항체 양 증가의 영향을 평가하는 것이었다. CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체의 두 가지 용량: 표준 용량(100μg)과 2.5배 더 높은 용량(250μg)을 비교했다. 또한, CEA-분할DOTAM-VH 구조체에 변형을 가하여 그 VH를 확장시켜 항약물 항체(ADA) 형성을 방지했다(이것은 이전에 테스트된 CEA-분할-DOTAM-VL 구조체과 함께 사용되었다). VH는 항체 CH1 도메인의 처음 3개의 아미노산: 알라닌, 세린 및 트레오닌(AST)을 포함하도록 확장되었으며, 이러한 구조체는 이하에서 CEA-분할-DOTAM-VH-AST로 지칭되었다.

항체 P1AD8592는 상기 실시예 1에 이미 설명되어 있다. P1AF0171은 융합 HC가 잔기 AST에 의해 연장된다는 점을 제외하면 P1AD8749와 동일하다- 따라서 항체 P1AD0171은 위에서 설명한 경쇄 D1AA3384(서열번호 34), 위에서 설명한 제1 중쇄 D1AC4022(서열번호 28), 및 하기 나타낸 바와 같은 제2 중쇄 D1AE3669로 구성된다:

D1AE3669 (HC놉 <CEA> CH1A1A Dotam-VH-AST)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSAST (서열번호 153)

· 1× 표준 용량의 CEA-분할-DOTAM-VH/VL BsAb, 이어서 7일 후 방사성표지 ²¹²Pb-DOTAM, 또는

· 2.5× 표준 용량의 CEA-분할-DOTAM-VH/VL BsAb, 이어서 7일 후 방사성표지 ²¹²Pb-DOTAM.

²¹²Pb-DOTAM의 체내분포는 방사성물질 주사 24시간 후에 평가되었다. 연구 개요는 도 17에 나타낸다.

연구 설계

프로토콜 175의 시간 경과 및 설계를 아래에 나타낸다.

프로토콜 175의 시간 경과

*화합물 농도가 낮아 IP 주사 필요(구조체 당 200μL=총 400μL)

프로토콜 175의 연구 그룹

*P1AF0171 용량은 ~30% 홀/홀 불순물을 보충하기 위해 143 및 357μg로 조정되었다.

각 SCID 마우스에서 연구 0일차에 오른쪽 옆구리에 RPMI/Matrigel의 5x10⁶개 세포(계대 24)를 SC 주사하여 고체 이종이식편을 안정화시켰다. 종양 세포 주사 21일 후, 마우스를 평균 종양 부피가 310 mm³인 실험그룹들로 분류하였다. 접종 후 29일차에 ²¹²Pb-DOTAM을 주사하였다; 평균 종양 부피는 30일차에 462 mm³였다.

²¹²Pb-DOTAM 주사 24시간 후 마우스 모두를 희생시키고 부검하여, 다음과 같은 장기 및 조직들을 방사능 함량 측정을 위해 수확하였다: 혈액, 피부, 비장, 췌장, 신장, 간, 근육, 꼬리 및 종양.

결과

주사 24시간 후 수집된 모든 조직의 평균²¹²Pb 분포 및 제거율이 도 18에 제시되어 있다. 두 가지 용량 수준 사이에 종양 또는 정상 조직의 ²¹²Pb 흡수에는 유의한 차이가 없었다. 종양 축적은 두 치료 그룹 모두에서 30-31% ID/g였으며, 이 시점에서 신장 흡수는 <2% ID/g이었다. 한 마리의 마우스는 ²¹²Pb-DOTAM 주사 문제로 인해 꼬리에 ~1% ID/g가 있었지만, 수집된 다른 건강한 조직에서는 눈에 띄는 ²¹²Pb 축적이 나타나지 않았다.

이상 반응 및 독성

본 연구와 관련된 이상 반응 또는 독성은 없었다.

결론

사전표적화 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체의 용량을 2.5배 증가시키는 것은 이 생체내 모델에서 후속적으로 투여되는 ²¹²Pb-DOTAM의 종양 축적을 개선하지 않았다. 그러나 이는 정상 조직의 방사능 축적도 증가시키지 않았으며, 이는 이 2단계 사전표적화 요법을 사용하여 달성한 강력한 특이성을 나타내는 것이다. 마지막으로, 상기 결과는 확장된 VH CEA-분할-DOTAM-VH-AST 구조체의 기능을 검증하여 주었다.

실시예 5: 프로토콜 185

프로토콜 185의 목표는 T84.66 에피토프를 표적으로 하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL을 평가하는 것이었다. P1AF0709 및 P1AF0298의 서열이 본원에 제공된다. P1AF0709는 D1AE4688(서열번호 83)의 제1 중쇄 및 D1AA4920(서열번호 84)의 제2 중쇄를 가진다. P1AF0298은 D1AE4687(서열번호 86)의 제1 중쇄 및 D1AE3668(서열번호 87)의 제2 중쇄를 가진다. 둘 모두 D1AA4120(서열"볐* 89)의 경쇄를 갖는다.

SC BxPC3 종양을 보유한 마우스에 표준 용량의 CEA-분할-DOTAM-VH/VL BsAb(항체 당 100μg)를 주사한 후, 6일 후에 방사성 표지 ²¹²Pb-DOTAM을 주사했다. ²¹²Pb-DOTAM의 체내분포는 방사성물질 주사 6시간 후에 평가되었다. 연구 개요는 도 19에 나타낸다.

연구 설계

프로토콜 185의 시간 경과 및 설계를 아래에 나타낸다.

프로토콜 185의 시간 경과

프로토콜 185의 연구 그룹

*P1AF0171 용량은 ~30% 홀/홀 불순물을 보충하기 위해 143 μg로 조정되었다.

각 SCID 마우스에서 연구 0일차에 오른쪽 옆구리에 RPMI/Matrigel의 5x10⁶개 세포(계대 27)를 SC 주사하여 고체 이종이식편을 안정화시켰다. 종양 세포 주사 22일 후, 마우스를 평균 종양 부피가 224 mm³인 실험그룹들로 분류하였다. ²¹²Pb-DOTAM은 접종 후 28일차에 주사되었으며, 이때 평균 종양 부피는 385mm³에 도달했다.

²¹²Pb-DOTAM 주사 6시간 후 마우스 모두를 희생시키고 부검하여, 다음과 같은 장기 및 조직들을 방사능 함량 측정을 위해 수확하였다: 혈액, 피부, 비장, 췌장, 신장, 간, 근육, 꼬리 및 종양. 수집된 종양을 다음과 같이 두 조각으로 나누었다: 하나는 방사능 함량을 측정하고 다른 하나는 Tissue-Tek®최적 절단 온도(OCT) 포매 매질을 포함하는 크라이오몰드에 넣고 급속 동결을 위해 드라이아이스에 두었다. OCT의 냉동 샘플들을 -80°C에서 유지시킨 후, 냉동 절편화, 면역 형광 염색 및 Zeiss Axio Scope.A1 모듈형 현미경을 사용하여 분석하였다.

결과

주사 6시간 후 수집된 모든 조직의 평균²¹²Pb 분포 및 제거율이 도 20에 제시되어 있다. 종양 축적은 40% ID/g(CH1A1A) 또는 44% ID/g(T84.66)이었다. 상기 2개 그룹에 대해 유일하게 눈에 띄는 방사능 축적은 신장에서 발견되었다: 6 h p.i.에서 3-5% ID/g.

T84.66(그룹 A) 또는 CH1A1A(그룹 B)를 표적으로 하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍의 종양내 분포의 예를 도 21에 나타낸다. 패널 A 및 C는 BxPC3 종양에서 CEA 발현이 높고 균질함을 보여주고, 패널 B 및 D는 주사 후 7일차에 항체 분포가 유사하게 분포됨을 보여준다. 그러나 그룹 A의 샘플은 그룹 B의 종양 샘플과 비교하여 전반적으로 더 강한 신호를 나타내어, T84.66이 CH1A1A보다 더 강한 결합제라는 증거를 제공한다.

이상 반응 및 독성

본 연구와 관련된 이상 반응 또는 독성은 없었다.

결론

상기 결과는 CEA의 T84.66 에피토프를 표적으로 하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 구조체들의 기능을 검증했다. 사전표적화된 CEA-발현 종양에서 생성된 212Pb의 축적은 높고 특이적이었고, CH1A1A 또는 T84.66 에피토프를 표적으로 하는 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍은 CEA-발현 종양 내부에 균질하게 분포되었다.

실시예 6: 프로토콜 189

프로토콜 189의 목적은 T84.66 VH-AST/CH1A1A VL 및 T84.66 VL/CH1A1 VH-AST를 표적으로 하는 이중 파라토프 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체 쌍을 CH1A1A VH-AST/VL을 표적화하는 양성 대조군 쌍과 비교하여 평가하는 것이었다. 이러한 이중-파라토프 조합은 2개의 에피토프(예를 들어, T84.66) 중 하나만을 발현하는 가용성 CEA에서 전체 Pb-DOTAM 결합제의 형성을 배제하여, 순환 방사능 증가 및 관련 방사선 유발 독성 및 종양 외 표적들과의 경쟁으로 인한 효능 감소와 같은 가능한 이상 반응을 완화시킨다.

SC BxPC3 종양을 보유한 마우스에 표준 용량의 CEA-분할-DOTAM-VH/VL BsAb(항체 당 100μg)를 주사한 후, 7일 후에 방사성 표지 ²¹²Pb-DOTAM을 주사했다. ²¹²Pb-DOTAM의 체내분포는 방사성물질 주사 6시간 후에 평가되었다. 연구 개요는 도 22에 나타낸다.

연구 설계

프로토콜 189의 시간 경과 및 설계를 아래에 나타낸다.

프로토콜 189의 시간 경과

프로토콜 189의 연구 그룹

각 SCID 마우스에서 연구 0일차에 오른쪽 옆구리에 RPMI/Matrigel의 5x10⁶개 세포(계대 31)를 SC 주사하여 고체 이종이식편을 안정화시켰다. 종양 세포 주사 14일 후, 마우스를 평균 종양 부피가 343 mm³인 실험그룹들로 분류하였다. 접종 후 22일차에 ²¹²Pb-DOTAM을 주사하였다; 평균 종양 부피는 21일차에 557 mm³에 도달했다.

²¹²Pb-DOTAM 주사 6시간 후 마우스 모두를 희생시키고 부검하여, 다음과 같은 장기 및 조직들을 방사능 함량 측정을 위해 수확하였다: 혈액, 피부, 비장, 췌장, 신장, 간, 근육, 꼬리 및 종양.

결과

주사 6시간 후 수집된 모든 조직의 평균²¹²Pb 분포 및 제거율이 도 23에 제시되어 있다.이중 파라토프 변이체들의 종양 축적은 T84.66 VH-AST + CH1A1A VL 및 T84.66 VL + CH1A1A VH-AST에 대해 각각 71% ID/g 및 46% ID/g였다. 양성 CH1A1A 대조군은 37% ID/g을 나타냈다. Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 이원 ANOVA는 세 그룹 모두 종양 흡수 양상에서 서로 유의미한 차이가 있음을 보여주었다(다른 두 그룹 대비 T84.66 VH-AST + CH1A1A VL의 경우 p<0.0001; CH1A1A 단독 대비 T84.66 VL + CH1A1A VH-AST의 경우 p = 0.0020). 다른 두 그룹과 비교하여 T84.66 VH-AST + CH1A1A VL 조합의 경우 혈중 보유가 약간 더 높게 나타났지만 다른 장기들은 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. <1% ID/g에 비해 2% ID/g. 신장 흡수율은 통계적으로 유의미하지는 않지만 유사하게 약간 더 높았다: 다른 2개의 경우 3% ID/g와 비교하여 T84.66 VH-AST + CH1A1A의 경우 4.5% ID/g.

이상 반응 및 독성

본 연구와 관련된 이상 반응 또는 독성은 없었다. 그러나 BxPC3 종양 성장은 이 연구에서 표준 성장 속도와 비교하여 훨씬 더 빠르고 변동성이 더 컸다. 부검에서, 큰 종양(대부분)이 액체로 채워져 있고 방사능 측정 전에 종양을 반으로 자르면 이 종양이 비워졌다고 결론지었다; 이 액체는 성장 속도를 가속화시켰을 가능성이 있지만, 개봉 후 종양을 계량하고 측정했기 때문에 IA/g%에 큰 영향을 미치지 않았다.

결론

상기 결과는 테스트 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 구조체들을 사용하여 CEA의 T84.66 및 CH1A1A 에피토프의 이중 파라토프 표적화의 기능을 검증하였으며 양성 CH1A1A 대조군과 비교하여 이 조합에 대해 놀라울 정도로 높은 효능을 입증했다. 사전표적화된 CEA-발현 종양에서 이루어진 ²¹²Pb의 축적은 높고 특이적이었으며, 이는 T84.66 VH-AST + CH1A1A VL 쌍에 대한 특정 이점을 나타낸다.

실시예 7

이들 실시예는 본원에 기술된 분할 항체에 의한 세포로의 Pb-DOTA 동원을 조사한다.

P1AF0712는 서열번호 97의 제1 중쇄, 서열번호 98의 제2 중쇄 및 서열번호 103의 경쇄를 갖는다. P1AF0713은 서열번호 100의 제1 중쇄, 서열번호 101의 제2 중쇄 및 서열번호 103의 경쇄를 갖는다.

트립신을 사용하여 MKN-45 세포를 배양 병에서 분리하고 Casy 세포 계수기를 사용하여 계수했다. 4°C에서 펠릿화한 후, 세포 300g을 FACS 완충액(PBS 중 2.5% FCS)에 재현탁하고, 2.0E+06 세포/mL로 조정하여, 96-웰 PP V-바닥 플레이트에 분배하였다(25 μL/웰 = 5.0 E+04젤렌/웰).

DOTA-FITC를 사용한 FACS 염색

CEA 특이적 SPLIT 항체(각각 P1AF0712 또는 P1AF0713)를 FACS 완충액에서 40μg/mL로 조정하여 최종 농도가 10μg/mL가 되도록 했다. 두 항체를 조합 또는 분리된 세포에 첨가한 다음, 완충액을 첨가하고 4°C에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, FITC로 표지된 Pb-DOTA를 항체와 등몰비로 세포에 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고 FACS Canto(BD, Pharmingen)를 사용하여 측정하기 위해 70 μl/웰 FACS 완충액에 재현탁하였다. SPLIT 반쪽들 중 어느 것도 형광 신호를 일으키지 않는 것으로 나타났으며, 이는 Pb-DOTA 결합 능력이 없음을 나타낸다(도 24). 두 SPLIT 반쪽들의 조합만이 Pb-DOTAM-FITC를 표적 세포로 동원할 수 있었다(도 24).

<huIgG(H+L)A488>을 사용한 FACS 염색

CEA 특이적 SPLIT 항체(각각 P1AF0712 또는 P1AF0713)를 FACS 완충액에서 40μg/mL로 조정하여 최종 농도가 10μg/mL가 되도록 했다. 두 항체를 분리 또는 조합된 세포에 첨가한 다음, 완충액을 첨가하고 4°C에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척했다. 세척 후, 세포를 2차 항체(<huIgG(H+L)> -Alexa488, c=10 μg/mL)를 포함하는 50 μL FACS-완충액에 재현탁시키고, 4°C에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고 FACS Canto(BD, Pharmingen)를 사용하여 측정하기 위해 70 μl/웰 FACS 완충액에 재현탁하였다. 두 SPLIT 항체에 대한 EC50은 비슷했으며, 이는 두 SPLIT 항체의 CEA 특이적 세포 결합을 나타낸다. 혼합물 내 더 많은 양의 항체로 인해, 이러한 상황에서 아래 표에 나타낸 바와 같은 더 낮은 EC50을 얻었다.

SPLIT 항체의 EC50 결정

2차 항체 기반 검출 (<hu> 488, 상단 패널) 또는 Pb-DOTA-FITC(DOTA-FITC, 하단 패널)을 사용하여 SPLIT 항체에 대해 EC50을 결정했다

실시예 8: Biacore 결합 실험

이 실시예는 기준 항체 CEA-DOTAM(RO7198427, PRIT-0213)과 비교하여 DOTAM에 대한 TA-분할-DOTAM-VH 및 TA-분할-DOTAM-VL의 결합을 개별적으로 테스트한다. DOTAM의 TA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍에 대한 결합을 참조 항체와 비교하여 추가로 테스트한다.

이들 실시예에서 사용된 코딩과 본 출원의 다른 곳에서 사용된 단백질 번호 사이의 대응을 아래에 나타낸다. 서열도 제공된다. 참조 항체는 본 실시예에서 "PRIT_RS"로 코딩된다.

이들 실험을 위해, PRIT SPLIT 항체를 MabSelect Sure(친화성 크로마토그래피)로 1단계 및 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, POROS XS)로 2단계 정제한 다음 Superdex 200(크기 배제 크로마토그래피)으로 연마하였다.

이들 실험은 25°C 측정 온도에서 Biacore T200으로 수행되었다. 모든 Biacore T200 실험은 HBS-P+(GE Healthcare, Br-1008-27) pH 7,4의 실행 완충액에서 수행되었다. 서로 다른 DOTAM 분획들을 사용하여 각 테스트 항체/항체 쌍에 대해 두 가지 실험을 수행했다.

1. 첫 번째 실험에서 칩에 포획된 비오티닐화된 DOTAM에 대한 개별 TA-분할-DOTAM-VH 및 TA-분할-DOTAM-VL 항체의 결합을 참조 항체와 비교하여 평가했다.

DOTAM(HBS-P+의 120nM 용액)은 CAP 칩 표면에서 고밀도(10μl/분, 60초)로 포획되었다. 그런 다음 전구약물_A 또는 전구약물_B의 HBS-P+에 있는 600nM 용액을 DOTAM 표면 위에 주사했다(10μl/분, 90초). 10 μl/분의 유속으로 240초 동안 해리를 모니터링하였다. 상대 최대 응답 결정은 T200 평가 소프트웨어를 사용하여 평가되었다.

결과를 도 26에 나타낸다. 개별 항체 중 어느 것도 포획된 DOTAM에 대한 결합을 나타내지 않았다.

2. 두 번째 실험에서, 개별 TA-분할-DOTAM-VH 및 TA-분할-DOTAM-VL 항체는 고정된 항-hFab를 사용하여 칩에 먼저 포획되었고, 이어서 DOTAM-모노스트렙타비딘 복합체의 결합(DOTAM +모노스트렙타비딘 커플링 600nM, 1:1 mol, RT에서 1h)을 평가했다.

HBS-P+ 중의 전구약물_A 또는 전구약물 B의 600nM 용액을 항 hFab(GE Healthcare, BR-1008-27) CM5 칩 표면에 주사했다(10μl/분, 120초). 전구약물 A 또는 B 용액의 고밀도 포획 후 DOTAM-모노스트렙타비딘 복합체를 주사하였다(20μl/분, 90초). 20 μl/분의 유속으로 180초 동안 해리를 모니터링하였다. 새로운 주기를 위해 표면은 Glycin 2.1을 사용하고 10μl/분으로 75초의 재생 시간을 사용하여 재생되었다. 상대 최대 반응 결정은 T200 평가 소프트웨어를 사용하여 평가되었다.

결과를 도 27에 나타낸다. 낮은 백분율의 최대 반응(도면에서 *로 표시됨)은 "흔적" 또는 DOTAM-SA와의 비특이적 상호 작용으로 간주되며, 분석을 최적화해야 할 필요성을 반영한다.

3. 세 번째 실험에서, DOTAM에 대한 TA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍의 결합을 참조 항체와 비교하여 평가한다. 고정화된 항-hFab를 사용하여 항체를 먼저 칩에 포획한 다음, DOTAM-모노스트렙타비딘 복합체의 결합(DOTAM +모노스트렙타비딘 커플링 600nM, 1:1 mol, RT에서 1h)을 평가했다.

HBS-P+ 중의 전구약물_A 및 전구약물 B의 300nM 용액을 항 hFab(GE Healthcare, BR-1008-27) CM5 칩 표면에 주사했다(10μl/분, 120초). 전구약물 A 및 B 용액의 고밀도 포획 후 DOTAM-모노스트렙타비딘 복합체를 주사하였다(20μl/분, 90초). 20 μl/분의 유속으로 180초 동안 해리를 모니터링하였다. 새로운 주기를 위해 표면은 Glycin 2.1을 사용하고 10μl/분으로 75초의 재생 시간을 사용하여 재생되었다. 상대 최대 반응 결정은 T200 평가 소프트웨어를 사용하여 평가되었다.

결과를 도 28에 나타낸다. 모든 TA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍은 DOTA 결합제인 P6_AB(P1AF0712/P1AF0713) 쌍을 제외하고 DOTAM에 대해 상당한 양의 결합을 보였다.

TA-분할-DOTAM-VH/VL 쌍에 대한 상당한 양의 DOTAM 결합을 나타내는 유사한 결과가 FAP-결합제 P1AF8286 및 P1AF8287에 대해서도 얻어졌다. P1AF8286은 서열번호 108의 제1 중쇄, 서열번호 109의 제2 중쇄 및 서열번호 111의 경쇄로 구성되고, P1AF8287은 서열번호 108의 제1 중쇄, 서열번호 110의 제2 중쇄 및 서열번호 111의 경쇄로 구성된다. 그러나 이 분석은 여전히 최적화되어야 한다.

실시예 9

재료 및 방법

일반

모든 실험 프로토콜은 지방 당국(Comit

R

gional d'Ethique de l'Exp

rimentation Animale du Limousin [CREEAL], Laboratoire D

Corning®Matrigel® 기저막 매트릭스(성장 인자 감소; 카탈로그 번호 354230)와 1:1 혼합된 세포 배양 배지에서 CEA-발현 종양 세포의 피하(SC) 주사에 의해 고체 이종 이식편을 안정화시켰다. 종양 부피는 매주 3회 수동 캘리퍼링을 통해 추정되었으며 다음 공식에 따라 계산되었다: 부피 = 0.5 × 길이 × 너비 ² . 종양 성장 속도에 따라 필요에 따라 추가 종양 측정을 수행했다.

종양 부담, 주사 부작용 또는 기타 원인으로 인해 참을 수 없는 고통이나 통증의 징후를 보이는 경우 예정된 종점 이전에 마우스를 안락사시켰다. 통증, 고통 또는 불편함의 징후에는 급성 체중(BW) 감소, 지저분한 털, 설사, 구부러진 자세 및 무기력이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 즉시 안락사에 관한 일반적인 기준은 초기 BW의 20%를 초과하는 BW 감소 또는 3000 mm³에 달하는 종양 부피이다. 처치된 동물의 BW는 주당 3회 측정되었으며, 건강 상태에 따라 필요에 따라 추가 측정되었다. 윤리적 이유로 안락사에 고려된 다른 요인들은 종양 상태(예를 들어, 괴사 부위, 혈액/체액 누출, 자기상해 징후) 및 전반적인 동물의 모습(예를 들어, 털, 자세, 움직임)이었다.

안락사 시점에 마취된 마우스에서 후안와 채혈을 사용하여 정맥동으로부터 혈액을 수집한 다음, 자궁경부 탈구로 종료 후 방사능 측정 및 조직학적 분석을 위한 추가 조직 수확을 수행했다. 예기치 않은 또는 비정상적인 병태들을 문서화하였다. 체내분포 분석을 위해 수집된 장기 및 조직들을 계량하고 2470 WIZARD² 자동 감마 계수기(PerkinElmer)를 사용하여 방사능에 대해 측정한 다음, 조직 그램에 대한 주사한 용량 백분율(% ID/g)을 계산하였으며 붕괴 및 배경에 대한 보정을 포함하였다.

GraphPad Prism 7(GraphPad Software, Inc.)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다.

테스트 화합물

P1AF6241, P1AF6239, P1AF7887, 및 P1AF7889는 CEA의 CH1A1A 에피토프를 표적화하는 N-말단 CEA-분할-DOTAM-VH/VL 항체들이다. P1AF6241 및 P1AF6239는 CEA에 대해 1가인 반면, P1AF7887 및 P1AF7889는 CEA에 대해 2가이다. 이들의 서열은 아래와 같다.

모든 항체 구조체들은 주사 당일까지 -80°C에서 보관되었으며, 주사 당일에 정맥내(IV) 투여를 위해 이들을 해동시켜 표준 비히클 완충액(20mM 히스티딘, 140mM NaCl; pH 6.0) 또는 0.9% NaCl에서 각각의 최종 농도까지 희석시켰다.

s, 프랑스)에서 방사성 표지를 수행하기 전 -20°C에서 유지시켰다.

²¹²Pb-DOTAM(RO7205834)은 토륨 발생장치로부터 DOTAM으로 용출하여 생성한 다음, 표지한 후 Ca로 퀀칭하였다. ²¹²Pb-DOTAM 용액을 0.9% NaCl로 희석시켜 IV 주사에 바람직한 ²¹²Pb 활성 농도를 얻었다.

종양 모델

BxPC3은 자연적으로 CEA를 발현하는 인간 원발성 췌장 선암종 세포주이다. 세포는 유럽 세포 배양 은행(European Collection of Authenticated Cell Cultures, 영국 솔즈베리))에 의해 공급되었으며 10% 소 태아 혈청(GE Healthcare Hyclone SH30088.03)이 보충된 RPMI 1640 배지, GlutaMAX™보충제, HEPES (Gibco, 참조 번호 72400-021)에서 배양되었다. Corning®Matrigel® 기저막 매트릭스(성장 인자 감소; 카탈로그 번호 354230)와 1:1 혼합된 RPMI 배지의 세포들을 0 연구일에 오른쪽 옆구리에 피하주사 하여 각 SCID 마우스에 고체 이종 이식편을 안정화시켰다. 마우스당 5x10⁶개의 BxPC3 세포를 100μL의 주사량으로 주사했다.

연구

프로토콜 193

프로토콜 193의 목적은 N-말단 SPLIT 구조체들을 사용하여 2단계 PRIT 후 SC BxPC3 종양을 보유하는 SCID 마우스에서 사전표적화된 ²¹²Pb-DOTAM의 체내분포 데이터를 제공하는 것이었다.

2단계 PRIT는 CEA-분할-DOTAM-VH 및 CEA-분할-DOTAM-VL을 공동 주사하고, 7일 후 ²¹²Pb-DOTAM을 주사하여 수행했다. 방사성물질 주사 6시간 후 마우스를 희생시키고 방사능 측정을 위해 혈액 및 장기를 수확하였다.

연구 개요는 도 30에 나타낸다.

연구 설계

프로토콜 193의 시간 경과 및 설계를 아래 표에 나타낸다.

프로토콜 193의 시간 경과

프로토콜 193의 연구 그룹

각 SCID 마우스에서 연구 0일차에 오른쪽 옆구리에 RPMI/Matrigel의 5x10⁶개 세포(계대 28)를 SC 주사하여 고체 이종이식편을 안정화시켰다. 종양 세포 주사 15일 후, 마우스를 평균 종양 부피가 272 mm³인 실험그룹들로 분류하였다. ²¹²Pb-DOTAM은 접종 후 22일차에 주사되었으며, 이 때 평균 종양 부피는 400mm³였다.

²¹²Pb-DOTAM 주사 6시간 후 마우스 모두를 희생시키고 부검하여, 다음과 같은 장기 및 조직들을 방사능 함량 측정을 위해 수확하였다: 혈액, 피부, 난소, 위, 소장, 결장, 비장, 췌장, 신장, 간, 폐, 심장, 대퇴골, 근육, 뇌, 꼬리 및 종양.

결과

주사 6시간 후 수집된 모든 조직의 평균²¹²Pb 축적 및 제거율이 도 31에 제시되어 있다. CEA 1가 N-말단 SPLIT(P1AF6241 + P1AF6239)로 사전표적화 시 평균 종양 흡수는 24.3 ± 5.4% ID/g 이었다. CEA 2가 N-말단 SPLIT(P1AF7887 + P1AF7889)는 평균 종양 흡수가 7.1 ± 2.2% ID/g이었다. Sidak의 다중 비교 검정을 사용한 이원 분산 분석(ANOVA) 결과 종양 ²¹²Pb 축적의 차이는 상기 처리에 대해 통계적으로 유의미한 것으로 나타났다(p < 0.0001). 조직 축적의 다른 차이는 본 검정을 사용하여 통계적으로 유의하지 않았으며(p = 0.05), 두 SPLIT 쌍에 대해 예기치 않은 흡수가 관찰되지 않았다. 신장에서의 흡수는 두 치료 그룹에서 2.7-3.8% ID/g였다.

이상 반응 및 독성

본 연구와 관련된 이상 반응 또는 독성은 없었다.

결론

연구 결과는 N-말단 SPLIT 구조체를 사용하여 CA-독립적인 2단계 사전표적화의 개념 증명을 입증했다. ²¹²Pb-DOTAM의 높고 특이적인 종양 흡수가 달성되었으며, 정상 조직에서는 방사능이 거의 축적되지 않았다.

이해를 명확히 하기 위해 예시 및 실시예를 예로 들어 전술한 발명들을 상세히 설명하였으나, 이러한 예시 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 내용은 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG (except US) Hoffmann-La Roche Inc. (US only) <120> SPLIT ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> 007844962 <140> PCT/EP2022/050359 <141> 2022-01-10 <150> EP 21151245.4 <151> 2021-01-12 <160> 153 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 1 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 2 Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 3 Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 4 Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 5 Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic 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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu 465 470 475 480 Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe 485 490 495 Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 500 505 510 Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr 515 520 525 Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 530 535 540 Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala 545 550 555 560 Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr 565 570 575 Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 580 585 590 <210> 153 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 153 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp 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Tyr Tyr 515 520 525 Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 530 535 540 Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala 545 550 555 560 Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr 565 570 575 Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 580 585 590 Ser Thr

Claims

항체 세트로서, 다음을 포함하고:
i) 다음을 포함하는 제1 항체:
a) 표적 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티;
b) 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 항체 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드; 및
c) 2개의 서브유닛을 포함하는 Fc 도메인,
이 때 (b)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (a)의 항원 결합 모이어티의 C-말단에 그리고 그 C-말단에 의해 (c)의 Fc 도메인의 서브유닛들 중 하나의 N-말단에 융합되며;
그리고 이 때 이러한 제1 항체는 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인을 포함하지 않고; 및
ii) 다음을 포함하는 제2 항체:
d) 표적 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티;
e) 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드; 및
f) 2개의 서브유닛을 포함하는 Fc 도메인,
이 때 (e)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (d)의 항원 결합 모이어티의 C-말단에 그리고 그 C-말단에 의해 (f)의 Fc 도메인의 서브유닛들 중 하나의 N-말단에 융합되며;
그리고 이 때 이러한 제2 항체는 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하지 않으며;
상기 제1 항체의 VH 도메인 및 상기 제2 항체의 VL 도메인은 함께 이펙터 모이어티에 대한 기능적 항원 결합 부위를 형성할 수 있는, 항체 세트
1항에 있어서, (a)의 항원 결합 모이어티 및 (d)의 항원 결합 모이어티가 Fab인, 항체 세트.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 및 제2 항체는 1-팔 항체인, 항체 세트.
제3항에 있어서, 제1 항체 및 제2 항체는 표적 항원에 대해 단일특이성이고 1가인, 항체 세트.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 항체는 다음 폴리펩티드를 포함하고:
i) N-말단으로부터 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인; 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 폴리펩티드;
ii) Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL); 및
iii) Fc 서브유닛 폴리펩티드(예를 들어, CH2-CH3);
이 때 (i)의 Fab 중쇄 및 (ii)의 Fab 경쇄는 표적 항원에 결합할 수 있는 Fab 단편을 형성하고; 및
제2 항체는 다음 폴리펩티드를 포함하고:
iv) N-말단으로부터 C-말단으로: Fab 중쇄(예를 들어, VH-CH1); 선택적 링커; 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인; 선택적 링커; 및 Fc 서브유닛(예를 들어, CH2-CH3)을 포함하는 폴리펩티드;
v) Fab 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, VL-CL); 및
vi) Fc 서브유닛 폴리펩티드(예를 들어, CH2-CH3);
이 때 (iv)의 Fab 중쇄 및 (v)의 Fab 경쇄는 표적 항원에 결합할 수 있는 Fab 단편을 형성하는, 항체 세트.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 항체는 표적 항원에 결합하는 추가 항원 결합 모이어티를 포함하는, 항체 세트.
제6항에 있어서, 제1 항체의 추가 항체 모이어티는 (a)의 항원 결합 모이어티와 동일한 표적 항원에 결합하는, 항체 세트.
제1항, 제2항, 제6항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 표적 항원에 결합하는 추가 항원 결합 모이어티를 포함하는, 항체 세트.
제8항에 있어서, 제2 항체의 추가 항원 결합 모이어티는 (d)의 항원 결합 모이어티와 동일한 표적 항원에 결합하는, 항체 세트.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 항체는 다음을 포함하고:
a) 표적 세포의 표면에 발현된 항원에 결합하는 제1 Fab 단편;
b) 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 항체 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드; 및
c) 제1 및 제2 서브유닛을 포함하는 Fc 도메인,
이 때 (b)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (a)의 Fab 단편의 사슬들 중 하나의 C-말단에 그리고 그 C-말단에 의해 (c)의 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되고;
그리고 표적 세포의 표면 상에 발현된 항원에 결합하는 제2 Fab 단편을 추가로 포함하며, 이 때 제2 Fab는 그 사슬들 중 하나의 C-말단에 의해 (c)의 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되고;
제2 항체는 다음을 포함하며:
d) 표적 세포의 표면에 발현된 항원에 결합하는 제1 Fab 단편;
e) 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 항체 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드; 및
f) 제1 및 제2 서브유닛을 포함하는 Fc 도메인,
이 때 (e)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (d)의 Fab 단편의 사슬들 중 하나의 C-말단에 그리고 그 C-말단에 의해 (f)의 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되고;
그리고 표적 세포의 표면 상에 발현된 항원에 결합하는 제2 Fab 단편을 추가로 포함하며, 이 때 제2 Fab는 그 사슬들 중 하나의 C-말단에 의해 (f)의 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되고;
이러한 제2 항체는 이펙터 모이어티에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인을 포함하지 않으며; 그리고
상기 제1 항체의 VH 도메인 및 상기 제2 항체의 VL 도메인은 함께 이펙터 모이어티에 대한 기능적 항원 결합 부위를 형성할 수 있는, 항체 세트.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인은 IgG Fc 도메인인, 항체 세트.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 Fc 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하도록 조작된, 항체 세트.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 항체에서 (b)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (a)의 Fab 단편의 사슬들 중 하나의 C-말단에 링커를 통해 융합되고 그 C-말단에 의해 (c)의 Fc 도메인의 서브유닛들 중 하나의 N-말단에 링커를 통해 융합되며; 그리고
제2 항체에서 (e)의 폴리펩티드는 그 N-말단에 의해 (d)의 Fab 단편의 사슬들 중 하나의 C-말단에 링커를 통해 융합되고 그 C-말단에 의해 (f)의 Fc 도메인의 서브유닛들 중 하나의 N-말단에 링커를 통해 융합되는, 항체 세트.
제13항에 있어서, 링커는 10 내지 70개, 10 내지 60개, 10 내지 50개 아미노산 또는 15 내지 30개 아미노산의 가요성 링커인, 항체 세트.
제13항에 있어서, 링커는 Gly 및 Ser으로부터 선택된 15 내지 30개의 연속 잔기, 선택적으로 Gly 및 Ser으로부터 선택된 15 내지 25개의 연속 잔기, 선택적으로 Gly 및 Ser으로부터 선택된 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 연속 잔기를 포함하는 가요성 링커인, 항체 세트.
제15항에 있어서, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG(서열번호 148) 또는 GGGGSGGGGGSGGGGSGGSGGS(서열번호 149) 또는 GGGGSGGGGGSGGGGSGGSGGG(서열번호 150), 선택적으로 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG(서열번호 148) 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGSGGG(서열번호 150)이거나 이를 포함하는, 항체 세트.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 모이어티는 약물, 세포독소, 이미징제 또는 방사성 표지 화합물로부터 선택되는, 항체 세트.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 모이어티는 방사성 표지 화합물인, 항체 세트.
제18항에 있어서, 방사성 표지 화합물은 방사성 표지 DOTA 또는 이의 염 또는 기능적 변이체를 포함하는, 항체 세트.
제19항에 있어서, 방사성 표지 화합물은 Lu 또는 Y 방사성 동위원소로 방사성 표지된 DOTA 또는 이의 염 또는 기능적 변이체인, 항체 세트.
제19항 또는 제20항에 있어서, 방사성 표지 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 (a) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 항체 세트.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성 표지 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열, 또는 서열번호 41에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는, 항체 세트.
제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성 표지 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은 (d) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는, 항체 세트.
제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성 표지 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은 서열번호 42의 아미노산 서열, 또는 서열번호 42에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는, 항체 세트.
제18항에 있어서, 방사성 표지 화합물은 Pb-DOTAM을 포함하는, 항체 세트.
제25항에 있어서, Pb-DOTAM에 대한 기능적 결합 부위는 100pM, 50pM, 20pM, 10pM, 5pM, 1pM 이하, 예를 들어, 0.9pM 이하, 0.8pM 이하, 0.7pM 이하, 0.6pM 이하 또는 0.5pM 이하의 결합 친화도의 K_D값으로 결합하는, 항체 세트.
제25항 또는 제26항에 있어서, Pb-DOTAM에 대한 기능적 결합 부위는 Pb-DOTAM 및 Bi-DOTAM에 결합하는, 항체 세트.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성 표지 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 다음을 포함하는, 항체 세트:
a) 아미노산 서열 FIGSRGDTYYASWAKG(서열번호 2), 또는 서열번호 2에서 최대 1, 2 또는 3개의 치환(이 때 이러한 치환은 Phe50, Asp56 및/또는 Tyr58을 포함하지 않으며, 그리고 선택적으로 Gly52 및/또는 Arg54도 포함하지 않음)을 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR2;
b) 아미노산 서열 ERDPYGGGAYPPHL(서열번호 3), 또는 서열번호 3에서 최대 1, 2 또는 3개의 치환(이 때 이러한 치환은 Glu95, Arg96, Asp97, Pro98을 포함하지 않고, 그리고 선택적으로 Ala100C, Tyr100D 및/또는 Pro100E도 포함하지 않고/않거나 선택적으로 Tyr99도 포함하지 않음)을 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR3;
및, 선택적으로 다음과 같은, 중쇄 CDR1:
c) 아미노산 서열 GFSLSTYSMS(서열번호 1) 또는 서열번호 1에서 최대 1, 2 또는 3개의 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 CDR1.
제28항에 있어서, 방사성 표지 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 (a) GFSLSTYSMS(서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) FIGSRGDTYYASWAKG(서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) ERDPYGGGAYPPHL(서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 항체 세트.
제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성 표지 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VH 도메인은 서열번호 7 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 7 또는 서열번호 9에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는, 항체 세트.
제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성 표지 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은 다음을 포함하는, 항체 세트:
d) 아미노산 서열 QSSHSVYSDNDLA(서열번호 4) 또는 서열번호 4에서 최대 1, 2 또는 3개의 치환(이 때 이러한 치환은 Tyr28 및 Asp32를 포함하지 않음)을 갖는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR1;
e) 아미노산 서열 LGGYDDESDTYG(서열번호 6) 또는 서열번호 6에서 최대 1, 2 또는 3개의 치환(이 때 이러한 치환은 Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c 및 Tyr96을 포함하지 않음)을 갖는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR3;
및, 선택적으로 다음과 같은, 경쇄 CDR2:
f) 아미노산 서열 QASKLAS(서열번호 5) 또는 서열번호 5에서 적어도 1, 2 또는 3개의 치환을 갖고 선택적으로 Gln50을 포함하지 않는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 CDR2.
제31항에 있어서, 방사성 표지 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은 (d) QSSHSVYSDNDLA(서열번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) QASKLAS(서열번호 5)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) LGGYDDESDTYG(서열번호 6)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는, 항체 세트.
제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성 표지 화합물에 대한 항원 결합 부위의 VL 도메인은 서열번호 8의 아미노산 서열, 또는 서열번호 8에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는, 항체 세트.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 항체가 동일한 표적 항원에 결합하는, 항체 세트.
제34항에 있어서, 제1 및 제2 항체가 동일한 표적 항원의 동일한 에피토프에 결합하는, 항체 세트.
제34항에 있어서, 제1 및 제2 항체가 동일한 표적 항원의 상이한 에피토프에 결합하는, 항체 세트.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 항원은 종양 관련 항원인, 항체 세트.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 항원은 암배아 항원(CEA), CD20, HER2, EGP-1(상피 당단백질-1, 영양막-2로도 알려져 있음), 결장 특이적 항원-p(CSAp), 췌장 점액 MUC1, GPRC5D 및 FAP로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 세트.
전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 항원은 CEA, GPRC5D 및 FAP로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 세트.
제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 항원은 CEA인, 항체 세트.
제40항에 있어서, 제1 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고 이는 다음을 포함하는, 항체 세트:
(a) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
제40항 또는 제41항에 있어서, 제1 항체는 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 25에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하는, 항체 세트.
제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항체는 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 26에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하는, 항체 세트.
제40항에 있어서, 제1 항체는 (a) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는, 항체 세트.
제40항 또는 제44항에 있어서, 제1 항체는 서열번호 49로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 49에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하는, 항체 세트.
제40항, 제44항 또는 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항체는 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 50에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하는, 항체 세트.
제40항에 있어서, 제1 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고 이는 다음을 포함하는, 항체 세트:
(a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
제40항 또는 제47항에 있어서, 제1 항체는 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 17에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하는, 항체 세트.
제40항, 제47항 또는 제48항에 있어서, 제1 항체는 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 18에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하는, 항체 세트.
제40항에 있어서, 제1 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고 이는 다음을 포함하는, 항체 세트:
(a) 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
제40항 또는 제50항에 있어서, 제1 항체는 서열번호 65로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 65에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하는, 항체 세트.
제40항, 제50항 또는 제51항에 있어서, 제1 항체는 서열번호 66으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 66에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL 서열을 포함하는, CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하는, 항체 세트.
제40항에 있어서, 제1 항체는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 117 또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 120, 121 또는 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 123, 124 또는 125의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는, 항체 세트.
제40항 또는 제53항에 있어서, 제1 항체는 서열번호 129, 130, 131, 132, 133 또는 134로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 135, 136, 137, 138, 139 또는 140으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는, 항체 세트.
제40항, 제53항 또는 제54항에 있어서, 제1 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고 이는 다음을 포함하는, 항체 세트:
(a) 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(f) 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
제40항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고 이는 다음을 포함하는, 항체 세트:
(a) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고 이는 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 25에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH 서열을 포함하는, 항체 세트.
제40항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고 이는 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 26에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL 서열을 포함하는, 항체 세트.
제40항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고 이는 (a) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 세트.
제40항 내지 제55항 또는 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고, 이는 서열번호 49로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 49에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH 서열을 포함하는, 항체 세트.
제40항 내지 제55항, 제59항 또는 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고, 이는 서열번호 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 50에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL 서열을 포함하는, 항체 세트.
제40항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고 이는 다음을 포함하는, 항체 세트:
(a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
제40항 내지 제55항 또는 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고, 이는 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 17에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH 서열을 포함하는, 항체 세트.
제40항 내지 제55항, 제62항 또는 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고, 이는 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 18에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL 서열을 포함하는, 항체 세트.
제40항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고 이는 다음을 포함하는, 항체 세트:
(a) 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
제40항 내지 제55항 또는 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고, 이는 서열번호 65로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 65에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH 서열을 포함하는, 항체 세트.
제40항 내지 제55항, 제65항 또는 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 CEA에 대한 항원 결합 부위를 포함하고, 이는 서열번호 66으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 66에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL 서열을 포함하는, 항체 세트.
제40항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고, 이는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열번호 117 또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (d) 서열번호 120, 121 또는 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열번호 123, 124 또는 125의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 세트.
제40항 내지 제55항 또는 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고, 이는 서열번호 129, 130, 131, 132, 133 또는 134로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열번호 135, 136, 137, 138, 139 또는 140으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이에 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 항체 세트.
제40항 내지 제55항, 제68항 또는 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고 이는 다음을 포함하는, 항체 세트:
(a) 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(b) 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(c) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(d) 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(e) 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(f) 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인, 또는
(g) 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인.
제40항에 있어서, 제1 항체는 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항의 항체이고 제2 항체는 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항의 항체인, 항체 세트.
제71항에 있어서, 제1 및 제2 항체는 CEA에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하고, 이는 서열번호 26에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 25에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체 세트.
제71항 또는 제72항에 있어서, 제1 항체 및 제2 항체는 표적 항원에 대해 단일특이성이고 1가인, 항체 세트.
제73항에 있어서, 제1 및 제2 항체 각각은 CEA에 결합하는 2개의 항원 결합 부위를 포함하고, 이는 서열번호 26에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열번호 25에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 항체 세트.
제1항 또는 제72항에 있어서,
제1 항체는 서열번호 146의 제1 중쇄; 서열번호 144의 제2 중쇄; 및 서열번호 143의 경쇄를 포함하고; 및/또는
제2 항체는 서열번호 145의 제1 중쇄; 서열번호 144의 제2 중쇄; 및 서열번호 143의 경쇄를 포함하는, 항체 세트.
제1항 또는 제74항에 있어서,
제1 항체는 서열번호 146의 제1 중쇄 폴리펩티드; 서열번호 147의 제2 중쇄 폴리펩티드; 및 서열번호 143의 제1 및 제2 경쇄 폴리펩티드를 포함하고; 및/또는
제2 항체는 서열번호 145의 제1 중쇄 폴리펩티드; 서열번호 147의 제2 중쇄 폴리펩티드; 및 서열번호 143의 제1 및 제2 경쇄 폴리펩티드를 포함하는, 항체 세트.
전술한 청구항 중 어느 한 항의 항체 세트를 발현하는 핵산 세트.
제77항의 핵산 세트를 포함하는 발현 벡터 또는 발현 벡터 세트.
제78항의 발현 벡터 또는 발현 벡터 세트를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 세포 세트.
방사선면역요법을 사전표적화하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는, 방법:
i) 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 항체 세트를 대상체에게 투여하는 단계(이 때, 제1 및 제2 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여되고, 이 때 항체는 표적 항원에 결합하고 표적 항원을 발현하는 세포 표면에 국재화되며; 이 때, 제1 및 제2 항체의 결합은 방사성 표지 화합물에 대한 기능적 결합 부위를 형성하고);
그리고
ii) 후속적으로 방사성 표지 화합물을 투여하는 단계(이 때, 방사성 표지 화합물은 방사성 표지 화합물에 대한 기능적 결합 부위에 결합함).
제80항에 있어서, 상기 방법은 제거제 또는 차단제를 투여하는 단계를 포함하지 않는, 방법.
제80항 또는 제81항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 항원은 암- 또는 종양-관련 항원이고 상기 방법은 종양 또는 암의 방사선면역요법 방법인, 방법.
제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 제80항 내지 제83항 중 어느 한 항의 방사면역요법을 사전표적화하는 방법에 사용하기 위한, 항체 세트.
방사선 촬영을 위해 조직 또는 장기에 방사성동위원소를 표적화하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
i) 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 항체 세트를 대상체에게 투여하는 단계(이 때, 제1 및 제2 항체는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로 투여되고, 이 때 항체는 표적 항원에 결합하고 표적 항원을 발현하는 세포 표면에 국재화되며, 이 때, 제1 및 제2 항체의 결합은 방사성 표지 화합물에 대한 기능적 결합 부위를 형성하고);
그리고
ii) 후속적으로 방사성 표지 화합물을 투여하는 단계(이 때, 방사성 표지 화합물은 방사성 표지 화합물에 대한 기능적 결합 부위에 결합함).
제85항에 있어서, 상기 방법은 제거제 또는 차단제를 투여하는 단계를 포함하지 않는, 방법.
제85항 또는 제86항에 있어서, 상기 방법은 이미징 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제87항에 있어서, 표적 항원은 암 또는 종양 관련 항원이고 상기 방법은 종양 또는 암을 이미징하는 방법인, 방법.