KR20230017845A - 중추 신경계 장애에 대한 섬유아세포 성장 인자 21(fgf21) 유전자 요법 - Google Patents

Abstract

중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조체가 본원에 기재된다.

Description

중추 신경계 장애에 대한 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21) 유전자 요법

본 명세서에 기술된 측면 및 실시예는 의학 분야, 특히 중추 신경계 장애에 대한 유전자 요법에 관한 것이다.

노화는 인지 기능 저하와 관련이 있으며 신경퇴행 및 치매의 주요 위험 요인이다(Wyss-Coray, T. Ageing, neurodegeneration and brain rejuvenation. Nature 539, 180-186 (2016)). 신경근골격 성능, 근력 및 이동 활동도 나이가 들면서 감소하는 것으로 보고되었다(Lynch, M.A. (2004). Physiol. Rev. 84, 87-136.; Wenz, T. et al. 2009. Proc Natl Acad Sci U S A 106 (48), 20405-10, Lhotellier L, Cohen-Salmon C. Physiol Behav 1989; 45:491-493). 가장 흔한 신경퇴행성 질환인 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD)은 주로 노인에게서 관찰되며 이러한 질환의 위험은 나이가 들수록 증가한다. 65세 이상의 개인 10명 중 1명은 AD를 갖고 있으며 그 유병률은 나이가 들수록 계속 증가한다. AD 유병률은 향후 20년 이내에 두 배가 될 것으로 예상된다 (Prince M., et al. The global prevalence of dementia: a systematic review and metaanalysis. Alzheimer’s Dement 9, e62(2013)). AD의 주요 임상 특징은 노년의 기억력 및 학습 결핍, 방향 감각 상실, 기분 변화 및 행동 문제이다(Hou, Y. et al. Ageing as a risk factor for neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology volume 15, pages565-581(2019)). PD의 진단적 특징에는 운동 진폭 및 속도, 경직 및/또는 휴식 떨림에 영향을 미치는 신경근 기능 장애가 포함된다(Hou, Y. et al. Nature Reviews Neurology volume 15, pages565-581(2019)).

불안 및 우울증 장애도 주요 공중 보건 문제이다. 구체적으로, 불안 장애는 인간에게 영향을 미치는 모든 정신 건강 문제 중에서 가장 흔하다(Zhang et al., Neuroscience, 196, 203-14 (2011)).

대사 장애(예: 당뇨병 및 비만)는 치매, 우울증, 불안, 뇌졸중 및 알츠하이머병(AD)을 유발하는 진행성 질환이다 (R. Mayeux, Y. Stern, Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, a006239 (2012); Asato et al, Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi, 32 (5-6), 251-5 (2012); O. Guillemot-Legris, G. G. Muccioli, Trends Neurosci. 40, 237-253 (2017))(9). 실제로, 비만 환자는 비만이 아닌 대상보다 이러한 중추 장애가 발생하기 쉽다.(A. J. Bruce-Keller, J. N. Keller, C. D. Morrison, Biochim. Biophys. Acta. 1792, 395-400 (2009). T2DM은 알츠하이머병(AD) 위험을 거의 두 배로 높인다(Ohara et al., 2011). 유사하게, 불안과 우울증의 유병률은 일반 인구보다 당뇨병과 비만 환자에서 더 높다는 것이 잘 알려져 있다 (Asato et al, Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi, 32 (5-6), 251-5 (2012)). 알츠하이머병과 혈관성 치매의 임상 진단을 포함하여 치매에 대한 전체 상대 위험도는 T2DM이 없는 사람보다 T2DM을 가진 사람에서 73% 더 높다 (Gudala et al., J. Diabetes Investig. 2013, 27;4(6):640-50). 마찬가지로 AD 환자는 뇌의 인슐린 저항성과 고인슐린혈증을 경험한다 (Biessels and Reagan, 2015, Nat Rev Neurosci. 2015 16(11):660-71; Stanley et al, 2016, J Exp Med. 25;213(8):1375-85). 이는 인슐린 저항성이 알츠하이머병으로 이어지는 인지 장애를 촉진하고 인슐린이 결핍된 뇌가 알츠하이머병 발병에 취약하다는 것을 시사한다.

생쥐를 대상으로 한 여러 연구에서 식이 유발 비만과 인슐린 저항성 및 인지 장애 사이의 연관성을 다루었으며 고지방 식이 요법(HFD)에 충분히 노출되면 인슐린 저항성 비만 설치류는 손상된 공간 학습 능력, 공간 기억력 및 인식 기억력뿐만 아니라 증가된 불안, 무쾌감증 및 우울증 유사 증상과 함께 행동에 극적인 변화를 보이는 것으로 나타났다(Guillemot-Legris, O. et al., 2017, Trends Neurosci. 40, 237-253).

비만은 또한 마우스와 인간 모두에서 신경근 기능, 운동 능력 및 협응력을 손상시킨다(Garland T, et al. J Exp Biol 2011; 214: 206?229; Seebacher, F. et al., International Journal of Obesity volume 41, pages1271-1278(2017); Perez LM, et al.. J Physiol (Lond) 2016; 594: 3187-3207; Zhang, Y., et al. Arch Biochem Biophys, 576, 39-48 (2015))

돌이킬 수 없는 방식으로 진행되는 경향이 있고 막대한 사회경제적 비용과 개인 비용을 수반하는 신경퇴행성 질환뿐만 아니라 노화와 관련된 인지 및 신경근 기능 저하에 효과적인 치료법이 거의 없거나 전혀 없다. 유사하게, 불안 및 우울증 장애는 종종 항불안제 또는 항우울제 약물 치료 및 인지 행동 요법과 같은 현재의 치료적 접근법에 내성이 있다. 따라서 새로운 치료 전략이 필요하다.

섬유아세포 성장 인자 21(FGF21)은 간에서 주로 분비되지만 지방 조직과 췌장에서도 분비되는 성장 인자(Muise, E. S. et al., 2008. Mol. Pharmacol. 74:403-412)로 포도당과 지질 대사 조절제이다. 또한 최근 보고에 따르면 FGF21은 신경변성, 재수초화, 인지 기능 저하, 알츠하이머병, 기분 안정제 및 우울증에 치료 효과를 발휘한다(Kuroda, M. et al., 2017. J Clin Invest. 127(9):3496-3509; Sharor, R. A. et al., 2019. J Neurotrauma. 37(1):14-26; Yu, Y. et al., 2015. Pharmacol Biochem Behav. 133:122-31; Wang, X-M. et al., 2016. Exp Cell Res. 346(2):147-56; Wang, Q. et al., 2018. Mol Neurobiol. 55:4702-4717; Sa-nguanmoo P. et al 2016. Hormones and Behavior. 85: 86-95; Sa-nguanmoo P. et al 2018. Biomedicine & Pharmacotherapy. 97:1663-1672; Ruhlmann C. et al., 2016. Aging. 8(11):2777-2789; Chen S. et al., 2019. Redox Biol. 22:101133; Amiri M. et al., 2018. Neurotoxicity Research. 34:574-583; Leng, Y. et al., 2015. Molecular Psychiatry. 20, 215-223; Wang, X. et al., Front. Pharmacol., 28 February 2020). 그러나 천연 FGF21 단백질은 약한 약동학적 특성을 나타낸다. 반감기가 짧고 생체 내(in vivo) 단백질 분해 및 시험관 내(in vitro) 응집에 취약하다(Huang, J. et al., 2013. J Pharmacol Exp Ther. 346(2):270-80; So, W. Y. and Leung, P.S. 2016. Med Res Rev. 36(4):672-704; Zhang, J. and Li, Y. 2015. Front Endocrinol (Lausanne). 6:168). 반감기를 연장하고 FGF21의 안정성과 용해도를 개선하기 위해 다양한 분자 공학 접근법이 개발되었다. 현재 3개의 조작된 FGF21 모방체(LY2405319, PF-05231023 및 BMS-986036)가 인간에서 테스트되고 있다. 그럼에도 불구하고 이러한 FGF21 모방체는 여러 번 투여해야 하므로 환자에게 상당한 부담이 된다. 더욱이, 조작된 FGF21 모방체/유사체는 천연 FGF21보다 더 높은 면역원성 위험, 예를 들어, LY2405319로 치료받은 환자는 주사 부위 반응, 항약물 항체 및 심각한 과민 반응을 나타낼 수 있다 (Gaich, G. et al., 2013. Cell Metab. 18(3):333-40). PF-05231023 또는 BMS-986036으로 치료받은 환자에서도 주사 부위 반응 및 항약물 항체가 보고되었다(Kim, A. M. et al., 2017. Diabetes Obes Metab. 19(12):1762-1772; Charles, E. D., et al., 2019. Obesity. 27(1):41-49; Sanyal, A. et al., 2019. Lancet. 392(10165):2705-2717).

따라서 기존 치료법의 모든 단점을 가지지 않은 신경근 및 인지 기능 저하에 대한 새로운 치료법이 여전히 필요하다.

본 발명의 측면은 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 유전자 구조체는 FGF21을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 유비쿼터스 프로모터에 작동가능하게 연결되도록 하고, 바람직하게는 유비쿼터스 프로모터는 CAG 프로모터 및 CMV 프로모터로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 유전자 구조체는 FGF21의 발현이 방지되기를 원하는 조직에서 발현되는 마이크로RNA의 적어도 하나의 표적 서열을 포함하고, 바람직하게는 마이크로RNA의 적어도 하나의 표적 서열은 포유동물의 심장 및/또는 간에서 발현되는 마이크로RNA에 결합하는 표적 서열로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 유전자 구조체는 간에서 발현되는 마이크로RNA의 적어도 하나의 표적 서열 및 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 적어도 하나의 표적 서열을 포함하도록 되어 있고, 바람직하게는 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열은 서열번호 13 및 21-25에서 선택되고 간에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열은 서열번호 12 및 14-20에서 선택되며, 보다 바람직하게는 유전자 구조체는 마이크로RNA-122a의 표적 서열(서열번호 12) 및 마이크로RNA-1의 표적 서열(서열번호 13)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 유전자 구조체는 FGF21을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되도록 한다:

(a) 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열과 적어도 60% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;

(b) 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및

(c) 유전자 코드의 축퇴로 인해 (b)의 뉴클레오티드 서열의 서열과 다른 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열.

본 발명의 또 다른 측면은 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 유전자 구조체를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 아데노 관련 바이러스 벡터이고, 바람직하게는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, rh10, rh8, Cb4, rh74, DJ, 2/5, 2/1, 1/2 또는 Anc80의 아데노 관련 바이러스 벡터이며, 보다 바람직하게는 혈청형 1, 8 또는 9의 아데노 관련 바이러스 벡터이다.

본 발명의 또 다른 측면은 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명의 유전자 구조체 및/또는 본 발명의 발현 벡터를 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용되는 성분을 추가로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 사용을 위한 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 약학적 조성물의 일부 실시양태에서 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태는, 노화 및/또는 대사 장애 또는 질환, 바람직하게는 비만 및/또는 당뇨병과 연관되고/되거나 이에 의해 유발된다. 본 발명에 따른 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 약학적 조성물의 일부 실시양태에서, 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태는, 신경염증, 신경변성, 인지 저하 및/또는 이와 관련된 질환 또는 상태이다. 일부 실시양태에서, 신경염증, 신경변성 및/또는 인지 저하와 관련된 질환 또는 상태는 인지 장애, 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 레비 소체 치매, 전측두엽 치매(FTD), 파킨슨병, 파킨슨 유사 질환, 파킨슨증, 헌팅턴병, 외상성 뇌손상, 프리온병, HIV 감염으로 인한 치매/신경인지 문제, 노화로 인한 치매/신경인지 문제, 타우병증, 다발성 경화증 및 기타 신경염증성/신경퇴행성 질환로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 알츠하이머병, 파킨슨병, 파킨슨 유사 질환 및 헌팅턴병으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 알츠하이머병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 알츠하이머병이다.

본 발명에 따른 사용을 위한 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 약학적 조성물의 일부 실시양태에서, 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태는 행동 장애, 바람직하게는 불안 장애 또는 우울 장애이다.

본 발명에 따른 사용을 위한 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 약학적 조성물의 일부 실시양태에서, 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태는 신경근 장애이고, 바람직하게는 신경근 장애는 감소된 근육 기능, 감소된 근력, 감소된 협응력, 감소된 균형 및/또는 저활동성이거나 이와 관련이 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 대상의 기억력 및/또는 학습을 개선하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 대상에게 본 발명의 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 바람직하게 대상은 노인 대상 및/또는 대사 장애 또는 질환, 바람직하게는 당뇨병 및/또는 비만으로 진단된 대상이다.

본 발명의 또 다른 측면은 대상에서 근육 기능, 근력, 협응력, 균형 및/또는 활동 저하를 개선하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 대상에게 본 발명의 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 바람직하게 대상은 노인 대상 및/또는 대사 장애 또는 질환, 바람직하게는 당뇨병 및/또는 비만으로 진단된 대상이다.

추가 측면에서 본 발명은 본 발명의 유전자 구조체, 발현 벡터 및/또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.

추가 측면에서 본 발명은 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태의 치료 및/또는 예방을 위한 치료제의 제조방법을 위한, 본 발명의 유전자 구조체, 발현 벡터 또는 조성물의 용도에 관한 것이다.

추가 측면에서 본 발명은 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태의 치료 및/또는 예방을 위한, 본 발명의 유전자 구조체, 발현 벡터 또는 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명자들은 중추신경계(CNS) 장애에 대응하기 위해 FGF21에 기초한 개선된 유전자 요법 전략을 개발하였다. 특히, 실험 부분에서 상술한 바와 같이 다음과 같은 의외의 장점을 발견하였다. AAV 매개 FGF21 유전자 요법은 여러 다른 마우스 모델에서 다른 투여 모드와 다른 유형의 벡터를 사용하여 강력한 과발현을 매개한다. 강력한 과발현은 FGF21의 순환 수준을 증가시키고 적어도 다음과 같은 이점을 발휘하는 것으로 나타났다.

＊ 개선된 협응력, 균형, 신경근 성능, 근력 및 운동 활동(실시예 1-4, 8, 10, 12 및 13)

＊ 강화된 기억력 및 학습(실시예 1, 3, 4, 8, 9, 10, 12 및 13)

＊ 미토콘드리아 기능 개선 및 산화 스트레스의 감소에 의해 감소된 신경변성(실시예 1 및 11)

＊ 감소된 불안 및 우울증과 같은 행동(실시예 2-4 및 12)

＊ 향상된 인지 성능, 기억력, 학습 및 탐색 능력(실시예 1, 3, 4, 8, 9, 10, 12 및 13)

＊ 감소된 신경염증(실시예 5 및 8)

따라서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명의 측면 및 실시예는 본 명세서에 논의된 바와 같은 문제 및 요구 중 적어도 일부를 해결한다.

유전자 구조체

제1 측면에서, 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전자 구조체는 요법에 사용하기 위한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자 구조체는 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전자 구조체는 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것이다.

본원에 기재된 바와 같은 "유전자 구조체"는 본 개시 내용을 고려하여 당업자가 이해하는 바와 같이 관례적이고 통상적인 의미를 갖는다. "유전자 구조체"는 또한 "발현 카세트" 또는 "발현 구조체"로 지칭될 수 있으며, 그의 발현을 제어하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심있는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 또는 유전자 그룹을 지칭한다. 본 출원의 "일반 정보"라는 제목의 부분은 "유전자 구조체"에 대한 보다 상세한 내용을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "작동 가능하게 연결된"은 본 출원의 "일반 정보" 부분에서 추가로 설명된다.

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 구조체는 포유동물에서의 발현에 적합하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "포유류에서 발현하기에 적합한"은 발현을 위해 사용되는 포유동물 숙주 세포를 기초로 하여 선택된 하나 이상의 조절 서열을 포함하는 유전자 구조체를 의미할 수 있으며, 이는 발현될 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된다. 바람직하게는, 발현을 위해 사용되는 상기 포유동물 숙주 세포는 인간, 뮤린 또는 개 세포이다.

본 발명에 따른 유전자 구조체에 존재하는 FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 임의의 FGF21 유전자 또는 FGF21 암호화 서열, 바람직하게는 인간, 마우스 또는 개의 FGF21 유전자 또는 FGF21 코딩 서열; 또는 돌연변이된 FGF21 유전자 또는 FGF21 암호화 서열, 바람직하게는 인간, 마우스 또는 개; 또는 코돈 최적화된 FGF21 유전자 또는 FGF21 코딩 서열, 바람직하게는 인간, 마우스 또는 개로부터의 것으로부터 유래될 수 있다.

따라서, 일부 실시양태에서, FGF21을 코딩하는 바람직한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 2 또는 3과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64 %, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74 %, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 암호화한다. 서열번호 1은 인간 FGF21의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 2는 뮤린 FGF21의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 3은 개 FGF21의 아미노산 서열을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 유전자 구조체에 존재하는 FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11로 이루어진 군에서 선택된 임의의 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는다. "동일성" 또는 "서열 동일성" 및 "유사성" 또는 "서열 유사성"에 대한 설명은 "일반 정보" 섹션에서 제공되었다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 유전자 구조체에 존재하는 인간 FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4, 5, 6 또는 7과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는다. 서열번호 4는 인간 FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다. 서열번호 5는 인간 FGF21, 변이체 1을 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열이다. 서열번호 6은 인간 FGF21, 변이체 2를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열이다. 서열번호 7은 인간 FGF21, 변이체 3을 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열이다. 변이체 1, 변이체 2 및 변이체 3은 동일한 인간 FGF21 단백질에 대해 암호화하고 서로 다른 코돈 최적화 알고리즘에 의해 획득되었다. "일반 정보" 섹션에서 "코돈 최적화"에 대한 설명을 제공했다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 유전자 구조체에 존재하는 마우스 FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8 또는 9와 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는다. 서열번호 8은 마우스 FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다. 서열번호 9는 마우스 FGF21을 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열이다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 유전자 구조체에 존재하는 개 FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 10 또는 11과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는다. 서열번호 10은 개 FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다. 서열번호 11은 개 FGF21을 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열이다.

일부 실시양태에서, FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 본 명세서에 설명된 바와 같은 유전자 구조체가 제공된다.

(a) 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열.

(b) 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열.

(c) 유전자 코드의 축퇴로 인해 (b)의 뉴클레오티드 서열의 서열과 다른 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열.

바람직한 실시양태에서, FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열이고, 바람직하게는 코돈-최적화된 인간 서열이며, 바람직하게는 서열번호 5, 6 및 7의 서열로부터 선택된다.

본원에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 FGF21은 당업자에게 공지된 FGF21의 활성의 적어도 검출가능한 수준을 발휘한다. FGF21의 활성은 항비만 및/또는 항당뇨 효과를 나타내는 것일 수 있다. FGF21의 활성은 또한 인슐린 감수성을 증가시키는 것일 수 있다. 이 활성은 예를 들어 인슐린 내성 시험 또는 포도당 내성 시험을 사용함으로써 당업자에게 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다. FGF21의 활성은 또한 신경염증 감소, 신경변성 감소, 인지 저하 감소, 신경근 기능 개선, 우울증 및 우울증 유사 행동 및 불안 및 불안 유사 행동과 같은 행동 장애를 개선하는 것일 수 있다. FGF21의 이러한 활성은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 실험 섹션에 기술된 임의의 방법을 사용하여 평가할 수 있다.

일부 실시양태에서, FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 유비쿼터스 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 바람직한 유비쿼터스 프로모터는 CMV 프로모터 및 CAG 프로모터로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 유비쿼터스 프로모터는 CAG 프로모터이다.

일부 실시양태에서, FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 FGF21의 발현을 방지하고자 하는 조직에서 발현되는 마이크로RNA의 적어도 하나의 표적 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, FGF21을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 유비쿼터스 프로모터 및 FGF21의 발현이 방지되기를 원하는 조직에서 발현되는 마이크로RNA의 적어도 하나의 표적 서열에 작동가능하게 연결된다.

"유비쿼터스 프로모터", "작동 가능하게 연결된" 및 "마이크로RNA"에 대한 설명은 "일반 정보" 섹션에서 제공되었다. 본 명세서에서 "조직에서 발현되는 마이크로RNA의 표적서열" 또는 "조직에서 발현되는 마이크로RNA와 결합하는 표적서열" 또는 "조직에서 발현되는 마이크로RNA의 결합부위"는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 상기 조직에서 발현되는 마이크로RNA의 적어도 일부에 상보적이거나 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

일부 실시양태에서, 마이크로RNA의 적어도 하나의 표적 서열은 포유동물의 심장 및/또는 간에서 발현되는 마이크로RNA에 결합하는 표적 서열로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 간에서 발현되는 마이크로RNA의 적어도 하나의 표적 서열 및 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 적어도 하나의 표적 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, FGF21을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 유비쿼터스 프로모터 및 간에서 발현되는 마이크로RNA의 적어도 하나의 표적 서열 및 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 적어도 하나의 표적 서열에 작동가능하게 연결된다. 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적서열은 바람직하게는 서열번호 13 및 21-25, 보다 바람직하게는 서열번호 12(마이크로RNA-122a)에서 선택되고 간에서 발현되는 마이크로RNA의 표적서열은 바람직하게는 서열번호 12 및 14-20, 보다 바람직하게는 서열번호 13(마이크로RNA-1)에서 선택된다.

본 명세서에서 "간에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열" 또는 "간에서 발현되는 마이크로RNA에 결합하는 표적 서열" 또는 "간에서 발현되는 마이크로RNA의 결합 부위"는 간에서 발현되는 마이크로RNA의 적어도 일부에 상보적이거나 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 유사하게, 본 명세서에서 사용되는 "심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열" 또는 "심장에서 발현되는 마이크로RNA에 결합하는 표적 서열" 또는 "심장에서 발현되는 마이크로RNA의 결합 부위"는 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 적어도 일부에 상보적이거나 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

간에서 발현되는 마이크로RNA의 일부(portion) 또는 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 일부는 본원에 기술된 바와 같이 상기 마이크로RNA의 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 또는 적어도 7개의 연속 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 결합 부위 서열은 발현된 마이크로RNA의 적어도 일부에 대해 완벽한 상보성을 가질 수 있으며, 이는 서열이 어떠한 불일치도 발생하지 않고 완벽하게 일치한다는 것을 의미한다. 대안적으로, 결합 부위 서열은 발현된 마이크로RNA의 적어도 일부에 부분적으로 상보적일 수 있는데, 이는 4개, 5개, 6개 또는 7개의 연속 뉴클레오티드에서 하나의 불일치가 발생할 수 있음을 의미한다. 부분적으로 상보적인 결합 부위는 바람직하게는 마이크로RNA의 시드 영역에 대해 완벽하거나 거의 완벽한 상보성을 포함하며, 이는 microRNA의 시드 영역과 결합 부위 간에 불일치(완전한 상보성) 또는 4개, 5개, 6개 또는 7개의 연속 뉴클레오티드당 하나의 불일치 (거의 완벽한 상보성)가 발생할 수 있음을 의미한다. 마이크로RNA의 시드 영역은 마이크로RNA의 약 2번 뉴클레오티드에서 약 8번 뉴클레오티드까지의 마이크로RNA의 5' 영역으로 구성된다. 본원에 기술된 일부(portion)는 바람직하게는 상기 마이크로RNA의 시드 영역이다. 간에서 발현되는 마이크로RNA 또는 심장에서 발현되는 마이크로RNA에 대한 표적 서열을 포함하는 메신저 RNA(mRNA)의 분해는 RNA 간섭 경로를 통하거나 mRNA의 직접적인 번역 제어(억제)를 통해 이루어질 수 있다. 본 발명은 이식유전자 또는 코딩된 단백질의 발현을 억제하는데 있어서 miRNA에 의해 궁극적으로 이용되는 경로에 의해 결코 제한되지 않는다.

본 발명에 관련하여, 간에서 발현되는 마이크로RNA에 결합하는 표적 서열은 서열번호 12 또는 14-20에서 선택될 수 있거나 서열번호 12 또는 14-20과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 간에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열은 서열번호 12 또는 서열번호 12와 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열이다. 추가의 실시양태에서, 서열번호 12 또는 14-20에 기재된 바와 같이 간에서 발현된 마이크로RNA의 표적 서열의 적어도 하나의 카피가 본 발명의 유전자 구조체에 존재한다. 추가 실시양태에서, 서열번호 12 또는 14-20에 기술된 바와 같이 간에서 발현된 마이크로RNA의 표적 서열의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 카피가 본 발명의 유전자 구조체에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 서열 miRT-122a(서열번호 12)의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 카피가 본 발명의 유전자 구조체에 존재한다. 간에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열의 바람직한 카피 수는 4개이다.

본원에서 사용된 바와 같이 간에서 발현된 마이크로RNA의 표적 서열은 당업자에게 공지된 바와 같이 간에서 발현된 마이크로RNA의 표적 서열의 적어도 검출가능한 수준의 활성을 발휘한다. 간에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열의 활성은 간에서 발현되는 동족 마이크로RNA에 결합하고, 도입유전자에 작동가능하게 연결될 때 간에서 도입유전자 발현의 탈표적화를 매개하는 것이다. 이 활성은 qPCR, 웨스턴 블롯 분석 또는 ELISA와 같은 당업자에게 공지된 표준 검정에 의해 mRNA 또는 단백질 수준에서 간에서의 이식유전자 발현 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다.

본 발명과 관련하여, 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열은 서열번호 13 또는 21-25에서 선택될 수 있거나 서열번호 13 또는 21-25와 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열은 서열번호 13에서 선택될 수 있거나 서열번호 13과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 서열번호:13 또는 21-25에 기술된 바와 같이 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열의 적어도 하나의 카피가 본 발명의 유전자 구조체에 존재한다. 추가 실시양태에서, 서열번호 13 또는 21-25에 기재된 바와 같이, 심장에서 발현된 마이크로RNA의 표적 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 카피가 본 발명의 유전자 구조체에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, miRT-1(서열번호 13)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 카피가 본 발명의 유전자 구조체에 존재한다. 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열의 바람직한 카피 수는 4개이다.

본원에서 사용되는 바와 같이 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열은 당업자에게 공지된 바와 같이 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열의 적어도 검출가능한 수준의 활성을 발휘한다. 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열의 활성은 심장에서 발현되는 동족 마이크로RNA에 결합하고, 도입유전자에 작동가능하게 연결될 때 심장에서 도입유전자 발현의 탈표적화를 매개하는 것이다. 이 활성은 qPCR, 웨스턴 블롯 분석 또는 ELISA와 같은 당업자에게 공지된 표준 분석법에 의해 mRNA 또는 단백질 수준에서 심장의 이식유전자 발현 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다.

일부 실시양태에서, 서열번호 12 또는 14-20에 기술된 바와 같이, 간에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열의 적어도 하나의 카피, 및 서열번호 13 또는 21-25에 기술된 바와 같이, 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열의 적어도 하나의 카피는 본 발명의 유전자 구조체에 존재한다. 추가 실시양태에서, 서열번호 12 또는 14-20에 기술된 바와 같이, 간에서 발현된 마이크로RNA의 표적 서열의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 카피, 및 서열번호 13 또는 21-25에 기술된 바와 같이, 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 카피는 본 발명의 유전자 구조체에 존재한다. 추가 실시양태에서 miRT-122a(서열번호 12)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 카피 및 miRT-1(서열번호 13)을 암호화하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 카피 뉴클레오티드 서열이 본 발명의 유전자 구조체에 결합된다. 추가 실시양태에서, miRT-122a(서열번호 12)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 4개 카피와 miRT-1(서열번호 13)을 인코딩하는 뉴클레오티드 시퀀스의 4개 카피가 본 발명의 유전자 구조체에서 조합된다.

일부 실시양태에서, 간에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열 및 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열이 서열번호 12 내지 25의 서열 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 기재된 바와 같은 유전자 구조체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열이 서열번호 13 및 21-25로부터 선택되고, 간에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열이 서열번호 12 및 14-20로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 유전자 구조체가 제공되며, 여기서 유전자 구조체는 마이크로RNA-122a의 표적 서열 및 마이크로RNA-1의 표적 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 유비쿼터스 프로모터는 CAG 프로모터, CMV 프로모터, 미니 CMV 프로모터, β-액틴 프로모터, RSV(rous-sarcoma-virus) 프로모터, EF1α(elongation factor 1 alpha) 프로모터, 초기 성장 반응 인자-1(Egr- 1) 프로모터, 진핵 개시 인자 4A(elF4A) 프로모터, 페리틴 중쇄 암호화 유전자(FerH) 프로모터, 페리틴 중경화 유전자(FerL) 프로모터, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 프로모터, GRP78 프로모터, GRP94 프로모터, 열충격 단백질 70(hsp70) 프로모터, 유비퀴틴 B 프로모터, SV40 프로모터, 베타-키네신 프로모터, ROSA26 프로모터 및 PGK-1 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직한 실시양태에서, 유비쿼터스 프로모터는 CAG 프로모터이다. CAG 프로모터는 실시양태에서 본 발명에 따른 유전자 구조체에 사용하기에 적합함을 입증하였다. 일부 실시양태에서, CAG 프로모터는 서열번호 27과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.

다른 바람직한 유비쿼터스 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터이다. CMV 프로모터는 실시예에서 본 발명에 따른 유전자 구조체에 사용하기에 적합함을 입증하였다. 일부 실시양태에서, CMV 프로모터는 서열번호 28과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 구성된다. 바람직하게는 상기 CMV 프로모터는 인트론 서열과 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 인트론 서열은 서열번호 26과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.

다른 바람직한 유비쿼터스 프로모터는 미니-CMV 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 미니-CMV 프로모터는 서열번호 36과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.

다른 바람직한 유비쿼터스 프로모터는 EF1α 프로모터이다. 일부 실시양태에서, EF1α 프로모터는 서열번호 37과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.

다른 바람직한 유비쿼터스 프로모터는 RSV 프로모터이다. 일부 실시양태에서, RSV 프로모터는 서열번호 38과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.

일부 실시양태에서, FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 조직 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

"조직 특이적 프로모터"에 대한 설명은 "일반 정보" 섹션에 제공되었다.

바람직한 실시양태에서, 조직 특이적 프로모터는 CNS 특이적 프로모터, 보다 바람직하게는 뇌 특이적 프로모터이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 CNS-특이적 프로모터는 시냅신 1 프로모터, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 II(CaMKII) 프로모터, 티로신 하이드록실라제(TH) 프로모터, 포크헤드 박스 A2(FOXA2) 프로모터, 알파-인터넥신(INA) 프로모터, 네스틴(NES) 프로모터, 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP) 프로모터, 알데하이드 탈수소효소 1 패밀리 멤버 L1(ALDH1L1) 프로모터, 미엘린 관련 희소돌기아교세포 염기성 단백질(MOBP) 프로모터, 호메오박스 단백질 9(HB9) 프로모터, 미엘린 염기성 단백질(MBP) 프로모터 및 성선자극호르몬 방출 호르몬(GnRH) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 뇌-특이적 프로모터는 시냅신 1 프로모터, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 II(CaMKII) 프로모터, 티로신 하이드록실라제(TH) 프로모터, 포크헤드 박스 A2(FOXA2) 프로모터, 알파-인터넥신(INA) 프로모터, 네스틴(NES) 프로모터, 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP) 프로모터, 알데하이드 탈수소효소 1 패밀리 멤버 L1(ALDH1L1) 프로모터, 미엘린 관련 희소돌기아교세포 염기성 단백질(MOBP) 프로모터, 미엘린 염기성 단백질(MBP) 프로모터 및 성선자극호르몬 방출 호르몬(GnRH) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직한 실시양태에서, CNS- 및/또는 뇌-특이적 프로모터는 시냅신 1 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 시냅신 1 프로모터는 서열번호 39와 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.

다른 바람직한 CNS- 및/또는 뇌-특이적 프로모터는 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II(CaMKII) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II(CaMKII) 프로모터는 서열번호 40과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.

다른 바람직한 CNS- 및/또는 뇌-특이적 프로모터는 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP) 프로모터는 서열번호 41과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.

다른 바람직한 CNS- 및/또는 뇌-특이적 프로모터는 네스틴 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 네스틴 프로모터는 서열번호 42와 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.

다른 바람직한 CNS-특이적 프로모터는 호메오박스 단백질 9(HB9) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 호메오박스 단백질 9(HB9) 프로모터는 서열번호 43과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.

다른 바람직한 CNS- 및/또는 뇌-특이적 프로모터는 티로신 하이드록실라제(TH) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 티로신 하이드록실라제(TH) 프로모터는 서열번호 44와 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.

다른 바람직한 CNS- 및/또는 뇌-특이적 프로모터는 미엘린 염기성 단백질(MBP) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 미엘린 염기성 단백질(MBP) 프로모터는 서열번호 45와 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 CNS- 및/또는 뇌-특이적 프로모터는 CNS 및/또는 뇌의 적어도 하나의 세포에서 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시한다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 CNS 및/또는 뇌 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%에서 발현을 지시한다. 본원에서 사용되는 CNS- 및/또는 뇌-특이적 프로모터는 또한 CNS 및/또는 뇌의 특정 영역 또는 세포 서브세트에서 발현을 지시하는 프로모터를 포함한다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같은 CNS- 및/또는 뇌 특이적 프로모터는 또한 해마, 소뇌, 피질, 시상하부 및/또는 후각 망울의 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%에서 발현을 지시할 수 있다. 발현은 "일반 정보" 섹션에 설명된 대로 평가될 수 있다.

또 다른 실시예에서, 조직 특이적 프로모터는 간 특이적 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 간-특이적 프로모터는 알부민 프로모터, 주요 비뇨 단백질 프로모터, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제(PEPCK) 프로모터, 간 강화 단백질 활성제 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터, 티록신 결합 글로불린 프로모터, 아포지단백질 A1 프로모터, 간 지방산 결합 단백질 프로모터, 페닐알라닌 하이드록실라제 프로모터 및 인간 α1-항트립신(hAAT) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직한 실시양태에서, 간 특이적 프로모터는 인간 α1-항트립신(hAAT) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 인간 α1-항트립신(hAAT) 프로모터는 서열번호 64와 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.

바람직하게는 상기 hAAT 프로모터는 인트론 서열과 함께 사용된다. 바람직한 인트론 서열은 아포지단백질 E로부터의 간세포 제어 영역(HCR) 인핸서이다. 가장 바람직한 인트론 서열은 서열번호 65에 정의된 바와 같은 아포지단백질 E로부터의 HCR 인핸서이다. 이와 관련하여 인트론 서열은 서열번호 53과 적어도 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 서열로 대체될 수 있다. 바람직한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 65와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 100% 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 상기 hAAT 프로모터는 인트론 서열의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 카피와 함께 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 hAAT 프로모터는 서열번호 65에 정의된 바와 같은 아포지단백질 E로부터의 HCR 인핸서의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 카피와 함께 사용된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 간-특이적 프로모터는 간의 적어도 하나의 세포에서 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시한다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 간 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%에서 발현을 지시한다. 본원에서 사용되는 간-특이적 프로모터는 또한 간의 특정 영역 또는 세포 서브세트에서 발현을 지시하는 프로모터를 포함한다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같은 간-특이적 프로모터는 또한 해마, 소뇌, 피질, 시상하부 및/또는 후각망울 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%에서 발현을 지시할 수 있다. 발현은 "일반 정보" 섹션에 설명된 대로 평가될 수 있다.

또 다른 실시예에서, 조직 특이적 프로모터는 지방 조직 특이적 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 지방 조직 특이적 프로모터는 지방세포 단백질 2(aP2, 지방산 결합 단백질 4(FABP4)로도 알려짐) 프로모터, PPARγ 프로모터, 아디포넥틴 프로모터, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제(PEPCK) 프로모터, 인간 아로마타제 시토크롬 p450(p450arom) 유래 프로모터, mini/aP2 프로모터(지방 특이적 aP2 인핸서 및 기본 aP2 프로모터로 구성), 분리 단백질 1(UCP1) 프로모터, 미니/UCP1 프로모터(지방 특이적 UCP1 인핸서 및 기본 UCP1 프로모터로 구성), 아디프신 프로모터, 렙틴 프로모터 및 Foxa-2 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직한 실시양태에서, 지방 조직-특이적 프로모터는 미니/aP2 프로모터 또는 미니/UCP1 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 미니/aP2 프로모터는 서열번호 66과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다. 일부 실시양태에서, 미니/UCP1 프로모터는 서열번호 67과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.

또 다른 실시예에서, 조직-특이적 프로모터는 골격근 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 골격근 촉진제는 미오신 경쇄 프로모터, 미오신 중쇄 프로모터, 데스민 프로모터, 근육 크레아틴 키나아제(MCK) 프로모터, 평활근 알파-액틴 프로모터, CK6 프로모터, Unc-45 미오신 샤페론 B 프로모터, 기저 MCK 인핸서의 카피와 조합된 MCK 프로모터, 및 Enh358MCK 프로모터(MCK 유전자의 358 bp 근위 프로모터와 MCK 인핸서의 조합)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직한 실시양태에서, 골격근 프로모터는 C5-12 프로모터이다. 일부 실시양태에서, C5-12 프로모터는 서열번호 68과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다.

본원에 사용된 프로모터(특히 프로모터 서열이 주어진 서열번호와 최소한의 동일성 백분율을 갖는 것으로 기술된 경우)는 적어도 당업자에게 공지된 바와 같은 프로모터의 활성을 발휘해야 한다. 바람직하게는 주어진 서열번호와 최소한의 동일성 백분율을 갖는 것으로 기술된 프로모터는 당업자에게 공지된 검정에서 평가된 바와 같이 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열(즉, 적어도 FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)의 전사를 제어해야 한다. 예를 들어, 그러한 분석은 이식유전자의 발현 측정을 포함할 수 있다. 발현은 "일반 정보" 섹션에 설명된 대로 평가될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전자 구조체는 요소 a), b), c), d) 및 e) 중 적어도 하나를 갖는다.

(a) 간 특이적 프로모터;

(b) 지방 조직 특이적 프로모터;

(c) 선택적으로 지방 조직에서 특정 발현을 가능하게 하며, 유비쿼터스 프로모터, 간에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열을 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열 및 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열을 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 조합;

(d) 골격근 촉진제; 및

(e) 선택적으로 상기 조합은 골격근에서 특이적 발현을 가능하게 하는, 유비쿼터스 프로모터와 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 서열의 조합.

추가적인 서열이 본 발명의 유전자 구조체에 존재할 수 있다. 본원에 적합한 예시적인 추가 서열은 역 말단 반복(ITR), SV40 폴리아데닐화 신호(서열번호 32), 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호(서열번호 33), CMV 인핸서 서열(서열번호 29), 및 인간 β-글로빈 및 면역글로불린 중쇄 유전자로부터의 인트론으로 구성된 키메라 인트론(서열번호 26)을 포함한다. 본 발명과 관련하여, "ITR"은 각각 AAV의 게놈으로부터 유도되는 하나의 5'ITR 및 하나의 3'ITR을 포함하는 것으로 의도된다. 바람직한 ITR은 AAV2에서 유래하고 서열번호 30(5' ITR) 및 서열번호 31(3' ITR)로 표시된다. 본 발명과 관련하여, CMV 인핸서 서열(서열번호 29) 및 CMV 프로모터 서열(서열번호 28)을 2개의 개별 서열 또는 단일 서열(서열번호 34)로 사용하는 것이 포함된다. 이들 추가 서열 각각은 본 발명에 따른 유전자 구조체에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 5'ITR 및 하나의 3'ITR, 바람직하게는 AAV2 ITR, 더 바람직하게는 서열번호 30(5 ' ITR) 및 서열번호 31(3' ITR)로 표시되는 AAV2 ITR을 추가로 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 FGF21을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호, 바람직하게는 SV40 폴리아데닐화 신호(바람직하게는 서열 번호 32로 표시됨) 및/또는 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호(바람직하게는 서열번호 33으로 표시됨)를 추가로 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 FGF21을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조체가 제공된다.

선택적으로, 추가의 뉴클레오티드 서열은 FGF21을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(들), 예를 들어 신호 서열, 핵 국소화 신호, 발현 인핸서 등을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.

일부 실시양태에서, FGF21을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조체가 제공되며, 임의로 유전자 구조체는 마이크로RNA의 표적 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, FGF21을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조체가 제공되며, 임의로 유전자 구조체는 FGF21의 발현이 방지되기를 원하는 조직에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열을 포함하지 않는다.

일부 실시양태에서, 본원에 사용된 서열 동일성 또는 유사성의 수준은 바람직하게는 70%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 80%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 90%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 95%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 99%이다.

발현 벡터

본원에 기술된 유전자 구조체는 발현 벡터에 배치될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서 임의의 이전 실시양태에 기술된 바와 같은 유전자 구조체를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 발현 벡터는 요법에 사용하기 위한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터는 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것이다.

"발현 벡터"에 대한 설명은 "일반 정보" 섹션에서 제공되었다.

일부 실시양태에서, 발현 벡터는 바이러스 발현 벡터이다. "바이러스 발현 벡터"에 대한 설명은 "일반 정보" 섹션에서 제공되었다.

바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스 벡터일 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 유래 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스 유래 벡터, 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 유래 벡터, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 유래 벡터라고도 한다. 바람직한 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스 벡터이다. "아데노 관련 바이러스 벡터"에 대한 설명은 "일반 정보" 섹션에 제공되었다.

일부 실시양태에서, 벡터는 혈청형 1의 AAV(AAV1), 혈청형 2의 AAV(AAV2), 혈청형 3의 AAV(AAV3), 혈청형 4의 AAV(AAV4), 혈청형 5의 AAV(AAV5), 혈청형 6의 AAV(AAV6), 혈청형 7의 AAV(AAV7), 혈청형 8의 AAV(AAV8), 혈청형 9의 AAV(AAV9), 혈청형 rh10의 AAV(AAVrh10), 혈청형 rh8의 AAV(AAVrh8), 혈청형 Cb4의 AAV(AAVCb4), 혈청형 rh74의 AAV (AAVrh74), 혈청형 DJ의 AAV(AAVDJ), 혈청형 2/5의 AAV(AAV2/5), 혈청형 2/1의 AAV(AAV2/1), 혈청형 1/2의 AAV(AAV1/2) 및 혈청형 Anc80(AAVAnc80)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아데노 관련 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 유래 벡터(AAV)이다.

바람직한 실시양태에서, 벡터는 혈청형 1, 8 또는 9(AAV1, AAV8 또는 AAV9)의 AAV이다. 보다 바람직한 실시양태에서 벡터는 혈청형 1 또는 8(AAV1 또는 AAV8)의 AAV이다. 이들 AAV 혈청형 1, 8 및 9는 본 발명에 따른 발현 벡터로서 사용하기에 적합한 것으로 실시예에서 입증된다.

바람직한 실시양태에서 발현 벡터는 AAV1이고 CMV 프로모터에 작동 가능하게 연결된 FGF21을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조체를 포함한다. 선택적으로, 유전자 구조체는 SV40 폴리아데닐화 신호(서열번호 32)를 추가로 포함한다. 이 벡터는 실시예에서 특히 근육내 투여에 의해 본 발명에 따른 발현 벡터로서 사용하기에 적합한 것으로 입증된다.

또 다른 바람직한 실시양태에서 발현 벡터는 AAV1이고 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 FGF21을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조체를 포함한다. 선택적으로, 유전자 구조체는 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호(서열번호 33)를 추가로 포함한다. 이 벡터는 실시예에서 특히 CSF(뇌척수액)내 투여에 의해 본 발명에 따른 발현 벡터로서 사용하기에 적합하다는 것을 입증하였다.

또 다른 바람직한 실시양태에서 발현 벡터는 AAV8이고 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 마이크로RNA-122a의 적어도 하나의 표적 서열(서열번호 12) 및 마이크로RNA-1의 적어도 하나의 표적 서열(서열번호 13)을 포함하는 유전자 구조체를 포함한다. 선택적으로, 유전자 구조체는 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호(서열번호 33)를 추가로 포함한다. 이 벡터는 실시예에서 특히 eWAT(부고환 백색 지방 조직)내 투여와 같은 지방내 조직에 의해 본 발명에 따른 발현 벡터로 사용하기에 적합한 것으로 입증되었다.

또 다른 바람직한 실시양태에서 발현 벡터는 AAV9이고 CAG 프로모터에 작동 가능하게 연결된 FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 마이크로RNA-122a의 적어도 하나의 표적 서열(서열번호 12) 및 마이크로RNA-1의 적어도 하나의 표적 서열(서열번호 13)을 포함하는 유전자 구조체를 포함한다. 이 벡터는 실시예에서 특히 CSF(뇌척수액)내 투여에 의해 본 발명에 따른 발현 벡터로서 사용하기에 적합하다는 것을 입증하였다.

조성물

추가 측면에서, 임의로 하나 이상의 약학적으로 허용되는 성분을 추가로 포함하는 상기 기재된 바와 같은 유전자 구조체 및/또는 상기 기재된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다.

이러한 조성물은 유전자 치료용 조성물이라 할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 약학적 조성물이다.

본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 성분"은 약학적으로 허용되는 담체, 충전제, 방부제, 가용화제, 비히클, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다. 따라서, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 성분은 약학적으로 허용되는 담체, 충전제, 방부제, 가용화제, 비히클, 희석제 및/또는 부형제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 약학적으로 허용되는 담체, 충전제, 방부제, 가용화제, 비히클, 희석제 및/또는 부형제는 예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함된, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition. Pharmaceutical Press (2013)에서 찾을 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 요법에 사용하기 위한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것이다.

추가 화합물이 본 발명의 조성물에 존재할 수 있다. 상기 화합물은 조성물의 전달에 도움이 될 수 있다. 이와 관련하여 적합한 화합물은 세포막을 통해 소포 또는 리포좀에 복합되거나 포획된 본원에 기재된 바와 같은 각각의 구성요소를 전달하는 복합체, 나노입자, 미셀 및/또는 리포좀을 형성할 수 있는 화합물이다. 이들 화합물 중 다수는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 화합물은 폴리에틸렌이민(PEI), 또는 폴리프로필렌이민 또는 폴리에틸렌이민 공중합체(PEC) 및 유도체; 합성 양친매성 물질(SAINT-18); 리포펙틴^TM, DOTAP를 포함하는 유사한 양이온성 중합체를 포함한다. 당업자는 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물에 어떤 유형의 제형이 가장 적합한지 알 것이다.

방법과 용도

본원에서는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 유전자 구조체, 발현 벡터 및 조성물을 제공한다.

추가 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전자 구조체, 발현 벡터 및/또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태의 치료 및/또는 예방 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 유전자 구조체, 발현 벡터 또는 조성물을 투여하는 단계는 이를 필요로 하는 대상체와 같은 대상체에게 투여하는 단계를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 치료적 유효량의 유전자 구조체, 발현 벡터 또는 조성물이 투여된다.

본원에서 사용되는 "유효량"은 유익한 또는 원하는 결과를 발휘하기에 충분한 양이다. 추가 측면에서, 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태의 치료 및/또는 예방을 위한 치료제의 제조를 위한, 본원에 기술된 바와 같은 유전자 구조체, 발현 벡터 또는 조성물의 용도를 제공한다.

추가 측면에서, 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태의 치료 및/또는 예방을 위한, 본원에 기재된 바와 같은 유전자 구조체, 발현 벡터 또는 조성물의 용도가 제공된다.

바람직한 실시양태에서, 중추 신경계 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태는 노화 및/또는 대사 장애 또는 질환, 바람직하게는 비만 및/또는 당뇨병과 연관되고/되거나 이에 의해 유발된다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도에 따른 일부 실시양태에서, 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태는 신경염증, 신경변성, 인지 저하 및/또는 이와 관련된 질환 또는 상태와 같을 수 있다.

일부 실시양태에서, 신경염증, 신경변성 및/또는 인지 저하와 관련된 질환 또는 상태는 인지 장애, 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 레비 소체 치매, 전측두엽 치매(FTD), 파킨슨병, 파킨슨 유사 질환, 파킨슨증, 헌팅턴병, 외상성 뇌손상, 프리온병, HIV 감염으로 인한 치매/신경인지 문제, 노화로 인한 치매/신경인지 문제, 타우병증, 다발성 경화증 및 기타 신경염증성/신경퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 알츠하이머병, 파킨슨병, 파킨슨 유사 질환 및 헌팅턴병으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 알츠하이머병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 알츠하이머병이다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도에 따른 일부 실시양태에서, 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태는 행동 장애일 수 있다. 바람직한 실시양태에서 행동 장애는 불안 장애 및/또는 우울 장애이다. 본 발명에 포함되는 불안 장애의 비제한적 예는 범불안 장애, 특정 공포증, 사회 불안 장애, 분리 불안 장애, 광장공포증, 공황 장애 및 선택적 함묵증이다. 본 발명에 포함되는 우울 장애의 비제한적인 예는 주요우울장애(MDD), 무쾌감증, 비정형우울증, 전형적 우울증, 정신병적 주요우울증, 긴장성우울증, 산후우울증, 월경전 불쾌장애, 계절정서장애, 기분부전장애, 이중우울증, 달리 명시되지 않은 우울장애, 우울성 성격장애, 재발성 단기 우울증 및 경미한 우울 장애이다. 일부 실시예에서, 불안 장애는 또한 불안-유사 행동과 관련될 수 있고 우울 장애는 또한 우울-유사 행동과 관련될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도에 따른 일부 실시양태에서, 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태는 신경근 장애일 수 있고, 바람직하게는 신경근 장애는 감소된 근육 기능, 감소된 근력, 감소된 협응력, 감소된 균형 및/또는 저활동성이거나 이와 관련이 있다.

또 다른 측면에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자 구조체 및/또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 발현 벡터 및/또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 기억력 및/또는 학습을 개선하는 방법이 제공된다. 바람직한 실시양태에서, 치료될 대상은 노인 대상 및/또는 대사 장애 또는 질환, 바람직하게는 비만 및/또는 당뇨병으로 진단된 대상이다. 일부 실시예에서, 메모리는 인식 및/또는 회상 메모리, 바람직하게는 인식 메모리일 수 있다. 일부 실시예에서, 기억은 감각 기억, 단기 기억 및/또는 장기 기억, 바람직하게는 단기 기억 및/또는 장기 기억일 수 있다. 일부 실시예에서, 메모리는 암시적(또는 절차적) 및/또는 명시적(또는 선언적) 메모리일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 메모리는 또한 공간 메모리일 수 있다. 일부 실시예에서, 학습은 공간 학습일 수 있다. 다른 유형의 메모리에 대한 자세한 설명은 "일반 정보" 섹션에 포함되어 있다.

또 다른 측면에서, 대상체에서 근육 기능, 근력, 협응력, 균형 및/또는 활동 저하를 개선하는 방법이 제공되며, 이 방법은 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 유전자 구조체 및/또는 본원에 기술된 발현 벡터 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 유효량의 유전자 구조체, 발현 벡터 또는 조성물이 투여된다. 바람직한 실시양태에서, 치료될 대상체는 노인 대상 및/또는 대사 장애 또는 질환, 바람직하게는 비만 및/또는 당뇨병으로 진단된 대상이다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도에 따른 바람직한 실시양태에서, 치료될 대상은 노인 대상 및/또는 대사 장애 또는 질환으로 진단된 대상이다. 다시 말하면, 본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도에 따른 일부 실시양태에서, 중추신경계 장애 또는 질환, 또는 그와 관련된 상태는, 노화 및/또는 대사 장애 또는 질환과 연관되고/연관되거나 이로 인해 유발된다. 대사 장애 또는 질병의 합병증도 포함될 수 있다.

본 명세서에서 노인 대상자는 바람직하게는 50세 이상, 바람직하게는 55세 이상, 보다 바람직하게는 60세 이상, 가장 바람직하게는 65세 이상의 대상자를 의미할 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도에 따른 다른 실시양태에서, 치료될 대상은 노인 대상이 아니고/아니거나 50세 이하, 45세 이하, 40세 이하, 35세 이하, 30세 이하, 25세 이하의 대상이다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도에 따른 다른 실시양태에서, 치료될 대상은 대사 장애 또는 질환으로 진단되지 않은 대상이다. 다시 말하면, 본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도에 따른 일부 실시양태에서, 중추신경계 장애 또는 질환, 또는 그와 관련된 상태는, 노화 및/또는 대사 장애 또는 질병과 연관되고/연관되거나 이로 인해 유발되지 않다.

대사 장애 및 질환에는 대사 증후군, 당뇨병, 비만, 비만 관련 동반 질환, 당뇨병 관련 동반 질환, 고혈당증, 인슐린 저항성, 포도당 불내성, 간 지방증, 알코올성 간 질환(ALD), 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비알코올성 지방간염(NASH), 관상동맥질환(CHD), 고지혈증, 죽상동맥경화증, 내분비병증, 골육종감소성 비만증후군(OSO), 당뇨병성 신장병증, 만성신장질환(CKD), 심장비대증, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신병증, 당뇨병성 신경병증, 관절염, 패혈증, 안구 혈관신생, 신경변성, 치매가 포함될 수 있으며, 우울증, 선종, 암종을 포함할 수도 있다. 당뇨병에는 당뇨병 전증, 고혈당증, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 젊은 성인기 발병 당뇨병(MODY), 단일성 당뇨병, 신생아 당뇨병, 임신성 당뇨병, 취성 당뇨병, 특발성 당뇨병, 약물 또는 화학 물질 유발 당뇨병, 스티프맨 증후군, 지방위축성 당뇨병, 성인의 잠복성 자가면역 당뇨병(LADA)이 포함될 수 있다. 비만에는 과체중, 중추/상체 비만, 말초/하체 비만, 병적 비만, 골육종 감소성 비만 증후군(OSO), 소아 비만, 멘델 (단일유전자) 증후군 비만, 멘델 비증후군 비만, 다유전자성 비만이 포함될 수 있다. 바람직한 대사 장애 또는 질환은 비만 및/또는 당뇨병이다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도에 따른 일부 실시양태에서, 치료될 대상은 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태가 발병할 위험이 있는 대상이다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도와 관련하여, 요법 및/또는 치료 및/또는 치료제는 CNS에서 FGF21의 발현 및/또는 CNS, 바람직하게는 뇌의 형질도입을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뇌에서의 FGF21의 발현은 시상하부 및/또는 피질 및/또는 해마 및/또는 소뇌 및/또는 후각 망울에서의 FGF21의 발현을 의미할 수 있다. 따라서, 뇌에서 FGF21의 발현은 시상하부, 피질, 해마, 소뇌 및 후각망울로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 모든 뇌 영역에서의 FGF21의 발현을 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, CNS 및/또는 뇌 및/또는 시상하부 및/또는 피질 및/또는 해마 및/또는 소뇌 및/또는 후각 망울에서의 발현 및/또는 형질도입은 CNS 및/또는 뇌 및/또는 시상하부 및/또는 피질 및/또는 해마 및/또는 소뇌 및/또는 후각망울에서의 특이적 발현 및/또는 특이적 형질도입을 의미할 수 있다. 실시양태에서, 발현은 간, 췌장, 지방 조직, 골격근 및/또는 심장에서의 발현을 수반하지 않는다. 일부 실시양태에서, 발현은 간, 췌장, 지방 조직, 골격근 및 심장으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 모든 기관에서의 발현을 포함하지 않는다. CNS 및/또는 뇌 및/또는 시상하부 및/또는 피질 및/또는 해마 및/또는 소뇌 및/또는 후각구 특이 발현에 대한 설명은 "일반 정보" 섹션에서 제공되었다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도와 관련하여, 요법 및/또는 치료 및/또는 치료제는 간에서의 FGF21의 발현 및/또는 간의 형질도입을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 간에서의 발현 및/또는 간에서의 형질도입은 간의 특이적 발현 및/또는 특이적 형질도입을 의미할 수 있다. 실시양태에서, 발현은 CNS, 뇌, 췌장, 지방 조직, 골격근 및/또는 심장에서의 발현을 수반하지 않는다. 일부 실시양태에서, 발현은 CNS, 뇌, 췌장, 지방 조직, 골격근 및 심장으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4개 또는 모든 기관에서의 발현을 수반하지 않는다. 간 특이적 발현에 대한 설명은 "일반 정보" 섹션에 나와 있다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도와 관련하여, 요법 및/또는 치료 및/또는 치료제는 근육에서의 FGF21의 발현 및/또는 근육의 형질도입을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 근육에서의 발현 및/또는 근육에서의 형질도입은 근육의 특이적 발현 및/또는 특이적 형질도입을 의미할 수 있다. 실시양태에서, 발현은 CNS, 뇌, 간, 췌장, 지방 조직 및/또는 심장에서의 발현을 수반하지 않는다. 일부 실시양태에서, 발현은 CNS, 뇌, 간, 췌장, 지방 조직 및 심장으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4개 또는 모든 기관에서의 발현을 수반하지 않는다. 근육 특이적 발현에 대한 설명은 "일반 정보" 섹션에 나와 있다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도와 관련하여, 요법 및/또는 치료 및/또는 치료제는 지방 조직에서의 FGF21의 발현 및/또는 지방 조직의 형질도입을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 지방 조직에서의 발현 및/또는 지방 조직에서의 형질도입은 지방 조직의 특이적 발현 및/또는 특이적 형질도입을 의미할 수 있다. 실시양태에서, 발현은 CNS, 뇌, 간, 췌장, 골격근 및/또는 심장에서의 발현을 수반하지 않는다. 일부 실시양태에서, 발현은 CNS, 뇌, 간, 췌장, 골격근 및 심장으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4개 또는 모든 기관에서의 발현을 수반하지 않는다. 지방 조직 특이적 발현에 대한 설명은 "일반 정보" 섹션에 나와 있다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도의 바람직한 실시예에서, 요법 및/또는 치료 및/또는 치료제는 다음 중 적어도 하나를 포함할 수 있다:

- CNS, 바람직하게는 뇌에서 FGF21의 발현;

- 말초 신체 기관, 바람직하게는 근육, 지방 조직 및/또는 간, 보다 바람직하게는 근육 및/또는 지방 조직에서 FGF21의 발현; 및

- FGF21의 순환 수준 증가.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도와 관련하여, "유전자 구조체의 발현을 수반하는"은 "유전자 구조체의 발현을 유발하는" 또는 "유전자 구조체의 발현을 유도하는" 또는 "형질 도입 포함"으로 대체될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도와 관련하여, 요법 및/또는 치료 및/또는 치료제는 근육에서의 FGF21의 발현 및/또는 근육의 형질도입을 수반할 수 있고, 바람직하게는 대퇴사두근, 비복근 및/또는 경골과 같은 골격근이다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도와 관련하여, 요법 및/또는 치료 및/또는 치료제는 지방 조직에서의 FGF21의 발현 및/또는 지방조직의 형질도입을 수반할 수 있고, 바람직하게는 백색 지방 조직(WAT)이다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도와 관련하여, 요법 및/또는 치료 및/또는 치료제는 FGF21의 증가된 순환 수준을 수반할 수 있다. FGF21의 순환 수준은 예를 들어 실험 부분에 기술된 바와 같이 ELISA와 같은 당업계에 공지된 방법에 따라 혈청에서 측정될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물의 일부 실시양태에서, 방법 또는 용도는 CNS에서 FGF21의 발현을 수반하지 않고/않거나 CNS의 형질도입을 수반하지 않는다.

바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료 또는 요법 또는 치료제의 사용 또는 투여는 반복될 필요가 없다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 또는 요법 또는 치료제의 사용 또는 투여는 매년 또는 각 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에 나열된 값 중 두 개 사이의 간격을 포함하는 연도로 반복될 수 있다.

치료 대상은 고등 포유동물, 예를 들어 고양이, 설치류(바람직하게는 생쥐, 랫트, 게르빌루스쥐 및 기니아 피그, 보다 바람직하게는 생쥐 및 랫트), 개 또는 인간일 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도와 관련하여, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 조성물 및/또는 치료제는 바람직하게 다음 효과 중 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 또는 모두를 나타낸다.

- 신경 염증 감소;

- 신경 발생 증가;

- 신경변성 감소;

- 증상 완화(본원에서 나중에 설명됨); 및

- 매개변수 개선(본원에서 나중에 설명됨).

신경 염증 감소는 신경 조직의 염증이 감소함을 의미할 수 있다. 이것은 예를 들어 실험 부분에서 수행된 바와 같이 (신경)염증 마커의 측정과 같은 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 예시적인 마커는 Il-1b, Il-6 및 NfkB이다. 이와 관련하여, "감소"(각각 "개선")는 실험 부분에서 수행되는 분석과 같은 당업자에게 공지된 분석을 사용하여 적어도 검출 가능한 감소(각각 검출 가능한 개선)를 의미한다. 감소는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80, 적어도 90% 또는 적어도 100%의 감소일 수 있다. 감소는 본 발명의 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 조성물을 사용한 적어도 1주, 1개월, 6개월, 1년 이상의 치료 후에 나타날 수 있다. 바람직하게는, 감소는 단일 투여 후에 관찰된다. 일부 실시양태에서, 감소는 적어도 1주, 1개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 12년, 15년, 20년 이상 동안, 바람직하게는 단일 투여 후 관찰된다.

신경 발생이 증가한다는 것은 뉴런이 신경 줄기 세포에 의해 생성된다는 것을 의미할 수 있다. 이것은 신경발생 마커의 측정과 같은 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 예시적인 마커는 Dcx, Ncam 및 Sox2이다. 이와 관련하여, "증가하다"(각각 "개선")는 실험 부분에서 수행되는 분석과 같은 당업자에게 공지된 분석을 사용하여 적어도 검출가능한 증가(각각 검출가능한 개선)를 의미한다. 증가는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%일 수 있다. 증가는 본 발명의 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 조성물을 사용한 적어도 1주, 1개월, 6개월, 1년 이상의 치료 후에 나타날 수 있다. 바람직하게는, 증가는 단일 투여 후에 관찰된다. 일부 실시양태에서, 증가는 적어도 1주, 1개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 12년, 15년, 20년 이상 동안, 바람직하게는 단일 투여 후 관찰된다.

신경변성의 감소는 뉴런의 사멸을 포함하여 뉴런의 구조 또는 기능의 손실이 감소함을 의미할 수 있다. 이것은 면역세포화학, 면역조직화학과 같은 당업자에게 공지된 기술을 사용하여, MRI와 같은 의료 이미징 기술, 뉴런 형태학 및 시냅스 변성 연구(시냅스에 위치한 단백질의 밀도를 측정함으로써) 또는 여러 노화 및 신경퇴행 마커의 발현 수준 분석에 의해 평가될 수 있다. 관련 마커의 비제한적 예는 표 1의 임의의 과정 및 경로와 관련된 마커와 같은 미토콘드리아 기능 장애 및/또는 산화 스트레스의 마커이다. 이와 관련하여 "감소"(각각 "개선")는 적어도 실험 부분에서 수행되는 분석과 같은 당업자에게 공지된 분석을 사용하여 검출 가능한 감소(각각 검출 가능한 개선)를 의미한다. 감소는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100%일 수 있다. 증가는 본 발명의 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 조성물을 사용한 적어도 1주, 1개월, 6개월, 1년 이상의 치료 후에 나타날 수 있다. 바람직하게는, 증가는 단일 투여 후에 관찰된다. 일부 실시양태에서, 증가는 적어도 1주, 1개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 12년, 15년, 20년 이상 동안, 바람직하게는 단일 투여 후 관찰된다.

증상의 완화는 전형적인 증상(예: 신경염증, 신경변성, 인지 저하, 시냅스 손실, 타우 인산화, 협응 상실, 균형 상실, 근력 상실, 근육 기능 상실, 활동 저하, 우울증, 불안, 무쾌감증) 의 진행이 개인, 상기 개인의 세포, 조직 또는 기관에서 느려지는 것을 의미할 수 있으며, 이는 의사가 평가할 때이다. 전형적인 증상의 감소는 증상 발달의 진행이 느려지거나 증상이 완전히 사라짐을 의미할 수 있다. 증상, 따라서 증상의 감소는 임상 검사 및 일상적인 실험실 검사를 포함하여 중추 신경계 장애 또는 질환이와 관련된 상태의 진단에 사용되는 것과 대부분 동일한 방법을 사용하여 다양한 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 임상 검사에는 행동 테스트와 인지 테스트가 포함될 수 있다. 실험실 검사에는 거시적 및 현미경적 방법, 분자적 방법, X선과 같은 방사선학적 방법, 생화학적 방법, 면역조직화학적 방법 등이 포함될 수 있다. 증상의 완화는 본 발명의 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 조성물을 사용한 적어도 1주, 1개월, 6개월, 1년 이상의 치료 후에 나타날 수 있다. 바람직하게는, 완화는 단일 투여 후에 관찰된다. 일부 실시양태에서, 완화는 적어도 1주, 1개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 12년, 15년, 20년 이상 동안, 바람직하게는 단일 투여 후 관찰된다.

매개변수의 개선은 행동 검사 후 결과 개선, 혈청 및 CSF 마커의 발현 개선, 세포사멸/신경발생 세포 마커의 발현 개선 등을 의미할 수 있다. 매개변수의 개선은 적어도 1주, 1개월, 6개월, 1년 또는 그 이상의 치료 후에 나타날 수 있다. 바람직하게는, 단일 투여 후에 개선이 관찰된다. 일부 실시양태에서, 개선은 적어도 1주, 1개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 12년, 15년, 20년 이상 동안, 바람직하게는 단일 투여 후 관찰된다.

본원에 기술된 바와 같은 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 조성물은 적어도 1주, 1개월, 6개월, 1년 이상의 본 발명의 유전자 구조 및/또는 발현 벡터 및/또는 조성물을 사용한 치료 후, 상기 증상 또는 특징이 본원에 기술된 바와 같이 감소된 경우(예를 들어, 더 이상 검출할 수 없음 또는 속도가 느려짐), 바람직하게 환자 또는 상기 환자의 세포, 조직 또는 기관의 증상 또는 특징을 완화시킬 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 조성물은 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태에 의해 영향을 받거나 발병할 위험이 있는 개인의 생체 내(in vivo) 세포, 조직 및/또는 기관에 투여하기에 적합할 수 있으며, 생체내, 생체외(ex vivo) 또는 시험관내(in vitro)에서 투여될 수 있다. 상기 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 조성물은 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 상태에 의해 영향을 받거나 발병할 위험이 있는 개인의 생체 내(in vivo) 세포, 조직 및/또는 기관에 직접 또는 간접적으로 투여될 수 있으며, 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 직접 또는 간접적으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도와 관련하여, 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 조성물은 상이한 투여 방식에 의해 투여될 수 있다. 투여 방식은 정맥내, 근육내, 복강내, 흡입을 통한, 비강내, 실질내, CSF(뇌척수액)내, 안구내, 피하, 관절내, 지방내 조직, 경구, 간내, 내장내, 귀내, 국소 투여 및/또는 역행성 관내 췌장 투여일 수 있다. CSF내 투여는 시스터나 마그나(cisterna magna), 척수강내 또는 심실내 전달을 통해 수행될 수 있다. "CSF내 투여", "비강내 투여", "실질내 투여", "대수조내 투여", "척수강내 투여" 및 "심실내 투여"는 본원에서 "일반 정보" 부분에 설명되어 있다.

바람직한 투여 방식은 근육내, eWAT(부고환 백색 지방 조직)내 와 같은 지방내 조직 및 CSF(뇌척수액)(마그나 수조를 통해, 경막내 또는 뇌실내 전달)내 투여이다. CSF내 투여의 경우, 시스터나 마그나를 통한 주사가 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 유전자 구조체, 발현 벡터, 조성물, 방법 및 용도와 관련하여 일부 실시양태에서, 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 조성물은 CSF내 투여를 통해 투여되지 않는다.

본 발명의 바이러스 발현 구조체 및/또는 바이러스 벡터 및/또는 핵산 분자 및/또는 조성물은 당업계에 공지된 적합한 수단을 사용하여 직접적으로 또는 간접적으로 투여될 수 있다. 개인 또는 상기 개인의 세포, 조직, 기관에 본 발명의 바이러스 발현 구조체 및/또는 바이러스 벡터 및/또는 핵산 분자 및/또는 조성물을 제공하는 수단의 개선은 지금까지 이미 달성한 진전을 고려하여 예상된다. 이러한 미래의 개선은 물론 본 발명의 언급된 효과를 달성하기 위해 통합될 수 있다. 바이러스 발현 구조체 및/또는 바이러스 벡터 및/또는 핵산 분자 및/또는 조성물은 개체, 상기 개체의 세포, 조직 또는 기관에 있는 그대로 전달될 수 있다. 질병 또는 상태에 따라, 상기 개인의 세포, 조직 또는 기관은 본원에서 앞서 기술된 바와 같을 수 있다. 본 발명의 바이러스 발현 구조체 및/또는 바이러스 벡터 및/또는 핵산 분자 및/또는 조성물을 투여할 때, 이러한 바이러스 발현 구조체 및/또는 벡터 및/또는 핵산 및/또는 조성물은 전달 방법에 적합한 용액에 용해되는 것이 바람직하다.

본원에 포함된 바와 같이, 상기 언급된 바와 같은 바이러스 발현 구조체, 벡터, 핵산 분자 및/또는 조성물의 치료 유효 용량은 바람직하게는 단일 및 고유 용량으로 투여되어 반복적인 주기적 투여를 피한다.

일반 정보

달리 명시되지 않는 한, 여기에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되고 본 개시 내용을 고려하여 읽는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터" 또는 "조절 서열"은 하나 이상의 코딩 서열의 전사를 제어하는 기능을 하는 핵산 단편을 지칭하며, 코딩 서열의 전사 개시 부위의 전사 방향에 대해 업스트림에 위치하고, DNA 의존 RNA 중합효소, 전사 개시 부위 및 전사 인자 결합 부위를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 다른 DNA 서열, 억제자 및 활성자 단백질 결합 부위, 및 프로모터로부터의 전사량을 조절하기 위해 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 것으로 당업자에게 공지된 임의의 다른 뉴클레오티드 서열에 대한 결합 부위의 존재에 의해 구조적으로 식별된다. "구성적" 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발달 조건 하에서 대부분의 조직에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 및/또는 "억제성" 프로모터는 유도 및/또는 억제되도록, 예를 들어 화학적 유도제 또는 억제 신호의 적용에 의해 생리학적으로 또는 발달적으로 조절되는 프로모터이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 기능적 관계에서 폴리뉴클레오티드 요소의 연결을 의미한다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동 가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 프로모터와 같은 전사 조절 서열은 그것이 코딩 서열의 전사에 영향을 미치면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된다는 것은 연결되는 DNA 서열이 전형적으로 연속적이며, 필요한 경우 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하기 위해 연속적이고 판독 프레임 내에 있음을 의미한다.

본원에서 사용되는 "조절자" 또는 "전사 조절자"는 특정 DNA 서열에 결합함으로써 DNA에서 메신저 RNA로 유전 정보의 전사 속도를 조절하는 단백질이다.

"단백질" 또는 "폴리펩티드"라는 용어는 상호 교환적으로 사용되며 특정 작용 방식, 크기, 3차원 구조 또는 기원에 대한 언급 없이 아미노산 사슬로 구성된 분자를 의미한다.

용어 "유전자"는 적합한 조절 영역(예: 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 세포에서 RNA 분자(예: mRNA)로 전사되는 영역(전사 영역)을 포함하는 DNA 단편을 의미한다. 유전자는 일반적으로 프로모터, 예를 들어, 폴리아데닐화- 및/또는 전사 종결 부위를 포함하는 5' 리더 서열, 코딩 영역 및 3'-비번역 서열(3'-말단)과 같은 작동가능하게 연결된 여러 단편을 포함할 것이다.

"유전자의 발현"은 적절한 조절 영역, 특히 프로모터에 작동 가능하게 연결된 DNA 영역이 생물학적 활성인, 즉 생물학적 활성 단백질 또는 펩티드로 번역될 수 있는 RNA로 전사된다.

본원에 기재된 아미노산 서열에서, 아미노산 또는 "잔기"는 3문자 기호로 표시된다. 이들 3문자 기호 및 대응하는 1문자 기호는 당업자에게 잘 알려져 있으며 다음과 같은 의미를 갖는다. A(Ala)는 알라닌, C(Cys)는 시스테인, D(Asp)는 아스파르트산, E(Glu)는 글루탐산, F(Phe)는 페닐알라닌, G(Gly)는 글리신, H(His)는 히스티딘, I(Ile)는 이소류신, K(Lys)는 라이신, L(Leu)는 류신, M(Met)은 메티오닌, N(Asn)은 아스파라긴, P(Pro)는 프롤린, Q(Gln)은 글루타민, R(Arg)은 아르기닌, S(Ser)는 세린, T(Thr)는 트레오닌, V(Val)은 발린, W(Trp)는 트립토판, Y(Tyr)는 티로신이다. 잔기는 임의의 단백질 생성 아미노산일 수 있지만, D-아미노산 및 번역후 변형에 의해 형성된 변형 아미노산과 같은 임의의 비-단백질 생성 아미노산일 수 있고, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 비천연 아미노산일 수도 있다.

서열 동일성

본 발명과 관련하여, FGF21을 암호화하는 핵산 분자와 같은 핵산 분자는 단백질 단편 또는 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 유도된 펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열로 표현된다. 본 발명과 관련하여, 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21)로서 FGF21 단백질 단편 또는 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 유도된 펩타이드는 아미노산 서열로 표시된다.

주어진 서열 번호(SEQ ID NO)에 의해 본 명세서에서 식별되는 각각의 핵산 분자 또는 단백질 단편 또는 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 파생된 펩타이드 또는 구조체는 개시된 바와 같은 이 특정 서열에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 확인된 각각의 코딩 서열은 주어진 단백질 단편 또는 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 유래된 펩타이드 또는 구조체를 암호화하거나 그 자체가 단백질 단편 또는 폴리펩타이드 또는 구조체 또는 펩타이드 또는 유도된 펩타이드이다.

본 출원 전반에 걸쳐, 특정 뉴클레오티드 서열번호(예로서 서열번호 X를 취함)를 언급할 때마다 주어진 단백질 단편 또는 폴리펩타이드 또는 펩타이드 또는 파생된 펩타이드를 암호화하며, 이를 다음으로 대체할 수 있다.

i. 서열번호 X와 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열;

ii. 유전자 코드의 축퇴로 인해 (i)의 핵산 분자의 서열과 상이한 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열; 또는

iii. 뉴클레오티드 서열 서열번호 X에 의해 암호화된 아미노산 서열과 적어도 60% 아미노산 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열.

서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 70%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 80%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 90%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 95%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 99%이다.

본 출원 전체에서 특정 아미노산 서열 서열번호(서열번호 Y를 예로 들음)를 언급할 때마다 다음과 같이 대체할 수 있다: 아미노산 서열 서열번호 Y와 적어도 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표현되는 폴리펩티드. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 70%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 80%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 90%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 95%이다. 서열 동일성 또는 유사성의 다른 바람직한 수준은 99%이다.

주어진 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열과의 동일성 또는 유사성 백분율에 의해 본원에 기술된 각각의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 각각 추가의 바람직한 실시양태에서 주어진 뉴클레오티드 또는 아미노산과 각각 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64 %, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74 %, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84 %, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 의 동일성 또는 유사성을 갖는다.

각각의 비코딩 뉴클레오타이드 서열(즉, 프로모터 또는 다른 조절 영역의)은 특정 뉴클레오타이드 서열번호 (서열번호 A를 예로서 취함)과 적어도 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 대체될 수 있다. 바람직한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 A와 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64 %, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74 %, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84 %, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 의 동일성을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 프로모터와 같은 이러한 비암호화 뉴클레오티드 서열은 당업자에게 공지된 프로모터의 활성과 같은 이러한 비암호화 뉴클레오티드 서열의 적어도 활성을 나타내거나 발휘한다.

"상동성", "서열 동일성" 등의 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 서열 동일성은 서열을 비교함으로써 결정되는 바와 같이 2개 이상의 아미노산(폴리펩티드 또는 단백질) 서열 또는 2개 이상의 핵산(폴리뉴클레오티드) 서열 사이의 관계로서 본원에 기술된다. 바람직한 실시양태에서, 서열 동일성은 2개의 주어진 서열번호의 전체 길이 또는 이의 일부에 기초하여 계산된다. 이들의 일부는 바람직하게는 두 서열번호의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%를 의미한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 경우에 따라 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 서열 관련성 정도를 의미하며, 경우에 따라 이러한 서열의 문자열 사이의 일치에 의해 결정된다. 2개의 아미노산 서열 사이의 "유사성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 그의 보존된 아미노산 치환체를 두 번째 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다. "동일성" 및 "유사성"은 각각 본원에 참조로 포함된 Bioinformatics and the Cell: 유전체학, 프로테오믹스, 전사체학의 현대적 계산 접근법, 2018; and Bioinformatics: 염기서열 및 게놈 분석, Mount D., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2004, 에 기술된 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다.

"서열 동일성" 및 "서열 유사성"은 2개의 서열의 길이에 따라 글로벌 또는 로컬 정렬 알고리즘을 사용하여 2개의 펩티드 또는 2개의 뉴클레오티드 서열의 정렬에 의해 결정될 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게 전체 길이에 걸쳐 서열을 최적으로 정렬하는 전체 정렬 알고리즘(예: 니들만-브니쉬)을 사용하여 정렬되는 반면, 실질적으로 다른 길이의 서열은 바람직하게는 로컬 정렬 알고리즘(예: 스미스-워터맨)을 사용하여 정렬된다. 그런 다음 서열이 (기본 매개변수를 사용하여 프로그램 EMBOSS 바늘 또는 EMBOSS 물에 의해 최적으로 정렬될 때) 서열 동일성의 적어도 특정 최소 비율(아래에 설명된 대로)을 공유할 때 "실질적으로 동일한" 또는 "본질적으로 유사한" 것으로 언급될 수 있다.

전역 정렬은 2개의 서열이 유사한 길이를 가질 때 서열 동일성을 결정하는데 적합하게 사용된다. 서열의 전체 길이가 실질적으로 다른 경우 스미스-워터맨 알고리즘을 사용하는 것과 같은 로컬 정렬이 선호된다. EMBOSS 바늘은 니들맨-브니쉬 전역 정렬 알고리즘을 사용하여 전체 길이(전체 길이)에 걸쳐 두 개의 시퀀스를 정렬하여 일치 수를 최대화하고 간격 수를 최소화한다. EMBOSS water는 스미스-워터맨 로컬 정렬 알고리즘을 사용한다. 일반적으로 EMBOSS 바늘 및 EMBOSS 물 기본 매개변수가 사용되며, 갭 개방 페널티 = 10(뉴클레오티드 서열)/10(단백질) 및 갭 확장 패널티 = 0.5(뉴클레오티드 서열)/0.5(단백질)와 함께 사용된다. 뉴클레오티드 서열의 경우 사용되는 기본 스코어링 매트릭스는 DNAfull이고 단백질의 경우 기본 스코어링 매트릭스는 Blosum62 (본원에 참조로 포함된 Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919)이다.

선택적으로 FASTA, BLAST 등과 같은 알고리즘을 사용하여 공용 데이터베이스를 검색하여 백분율 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 실시예의 핵산 및 단백질 서열은 예를 들어, 다른 패밀리 구성원 또는 관련 서열을 식별하기 위해 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "쿼리 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 본원에 참조로 포함된 Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10의 BLASTn 및 BLASTx 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12로 수행되어 본 발명의 산화환원효소 핵산 분자에 상동인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 검색은 BLASTx 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행되어 본 발명의 단백질 분자에 상동인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해, 본원에 참조로 포함된 Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402에 기재된 대로 갭 BLAST를 활용할 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 사용할 때 각 프로그램의 기본 매개변수(예: BLASTx 및 BLASTn)를 사용할 수 있다. 월드 와이드 웹(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 액세스할 수 있는 National Center for Biotechnology Information의 홈페이지를 참조할 수 있다. 임의로, 아미노산 유사성 정도를 결정함에 있어서, 당업자는 또한 소위 보존적 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 본원에서 사용되는 "보존적" 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환성을 의미한다. 보존적 치환을 위한 아미노산 잔기 부류의 예는 하기 표에 제시되어 있다.

대안적인 보존적 아미노산 잔기 치환 부류:

아미노산 잔기의 대안적인 물리적 및 기능적 분류:

예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드 포함 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황 포함 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다. 본원에 개시된 아미노산 서열의 치환 변이체는 개시된 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입된 것이다. 바람직하게는 아미노산 변화는 보존적이다. 각각의 천연 발생 아미노산 각각에 대한 바람직한 보존적 치환은 Arg에서 Lys로; Asn에서 Gln 또는 His로; Asp에서 Glu로; Cys에서 Ser 또는 Ala로; Gln에서 Asn으로; Glu에서 Asp로; Gly에서 Pro 로; His 에서 Asn 또는 Gln; Ile에서 Leu 또는 Val로; Leu에서 Ile 또는 Val로; Lys에서 Arg로; Gln 또는 Glu; Met에서 Leu 또는 Ile로; Phe에서 Met, Leu 또는 Tyr로; Ser에서 Thr로; Thr에서 Ser로; Trp에서 Tyr로; Tyr에서 Trp 또는 Phe로; 및 Val에서 Ile 또는 Leu로의 치환이다.

예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드 포함 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황 포함 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다. 본원에 개시된 아미노산 서열의 치환 변이체는 개시된 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입된 것이다. 바람직하게는 아미노산 변화는 보존적이다. 각각의 천연 발생 아미노산 각각에 대한 바람직한 보존적 치환은 Arg에서 Lys로; Asn에서 Gln 또는 His로; Asp에서 Glu로; Cys에서 Ser 또는 Ala로; Gln에서 Asn으로; Glu에서 Asp로; Gly에서 Pro 로; His 에서 Asn 또는 Gln; Ile에서 Leu 또는 Val로; Leu에서 Ile 또는 Val로; Lys에서 Arg로; Gln 또는 Glu; Met에서 Leu 또는 Ile로; Phe에서 Met, Leu 또는 Tyr로; Ser에서 Thr로; Thr에서 Ser로; Trp에서 Tyr로; Tyr에서 Trp 또는 Phe로; 및 Val에서 Ile 또는 Leu로의 치환이다.

유전자 또는 코딩 서열

용어 "유전자"는 적합한 조절 영역(예: 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 세포에서 RNA 분자(예: mRNA)로 전사되는 영역(전사 영역)을 포함하는 DNA 단편을 의미한다. 유전자는 일반적으로 예를 들어, 폴리아데닐화- 및/또는 전사 종결 부위를 포함하는 프로모터, 5' 리더 서열, 코딩 영역 및 3'-비번역 서열(3'-말단)과 같은 작동가능하게 연결된 여러 단편을 포함할 것이다. 키메라 또는 재조합 유전자(예: FGF21 유전자)는 자연에서 일반적으로 발견되지 않는 유전자, 예를 들어 프로모터가 자연에서 전사된 DNA 영역의 일부 또는 전부와 연관되지 않은 유전자이다. 유전자의 발현"은 RNA로 전사되는 과정을 말하며, 여기서 적절한 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 DNA 영역, 특히 프로모터는, 생물학적 활성인, 즉 생물학적 활성 단백질 또는 펩티드로 번역될 수 있는 것을 의미한다.

"트랜스유전자"는 본원에서 세포에 새로 도입된 유전자 또는 코딩 서열 또는 핵산 분자(즉, FGF21을 코딩하는 분자), 즉 존재할 수 있지만 일반적으로 발현되지 않을 수 있는 유전자 또는 세포에서 불충분한 수준으로 발현된다. 이러한 맥락에서, "불충분하다"는 상기 FGF21이 세포에서 발현되더라도, 본원에 기재된 상태 및/또는 질병이 여전히 발달될 수 있음을 의미한다. 이 경우, 본 발명은 FGF21의 과발현을 허용한다. 트랜스유전자는 세포 고유의 서열, 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 서열을 포함할 수 있고, 둘 모두의 조합을 포함할 수 있다. 트랜스유전자 는 FGF21을 코딩하는 서열 및/또는 세포에서 FGF21을 코딩하는 서열의 발현을 위한 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 본원에서 앞서 확인된 추가 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 도입유전자는 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않는다.

프로모터

본원에서 사용되는 용어 "프로모터" 또는 "전사 조절 서열"은 하나 이상의 코딩 서열의 전사를 제어하는 기능을 하는 핵산 단편을 지칭하며, 전사 개시 부위의 전사 방향에 대해 업스트림에 위치하고, DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 전사 개시 부위 및 기타 DNA 서열에 대한 결합 부위의 존재에 의해 구조적으로 식별되며, 전사 인자 결합 부위, 억제인자 및 활성인자 단백질 결합 부위, 및 프로모터로부터의 전사량을 직접적으로 또는 간접적으로 조절하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 기타 뉴클레오타이드 서열을 포함하되 이에 국한되지 않는다. "구성적" 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발달 조건 하에서 대부분의 조직에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 생리학적으로 또는 예를 들어, 화학 유도제의 적용에 의해 발달적으로 조절되는 프로모터이다.

"유비쿼터스 프로모터"는 유기체의 실질적으로 모든 조직, 기관 및 세포에서 활성이다.

"기관-특이적" 또는 "조직-특이적" 프로모터는 각각 특정 유형의 기관 또는 조직에서 활성인 프로모터이다. 기관 특이적 및 조직 특이적 프로모터는 주로 하나의 기관 또는 조직에서 하나 이상의 유전자(또는 코딩 서열)의 발현을 조절하지만 다른 기관 또는 조직에서도 검출 가능한 수준("누출(leaky)") 발현을 허용할 수 있다. 다른 장기 또는 조직에서의 누출 발현은 장기 특이적 발현에 비해 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배 또는 적어도 5배 낮지만 당업자에게 공지된 표준 분석법(예를 들어, qPCR, 웨스턴 블롯 분석, ELISA)에 의해 mRNA 또는 단백질의 수준에서 평가된 기관 특이적 또는 조직 특이적 발현과 비교하여 여전히 검출가능한 발현이다. 누출 발현이 감지될 수 있는 장기 또는 조직의 최대 수는 5개, 6개, 7개 또는 8개이다.

"CNS- 또는 뇌-특이적 프로모터"는 CNS 및/또는 뇌에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이며, 동시에 다른(최대 5, 6, 7 또는 8) 기관 및 신체부분에서 누출 발현을 여전히 허용한다. CNS 및/또는 뇌에서의 전사는 시상하부, 피질, 해마, 소뇌 및 후각망울과 같은 관련 영역 및 뉴런 및/또는 신경교세포와 같은 세포에서 검출될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, CNS- 및/또는 뇌- 및/또는 시상하부 및/또는 피질- 및/또는 해마- 및/또는 소뇌- 및/또는 후각구-특이적 프로모터는 다른 기관이나 조직에 비해 CNS 및/또는 뇌 및/또는 시상하부 및/또는 피질 및/또는 해마 및/또는 소뇌 및/또는 후각 망울에서 FGF21의 우선적 또는 우세한 (10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상 이상) 발현을 유도할 수 있는 프로모터일 수 있다. 다른 장기 또는 조직은 간, 췌장, 지방 조직, 골격근, 심장, 신장, 결장, 조혈 조직, 폐, 난소, 비장, 위, 고환 등일 수 있다. 바람직하게는 다른 기관은 간과 심장이다. 표현은 "일반 정보" 섹션에 설명된 대로 평가될 수 있다.

출원 전반에 걸쳐, 발현 맥락에서 CNS- 및/또는 뇌- 및/또는 시상하부 및/또는 피질- 및/또는 해마- 및/또는 소뇌- 및/또는 후각망울-특이적이 언급되는 경우, CNS및/또는 뇌 및/또는 시상하부 및/또는 피질 및/또는 해마 및/또는 소뇌 및/또는 후각 망울을 구성하는 세포 유형(들)의 세포 유형 특이적 발현이 또한 각각 예상된다.

"간 특이적 프로모터"는 간에서 전사를 개시할 수 있는 동시에 신체의 다른(최대 5, 6, 7 또는 8개) 기관 및 신체부분에서 임의의 누출 발현을 여전히 허용하는 프로모터이다. 간에서의 전사는 간 조직 및 간세포, 쿠퍼 세포 및/또는 타원형 세포와 같은 간 세포에서 검출될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 간 특이적 프로모터는 다른 기관 또는 조직과 비교하여 간에서 FGF21의 우선적 또는 우세한 (10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상 이상) 발현을 유도할 수 있는 프로모터일 수 있다. 다른 기관 또는 조직은 CNS, 뇌, 췌장, 지방 조직, 골격근, 심장, 신장, 결장, 조혈 조직, 폐, 난소, 비장, 위, 고환 등일 수 있다. 바람직하게는 다른 기관은 심장이다. 표현은 "일반 정보" 섹션에 설명된 대로 평가될 수 있다.

출원 전반에 걸쳐, 발현과 관련하여 간-특이적이 언급되는 경우, 간을 구성하는 세포 유형(들)(간세포, 쿠퍼 세포 및/또는 타원형 세포 포함)의 세포-유형 특이적 발현이 또한 각각 구상된다.

"지방 조직-특이적 프로모터"는 지방 조직에서 전사를 개시할 수 있는 동시에 신체의 다른(최대 5, 6, 7 또는 8개) 기관 및 신체부분에서 임의의 누출 발현을 여전히 허용하는 프로모터이다. 지방 조직에서의 전사는 지방 조직 및 백색 지방세포, 갈색 지방세포, 베이지 지방세포, 지방전구세포, 간질 혈관 세포와 같은 지방 조직 세포에서 검출될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 지방 조직 특이적 프로모터는 다른 기관 또는 조직과 비교하여 지방 조직에서 FGF21의 우선적 또는 우세한 (10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상 이상) 발현을 유도할 수 있는 프로모터일 수 있다. 다른 기관 또는 조직은 CNS, 뇌, 췌장, 간, 골격근, 심장, 신장, 결장, 조혈 조직, 폐, 난소, 비장, 위, 고환 등일 수 있다. 바람직하게는 다른 기관은 심장이다. 표현은 "일반 정보" 섹션에 설명된 대로 평가될 수 있다.

본 출원 전체에서, 발현의 맥락에서 지방 조직 특이적이 언급되는 경우, 지방 조직을 구성하는 세포 유형(들)(백색 지방세포, 갈색 지방세포, 베이지 지방세포, 지방전구세포, 간질 혈관 세포 포함) 의 세포 유형 특이적 발현도 각각 구상된다.

"골격근 프로모터"는 골격근에서 전사를 개시할 수 있는 동시에 신체의 다른(최대 5개, 6개, 7개 또는 8개) 기관 및 신체부분에서 임의의 누출 발현을 여전히 허용하는 프로모터이다. 골격근에서의 전사는 골격근 조직 및 근세포, 근모세포, 위성 세포와 같은 골격근 세포에서 검출될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 골격근 특이적 프로모터는 다른 기관 또는 조직과 비교하여 골격근에서 FGF21의 우선적 또는 우세한 (10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상 이상) 발현을 유도할 수 있는 프로모터일 수 있다. 다른 기관 또는 조직은 CNS, 뇌, 췌장, 간, 골격근, 심장, 신장, 결장, 조혈 조직, 폐, 난소, 비장, 위, 고환 등일 수 있다. 바람직하게는 다른 기관은 심장이다. 표현은 "일반 정보" 섹션에 설명된 대로 평가될 수 있다.

본 출원 전체에서, 발현의 맥락에서 골격근 특이적이 언급되는 경우, 골격근을 구성하는 세포 유형(들)(근세포, 근모세포, 위성 세포 포함) 의 세포 유형 특이적 발현도 각각 구상된다.

작동 가능하게 연결된(Operably linked)

본원에서 사용되는 바와 같이, "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 기능적 관계에서 폴리뉴클레오티드 요소의 연결을 의미한다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동 가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 전사 조절 서열은 코딩 서열의 전사에 영향을 미치면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 작동가능하게 연결된다는 것은 연결되는 DNA 서열이 전형적으로 연속적이며, 필요한 경우 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하기 위해 연속적이고 판독 프레임 내에 있음을 의미한다. 연결은 편리한 제한 부위 또는 그 대신에 삽입된 어댑터 또는 링커에서의 라이게이션에 의해 또는 유전자 합성에 의해 달성될 수 있다.

마이크로RNA

본원에서 사용된 바와 같이, "마이크로RNA" 또는 "miRNA" 또는 "miR"은 본 개시내용을 고려하여 당업자가 이해하는 바와 같이 관례적이고 통상적인 의미를 갖는다. 마이크로RNA는 식물, 동물 및 일부 바이러스에서 발견되는 작은 비암호화 RNA 분자로, RNA 침묵 및 유전자 발현의 전사 후 조절 기능을 할 수 있다. 마이크로RNA의 표적 서열은 "miRT"로 표시될 수 있다. 예를 들어, 마이크로RNA-1 또는 miRNA-1 또는 miR-1의 표적 서열은 miRT-1로 표시될 수 있다.

단백질과 아미노산

용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드" 또는 "아미노산 서열"은 상호 교환적으로 사용되며 특정 작용 방식, 크기, 3차원 구조 또는 기원에 대한 언급 없이 아미노산 사슬로 구성된 분자를 의미한다. 본원에 기재된 아미노산 서열에서, 아미노산 또는 "잔기"는 3문자 기호로 표시된다. 이들 3문자 기호 및 대응하는 1문자 기호는 당업자에게 잘 알려져 있으며 다음과 같은 의미를 갖는다: A(Ala)는 알라닌, C(Cys)는 시스테인, D(Asp)는 아스파르트산, E(Glu)는 글루탐산, F(Phe)는 페닐알라닌, G(Gly)는 글리신, H(His)는 히스티딘, I(Ile)는 이소류신, K(Lys)는 라이신, L(Leu)는 류신, M(Met)은 메티오닌, N(Asn)은 아스파라긴, P(Pro)는 프롤린, Q(Gln)은 글루타민, R(Arg)은 아르기닌, S(Ser)는 세린, T(Thr)는 트레오닌, V(Val)은 발린, W(Trp)는 트립토판, Y(Tyr)는 티로신이다. 잔기는 임의의 단백질 생성 아미노산일 수 있지만, D-아미노산 및 번역후 변형에 의해 형성된 변형 아미노산과 같은 임의의 비-단백질 생성 아미노산 및 임의의 비천연 아미노산일 수 있다.

CNS와 뇌

본원에서 사용된 "중추 신경계" 또는 "CNS"는 감각 자극이 전달되고 운동 자극이 전달되는 뇌 및 척수를 포함하는 신경계의 일부를 의미하고, 전체 신경계의 활동을 협응력한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "뇌"는 신경계의 중추 기관을 말하며 대뇌, 뇌간 및 소뇌로 구성된다. 그것은 감각 기관으로부터 받은 정보를 처리, 통합 및 협응력하고 신체의 나머지 부분에 보내는 명령에 관한 결정을 내리는 신체 활동의 대부분을 제어한다.

특히, 본원에서 사용되는 '시상하부'는 체온 조절, 갈증, 배고픔 및 기타 항상성 시스템을 제어하는 자율신경계와 뇌하수체의 활동을 모두 협응력하는 시상 아래의 전뇌 영역을 의미하며, 수면과 감정 활동에 관여한다. 본원에서 사용되는 "해마"는 변연계에 속하며 단기 기억에서 장기 기억으로의 정보 통합, 및 탐색을 가능하게 하는 공간 기억에서 중요한 역할을 한다. 해마는 대뇌 피질(allocortical) 아래에 있으며 영장류의 내측 측두엽에 있다. 본원에서 사용되는 "피질" 또는 "대뇌 피질"은 인간 및 다른 포유동물에서 뇌 대뇌의 신경 조직의 외부층이다. 그것은 기억, 주의, 지각, 인식, 생각, 언어 및 의식에서 중요한 역할을 한다. 본원에서 사용된 "소뇌"는 모든 척추동물의 후뇌의 주요 특징을 의미한다. 인간의 경우 운동 제어에 중요한 역할을 한다. 또한 주의력 및 언어와 같은 일부 인지 기능과 공포 및 쾌락 반응 조절에도 관여할 수 있다. 본원에서 사용된 "후각 망울"은 후각 시스템(후각에 전념하는 시스템)의 필수 구조를 의미한다. 후각 망울은 감정, 기억 및 학습에서 역할을 하는 곳으로 후각망울은 편도체, 안와전두피질(OFC) 및 해마에서 추가로 처리할 정보를 보낸다.

유전자 구조체

본원에 기술된 바와 같은 유전자 구조체는 여기서 상기 FGF21을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 적합한 세포, 예를 들어, Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987) 및 in Sambrook and Russell (2001, supra)에 기재된 것과 같은 다세포 유기체의 배양 세포 또는 세포에서 발현되는 당업자에게 공지된 바와 같은 임의의 클로닝 및/또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있고; 둘 다 본 명세서에 그 전체가 참조로 포함된다. 또한 Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488 (부위 지정 돌연변이 유발을 설명함) and Roberts et al. (1987) Nature 328:731 734 or Wells, J.A., et al. (1985) Gene 34: 315 (카세트 돌연변이 유발을 설명함)을 참고할 수 있다.

발현 벡터

"발현 벡터" 또는 "벡터"라는 어구는 예를 들어, 그러한 서열과 호환가능한 숙주에서 유전자 또는 코딩 서열의 발현을 달성할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 도입함으로써 일반적으로 세포에서 유전자 발현을 얻기 위해 사용되는 분자 생물학의 도구를 의미한다. 발현 벡터는 세포에서 안정화되고 에피솜으로 남을 수 있는 게놈을 운반한다. 본 발명의 맥락에서, 세포는 구조체를 만드는 데 사용되는 세포 또는 구조체가 투여될 세포를 포함하는 것을 의미할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 예를 들어 동종 재조합 등을 통해 세포의 게놈으로 통합될 수 있다.

이들 발현 벡터는 전형적으로 적어도 적합한 프로모터 서열 및 선택적으로 전사 종결 신호를 포함한다. 표현에 영향을 미치는 데 필요하거나 도움이 되는 추가 요소도 여기에 설명된 대로 사용할 수 있다. FGF21을 암호화하는 핵산 또는 DNA 또는 뉴클레오타이드 서열은 시험관 내(in vitro) 세포 배양으로 도입 및 발현될 수 있는 DNA 구조체에 통합된다. 구체적으로, DNA 구조체는 박테리아, 예를 들어 대장균(E. coli)과 같은 원핵 숙주에서 복제에 적합하거나 배양된 포유동물, 식물, 곤충, (예를 들어 Sf9), 효모, 진균 또는 다른 진핵 세포 라인에 도입될 수 있다.

특정 숙주에 도입하기 위해 제조된 DNA 구조체는 숙주에 의해 인식되는 복제 시스템, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 의도된 DNA 세그먼트, 및 폴리펩티드-코딩 세그먼트에 작동가능하게 연결된 전사 및 번역 개시 및 종결 조절 서열을 포함할 수 있다. "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 본 명세서에서 이미 설명되었다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사를 자극한다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 신호 서열에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현된다면 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이며, 신호 서열의 경우에는 연속적이며 리딩 프레임 내에 있다. 그러나 인핸서는 전사를 제어하는 코딩 서열과 연속적일 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위 또는 그 대신에 삽입된 어댑터 또는 링커에서의 연결 또는 유전자 합성에 의해 달성된다.

적절한 프로모터 서열의 선택은 일반적으로 DNA 세그먼트의 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 따라 달라진다. 적합한 프로모터 서열의 예는 당업계에 잘 알려진 원핵 및 진핵 프로모터를 포함한다(예를 들어 Sambrook and Russell, 2001, supra 참조). 전사 조절 서열은 전형적으로 숙주에 의해 인식되는 이종 인핸서 또는 프로모터를 포함한다. 적절한 프로모터의 선택은 숙주에 따라 다르지만, trp, lac 및 파지 프로모터, tRNA 프로모터 및 당분해 효소 프로모터와 같은 프로모터가 알려져 있고 이용가능하다(예를 들어, Sambrook and Russell, 2001, supra 참조). 발현 벡터는 복제 시스템과 전사 및 번역 조절 서열을 폴리펩티드 인코딩 세그먼트의 삽입 부위와 함께 포함한다. 대부분의 경우 복제 시스템은 벡터를 만드는 데 사용되는 세포(E. Coli와 같은 박테리아 세포)에서만 기능한다. 대부분의 플라스미드와 벡터는 벡터에 감염된 세포에서 복제되지 않는다. 세포주와 발현 벡터의 실행 가능한 조합의 예는 Sambrook and Russell (2001, supra) and in Metzger et al. (1988) Nature 334: 31-36에 기재되어 있다. 예를 들어, 적합한 발현 벡터는 효모, 예를 들어 S.cerevisiae, 예를 들어, 곤충 세포, 예를 들어, Sf9 세포, 포유류 세포, 예를 들어, CHO 세포 및 박테리아 세포, 예를 들어 대장균(E. coli)에서 발현될 수 있다. 따라서 세포는 원핵 또는 진핵 숙주 세포일 수 있다. 세포는 액체 또는 고체 배지에서 배양하기에 적합한 세포일 수 있다.

선택적으로, 숙주 세포는 트랜스제닉 식물 또는 동물과 같은 다세포 유기체의 일부인 세포이다.

적절한 프로모터 서열의 선택은 일반적으로 DNA 세그먼트의 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 따라 달라진다. 적합한 프로모터 서열의 예는 당업계에 잘 알려진 원핵 및 진핵 프로모터를 포함한다(예를 들어 Sambrook and Russell, 2001, supra 참조). 전사 조절 서열은 전형적으로 숙주에 의해 인식되는 이종 인핸서 또는 프로모터를 포함한다. 적절한 프로모터의 선택은 숙주에 따라 다르지만, trp, lac 및 파지 프로모터, tRNA 프로모터 및 당분해 효소 프로모터와 같은 프로모터가 알려져 있고 이용가능하다(예를 들어, Sambrook and Russell, 2001, supra 참조). 발현 벡터는 복제 시스템과 전사 및 번역 조절 서열을 폴리펩티드 인코딩 세그먼트의 삽입 부위와 함께 포함한다. 대부분의 경우 복제 시스템은 벡터를 만드는 데 사용되는 세포(E. Coli와 같은 박테리아 세포)에서만 기능한다. 대부분의 플라스미드와 벡터는 벡터에 감염된 세포에서 복제되지 않는다. 세포주와 발현 벡터의 실행 가능한 조합의 예는 Sambrook and Russell (2001, supra) and in Metzger et al. (1988) Nature 334: 31-36에 기재되어 있다. 예를 들어, 적합한 발현 벡터는 효모, 예를 들어 S.cerevisiae, 예를 들어, 곤충 세포, 예를 들어, Sf9 세포, 포유류 세포, 예를 들어, CHO 세포 및 박테리아 세포, 예를 들어 대장균(E. coli)에서 발현될 수 있다. 따라서 세포는 원핵 또는 진핵 숙주 세포일 수 있다. 세포는 액체 또는 고체 배지에서 배양하기에 적합한 세포일 수 있다.

선택적으로, 숙주 세포는 트랜스제닉 식물 또는 동물과 같은 다세포 유기체의 일부인 세포이다.

바이러스 벡터

바이러스 벡터 또는 바이러스 발현 벡터 바이러스 유전자 요법 벡터는 본원에 기술된 바와 같은 유전자 구조체를 포함하는 벡터이다.

바이러스 벡터 또는 바이러스 유전자 치료 벡터는 유전자 치료에 적합한 벡터이다. 유전자 요법에 적합한 벡터는 Anderson 1998, Nature 392: 25-30; Walther and Stein, 2000, Drugs 60: 249-71; Kay et al., 2001, Nat. Med. 7: 33-40; Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-604; Amado and Chen, 1999, Science 285: 674-6; Federico, 1999, Curr. Opin. Biotechnol.10: 448-53; Vigna and Naldini, 2000, J. Gene Med. 2: 308-16; Marin et al., 1997, Mol. Med. Today 3: 396-403; Peng and Russell, 1999, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 454-7; Sommerfelt, 1999, J. Gen. Virol. 80: 3049-64; Reiser, 2000, Gene Ther. 7: 910-3; 및 거기에 인용된 참고문헌에 기술되어 있다.

특히 적합한 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다. 이들 벡터는 활액 세포 및 간 세포를 포함하는 다양한 분열 및 비분할 세포 유형을 감염시킨다. 상기에 나타낸 것처럼 세포 진입 후 아데노바이러스 및 AAV 벡터의 에피솜 성질은 이들 벡터를 치료적 적용에 적합하게 만든다(Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-2604; Goncalves, 2005, Virol J. 2(1):43). AV 벡터는 이식유전자 발현의 매우 안정적인 장기 발현(개에서 최대 9년(Niemeyer et al, Blood. 2009 Jan 22;113(4):797-806) 및 인간에서 ~10년(Buchlis, G. et al., Blood. 2012 Mar 29;119(13):3038-41))을 초래하는 것으로 알려져 있기 때문에 훨씬 더 바람직하다. 바람직한 아데노바이러스 벡터는 Russell(2000, supra)이 검토한 바와 같이 숙주 반응을 감소시키도록 변형된다. AAV 벡터를 사용한 유전자 치료 방법은 Wang et al., 2005, J Gene Med. March 9 (Epub ahead of print), Mandel et al., 2004, Curr Opin Mol Ther. 6(5):482-90, and Martin et al., 2004, Eye 18(11):1049-55, Nathwani et al, N Engl J Med. 2011 Dec 22;365(25):2357-65, Apparailly et al, Hum Gene Ther. 2005 Apr;16(4):426-34에 설명되어 있다.

다른 적합한 유전자 요법 벡터는 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 본 발명에 적용하기 위한 바람직한 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 기반 발현 구조체다. 렌티바이러스 벡터는 분열 및 비분할 세포의 게놈을 감염시키고 안정적으로 통합하는 능력을 갖는다(Amado and Chen, 1999 Science 285: 674-6). 렌티바이러스 기반 발현 구조체의 구성 및 사용 방법은 미국 특허 번호 6,165,782, 6,207,455, 6,218,181, 6,277,633 및 6,323,031, Federico(1999, Curr Opin Biotechnol 10: 448-53) 및 Vigna et al. (2000, J Gene Med 2000; 2: 308-16에 설명되어 있다.

다른 적합한 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 폴리오마 바이러스 벡터 또는 백시니아 바이러스 벡터를 포함한다.

아데노 관련 바이러스 벡터(AAV vector)

본 명세서에서 동의어로 사용되는 용어 "아데노 관련 바이러스", "AAV 바이러스", "AAV 비리온", "AAV 바이러스 입자" 및 "AAV 입자"는 AAV의 적어도 하나의 캡시드 단백질 (바람직하게는 특정 AAV 혈청형의 모든 캡시드 단백질로 구성됨) 및 AAV 게놈의 캡슐화된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 입자가 AAV 역위 말단 반복에 의해 측면에 있는 이종 폴리뉴클레오티드(즉, 포유동물 세포로 전달될 도입유전자와 같은 야생형 AAV 게놈과 상이한 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 경우, 이들은 전형적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 "AAV 바이러스 벡터" 또는 "AAV 벡터"로 알려져 있다. AAV는 의존 바이러스 계열 파르보바이러스과에 속하는 바이러스를 말한다. AAV 게놈은 길이가 약 4.7Kb이고 양성 또는 음성으로 검출될 수 있는 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA)으로 구성된다. 본 발명은 또한 dsAAV 또는 scAAV로도 불리는 이중 가닥 AAV의 사용을 포함한다. 게놈은 DNA 가닥의 양쪽 끝에 역전된 말단 반복(ITR)과 두 개의 개방 판독 프레임(ORF)인 rep 및 cap을 포함한다. 프레임 담당자는 AAV 라이프사이클에 필요한 단백질 Rep를 암호화하는 4개의 중첩 유전자로 구성된다. 프레임 캡은 20면체 대칭의 캡시드를 형성하기 위해 상호작용하는 VP1, VP2 및 VP3와 같은 캡시드 단백질과 중복되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다(Carter와 Samulski ., 2000 및 Gao et al, 2004 참조).

바람직한 바이러스 벡터 또는 바람직한 유전자 요법 벡터는 AAV 벡터이다. 본원에서 사용되는 AAV 벡터는 바람직하게는 재조합 AAV 벡터(rAAV 벡터)를 포함한다. 본원에 사용된 "rAAV 벡터"는 본원에 설명된 바와 같은 AAV 혈청형으로부터 유래된 캡시드 단백질의 단백질 쉘에 캡슐화된 AAV 게놈의 일부를 포함하는 재조합 벡터를 지칭한다. AAV 게놈의 일부는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 등과 같은 아데노 관련 바이러스 혈청형에서 파생된 역 말단 반복(ITR)을 포함할 수 있다. 바람직한 ITR은 서열번호 30(5' ITR) 및 서열번호 31(3' ITR)을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 구성되는 서열로 표시되는 AAV2의 ITR이다. 본 발명은 또한 바람직하게는 3' ITR로서 서열번호 31과 적어도 80%(또는 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%)의 동일성을 갖는 서열의 사용을 포함한다.

캡시드 단백질로 구성된 단백질 껍질은 모든 AAV 혈청형에서 파생될 수 있다. 단백질 껍질은 또한 캡시드 단백질 껍질로 명명될 수 있다. rAAV 벡터는 하나 또는 바람직하게는 모든 야생형 AAV 유전자가 결실될 수 있지만, 여전히 기능성 ITR 핵산 서열을 포함할 수 있다. 기능적 ITR 서열은 AAV 비리온의 복제, 구조 및 패키징에 필요한다. ITR 서열은 야생형 서열일 수 있거나 야생형 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있거나 예를 들어 뉴클레오타이드의 삽입, 돌연변이, 결실 또는 치환에 의해 그들이 기능을 유지하는 한 변경될 수 있다. 이와 관련하여 기능성은 게놈을 캡시드 껍질로 직접 패키징한 다음 감염될 숙주 세포 또는 표적 세포에서 발현을 허용하는 능력을 의미한다. 본 발명의 맥락에서 캡시드 단백질 쉘은 rAAV 벡터 게놈 ITR과 상이한 혈청형일 수 있다.

선택한 핵산 서열로 표시되는 핵산 분자는 바람직하게는 위에서 확인된 바와 같이 rAAV 게놈 또는 ITR 서열 사이에 삽입되며, 예를 들어 코딩 서열 및 3' 종결 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 요소를 포함하는 발현 구조가 있다. 상기 핵산 분자는 트랜스진(transgene)으로도 불릴 수 있다.

"AAV 헬퍼 기능"은 일반적으로 rAAV 복제에 필요한 해당 AAV 기능과 트랜스(in trans)에서 rAAV 벡터에 제공되는 패키징을 의미한다. AAV 도우미 기능은 rAAV 벡터에 없는 AAV 기능을 보완하지만 AAV ITR(rAAV 벡터 게놈에서 제공)이 부족한다. AAV 헬퍼 기능은 AAV의 2개의 주요 ORF, 즉 rep 코딩 영역 및 cap 코딩 영역 또는 이들의 기능적 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. Rep 및 Cap 영역은 본원에 참조로 포함된 예를 들어, Chioriniet al. (1999, J. of Virology, Vol 73(2): 1309-1319) 또는 US 5,139,941(됨)처럼 당업계에 잘 알려져 있다. AAV 헬퍼 함수는 AAV 헬퍼 구성에서 제공될 수 있다. 숙주 세포로 헬퍼 구조의 도입이 예를 들어 본원에서 확인된 rAAV 벡터에 존재하는 rAAV 게놈의 도입 전 또는 도입과 동시에 형질전환, 형질감염 또는 형질도입에 의해 발생할 수 있다. 따라서 본 발명의 AAV 헬퍼 구조체는 한편으로는 rAAV 벡터의 캡시드 단백질 껍질에 대한 혈청형의 원하는 조합을 생성하고 다른 한편으로는 상기 rAAV 벡터 복제 및 패키징에 존재하는 rAAV 게놈에 대한 혈청형의 원하는 조합을 생성하도록 선택될 수 있다.

"AAV 헬퍼 바이러스"는 AAV 복제 및 패키징에 필요한 추가 기능을 제공한다. 적합한 AAV 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스(예: HSV 유형 1 및 2) 및 백시니아 바이러스를 포함한다. 헬퍼 바이러스에 의해 제공되는 추가 기능은 본원에 참조로 포함된 US 6,531,456에 기술된 바와 같이 플라스미드를 통해 숙주 세포에 도입될 수도 있다.

"형질도입"은 FGF21을 바이러스 벡터에 의해 수용 숙주 세포로 전달하는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 rAAV 벡터에 의한 표적 세포의 형질도입은 그 벡터에 포함된 rAAV 게놈을 형질도입된 세포로 전달하게 한다. "숙주 세포" 또는 "표적 세포"는 대상의 근육 세포와 같이 DNA 전달이 일어나는 세포를 의미한다. AAV 벡터는 분열 및 비분열 세포 모두를 형질도입할 수 있다.

AAV 벡터의 제조

전이유전자를 벡터화하기 위한 재조합 AAV(rAAV)의 생산은 이전에 기술된 바 있다. Ayuso E, et al., Curr. Gene Ther. 2010; 10:423-436, Okada T, et al., Hum. Gene Ther. 2009; 20:1013-1021, Zhang H, et al., Hum. Gene Ther. 2009; 20:922-929, and Virag T, et al., Hum. Gene Ther. 2009; 20:807-817를 참조한다. 이들 프로토콜은 본 발명의 AAV를 생성하기 위해 사용되거나 적응될 수 있다. 한 실시양태에서, 생산자 세포주는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(ITR 옆에 있는 발현 카세트 포함) 및 rep 및 cap 단백질을 코딩하고 헬퍼 기능을 제공하는 구조체(들)로 일시적으로 형질감염된다. 또 다른 실시양태에서, 세포주는 헬퍼 기능을 안정적으로 공급하고 본 발명의 폴리뉴클레오티드(ITR 옆에 있는 발현 카세트 포함) 및 rep 및 cap 단백질을 암호화하는 구조체(들)로 일시적으로 형질감염된다. 또 다른 실시양태에서, 세포주는 rep 및 cap 단백질 및 헬퍼 기능을 안정적으로 공급하고 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 일시적으로 형질감염된다. 또 다른 실시양태에서, 세포주는 rep 및 cap 단백질을 안정적으로 공급하고 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 헬퍼 기능을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 일시적으로 형질감염된다. 또 다른 실시양태에서, 세포주는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, rep 및 cap 단백질 및 헬퍼 기능을 안정적으로 공급한다. 이들 및 다른 AAV 생산 시스템을 만들고 사용하는 방법은 당업계에 기술되어 있다. Muzyczka N, et al., US 5,139,941, Zhou X, et al., US 5,741,683, Samulski R, et al., US 6,057,152, Samulski R, et al., US 6,204,059, Samulski R, et al., US 6,268,213, Rabinowitz J, et al., US 6,491,907, Zolotukhin S, et al., US 6,660,514, Shenk T, et al., US 6,951,753, Snyder R, et al., US 7,094,604, Rabinowitz J, et al., US 7,172,893, Monahan P, et al., US 7,201,898, Samulski R, et al., US 7,229,823, and Ferrari F, et al., US 7,439,065를 참조한다.

rAAV 벡터에 존재하는 rAAV 게놈은 AAV 혈청형 (바람직하게는 본원에서 앞서 개시된 바와 같은 혈청형 AAV2의 것) 중 하나의 역위 말단 반복 영역(ITR)의 적어도 뉴클레오티드 서열, 또는 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 60% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 및 2개의 ITR 사이에 삽입된 FGF21을 코딩하는 (적절한 규제 요소의 통제하에) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 벡터 게놈은 벡터 게놈을 rAAV 캡시드로 효율적으로 패키징할 수 있도록 플랭킹 5' 및 3' ITR 서열을 사용해야 한다.

여러 AAV 혈청형 및 해당 ITR의 완전한 게놈이 시퀀싱되었다(Chiorini et al. 1999, J. of Virology Vol. 73, No.2, p1309-1319). 이들은 예를 들어 Applied Biosystems Inc.(Fosters, CA, USA) 또는 표준 분자 생물학 기술에 의해 공급되는 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 당업계에 공지된 바와 같이 화학적 합성에 의해 클로닝되거나 제조될 수 있다. ITR은 AAV 바이러스 게놈으로부터 클로닝되거나 AAV ITR을 포함하는 벡터로부터 절단될 수 있다. ITR 뉴클레오티드 서열은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 하나 이상의 치료 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 한쪽 끝에서 결찰될 수 있거나, ITR 사이의 AAV 서열은 원하는 뉴클레오티드 서열로 교체될 수 있다.

바람직하게는, rAAV 벡터에 존재하는 rAAV 게놈은 AAV의 rep(복제) 또는 cap(캡시드) 유전자와 같은 바이러스 단백질을 암호화하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다. 이 rAAV 게놈은 예를 들어 항생제 내성 유전자, 형광 단백질(예: gfp)을 암호화하거나 당업계에 알려진 화학적, 효소적 또는 달리 검출 가능하고/하거나 선택 가능한 생성물 (예: lacZ, aph 등) 을 암호화하는 유전자와 같은 마커 또는 리포터 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

상기 rAAV 벡터에 존재하는 rAAV 게놈은 FGF21을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 추가로 포함한다.

적합한 3' 비번역 서열은 또한 FGF21을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 3' 비번역 영역은 뉴클레오티드 서열과 자연적으로 결합된 것일 수 있거나 예를 들어 SV40 폴리아데닐화 신호(서열번호 32) 및 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호(서열번호 33)와 같은 다른 유전자들로부터 유래된 것일 수 있다.

발현

발현은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 발현은 qPCR, RNA 시퀀싱, 노던 블롯 분석, 웨스턴 블롯 분석, 단백질 유래 펩타이드의 질량 분석 또는 ELISA와 같은 당업자에게 공지된 표준 분석법에 의해 mRNA 또는 단백질 수준에서 형질도입된 조직에서의 트랜스진 발현 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다.

발현은 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자 구조체, 발현 벡터 또는 조성물의 투여 후 언제든지 평가될 수 있다. 본원의 일부 실시양태에서, 발현은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 14주, 16주, 18주, 20주, 22주, 24주, 28주, 32주, 36주, 40주 이상 후에 평가될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, CNS 및/또는 뇌 및/또는 시상하부 및/또는 피질 및/또는 해마 및/또는 소뇌 및/또는 후각망울 특이적 발현은 다른 기관 또는 조직과 비교하여 CNS 및/또는 뇌 및/또는 시상하부 및/또는 피질 및/또는 해마 및/또는 소뇌 및/또는 후각망울에서 FGF21의 우선적이거나 우세한 (10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상 이상) 발현을 의미한다. 다른 장기 또는 조직은 간, 췌장, 지방 조직, 골격근, 심장, 신장, 결장, 조혈 조직, 폐, 난소, 비장, 위, 고환 등일 수 있다. 바람직하게는 다른 기관은 간 및/또는 심장이다. 실시양태에서, 발현은 간, 췌장, 지방 조직, 골격근 및/또는 심장에서 검출가능하지 않다. 일부 실시양태에서, 발현은 간, 췌장, 지방 조직, 골격근, 심장, 신장, 결장, 조혈 조직, 폐, 난소, 비장, 위 및 고환. 발현은 상기 기재된 바와 같이 평가될 수 있다.

명세서 전반에 걸쳐, CNS- 및/또는 뇌- 및/또는 시상하부 및/또는 피질- 및/또는 해마- 및/또는 소뇌- 및/또는 후각망울-특이적이 표현의 맥락에서 언급되는 경우, 세포-유형 특이적 CNS 및/또는 뇌 및/또는 시상하부 및/또는 피질 및/또는 해마 및/또는 소뇌 및/또는 후각 망울을 구성하는 세포 유형(들)의 발현이 또한 각각 예상된다.

본 발명의 맥락에서, 간 특이적 발현은 다른 기관 또는 조직과 비교하여 간에서 FGF21의 우선적이거나 우세한 (10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상 이상) 발현을 의미한다. 다른 장기 또는 조직은 CNS, 뇌, 췌장, 지방 조직, 골격근, 심장, 신장, 결장, 조혈 조직, 폐, 난소, 비장, 위, 고환 등일 수 있다. 바람직하게는 다른 기관은 간 및/또는 심장이다. 실시양태에서, 발현은 CNS, 뇌, 췌장, 지방 조직, 골격근 및/또는 심장에서 검출가능하지 않다. 일부 실시양태에서, 발현은 CNS, 뇌, 췌장, 지방 조직, 골격근, 심장, 신장, 결장, 조혈 조직, 폐, 난소, 비장, 위 및 고환으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 모든 기관에서 검출가능하지 않다.

명세서 전반에 걸쳐, CNS- 및/또는 뇌- 및/또는 시상하부 및/또는 피질- 및/또는 해마- 및/또는 소뇌- 및/또는 후각망울-특이적이 표현의 맥락에서 언급되는 경우, 세포-유형 특이적 CNS 및/또는 뇌 및/또는 시상하부 및/또는 피질 및/또는 해마 및/또는 소뇌 및/또는 후각 망울을 구성하는 세포 유형(들)의 발현이 또한 각각 예상된다. 바람직하게는 다른 기관은 심장이다. 실시양태에서, 발현은 CNS, 뇌, 췌장, 지방 조직, 골격근 및/또는 심장에서 검출가능하지 않다. 일부 실시양태에서, 발현은 CNS, 뇌, 췌장, 지방 조직, 골격근, 심장, 신장, 결장, 조혈 조직, 폐, 난소, 비장, 위 및 고환으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 모든 기관에서 검출가능하지 않다.

명세서 전반에 걸쳐, 발현의 맥락에서 간-특이적이 언급되는 경우, 간을 구성하는 세포 유형(들)의 세포-유형 특이적 발현이 또한 각각 구상된다.

본 발명의 맥락에서, 근육 특이적 발현은 다른 기관 또는 조직과 비교하여 근육에서 FGF21의 우선적이거나 우세한 (10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상 이상) 발현을 의미한다. 다른 장기 또는 조직은 중추신경계, 뇌, 간, 췌장, 지방조직, 심장, 신장, 결장, 조혈조직, 폐, 난소, 비장, 위, 고환 등 일 수 있다. 바람직하게는 다른 기관은 간 및/또는 심장이다. 실시양태에서, 발현은 CNS, 뇌, 간, 췌장, 지방 조직 및/또는 심장에서 검출가능하지 않다. 일부 실시양태에서, 발현은 CNS, 뇌, 간, 췌장, 지방 조직, 심장, 신장, 결장, 조혈 조직, 폐, 난소, 비장, 위 및 고환으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 모든 기관에서 검출가능하지 않다.

명세서 전반에 걸쳐, 발현의 맥락에서 근육-특이적이 언급되는 경우, 근육을 구성하는 세포 유형(들)의 세포-유형 특이적 발현이 또한 각각 구상된다.

본 발명의 맥락에서, 지방 조직 특이적 발현은 다른 기관 또는 조직과 비교하여 지방 조직에서 FGF21의 우선적이거나 우세한 (10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상 이상) 발현을 의미한다. 다른 장기 또는 조직은 중추신경계, 뇌, 간, 췌장, 골격근, 심장, 신장, 결장, 조혈조직, 폐, 난소, 비장, 위, 고환 등 일 수 있다. 바람직하게는 다른 기관은 간 및/또는 심장이다. 실시양태에서, 발현은 CNS, 뇌, 간, 췌장, 골격근 및/또는 심장에서 검출가능하지 않다. 일부 실시양태에서, 발현은 CNS, 뇌, 간, 췌장, 골격근, 심장, 신장, 결장, 조혈 조직, 폐, 난소, 비장, 위 및 고환으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 모든 기관에서 검출가능하지 않다.

명세서 전반에 걸쳐, 발현의 맥락에서 지방 조직-특이적이 언급되는 경우, 지방 조직을 구성하는 세포 유형(들)의 세포-유형 특이적 발현이 또한 각각 구상된다.

투여

본원에서 사용된 바와 같이, "CSF내 투여"는 뇌를 둘러싼 수막의 지주막층과 연질막층 사이의 지주막하 공간에 위치한 CSF로의 직접적인 투여를 의미한다. CSF내 투여는 시스터나 마그나(cisterna magna)내, 심실내 또는 경막내 투여를 통해 수행될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "대조내 투여"는 소뇌와 숨뇌(medulla oblongata)의 배면 사이에 위치한 지주막하공간 (subarachnoid space)의 개구인 대조로의 투여를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "뇌실내 투여"는 뇌의 양측 뇌실 중 어느 하나로의 투여를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "경막내 투여"는 척추의 척추강내 공간 내의 CSF로의 직접적인 투여를 포함한다. 본원에서 사용되는 "실질내 투여"는 뇌 실질의 임의의 영역으로의 직접 국소 투여를 의미한다. 본원에서 사용되는 "비강내 투여"는 비강 구조를 통한 투여를 의미한다.

근육내 투여는 근육, 바람직하게는 골격근에 직접 투여하는 것을 의미한다. 지방내 투여는 지방조직에 직접 투여하는 것을 의미한다.

코돈 최적화

본원에 사용된 "코돈 최적화"는 예를 들어 발현 숙주 세포 또는 유기체에서 코딩으로부터 전사된 전사체 RNA 분자의 번역을 개선하기 위해 기존 코딩 서열을 변형시키거나 코딩 서열을 설계하기 위해 사용되는 프로세스를 지칭한다. 서열, 또는 코딩 서열의 전사를 향상시키기 위해. 코돈 최적화는 발현 숙주 유기체의 코돈 선호도에 적합하도록 코딩 서열에 대한 코돈을 선택하는 것을 포함하는 과정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 포유류의 코돈 선호도에 맞추기 위해 바람직하게는 뮤린, 개 또는 인간 발현 숙주이다. 코돈 최적화는 또한 잠재적으로 RNA 안정성 및/또는 번역에 부정적인 영향을 미치는 요소(예: 종결 서열, TATA 상자, 스플라이스 부위, 리보솜 진입 부위, 반복 및/또는 GC 풍부 서열 및 RNA 2차 구조 또는 불안정 모티프)를 제거한다. 일부 실시양태에서, 코돈 최적화된 서열은 코돈 최적화되지 않은 원래의 서열과 비교하여 유전자 발현, 전사, RNA 안정성 및/또는 번역에서 적어도 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상 증가를 나타낸다.

기억력

기억은 일반적으로 데이터나 정보를 인코딩, 저장 및 필요할 때 검색하는 뇌의 기능으로 이해된다. 다른 유형 또는 메모리가 설명되었다. 한 가지 가능한 구분은 감각 기억, 단기 기억 및 장기 기억을 포함한다. 감각 기억은 항목을 인지한 후 1초 이내에 감각 정보를 보유한다. 단기(작업 기억이라고도 함) 기억은 일반적으로 리허설 없이 몇 초에서 1분 동안 회상할 수 있다. 반대로 장기 기억은 훨씬 더 많은 양의 정보를 잠재적으로 무제한(최대 수명까지) 동안 저장할 수 있다.

또 다른 차이점은 절차적 기억(또는 암시적 기억)과 명시적 기억(또는 선언적 기억)을 포함한다. 암시적 기억은 정보의 의식적 회상에 기반하지 않고 암시적 학습, 즉 무언가를 수행하는 방법을 기억하는 것이다. 명시적(또는 선언적) 기억은 사실 정보, 이전 경험 및 개념에 대한 의식적이고 의도적인 회상이다.

회상 기억과 인식 기억(recognition memory)도 구분할 수 있다. 인식이란 회상이 기억으로부터 관련 세부 사항의 검색을 지정하는 동안 사건 또는 친숙한 정보 조각을 "인식"하는 우리의 능력을 의미한다.

공간 기억은 자신의 환경과 공간 방향에 대한 정보 기록을 담당하는 기억의 한 형태이다.

본 문헌 및 그 청구범위에서, "포함하다"라는 동사 및 그 활용형은 비제한적 의미로 단어 뒤에 오는 항목이 포함되지만 구체적으로 언급되지 않은 항목은 제외되지 않는다는 의미로 사용된다. 또한, "구성되다"라는 동사는 "본질적으로 구성되다"로 대체될 수 있으며 이는 본 명세서에 기술된 조성물은 구체적으로 식별된 것 이외의 추가 구성요소(들)를 포함할 수 있으며, 상기 추가 구성요소(들)는 본 발명의 고유한 특성을 변경하지 않는다. 또한, "이루다"라는 동사는 본 명세서에 기술된 구체적으로 식별된 것보다 추가적인 단계(들)을 포함할 수 있는 방법을 의미하는 "본질적으로 이루어지다"로 대체될 수 있고, 상기 추가 단계(들)은 본 발명의 독특한 특성을 변경하지 않는다.

부정관사 "하나(a)" 또는 "하나(an)"에 의한 요소에 대한 언급은 문맥상 요소 중 하나만 존재하도록 명확하게 요구하지 않는 한 요소 중 하나 이상이 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서 부정관사 "하나(a)" 또는 "하나(an)"은 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.

본원에서 사용되는 "적어도" 특정 값은 특정 값 이상을 의미한다. 예를 들어, "적어도 2"는 "2 이상", 즉 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ..., 등과 같이 이해되어야 한다.

또한, 상세한 설명 및 특허청구범위에서 제1, 제2, 제3 등의 용어는 유사한 요소를 구별하기 위해 사용된 것이며 반드시 순차적 또는 연대기적 순서를 설명하기 위해 사용된 것은 아니다. 이렇게 사용된 용어는 적절한 상황에서 상호 교환 가능하며 여기에 설명된 본 발명의 실시예는 여기에 설명되거나 예시된 것과 다른 순서로 작동할 수 있음을 이해해야 한다.

수치(예를 들어, 약 10)와 관련하여 사용될 때 단어 "약" 또는 "대략"은 바람직하게는 그 값이 주어진 값(10의)보다 많거나 적은 값의 0.1%일 수 있음을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "및/또는"이라는 용어는 언급된 경우 중 하나 이상이 단독으로 또는 언급된 경우 중 적어도 하나와 조합하여 최대 모든 언급된 경우까지 발생할 수 있음을 나타낸다.

다양한 실시예가 여기에서 설명된다. 본 명세서에서 식별된 각각의 실시예는 달리 나타내지 않는 한 함께 결합될 수 있다.

본 명세서에 인용된 모든 특허 출원, 특허 및 인쇄된 간행물은 전체적으로 참고로 본 명세서에 포함되고, 모든 정의, 주제 면책 조항 또는 부인을 제외하며, 포함된 자료가 여기에 명시된 공개 내용과 일치하지 않는 경우를 제외하고, 이 경우 본 공개의 언어가 우선한다.

당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 등가인 많은 방법 및 재료를 인식할 것이다. 실제로, 본 발명은 설명된 방법 및 물질에 결코 제한되지 않는다.

본 발명은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 하기 실시예에 의해 추가로 기술된다.

도 1. 늙은 마우스에서 AAV1-CMV-moFGF21 벡터의 근육 투여 후 증가된 FGF21 순환 수준.
(A) FGF21의 발현 수준. 뮤린 코돈-최적화 FGF21 코딩 서열(moFGF21)의 발현 수준을 경골근, 비복근 및 대퇴사두근 및 간에서 희생시 RTqPCR로 측정하고 Rplp0 값으로 정규화하였다. (B) AAV 투여 6개월 후 FGF21의 순환 수준. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 5마리 동물/그룹. ND, 감지되지 않음. AU, 임의 단위. *** p<0.001 vs 대조군(21개월) AAV1-null 처리된 마우스.
도 2. 늙은 마우스에서 AAV1-CMV-moFGF21 벡터의 근육 투여 후 개선된 신경근 성능. (A) 로타로드 테스트. 히스토그램은 마우스가 가속 로타로드에 머물렀던 시간을 나타낸다. AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 처리된 늙은 쥐는 협응력과 균형이 개선된 것으로 나타났다. (B) 행 와이어 테스트. AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 처리된 늙은 쥐는 협응력력과 근육 기능이 개선된 것으로 나타났다. (C) 오픈 필드 테스트에서 최대 속도를 측정하였다. (D) 그립 강도. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 12-15마리의 동물/그룹. N, 뉴턴. g, 체중 그램. * p<0.05 및 *** p<0.001 vs 대조군(3-5개월) 미처리 마우스; ## p<0.01 및 ### p<0.001 vs 대조군(8-10개월령) 미처리 마우스; $ p<0.05 및 $$$ p<0.001 vs 대조군(22-24개월) AAV1-null 처리된 마우스.
도 3. AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 늙은 마우스에서 개선된 인지 기능. 새로운 객체 인식 (Novel Object Recognition) 테스트는 메모리를 평가하기 위해 수행되었다. 히스토그램은 차별 지수를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 11-13마리의 동물/그룹. * p<0.05 vs 대조군(2개월령) 미처리 마우스; $p<0.05 vs 대조군(27개월령) AAV1-null 처리된 마우스.
도 4. FGF21을 암호화하는 AAV 벡터로 처리한 후 비만의 장기 복귀. (A-B) AAV8-CAG-moFGF21-dmiRT 벡터(A)로 eWAT 내 처리된 동물 또는 AAV1-CMV-moFGF21 벡터(B)로 im 처리된 동물의 체중 진화. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 6-10마리 동물/그룹. HFD, 고지방식이.
도 5. FGF21을 코딩하는 AAV 벡터로 처리한 후 증가된 FGF21 순환 수준. (A-B) AAV8-CAG-moFGF21-dmiRT 벡터(A)로 eWAT 내 처리된 동물 또는 AAV1-CMV-moFGF21 벡터(B)로 im 처리된 동물에서 AAV 투여 6개월 후 FGF21의 순환 수준. (C-D) (A-B)와 동일한 집단에서 지방 조직, 골격근 및 간에서 FGF21의 발현 수준. 뮤린 코돈-최적화 FGF21 코딩 서열(moFGF21)의 발현 수준을 RTqPCR에 의해 희생시 측정하고 Rplp0 값으로 정규화하였다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 6-10마리 동물/그룹. ND, 감지되지 않음. HFD, 고지방식이. AU, 임의 단위. eWAT, 부고환 백색 지방 조직(epididymal white adipose tissue). iWAT, 사타구니 백색 지방 조직(inguinal white adipose tissue). iBAT 견갑간 갈색 지방 조직(interscapular brown adipose tissue). ** p<0.01 및 *** p<0.001 vs 대조군 식이 제공 마우스; # p<0.05, ## p<0.01 및 ### p<0.001 vs 대조군 HFD-공급 마우스; $$ p<0.01 및 $$$ p<0.001 vs 5x10¹⁰ vg의 AAV8-CAG-moFGF21-dmiRT 또는 7x10¹⁰ vg의 AAV1-CMV-moFGF21로 eWAT 내 처리된 HFD-공급 마우스; &&& p<0.001 vs 1x10¹¹ vg의 AAV1-CMV-moFGF21로 im 처리된 HFD-공급 마우스.
도 6. AAV8-CAG-moFGF21-dmiRT 벡터로 eWAT 내 처리된 HFD 공급 수컷 마우스에서 증가된 운동 활성. 이동 활동은 오픈 필드 테스트를 통해 평가되었다. (A) 이동 거리. (B) 최대 속도. (C) 이동 시간. (D) 휴식 시간. (E) 교차된 선. (F) 빠른 시간. (G) 느린 시간. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 5-15마리 동물/그룹. HFD, 고지방식이. ** p<0.01 및 *** p<0.001 vs 대조군(2개월령) 사료 공급 마우스; # p<0.05 vs 대조군(11개월령) 사료 공급 마우스; $ p<0.05, $$ p<0.01 및 $$$ p<0.001 vs 대조군(11개월령) HFD 공급 마우스.
도 7. AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 HFD 공급 수컷 마우스에서 증가된 운동 활성. 이동 활동은 오픈 필드 테스트를 통해 평가되었다. (A) 이동 거리. (B) 최대 속도. (C) 이동 시간. (D) 휴식 시간. (E) 교차된 선. (F) 빠른 시간. (G) 느린 시간. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 5-15마리 동물/그룹. HFD, 고지방식이. ** p<0.01 및 *** p<0.001 vs 대조군(2개월령) 사료 공급 마우스; # p<0.05 및 #### p<0.001 vs 대조군(11개월령) 사료 공급 마우스; $ p<0.05, $$ p<0.01 및 $$$ p<0.001 vs 대조군(11개월령) HFD 공급 마우스. & p<0.05 및 && p<0.01 vs AAV1-CMV-moFGF21의 7x10¹⁰ vg로 im 처리된 HFD 공급 마우스.
도 8. FGF21을 인코딩하는 AAV 벡터로 처리된 HFD 공급 수컷 마우스에서 감소된 불안. 불안은 오픈 필드 테스트를 통해 평가되었다. (A-B) 히스토그램은 동물이 AAV8-CAG-moFGF21-dmiRT 벡터(A)로 eWAT 내 처리하거나 AAV1-CMV-moFGF21 벡터(B)로 im 처리한 시간을 중앙에서 보낸 시간을 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 5-15마리 동물/그룹. HFD, 고지방식이. * p<0.05 vs 대조군(2개월령) 사료 공급 마우스.
도 9. HFD를 먹인 암컷 마우스에서 AAV1-CMV-moFGF21 벡터의 근육내 투여에 의한 비만의 장기적 복귀. (A) 체중 진화. (B) AAV 투여 3개월 후 FGF21의 순환 수준. (C) FGF21의 발현 수준. 뮤린 코돈-최적화 FGF21 코딩 서열(moFGF21)의 발현 수준을 RTqPCR에 의해 경골근 골격근 및 희생 시 간에서 측정하고 Rplp0 값으로 정규화하였다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 9-10마리 동물/그룹. ND, 감지되지 않음. HFD, 고지방식이. AU, 임의 단위. *** p<0.001 vs 대조군 식이 제공 마우스; ### p<0.001 vs 대조군 HFD 공급 마우스; $$$ p<0.001 vs AAV1-CMV-moFGF21의 1x10¹¹ vg로 im 처리된 HFD 공급 마우스.
도 10. AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 HFD 공급 암컷 마우스에서 증가된 운동 활성. 이동 활동은 오픈 필드 테스트를 통해 평가되었다. (A) 이동 거리. (B) 최대 속도. (C) 이동 시간. (D) 휴식 시간. (E) 교차된 선. (F) 빠른 시간. (G) 느린 시간. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 6-9마리 동물/그룹. HFD, 고지방식이. * p<0.05 및 ** p<0.01 vs 대조군 식이 제공 마우스.
도 11. AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 HFD 공급 암컷 마우스에서 감소된 불안. 불안은 오픈 필드 테스트를 통해 평가되었다. 히스토그램은 동물이 중앙에서 보낸 시간을 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 6-9마리 동물/그룹. HFD, 고지방식이.
도 12. AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 HFD 공급 암컷 마우스에서 개선된 신경근 성능. (A) 로타로드 테스트. 히스토그램은 마우스가 가속 로타로드에 머물렀던 시간을 나타낸다. AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 처리된 마우스는 향상된 협응력 및 균형을 나타냈다. (B) 그립 강도. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 6-9마리 동물/그룹. N, 뉴턴. g, 체중 그램. HFD, 고지방식이. ** p<0.01 및 *** p<0.001 vs 대조군 식이 제공 마우스; ## p<0.01 vs 대조군 HFD 공급 마우스; $ p<0.05 vs AAV1-CMV-moFGF21의 1x10¹¹ vg로 im 처리된 HFD 공급 마우스.
도 13. AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 HFD 공급 암컷 마우스에서 개선된 인지 기능. 기억력은 새로운 객체 인식 (Novel Object Recognition) 테스트(A)와 Y-미로 테스트(B)로 평가되었다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 6-9마리 동물/그룹. HFD, 고지방식이. ## p<0.01 vs 대조군 HFD 공급 마우스.
도 14. AAV1-CAG-moFGF21 CSF 내 투여 후 db/db 마우스에서 증가된 운동 활성. (A) 이동 거리, (B) 최대 속도 및 (C) 9주령의 비처리 db/+(린), 비처리 db/db 및 AAV1-CAG-moFGF21 처리 db/db 마우스에서 오픈 필드 테스트에서 빠른 시간을 측정하였다. 결과는 평균 ± SEM, n=6 동물/그룹으로 표현된다. *p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 vs db/+ 마우스 및 ## p<0.01 ### p<0.001 vs db/db 미처리 마우스.
도 15. AAV1-CAG-moFGF21로 CSF 내 처리된 db/db 마우스에서 불안 유사 행동의 개선. (A) 경계에서의 거리 및 (B) 중심에서의 거리는 9주령의 미처리 db/+(린), 미처리 db/db 및 AAV1-CAG-moFGF21-처리 db/db 마우스에서 오픈 필드 테스트에서 측정되었다. 결과는 평균 ± SEM, n=6 동물/그룹으로 표현된다. **p<0.01 및 *** p<0.001 vs db/+ 마우스.
도 16. AAV1-CAG-moFGF21 내-CSF-처리된 db/db 마우스의 탐색 능력 증가. (A) 항목 수 및 (B) 10주령의 비처리 db/+(린), 비처리 db/db 및 AAV1-CAG-moFGF21-처리 db/db 마우스에서 Y-미로 테스트에서의 최초 잠복기를 측정하였다. 결과는 평균 ± SEM, n=6 동물/그룹으로 표현된다. *p<0.05 vs db/+ 마우스.
도 17. AAV1-CAG-moFGF21 벡터를 사용한 CSF내 유전자 요법 후 db/db 마우스에서 단기 기억의 개선. 식별 지수는 11주령의 미처리 db/+(린), 미처리 db/db 및 AAV1-CAG-moFGF21-처리 db/db 마우스에서 새로운 물체 인식 테스트 동안 측정되었으며 예시의 일반 절차에서 설명된 대로 계산되었다. 결과는 평균 ± SEM, n=6 동물/그룹으로 표현된다. *p<0.05 vs db/+ 마우스.
도 18. AAV1-FGF21-처리된 db/db 마우스의 뇌에서 FGF21의 발현. 뮤린 코돈-최적화 FGF21(moFgf21) 코딩 서열의 발현 수준을 db/db 마우스의 시상하부, 피질, 해마, 소뇌 및 후각 구근에서 RTqPCR로 측정하고, Rplp0 값으로 정규화하였다. AAV1-CAG-moFGF21 벡터의 5x10¹⁰ vg/마우스의 CSF내 투여 16주 후 분석을 수행하였다. 결과는 평균 ± SEM, n=7 동물/그룹으로 표현된다. ND, 감지되지 않음.
도 19. AAV9-FGF21 벡터로 처리된 db/db 마우스에서 뇌 염증의 감소. 성상 세포 마커(Gfap 및 S100b), 소교 세포 마커(Aif1) 및 염증 분자(Nfkb, Il1b 및 Il6)의 발현 수준을 db/db 마우스의 시상하부에서 RTqPCR로 측정하고 Rplp0 값으로 정규화하였다. 분석은 AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT 벡터의 5x10¹⁰ vg/마우스의 CSF 내 투여 후 12주에 수행되었다. 결과는 평균 ± SEM, n=9 동물/그룹으로 표현된다. *p<0.05 vs 처리되지 않은 마우스. Gfap, 신경아교 섬유질 산성 단백질; S100b, 칼슘 결합 단백질 B; Aif1, 동종이식 염증 인자 1; Nfkb, 핵 인자 카파 B; Il1b, 인터루킨 1 베타; Il6, 인터루킨 6.
도 20. AAV9-FGF21로 처리된 SAMP8 마우스에서 뇌 염증의 감소. 성상 세포 마커(Gfap 및 S100b), 소교 세포 마커(Aif1) 및 염증 분자(Nfkb, Il1b 및 Il6)의 발현 수준을 SAMP8 마우스의 시상하부에서 RTqPCR로 측정하고 Rplp0 값으로 정규화하였다. 분석은 AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT 벡터의 5x10¹⁰ vg/마우스의 CSF 내 투여 후 14주에 수행되었다. 결과는 평균 ± SEM, n=9 동물/그룹으로 표현된다. **p<0.01 vs 처리되지 않은 마우스. Gfap, 신경아교 섬유질 산성 단백질 ; S100b, 칼슘 결합 단백질 B; Aif1, 동종이식 염증 인자 1; Nfkb, 핵 인자 카파 B; Il1b, 인터루킨 1 베타; Il6, 인터루킨 6.
도 21. AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 SAMP8 마우스에서 신경근 성능 및 인지의 개선. (A) AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 SAMP8 마우스 및 처리되지 않은 SAMP8 및 SAMR1 마우스에서 경골, 비복근 및 대퇴사두근 및 간에서 moFGF21의 발현 수준. moFGF21의 발현 수준은 희생 시 RTqPCR에 의해 측정되었고 Rplp0 값으로 정규화되었다. (B) (A)와 동일한 집단에서 FGF21의 순환 수준. (C-D) 로타로드 테스트는 AAV 투여 후 24주에 수행되었다. (C)의 히스토그램은 마우스가 가속 로타로드에 머물렀던 시간을 나타낸다. (D) 운동 학습 능력. (E-F) 새로운 객체 인식 (Novel Object Recognition) 테스트는 7개월 된 마우스에서 단기(E) 및 장기(F) 기억을 평가하기 위해 수행되었다. 히스토그램은 차별 지수를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 7-12마리 동물/그룹. ND, 감지되지 않음. AU, 임의 단위. ** p<0.01 및 *** p<0.001 vs SAMR1; ### p<0.001 vs 미처리 SAMP8.
도 22. AAV1-CMV-moFGF21로 im 처리된 SAMP8 마우스에서 뇌 염증의 감소. 염증 분자 Ccl19(A) 및 Il6a(B)의 발현 수준은 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 SAMP8 마우스 및 처리되지 않은 SAMP8 및 SAMR1 마우스의 피질 및 해마에서 RTqPCR에 의해 측정되었고, Rplp0 값으로 정규화되었다. 분석은 생후 42주까지 희생하여 수행되었다. 결과는 평균 ± SEM, n=4-5 동물/그룹으로 표현된다. Ccl19, 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19; Il6, 인터류킨 6. *p<0.05 vs 처리되지 않은 SAMP8 마우스.
도 23. AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 3xTg-AD 마우스의 기억력 개선. (A) AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 3xTg-AD 마우스 및 처리되지 않은 3xTg-AD 및 B6129SF2/J 마우스에서 FGF21의 순환 수준. (B) (A)에서와 동일한 집단의 경골근, 비복근 및 대퇴사두근 근육 및 간에서 moFGF21의 발현 수준. moFGF21의 발현 수준은 희생 시 RTqPCR에 의해 측정되었고 Rplp0 값으로 정규화되었다. (C-D) 새로운 객체 인식 (Novel Object Recognition) 테스트는 8개월 된 마우스에서 단기(C) 및 장기(D) 기억을 평가하기 위해 수행되었다. 히스토그램은 차별 지수를 나타낸다. (E) 피질의 불용성 아밀로이드 β40 (Aβ40) 수준. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 3-11마리 동물/그룹. ND, 감지되지 않음. AU, 임의 단위. *** p<0.001 vs B6129SF2/J; ### p<0.001 vs 미처리 3xTg-AD.
도 24. 상이한 용량의 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 늙은 마우스에서 개선된 신경근 성능 및 인지. (A) 1x10¹¹ 또는 3x10¹¹ vg의 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 늙은 마우스에서 FGF21의 순환 수준. 분석은 AAV 2개월 후 수행되었다. (B-C) 로타로드 테스트는 AAV 투여 2개월 후 수행되었다. (B)의 히스토그램은 마우스가 가속 로타로드에 머물렀던 평균 시간을 나타낸다. (C) 운동 학습 능력. (D-E) 새로운 객체 인식 (Novel Object Recognition) 테스트는 26개월 된 마우스에서 단기(D) 및 장기(E) 기억을 평가하기 위해 수행되었다. 히스토그램은 차별 지수를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 6-12마리 동물/그룹. ND, 감지되지 않음. AU, 임의 단위. * p<0.05 및 *** p<0.001 vs 대조군.
도 25. AAV1-CMV-moFGF21로 im 처리된 늙은 동물의 뇌에서 OXPHOS 마커의 발현. 여러 OXPHOS 마커의 발현 수준을 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리한 25개월 된 마우스의 피질 및 해마에서 RTqPCR로 측정하고 Rplp0 값으로 정규화하였다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 4-6마리 동물/그룹. AU, 임의 단위; Ppargc1a, 퍼옥시좀 증식제-활성화 수용체 감마 보조활성화제 1 알파; Ppargc1b, 퍼옥시좀 증식제-활성화 수용체 감마 보조활성화제 1 베타; Atp5f1a, ATP 합성효소 F1 서브유닛 알파; mt-co1, 시토크롬 c 산화효소 1; Cox6, 시토크롬 c 산화효소 소단위 6; Cox5a, 사이토크롬 c 산화효소 소단위 5a. *p<0.05 vs 대조군(25개월령) 미처리 마우스.
도 26. AAV1-CMV-moFGF21로 im 처리된 늙은 동물의 뇌에서 항산화제 마커의 발현. 다양한 항산화제 마커의 발현 수준을 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리한 25개월 된 마우스의 피질 및 해마에서 RTqPCR로 측정하고 Rplp0 값으로 정규화하였다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 4-6마리 동물/그룹. AU, 임의 단위; Nrf2, NF-E2 관련 인자 2; Sod1, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1; 고양이, 카탈라아제. *p<0.05 vs 대조군(25개월령) 미처리 마우스.
도 27. AAV1-CMV-moFGF21을 사용한 치료는 뇌에서 해당 작용의 연령 관련 장애를 상쇄하였다. 몇 가지 당분해 관련 유전자의 발현 수준을 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리하고 Rplp0 값으로 정규화한 25개월 된 마우스의 피질 및 해마에서 RTqPCR로 측정하였다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 4-6마리 동물/그룹. AU, 임의 단위; GAPDH, 글리세르데하이드-3-포스페이트 탈수소효소; Hk1, 헥소키나아제 1; Pfkp, 포스포프럭토키나아제의 혈소판 이소형; Gpd1, 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 1; Gpd2, 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소 2; Pkm, 피루베이트 키나아제 M. *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001 vs 대조군(25개월) 미처리 마우스.
도 28. AAV1-CMV-moFGF21 처리는 주요 시냅스 단백질의 발현을 증가시켰다. 주요 시냅스 단백질의 발현 수준을 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리하고 Rplp0 값으로 정규화한 25개월 된 마우스의 피질 및 해마에서 RTqPCR로 측정하였다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 4-6마리 동물/그룹. AU, 임의 단위; Syp, 시냅토피신; Gria1 및 Gria2, 알파-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸 프로프리온산(AMPA)-유형 이온성 글루타메이트 수용체의 GluR1 및 GluR2 서브유닛; N-메틸-d-아스파르테이트(NMDA)-유형 이온성 글루타메이트 수용체의 Grin1, Grin2a 및 Grin2b, NR1, N2A 및 N2B 서브유닛; Atf4, 활성화 전사 인자 4. *p<0.05 및 ***p<0.001 vs 대조군(25개월) 미처리 마우스.
도 29. AAV1-CMV-moFGF21을 사용한 처리는 자가포식 및 항-ER 스트레스 마커의 발현을 증가시킨다. 자가포식 마커 p62(Sqstm1에 의해 암호화됨) 및 Atg5의 발현 수준 및 샤페론 BiP의 발현 수준은 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 25개월 된 마우스의 Cortex에서 RTqPCR에 의해 측정되었고, Rplp0 값으로 정규화되었다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 4-6마리 동물/그룹. AU, 임의 단위; Atg5, autophagy 관련 5. *p<0.05 vs 대조군(25개월) 미처리 마우스.
도 30. AAV1-FGF21을 사용한 치료는 뇌에서 콜레스테롤 항상성을 개선한다.
콜레스테롤 24-수산화효소(Cyp46a1에 의해 암호화됨)의 발현 수준은 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 25개월 된 마우스의 피질에서 RTqPCR에 의해 측정되었고, Rplp0 값으로 정규화되었다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 4-6마리 동물/그룹. AU, 임의 단위. *p<0.05 vs 대조군(25개월령) 미처리 마우스.
도 31. FGF21을 암호화하는 AAV 벡터로 CSF내 처리 후 비만의 장기 복귀. (A) 상이한 용량의 AAV1-CAG-moFGF21-dmiRT 벡터로 CSF 내 처리된 동물의 체중 진화. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n=10마리 동물/그룹. HFD, 고지방식이. (B) 뮤린 코돈-최적화 FGF21(moFgf21) 코딩 서열의 발현 수준을 시상하부, 피질 및 먹이 및 HFD 공급 마우스의 해마에서 RTqPCR로 측정하고, Rplp0 값으로 정규화하였다. AAV1-CAG-moFGF21 벡터의 5x10⁹ 및 1x10¹⁰ vg/마우스의 CSF내 투여 11개월 후 분석을 수행하였다. 결과는 평균 ± SEM, n=8 동물/그룹으로 표현된다. ND, 감지되지 않음.
도 32. AAV1-CAG-moFGF21 벡터로 CSF 내 처리된 HFD 공급 수컷 마우스에서 증가된 운동 활성. 이동 활동은 오픈 필드 테스트를 통해 평가되었다. (A) 이동 거리. (B) 최대 속도. (C) 이동 시간. (D) 휴식 시간. (E) 빠른 시간. (F) 느린 시간. (G) 교차된 선. (H) 중앙에 있는 항목. (I) 경계에 있는 항목. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 그룹당 최소 10마리의 동물. HFD, 고지방식이. * p<0.05 및 ** p<0.01 및 대조 음식 섭취 마우스; # p<0.05, ## p<0.01 및 ### p<0.001 vs 대조군 HFD 공급 마우스.
도 33. FGF21을 암호화하는 AAV 벡터로 처리된 HFD 공급 마우스에서 감소된 불안. 불안은 오픈 필드 테스트(Open field test)와 Elevated Plus Maze test를 통해 평가되었다. (A) 중앙에 있는 시간, (B) 경계에 있는 시간, (C) 중앙까지의 대기 시간, (D) 중앙에 있는 거리 및 (E) 국경에 있는 거리는 모든 마우스 그룹의 오픈 필드 테스트에서 측정되었다. (F) 히스토그램은 동물이 높은 플러스 미로의 열린 팔 또는 닫힌 팔에서 보낸 시간의 백분율을 보여준다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 그룹당 최소 10마리의 동물. HFD, 고지방식이. * p<0.05 및 ** p<0.01 vs 대조군 식이 제공 마우스; # p<0.05, ## p<0.01 및 ### p<0.001 vs 대조군 HFD 공급 마우스.

도 34. AAV1-CAG-moFGF21 벡터로 CSF내 처리된 HFD 공급 마우스에서 개선된 인지 기능. Novel Object Recognition 테스트는 단기 및 장기 기억 모두를 평가하기 위해 수행되었다. 히스토그램은 (A) 단기 시험 및 (B) 장기 시험의 차별 지수를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 그룹당 최소 10마리의 동물. HFD, 고지방식이. * p<0.05 vs 대조군 식이 제공 마우스.
도 35. AAV1-CAG-moFGF21 HFD 공급 마우스에서의 개선된 학습. Barnes maze test는 마우스의 학습 능력과 기억력을 연구하기 위해 수행되었다. (A) 그래프는 다른 시도 동안 반스 미로의 구멍에 들어가는 시간을 보여준다. (B) 학습 기울기는 홀에 들어가기 위한 시행 의존적 개선으로부터 계산되었다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 그룹당 최소 10마리의 동물.
도 36. AAV1-CAG-moFGF21 벡터로 CSF 내 처리된 늙은 마우스에서 개선된 신경근 성능 및 학습. (A) 히스토그램은 마우스가 가속 로타로드에 머물렀던 평균 시간을 나타낸다. (B) 그래프는 로타로드를 떨어뜨리는 시간의 시험 의존적 향상을 보여주고 (C) 히스토그램은 이 시험 의존적 개선의 기울기를 보여준다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 그룹당 최소 7마리의 동물. * p<0.05, ** p<0.01 및 *** p<0.001 vs 대조군 비처리 마우스.
도 37. AAV1-CAG-moFGF21 벡터로 CSF내 처리된 늙은 마우스에서 개선된 인지 기능. Novel Object Recognition 테스트는 단기 및 장기 기억 모두를 평가하기 위해 수행되었다. 히스토그램은 (A) 단기 시험 및 (B) 장기 시험의 차별 지수를 나타낸다. 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다. n = 6마리 동물/그룹. *** p<0.001 vs 대조군 비처리 마우스.

실시예

실시예 1에서, AAV1-CMV-moFGF21의 근육내 투여는 강력한 과발현을 매개하고 FGF21의 순환 수준을 증가시키며 다음과 같은 이점을 갖는다:

＊ 협응력, 균형, 신경근 성능, 근력 및 운동 활동 개선

＊ 향상된 기억력 및 학습

＊ 미토콘드리아 기능 개선 및 산화 스트레스 감소를 통한 신경퇴행 감소

실시예 2에서, AAV1-CMV-moFGF21의 근육내 투여 및 AAV8-CAG-moFGF21-dmiRT의 eWAT 내 투여는 강력한 과발현을 매개하고 FGF21의 순환 수준을 증가시키며 다음과 같은 이점을 갖는다:

＊ 개선된 이동 활동 및 신경근 성능

＊ 불안과 유사한 행동 감소

실시예 3에서, AAV1-CMV-moFGF21의 근육내 투여는 강력한 과발현을 매개하고 FGF21의 순환 수준을 증가시키며 다음과 같은 이점을 갖는다:

＊ 협응력, 균형, 신경근 성능, 근력 및 운동 활동 개선

＊ 불안과 유사한 행동 감소

＊ 인지 능력, 기억력, 학습 및 탐색 능력 향상

실시예 4에서, AAV1-CAG-moFGF21의 CSF내 투여는 강력한 과발현을 매개하고 다음과 같은 이점을 갖는다:

＊ 운동 활동 개선

＊ 불안과 유사한 행동 감소

＊ 향상된 인지 성능, 기억력 및 탐색 능력

실시예 5에서, AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT의 CSF내 투여는 강력한 과발현을 매개하고 다음과 같은 이점을 갖는다:

＊ 우울증 개선을 나타내는 신경염증 감소

실시예 8 및 9에서, AAV1-CMV-moFGF21의 근육내 투여는 SAMP8 마우스 (신경 염증과 같은 연령 관련 뇌 병리를 가진 노화의 널리 사용되는 마우스 모델) 및 3xTg-AD 마우스(알츠하이머병 모델)에서 긍정적인 치료 효과를 매개하는 것으로 나타났다.

실시예 10에서, AAV1-CMV-moFGF21의 근육내 투여는 개선된 협응, 균형 및 운동 학습뿐만 아니라 단기 및 장기 기억을 유도하는 것으로 나타났다.

실시예 11에서는 AAV1-CMV-moFGF21의 근육내 투여가 미토콘드리아 기능 개선, 포도당 대사 및 autophagia 증가, 산화 및 ER 스트레스 감소, 및 늙은 쥐의 피질 및 해마에서 콜레스테롤 항상성 및 시냅스 기능의 개선에 의한 신경변성 및 인지 저하를 억제함을 나타내었다.

실시예 12 및 13에서, AAV1-CAG-moFGF21의 CSF내 투여는 당뇨병 및 비만과 관련된 신경근 및 인지 감퇴를 개선하고 신경근 성능을 개선하고 학습 및 장단기 기억력을 향상시켰다.

실시예의 일반적인 실험절차

대상체의 특성

수컷 SAMP8/TaHsd(SAMP8), 수컷 및 암컷 C57Bl/6J 마우스, 수컷 BKS.Cg-+Lepr^db/+Lepr^db/OlaHsd(db/db) 및 수컷 BKS.Cg-m+/+Lepr^db/OlaHsd(db/+, 희박) 마우스, 수컷 SAMR1/TaHsd(SAMR1) 마우스, 수컷 3xTg-AD(B6;129Tg(APPSwe,tauP301L)1Lfa Psen1^tm1Mpm) 및 수컷 B6129SF2/J를 사용하였다. 마우스에게 표준 식이(2018S Teklad Global Diets®, Harlan Labs., Inc., Madison, WI, US) 또는 고지방 식이(TD.88137 Harlan Teklad Madison, WI, US)를 자유롭게(ad libitum) 먹이고 12시간의 명암 주기(오전 8시에 점등) 및 안정적인 온도(22℃ ± 2)를 유지하였다. 명시된 경우, 마우스를 16시간 동안 절식시켰다. 조직 샘플링을 위해 마우스를 흡입 마취제 이소플루란(IsoFlo®, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, US)으로 마취하고 목을 베었다. 관심 조직을 절제하고 분석할 때까지 -80℃ 또는 포르말린과 함께 보관하였다. 모든 실험 절차는 Universitat Autonoma de Barcelona의 동물 및 인간 실험 윤리 위원회의 승인을 받았다.

재조합 AAV 벡터

혈청형 1 또는 8 또는 9의 단일 가닥 AAV 벡터는 표준 방법(Ayuso, E. et al., 2010. Curr Gene Ther. 10(6):423-36)에 따라 HEK293 세포의 삼중 형질감염에 의해 생성되었다. 세포를 DMEM 10% FBS에서 80% 컨플루언스까지 10개의 롤러 병 (850 cm², 평면; Corning™, Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, MO, US)에서 배양하고 AAV2 ITR, AAV2 rep 유전자 및 혈청형 1 또는 8 캡 유전자의 AAV를 보유하는 헬퍼 플라스미드, 및 아데노바이러스 헬퍼 기능을 운반하는 플라스미드 옆에 있는 발현 카세트를 운반하는 플라스미드로 인산칼슘 방법에 의해 공동 형질감염시켰다. 사용된 트랜스진은 다음과 같다: 1) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서/치킨 베타 액틴(CAG) 프로모터; 2) 발현 카세트의 3' 비번역 영역에 클로닝된 miRT122a 서열(5'CAAACACCATTGTCACACTCCA3')(서열번호 12) 의 4개의 탠덤 반복 및 miRT1 서열(5'TTACATACTTCTTTACATTCCA3')(서열번호 13) 의 4개의 탠덤 반복 이 추가된 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서/치킨 베타 액틴(CAG) 프로모터; 또는 3) CMV 프로모터. CMV 프로모터를 운반하는 비암호화 플라스미드를 사용하여 null 벡터를 생성하였다. AAV는 폴리에틸렌 글리콜 침전 단계 및 2개의 연속 염화세슘(CsCl) 기울기를 기반으로 한 최적화된 방법으로 정제되었다. 이 2세대 CsCl 기반 프로토콜은 빈 AAV 캡시드와 DNA 및 단백질 불순물을 극적으로 감소시켰습니다(Ayuso, E. et al., 2010. Curr Gene Ther. 10(6):423-36). 정제된 AAV 벡터를 PBS에 대해 투석하고 여과하고 -80℃에서 보관하였다. 바이러스 게놈의 역가는 선형화된 플라스미드 DNA를 표준 곡선으로 사용하여 AAV2 참조 표준 물질에 대해 설명된 프로토콜에 따라 정량적 PCR에 의해 결정되었다(Lock M, et al., Hum. Gene Ther. 2010; 21:1273-1285). 당업계에 잘 알려진 분자 생물학 기술에 따라 벡터를 구성하였다.

AAV 벡터의 생체 내(In vivo) eWAT내 투여

케타민(100mg/kg) 및 자일라진(10mg/kg)을 복강내 주사하여 마우스를 마취시켰다. 부고환 백색 지방 조직을 노출시키기 위해 개복술을 시행하였다. AAV 벡터를 0.001% Pluronic® F68(Gibco)이 포함된 PBS에 재현탁하고 부고환 지방 패드에 직접 주입하였다. 각 부고환 지방 패드에 50 μL의 AAV 용액을 두 번 주입하였다(한 번은 고환에 가깝게 주입하고 다른 하나는 지방 패드 중간에 주입). 복부를 멸균 식염수로 헹구고 2층 접근법으로 폐쇄하였다.

AAV 벡터의 근육내 투여

케타민(100mg/kg) 및 자일라진(10mg/kg)을 복강내 주사하여 마우스를 마취시켰다. 뒷다리를 면도하고 벡터를 각 뒷다리의 대퇴사두근, 비복근 및 두경골근에 분포된 6개의 주사 부위로 나누어 총 부피 180 ㎕의 근육내 주사에 의해 투여하였다.

AAV 벡터의 생체 내(In vivo) CSF 내 투여

케타민(100mg/kg) 및 자일라진(10mg/kg)을 복강내 주사하여 마우스를 마취시키고, 면도하고 에탄올로 헹군 귀 뒤로부터 대략 견갑골 사이까지 후두부 피부를 마취시켰다. 마우스는 엎드린 자세로 머리를 약간 아래쪽으로 기울였습니다. 2 mm 안면부-꼬리(ostro-caudal) 절게는 45-55°의 각도로 Hamilton 주사기를 후두부와 C1-척추골 사이의 대조(cisterna magn(에 삽입하기 위해 만들어졌으며 5 μl의 벡터 희석액이 투여되었다. CNS가 벡터 전달을 위한 주요 표적 구획이라는 점을 감안할 때, 체중(5x10⁹, 1x10¹⁰ 및 5x10¹⁰ vg/마우스)에 관계없이 동일한 수의 벡터 게놈/마우스를 마우스에 투여하였다.

RNA 분석

총 RNA는 각각 QIAzol 라이시스 시약(Qiagen NV, Venlo, NL) 또는 Tripure 분리 시약(Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN, US), 및 RNeasy Lipid Tissue Minikit (Qiagen NV, Venlo, NL)를 사용하여 지방 저장소 또는 골격근에서 얻었다. 잔류 바이러스 게놈을 제거하기 위해 전체 RNA를 DNAseI(Qiagen NV, Venlo, NL)로 처리하였다. RT-PCR의 경우 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(04379012001, Roche, California, USA)를 사용하여 1μg의 RNA 샘플을 역전사하였다. 실시간 정량 PCR은 EXPRESS SYBRGreen qPCR 슈퍼믹스(Invitrogen™, Life Technologies Corp., Carslbad, CA, US)를 사용하여 SmartCyclerII®(Cepheid, Sunnyvale, USA)에서 수행되었다. 데이터는 Rplp0 값으로 정규화되었고 이전에 기술된 바와 같이 분석되었다(Pfaffl, M., Nucleic Acids Res. 2001; 29(9):e45).

총 RNA는 각각 Tripure 분리 시약(Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN, US), 및 해마 샘플용 RNeasy Mini Kit 또는 RNeasy Micro Kit(Qiagen NV, Venlo, NL)을 사용하여 시상 하부, 피질, 해마, 소뇌 및 후각 망울에서 총 RNA를 얻었다. 잔류 바이러스 게놈을 제거하기 위해 전체 RNA를 DNAseI(Qiagen NV, Venlo, NL)로 처리하였다. RT-PCR 분석을 위해 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(04379012001, Roche, California, USA)를 사용하여 1μg의 RNA 샘플을 역전사하였다. 실시간 정량 PCR은 TB Green Premix Ex TaqII(Takara Bio Europe, France)를 사용하여 SmartCyclerII®(Cepheid, Sunnyvale, USA)에서 수행되었다. 데이터는 Rplp0 값으로 정규화되었고 이전에 기술된 바와 같이 분석되었다(Pfaffl, M., Nucleic Acids Res. 2001; 29(9):e45).

사용된 프라이머의 개요는 다음과 같다:

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마이크로어레이를 이용한 mRNA 발현 분석

cDNA 합성 및 어레이 혼성화. mRNA 발현 분석을 위해 Affymetrix Clariom S Mouse 마이크로어레이(Affymetrix, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였다. 약 300ng의 전체 RNA를 제조업체 지침에 따라 GeneChip WT Plus 시약 키트(Affymetrix, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 처리하고 Affymetrix Clariom S 마우스 마이크로어레이 플레이트에 혼성화하였다. Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash 및 Stain 키트는 어레이 처리에 사용되었다. 칩은 이후 Affymetrix GeneChip 스캐너 3000으로 스캔되었다.

어레이 품질 관리 및 정규화. Expression ConsoleTM 소프트웨어(Affymetrix, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)도 마이크로어레이의 품질 관리를 수행하고 모든 마이크로어레이의 데이터를 정규화하는 데 사용되었다. RMA 알고리즘을 사용하여 백그라운드 보정, log2 변환 및 분위수 정규화를 수행하여 마이크로어레이에서 값을 비교할 수 있다. 그 후, Affymetrix Transcriptome Analysis Console 소프트웨어(Affymetrix, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 FGF21 처리된 뇌 샘플과 Null 처리된 뇌 샘플에 주석을 달고 비교하여 계산된 배수 변화 및 p-값을 가진 유전자 목록을 생성하였다.

FGF21 순환 수준 측정

FGF21의 순환 수준은 정량적 샌드위치 효소 면역분석 마우스/래트 FGF-21 ELISA 키트(MF2100, R&Dsystems, Abingdon, UK)에 의해 결정되었다.

아밀로이드 베타 추출 및 정량

해부된 피질은 프로테아제 억제제 칵테일 (완전 EDTA 무첨가, Roche, Mannheim, Germany)이 보충된 차가운 T-PER 완충액(ThermoScientific, Rockford, IL, USA)에서 초음파 분쇄기(Sonics, Vibra-Cell, Newtown, USA)를 사용하여 균질화되었다. 간단한 초음파 처리 후 샘플을 SW-55Ti 로터를 사용하여 초원심분리기(Optima XPN-100, Beckman Coulter, Brea, CA, USA)에서 1시간 동안 4°C에서 100,000xg로 원심분리하였다. 상청액을 가용성 분획으로 표시하였다. 펠릿을 70% 포름산 용액에 재현탁시켰다. 초음파 처리 및 원심 분리 단계를 반복하고 상청액을 회수하여 진공 농축기(Savant SpeedVac DNA130 농축기, ThermoFischer Scientific)에서 4시간 동안 건조하였다. 건조된 개미 추출물을 DMSO에 재현탁하고 불용성 분획으로 표시하였다. 모든 분획은 추가 사용까지 즉시 -80℃에서 보관하였다.

제조업체가 권장하는 프로토콜(Human Aβ40 ELISA 키트, Invitrogen, ref. KHB3481)에 따라 ELISA로 불용성 분획에서 Aβ40 수준을 정량화하였다. 데이터는 각 샘플의 총 단백질 양으로 정규화되었다(Pierce BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific, ref. 23225).

오픈 필드 테스트

오픈 필드 테스트는 이전에 보고된 대로 오전 9시에서 오후 1시 사이에 수행되었다(Haurigot et al, 2013). 간단히 말해서, 흰색 플라스틱 벽과 바닥 상자(45x45x40cm)의 모서리에 동물을 배치하였다. C57Bl/6J 마우스의 경우 비디오 추적 시스템(SMART Junior; Panlab)을 사용하여 처음 6분 동안 운동 및 탐색 활동을 평가하였다. db/db 마우스와 그 대조군의 경우, 마우스는 먼저 야외 경기장에서 5분 동안 길들여졌습니다. 그런 다음 홈 케이지에 5분 동안 배치한 후 다시 야외 경기장에 배치하고 처음 12분 동안 운동 및 탐색 활동을 평가하였다.

새로운 객체 인식 테스트

새로운 물체 인식 테스트는 열린 필드 상자에서 수행되었다. 마우스를 상자에 적응시키기 위해 오픈 필드 테스트를 사용하였다. 다음날 첫 번째 시도를 수행하기 위해 두 개의 동일한 물체(A와 B)를 상자의 오른쪽 상단과 왼쪽 상단 사분면에 배치한 다음 마우스를 두 물체에 거꾸로 배치하였다. 10분의 탐색 후 마우스를 상자에서 꺼내고 10분 휴식을 취하였다. 두 번째 시도에서는 동일한 개체(A와 B) 중 하나가 개체 C(새 개체)로 대체되었다. 그런 다음 단기 기억 실험을 위해 추가로 10분 동안 탐색하기 위해 마우스를 상자에 다시 넣었다. 장기 기억 실험의 경우, 그 다음날 물체 C가 새로운 물체(D)로 대체되어 마우스가 물체 A와 D를 10분 동안 더 탐색할 수 있게 되었다. 동물이 새로운 물체를 탐색하는 데 소비한 시간을 기록하고 비디오 추적 시스템(SMART Junior; Panlab)을 사용하여 평가하였다. 새로운 물체 인식 테스트 메모리의 평가는 다음 공식에 따라 계산된 식별 비율의 백분율로 표시된다. 식별 비율(%) = (N-F)/(N+F)x100%, 여기서 N은 탐색에 소요된 시간을 나타낸다. 새 개체와 F는 동일한 개체를 탐색하는 데 소요된 시간을 나타낸다.

로타로드 테스트(Rotarod test)

마우스를 4 RPM으로 회전하는 회전 막대(Panlab, Barcelona, Spain)에 올려놓았다. 차선 폭, 50mm; 막대 직경, 30mm. 일단 안정화되면, 마우스는 x초당 xRPM의 점진적으로 증가하는 속도를 받게 된다. 실험 첫날은 장치 사용에 대해 동물을 훈련시키는 데 사용되었다. 각 동물은 3번의 실험을 거쳤다. 마우스가 로드에 남아 있는 시간을 기록하였다. 그런 다음 동물은 1일 휴식을 취하고 3일째에는 마우스가 로드에서 3번 더 시도하였다. 3회 시험의 평균을 분석하였다. 운동 학습의 평가를 위해 각 개별 시도의 성능을 분석하였다.

그립 강도 테스트

그립 강도 테스트 미터(Panlab, Barcelona, Spain)를 사용하여 앞다리 그립 강도를 평가하였다. 악력 측정기를 수평으로 놓고 마우스를 꼬리로 잡고 장치 쪽으로 내렸다. 동물은 앞발로 금속 막대를 잡을 수 있게 한 다음 수평면에서 뒤로 잡아당겼다. 그립을 잃기 직전에 바에 가해진 힘을 최고 장력으로 기록하였다. 3회 시험의 평균을 분석하였다.

행 와이어 테스트(Hang wire test)

와이어 행잉 테스트는 2개의 수직 스탠드에 고정된 폭 55cm, 두께 2mm의 금속 와이어를 사용하여 수행되었다. 와이어는 동물이 넘어질 때 부상을 방지하기 위해 침구 재료 층 위 35cm에 유지되었다. 꼬리로 다루어진 생쥐는 앞다리로 철사의 가운데를 잡도록 허용되었다. 마우스가 쓰러질 때까지의 시간을 측정하였다. 실험 횟수에 관계없이 180초의 제한 정지 시간에 도달한 마우스는 실험을 중단할 수 있었고, 나머지 마우스는 최대 3번의 실험 동안 직접 재시험하였다(시행 사이에 30초의 회복 기간이 사용됨).

반스 미로 테스트(Barnes maze test)

Barnes 미로 테스트는 주변에 20개의 균일한 간격의 구멍이 있는 높은 원형 플랫폼으로 구성되었다. 탈출 상자는 하나의 구멍 아래에 장착되고 나머지 19개의 구멍은 덮혀 있다. 훈련 및 시험 시 밝은 빛(1000루멘 이상), 탁 트인 공간, 소음(90db 이상) 등의 혐오자극이 도주행동을 유도하는 동기요인으로 작용하였다. Barnes maze는 빈 방에서 진행되었으며 벽의 시각적 단서는 참고 자료로 사용되었다. 첫째 날 동안 동물을 탈출 상자에서 1분 동안 적응시킨 후 개방 플랫폼에서 140초 동안 적응시켰다. 모든 동물이 적응되면 탈출 상자를 Barnes 미로의 다른 구멍으로 옮겨 교육 기간 동안 유지하였다. 첫 번째 훈련에서는 Barnes 미로 한가운데에서 15초 동안 쥐를 PVC 튜브 안에 넣은 다음 PVC를 풀어 동물들이 자유롭게 플랫폼을 탐색하고 140초 동안 탈출 상자를 찾도록 하였다. 올바른 구멍을 찾아 탈출 상자에 들어가면 동물은 30초 동안 안에 머물고 그렇지 않으면 동물을 탈출 상자로 안내하였다. 다음 날(2, 3, 4)에는 하루에 두 번의 교육을 첫 번째 교육으로 평가하였다. 마지막 날(5일)에는 스케이프 박스를 제거하고 180초 동안 기억력을 평가하는 탐침 시험을 진행하였다. 동물들이 Barnes 미로를 탐험하는 데 소비한 시간을 기록하고 비디오 추적 시스템(SMART Junior; Panlab)을 사용하여 평가하였다. 동물들이 풍경 상자를 찾을 때까지 보낸 시간을 기억의 척도로 계산하였다.

높은 플러스 미로(Elevated plus maze)

고가 플러스 미로 테스트는 열린 팔과 닫힌 팔, 중간에서 교차된 부분, 중앙 영역으로 구성된 장치에서 수행되었다. 구조체는 바닥에서 90-100cm 높이로 올라갔다. 시험하는 동안 마우스를 중앙 영역에 놓고 5분 동안 팔 사이를 자유롭게 움직일 수 있도록 하였다. 동물이 열린 팔과 닫힌 팔을 탐색하는 데 소비한 시간을 기록하고 비디오 추적 시스템(SMART Junior; Panlab)을 사용하여 평가하였다. 두 팔을 벌린 횟수와 두 팔을 벌린 시간을 쥐의 열린 공간 유발 불안 지표로 사용하였다.

통계 분석

모든 값은 평균 ± SEM으로 표시된다. 데이터는 Tukey의 사후 보정을 사용하여 일원 분산 분석으로 분석하였다. 단, 두 개의 실험 그룹만 비교하는 매개변수는 예외로, 이 경우 짝이 없는 스튜던트 t-테스트가 사용되었다. 차이는 P < 0.05일 때 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 1. FGF21을 암호화하는 AAV 벡터로 처리된 노령 마우스에서 신경근 성능 및 인지 개선 및 신경변성 감소

FGF21을 사용한 골격근의 유전 공학이 노령 동물에서 치료 효과를 발휘할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 13.5개월 된 수컷 C57Bl6 마우스에 CMV 프로모터(AAV1-CMV-moFGF21)의 제어 하에 뮤린 코돈-최적화된 FGF21 코딩 서열(moFGF21)을 암호화하는 혈청형 1의 AAV 벡터의 3×10¹¹ 바이러스 게놈(vg)을 근육내 투여하였다. 연령이 일치하는 대조군 동물을 동일한 용량의 AAV1-CMV-Null 벡터로 처리하였다. 치료받지 않은 어린 쥐의 집단은 추가 대조군으로 사용되었다. 모든 실험군은 초식이를 먹였다.

AAV1-CMV-moFGF21 처리된 마우스는 3개의 주사된 근육에서 코돈 최적화된 FGF21의 과발현을 나타내었지만 간 및 심장과 같은 비표적 조직에서는 그렇지 않았다(도 1A). FGF21의 골격근 과발현은 FGF21의 혈류로의 분비를 증가시켰다(도 1B).

AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 늙은 쥐를 처리하면 협응력과 균형이 향상되었다. 눈에 띄게, 22개월 된 AAV1-CMV-moFGF21 처리 마우스와 3개월 된 미처리 마우스 사이에 차이가 관찰되지 않았다(도 2A). 골격근 기능 및 협응력을 더 연구하기 위해 행 와이어 테스트가 수행되었다. AAV1-CMV-moFGF21로 처리된 늙은 마우스는 Null 벡터로 처리된 마우스와 비교하여 개선된 신경근 성능을 보여주었다(도 2B). 오픈 필드 테스트는 나이가 들면서 신체 활동 수준이 감소하는 것으로 나타났다(도 2C). AAV-CMV-moFGF21 처리 마우스는 활성 수준이 크게 증가하여 23개월 된 AAV-FGF21 처리 마우스의 활성 수준이 4개월 된 미처리 마우스와 유사하게 되었다(도 1C). 이전 보고서(Wenz, T. et al. 2009. Proc Natl Acad Sci U S A 106 (48), 20405-10)와 일치하여 악력 테스트는 노화와 관련된 근력 손실을 입증하였다(도 2D). AAV-CVM-moFGF21 처리된 마우스는 AAV1-CMV-Null 연령 일치 대응물과 비교하여 이 매개변수의 상당한 개선을 나타냈으며, 이전 마우스의 그립 강도는 4개월된 마우스와 비교하여 약간 감소하였다(도 2D). 또한, 27개월령까지 FGF21-암호화 벡터로 처리된 마우스는 AAV1-CMV-Null 벡터로 처리된 연령 일치 집단보다 새로운 물체 인식 테스트에서 현저하게 더 나은 성능을 나타냈으며, 2개월 된 동물과 동등한 인식 지수를 가졌다(도 3). 이러한 모든 결과는 AAV1-CMV-moFGF21 벡터를 사용한 치료가 늙은 쥐에서 신경근 성능, 강화된 학습 및 정상화된 기억력을 개선했음을 시사한다.

AAV-FGF21 매개 인지 개선의 기본 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 AAV1-CMV-moFGF21 또는 AAV1-CMV-Null 벡터로 처리된 늙은 쥐의 뇌에서 RNA를 얻고, Affymetrix Clariom S Mouse 마이크로어레이 기술을 사용하여 전사체의 분석을 수행하였다. 데이터 전처리는 Affymetrix Expression Console을 사용하여 수행되었다. 그 후, Affymetrix Transcriptome Analysis Console을 사용하여 AAV1-CMV-moFGF21 또는 AAV1-CMV-Null 벡터로 처리된 늙은 쥐의 뇌 샘플을 비교하여 배수 변화 및 p-값이 계산된 유전자 목록을 생성하였다. Microarray 분석에서 얻은 transcriptomic 데이터를 해석하기 위해 Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)를 수행하였다. 이 방법은 유전자 세트, 즉 이전의 생물학적 지식, 예를 들어 생물학적 기능, 생물학적 경로 또는 세포 구획에 기초한 공통 특징을 공유하는 유전자 그룹에 의존한다(Subramanian, A. et al., 2005). 이 세트에는 다양한 수의 유전자(유전자 세트의 크기)가 포함되어 있으며 Hallmark, KEGG, Reactome 또는 Gene Ontology(GO)와 같은 여러 데이터베이스에서 검색한 다음 과한 기술(overrepresentation) 분석을 계산하였다. GSEA의 목표는 유전자 세트의 구성원이 처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플과 상관관계가 있는지 여부를 결정하는 것이다. 세트가 과장된 정도를 계산하고 세트의 크기를 설명하기 위해 정규화하여 정규화 농축 점수(NES) 및 관련 p-값을 산출하여 통계적 유의성을 설명하였다.

주로 미토콘드리아 기능 향상 및 산화 스트레스(Yu, Y. et al., 2015; Wang, X-M. et al., 2016; Sa-nguanmoo P. et al 2016; Sa-nguanmoo P. et al 2018; Chen S. et al., 2019; Amiri M. et al., 2018), GSEA는 산화적 인산화와 관련된 경로, 호흡 전자 수송, 분리 단백질 매개 열 발생, 반응성 산소 종, 미토콘드리아 복합체 및 성분, 크리스태 형성 및 미토콘드리아 막 횡단 수송의 감소로 인해 재조합 FGF21 단백질로 처리된 동물에서 신경변성 및 인지 저하의 개선을 설명하는 이전 보고서와 의 일치는 AAV1-CMV-Null 벡터를 받은 마우스와 비교하여 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 처리된 늙은 동물에서 풍부하였다(표 1). 따라서 데이터는 FGF21 유전자 요법이 미토콘드리아 기능의 개선 및 산화 스트레스의 감소를 통해 신경퇴행을 억제함을 나타낸다.

표 1: GSEA 분석에서 얻은 산화 및 미토콘드리아 대사와 관련된 유전자 농축 세트

실시예 2. FGF21을 암호화하는 AAV 벡터로 처리한 HFD 공급 수컷 마우스에서 저활동성 및 불안 및 우울증 유사 증상의 역전

우리는 FGF21을 사용하여 지방 조직 또는 골격근의 AAV 매개 유전 공학의 치료 가능성을 평가하여 비만 및 당뇨병 관련 불안과 신경근 성능 감소를 되돌렸다. 이를 위해 10주령 수컷 C57Bl6 마우스에게 18주 동안 HFD를 공급하였다. 추적 관찰 첫 4개월 동안, 음식을 먹인 동물의 체중이 25% 증가한 반면, HFD를 먹인 동물은 비만이 되었다(91% 체중 증가)(도 4A-B). 그런 다음 비만 동물에게 miR122a 및 miR1의 표적 부위를 포함하는 CAG 유비쿼터스 프로모터의 제어 하에 5x10¹⁰ vg 또는 1x10¹¹ vg의 뮤린 코돈-최적화 FGF21 코딩 서열을 암호화하는 AAV8 벡터를 eWAT(eWAT: 부고환 백색 지방 조직) 내 투여하였다. (AAV8-CAG-moFGF21-dmiRT). 또 다른 비만 마우스 집단에 AAV1-CMV-moFGF21 벡터를 3가지 상이한 투여량: 7x10¹⁰, 1x10¹¹ 및 3x10¹¹ vg/마우스로 근육내(im) 투여하였다. AAV 투여 후, AAV-처리된 마우스는 약 1년, 즉 16.5개월령까지 HFD를 유지하였다. 대조군으로서, 처리되지 않은 먹이 및 HFD를 먹인 C57Bl6 마우스를 사용하였다.

5x10¹⁰vg 또는 1x10¹¹vg의 AAV8-CAG-moFGF21-dmiRT 벡터로 처리된 동물은 초기에 각각 체중의 14% 및 25%가 감소했고, 계속해서 점진적으로 체중이 감소하였다(도 4A). 실제로, 1x10¹¹ vg의 AAV8-CAG-moFGF21-dmiRT로 처리된 HFD를 먹인 마우스의 체중은 연구 종료 시점(~14.5개월)까지 음식을 먹인 동물의 체중과 유사하였다(도 4A).

AAV1-CMV-moFGF21로 처리된 그룹에서 명확한 용량 의존적 체중 감소가 관찰되었다. 벡터의 가장 낮은 용량은 HFD 공급과 관련된 체중 증가를 상쇄하지 않았지만, 이 동물의 평균 체중은 항상 대조군 HFD 공급 마우스보다 낮았다(도 4B). 1x10¹¹ vg AAV1-CMV-moFGF21로 처리된 동물은 처음에 체중의 18%가 감소했고 계속해서 점진적으로 체중이 감소하였다(도 4B). 이 생쥐의 체중은 연구가 끝날 무렵(~14.5개월) 음식을 먹인 동물의 체중과 비슷하였다(도 4B). 3x10¹¹ vg AAV1-CMV-FGF21을 투여시, HFD를 먹인 쥐는 처음에 체중의 34%를 잃었고, 또한 체중의 점진적인 감소를 경험했으며, 연구가 끝날 무렵 음식을 먹인 동물의 체중보다 낮았고, HFD 공급을 시작하기 전에 기록된 무게와 비교하여 약간 증가하였다(도 4B).

5x10¹⁰ 또는 1x10¹¹ vg의 AAV8-CAG-moFGF21-dmiRT 벡터로 eWAT 내 처리된 동물은 FGF21의 지방 특이적 과발현에 의해 매개되는 혈류에서 높은 수준의 FGF21을 나타냈다(도 5A)(도 5B). 유사하게, AAV1-CMV-FGF21 벡터로 처리된 HFD 공급 마우스는 순환하는 FGF21의 현저한 증가를 나타냈고(도 5C), 이는 3개의 주입된 근육에서 벡터 유래 FGF21의 높은 수준의 발현과 유사하였다(도 5D). 벡터 혈청형, 프로모터 및 투여 경로의 이러한 조합은 간과 같은 비표적 조직에서 이식유전자의 발현을 유도하지 않았다(도 5D).

AAV8-CAG-moFGF21-dmiRT 또는 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 처리하면 운동 활성에 대한 효과가 매개된다. HFD를 먹인 미처리 동물의 오픈 필드 테스트에서 관찰된 저활동성과는 대조적으로, 5x10¹⁰ vg 또는 1x10¹¹ vg의 AAV8-CAG-moFGF21-dmiRT로 처리한 마우스는 음식을 먹인 동물과 동일한 정도의 자발적 운동 활성을 보였습니다(도 6). 11개월 된 AAV8-CAG-moFGF21-dmiRT 처리된 동물은 처리되지 않은 HFD 공급 대조군보다 더 많은 거리를 이동하고, 더 많은 시간과 더 빠른 속도로 이동하고, 더 적은 시간을 쉬고 느리고 빠른 움직임을 하는 데 더 많은 시간을 소비하였다(도 6A-G). 1x10¹¹ 및 3x10¹¹ vg의 AAV1-CMV-moFGF21로 im 처리된 마우스에서도 유사한 관찰이 이루어졌다(도 7). 이러한 결과는 FGF21-암호화 AAV 벡터로 처리된 HFD 공급 마우스에서 개선된 신경근 성능을 제안한다. 이러한 결과는 또한 총 이동 거리와 같은 오픈 필드 테스트에서 우울증과 유사한 행동으로 특징지어지는 행동의 감소를 나타낸다(예: Wang et al. 2020 Front. Pharmacol., 2020년 2월 28일 참조).

식이 유발 비만을 나타내는 마우스는 비만 및 당뇨병 환자에서 관찰되는 불안-유사 행동을 모방하는 것으로 보고되었다(Asato et al, Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi, 32 (5-6), 251-5 (2012)). 마우스에서 이 매개변수를 평가하는 데 널리 사용되는 오픈 필드 테스트를 통해 불안 유사 행동을 조사하였다(Zhang, L-L. et al., 2011, Neuroscience, 196, 203-14). 마우스는 새로운 환경의 탁 트인 공간에 놓였을 때 장치 주변을 돌아다니는 것을 선호한다. 따라서 오픈 필드의 중앙 영역에서 보내는 시간은 불안 관련 성향 수준과 반비례 관계가 있는 것으로 간주된다. 16.5개월 된 치료되지 않은 HFD를 먹인 쥐는 같은 연령의 음식을 먹인 대조군과 비교하여 중앙 구역에서 더 적은 시간을 보냈으며 이는 불안 수준이 높아졌음을 시사한다(도 8A). 대조적으로, AAV8-CAG-moFGF21-dmiRT 벡터를 사용한 치료는 불안을 완전히 상쇄시켰다; 특히, 1x10¹¹ vg의 AAV8-CAG-moFGF21-dmiRT로 처리된 HFD를 먹인 마우스가 중앙 구역에서 보낸 시간은 2개월 된 음식을 먹인 대조군 마우스와 유사하였다(도 8A). AAV1-CMV-moFGF21 벡터의 1x10¹¹ 및 3x10¹¹ vg의 근육내 투여는 또한 HFD-관련 불안의 중화작용을 매개하였다(도 8B).

이러한 모든 결과는 FGF21 암호화 AAV 벡터를 사용한 치료가 당뇨병 및 비만과 관련된 행동 결함을 개선했음을 시사한다.

실시예 3. FGF21을 암호화하는 AAV 벡터로 처리된 HFD 공급 암컷 마우스에서 불안의 대응 및 신경근 성능 및 인지의 개선

다음으로, 우리는 AAV1-CMV-moFGF21 벡터의 im 투여가 비만 및 인슐린 저항성 암컷 마우스에서 치료 효과를 중재할 수 있는지 여부를 평가하였다. 이를 위해 11주령 암컷 C57Bl6 마우스에 8주 동안 HFD를 먹인 후 AAV1-CMV-moFGF21 벡터를 사용하여 대퇴사두근, 비복근 및 경골근 골격근에서 1x10¹¹ 또는 3x10¹¹ vg/마우스의 용량으로 치료하였다. 처리되지 않은 식이 및 HFD 공급 집단이 대조군으로 사용되었다.

1x10¹¹ vg의 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 처리된 암컷 마우스는 처음에 체중의 5%를 잃었고 항상 대조군 HFD 공급 마우스보다 평균 체중이 더 낮았다(도 9A). 주목할 만하게, 3x10¹¹ vg의 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 처리된 마우스 집단은 AAV 전달 몇 주 내에 체중을 정상화하였다(도 9A). 실제로, 이 그룹의 동물의 평균 체중은 추적 관찰 기간(~8개월) 동안 음식을 먹인 미처리 집단의 체중과 구별할 수 없게 되었다(도 9A).

AAV1-CAG-moFGF21 벡터로 im 내 처리한 HFD 공급 수컷 마우스에서 관찰한 것과 유사하게, 동일한 벡터를 사용한 암컷 마우스의 골격근의 유전 공학은 또한 순환 FGF21 수준의 현저한 증가(도 9B) 및 주사된 근육에서 인자의 특이적 과발현(도 9C)을 매개하였다.

신경근 성능을 평가하기 위해 오픈 필드, 로타로드 및 그립 강도 테스트를 수행하였다. 오픈 필드 테스트 동안, 골격근에서 HFD를 공급하고 FGF21을 과발현하는 암컷 마우스는 증가된 운동 활성을 보였다(도 10). 총 이동 거리 감소와 같이 오픈 필드 테스트에서 일반적으로 우울증과 유사한 행동으로 특징지어지는 행동(예: Wang et al. 2020 Front. Pharmacol., 2020년 2월 28일 참조)도 개선되었다. 명백하게, 오픈 필드 테스트는 또한 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 처리된 마우스에서 감소된 불안을 드러냈다(도 11). 또한, 3x10¹¹ vg의 AAV1-CMV-FGF21 벡터를 근육 투여한 암컷 마우스는 처리되지 않은 HFD 공급 대응물보다 가속 로타로드에서 더 오래 머무를 수 있었고, 협응력 및 균형의 개선을 입증하였다(도 12A). 또한, 전자 마우스는 무처리 비만 마우스보다 더 높은 근력을 나타내어, 전자 마우스의 쥐는 힘이 음식을 먹인 마우스에 비해 약간 감소하였다(도 12B).

인지 성능에 대한 AAV1-CMV-FGF21 벡터 처리의 효과를 테스트하기 위해 새로운 물체 인식 및 Y-미로 테스트를 수행하였다. FGF21-암호화 벡터로 처리된 HFD를 먹인 암컷 마우스는 두 테스트에서 처리되지 않은 HFD를 먹인 집단보다 현저하게 더 나은 성능을 보였다. 신개념 물체인식 검사에서는 3x10¹¹ vg/마우스의 AAV1-CMV-FGF21 벡터를 받은 마우스는 음식을 먹인 대조군 집단과 동등한 인식 지수를 가졌고, 1x10¹¹ vg의 용량으로 처리된 마우스는 대조군 야윈 동물보다 더 나은 학습 및 기억력을 나타냈다(도 13A). 또한, AAV1-CMV-FGF21 벡터로 처리된 마우스는 용량에 관계없이 Y-미로에서 향상된 공간 기억을 보였다(도 13B). 1x10¹¹ 또는 3x10¹¹ vg/마우스의 AAV1-CMV-FGF21 벡터로 처리된 대조군 먹이 공급 및 HFD 공급 마우스는 유사하게 다른 팔보다 더 자주 새로운 팔을 탐색하였다(도 13B).

이러한 모든 결과는 FGF21 암호화 AAV 벡터를 사용한 치료가 당뇨병 및 비만과 관련된 신경근 및 인지 저하를 개선했음을 시사한다.

실시예 4. FGF21을 암호화하는 AAV 벡터로 처리된 db/db 마우스에서 증가된 이동 활동 및 불안 유사 행동의 개선, 탐색 능력 및 인지.

FGF21 유전자 요법으로 뇌의 AAV 매개 유전 공학의 인지 저하에 대한 치료 가능성을 db/db 마우스에서 평가하였다. Db/db 마우스는 렙틴 신호 전달의 결핍을 특징으로 하는 비만 및 당뇨병의 널리 사용되는 유전자 마우스 모델이다. 또한, db/db 마우스는 신경 염증 및 인지 저하의 마우스 모델로도 사용되었다(Dey et al, J. Neuroimmmunol. 2014; Dinel et al Plos one 2011; Stranahan et al Nat Neurosci 2008; Zheng, Biochimica and Biophysica Acta 2017).

2개월 된 db/db 수컷 마우스에게 5x10¹⁰ vg/마우스의 CAG 유비쿼터스 프로모터(AAV1-CAG-moFGF21)의 제어 하에 뮤린 코돈 최적화된 FGF21 암호화 서열을 암호화하는 AAV1 벡터를 시스터나 마그나를 통해 국소 뇌척수액(CSF)으로 투여하였다. 대조군으로는 무처리 db/db 및 무처리 db/+(lean) 마우스를 사용하였다.

AAV1-CAG-moFGF21 벡터의 CSF 내 투여는 AAV 투여 16주 후 시상하부, 피질, 해마, 소뇌 및 후각 망울과 같은 뇌의 다른 영역에서 인자의 증가된 발현 수준에 의해 입증되는 바와 같이, 뇌에서 FGF21의 광범위한 과발현을 매개하였다(도 18).

모든 그룹의 마우스에 대해 9주령에 오픈 필드 테스트를 수행하였다. 처리되지 않은 db/db 마우스는 이동 거리, 최대 속도 및 빠른 시간의 감소를 보였다(도 14A-C). 이러한 모든 매개변수는 AAV1-CAG-moFGF21 투여 후 db/db 마우스에서 개선되었으며(도 14A-C), 이는 FGF21 유전자 요법 치료 후 증가된 운동 활성을 나타낸다. 총 이동 거리 감소와 같이 오픈 필드 테스트에서 일반적으로 우울증과 유사한 행동으로 특징지어지는 행동(예: Wang et al. 2020 Front. Pharmacol., 28 February 2020 참조)도 개선되었다.

불안한 행동은 야외에서도 연구되었고, db/db 미처리 마우스 (경계에서 증가된 거리 및 중심에서 감소된 거리) (도 15A-B)에서 관찰된 장애는 AAV1-CAG-moFGF21 CSF 내 투여 후 db/db 마우스에서 개선되었으며(도 15A-B), 이는 불안 유사 행동의 감소를 나타낸다.

10주령의 모든 마우스 그룹에 대해 Y-미로 테스트를 수행하였고, 처리되지 않은 db/db 마우스는 db/+ 희박 마우스보다 탐색 능력이 낮았으며(도 16A-B), db/db 마우스는 AAV1-CAG-moFGF21 유전자 요법으로 CSF내 치료 후 개선되었다(항목 수 증가 및 제1 선택 잠복기 감소)(도 16A-B).

AAV1-CAG-moFGF21 벡터를 사용한 CSF 내 처리가 기억에 미치는 영향을 테스트하기 위해 생후 11주에 새로운 물체 인식 테스트를 수행하였다. AAV1-CAG-moFGF21-암호화 벡터로 처리된 Db/db 마우스는 처리되지 않은 db/db 집단보다 현저하게 더 나은 성능을 보였다(도 17). 또한, 미처리 db/db 마우스에서 관찰된 식별 지수의 현저한 감소는 AAV1-CAG-moFGF21 투여 후 크게 개선되었으며(도 17), 이는 유전자 치료 후 증가된 기억력을 나타낸다.

실시예 5. FGF21을 인코딩하는 AAV 벡터로 처리된 db/db 및 SAMP8 마우스의 우울증 감소를 나타내는 신경염증 감소

우리는 또한 신경 염증 감소를 위한 AAV 매개 FGF21 유전자 요법의 가능성을 평가하였다.

먼저, 신경 염증과 같은 연령 관련 뇌 병리를 갖는 노화의 마우스 모델로 널리 사용되는 SAMP8(노화 가속 마우스 경향 8) 마우스를 사용하였다(Takeda T., Neurochem. Res. 2009, 34(4) :639-659; Grinan-Ferre C. 등 Mol. Neurobiol. 2016, 53(4):2435-2450). 뇌의 염증은 성상 세포 마커 Gfap 및 S100b, 소교 세포 마커 Aif1 및 Nfkb, Il1b 및 Il6과 같은 전 염증 분자의 발현을 통해 분석되었다. 전-염증성 사이토카인 Il1b 및 Il6의 발현은 뇌에서 FGF21을 과발현하는 SAMP8 마우스의 시상하부에서 감소되었다(도 20).

둘째, 우리는 비만과 당뇨병에 널리 사용되는 유전자 마우스 모델인 db/db 마우스를 사용하였다. 또한, 이들 마우스는 지방 조직 및 간과 같은 말초 조직뿐만 아니라 뇌에도 염증을 나타낸다(Dey et al, J. Neuroimmmunol. 2014). AAV9-CAG-moFGF21-dmiRT 벡터로 CSF 내 처리된 Db/db 마우스는 시상하부에서 Gfap, S100b, Aif1, Nfkb, Il1b 및 Il6의 감소된 발현을 보였다(도 19).

염증성 사이토카인의 발현 수준 감소와 함께 성상교세포 마커의 감소는 FGF21 유전자 요법 치료 후 해로운 성상교세포(A1 성상교세포)의 개체수가 감소하고 미세아교세포의 감소도 있음을 나타낸다.

많은 연구에서 염증 과정이 우울증의 병인학에서 중심적인 역할을 한다는 것을 뒷받침하였다(Wang et al. 2020 Front. Pharmacol., 2020년 2월 28일). 실시예 2, 3 및 4에서 관찰된 감소된 우울증 유사 행동과 함께, 이는 FGF21 유전자 요법이 항우울 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.

실시예 6. SAMP8 마우스에서 AAV1-CMV-moFGF21 벡터의 근육내 투여.

인지 기능 저하에 대한 FGF21을 사용한 골격근의 AAV 매개 유전 공학의 치료 가능성을 추가로 평가하기 위해 SAMP8 마우스를 사용하였다. SAMP8 마우스 모델은 8-12개월령까지 인지 감퇴를 나타낸다(Miyamoto, M., Physiol Behav. 1986; 38(3):399-406; Markowska, AL., Physiol Behav. 1998; 64(1): 15-26).

SAMP8 마우스에 3x1011 vg/마우스의 AAV1-CMV-moFGF21 벡터를 근육내 투여한다. 대조군으로서 미처리 SAMP8 및 SAMR1 동물을 사용하였다. Y-Maze, Open-Field, 새로운 물체 인식 테스트, 로타로드, 행 와이어 테스트, 그립 강도 테스트 및 Morris Water Maze와 같은 몇 가지 행동 및 신경근 테스트가 이 마우스에서 수행된다. 희생 시, 분석을 위해 혈청 및 조직 샘플을 채취한다. 이러한 샘플의 분석에는 신경 발생(Sox2, NeuN 및 Dcx와 같은 신경 마커의 발현), 신경염증(GFAP, Iba1 및 여러 사이토카인 수준의 발현), 시냅스 퇴화(시냅토피신 및 척추 밀도의 단백질 수준)에 대한 연구가 포함된다.

실시예 7. 알츠하이머병 마우스 모델에서 AAV1-CMV-moFGF21 벡터의 근육내 투여.

알츠하이머병에 대한 FGF21을 사용한 골격근의 AAV 매개 유전 공학의 치료 가능성을 평가하기 위해 3xTg-AD (B6;129Tg(APPSwe,tauP301L)1Lfa Psen1^tm1Mpm) 마우스 모델을 사용하였다. 3xTg-AD는 알츠하이머병의 널리 사용되는 마우스 모델로, 3개의 돌연변이 대립유전자 모두에 대해 동형접합체이고, Psen1 돌연변이에 대해 동형접합체이며, 동시 주입된 APPSwe 및 tauP301L 이식유전자에 대해 동형접합체이다(Belfiore, R., Aging Cell. 2019, 18(1):e12873)

3xTg-AD 마우스에 3x10¹¹ vg/마우스의 AAV1-CMV-moFGF21 벡터를 근육내 투여하였다. 대조군으로서, 처리되지 않은 3xTg-AD 동물을 사용하였다. Y-Maze, Open-Field, 새로운 물체 인식 테스트, 로타로드, 행 와이어 테스트, 그립 강도 테스트 및 Morris Water Maze와 같은 몇 가지 행동 및 신경근 테스트가 이 마우스에서 수행된다. 희생 시, 분석을 위해 혈청 및 조직 샘플을 채취한다. 이러한 샘플의 분석에는 신경발생(Sox2, NeuN 및 Dcx와 같은 신경 마커의 발현), 신경염증(GFAP, Iba1 및 여러 사이토카인 수준의 발현), 아밀로이드-베타 수준(가용성 아밀로이드 및 플라크), 시냅스 변성(시냅토파이신 및 척추 밀도의 단백질 수준)에 대한 연구, 타우 인산화 수준에 대한 연구가 포함된다.

실시예 8. AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 근육내 처리된 SAMP8 마우스에서 개선된 신경근 성능 및 인지

8주령 수컷 SAMP8 마우스에 3x1011 vg/마우스의 AAV1-CMV-moFGF21 벡터를 근육내 투여하였다. 대조군으로서, 처리되지 않은 SAMP8 및 SAMR1 동물을 사용하였다.

AAV1-CMV-moFGF21 처리된 SAMP8 마우스는 3개의 주사된 근육에서 코돈 최적화된 FGF21의 특이적 과발현 및 증가된 FGF21 순환 수준을 나타냈다(도 21 A-B).

AAV1-CMV-moFGF21 벡터 처리가 신경근 성능에 미치는 영향을 테스트하기 위해 로타로드 테스트를 수행하였다. 3x10¹¹ vg의 AAV1-CMV-moFGF21 벡터를 근육 투여한 SAMP8 마우스는 처리되지 않은 SAMP8 및 SAMR1보다 가속 로타로드에서 더 오래 머무를 수 있었고, 협응력 및 균형의 개선을 입증하였다(도 21C). 운동 학습 능력은 또한 후속 시도 동안 성능 향상을 검사하여 평가되었다. 현저하게, AAV1-FGF21 처리된 SAMP8 마우스는 처리되지 않은 SAMP8 및 SAMR1 대응물을 능가하였다(도 21D). 또한, FGF21을 코딩하는 벡터로 처리한 SAMP8 마우스의 인지 감퇴 예방을 새로운 물체 인식 테스트에서 추가로 확인하였다. 32주령까지 처리된 SAMP8 마우스는 처리되지 않은 SAMP8 마우스 및 대조군 SAMR1 마우스 모두와 비교하여 단기 및 장기 기억의 현저한 개선을 보였다(도 21E-F).

케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(Ccl19) 및 Il6의 발현을 통해 뇌의 염증을 분석하였다. Cccl19는 SAMP8의 신경병리학적 표현형에서 주요 역할을 하는 것으로 가정되었다(Carter TA. Genome Biol. 2005;6(6):R48). SAMP8은 SAMR1 마우스와 비교하여 피질 및 해마에서 현저하게 증가된 Ccl19 발현 수준을 보여주었다(도 22A). AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 SAMP8 마우스를 처리하면 이러한 뇌 영역에서 Ccl19 발현 수준이 정상화된다(도 22A). 더욱이, AAV1-FGF21-처리된 SAMP8은 해마에서 감소된 Il6 발현을 보였다(도 22B).

이러한 모든 결과는 AAV1-FGF21로 치료하면 SAMP8 마우스에서 신경근 성능, 운동 학습 및 기억력이 향상되고 뇌 염증이 감소함을 시사한다.

실시예 9. AV1-CMV-moFGF21 벡터로 근육 내 처리된 알츠하이머병 마우스 모델의 기억력 향상

8주령 수컷 3xTg-AD 마우스에 3x10¹¹ vg/마우스의 AAV1-CMV-moFGF21 벡터를 근육내 투여하였다. 대조군으로는 미처리 3xTG-AD 및 B6129SF2/J 동물을 사용하였다.

AAV1-CAG-moFGF21 벡터로 im 내 처리한 SAMP8 마우스에서 관찰한 것과 유사하게, 동일한 벡터를 사용한 3xTg-AD마우스의 골격근의 유전 공학은 또한 순환 FGF21 수준의 현저한 증가(도 23A) 및 주입된 근육에서 인자의 특이적 과발현(도 23B)을 매개하였다.

뇌에서 아밀로이드 플라크(아밀로이드-β(Aβ)로 구성된 1차)의 축적과 기억 상실은 알츠하이머병의 주요 특징이다(Belfiore R. et al. Aging Cell. 2019;18(1):e12873). AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 3xTg-AD 마우스를 처리하면 처리되지 않은 3xTg-AD 마우스와 비교하여 처리된 3xTg-AD 마우스에서 현저하게 개선된 단기 및 장기 기억에 의해 입증된 바와 같이 인지 저하가 배제되었다(도 23C-D). 참고로, AAV1-FGF21-처리된 3xTg-AD 마우스의 식별 지수는 대조군 B6129SF2/J 동물의 식별 지수와 유사하였다(도 23C-D). 더욱이, AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 3xTg-AD 마우스는 처리되지 않은 3xTg-AD 마우스와 비교하여 피질에서 현저하게 감소된 불용성 Aβ40 수준을 나타냈다(도 23E).

실시예 10. 다른 용량의 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 늙은 쥐의 신경근 성능 및 인지 개선

13개월 된 수컷 C57Bl6 마우스에 1×10¹¹ 또는 3×10¹¹ vg의 AAV1-CMV-moFGF21 벡터를 근육내 투여하였다. 처리되지 않은 연령 일치 대조군 동물이 대조군으로 사용되었다.

AAV1-CMV-moFGF21-처리된 마우스는 용량 의존적 방식으로 혈류로 FGF21의 분비를 보였다(도 24A). AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 처리된 늙은 마우스는 용량에 관계없이 개선된 협응, 균형 및 운동 학습을 보였다(도 24B-C). 또한, 1x10¹¹ 또는 3x10¹¹ vg의 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 늙은 마우스를 처리하면 단기 및 장기 기억이 현저하게 개선되었다(도 24D-E).

실시예 11. AAV1-CMV-moFGF21로 im 처리된 늙은 쥐의 신경변성 및 인지 저하의 배제에 관여하는 분자 메커니즘 및 뇌 영역

이전에 언급한 바와 같이, 전체 뇌 전사체 분석은 미토콘드리아 기능의 개선 및 산화 스트레스의 감소가 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 처리된 노령 마우스에서 신경변성 및 인지 저하의 억제를 매개함을 시사하였다(표 1). 다음으로, 우리는 AAV1-FGF21 처리된 마우스에서 인지 성능의 개선과 관련된 추가 분자 메커니즘을 해독할 뿐만 아니라 특별히 영향을 받는 뇌 영역을 특성화하였다.

qPCR에 의한 몇 가지 산화적 인산화(OXPHOS) 및 항산화 마커의 측정은 GSEA 결과를 더욱 확증하였다(도 25 및 26). 더욱이, qPCR 분석은 OXPHOS의 강화가 주로 피질에서 그리고 인지 기능에 관여하는 두 주요 뇌 영역인 해마(도 25)에서 그 정도는 덜한 것으로 나타났다. 상세하게는, 3×10¹¹ vg의 AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 늙은 동물은 연령이 일치하는 상대와 비교하여 피질에서 퍼옥시좀 증식자-활성화 수용체 감마 보조활성화자 1 알파 및 베타 (각각 Ppargc1a 및 Ppargc1b), 및 그들의 전사 표적 ATP Synthase F1 Subunit alpha (Atp5f1a), cytochrome c oxidase 1 (mt-co1) 및 cytochrome c oxidase subunit 6 (Cox6) 피질, 및 해마에서 Atp5f1a 및 사이토크롬 c 산화효소 소단위 5a(Cox5a)의 증가된 발현을 나타내었다(도 25)(Sahin, E. et al. Nature. 2011; 470(7334):359-65).

마찬가지로, 항산화 유전자 발현 (Jaiswal AK, 2004. Free Radic Biol Med 36:1199-1207; Lee JM, 2004. J Biochem Mol Biol 37:139-143) 및 Ppargc1a 표적이기도 한 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(Sod1) 및 카탈라아제(Cat)와 같은 활성산소 종 해독 효소를 암호화하는 주요 유전자의 유전자(Sahin, E. et al. Nature. 2011; 470( 7334):359-65)의 활성화를 협응력하는 전사 인자 NF-E2 관련 인자 2(Nrf2)의 발현 증가는 AAV1-CMV-moFGF21-처리된 늙은 마우스의 피질 및 해마에서 문서화되었다(도 26).

뇌는 에너지를 요구하는 기관이며 당분해, TCA 주기 및 산화적 인산화를 통한 효율적인 ATP 생산에 크게 의존한다(Butterfield DA. Nat Rev Neurosci 2019 Mar;20(3):148-160). 해당과정이 OXPHOS에 대한 포도당의 대사를 담당한다는 점을 감안하여 주요 해당과정 관련 유전자의 발현 수준을 결정하였다. AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 처리한 늙은 쥐는 피질에서 GAPDH(glycerldehyde-3-phosphate dehydrogenase), hexokinase 1(Hk1), Pfkp(phosphofructokinase)의 혈소판 이소형, glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase 1 및 2(각각 Gpd1 및 Gpd2) 및 해마에서 피루베이트 키나아제 M(Pkm) 및 Gpd2의 발현 증가를 보였으며, 이러한 뇌 영역에서 향상된 해당 작용을 제안된다(도 27).

이러한 모든 결과는 AAV1-CMV-moFGF21로 늙은 쥐를 치료하면 노화와 관련된 포도당 대사 감소 및 미토콘드리아 기능 장애를 배제하여 신경 기능을 위한 효율적인 ATP 생산을 보장할 수 있음을 시사한다.

미토콘드리아 섭동 및 감소된 ATP 생산이 시냅스 기능 장애 및 퇴화에 기여하는 것으로 보고되었으며, 이는 인지 결핍 및 기억 상실과 밀접한 관련이 있음을 언급할 가치가 있다(Butterfield DA. Nat Rev Neurosci 2019 Mar;20(3):148-160 ;Cai Q. J Alzheimers Dis. 2017;57(4):1087-1103). 눈에 띄게, 25개월령까지 AAV1-CMV-moFGF21로 처리된 늙은 동물은 주요 시냅스 단백질의 강력한 증가된 발현을 보였다(도 28). 구체적으로, 알파-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이속사졸 프로프리온산(AMPA) 유형의 시냅토파이신(Syp), GluR1 및 GluR2 서브유닛(각각 Gria1 및 Gria2) 및 N-메틸-d-아스파르테이트(NMDA) 유형(Grin1, Grin2a, Grin2b) 이온성 글루타메이트 수용체의 NR1, N2A 및 N2B 서브유닛의 발현 수준은, 피질에서 증가하였다(도 28). Gria2는 또한 해마에서 증가하였다(도 28). 더욱이, 활성화 전사 인자 4(Atf4), 시냅스 가소성 및 기억의 조절을 포함하는 광범위한 활동에 관여하는 핵심 전사 인자의 증가된 발현 수준이 피질에서 검출되었다(도 28) (Ill-Raga g. Hippocampus 2013; 23:431-436; Liu J. Front Cell Neurosci. 2014; 8:177). 주요 시냅스 단백질의 향상된 발현은 시냅스 가소성을 향상시키고 결과적으로 피질 및 해마 기능을 향상시킬 것이다.

뇌 자가포식 능력은 나이가 들면서 감소하고 신경변성을 유발하는 것으로 보고되었다(Lipinski MM. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107:14164-9; Hara T. Nature 2006; 441:885-9; Komatsu M. Nature 2006; 441 :880-4). AAV1-CMV-moFGF21 벡터로 im 처리된 늙은 마우스는 피질에서 자가포식 마커 p62(Sqstm1 유전자에 의해 암호화됨) 및 자가포식 관련 5(Atg5)의 발현 증가를 보였다(도 29). 마찬가지로 소포체(ER)도 세포의 항상성에 필수적인 역할을 한다. 항-아폽토시스 샤페론 BiP(GRP78로도 알려짐)의 유도는 세포가 ER 스트레스를 견디기 위한 주요 세포 보호 메커니즘을 나타낼 수 있다(A.S. Lee, Trends Biochem. Sci. 26 (2001) 504-510). 이와 관련하여, AAV1-FGF21 처리된 늙은 마우스의 피질에서 증가된 BiP 발현이 관찰되었다(도 29). 그의 발현이 또한 AAV1-CMV-moFGF21로 im 처리된 늙은 마우스의 피질에서 유도된 Atf4(도 28)는 BiP 발현을 상향조절하는 것으로 보고되었다(Luo S. J Biol Chem. 2003; 278(39):37375-85).

마지막으로, 뇌 콜레스테롤 항상성 이상(특히 뉴런의 높은 농도)과 알츠하이머병, 파킨슨병 및 헌팅턴병을 비롯한 여러 신경퇴행성 장애 사이의 강한 연관성이 관찰되었다(Vance JE. Dis Model Mech 2012; 5:746-55). Cyp46a1에 의해 암호화된 콜레스테롤 24-수산화효소는 뇌에서 콜레스테롤 유출을 조절하여 뇌 콜레스테롤 항상성을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. 더욱이, 증가하는 증거는 Cyp46a1이 신경퇴행성 장애의 병인 및 진행에 역할을 하며, 뇌에서 그 수준을 증가시키는 것이 신경보호적이라는 것을 시사한다(Kacher R. Brain. 2019;142(8):2432-2450; Djelti F. Brain 2015;138(8편):2383-98). 일치하게, AAV1-CMV-moFGF21 벡터로의 처리는 늙은 마우스의 피질에서 Cyp46a1의 발현을 증가시켰다(도 30).

종합하면, 이러한 결과는 FGF21 유전자 치료가 미토콘드리아 기능 개선, 포도당 대사 및 자가포식 증가, 산화 및 ER 스트레스 감소, 콜레스테롤 항상성 및 노령 마우스의 피질 및 해마에서의 시냅스 기능 개선을 통해 신경변성 및 인지 저하를 억제함을 나타낸다.

실시예 12. FGF21을 인코딩하는 AAV 벡터로 CSF 내 처리된 HFD 공급 수컷 마우스의 불안 대응 및 신경근 성능 및 인지 개선

우리는 다음으로 AAV1-CAG-moFGF21 벡터의 CSF 내 투여가 비만 및 인슐린 저항성 수컷 마우스에서 치료 효과를 중재할 수 있는지 여부를 평가하였다. 이를 위해 8주령 수컷 C57Bl6 마우스에게 3개월 동안 HFD를 공급하였다. 추적 관찰 첫 3개월 동안 음식을 먹인 동물의 체중은 32% 증가한 반면 HFD를 먹인 동물은 비만이 되었다(84% 체중 증가). 이어서, 비만 동물에게 5x10⁹ 또는 1x10¹⁰ vg/마우스의 AAV1-CAG-moFGF21 벡터를 CSF내 투여하였다. 처리되지 않은 식이 및 HFD 공급 집단이 대조군으로 사용되었다. 초기에, AAV1 벡터로 처리된 HFD-급여 마우스는 체중이 감소하여, 나이에 맞는 음식을 먹은 마우스와 유사한 수준에 도달하였다(도 31A). AAV1 처리 2개월 후, HFD 공급 마우스의 체중은 안정화되었고 실험의 후속 조치 동안(~11개월) 유사한 수준으로 유지되었다(도 31A).

AAV1-CAG-moFGF21 벡터로 CSF 내 처리한 db/db 수컷 마우스에서 관찰한 것과 유사하게, 동일한 벡터를 사용하여 HFD를 먹인 마우스의 뇌 유전 공학은 다른 뇌 영역에서 인자의 특정 과발현을 매개하였다(도 31B).

신경근 성능을 평가하기 위해 추적 관찰 기간이 끝날 때 오픈 필드 테스트를 수행하였다. 오픈 필드 테스트 동안, 2회 용량의 AAV1 벡터와 함께 CSF내 투여된 HFD 공급 마우스는 증가된 운동 활성을 보였다(도 32). 총 이동 거리에서 관찰된 증가는 또한 AAV 처리 마우스에서 우울증과 유사한 행동의 개선을 나타낸다. 불안의 척도로, 오픈 필드의 중앙과 경계에서 보낸 거리와 시간을 측정했으며, 데이터는 AAV1-CAG-moFGF21 처리된 마우스가 HFD를 먹인 대조군 마우스보다 중앙에서 더 많은 시간을 보냈고 경계에서 더 적은 시간을 보냈다는 것을 보여주었고(도 33A-E), 이는 HFD 대조군 마우스보다 덜 불안한 행동을 나타낸다.

인지 성능에 대한 AAV1-CAG-FGF21 벡터를 사용한 CSF 내 처리의 효과를 테스트하기 위해, 새로운 물체 인식 및 Barnes 미로 테스트를 수행하였다. 새로운 물체 인식 시험에서, AAV1-CAG-FGF21 벡터의 두 용량을 받은 마우스는 단기 및 장기 기억 시험 모두에서 음식을 먹인 대조군 집단과 동등한 인식 지수를 가졌으며(도 34), 반면에 HFD를 먹인 대조군 마우스는 기억력 손상을 나타내는 인지 지수 손상을 보였다(도 34). AAV1 intra-CSF 처리된 마우스의 학습 능력은 Barnes 미로에서 측정되었다. 2회 투여량의 AAV1 벡터로 처리된 HFD 공급 마우스의 구멍에 들어가는 시간(도 35A) 및 학습 기울기(도 35B)에서 관찰된 감소는 AAV-1 처리된 마우스가 대조군 HFD공급 마우스 보다 증가된 학습 능력을 가짐을 나타내었으며, 사료를 먹인 대조군 마우스와 비슷한 수준에 도달하였다.

이러한 모든 결과는 FGF21 암호화 AAV 벡터를 사용한 CSF 내 치료가 당뇨병 및 비만과 관련된 신경근 및 인지 저하를 개선했음을 시사한다.

실시예 13. FGF21을 인코딩하는 AAV 벡터로 처리된 늙은 쥐의 신경근 성능 및 인지 개선

FGF21을 사용한 CSF 내 유전자 요법이 노령 동물에서 치료 효과를 발휘할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 13개월 된 수컷 C57Bl6 마우스에 5x10⁹ 및 1x10¹⁰ vg/마우스의 AAV1-CAG-moFGF21 벡터를 CSF 내 투여하였다. 처리되지 않은 집단은 대조군으로 사용되었다. 모든 실험 그룹은 모든 실험 동안 사료를 먹였다.

신경근 성능을 평가하기 위해 로타로드 테스트는 23개월령의 모든 그룹에서 수행되었다. 모든 용량의 AAV1-CAG-moFGF21로 CSF 내 처리된 늙은 마우스는 처리되지 않은 오래된 대응물보다 가속 로타로드에서 더 오래 머무를 수 있었고(도 36A), 협응력 및 균형의 개선을 입증하였다. 더욱이, 상이한 시험 동안, AAV1 처리된 마우스에서 로타로드를 떨어뜨리는 시간에서 시험 의존적 개선이 있었고(도 36B-C), 이는 오래 처리된 마우스에서 강화된 학습을 나타낸다.

더구나, 생후 24-25개월까지 FGF21-암호화 벡터의 5x10⁹ vg/마우스로 처리된 마우스는 새로운 물체 인식 테스트 단기 및 장기 시험 모두에서(도 37A-B), 연령 일치 집단 미처리 마우스보다 현저하게 더 잘 수행하였으며, AAV1-CAG-moFGF21 벡터로 치료하면 신경근 기능이 향상되고 늙은 쥐의 학습과 장단기 기억력이 향상된다는 것을 시사한다.

서열

호모 사피엔스 FGF21의 아미노산 서열 (서열번호 1)

MDSDETGFEHSGLWVSVLAGLLLGACQAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS

호모 사피엔스 FGF21의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 4)

ATGGACTCGGACGAGACCGGGTTCGAGCACTCAGGACTGTGGGTTTCTGTGCTGGCTGGTCTTCTGCTGGGAGCCTGCCAGGCACACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACACAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGAGCCCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTTCCTGTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCGCTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTCTTGAGGACGGATACAATGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCACCTGCCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGACCCTGCACCCCGAGGACCAGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCCCCGCACTCCCGGAGCCACCCGGAATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGATGTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCAGCTACGCTTCCTGA

호모 사피엔스 FGF21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열 - 변형 1 (서열번호 5)

ATGGATTCTGATGAGACAGGCTTCGAGCACAGCGGCCTGTGGGTTTCAGTTCTGGCTGGACTGCTGCTGGGAGCCTGTCAGGCACACCCTATTCCAGATAGCAGCCCTCTGCTGCAGTTCGGCGGACAAGTGCGGCAGAGATACCTGTACACCGACGACGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAAATCAGAGAGGATGGCACAGTTGGCGGAGCCGCCGATCAGTCTCCTGAATCTCTGCTCCAGCTGAAGGCCCTGAAGCCTGGCGTGATCCAGATCCTGGGCGTGAAAACCAGCCGGTTCCTGTGCCAAAGACCTGACGGCGCCCTGTATGGCAGCCTGCACTTTGATCCTGAGGCCTGCAGCTTCAGAGAGCTGCTGCTTGAGGACGGCTACAACGTGTACCAGTCTGAGGCCCATGGCCTGCCTCTGCATCTGCCTGGAAACAAGAGCCCTCACAGAGATCCCGCTCCTAGAGGCCCTGCCAGATTTCTGCCTCTTCCTGGATTGCCTCCTGCTCTGCCAGAGCCTCCTGGAATTCTGGCTCCTCAGCCTCCTGATGTGGGCAGCTCTGATCCTCTGAGCATGGTCGGACCTAGCCAGGGCAGATCTCCTAGCTACGCCTCTTGA

호모 사피엔스 FGF21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열 - 변형 2 (서열번호 6)

ATGGACAGCGATGAAACCGGGTTCGAGCACAGCGGTCTGTGGGTGTCCGTGCTGGCCGGACTGCTCCTGGGAGCCTGTCAGGCGCACCCCATCCCTGACTCCTCGCCGCTGCTGCAATTCGGCGGACAAGTCCGCCAGAGATACCTGTACACCGACGACGCCCAGCAGACCGAAGCCCACCTGGAAATTCGGGAGGACGGGACTGTGGGAGGCGCTGCAGATCAGTCACCCGAGTCCCTCCTCCAACTGAAGGCCTTGAAGCCCGGCGTGATTCAGATCCTGGGCGTGAAAACTTCCCGCTTCCTTTGCCAACGGCCGGATGGAGCTCTGTACGGATCCCTGCACTTCGACCCCGAAGCCTGCTCATTCCGCGAGCTGCTCCTTGAGGACGGCTATAACGTGTACCAGTCTGAGGCCCATGGACTCCCCCTGCATCTGCCCGGCAACAAGTCCCCTCACCGGGATCCTGCCCCAAGAGGCCCAGCTCGGTTTCTGCCTCTGCCGGGACTGCCTCCAGCGTTGCCCGAACCCCCTGGTATCCTGGCCCCGCAACCACCTGACGTCGGTTCGTCGGACCCGCTGAGCATGGTCGGTCCGAGCCAGGGAAGGTCCCCGTCCTACGCATCCTGA

호모 사피엔스 FGF21의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열 - 변형 3 (서열번호 7)

ATGGATTCCGACGAAACTGGATTTGAACATTCAGGGCTGTGGGTCTCTGTGCTGGCTGGACTGCTGCTGGGGGCTTGTCAGGCTCACCCCATCCCTGACAGCTCCCCTCTGCTGCAGTTCGGAGGACAGGTGCGGCAGAGATACCTGTATACCGACGATGCCCAGCAGACAGAGGCACACCTGGAGATCAGGGAGGACGGAACCGTGGGAGGAGCAGCCGATCAGTCTCCCGAGAGCCTGCTGCAGCTGAAGGCCCTGAAGCCTGGCGTGATCCAGATCCTGGGCGTGAAGACATCTCGGTTTCTGTGCCAGCGGCCCGACGGCGCCCTGTACGGCTCCCTGCACTTCGATCCCGAGGCCTGTTCTTTTAGGGAGCTGCTGCTGGAGGACGGCTACAACGTGTATCAGAGCGAGGCACACGGCCTGCCACTGCACCTGCCTGGCAATAAGTCCCCTCACCGCGATCCAGCACCCAGGGGCCCAGCACGCTTCCTGCCTCTGCCAGGCCTGCCCCCTGCCCTGCCAGAGCCACCCGGCATCCTGGCCCCCCAGCCTCCAGATGTGGGCTCCAGCGATCCTCTGTCAATGGTGGGGCCAAGTCAGGGGCGGAGTCCTTCATACGCATCATAA

뮤린 코돈-최적화된 FGF21의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 9)

ATGGAATGGATGAGAAGCAGAGTGGGCACCCTGGGCCTGTGGGTGCGACTGCTGCTGGCTGTGTTTCTGCTGGGCGTGTACCAGGCCTACCCCATCCCTGACTCTAGCCCCCTGCTGCAGTTTGGCGGACAAGTGCGGCAGAGATACCTGTACACCGACGACGACCAGGACACCGAGGCCCACCTGGAAATCCGCGAGGATGGCACAGTCGTGGGCGCTGCTCACAGAAGCCCTGAGAGCCTGCTGGAACTGAAGGCCCTGAAGCCCGGCGTGATCCAGATCCTGGGCGTGAAGGCCAGCAGATTCCTGTGCCAGCAGCCTGACGGCGCCCTGTACGGCTCTCCTCACTTCGATCCTGAGGCCTGCAGCTTCAGAGAGCTGCTGCTGGAGGACGGCTACAACGTGTACCAGTCTGAGGCCCACGGCCTGCCCCTGAGACTGCCTCAGAAGGACAGCCCTAACCAGGACGCCACAAGCTGGGGACCTGTGCGGTTCCTGCCTATGCCTGGACTGCTGCACGAGCCCCAGGATCAGGCTGGCTTTCTGCCTCCTGAGCCTCCAGACGTGGGCAGCAGCGACCCTCTGAGCATGGTGGAACCTCTGCAGGGCAGAAGCCCCAGCTACGCCTCTTGA

CAG 프로모터의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 27)

GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAG

CMV 프로모터의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 28)

GTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT

CMV 인핸서의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 29)

GGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG

CMV 프로모터 및 CMV 인핸서 서열 (서열번호 34)

GGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT

AAV2 5’ ITR (서열번호 30)

GCGCGCTC GCTCGCTCAC TGAGGCCGCC CGGGCAAAGC

CCGGGCGTCG GGCGACCTTT GGTCGCCCGG CCTCAGTGAG CGAGCGAGCG

CGCAGAGAGG GAGTGGCCAA CTCCATCACT AGGGGTTCCT

AAV2 3’ ITR (서열번호 31)

AGGAACCCCT AGTGATGGAG TTGGCCACTC CCTCTCTGCG

CGCTCGCTCG CTCACTGAGG CCGGGCGACC AAAGGTCGCC CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCA GTGAGCGAGC GAGCGCGC

토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호 (polyA 신호를 포함하는 토끼 베타-글로빈의 3' UTR 및 플랭킹 영역) (서열번호 33)

GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATC

miRT 서열

miRT-122a (서열번호 12): 5’ CAAACACCATTGTCACACTCCA 3’, 간에서 발현되는 microRNA-122a(miRBase 데이터베이스 MI0000442에 대한 수탁 번호)에 대한 표적.

miRT-152 (서열번호 14): 5’ CCAAGTTCTGTCATGCACTGA 3’, 간에서 발현되는 microRNA-152(MI0000462)에 대한 표적.

miRT-199a-5p (서열번호 15): 5’ GAACAGGTAGTCTGAACACTGGG 3’, 간에서 발현되는 마이크로RNA 199a(MI0000242)에 대한 표적.

miRT-199a-3p (서열번호 16): 5’ TAACCAATGTGCAGACTACTGT 3’, 간에서 발현되는 microRNA-199a(MI0000242)에 대한 표적.

miRT-215 (서열번호 17): 5’ GTCTGTCAATTCATAGGTCAT 3’, 간에서 발현되는 microRNA-215(MI0000291)에 대한 표적.

miRT-192 (서열번호 18): 5’ GGCTGTCAATTCATAGGTCAG 3’, 간에서 발현되는 microRNA-192(MI0000234)에 대한 표적.

miRT-148a (서열번호 19): 5’ ACAAAGTTCTGTAGTGCACTGA 3’, 간에서 발현되는 microRNA-148a(MI0000253)에 대한 표적.

miRT-194 (서열번호 20): 5’ TCCACATGGAGTTGCTGTTACA 3’, 간에서 발현되는 microRNA-194(MI0000488)에 대한 표적.

miRT-133a (서열번호 21): 5’ CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA 3’, 심장에서 발현되는 microRNA-133a(MI0000450)에 대한 표적.

miRT-206 (서열번호 22): 5’ CCACACACTTCCTTACATTCCA 3’, 심장에서 발현되는 microRNA-206 (MI0000490)에 대한 표적.

miRT-1 (서열번호 13): 5’ TTACATACTTCTTTACATTCCA 3’, 심장에서 발현되는 microRNA-1(MI0000651)에 대한 표적.

miRT-208a-5p (서열번호 23): 5’ GTATAACCCGGGCCAAAAGCTC 3’, 심장에서 발현되는 microRNA-208a(MI0000251)에 대한 표적.

miRT-208a-3p (서열번호 24): 5’ ACAAGCTTTTTGCTCGTCTTAT 3’, 심장에서 발현되는 microRNA-208a(MI0000251)에 대한 표적.

miRT-499-5p (서열번호 25): 5’ AAACATCACTGCAAGTCTTAA 3’, 심장에서 발현되는 microRNA-499(MI0003183)에 대한 표적.

pAAV-CAG-moFGF21-dmiRT (서열번호 35)

1 AGTGAGCGAG CGAGCGCGCA GCTGCATTAA TGAATCGGCC AACGCGCGGG

51 GAGAGGCGGT TTGCGTATTG GGCGCTCTTC CGCTTCCTCG CTCACTGACT

101 CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG CTGCGGCGAG CGGTATCAGC TCACTCAAAG

151 GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG GATAACGCAG GAAAGAACAT

201 GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA CCGTAAAAAG GCCGCGTTGC

251 TGGCGTTTTT CCATAGGCTC CGCCCCCCTG ACGAGCATCA CAAAAATCGA

301 CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA GGACTATAAA GATACCAGGC

351 GTTTCCCCCT GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC

401 TTACCGGATA CCTGTCCGCC TTTCTCCCTT CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT

451 CATAGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA

501 GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA GCCCGACCGC TGCGCCTTAT

551 CCGGTAACTA TCGTCTTGAG TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA

601 CTGGCAGCAG CCACTGGTAA CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG

651 TGCTACAGAG TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA CTACGGCTAC ACTAGAAGAA

701 CAGTATTTGG TATCTGCGCT CTGCTGAAGC CAGTTACCTT CGGAAAAAGA

751 GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT

801 TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA TTACGCGCAG AAAAAAAGGA TCTCAAGAAG

851 ATCCTTTGAT CTTTTCTACG GGGTCTGACG CTCAGTGGAA CGAAAACTCA

901 CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT GAGATTATCA AAAAGGATCT TCACCTAGAT

951 CCTTTTAAAT TAAAAATGAA GTTTTAAATC AATCTAAAGT ATATATGAGT

1001 AAACTTGGTC TGACAGTTAC CAATGCTTAA TCAGTGAGGC ACCTATCTCA

1051 GCGATCTGTC TATTTCGTTC ATCCATAGTT GCCTGACTCC CCGTCGTGTA

1101 GATAACTACG ATACGGGAGG GCTTACCATC TGGCCCCAGT GCTGCAATGA

1151 TACCGCGAGA CCCACGCTCA CCGGCTCCAG ATTTATCAGC AATAAACCAG

1201 CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT CCTGCAACTT TATCCGCCTC

1251 CATCCAGTCT ATTAATTGTT GCCGGGAAGC TAGAGTAAGT AGTTCGCCAG

1301 TTAATAGTTT GCGCAACGTT GTTGCCATTG CTACAGGCAT CGTGGTGTCA

1351 CGCTCGTCGT TTGGTATGGC TTCATTCAGC TCCGGTTCCC AACGATCAAG

1401 GCGAGTTACA TGATCCCCCA TGTTGTGCAA AAAAGCGGTT AGCTCCTTCG

1451 GTCCTCCGAT CGTTGTCAGA AGTAAGTTGG CCGCAGTGTT ATCACTCATG

1501 GTTATGGCAG CACTGCATAA TTCTCTTACT GTCATGCCAT CCGTAAGATG

1551 CTTTTCTGTG ACTGGTGAGT ACTCAACCAA GTCATTCTGA GAATAGTGTA

1601 TGCGGCGACC GAGTTGCTCT TGCCCGGCGT CAATACGGGA TAATACCGCG

1651 CCACATAGCA GAACTTTAAA AGTGCTCATC ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG

1701 GCGAAAACTC TCAAGGATCT TACCGCTGTT GAGATCCAGT TCGATGTAAC

1751 CCACTCGTGC ACCCAACTGA TCTTCAGCAT CTTTTACTTT CACCAGCGTT

1801 TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT GCCGCAAAAA AGGGAATAAG

1851 GGCGACACGG AAATGTTGAA TACTCATACT CTTCCTTTTT CAATATTAT

1901 GAAGCATTTA TCAGGGTTAT TGTCTCATGA GCGGATACAT ATTTGAATGT

1951 ATTTAGAAAA ATAAACAAAT AGGGGTTCCG CGCACATTTC CCCGAAAAGT

2001 GCCACCTGAC GTCTAAGAAA CCATTATTAT CATGACATTA ACCTATAAAA

2051 ATAGGCGTAT CACGAGGCCC TTTCGTCTCG CGCGTTTCGG TGATGACGGT

2101 GAAAACCTCT GACACATGCA GCTCCCGGAG ACGGTCACAG CTTGTCTGTA

2151 AGCGGATGCC GGGAGCAGAC AAGCCCGTCA GGGCGCGTCA GCGGGTGTTG

2201 GCGGGTGTCG GGGCTGGCTT AACTATGCGG CATCAGAGCA GATTGTACTG

2251 AGAGTGCACC ATATGCGGTG TGAAATACCG CACAGATGCG TAAGGAGAAA

2301 ATACCGCATC AGGCGATTCC AACATCCAAT AAATCATACA GGCAAGGCAA

2351 AGAATTAGCA AAATTAAGCA ATAAAGCCTC AGAGCATAAA GCTAAATCGG

2401 TTGTACCAAA AACATTATGA CCCTGTAATA CTTTTGCGGG AGAAGCCTTT

2451 ATTTCAACGC AAGGATAAAA ATTTTTAGAA CCCTCATATA TTTTAAATGC

2501 AATGCCTGAG TAATGTGTAG GTAAAGATTC AAACGGGTGA GAAAGGCCGG

2551 AGACAGTCAA ATCACCATCA ATATGATATT CAACCGTTCT AGCTGATAAA

2601 TTCATGCCGG AGAGGGTAGC TATTTTTGAG AGGTCTCTAC AAAGGCTATC

2651 AGGTCATTGC CTGAGAGTCT GGAGCAAACA AGAGAATCGA TGAACGGTAA

2701 TCGTAAAACT AGCATGTCAA TCATATGTAC CCCGGTTGAT AATCAGAAAA

2751 GCCCCAAAAA CAGGAAGATT GTATAAGCAA ATATTTAAAT TGTAAGCGTT

2801 AATATTTTGT TAAAATTCGC GTTAAATTTT TGTTAAATCA GCTCATTTTT

2851 TAACCAATAG GCCGAAATCG GCAAAATCCC TTATAAATCA AAAGAATAGA

2901 CCGAGATAGG GTTGAGTGTT GTTCCAGTTT GGAACAAGAG TCCACTATTA

2951 AAGAACGTGG ACTCCAACGT CAAAGGGCGA AAAACCGTCT ATCAGGGCGA

3001 TGGCCCACTA CGTGAACCAT CACCCTAATC AAGTTTTTTG GGGTCGAGGT

3051 GCCGTAAAGC ACTAAATCGG AACCCTAAAG GGAGCCCCCG ATTTAGAGCT

3101 TGACGGGGAA AGCCGGCGAA CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA AGAAAGCGAA

3151 AGGAGCGGGC GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT AGCGGTCACG CTGCGCGTAA

3201 CCACCACACC CGCCGCGCTT AATGCGCCGC TACAGGGCGC GTACTATGGT

3251 TGCTTTGACG AGCACGTATA ACGTGCTTTC CTCGTTAGAA TCAGAGCGGG

3301 AGCTAAACAG GAGGCCGATT AAAGGGATTT TAGACAGGAA CGGTACGCCA

3351 GAATCCTGAG AAGTGTTTTT ATAATCAGTG AGGCCACCGA GTAAAAGAGT

3401 CTGTCCATCA CGCAAATTAA CCGTTGTCGC AATACTTCTT TGATTAGTAA

3451 TAACATCACT TGCCTGAGTA GAAGAACTCA AACTATCGGC CTTGCTGGTA

3501 ATATCCAGAA CAATATTACC GCCAGCCATT GCAACGGAAT CGCCATTCGC

3551 CATTCAGGCT GCGCAACTGT TGGGAAGGGC GATCGGTGCG GGCCTCTTCC

3601 ACTGAGGCCC AGCTGCGCGC TCGCTCGCTC ACTGAGGCCG CCCGGGCAAA

3651 GCCCGGGCGT CGGGCGACCT TTGGTCGCCC GGCCTCAGTG AGCGAGCGAG

3701 CGCGCAGAGA GGGAGTGGCC AACTCCATCA CTAGGGGTTC CTTGTAGTTA

3751 ATGATTAACC CGCCATGCTA CTTATCTACT CGACATTGAT TATTGACTAG

3801 TTATTAATAG TAATCAATTA CGGGGTCATT AGTTCATAGC CCATATATGG

3851 AGTTCCGCGT TACATAACTT ACGGTAAATG GCCCGCCTGG CTGACCGCCC

3901 AACGACCCCC GCCCATTGAC GTCAATAATG ACGTATGTTC CCATAGTAAC

3951 GCCAATAGGG ACTTTCCATT GACGTCAATG GGTGGAGTAT TTACGGTAAA

4001 CTGCCCACTT GGCAGTACAT CAAGTGTATC ATATGCCAAG TACGCCCCCT

4051 ATTGACGTCA ATGACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCATTATG CCCAGTACAT

4101 GACCTTATGG GACTTTCCTA CTTGGCAGTA CATCTACGTA TTAGTCATCG

4151 CTATTACCAT GGTCGAGGTG AGCCCCACGT TCTGCTTCAC TCTCCCCATC

4201 TCCCCCCCCT CCCCACCCCC AATTTTGTAT TTATTTATTT TTTAATTATT

4251 TTGTGCAGCG ATGGGGGCGG GGGGGGGGGG GGGGCGCGCG CCAGGCGGGG

4301 CGGGGCGGGG CGAGGGGCGG GGCGGGGCGA GGCGGAGAGG TGCGGCGGCA

4351 GCCAATCAGA GCGGCGCGCT CCGAAAGTTT CCTTTTATGG CGAGGCGGCG

4401 GCGGCGGCGG CCCTATAAAA AGCGAAGCGC GCGGCGGGCG GGAGTCGCTG

4451 CGTTGCCTTC GCCCCGTGCC CCGCTCCGCG CCGCCTCGCG CCGCCCGCCC

4501 CGGCTCTGAC TGACCGCGTT ACTCCCACAG GTGAGCGGGC GGGACGGCCC

4551 TTCTCCTCCG GGCTGTAATT AGCGCTTGGT TTAATGACGG CTTGTTTCTT

4601 TTCTGTGGCT GCGTGAAAGC CTTGAGGGGC TCCGGGAGGG CCCTTTGTGC

4651 GGGGGGAGCG GCTCGGGGGG TGCGTGCGTG TGTGTGTGCG TGGGGAGCGC

4701 CGCGTGCGGC TCCGCGCTGC CCGGCGGCTG TGAGCGCTGC GGGCGCGGCG

4751 CGGGGCTTTG TGCGCTCCGC AGTGTGCGCG AGGGGAGCGC GGCCGGGGGC

4801 GGTGCCCCGC GGTGCGGGGG GCTGCGAGGG GAACAAAGGC TGCGTGCGGG

4851 GTGTGTGCGT GGGGGGGTGA GCAGGGGGTG TGGGCGCGTC GGTCGGGCTG

4901 CAACCCCCCC TGCACCCCCC TCCCCGAGTT GCTGAGCACG GCCCGGCTTC

4951 GGGTGCGGGG CTCCGTACGG GGCGTGGCGC GGGGCTCGCC GTGCCGGGCG

5001 GGGGGTGGCG GCAGGTGGGG GTGCCGGGCG GGGCGGGGCC GCCTCGGGCC

5051 GGGGAGGGCT CGGGGGAGGG GCGCGGCGGC CCCCGGAGCG CCGGCGGCTG

5101 TCGAGGCGCG GCGAGCCGCA GCCATTGCCT TTTATGGTAA TCGTGCGAGA

5151 GGGCGCAGGG ACTTCCTTTG TCCCAAATCT GTGCGGAGCC GAAATCTGGG

5201 AGGCGCCGCC GCACCCCCTC TAGCGGGCGC GGGGCGAAGC GGTGCGGCGC

5251 CGGCAGGAAG GAAATGGGCG GGGAGGGCCT TCGTGCGTCG CCGCGCCGCC

5301 GTCCCCTTCT CCCTCTCCAG CCTCGGGGCT GTCCGCGGGG GGACGGCTGC

5351 CTTCGGGGGG GACGGGGCAG GGCGGGGTTC GGCTTCTGGC GTGTGACCGG

5401 CGGCTCTAGA GCCTCTGCTA ACCATGTTCA TGCCTTCTTC TTTTTCCTAC

5451 AGCTCCTGGG CAACGTGCTG GTTATTGTGC TGTCTCATCA TTTTGGCAAA

5501 GAATTGATTA ATTCGAGCGA ACGCGTCGAG TCGCTCGGTA CGATTTAAAT

5551 TGAATTGGCC TCGAGCGCAA GCTTGAGCTA GCGCCACCAT GGAATGGATG

5601 AGAAGCAGAG TGGGCACCCT GGGCCTGTGG GTGCGACTGC TGCTGGCTGT

5651 GTTTCTGCTG GGCGTGTACC AGGCCTACCC CATCCCTGAC TCTAGCCCCC

5701 TGCTGCAGTT TGGCGGACAA GTGCGGCAGA GATACCTGTA CACCGACGAC

5751 GACCAGGACA CCGAGGCCCA CCTGGAAATC CGCGAGGATG GCACAGTCGT

5801 GGGCGCTGCT CACAGAAGCC CTGAGAGCCT GCTGGAACTG AAGGCCCTGA

5851 AGCCCGGCGT GATCCAGATC CTGGGCGTGA AGGCCAGCAG ATTCCTGTGC

5901 CAGCAGCCTG ACGGCGCCCT GTACGGCTCT CCTCACTTCG ATCCTGAGGC

5951 CTGCAGCTTC AGAGAGCTGC TGCTGGAGGA CGGCTACAAC GTGTACCAGT

6001 CTGAGGCCCA CGGCCTGCCC CTGAGACTGC CTCAGAAGGA CAGCCCTAAC

6051 CAGGACGCCA CAAGCTGGGG ACCTGTGCGG TTCCTGCCTA TGCCTGGACT

6101 GCTGCACGAG CCCCAGGATC AGGCTGGCTT TCTGCCTCCT GAGCCTCCAG

6151 ACGTGGGCAG CAGCGACCCT CTGAGCATGG TGGAACCTCT GCAGGGCAGA

6201 AGCCCCAGCT ACGCCTCTTG AGAATGCGGG CCCGGTACCC CCGACGCGGC

6251 CGCTAATTCT AGATCGCGAA CAAACACCAT TGTCACACTC CAGTATACAC

6301 AAACACCATT GTCACACTCC AGATATCACA AACACCATTG TCACACTCCA

6351 AGGCGAACAA ACACCATTGT CACACTCCAA GGCTATTCTA GATCGCGAAT

6401 TACATACTTC TTTACATTCC AGTATACATT ACATACTTCT TTACATTCCA

6451 GATATCATTA CATACTTCTT TACATTCCAA GGCGAATTAC ATACTTCTTT

6501 ACATTCCAAG GCTACCTGAG GCCCGGGGGT ACCTCTTAAT TAACTGGCCT

6551 CATGGGCCTT CCGCTCACTG CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC

6601 CAGTCAGGTG CAGGCTGCCT ATCAGAAGGT GGTGGCTGGT GTGGCCAATG

6651 CCCTGGCTCA CAAATACCAC TGAGATCTTT TTCCCTCTGC CAAAAATTAT

6701 GGGGACATCA TGAAGCCCCT TGAGCATCTG ACTTCTGGCT AATAAAGGAA

6751 ATTTATTTTC ATTGCAATAG TGTGTTGGAA TTTTTTGTGT CTCTCACTCG

6801 GAAGGACATA TGGGAGGGCA AATCATTTAA AACATCAGAA TGAGTATTTG

6851 GTTTAGAGTT TGGCAACATA TGCCCATATG CTGGCTGCCA TGAACAAAGG

6901 TTGGCTATAA AGAGGTCATC AGTATATGAA ACAGCCCCCT GCTGTCCATT

6951 CCTTATTCCA TAGAAAAGCC TTGACTTGAG GTTAGATTTT TTTTATATTT

7001 TGTTTTGTGT TATTTTTTTC TTTAACATCC CTAAAATTTT CCTTACATGT

7051 TTTACTAGCC AGATTTTTCC TCCTCTCCTG ACTACTCCCA GTCATAGCTG

7101 TCCCTCTTCT CTTATGGAGA TCCCTCGACC TGCAGCCCAA GCTGTAGATA

7151 AGTAGCATGG CGGGTTAATC ATTAACTACA AGGAACCCCT AGTGATGGAG

7201 TTGGCCACTC CCTCTCTGCG CGCTCGCTCG CTCACTGAGG CCGGGCGACC

7251 AAAGGTCGCC CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCA GTGAGCGAGC

7301 GAGCGCGCAG CTGGCGTAA

AAV2 5’ ITR: 3615-3742 bp

CAG 프로모터: 3782-5452 bp

무스 무큘러스 코돈-최적화된 FGF21 (moFGF21): 5589-6221 bp

dmiRT (4 copies of the miRT-122a and 4 copies of the miRT-1): 6254-6514 bp

토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호 (polyA 신호를 포함하는 토끼 베타-글로빈의 3' UTR 및 3' 플랭킹 영역): 6674-6764 bp

AAV2 3’ ITR: 7181-7308 bp

pAAV-CAG-moFGF21 (서열번호 46)

1 AGTGAGCGAG CGAGCGCGCA GCTGCATTAA TGAATCGGCC AACGCGCGGG GAGAGGCGGT

61 TTGCGTATTG GGCGCTCTTC CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG

121 CTGCGGCGAG CGGTATCAGC TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG

181 GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA CCGTAAAAAG

241 GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT CCATAGGCTC CGCCCCCCTG ACGAGCATCA CAAAAATCGA

301 CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA GGACTATAAA GATACCAGGC GTTTCCCCCT

361 GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA CCTGTCCGCC

421 TTTCTCCCTT CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CATAGCTCAC GCTGTAGGTA TCTCAGTTCG

481 GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA GCCCGACCGC

541 TGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGTCTTGAG TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA

601 CTGGCAGCAG CCACTGGTAA CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG

661 TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA CTACGGCTAC ACTAGAAGAA CAGTATTTGG TATCTGCGCT

721 CTGCTGAAGC CAGTTACCTT CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC

781 ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA TTACGCGCAG AAAAAAAGGA

841 TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT CTTTTCTACG GGGTCTGACG CTCAGTGGAA CGAAAACTCA

901 CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT GAGATTATCA AAAAGGATCT TCACCTAGAT CCTTTTAAAT

961 TAAAAATGAA GTTTTAAATC AATCTAAAGT ATATATGAGT AAACTTGGTC TGACAGTTAC

1021 CAATGCTTAA TCAGTGAGGC ACCTATCTCA GCGATCTGTC TATTTCGTTC ATCCATAGTT

1081 GCCTGACTCC CCGTCGTGTA GATAACTACG ATACGGGAGG GCTTACCATC TGGCCCCAGT

1141 GCTGCAATGA TACCGCGAGA CCCACGCTCA CCGGCTCCAG ATTTATCAGC AATAAACCAG

1201 CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT CCTGCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT

1261 ATTAATTGTT GCCGGGAAGC TAGAGTAAGT AGTTCGCCAG TTAATAGTTT GCGCAACGTT

1321 GTTGCCATTG CTACAGGCAT CGTGGTGTCA CGCTCGTCGT TTGGTATGGC TTCATTCAGC

1381 TCCGGTTCCC AACGATCAAG GCGAGTTACA TGATCCCCCA TGTTGTGCAA AAAAGCGGTT

1441 AGCTCCTTCG GTCCTCCGAT CGTTGTCAGA AGTAAGTTGG CCGCAGTGTT ATCACTCATG

1501 GTTATGGCAG CACTGCATAA TTCTCTTACT GTCATGCCAT CCGTAAGATG CTTTTCTGTG

1561 ACTGGTGAGT ACTCAACCAA GTCATTCTGA GAATAGTGTA TGCGGCGACC GAGTTGCTCT

1621 TGCCCGGCGT CAATACGGGA TAATACCGCG CCACATAGCA GAACTTTAAA AGTGCTCATC

1681 ATTGGAAAAC GTTCTTCGGG GCGAAAACTC TCAAGGATCT TACCGCTGTT GAGATCCAGT

1741 TCGATGTAAC CCACTCGTGC ACCCAACTGA TCTTCAGCAT CTTTTACTTT CACCAGCGTT

1801 TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACGG

1861 AAATGTTGAA TACTCATACT CTTCCTTTTT CAATATTATT GAAGCATTTA TCAGGGTTAT

1921 TGTCTCATGA GCGGATACAT ATTTGAATGT ATTTAGAAAA ATAAACAAAT AGGGGTTCCG

1981 CGCACATTTC CCCGAAAAGT GCCACCTGAC GTCTAAGAAA CCATTATTAT CATGACATTA

2041 ACCTATAAAA ATAGGCGTAT CACGAGGCCC TTTCGTCTCG CGCGTTTCGG TGATGACGGT

2101 GAAAACCTCT GACACATGCA GCTCCCGGAG ACGGTCACAG CTTGTCTGTA AGCGGATGCC

2161 GGGAGCAGAC AAGCCCGTCA GGGCGCGTCA GCGGGTGTTG GCGGGTGTCG GGGCTGGCTT

2221 AACTATGCGG CATCAGAGCA GATTGTACTG AGAGTGCACC ATATGCGGTG TGAAATACCG

2281 CACAGATGCG TAAGGAGAAA ATACCGCATC AGGCGATTCC AACATCCAAT AAATCATACA

2341 GGCAAGGCAA AGAATTAGCA AAATTAAGCA ATAAAGCCTC AGAGCATAAA GCTAAATCGG

2401 TTGTACCAAA AACATTATGA CCCTGTAATA CTTTTGCGGG AGAAGCCTTT ATTTCAACGC

2461 AAGGATAAAA ATTTTTAGAA CCCTCATATA TTTTAAATGC AATGCCTGAG TAATGTGTAG

2521 GTAAAGATTC AAACGGGTGA GAAAGGCCGG AGACAGTCAA ATCACCATCA ATATGATATT

2581 CAACCGTTCT AGCTGATAAA TTCATGCCGG AGAGGGTAGC TATTTTTGAG AGGTCTCTAC

2641 AAAGGCTATC AGGTCATTGC CTGAGAGTCT GGAGCAAACA AGAGAATCGA TGAACGGTAA

2701 TCGTAAAACT AGCATGTCAA TCATATGTAC CCCGGTTGAT AATCAGAAAA GCCCCAAAAA

2761 CAGGAAGATT GTATAAGCAA ATATTTAAAT TGTAAGCGTT AATATTTTGT TAAAATTCGC

2821 GTTAAATTTT TGTTAAATCA GCTCATTTTT TAACCAATAG GCCGAAATCG GCAAAATCCC

2881 TTATAAATCA AAAGAATAGA CCGAGATAGG GTTGAGTGTT GTTCCAGTTT GGAACAAGAG

2941 TCCACTATTA AAGAACGTGG ACTCCAACGT CAAAGGGCGA AAAACCGTCT ATCAGGGCGA

3001 TGGCCCACTA CGTGAACCAT CACCCTAATC AAGTTTTTTG GGGTCGAGGT GCCGTAAAGC

3061 ACTAAATCGG AACCCTAAAG GGAGCCCCCG ATTTAGAGCT TGACGGGGAA AGCCGGCGAA

3121 CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA AGAAAGCGAA AGGAGCGGGC GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT

3181 AGCGGTCACG CTGCGCGTAA CCACCACACC CGCCGCGCTT AATGCGCCGC TACAGGGCGC

3241 GTACTATGGT TGCTTTGACG AGCACGTATA ACGTGCTTTC CTCGTTAGAA TCAGAGCGGG

3301 AGCTAAACAG GAGGCCGATT AAAGGGATTT TAGACAGGAA CGGTACGCCA GAATCCTGAG

3361 AAGTGTTTTT ATAATCAGTG AGGCCACCGA GTAAAAGAGT CTGTCCATCA CGCAAATTAA

3421 CCGTTGTCGC AATACTTCTT TGATTAGTAA TAACATCACT TGCCTGAGTA GAAGAACTCA

3481 AACTATCGGC CTTGCTGGTA ATATCCAGAA CAATATTACC GCCAGCCATT GCAACGGAAT

3541 CGCCATTCGC CATTCAGGCT GCGCAACTGT TGGGAAGGGC GATCGGTGCG GGCCTCTTCC

3601 ACTGAGGCCC AGCTGCGCGC TCGCTCGCTC ACTGAGGCCG CCCGGGCAAA GCCCGGGCGT

3661 CGGGCGACCT TTGGTCGCCC GGCCTCAGTG AGCGAGCGAG CGCGCAGAGA GGGAGTGGCC

3721 AACTCCATCA CTAGGGGTTC CTTGTAGTTA ATGATTAACC CGCCATGCTA CTTATCTACT

3781 CGACATTGAT TATTGACTAG TTATTAATAG TAATCAATTA CGGGGTCATT AGTTCATAGC

3841 CCATATATGG AGTTCCGCGT TACATAACTT ACGGTAAATG GCCCGCCTGG CTGACCGCCC

3901 AACGACCCCC GCCCATTGAC GTCAATAATG ACGTATGTTC CCATAGTAAC GCCAATAGGG

3961 ACTTTCCATT GACGTCAATG GGTGGAGTAT TTACGGTAAA CTGCCCACTT GGCAGTACAT

4021 CAAGTGTATC ATATGCCAAG TACGCCCCCT ATTGACGTCA ATGACGGTAA ATGGCCCGCC

4081 TGGCATTATG CCCAGTACAT GACCTTATGG GACTTTCCTA CTTGGCAGTA CATCTACGTA

4141 TTAGTCATCG CTATTACCAT GGTCGAGGTG AGCCCCACGT TCTGCTTCAC TCTCCCCATC

4201 TCCCCCCCCT CCCCACCCCC AATTTTGTAT TTATTTATTT TTTAATTATT TTGTGCAGCG

4261 ATGGGGGCGG GGGGGGGGGG GGGGCGCGCG CCAGGCGGGG CGGGGCGGGG CGAGGGGCGG

4321 GGCGGGGCGA GGCGGAGAGG TGCGGCGGCA GCCAATCAGA GCGGCGCGCT CCGAAAGTTT

4381 CCTTTTATGG CGAGGCGGCG GCGGCGGCGG CCCTATAAAA AGCGAAGCGC GCGGCGGGCG

4441 GGAGTCGCTG CGTTGCCTTC GCCCCGTGCC CCGCTCCGCG CCGCCTCGCG CCGCCCGCCC

4501 CGGCTCTGAC TGACCGCGTT ACTCCCACAG GTGAGCGGGC GGGACGGCCC TTCTCCTCCG

4561 GGCTGTAATT AGCGCTTGGT TTAATGACGG CTTGTTTCTT TTCTGTGGCT GCGTGAAAGC

4621 CTTGAGGGGC TCCGGGAGGG CCCTTTGTGC GGGGGGAGCG GCTCGGGGGG TGCGTGCGTG

4681 TGTGTGTGCG TGGGGAGCGC CGCGTGCGGC TCCGCGCTGC CCGGCGGCTG TGAGCGCTGC

4741 GGGCGCGGCG CGGGGCTTTG TGCGCTCCGC AGTGTGCGCG AGGGGAGCGC GGCCGGGGGC

4801 GGTGCCCCGC GGTGCGGGGG GCTGCGAGGG GAACAAAGGC TGCGTGCGGG GTGTGTGCGT

4861 GGGGGGGTGA GCAGGGGGTG TGGGCGCGTC GGTCGGGCTG CAACCCCCCC TGCACCCCCC

4921 TCCCCGAGTT GCTGAGCACG GCCCGGCTTC GGGTGCGGGG CTCCGTACGG GGCGTGGCGC

4981 GGGGCTCGCC GTGCCGGGCG GGGGGTGGCG GCAGGTGGGG GTGCCGGGCG GGGCGGGGCC

5041 GCCTCGGGCC GGGGAGGGCT CGGGGGAGGG GCGCGGCGGC CCCCGGAGCG CCGGCGGCTG

5101 TCGAGGCGCG GCGAGCCGCA GCCATTGCCT TTTATGGTAA TCGTGCGAGA GGGCGCAGGG

5161 ACTTCCTTTG TCCCAAATCT GTGCGGAGCC GAAATCTGGG AGGCGCCGCC GCACCCCCTC

5221 TAGCGGGCGC GGGGCGAAGC GGTGCGGCGC CGGCAGGAAG GAAATGGGCG GGGAGGGCCT

5281 TCGTGCGTCG CCGCGCCGCC GTCCCCTTCT CCCTCTCCAG CCTCGGGGCT GTCCGCGGGG

5341 GGACGGCTGC CTTCGGGGGG GACGGGGCAG GGCGGGGTTC GGCTTCTGGC GTGTGACCGG

5401 CGGCTCTAGA GCCTCTGCTA ACCATGTTCA TGCCTTCTTC TTTTTCCTAC AGCTCCTGGG

5461 CAACGTGCTG GTTATTGTGC TGTCTCATCA TTTTGGCAAA GAATTGATTA ATTCGAGCGA

5521 ACGCGTCGAG TCGCTCGGTA CGATTTAAAT TGAATTGGCC TCGAGCGCAA GCTTGAGCTA

5581 GCGCCACCAT GGAATGGATG AGAAGCAGAG TGGGCACCCT GGGCCTGTGG GTGCGACTGC

5641 TGCTGGCTGT GTTTCTGCTG GGCGTGTACC AGGCCTACCC CATCCCTGAC TCTAGCCCCC

5701 TGCTGCAGTT TGGCGGACAA GTGCGGCAGA GATACCTGTA CACCGACGAC GACCAGGACA

5761 CCGAGGCCCA CCTGGAAATC CGCGAGGATG GCACAGTCGT GGGCGCTGCT CACAGAAGCC

5821 CTGAGAGCCT GCTGGAACTG AAGGCCCTGA AGCCCGGCGT GATCCAGATC CTGGGCGTGA

5881 AGGCCAGCAG ATTCCTGTGC CAGCAGCCTG ACGGCGCCCT GTACGGCTCT CCTCACTTCG

5941 ATCCTGAGGC CTGCAGCTTC AGAGAGCTGC TGCTGGAGGA CGGCTACAAC GTGTACCAGT

6001 CTGAGGCCCA CGGCCTGCCC CTGAGACTGC CTCAGAAGGA CAGCCCTAAC CAGGACGCCA

6061 CAAGCTGGGG ACCTGTGCGG TTCCTGCCTA TGCCTGGACT GCTGCACGAG CCCCAGGATC

6121 AGGCTGGCTT TCTGCCTCCT GAGCCTCCAG ACGTGGGCAG CAGCGACCCT CTGAGCATGG

6181 TGGAACCTCT GCAGGGCAGA AGCCCCAGCT ACGCCTCTTG AGAATGCGGG CCCGGTACCC

6241 CCGACGCGGC CTAACTGGCC TCATGGGCCT TCCGCTCACT GCCCGCTTTC CAGTCGGGAA

6301 ACCTGTCGTG CCAGTCAGGT GCAGGCTGCC TATCAGAAGG TGGTGGCTGG TGTGGCCAAT

6361 GCCCTGGCTC ACAAATACCA CTGAGATCTT TTTCCCTCTG CCAAAAATTA TGGGGACATC

6421 ATGAAGCCCC TTGAGCATCT GACTTCTGGC TAATAAAGGA AATTTATTTT CATTGCAATA

6481 GTGTGTTGGA ATTTTTTGTG TCTCTCACTC GGAAGGACAT ATGGGAGGGC AAATCATTTA

6541 AAACATCAGA ATGAGTATTT GGTTTAGAGT TTGGCAACAT ATGCCCATAT GCTGGCTGCC

6601 ATGAACAAAG GTTGGCTATA AAGAGGTCAT CAGTATATGA AACAGCCCCC TGCTGTCCAT

6661 TCCTTATTCC ATAGAAAAGC CTTGACTTGA GGTTAGATTT TTTTTATATT TTGTTTTGTG

6721 TTATTTTTTT CTTTAACATC CCTAAAATTT TCCTTACATG TTTTACTAGC CAGATTTTTC

6781 CTCCTCTCCT GACTACTCCC AGTCATAGCT GTCCCTCTTC TCTTATGGAG ATCCCTCGAC

6841 CTGCAGCCCA AGCTGTAGAT AAGTAGCATG GCGGGTTAAT CATTAACTAC AAGGAACCCC

6901 TAGTGATGGA GTTGGCCACT CCCTCTCTGC GCGCTCGCTC GCTCACTGAG GCCGGGCGAC

6961 CAAAGGTCGC CCGACGCCCG GGCTTTGCCC GGGCGGCCTC AGTGAGCGAG CGAGCGCGCA

7021 GCTGGCGTAA

AAV2 5’ ITR: 3601-3742 bp

CAG 프로모터: 3779-5423 bp

무스 무큘러스 코돈-최적화된 FGF21 (moFGF21): 5588-6221 bp

토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호 (polyA 신호를 포함하는 토끼 베타-글로빈의 3' UTR 및 3' 플랭킹 영역): 6315 -6833 bp

AAV2 3’ ITR: 6892-7024 bp

pAAV-CMV-moFGF21 (서열번호 63)

1 GGGGCTAGCG CCACCATGGA ATGGATGAGA AGCAGAGTGG GCACCCTGGG

51 CCTGTGGGTG CGACTGCTGC TGGCTGTGTT TCTGCTGGGC GTGTACCAGG

101 CCTACCCCAT CCCTGACTCT AGCCCCCTGC TGCAGTTTGG CGGACAAGTG

151 CGGCAGAGAT ACCTGTACAC CGACGACGAC CAGGACACCG AGGCCCACCT

201 GGAAATCCGC GAGGATGGCA CAGTCGTGGG CGCTGCTCAC AGAAGCCCTG

251 AGAGCCTGCT GGAACTGAAG GCCCTGAAGC CCGGCGTGAT CCAGATCCTG

301 GGCGTGAAGG CCAGCAGATT CCTGTGCCAG CAGCCTGACG GCGCCCTGTA

351 CGGCTCTCCT CACTTCGATC CTGAGGCCTG CAGCTTCAGA GAGCTGCTGC

401 TGGAGGACGG CTACAACGTG TACCAGTCTG AGGCCCACGG CCTGCCCCTG

451 AGACTGCCTC AGAAGGACAG CCCTAACCAG GACGCCACAA GCTGGGGACC

501 TGTGCGGTTC CTGCCTATGC CTGGACTGCT GCACGAGCCC CAGGATCAGG

551 CTGGCTTTCT GCCTCCTGAG CCTCCAGACG TGGGCAGCAG CGACCCTCTG

601 AGCATGGTGG AACCTCTGCA GGGCAGAAGC CCCAGCTACG CCTCTTGAGA

651 ATGCGGGCCC GGTACCCCCT CGACGGTACC AGCGCTGTCG AGGCCGCTTC

701 GAGCAGACAT GATAAGATAC ATTGATGAGT TTGGACAAAC CACAACTAGA

751 ATGCAGTGAA AAAAATGCTT TATTTGTGAA ATTTGTGATG CTATTGCTTT

801 ATTTGTAACC ATTATAAGCT GCAATAAACA AGTTAACAAC AACAATTGCA

851 TTCATTTTAT GTTTCAGGTT CAGGGGGAGA TGTGGGAGGT TTTTTAAAGC

901 AAGTAAAACC TCTACAAATG TGGTAAAATC GATTAGGATC TTCCTAGAGC

951 ATGGCTACCT AGACATGGCT CGACAGATCA GCGCTCATGC TCTGGAAGAT

1001 CTCGATTTAA ATGCGGCCGC AGGAACCCCT AGTGATGGAG TTGGCCACTC

1051 CCTCTCTGCG CGCTCGCTCG CTCACTGAGG CCGGGCGACC AAAGGTCGCC

1101 CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCA GTGAGCGAGC GAGCGCGCAG

1151 CTGCCTGCAG GGGCGCCTGA TGCGGTATTT TCTCCTTACG CATCTGTGCG

1201 GTATTTCACA CCGCATACGT CAAAGCAACC ATAGTACGCG CCCTGTAGCG

1251 GCGCATTAAG CGCGGCGGGT GTGGTGGTTA CGCGCAGCGT GACCGCTACA

1301 CTTGCCAGCG CCCTAGCGCC CGCTCCTTTC GCTTTCTTCC CTTCCTTTCT

1351 CGCCACGTTC GCCGGCTTTC CCCGTCAAGC TCTAAATCGG GGGCTCCCTT

1401 TAGGGTTCCG ATTTAGTGCT TTACGGCACC TCGACCCCAA AAAACTTGAT

1451 TTGGGTGATG GTTCACGTAG TGGGCCATCG CCCTGATAGA CGGTTTTTCG

1501 CCCTTTGACG TTGGAGTCCA CGTTCTTTAA TAGTGGACTC TTGTTCCAAA

1551 CTGGAACAAC ACTCAACCCT ATCTCGGGCT ATTCTTTTGA TTTATAAGGG

1601 ATTTTGCCGA TTTCGGCCTA TTGGTTAAAA AATGAGCTGA TTTAACAAAA

1651 ATTTAACGCG AATTTTAACA AAATATTAAC GTTTACAATT TTATGGTGCA

1701 CTCTCAGTAC AATCTGCTCT GATGCCGCAT AGTTAAGCCA GCCCCGACAC

1751 CCGCCAACAC CCGCTGACGC GCCCTGACGG GCTTGTCTGC TCCCGGCATC

1801 CGCTTACAGA CAAGCTGTGA CCGTCTCCGG GAGCTGCATG TGTCAGAGGT

1851 TTTCACCGTC ATCACCGAAA CGCGCGAGAC GAAAGGGCCT CGTGATACGC

1901 CTATTTTTAT AGGTTAATGT CATGATAATA ATGGTTTCTT AGACGTCAGG

1951 TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCGCGGAAC CCCTATTTGT TTATTTTTCT

2001 AAATACATTC AAATATGTAT CCGCTCATGA GACAATAACC CTGATAAATG

2051 CTTCAATAAT ATTGAAAAAG GAAGAGTATG AGTATTCAAC ATTTCCGTGT

2101 CGCCCTTATT CCCTTTTTTG CGGCATTTTG CCTTCCTGTT TTTGCTCACC

2151 CAGAAACGCT GGTGAAAGTA AAAGATGCTG AAGATCAGTT GGGTGCACGA

2201 GTGGGTTACA TCGAACTGGA TCTCAACAGC GGTAAGATCC TTGAGAGTTT

2251 TCGCCCCGAA GAACGTTTTC CAATGATGAG CACTTTTAAA GTTCTGCTAT

2301 GTGGCGCGGT ATTATCCCGT ATTGACGCCG GGCAAGAGCA ACTCGGTCGC

2351 CGCATACACT ATTCTCAGAA TGACTTGGTT GAGTACTCAC CAGTCACAGA

2401 AAAGCATCTT ACGGATGGCA TGACAGTAAG AGAATTATGC AGTGCTGCCA

2451 TAACCATGAG TGATAACACT GCGGCCAACT TACTTCTGAC AACGATCGGA

2501 GGACCGAAGG AGCTAACCGC TTTTTTGCAC AACATGGGGG ATCATGTAAC

2551 TCGCCTTGAT CGTTGGGAAC CGGAGCTGAA TGAAGCCATA CCAAACGACG

2601 AGCGTGACAC CACGATGCCT GTAGCAATGG CAACAACGTT GCGCAAACTA

2651 TTAACTGGCG AACTACTTAC TCTAGCTTCC CGGCAACAAT TAATAGACTG

2701 GATGGAGGCG GATAAAGTTG CAGGACCACT TCTGCGCTCG GCCCTTCCGG

2751 CTGGCTGGTT TATTGCTGAT AAATCTGGAG CCGGTGAGCG TGGGTCTCGC

2801 GGTATCATTG CAGCACTGGG GCCAGATGGT AAGCCCTCCC GTATCGTAGT

2851 TATCTACACG ACGGGGAGTC AGGCAACTAT GGATGAACGA AATAGACAGA

2901 TCGCTGAGAT AGGTGCCTCA CTGATTAAGC ATTGGTAACT GTCAGACCAA

2951 GTTTACTCAT ATATACTTTA GATTGATTTA AAACTTCATT TTTAATTTAA

3001 AAGGATCTAG GTGAAGATCC TTTTTGATAA TCTCATGACC AAAATCCCTT

3051 AACGTGAGTT TTCGTTCCAC TGAGCGTCAG ACCCCGTAGA AAAGATCAAA

3101 GGATCTTCTT GAGATCCTTT TTTTCTGCGC GTAATCTGCT GCTTGCAAAC

3151 AAAAAAACCA CCGCTACCAG CGGTGGTTTG TTTGCCGGAT CAAGAGCTAC

3201 CAACTCTTTT TCCGAAGGTA ACTGGCTTCA GCAGAGCGCA GATACCAAAT

3251 ACTGTCCTTC TAGTGTAGCC GTAGTTAGGC CACCACTTCA AGAACTCTGT

3301 AGCACCGCCT ACATACCTCG CTCTGCTAAT CCTGTTACCA GTGGCTGCTG

3351 CCAGTGGCGA TAAGTCGTGT CTTACCGGGT TGGACTCAAG ACGATAGTTA

3401 CCGGATAAGG CGCAGCGGTC GGGCTGAACG GGGGGTTCGT GCACACAGCC

3451 CAGCTTGGAG CGAACGACCT ACACCGAACT GAGATACCTA CAGCGTGAGC

3501 TATGAGAAAG CGCCACGCTT CCCGAAGGGA GAAAGGCGGA CAGGTATCCG

3551 GTAAGCGGCA GGGTCGGAAC AGGAGAGCGC ACGAGGGAGC TTCCAGGGGG

3601 AAACGCCTGG TATCTTTATA GTCCTGTCGG GTTTCGCCAC CTCTGACTTG

3651 AGCGTCGATT TTTGTGATGC TCGTCAGGGG GGCGGAGCCT ATGGAAAAAC

3701 GCCAGCAACG CGGCCTTTTT ACGGTTCCTG GCCTTTTGCT GGCCTTTTGC

3751 TCACATGTCC TGCAGGCAGC TGCGCGCTCG CTCGCTCACT GAGGCCGCCC

3801 GGGCAAAGCC CGGGCGTCGG GCGACCTTTG GTCGCCCGGC CTCAGTGAGC

3851 GAGCGAGCGC GCAGAGAGGG AGTGGCCAAC TCCATCACTA GGGGTTCCTG

3901 CGGCCGCGAT ATCTGTAGTT AATGATTAAC CCGCCATGCT ACTTATCTAC

3951 AGATCTCAAT ATTGGCCATT AGCCATATTA TTCATTGGTT ATATAGCATA

4001 AATCAATATT GGCTATTGGC CATTGCATAC GTTGTATCTA TATCATAATA

4051 TGTACATTTA TATTGGCTCA TGTCCAATAT GACCGCCATG TTGGCATTGA

4101 TTATTGACTA GTTATTAATA GTAATCAATT ACGGGGTCAT TAGTTCATAG

4151 CCCATATATG GAGTTCCGCG TTACATAACT TACGGTAAAT GGCCCGCCTG

4201 GCTGACCGCC CAACGACCCC CGCCCATTGA CGTCAATAAT GACGTATGTT

4251 CCCATAGTAA CGCCAATAGG GACTTTCCAT TGACGTCAAT GGGTGGAGTA

4301 TTTACGGTAA ACTGCCCACT TGGCAGTACA TCAAGTGTAT CATATGCCAA

4351 GTCCGCCCCC TATTGACGTC AATGACGGTA AATGGCCCGC CTGGCATTAT

4401 GCCCAGTACA TGACCTTACG GGACTTTCCT ACTTGGCAGT ACATCTACGT

4451 ATTAGTCATC GCTATTACCA TGGTGATGCG GTTTTGGCAG TACACCAATG

4501 GGCGTGGATA GCGGTTTGAC TCACGGGGAT TTCCAAGTCT CCACCCCATT

4551 GACGTCAATG GGAGTTTGTT TTGGCACCAA AATCAACGGG ACTTTCCAAA

4601 ATGTCGTAAC AACTGCGATC GCCCGCCCCG TTGACGCAAA TGGGCGGTAG

4651 GCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG AGCTCGTTTA GTGAACCGTC

4701 AGATCACTAG GCTAGCTATT GCGGTAGTTT ATCACAGTTA AATTGCTAAC

4751 GCAGTCAGTG CTTCTGACAC AACAGTCTCG AACTTAAGCT GCAGTGACTC

4801 TCTTAAGGTA GCCTTGCAGA AGTTGGTCGT GAGGCACTGG GCAGGTAAGT

4851 ATCAAGGTTA CAAGACAGGT TTAAGGAGAC CAATAGAAAC TGGGCTTGTC

4901 GAGACAGAGA AGACTCTTGC GTTTCTGATA GGCACCTATT GGTCTTACTG

4951 ACATCCACTT TGCCTTTCTC TCCACAGGTG TCCACTCCCA GTTCAATTAC

5001 AGCTCTTAAG GCTAGAGTAC TTAATACGAC TCACTATAGA ATACGACTCA

5051 CTATAGGGAG ACGCTAGCGT CGA

AAV2 5’ ITR: 3772-3899 bp

CMV 인핸서: 4093-4472 bp

CMV 프로모터: 4473-4684 bp

β-글로빈 인트론(인간 β-글로빈 및 면역글로불린 중쇄 유전자의 인트론으로 구성된 키메라 인트론): 4845-4977 bp

무스 무큘러스 코돈-최적화된 FGF21 (moFGF21): 16-648 bp

SV40 polyA 신호: 713-834 bp

AAV2 3’ ITR: 1021-1148 bp

<110> Universitat Autonoma de Barcelona <120> Fibroblast growth factor 21 (FGF21) gene therapy for central nervous system disorders <130> P6092231PCT <150> EP 20382442.0 <151> 2020-05-26 <160> 122 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu 165 170 175 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190 Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205 Ser <210> 2 <211> 210 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Glu Trp Met Arg Ser Arg Val Gly Thr Leu Gly Leu Trp Val Arg 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Val Phe Leu Leu Gly Val Tyr Gln Ala Tyr Pro Ile 20 25 30 Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg 35 40 45 Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Asp Gln Asp Thr Glu Ala His Leu Glu Ile 50 55 60 Arg Glu Asp Gly Thr Val Val Gly Ala Ala His Arg Ser Pro Glu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly 85 90 95 Val Lys Ala Ser Arg Phe Leu Cys Gln Gln Pro Asp Gly Ala Leu Tyr 100 105 110 Gly Ser Pro His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu 115 120 125 Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro 130 135 140 Leu Arg Leu Pro Gln Lys Asp Ser Pro Asn Gln Asp Ala Thr Ser Trp 145 150 155 160 Gly Pro Val Arg Phe Leu Pro Met Pro Gly Leu Leu His Glu Pro Gln 165 170 175 Asp Gln Ala Gly Phe Leu Pro Pro Glu Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser 180 185 190 Asp Pro Leu Ser Met Val Glu Pro Leu Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr 195 200 205 Ala Ser 210 <210> 3 <211> 209 <212> PRT <213> Canis lupus familiaris <400> 3 Met Gly Trp Ala Glu Ala Gly Phe Glu His Leu Gly Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Val Leu Ala Val Leu Leu Leu Glu Ala Cys Arg Ala His Pro Ile Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Glu Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60 Ala Asp Gly Thr Val Val Gly Ala Ala Arg Gln Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Gly Pro Asp Gly Thr Leu Tyr Gly 100 105 110 Ser Leu His Phe Asp Pro Val Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Tyr Asn Ile Tyr His Ser Glu Thr Leu Gly Leu Pro Leu 130 135 140 Arg Leu Arg Pro His Asn Ser Ala Tyr Arg Asp Leu Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Pro Ala Pro Pro Glu 165 170 175 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Glu Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190 Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205 Ser <210> 4 <211> 630 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggactcgg acgagaccgg gttcgagcac tcaggactgt gggtttctgt gctggctggt 60 cttctgctgg gagcctgcca ggcacacccc atccctgact ccagtcctct cctgcaattc 120 gggggccaag tccggcagcg gtacctctac acagatgatg cccagcagac agaagcccac 180 ctggagatca gggaggatgg gacggtgggg ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc 240 ctgcagctga aagccttgaa gccgggagtt attcaaatct tgggagtcaa gacatccagg 300 ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg tatggatcgc tccactttga ccctgaggcc 360 tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac 420 ggcctcccgc tgcacctgcc agggaacaag tccccacacc gggaccctgc accccgagga 480 ccagctcgct tcctgccact accaggcctg ccccccgcac tcccggagcc acccggaatc 540 ctggcccccc agccccccga tgtgggctcc tcggaccctc tgagcatggt gggaccttcc 600 cagggccgaa gccccagcta cgcttcctga 630 <210> 5 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized Homo sapiens FGF21 - variant 1 <400> 5 atggattctg atgagacagg cttcgagcac agcggcctgt gggtttcagt tctggctgga 60 ctgctgctgg gagcctgtca ggcacaccct attccagata gcagccctct gctgcagttc 120 ggcggacaag tgcggcagag atacctgtac accgacgacg cccagcagac agaagcccac 180 ctggaaatca gagaggatgg cacagttggc ggagccgccg atcagtctcc tgaatctctg 240 ctccagctga aggccctgaa gcctggcgtg atccagatcc tgggcgtgaa aaccagccgg 300 ttcctgtgcc aaagacctga cggcgccctg tatggcagcc tgcactttga tcctgaggcc 360 tgcagcttca gagagctgct gcttgaggac ggctacaacg tgtaccagtc tgaggcccat 420 ggcctgcctc tgcatctgcc tggaaacaag agccctcaca gagatcccgc tcctagaggc 480 cctgccagat ttctgcctct tcctggattg cctcctgctc tgccagagcc tcctggaatt 540 ctggctcctc agcctcctga tgtgggcagc tctgatcctc tgagcatggt cggacctagc 600 cagggcagat ctcctagcta cgcctcttga 630 <210> 6 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized Homo sapiens FGF21 - variant 2 <400> 6 atggacagcg atgaaaccgg gttcgagcac agcggtctgt gggtgtccgt gctggccgga 60 ctgctcctgg gagcctgtca ggcgcacccc atccctgact cctcgccgct gctgcaattc 120 ggcggacaag tccgccagag atacctgtac accgacgacg cccagcagac cgaagcccac 180 ctggaaattc gggaggacgg gactgtggga ggcgctgcag atcagtcacc cgagtccctc 240 ctccaactga aggccttgaa gcccggcgtg attcagatcc tgggcgtgaa aacttcccgc 300 ttcctttgcc aacggccgga tggagctctg tacggatccc tgcacttcga ccccgaagcc 360 tgctcattcc gcgagctgct ccttgaggac ggctataacg tgtaccagtc tgaggcccat 420 ggactccccc tgcatctgcc cggcaacaag tcccctcacc gggatcctgc cccaagaggc 480 ccagctcggt ttctgcctct gccgggactg cctccagcgt tgcccgaacc ccctggtatc 540 ctggccccgc aaccacctga cgtcggttcg tcggacccgc tgagcatggt cggtccgagc 600 cagggaaggt ccccgtccta cgcatcctga 630 <210> 7 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized Homo sapiens FGF21 - variant 3 <400> 7 atggattccg acgaaactgg atttgaacat tcagggctgt gggtctctgt gctggctgga 60 ctgctgctgg gggcttgtca ggctcacccc atccctgaca gctcccctct gctgcagttc 120 ggaggacagg tgcggcagag atacctgtat accgacgatg cccagcagac agaggcacac 180 ctggagatca gggaggacgg aaccgtggga ggagcagccg atcagtctcc cgagagcctg 240 ctgcagctga aggccctgaa gcctggcgtg atccagatcc tgggcgtgaa gacatctcgg 300 tttctgtgcc agcggcccga cggcgccctg tacggctccc tgcacttcga tcccgaggcc 360 tgttctttta gggagctgct gctggaggac ggctacaacg tgtatcagag cgaggcacac 420 ggcctgccac tgcacctgcc tggcaataag tcccctcacc gcgatccagc acccaggggc 480 ccagcacgct tcctgcctct gccaggcctg ccccctgccc tgccagagcc acccggcatc 540 ctggcccccc agcctccaga tgtgggctcc agcgatcctc tgtcaatggt ggggccaagt 600 caggggcgga gtccttcata cgcatcataa 630 <210> 8 <211> 633 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 atggaatgga tgagatctag agttgggacc ctgggactgt gggtccgact gctgctggct 60 gtcttcctgc tgggggtcta ccaagcatac cccatccctg actccagccc cctcctccag 120 tttgggggtc aagtccggca gaggtacctc tacacagatg acgaccaaga cactgaagcc 180 cacctggaga tcagggagga tggaacagtg gtaggcgcag cacaccgcag tccagaaagt 240 ctcctggagc tcaaagcctt gaagccaggg gtcattcaaa tcctgggtgt caaagcctct 300 aggtttcttt gccaacagcc agatggagct ctctatggat cgcctcactt tgatcctgag 360 gcctgcagct tcagagaact gctgctggag gacggttaca atgtgtacca gtctgaagcc 420 catggcctgc ccctgcgtct gcctcagaag gactccccaa accaggatgc aacatcctgg 480 ggacctgtgc gcttcctgcc catgccaggc ctgctccacg agccccaaga ccaagcagga 540 ttcctgcccc cagagccccc agatgtgggc tcctctgacc ccctgagcat ggtagagcct 600 ttacagggcc gaagccccag ctatgcgtcc tga 633 <210> 9 <211> 633 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized Mus musculus FGF21 <400> 9 atggaatgga tgagaagcag agtgggcacc ctgggcctgt gggtgcgact gctgctggct 60 gtgtttctgc tgggcgtgta ccaggcctac cccatccctg actctagccc cctgctgcag 120 tttggcggac aagtgcggca gagatacctg tacaccgacg acgaccagga caccgaggcc 180 cacctggaaa tccgcgagga tggcacagtc gtgggcgctg ctcacagaag ccctgagagc 240 ctgctggaac tgaaggccct gaagcccggc gtgatccaga tcctgggcgt gaaggccagc 300 agattcctgt gccagcagcc tgacggcgcc ctgtacggct ctcctcactt cgatcctgag 360 gcctgcagct tcagagagct gctgctggag gacggctaca acgtgtacca gtctgaggcc 420 cacggcctgc ccctgagact gcctcagaag gacagcccta accaggacgc cacaagctgg 480 ggacctgtgc ggttcctgcc tatgcctgga ctgctgcacg agccccagga tcaggctggc 540 tttctgcctc ctgagcctcc agacgtgggc agcagcgacc ctctgagcat ggtggaacct 600 ctgcagggca gaagccccag ctacgcctct tga 633 <210> 10 <211> 629 <212> DNA <213> Canis lupus familiaris <400> 10 atgggctggg ccgaggccgg gttcgagcac ctgggactgt gggtccctgt gctggctgtg 60 cttttgctgg aagcctgccg ggcacatccg atccctgact ccagccccct cctacaattt 120 ggaggtcaag ttcgacagcg gtacctctac accgacgatg cccaggagac agaggcccac 180 ctagagatca gggccgatgg cacagggtgg gggctgcccg ccagagccct gaaagtctcc 240 tggagctgaa agccctaaag ccaggggtca ttcaaatctt gggagtcaaa acatccaggt 300 tcctgtgcca gggcccagat gggacactat atggctcgct ccatttcgac cctgtggcct 360 gcagtttccg agaactgctt cttgaggatg ggtacaacat ctaccactcc gagacccttg 420 gtctcccgct tcgcctgcgc ccccacaact ccgcataccg ggacttggca ccccgcgggc 480 ctgcccgctt cctgccactg ccaggcctgc ttccagcacc cccagagcct ccagggatcc 540 tggccccgga gcctcctgac gtgggctcct cggaccctct gagcatggtg gggccttcac 600 agggccggag tcccagctat gcttcctaa 629 <210> 11 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized Canis lupus familiaris FGF21 <400> 11 atgggatggg ctgaggctgg attcgaacac ctgggactct gggtgcccgt cctggccgtg 60 ctgctcctgg aggcttgcag ggctcatccc atccctgaca gctccccact cctgcagttt 120 ggaggacagg tgaggcagcg gtacctgtat accgacgatg cccaggagac agaagctcac 180 ctggaaattc gggctgatgg aacagtggtc ggagctgccc gacagtcccc agagtctctc 240 ctggaactga aggccctcaa acccggagtg atccagattc tgggcgtcaa gacttctaga 300 ttcctgtgcc agggaccaga cggcaccctg tacggcagcc tgcatttcga tcctgtggcc 360 tgttcctttc gagagctcct gctcgaagac ggctacaaca tctatcactc tgagaccctg 420 ggactcccac tgcgactcag acctcataat agtgcctatc gagatctggc tcccaggggc 480 ccagctaggt ttctgccact ccccggactg ctccctgctc cacctgagcc acccggcatt 540 ctggctccag aacctccaga cgtgggctct agtgatccac tgagtatggt cggcccctca 600 caggggaggt 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promoter <400> 38 catgtttgac agcttatcat cgcagatccg tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60 atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120 gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180 tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat tcgcgtatct 240 gaggggacta gggtgtgttt aggcgaaaag cggggcttcg gttgtacgcg gttaggagtc 300 ccctcaggat atagtagttt cgcttttgca tagggagggg gaaatgtagt cttatgcaat 360 actcttgtag tcttgcaaca tggtaacgat gagttagcaa catgccttac aaggagagaa 420 aaagcaccgt gcatgccgat tggtggaagt aaggtggtac gatcgtgcct tattaggaag 480 gcaacagacg ggtctgacat ggattggacg aaccactaaa ttccgcattg cagagatatt 540 gtatttaagt gcctagctcg atacaataaa cgccatttga ccattcacca cattggtgtg 600 cacctccaag ctgggtacca gct 623 <210> 39 <211> 448 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synapsin 1 promoter <400> 39 ctgcgctctc aggcacgaca cgactcctcc gctgcccacc gcagactgag gcagcgctga 60 gtcgccggcg ccgcagcgca gatggtcgcg cccgtgcccc cctatctcgc gcctcgcgtg 120 gtgcggtccg 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ggactttcct acttggcagt 4440 acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacaccaatg 4500 ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg 4560 ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactgcgatc 4620 gcccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag 4680 agctcgttta gtgaaccgtc agatcactag gctagctatt gcggtagttt atcacagtta 4740 aattgctaac gcagtcagtg cttctgacac aacagtctcg aacttaagct gcagtgactc 4800 tcttaaggta gccttgcaga agttggtcgt gaggcactgg gcaggtaagt atcaaggtta 4860 caagacaggt ttaaggagac caatagaaac tgggcttgtc gagacagaga agactcttgc 4920 gtttctgata ggcacctatt ggtcttactg acatccactt tgcctttctc tccacaggtg 4980 tccactccca gttcaattac agctcttaag gctagagtac ttaatacgac tcactataga 5040 atacgactca ctatagggag acgctagcgt cga 5073 <210> 64 <211> 397 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hAAT promoter <400> 64 gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag tgagagcaga gggccagcta 60 agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc ctccaccttg gacacaggac 120 gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca 180 ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact 240 tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct 300 cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct 360 cagcttcagg caccaccact gacctgggac agtgaat 397 <210> 65 <211> 154 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatocyte control region (HCR) enhancer from apolipoprotein E <400> 65 cagagaggtc tctgacctct gccccagctc caaggtcagc aggcagggag ggctgtgtgt 60 ttgctgtttg ctgcttgcaa tgtttgccca ttttagggac atgagtaggc tgaagtttgt 120 tcagtgtgga cttcagaggc agcacacaaa cagc 154 <210> 66 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mini/aP2 promoter <400> 66 gattaacccg ccatgctact tatctactcg acattgatta ttgactaggg gaattccagc 60 aggaatcagg tagctggaga atcgcacaga gccatgcgat tcttggcaag ccatgcgaca 120 aaggcagaaa tgcacatttc acccagagag aagggattga tgtcagcagg aagtcaccac 180 ccagagagca aatggagttc ccagatgcct gacatttgcc ttcttactgg atcagagttc 240 actagtggaa gtgtcacagc ccaaacactc ccccaaagct cagcccttcc ttgccttgta 300 acaatcaagc cgctcctgga tgaactgctc cgccctctgt ctctttggca gggttggagc 360 ccactgtggc ctgagcgact tctatggctc ccttttctgt gattttcatg gtttctgagc 420 tcttttcccc cgctttatga ttttctcttt ttgtctctct cttgctaaac ctccttcgta 480 tatatgccct ctcaggtttc atttctgaat catctactgt gaactattcc cattgtttgc 540 cagaagcccc ctggttcttc cttctagaca ccaggcaagg ggcaggaggt aagaggcagg 600 agtccataaa acagccctga gagcctgctg ggtcagtgcc tgctgtcaga a 651 <210> 67 <211> 722 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mini/UCP1 <400> 67 gacgtcacag tgggtcagtc acccttgatc acactgcacc agtcttcacc tttccacgct 60 tcctgccaga gcatgaatca ggctctctgg ggataccggc ctcaccccta ctgaggcaaa 120 ctttctccca cttctcagag gctctgaggg cagcaaggtc agccctttct ttggaatcta 180 gaaccactcc ctgtcttgag ctgacatcac agggcaggca gatgcagcag ggaagggcct 240 gggactggga cgttcatcct acaagaaagc tgtggaactt ttcagcaaca tctcagaaat 300 cagatcgcac ttattcaaag gagccaggcc ctgctctgcg ccctggtgga ggctcctcat 360 gtgaagagtg acaaaaggca ccatgttgtg gatacggggc gaagcccctc cggtgtgtcc 420 tccaggcatc atcaggaact agtgccaaag cagaggtgct ggccagggct ttgggagtga 480 cgcgcgtctg ggaggcttgt gcgcccaggg cacgcccctg ccgattccca ctagcaggtc 540 ttgggggacc tgggccggct ctgcccctcc tccagcaatc gggctataaa gctcttccaa 600 gtcagggcgc agaagtgccg ggcgatccgg gcttaaagag cgagaggaag ggacgctcac 660 ctttgagctc ctccacaaat agccctggtg gctgccacag aagttcgaag ttgagagttc 720 gg 722 <210> 68 <211> 326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C5-12 promoter <400> 68 cggccgtccg ccttcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg gtgaggaatg 60 gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt tggcgctcta 120 aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca aatatggcga 180 cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg cattcctggg 240 ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg cggcccacga 300 gctacccgga ggagcgggag gcgcca 326 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccl19-Fw <400> 69 gcgggctcac tggggcacac 20 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccl19-Rv <400> 70 tgggaaggtc cagagaacca g 21 <210> 71 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppargc1a-Fw <400> 71 tttggccgac gacacgactt ttc 23 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppargc1a-Rv <400> 72 ttgtgttggg cgagagaaag 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppargc1b-Fw <400> 73 agaagcgctt tgaggtgttc 20 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppargc1b-Rv <400> 74 ggtgataaaa ccgtgcttct gg 22 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atp5f1a-Fw <400> 75 tctcggccag agactaggac 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atp5f1a-Rv <400> 76 gcacttgcac caatgaattt 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mt-co1-Fw <400> 77 atgagcaaaa gcccacttcg 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mt-co1-Rv <400> 78 accgtggaga tttggtccag 20 <210> 79 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cox6-Fw <400> 79 agtccctctg tcccgtgtc 19 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cox6-Rv <400> 80 atatgctgag gtcccccttt 20 <210> 81 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cox5a-Fw <400> 81 ctcgtcagcc tcagccagt 19 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cox5a-Rv <400> 82 tagcagcgaa tggaacagac 20 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sod1-Fw <400> 83 tacacaaggc tgtaccagtg c 21 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sod1-Rv <400> 84 tttccagcag tcacattgcc 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nrf2-Fw <400> 85 agtcgcttgc cctggatatc 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nrf2-Rv <400> 86 tgccaaactt gctccatgtc 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cat-Fw <400> 87 tgtgcatgca tgacaaccag 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cat-Rv <400> 88 gcactgttga agcgtttcac 20 <210> 89 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh-Fw <400> 89 ccttccgtgt tcctaccc 18 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh-Rv <400> 90 caacctggtc ctcactgtag 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HkI-Fw <400> 91 acggtcaaaa tgctgccttc 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HkI-Rv <400> 92 aatcgttcct ccgagatcca 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pfkp-Fw <400> 93 tgtgtctgaa ggagcaatcg 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pfkp-Rv <400> 94 ggccaaaatc ctgtcaaatg 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gpd1-Fw <400> 95 agacacccaa ctttcgcatc 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gpd1-Rv <400> 96 tattcttcaa ggccccacag 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gpd2-Fw <400> 97 ttgccttggg agaagatgac 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gpd2-Rv <400> 98 agttccgcac ttcattcagg 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pkm-Fw <400> 99 gctttgcatc tgatcccatt 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pkm-Rv <400> 100 agtccagcca caggatgttc 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Syp-Fw <400> 101 acatggacgt ggtgaatcag 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Syp-Rv <400> 102 aagatggcaa agacccactg 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gria1-Fw <400> 103 ccatgctggt tgccttaatc 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gria1-Rv <400> 104 ccgtatggct tcattgatgg 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gria2-Fw <400> 105 aagggcgtgt aatccttgac 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gria2-Rv <400> 106 tttcagcagg tctccatcag 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Grin1-Fw <400> 107 tgactacccg aatgtccatc 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Grin1-Rv <400> 108 ttgtagacgc gcatcatctc 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Grin2a-Fw <400> 109 tgtgaagaag tgctgcaagg 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Grin2a-Rv <400> 110 cgcctatcat tccattccac 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Grin2b-Fw <400> 111 ttggtgaggt ggtcatgaag 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Grin2b-Rv <400> 112 tgcgtgatac catgacactg 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sqstm1-Fw <400> 113 tgctggcggc tttacatttg 20 <210> 114 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sqstm1-Rv <400> 114 cagaagcaga gaaggaaaag cc 22 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atg5-Fw <400> 115 agatggacag ctgcacacac 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atg5-Rv <400> 116 ttggctctat cccgtgaatc 20 <210> 117 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atf4-Fw <400> 117 atgatggctt ggccagtg 18 <210> 118 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atf4-Rv <400> 118 ccattttctc caacatccaa tc 22 <210> 119 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bip-Fw <400> 119 ctgaggcgta ttgggaag 18 <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bip-Rv <400> 120 tcatgacatt cagtccagca a 21 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyp46a1-Fw <400> 121 tcgttgaacg tctccatcag 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyp46a1-Rv <400> 122 tttggggaga gactgtttgg 20

Claims (15)

1. 중추 신경계(CNS) 장애 또는 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 섬유아세포 성장 인자 21(FGF21)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조체.
   
2. 제1항에 있어서, FGF21을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 유비쿼터스 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 바람직하게는 유비쿼터스 프로모터가 CAG 프로모터 및 CMV 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 구조체.
   
3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 구조체는 FGF21의 발현을 방지하고자 하는 조직에서 발현되는 마이크로RNA의 적어도 하나의 표적 서열을 포함하고, 바람직하게는 상기 마이크로RNA의 적어도 하나의 표적 서열은 포유동물의 심장 및/또는 간에서 발현되는 마이크로RNA에 결합하는 표적 서열로부터 선택되는, 유전자 구조체.
   
4. 제3항에 있어서, 간에서 발현되는 마이크로RNA의 적어도 하나의 표적 서열 및 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 적어도 하나의 표적 서열을 포함하고, 바람직하게는 상기 심장에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열은 서열번호 13 및 21-25로부터 선택되며, 상기 간에서 발현되는 마이크로RNA의 표적 서열은 서열번호 12 및 14-20에서 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 유전자 구조체는 마이크로RNA-122a의 표적 서열(서열번호 12) 및 마이크로RNA-1의 표적 서열(서열번호 13)을 포함하는, 유전자 구조체.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGF21을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은,
   (a) 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열과 적어도 60% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
   (b) 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 뉴클레오티드 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및
   (c) 유전자 코드의 축퇴로 인해 (b)의 뉴클레오티드 서열의 서열과 다른 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군에서 선택되는, 유전자 구조체.
   
6. 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 유전자 구조체를 포함하고, 바람직하게는 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터이고, 더 바람직하게는 상기 발현 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 및 렌티바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 발현 벡터.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 발현 벡터는 아데노 관련 바이러스 벡터, 바람직하게는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, rh10, rh8, Cb4, rh74, DJ, 2/5, 2/1, 1/2 또는 Anc80의 아데노 관련 바이러스 벡터, 보다 바람직하게는 혈청형 1, 8 또는 9의 아데노 관련 바이러스 벡터인 것인, 발현 벡터.
   
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 구조체 및/또는 제6항 또는 제7항에 기재된 발현 벡터를 포함하고, 선택적으로 중추 신경계(CNS) 장애 또는 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 하나 이상의 약학적으로 허용되는 성분을 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
   
9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항 및/또는 제6항 또는 제7항 및/또는 제8항에 있어서, 상기 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환은 노화 및/또는 대사 장애 또는 질환, 바람직하게는 비만 및/또는 당뇨병과 연관되고/되거나 이에 의해 유발되는 것인, 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 약학적 조성물.
   
10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항 및/또는 제6항 또는 제7항 및/또는 제8항에 있어서, 상기 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환은 신경염증, 신경변성, 인지 저하 및/또는 이와 관련된 질환 또는 상태인, 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 약학적 조성물.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 신경염증, 신경변성 및/또는 인지 저하와 연관되고/되거나 이에 의해 유발되는 질환 또는 상태는 인지 장애, 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 레비 소체 치매, 전측두엽 치매(FTD), 파킨슨병, 파킨슨 유사 질환, 파킨슨증, 헌팅턴병, 외상성 뇌손상, 프리온병, HIV 감염으로 인한 치매/신경인지 문제, 노화로 인한 치매/신경인지 문제, 타우병증, 다발성 경화증 및 기타 신경염증성/신경퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 알츠하이머병, 파킨슨병, 파킨슨 유사 질환 및 헌팅턴병으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 알츠하이머병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 알츠하이머병인, 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 약학적 조성물.
    
12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항 및/또는 제6항 또는 제7항 및/또는 제8항에 있어서, 상기 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환은 행동 장애, 바람직하게는 불안 장애 또는 우울 장애인, 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 약학적 조성물.
    
13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항 및/또는 제6항 또는 제7항 및/또는 제8항에 있어서, 상기 중추신경계(CNS) 장애 또는 질환은 신경근 장애이고, 바람직하게는 신경근 장애는 근육 기능 저하, 근력 저하, 협응 저하, 균형 저하 및/또는 활동 저하이거나 이와 관련이 있는, 유전자 구조체 및/또는 발현 벡터 및/또는 약학적 조성물.
    
14. 대상에게 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 구조체 및/또는 제6항 또는 제7항에 기재된 발현 벡터 및/또는 제8항에 기재된 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 바람직하게는 대상은 노인 대상 및/또는 대사 장애 또는 질환, 바람직하게는 당뇨병 및/또는 비만으로 진단된 대상인, 대상의 기억력 및/또는 학습을 개선하는 방법.
    
15. 대상에게 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 구조체 및/또는 제6항 또는 제7항에 기재된 발현 벡터 및/또는 제8항에 기재된 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 바람직하게는 대상은 노인 대상 및/또는 대사 장애 또는 질환, 바람직하게는 당뇨병 및/또는 비만으로 진단된 대상인, 대상의 근육 기능, 근력, 협응력, 균형 및/또는 활동 저하를 개선하는 방법.
    

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