KR20230086796A - 나노섬유를 이용한 세포 배양 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유, 바람직하게는 키틴 또는 키토산 나노섬유를 포함하는 세포 캐리어; 접착성 세포의 i) 부유 배양, ii) 분화 유도, iii) 비동결 상태 하에서의 수송 및 보존, iv) 이식, v) 배양 상청으로부터의 생리 활성 물질의 회수 등과 같은 다양한 조작에서의 공통의 캐리어가 될 수 있는 캐리어; 및 캐리어를 이용함으로써 접착성 세포의 i) 부유 배양, ii) 분화 유도, iii) 비동결 상태 하에서의 수송 및 보존, iv) 이식, 및 v) 배양 상청으로부터의 생리 활성 물질의 회수로부터 선택되는 복수의 조작의 연속적인 실시를 제공한다.

Description

나노섬유를 이용한 세포 배양{CELL CULTURING USING NANOFIBERS}

본 발명은 세포의 배양, 보존, 수송 또는 이식에 있어서의, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유의 캐리어로서의 이용에 관한 것이다.

최근, 재생 의료의 분야에서는, iPS 세포 및 ES 세포 등의 다능성 줄기 세포를 배양하여 목적의 유사 장기 세포(organ cells-like)로의 분화를 유도하고, 얻어지는 세포를 이식하는 것을 포함한 연구가 활발히 실시되고 있다. 그러나, ES 세포의 수립에는 윤리적인 문제가 있고, iPS 세포는 암화(tumorigenicity) 리스크의 문제를 가지고 있다. 또한, iPS 세포로부터, 목적의 장기를 구성하는 세포로의 분화에 대해서는, 최종 분화 유도도가 낮을 수도 있고, 고분화된 세포를 얻기 위해 장기간의 배양이 요구될 수도 있는 것이 보고되어 있으며, 따라서 비용 문제가 부각되어 있다. 그러한 과제를 받아, 암화 리스크가 낮은 간엽계 줄기 세포 및 신경 줄기 세포 등의 체성 줄기 세포, 및 분화 유도 기간을 단축시킬 수 있는 전구 지방 세포 및 전구 심근 세포 등의 전구 세포가 다시 주목받고 있다. 특히, 지방, 연골 등으로 쉽게 분화되는 간엽계 줄기 세포 및 전구 지방 세포는 용이한 입수 가능성의 이점을 가져, 여러 가지 연구에 이용된다.

또한, 체성 줄기 세포 및 전구 세포뿐만 아니라, 조직으로부터 직접 분취되는 초기 배양 세포를 이용하는 요구가 높다. 예를 들면, 인간의 간으로부터 조제된 초기 간세포는 분취 후에 세포용 플레이트에 파종하여 수송하거나, 또는 동결 세포로서 공급한다(stock). 얻어진 세포를 시험에 이용하는 것은, 의약품의 약물 대사의 연구에 크게 기여한다. 또한, 암환자로부터 분리된 암조직을 효소 처리에 의해 소화함으로써 조제된 초기 암세포는, 암연구 뿐만 아니라, 항암제 감수성 시험 등에도 이용되어, 대단히 요구되고 있다.

골수로부터 단리되는 간엽계 줄기 세포뿐만 아니라, 간엽계 줄기 세포는 치수 유래 간엽계 줄기 세포, 지방 흡인 시에 지방 세포와 함께 단리되는 지방 조직 유래 간엽계 줄기 세포 등을 포함한다. 이러한 간엽계 줄기 세포는 샬레 중에서 단층 배양에 의해 용이하게 증식시킬 수 있고, 지방, 연골 및 뼈로 더 분화시킬 수 있다. 또한 최근에는, 이러한 간엽계 줄기 세포가 간, 췌장 등을 구성하는 세포로 분화할 수 있는 것도 밝혀졌다. 또한, 간엽계 줄기 세포로부터 분화된 세포의 이식 뿐만 아니라, 간엽계 줄기 세포 자체의 이식도 검토가 개시되었다. 보다 최근에는, 간엽계 줄기 세포 자체에 의해 세포 밖으로 분비되는 사이토카인 및 엑소좀이 주목을 받고 있어, 간엽계 줄기 세포를 마이크로캐리어에 접착시켜 배양하고, 배양 상청 중에 분비된 생리 활성 물질을 단리하고, 의약품 및 화장품에 응용하는 시도도 검토되고 있다.

전구 지방 세포는 지방 흡인 시에 지방 세포와 함께 단리되는 세포이며, 상기 지방 조직 유래 간엽계 줄기 세포와 같이, 생체로부터 대량으로 용이하게 분취할 수 있다. 전구 지방 세포 또한, 지방 세포뿐만 아니라, 연골 세포 등으로 분화할 수 있는 성질을 가져, 지방 세포 이식뿐만 아니라, 관절 연골 이식에 대한 응용도 검토되고 있다. 또한, 지방 세포의 배양 상청은 피부에 대한 보호 효과를 갖는 성분을 포함하고 있는 것이 보고되어 있고, 배양 상청으로부터 단리된 생리 활성 물질의 의약품 및 화장품에 대한 이용도 검토되고 있다. 지방 세포는 저증식능이기 때문에 암이 되기 어렵고, 피하 조직 등의 이식이 용이한 부위에 유리하게 이식할 수 있다. 따라서, 정상적인 유전자가 도입된 지방 세포를 유전자 변이 환자에게 피하 이식함으로써, 유전자 변이에 의해 야기된 질환을 치료할 수 있다.

이러한 상황 아래, 간엽계 줄기 세포 및 전구 지방 세포에 대한 연구, 치료를 위한 세포 이식의 응용, 세포의 배양 상청으로부터의 생리 활성 물질의 단리 등을 실시하는 경우에, 각 단계에서 여러 가지 과제가 존재한다. 현재, 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포 등은 일반적으로 하나의 개체로부터 대량으로 조제되어 동결되고, 동결 보존된 세포는 여러 가지 목적으로 이용된다. 그러나, 자가 이식 시스템을 운영하며 다수의 동종이계 세포 스톡을 관리 및 보관하는, 장래에 기대되는 세포 뱅크 시스템에서는, 세포의 동결을 전제로 하는 현재의 수송 기술에 의한 이식에 적합한 상태의 세포를 대량으로, 안정적으로 공급하는 것이 어렵다. 즉, 이식을 위해서는, 동결 보존된 세포를 융해시켜 배양하고, 필요에 따라서 목적의 세포로 분화시킬 필요가 있으며, 양호한 상태의 세포를 대량으로 제공할 필요가 있다. 세포를 동결한 상태로 수송해야 하는 경우, 이식 시설은 세포를 보존 및 관리하는 세포 뱅크로부터 동결 세포를 얻고, 시설 자체에서 대량 배양을 행해야 한다. 이 때문에, 이식 시설이 대량의 세포 배양 설비(예를 들면, 셀 프로세싱 센터(CPC))를 가질 필요가 있고, 설비를 가지지 않은 시설에서는 이식 치료가 어려워진다. 한편, 세포 뱅크는 일반적으로 세포의 대량 배양을 위한 기술 및 설비를 갖고 있다. 세포 뱅크측에서 이식에 적합한 양호한 상태의 세포를 대량으로 조제하여, 얻어진 세포를 양호한 상태를 유지하면서 이식 시설에 신속하게 공급할 수 있으면, 세포의 대량 배양 설비를 가지지 않은 시설에서도 이식 치료를 행할 수 있다. 이 과제를 해결하기 위해, 대량의 세포를 동결시키지 않고 양호한 상태를 유지하면서 수송하기 위한 기술이 필수적이다.

간엽계 줄기 세포 등을 마이크로캐리어에 접착되어 있는 상태로 배양 및 증식시키고, 얻어진 세포를 이식하고, 배양 상청으로 방출된 생리 활성 물질을 회수하기 위한 기술이 연구되고 있다. 그러나, 현재 입수 가능한 마이크로캐리어는 정치 상태에서 배지 중에 침전물을 형성하여, 배양 시에 교반해야 한다. 교반 시에 캐리어 사이의 충돌에 의해 세포사가 발생하는 문제가 지적되고 있다. 또한, 마이크로캐리어로부터 세포를 회수할 때에는, 트립신 등의 단백질 분해 효소를 이용하여 세포 사이 및 세포와 기재 사이의 접착을 풀어야 한다. 단백질 분해 효소에 의한 세포 손상 및 생존 저하도 과제이다. 또한, 일반적으로 입수 가능한 마이크로캐리어는 생분해성이 아니기 때문에, 배양된 세포를 이식에 적용하기 위해서는, 마이크로캐리어로부터 박리하여 회수해야 한다. 또한, 필요에 따라서 세포를 다른 생분해성 캐리어에 의해 유지해야 한다. 이러한 세포 처리는 복잡하며, 많은 비용이 든다.

본 발명자들은 물에서의 분산성을 향상시킨 다당류 등의 나노섬유를 이용함으로써 동식물 세포 및/또는 조직을 부유 상태로 배양하기 위한 배지 조성물을 개발했다(특허문헌 1).

WO 2015/111686 A1

본 발명은 비동결 조건 하에서 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포 등의 대량의 접착성 세포를, 양호한 상태를 유지하면서 수송하기 위한 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 교반 시의 마이크로캐리어의 충돌에 의한 세포사, 계대 시의 단백질 분해 효소 처리에 의한 세포 손상, 마이크로캐리어 상의 세포에 이식 등을 실시하기 위해 필요한 복잡한 세포 처리 등의, 종래의 마이크로캐리어를 이용한 접착성 세포의 부유 배양에 있어서의 여러 가지 과제를 해결할 수 있는 새로운 캐리어를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 열심히 연구를 실시하여, 배지에 불용성이며, 배지에서 부유하고, 세포를 접착시키는 활성을 가지며, 생분해성이고, 단백질 분해 효소를 필요로 하지 않고 효소 소화될 수 있는, 키틴 등의 다당류로 이루어지는 나노섬유를 캐리어로서 이용함으로써, 상기 여러 가지 과제를 한번에 해결할 수 있는 것을 찾아냈다. 다당류로 이루어지는 나노섬유를 액체 배지 중에서 혼합하고 간엽계 줄기 세포 및 전구 지방 세포 등의 접착성 세포를 나노섬유에 접착되어 있는 상태로 배양함으로써, 세포를 정치 상태로 부유 배양할 수 있었다. 부유 배양 조건 하에서 나노섬유에 접착된 세포는 장기간의 생존성을 나타냈다. 간엽계 줄기 세포 및 전구 지방 세포는 그 형질을 유지하면서 나노섬유 상에서 양호하게 증식했다. 분화 유도 배지에서 배양하는 경우, 나노섬유 상에 접착된 전구 지방 세포는 지방 세포로 분화된다. 따라서, 나노섬유 상의 세포가 분화 유도될 수 있는 것 또한 찾아냈다. 나노섬유 상에 접착된 세포를, 나노섬유를 구성하는 다당류(예를 들어, 키틴)의 분해 효소로 처리함으로써, 단백질 분해 효소를 이용하는 일 없이, 세포에 대한 손상을 최소화하면서 회수할 수 있었다. 다당류로 이루어지는 나노섬유는 생분해성이므로, 나노섬유에 접착되어 계속 접착 상태인 세포를, 나노섬유와 함께, 이식하기 쉬운 시트형으로 형성할 수 있었다. 나노섬유에 접착된 세포는 원심분리 조작 등에 의해 용이하게 침전물을 형성하므로, 나노섬유에 접착된 세포의 배양물로부터 배양 상청을 용이하게 회수할 수 있었다. 따라서, 다당류로 이루어지는 나노섬유는 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포, 초기 세포 등을 위해 요구되는, 비동결 조건 하에서의 세포 수송, 배양, 분화 유도, 이식 및 생리 활성 물질 생산을 위한 캐리어로서 유용하고, 이 캐리어를 이용함으로써, 세포 배양, 분화 유도, 세포 수송, 이식 및 생리 활성 물질 생산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 복수의 조작을 연속적으로 행할 수 있는 것을 찾아냈다.

상기 지견에 의거하여, 본 발명자들은 추가적인 연구를 실시하여 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 이하와 같다:

[1] 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유를 포함하는 캐리어로서,

접착성 세포에 이하의 (1) 내지 (3)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2 이상의 처리를 연속적으로 실시하기 위한, 캐리어:

(1) 부유 배양,

(2) 비동결 상태 하에서의 보존 및/또는 수송, 및

(3) 이식.

[2] 부유 배양이 접착성 세포의 유지 또는 증식, 접착성 세포의 분화 유도, 및/또는 접착성 세포에 의한 액성 인자의 생산을 위한 것인, 상기 [1]의 캐리어.

[3] 상기 캐리어가 처리 (1) 내지 (3)을 접착성 세포에 연속적으로 실시하기 위한 것인, 상기 [1] 또는 [2]의 캐리어.

[4] 상기 접착성 세포가 줄기 세포 또는 전구 세포인, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 캐리어.

[5] 상기 접착성 세포가 간엽계 줄기 세포 또는 전구 지방 세포인, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 캐리어.

[6] 상기 비수용성 다당류가 키틴 또는 키토산인, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 캐리어.

[7] 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 접착성 세포에 이하의 (1) 내지 (3)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2 이상의 처리를 연속적으로 실시하는 것을 포함하는, 접착성 세포의 처리 방법:

(1) 부유 배양,

(2) 비동결 상태 하에서의 보존 및/또는 수송, 및

(3) 이식.

[8] 상기 부유 배양이 접착성 세포의 유지 또는 증식, 접착성 세포의 분화 유도, 및/또는 접착성 세포에 의한 액성 인자의 생산을 위한 것인, 상기 [7]의 방법.

[9] 상기 접착성 세포에 처리 (1) 내지 (3)이 연속적으로 실시되는, 상기 [7] 또는 [8]의 방법.

[10] 상기 접착성 세포가 줄기 세포 또는 전구 세포인, 상기 [7] 내지 [9] 중 어느 하나의 방법.

[11] 상기 접착성 세포가 간엽계 줄기 세포 또는 전구 지방 세포인, 상기 [7] 내지 [9] 중 어느 하나의 방법.

[12] 상기 비수용성 다당류가 키틴 또는 키토산인, 상기 [7] 내지 [11] 중 어느 하나의 방법.

[13] 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착된 접착성 세포를, 비수용성 다당류의 분해 효소로 처리하여 나노섬유를 분해하고, 접착성 세포를 나노섬유로부터 박리하여 접착성 세포를 회수하는 것을 더 포함하는, 상기 [7] 내지 [12] 중 어느 하나의 방법.

[14] 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착된 접착성 세포를 회수하는 방법으로서,

접착성 세포를 비수용성 다당류의 분해 효소로 처리하여 나노섬유를 분해하고, 접착성 세포를 나노섬유로부터 박리하여 접착성 세포를 회수하는 것을 포함하는, 방법.

[15] 상기 비수용성 다당류가 키틴 또는 키토산인, 상기 [14]의 방법.

[16] 상기 분해 효소가 키티나아제, 키토비아제, 키토사나아제 또는 β-1,3-글루카나아제인, 상기 [15]의 방법.

본 발명에 의하면, 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포 등의 접착성 세포를 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로 배양함으로써, 세포의 상해 및 기능 상실을 일으키는 리스크가 있는 진탕, 회전 등의 조작 없이, 정치 상태로 부유 배양할 수 있다. 접착성 세포의 부유 배양(3차원(3D) 배양)이 가능하므로, 단층 배양(2차원(2D) 배양)과 비교하여 보다 적은 양의 배지로, 보다 많은 수의 세포를 배양할 수 있다.

본 발명의 배지 조성물을 이용한 배양에 있어서는, 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포 등의 접착성 세포의 유지 배양을 행할 수 있고, 또는 그 형질을 유지하면서 증식시킬 수도 있다. 또는, 특정 분화 조건 하에서 배양함으로써 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포 등의 미분화 세포를 특정 세포로 분화시킬 수 있다.

본 발명의 배지 조성물을 이용한 배양에 있어서는, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착된 세포의 부유 배양이 행해지므로, 원심분리 조작 등에 의해 나노섬유에 접착된 세포를 용이하게 제거하고, 배양 상청을 회수할 수 있다. 상기와 같이, 단층 배양과 비교하여 부유 배양에서는, 보다 적은 양의 배지로, 보다 많은 수의 세포를 배양할 수 있으므로, 세포에 의해 배양 상청 중에 방출된 유용한 생리 활성 물질을 고농도로 축적시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 배지 조성물은 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포 등의 접착성 세포에 의해 배지 중으로 방출된 유용한 생리 활성 물질을 회수 및 정제하는데 유용하다.

또한, 본 발명의 배지 조성물을 이용한 배양에 있어서는, 나노섬유를 구성하는 다당류(예를 들어, 키틴)의 분해 효소(예를 들어, 키티나아제)로 처리함으로써, 동물 유래의 단백질 분해 효소를 이용하는 일 없이, 나노섬유에 접착된 세포를 회수할 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서는, 단백질 분해 효소에 의한 세포에 대한 손상, 동물 성분에 의한 오염에 기인한 감염의 리스크 등을 최소화하면서, 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포 등의 접착성 세포의 계대 조작을 행하거나, 또는 나노섬유에 접착된 세포를 마이크로캐리어로부터 박리하고 회수할 수 있다.

간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포 등의 접착성 세포는 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로 장기간 양호한 생존성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 배지 조성물은 상기 접착성 세포를 비동결 조건 하에서 보존하고 수송하는데 유용하다. 예를 들면, 플레이트 상에서 세포의 접착 배양을 행하고, 플레이트를 직접 수송하는 경우, 수송 시에 진동에 의해 세포가 플레이트로부터 박리될 수도 있고, 따라서 세포 고유의 기능이 저하될 수도 있다. 그러나, 본 발명의 배지 조성물에 있어서는, 나노섬유에 접착된 세포가 부유된 상태로 유지될 수 있고, 따라서 플레이트로부터 세포가 박리되는, 수송 시의 진동에 의한 세포의 손상 등을 피할 수 있고, 세포 고유의 기능을 유지하면서 비동결 조건 하에서 세포를 보존 및 수송할 수 있다. 또한, 단층 배양 상태의 보존 및 수송과 비교하여 적은 양의 배지 및 스페이스로, 많은 수의 세포를 보존하고 수송할 수 있다.

비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유는 생분해성이므로, 나노섬유에 접착된 세포를 접착 상태에서, 나노섬유와 함께 생체 내에 이식할 수 있다. 따라서, 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포 등의 접착성 세포를 본 발명의 배지 조성물 중에서 배양하고, 원하는 분화 단계까지 분화시켜, 얻어진 세포를 나노섬유로부터 박리 하는 일 없이, 나노섬유와 함께 생체 내에 이식할 수 있다. 따라서, 세포 박리 조작에 의한 세포 손상 및 기능 상실의 리스크를 피할 수 있고, 양호한 상태로 세포를 이식할 수 있다.

따라서, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유는 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포 등의 접착성 세포의 i) 배양, ii) 분화 유도, iii) 비동결 조건 하에서의 수송 및 보존, iv) 이식, v) 배양 상청으로부터의 생리 활성 물질의 회수 등의 여러 가지 조작에 있어서의 공통의 캐리어로서 이용할 수 있다. 따라서, 상기 캐리어를 이용함으로써, 상기 i) 배양, ii) 분화 유도, iii) 비동결 조건 하에서의 수송 및 보존, iv) 이식, v) 배양 상청으로부터의 생리 활성 물질의 회수로부터 선택되는 복수의 조작을 연속적으로 행할 수 있다(도 1).

도 1은, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유를 공통의 캐리어로서 이용함으로써, 접착성 세포에 i) 배양, ii) 분화 유도, iii) 비동결 조건 하에서의 수송 및 보존, iv) 이식, v) 배양 상청으로부터의 생리 활성 물질의 회수 등의 복수의 조작을 연속적으로 실시하는 일 실시형태를 나타내는 모식도이다.
도 2는 Yatalase 처리에 의해 단세포에 분산된 인간 전구 지방 세포의 사진이다.
도 3은 키틴 나노섬유 상에서 37℃ 또는 25℃에서 7일간 유지된 인간 전구 지방 세포의 유주능 및 증식능을 나타낸다.
도 4는 키틴 나노섬유 상에서 37℃ 또는 25℃에서 7일간 유지된 인간 전구 지방 세포로부터 분화된 지방 세포를 나타낸다.
도 5는 키틴 나노섬유 상에서 37℃ 또는 25℃에서 7일간 유지된 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포의 유주능 및 증식능을 나타낸다.
도 6은 키틴 나노섬유 상에서 37℃ 또는 25℃에서 7일간 유지된 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포로부터 분화된 지방 세포를 나타낸다.
도 7은 키틴 나노섬유를 이용한 세포 수송법의 개념도를 나타낸다.
도 8은 키틴 나노섬유 상에서 37℃ 또는 25℃에서 10일간 배양함으로써 제작된 인간 전구 지방 세포 시트의 상태를 나타낸다.

본 발명은 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유의, 접착성 세포에 대한 다양한 배양 방법론에 있어서의 캐리어로서의 이용을 제공한다. 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 접착성 세포에 (1) 부유 배양, (2) 비동결 상태 하에서의 보존 및/또는 수송, (3) 이식 등의 여러 가지 처리를 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명은 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 접착성 세포에 (1) 부유 배양, (2) 비동결 상태 하에서의 보존 및/또는 수송, (3) 이식 등의 처리를 실시하는 것을 포함하는, 접착성 세포의 처리 방법으로서도 파악할 수 있다.

[접착성 세포]

세포는 동물 및 식물을 구성하는 가장 기본적인 단위이며, 이는 그 요소로서, 세포막의 내부에 세포질과 각종 세포 소기관을 갖는다. 이 때, DNA를 내포하는 핵은 세포 내부에 포함되거나 포함되지 않아도 된다.

동물의 예로는 곤충류, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 범갑각류, 6각류, 포유류 등을 들 수 있고, 적합한 것은 포유류이다. 포유류의 예는, 한정되는 것은 아니지만, 래트, 마우스, 토끼, 기니피그, 다람쥐, 햄스터, 들쥐, 오리너구리, 돌고래, 고래, 개, 고양이, 염소, 소, 말, 양, 돼지, 코끼리, 비단마모셋, 다람쥐원숭이, 레서스원숭이, 침팬지, 인간 등을 들 수 있다. 식물은 채취된 세포가 액체 배양에 적용될 수 있으면 특별히 한정되지 않는다. 그 예는, 한정되는 것은 아니지만, 생약류(예를 들면, 사포닌, 알카로이드류, 베르베린, 스코폴린, 식물성 스테롤 등)를 생산하는 식물(예를 들면, 인삼, 페리윙클, 사리풀, 황련, 벨라돈나 등), 화장품 또는 식품의 원료가 되는 색소 또는 다당체(예를 들면, 안토시아닌, 잇꽃 색소, 꼭두서니 색소, 사프란 색소, 플라본류 등)를 생산하는 식물(예를 들면, 블루베리, 잇꽃, 꼭두서니, 사프란 등), 또는 원료 의약품(active pharmaceutical ingredient)을 생산하는 식물 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 포유류의 세포가 바람직하게 이용된다.

본 발명의 일 실시형태에 있어서는, 접착성 세포가 이용된다. 접착성 세포는 생존 및 증식에 용기벽 등의 스캐폴드를 필요로 하는 세포이다. 본 발명에 있어서는, 접착성 세포가 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되므로, 세포의 양호한 부유 배양, 비동결 상태 하에서의 보존 및/또는 수송, 이식 등의 처리가 달성된다.

본 발명에 있어서 이용되는 접착성 세포는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 줄기 세포, 전구 세포, 체성 비줄기 세포(somatic non-stem cell), 초기 배양 세포, 세포주, 암세포 등을 들 수 있다. 줄기 세포는 자기 자신을 복제하는 능력과 다른 복수 계통으로 분화하는 능력을 겸비한 세포이다. 접착성 줄기 세포의 예는, 한정되는 것은 아니지만, 간엽계 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 생식 줄기 세포, 장 줄기 세포, 암 줄기 세포, 모낭 줄기 세포 등의 체성 줄기 세포 등을 들 수 있다. 간엽계 줄기 세포는 골세포, 연골 세포 및 지방 세포 모두 또는 몇개로의 분화능을 갖는 줄기 세포이다. 간엽계 줄기 세포는 골수, 말초 혈액, 제대혈, 지방 조직 등의 조직 중에 저빈도로 존재하고, 이러한 조직으로부터 공지의 방법에 의해 단리할 수 있다. 전구 세포는 상기 줄기 세포로부터 특정 체세포 또는 생식 세포로 분화하는 도중의 단계에 있는 세포이다. 접착성 전구 세포의 예는, 한정되는 것은 아니지만, 전구 지방 세포, 전구 심근 세포, 전구 내피 세포, 신경 전구 세포, 간 전구 세포, 췌장 전구 세포, 신장 전구 세포 등을 들 수 있다. 접착성 체성 비줄기 세포의 예는, 한정되는 것은 아니지만, 섬유아세포, 골세포, 골주피 세포(bone pericyte), 각질 형성 세포, 지방 세포, 간엽 세포, 상피 세포(epithelial cell), 표피 세포(epidermal cell), 내피 세포, 혈관 내피 세포, 간실질 세포, 연골 세포, 난구 세포, 신경계 세포, 신경교세포, 뉴런, 희소돌기교세포, 미세아교세포, 별아교세포, 심장 세포, 식도 세포, 근육 세포(예를 들어, 평활근 세포 또는 골격근 세포), 췌장 베타 세포, 멜라닌 세포 등을 들 수 있다. 초기 배양 세포는 생체로부터의 세포 및 조직의 분리 후, 제1 계대를 행하기 전의 배양 상태에 있는 세포이다. 초기 배양 세포는 임의의 조직, 예를 들면 피부, 신장, 비장, 부신, 간, 폐, 난소, 췌장, 자궁, 위, 결장, 소장, 대장, 방광, 전립선, 고환, 흉선, 근육, 결합 조직, 뼈, 관절, 혈관 조직, 혈액, 심장, 눈, 뇌, 신경 조직 등으로부터 채취된 세포여도 된다. 세포주는 생체 외에서의 인위적인 조작에 의해 무한의 증식능을 획득한 세포이다. 본 발명에 있어서 이용되는 접착성 세포는 바람직하게는 줄기 세포 또는 전구 세포이며, 보다 바람직하게는 간엽계 줄기 세포 또는 전구 지방 세포이다.

[나노섬유]

본 발명에 있어서 이용되는 나노섬유는 액체 배지 중에 분산되고, 나노섬유에 접착된 세포(바람직하게는 접착성 세포)를 액체 배지 중에 부유시키는 효과를 나타낸다.

본 명세서에 있어서, 나노섬유는 평균 섬유 직경(D)이 0.001 내지 1.00μm인 섬유를 말한다. 본 발명에 있어서 이용되는 나노섬유의 평균 섬유 직경은 바람직하게는 0.005 내지 0.50μm, 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.05μm, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.02μm이다.

본 발명에 있어서 이용되는 나노섬유의 어스펙트비(L/D)는 특별히 한정되지 않고, 평균 섬유 길이/평균 섬유 직경으로부터 얻어지며, 통상 2~500, 바람직하게는 5~300, 보다 바람직하게는 10~250이다.

본 명세서에 있어서, 나노섬유의 평균 섬유 직경(D)은 이하와 같이 구한다. 우선, JEOL Ltd. 제조의 이온 클리너(JIC-410)에 의해 3분간, Okenshoji Co., Ltd. 제조의 콜로디온 지지막의 친수화 처리를 행하고, 평가 대상이 되는 나노섬유 분산액(초순수로 희석) 몇방울을 적하 첨가하여, 실온에서 건조시킨다. 이것을 Hitachi, Ltd. 제조의 투과형 전자현미경(TEM, H-8000)(10,000배)에서 가속 전압 200kV로 관찰한다. 얻어진 화상을 이용함으로써, 나노섬유(표본수: 200~250) 하나하나의 섬유 직경을 계측하고, 그 평균을 평균 섬유 직경(D)으로 한다.

또한, 평균 섬유 길이(L)는 이하와 같이 구한다. 평가 대상이 되는 나노섬유 분산액을 순수에 의해 100ppm으로 희석하고, 초음파 세척기를 이용하여 나노섬유를 균일하게 분산시킨다. 미리 농황산으로 표면의 친수화 처리를 실시한 실리콘 웨이퍼 상에 나노섬유 분산액을 캐스팅하고, 110℃에서 1시간 건조시켜, 샘플로서 이용한다. 주사형 전자현미경(SEM, JSM-7400F)(2,000배)에서, 얻어진 샘플을 관찰함으로써 얻어진 화상을 이용하여, 나노섬유(표본수: 150~250) 하나하나의 섬유 길이를 계측하고, 그 평균을 평균 섬유 길이(L)로 한다.

바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명에 있어서 이용되는 나노섬유는, 액체 배지와 혼합했을 때, 1차 섬유 직경을 유지하면서 액체 중에 균일하게 분산되고, 액체의 점도를 실질적으로 증가시키는 일 없이, 나노섬유에 접착된 세포를 실질적으로 유지하며, 그 침전을 방지하는 효과를 나타낸다. 액체의 점도를 실질적으로 증가시키는 일이 없다는 것은 액체의 점도가 8mPa·s를 초과하지 않는 것을 의미한다. 이 때, 액체의 점도(즉, 하기 본 발명의 배지 조성물의 점도)는 8mPa·s 이하, 바람직하게는 4mPa·s 이하, 보다 바람직하게는 2mPa·s 이하이다. 나노섬유를 포함한 액체의 점도는, 예를 들면 25℃ 조건 하에서 음차 진동식 점도계(SV-1A, A&D Company Ltd.)를 이용하여 측정할 수 있다.

본 발명에 있어서 이용되는 나노섬유는 비수용성 다당류로 구성된다. 당류란, 10개 이상의 단당류(예를 들면, 트리오스, 테트로오스, 펜토오스, 헥사오스, 헵토오스 등)가 중합된 글리코폴리머를 의미한다.

비수용성 다당류의 예는, 한정되는 것은 아니지만, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 등의 셀룰로오스류; 키틴, 키토산 등의 키틴질 등을 들 수 있다. 비수용성 다당류는 바람직하게는 키틴 또는 키토산이며, 보다 바람직하게는 키틴이다.

셀룰로오스는 포도당의 6원환인 D-글루코피라노오스가 β-1,4글루코시드 결합된 천연 고분자 화합물이다. 원료로서는, 예를 들면 목재, 대나무, 대마, 황마, 양마, 코튼, 농작물·음식 잔사 등의 식물 유래 셀룰로오스, 또는 박테리아 셀룰로오스, 클라도포라, 글라우코키스티스, 발로니아, 튜니케이트 셀룰로오스 등의 미생물 산생 또는 동물 산생의 셀룰로오스를 이용할 수 있다. 식물 유래 셀룰로오스에 있어서, 마이크로피브릴로 불리는 매우 미세한 섬유가 다발이 되어, 피브릴, 라멜라 및 섬유 세포와 같이 단계적으로 보다 고차의 구조를 형성한다. 또한, 박테리아 셀룰로오스에 있어서는, 박테리아 세포로부터 분비되고 변하지 않는 굵기를 갖는 셀룰로오스 마이크로피브릴이 미세한 그물 구조를 형성한다.

본 발명에 있어서, 코튼, 박테리아 셀룰로오스 등의 고순도의 셀룰로오스 원료는 직접 이용할 수 있다. 그러나, 다른 식물 유래 셀룰로오스 등은 단리 및 정제 후에 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서 바람직하게 이용되는 셀룰로오스로는 코튼 셀룰로오스, 박테리아 셀룰로오스, 크라프트 펄프 셀룰로오스, 결정 셀룰로오스 등을 들 수 있다.

키틴질이란 키틴 및 키토산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 당질을 말한다. 키틴 및 키토산을 구성하는 주요 당 단위는 각각 N-아세틸글루코사민 및 글루코사민이다. 일반적으로, 키틴은 N-아세틸글루코사민 함유량이 높고 산성 수용액에서 난용성이며, 키토산은 글루코사민 함유량이 높고 산성 수용액에서 가용성이다. 편의상, 본 명세서에 있어서는, 키틴은 구성 당 중에 50% 이상의 N-아세틸글루코사민을 함유하고, 키토산은 50% 미만의 N-아세틸글루코사민을 함유한다. 높은 부유 작용을 달성하기 위해, 키틴을 구성하는 당 단위 중의 N-아세틸글루코사민의 비율이 보다 높은 것이 보다 바람직하다. 키틴을 구성하는 당 단위 중의 N-아세틸글루코사민의 비율은 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 100%이다.

키틴의 원료로서는, 예를 들면 새우, 게, 곤충, 조개, 버섯 등의 많은 생물자원을 이용할 수 있다. 본 발명에 이용되는 키틴은 게 껍질, 새우 껍질 등으로부터 유래되는 키틴 등의 α-형태 결정 구조를 갖는 것, 또는 오징어의 뼈로부터 유래되는 키틴 등의 β-형태 결정 구조를 갖는 것이어도 된다. 게 및 새우의 껍데기는 종종 산업 폐기물로 간주되며, 용이하게 입수 가능하고 유효하게 이용되므로 원료로서 바람직하다. 한편, 불순물로서 포함되는 단백질, 미네랄 등의 제거를 위해 단백질 제거 단계 및 탈회 단계가 필요하다. 따라서, 본 발명에 있어서는, 이미 매트릭스 제거 처리가 실시된 정제 키틴을 이용하는 것이 바람직하다. 정제 키틴은 시판되고 있다.

상기 비수용성 다당류를 함유하는 원료를 분쇄함으로써, 비수용성 다당류로 구성되는 나노섬유를 얻을 수 있다. 분쇄 방법은 한정되지 않지만, 본 발명의 목적을 만족하는, 후술하는 섬유 직경 및 섬유 길이까지 미세화하기 위해서는, 매체 교반 밀, 예를 들면 고압 호모지나이저, 그라인더(맷돌), 비드밀 등의 강한 전단력을 얻을 수 있는 방법이 바람직하다.

이들 중에서도, 고압 호모지나이저에 의한 미세화가 바람직하고, 예를 들면 JP-A-2005-270891 또는 JP-B-5232976에 개시된 습식 분쇄법에 의한 미세화(분쇄화)가 바람직하다. 구체적으로는, 원료의 분산액을 한쌍의 노즐로부터 고압으로 각각 분사하고 충돌시킴으로써 원료를 분쇄하고, 그러기 위해서는, 예를 들면 스타 버스트 시스템(Sugino Machine Limited 제조의 고압 분쇄 장치) 또는 나노 베이터(Yoshida Kikai Co., Ltd.의 고압 분쇄 장치)를 이용한다.

상기 고압 호모지나이저에 의한 원료의 미세화(분쇄화)에 있어서, 미세화 및 균질화의 정도는 고압 호모지나이저의 초고압 챔버로 압송하는 압력과, 초고압 챔버에 통과시키는 횟수(처리 횟수) 및 수분산액 중의 원료의 농도에 의존한다. 압송 압력(처리 압력)은 특별히 한정되지 않고, 통상 50~250MPa, 바람직하게는 150~245MPa이다.

미세화 처리 시의 수분산액 중의 원료의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.1질량%~30질량%, 바람직하게는 1질량%~10질량%이다. 미세화(분쇄화)의 처리 횟수는 특별히 한정되지 않지만, 상기 수분산액 중의 원료의 농도에 따라서 상이하다. 원료의 농도가 0.1~1질량%인 경우, 미세화를 위해서는 10~100회의 처리 횟수가 충분하지만, 1~10질량%에서는 약 10~1000회의 처리가 요구되는 경우가 있다.

상기 미세화 처리 시의 수분산액의 점도는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 비수용성 다당류가 α 키틴인 경우, 수분산액의 점도는 1~100mPa·S, 바람직하게는 1~85mPa·S(25℃ 조건 하에서 음차 진동식 점도계(SV-1A, A&D Company Ltd.)에 의한다)의 범위 내이다. 미세화 처리 시의 수분산액 중의 비수용성 다당류의 입자 크기는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 비수용성 다당류가 α 키틴인 경우, 수분산액 중의 α 키틴의 평균 입자 크기는, 0.5~200μm, 바람직하게는 30~150μm(레이저 회절/산란식 입자 지름 분포 측정 장치 LA-960(Horiba, Ltd.)에 의한다)의 범위 내이다.

나노섬유의 조제 방법은 WO 2015/111686 A1 등에 기재되어 있다.

[나노섬유를 포함하는 배지 조성물]

본 발명에 있어서, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착된 접착성 세포에, 부유 배양 또는 비동결 상태 하에서의 보존 및/또는 수송을 실시하는 경우, 나노섬유를 포함하는 액체 배지 조성물(본 명세서에 있어서, 본 발명의 배지 조성물이라고 칭하기도 한다.)을 이용한다.

바람직한 실시형태에 있어서, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유는 본 발명의 배지 조성물 중에 균일하게 분산되고, 나노섬유에 접착된 접착성 세포를 액체 배지 중에 부유시킨다.

본 발명에 있어서, 세포의 부유란 배양 용기에 대해서 세포가 접착하지 않는 상태(비접착)인 것을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서, 세포를 증식, 분화 또는 유지할 때, 액체 배지 조성물에 대한 외부로부터의 압력이나 진동, 또는 조성물 중에서의 진탕, 회전 조작 등을 하지 않고 세포 및/또는 조직이 액체 배지 조성물 중에 균일하게 분산 및 부유되어 있는 상태를 "부유 정치"라고 하고, 이러한 상태에서의 세포 및/또는 조직의 배양을 "부유 정치 배양"이라고 한다. "부유 정치"에 있어서, 부유 기간으로는 적어도 5분, 바람직하게는 1시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 6일 이상, 21일 이상을 들 수 있지만, 부유 상태를 유지하는 한, 상기 기간으로 한정되지 않는다.

바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 배지 조성물은 세포의 배양, 보존 또는 수송이 가능한 온도 범위(예를 들면, 0~40℃)의 적어도 한 점에서 세포의 부유 정치를 가능하게 한다. 본 발명의 배지 조성물은 바람직하게는 25~37℃, 가장 바람직하게는 37℃의 온도 범위의 적어도 한 점에서 세포의 부유 정치를 가능하게 한다.

부유 정치가 가능한지 여부는, 예를 들면 폴리스티렌 비즈(크기 500~600μm, Polysciences Inc. 제조)를 평가 대상이 되는 배지 조성물 중에 균일하게 분산시키고, 25℃에서 정치하여, 적어도 5분(바람직하게는, 24시간 이상, 48시간 이상) 동안 세포의 부유 상태를 유지할 수 있는지 여부를 관찰함으로써 평가할 수 있다.

본 발명의 배지 조성물 중에 있어서의 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유의 농도는, 배지 조성물을 이용하여 접착성 세포에 부유 배양, 비동결 상태로의 보존 또는 수송을 실시했을 경우에, 접착성 세포의 생존성을 향상시킬 수 있도록, 또는 접착성 세포를 부유(바람직하게는 부유 정치)시킬 수 있도록 적절히 정할 수 있다. 예를 들면, 키틴 나노섬유의 경우, 배지 조성물 중의 키틴 나노섬유 농도는, 예를 들면 0.0001%(중량/용량) 이상, 바람직하게는 0.001%(중량/용량) 이상이다. 배지 조성물 중의 키틴 나노섬유의 농도의 상한치는, 예를 들면 1.0%(중량/용량) 이하, 바람직하게는 0.1%(중량/용량) 이하이다.

본 발명의 배지 조성물 중에 포함되는 배지는, 이용되는 접착성 세포의 종류 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면, 포유류의 접착성 세포의 배양, 보존 또는 수송을 목적으로 이용되는 경우, 포유류의 세포를 배양하기 위해 일반적으로 이용되는 배지를 본 발명의 배지 조성물에 포함되는 배지로서 이용할 수 있다. 포유류 세포용 배지의 예로는 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagles's Medium; DMEM), 햄 F12 배지(햄 영양분 혼합물 F12; Ham's Nutrient Mixture F12), DMEM/F12 배지, 맥코이 5A 배지(McCoy's 5A medium), 이글 MEM 배지(이글 최소 필수 배지; Eagles's Minimum Essential Medium; EMEM), αMEM 배지(알파 수정 이글 최소 필수 배지; alpha Modified Eagles's Minimum Essential Medium; αMEM), MEM 배지(최소 필수 배지), RPMI1640 배지, 이스코브 수정 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium; IMDM), MCDB131 배지, 윌리엄 배지 E, IPL41 배지, 피셔 배지, StemPro34(Invitrogen 제조), X-VIVO 10(Cambrex Corporation 제조), X-VIVO 15(Cambrex Corporation 제조), HPGM(Cambrex Corporation 제조), StemSpan H3000(STEMCELL Technologies 제조), StemSpan SFEM(STEMCELL Technologies 제조), StemlineII(Sigma Aldrich 제조), QBSF-60(Quality Biological 제조), StemPro hESC SFM(Invitrogen 제조), mTeSR1 또는 2 배지(STEMCELL Technologies 제조), Sf-900II(Invitrogen 제조), Opti-Pro(Invitrogen 제조) 등을 들 수 있다.

당업자는 목적에 따라, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 인, 염소, 각종 아미노산, 각종 비타민, 항생 물질, 혈청, 지방산, 당 등을 상기 배지에 자유롭게 첨가할 수 있다. 포유류 세포의 배양, 보존 또는 수송에 대해, 당업자는 목적에 따라, 1종 이상의 다른 화학 성분 및 생체 물질을 조합하여 첨가하는 것도 가능하다. 포유류 세포용 배지에 첨가되는 성분의 예로는 소 태아 혈청, 인간 혈청, 말 혈청, 인슐린, 트란스페린, 락토페린, 콜레스테롤, 에탄올아민, 아셀렌산나트륨, 모노티오글리세롤, 2-메르캅토에탄올, 소 혈청 알부민, 피루브산나트륨, 폴리에틸렌글리콜, 각종 비타민, 각종 아미노산, 한천, 아가로오스, 콜라겐, 메틸셀룰로오스, 각종 사이토카인, 각종 호르몬, 각종 증식 인자, 각종 세포외 매트릭스, 각종 세포 접착 분자 등을 들 수 있다. 배지에 첨가되는 사이토카인의 예는, 한정되는 것은 아니지만, 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-7(IL-7), 인터류킨-8(IL-8), 인터류킨-9(IL-9), 인터류킨-10(IL-10), 인터류킨-11(IL-11), 인터류킨-12(IL-12), 인터류킨-13(IL-13), 인터류킨-14(IL-14), 인터류킨-15(IL-15), 인터류킨-18(IL-18), 인터류킨-21(IL-21), 인터페론-α(IFN-α), 인터페론-β(IFN-β), 인터페론-γ(IFN-γ), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 단구 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구-매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 줄기 세포 인자(SCF), flk2/flt3 리간드(FL), 백혈병 세포 저해 인자(LIF), 온코스타틴 M(OM), 에리스로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO) 등을 들 수 있다.

배지에 첨가되는 호르몬의 예는, 한정되는 것은 아니지만, 멜라토닌, 세로토닌, 티록신, 트리아이오도티로닌, 에피네프린, 노르에피네프린, 도파민, 항뮬러관 호르몬, 아디포넥틴, 부신피질 자극 호르몬, 안지오텐시노겐 및 안지오텐신, 항이뇨 호르몬, 심방 나트륨 이뇨성 펩티드, 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 코르티코트로핀 방출 호르몬, 에리스로포이에틴, 여포 자극 호르몬, 가스트린, 그렐린, 글루카곤, 생식샘 자극 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 인간 융모성 생식샘 자극 호르몬, 인간 태반성 락토겐, 성장 호르몬, 인히빈, 인슐린, 인슐린형 성장 인자, 렙틴, 황체 형성 호르몬, 멜라닌 세포 자극 호르몬, 옥시토신, 부갑상선 호르몬, 프로락틴, 가스트린 방출 펩티드, 소마토스타틴, 트롬보포이에틴, 갑상선 자극 호르몬, 티로트로핀 방출 호르몬, 코르티솔, 안드로스테네디온, 테스토스테론, 데히드로에피안드로스테론, 안드로스테네디온, 디히드로테스토스테론, 에스트라디올, 에스트론, 에스트리올, 프로게스테론, 칼시트리올, 칼시디올, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 프로스타시클린, 트롬복산, 프로락틴 방출 호르몬, 리포트로핀, 뇌 나트륨 이뇨 펩티드, 신경 펩티드 Y, 히스타민, 엔도텔린, 췌장 폴리펩티드, 레닌 및 엔케팔린을 들 수 있다.

배지에 첨가되는 증식 인자의 예는, 한정되는 것은 아니지만, 트랜스포밍 성장 인자-α(TGF-α), 트랜스포밍 성장 인자-β(TGF-β), 매크로파지 염증 단백질-1α(MIP-1α), 표피 세포 증식 인자(EGF), 섬유아세포 증식 인자-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9(FGF-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), 신경 세포 증식 인자(NGF), 간세포 증식 인자(HGF), 백혈병 저지 인자(LIF), 프로테아제 넥신 I, 프로테아제 넥신 II, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 콜린 작동성 분화 인자(CDF), 케모카인, 노치 리간드(델타1 등), Wnt 단백질, 안기오포이에틴형 단백질 2, 3, 5 또는 7(Angpt2, 3, 5, 7), 인슐린형 성장 인자(IGF), 인슐린형 성장 인자 결합 단백질-1(IGFBP), 플레이오트로핀 등을 들 수 있다.

또한, 유전자 재조합 기술에 의해 이러한 사이토카인 및 증식 인자의 아미노산 서열을 인위적으로 개변시킨 것을 첨가하는 것도 가능하다. 그 예로는 IL-6/가용성 IL-6 수용체 복합체, HyperIL-6(IL-6과 가용성 IL-6 수용체의 융합 단백질) 등을 들 수 있다.

각종 세포외 매트릭스 및 각종 세포 접착 분자의 예로는 콜라겐 I 내지 XIX, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌-1 내지 12, 니트로겐, 테나신, 트롬보스폰딘, 본 빌레브란트 인자, 오스테오폰틴, 피브리노겐, 각종 엘라스틴, 각종 프로테오글리칸, 각종 카드헤린, 데스모콜린, 데스모글레인, 각종 인테그린, E-셀렉틴, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 면역 글로불린 슈퍼패밀리, 마트리겔, 폴리-D-리신, 폴리-L-리신, 키틴, 키토산, 세파로오스, 히알루론산, 알긴산겔, 각종 하이드로겔, 이들의 절단 단편 등을 들 수 있다.

배지에 첨가되는 항생 물질의 예로는 설폰아미드 및 조제용 물질, 페니실린, 페네티실린, 메티실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 나프실린, 암피실린, 암옥시실린, 시클라실린, 카르베니실린, 티카르실린, 피페라실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 메실리남, 안디노실린, 세팔로스포린 및 그 유도체, 옥솔린산, 아미플록사신, 테마플록사신, 날리딕스산, 피로미드산, 시프로플록사신, 시녹사신, 노르플록사신, 퍼플록사신, 로작사신, 오플록사신, 에녹사신, 피페미드산, 설박탐, 클라뷰란산, β-브로모페니실란산, β-클로로페니실란산, 6-아세틸메틸렌페니실란산, 세폭사졸, 설탐피실린, 아디노시린 및 설박탐 포름알데히드 후드레이트 에스테르, 타조박탐, 아즈트레오남, 설파제틴, 이소설파제틴, 노르카디신, m-카르복시페닐, 페닐아세트아미도포스폰산메틸, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 테트라사이클린, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 메타사이클린, 및 미노사이클린을 들 수 있다.

배지 조성물을 이용하여 접착성 세포에 부유 배양, 비동결 상태 하에서의 보존 또는 수송을 실시했을 경우에, 접착성 세포의 생존성을 향상시킬 수 있도록, 또는 접착성 세포를 부유(바람직하게는 부유 정치)시킬 수 있는 농도가 달성되도록, 상기 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유를 적절한 액체 배지와 혼합함으로써 상기 본 발명의 배지 조성물을 제조할 수 있다.

바람직한 실시형태에 있어서, 생리적인 수성 용매 중의, 상기 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유의 분산액을 액체 배지와 혼합하여 본 발명의 배지 조성물을 조제한다. 분산액은 멸균(오토클레이브, 감마선 멸균 등)해도 된다. 또는, 분산액과, 분말 배지를 물에 녹여 조제한 액체 배지(배지의 수용액)를 혼합하고, 멸균한 후에 이용해도 된다. 분산액과 액체 배지는 혼합하기 전에 각각 멸균해도 된다. 수성 용매의 예는, 한정되는 것은 아니지만, 물, 디메틸설폭시드(DMSO) 등을 들 수 있다. 수성 용매로서는, 물이 바람직하다. 수성 용매는 적절한 완충제 및 염을 포함해도 된다. 상기 나노섬유 분산액은 본 발명의 배지 조성물을 조제하기 위한 배지 첨가제로서 유용하다.

혼합 비율은 특별히 한정되지 않지만, 나노섬유의 분산액:액체 배지(배지의 수용액)(체적비)가 통상 1:99~99:1, 바람직하게는 10:90~90:10, 보다 바람직하게는 20:80~80:20이다.

[비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유를 이용한 접착성 세포의 처리]

본 발명은 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유의, 접착성 세포의 다양한 배양 방법론에 있어서의 캐리어로서의 이용을 제공한다. 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 접착성 세포에 (1) 부유 배양, (2) 비동결 상태 하에서의 보존 및/또는 수송, (3) 이식 등의 여러가지 처리를 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명은 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 접착성 세포에 (1) 부유 배양, (2) 비동결 상태 하에서의 보존 및/또는 수송, (3) 이식 등의 처리를 실시하는 것을 포함한, 접착성 세포의 처리 방법으로 파악하는 것도 가능하다.

(1) 부유 배양

비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로 접착성 세포를 배양함으로써 접착성 세포의 부유 배양을 행할 수 있다. 부유 배양은 상기 본 발명의 배지 조성물 중에서 접착성 세포를 배양함으로써 행할 수 있다. 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유는 나노섬유에 접착된 세포를 배지 중에서 부유시키는 효과(바람직하게는 부유 정치시키는 효과)를 나타낸다. 본 발명의 배지 조성물에 있어서, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유는 균일하게 분산되므로, 배지 조성물 중에서 접착성 세포를 배양하는 경우, 접착성 세포는 나노섬유에 접착하여, 배지 조성물 중에 부유한다. 부유 효과에 의해, 단층 배양에 비해, 일정 체적당 세포수를 보다 증가시켜 배양할 수 있다. 종래의 회전 또는 진탕 조작을 수반하는 부유 배양에 있어서는, 세포에 대해 전단력이 작용하므로, 세포의 증식률 및 회수율이 낮아지거나, 또는 세포의 기능이 손상될 수도 있다. 본 발명의 배지 조성물을 이용하면, 진탕 등의 조작을 필요로 하는 일 없이, 분산 상태로 세포를 배양할 수 있다. 따라서, 세포 기능의 손실 없이, 목적으로 하는 접착성 세포를 용이하고 대량으로 부유 배양하는 것을 기대할 수 있다. 또한, 종래의 겔 기재를 포함한 배지에서 세포를 부유 배양할 경우, 세포의 관찰 및 회수가 어려운 경우가 있고, 회수 시에 그 기능이 손상되는 경우가 있다. 그러나, 본 발명의 배지 조성물을 이용하면, 부유 배양한 세포를, 그 기능을 손상시키는 일 없이, 관찰 및 회수하는 것이 기대된다. 또한, 종래의 겔 기재를 포함한 배지는 점도가 높아 배지의 교환을 어렵게 하는 경우가 있다. 그러나, 본 발명의 배지 조성물은 저점도이므로, 피펫, 펌프 등으로 용이하게 교환하는 것이 기대된다.

비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유를 이용하여 접착성 세포의 부유 배양을 행하는 경우, 본 발명의 배지 조성물에 별도 조제한 접착성 세포를 첨가하고, 균일하게 분산되도록 혼합한다. 이 경우, 혼합 방법은 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 피펫팅 등을 이용한 수동 혼합, 스터러, 볼텍스 믹서, 마이크로플레이트 믹서, 진탕기 등의 기기를 이용한 혼합을 들 수 있다. 혼합 후, 얻어진 세포 현탁액을 정치 상태로 배양해도 되고, 또는 필요에 따라서 회전, 진탕 또는 교반하면서 배양해도 된다. 회전 속도와 빈도는 당업자의 목적에 따라 적절히 설정할 수 있다. 예를 들면, 접착성 세포를 계대 배양으로부터 회수하고, 적절한 세포 해리액을 이용하여 단일 세포 또는 이것에 가까운 상태로 분산시키고, 분산된 접착성 세포를 본 발명의 배지 조성물 중에서 현탁시켜, 이것에 부유 배양(바람직하게는, 부유 정치 배양)을 실시한다.

세포를 배양할 때의 온도는, 동물 세포의 경우, 통상 25 내지 39℃(예를 들면, 37℃), 바람직하게는 33 내지 39℃이다. CO₂ 농도는, 배양의 분위기 중에서 통상 4 내지 10체적%이며, 4 내지 6체적%가 바람직하다. 배양 기간은 배양의 목적에 따라 적절히 설정해도 된다.

본 발명의 배지 조성물 중에서 접착성 세포를 배양하는 경우, 세포 배양에 일반적으로 이용되는, 샬레, 플라스크, 플라스틱 백, 테플론(등록상표) 백, 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 시험관, 트레이, 배양 백, 롤러 보틀 등의 배양 용기를 배양에 이용할 수 있다. 나노섬유에 접착된 접착성 세포가 배양 용기에 접착되지 않도록, 상기 배양 용기는 세포 저접착성인 것이 바람직하다. 세포 저접착성 배양 용기로서는, 세포와의 접착성을 향상시키기 위해 인공적으로 처리(예를 들면, 세포외 매트릭스 등으로 코팅 처리)되어 있지 않은 표면을 갖는 배양 용기, 또는 세포와의 접착성을 저감시키기 위해 인공적으로 처리된 표면을 갖는 배양 용기를 이용할 수 있다.

배지를 교환할 필요가 있는 경우, 원심분리 또는 여과 처리에 의해 세포를 분리하고, 신선한 배지 또는 본 발명의 배지 조성물을 세포에 첨가할 수 있다. 또는, 원심분리 또는 여과 처리에 의해 세포를 적절히 농축시키고, 신선한 배지 또는 본 발명의 배지 조성물을 농축액에 첨가할 수 있다. 예를 들면, 원심분리의 중력가속도(G)는, 한정되는 것은 아니지만, 100G 내지 400G이고, 여과 처리에 이용하는 필터의 구멍의 크기는 10μm 내지 100μm이다.

접착성 세포는 기계적인 제어 및 폐쇄 환경 하에서 세포 파종, 배지 교환, 세포 화상 취득 및 배양 세포의 회수를 자동으로 실시함으로써, pH, 온도, 산소 농도 등을 제어하면서, 고밀도 배양이 가능한 바이오리엑터 및 자동 배양 장치를 이용하여 배양하는 것도 가능하다.

(1-1) 접착성 세포의 유지 또는 증식

접착성 세포는, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로 부유 배양이 실시될 때 효율적으로 증식하므로, 부유 배양은 접착성 세포의 유지 또는 증식 방법으로서 우수하다. 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 접착성 세포에 부유 배양을 실시하는 경우, 접착성 세포는 배양 용기에 접착하는 일 없이, 또는 배양 용기의 바닥면에만 국부적으로 존재하는 일 없이, 3차원적으로 퍼지면서 분산됨으로써, 증식이 촉진된다. 특히, 나노섬유로서 키틴 나노섬유를 이용하는 경우, 접착성 세포가 키틴 나노섬유에 접착되고, 거기서부터 스캐폴드로서 강력하게 증식한다. 결과적으로, 증식된 세포가 포도송이와 같이 나노섬유 상에서 연결된다. 이 증식-촉진 효과에는, 접착성 세포 및/또는 조직을 부유시키기(즉, 접착성 세포의 배양 용기로의 접착을 회피하기) 위해 충분한 농도의 나노섬유가 배지 조성물 중에 존재하는 것만이 요구되며, 부유 정치(즉, 외부로부터의 압력, 진동, 진탕, 회전 조작 등이 없이, 세포가 액체 배지 조성물 중에서 균일하게 분산되어 부유 상태에 있는 것)가 가능한 것은 필수는 아니다. 예를 들면, 키틴 나노섬유의 경우, 부유 작용의 발현을 위해 충분한 0.0001%(중량/용량) 이상의 농도이면, 안정적인 부유 정치 배양을 가능하게 하는 0.03%(중량/용량) 미만의 농도(예를 들면, 0.025%(중량/용량) 이하, 0.02%(중량/용량) 이하)여도, 증식-촉진 효과가 제공된다. 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 접착성 세포에 부유 배양을 실시하는 경우, 세포를 배양 용기의 바닥면에 접착시키고 단층 배양했을 경우보다 높은 밀도로 유지 및 증식시킬 수 있다.

비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 접착성 세포에 부유 배양을 실시하여 접착성 세포를 유지 또는 증식하는 경우, 부유 배양에 이용하는 본 발명의 배지 조성물 중에 포함되는 배지로서 상기 접착성 세포의 형질을 유지하면서 유지 또는 증식할 수 있는 배지가 이용된다. 당업자는 접착성 세포의 종류에 따라 배지를 적절히 선택할 수 있다.

일 실시형태에 있어서, 포유 동물의 줄기 세포(예를 들면, 간엽계 줄기 세포) 또는 전구 세포(예를 들면, 전구 지방 세포)는 키틴 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 세포의 부유 배양을 행함으로써 유지 또는 증식시킨다. 부유 배양에 의해, 포유 동물의 줄기 세포(예를 들면, 간엽계 줄기 세포) 또는 전구 세포(예를 들면, 전구 지방 세포)를, 형질(예를 들면, 분화능)을 유지하면서 유지 또는 증식시킬 수 있다.

비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 접착성 세포에 부유 배양을 실시하는 경우, 배양 용기로부터의 세포의 박리 조작 없이, 신선한 배지 또는 본 발명의 배지 조성물을 부유 배양물에 간단히 첨가하거나, 또는 신선한 배지 또는 본 발명의 배지 조성물에 배양 후의 배양물을 전부 또는 일부 첨가하는 것만으로 접착성 세포를 계대할 수 있다. 따라서, 본 발명의 계대 배양 방법을 이용하면, 배양 용기로부터의 세포의 박리 조작 없이, 접착성 세포를 계대 배양할 수 있다. 또한, 이 계대 배양 방법을 이용하면, 배양 용기로부터의 세포의 박리 조작 없이, 접착성 세포의 배양 규모를 확대할 수 있다. 배양 용기로부터의 세포의 박리 조작으로서는, 킬레이트제(예를 들면, EDTA) 및/또는 단백질 분해 효소(예를 들면, 트립신, 콜라게나아제)에 의한 처리를 들 수 있다. 상기 계대 배양 방법은 배양 용기로부터의 세포의 박리 조작에 대해 감수성이 높은 접착성 세포(예를 들면, 박리 조작에 의해 생존성이 저하하는 접착성 세포, 박리 조작에 의해 형질이 변하기 쉬운 접착성 세포)의 계대 배양에 유리하다. 배양 용기로부터의 세포의 박리 조작에 대해 감수성이 높은 접착성 세포의 예는, 한정되는 것은 아니지만, 줄기 세포(예를 들면, 간엽계 줄기 세포), 전구 세포(예를 들면, 전구 지방 세포), 초기 배양 세포 등을 들 수 있다.

(1-2) 접착성 세포의 분화 유도

비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 접착성 세포에 부유 배양을 실시하는 경우, 적절한 분화 유도 조건 하에서 부유 배양을 행함으로써, 접착성 세포의 원하는 세포로의 분화를 유도할 수 있다. 상기와 같이, 세포가 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 접착성 세포의 부유 배양을 행하는 경우, 그 증식이 촉진된다. 따라서, 적절한 분화 유도 조건 하에서 부유 배양을 행함으로써, 접착성 세포의 원하는 세포로의 양호한 분화 유도를 기대할 수 있다.

분화 유도 조건은 접착성 세포 및 원하는 분화 세포의 종류에 따라 적절히 정할 수 있다. 당업자는 여러 가지 공지의 분화 유도 조건을 상기 부유 배양에 적용함으로써, 특정의 접착성 세포를 원하는 세포로 분화시킬 수 있다. 예를 들면, 특정의 분화 유도 인자를 상기 본 발명의 배지 조성물 중에 첨가하고, 분화 유도 인자의 존재 하에서 접착성 세포의 부유 배양을 행함으로써, 원하는 세포로의 분화를 유도할 수 있다.

본 발명에 적용할 수 있는 분화 유도 조건은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 이하를 들 수 있다.

· 간엽계 줄기 세포의 지방 세포로의 분화: 이소부틸메틸크산틴(IBMX), 덱사메타손, 인슐린 및 인도메타신을 지방 세포 분화 유도 인자로서 이용하여, 이러한 인자의 존재 하에서 간엽계 줄기 세포를 배양한다.

· 간엽계 줄기 세포의 골세포로의 분화: 덱사메타손, 아스코르브산 및 β 글리세로인산을 골세포 분화 유도 인자로서 이용하여, 이러한 인자의 존재 하에서 간엽계 줄기 세포를 배양한다.

· 간엽계 줄기 세포의 연골 세포로의 분화: 인슐린, TGF-β3 및 아스코르브산을 연골 세포 분화 유도 인자로서 이용하여, 이러한 인자의 존재 하에서 간엽계 줄기 세포를 배양한다.

간엽계 줄기 세포의 지방 세포 분화, 골세포 분화 또는 연골 세포 분화의 조건은, 예를 들면 이하의 논문에 기재되어 있다.

[1] da Silva Meirelles L, Caplan AI, NardiNB., Stem Cells 2008; 26(9): 2287-99.

[2] Crisan M, Yap S, CasteillaL 외, Cell Stem Cell 2008; (3): 301-13.

[3] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I 외, Cytother2006; 8(4): 315-7.

[4] Caplan AI., Cell Stem Cell 2008; 3(3): 229-30.

· 전구 지방 세포의 지방 세포로의 분화: 이소부틸메틸크산틴(IBMX), 덱사메타손, 인슐린 및 인도메타신을 지방 세포 분화 유도 인자로서 이용하여, 이러한 인자의 존재 하에서 전구 지방 세포를 배양한다.

전구 지방 세포의 지방 세포 분화의 조건은, 예를 들면 이하의 논문에 기재되어 있다.

[5] Hutley L J, Newell F M 외, Eur J Clin Invest. 2003; 33(7): 574-81.

[6] Yin Y, Yuan H 외, Mol Endocrinol. 2006; 20(2): 268-78.

[7] Rival Y, StennevinA 외, J Pharmacol Exp Ther. 2004; 311(2): 467-75.

또한, 이하의 분화 유도 조건은 공지된 것이며, 본 발명에 적용할 수 있다.

· 전구 지방 세포의 골세포로의 분화:

[8] Shirakawa K, Maeda S 외, Mol Cell Biol. 2006; 26(16): 6105-16.

분화 유도 조건 하에서의 접착성 세포의 부유 배양은 원하는 분화 세포가 출현할 때까지 행해진다. 원하는 분화 세포의 출현은 세포의 분화 마커의 발현 등을 조사함으로써 확인할 수 있다. 부유 배양의 결과, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 원하는 분화 세포를 얻을 수 있다.

일 실시형태에 있어서, 지방 세포, 골세포 또는 연골 세포로의 분화 유도 조건 하에서, 키토산 나노섬유에 접착된 포유 동물의 간엽계 줄기 세포에 부유 배양을 실시한다. 지방 세포, 골세포 또는 연골 세포가 출현할 때까지 부유 배양을 행함으로써, 지방 세포, 골세포 또는 연골 세포를 얻는다. 지방 세포, 골세포 또는 연골 세포는 키토산 나노섬유에 접착되어 있는 상태로 얻을 수도 있다.

일 실시형태에 있어서, 지방 세포로의 분화 유도 조건 하에서, 키토산 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 포유 동물의 전구 지방 세포에 부유 배양을 실시한다. 지방 세포가 출현할 때까지 부유 배양을 실시함으로써, 지방 세포를 얻는다. 지방 세포는 키토산 나노섬유에 접착되어 있는 상태로 얻을 수도 있다.

(1-3) 접착성 세포에 의한 액성 인자의 생산

비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 접착성 세포의 부유 배양을 행하는 경우, 높은 밀도로 접착성 세포를 배양할 수 있고, 효율적으로 증식시킬 수 있다. 따라서, 부유 배양은 생체외 세포 배양에 의한 액성 인자의 생산에 유용하다. 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 원하는 액성 인자를 생산하는 접착성 세포에 부유 배양을 실시하고, 배양물(예를 들면, 배양 상청)로부터 목적으로 하는 액성 인자를 단리함으로써, 액성 인자를 얻을 수 있다. 액성 인자의 예는, 한정되는 것은 아니지만, 항체, 효소(우로키나아제 등), 호르몬(인슐린 등), 사이토카인(인터페론, 인터류킨, 종양 괴사 인자, 콜로니 자극 인자, 성장 인자 등), 백신의 항원, 기타 생리 활성 물질(단백질, 펩티드 등)을 들 수 있다. 액성 인자를 생산하는 세포로는 피부 세포, 연골 세포, 간세포, 췌장 세포, 신장 세포, 간엽계 줄기 세포, 지방 세포 등의 비형질 전환 세포, 및 액성 인자를 코딩하는 유전자 또는 유용 물질의 생합성에 관여하는 유전자를 도입한 형질 전환 세포를 들 수 있다. 원하는 액성 인자를 생산하는 세포는, 바람직하게는 액성 인자를 세포 밖으로 분비하는 세포이다. 액성 인자를 생산하는 세포의 구체예는, 한정되는 것은 아니지만, 액성 인자를 코딩하는 유전자 또는 액성 인자의 생합성에 관여하는 유전자를 도입한, HEK293, CHO-K1, BHK-21, MDCK, Vero, HepG2, MCF-7 등을 들 수 있다. 재조합 단백질 등의 액성 인자의 생산에 이용되는 세포는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이러한 세포를 본 발명의 방법에 대해 이용할 수 있다. 배양 규모는 상기 (1-1)에 기재한 접착성 세포의 유지 또는 증식 방법에 의해 확대해도 된다. 배양물로부터 액성 인자를 단리하기 위해서는, 배양물로부터 세포를 제거할 필요가 있다. 상기 부유 배양을 이용하는 경우, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 접착성 세포가 배지 조성물 중에 부유되므로, 원심분리, 여과 처리 등의 간편한 방법으로 세포를 제거할 수 있다. 또한, 배지 조성물 중의 나노섬유도 원심분리, 여과 처리 등의 간편한 방법에 의해 제거할 수 있다. 배양물로부터 액성 인자를 단리하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등의 크로마토그래피) 등의, 생리 활성 물질의 생화학적인 분리 및 정제 방법을 적용할 수 있다.

일 실시형태에 있어서, 키토산 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 포유 동물의 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포 또는 지방 세포에 부유 배양을 실시하고, 이러한 세포에 의해 세포 밖으로 분비되는 사이토카인, 엑소좀 등의 유용 물질을, 얻어진 배양 상청으로부터 단리한다. 지방 세포는 상기 (1-2)의 방법에 의해 포유 동물의 간엽계 줄기 세포 또는 전구 지방 세포로부터 유도될 수도 있다.

(2) 비동결 상태 하에서의 보존 및/또는 수송

접착성 세포는 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로 높은 생존성을 나타낸다. 또한, 스캐폴드로부터 분리하는 일 없이, 접착성 세포를 높은 밀도로 농축할 수 있다. 따라서, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유는 비동결 상태 하에서의 접착성 세포의 보존 및/또는 수송을 위한 캐리어로서 이용할 수 있다. 상기 본 발명의 배지 조성물을 이용하여, 세포가 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되고 배지 조성물 중에 부유된 상태로(바람직하게는 부유 정치 상태로), 나노섬유를 이용한 접착성 세포의 비동결 상태 하에서의 보존 및/또는 수송을 행할 수 있다.

보존 및/또는 수송에 이용하는 본 발명의 배지 조성물은 상기 조성에 더하여, 세포 및 조직의 비동결 상태에서의 보존 시에 세포 연명 효과를 갖는 각종 성분을 포함해도 된다. 상기 성분의 예로는 당류(다당류는 제외)(예를 들면, 단당류, 이당류), 항산화제(예를 들면, SOD, 비타민 E 또는 글루타티온), 친수성 폴리머(예를 들면, 폴리비닐피롤리돈), 킬레이트제(예를 들면, EDTA), 당 알코올(예를 들면, 만니톨, 소르비톨), 글리세롤 등을 들 수 있다.

보존 및/또는 수송을 위해서는, 예를 들면 원하는 접착성 세포를 본 발명의 배지 조성물 중에 분산시켜, 접착성 세포를 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착시킴으로써, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착된 접착성 세포의 현탁액을 얻는다. 상기 (1)의 부유 배양에 의해 얻어지는, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착된 접착성 세포를 포함한 배양물에 직접 보존 및/또는 수송을 실시해도 된다. 또한, 상기 (1)의 부유 배양에 의해 얻어지는 배양물에 원심분리 등을 실시하여, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착된 접착성 세포를 회수하고, 이것을 적절한 액체 배지에서 현탁함으로써, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착된 접착성 세포의 현탁액을 얻을 수 있다. 현탁액 중의 접착성 세포의 농도는 특별히 한정되지 않고, 통상 1×10²~5×10⁶세포/mL, 바람직하게는 1×10⁴~1×10⁶세포/mL이다.

보존 및/또는 수송을 위해서는, 상기 접착성 세포의 현탁액을 단단히 밀봉할 수 있는 용기 안에 넣는다. 상기 용기의 예는 한정되는 것은 아니지만, 플라스크, 플라스틱 백, 테플론(등록상표) 백, 시험관, 배양 백 등을 들 수 있다. 보존 또는 수송 시에 내용물의 누락 및 외부 세계로부터의 세균 등에 의한 오염을 피하기 위해, 접착성 세포의 현탁액을 포함한 용기는 단단히 밀봉되는 것이 바람직하다.

보존 및/또는 수송 시의 온도는, 접착성 세포 또는 조직의 생존이 유지되는 한 특별히 한정되지 않고, 통상은 37℃ 이하이다. 온도가 낮은 경우에 보존 및/또는 수송 시의 세포 또는 조직의 생존성의 저하를 피할 수 있다. 그러나, 세포 또는 조직의 동결을 방지하기 위해, 통상은 본 발명의 배지 조성물의 융점을 초과하는 온도에서 보존 및/또는 수송된다. 따라서, 보존 및/또는 수송 시의 온도는 통상 -5~42℃, 바람직하게는 1~37℃, 보다 바람직하게는 4~32℃, 더욱 바람직하게는 18~30℃로 유지된다.

보존 및/또는 수송의 기간은, 원하는 접착성 세포를 본 발명의 배지 조성물 중에서 생존 상태로 유지할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 통상은 1시간 이상, 10일 이내, 바람직하게는 1~8일, 보다 바람직하게는 1~3일이다. 보존 및/또는 수송 기간 중, 접착성 세포는, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로, 본 발명의 배지 조성물 중에서 부유 정치 상태를 유지하는 것이 바람직하다.

본 발명의 보존 또는 수송 방법을 이용하면, 스캐폴드로부터의 분리 없이, 비동결 상태 하에서, 부유 상태를 유지하면서 접착성 세포를 보존 및/또는 수송할 수 있다. 따라서, 세포의 동결, 스캐폴드로부터의 접착성 세포의 박리, 침전에 의해 접촉된 세포들의 응집 등에 의한 손상을 최소화하고, 특유의 기능을 유지하면서, 접착성 세포를 보존 및/또는 수송할 수 있다.

일 실시형태에 있어서, 포유 동물의 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포, 지방 세포, 골세포 또는 연골 세포는 키토산 나노섬유에 접착되어 있는 상태로 비동결 상태 하에서 보존 및/또는 수송된다. 지방 세포, 골세포 또는 연골 세포는 상기 (1-2)의 방법에 의해 포유 동물의 간엽계 줄기 세포 또는 전구 지방 세포로부터 유도된 것이어도 된다.

보존 및/또는 수송된 접착성 세포를 회수할 때, 접착성 세포를 킬레이트제(예를 들어, EDTA) 및/또는 단백질 분해 효소(예를 들어, 트립신, 콜라게나아제)로 접착성 세포를 처리함으로써 접착성 세포를 나노섬유로부터 박리해도 되고, 또는 후술하는 본 발명의 회수 방법에 의해 적절한 분해 효소로 나노섬유를 분해함으로써 접착성 세포를 나노섬유로부터 박리해도 된다. 나노섬유에 접착되어 있는 상태로 보존 및/또는 수송된 접착성 세포를 상기 (1-1)에 기재된 방법에 의해 부유 배양한 후에 회수 조작을 행해도 된다. 또는, 나노섬유에 접착된 접착성 세포를 세포 접착성 배양기로 옮기고, 계속해서 배양해도 된다. 세포 접착성 배양기는 배양기의 표면의 세포와의 접착성을 향상시키는 목적으로, 세포외 매트릭스(ECM) 등의 임의의 세포 지지 기질로 코팅되어도 된다. 세포 지지 기질의 예는, 한정되는 것은 아니지만, 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 라미닌, 및 피브로넥틴, 그 혼합물, 예를 들면 마트리겔 등을 들 수 있다. 세포 접착성 배양기 중에서 나노섬유에 접착된 접착성 세포를 배양하는 경우, 접착성 세포가 나노섬유로부터 세포 접착성 배양기의 표면으로 이동하고, 배양기의 표면에 접착되어 있는 상태로 증식한다. 배양기의 표면에 접착된 세포를 킬레이트제(예를 들면, EDTA) 및/또는 단백질 분해 효소(예를 들면, 트립신, 콜라게나아제)로의 처리에 의해 표면으로부터 박리 함으로써 회수해도 된다.

(3) 이식

상기와 같이, 접착성 세포는 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착되어 있는 상태로 높은 생존성을 나타낸다. 또한, 접착성 세포를 스캐폴드로부터의 분리 없이, 양호한 기능을 유지하면서 높은 밀도로 농축시킬 수 있다. 키틴 등의 비수용성 다당류는 생분해성이므로, 체내에 이식한 후에 분해 및 소실된다. 따라서, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유는 접착성 세포의 생체 내로의 이식을 위한 캐리어로서 이용할 수 있다. 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착된 접착성 세포의 유효량을, 접착성 세포에 의한 치료를 필요로 하는 환자에게 이식하는 것으로 환자의 질환 및 장해를 치료할 수 있다. 질환 및 장해는 접착성 세포의 결실, 부족 또는 기능부전에 기인하는 것일 수도 있다. 예를 들면, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착된 인간 접착성 세포의 유효량을, 접착성 세포에 의한 치료를 필요로 하는 인간 환자에게 이식하는 것으로 인간 환자의 질환 및 장해를 치료할 수 있다. 이식되는 접착성 세포는, 상기 (1)의 부유 배양, 또는 상기 (2)의 비동결 상태 하에서의 보존 및/또는 수송에 의해 얻어도 된다.

일 실시형태에 있어서, 키토산 나노섬유에 접착된, 포유 동물의 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포, 지방 세포, 골세포 또는 연골 세포를, 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포, 지방 세포, 골세포 또는 연골 세포에 의한 치료를 필요로 하는 환자에게 이식하는 것으로, 환자의 질환 및 장해를 치료할 수 있다. 질환 및 장해는 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포, 지방 세포, 골세포 또는 연골 세포의 결실, 부족, 또는 기능부전에 기인하는 것일 수도 있다. 포유 동물은 바람직하게는 인간이다. 이식되는 간엽계 줄기 세포 또는 전구 지방 세포는 상기 (1-1)의 방법에 의해 유지 또는 증식되어도 된다. 지방 세포, 골세포 또는 연골 세포는 상기 (1-2)의 방법에 의해, 포유 동물의 간엽계 줄기 세포 또는 전구 지방 세포로부터 유도되어도 된다.

[연속적 처리]

상기와 같이, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유는, 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포 등의 접착성 세포의 (1) 부유 배양(유지 또는 증식, 분화 유도 또는 액성 인자의 생산), (2) 비동결 상태 하에서의 보존 및/또는 수송, 및 (3) 이식 등의 여러 가지 조작을 위한 공통의 캐리어로서 이용할 수 있다. 따라서, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유를 이용하면, (1) 부유 배양((1-1) 유지 또는 증식, (1-2) 분화 유도, 또는 (1-3) 액성 인자 생산), (2) 비동결 상태 하에서의 보존 및/또는 수송, 및 (3) 이식으로부터 선택되는 복수의 처리를 연속적으로 행할 수 있다. "연속적"이란, 특정 조작에 의해 얻어진 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착된 접착성 세포에, 접착 상태를 유지하면서 다음 조작을 실시하는 것을 의미한다. 스캐폴드로부터 접착성 세포를 박리하는 일 없이, 복수의 조작을 연속적으로 행함으로써, 접착성 세포의 생존성 및 기능을 양호한 상태로 유지할 수 있다.

처리의 조합 및 그 순서는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 적절히 설정할 수 있다. 동일한 처리를 연속적으로 또는 비연속적으로 여러 차례 행해도 된다. 처리의 조합 및 그 순서의 예는, 한정되는 것은 아니지만, 이하와 같다.

(a) (1-1)→(2)

(b) (1-1)→(2)→(1-1)

(c) (1-1)→(2)→(1-2)

(d) (1-1)→(2)→(1-1)→(1-2)

(e) (1-1)→(2)→(1-2)→(1-1)

(f) (1-1)→(2)→(1-1)→(1-2)→(1-1)

(g) (1-1)→(1-2)→(2)

(h) (1-1)→(1-2)→(1-1)→(2)

(i) (1-1)→(1-2)→(2)→(1-1)

(j) (1-1)→(1-2)→(1-1)→(2)→(1-1)

(k) (1-1)→(1-2)

(l) (1-1)→(1-2)→(1-1)

(m) 상기 (a)~(l) 중 몇개의 조작(예를 들면, (a), (b), (c) 또는 (k)) 후, 연속적으로 (3)

(n) 상기 (a)~(l) 중 몇개의 조작(예를 들면, (a), (b), (c) 또는 (k)) 후, 연속적으로 (1-3)

상기 조합에 있어서, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유는 바람직하게는 키틴 나노섬유이다. 상기 (a) 및 (b)의 조작 (1-1)에 있어서, 유지 또는 증식되는 접착성 세포는, 바람직하게는 포유 동물의 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포, 지방 세포, 골세포 또는 연골 세포이다. 상기 (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k) 및 (l)의, 조작 (1-2) 전에 행하는 조작 (1-1)에 있어서, 유지 또는 증식되는 접착성 세포는, 바람직하게는 포유 동물의 간엽계 줄기 세포 또는 전구 지방 세포이다. 상기 (e), (f), (h), (i), (j) 및 (l)의, 조작 (1-2) 후에 행하는 조작 (1-1)에 있어서, 유지 또는 증식되는 접착성 세포는, 바람직하게는 지방 세포, 골세포 또는 연골 세포이다. 상기 조합에 있어서, 조작 (1-2)는, 바람직하게는 포유 동물의 간엽계 줄기 세포 또는 전구 지방 세포로부터의, 지방 세포, 골세포 또는 연골 세포로의 분화 유도이다.

[나노섬유에 접착된 접착성 세포의 회수]

본 발명은, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착된 접착성 세포를 비수용성 다당류의 분해 효소로 처리하여 나노섬유를 분해하고, 나노섬유로부터 접착성 세포를 박리하여, 접착성 세포를 회수하는 것을 포함한, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착된 접착성 세포로부터 접착성 세포를 회수하는 방법을 제공한다.

일반적으로, 배양 용기 등에 접착된 접착성 세포를 박리에 의해 회수하는 경우, 킬레이트제(예를 들어, EDTA) 및/또는 단백질 분해 효소(예를 들어, 트립신, 콜라게나아제)에 의한 처리를 행한다. 이 처리를 행하는 경우, 접착성 세포의 세포외 매트릭스의 구조가 파괴되거나, 또는 접착성 세포에 대한 킬레이트제나 단백질 분해 효소의 직접적인 작용에 의해 접착성 세포가 손상되고, 그 생존성 및 기능이 손상될 수도 있다. 킬레이트제 또는 단백질 분해 효소를 이용하여 세포를 회수하는 경우, 배지 중에 포함되는 2가 이온, 단백질 등을 제거하기 위해, 배지를 제거하고 세포를 PBS 등으로 세정할 필요가 있으며, 이 세정 조작이 세포를 손상시킬 수도 있다. 특히, 줄기 세포(예를 들면, 간엽계 줄기 세포), 전구 세포(예를 들면, 전구 지방 세포), 초기 배양 세포 등은 상기 킬레이트제 및 단백질 분해 효소를 이용한 박리 조작에 대한 감수성이 높다. 그에 반해, 본 발명의 회수 방법에 있어서는, 접착성 세포가 접착된 나노섬유를 구성하는 비수용성 다당류가 분해된다. 따라서, 접착성 세포의 세포외 매트릭스의 구조의 파괴를 최소화할 수 있다. 포유 동물의 세포 등은, 통상 그 구성 성분으로서 비수용성 다당류를 포함하지 않으므로, 비수용성 다당류의 분해 효소로 세포를 처리해도, 세포에 대한 직접적인 영향을 최소화할 수 있다. 또한, 포유 동물의 배지 등은, 통상 비수용성 다당류를 포함하지 않으므로, PBS 등에 의한 세정 조작이 불필요하다. 따라서, 본 발명의 회수 방법에 따르면, 접착성 세포에 대한 손상을 최소화하면서, 나노섬유로부터 접착성 세포를 박리함으로써 회수할 수 있다.

본 발명의 회수 방법에 있어서는, 비수용성 다당류의 분해 효소는, 그 종류에 따라 적절히 선택된다. 예를 들면, 비수용성 다당류로서 키틴 또는 키토산을 이용하는 경우, 그 분해 효소로서, 키티나아제, 키토비아제, 키토사나아제, β-1,3-글루카나아제 등을 이용할 수 있다. 비수용성 다당류로서 셀룰로오스를 이용하는 경우, 그 분해 효소로서, 셀룰라아제(엔도글루카나아제(EC 3.2.1.4)("EG"), 엑소글루카나아제 또는 셀로비오히드로라아제(EC 3.2.1.91)("CBH"), β-글루코시다아제([β]-D-글루코시데글루코히드로라아제; EC 3.2.1.21)("BG"))를 이용할 수 있다. 셀룰로오스 원료가 다량의 헤미셀룰로오스를 포함하는 경우, 셀룰로오스 이외에 헤미셀룰로오스를 분해하기 위한 효소로서 크실라나아제 또는 만나나아제를 첨가하는 것이 바람직하다. 복수의 분해 효소를 조합하여 이용해도 된다. 예를 들면, 비수용성 다당류로서 키틴 또는 키토산을 이용하는 경우, 그 분해 효소로서 키티나아제, 키토비아제, 키토사나아제, 및 β-1,3-글루카나아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2, 3 또는 4의 효소의 혼합물을 이용해도 된다. Yatalase(Takara Bio Inc.)는 키티나아제, 키토비아제, 키토사나아제 및 β-1,3-글루카나아제의 혼합물이며, 본 발명의 회수 방법에서 키틴 또는 키토산의 분해 효소로서 바람직하게 이용할 수 있다.

예를 들면, 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유에 접착된 접착성 세포의 현탁액에 비수용성 다당류의 분해 효소를 첨가하고, 접착성 세포의 박리에 충분한 시간 동안, 혼합물을 배양한다. 상기한 바와 같이, 박리에는 킬레이트제(EDTA) 또는 단백질 분해 효소(트립신, 콜라게나아제)가 요구되지 않으므로, 일 실시형태에 있어서, 킬레이트제(EDTA) 및/또는 단백질 분해 효소(예를 들면, 트립신, 콜라게나아제)를 첨가하는 일 없이, 현탁액에 비수용성 다당류의 분해 효소를 첨가한다. 또한, PBS 등에 의한 세정 조작이 불필요하므로, 일 실시형태에 있어서, 접착성 세포가 현탁되는 매체 중의 2가 이온 및/또는 단백질을 제거하는(예를 들면, 농도를 1/10 이하로 설정한다) 세정 조작을 행하는 일 없이, 매체에 비수용성 다당류의 분해 효소를 첨가한다. 비수용성 다당류의 분해 효소에 의한 배양 온도는 통상 20℃~37℃이다. 배양 시간은 효소의 종류 등에 따라 상이하고, 통상 5~60분이다.

나노섬유가 분해되고 접착성 세포가 나노섬유로부터 박리되는 경우, 현탁액에 원심분리를 실시함으로써, 박리된 접착성 세포를 회수할 수 있다.

이와 같이 회수된 접착성 세포에 대한 손상은 최소화되므로, 세포를 기능 분석, 이식 등에 바람직하게 이용할 수 있다.

예를 들면, 상기 비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유를 이용한 접착성 세포의 처리에 있어서, (1) 부유 배양((1-1) 유지 또는 증식, (1-2) 분화 유도) 또는 (2) 비동결 상태 하에서의 보존 및/또는 수송의 조작 후, 본 발명의 회수 방법에 의해 나노섬유로부터 접착성 세포를 박리하고 회수해도 된다. 상기 연속 조작(예를 들면, (a)~(l)) 후, 본 발명의 회수 방법에 의해 나노섬유로부터 접착성 세포를 박리하고 회수해도 된다.

본 발명의 배지 조성물의 실시예를 구체적으로 기재함으로써, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 그것 때문에 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

(실험예 1: 키틴 나노섬유를 이용한 3D 배양에 의한 인간 전구 지방 세포의 증식)

키틴 나노섬유(바이오매스 나노섬유 BiNFi-S 2질량%, Sugino Machine Limited, Lot. GG30-G30) 및 탈아실화 젤란검(DAG)(KELCOGEL CG-LA, SANSHO Co., Ltd. 제조)을 1%(w/v)까지, 각각 초순수(Milli-Q수)에서 현탁시키고, 90℃에서 가열에 의해 교반함으로써 분산시켜, 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균했다. 인간 전구 지방 세포 증식 배지(#CAS11K500, TOYOBO CO., LTD. 제조)에 키틴 나노섬유를 첨가함으로써 얻어진 배지 조성물(최종 농도: 0.003%(w/v), 0.01%(w/v), 0.03%(w/v)), 탈아실화 젤란검을 첨가한 배지 조성물(최종 농도: 0.015%(w/v), 0.03%(w/v)), 및 상기 기재를 갖지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속해서, 배양된 인간 전구 지방 세포(피하 조직 유래, #CAS02s05a, TOYOBO CO., LTD. 제조)를 상기 각 배지 조성물에서 33333세포/mL로 현탁시키고, 96웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트(Corning Incorporated 제조, #3474)에서 150μL/웰로 파종했다. CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 10일간 세포를 배양했다. 3, 7, 10일째의 배양 배지에 ATP 시약(150μL, CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay, Promega 제조)을 첨가하고, 세포를 현탁시켜, 약 10분간 실온에서 정치시켰다. FlexStation3(Molecular Devices 제조)에 의해 발광 강도(RLU값)를 측정하고, 배지 만의 발광값을 빼서, 4개의 샘플의 평균으로서 생존 세포의 수를 산출했다.

결과적으로, 키틴 나노섬유를 첨가한 배지 조성물을 이용하여 인간 전구 지방 세포를 배양한 경우, 0.003%(w/v) 이상의 농도에서 세포 증식 작용이 확인되었다. 각 배양에서의 RLU값(ATP 측정, 발광 강도)을 표 1에 나타낸다.

	0일째	3일째	7일째	10일째
미첨가	13140	13061	4673	2395
DAG 0.015%	13722	14974	8762	7560
DAG 0.003%	13620	14468	8221	7125
키틴 나노섬유 0.003%	14284	18541	20253	20114
키틴 나노섬유 0.01%	13760	18914	19413	21967
키틴 나노섬유 0.03%	13538	18517	19550	22909

(실험예 2: 키틴 나노섬유를 이용한 3D 배양에 의한 인간 지방 조직 유래 간엽계 줄기 세포의 증식)

키틴 나노섬유(바이오매스 나노섬유 BiNFi-S 2질량%, Sugino Machine Limited, Lot. GG30-G30)를 1%(w/v)까지, 초순수(Milli-Q수)에서 현탁시키고, 90℃에서 가열에 의해 교반함으로써 분산시켜, 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균했다. 저혈청 배지인 간엽계 줄기 세포 증식 배지(C-28009, Takara Bio Inc. 제조)에 키틴 나노섬유를 첨가함으로써 얻어지는 배지 조성물(최종 농도: 0.001%(w/v), 0.003%(w/v), 0.01%(w/v), 0.03%(w/v)), 및 상기 기재를 갖지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속해서, 배양된 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포(C-12977, Takara Bio Inc. 제조)를 상기 각 배지 조성물에서 13333세포/mL로 현탁시키고, 96웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트(Corning Incorporated 제조, #3474)에서 150μL/웰로 파종했다. 세포를 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 10일간 배양했다. 3, 7, 10일째의 배지에 ATP 시약(150μL, CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay, Promega 제조)을 첨가하고, 세포를 현탁시켜, 약 10분간 실온에서 정치시켰다. FlexStation3(Molecular Devices 제조)에 의해 발광 강도(RLU값)를 측정하고, 배지 만의 발광값을 빼서, 4개의 샘플의 평균으로서 생존 세포의 수를 산출했다.

결과적으로, 키틴 나노섬유를 첨가한 배지 조성물을 이용하여 인간 지방 조직 유래 간엽계 줄기 세포를 배양한 경우, 0.001%(w/v) 이상의 농도에서 세포 증식 촉진 작용이 확인되었다. 각 배양에서의 RLU값(ATP 측정, 발광 강도)을 표 2에 나타낸다.

	0일째	3일째	7일째	10일째
미첨가	1562	2646	3049	3954
키틴 나노섬유 0.001%	1488	3278	5721	6276
키틴 나노섬유 0.003%	1455	3071	3759	4868
키틴 나노섬유 0.01%	1646	5150	15716	15162
키틴 나노섬유 0.03%	1744	5106	15434	15386

(실험예 3: 키틴 나노섬유에 접착된 인간 전구 지방 세포의 회수)

키틴 나노섬유(바이오매스 나노섬유 BiNFi-S 2질량%, Sugino Machine Limited, Lot. GG30-G30)를 1%(w/v)까지, 초순수(Milli-Q수)에서 현탁시키고, 90℃에서 가열에 의해 교반함으로써 분산시켜, 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균했다. 인간 전구 지방 세포 증식 배지(#CAS11K500, TOYOBO CO., LTD. 제조)에 키틴 나노섬유를 첨가함으로써 얻어지는 배지 조성물(최종 농도: 0.03%(w/v))을 조제했다. 계속해서, 배양된 인간 전구 지방 세포(피하 조직 유래, #CAS02s05a, TOYOBO CO., LTD. 제조)를 상기 배지 조성물에서 33333세포/mL로 현탁시키고, 96웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트(Corning Incorporated 제조, #3474)에서 150μL/웰로 파종했다. 세포를 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 3일간 배양하고, 세포를 키틴 나노섬유에 접착시켰다.

배양 3일 후, 키틴 분해 효소를 포함한 Yatalase(Takara Bio Inc. 제조, T017)를 0.1%(w/v) 또는 0.25%(w/v)의 최종 농도로 각 웰에 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 약 1시간 정치시켰다. 그 후, 키틴 나노섬유 분해물 및 인간 전구 지방 세포를 포함한 4웰의 세포 현탁액을 15mL 시험관에 회수하고, 1500rpm으로 원심분리했다. 원심분리 후, 상청 중의 배지 성분을 제거하고, 침전된 인간 전구 지방 세포를 600μL의 인간 전구 지방 세포 증식 배지(#CAS11K500, TOYOBO CO., LTD. 제조)에서 현탁시켜, 96웰 평저 마이크로플레이트(Corning Incorporated 제조, #3585)에서 150μL/웰로 재파종하고, 사진 촬영을 했다.

결과적으로, 키틴 나노섬유를 첨가한 배지 조성물에서 인간 전구 지방 세포를 배양하는 경우, 인간 전구 지방 세포가 키틴 나노섬유에 접착되고, Yatalase를 이용하여 키틴 나노섬유를 소화하는 경우에 키틴 나노섬유에 접착된 인간 전구 지방 세포가 단세포형으로 단리될 수 있었던 것을 발견했다. Yatalase 처리 후의 세포의 사진을 도 2에 나타낸다.

(실험예 4: 키틴 나노섬유에 접착된 인간 전구 지방 세포의 회수 및 재파종)

키틴 나노섬유(바이오매스 나노섬유 BiNFi-S 2질량%, Sugino Machine Limited, Lot. GG30-G30)를 1%(w/v)까지, 초순수(Milli-Q수)에서 현탁시키고, 90℃에서 가열에 의해 교반함으로써 분산시켜, 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균했다. 인간 전구 지방 세포 증식 배지(#CAS11K500, TOYOBO CO., LTD. 제조)에 키틴 나노섬유를 첨가함으로써 얻어지는 배지 조성물(최종 농도: 0.03%(w/v))을 조제했다. 계속해서, 배양된 인간 전구 지방 세포(피하 조직 유래, #CAS02s05a, TOYOBO CO., LTD. 제조)를 상기 배지 조성물에서 33333세포/mL로 현탁시키고, 96웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트(Corning Incorporated 제조, #3474)에서 150μL/웰로 파종했다. 세포를 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 3일간 배양하고, 세포를 키틴 나노섬유에 접착시켰다.

배양 3일 후, 키틴 분해 효소를 포함한 Yatalase(Takara Bio Inc. 제조, T017)를 0.1%(w/v) 또는 0.25%(w/v)의 최종 농도로 각 웰에 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 약 1시간 정치시켰다. 그 후, 키틴 나노섬유 분해물 및 인간 전구 지방 세포를 포함한 4웰의 세포 현탁액을 15mL 시험관에 회수하고, 1500rpm으로 원심분리했다. 원심분리 후, 상청 중의 배지 성분을 제거하고, 침전된 인간 전구 지방 세포를 600μL의 인간 전구 지방 세포 증식 배지(#CAS11K500, TOYOBO CO., LTD. 제조)에서 현탁시켜, 96웰 평저 마이크로플레이트(Corning Incorporated 제조, #3585)에서 150μL/웰로 재파종하고, 세포 증식 및 지방 세포로의 분화 유도의 정도를 평가했다.

세포 증식은 ATP값의 측정법을 이용하여 평가했다. 재파종 후, 세포를 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 최대 7일간 배양했다. 재파종 후 0, 3, 7일째의 배지에 ATP 시약(150μL, CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay, Promega 제조)을 첨가하고, 혼합물을 약 10분간 실온에서 정치시켰다. FlexStation3(Molecular Devices 제조)에 의해 발광 강도(RLU값)를 측정하고, 배지 만의 발광값을 빼서, 생존 세포의 수(4개의 샘플의 평균)를 산출했다.

지방 세포로의 분화는 지방 세포 마커로서 mRNA 발현값을 이용하여 평가했다. 세포를 재파종하고, CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 3일간 배양했다. 96웰 평저 마이크로플레이트로의 세포의 접착을 확인하고, 배지를 제거해, 인간 지방 세포 분화 배지(#CAS11D250, TOYOBO CO., LTD. 제조) 150μL/웰로 교환했다. 세포를 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 10일간 배양했다.

분화 배지로의 교환 시(0일째)와 10일째에 RNeasy Mini kit(QIAGEN 제조)를 이용하여, 접착된 세포로부터 총 RNA를 추출했다. PrimeScript^TM RT Master Mix(Takara Bio Inc. 제조)를 이용하여, GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems 제조) 상에서 역전사 반응을 행하여, 총 RNA로부터 cDNA를 합성했다. 멸균수에 의해 1/10로 희석된, 얻어진 각 cDNA 샘플을 PCR 템플릿으로서 이용했다. 또한, 분배 및 혼합된 cDNA를 검량선 작성용 샘플로서 이용했다. 검량선은 3배 공비로 1/3에서 1/243 희석까지의 정량 범위에서 설정했다. PCR은 각 cDNA 샘플, 검량 샘플, Premix Ex Taq^TM(Takara Bio Inc. 제조) 및 각종 TaqMan 프로브(Applied Biosystems 제조), 및 7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems 제조)을 이용하여 행했다. PPIA(시클로필린 B) mRNA를 내재성 컨트롤로서 이용하고, PPAR 감마 mRNA 또는 리포프로테인 리파아제(LPL) mRNA의 발현을 PPIA의 값으로 보정했다. 이용한 프로브(Applied Biosystems 제조)를 이하에 나타낸다.

PPIA: HS99999904

PPAR 감마: HS011155134

LPL: HS00173425

결과적으로, 키틴 나노섬유를 첨가한 배지 조성물에서 인간 전구 지방 세포를 배양한 경우, 키틴 나노섬유에 인간 전구 지방 세포가 접착되고, Yatalase를 이용하여 키틴 나노섬유가 소화되는 경우에 키틴 나노섬유에 접착된 인간 전구 지방 세포가 단세포형으로 단리될 수 있었던 것을 발견했다. 또한, 단리된 세포는 96웰 평저 마이크로플레이트 상에서의 증식능 및 지방 세포로의 분화능을 유지한다. 세포 증식 평가에 관한 RLU값(ATP 측정, 발광 강도)을 표 3에 나타내고, 지방 세포 분화 평가에 관한 PPAR 감마 및 LPL mRNA 발현값은 각각 표 4 및 표 5에 나타낸다.

	0일째	3일째	7일째
Yatalase 0.1 %	9304	21547	57172
Yatalase 0.25 %	15017	16919	53602

PPAR 감마 (PPIA 보정값)	0일째	10일째
Yatalase 0.1 %	0.12	1.28
Yatalase 0.25 %	0.10	1.08

LPL 감마 (PPIA 보정값)	0일째	10일째
Yatalase 0.1 %	0	1.40
Yatalase 0.25 %	0	1.28

(실험예 5: 키틴 나노섬유에 접착된 인간 전구 지방 세포의 분화 유도)

키틴 나노섬유(바이오매스 나노섬유 BiNFi-S 2질량%, Sugino Machine Limited, Lot. GG30-G30)를 1%(w/v)까지, 초순수(Milli-Q수)에서 현탁시키고, 90℃에서 가열에 의해 교반함으로써 분산시켜, 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균했다. 이 용액을 이용하여, 인간 지방 세포 분화 배지(#CAS11D250, TOYOBO CO., LTD. 제조)에 키틴 나노섬유를 첨가함으로써 얻어지는 배지 조성물(최종 농도: 0.03%(w/v))을 조제했다. 계속해서, 배양된 인간 전구 지방 세포(피하 조직 유래, #CAS02s05a, TOYOBO CO., LTD. 제조)를 상기 배지 조성물에서 33333세포/mL로 현탁시키고, 96웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트(Corning Incorporated 제조, #3474)에서 150μL/웰로 파종했다. 세포를 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 최대 14일간 배양했다.

세포 생존성은 ATP값의 측정법을 이용하여 평가했다. 0, 4, 8, 14일째의 배지에 ATP 시약(150μL, CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay, Promega 제조)을 첨가하고, 혼합물을 약 10분간 실온에서 정치시켰다. FlexStation3(Molecular Devices 제조)에 의해 발광 강도(RLU값)를 측정하고, 배지 만의 발광값을 빼서, 생존 세포의 수(4개의 샘플의 평균)를 산출했다.

지방 세포로의 분화는 지방 세포 마커로서 mRNA 발현값을 이용하여 평가했다. 상기 배지 조성물에서의 인간 전구 지방 세포의 파종시(0일째), 및 4, 8 및 14일째에, RNeasy Mini kit(QIAGEN 제조)를 이용하여 세포 현탁액으로부터 총 RNA를 추출했다. PrimeScript^TM RT Master Mix(Takara Bio Inc. 제조)를 이용하여, GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems 제조) 상에서 역전사 반응을 행하여, 총 RNA로부터 cDNA를 합성했다. 멸균수에 의해 1/10로 희석된, 얻어진 각 cDNA 샘플을 PCR 템플릿으로서 이용했다. 또한, 분배 및 혼합된 cDNA를 검량선 작성용 샘플로서 이용했다. 검량선은 3배 공비로 1/3에서 1/243 희석까지의 정량 범위에서 설정했다. PCR은 각 cDNA 샘플, 검량 샘플, Premix Ex Taq^TM(Takara Bio Inc. 제조) 및 각종 TaqMan 프로브(Applied Biosystems 제조), 및 7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems 제조)을 이용하여 행했다. 이용한 프로브(Applied Biosystems 제조)를 이하에 나타낸다.

PPIA: HS99999904

PPAR 감마: HS011155134

LPL: HS00173425

FABP4: HS01086177

결과적으로, 배지 조성물에 키틴 나노섬유를 첨가한 조건 하에서 지방 세포로의 분화를 유도하는 경우, 세포 생존성을 유지하면서, 인간 지방 전구 세포로부터 지방 세포로 분화를 유도할 수 있었던 것이 분명해졌다. 세포 생존성에 대한 RLU값(ATP 측정, 발광 강도)을 표 6에 나타낸다. 0일째의 값이 100%인 경우의 상대값을 나타낸다. 지방 세포 분화 평가에 관한 PPAR 감마, LPL 및 FABP4 mRNA 발현을 표 7, 표 8 및 표 9에 나타낸다.

%	4일째	8일째	14일째
미첨가	68.3	67.4	57.6
키틴 나노섬유 0.01%	95.9	102.5	93.0

PPAR 감마 (PPIA 보정값)	0일째	4일째	8일째	14일째
미첨가	0.15	1.19	2.11	2.16
키틴 나노섬유 0.01%	0.27	1.03	1.76	1.88

LPL (PPIA 보정값)	0일째	4일째	8일째	14일째
미첨가	0	1.32	7.03	9.48
키틴 나노섬유 0.01%	0	1.76	6.01	10.96

FABP4 (PPIA 보정값)	0일째	4일째	8일째	14일째
미첨가	0	0.83	1.99	1.85
키틴 나노섬유 0.01%	0	1.03	1.54	1.86

(실험예 6: 키틴 나노섬유에 접착된 인간 전구 지방 세포의 수송 시험)

키틴 나노섬유(바이오매스 나노섬유 BiNFi-S 2질량%, Sugino Machine Limited, Lot. GG30-G30)를 1%(w/v)까지, 초순수(Milli-Q수)에서 현탁시키고, 90℃에서 가열에 의해 교반함으로써 분산시켜, 수용액(또는 현탁액)을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균했다. 인간 전구 지방 세포 증식 배지(#CAS11K500, TOYOBO CO., LTD. 제조), 또는 10% FBS(#35-015-CV, Corning Incorporated 제조)를 포함한 DMEM 배지(#044-29765, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)에 키틴 나노섬유를 첨가함으로써 얻어지는 배지 조성물(최종 농도: 0.01%(w/v)), 및 키틴 나노섬유를 갖지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속해서, 배양된 인간 전구 지방 세포(피하 조직 유래, #CAS02s05a, TOYOBO CO., LTD. 제조)를 상기 각 배지 조성물에서 90000세포/mL로 현탁시키고, 6웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트(#3471, Corning Incorporated 제조)에서 5mL/웰로 파종했다. 세포를 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 3일간 배양했다. 배양 후, 인간 전구 지방 세포가 접착된 키틴 나노섬유를 50mL 시험관에 회수했다. 원심분리 후, 펠릿된(pelletized) 인간 전구 지방 세포가 접착된 키틴 나노섬유에 새로운 인간 전구 지방 세포 증식 배지(#CAS11K500, TOYOBO CO., LTD. 제조), 또는 10% FBS(#35-015-CV, Corning Incorporated 제조)를 포함한 DMEM 배지(#044-29765, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)를 첨가하고, 또는 현탁시켜, 6웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트(Corning Incorporated 제조, #3471) 또는 15mL 시험관으로 옮겼다. 6웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트는 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 7일간 배양하고, 15mL 시험관은 25℃ 배양기에서 7일간 정치시켰다.

CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂) 또는 25℃ 배양기에서 7일간 유지된 키틴 나노섬유에 접착된 인간 전구 지방 세포를 100mm 배양 디쉬(#430167, Corning Incorporated 제조)에 배지와 함께 재파종했다. CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 7일간 세포를 더 배양하고, 키틴 나노섬유로부터 유주 또는 증식되는 인간 전구 지방 세포를 현미경으로 관찰했다(도 3).

현미경에 의한 확인 후, 배지를 제거하고, 디쉬에 접착된 인간 전구 지방 세포 및 키틴 나노섬유를 PBS(-)(#045-29795, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)로 세정하고, 트립신(#CA090K, TOYOBO CO., LTD. 제조)을 첨가하여 인간 전구 지방 세포 만을 회수했다. 회수된 인간 전구 지방 세포를, 인간 전구 지방 세포 증식 배지(#CAS11K500, TOYOBO CO., LTD. 제조), 또는 10% FBS(#35-015-CV, Corning Incorporated 제조)를 포함한 DMEM 배지(#044-29765, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)에서 현탁시키고, 6웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트(Corning Incorporated 제조, #3471)에서 5mL/웰로 파종하여, 5일간 배양했다. 5일간 배양 후, 지방 세포 분화 배지(#CA811D250, TOYOBO CO., LTD. 제조)로 배지를 교환하고, 배양을 17일간 더 계속하여, 지방 세포로의 분화 유도를 현미경으로 관찰했다(도 4).

결과적으로, 키틴 나노섬유에 접착된 인간 전구 지방 세포는 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂) 또는 25℃ 배양기 중 어느 조건에서도 7일간 정치한 후에 키틴 나노섬유로부터의 유주능 및 증식능을 나타내고(도 3), 지방 세포로의 분화능을 유지했다(도 4). 인간 전구 지방 세포 증식 배지(#CAS11K500, TOYOBO CO., LTD. 제조), 및 10% FBS(#35-015-CV, Corning Incorporated 제조)를 포함한 DMEM 배지(#044-29765, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조) 중 어느 것을 이용해도 비슷한 결과가 얻어졌다.

(실험예 7: 키틴 나노섬유에 접착된 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포의 수송 시험)

키틴 나노섬유(바이오매스 나노섬유 BiNFi-S 2질량%, Sugino Machine Limited, Lot.GG30-G30)를 1%(w/v)까지, 초순수(Milli-Q수)에서 현탁시키고, 90℃에서 가열에 의해 교반함으로써 분산시켜, 수용액(또는 현탁액)을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균했다. ADSC 배지(#C-28009, Takara Bio Inc. 제조), 또는 10% FBS(#35-015-CV, Corning Incorporated 제조)를 포함한 DMEM 배지(#044-29765, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)에 키틴 나노섬유를 첨가함으로써 얻어지는 배지 조성물(최종 농도: 0.01%(w/v)), 및 키틴 나노섬유를 갖지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속해서, 배양된 인간 지방 조직 유래 간엽계 줄기 세포(#C-12977, Takara Bio Inc. 제조)를 상기 각 배지 조성물에서 90000세포/mL로 현탁시키고, 6웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트(#3471, Corning Incorporated 제조)에서 5mL/웰로 파종했다. 세포를 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 3일간 배양했다. 배양 후, 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포가 접착된 키틴 나노섬유를 50mL 시험관에 회수했다. 원심분리 후, 펠릿된 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포가 접착된 키틴 나노섬유에, 새로운 ADSC 배지(#C-28009, Takara Bio Inc. 제조), 또는 10% FBS(#35-015-CV, Corning Incorporated 제조)를 포함한 DMEM 배지(#044-29765, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)를 첨가하고, 현탁시켜, 6웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트(Corning Incorporated 제조, #3471) 또는 15mL 시험관으로 옮겼다. 6웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트는 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 7일간 배양하고, 15mL 시험관은 25℃ 배양기에서 7일간 정치시켰다.

CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂) 또는 25℃ 배양기에서 7일간 유지된 키틴 나노섬유에 접착된 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포를, 100mm 배양 디쉬(#430167, Corning Incorporated 제조)에 배지와 함께 재파종했다. 세포를 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 7일간 더 배양하고, 키틴 나노섬유로부터 유주 또는 증식된 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포를 현미경으로 관찰했다(도 5).

현미경으로 확인 후, 배지를 제거하고, 디쉬에 접착된 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포와 키틴 나노섬유를 PBS(-)(#045-29795, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)로 세정하고, 트립신(#C-41210, Takara Bio Inc. 제조)을 첨가하여 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포 만을 회수했다. 회수한 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포를 ADSC 배지(#C-28009, Takara Bio Inc. 제조), 또는 10% FBS(#35-015-CV, Corning Incorporated 제조)를 포함한 DMEM 배지(#044-29765, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조)에서 현탁시키고, 6웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트(Corning Incorporated 제조, #3471)에서 5mL/웰로 파종하여 2일간 배양했다. 2일간 배양 후, 지방 세포 분화 배지(#C-28016, Takara Bio Inc. 제조)로 배지를 교환하고, 배양을 8일간 더 계속해, 지방 세포로의 분화 유도를 현미경으로 관찰했다(도 6).

결과적으로, 키틴 나노섬유에 접착된 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포는, CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂) 또는 25℃ 배양기 중 어느 조건에서도 7일간 정치 후에 키틴 나노섬유로부터의 유주능 및 증식능을 나타냈고(도 5), 지방 세포로의 분화능을 유지했다(도 6). ADSC 배지(#C-28009, Takara Bio Inc. 제조), 및 10% FBS(#35-015-CV, Corning Incorporated 제조)를 포함한 DMEM 배지(#044-29765, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제조) 중 어느 배지를 이용해도 비슷한 결과가 얻어졌다.

상기 결과로부터, 키틴 나노섬유에 접착되어 있는 상태로 세포가 수송되고, 세포가 직접 디쉬에 재파종되며, 세포가 디쉬 상에 유주 또는 증식되어, 트립신 등으로 회수되는, 비동결 상태 하에서의 새로운 세포 수송법을 확립했다. 모델을 도 7에 나타낸다.

(실험예 8: α 키틴 나노섬유, β 키틴 나노섬유, 또는 키토산 나노섬유를 이용한 3D 배양에 의한 MDCK 세포 증식 효과)

WO 2015/111686 A1에 따라 조제한 α 키틴 나노섬유(바이오매스 나노섬유 BiNFi-S 2질량%, Sugino Machine Limited)를 1%(w/v)까지, 초순수(Milli-Q수)에서 현탁시키고, 90℃에서 가열에 의해 교반함으로써 분산시켜, 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균했다. 또한, 키토산 나노섬유 및 β 키틴 나노섬유를 1%(w/v)까지, 초순수(Milli-Q수)에서 현탁시키고, 90℃에서 가열에 의해 교반함으로써 용해시켜, 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균했다. 이용한 나노섬유는, 200MPa, 패스 10회의 소섬유화(fibrillating) 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 1), 200MPa, 패스 1회의 소섬유화 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 2), 200MPa, 패스 10회의 소섬유화 조건으로 나노섬유화한 키토산 나노섬유(샘플 3), 및 200MPa, 패스 10회의 소섬유화 조건으로 나노섬유화한 β 키틴 나노섬유(샘플 4)이다.

무혈청 배지 KBM220 배지(KOHJIN BIO 조제)에 0.03%(w/v)의 최종 농도로 각 나노섬유 샘플(1~4)을 첨가함으로써 배지 조성물을 조제했다. 계속해서, 배양된 개 신장 세뇨관 상피 세포주 MDCK(DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD. 제조)를, 상기 각 나노섬유 샘플(1~4)을 첨가한 배지 조성물에서 66666세포/mL로 파종하고, 125mL 플라스크(Thermo Scientific, 4115-0125)에 30mL씩 분배했다. 각 플라스크는 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 진탕 상태(cfg50rpm)로 6일간 계속해서 배양했다. 6일째에, 각 나노섬유 샘플(1~4) 및 나노섬유에 접착된 MDCK 세포를 50mL 시험관에 회수하고, 원심분리(cfg1000rpm, 3분)하여, 배지 만을 제거했다. 잔존한 각 나노섬유 샘플 및 MDCK 세포에 새로운 KBM220 배지를 첨가 및 현탁시키고, 현탁액을 원래의 125mL 플라스크로 되돌려, 진탕 상태(cfg50rpm)로 계속해서 배양했다. 배지 교환을 위한 상기 조작은 9일째와 13일째에도 행했다.

0, 6, 13, 17일째의 배지를 피펫팅에 의해 현탁시키고, 100μL의 세포 현탁액에 대해 ATP 시약(100μL, CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay, Promega 제조)을 첨가 및 반응시켜, 혼합물을 약 10분간 실온에서 정치시켰다. FlexStation3(Molecular Devices 제조)에 의해 발광 강도(RLU값)를 측정하고, 배지 만의 발광값을 빼서, 4개의 샘플의 평균으로서 생존 세포의 수를 측정했다.

결과적으로, 125mL 플라스크 중에서 각 나노섬유 샘플(1~4)을 포함한 배지 조성물에 MDCK 세포를 배양하는 경우, α 키틴 나노섬유를 첨가한 샘플 2에서 가장 높은 세포 증식 촉진 작용이 확인되었다. 또한, 샘플 1의 α 키틴 나노섬유와 샘플 3의 키토산 나노섬유에서도 세포 증식 촉진 효과가 확인되었다. 한편, 샘플 4의 β 키틴 나노섬유는 약한 세포 증식 촉진 작용을 나타냈다. 각 배양에서의 RLU값(ATP 측정, 발광 강도)을 표 10에 나타낸다.

샘플	나노섬유	0일째	6일째	13일째	17일째
1	α 키틴 (샘플 1)	7307	10351	18945	25889
2	α 키틴 (샘플 2)	6985	17469	38108	47912
3	키토산 (샘플 3)	6905	12058	21853	25649
4	β 키틴 (샘플 4)	6566	10663	10093	9916

(실험예 9: 각 소섬유화 조건 하에서의 α 키틴 나노섬유를 이용한 3D 배양에 의한 MDCK 세포 증식 효과)

WO 2015/111686 A1에 따라 조제한 α 키틴 나노섬유(바이오매스 나노섬유 BiNFi-S 2질량%, Sugino Machine Limited)를 1%(w/v)까지, 초순수(Milli-Q수)에서 현탁시키고, 90℃에서 가열에 의해 교반함으로써 분산시켜, 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균했다. 이용한 α 키틴 나노섬유는, 200MPa, 패스 10회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 1), 200MPa, 패스 1회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 2), 100MPa, 패스 1회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 5), 200MPa, 패스 3회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 6), 100MPa, 패스 5회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 7), 및 α 키틴 원료(샘플 8)이다.

무혈청 배지 KBM220 배지(KOHJIN BIO 조제)에 0.03%(w/v)의 최종 농도로 각 나노섬유 샘플(1, 2, 5~8)을 첨가함으로써 배지 조성물을 조제하고, 상기 기재를 갖지 않는 미첨가 배지 조성물(샘플 9)을 조제했다.

계속해서, 개 신장 세뇨관 상피 세포주 MDCK(DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD. 제조)를, 상기 각 나노섬유 샘플(1, 2, 5~8)을 첨가한 배지 조성물에서 66666세포/mL로 파종하고, 125mL 플라스크(Thermo Scientific, 4115-0125)에 30mL씩 분배했다. 각 플라스크는 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 7일간 진탕 상태(cfg50rpm)로 계속해서 배양했다.

0, 3, 7일째의 배지를 피펫팅에 의해 현탁시키고, 100μL의 세포 현탁액에 대해 ATP 시약(100μL, CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay, Promega 제조)을 첨가 및 반응시켜, 혼합물을 약 10분간 실온에서 정치시켰다. FlexStation3(Molecular Devices 제조)에 의해 발광 강도(RLU값)를 측정하고, 배지만의 발광값을 빼서, 4개의 샘플의 평균으로서 생존 세포의 수를 측정했다.

결과적으로, 125mL 플라스크 중에서 각 나노섬유 샘플(1, 2, 5~8)을 포함한 배지 조성물에 MDCK 세포를 배양하는 경우, 저소섬유화인 α 키틴 나노섬유를 첨가한 샘플 5 및 샘플 6에서 가장 높은 세포 증식 촉진 작용이 확인되었다. 한편, 샘플 8의 α 키틴 원료의 세포 증식 촉진 작용은 확인되지 않았다. 각 배양에서의 RLU값(ATP 측정, 발광 강도)을 표 11에 나타낸다.

샘플	나노섬유(소섬유화)	0일째	3일째	7일째
1	α 키틴(샘플 1)	7884	17483	27007
2	α 키틴(샘플 2)	8146	32372	42390
5	α 키틴(샘플 5)	8058	23258	35941
6	α 키틴(샘플 6)	8328	23941	50496
7	α 키틴(샘플 7)	8143	29171	55898
8	α 키틴 원료(샘플 8)	7619	2401	4507
9	미첨가(샘플 9)	8096	5374	2947

(실험예 10: 각 소섬유화 조건 하에서의 α 키틴 나노섬유를 이용한 3D 배양에 의한 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포 증식 작용)

WO 2015/111686 A1에 따라 조제한 α 키틴 나노섬유(바이오매스 나노섬유 BiNFi-S 2질량%, Sugino Machine Limited)를 1%(w/v)까지, 초순수(Milli-Q수)에서 현탁시키고, 90℃에서 가열에 의해 교반함으로써 분산시켜, 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균했다. 이용한 α 키틴 나노섬유는, 200MPa, 패스 10회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 1), 200MPa, 패스 1회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 2), 및 200MPa, 패스 5회의 조건으로 나노섬유화한 키토산 나노섬유(샘플 10)였다.

간엽계 줄기 세포 증식 배지 2 배지(Takara Bio Inc. 제조)에 0.001%(w/v), 0.003%(w/v), 또는 0.01%(w/v)의 최종 농도로 각 나노섬유 샘플(1, 2, 10)을 첨가함으로써 배지 조성물을 조제하고, 상기 기재를 갖지 않는 미첨가 배지 조성물(샘플 9)을 조제했다. 계속해서, 배양된 인간 골수 유래 간엽계 줄기 세포(C-12974, Takara Bio Inc. 제조)를, 상기 키틴 나노섬유 첨가 배지 조성물 또는 미첨가 배지 조성물에서 20000세포/mL로 파종하고, 96웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트(Corning Incorporated 제조, #3474)의 웰에 웰당 150μL씩 분배했다. 각 플레이트는 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 10일간 계속해서 배양했다. 3, 7, 10일째의 배지에 ATP 시약(150μL, CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay, Promega 제조)을 첨가하고, 혼합물을 현탁시켜, 약 10분간 실온에서 정치시켰다. FlexStation3(Molecular Devices 제조)에 의해 발광 강도(RLU값)를 측정하고, 배지 만의 발광값을 빼서, 4개의 샘플의 평균으로서 생존 세포의 수를 측정했다.

결과적으로, 96웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트 중에서 각 나노섬유 샘플(1, 2, 10)을 포함한 배지 조성물에 인간 골수 간엽계 세포를 배양하는 경우, 샘플 1과 비교하여, 저소섬유화인 α 키틴 나노섬유를 첨가한 샘플 2 및 샘플 10에서 가장 높은 세포 증식 촉진 작용이 확인되었다. 각 배양에서의 RLU값(ATP 측정, 발광 강도)을 표 12에 나타낸다.

	0일째	3일째	7일째	10일째
미첨가(샘플 9)	4067	4178	2875	4391
샘플 1 0.001%	4664	5752	3790	6212
샘플 1 0.003%	4516	5366	5865	7210
샘플 1 0.01%	4125	6005	7964	10299
샘플 2 0.001%	4092	5094	6877	7319
샘플 2 0.003%	4193	5499	9676	13407
샘플 2 0.01%	3872	5564	8894	15736
샘플 10 0.001%	4029	4769	6820	7898
샘플 10 0.003%	4494	6419	11462	14588
샘플 10 0.01%	3249	5204	10485	15105

(실험예 11: 고소섬유화 조건 하에서의 α 키틴 나노섬유를 이용한 3D 배양에 의한 MDCK 세포 증식 작용)

WO 2015/111686 A1에 따라 조제한 α 키틴 나노섬유(바이오매스 나노섬유 BiNFi-S 2질량%, Sugino Machine Limited)를 1%(w/v)까지, 초순수(Milli-Q수)에서 현탁시키고, 90℃에서 가열에 의해 교반함으로써 분산시켜, 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균했다. 이용한 α 키틴 나노섬유는, 200MPa, 패스 1회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 2), 200MPa, 패스 20회의 조건으로 나노섬유화한 키토산 나노섬유(샘플 11), 200MPa, 패스 50회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 12), 200MPa, 패스 100회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 13), 및 200MPa, 패스 200회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 14)였다.

무혈청 배지 KBM220 배지(KOHJIN BIO 조제)에 0.006%(w/v), 0.02%(w/v), 또는 0.06%(w/v)의 최종 농도로 각 나노섬유 샘플(2, 11~14)을 첨가함으로써 배지 조성물을 조제하고, 상기 기재를 갖지 않는 미첨가 배지 조성물(샘플 9)을 조제했다. 계속해서, 개 신장 세뇨관 상피 세포주 MDCK(DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD. 제조)를, 상기 키틴 나노섬유 첨가 배지 조성물 또는 미첨가 배지 조성물에서 33333세포/mL로 파종하고, 96웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트(Corning Incorporated 제조, #3474)의 웰에 웰당 150μL씩 분배했다. 각 플레이트는 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 6일간 계속해서 배양했다. 3, 6일째의 배지에 ATP 시약(100μL, CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay, Promega 제조)을 첨가하고, 혼합물을 현탁시켜, 약 10분간 실온에서 정치시켰다. FlexStation3(Molecular Devices 제조)에 의해 발광 강도(RLU값)를 측정하고, 배지 만의 발광값을 빼서, 4개의 샘플의 평균으로서 생존 세포의 수를 측정했다.

결과적으로, 96웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트 중에서 각 나노섬유 샘플(2, 11~14)을 포함한 배지 조성물에 MDCK 세포를 배양하는 경우, 샘플 2와 비교하여, 고소섬유화인 α 키틴 나노섬유를 첨가한 샘플 11에서 약한 세포 증식 촉진 작용이 확인되었다. 소섬유화를 증가시킨 샘플(12~14)은 더 약한 촉진 작용 밖에 나타내지 않았다. 각 배양에서의 RLU값(ATP 측정, 발광 강도)을 표 13에 나타낸다.

	3일째	6일째
미첨가(샘플 9)	7241	8361
샘플 2(0.006%)	17882	47095
샘플 2(0.02%)	16804	53055
샘플 2(0.06%)	16134	56368
샘플 11(0.006%)	14312	36919
샘플 11(0.02%)	15382	39506
샘플 11(0.06%)	14744	41891
샘플 12(0.006%)	13896	28671
샘플 12(0.02%)	14692	31694
샘플 12(0.06%)	15321	36274
샘플 13(0.006%)	13889	29671
샘플 13(0.02%)	13754	30630
샘플 13(0.06%)	15345	32912
샘플 14(0.006%)	13509	27234
샘플 14(0.02%)	14106	33868
샘플 14(0.06%)	14106	33868

(실험예 12: 키틴 나노섬유에 접착된 인간 전구 지방 세포의 시트의 제작)

제조예 1에서 조제한 키틴 나노섬유(바이오매스 나노섬유 BiNFi-S 2질량%, Sugino Machine Limited, Lot. GG30-G30)를 1%(w/v)까지, 초순수(Milli-Q수)에서 현탁시키고, 90℃에서 가열에 의해 교반함으로써 분산시켜, 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균했다. 인간 전구 지방 세포 증식 배지(#CAS11K500, TOYOBO CO., LTD. 제조)에 0.01%(w/v)의 최종 농도로 키틴 나노섬유를 첨가함으로써 배지 조성물을 조제하고, 상기 기재를 갖지 않는 미첨가 배지 조성물을 조제했다. 계속해서, 배양된 인간 전구 지방 세포(피하 조직 유래, #CAS02s05a, TOYOBO CO., LTD. 제조)를, 상기 키틴 나노섬유 첨가 배지 조성물 또는 미첨가 배지 조성물에서 33333세포/mL로 파종하고, 96웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트(Corning Incorporated 제조, #3474)의 웰에 웰당 150μL씩 분배했다. 각 플레이트는 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 10일간 계속해서 배양했다. 10일째에, 인간 전구 지방 세포를 관찰하고, 사진 촬영을 했다.

결과적으로, 본 발명의 배지 조성물인 키틴 나노섬유를 이용하여 인간 전구 지방 세포를 96웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트 상에서 10일간 배양하는 경우, 도 8에 나타낸 바와 같이, 키틴 나노섬유와 인간 전구 지방 세포의 융합에 의해 세포 시트가 얻어지는 것이 분명해졌다.

(실험예 13: 키틴 나노섬유를 이용한 3D 배양에 의한 인간 지방 조직 유래 간엽계 줄기 세포의 증식)

WO 2015/111686 A1에 따라 조제한 α 키틴 나노섬유(바이오매스 나노섬유 BiNFi-S 2질량%, Sugino Machine Limited)를 1%(w/v)까지, 초순수(Milli-Q수)에서 현탁시키고, 90℃에서 가열에 의해 교반함으로써 분산시켜, 수용액을 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균했다. 이용한 α 키틴 나노섬유는, 200MPa, 패스 5회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 15), 200MPa, 패스 20회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 11), 200MPa, 패스 50회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 12), 200MPa, 패스 100회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 13), 및 200MPa, 패스 200회의 조건으로 나노섬유화한 α 키틴 나노섬유(샘플 14)였다. 저혈청 배지인 간엽계 줄기 세포 증식 배지(C-28009, Takara Bio Inc. 제조)에 키틴 나노섬유를 첨가함으로써 배지 조성물(최종 농도: 0.002%(w/v), 0.006%(w/v), 0.02%(w/v))을 얻고, 상기 기재를 갖지 않는 미첨가 배지 조성물(샘플 9)을 조제했다. 계속해서, 배양된 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포(C-12977, Takara Bio Inc. 제조)를 상기 각 배지 조성물에서 13333세포/mL로 현탁시키고, 96웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트(Corning Incorporated 제조, #3474)에서 150μL/웰로 파종했다. 세포를 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 정치 상태로 10일간 배양했다. 4, 8, 11일째의 배지에 ATP 시약(150μL, CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay, Promega 제조)을 첨가하고 현탁시켜, 혼합물을 약 10분간 실온에서 정치시켰다. FlexStation3(Molecular Devices 제조)에 의해 발광 강도(RLU값)를 측정하고, 배지 만의 발광값을 빼서, 생존 세포의 수(4개의 샘플의 평균)를 산출했다.

결과적으로, 96웰 평저 초저접착 표면 마이크로플레이트에서, 각 나노섬유 샘플(15, 11~14)을 포함한 배지 조성물에 인간 지방 유래 간엽계 줄기 세포를 배양하는 경우, 고소섬유화인 α 키틴 나노섬유 첨가(샘플 11)에 의해, 샘플 15와 비교하여, 약한 세포 증식 촉진 작용이 확인되었다. 소섬유화를 증가시킨 샘플(12~14)은 분명한 증식 촉진 작용을 나타내지 않았다. 각 배양에서의 RLU값(ATP 측정, 발광 강도)을 표 14 및 표 15에 나타낸다.

	4일째	8일째	11일째
미첨가(샘플 9)	4972	8512	6938
샘플 15(0.002%)	10481	18950	19409
샘플 15(0.006%)	9906	17758	23314
샘플 15(0.02%)	9861	16065	21629
샘플 11(0.002%)	9170	13776	14939
샘플 11(0.006%)	9684	13790	18219
샘플 11(0.02%)	9250	12270	16744
샘플 12(0.002%)	8491	10658	11137
샘플 12(0.006%)	8083	8902	10370
샘플 12(0.02%)	7706	7436	8271

	4일째	8일째	11일째
미첨가(샘플 9)	4648	3960	5375
샘플 15(0.002%)	10298	18656	16750
샘플 15(0.006%)	10042	17958	21934
샘플 15(0.02%)	10020	15931	24792
샘플 13(0.002%)	8765	10499	12185
샘플 13(0.006%)	8631	9168	11430
샘플 13(0.02%)	7341	7715	8381
샘플 14(0.002%)	8258	11109	12561
샘플 14(0.006%)	8504	9727	10712
샘플 14(0.02%)	7500	7327	8287

실험예 8~13에서 이용한 각종 소섬유화 조건(압력, 그라인딩수)으로 조제되는 α 키틴 분산액의 물성값(α 키틴의 측정 농도, 점도, 메디안 입자 크기 및 평균 입자 크기)을 표 16에 나타낸다.

압력 MPa	그라인딩수 패스	측정 농도 %(w/v)	점도 mPa·S (22.3~26.2℃)	레이저 회절 메디안 입자 크기 μm	레이저 회절 평균 입자 크기 μm
200	1	0.77%	1.02	55.9	80
		0.99%	2.10	58.5	68.6
200	3	1.15%	4.23	104.6	132.2
200	5	1.19%	6.75	68.3	83.5
		1.05%	6.73	65	80.7
200	10	1.17%	71.90	29.8	40.8
200	20	0.96%	58.30	38.2	52.8
		0.96%	53.00	34.3	40.8
200	50	1.05%	82.10	0.6	0.93
200	100	1.12%	58.50	0.53	0.8
200	200	1.14%	32.70	0.67	0.84
100	5	0.84%	8.37	96.2	116.1

비수용성 다당류로 이루어지는 나노섬유는, 간엽계 줄기 세포, 전구 지방 세포 등의 접착성 세포의 i) 배양, ii) 분화 유도, iii) 비동결 조건 하에서의 수송 및 보존, iv) 이식, v) 배양 상청으로부터의 생리 활성 물질의 회수 등의 여러 가지 조작에 있어서 공통의 캐리어로서 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 캐리어를 이용하면, 상기 i) 배양, ii) 분화 유도, iii) 비동결 조건 하에서의 수송 및 보존, iv) 이식, v) 배양 상청으로부터의 생리 활성 물질의 회수로부터 선택되는 복수의 조작을 연속적으로 행할 수 있다.

본 명세서에 기재된, 특허 및 특허 출원서를 포함한 임의의 간행물에 개시된 내용은, 본 명세서에 개시된 정도까지, 참조에 의해 그 전체가 여기에 포함된다.

(관련 출원의 표시)

본 출원은 일본에 출원된 특허 출원 번호 2017-68377(출원일: 2017년 3월 30일) 및 일본에 출원된 특허 출원 번호 2017-174237(출원일: 2017년 9월 11일)을 기초로 하며, 참조에 의해 그 내용이 전부 여기에 포함된다.

Claims (3)

1. 간엽계 줄기 세포 또는 전구 지방 세포를, α 키틴 나노섬유를 함유하는 배지에서 부유 배양하는 단계를 포함하는, 간엽계 줄기 세포 또는 전구 지방 세포를 생산하는 방법.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 α 키틴 나노섬유는 하기 조건 (i) 내지 (iii)을 사용하여 조제되는 것인, 방법:
   (i) 고압 호모지나이저의 초고압 챔버로 압송하는 압력이 50~250MPa이고,
   (ii) 초고압 챔버에 통과시키는 처리 횟수가 1~10이고, 또한
   (iii) 수분산액 중의 원료로서의 α 키틴의 농도가 0.1질량%~1질량%이다.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 배지는 0.0001~1.0%(중량/용량)의 α 키틴 나노섬유를 포함하는, 방법.

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