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CN118546856B - 一种源自竹叶的多功能组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种源自竹叶的多功能组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN118546856B CN202410571005.3A CN202410571005A CN118546856B CN 118546856 B CN118546856 B CN 118546856B CN 202410571005 A CN202410571005 A CN 202410571005A CN 118546856 B CN118546856 B CN 118546856B
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Abstract

本发明提供了一种源自竹叶的多功能组合物，属于竹叶资源开发技术领域，所述组合物包括外泌体和纳米纤维，所述外泌体和所述纳米纤维均来源于竹叶，所述外泌体和所述纳米纤维的质量比为1：(1～100)。该组合物的所有成分均提取自竹叶，具有协同促进细胞增殖、抗氧化和抑制细菌生长等功能，该组合物成分丰富、稳定性高、且无有机溶剂残留，同时还具备滞留靶向性高、半衰期长的特点，具有巨大的应用转化前景。本发明还提供了一种源自竹叶的多功能组合物的制备方法和应用。

Description

一种源自竹叶的多功能组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于竹叶资源开发技术领域，特别涉及一种源自竹叶的多功能组合物及其制备方法和应用。
背景技术
竹子属于农业和林业的经济作物之一，且竹产业已成为全球公认的绿色产业，拥有巨大的经济价值、生态价值、文化价值和药用价值。但在竹子资源的综合利用中，竹叶的开发明显滞后，基本上处于原始阶段。根据栽培者提供的数据，竹叶通常被视为农业废弃物，大多数落叶腐烂后成为优质有机肥，有些则作为冬春季的畜类青饲料（Journal ofNatural Fibers, 2023, 20(1): 2178581.）。近年来研究报道了竹叶中含有多种活性物质包括黄酮类、酚酸类、多糖、竹醌、辅酶Q10等，具有抑菌、抗炎、抗氧化、预防心血管疾病和代谢性疾病、抗糖尿病等药理作用（J Ethnopharmacol. 2023 Apr 24;306:116166；Antioxidants (Basel). 2023 Jun 8;12(6):1239.；Nutrients. 2022 Feb 14;14(4):793.），引起了对竹叶资源开发利用的重视。然而，传统植物提取物的提取方式多采用有机溶剂萃取，易造成有机溶剂残留，对人体产生刺激或有害影响；且得到的化学提取物的成分易被破坏，一般只包含单一或几种活性物；活性物直接与空气接触，易氧化变质；化学提取物通常无法直接进入细胞内发挥作用。
研究显示，相较于化学提取物，植物外泌体提取技术不需要其他介质，无杂质引入，因此原料的安全性会更高，生产成本更低。植物外泌体是由活细胞分泌的具有膜结构的囊泡，是一种天然的纳米级颗粒，其中富集了大量植物次生代谢产物，以及多种RNA、蛋白质、脂质等活性物质，因此可保留与原植物相似的药理活性，与单一的植物提取物相比，具有多组分、多交叉尺度、多效应的特点，在细胞摄取和功能协同方面具有显著优势，可作为一种新型的药效物质（Pharmaceutics. 2022 Sep 8;14(9):1905.； J ExtracellVesicles. 2021 Feb;10(4):e12069.；Cell Host Microbe. 2018 Nov 14;24(5):637-652.e8.）。并且植物外泌体表面有磷脂双分子层保护，稳定性更高。但现有的植物外泌体还存在滞留靶向性差、体内半衰期短，难以控释等问题，导致植物外泌体的实际应用受到限制。
发明内容
为了解决传统竹叶提取物成分单一、稳定性差和有机溶剂残留的问题，本发明提供了一种源自竹叶的多功能组合物，该组合物的所有成分均提取自竹叶，具有协同促进细胞增殖、抗氧化和抑制细菌生长等功能，该组合物成分丰富、稳定性高、且无有机溶剂残留，同时还具备滞留靶向性高、半衰期长的特点，具有巨大的应用转化前景。
本发明还提供了一种源自竹叶的多功能组合物的制备方法和应用。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供一种源自竹叶的多功能组合物，所述组合物包括外泌体和纳米纤维，所述外泌体和所述纳米纤维均来源于竹叶，所述外泌体和所述纳米纤维的质量比为1：（1～100）。
进一步的，所述外泌体的分子量为3 kD～100 kD，粒径为30～500 nm。
进一步的，所述纳米纤维包括纤维素纳米纤维、阳离子纤维素纳米纤维、阴离子纤维素纳米纤维和纤维素纳米晶中的至少一种。
进一步的，所述纤维素纳米纤维的直径为5～60 nm，长度为200-1000 nm,所述纤维素纳米晶的直径为5～60 nm，长度＜100 nm；
所述阳离子纤维素纳米纤维和所述阴离子纤维素纳米纤维均通过所述纤维素纳米纤维改性获得。
基于同一发明构思，本发明提供一种源自竹叶的多功能组合物，所述组合物包括外泌体提取液和纳米纤维，所述外泌体提取液和所述纳米纤维均来源于竹叶，所述外泌体提取液的体积和所述纳米纤维的质量比值为（1～1000）mL：1g。
基于同一发明构思，本发明提供一种源自竹叶的多功能组合物的制备方法，所述制备方法包括：
将鲜竹叶碎片浸泡于渗透缓冲液中，后取出榨汁，所得汁液进行离心，取上清液，收集下层沉淀物；
将所述上清液先在离心力2000～6000 xg下离心40～80 min，后在离心力8000-12000 xg下离心40～80 min，取上清，除去其中分子量大于100 kD和小于3 kD的组分，获得外泌体提取液；
将所述下层沉淀物依次进行碱处理和漂白处理，后进行以下操作中的至少一项，获得纳米纤维：
a.所述漂白处理完毕后，进行机械处理，获得纤维素纳米纤维；
其中，所述机械处理包括研磨、高速剪切、高乳化剪切、高压均质法和超声处理中的任意一种；
b.所述漂白处理完毕后，进行机械处理，再经化学处理或生物降解处理，获得阳离子纤维素纳米纤维或阴离子纤维素纳米纤维；
其中，所述化学处理包括超低酸水解、有机酸水解、季铵盐阳离子化改性、TEMPO氧化降解、高碘酸盐氧化和低共熔溶剂处理中的任意一种，所述生物降解处理包括酶解或微生物发酵；
c.所述漂白处理完毕后，采用强酸水解、强氧化剂氧化降解、离子液体处理、有机酸水解、固体酸水解、亚临界水解和AVAP法中的任意一种方法制备纤维素纳米晶；将所述纳米纤维与所述外泌体提取液混合均匀，获得多功能组合物。
基于同一发明构思，本发明提供一种源自竹叶的多功能组合物在制备防治微生物感染性疾病药物、防治活性氧及其引起的氧化损伤相关疾病药物和护肤美妆产品中的至少一种中的应用，所述防治微生物感染性疾病药物中，所述微生物感染性疾病包括病毒感染性疾病、细菌感染性疾病和衣原体感染性疾病中的至少一种；
所述防治活性氧及其引起的氧化损伤相关疾病药物中，所述活性氧及其引起的氧化损伤相关疾病包括神经退行性疾病、癌症、糖尿病、眼部疾病、精神疾病、呼吸道感染和类风湿性关节炎中的至少一种。
基于同一发明构思，本发明提供一种具有抗菌、抗氧化功能的药物，所述药物的有效成分包含上述一种源自竹叶的多功能组合物。
进一步的，所述药物的剂型包括冻干粉剂、颗粒剂、微球剂、胶囊剂、薄膜剂、凝胶剂和喷雾剂中的任意一种。
基于同一发明构思，本发明还提供一种具有抗菌、抗氧化功能的美容护肤品，所述美容护肤品的有效成分包含上述一种源自竹叶的多功能组合物。
基于同一发明构思，本发明还提供一种源自竹叶的多功能组合物在制造具有抗菌、抗氧化功能的医疗器械中的应用。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1.本发明一种源自竹叶的多功能组合物，包括外泌体和纳米纤维，外泌体和纳米纤维均提取自竹叶，该组合物成分天然、生物相容性好、富含活性物、稳定性高、且无有机溶剂残留，其中竹叶外泌体主要发挥抗氧化作用，竹叶纳米纤维主要发挥抗菌作用，二者结合不仅可以解决竹叶外泌体滞留靶向性差、半衰期短的问题，还可在抗氧化、抑制细菌生长及促进细胞增殖等方面实现协同增效，具有巨大的应用转化前景。
2.本发明一种源自竹叶的多功能组合物，包括竹叶来源的外泌体和纳米纤维，其提取工艺简单、对环境友好，成分天然、细胞相容性高、生物活性高，利于细胞和组织的粘附、增殖、生长和分化，可应用于制备细胞培养的涂层和组织修复生物材料，本发明通过实验表明，该组合物能够显著抑制细菌的生长，具有较强的DPPH自由基清除能力，因此，可以将组合物制备成薄膜、凝胶、喷雾等制剂，可应用于药品或者功效性化妆品、医疗器械等领域，本发明有望成为竹叶资源开发利用的新策略，对竹叶增值产品的开发及竹叶外泌体功能性产品在各领域的应用有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为竹叶外泌体、竹叶纳米纤维和二者组合物悬液：（A）NTA检测BL-EVNs的粒径图；（B）不同竹叶纤维的形貌，比例尺 = 100 nm；（C）BL-EVNs与不同类型竹叶纳米纤维素的混合悬液。
图2为竹叶外泌体的细胞相容性评价：（A）BL-EVNs的细胞毒性；（B）与BL-EVNs（108particles/mL）共孵育72 h后细胞的增殖率。
图3为竹叶纳米纤维素薄膜层的细胞相容性及细胞增殖评价：（A）孔板底部纳米纤维素涂层的图像；细胞在CNF、a-CNF、b-CNF、CNC纳米纤维涂层上的粘附（B）与增殖（C）。
图4为竹叶组合物促进细胞增殖能力评价。
图5为竹叶组合物抗氧化活性评价：BL-EVNs（A）、纳米纤维素及其与BL-EVNs的组合物（B）的DPPH自由基清除率。
图6为竹叶组合物抑菌活性评价：金黄色葡萄球菌在含有BL-EVNs（A）、纳米纤维素及其与BL-EVNs的组合物（B）的培养基中细菌生长率。
图7为竹叶组合物的制剂类型。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明整体思路如下：
大量研究表明，当外泌体固定在支架材料上时，相比于单独使用外泌体，可以最大程度上发挥外泌体的优势（Theranostics. 2023;13(12):4266-4286；Acta Biomater.2023;171:68-84. ；J Control Release. 2023;361:280-296.；J Control Release.2024;368:355-371.）。因此，近年来，一些生物材料如水凝胶、纳米纤维、胶原蛋白支架、角蛋白海绵、聚合物基支架及无机材料等已被用于装载外泌体以控释方式延长其在体内的保留时间，赋予外泌体在表面组织的滞留靶向能力（Int. J. Mol. Sci. 22 (24) (2021)13347.；Front. Bioeng. Biotechnol. 11 (2023) 1077825.；）。其中，植物衍生的纳米纤维因其引人注目的特性而受到广泛关注，包括低密度（1.6 g/cm3）、高强度（2-3 GPa）、高比表面积（高达800 m2/g）、丰富的羟基基团、强大的吸水性、可持续性、生物相容性和生物降解性。此外，纳米纤维现在可以在工业操作中大规模生产。由于纳米纤维可用于制备结构可控的纳米材料，适用于各种表面改性策略来进行功能化，容易制备成凝胶、薄膜、胶囊、喷雾等各种制剂类型，使纳米纤维在生物材料、食品包装和保鲜技术、废水处理、以及新能源等领域均具有巨大的应用潜力。例如，已有研究表明，植物衍生纳米纤维素作为一种低成本、来源天然的生物材料，是传统不可生物降解的石油基聚合物的可再生的替代品，不仅能够维持外泌体功能和缓释，将外泌体直接运送到疾病部位并增加外泌体在特定组织或器官中的定位和持久性，还具备一定的组织修复特性，包括促进细胞的粘附、增殖、生长分化，以及血管新生和皮肤再上皮化（J Control Release. 2023;361:280-296.；Acta Biomater.2023;171:68-84.）。此外，负载外泌体的纳米纤维可以保持其纤维结构长达12周，而不受温度的影响，通过实验室简单、常规的高压灭菌和紫外辐照灭菌等灭菌方法即可实现纳米纤维生物材料的灭菌。因此，植物衍生的纳米纤维有望成为一种有效的外泌体配方策略，并在各个领域广泛应用。
基于此，本发明采用竹叶纳米纤维素负载竹叶外泌体。在提取竹叶外泌体的同时对产生的竹叶残渣进行废物利用，从中提取的竹叶纳米纤维可用于负载竹叶外泌体，实现了竹叶资源利用的最大化。
本发明源自竹叶的多功能组合物，包括竹叶纳米纤维和竹叶外泌体（或竹叶外泌体提取液），本发明对竹叶纳米纤维的开发利用可以使竹叶“变废为宝”，为竹叶进一步开发成增值产品提供新方向。相较于竹子纤维的提取，竹叶纤维生产在能耗、时间，经济成本上具有明显的优势。所述纳米纤维包括纤维素纳米纤维、阳离子纤维素纳米纤维、阴离子纤维素纳米纤维和纤维素纳米晶中的至少一种。所述纤维素纳米纤维为直径5～60 nm，长度200-1000 nm的细长纤维，交缠在一起形成网络结构，所述纤维素纳米晶为直径5～60 nm，长度＜100 nm的短棒状纤维。所得竹叶纳米纤维可应用于生物医药、食品包装、保鲜技术、材料和美妆领域，具体用途包括细胞培养、纳米药物载体、伤口敷料、可降解餐具、购物袋、保鲜膜、面膜、机械增强材料和3D打印材料等。其中，表面改性的阴离子或阳离子纤维素纳米纤维，可应用于废水处理、从溶液中捕获或回收金属颗粒。
本发明源自竹叶的多功能组合物，竹叶外泌体分子量在3 kD～100 kD，粒径在30～500 nm左右，具有脂膜结构，内部富含有核酸、蛋白质和脂质，具有与原植物相似的药理活性，包括抑菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等，优于单一化学提取物。可应用于美容护肤领域，如制备保湿、抗氧化、抑菌抗炎等面膜、喷雾、纳米乳等产品。本发明的竹叶外泌体制备工艺能够避免有机试剂带来的污染和毒副作用。本发明制备的组合物中，竹叶外泌体与竹叶纳米纤维的组合策略能够实现协同增效，在促进细胞增殖，抗氧化、抗菌等方面效果显著。
本发明提供的竹叶组合物同时还具有良好的生物降解性，在食品领域的应用可以包括可降解性餐具、吸管、食品包装材料、保鲜喷雾、保鲜膜等。
下面将结合实施例及实验数据对本申请一种源自竹叶的多功能组合物及其制备方法和应用进行详细说明。
实施例1
本实施例一种源自竹叶的多功能组合物的悬液，通过以下方法制备：
1.竹叶外泌体的提取：称取200 g新鲜竹叶，用解剖刀在叶片叶与叶柄交界处切断，叶片放入去离子中轻轻冲洗3次，用吸水纸蘸干表面水分后, 剪成1～2 cm碎片后立即浸入盛有渗透缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，0.6% NaC，0.1% 2-巯基乙酸到乙醇）的玻璃瓶中，抽真空浸泡30 min，直至缓冲液充满整个碎片组织。用滤网捞出叶片，吸水纸轻轻蘸干表面水分，榨汁，收集汁液，将汁液离心，收集上清液，0～4℃下，先采用离心力4000 xg离心60 min，再采用离心力10000 xg离心60 min。取上清，先用100 kD超滤管于4℃，5000xg离心30 min除去上清液中分子量大于100 kD组分，后转移至3kD超滤管中，4℃，5000 xg离心30 min去除分子量小于3 kD的组分，最后得到含有3 kD-100 kD分子量组分的提取液，即为竹叶外泌体提取液。
2.竹叶残渣预处理：将步骤1收集上清液后的竹叶叶片残渣进行破壁处理，即采用破壁机将叶片打碎，破碎的叶片组织以2 wt %的比例分散在装有1000 mL蒸馏水的烧杯中，置于磁力搅拌器上。叶片组织分散体在80℃下温和搅拌下洗涤2 h，转速设为300 rpm，随后使用双层定量滤纸进行真空抽滤，在50℃烘箱中干燥至恒定重量。
随后采用碱处理+漂白的方法提取竹叶原纤维：
1）将27 g NaOH和75 mL乙酸加入到925 m L蒸馏水中配制醋酸缓冲液；
2）21.25 g NaClO2（80%）溶解在1000 mL水中配制亚氯酸钠溶液；
3）将1：1：1体积的醋酸缓冲液、亚氯酸钠溶液和蒸馏水混合液装入1000 mL 的玻璃烧杯中。然后加入破碎的竹叶组织，使其分散在处理液中，保持在90℃反应温度下、温和搅拌2 h，然后真空过滤，用蒸馏水彻底清洗至中性，在50℃烘箱中干燥备用。
3.机械法制备竹叶纤维素纳米纤维（CNF）：5 g竹叶原纤维以分散在500 mL去离子水中，首先使用高速剪切混合器充分剪切，25000 rpm，15 min，然后超声，100 W，15 min，得到单纯机械法制备的的纳米纤维素（CNF），60℃干燥备用。
4.竹叶组合物的制备：1 g 竹叶纤维素纳米纤维与10 mL竹叶外泌体提取液充分混合均匀。
实施例2
本实施例一种源自竹叶的多功能组合物的悬液，通过以下方法制备：
1.竹叶外泌体提取液的制备：同实施例1。
2.竹叶残渣预处理：同实施例1。
3.机械法结合阳离子醚化剂制备竹叶阳离子纤维素纳米纤维（a-CNF）：同实施例1制备出CNF，5 g超声处理后的CNF与225 mL异丙醇溶液混合，室温下搅拌1 h后，滴加入2.5mL的10 mol/L的NaOH溶液，继续搅拌30 min后，滴加17.8 mL EPTMAC。加入去离子水使溶剂总体积为250 mL，在60℃下搅拌反应3 h后，加入冰醋酸中和至中性，采用无水乙醇洗涤、过滤、得到阳离子纳米纤维（a-CNF）。60℃干燥备用。
4.竹叶组合物的制备：1 g竹叶阳离子纤维素纳米纤维（a-CNF）与10 mL竹叶外泌体提取液充分混合均匀。
实施例3
本实施例一种源自竹叶的多功能组合物的悬液，通过以下方法制备：
1.竹叶外泌体提取液的制备：同实施例1。
2.竹叶残渣预处理：同实施例1。
3.机械法结合TEMPO氧化法制备竹叶阴离子纤维素纳米纤维（b -CNF）：同实施例1制备CNF，50 mL取超声处理过的1 wt%的CNF悬液50 mL；将TEMPO（50 mg，0.32 mmol）和溴化钠（500 mg，4.86 mmol）溶解在50 mL蒸馏水中，同时用0.5 mol/L NaOH溶液来控制体系的pH在10左右，室温搅拌下缓慢滴加到CNF的分散悬液中；在混合溶液中缓慢加入15 mL 12wt% NaClO溶液进行氧化反应，同时加入0.5 mol/L NaOH溶液，使反应液的pH始终保持在10.8（pH 计检测）。当pH不再下降时，加入无水乙醇1 mL以终止反应，同时用0.5 mol/L HCl将pH调整为7。最后将氧化后的纳米纤维素（b-CNF）用蒸馏水彻底洗涤五次以上，60℃干燥备用。
4.竹叶组合物的制备：1 g 竹叶阴离子纤维素纳米纤维（b-CNF）与10 mL竹叶外泌体提取液充分混合均匀。
实施例4
本实施例一种源自竹叶的多功能组合物的悬液，通过以下方法制备：
1.竹叶外泌体提取液的制备：同实施例1。
2.竹叶残渣预处理：同实施例1。
3.64%硫酸水解法制备竹叶纤维素纳米晶CNC：20 g竹叶原纤维于500 mL的玻璃烧杯中，将64% H2SO4在搅拌中缓慢倒入烧杯中，45℃下搅拌反应45 min，反应完成后转移至5L的玻璃烧杯中，加入大量的去离子水搅拌均匀，静置过夜，移除上清，然后加入去离子水洗涤，4400 rpm，20 min，离心3次；最后，将CNC移入分子量为3500 Da的透析袋中，然后放入去离子水中透析3-7天，超声5 min，60℃干燥备用。
4.竹叶组合物的制备：1 g 竹叶纤维素纳米晶CNC与10 mL竹叶外泌体提取液充分混合均匀。
实施例5
本实施例一种组合物悬液，通过以下方法制备：
1.竹叶外泌体提取液的制备：同实施例1。
2.将1 g羧甲基纤维素（CMC）与10 mL竹叶外泌体提取液充分混合均匀。羧甲基纤维素原料为木材。
实施例6
本实施例一种组合物悬液，通过以下方法制备：
1.竹叶外泌体提取液的制备：同实施例1
2.将1 g微晶纤维素（MCC）与10 mL竹叶外泌体提取液充分混合均匀。微晶纤维素的原料为稻壳。
实施例7
本实施例对竹叶外泌体、竹叶纳米纤维进行表征。
1.竹叶外泌体的表征：将竹叶外泌体提取液用1×PBS溶液稀释10倍，使用纳米颗粒跟踪分析仪（NTA）测定竹叶外泌体的粒径和浓度，利用动态激光光散射仪（DLS）测定竹叶外泌体的Zeta电位。
结果如图1A所示，BL-EVNs（竹叶外泌体）的平均粒径为132.2 ± 7.5 nm，粒子浓度为2.6×1010 particles/mL。
2.竹叶纳米纤维素的表征：分别取上述实施例中纳米纤维素（CNF、a-CNF、b-CNF、CNC）0.1 g，分散在10 mL的去离子水中，配制得1 wt%的纳米纤维素悬液，用移液枪吸取20μL滴加到载玻片上，盖上盖破片后于光学显微镜下观察，拍照。
结果如图1B所示，纤维素纳米纤维CNF、a-CNF、b-CNF均呈相互缠绕的细长纤维，直径为10-20 nm，长度为200-1000 nm；纤维素纳米晶CNC呈短棒状，直径为5-10 nm，长度为10-60 nm。
竹叶组合物悬液的制备：准确称取0.2 g的4种纳米纤维素，与2 mL竹叶外泌体提取液充分混合均匀，结果如图1C所示。
实施例8
本实施例对竹叶外泌体、竹叶纳米纤维和二者组合物的各项性能进行测试。
1.细胞实验：
测试竹叶外泌体的细胞相容性：取对数生长期L929细胞，以每孔5×104细胞密度接种于96孔板内，37℃培养12 h。小心除去培养上清，PBS洗孔2次。分别加入含有不同浓度竹叶外泌体（109、108、107、106 particles/mL）的1640培养基200 μL，37 ℃孵育24 h。小心除去培养基上清，PBS洗孔2次，每孔加入100 μL含CCK8（5 mg/mL）的无血清培养基，于37 ℃继续孵育4 h，随后在450 nm波长下进行酶标测定吸光度。
结果如图2A、B所示，当BL-EVNs浓度等于或小于108 particles/mL时，细胞存活率约为100%，无细胞毒性（图2 A），且与TC板相比，72 h内能显著促进细胞的增殖（图2 B）。
2.细胞在竹叶纳米纤维素涂层上的粘附与增殖试验：
以5×104个/孔的细胞密度将L929细胞接种于96孔板内，实验分组如下：1）Control组：未经处理的空白孔板；2）CNF组：单纯机械处理的CNF薄膜层；3）a-CNF组：阳离子化的CNF薄膜层；4）b-CNF组：阴离子化的CNF薄膜层；5）CNC组：纤维素纳米晶薄膜层；以空白薄膜层作为各薄膜层的阴性对照，n = 3，共培养12 h后，小心吸弃孔板内培养基，加入100μL 1×PBS清洗，重复2次，每孔加入100 μL含CCK8（5 mg/mL）的无血清培养基，于37 ℃继续孵育4 h，随后在450 nm波长下进行酶标测定吸光度。对于细胞的增殖，在培养至24、48、72h时小心吸弃孔板内培养基，1×PBS清洗两次，同上通过CCK8法进行检测。
结果如图3所示，纳米纤维素在孔板底部形致密的薄涂层（图3A）；细胞种板12 h后，在CNF、a-CNF、b-CNF和CNC涂层上的粘附率分别为43.22% ± 4.25%、 84.19% ±2.09%、81.24% ± 5.59%、62.78% ± 5.99%（图3B）；72 h后细胞分别增殖55.64% ±0.77%、56.71% ± 0.71%、67.98% ± 0.14%、43.11% ± 2.23%，显著高于对照组（39.06%± 0.45%）（图3C）。这些结果表面四种纳米纤维涂层中，a-CNF和b-CNF更利于细胞的粘附，且b-CNF促进细胞增殖的能力最强。
3.细胞在竹叶组合物薄膜层上的粘附与增殖试验：
细胞分散在含有竹叶外泌体（108 particles/mL）的无血清培养基中后，以5×104个/孔的细胞密度将L929细胞接种于96孔板内，实验分组及后续实验操作同步骤2，并与市面上的羧甲基纤维素、微晶纤维素进行比较，即增加了6）CMC组：羧甲基纤维素薄膜层；7）MCC组：微晶纤维素薄膜层。
结果如图4所示，竹叶组合物对细胞的促增殖作用要显著优于单一的竹叶外泌体或竹叶纳米纤维素组分，且其中，竹叶外泌体与阴离子化的纤维素纳米纤维（b-CNF）组合的效果最佳。
4.抗氧化试验：
DPPH自由基清除实验：采用微板法评价竹叶组合物和CMC、MCC+竹叶外泌体组合物的抗氧化活性。称取0.05 g的6种纤维素样品，加入0.8 mL氮自由基提取液，40℃水浴浸提60 min，10000 rpm离心10 min，取上清液，4℃保存待用。BL-EVNs（1010 particles/mL）用PBS溶液稀释为109、108、107 particles/mL后，分别与氮自由基提取液按1:9的比例混合，即100 μL BL-EVNs加入到900 μL氮自由基提取液中，震荡混匀，10000 rpm离心10 min，取上清，4℃保存待用。对于竹叶组合物，将纳米纤维素氮自由基提取液与BL-EVNs的氮自由基提取液以1：1的比例混合。配制维生素 C 溶液：将一支 10 mg 维生素 C 充分溶解于 1ml 氮自由基提取液中，即成10 mg/ml 维生素 C 溶液；可分成 0.1 ml 的小份，-20℃保存。配制Vc 标准工作液：用氮自由基提取液将 10 mg/ml 维生素 C溶液稀释至 50、40、30、20、10、5μg/ml 的 Vc 标准工作液以制备标准曲线；酶标仪开机预热 30 min 以上，检测波长 517nm，无水乙醇调零。DPPH 加样：按照下表设置空白管、样本测定管、样本对照管、阳性对照管，溶液应按照顺序依次加入，混匀，室温避光静置 30min。
表1 DPPH氮自由基清除实验
加入组分（mL） 空白管 样本测定管 样本对照管 阳性对照管（标准管）
氮自由基提取液 0.05 - - -
上清液 - 0.05 0.05 -
Vc标准工作液 - - - 0.05
无水乙醇 0.225 0.225 0.45 0.225
DPPH溶液 0.225 0.225 - 0.225
OD 值测定：取 96 孔板，将各管溶液依次吸取 300ul 加至 96 孔板中，用酶标仪检测各管吸光度值，依次记为 A0、A1、A2、A3。
阳性对照·DPPH 清除率(%)= ( A0- A3)/A0×100%
待测样本·DPPH 清除率(%)=[A0-( A1- A2)]/A0×100%
备注：A0=空白管的吸光度值
A1=样本测定管的吸光度值
A2=样本对照管的吸光度值
A3=阳性对照管的吸光度值。
结果如图5所示，BL-EVNs（1010 particles/mL）具有较强的抗氧化能力，且BL-EVNs的DPPH氮自由基清除能力呈的浓度依赖性。CNF、a-CNF、b-CNF和CNC的氮自由基清除能力分别为10.51 % ± 0.87%、15.88 % ± 1.85%、12.47 % ± 0.21%、24.35 % ± 0.46%。竹叶组合物种发挥抗氧化能力的主要是BL-EVNs，纳米纤维素a-CNF、b-CNF和纤维素纳米晶CNC的加入后均可以显著增强BL-EVNs的DPPH氮自由基清除能力。
5.抑菌试验：
金葡菌溶液的制备：将-80℃中甘油冻存的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌种取出于37℃水浴中速融后，用接种环蘸取适量菌液进行划板，于37℃恒温培养箱中倒置培养24h后，挑取单菌落于10 mL的液体培养基中，充分混匀后置于恒温振荡摇床中，参数设置为37℃，100 rpm，培养16 h。然后采用紫外可见分光光度仪检测OD 600= 2.5，通过计算得到培养基溶液金葡菌浓度为5×109 CFU/mL，稀释至1×107 CFU/mL备用。
实验分组为1）1×PBS溶液；2）青霉素-链霉素溶液作为阳性对照组；3）竹叶外泌体溶液（1010 particles/mL）；4）四种1 wt% 纳米纤维素悬液（CNF、a-CNF、b-CNF、CNC）；5）竹叶外泌体溶液（1010 particles/mL）分别与四种1 wt% 纳米纤维素悬液以1：1体积混合的溶液；6）竹叶外泌体溶液（1010 particles/mL）与1 wt% 羧甲基纤维素（CMC）悬液以1：1体积混合的溶液作为对照组1；7）竹叶外泌体溶液（1010 particles/mL）与1 wt% 微晶纤维素（MCC）悬液以1：1体积混合的溶液作为对照组2。用移液枪分别吸取上述溶液1 mL加入到2 mL金葡菌浓度为107 CFU/mL的液体培养基中，充分混匀后置于恒温振荡摇床中，参数设置为37℃，100 rpm，培养过夜。用移液管吸取300 uL于96孔板中，用酶标仪检测每组样品OD600处的吸光度值，定量评价不同组的抗菌活性。细菌生长率计算公式如下：
细菌生长率（%）=（A2-A1）/A2×100%
A1为初始菌液在OD600处的吸光度值；
A2为培养过夜后待测菌液在OD600处的吸光度值。
结果如图6所示，发挥抗菌作用的主要是竹叶纤维素纳米纤维，当竹叶外泌体与竹叶纳米纤维素组合后，抗菌能力显著增强，且显著优于CMC组和MCC组。
6.竹叶组合物制剂的制备：
组合物薄膜的制备：准确称取2 g干燥的a-CNF纳米纤维素样品，分别制备成1 wt%悬液，将盛满纳米纤维悬液的小皿置于60 ℃恒温干燥箱中干燥过夜后，得到薄膜样品。此时向小皿中倒入75%乙醇浸泡30 min，便于用镊子小心将薄膜从小皿底部完整掀下。乙醇挥干后，干燥的薄膜密封好后于-20℃保存备用。将干燥薄膜裁剪成4 cm2大小后浸泡到竹叶外泌体溶液（1010 particles/mL）中12 h后取出，得到装载竹叶外泌体的纳米纤维薄膜。如图7A所示。
组合物凝胶的制备：首先采用反复冻融法制备纳米纤维素凝胶。称取5 g的b-CNF纳米纤维素分散在10 mL的去离子水中，搅拌均匀，形成胶体溶液。将胶体溶液于-20℃冷冻2 h后取出，置于室温下溶化，反复冻融5次后形成纳米纤维素水凝胶，冻干。1 g纳米纤维素水凝胶冻干品可用10 mL竹叶外泌体溶液（1010 particles/mL）溶解，搅拌混匀制备组合物水凝胶。如图7B所示。
组合物喷雾的制备：竹叶外泌体与竹叶纳米纤维素CNC以1000 mL:1 g的比例混合，充分震荡混匀后超声，100 W，5 min。可从喷瓶中均匀喷出，喷雾在皮肤表面形成一层均匀的水膜。如图7C所示。经测试，每1g纳米纤维素能吸纳约109个竹叶外泌体粒子。
本发明的竹叶组合物可以直接制备成各种制剂，包括薄膜、凝胶和喷雾等，使该竹叶组合物可以适用于不同疾病部位，此外除了医药领域，也可以在食品包装、保鲜技术、护肤产品等领域中加以应用。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (8)

1.一种源自竹叶的多功能组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将鲜竹叶碎片浸泡于渗透缓冲液中，后取出榨汁，所得汁液进行离心，取上清液，收集下层沉淀物；
将所述上清液先在离心力2000～6000xg下离心40～80min，后在离心力8000-12000xg下离心40～80min，取上清，除去其中分子量大于100kD和小于3kD的组分，获得外泌体提取液；
将所述下层沉淀物依次进行碱处理和漂白处理，后进行以下操作中的至少一项，获得纳米纤维，其中，所述纳米纤维包括纤维素纳米纤维、阳离子纤维素纳米纤维、阴离子纤维素纳米纤维和纤维素纳米晶中的至少一种：
a.所述漂白处理完毕后，进行机械处理，获得纤维素纳米纤维；
b.所述漂白处理完毕后，进行机械处理，再经化学处理或生物降解处理，获得阳离子纤维素纳米纤维或阴离子纤维素纳米纤维；
c.所述漂白处理完毕后，采用强酸水解、强氧化剂氧化降解、离子液体处理、有机酸水解、固体酸水解、亚临界水解和AVAP法中的任意一种方法制备纤维素纳米晶；
将所述纳米纤维与所述外泌体提取液混合均匀，获得多功能组合物。
2.一种源自竹叶的多功能组合物，其特征在于，所述组合物通过权利要求1所述的一种源自竹叶的多功能组合物的制备方法制得，所述外泌体提取液的体积和所述纳米纤维的质量比值为(1～1000)mL：1g，所述外泌体的分子量为3kD～100kD，粒径为30～500nm。
3.根据权利要求2所述的一种源自竹叶的多功能组合物，其特征在于，所述纤维素纳米纤维的直径为5～60nm，长度为200-1000nm,所述纤维素纳米晶的直径为5～60nm，长度＜100nm。
4.如权利要求2或3所述的一种源自竹叶的多功能组合物在制备防治金黄色葡萄球菌感染性疾病药物中的应用。
5.一种具有抗金黄色葡萄球菌、抗氧化功能的药物，其特征在于，所述药物的有效成分包含权利要求2或3所述的一种源自竹叶的多功能组合物。
6.根据权利要求5所述的一种具有抗金黄色葡萄球菌、抗氧化功能的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括冻干粉剂、颗粒剂、微球剂、胶囊剂、薄膜剂、凝胶剂和喷雾剂中的任意一种。
7.一种具有抗金黄色葡萄球菌、抗氧化功能的美容护肤品，其特征在于，所述美容护肤品的有效成分包含权利要求2或3所述的一种源自竹叶的多功能组合物。
8.如权利要求2或3所述的一种源自竹叶的多功能组合物在制造具有抗金黄色葡萄球菌、抗氧化功能的医疗器械中的应用。
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