[go: up one dir, main page]

KR20220004076A - 리툭시맙-내성 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

리툭시맙-내성 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220004076A
KR20220004076A KR1020217036085A KR20217036085A KR20220004076A KR 20220004076 A KR20220004076 A KR 20220004076A KR 1020217036085 A KR1020217036085 A KR 1020217036085A KR 20217036085 A KR20217036085 A KR 20217036085A KR 20220004076 A KR20220004076 A KR 20220004076A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gly
ser
leu
pro
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
KR1020217036085A
Other languages
English (en)
Inventor
토마스 찰스 페르텔
바브라 존슨 사수
마크 더블유 레오날드
Original Assignee
알로젠 테라퓨틱스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 알로젠 테라퓨틱스 인코포레이티드 filed Critical 알로젠 테라퓨틱스 인코포레이티드
Publication of KR20220004076A publication Critical patent/KR20220004076A/ko
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

CD19에 특이적으로 결합하고 리툭시맙 결합에 내성인 CD19 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 이들 CD19-특이적 CAR을 포함하는 면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)가 본원에서 제공된다. 또한, 이들 CD19-특이적 CAR, 및 이들 CD19-특이적 CAR을 포함하는 면역 세포를 제조하고 사용하는 방법이 제공된다.

Description

리툭시맙-내성 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 4월 26일에 출원된 미국 가출원 제62/839,455호; 및 2020년 4월 3일에 출원된 미국 가출원 제63/005,041호에 대한 우선권을 주장하며, 둘 모두의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
본 개시는 CD19에 결합하는 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR), 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이를 사용하는 환자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다. 2020년 4월 21일에 생성된 전술한 ASCII 사본의 명칭은 AT-028_03WO_SL.txt이며, 크기는 81,460 바이트이다.
암 관련 항원을 인식하도록 유전적으로 변형된 면역 세포의 입양 전달은 암 치료에 대한 새로운 접근법으로서의 가능성을 나타낸다(예를 들어, Brenner 등, Current Opinion in Immunology, 22(2): 251-257 (2010); Rosenberg 등, Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008) 참조). 면역 세포는 키메라 항원 수용체(CAR), CD19 항원 인식 모이어티로 이루어진 융합 단백질 및 T 세포 활성화 도메인을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다(예를 들어, Eshhar 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993), 및 Sadelain 등, Curr. Opin. Immunol, 21(2): 215-223 (2009) 참조). CAR-T 세포(CAR-T)와 같은 CAR을 함유하는 면역 세포는 표적 세포를 인식하고 죽이는 능력을 유지시키거나 향상시키면서 항원 특이성을 가지도록 조작된다.
암, 특히 CD19의 비정상적인 발현을 수반하는 악성 종양에 대한 치료제가 필요하다. 이러한 요구를 해결하는 방법 및 조성물이 본원에서 제공된다.
CD19에 특이적으로 결합하는 CD19 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR); 이들 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 이들 CD19-특이적 CAR을 발현하는 면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)가 본원에서 제공된다. 또한, 이들 CD19-특이적 CAR, 및 이들 CD19-특이적 CAR을 포함하는 면역 세포를 제조하고 사용하는 방법이 제공된다.
일 양태에서, 본 개시는 서열번호 9와 적어도 70% 동일한 항-CD19 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기에서 폴리펩티드는 리툭시맙 결합 부위를 포함하지 않으며, 폴리뉴클레오티드는 포유류 T 세포에서 항-CD19 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현할 수 있는 짧은 EF1a 프로모터를 포함한다.
일부 구현예에서, 짧은 EF1a 프로모터는 서열번호 15의 핵산 서열 내에 인트론 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 인트론은 서열번호 39의 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 16의 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 15의 핵산 서열을 포함하는 전장 EF1a 프로모터이다.
일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 15의 핵산 서열을 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8 내지 14 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드를 암호화한다. 　
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 안전 스위치를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 안전 스위치는 링커 펩티드를 사용하여 CD19 CAR에 연결된다.
일부 구현예에서, 안전 스위치는 T2A 링커를 사용하여 항-CD19 CAR에 연결된다.
일부 구현예에서, 안전 스위치는 항체 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 안전 스위치는 돌연변이된 CD20 미모토프(mimotope)를 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 CD8 힌지/막관통 도메인을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 CD34 에피토프를 포함한다.
일부 구현예에서, CD34 에피토프는 QBEND-10 에피토프이다.
일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 　
일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8 내지 14 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드를 암호화한다. 　
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에서 기술된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
일부 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, DNA 벡터, 플라스미드, RNA 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스 관련 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일 양태에서, 본 개시는 본원에서 기술된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 서열번호 3과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 　
일부 구현예에서, 본 개시는 표 1에 나타낸 바와 같이 항-CD19 CAR v1.2, v1.3, v1.4, v1.5 또는 v1.6 렌티바이러스 작제물과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 표 1에 나타낸 바와 같이 항-CD19 CAR v1.2 렌티바이러스 작제물과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 신호 서열이 있거나 없는 서열번호 9 또는 서열번호 10과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 서열번호 16의 핵산을 포함하는 EF1a 짧은 프로모터에 의해 유도되는, 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 개시는 서열번호 16의 핵산을 포함하는 EF1a 짧은 프로모터에 의해 유도되는, 신호 서열이 있거나 없는 서열번호 9 또는 10의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 EF1a 유전자의 제1 인트론을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 리툭시맙 미모토프를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 도 1에 도시된 CD19 CAR v1.2 렌티바이러스 작제물을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다(ALLO-501A로도 지칭될 수 있음).
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 본원에서 기술된 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포, 종양 침윤성 림프구(TIL), NK 세포, TCR 발현 세포, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포이다.
일부 구현예에서, 세포는 자가 T 세포이다.
일부 구현예에서, 세포는 동종 T 세포이다.
일 양태에서, 본 개시는 본원에서 기술된 조작된 면역 세포를 제공하며, 여기에서 세포는 리툭시맙에 내성을 갖는다.
다른 양태에서, 본 개시는 전술한 바와 같은 조작된 면역 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법을 제공하며, 이는 본원에서 기술된 바와 같은 조작된 면역 세포, 또는 본원에서 기술된 바와 같은 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 비호지킨(Non-Hodgkin) 림프종(NHL)이다.
일부 구현예에서, 대상체는 리툭시맙으로 치료받았거나 현재 치료 중이다.
일 양태에서, 본 개시는 본원에서 기술된 키메라 항원 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포 또는 조작된 면역 세포를 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
도 1은 리툭시맙-내성 CD19 키메라 항원 수용체의 개략도를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 리툭시맙 내성 CAR 발현 벡터로 형질도입된 Pan T 세포로부터의 5일차의 CAR 발현을 보여주는 유세포 계측 플롯을 나타낸다. 도 2a는 공여자 541 및 604로부터의 세포에서의 CAR 발현을 나타낸다. 도 2b는 공여자 410으로부터의 세포에서의 CAR 및 CD34 발현을 나타낸다. 유사한 프로파일이 공여자 2593에서 관찰되었다(데이터 미도시).
도 3은 13일차에 4 개체의 공여자 모두로부터의 정규화된 세포 증식 및 최종 CAR 발현을 나타낸다.
도 4a 내지 4d는 리툭시맙 내성 CAR 발현 벡터로 형질도입된, 공여자 541(도 4a), 604(도 4b), 410(도 4c), 2593(도 4d)으로부터의 Pan T 세포의 시간 경과에 따른 세포 증식 및 CAR 발현을 나타낸다.
도 5a 내지 5d는 리툭시맙 내성 CAR 발현 벡터로 형질도입된, 공여자 541(도 5a), 604(도 5b), 410(도 5c), 2593(도 5d)으로부터의 Pan T 세포의 5일차, 9일차 및 13일차에서의 CD4/CD8 비를 나타낸다.
도 6a 내지 6d는 리툭시맙 내성 CAR 발현 벡터로 형질도입된, 공여자 541(도 6a), 604(도 6b), 410(도 6c), 2593(도 6d)으로부터의 Pan T 세포의 9일차에서의 표현형 및 활성화를 나타낸다.
도 7은 9일차에 4 개체의 공여자 모두로부터 평균화된 TIM3 및 PD1 염색을 사용하여 측정된 표현형, 활성화 %CD8+, 및 무력도(anergy)를 나타낸다.
도 8a 내지 8d는 리툭시맙 내성 CAR 발현 벡터로 형질도입된, 공여자 541(도 8a), 604(도 8b), 410(도 8c), 2593(도 8d)으로부터의 Pan T 세포의 13일차에서의 표현형 및 활성화를 나타낸다.
도 9는 13일차에 4 개체의 공여자 모두로부터 TIM3 및 PD1 염색을 사용하여 측정된 표현형, 활성화 %CD8+, 및 무력도를 나타낸다.
도 10은 각 CAR 작제물에 대한 표적 세포로서 Raji 세포를 사용하는 평균 단기(24시간) 사멸 분석을 나타낸다.
도 11a 내지 11d는 각각의 CAR 작제물에 대해 8:1(도 11a), 4:1(도 11b), 2:1(도 11c), 및 1:1(도 11d)의 E:T를 갖는 표적 세포로서 A549-CD19+ 세포를 사용하는 평균 장기 사멸 분석을 나타낸다.
도 12는 Pan T 세포를 리툭시맙-내성 렌티바이러스 작제물(ALLO-501v1.2 및 v1.3) 또는 리툭시맙-민감성 렌티바이러스 작제물(ALLO-501v1.0)의 렌티바이러스 제제의 연속 희석으로 형질도입한 후 5일차에서의 %CAR+ T 세포의 레벨을 나타낸다.
도 13a 및 13b는, Raji 세포를 가진 NSG 마우스 종양 모델에서 시험했을 때, 리툭시맙-내성 CAR 발현 벡터(ALLO-501v1.2) 또는 리툭시맙-민감성 CAR 발현 벡터(ALLO-501v1.0)로 형질도입된 공여자 541(도 13a) 및 604(도 13b)로부터의 Pan T 세포의 생체 내 효능을 나타낸다.
키메라 항원 수용체(CAR) 요법은 암 치료에 대한 유망한 접근법이다. v1.0으로서 본원에서 기술된 CAR 작제물은 안전 스위치로서 작용하는 합성 펩티드, RQR8을 발현하는 예시적인 항-CD19 CAR이다. RQR8은 2개의 리툭시맙 결합 미모토프를 함유한다. 이상 반응의 경우, 환자는 순환 중인 항-CD19 v1.0의 레벨을 고갈시키기 위해 리툭시맙으로 치료될 수 있다. 리툭시맙은 또한 일부 비호지킨 림프종(NHL) 징후에서 표준 치료로 사용되며, 고용량으로 투여된다. 리툭시맙의 긴 반감기로 인해, 순환하는 리툭시맙의 레벨이 낮은 농도에 도달할 때까지 항-CD19 v1.0을 환자에게 투여할 수 없다. 리툭시맙 내성 CD19 CAR 요법은 이전에 리툭시맙으로 치료 받은 환자가 리툭시맙 레벨이 감소할 때까지 기다릴 필요 없이, 성분채집술을 받지 않고 CAR-T 요법을 즉시 받을 수 있게 한다. CD20 결합 항체 리툭시맙에 내성을 갖는 항-CD19 키메라 항원 수용체(CAR)가 본원에서 제공된다. 신규 CAR 작제물은 CAR 발현 및 활성을 유지하면서 리툭시맙 결합을 제거하도록 설계된다.
I. 키메라 항원 수용체
본원에서 사용되는 바와 같이, 키메라 항원 수용체(CAR)는 표적 항원(예를 들어, 암세포 상의 표적 항원)을 특이적으로 인식하는 단백질이다. 표적 항원에 결합될 경우, CAR은 면역 세포를 활성화시켜 그 항원(예를 들어, 암 세포)을 가진 세포를 공격하고 파괴할 수 있다. CAR은 또한 그들의 효능을 증가시키기 위해 공자극 또는 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다. Krause 등, J. Exp. Med., Volume 188, No. 4, 619-626(1998); Finney 등, Journal of Immunology, 161: 2791-2797(1998), Song 등, Blood 119:696-706(2012); Kalos 등, Sci. Transl. Med. 3:95(2011); Porter 등, N. Engl. J. Med. 365:725-33(2011), 및 Gross 등, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 56:59-83(2016); 미국 특허 제7,741,465호 및 제6,319,494호 참조.
본원에서 기술된 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하되, 세포외 도메인은 CD19에 특이적으로 결합하는 CD19 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 특이적 CAR은 신호 서열, CD19 항원 결합 도메인(예를 들어, 4G7로부터 유래된 scFv), 힌지 및 막관통 영역, 및 하나 이상의 연속적인 신호 전달 도메인과 같은 5'에서 3'까지의 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 결합 도메인은 CD19에 결합하여 CD19의 발현과 관련된 혈액암을 치료한다.
동종 항-CD19 CAR v1.0에 사용된 키메라 항원 수용체(CAR)의 scFv 부분은 마우스 항-인간 CD19 항체 클론 4G7로부터 유래된다. 4G7은 CD19를 인식하는 CD19 단클론 항체이다. 4G7로부터 형성된 단쇄 가변 단편(scFv)은 일부 키메라 항원 수용체(CAR)의 표적화 성분을 포함한다(WO2014184143A1 참조). 일부 구현예에서, CD19 단클론 항체 4G7로부터 유래된 scFv는 가요성 링커에 의해 함께 연결된 CD19 단클론 항체 4G7 면역글로불린 감마 1 중쇄의 일부(GenBank: CAD88275.1; 서열번호 17) 및 CD19 단클론 항체 4G7 면역글로불린 카파 경쇄의 일부(GenBank: CAD88204.1; 서열번호 35)를 포함한다. (Peipp M., D. Saul, 등, 2004, Efficient eukaryotic expression of fluorescent scFv fusion proteins directed against CD antigens for FACS applications. J. Immunol. Methods, 285:265-280 참조). 일부 구현예에서, scFv는 가요성 링커에 의해 함께 연결된 CD19 단클론 항체 4G7 면역글로불린 감마 1 중쇄의 가변 단편 및 CD19 단클론 항체 4G7 면역글로불린 카파 경쇄의 가변 단편을 포함한다.
CD19 단클론 항체 4G7 면역글로불린 감마 1 중쇄(신호 서열은 밑줄이 그어져 있음)
MEWSWIFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELIKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGTYYYGSRVFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(서열번호 17).
CD19 단클론 항체 4G7 면역글로불린 카파 경쇄(신호 서열은 밑줄이 그어져 있음)
MRCLAEFLGLLVLWIPGAIGDIVMTQAAPSIPVTPGESVSISCRSSKSLLNSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(서열번호 18).
일부 구현예에서, scFv는 서열번호 17 및/또는 서열번호 18의 아미노산 서열의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 34 및/또는 서열번호 35의 아미노산 서열의 가변 영역과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 포함한다. 4G7로부터 유래된 항-CD19 scFv에 특이적으로 결합하는, 항체를 포함하는 항원 결합 분자뿐만 아니라 이러한 서열을 포함하는 분자 및 이러한 분자를 나타내는 세포가 본원에 개시된다. 항원 결합 분자의 인간화 형태는 또한 본 개시의 양태로서 형성된다. 이들 항원 결합 분자의 적용 및 용도가 또한 개시된다.
a. 항원 결합 도메인
전술한 바와 같이, 본원에서 기술된 CD19 CAR은 항원 결합 도메인을 포함한다. 본원에서 사용된 "항원 결합 도메인"은 특정 표적 항원, 예를 들어, CD19 단백질 또는 이의 단편일 수 있는 특정 표적 항원에 결합하는 임의의 폴리펩티드를 의미한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 종양 세포 상의 CD19 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 증식성 질환에 관여하는 세포 상의 CD19 항원에 결합한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 가변 중쇄, 가변 경쇄, 및/또는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 경쇄 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3), 및 중쇄 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하는 단쇄 가변 단편(scFv)이다. 항원 결합 도메인의 변이체(예를 들어, CDR의 변이체, VH 및/또는 VL), 즉 각각 본원에서 기술된 항원 결합 도메인 서열의 아미노산 서열에 대해 적어도 70 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 95 내지 97%, 97 내지 99%, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄 또한 본 개시의 범위 내에 있다. 일부 경우, 이러한 분자는 적어도 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 포함하는 반면, 다른 경우, 변이체 형태는 2개의 가변 경쇄 및 2개의 가변 중쇄(또는 이의 하위 부분)를 함유한다. 당업자는 공지된 기술을 사용하여 본원에서 제시된 바와 같은 항원 결합 도메인의 적절한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 소정의 구현예에서, 당업자는 활성에 중요한 것으로 여겨지지 않는 영역을 표적화함으로써 활성을 파괴하지 않고 변경될 수 있는 분자의 적절한 영역을 식별할 수 있다.
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인의 폴리펩티드 구조는, 단클론 항체, 이중 특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체(본원에서 때때로 "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체(본원에서 때때로 "항체 접합체"로 지칭됨), 및 이의 단편을 각각 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 아비머를 포함하거나 이로 구성된다.
CD19 항원 결합 도메인은 제2 표적에 결합하는 것보다 더 단단히 하나의 표적에 결합할 때 "선택적"인 것으로 지칭된다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 scFv이다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본원에서 기술된 CD19 키메라 항원 수용체(CAR) 중 어느 하나를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시는 표 1에 기술된 바와 같은 CD19 CAR을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 이를 제조하는 방법이 본원에서 제공된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
b. 안전 스위치 및 단클론 항체 특이적 에피토프
안전 스위치
이상 반응은 (하나 이상의 CAR을 함유하는) 면역 세포를 리툭시맙 결합 에피토프가 아닌 자살 유전자로 형질도입함으로써 최소화될 수 있음이 이해될 것이다. 유도 가능한 "온(on)" 또는 "가속기" 스위치를 면역 세포 내에 통합하는 것 또한 바람직할 수 있다. 적합한 기술은, 세포가 본 개시의 CAR 작제물로 형질도입되기 전, 후, 또는 동시에 유도성 카스파제-9(미국 출원 제2011/0286980호) 또는 티미딘 키나아제를 사용하는 것을 포함한다. 자살 유전자 및/또는 "온" 스위치를 도입하기 위한 추가의 방법은 TALENS, 아연 핑거, RNAi, siRNA, shRNA, 안티센스 기술, 및 당업계에 공지된 다른 기술을 포함한다.
본 개시에 따르면, 추가적인 온-오프 또는 다른 유형의 제어 스위치 기술이 본원에 통합될 수 있다. 이들 기술은 이량체화 도메인 및 이러한 도메인 이량체화의 선택적인 활성화제의 사용을 도입할 수 있다. 이들 기술은, 예를 들어, 특정 세포에서 FKBP/Rapalog 이량체화 시스템을 이용하는 Wu 등, Science, 2014, 350(6258)에 기술된 것들을 포함하며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 추가적인 이량체화 기술은, 예를 들어, Fegan 등, Chem. Rev. 110, 3315-3336(2010) 및 미국 특허 제5,830,462호; 제5,834,266호; 제5,869,337호; 및 제6,165,787호에 기술되어 있고, 그 내용 또한 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 추가적인 이량체화 쌍은 시클로스포린-A/시클로필린, 수용체, 에스트로겐/에스트로겐 수용체(선택적으로 타목시펜 사용), 글루코코르티코이드/글루코코르티코이드 수용체, 테트라사이클린/테트라사이클린 수용체, 비타민 D/비타민 D 수용체를 포함할 수 있다. 이량체화 기술의 추가적인 예는, 예를 들어, WO2014/127261, WO2015/090229, US2014/0286987, US2015/0266973, US2016/0046700, 미국 특허 제8,486,693호, US2014/0171649, 및 US2012/0130076에서 찾을 수 있으며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 추가로 통합된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 CAR-면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)는 리툭시맙 결합이 결핍된 자살 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 자살 펩티드는 돌연변이된 RQR8 서열을 포함한다. 예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 통합되는 WO2013153391A 참조. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 CAR-면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)에서, 자살 폴리펩티드는 CAR-면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)의 표면에서 발현된다. 일부 구현예에서, 자살 폴리펩티드는 서열번호 19에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 　
CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(서열번호 19).
자살 폴리펩티드는 또한 아미노 말단에 신호 펩티드를 포함할 수 있다 - 예를 들어, MGTSLLCWMALCLLGADHADA(서열번호 20). 일부 구현예에서, 자살 폴리펩티드는 서열번호 21에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 이는 서열번호 20의 신호 서열을 포함한다. 　
MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(서열번호 21).
특정 구현예에서, 자살 펩티드는 리툭시맙 결합을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이된 잔기, 삽입된 잔기, 또는 결실된 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
자살 폴리펩티드가 CAR-면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)의 표면에서 발현될 경우, 폴리펩티드의 자살 유전자 에피토프에 결합하는 항체는 세포의 용해를 야기한다. CD19-특이적 CAR-면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)의 결실은, 예를 들어, 자살 제제를 환자에게 투여함으로써 생체 내에서 발생할 수 있다. 전달된 세포를 결실시키기로 하는 결정은, 예를 들어 허용되지 않는 레벨의 독성이 검출되는 경우와 같은, 환자에서 검출되는 전달된 세포에 기인하는 바람직하지 않은 효과로부터 발생할 수 있다. 본원에서 사용되는, "자살 제제"는 CAR 면역 세포에 결합하여 면역 세포를 발현하는 CAR의 용해를 유발하는 분자를 지칭한다.
일부 구현예에서, 자살 폴리펩티드는 세포의 표면에서 발현된다. 일부 구현예에서, 자살 폴리펩티드는 CAR 작제물에 포함된다. 일부 구현예에서, 자살 폴리펩티드는 CD19 CAR 작제물의 일부가 아니다.
일부 구현예에서, 본원에서 개시된 CD19-특이적 CAR 중 어느 하나의 세포외 도메인은 단클론 항체에 특이적인(즉, 단클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는) 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 이들 에피토프는 본원에서 mAb-특이적 에피토프로도 지칭된다. 예시적인 mAb-특이적 에피토프는 국제 특허 공개 WO2016/120216호에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 통합된다. 이들 구현예에서, CAR의 세포외 도메인은 CD19에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 및 하나 이상의 단클론 항체(mAb)에 결합하는 하나 이상의 에피토프를 포함한다. mAb-특이적 에피토프를 포함하는 CAR은 단쇄 또는 다쇄일 수 있다.
본원에서 기술된 CAR의 세포외 도메인에서 단클론 항체에 특이적인 에피토프를 포함하는 것은 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포의 분류 및 고갈을 허용한다. 일부 구현예에서, 이러한 특징은 또한 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포의 투여에 의해 고갈된 내인성 CD19 발현 세포의 회복을 촉진한다. 일부 구현예에서, 고갈을 허용하는 것은, 예를 들어, 대상체에게 투여 시, 유해한 효과의 경우에 안전 스위치를 제공한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 개시는 mAb-특이적 에피토프를 포함하는 CAR와 함께 제공된 조작된 면역 세포를 분류 및/또는 고갈시키기 위한 방법 및 내인성 CD19-발현 세포의 회복을 촉진하기 위한 방법에 관한 것이다.
단클론 항체 특이적 에피토프를 포함하는 CAR를 생성하기 위해, 특히, 비제한적인 예로서 CD34 에피토프/QBEND-10과 같은 의학적 용도 또는 GMP 제조의 용도에 대해 이미 승인된 것들을 생성하기 위해, 여러 에피토프-단클론 항체 커플이 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 mAb-특이적 에피토프(들)를 발현하는 CD19-특이적 CAR이 부여된 조작된 면역 세포를 분류하는 방법, 및 이들 CAR이 부여된 조작된 면역 세포의 활성화가 전술한 CAR의 외부 리간드 결합 도메인을 표적화하는 항체를 사용하여 세포를 고갈시킴으로써 조절되는 치료 방법을 포함한다. 표 2은 본 개시의 CAR의 세포외 도메인에 삽입될 수 있는 예시적인 미모토프 서열을 제공한다.
Figure pct00009
특정 구현예에서, CAR은 표 2에 제시된 에피토프 또는 미모토프 아미노산 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 에피토프 또는 미모토프 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 서열번호 22가 아니거나 이를 포함하지 않는 에피토프 또는 미모토프 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프 또는 미모토프를 포함한다. 　
c. 힌지 도메인
본 개시의 CAR의 세포외 도메인은 "힌지" 도메인(또는 힌지 영역)을 포함할 수 있다. 이 용어는 통상적으로 CAR 내의 막관통 도메인을 CAR 내의 세포외 항원 결합 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 폴리펩티드에 대한 것이다. 특히, 힌지 도메인은 세포외 항원 결합 도메인에 대한 더 많은 유연성 및 접근성을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
힌지 도메인은 최대 300개의 아미노산을 포함할 수 있고, 일부 구현예에서는 10 내지 100개의 아미노산, 또는 일부 구현예에서는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 힌지 도메인은 자연적으로 발생하는 분자의 전부 또는 일부, 예를 들어, CD8, CD4, CD28, 4-1BB, 또는 IgG의 세포외 영역의 전부 또는 일부(특히, IgG의 힌지 영역; 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, 또는 이의 단편과 같은 면역글로불린 계통의 일부 또는 전부를 함유할 수 있음), 또는 항체 중쇄 불변 영역의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 힌지 도메인은 자연적으로 발생하는 힌지 서열에 상응하는 합성 서열일 수 있거나, 완전히 합성된 힌지 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 전술한 힌지 도메인은 인간 CD8α 사슬(예를 들어, NP_001139345.1)의 일부이다. 또 다른 특정 구현예에서, 전술한 힌지 및 막관통 도메인은 인간 CD8α 사슬의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 기술된 CAR의 힌지 도메인은 CD8α, IgG1, IgG4, PD-1 또는 FcγRIIIα의 하위 서열, 특히 CD8α, IgG1, IgG4, PD-1 또는 FcγRIIIα 중 어느 하나의 힌지 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 인간 CD8α 힌지, 인간 IgG1 힌지, 인간 IgG4, 인간 PD-1 또는 인간 FcγRIIIα 힌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 개시된 CAR은 scFv, CD8α 인간 힌지 및 막관통 도메인, CD3ζ 신호 전달 도메인, 및 4-1BB 신호 전달 도메인을 포함한다. 표 3은 본원에서 제공된 예시적인 힌지에 대한 아미노산 서열을 제공한다.
Figure pct00010
특정 구현예에서, 힌지 영역은 표 3에 제시된 힌지 도메인 아미노산 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 힌지 도메인 아미노산 서열을 포함한다.
d. 막관통 도메인
본 개시의 CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인으로 설계된다. 이는 유사하게 CAR의 세포내 도메인에 융합될 수 있다. 일부 경우, 막관통 도메인은, 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하도록 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 짧은 링커는 CAR의 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인 중 어느 하나 또는 일부 사이에 결합을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 글리신 반복 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 (GGGGS)n을 포함하되, n은 1, 2, 3, 4 또는 5이다(서열번호 41).
본원에 개시된 CAR에 대한 적절한 막관통 도메인은 (a) 림프구 세포(예를 들어, 제한 없이, T 헬퍼(Th) 세포, 세포독성 T(Tc) 세포, T 조절(Treg) 세포, 또는 자연 살해(NK) 세포)와 같은 면역 세포의 표면에서 발현되고/되거나 (b) 표적 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 유도하기 위해 세포외 항원 결합 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인과 상호작용하는 능력을 갖는다.
막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다.
본 개시에서 특정적으로 사용되는 막관통 영역은, CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, 예정사멸-1 (PD-1), 유도성 T 세포 공자극제(ICOS), 림프구 기능 연관 항원-1(LFA-1, CD1-1a/CD18), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD247, CD276(B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig 알파(CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 부류 1분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호 전달 림프구 활성화 분자(Signaling Lymphocytic Activation Molecules, SLAM 단백질), 활성 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래될 수 있다(이들로 이루어지거나 이에 상응할 수 있다).
비제한적인 예로서, 막관통 영역은 α, β, γ 또는 δ와 같은 T 세포 수용체, CD3 복합체를 구성하는 폴리펩티드, IL-2 수용체 p55(α 사슬), p75(β 사슬) 또는 γ 사슬, Fc 수용체의 서브유닛 사슬, 특히 Fcγ 수용체 III 또는 CD 단백질로부터 유래되거나, 이의 일부일 수 있다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성 도메인일 수 있고, 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 주로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전술한 막관통 도메인은 인간 CD8α 사슬(예를 들어, NP_001139345.1)로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 CAR 내의 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 CAR 내의 막관통 도메인은 아미노산 서열 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(서열번호 35)를 포함하는 CD8α 막관통 도메인이다. 일부 구현예에서, CD8α 막관통 도메인은 서열번호 35의 막관통 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 CAR 내의 힌지 및 막관통 도메인은 아미노산 서열
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(서열번호 36)을 포함하는 CD8α 힌지 및 막관통 도메인이다.
e. 세포내 도메인
본 개시의 CAR의 세포내(세포질) 도메인은 CAR을 포함하는 면역 세포의 정상적인 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 제공할 수 있다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 세포 용해 활성 또는 헬퍼 활성을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, CAR에 사용하기 위한 활성화 세포내 신호 전달 도메인은, 예를 들어, 제한 없이, 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 T 세포 수용체 및 공수용체의 세포질 서열일 수 있고, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열일 수 있다.
적절한 (예를 들어, 활성화시키는) 세포내 도메인은, CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, 예정사멸-1 (PD-1), 유도성 T 세포 공자극제(ICOS), 림프구 기능 연관 항원-1(LFA-1, CD1-1a/CD18), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD247, CD276(B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig 알파(CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 부류 1분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호 전달 림프구 활성화 분자(Signaling Lymphocytic Activation Molecules, SLAM 단백질), 활성 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된 (또는 이에 상응하는) 신호 전달 도메인을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다는 것이 이해될 것이다.
본 개시의 CAR의 세포내 도메인은, 전술한 활성화 도메인 이외에, 공자극 신호 전달 도메인(본원에서 공자극 분자로 상호 교환 가능하게 지칭됨)을 통합하여 이의 효능을 증가시킬 수 있다. 공자극 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 활성화 분자에 의해 제공되는 일차 신호 이외의 추가적인 신호를 제공할 수 있다.
본 개시의 범위 내의 적절한 공자극 도메인은, 예를 들어, CD28, OX40, 4-1BB/CD137, CD2, CD3(알파, 베타, 델타, 엡실론, 감마, 제타), CD4, CD5, CD7, CD9, CD16, CD22, CD27, CD30, CD33, CD37, CD40, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, PD-1, ICOS, 림프구 기능 연관 항원-1(LFA-1)(CD1 1a/CD18), CD247, CD276(B7-H3), LIGHT(종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14; TNFSF14), NKG2C, Ig 알파(CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 부류 I 분자, TNFR, 인테그린, 신호 전달 림프구 활성화 분자, BTLA, Toll 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1-1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1-1a, LFA-1, ITGAM, CD1-1b, ITGAX, CD1-1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 리간드, 또는 이의 단편, 또는 이의 조합으로부터 유래될 수 있다(또는 상응할 수 있다). 위에 열거되지 않은 추가적인 공자극 분자 또는 이의 단편 또한 본 개시의 범위 내에 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, CAR의 세포내/세포질 도메인은 41BB/CD137 도메인을 그 자체로서 포함하거나 본 개시의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 도메인(들)과 조합되도록 설계될 수 있다. 41BB/CD137의 완전한 천연 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_001552.2에 기술되어 있다. 완전한 천연 41BB/CD137 핵산 서열은 NCBI 참조 서열: NM_001561.5에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, CAR의 세포내/세포질 도메인은 CD28 도메인을 그 자체로서 포함하거나 본 개시의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 도메인(들)과 조합되도록 설계될 수 있다. 완전한 CD28의 천연 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_006130.1에 기술되어 있다. 완전한 천연 CD28 핵산 서열은 NCBI 참조 서열: NM_006139.1에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, CAR의 세포내/세포질 도메인은 CD3 제타 도메인을 그 자체로서 포함하거나 본 개시의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 도메인(들)과 조합되도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 서열번호 38에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 95%, 97%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포내 도메인은 CD3 제타 사슬 부분 및 공자극 신호전달 분자의 부분을 포함할 수 있다. 본 개시의 CAR의 세포내 신호 전달 부분 내의 세포내 신호 전달 서열은 무작위 또는 특정 순서로 서로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 CD3 제타의 활성화 도메인 및 CD28의 신호 전달 도메인을 포함하도록 설계된다.
일부 구현예에서, 세포내 도메인은 CD3 제타의 활성화 도메인 및 4-1BB의 신호 전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일부 구현예에서, 4-1BB(세포내 도메인)는 아미노산 서열:
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(서열번호 37)을 포함한다.
CD3 제타 아미노산 서열은 서열번호 38을 포함할 수 있다. 　
LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(서열번호 38).
일부 구현예에서, 본 개시의 CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 공자극 분자의 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 41BB(GenBank: AAA53133) 및 CD28(NP_006130.1)의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 서열번호 37 또는 서열번호 38에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 95%, 97%, 또는 99%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 서열번호 37에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 95%, 97%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖고/갖거나 서열번호 38에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 95%, 97%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
예시적인 구현예에서, 본 개시의 CAR은 N-말단에서 C-말단까지, CD8α 신호 서열, CD19 scFv, CD8α 힌지 및 막관통 영역, 41BB 세포질 신호 전달 도메인, 및 CD3ζ 세포질 신호 전달 도메인을 포함한다.
III. CAR을 포함하는 면역 세포
a. 면역 세포
본 개시의 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)가 본원에서 제공된다.
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 CAR 집단을 포함하되, 각각의 CAR은 상이한 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CAR 집단을 포함하되, 각각의 CAR은 동일한 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다.
조작된 면역 세포는 동종 또는 자가일 수 있다.
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 T 세포(예를 들어, 염증성 T 림프구 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구, 헬퍼 T 림프구, 종양 침윤 림프구(TIL)), NK 세포, NK-T 세포, TCR 발현 세포, 수지상 세포, 살상 수지상 세포, 비만 세포, 또는 B 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 CD4+ T 림프구 및 CD8+ T 림프구로 이루어진 군으로부터 유래될 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 조작된 면역 세포는 T 세포이다. 일부 예시적인 구현예에서, 조작된 면역 세포는 감마 델타 T 세포이다. 일부 예시적인 구현예에서, 조작된 면역 세포는 대식세포이다.
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는, 예를 들어 줄기 세포로부터 유래될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 비-인간 배아 줄기 세포, 보다 구체적으로, 비-인간 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 전구 세포, 골수 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 말초 혈액으로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 세포는 골수로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 세포는 제대혈로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 전기천공, 초음파형성, 바이오리스틱스(예를 들어, Gene Gun), 지질 형질감염, 중합체 형질감염, 나노입자, 바이러스 형질감염(예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, AAV), 또는 다중총으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 핵산 벡터에 의해 형질감염되거나 형질도입된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 CD19-특이적 CAR을 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%를 초과하는 줄기 세포 기억 및 중추 기억 세포의 백분율을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 CD19-특이적 CAR을 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는 약 10% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 100%, 약 15% 내지 약 90%, 약 15% 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 70%, 약 15% 내지 약 60%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 100%, 약 25% 내지 약 50%, 약 75% 내지 약 100%, 또는 약 50% 내지 약 75%의 줄기 세포 기억 및 중추 기억 세포의 백분율을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 본원에서 기술된 CAR 중 어느 하나를 발현하는 염증성 T-림프구이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 본원에서 기술된 CAR 중 어느 하나를 발현하는 세포독성 T 림프구이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 본원에서 기술된 CAR 중 어느 하나를 발현하는 조절 T-림프구이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 본원에서 기술된 CAR 중 어느 하나를 발현하는 헬퍼 T 림프구이다.
증식 및 유전자 변형 전에, 세포의 공급원은 다양한 비제한적인 방법을 통해 대상체로부터 수득될 수 있다. 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 줄기 세포- 또는 iPSC-유래 T 세포 또는 NK 세포, 그리고 감염 부위, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양으로부터의 조직을 포함하는 다수의 비제한적인 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 당업자에게 이용 가능하고 공지된 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 건강한 공여자, 암으로 진단된 환자 또는 감염으로 진단된 환자로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 상이한 표현형 특성을 나타내는 혼합된 세포 집단의 일부일 수 있다.
또한, 전술한 방법 중 어느 하나에 따라 형질전환된 면역 세포(예를 들어, T 세포)로부터 수득된 세포주가 본원에서 제공된다. 또한, 면역억제 치료에 내성을 갖는 변형된 세포가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 본 개시에 따른 단리된 세포는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 개시의 면역 세포는, 일반적으로 공지된 방법을 사용하여, 면역 세포의 유전적 변형 전 또는 후에 활성화되고 증식될 수 있다. 대체로, 본 개시의 조작된 면역 세포는, 예를 들어, T 세포에 대한 활성화 신호를 생성하도록 T 세포의 표면 상에서 CD3 TCR 복합체 및 공자극 분자를 자극하는 제제와 세포를 접촉시킴으로써 증식될 수 있다. 예를 들어, 칼슘 아이오노포어 A23187, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA), 또는 피토헤마글루티닌(PHA)과 같은 유사분열성 렉틴과 같은 화학물질을 사용하여 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 집단은, 예를 들어, 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 표면에 고정된 항-CD28 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 아이오노포어와 함께 단백질 키나아제 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해, 시험관 내에서 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상에서 부속 분자의 공자극을 위해, 부속 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체는 비드 또는 플레이트 또는 다른 기판 상에 배치될 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은, 혈청(예를 들어, 소태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGA베타, 및 TNF를 포함하는 증식 및 생존에 필요한 인자, 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 기타 첨가제를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, Minimal Essential Media 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-vivo 15(Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는, 계면활성제, 플라스마산염, 및 N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올과 같은 환원제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 배지는 추가 아미노산, 피루브산나트륨, 및 비타민이 추가된 RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20, Optimizer가 포함될 수 있으며, 혈청이 없거나 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정의된 호르몬 세트의 적절한 양 및/또는 T 세포(예를 들어, IL-7 및/또는 IL-15)의 성장 및 증식에 충분한 사이토카인(들)의 양으로 충진될 수 있다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양에만 포함되고, 대상체에게 주입될 세포의 배양에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지원하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도(예를 들어, 37°C) 및 대기(예를 들어, 공기 + 5% CO2)에서 유지된다. 다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 세포는 조직 또는 세포와 공동 배양함으로써 증식될 수 있다. 세포는 또한 생체 내에서, 예를 들어 세포를 대상체에게 투여한 후 대상체의 혈액 내에서 증식될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시에 따른 조작된 면역 세포는 하나 이상의 파괴되거나 불활성화된 유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시에 따른 조작된 면역 세포는, CD52, CD19, GR, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, HLA, TCRα 및 TCRβ로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 파괴되거나 불활성화된 유전자를 포함하고/하거나, CAR, 다쇄 CAR 및/또는 pTα 이식유전자를 발현한다. 일부 구현예에서, 단리된 세포는 다쇄 CAR을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시에 따른 단리된 세포는, CD52 및 GR, CD52 및 TCRα, CDR52 및 TCRβ, CD19 및 CD52, CD19 및 TCRα, CD19 및 TCRβ, GR 및 TCRα, GR 및 TCRβ, TCRα 및 TCRβ, PD-1 및 TCRα, PD-1 및 TCRβ, CTLA-4 및 TCRα, CTLA-4 및 TCRβ, LAG3 및 TCRα, LAG3 및 TCRβ, TIM3and TCRα, Tim3 및 TCRβ, BTLA 및 TCRα, BTLA 및 TCRβ, BY55 및 TCRα, BY55 및 TCRβ, TIGIT 및 TCRα, TIGIT 및 TCRβ, B7H5 및 TCRα, B7H5 및 TCRβ, LAIR1 및 TCRα, LAIR1 및 TCRβ, SIGLEC10 및 TCRα, SIGLEC10 및 TCRβ, 2B4 및 TCRα, 2B4 및 TCRβ로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 파괴되거나 불활성화된 유전자를 포함하고/하거나 CAR, 다쇄 CAR 및/또는 pTα 이식유전자를 발현한다. 일부 구현예에서, 방법은 선택적 DNA 절단에 의해 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 엔도뉴클레아제를 세포 내에 도입함으로써 하나 이상의 유전자를 파괴하거나 불활성화시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 메가TAL 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALE-뉴클레아제), 또는 CRIPR(예를 들어, Cas9) 엔도뉴클레아제일 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 TCRα 유전자 및/또는 TCRβ 유전자(들)를 파괴하거나 불활성화시킴으로써 본 개시에 따른 세포에서 기능하지 않게 된다. 일부 구현예에서, 개체로부터 유래된 변형된 세포를 수득하는 방법이 제공되며, 여기에서 세포는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 신호 전달 경로와 독립적으로 증식할 수 있다. MHC 신호 전달 경로와 독립적으로 증식할 수 있고, 이러한 방법에 의해 수득되기 용이한 변형된 세포는 본 개시의 범위에 포함된다. 본원에서 개시된 변형된 세포는, 숙주 대 이식편(HvG) 거부 반응 및 이식편 대 숙주 질환(GvHD)에 대한 치료를 이를 필요로 하는 환자의 치료에 사용될 수 있다; 따라서, 본 개시의 범위는 파괴되고나 불활성화된 TCRα 및/또는 TCRβ 유전자를 포함하는 변형된 세포의 유효량을 투여함으로써 전술한 환자를 치료하는 단계를 포함하는, 숙주 대 이식편(HvG) 거부 반응 및 이식편 대 숙주 질환(GvHD)에 대한 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법이다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 하나 이상의 화학요법 약물에 내성이 있도록 조작된다. 화학요법 약물은, 예를 들어, 퓨린 뉴클레오티드 유사체(PNA)일 수 있으므로, 면역 세포를 입양 면역요법과 화학요법을 병용하는 암 치료에 적합하게 한다. 예시적인 PNA는, 예를 들어, 클로파라빈, 플루다라빈, 시클로포스파미드, 및 시타라빈을 단독으로 또는 조합하여 포함한다. PNA는 데옥시시티딘 키나아제(dCK)에 의해 모노-, 디-, 및 트리-포스페이트 PNA로 대사된다. 이들의 삼인산 형태는 DNA 합성을 위해 ATP와 경쟁하고, 세포자멸-유도제로서 작용하며, 트리뉴클레오티드 생산에 관여하는 리보뉴클레오티드 환원효소(RNR)의 강력한 억제제이다. 파괴되거나 불활성화된 dCK 유전자를 포함하는 CD19-특이적 CAR-T 세포가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, dCK 녹아웃 세포는, 예를 들어, mRNA의 전기천공에 의해 dCK 유전자를 표적으로 하는 특이적 TAL-눌세아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 T 세포의 형질감염에 의해 제조된다. dCK 녹아웃 CD19-특이적 CAR-T 세포는, 예를 들어 클로라파라빈 및/또는 플루다라빈을 포함하여, PNA에 내성이 있고, CD19-발현 세포에 대한 T 세포 세포독성 활성을 유지한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 단리된 세포 또는 세포주는 pTα 또는 이의 기능적 변이체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 세포 또는 세포주는 TCRα 유전자를 파괴하거나 불활성화시킴으로써 추가로 유전적으로 변형될 수 있다.
본 개시는 또한 본원에서 기술된 CAR 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다.
c. 제조 방법
본 개시의 CAR 및 면역 세포를 함유하는 CAR을 제조하는 방법이 본원에서 제공된다. 본 개시에 따른 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 항원 결합 도메인, 면역 세포, 조성물 등을 제조하는 데에는 다양한 공지된 기술이 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 및 벡터
일부 구현예에서, CAR은 플라스미드 벡터를 통해 이식유전자로서 면역 세포 내에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 플라스미드 벡터는, 예를 들어, 벡터를 수용한 세포의 식별 및/또는 선택을 제공하는 선택 마커를 함유할 수도 있다.
CAR 폴리펩티드는 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입한 후, 세포에서 실시간으로 합성될 수 있다. 대안적으로, CAR 폴리펩티드는 세포 외부에서 생산된 후, 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 작제물을 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, (예를 들어, 렌티바이러스 벡터를 사용하는) 안정한 형질전환 방법이 폴리뉴클레오티드 작제물을 세포의 게놈 내로 통합하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 일시적인 형질전환 방법은 폴리뉴클레오티드 작제물, 및 세포의 게놈 내에 통합되지 않은 폴리뉴클레오티드 작제물을 일시적으로 발현하는 데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 바이러스 매개 방법이 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스), 리포좀 등과 같은 임의의 적절한 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 일시적 변환 방법은, 예를 들어, 제한 없이, 미세주입, 전기천공 또는 입자 충돌을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 적어도 하나의 공자극 분자, 및 활성화 도메인에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 바이러스 벡터 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 쥣과 백혈병 바이러스 벡터, SFG 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 및 우두 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 핵산은 플라스미드 내에 함유된다.
일 양태에서, 본 개시는 포유류 T 세포에서 CAR 이식 유전자를 발현할 수 있는 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 EF1a 프로모터이다. 천연 EF1a 프로모터는, 아미노아실 tRNA를 리보솜으로 효소 전달하는 역할을 하는, 신장 인자-1 복합체의 알파 서브유닛의 발현을 유도한다. EF1a 프로모터는 포유류 발현 플라스미드에 광범위하게 사용되어 왔으며, 렌티바이러스 벡터로 클로닝된 이식 유전자로부터 CAR 발현을 유도하는 데 효과적인 것으로 나타났다. 예를 들어, Milone 등, Mol. Ther. 17(8): 1453-1464(2009) 참조. 일부 구현예에서, EF1a 프로모터는 서열번호 15로서 제공된 서열을 포함한다. 　
GCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAG GTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACGCCCCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA(서열번호 15)
전술한 EF1a 프로모터 서열은 EF1a 유전자의 제1 엑손(굵은 글씨체) 및 제1 인트론(밑줄이 그어짐, 서열번호 39)을 포함하고, 이어서 제2 엑손의 N-말단 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드는 짧은 EF1a 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15의 핵산 서열보다 짧은 EF1a 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드는 EF1a 유전자의 제1 인트론을 포함하지 않는 EF1a 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39의 핵산 서열을 포함하지 않는 EF1a 프로모터를 포함한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 서열번호 16으로서 제공된 서열을 포함한다.
GCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAG(서열번호 16)
본원에서 기술된 면역 세포의 시험관 내 조작 또는 유전적 변형 전에, 세포는 대상체로부터 수득될 수 있다. CD19 CAR을 발현하는 세포는 동종 또는 자가 프로세스로부터 유래될 수 있다.
원재료
일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포를 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 그리고 감염 부위, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양으로부터의 조직을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 특정 구현예에서, T 세포는 FICOLLTM 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액의 유니트로부터 수득될 수 있다.
세포는 성분채집술에 의해 개체의 순환 혈액으로부터 수득될 수 있다. 성분채집술 제품은 일반적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 특정 구현예에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 세척되어 혈장 분획이 제거되고, 후속 프로세스를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 놓일 수 있다.
특정 구현예에서, T 세포는, 예를 들어 PERCOLLTM 구배를 통한 원심분리를 사용하여, 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 PBMC로부터 단리된다. T 세포(예를 들어, CD28+, CD4+, CDS+, CD45RA-, 및 CD45RO+ T 세포 또는 CD28+, CD4+, CDS+, CD45RA-, CD45RO+, 및 CD62L+ T 세포)의 특이적 하위모집단은 당업계에 공지된 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 음성 선별에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성으로 선별된 세포에 대해 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 본원에서 사용하기 위한 하나의 방법은 음성 자기 면역 부착성 또는 유세포 계측법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이며, 이는 음성으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커를 대상으로 한 단클론 항체의 칵테일을 사용한다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부하게 하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 일반적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 유세포 계측법 및 세포 분류는 또한 본 개시에 사용하기 위해 관심 세포 집단을 단리하는데 사용될 수 있다.
PBMC는 본원에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 면역 세포(예를 들어, CAR 또는 TCR)를 사용하는 유전적 변형에 직접 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, PBMC를 단리한 후, T 림프구를 추가로 단리할 수 있고, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구 둘 모두는 유전적 변형 및/또는 증식 전 또는 후에 미처리, 기억 및 효과기 T 세포 하위모집단으로 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포는 이들 유형의 CD8+ 세포 각각과 연관된 세포 표면 항원을 식별함으로써 미처리, 줄기 세포 기억, 중추 기억, 및 효과기 세포로 추가로 분류된다. 일부 구현예에서, 중추 기억 T 세포의 표현형 마커의 발현은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및 CD127을 포함하고, 그랜자임 B에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 줄기 세포 기억 T 세포는 CD45RO-, CD62L+, CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 중추 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 효과기 T 세포는 CD62L, CCR7, CD28 및 CD127에 대해 음성이고, 그랜자임 B 및 퍼포린에 대해 양성이다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 하위모집단으로 추가로 분류된다. 예를 들어, CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 식별함으로써 미처리, 중추 기억, 및 효과기 세포로 분류될 수 있다.
줄기 세포 유래 면역 세포
일부 구현예에서, 면역 세포는 배아 줄기(ES) 또는 유도된 다능성 줄기(iPS) 세포로부터 유래될 수 있다. 적절한 HSC, ES 세포, iPS 세포 및 다른 줄기 세포는 불멸 세포주로부터 배양되거나 환자로부터 직접 단리될 수 있다. 줄기 세포를 단리, 발생 및/또는 배양하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 재프로그램화된 T 세포로부터 유래된 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)이다. 일부 구현예에서, 원재료는 T 세포 또는 비-T 세포로부터 유래된 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)일 수 있다. 원재료는 배아 줄기 세포일 수 있다. 원재료는 B 세포, 또는 말초 혈액 단핵 세포 단리체, 조혈 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 지방 줄기 세포, 또는 임의의 다른 체세포 유형 유래의 임의의 다른 세포일 수 있다.
단리된 세포의 유전적 변형
T 세포와 같은 면역 세포는 공지된 방법을 사용하여 단리한 후 유전적으로 변형될 수 있거나, 면역 세포는 유전적으로 변형되기 전에 시험관 내에서 활성화되고 증식(또는 전구세포의 경우 분화)될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 면역 세포는 내인성 TCRα 및/또는 CD52의 발현을 감소시키거나 제거하기 위해 유전적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 세포는 내인성 단백질(예를 들어, TCRα 및/또는 CD52)의 발현을 감소시키거나 제거하기 위해 유전자 편집 기술(예를 들어, CRISPR/Cas9, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), TALEN, MegaTAL, 메가뉴클레아제)을 사용하여 유전적으로 변형된다. 또 다른 구현예에서, T 세포와 같은 면역 세포는 본원에서 기술된 키메라 항원 수용체(예를 들어, CAR을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입됨)로 유전적으로 변형된 후, 시험관 내에서 활성화되고/되거나 증식된다. T 세포를 활성화하고 증식시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제6,905,874호; 미국 특허 제6,867,041호; 미국 특허 제6,797,514호, 및 PCT WO2012/079000(이들의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 통합됨)에 기술되어 있다. 대체로, 이러한 방법은 IL-2와 같은 적절한 사이토카인을 갖는 배양 배지에서 PBMC 또는 단리된 T 세포를 자극 분자 및 항-CD3 및 항-CD28 항체와 같은 공자극 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 동일한 비드에 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체는 "대체" 항원 제시 세포(APC)로서 기능한다. 일 실시예는 Dynabeads® 시스템, 인간 T 세포의 생리학적 활성화를 위한 CD3/CD28 활성화제/자극제 시스템이다. 다른 구현예에서, T 세포는, 미국 특허 제6,040,177호; 미국 특허 제5,827,642호; 및 WO2012129514(이들의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 통합됨)에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여, 활성화되고 자극되어 배양 보조 세포 및 적절한 항체 및 사이토카인으로 증식할 수 있다.
본 개시의 작제물 및 조작된 면역 세포를 제조하기 위한 특정 방법은 PCT 출원 PCT/US15/14520에 기술되어 있으며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
PBMC는 NK 세포 또는 NKT 세포와 같은 다른 세포독성 림프구를 추가로 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 개시된 키메라 수용체의 코딩 서열을 운반하는 발현 벡터는 인간 공여자 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포의 집단에 도입될 수 있다. 발현 벡터를 운반하는 성공적으로 형질도입된 T 세포는 유세포 계측법을 사용하여 분류되어 CD3 양성 T 세포를 단리한 후, 항-CD3 항체 및 IL-2 또는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여, 세포 활성화에 더하여 T 세포를 발현하는 이들 CAR의 수를 증가시키기 위해 추가로 증식될 수 있다. 표준 절차는 인간 대상체에서 사용하기 위한 보관 및/또는 준비를 위해 CAR을 발현하는 T 세포의 동결보존을 위해 사용된다. 일 구현예에서, T 세포의 시험관 내 형질도입, 배양 및/또는 증식은 태아 송아지 혈청 및 태아 소 혈청과 같은 비인간 동물 유래 산물의 부재 하에 수행된다.
폴리뉴클레오티드의 클로닝을 위해, 벡터를 숙주 세포(단리된 숙주 세포) 내로 도입하여 벡터 자체의 복제를 허용함으로써 그 안에 함유된 폴리뉴클레오티드의 복사를 증폭시킬 수 있다. 클로닝 벡터는 복제 기점, 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 및 선택성 마커를 포함하되 이에 한정되지 않는 서열 성분을 함유할 수 있다. 이들 요소는 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 예를 들어, 복제 기점은 숙주 세포에서 벡터의 자율 복제를 촉진하기 위해 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시는 본원에서 제공된 벡터를 함유하는 단리된 숙주 세포를 제공한다. 벡터를 함유하는 숙주 세포는 벡터에 함유된 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 클로닝에 유용할 수 있다. 적절한 숙주 세포는 원핵 세포, 진균 세포, 효모 세포, 또는 포유류 세포와 같은 더 높은 진핵 세포를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 목적을 위한 적절한 원핵 세포는, 제한 없이, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체와 같은 진균, 대장균속(예를 들어, 대장균, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라(예를 들어, 살모넬라 티피무리움), 세라티아(예를 들어, 세라티아 마르세센스), 및 시겔라)와 같은 장내세균뿐만 아니라, B. 서브틸리스 및 B 리체니포미스와 같은 바실리우스균, P. 아에루기노사와 같은 슈도노마스 및 스트렙토마이세스를 포함한다.
벡터는, 제한 없이, DEAE-덱스트란 매개 전달, 인산칼슘 침전물 방법, 양이온성 지질 매개 전달, 리포좀 매개 형질감염, 전기천공, 미세투과성 충돌, 수용체 매개 유전자 전달, 폴리리신, 히스톤, 키토산, 및 펩티드에 의해 매개되는 전달을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 관심 벡터의 발현에 대한 세포의 형질감염 및 형질전환을 위한 표준 방법은 당업계에 공지되어 있다. 추가의 구현예에서, 상이한 발현 벡터의 혼합물은 면역 효과기 세포의 공여자 집단을 유전적으로 변형시키는 데 사용될 수 있으며, 여기에서 각각의 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 상이한 CAR을 암호화한다. 생성된 형질도입된 면역 효과기 세포는 조작된 세포의 혼합 집단을 형성하고, 조작된 세포의 비율은 둘 이상의 상이한 CAR을 발현한다.
일부 구현예에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터를 포함한다. CAR 코딩 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 포장 세포주 내로 도입될 수 있고, 포장 세포주에 의해 생산된 렌티바이러스는 T 세포의 형질도입에 사용되어 CAR-T 세포를 생성할 수 있다. CAR를 암호화하는 렌티바이러스를 제조하기 위해, HEK-293T 세포를 0일차에 6-웰 플레이트의 웰 당 10% FBS(Hyclone 또는 JR Scientific)가 보충된 2 mL의 DMEM(Gibco) 중의 mL 당 0.4백만 세포로 플레이팅할 수 있다. 1일차에, 렌티바이러스는 6-웰 플레이트의 웰 당 250uL의 Opti-MEM(Gibco) 중 렌티바이러스 포장 벡터 1.5 ug의 psPAX2, 0.5 ug의 pMD2G, 및 0.5 ug의 적절한 전달 CAR 벡터와 함께 혼합하여 제조될 수 있다("DNA 혼합물"). 250uL의 Opti-MEM 중 10uL의 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 5분 동안 실온에서 배양한 다음, 전술한 DNA 혼합물에 첨가할 수 있다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양하고, 총 부피 500uL를 HEK-293T를 함유하는 웰의 측면에 서서히 첨가하였다. CAR-함유 렌티바이러스 생산 및 형질도입의 일반적인 방법은 대체로 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Milone 등, Leukemia, 2018, 32:1529-1541; Sanber 등, Construction of stable packaging cell lines for clinical lentiviral vector production, Nature 2015, DOI: 10.1038; Roddie 등, Cytotherapy 2019, 21:327-340 참조(이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)). 일 구현예에서, 본 개시는 CD19 단백질을 표적화하는 CAR 또는 TCR을 발현하는 유전적으로 조작된 세포를 저장하는 방법을 제공한다. 이는 해동 시 세포가 생존가능하게 유지되도록 면역 세포를 동결 보존하는 것을 포함한다. CAR을 발현하는 면역 세포의 일부는 악성 종양을 앓고 있는 환자의 향후 치료를 위한 이러한 세포의 영구적인 공급원을 제공하기 위해 당업계에 공지된 방법에 의해 동결 보존될 수 있다. 필요한 경우, 동결 보존된 형질전환된 면역 세포는 더 많은 이러한 세포를 위해 해동, 성장 및 증식될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 먼저 배양 배지로부터 수확된 후, 치료 유효량으로 투여하기에 적합한 배지 및 용기 시스템("약학적으로 허용 가능한" 담체)에서 세척되고 농축됨으로써 제형화된다. 적절한 주입 매질은 임의의 등장성 매질 제형, 통상적으로 생리식염수, NormosolTM R(Abbott) 또는 Plasma-LyteTM A(Baxter)일 수 있지만, 물 중 5% 덱스트로스 또는 링거 락트산이 또한 사용될 수 있다. 주입 매질은 인간 혈청 알부민으로 보충될 수 있다.
동종 CAR T 세포
동종 CAR T 요법, 또는 AlloCARTM를 제조하는 프로세스는 건강한 공여자로부터 건강한, 선택된, 스크리닝되고 시험된 T 세포를 수득하는 단계를 포함한다. 다음으로, T 세포는 혈액 또는 고형 종양에서 발현되는 특정 세포 표면 단백질(예를 들어, CD19)을 인식하는 CAR을 발현하도록 조작된다. 동종 T 세포는 이식편 대 숙주 질환(GvHD)의 위험을 감소시키고 동종 거부 반응을 예방하도록 편집된 유전자이다. T 세포 수용체 유전자(예를 들어, TCRα, TCRβ)를 녹아웃하여 GvHD를 회피한다. CD52 유전자는 CAR T 산물이 항-CD52 항체 치료에 내성을 갖도록 녹아웃될 수 있다. 따라서, 항-CD52 항체 치료는 숙주 면역계를 억제하고 CAR T가 생착된 상태로 유지되어 완전한 치료 효과를 달성하도록 하는 데 사용될 수 있다. 이어서, 조작된 T 세포는 정제 단계를 거치고, 궁극적으로 환자에게 전달하기 위해 바이알에 동결 보존된다.
자가 CAR T 세포
자가 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법은, 환자 자신의 세포(예를 들어, T 세포를 포함하는 백혈구)를 수집하고, T 세포를 유전적으로 조작하여 하나 이상의 특정 암세포의 세포 표면에서 발현된 표적을 인식하고, 암세포를 죽이는 CAR을 발현하는 것을 포함한다. 이후, 조작된 세포를 동결 보존하고, 이어서 환자에게 투여한다.
IV. 치료 방법
본 개시는 환자에서 바람직하지 않고/않거나 상승된 CD19 레벨과 관련된 병태를 치료하거나 예방하는 방법을 포함하며, 방법은 적어도 하나의 CAR, 또는 본원에서 개시된 CAR을 포함하는 면역 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
암을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 T 세포 매개 면역 반응을 생성하는 것에 관한 것으로서, 대상체에게 본 출원의 조작된 면역 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 매개 면역 반응은 표적 세포 또는 세포들에 대해 유도된다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 종양 세포이다. 일부 양태에서, 본 개시는 악성 종양을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 포함하며, 방법은 본원에서 기술된 적어도 하나의 단리된 항원 결합 도메인의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시는 악성 종양을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 포함하며, 방법은 적어도 하나의 면역 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 면역 세포는 적어도 하나의 키메라 항원 수용체, T 세포 수용체, 및/또는 본원에서 기술된 단리된 항원 결합 도메인을 포함한다.
본 개시의 면역 세포를 함유하는 CAR은 CD19의 비정상적인 발현을 포함하는 악성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 면역 세포를 함유하는 CAR은 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "암"은 고형 종양 및 혈액 유래 종양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 용어 "암"은 방광, 뼈 또는 혈액, 뇌, 유방, 자궁경부, 흉부, 결장, 내막, 식도, 눈, 머리, 신장, 간, 림프절, 폐, 구강, 목, 난소, 췌장, 전립선, 직장, 위, 고환, 인후 및 자궁의 암을 포함하지만 이에 한정되지 않는 피부 조직, 기관, 혈액 및 혈관의 질환을 지칭한다. 특이적 암은, 진행성 악성종양, 아밀로이드증, 신경 모세포종, 수막종, 혈관 주위 세포종, 다발성 뇌 전이, 교모세포종 다형, 교모세포종,뇌간 신경교종, 악성 뇌종양의 나쁜 예후, 악성 신경아교종, 재발성 악성 골종, 역형성 성상세포종, 역형성 희소돌기아교종, 신경내분비종양, 직장 선암종, Dukes C & D 대장암, 절제 불가능한 대장암, 전이성 간세포 암종, 카포시 육종, 핵형 급성 골수성 백혈병, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(NHL), 피부 T 세포 림프종, 피부 B 세포 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종, 저등급 여포성 림프종, 악성 흑색종, 악성 중피종, 악성 흉수 중피종 증후군, 복막 암종, 유두 장액 암종, 부인과 육종, 연조직 육종, 경피증, 피부 혈관염, 랑게르한스 세포 조직구증, 평활근육종, 진행성 골화섬유형성이상, 호르몬 불응성 전립선암, 절제된 고위험 연조직 육종, 절제 불가능한 간세포암종, Waldenstrom 거대 글로불린 혈증, 다발성골수종, 지연성 골수종, 나팔관암, 안드로겐 의존성 전립선암, 안드로겐 의존성 IV기 비전이성 전립선암, 호르몬 불감수성 전립선암, 화학요법 치료성 전립선 암, 유두상 갑상선암, 여포성 갑상선암, 갑상선 수질암, 및 평활근종을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 암은 전이성이다. 또 다른 구현예에서, 암은 화학요법 또는 방사선에 불응성 또는 내성이다.
예시적인 구현예에서, CAR 함유 면역 세포, 예를 들어, 본 개시의 CAR-T 세포는 NHL을 치료하는 데 사용된다.
또한, 대상체에서 종양의 크기를 감소시키는 방법이 제공되며, 방법은 본 개시의 조작된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 세포는 CD19 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하고 종양 상의 CD19 항원에 결합한다.
일부 구현예에서, 대상체는 고형 종양, 또는 림프종 또는 백혈병과 같은 혈액 악성 종양을 갖는다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 종양층으로 전달된다. 일부 구현예에서, 암은 대상체의 골수에 존재한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 자가 면역 세포, 예를 들어, 자가 T 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 동종 면역 세포, 예를 들어, 동종 T 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 이종 면역 세포, 예를 들어, 이종 T 세포이다. 일부 구현예에서, 본 출원의 조작된 세포는 생체 내에서 형질감염되거나 형질도입된다. 다른 구현예에서, 조작된 세포는 생체 외에서 형질감염되거나 형질도입된다. 본원에서 사용되는 용어 "시험관 내 세포"는 생체 외에서 배양되는 임의의 세포를 지칭한다.
치료제(예를 들어, 조작된 CAR T 세포)의 "치료적 유효량", "유효 투여량", "유효량", 또는 "치료적 유효 투여량"은, 단독으로 사용되거나 다른 치료제와 병용될 경우, 질환의 발병으로부터 대상체를 보호하거나, 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속 시간의 증가로 입증되는 질환 퇴행을 촉진하거나, 질환으로 인한 장애 또는 손상을 예방하는 임의의 양이다. 질환 퇴행을 촉진하는 치료제의 능력은, 예를 들어, 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관 내 분석에서 제제의 활성을 분석함으로써, 당업자에게 공지된 다양한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
용어 "환자" 및 "대상체"는 상호 교환적으로 사용되며, 인간 및 비인간 동물 대상체뿐만 아니라 공식적으로 진단된 장애를 가진 대상체, 공식적으로 인식된 장애를 갖지 않은 대상체, 의학적 치료를 받는 대상체, 장애를 발달시킬 위험이 있는 대상체 등을 포함한다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 치료적 처치, 예방적 치료, 및 대상체가 장애 또는 다른 위험 인자를 발생시킬 위험을 감소시키는 응용을 포함한다. 치료는 장애의 완전한 치유를 필요로 하지 않으며, 증상 또는 기저 위험 인자를 감소시키는 구현예를 포함한다. 용어 "예방"은 이벤트의 가능성을 100% 제거할 것을 요구하지 않는다. 오히려, 이는 화합물 또는 방법의 존재 시에 이벤트의 발생 가능성이 감소되었음을 나타낸다.
조성물 중 세포의 목적하는 치료량은 일반적으로 적어도 2개의 세포(예를 들어, 적어도 1개의 CD8+ 중심 기억 T 세포 및 적어도 1개의 CD4+ 헬퍼 T 세포 서브세트)이거나, 보다 일반적으로 102개 세포보다 크고, 최대 106개이며, 최대 108개 또는 109개 세포까지 포함되고, 1010개 세포를 초과할 수 있다. 세포의 수는 조성물이 의도되는 목적하는 용도, 및 그 안에 포함된 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 목적하는 세포의 밀도는 통상적으로 106 세포/ml 초과이며, 일반적으로 107 세포/ml 초과, 일반적으로 108 세포/ml 이상이다. 임상적으로 관련된 면역 세포의 수는 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 또는 1012개의 세포와 누적적으로 동일하거나 이를 초과하는 다수의 주입으로 배분될 수 있다. 본 개시의 일부 양태에서, 특히 주입된 모든 세포가 특정 표적 항원(CD19)으로 리디렉팅될 것이므로, 106/킬로그램(환자당 106 내지 1011개) 범위의 더 적은 수의 세포가 투여될 수 있다. CAR 치료는 이들 범위 내의 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 세포는 치료를 받는 환자에 대해 자가, 동종, 또는 이종일 수 있다.
일부 구현예에서, CAR T 세포의 치료적 유효량은, 약 1 X 105 세포/kg, 약 2 X 105 세포/kg, 약 3 X 105 세포/kg, 약 4 X 105 세포/kg, 약 5 X 105 세포/kg, 약 6 X 105 세포/kg, 약 7 X 105 세포/kg, 약 8 X 105 세포/kg, 약 9 X 105 세포/kg, 2 X 106 세포/kg, 약 3 X 106 세포/kg, 약 4 X 106 세포/kg, 약 5 X 106 세포/kg, 약 6 X 106 세포/kg, 약 7 X 106 세포/kg, 약 8 X 106 세포/kg, 약 9 X 106 세포/kg, 약 1 X 107 세포/kg, 약 2 X 107 세포/kg, 약 3 X 107 세포/kg, 약 4 X 107 세포/kg, 약 5 X 107 세포/kg, 약 6 X 107 세포/kg, 약 7 X 107 세포/kg, 약 8 X 107 세포/kg, 또는 약 9 X 107 세포/kg이다.
일부 구현예에서, CAR+/CAR-T+/TCR+ 세포에 대한 표적 투여량은 1Х106 내지 2Х108 세포/kg의 범위, 예를 들어 2Х106 세포/kg이다. 이러한 범위의 초과 및 미만의 투여량이 특정 대상체에게 적절할 수 있고, 필요에 따라 의료 제공자에 의해 적절한 투여량 레벨이 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 개시에 따라 세포의 다중 투여량이 제공될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 추가적인 활성제를 더 포함한다.
본 개시의 CAR 발현 세포 집단은 단독으로 투여되거나, 희석제 및/또는 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 같은 다른 성분과 조합하여 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 본 개시의 약학적 조성물은, 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 본원에서 기술된 바와 같은 T 세포와 같은 CAR 또는 TCR 발현 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은, 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등과 같은 완충제; 포도당, 만노오스, 수크로오스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 글리신; 항산화제와 같은 폴리펩티드 또는 아미노산; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 개시의 조성물은 바람직하게는 정맥 내 투여용으로 제형화될 수 있다.
약학적 조성물(용액, 현탁액 등)은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 주사용수와 같은 멸균 희석제, 식염수, 링거 용액, 바람직하게는 등장성 염화나트륨과 같은 생리식염수, 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노- 또는 디글리세리드와 같은 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트와 같은 완충제, 시트르산염 또는 인산염, 및 염화 나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장성 조절을 위한 제제. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다회 투여 바이알에 봉입될 수 있다. 바람직하게는, 주사 가능한 약학적 조성물은 멸균된다.
일부 구현예에서, 환자에게 투여 시, 본원에서 기술된 CD19-특이적 CAR 중 어느 하나를 세포 표면에서 발현하는 조작된 면역 세포는 환자의 내인성 CD19-발현 세포를 감소, 사멸 또는 용해시킬 수 있다. 일 구현예에서, 본원에서 기술된 CD19-특이적 CAR 중 어느 하나를 발현하는 조작된 면역 세포에 의해 CD19을 발현하는 세포주의 CD19-발현 내인성 세포 또는 세포들의 감소 또는 용해 백분율은 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 또는 초과이다. 일 구현예에서, 본원에서 기술된 CD19-특이적 CAR 중 어느 하나를 발현하는 조작된 면역 세포에 의해 CD19을 발현하는 세포주의 CD19-발현 내인성 세포 또는 세포들의 감소 또는 용해 백분율은 약 5% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%이다. 일 구현예에서, 내인성 CD19-발현 세포는 내인성 CD19-발현 골수 세포이다.
일 구현예에서, 본 개시의 CD19-특이적 CAR을 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포에 의해 CD19을 발현하는 표적 세포, 예를 들어, 세포주의 감소 또는 용해 백분율은 본원에서 개시된 분석을 사용하여 측정될 수 있다.
방법은 하나 이상의 화학요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 화학요법제는 림프고갈(전처치) 화학요법제이다. 예를 들어, T 세포 요법을 필요로 하는 환자를 조절하는 방법은 환자에게 시클로포스파미드의 특정 유용한 투여량(200 mg/m2/일 내지 2000 mg/m2/일, 약 100 mg/m2/일 내지 2000 mg/m2/일; 예를 들어, 약 100 mg/m2/일, 약 200 mg/m2/일, 약 300 mg/m2/일, 약 400 mg/m2/일, 약 500 mg/m2/일, 약 600 mg/m2/일, 약 700 mg/m2/일, 약 800 mg/m2/일, 약 900 mg/m2/일, 약 1000 mg/m2/일, 약 1500 mg/m2/일, 또는 약 2000 mg/m2/일) 및 플루다라빈의 특정 투여량(20 mg/m2/일 내지 900 mg/m2/일, 약 10 mg/m2/일 내지 약 900 mg/m2/일; 예를 들어, 약 10 mg/m2/일, 약 20 mg/m2/일, 약 30 mg/m2/일, 약 40 mg/m2/일, 약 40 mg/m2/일, 약 50 mg/m2/일, 약 60 mg/m2/일, 약 70 mg/m2/일, 약 80 mg/m2/일, 약 90 mg/m2/일, 약 100 mg/m2/일, 약 500 mg/m2/일, 또는 약 900 mg/m2/일)을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 투여량 처방은 환자를 치료하는 단계를 포함하며, 조작된 T 세포의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계 이전에 약 300 mg/m2/일의 시클로포스파미드 및 약 30 mg/m2/일의 플루다라빈을 환자에게 3일 동안 매일 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 림프고갈은 CD52 항체의 투여를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CD52 항체는 약 13 mg/일 IV의 투여량으로 투여된다.
다른 구현예에서, 항원 결합 도메인, 형질도입된(또는 달리 조작된) 세포 및 화학요법제는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하기에 효과적인 양으로 각각 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에서 개시된 CAR-발현 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 임의의 수의 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 화학요법제의 예는, 티오테파 및 시클로포스파미드(CYTOXANTM와 같은 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술판과 같은 알킬 술포네이트; 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아미드 및 트리메틸올로멜라민 계를 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 염화물, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로우레아; 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신 , 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신과 같은 항생제; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질; 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU와 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄과 같은 항-부신제; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드(예를 들어, 파클리탁셀(TAXOLTM, Bristol-Myers Squibb) 및 독세탁셀(TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer)); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RF S2000; 디플루오로메틸오미틴(DMFO); TargretinTM(벡사로텐), PanretinTM, (알리트레티노인)과 같은 레티노산 유도체; ONTAKTM(데닐류킨 디프티톡스); 에스페라미신; 카페시타빈; 및 전술한 것들 중 임의의 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 본 정의에는, 예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(Fareston)을 포함하는 항-에스트로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 전술한 것들 중 임의의 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체와 같은, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제가 포함된다. 적절한 경우, CHOP(즉, 시클로포스파미드(Cytoxan®)), 독소루비신(히드록시독소루비신), 빈크리스틴(Oncovin®), 및 프레드니손을 포함하되 이에 한정되지 않는 화학요법제의 조합이 또한 투여된다.
일부 구현예에서, 화학요법제는 조작된 세포, 폴리펩티드, 또는 핵산의 투여와 동시에 투여되거나 투여 후 1주일 이내에 투여된다. 다른 구현예에서, 화학요법제는 조작된 세포, 폴리펩티드 또는 핵산의 투여 후 1 내지 4주 또는 1주 내지 1개월, 1주 내지 2개월, 1주 내지 3개월, 1주 내지 6개월, 1주 내지 9개월, 또는 1주 내지 12개월에 투여된다. 다른 구현예에서, 화학요법제는 세포, 폴리펩티드 또는 핵산을 투여하기 적어도 1개월 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 방법은 2개 이상의 화학요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 추가적인 치료제가 본원에서 기술된 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 잠재적으로 유용한 추가 치료제는 니볼루맙(Opdivo®), 펨브롤리주맙(Keytruda®), 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 및 아테졸리주맙과 같은 PD-1 억제제를 포함한다.
본 개시와 조합하여 사용하기에 적합한 추가 치료제는, 이브루티닙(Imbruvica®), 오파투무맙(Arzerra®, 리툭시맙(Rituxan®), 베바시주맙(Avastin®), 트라스투주맙(Herceptin®), 트라스투주맙 엠탄신(KADCYLA®), 이마티닙(Gleevec®), 세툭시맙(Erbitux®, 파니투무맙)(Vectibix®), 카투막소맙, 이브리투모맙, 오파투무맙, 토시투모맙, 브렌툭시맙, 알렘투주맙, 겜투주맙, 엘로티닙, 게피티닙, 반데타닙, 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, 엑시티닙, 마시티닙, 파조파닙, 수니티닙, 소라페닙, 토세라닙, 레스타우르티닙, 엑시티닙, 세디라닙, 렌티바티닙, 닌테다닙, 파조파닙, 레고라페닙, 세막사닙, 소라페닙, 수니티닙, 티보자닙, 토세라닙, 반데타닙, 엔트렉티닙, 카보잔티닙, 이마티닙, 다사티닙, 닐로티닙, 포나티닙, 라도티닙, 보수티닙, 레스타우르티닙, 룩소리티닙, 파크리티닙, 코비메티닙, 셀루메티닙, 트라메티닙, 비니메티닙, 알렉티닙, 세리티닙, 크리조티닙, 애플리버셉트, 아디포티드, 데닐류킨 디프티톡스, 에베롤리무스 및 템시로리무스와 같은 mTOR 억제제, 소니데깁 및 비스모데깁과 같은 고슴도치 억제제, CDK 억제제(팔보시클립)와 같은 CDK 억제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, CAR 함유 면역 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 신경독성을 예방하기 위한 치료 요법과 함께 투여될 수 있다. 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 신경독성을 예방하기 위한 치료 요법은 렌질루맙, 토실리주맙, 심방 나트륨이뇨 펩티드(ANP), 아나킨라, iNOS 억제제(예를 들어, L-NIL 또는 1400W)를 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, CAR-함유 면역 세포를 포함하는 조성물은 항염증제와 함께 투여될 수 있다. 항염증제 또는 약물은 스테로이드 및 글루코코르티코이드(베타메타손, 부데소니드, 덱사메타손, 히드로코르티손 아세테이트, 히드로코르티손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론을 포함함), 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 메토트렉세이트, 술파살라진, 레플루노미드, 항-TNF 약물, 시클로포스파미드 및 미코페놀레이트를 포함하는 비스테로이드성 항염증제(NSAIDS)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 NSAID는 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 나트륨, Cox-2 억제제, 및 시알레이트를 포함한다. 예시적인 진통제는 프로포르시펜 염산염의 아세트아미노펜, 옥시코돈, 트라마돌을 포함한다. 예시적인 글루코코르티코이드는 코르티손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 또는 프레드니손을 포함한다. 예시적인 생물학적 반응 조절제는 세포 표면 마커(예를 들어, CD4, CD5 등), TNF 길항제(예를 들어, 에타너셉트(ENBREL®), 아달리무맙(HUMIRA®) 및 인플릭시맙(REMICADE®))와 같은 사이토카인 억제제, 케모카인 억제제 및 접착 분자 억제제에 대해 유도되는 분자를 포함한다. 생물학적 반응 조절제는 단클론 항체뿐만 아니라 분자의 재조합 형태 또한 포함한다. 예시적인 DMARD는 아자티오프린, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 페니실라민, 레플루노미드, 술파살라진, 히드록시클로로퀸, 금(경구(아우라노핀) 및 근육내) 및 미노시클린을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 기술된 조성물은 사이토카인과 함께 투여된다. 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인, 및 통상적인 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토카인은, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로렐락신; 난포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 및 황체형성 호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자(HGF); 섬유아세포 성장 인자(FGF); 프로락틴; 태반 락토겐; 뮐러관-억제 물질; 마우스 성선 자극 호르몬-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); NGF-베타와 같은 신경 성장 인자(NGF); 혈소판 성장 인자; TGF-알파 및 TGF-베타와 같은 형질전환 성장 인자(TGF); 인슐린-유사 성장 인자 I 및 II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론-알파, 베타, 및 감마와 같은 인터페론, 대식세포-CSF(M-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자(CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); IL-1, IL-1 알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, IL-21와 같은 인터루킨(IL); TNF-알파 또는 TNF-베타와 같은 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 사이토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양으로부터의 단백질, 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적으로 활성인 등가물을 포함한다.
V. 분류 및 고갈 방법
일부 구현예에서, 면역 세포 집단의 시험관 내 분류 방법이 제공되며, 여기에서 면역 세포 집단의 서브세트는 단클론 항체(예를 들어, 예시적인 미모토프 서열)에 특이적인 에피토프를 포함하는 CD19-특이적 CAR 중 어느 하나를 발현하는 조작된 면역 세포를 포함한다. 방법은 면역 세포 집단을 에피토프에 특이적인 단클론 항체와 접촉시키는 단계, 및 CD19-특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포에서 농축된 세포 집단을 수득하기 위해 단클론 항체에 결합하는 면역 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 전술한 에피토프에 특이적인 전술한 단클론 항체는 형광단에 선택적으로 접합된다. 본 구현예에서, 단클론 항체에 결합하는 세포를 선택하는 단계는 형광 활성화 세포 분류(Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS)에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 전술한 에피토프에 특이적인 전술한 단클론 항체는 자기 입자에 선택적으로 접합된다. 본 구현예에서, 단클론 항체에 결합하는 세포를 선택하는 단계는 자기 활성화 세포 분류(Magnetic Activated Cell Sorting, MACS)에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, CAR을 발현하는 면역 세포를 분류하는 방법에 사용된 mAb는 알렘투주맙, 이브리투모맙 튜세탄, 뮤로모납-CD3, 토시투모맙, 압시시맙, 바실릭시맙, 브렌툭시맙 베도틴, 세툭시맙, 인플릭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 세톨리주맙 페골, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 겜투주맙, 나탈리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 라니비주맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 베돌리주맙, 아달리무맙, 벨리무맙, 카나키누맙, 데노수맙, 골리무맙, 이필리무맙, 오파투무맙, 파니투무맙, QBEND-10 및/또는 우스테키누맙으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 전술한 mAb는 리툭시맙이다. 또 다른 구현예에서, 전술한 mAb는 QBEND-10이다.
일부 구현예에서, 전술한 CAR-발현 면역 세포를 시험관 내에서 분류하기 위한 방법을 사용할 때 수득된 CAR-발현 면역 세포의 집단은 CAR-발현 면역 세포의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR-발현 면역 세포를 시험관 내에서 분류하기 위한 방법을 사용할 때 수득된 CAR-발현 면역 세포의 집단은 CAR-발현 면역 세포의 적어도 85%를 포함한다.
일부 구현예에서, 전술한 CAR-발현 면역 세포를 시험관 내에서 분류하기 위한 방법을 사용할 때 수득된 CAR-발현 면역 세포의 집단은 초기(분류되지 않은) 세포 집단과 비교하여 시험관 내에서 증가된 세포독성 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 전술한 시험관 내에서의 세포독성 활성은 10%, 20%, 30% 또는 50%만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다.
일부 구현예에서, mAb는 지지체 또는 표면 상에 미리 결합된다. 고형 지지체의 비제한적인 예는, 비드, 아가로스 비드, 자기 비드, 플라스틱 웰 플레이트, 유리 웰 플레이트, 세라믹 웰 플레이트, 컬럼, 또는 세포 배양 백을 포함할 수 있다.
수용자에게 투여될 CAR-발현 면역 세포는 시험관 내에서 공급원 모집단으로부터 농축될 수 있다. 공급원 모집단을 농축하는 방법은 밀도 원심분리, 면역-자성 비드 정제, 친화도 크로마토그래피, 및 형광 활성화 세포 분류의 조합을 사용하여, CD34 항원과 같은 항원을 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
유세포 계측법을 사용하여 세포 집단 내의 특정 세포 유형을 정량화할 수 있다. 일반적으로, 유세포 계측법은 주로 광학 수단으로 세포의 구성 요소 또는 구조적 특징을 정량화하는 방법이다. 상이한 세포 유형은 구조적 특징을 정량화함으로써 구별될 수 있기 때문에, 유세포 계측법 및 세포 분류를 사용해 혼합물 내에서 상이한 표현형의 세포를 계수하고 분류할 수 있다.
유세포 계측법 분석은 두 가지 주요 단계를 포함한다: 1) 선택된 세포 유형을 하나 이상의 표지된 마커로 표지하는 단계, 및 2) 집단에서의 총 세포 수에 대한 표지된 세포의 수를 결정하는 단계. 일부 구현예에서, 세포 유형을 표지하는 방법은 특정 세포 유형에 의해 발현된 마커에 표지된 항체를 결합하는 단계를 포함한다. 항체는 형광 화합물로 직접 표지되거나, 예를 들어 제1 항체를 인식하는 형광 표지된 제2 항체를 사용하여 간접적으로 표지될 수 있다.
일부 구현예에서, CAR을 발현하는 T 세포를 분류하는 데 사용되는 방법은 자기 활성화 세포 분류(MACS)이다. 자기 활성화 세포 분류(MACS)는 초 상자성 나노입자 및 컬럼을 사용하여 표면 항원(CD 분자)에 따라 다양한 세포 집단을 분리하는 방법이다. MACS는 순수 세포 집단을 수득하는 데 사용될 수 있다. 단일 세포 현탁액 중의 세포는 마이크로비드로 자기적으로 표지될 수 있다. 샘플을 세포 친화적인 코팅으로 덮여 있는 강자성 구체로 구성된 컬럼에 도포하여, 세포를 신속하고 안전하게 분리할 수 있다. 표지되지 않은 세포는 통과하는 반면, 자기 표지된 세포는 컬럼 내에 유지된다. 관류는 표지되지 않은 세포 분획으로서 수집될 수 있다. 세척 단계 후, 컬럼을 분리기로부터 제거하고, 자기 표지된 세포를 컬럼으로부터 용리시킨다.
T 세포와 같은 특정 세포 집단의 정제에 대한 상세한 프로토콜은 Basu S 등, (2010) (Basu S, Campbell HM, Dittel BN, Ray A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41): 1546)에서 찾을 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시는 생체 내 고갈에 의한 CD19-특이적 CAR-발현 면역 세포를 고갈시키는 방법을 제공한다. 생체 내 고갈은 억제 또는 제거에 의해 CAR-발현 면역 세포의 증식을 중단시키는 것을 목적으로 하는, 포유동물 유기체에 대한 치료제(예를 들어, CAR 상의 에피토프에 결합하는 분자)를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 mAb 특이적 에피토프를 포함하는 CD19 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포를 생체 내에서 고갈시키는 방법에 관한 것으로서, 전술한 조작된 면역 세포 또는 전술한 CAR 발현 면역 세포를 적어도 하나의 에피토프 특이적 mAb와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 양태는 전술한 조작된 면역 세포를 에피토프-특이적 항체와 접촉시킴으로써, 키메라 scFv(예를 들어, mAb-특이적 에피토프의 삽입에 의해 형성됨)를 포함하는 CAR-발현 면역 세포를 생체 내에서 고갈시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이고/이거나, 항체는 단클론이다.
일 구현예에 따르면, 면역 조작된 세포의 생체 내 고갈은 본 발명의 시험관 내 방법을 사용하여 이전에 분류된 조작된 면역 세포 상에서 수행된다. 이 경우, 동일한 주입된 mAb가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, mAb-특이적 항원은 CD20 항원이고, 에피토프-특이적 mAb는 리툭시맙이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 환자에서 mAb-특이적 에피토프(CAR-발현 면역 세포)를 포함하는 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포를 생체 내에서 고갈시키는 방법에 관한 것으로서, 전술한 CAR-발현 면역 세포를 적어도 하나의 에피토프-특이적 mAb와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 전술한 조작된 면역 세포 또는 전술한 CAR-발현 면역 세포를 적어도 하나의 에피토프-특이적 mAb와 접촉시키는 단계는 에피토프-특이적 mAb(예를 들어, 리툭시맙)을 환자 내로 주입하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자에게 투여되는 에피토프-특이적 mAb의 양은 환자 내 CAR-발현 면역 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 제거하기에 충분하다.
일부 구현예에서, 전술한 조작된 면역 세포 또는 전술한 CAR-발현 면역 세포를 적어도 하나의 에피토프-특이적 mAb와 접촉시키는 단계는 375 mg/m2의 리툭시맙을 환자 내로 1회 또는 수회 주입하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, mAb(예를 들어, 리툭시맙)는 매주 1회 투여된다.
일부 구현예에서, mAb-특이적 에피토프(CAR-발현 면역 세포)를 포함하는 CAR을 발현하는 면역 세포가 에피토프-특이적 mAb를 사용하는 보체 의존성 세포독성(CDC) 분석에서 고갈되면, 생존 가능한 CAR-발현 면역 세포의 양은 감소한다. 일부 구현예에서, 생존 가능한 CAR-발현 면역 세포의 양은 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%만큼 감소한다. 일부 구현예에서, 전술한 mAb-특이적 에피토프는 CD20 에피토프 또는 미모토프이고/이거나 에피토프-특이적 mAb는 리툭시맙이다.
특정 구현예에서, CAR-조작된 면역 세포의 생체 내 고갈은 이중 특이적 항체를 주입함으로써 수행된다. 정의에 따르면, 이중 특이적 단클론 항체(BsAb)는 2개의 상이한 단클론 항체의 단편으로 구성되며 결과적으로 2개의 상이한 유형의 항원에 결합하는 인공 단백질이다. 이들 BsAb 및 면역요법에서의 이들의 사용은 Muller D 및 Kontermann R.E. (2010) Bispecific Antibodies for Cancer Immunotherapy, BioDrugs 24 (2): 89-98에서 조사된 바 있다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 주입된 이중 특이적 mAb는 키메라 scFv를 발현하는 조작된 면역 세포 상에 부착된 mAb-특이적 에피토프와 효과기 및 세포독성 세포 상의 표면 항원(예를 들어, 림프구, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포(NK 세포), 세포독성 T 림프구(CTL)와 같은 면역 세포) 둘 모두에 결합할 수 있다. 이렇게 함으로써, BsAb에 의해 유발되는 조작된 면역 세포의 고갈은 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 통해 발생할 수 있다. (Deo Y M, Sundarapandiyan K, Keler T, Wallace PK, 및 Graziano RF, (2000), Journal of Immunology, 165 (10):5954-5961]).
일부 구현예에서, 세포독성 약물은 CAR-발현 면역 세포를 고갈시키는 데 사용될 수 있는 에피토프-특이적 mAb에 결합된다. 단클론 항체의 표적화 능력을 세포독성 약물의 암 사멸 능력과 조합함으로써, 항체-약물 접합체(ADC)는 약물의 단독 사용과 비교했을 경우, 건강한 조직과 병든 조직 간의 민감한 구별을 가능하게 한다. 몇몇 ADC에 대해 시장 승인을 받았으며, 특히 링커에서 이를 제조하는 기술은 Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail 등, (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos 및 Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz 및 Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; 미국 특허 제4,975,278호에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 주입될 에피토프-특이적 mAb는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 촉진할 수 있는 분자와 사전에 접합된다. 따라서, 보체 시스템은 유기체로부터 병원균을 제거하는 항체의 능력을 보조하거나 보완한다. 자극 시, 활성화 연쇄반응은 세포 사멸 막 공격 복합체의 반응 및 활성화의 대규모 증폭으로서 유발된다. 상이한 분자는 글리칸과 같은 mAb를 접합하는 데 사용될 수 있다(Courtois, A, Gac-Breton, S., Berthou, C, Guezennec, J., Bordron, A. 및 Boisset, C. (2012), Complement dependent cytotoxicity activity of therapeutic antibody fragments can be acquired by immunogenic glycan coupling, Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458; http://www.ejbiotechnology.info DOI: 10.2225/voll5-issue5).
VI. 키트 및 제조 물품
본 출원은 본원에 기술된 CD19 함유 CAR 또는 CD19 CAR 함유 면역 세포 중 어느 하나를 포함하는 키트, 및 이의 약학적 조성물을 제공한다. 일부 예시적인 구현예에서, 본 개시의 키트는 대상체에게 림프고갈 요법 및 CAR-T 요업을 투여하기 위한 동종 CD19 CAR 함유 T 세포 및 CD52 항체를 포함한다.
본 출원은 또한 본원에서 기술된 치료 조성물 또는 키트 중 어느 하나를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 제조 물품의 예는 바이알(예를 들어, 밀봉된 바이알)을 포함한다.
실시예
실시예 1: 리툭시맙 내성 CD19 CAR 면역 세포의 생성
도 1 및 표 4에 나타낸 바와 같이 리툭시맙 결합 부위를 발현하지 않는 리툭시맙-내성 항-CD19 키메라 항원 수용체 작제물을 생성하였다. 렌티바이러스 벡터 작제물을 바이러스 포장 세포주에 도입하고, 렌티바이러스를 함유하는 항-CD19 CAR을 Allogene에서 생산하였다.
4 개체의 인간 공여자(541, 604, 410 및 2593) 유래의 Pan T 세포를 해동하고, IL-2(100 IU/ml)의 존재 하에 대용량 T 세포 TransActTM(1:15 비율)를 사용하여 1.5 x 106 세포/ml로 활성화하였다. 2일 후, 1.5x106 세포(3 ml 중)를 표 4에 기술된 벡터를 포함하는 2 ml의 신선한 렌티바이러스로 형질도입하였다. 변형된 벡터의 개략도를 도 1에 도시하였다. IL-2(100 IU/ml)를 0, 2, 5, 7, 9 및 12일차에 첨가하였다. 총 6 x 106의 세포를 5일차에 6-웰 G-Rex 플레이트에 옮기고, 9 및 12일차에 배지 교환을 수행하였다. 세포를 13일차에 동결시켰다.
Figure pct00011
유세포 계측 실험을 림프구, 살아있는 CD3+, CAR+, CD4/CD8 및 하류 마커 상에서 게이팅된 형질도입된 세포에 대해 수행하였다. 인간 형질도입 검사 및 CD34 패널은 CD3, CD4, CD8, 생존력, CD34 및 항-CD19 CAR에 대한 항체에 대한 항-이디오타입(4G7 항-Id)의 패널을 사용하여 5일차 및 13일차에 수행되었다. 도 2a 및 2b는 항-CD19 CAR 항-Id 항체를 사용하여 표 4에 제시된 CAR 발현 벡터로 형질도입된 Pan T 세포로부터 5일차의 CAR 발현을 보여주는 유세포 계측 플롯을 나타낸다.
인간 표현형 및 활성화 패널을 갖는 유세포 분석을 9 및 13일차에 수행하였다. 패널은 CD3, CD4, CD8, 생존력, CD45RO, CD62L, CD25, 4-1BB, PD-1, 항-CD19 CAR에 대한 항체에 대한 항-이디오타입, 및 TIM3을 포함하였다. 세포는 13일차에 4 개체의 공여자 모두로부터의 세포 증식 및 최종 CAR 발현에 대해 정규화되었다(도 3). 도 3의 데이터는 v1.2가 더 높은 형질도입 속도(%CAR+)를 나타냈지만, v1.2 형질도입된 세포가, 예를 들어, v1.0 및 v1.1과 비교하여 더 낮은 레벨의 CAR 발현(CAR MFI)을 나타냈다는 것을 보여준다. 세포 증식 및 CAR 발현은 리툭시맙 내성 CAR 발현 벡터로 형질도입된, 공여자 541(도 4a), 604(도 4b), 410(도 4c), 2593(도 4d)으로부터의 Pan T 세포의 시간 경과에 따라 모니터링되었다.
리툭시맙 내성 CAR 발현 벡터로 형질도입된, 공여자 541(도 5a), 604(도 5b), 410(도 5c), 2593(도 5d)으로부터의 Pan T 세포의 5일차, 9일차 및 13일차에서의 CD4/CD8 비를 측정하였다. 도 6a 내지 6d는 리툭시맙 내성 CAR 발현 벡터로 형질도입된, 공여자 541(도 6a), 604(도 6b), 410(도 6c), 2593(도 6d)으로부터의 Pan T 세포의 9일차에서의 표현형 및 활성화를 나타낸다. 도 7은 9일차에 4 개체의 공여자 모두로부터 평균화된 TIM3 및 PD1 염색을 사용하여 측정된 표현형, 활성화 %CD8+, 및 T 세포 무력도를 나타낸다. 리툭시맙 내성 CAR 발현 벡터로 형질도입된, 공여자 541(도 8a), 604(도 8b), 410(도 8c), 2593(도 8d)으로부터의 Pan T 세포의 13일차에서의 표현형 및 활성화가 측정되었다. 도 9는 13일차에 4 개체의 공여자 모두로부터 TIM3 및 PD1 염색을 사용하여 측정된 표현형, 활성화 %CD8+, 및 T 세포 무력도를 나타낸다.
실시예 2: 단기 및 장기 시험관 내 사멸 분석
실시예 1로부터의 형질도입된 CAR 세포를 장/단기 사멸 능력에 대해 시험하였다. 후방 Luminex 분석을 위해 Raji 세포(2:1 E-to-T)와 CAR T 세포 공동 배양물을 제조하였다. 표적 세포로서 Raji 세포를 사용하는 평균 단기(24시간) 사멸 분석을 각 CAR 작제물에 대해 결정하였다(도 10). 도 11a 내지 11d는 각각의 CAR 작제물에 대해 8:1(도 11a), 4:1(도 11b), 2:1(도 11c), 및 1:1(도 11d)의 E: T를 갖는 표적 세포로서 A549-CD19+ 세포를 사용하는 평균 장기 사멸 분석을 나타낸다.
사멸 분석 결과를 표현형 특성과의 상관관계에 대해 분석하였다. 1:1 E-to-T에서의 7일차 사멸 백분율은 CAR+CD4+41BB+, CAR+CD4+Tim3+(p = 0.0352), CAR+CD4+TEM+(p = 0.0328), CAR+CD8+PD-1+(p = 0.0269) 및 13일차에서의 %CAR 발현(p = 0.0245)과 음의 상관 관계가 있다. 1:1 E-to-T에서의 7일차 사멸 백분율은 CAR+CD8+TSCM+와 양의 상관 관계가 있다. 1:1 E-to-T에서의 9일차 사멸 백분율은 CAR+CD4+Tim3+, CAR+CD4+TEM+(p = 0.0031), CAR+CD8+Tcm+(p = 0.0182) 및 13일차에서의 %CAR 발현(p = 0.0469)과 음의 상관 관계가 있다. 1:1 E-to-T에서의 9일차 사멸 백분율은 CAR+CD8+TSCM+, CAR+CD8+Tim3-PD-1-(p = 0.0318), 및 CAR+CD4+TSCM+(p = 0.0289)와 양의 상관 관계가 있다.
실시예 3: 상이한 렌티바이러스 작제물을 함유하는 렌티바이러스의 역가 분석
이 실험에서, 렌티바이러스 벡터 작제물을 바이러스 포장 세포주에 도입하고, 렌티바이러스를 함유하는 항-CD19 CAR을 생성하고, 실시예 1에서와 유사한 프로토콜로 렌티겐(Gaithersberg, MD)에서 역가를 결정하였다.
렌티바이러스 역가는 바이러스 단백질 p24 레벨의 물리적 역가를 측정하거나 형질도입 역가를 측정함으로써 평가하였다. 안전 스위치 RQR8이 렌티바이러스 작제물 v1.0에서 제거되었을 때, 바이러스 역가가 상당히 감소한다는 것이 예기치 않게 밝혀졌다(표 5의 v1.1과 v1.0 비교). v1.1에서의 EF1a 프로모터를 v1.2에서와 같은 짧은 또는 절단된 EF1a 프로모터("EF1a(짧은) 프로모터")로 대체했을 때 역가가 개선되었다.
Figure pct00012
항-CD19 CAR v1.0, v1.2 및 v1.3의 렌티바이러스 제제의 완건성을 분석하기 위해, 바이러스 적정 분석을 수행하였다. v1.0, v1.2 및 v1.3의 렌티바이러스 제제의 연속 부피 희석을 Pan T 세포의 형질도입 후 5일차의 %CAR+ T 세포에 대해 분석하였다. 결과는 낮은 희석(예를 들어, 10% v/v)에서, 3개의 작제물 모두가 유사한 허용 가능한 형질도입 효율을 나타냈다는 것을 보여준다. 그러나, 희석이 증가함(예를 들어, 3.3%, 1.1% v/v)에 따라, 리툭시맙-내성 항-CD19 CAR 작제물 v1.3의 형질도입 효율은 다른 리툭시맙-내성 항-CD19 CAR 작제물 v1.2와 비교하여 더 유의하게 떨어졌다. 도 12 참조. 작제물 v1.2를 생체 내 분석을 위해 선택하였다.
실시예 4: 생체 내 효능 분석
이 실험에서는, 마우스 종양 모델에서 ALLO-501v1.2의 생체 내 항-종양 효능을 ALLO-501v1.0과 비교하여 분석하였다. 루시페라아제 리포터 유전자를 운반하는 CD19 양성 Raji 세포를 NSG 마우스에 주입하였다. v1.0 또는 v1.2 렌티바이러스 작제물을 함유하는 렌티바이러스를 2개체의 공여자 541 및 604의 Pan T 세포로 형질도입하였다. NSG 마우스에게 꼬리 정맥 주사를 통해 100,000 루시페라아제 Raji 세포를 접종하였다. 접종 후 4일차에, Raji-함유 NSG 마우스에게 표시된 투여량으로 CAR 작제물을 투여하였다. Raji 생착 및 진행을 루시페라아제 기질의 i.p. 주사로 평가한 다음, 누적 루시페라아제 신호를 측정하였다. 결과를 도 13a(공여자 541) 및 도 13b(공여자 604)에 나타냈다.
개시된 교시는 다양한 응용, 방법, 키트, 및 조성물을 참조하여 설명되었지만, 본원의 교시 및 아래의 청구된 발명을 벗어나지 않고서 다양한 변경 및 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 전술한 실시예는 개시된 교시를 더 잘 설명하기 위해 제공되며, 본원에서 제시된 교시의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 본 교시는 이들 예시적인 구현예의 관점에서 설명되었지만, 당업자는 과도한 실험 없이 이들 예시적인 구현예의 수많은 변형 및 변경이 가능하다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 이러한 모든 변형 및 변경은 본 교시의 범위 내에 있다.
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
SEQUENCE LISTING <110> ALLOGENE THERAPEUTICS, INC. <120> RITUXIMAB-RESISTANT CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND USES THEREOF <130> AT-028/03WO <140> <141> <150> 63/005,041 <151> 2020-04-03 <150> 62/839,455 <151> 2019-04-26 <160> 41 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2019 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> source <223> /note="chimeric antigen receptor" <400> 1 atgctgacca gcctgctgtg ctggatggcc ctgtgcctgc tgggcgccga ccacgccgat 60 gcctgcccct acagcaaccc cagcctgtgc agcggaggcg gcggcagcga gctgcccacc 120 cagggcacct tctccaacgt gtccaccaac gtgagcccag ccaagcccac caccaccgcc 180 tgtccttatt ccaatccttc cctgtgtagc ggagggggag gcagcccagc ccccagacct 240 cccaccccag cccccaccat cgccagccag cctctgagcc tgagacccga ggcctgccgc 300 ccagccgccg gcggcgccgt gcacaccaga ggcctggatt tcgcctgcga tatctacatc 360 tgggccccac tggccggcac ctgtggcgtg ctgctgctga gcctggtgat caccctgtac 420 tgcaaccacc gcaaccgcag gcgcgtgtgc aagtgcccca ggcccgtggt gagagccgag 480 ggcagaggca gcctgctgac ctgcggcgac gtggaggaga acccaggccc catggagacc 540 gacaccctgc tgctgtgggt gctgctgctg tgggtgccag gcagcaccgg cgaggtgcag 600 ctgcagcaga gcggacccga gctgatcaag ccaggcgcca gcgtgaagat gagctgcaag 660 gccagcggct acaccttcac cagctacgtg atgcactggg tgaagcagaa gccaggccag 720 ggcctggagt ggatcggcta catcaacccc tacaacgacg gcaccaagta caacgagaag 780 ttcaagggca aggccaccct gaccagcgac aagagcagca gcaccgccta catggagctg 840 agcagcctga ccagcgagga cagcgccgtg tactactgcg ccagaggcac ctactactac 900 ggcagccggg tgttcgacta ctggggccag ggcaccaccc tgaccgtgag ctctggcgga 960 ggcggctctg gcggaggcgg ctctggcgga ggcggcagcg acatcgtgat gacccaggct 1020 gcccccagca tccccgtgac cccaggcgag agcgtgagca tcagctgccg gagcagcaag 1080 agcctgctga acagcaacgg caacacctac ctgtactggt tcctgcagcg gccaggccag 1140 agcccccagc tgctgatcta ccggatgagc aacctggcca gcggcgtgcc cgaccggttc 1200 agcggcagcg gcagcggcac cgccttcacc ctgcggatca gccgggtgga ggccgaggac 1260 gtgggcgtgt actactgcat gcagcacctg gagtacccct tcaccttcgg agccggcacc 1320 aagctggagc tgaagcggtc ggatcccacc accaccccag ccccacggcc acctacccct 1380 gccccaacca tcgccagcca gcccctgagc ctgcggcctg aagcctgcag gcctgccgcc 1440 ggaggagccg tgcacacaag gggcctggac ttcgcctgcg acatctatat ctgggccccc 1500 ctggccggga catgcggggt gctgctgctg tccctggtga ttacactgta ttgcaaacgg 1560 ggccggaaga agctgctgta catcttcaag cagcccttca tgcggcccgt gcagaccacc 1620 caggaggagg acggctgcag ctgccggttc cccgaggaag aggaaggcgg ctgcgagctg 1680 cgggtgaagt tcagccggag cgccgacgcc ccagcctacc agcagggcca gaaccagctg 1740 tacaacgagc tgaacctggg acggcgggag gagtacgacg tgctggacaa gcggcgggga 1800 cgggaccccg agatgggcgg caagcctcgc cggaagaatc cccaggaggg cctgtacaac 1860 gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 1920 cgccggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 1980 tacgacgccc tgcacatgca ggccctgcca ccccggtga 2019 <210> 2 <211> 1488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> source <223> /note="chimeric antigen receptor" <400> 2 atggagaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccagg cagcaccggc 60 gaggtgcagc tgcagcagag cggacccgag ctgatcaagc caggcgccag cgtgaagatg 120 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacgtga tgcactgggt gaagcagaag 180 ccaggccagg gcctggagtg gatcggctac atcaacccct acaacgacgg caccaagtac 240 aacgagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accagcgaca agagcagcag caccgcctac 300 atggagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc cagaggcacc 360 tactactacg gcagccgggt gttcgactac tggggccagg gcaccaccct gaccgtgagc 420 tctggcggag gcggctctgg cggaggcggc tctggcggag gcggcagcga catcgtgatg 480 acccaggctg cccccagcat ccccgtgacc ccaggcgaga gcgtgagcat cagctgccgg 540 agcagcaaga gcctgctgaa cagcaacggc aacacctacc tgtactggtt cctgcagcgg 600 ccaggccaga gcccccagct gctgatctac cggatgagca acctggccag cggcgtgccc 660 gaccggttca gcggcagcgg cagcggcacc gccttcaccc tgcggatcag ccgggtggag 720 gccgaggacg tgggcgtgta ctactgcatg cagcacctgg agtacccctt caccttcgga 780 gccggcacca agctggagct gaagcggtcg gatcccacca ccaccccagc cccacggcca 840 cctacccctg ccccaaccat cgccagccag cccctgagcc tgcggcctga agcctgcagg 900 cctgccgccg gaggagccgt gcacacaagg ggcctggact tcgcctgcga catctatatc 960 tgggcccccc tggccgggac atgcggggtg ctgctgctgt ccctggtgat tacactgtat 1020 tgcaaacggg gccggaagaa gctgctgtac atcttcaagc agcccttcat gcggcccgtg 1080 cagaccaccc aggaggagga cggctgcagc tgccggttcc ccgaggaaga ggaaggcggc 1140 tgcgagctgc gggtgaagtt cagccggagc gccgacgccc cagcctacca gcagggccag 1200 aaccagctgt acaacgagct gaacctggga cggcgggagg agtacgacgt gctggacaag 1260 cggcggggac gggaccccga gatgggcggc aagcctcgcc ggaagaatcc ccaggagggc 1320 ctgtacaacg agctgcagaa ggacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag 1380 ggcgagcggc gccggggcaa gggccacgac ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc 1440 aaggacacct acgacgccct gcacatgcag gccctgccac cccggtga 1488 <210> 3 <211> 1488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> source <223> /note="chimeric antigen receptor" <400> 3 atggagacag ataccctgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcctgg ctccacagga 60 gaggtgcagc tgcagcagtc tggaccagag ctgatcaagc ctggagcatc cgtgaagatg 120 tcttgcaagg ccagcggcta tacattcacc agctacgtga tgcactgggt gaagcagaag 180 cctggccagg gcctggagtg gatcggctat atcaatccat acaacgacgg caccaagtat 240 aatgagaagt ttaagggcaa ggccacactg acctctgata agagctcctc tacagcctac 300 atggagctga gctccctgac ctctgaggac agcgccgtgt actattgcgc cagaggcaca 360 tactattacg gcagcagggt gttcgattac tggggccagg gcaccacact gaccgtgtct 420 agcggaggag gaggctccgg aggaggaggc tctggcggcg gcggcagcga catcgtgatg 480 acacaggcag caccaagcat cccagtgacc cctggcgaga gcgtgtccat ctcttgtcgg 540 tcctctaagt ccctgctgaa ctctaatggc aacacctatc tgtactggtt tctgcagcgg 600 cccggacagt ccccacagct gctgatctat aggatgagca acctggcatc cggagtgcct 660 gatcgcttca gcggctccgg ctctggaaca gcctttaccc tgaggatctc tcgggtggag 720 gcagaggacg tgggcgtgta ttactgcatg cagcacctgg agtacccctt cacatttggc 780 gcaggaacca agctggagct gaagcggagc gaccccacca caacccctgc accacggccc 840 cctacaccag cacctaccat cgcatctcag ccactgagcc tgcggcccga ggcctgtagg 900 cctgcagcag gaggagcagt gcacaccagg ggcctggact tcgcctgcga tatctatatc 960 tgggcaccac tggcaggaac atgtggcgtg ctgctgctga gcctggtcat caccctgtat 1020 tgcaagagag gcaggaagaa gctgctgtac atcttcaagc agccttttat gcggccagtg 1080 cagacaaccc aggaggagga tggctgctcc tgtagattcc cagaggagga ggagggagga 1140 tgtgagctgc gcgtgaagtt tagccggtcc gccgacgcac cagcatatca gcagggccag 1200 aatcagctgt acaatgagct gaacctgggc cggagagagg agtacgacgt gctggataag 1260 aggaggggaa gggaccccga gatgggaggc aagccacgga gaaagaatcc ccaggagggc 1320 ctgtataacg agctgcagaa ggataagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag 1380 ggagagaggc gccggggcaa gggacacgac ggcctgtatc agggcctgtc cacagccacc 1440 aaggacacct acgatgccct gcacatgcag gccctgccac caaggtga 1488 <210> 4 <211> 1875 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> source <223> /note="chimeric antigen receptor" <400> 4 atgggaacaa gcctgctgtg ctggatggct ctgtgcctgc tgggggccga ccacgctgac 60 gcctccgggg gggggggctc tcctgcccct aggcccccta cacctgcacc aaccatcgca 120 tcccagccac tgtctctgcg ccctgaggcc tgccggccag cagcaggagg agcagtgcac 180 acccgcggcc tggacttcgc ctgcgatatc tatatctggg caccactggc aggcacatgt 240 ggcgtgctgc tgctgagcct ggtcatcacc ctgtactgca atcacaggaa ccggagaagg 300 gtgtgcaagt gtccccggcc tgtggtgaga gcagagggaa ggggcagcct gctgacatgt 360 ggcgacgtgg aggagaatcc aggccctatg gagacagata ccctgctgct gtgggtgctg 420 ctgctgtggg tgcccggcag caccggagag gtgcagctgc agcagtccgg accagagctg 480 atcaagcctg gagccagcgt gaagatgtcc tgtaaggcct ctggctatac attcaccagc 540 tacgtgatgc actgggtgaa gcagaagcct ggccagggcc tggagtggat cggctatatc 600 aatccataca acgacggcac aaagtataac gagaagttta agggcaaggc cacactgacc 660 tccgataaga gctcctctac agcctacatg gagctgagct ccctgacctc tgaggacagc 720 gccgtgtact attgcgccag aggcacatac tattacggct ctagggtgtt cgattactgg 780 ggccagggca ccacactgac cgtgtctagc ggaggaggag gcagcggagg aggaggctcc 840 ggcggcggcg gctctgacat cgtgatgaca caggcagcac catccatccc agtgacccct 900 ggcgagagcg tgtccatctc ttgtcggtcc tctaagagcc tgctgaactc caatggcaac 960 acctatctgt actggtttct gcagcggccc ggacagagcc cacagctgct gatctatagg 1020 atgtctaatc tggcaagcgg cgtgcccgat cgcttcagcg gctccggctc tggcacagcc 1080 tttaccctga ggatctcccg cgtggaggca gaggacgtgg gcgtgtatta ctgcatgcag 1140 cacctggagt accccttcac atttggcgca ggcaccaagc tggagctgaa gcggagcgac 1200 cccaccacaa cccctgcacc acggccaccc acaccagcac ctactattgc atcccagcca 1260 ctgagcctgc ggcccgaggc ctgtaggcct gccgccggcg gcgcagtgca cacccggggc 1320 ctggactttg cctgcgatat ctacatctgg gcacctctgg ccggcacatg cggcgtgctg 1380 ttactgagcc tggtcatcac cctgtattgc aagcggggca gaaagaagct gctgtacatc 1440 ttcaagcagc cttttatgcg gccagtgcag acaacccagg aggaggatgg ctgctcctgt 1500 agattcccag aggaggagga gggaggatgt gagctgcgcg tgaagtttag ccggtccgcc 1560 gacgcaccag catatcagca gggccagaac cagctgtaca atgagctgaa cctgggccgg 1620 agagaggagt atgacgtgct ggataagaga cggggccggg accccgagat gggaggcaag 1680 ccacgccgga agaatcccca ggagggcctg tataacgagc tgcagaagga taagatggcc 1740 gaggcctaca gcgagatcgg catgaaggga gagagaaggc gcggcaaggg acacgacggc 1800 ctgtaccagg gcctgagcac agcaacaaaa gacacctacg acgcactgca catgcaggct 1860 ctgccccctc ggtaa 1875 <210> 5 <211> 1941 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> source <223> /note="chimeric antigen receptor" <400> 5 atgggaacct ctctgctgtg ctggatggct ctgtgcctgc tgggggccga tcacgctgac 60 gcaagtggcg ggggggggtc cgaactgccc acacagggca ccttctccaa cgtgagcacc 120 aacgtgagct ccggcggagg aggcagccct gcaccaaggc cccctacacc agcacctacc 180 atcgcatctc agccactgag cctgcgcccc gaggcctgcc ggcctgcagc aggcggcgcc 240 gtgcacaccc gcggcctgga ctttgcctgc gatatctata tctgggcacc tctggcaggc 300 acatgtggcg tgctgctgct gagcctggtc atcaccctgt actgcaatca caggaaccgg 360 agaagggtgt gcaagtgtcc acggcccgtg gtgagagcag agggaagggg ctccctgctg 420 acatgtggcg acgtggagga gaatcctggc ccaatggaga cagataccct gctgctgtgg 480 gtgctgctgc tgtgggtgcc cggctccacc ggagaggtgc agctgcagca gtctggacca 540 gagctgatca agccaggagc atccgtgaag atgtcttgta aggccagcgg ctatacattc 600 accagctacg tgatgcactg ggtgaagcag aagccaggac agggcctgga gtggatcggc 660 tatatcaatc cttacaacga cggcaccaag tataacgaga agtttaaggg caaggccaca 720 ctgacctctg ataagtctag ctccacagcc tacatggagc tgtctagcct gaccagcgag 780 gactccgccg tgtactattg cgccagaggc acatactatt acggcagcag ggtgttcgat 840 tactggggcc agggcaccac actgaccgtg tcctctggag gaggaggctc cggaggagga 900 ggctctggcg gcggcggcag cgacatcgtg atgacacagg cagcaccttc catcccagtg 960 accccaggcg agtctgtgag catctcctgt cggagctcca agtccctgct gaactctaat 1020 ggcaacacct atctgtactg gtttctgcag cggcccggac agtccccaca gctgctgatc 1080 tataggatga gcaatctggc ctccggcgtg ccagatcgct tctctggcag cggctccggc 1140 acagccttta ccctgaggat ctctcgcgtg gaggcagagg acgtgggcgt gtattactgc 1200 atgcagcacc tggagtaccc attcacattt ggcgcaggca ccaagctgga gctgaagcgg 1260 agcgacccca ccacaacccc agcacctcgg ccacccacac cagcacccac catcgcatct 1320 cagcctctga gcctgcggcc cgaggcctgt aggcccgcag caggaggagc agtgcacacc 1380 cggggcctgg acttcgcctg cgatatctac atctgggcac cactggccgg cacatgcggc 1440 gtgctgttac tgagcctggt catcaccctg tattgcaagc ggggcagaaa gaagctgctg 1500 tacatcttca agcagccctt tatgcggcct gtgcagacaa cccaggagga ggatggctgc 1560 tcctgtagat tccctgagga ggaggaggga ggatgtgagc tgcgcgtgaa gttttctcgg 1620 agcgccgacg caccagcata tcagcaggga cagaaccagc tgtacaatga gctgaacctg 1680 ggccggagag aggagtatga cgtgctggat aagagacggg gccgggaccc cgagatggga 1740 ggcaagcctc gccggaagaa tccacaggag ggcctgtata acgagctgca gaaggataag 1800 atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggagaga gaaggcgcgg caagggacac 1860 gacggcctgt accagggcct gagcacagca acaaaagaca cctacgacgc actgcacatg 1920 caggctctgc caccaagatg a 1941 <210> 6 <211> 2019 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> source <223> /note="chimeric antigen receptor" <400> 6 atggggacct cactgctgtg ctggatggct ctgtgcctgc tgggggccga ccacgctgac 60 gcctgctctg gggggggggg gggctcatgc tccggaggag gaggctctga gctgccaacc 120 cagggcacat tctccaacgt gagcaccaac gtgtctcctg ccaagccaac cacaaccgca 180 tgcagcggcg gaggaggagg cagctgttcc ggcggcggcg gcagccctgc cccaaggccc 240 cctaccccag cacctacaat cgcatctcag cctctgagcc tgcgcccaga ggcctgtcgg 300 cccgcagcag gaggagcagt gcacacccgc ggcctggact ttgcctgcga tatctatatc 360 tgggcaccac tggcaggcac ctgtggcgtg ctgctgctga gcctggtcat caccctgtac 420 tgcaatcaca ggaaccggag aagggtgtgc aagtgtccac ggcccgtggt gagagcagag 480 ggaaggggct ctctgctgac ctgtggcgac gtggaggaga atcctggccc tatggagaca 540 gatacactgc tgctgtgggt gctgctgctg tgggtgcccg gcagcacagg agaggtgcag 600 ctgcagcagt ccggacctga gctgatcaag ccaggcgcct ccgtgaagat gtcttgcaag 660 gccagcggct ataccttcac aagctacgtg atgcactggg tgaagcagaa gccaggccag 720 ggcctggagt ggatcggcta tatcaatccc tacaacgacg gcaccaagta taacgagaag 780 tttaagggca aggccaccct gacaagcgat aagagctcct ctaccgccta catggagctg 840 agctccctga caagcgagga ctccgccgtg tactattgcg ccagaggcac ctactattac 900 ggctccaggg tgttcgatta ctggggccag ggcacaaccc tgacagtgtc tagcggagga 960 ggaggcagcg gaggaggagg ctccggcggc ggcggctctg acatcgtgat gacccaggca 1020 gcaccatcca tccctgtgac accaggcgag tctgtgagca tctcctgtcg gtcctctaag 1080 tccctgctga actctaatgg caacacctat ctgtactggt ttctgcagcg gcccggacag 1140 tctcctcagc tgctgatcta taggatgagc aatctggcct ccggcgtgcc tgatcgcttc 1200 tctggcagcg gctccggcac cgcctttaca ctgaggatca gccgcgtgga ggcagaggac 1260 gtgggcgtgt attactgcat gcagcacctg gagtaccctt tcacctttgg cgccggcaca 1320 aagctggagc tgaagcggag cgaccccaca accacaccag cacctcggcc acccacccca 1380 gcaccaacaa tcgcatctca gccactgagc ctgcggcccg aggcctgtag gccagccgcc 1440 ggcggcgcag tgcacacccg gggcctggac ttcgcctgcg atatctacat ctgggcccct 1500 ctggccggca cctgcggcgt gctgttactg agcctggtca tcaccctgta ttgcaagcgg 1560 ggcagaaaga agctgctgta catcttcaag cagcccttca tgcggcccgt gcagaccaca 1620 caggaggagg atggctgctc ctgtagattc ccagaggagg aggagggagg atgtgagctg 1680 cgcgtgaagt tttctcggag cgccgacgca cctgcatatc agcagggaca gaaccagctg 1740 tacaatgagc tgaacctggg ccggagagag gagtatgacg tgctggataa gagacggggc 1800 cgggaccccg agatgggagg caagccccgc cggaagaatc ctcaggaggg cctgtataac 1860 gagctgcaga aggataagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggagagaga 1920 aggcgcggca agggccacga cggcctgtac cagggcctgt ccacagcaac aaaggatact 1980 tatgacgctc tgcacatgca ggctctgccc cctcggtga 2019 <210> 7 <211> 2061 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> source <223> /note="chimeric antigen receptor" <400> 7 atgggaacca gcctgctgtg ctggatggca ctgtgcctgc tgggagcaga ccacgccgat 60 gccgaactgc ctactcaggg gacattctct aatgtgagca ccaacgtgag ctctggagga 120 ggaggctccg agctgccaac ccagggcaca ttctctaatg tgagcacaaa cgtgtctccc 180 gccaagccta ccacaaccgc cgaactgcct acccagggca cattttccaa cgtgtctacc 240 aacgtgtcta gcggaggagg aggctccccc gcacctaggc cccctacccc agcaccaaca 300 atcgcaagcc agcctctgtc cctgcgccca gaggcatgca ggccagcagc aggaggagca 360 gtgcacaccc gcggcctgga ctttgcctgc gatatctata tctgggcacc actggcagga 420 acctgtggcg tgctgctgct gtctctggtc atcaccctgt actgcaatca cagaaaccgg 480 agaagggtgt gcaagtgtcc tcggccagtg gtgagagcag agggaagggg cagcctgctg 540 acctgtggcg acgtggagga gaatcccggc cctatggaga cagatacact gctgctgtgg 600 gtgctgctgc tgtgggtgcc aggctctaca ggagaggtgc agctgcagca gagcggacct 660 gagctgatca agccaggcgc ctctgtgaag atgagctgca aggcctccgg ctataccttc 720 acaagctacg tgatgcactg ggtgaagcag aagccaggcc agggcctgga gtggatcggc 780 tatatcaatc cctacaacga cggcaccaag tataacgaga agtttaaggg caaggccacc 840 ctgacatccg ataagagctc ctctaccgcc tacatggagc tgagctccct gacatccgag 900 gactctgccg tgtactattg cgccagaggc acctactatt acggctctag ggtgttcgat 960 tactggggcc agggcacaac cctgacagtg tctagcggag gaggaggctc tggaggagga 1020 ggcagcggcg gcggaggctc cgacatcgtg atgacccagg cagcaccatc catcccagtg 1080 acacctggcg agagcgtgtc catctcttgt aggtcctcta agtctctgct gaacagcaat 1140 ggcaacacct atctgtactg gtttctgcag cggcccggac agagccctca gctgctgatc 1200 tataggatgt ccaatctggc ctctggagtg cctgatcgct tcagcggctc cggctctgga 1260 accgccttta cactgaggat ctcccgcgtg gaggcagagg acgtgggcgt gtattactgc 1320 atgcagcacc tggagtaccc tttcaccttt ggcgccggca caaagctgga gctgaagcgg 1380 agcgacccca caaccacacc agcaccccgg ccaccaaccc ctgcccctac aatcgcaagc 1440 cagccactgt ccctgcggcc cgaggcctgt agacctgccg ccggcggcgc cgtccatacc 1500 cgcggcctgg atttcgcctg cgatatctac atttgggccc ctctggccgg cacttgcggc 1560 gtgctgctgc tgagcctggt catcaccctg tattgcaagc ggggcagaaa gaagctgctg 1620 tacatcttca agcagccctt catgcggccc gtgcagacca cacaggagga ggatggctgc 1680 tcctgtagat tcccagagga ggaggaggga ggatgtgagc tgcgcgtgaa gtttagccgg 1740 tccgccgacg cacctgcata tcagcagggc cagaaccagc tgtacaatga gctgaacctg 1800 ggccggagag aggagtacga cgtgctggat aagagaaggg gacgggaccc cgagatggga 1860 ggcaagcccc gccggaagaa tcctcaggag ggcctgtata acgagctgca gaaggataag 1920 atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggagaga gaaggcgcgg caagggacac 1980 gacggcctgt atcagggcct gtccaccgcc acaaaggaca cctacgatgc cctgcacatg 2040 caggccctgc ctccaagatg a 2061 <210> 8 <211> 672 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="chimeric antigen receptor" <400> 8 Met Leu Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Asp Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser 35 40 45 Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro 65 70 75 80 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 85 90 95 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 100 105 110 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 115 120 125 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg 130 135 140 Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Arg Ala Glu 145 150 155 160 Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly 165 170 175 Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val 180 185 190 Pro Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 195 200 205 Ile Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 210 215 220 Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln 225 230 235 240 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys 245 250 255 Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser 260 265 270 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 275 280 285 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val 290 295 300 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly 305 310 315 320 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val 325 330 335 Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val 340 345 350 Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn 355 360 365 Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu 370 375 380 Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 385 390 395 400 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val 405 410 415 Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr 420 425 430 Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp 435 440 445 Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 450 455 460 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 465 470 475 480 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 485 490 495 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 500 505 510 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 515 520 525 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 530 535 540 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 545 550 555 560 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 565 570 575 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 580 585 590 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 595 600 605 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 610 615 620 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 625 630 635 640 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 645 650 655 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 660 665 670 <210> 9 <211> 495 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="chimeric antigen receptor" <400> 9 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile 20 25 30 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 35 40 45 Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr 65 70 75 80 Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser 165 170 175 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr 180 185 190 Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu 195 200 205 Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 210 215 220 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu 225 230 235 240 Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro 245 250 255 Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro 260 265 270 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 275 280 285 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 290 295 300 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 305 310 315 320 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 325 330 335 Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 340 345 350 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 355 360 365 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg 370 375 380 Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln 385 390 395 400 Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp 405 410 415 Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro 420 425 430 Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp 435 440 445 Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg 450 455 460 Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr 465 470 475 480 Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 490 495 <210> 10 <211> 495 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="chimeric antigen receptor" <400> 10 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile 20 25 30 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 35 40 45 Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr 65 70 75 80 Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met 145 150 155 160 Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser 165 170 175 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr 180 185 190 Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu 195 200 205 Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 210 215 220 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu 225 230 235 240 Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro 245 250 255 Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro 260 265 270 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 275 280 285 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 290 295 300 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 305 310 315 320 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 325 330 335 Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 340 345 350 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 355 360 365 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg 370 375 380 Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln 385 390 395 400 Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp 405 410 415 Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro 420 425 430 Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp 435 440 445 Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg 450 455 460 Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr 465 470 475 480 Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 490 495 <210> 11 <211> 624 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="chimeric antigen receptor" <400> 11 Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Asp Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro 20 25 30 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 35 40 45 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 50 55 60 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 65 70 75 80 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg 85 90 95 Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Arg Ala Glu 100 105 110 Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly 115 120 125 Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val 130 135 140 Pro Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 145 150 155 160 Ile Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 165 170 175 Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln 180 185 190 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys 195 200 205 Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser 210 215 220 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 225 230 235 240 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val 245 250 255 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly 260 265 270 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val 275 280 285 Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val 290 295 300 Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn 305 310 315 320 Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu 325 330 335 Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 340 345 350 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val 355 360 365 Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr 370 375 380 Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp 385 390 395 400 Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 405 410 415 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 420 425 430 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 435 440 445 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 450 455 460 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 465 470 475 480 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 485 490 495 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 500 505 510 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 515 520 525 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 530 535 540 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 545 550 555 560 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 565 570 575 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 580 585 590 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 595 600 605 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 610 615 620 <210> 12 <211> 646 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="chimeric antigen receptor" <400> 12 Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Asp Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln 20 25 30 Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln 50 55 60 Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala 65 70 75 80 Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala 85 90 95 Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr 100 105 110 Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg 115 120 125 Pro Val Val Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp 130 135 140 Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp 145 150 155 160 Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln 165 170 175 Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser 180 185 190 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val 195 200 205 Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro 210 215 220 Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr 225 230 235 240 Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser 245 250 255 Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr 260 265 270 Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 275 280 285 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 290 295 300 Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val 305 310 315 320 Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu 325 330 335 Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro 340 345 350 Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser 355 360 365 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr 370 375 380 Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 385 390 395 400 Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 405 410 415 Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 420 425 430 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 435 440 445 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 450 455 460 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 465 470 475 480 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 485 490 495 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 500 505 510 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 515 520 525 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 530 535 540 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 545 550 555 560 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 565 570 575 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 580 585 590 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 595 600 605 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 610 615 620 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 625 630 635 640 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 645 <210> 13 <211> 672 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="chimeric antigen receptor" <400> 13 Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Asp Ala Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Cys Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser 35 40 45 Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Ser Gly Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro 65 70 75 80 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 85 90 95 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 100 105 110 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 115 120 125 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg 130 135 140 Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Arg Ala Glu 145 150 155 160 Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly 165 170 175 Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val 180 185 190 Pro Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 195 200 205 Ile Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 210 215 220 Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln 225 230 235 240 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys 245 250 255 Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser 260 265 270 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 275 280 285 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val 290 295 300 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly 305 310 315 320 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val 325 330 335 Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val 340 345 350 Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn 355 360 365 Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu 370 375 380 Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 385 390 395 400 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val 405 410 415 Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr 420 425 430 Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp 435 440 445 Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 450 455 460 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 465 470 475 480 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 485 490 495 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 500 505 510 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 515 520 525 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 530 535 540 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 545 550 555 560 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 565 570 575 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 580 585 590 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 595 600 605 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 610 615 620 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 625 630 635 640 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 645 650 655 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 660 665 670 <210> 14 <211> 686 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="chimeric antigen receptor" <400> 14 Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Asp Ala Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val 20 25 30 Ser Thr Asn Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln 35 40 45 Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr 50 55 60 Thr Thr Ala Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr 65 70 75 80 Asn Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr 85 90 95 Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala 100 105 110 Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe 115 120 125 Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val 130 135 140 Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg 145 150 155 160 Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Arg Ala Glu Gly Arg 165 170 175 Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met 180 185 190 Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly 195 200 205 Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys 210 215 220 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 225 230 235 240 Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 245 250 255 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 260 265 270 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser 275 280 285 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 290 295 300 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe Asp 305 310 315 320 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 325 330 335 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr 340 345 350 Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile 355 360 365 Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 370 375 380 Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile 385 390 395 400 Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 405 410 415 Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala 420 425 430 Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe 435 440 445 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp Pro Thr 450 455 460 Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser 465 470 475 480 Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly 485 490 495 Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp 500 505 510 Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile 515 520 525 Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys 530 535 540 Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys 545 550 555 560 Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val 565 570 575 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 580 585 590 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 595 600 605 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 610 615 620 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 625 630 635 640 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 645 650 655 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 660 665 670 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 675 680 685 <210> 15 <211> 1189 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> source <223> /note="artificial promoter" <400> 15 gcgtgaggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag 60 ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg 120 gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata 180 agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggta 240 agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct 300 tgaattactt ccacgcccct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg 360 aagtgggtgg gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt 420 tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg 480 tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct 540 ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt 600 ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg 660 gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc 720 tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg 780 gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc 840 aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag 900 ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag 960 gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt 1020 ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca 1080 cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa 1140 gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1189 <210> 16 <211> 237 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> source <223> /note="promoter" <400> 16 gcgtgaggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag 60 ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg 120 gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata 180 agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacag 237 <210> 17 <211> 464 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="immunoglobulin gamma 1 heavy chain" <400> 17 Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Val Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr 130 135 140 Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn 145 150 155 160 Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val 210 215 220 Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg 225 230 235 240 Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser 245 250 255 Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu 260 265 270 Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro 275 280 285 Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala 290 295 300 Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val 305 310 315 320 Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe 325 330 335 Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 340 345 350 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile 355 360 365 Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys 370 375 380 Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp 385 390 395 400 Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp 405 410 415 Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser 420 425 430 Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly 435 440 445 Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 18 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="immunoglobulin kappa light chain" <400> 18 Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe 85 90 95 Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp 165 170 175 Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys 195 200 205 Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys 210 215 220 Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 19 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="rituximab binding sequence" <400> 19 Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Pro 20 25 30 Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 65 70 75 80 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 85 90 95 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 100 105 110 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val 115 120 125 Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val 130 135 <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> source <223> /note="signal peptide" <400> 20 Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Asp Ala 20 <210> 21 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 21 Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asp His Ala Asp Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser 35 40 45 Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser 50 55 60 Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro 65 70 75 80 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 85 90 95 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 100 105 110 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 115 120 125 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg 130 135 140 Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val 145 150 155 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 22 Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys 1 5 <210> 23 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 23 Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp 1 5 10 15 Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn 20 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 24 Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 25 Cys Gln Tyr Asn Leu Ser Ser Arg Ala Leu Lys Cys 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 26 Cys Val Trp Gln Arg Trp Gln Lys Ser Tyr Val Cys 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 27 Cys Met Trp Asp Arg Phe Ser Arg Trp Tyr Lys Cys 1 5 10 <210> 28 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 28 Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp 1 5 10 15 Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg 20 25 <210> 29 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 29 Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln 1 5 10 15 Ile Lys Glu <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 30 Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser 1 5 10 15 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 31 Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ser 1 5 10 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 32 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 33 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 33 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 34 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 34 Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 35 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 35 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr 20 <210> 36 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 36 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 35 40 45 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 50 55 60 Ile Thr 65 <210> 37 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 37 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 38 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 38 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 1 5 10 15 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 20 25 30 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 35 40 45 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 100 105 110 Arg <210> 39 <211> 943 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> source <223> /note="intron" <400> 39 gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg 60 ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt 120 tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg 180 agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc 240 ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac 300 gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc 360 ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag 420 gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc 480 tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc 540 ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag 600 ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa 660 aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc 720 caggcacctc gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg 780 gttttatgcg atggagtttc cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg 840 gcacttgatg taattctcct tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct 900 caagcctcag acagtggttc aaagtttttt tcttccattt cag 943 <210> 40 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> source <223> /note="mutated rituximab binding sequences" <400> 40 Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Pro 20 25 30 Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Cys 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 65 70 75 80 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 85 90 95 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 100 105 110 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val 115 120 125 Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val 130 135 <210> 41 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> SITE <222> (1)..(25) <223> /note="This sequence may encompass 1-5 'Gly Gly Gly Gly Ser' repeating units" <400> 41 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25

Claims (27)

  1. 서열번호 9와 적어도 70% 동일한 항-CD19 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리펩티드는 리툭시맙 결합 부위를 포함하지 않으며, 상기 폴리뉴클레오티드는 포유류 T 세포에서 항-CD19 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현할 수 있는 짧은 EF1a 프로모터를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 짧은 EF1a 프로모터는 서열번호 15에 의해 포함된 인트론을 포함하지 않는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 인트론은 서열번호 39의 핵산 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 16의 핵산 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 안전 스위치를 추가로 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 안전 스위치는 링커 펩티드를 사용하여 상기 CD19 CAR에 연결되는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  7. 제5항에 있어서, 상기 안전 스위치는 T2A 링커를 사용하여 상기 항-CD19 CAR에 연결되는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안전 스위치는 항체 결합 부위를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  9. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안전 스위치는 돌연변이된 CD20 미모토프를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 CD34 에피토프를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 CD34 에피토프는 QBEND-10 에피토프인, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 CD8 힌지/막관통 도메인을 추가로 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 8 내지 14 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리펩티드를 암호화하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  15. 제15항에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터, DNA 벡터, 플라스미드, RNA 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스 관련 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 이들의 임의의 조합인, 벡터.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 면역 세포로서, 상기 조작된 면역 세포는 리툭시맙 결합 부위를 발현하지 않는, 조작된 면역 세포.
  17. 제14항 또는 제16항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 리툭시맙 결합 부위를 발현하지 않는, 조작된 면역 세포.
  18. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포, 종양 침윤 림프구(TIL), NK 세포, TCR-발현 세포, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포인, 조작된 면역 세포.
  19. 제19항에 있어서, 상기 세포는 자가 T 세포인, 조작된 면역 세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 세포는 동종 T 세포인, 조작된 면역 세포.
  21. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조작된 면역 세포.
  22. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 리툭시맙에 내성인, 조작된 면역 세포.
  23. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포를 포함하는, 약학적 조성물.
  24. 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포, 또는 제24항의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제25항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 비호지킨 림프종(NHL)인, 방법.
  26. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 대상체는 리툭시맙으로 치료받았거나 현재 치료 중인, 방법.
  27. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포, 또는 제24항의 약학적 조성물을 포함하는, 제조 물품.
KR1020217036085A 2019-04-26 2020-04-24 리툭시맙-내성 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 Pending KR20220004076A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962839455P 2019-04-26 2019-04-26
US62/839,455 2019-04-26
US202063005041P 2020-04-03 2020-04-03
US63/005,041 2020-04-03
PCT/US2020/029775 WO2020219848A1 (en) 2019-04-26 2020-04-24 Rituximab-resistant chimeric antigen receptors and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220004076A true KR20220004076A (ko) 2022-01-11

Family

ID=70847489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217036085A Pending KR20220004076A (ko) 2019-04-26 2020-04-24 리툭시맙-내성 키메라 항원 수용체 및 이의 용도

Country Status (21)

Country Link
US (2) US11896617B2 (ko)
EP (2) EP3959235B1 (ko)
JP (1) JP7664180B2 (ko)
KR (1) KR20220004076A (ko)
CN (1) CN113728001A (ko)
AU (1) AU2020263495A1 (ko)
BR (1) BR112021021178A2 (ko)
CA (1) CA3134308A1 (ko)
CO (1) CO2021014121A2 (ko)
DK (1) DK3959235T5 (ko)
ES (1) ES2961314T3 (ko)
FI (1) FI3959235T3 (ko)
IL (1) IL287487A (ko)
MX (1) MX2021012820A (ko)
MY (1) MY204280A (ko)
PE (1) PE20212369A1 (ko)
PH (1) PH12021552415A1 (ko)
SA (1) SA521430654B1 (ko)
SG (1) SG11202111031RA (ko)
TW (1) TWI865517B (ko)
WO (1) WO2020219848A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7451410B2 (ja) * 2017-10-31 2024-03-18 アロジーン セラピューティクス，インコーポレイテッド 同種キメラ抗原受容体ｔ細胞投与のための方法および組成物
WO2022147444A2 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Alaunos Therapeutics, Inc. Recombinant vectors comprising polycistronic expression cassettes and methods of use thereof

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US6319494B1 (en) 1990-12-14 2001-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
US5830462A (en) 1993-02-12 1998-11-03 President & Fellows Of Harvard College Regulated transcription of targeted genes and other biological events
US5834266A (en) 1993-02-12 1998-11-10 President & Fellows Of Harvard College Regulated apoptosis
US5869337A (en) 1993-02-12 1999-02-09 President And Fellows Of Harvard College Regulated transcription of targeted genes and other biological events
US20030036654A1 (en) 1994-08-18 2003-02-20 Holt Dennis A. Synthetic multimerizing agents
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
KR20030032922A (ko) 2000-02-24 2003-04-26 싸이트 테라피스 인코포레이티드 세포의 동시 자극 및 농축
WO2003029412A2 (en) 2001-10-02 2003-04-10 Institut Clayton De La Recherche Restricted expression lentivial vectors
WO2007137300A2 (en) 2006-05-23 2007-11-29 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Modified dendritic cells having enhanced survival and immunogenicity and related compositions and methods
US9089520B2 (en) 2010-05-21 2015-07-28 Baylor College Of Medicine Methods for inducing selective apoptosis
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
US9024028B2 (en) 2011-01-26 2015-05-05 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the synthesis of multimerizing agents
RU2688185C2 (ru) 2011-03-23 2019-05-21 Фред Хатчинсон Кэнсер Рисерч Сентер Способ и композиции для клеточной иммунотерапии
GB201206559D0 (en) 2012-04-13 2012-05-30 Ucl Business Plc Polypeptide
WO2014184143A1 (en) 2013-05-13 2014-11-20 Cellectis Cd19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof
KR102247979B1 (ko) * 2012-05-25 2021-05-04 셀렉티스 면역요법을 위한 동종이형 및 면역억제제 저항성인 ｔ 세포의 조작 방법
EP3881868B1 (en) 2013-02-15 2023-09-27 The Regents Of The University Of California Chimeric antigen receptor and methods of use thereof
KR20150131218A (ko) 2013-03-14 2015-11-24 벨리쿰 파마슈티컬스, 인크. T 세포 증식의 제어 방법
CA2956667A1 (en) 2013-07-29 2015-02-05 Bluebird Bio, Inc. Multipartite signaling proteins and uses thereof
US10287354B2 (en) 2013-12-20 2019-05-14 Novartis Ag Regulatable chimeric antigen receptor
KR102729771B1 (ko) 2014-02-04 2024-11-14 카이트 파마 인코포레이티드 B 세포 악성종양 및 다른 암을 치료하는데 유용한 자가 t 세포 및 그의 조성물의 생산 방법
CA2937750A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for activating t cells using an inducible chimeric polypeptide
GB201403972D0 (en) * 2014-03-06 2014-04-23 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
PL3183268T3 (pl) * 2014-08-19 2020-09-07 Novartis Ag Chimeryczny receptor antygenowy (CAR) anty-CD123 do zastosowania w leczeniu nowotworu złośliwego
EP3189148A4 (en) * 2014-09-02 2018-05-02 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Costimulation of chimeric antigen receptors by myd88 and cd40 polypeptides
JP2018504145A (ja) 2015-01-26 2018-02-15 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 再発性／難治性急性骨髄性リンパ腫または芽球性形質細胞様樹状細胞新生物を処置するための、ｃｄ１２３に結合するキメラ抗原受容体を賦与された、操作されたｔ細胞受容体ノックアウト免疫細胞
GB201518792D0 (en) * 2015-10-23 2015-12-09 Univ Manchester Production of proteins
WO2017103613A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Ucl Business Plc Treatment
CA3017213A1 (en) 2016-03-11 2017-09-14 Bluebird Bio, Inc. Genome edited immune effector cells
EP3443001B1 (en) * 2016-04-11 2025-04-30 Obsidian Therapeutics, Inc. REGULATED BIOCIRCUIT SYSTEMS
GB201609597D0 (en) 2016-06-01 2016-07-13 Univ Sheffield Therapy
EP3589646A4 (en) * 2017-03-03 2021-01-20 Obsidian Therapeutics, Inc. CD19 COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMMUNOTHERAPY
AU2018246377B2 (en) 2017-03-31 2025-01-30 Cellectis Sa Universal anti-CD22 chimeric antigen receptor engineered immune cells
US20210189361A1 (en) 2018-04-23 2021-06-24 Duke University Downregulation of snca expression by targeted editing of dna-methylation
JP7399157B2 (ja) * 2018-08-28 2023-12-15 北京永泰瑞科生物科技有限公司 改良された治療用ｔ細胞

Also Published As

Publication number Publication date
CO2021014121A2 (es) 2021-10-29
MX2021012820A (es) 2021-11-25
SG11202111031RA (en) 2021-11-29
CA3134308A1 (en) 2020-10-29
EP3959235A1 (en) 2022-03-02
US20200384026A1 (en) 2020-12-10
ES2961314T3 (es) 2024-03-11
WO2020219848A1 (en) 2020-10-29
EP4295851A3 (en) 2024-02-14
PH12021552415A1 (en) 2022-07-11
BR112021021178A2 (pt) 2022-03-15
US20240277763A1 (en) 2024-08-22
SA521430654B1 (ar) 2024-08-11
EP3959235B1 (en) 2023-07-26
JP7664180B2 (ja) 2025-04-17
EP4295851A2 (en) 2023-12-27
DK3959235T3 (da) 2023-10-16
CN113728001A (zh) 2021-11-30
PE20212369A1 (es) 2021-12-21
FI3959235T3 (fi) 2023-09-27
IL287487A (en) 2021-12-01
JP2022532996A (ja) 2022-07-21
US11896617B2 (en) 2024-02-13
TW202106704A (zh) 2021-02-16
AU2020263495A1 (en) 2021-10-28
DK3959235T5 (da) 2024-08-05
MY204280A (en) 2024-08-21
TWI865517B (zh) 2024-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3823665B1 (en) Chimeric antigen receptors with bcma specificity and uses thereof
CN113543799B (zh) 靶向dll3的嵌合抗原受体和结合剂
CN115397460A (zh) 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
US20230087953A1 (en) Bcma-directed chimeric antigen receptor t cell compositions and methods and uses thereof
US20240277763A1 (en) Rituximab-resistant chimeric antigen receptors and uses thereof
KR20230084470A (ko) 면역 세포 기능의 향상
US20250171731A1 (en) Methods of manufacturing allogeneic car t cells
JP2025102823A (ja) 臨床的に意義のあるｅｇｆｒ変異型タンパク質との交差反応性を有する高親和性キメラ抗原受容体（ｃａｒ）を含む、組成物および方法
JP2024509917A (ja) 腫瘍溶解性ウイルスによる直交性ｉｌ－２の送達を用いた、固形腫瘍におけるｔ細胞の選択的刺激方法
CA3200770A1 (en) Methods and reagents for characterizing car t cells for therapies
RU2816370C2 (ru) Устойчивые к ритуксимабу химерные антигенные рецепторы и пути их применения
RU2828787C2 (ru) Способы получения аллогенных t-клеток с car
JP2025109712A (ja) リツキシマブ耐性キメラ抗原受容体およびその用途
HK40071084A (en) Rituximab-resistant chimeric antigen receptors and uses thereof
HK40071084B (en) Rituximab-resistant chimeric antigen receptors and uses thereof
KR20230142760A (ko) Car t 세포 의약품의 제형 및 프로세스
KR20230135593A (ko) 면역 세포를 형질도입하는 방법
HK40065098A (en) Rituximab-resistant chimeric antigen receptors and uses thereof
HK40052063A (en) Chimeric antigen receptors with bcma specificity and uses thereof
HK40052063B (en) Chimeric antigen receptors with bcma specificity and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20211104

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application