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KR20150131218A - T 세포 증식의 제어 방법 - Google Patents

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KR20150131218A
KR20150131218A KR1020157028844A KR20157028844A KR20150131218A KR 20150131218 A KR20150131218 A KR 20150131218A KR 1020157028844 A KR1020157028844 A KR 1020157028844A KR 20157028844 A KR20157028844 A KR 20157028844A KR 20150131218 A KR20150131218 A KR 20150131218A
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South Korea
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cell
cells
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ligand
composition
Prior art date
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KR1020157028844A
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데이비드 스펜서
아론 에드워드 포스터
케빈 슬라윈
Original Assignee
벨리쿰 파마슈티컬스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 기술은 전반적으로 면역학 분야에 관한 것이며, 부분적으로 T 세포, 예를 들어 치료 T 세포의 증식을 제어하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한, 본 방법은 피험체에서 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

T 세포 증식의 제어 방법{METHODS FOR CONTROLLING T CELL PROLIFERATION}
본 기술은 전반적으로 면역학 분야에 관한 것이며, 부분적으로 T 세포, 예를 들어 치료 T 세포의 증식을 제어하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한, 본 방법은 피험체에서 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
관련 특허 출원
2013년 3월 14일에 출원된 "T 세포 증식 방법"이라는 명칭의 미국 특허 가출원 제61/783,445호에 우선권을 주장하며, 이는 본원에서 그 전문으로 참조에 포함된다.
배경기술
T 세포 활성화는 주변에 존재하는 병원성 미생물(예를 들어, 바이러스, 세균 및 기생생물), 외래 단백질 및 유해한 화학 물질에 대한 방어 면역에 있어 중요한 단계이다. T 세포는 항원 제시 세포의 표면에 제시된 항원을 인식하는 수용체(즉, T 세포 수용체)를 자신의 표면에 발현한다. 정상의 면역 과정에서, 상기 항원과 T 세포 수용체의 결합은 세포 내 변화를 개시하여 T 세포를 활성화한다.
키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptr)는 T 세포에 항원 특이성을 전달하도록 설계된 인공 수용체이다. 이들은 T 세포를 활성화하고 특이적 면역성을 제공하도록 선택된 항원 특이적 구성요소, 막관통 구성요소, 및 세포 내 구성요소를 포함한다. 키메라 항원 수용체 발현 T 세포는 암 요법을 포함한 다양한 요법에 사용될 수 있다. 종양에 대해 효과적이지만, 일부 경우에 이들 치료는 건강한 조직에 부분적으로 비특이적인 공격으로 인한 부작용을 일으켜 왔다. 강한 면역 치료 반응을 제공하며 독성의 부작용을 방지하는 제어 가능한 T 세포 요법이 요구되어 진다.
본 발명은 부분적으로 예를 들어 면역 반응을 유도하거나 증가시키는데 사용될 수 있는 CID-유도성 키메라 신호전달 분자(CSM: CID-inducible chimeric signaling molecule)를 제공한다. CSM은 단독으로 또는 키메라 항원 수용체(CAR)와 함께 사용될 수 있으며, 이는 특정 종양 세포에 특이적으로 대항하는 면역 반응을 가능하게 한다. 제어되는 T 세포 활성화 방법은 이전의 CAR 기반 치료의 많은 독성의 부작용을 방지한다.
본원에서 논의된 키메라 신호전달 분자는 세포에서 동시 발현되는 키메라 항원 수용체(CAR) 제어의 유지 및 조정을 가능하게 한다. 질환 또는 병태에 연관된 세포 항원을 표적화하도록 설계된 항원 특이적 T 세포의 활성화는 리간드 유도 인자의 투여에 의존적이다. 리간드 유도 인자는 키메라 신호전달 분자와 다량체를 형성하여 CAR 발현 세포를 활성화하고, 이는 차례로 NF-κB 신호전달을 활성화하고, 이는 세포, 예를 들어 T 세포, 종양 침윤 림프구, 자연 사멸 세포, 또는 자연 사멸 T 세포를 활성화한다(예를 들어 [도 20] 참조). 리간드 유도 인자가 존재하지 않을 경우, T 세포는 휴지 상태이거나, 기저 수준의 활성을 가진다. 리간드의 정기적인 투여 일정으로 CAR 발현 T 세포 증식 및 활성화의 속도 및 크기를 결정한다.
완전한 활성화 및 종양 세포 사멸은 항원 인식 및 CD3 제타 신호전달을 통한 NFAT의 추가적인 활성화에 의존적이다. 완전 반응(CR: complete response)이 달성되면 리간드의 투여를 중단한다. 질환 또는 병태가 재발하는 경우, 리간드 투여를 재개하여 휴지 상태의 종양-표적 T 세포의 재확장 및 재활성화를 유도한다.
세포 요법의 한 예에서, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산으로 형질도입된 T 세포를 환자에 투여하여 암을 치료하였다(Zhong, X.-S., (2010) Molecular Therapy 18:413-420). 예를 들어, 인간화 단클론 항체 트라스투주맙(허셉틴)을 기반으로 한 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포를 이용하여 암 환자를 치료하였다. 그러나 부작용이 가능하며, 적어도 보고된 한 경우에서, 요법은 환자에게 치명적인 결과를 가져왔다(Morgan, R.A., et al., (2010) Molecular Therapy 18:843-851). 본원에서 제시된 바와 같이, 제어 가능한 유도성 안전 스위치로 세포의 형질도입은 리간드 유도 인자의 투여를 정지시킴으로써 부작용이 진행되는 것을 방지할 수 있는 안전 스위치를 제공할 것이다. 낮은 수준의 기저 활성이 남아있을 수 있지만, 유도 인자의 존재를 제거하는 것은 부작용 증상을 중단시키지는 못하더라도 급격하게 감소시킬 것이다.
세포 요법의 또 다른 예에서, T 세포를 비기능성 TGF-베타 수용체를 발현하도록 변형하여 TGF-베타에 내성을 갖도록 만들었다. 이로써 변형된 T 세포는 TGF-베타에 의해 유발되는 세포 독성을 방지할 수 있고, 세포는 세포 요법에 사용될 수 있다(Bollard, C.J., et al., (2002) Blood 99:3179-3187; Bollard, C.M., et al., (2004) J. Exptl. Med. 200:1623-1633). 하지만, 변형된 T 세포는 이제 정상적인 세포 제어 부분이 결여되기 때문에, T 세포 림프종, 또는 다른 부작용도 가져올 수 있다; 이들 치료 T 세포 자체가 악성이 될 수 있다. 본원에서 제시된 유도성 CSM 폴리펩티드-기반의 안전 스위치로 이들 변형된 T 세포의 형질도입은 안전 스위치를 제공함으로써 상기 결과를 방지할 수 있을 것이다.
따라서, 일부 실시양태에서 유도성 키메라 신호전달 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로서, 유도성 키메라 신호전달 분자가 막 표적화 영역, 다량체화 영역, 및 CD27, CD28, ICOS, 4-1BB, CD40, RANK/TRANCE-R, CD3 제타 사슬, 및 OX40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공자극 폴리펩티드 세포질 신호전달 영역을 포함하는 것인 조성물을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 막 표적화 영역은 미리스토일화 표적화 서열, 팔미토일화 표적화 서열, 프레닐화 서열(즉, 파르네실화, 제라닐-제라닐화, CAAX 박스), 단백질-단백질 상호작용 모티프 및 수용체로부터의 막횡단 서열(신호 펩티드를 이용함)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 측면에서, 막 표적화 영역은 미리스토일화 표적화 서열이다. 일부 실시양태에서, 유도성 키메라 신호전달 분자는 CD27, CD28, ICOS, 4-1BB, CD40, RANK/TRANCE-R, CD3 제타 사슬, 및 OX40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 공자극 폴리펩티드 세포질 신호전달 영역을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 공자극 폴리펩티드 세포질 신호전달 영역은 CD28 세포질 신호전달 영역 및 4-1BB 세포질 신호전달 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공자극 폴리펩티드 세포질 신호전달 영역은 OX40 세포질 신호전달 영역 폴리펩티드 및 4-1BB 세포질 신호전달 영역 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도성 키메라 신호전달 분자는 CD3ζ 폴리펩티드를 더 포함한다.
일부 실시양태에서, 다량체화 영역은 FKBP, 사이클로필린 수용체, 스테로이드 수용체, 테트라사이클린 수용체, 중쇄 항체 서브유닛, 경쇄 항체 서브유닛, 및 이들의 변이된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 다량체화 영역은 FKBP12 영역이다. 일부 실시양태에서, FKB12 영역은 FKB12v36 영역이다. 일부 실시양태에서, 다량체화 영역은 Fv'Fvls이다. 일부 실시양태에서, 다량체화 영역은 FK506 이량체 및 이량체 FK506 유사체 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 리간드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 AP1903 또는 AP20187이다. 일부 실시양태에서, 다량체화 영역은 서열 번호 58의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 갖는다. 일부 실시양태에서, 다량체화 영역은 서열 번호 57의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 다량체화 영역은 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 다량체화 영역은 서열 번호 59의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 다량체화 영역은 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 다량체화 영역은 서열 번호 59의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 다량체화 영역은 서열 번호 58 또는 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 다량체화 영역은 서열 번호 57 또는 서열 번호 59의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 바이러스 벡터 내에 포함된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 쥐 백혈병 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 쥐 백혈병 바이러스 벡터는 MoMLV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 SFG 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 플라스미드 내에 포함된다.
본 출원에서는 또한, 본 출원의 임의의 조성물로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포, 종양 침윤 림프구, B 세포, NK 세포, 또는 NK-T 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 골수로부터 얻거나 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포는 제대혈로부터 얻거나 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포는 말초 혈액으로부터 얻거나 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포는 말초 혈액 단핵 세포로부터 얻거나 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다.
다른 실시양태에서, 세포는 신호 펩티드, 단일쇄 가변 단편, CH2-CH3 경첩 영역 및 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산으로 추가로 형질전환 또는 형질도입된다. 일부 실시양태에서, 단일쇄 가변 단편은 종양 세포 상의 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일쇄 가변 단편은 과증식 질환과 관련된 세포 상의 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 단일쇄 가변 단편은 αPSMA, αPSCA, αMUC1, αCD19, αROR1, α메소텔린, αGD2, αCD123, αMUC16, 및 αHer2/Neu 단일쇄 가변 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 단일쇄 가변 단편은 αCD19 단일쇄 가변 단편이다.
또한, 면역 반응의 유도 방법으로서, 본 출원의 조성물로 세포를 시험관 내 또는 생체 외 형질감염 또는 형질도입하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포를 다량체화 영역에 결합하는 리간드와 접촉시켜, 유도성 키메라 신호전달 분자의 다량체화를 유발하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 이량체이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 이량체 FK506, 또는 이량체 FK506 유사 유사체가다. 일부 실시양태에서, 리간드는 AP1903 또는 AP20187이다. 일부 실시양태에서, 방법은 형질감염 또는 형질전환된 세포를 피험체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 정맥 내 투여에 의해 피험체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 생체 내 면역 반응의 유도 방법으로서, 피험체에게 본 출원의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서 방법은 피험체에게 다량체화 영역에 결합하는 리간드를 포함하는 조성물을 투여하여 유도성 키메라 신호전달 분자의 다량체화를 유발하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 이량체이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 이량체 FK506, 또는 이량체 FK506 유사 유사체가다. 일부 실시양태에서, 리간드는 AP1903 또는 AP20187이다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 조성물 또는 세포로 치료받은 피험체는 과증식 질환을 갖는 것으로 진단받았다. 다른 실시양태에서, 피험체는 종양을 갖는 것으로 진단받았다. 다른 실시양태에서, 피험체는 암을 가진다. 다른 실시양태에서, 피험체는 고형 종양을 가진다. 다른 실시양태에서, 세포는 종양 침윤 림프구 또는 T 세포이다. 다른 실시양태에서, 세포는 종양상(tumor bed)으로 전달된다. 다른 실시양태에서, 암은 피험체의 혈액 또는 골수에 존재한다. 다른 실시양태에서, 피험체는 혈액 또는 골수 질환을 가진다. 다른 실시양태에서, 피험체는 줄기세포 이식에 의해 완화될 수 있는 임의의 병태 또는 장애를 갖는 것으로 진단받았다. 다른 실시양태에서, 피험체는 겸상 적혈구 빈혈증 또는 이염성 백질이영양증을 갖는 것으로 진단받았다. 다른 실시양태에서, 피험체는 원발성 면역결핍 질환, 혈구탐식성 림프조직구증(HLH: hemophagocytosis lymphohistiocytosis) 또는 기타 혈구탐식성 장애, 유전성 골수 기능 부전증, 혈색소병증, 대사장애, 및 파골세포 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 병태를 갖는 것으로 진단받았다. 다른 실시양태에서, 피험체는 중증 복합 면역결핍증(SCID: Severe Combined Immune Deficiency), 복합 면역결핍증(CID: Combined Immune Deficiency), 선천성 T 세포 결함/결핍증, 공통 가변성 면역결핍증(CVID: Common Variable Immune Deficiency), 만성 육아종증, IPEXIPEX[면역결핍(Immune deficiency), 다발성 내분비병증(polyendocrinopathy), 장질환(enteropathy), X 연관(X-linked)] 또는 IPEX 유사 질환, 비스코트-올드리치 증후군, CD40 리간드 결핍증, 백혈구 부착 결핍증, DOCK 8 결핍증, IL-10 결핍증/IL-10 수용체 결핍증, GATA 2 결핍증, X 연관 림프증식성 질환(XLP: X-linked lymphoproliferative disease): 연골 털 형성 저하증, 슈바치만 다이아몬드 증후군, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 선천성 이상각화증, 판코니 빈혈증, 선천성 호중구 감소증, 겸상 적혈구병, 지중해 빈혈증, 점액 다당류증, 스핑고지질증, 및 골화석증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병태를 갖는 것으로 진단받았다. 일부 실시양태에서, 피험체는 HIV, 인플루엔자, 헤르페스, 바이러스성 간염, 엡스타인 바, 소아마비, 바이러스성 뇌염, 홍역, 수두, 거대세포 바이러스(CMV: Cytomegalovirus), 아데노바이러스(ADV: adenovirus), HHV-6(인간 헤르페스바이러스 6, I:human herpesvirus 6, I), 및 유두종 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 병인의 감염을 갖는 것으로 진단받았거나, 폐렴, 결핵, 및 매독으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세균 병인의 감염을 갖는 것으로 진단받았거나, 또는 말라리아, 트리파노소마증, 리슈만편모충증, 트리코모나스증, 및 아메바증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기생생물 병인의 감염을 갖는 것으로 진단받았다.
또한, 피험체에서 백혈병의 치료 방법으로서, 본 출원의 세포를 투여하는 단계 및 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하며, 세포는 유도성 CSM, 및 단일쇄 가변 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체로 형질도입 또는 형질감염되는 것인 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단일쇄 가변 단편은 CD19에 결합한다. 일부 실시양태에서, 다량체 리간드는 AP1903 또는 AP20187이다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 피험체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여해야 하는지를 판단하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 질환 또는 병태 증상이 남아있거나 증상 감소 후에 확인되는 피험체에게 추가 용량의 다량체 리간드를 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 피험체는 본 출원의 조성물 또는 세포의 투여 전에 질환 또는 병태를 갖는 것으로 진단받았고, 다량체 리간드의 투여 후에 질환 또는 병태가 확인되어, 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여한다.
일부 실시양태에서, 방법은 피험체에서 병태 또는 질환의 존재, 부재 또는 단계를 확인하는 단계, 및 피험체에서 확인된 병태 또는 질환의 존재, 부재 또는 단계에 기초하여, 다량체 결합 영역에 결합하는 다량체 리간드를 투여하고, 환자에게 투여되는 다량체 리간드의 다음 투여량을 유지하거나 조정하기 위한 지시를 전달하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시양태에서, 병태는 암이다. 일부 실시양태에서, 병태는 백혈병이다. 일부 실시양태에서, 병태는 고형 종양이다.
다른 실시양태에서, 방법은 다량체 리간드의 투여 후 종양 크기 및/또는 종양 세포 수에 비해 피험체에서 종양 크기 증가 및/또는 종양 세포 수의 증가가 있는지 없는지를 판단하는 단계, 및 종양 크기 증가 및/또는 종양 세포 수의 증가가 있다고 판단되는 경우 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 크기 및/또는 종양 세포 수는 다량체 리간드의 투여 전의 종양 크기 및/또는 종양 세포 수에 비해 다량체 리간드의 투여 후에 감소된다.
일부 실시양태에서, 방법은 다량체 리간드의 투여 후 CD19 발현 B 세포의 수준에 비해 피험체에서 CD19 발현 B 세포에 있어 증가가 있는지 없는지를 판단하는 단계, 및 피험체에서 CD19 발현 B 세포의 증가가 있다고 판단되는 경우 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, CD19 발현 B 세포의 수준은 다량체 리간드의 투여 전의 CD19 발현 B 세포의 수준에 비해 다량체 리간드의 투여 후에 감소된다.
특정 실시양태는 하기 설명, 실시예, 청구항 및 도면에서 추가로 기재된다.
도면은 본 기술의 실시양태를 예시하는 것이며 제한하는 것은 아니다. 예시를 명확하고 용이하게 하기 위해, 도면의 크기를 조정하지 않으며, 일부 경우에는, 구체적인 실시양태의 이해를 용이하게 하기 위해 여러 측면을 과장하거나 확대하여 보여줄 수 있다.
[도 1]은 키메라 항원 수용체(CAR)의 유전자 전달을 도시한다.
[도 2]는 CAR 개선점 및 연관된 독성을 도시한다.
[도 3]은 자살(아폽토시스) 유전자를 또한 발현하는 CAR 발현 세포와 비교하여 CID 제어되는 키메라 신호전달 분자의 이론적 분석을 그래프로 설명한다.
[도 4]는 CID-제어되는 CSM의 일부 예를 도시한다.
[도 5]는 CSM의 CID-유도, 및 CAR을 포함하는 T 세포의 유도성 CSM 활성화를 도시한다.
[도 6]은 종양 세포의 CID 제어되는 T 세포 사멸을 도시한다.
[도 7]은 변형된 T 세포의 FACS 분류 분석의 결과를 제공한다.
[도 8]은 변형된 T 세포와 대조군 T 세포에서 GM-CSF 및 인터페론 감마 수준의 막대그래프를 제공한다.
[도 9]는 변형된 T 세포와 대조군 T 세포에서 IL-10 및 IL-13 수준의 막대그래프를 제공한다.
[도 10]은 변형된 T 세포와 대조군 T 세포에서 IL-4 및 IL-5 수준의 막대그래프를 제공한다.
[도 11]은 변형된 T 세포와 대조군 T 세포에서 IL-6 및 IL-8 수준의 막대그래프를 제공한다.
[도 12]는 변형된 T 세포와 대조군 T 세포에서 IL-1β 및 IL-12-p70 수준의 막대그래프를 제공한다.
[도 13]은 변형된 T 세포와 대조군 T 세포에서 IP-10 및 MIP1-α 수준의 막대그래프를 제공한다.
[도 14]는 변형된 T 세포와 대조군 T 세포에서 MIP1β 및 RANTES 수준의 막대그래프를 제공한다.
[도 15]는 변형된 T 세포와 대조군 T 세포에서 TNF-α 수준의 막대그래프를 제공한다.
[도 16]: AP1903으로 iMC-형질도입된 T 세포의 활성화는 종양 세포의 T 세포 사멸을 유도한다. 대조군 벡터(MyD88/CD40 신호전달 도메인 결여) 또는 iMC로 형질도입된 T 세포를 CAPAN-1-GFP 종양 세포와 T 세포 대 종양 세포 5:1 비율로 배양하였다. 공동 배양물을 10 nM AP1903과 함께 또는 없이 배양하였다. 72시간 후에, 공동 배양물을 GFP+ 종양 세포(X-축)에 대해 유세포 분석법으로 분석하였다.
[도 17]: 상이한 공여자에 대해 [도 16]에 논의된 것과 유사한 실험의 결과를 보여준다.
[도 18]: AP1903으로 iMC-형질도입된 T 세포의 활성화는 종양 세포의 T 세포 사멸을 유도한다. 대조군 벡터(MyD88/CD40 신호전달 도메인 결여) 또는 iMC로 형질도입된 T 세포를 CAPAN-1-GFP 종양 세포와 T 세포 대 종양 세포 5:1 비율로 배양하였다. 공동 배양물을 10 nM AP1903과 함께 또는 없이 배양하였다. 72시간 후에, 공동 배양물을 GFP+ 종양 세포에 대해 유세포 분석법으로 분석하였다(n = 2).
[도 19]: AP1903으로 iMC-형질도입된 T 세포의 활성화는 종양 세포의 T 세포 사멸을 유도한다. 대조군 벡터(MyD88/CD40 신호전달 도메인 결여) 또는 iMC로 형질도입된 T 세포를 CAPAN-1-GFP 종양 세포와 T 세포 대 종양 세포 5:1 비율로 배양하였다. 공동 배양물을 10 nM AP1903과 함께 또는 없이 배양하였다. 72시간 후에, 공동 배양물을 형광 현미경 관찰법으로 분석하여 10 nM AP1903으로 활성화되었을 때 T 세포 모세포의 활성화(오른쪽 두 패널) 및 GFP+ 종양 세포의 제거를 나타내었다.
[도 20]은 본원에서 제공되는 키메라 항원 수용체(왼쪽) 및 키메라 신호전달 분자로 형질도입 또는 형질전환된 세포의 예의 개략도이다.
[도 21]은 본원에서 제공되는 키메라 항원 수용체(왼쪽) 및 키메라 신호전달 분자로 형질도입 또는 형질전환된 세포의 예의 개략도이다.
[도 22]는 유도성 키메라 항원 수용체의 플라스미드 지도이다.
일반적으로, T 세포 요법은 주입된 세포의 생체 내 확장이 저조하다는 어려움이 수반되어 왔다. 이러한 문제에 대처하는 한 가지 방법은 환자에게 고용량의 IL-2를 투여하는 것이다. 상기 요법은 T 세포 성장 및 항종양 기능을 돕지만, 환자에게 역시 매우 독성을 갖는다. 이는 고용량의 IL-2는 흑색종의 치료 기준 요법으로 여겨지기 때문에 흑색종에 일반적으로 이용되어 왔다. 대부분 다른 T 세포 요법 적용은 독성 효과로 인해 IL-2를 T 세포 요법과 함께 이용하지 않았다. T 세포 요법에서 발생하는 또 다른 문제는 주입된 T 세포의 생착과 지속성(또한 생체 내 증식 작용)이 저조하다는 것이며, 이는 T 세포 주입 전에 림프구 고갈상태로 조건화함으로써 대처되었다. 연구자들은 이를 달성하기 위해 일반적으로 화학요법(특히 사이클로포스파미드)를 사용하지만, 일부는 캄파스를 포함한 항체를 사용한다. 조건화는 림프계 "공간"을 생성하고 성장 및 생존 인자와 경쟁하는 조절성 면역 세포를 고갈시켜 T 세포 요법을 크게 촉진하는 것으로 보인다. 그러나 이것은 환자에게 매우 독성을 가지며, 정상 면역 세포(예를 들어, 병원균 특이적)를 완전히 제거하고, 일부 암 유형 또는 고령 환자들에게 쉽게 사용될 수 없다. 게다가, 림프구 고갈 요법의 사용은 T 세포 요법을 단독 치료법이라기보다는 "과정"이 되도록 할 수 있다.
각각의 환자는 그들을 위해 고유한 세포 산물이 제조되도록 해야 하기 때문에 T 세포 요법은 대개는 부티크 요법으로 생각된다. 통상의 T 세포 요법(반복적인 항원 자극 또는 종양 침윤 림프구(TIL: tumor infiltrating lymphocyte)에 의함)은 이의 특이성 또는 기능에 있어 재현성이 없으며 지나치게 일정하지 않은 결과를 가져오며, 어떤 경우에는 치료를 위한 제품을 생산할 수 없게 된다. 천연 또는 키메라 T 세포 수용체의 유전자 전달이 이러한 문제를 해결하기 시작하였으나(매우 종양 특이적 T 세포가 2주 내에 생성될 수 있음), 명백한 것은 유전자 변형된 T 세포가 자연 발생 T 세포와 다르게 작용할 수 있다는 것이다. 게다가, 매우 특이적인 CAR T 세포 또는 최적화된 TCR 알파 및 베타 사슬을 발현하는 T 세포는 탈표적 독성(off target toxicity)을 유발할 수 있어 자살 유전자의 포함을 불가피하게 한다.
[도 1]은 키메라 항원 수용체(CAR)의 가장 기본적인 구성요소를 도시한다. 종양 특이적 단클론 항체의 가변 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)는 T 세포 수용체 복합체의 CD3 제타 사슬과 인-프레임으로 융합된다. VH 및 VL은 일반적으로 유연한 글리신-세린 링커를 이용하여 함께 연결된 후 스페이서(CH2CH3)에 의해 막관통 도메인에 부착되어 세포 표면으로부터 scFV를 뻗어 종양 항원과 상호작용할 수 있다.
형질도입 후, T 세포는 이제 자신의 표면에 CAR을 발현하고, 종양 항원과 접촉 및 결찰 시 CD3 제타 사슬을 통해 신호를 전달하여 세포독성 및 세포 활성화를 유도한다.
[도 2]는 다양한 키메라 항원 수용체의 발달을 도시한다. 연구자들은 CD3 제타를 통한 T 세포의 활성화가 종양 특이적 사멸을 유도하는데 충분하지만, T 세포 증식 및 생존을 유도하기에는 불충분하다는 것을 알아내었다. 제타 사슬만을 발현하는 CAR로 변형된 T 세포를 이용한 초기 임상 실험은 유전자 변형된 T 세포가 생체 내에서 저조한 생존 및 증식을 보인다는 것을 입증하였다. 상기 구조물은 1세대 CAR로 불린다.
B7 축을 통한 공자극이 완전한 T 세포 활성화에 필수적이기 때문에 연구자들은 공자극 폴리펩티드 CD28 신호전달 도메인을 CAR 구조물에 첨가하였다. 상기 영역은 일반적으로 막관통 영역(CD3 제타 형태 대신에), 및 PI3K 및 Lck에 결합하기 위한 YMNM 모티프를 포함한다. 제타만을 갖는 CAR 또는 제타 및 CD28 둘 다를 갖는 CAR을 발현하는 T 세포들의 생체 내 비교는 CD28이 부분적으로는 활성화 후 IL-2의 생산 증가로 인해 생체 내 확장을 상승시켰다는 것을 증명하였다. CD28이 포함된 것은 2세대 CAR로 불린다.
CAR 설계에 공자극 폴리펩티드 4-1BB 또는 OX40의 사용으로 T 세포 생존 및 효능이 더 향상되었다. 특히, 4-1BB가 T 세포 증식 및 생존을 크게 향상시키는 것으로 보인다. 상기 3세대 설계(3개의 신호전달 도메인을 가짐)는 PSMA CAR(Zhong XS, et al., Mol Ther. 2010 Feb;18(2):413-20)에, 그리고 CLL 치료에 가장 뛰어난 CD19 CAR(Milone, M.C., et al., (2009) Mol. Ther. 17:1453-1464; Kalos, M., et al., Sci. Transl. Med. (2011) 3:95ra73; Porter, D., et al., (2011) N. Engl. J. Med. 365: 725-533)에 사용되었다. 이들 세포는 3명의 환자에서 생체 내에서 1000배 더 확장하는 인상적인 기능을 보였으며, 3명의 환자 모두에서 지속 관해를 유발하였다.
그러나 CAR의 항종양 효과가 개선되었기 때문에, 이의 위험성 역시 커졌다. 2세대 및 3세대 CAR을 이용하여 2차례 사망은 높은 관심을 받았으며, 이는 소수의 환자만이 치료받았다는 점을 고려하면 매우 높은 비율이다. 이러한 사망의 원인은 매우 활성화된 T 세포에 의해 유발되는 사이토카인 폭풍 및 종양 용해 증후군으로 인한 패혈증이었다(Morgan, R.A., et al. (2010) Mol. Ther. 14:843-851).
자살 유전자는 양자(adoptively) 전달된 T 세포로부터 원하지 않는 부작용에 대해 충분한 방어를 제공한다. 그러나 유전자 변형된 T 세포에 따르는 독성의 제거는 치료법의 치료 효능도 역시 제거할 것이다.
T 세포 수용체 신호전달은 이량체화의 화학 유도 인자(CID: chemical inducer of dimerization)에 결합하는 다량체화 영역을 포함하는 키메라 수용체와 함께 CID를 이용하여 유도될 수 있으며, T 세포는 1, 2, 또는 3개의 FKBP 단편에 연결된 CD3 제타 사슬을 발현하도록 조작되었다. 세포는 키메라 수용체를 발현하였고, CID-의존적 T 세포 활성화를 증명하였다(Spencer, D. M., et al., Science, 1993. 262: p. 1019-1024). 본 출원은, 부분적으로, CID에 의해 제어되는 유도성 키메라 신호전달 분자(CSM)를 제공한다. 유도성 CSM을 발현하는 T 세포를 CID와 접촉시켜, 세포 활성화 및 면역 반응을 유발하였다.
[도 3]은 자살 유전자를 이용하는 CAR 치료 방법과 본 출원의 치료법을 비교한다. 본 출원은, 부분적으로, 생체 내 T 세포 증식 및 기능을 증폭하여 항종양 효과를 점진적으로 증가시키는 유전자 공학 접근법을 제공한다. 이량체화의 화학 유도 인자를 생체 내 T 세포를 활성화하기 위한 제어 가능한 시스템에 사용하여 T 세포의 기능 및 빈도를 증가시킨다.
[도 4] 및 [도 5]에 나타낸 바와 같이, 일부 실시양태에서 CSM은 예를 들어 CID 의존적 증식 및 공자극을 가능하게 하는 CD3 제타가 존재하거나 존재하지 않는 하나 이상의 공자극 폴리펩티드, 예를 들어 CD28 및 4-1BB와 나란한 다량체화 영역, 예를 들어 Fv 도메인을 이용한다. CSM은 단독으로 사용되어 공자극을 제공하고, T 세포 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 상기 방법을 이용하여, T 세포군, 예를 들어 비특이적 표적을 갖는 세포군을 CSM 코딩 DNA로 형질감염하거나 형질전환한 후 피험체에게 투여하여 전반적인 면역 반응을 향상시킬 수 있다.
또한, 상기 CSM은 예를 들어 scFv 폴리펩티드, 및 CD3 제타 사슬을 포함할 수 있는 CAR과 함께 세포에서 발현될 수 있다. 이 방법에서, 유도성 CSM 분자는 CAR과 함께 사용함으로써 CAR 신호전달을 두 가지 별개의 기능으로 분리한다. CAR에 의해 제공되는 두 번째 기능은 조작된 T 세포에 항원 특이적 세포독성을 제공한다. [도 4]에서, 예는 PSMA에 대해 특이성을 갖는 CAR을 보여준다. 이들 조작된 T 세포는, 예를 들어 특이적 면역 반응, 예를 들어 전립선암 종양에 대한 면역 반응을 생성하도록 피험체에게 투여될 수 있다(도 6).
[도 22]에 나타낸 바와 같이, 일부 실시양태에서, 예를 들어 CD40 세포질 영역 폴리펩티드 또는 절단된 MyD88 폴리펩티드와 같은 유도성 공자극 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체 자체의 활성화를 제어하는데 사용된다. 상기 변형된 유도성 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 T 세포와 같은 세포를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 세포는 본원에서 논의된 키메라 신호전달 분자를 추가로 발현할 수 있으며, 특정 실시양태에서, 키메라 신호전달 분자는 CD3 제타 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도성 키메라 항원 수용체는 CD40 세포질 영역 폴리펩티드 및 MyD88 폴리펩티드 모두를 포함한다.
본원에서 사용되는 청구항 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는(comprising)"과 함께 사용될 때 단어 "하나의"("a" 또는 "an")의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 또는 초과," "적어도 하나," 및 "하나 이상"의 의미와도 일치한다. 더 나아가, 용어 "갖는" 및 "포함하는"("including", "containing" 및 "comprising")은 호환적이며 당업자는 상기 용어가 개방형 용어라는 것을 인식한다.
본원에서 사용되는 용어 "동종이형(allogeneic)"은 숙주와 공여 세포 사이에 항원과 관련하여 상이한 HLA 또는 MHC 유전자좌를 나타낸다.
따라서, 동종으로부터 전이된 세포 또는 조직은 항원과 관련하여 다를 수 있다. 동계(syngeneic) 마우스는 하나 이상의 유전자좌에서 다를 수 있으며(극소이유전자형(congeneic)), 동종이계 마우스는 동일한 배경을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원"은 면역 반응을 유발하는 분자로서 정의된다. 이러한 면역 반응은 항체 생산, 또는 특정 면역적 적격 세포의 활성화, 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 항원은 생물체, 단백질/항원의 서브유닛, 사멸되거나 불활성화된 전세포 또는 용해물로부터 유래될 수 있다. 전형적인 생물체는 헬리코박터, 캄필로박터, 클로스트리디아, 코리네박테리움 디프테리에(Corynebacterium diphtheriae), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 보렐리아 부르그도페리(Borrelia burgdorferi), 플라스모듐, 단순 헤르페스 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 유두종바이러스, 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 이. 콜라이(E. coli), 홍역 바이러스, 로타바이러스, 쉬겔라, 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 네이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함한 모든 고분자가 항원으로 역할을 할 수 있다. 게다가, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 면역 반응을 유발하는 단백질에 대한 병원성 게놈 또는 유전자 또는 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열 또는 부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 모든 DNA는 항원 합성을 일으킨다. 또한, 본 방법이 유전자 또는 게놈의 전체 핵산 서열의 사용에 제한되지 않는다. 본 발명은 하나 초과의 유전자 또는 게놈의 부분적인 핵산의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는다는 것과 상기 핵산 서열은 원하는 면역 반응을 유발하도록 다양한 조합으로 배열된다는 것이 당연히 내재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "암"은 고유한 특성- 정상적인 제어 상실-이 조절되지 않는 성장, 분화의 결여, 국소 조직 침습, 및 전이를 일으키는 세포의 과증식으로 정의된다. 예로는 흑색종, 비소세포폐암, 소세포 폐암, 폐암, 간암종, 백혈병, 망막모세포종, 성상세포종, 교모세포종, 치육세포암, 설암, 신경모세포종, 두부암, 경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 고환암, 난소암, 중피종, 자궁경부암, 위장암, 림프종, 뇌암, 결장암, 육종 또는 방광암이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "세포," "세포주," 및 "세포 배양물"은 호환적으로 사용될 수 있다. 이들 용어 모두는 또한 계속되는 모든 세대인 이들의 자손을 포함한다. 모든 자손은 의도적이거나 우연한 돌연변이로 인해 동일하지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "cDNA"는 주형으로서 전령 RNA를 이용하여 제조된 DNA를 나타내고자 한다. 게놈의 프로세싱되지 않거나 부분적으로 프로세싱된 RNA 주형으로부터 중합된 게놈 DNA 또는 DNA가 아닌 cDNA를 이용하는 유리한 점은 cDNA가 주로 상응하는 단백질의 코딩 서열을 포함한다는 것이다. 예를 들어 비코딩 영역이 최적 발현에 필요한 경우 또는 인트론과 같은 비코딩 영역이 안티센스 방식으로 표적화 될 수 있는 경우에 전체 또는 부분적인 게놈 서열이 사용될 때가 있다.
본원에서 사용되는 용어 "발현 구조물" 또는 "전이유전자"는 핵산 코딩 서열의 일부분 또는 전체가 전사될 수 있는 유전자 산물을 코딩하는 핵산을 포함하는 모든 유형의 유전 구조물로서 정의되며, 벡터에 삽입될 수 있다. 전사체는 단백질로 번역될 수 있으나, 반드시 번역될 필요는 없다. 특정 실시양태에서, 발현은 유전자의 전사 및 mRNA에서 유전자 산물로의 번역 모두를 포함한다. 다른 실시양태에서, 발현은 관심 유전자를 코딩하는 핵산의 전사만을 포함한다. 용어 "치료 구조물"도 발현 구조물 또는 전이유전자를 나타내는데 사용될 수 있다. 발현 구조물 또는 전이유전자는 예를 들어 암과 같은 과증식 질환 또는 장애를 치료하는 요법으로서 사용될 수 있으며, 따라서 발현 구조물 또는 전이유전자는 치료 구조물 또는 예방 구조물이 된다.
본원에서 사용되는 용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 유전자 산물의 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 나타낸다. 일부 경우에, RNA 분자는 이어서 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드로 번역된다. 다른 경우에, 이들 서열은 번역되지 않고 예를 들어 안티센스 분자 또는 리보자임을 생산한다. 발현 벡터는 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열을 나타내는 여러 가지 제어 서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 통제하는 제어 서열 이외에, 벡터 및 발현 벡터는 또한 다른 기능을 하는 아래에 논의되는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "생체 외"는 신체 "바깥"을 나타낸다. 용어 "생체 외" 및 "시험관 내"는 본원에서 호환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "기능적으로 등가"는, 공자극 폴리펩티드와 관련되는 경우, 세포질 영역, 또는 신호전달 영역을 나타내거나, 핵산 단편, 변이체, 또는 유사체와 관련되는 경우, 종양 또는 과증식 질환을 파괴하는 면역 반응을 자극하는 공자극 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 나타낸다. "기능적으로 등가"는 예를 들어 세포 외 도메인이 결여되어 있지만 T 세포에서 발현되는 경우 T 세포 매개된 종양 사멸 반응을 증폭할 수 있는 공자극 폴리펩티드를 나타낸다.
용어 "과증식 질환"은 세포의 과증식의 결과로 생기는 질환으로 정의된다. 전형적인 과증식 질환은 암 또는 자가면역 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 과증식 질환은 혈관 폐쇄, 재협착, 죽상동맥경화증, 또는 염증성 장질환을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자"는 기능적 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 코딩하는 단위로서 정의된다. 이해되는 바와 같이, 상기 기능적 용어는 게놈 서열, cDNA 서열을 포함하고, 단백질, 폴리펩티드, 도메인, 펩티드, 융합 단백질, 및 변이체를 발현하거나 발현하도록 조정된 더 작게 조작된 유전자 분절을 포함한다.
용어 "면역원성 조성물" 또는 "면역원"은 면역 반응을 유발할 수 있는 물질을 나타낸다. 면역원의 예는 예를 들어 항원, 자가면역 질환을 유도하는 역할을 하는 자가항원, 및 암 세포 상에 발현되는 종양 연관된 항원을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역저하된"은 면역계가 감소되거나 약화된 피험체로 정의된다. 면역저하된 상태는 면역계의 결함 또는 기능장애, 또는 감염 및/또는 질환에 대한 감수성을 증가시키는 기타 인자에서 기인될 수 있다. 상기 분류는 평가를 위한 개념적 기반을 허용하지만, 면역저하된 개체는 대개 어느 한 그룹에 완전하게 들어맞지 않는다. 신체의 방어 기전에 있어 여러 가지 결함이 영향받을 수 있다. 예를 들어, HIV에 의해 유발된 특정 T-림프구 결함을 가진 개체는 항바이러스 요법에 사용되는 약물에 의해 유발된 호중구 감소증을 가질 수 있거나 피부 및 점막의 완전성의 파괴에 의해 면역저하될 수 있다. 면역저하된 상태는 유치 중심관 또는 정맥 내 약물 남용으로 인한 다른 유형의 손상의 결과로 생길 수 있거나, 2차 악성 종양, 영양실조, 또는 결핵 또는 성적으로 전염되는 질병, 예를 들어 매독 또는 간염과 같은 감염원에 감염됨으로써 유발될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 또는 약리학적으로 허용되는"은 동물 또는 인간에 투여되는 경우 거부반응, 알레르기 반응, 또는 기타 부반응을 일으키지 않는 분자체 및 조성물을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 피험체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 피험체는 인간이다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체"는 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 성분을 위해 상기 매질 및 제제의 사용은 당 업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상의 매질 또는 제제가 본원에 제시된 벡터 또는 세포에 부적합 경우를 제외하고는, 치료 조성물에 이들의 사용이 고려된다. 보충의 활성 성분이 또한 조성물에 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 사슬로서 정의된다. 게다가, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 본원에서 사용되는 핵산과 폴리뉴클레오티드는 호환적이다. 핵산은 폴리뉴클레오티드이며, 단량체인 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있다. 단량체의 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본원에서 사용되는 폴리뉴클레오티드는, 제한 없이 즉 통상의 클로닝 기술 및 PCR™ 등을 이용한 재조합 방법, 즉 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터 핵산 서열의 클로닝을 포함하는 당 업계에 이용 가능한 임의의 방법에 의해, 그리고 합성 방법에 의해 얻을 수 있는 모든 핵산 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 게다가, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 돌연변이를 포함하며, 당 업계에 잘 알려진 방법에 의한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 돌연변이를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 핵산은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 통상적으로 정해진 서열을 갖는 아미노산 잔기의 사슬로서 정의된다. 본원에서 사용되는 용어 폴리펩티드는 용어 단백질과 호환될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 유전자의 특이적 전사를 개시하는데 필요한 세포의 합성 장치 또는 도입된 합성 장치에 의해 인식되는 DNA 서열로서 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 반응을 조절한다(regulate an immune response)", "면역 반응을 조정한다(modulate an immune response)", 또는 "면역 반응을 제어한다(control an immune response)"는 면역 반응을 변경할 수 있는 능력을 나타낸다. 예를 들어, 조성물은 면역 반응을 상승 및/또는 활성화할 수 있다. 게다가, 조성물은 또한 면역 반응을 억제할 수 있다. 조절의 형태는 조성물과 함께 사용되는 리간드에 의해 결정된다. 예를 들어, 이량체의 유사체 화학물질은 공자극 폴리펩티드의 이량체화를 일으켜 T 세포의 활성화를 유도하지만, 단량체의 유사체 화학물질은 공자극 폴리펩티드의 이량체화를 일으키지 못하여 T 세포를 활성화하지 못할 것이다.
용어 "형질감염" 및 "형질도입"은 호환적이며 외인성 DNA 서열이 진핵 숙주 세포에 도입되는 과정을 나타낸다. 형질감염(또는 형질도입)은 전기천공, 미세주입, 유전자 총 전달법, 레트로바이러스 감염, 리포펙틴, 수퍼펙션 등을 포함한 많은 방법에 의해 달성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "동계"는 동일하거나 조직 이식을 가능하게 할 정도로 매우 연관된 유전자형을 가지거나 면역적으로 적합한 세포, 조직 또는 동물을 나타낸다. 예를 들어, 동일한 동계교배계의 일란성 쌍둥이 또는 동물. 동계(Syngeneic 및 isogeneic)는 호환적으로 사용될 수 있다.
용어 "환자" 또는 "피험체"는 호환적이며, 본원에서 사용되는 생물체 또는 동물; 예를 들어, 인간, 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이), 마우스, 돼지, 소, 염소, 토끼, 랫트, 기니아 피그, 햄스터, 말, 원숭이, 양, 또는 기타 비인간 포유동물을 포함한 포유동물; 예를 들어 비-포유동물 척추동물, 예를 들어 조류(예를 들어 닭 또는 오리) 또는 어류, 및 비-포유동물 무척추동물을 포함한 비-포유동물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "백신"은 동물에 투여될 수 있는 형태인 본원에서 제시된 조성물을 포함하는 제제를 나타낸다. 전형적으로, 백신은 조성물이 현탁되거나 용해되는 통상의 식염수 또는 완충 수용액 매질을 포함한다. 상기 형태로, 조성물은 병태를 예방하고, 개선하고, 또는 그외 치료하는데 편리하게 이용될 수 있다. 피험체에 도입시, 백신은 면역 반응을 유발할 수 있으며, 상기 면역 반응에는 항체 생산, 사이토카인 및/또는 기타 세포 반응이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "전사 제어 하에" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 프로모터가 RNA 중합효소 개시 및 유전자 발현을 제어하는 핵산과 관련하여 정확한 위치 및 방향에 있는 것으로 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료", "치료하다", "치료된", 또는 "치료하는"은 예방 및/또는 치료를 나타낸다. 암성 고형 종양과 같은 고형 종양에 관하여 사용되는 경우, 예를 들어, 용어는 고형 종양 또는 암에 대해 피험체의 내성을 증가시키는 예방적 치료에 의한 예방을 나타낸다. 일부 예에서, 암이 가족력이 있거나 유전적으로 연관되는 경우, 피험체는 암을 예방하도록 치료될 것이다. 감염성 질환에 관하여 사용되는 경우, 예를 들어, 용어는 병원체에 감염에 대해 피험체의 내성을 증가시거나, 다시 말해 피험체가 병원체에 감염되거나 감염에 기인하는 병의 증상을 나타낼 가능성을 감소시키는 예방적 치료 및 피험체가 감염된 후 감염과 싸우기 위해서, 예를 들어 감염을 감소하거나 제거하거나 감염이 더 악화되는 것을 방지하기 위한 치료를 나타낸다.
혈액 질환: 본원에서 사용되는 용어 "혈액 질환" 및/또는 "혈액의 질환들"은 혈액 세포, 헤모글로빈, 혈액 단백질, 혈액응고의 기전, 혈액 생산, 혈액 단백질의 생산 등 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는, 혈액의 생산 및 이의 구성요소에 영향을 주는 병태를 나타낸다. 혈액 질환의 비제한적 예는 빈혈증, 백혈병, 림프종, 혈액학적 신생물, 알부민혈증, 혈우병 등을 포함한다.
골수 질환: 본원에서 사용되는 용어 "골수 질환"은 혈액 세포 및 혈소판 생산의 감소를 일으키는 병태를 나타낸다. 일부 골수 질환에서, 정상의 골수 구조는 감염(예를 들어, 결핵) 또는 악성 종양에 의해 대체되고, 차례로 혈액 세포 및 혈소판의 생산에 있어 감소를 일으킬 수 있다. 골수 질환의 비제한적인 예는 백혈병, 세균 감염(예를 들어, 결핵), 방사선 숙취 또는 중독, 무호흡 혈구감소증, 빈혈증, 다발성 골수종 등을 포함한다.
T 세포 및 활성화 T 세포(CD3+ 세포를 의미하는 것을 포함한다): T 세포(T 림프구로도 나타냄)는 림프구로 나타내는 백혈구의 군에 속한다. 림프구는 일반적으로 세포 매개 면역에 관련된다. "T 세포"에서 "T"는 흉선에서 유래되는 세포 또는 이의 성숙이 흉선에 의해 영향받는 세포를 나타낸다. T 세포는 T 세포 수용체로 알려진 세포 표면 단백질의 존재에 의해 다른 림프구 유형, 예를 들어 B 세포 및 자연 사멸(NK) 세포와 구별될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "활성화 T 세포"는 II형 주조직 적합성(MHC: major histocompatibility) 마커의 문맥에서 제시되는 항원 결정인자의 인식에 의해 면역 반응(예를 들어, 활성화 T 세포의 클론 확장)을 생성하도록 자극되는 T 세포를 나타낸다. T-세포는 항원 결정인자, 사이토카인 및/또는 림포카인 및 분화 클러스터 세포 표면 단백질(예를 들어, CD3, CD4, CD8 등 및 이들의 조합)의 존재에 의해 활성화된다. 분화 클러스터 단백질을 발현하는 세포를 T 세포 표면상의 그 단백질의 발현에 대해 "양성"이라고 말한다(예를 들어, CD3 또는 CD4 발현에 양성인 세포를 CD3+ 또는 CD4+로 나타냄). CD3 및 CD4 단백질은 T 세포에서 신호전달에 직접 및/또는 간접적으로 관련될 수 있는 세포 표면 수용체 또는 공수용체이다.
말초 혈액: 본원에서 사용되는 용어 "말초 혈액"은 혈액의 세포 구성요소를 나타내며(예를 들어, 적혈구, 백혈구 및 혈소판), 이들은 순환하는 혈액으로부터 얻거나 제조되고 림프계, 비장, 간 또는 골수 내에 격리되지 않는다.
제대혈: 제대혈은 말초 혈액과 다르며 림프계, 비장, 간 또는 골수 내에 격리된 혈액이다. 용어 "제대혈"("umbilical cord", "umbilical blood" 또는 "cord blood"가 호환적으로 사용될 수 있음)은 태반 내와 출산 후 부착된 제대 내에 남아있는 혈액을 나타낸다. 제대혈은 대개 조혈세포를 포함한 줄기세포를 포함한다.
"얻거나 제조된다"는 것은 세포의 경우 세포 또는 세포 배양물이 출처로부터 단리, 정제, 또는 부분적으로 단리되는 것을 의미하며, 출처는 예를 들어 제대혈, 골수, 또는 말초 혈액이 될 수 있다. 또한, 용어는 원래 출처, 또는 세포 배양물이 배양되고 세포가 복제되는 경우, 및 자손 세포가 본래 출처로부터 바로 유래되는 경우에 적용할 수 있다.
사멸된 세포의 백분율로 "사멸"("kill" 또는 "killing")은 아폽토시스 측정을 위해 공지된 임의의 방법을 이용하여 측정되는 아폽토시스를 통한 세포의 사망을 의미한다. 용어는 또한 세포 제거를 나타낼 수 있다.
공여 T 세포: 본원에서 사용되는 용어 "공여 T 세포"는 대개 동종이형 줄기세포 이식 후 항바이러스 및/또는 항종양 면역을 부여하기 위해 수여자에게 투여되는 T 세포를 나타낸다. 공여 T 세포는 대개 골수 이식 거부반응을 억제하거나 동종생착(alloengraftment)의 성공을 증가시키기 위해 사용되지만, 동일한 공여 T 세포가 숙주 항원에 대해 동종공격적인(alloaggressive) 반응을 일으킬 수 있으며, 이는 차례로 이식 vs. 숙주 질환(GVHD)을 일으킬 수 있다. 어떤 활성화 공여 T 세포는 다른 활성화 T 세포에 비해 더 높거나 더 낮은 GvHD 반응을 일으킬 수 있다. 공여 T 세포는 또한 수여 종양 세포에 반응할 수 있어서 유익한 이식 vs. 종양 효과를 가져 올 수 있다.
"기능 보존 변이체"는 단백질 또는 효소의 전체적인 입체구조 및 기능을 변경하지 않으면서 주어진 아미노산 잔기가 변화된 단백질 또는 효소이다. 상기 변화는 극성 또는 비극성 특성, 크기, 모양 및 전하를 포함한 유사한 특성을 갖는 아미노산의 대체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 보편적으로 공지된 비유전적으로 코딩되는 많은 아미노산의 보존적 아미노산 치환은 당 업계에 잘 알려져 있다. 기타 비코딩되는 아미노산을 위한 보존적 치환은 유전적으로 코딩된 아미노산의 특성과 비교하여 이들의 물리적 특성을 기초로 하여 결정될 수 있다.
보존되는 것으로 나타낸 것 외의 아미노산이 단백질 또는 효소에서 달라질 수 있어서, 유사한 기능의 두 단백질 사이에 백분율의 단백질 또는, 아미노산 서열 유사성이 달라질 수 있고 예를 들어 정렬 체계에 따라 결정되는 바에 따라, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이 될 수 있다. 본원에서 나타내는 "서열 유사성"은 뉴클레오티드 또는 단백질 서열이 연관된 정도를 의미한다. 두 서열 사이의 유사성 정도는 백분율의 서열 동일성 및/또는 보존성을 기본으로 할 수 있다. 본원에서 나타내는 "서열 동일성"은 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 변함없는 정도를 의미한다. "서열 정렬"은 유사성의 정도를 평가하기 위해 최대 수준의 동일성(아미노산 서열의 경우, 보존성)을 이루도록 2개 이상의 서열을 일렬로 배열하는 과정을 의미한다. 서열을 정렬하고 유사성/동일성을 평가하는 많은 방법은 예를 들어 유사성이 MEGALIGN 알고리즘, 및 BLASTN, BLASTP, 및 FASTA를 기반으로 하는 클러스터 방법과 같이 당 업계에 공지되어 있다. 상기 프로그램을 이용하는 경우, 바람직한 설정이 최고의 서열 유사성을 결과로 가져오는 방법이다.
중간엽 간질 세포: 본원에서 사용되는 용어 "중간엽 간질 세포" 또는 "골수 유래 중간엽 간질 세포"는 생체 외, 시험관 내 및 생체 내에서 지방세포, 조골세포 및 연골 모세포로 분화할 수 있는 다분화능(multipotent) 줄기세포를 나타내며, 표준 배양 조건에서 플라스틱 배양 접시에 유착하고, 조혈계 마커에 대해 음성이고 CD73, CD90 및 CD105에 양성인 단핵 골수 세포의 일부로서도 정의될 수 있다.
배아 줄기세포: 본원에서 사용되는 용어 "배아 줄기세포"는 50 내지 150개 세포 사이의 초기 단계 배아인 배반포의 내세포 집단으로부터 유래된 전분화능(pluripotent) 줄기세포를 나타낸다. 배아 줄기세포는 그들 자신을 무한으로 재생성할 수 있으며 3가지 1차 배엽인 외배엽, 내배엽, 및 중배엽 모두로 분화할 수 있다는 특징을 갖는다. 전분화능 세포가 모든 세포 유형을 생성할 수 있는 반면, 다분화능 세포(예를 들어 성인 줄기세포)는 단지 한정된 수의 세포 유형만을 생산할 수 있다는 점에서 전분화능은 다분화능과 구별된다.
유도성 전분화능 줄기세포: 본원에서 사용되는 용어 "유도성 전분화능 줄기세포" 또는 "유도된 전분화능 줄기세포"는 모든 세포는 아니더라도 배아 줄기세포와 같이 많은 세포로 분화될 수 있는 세포를 생성하기 위해, 유전적(예를 들어, 차례로 전분화능을 활성화하는 유전자의 발현), 생물학적(예를 들어, 치료 바이러스 또는 레트로바이러스) 및/또는 화학적(예를 들어, 소분자, 펩티드 등) 조작에 의해 "재프로그램"되거나 유도되는 성체 세포, 또는 분화된 세포를 나타낸다. 유도성 전분화능 줄기세포는 중간 또는 최종적으로 분화된 상태(예를 들어, 피부 세포, 뼈 세포, 섬유아세포 등)를 이룬 후 탈분화하도록 유도됨으로써 다분화능 또는 전분화능 세포를 생성하는 능력의 일부 또는 전체를 다시 얻는다는 점에서 배아 줄기세포와 구별된다.
CD34+ 세포: 본원에서 사용되는 용어 "CD34+ 세포"는 이의 세포 표면상에 CD34 단백질을 발현하는 세포를 나타낸다. 본원에서 사용되는 "CD34"는 세포 표면 당단백질(예를 들어, 시알로뮤신 단백질)을 나타내며, 대개 세포-세포 부착 인자로서 역할을 하며 림프절로의 T 세포 진입과 관련되며 "분화 클러스터" 유전자 패밀리의 일원이다. 또한, CD34는 줄기세포 또는 세포 외 기질에 부착하거나 기질 세포에 골수세포가 직접적으로 부착하는 것을 매개할 수 있다. CD34+ 세포는 대개 조혈 세포로서 제대 및 골수, 중간엽 줄기세포의 서브세트, 혈관내피 전구 세포, 림프관(늑막 림프관 제외)이 아닌 혈관의 내피세포, 비만세포, 피부 진피의 간질과 부속기관 주변의 수지상 세포의 부분집단(인자 XIIIa 음성), 및 특정 연조직 종양 내 세포(예를 들어, 포상연부육종, pre-B 급성 림프모구성 백혈병(Pre-B-ALL:pre-B-acute leukoblastic leukemia), 급성 골수성 백혈병(AML:acute myelogenous leukemia), AML-M7, 융기 피부 섬유육종, 위장관 기질 종양, 거대세포 섬유모세포종, 과립구 육종, 카포시 육종, 지방육종, 악성 섬유조직구종, 악성 말초 신경집 종양, 수막 혈관 주위세포종, 수막종, 신경섬유종, 슈반종, 및 유두 갑상샘 암종)에서 발견된다.
종양 침윤 림프구(TIL)는 종양을 침윤하고 표적된 구역에 있는 종양 세포를 사멸시키는 여러 수용체를 갖는 T 세포를 나타낸다. 본 출원의 방법을 이용하여 TIL의 활성을 조절함으로써 종양 세포 제거를 더 직접적으로 제어할 수 있다.
유전자 발현 벡터: 본원에서 사용되는 용어 "유전자 발현 벡터", "핵산 발현 벡터", 또는 "발현 벡터"는 문헌 전반에 걸쳐 호환적으로 사용될 수 있으며, 일반적으로 숙주 세포에서 복제될 수 있고 유전자 또는 유전자들을 숙주 세포에 도입하는데 이용될 수 있는 핵산 분자(예를 들어, 플라스미드, 파아지, 자율적인 복제 서열(ARS: autonomously replication sequence), 인공 염색체, 효모 인공 염색체(예를 들어, YAC))를 나타낸다. 발현 벡터에 도입되는 유전자는 내인성 유전자(예를 들어, 숙주 세포 또는 생물체에서 보통 발견되는 유전자) 또는 이종 유전자(예를 들어, 숙주 또는 생물체의 게놈에서 또는 과잉 염색체 핵산에서 보통 발견되지 않는 유전자). 발현 벡터에 의해 세포에 도입되는 유전자는 천연 유전자 또는 변형되거나 조작되지 않은 유전자일 수 있다. 또한, 유전자 발현 벡터는 때로는 발현 벡터가 운반하는 유전자 또는 유전자들의 효율적인 전사를 촉진하거나 상승시킬 수 있는 인핸서 서열, 프로모터 영역 및/또는 종결 서열로서 기능할 수 있는 5' 및 3' 비번역 조절 서열을 포함하도록 조작될 수도 있다. 유전자 발현 벡터는 때로는 특정 세포 유형, 세포 위치, 또는 조직 유형에서 복제 및/또는 발현 기능성(예를 들어 전사 및 번역)을 위해 조작되기도 한다. 발현 벡터는 때로는 숙주 또는 수용 세포에서 벡터의 유지를 선별할 수 있는 표지를 포함한다.
발생적으로 조절되는 프로모터: 본원에서 사용되는 용어 "발생적으로 조절되는 프로모터"는 발생 프로그램 또는 경로에 의해 제어받고, 개시되거나 영향받는 특정 조건하에서 발현되는 유전자를 전사하는 RNA 폴리머라제를 위한 결합 개시 부위로서 역할을 하는 프로모터를 나타낸다. 발생적으로 조절되는 프로모터는 대개 발생 프로그램 또는 경로의 일부분이 되는 유전자의 전사에 영향을 줄 수 있는 전사 활성 인자 또는 전사 리프레서가 결합하기 위한 프로모터 영역에 또는 프로모터 영역 가까이에 추가의 제어 영역을 갖는다. 발생적으로 조절되는 프로모터는 때로는 유전자 산물이 세포의 발생적 분화에 영향을 주는 유전자를 전사하는데 관련된다.
발생적으로 분화된 세포: 본원에서 사용되는 용어 "발생적으로 분화된 세포는 대개 발생적으로 조절되는 특정 유전자의 발현을 수반하는 과정을 거치는 세포를 나타내며, 상기 과정에 의해 세포는 특정 기능을 수행하기 위해 덜 발달된 형태에서 더 발달된 형태로 발전한다. 발생적으로 분화된 세포의 비제한적인 예는 간세포, 폐 세포, 피부 세포, 신경 세포, 혈액 세포 등이다. 발생적 분화에 있어 변화는 일반적으로 유전자 발현의 변화(예를 들어, 유전자 발현 패턴의 변화), 유전적 재편성(예를 들어, 잠재되거나 발현될 유전자를 각각 숨기거나 노출하는 크로마틴의 재형성)을 수반하며, 경우에 따라 DNA 서열의 변화(예를 들어, 면역 다양성 분화)를 수반한다. 발생 과정에서 세포 분화는 유전자 조절 네트워크의 결과로서 이해될 수 있다. 조절 유전자 및 이의 시스-조절 모듈은 입력(예를 들어, 발생 경로 또는 프로그램의 상류에서 발현되는 단백질)을 받고 네트워크 다른 곳에서 출력을 생성하는(예를 들어, 발현된 유전자 산물이 발생 경로 또는 프로그램의 하류에 다른 유전자에 작용함) 유전자 조절 네트워크의 중심점이 된다.
용어 "과증식 질환"은 세포의 과증식으로 인한 질환으로 정의된다. 대표적인 과증식 질환은 암 또는 자가 면역 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 기타 과증식 질환은 혈관 폐쇄, 재협착, 죽상동맥경화증, 또는 염증성 장질환을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 바이러스 벡터 내에 포함된다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 생체 외에서 바이러스 벡터와 접촉되고, 일부 실시양태에서, T 세포는 생체 내에서 바이러스 벡터와 접촉되는 것으로 이해된다.
발현 구조물의 조작
발현 구조물은 공자극 폴리펩티드 및 리간드 결합 도메인을 코딩하고, 이들 모두는 작동 가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 프로모터 서열이 두 번째 서열에 기능적으로 연결되어 있다는 것을 나타내고자 하며, 상기 프로모터 서열이 두 번째 서열에 상응하는 DNA의 전사를 개시하고 매개한다. 보다 구체적으로 하나 초과의 리간드 결합 도메인이 발현 구조물에 사용된다. 게다가, 발현 구조물은 막 표적화 서열을 포함한다. 적합한 발현 구조물은 상기 FKBP 리간드 결합 요소의 양쪽에 공자극 폴리펩티드 요소를 포함할 수 있다. 발현 구조물은 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터 또는 플라스미드에 삽입될 수 있다. 제공되는 방법의 단계는 임의의 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 이들 방법은 형질도입, 형질전환, 또는 그 외 본원에서 제시된 항원 제시 세포에 핵산을 제공하는 방법을 제한없이 포함한다.
발현 구조물은 마커 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 마커 폴리펩티드는 공자극 폴리펩티드에 연결된다. 예를 들어, 마커 폴리펩티드는 예를 들어, 절단 가능한 2A-유사 서열과 같은 폴리펩티드 서열을 통해 공자극 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 마커 폴리펩티드는, 예를 들어, CD19, ΔCD19 일 수 있거나, 예를 들어 유도성 CSM의 활성에 영향을 주지 않도록 선택된 이종 단백질이 될 수 있다.
2A-유사 서열, 또는 "절단 가능한" 2A 서열은 예를 들어 토세아 아시그나(Thosea asigna)를 포함하는, 예를 들어, 많은 다양한 바이러스로부터 유래된다. 이러한 서열은 때로는 "펩티드 스키핑(skipping) 서열"로도 알려져 있다. 상기 유형의 서열은 분리될 두 펩티드 사이의 시스트론 내에 배치될 때, 리보솜은 펩티드 결합을 건너뛰는 것처럼 보이며, 토세아 아시그나 서열의 경우 Gly과 Pro 아미노산 사이의 결합이 생략된다. 이로써 2 내지 3개의 폴리펩티드, 이 경우에는 공자극 폴리펩티드 세포질 영역과 마커 폴리펩티드가 생긴다. 이러한 서열이 사용되는 경우, 2A 서열의 5'에서 코딩되는 펩티드는 2A 서열에 Gly 잔기 및 임의의 상류를 포함하는 카복시 말단에 추가의 아미노산으로 끝날 수 있다. 2A 서열의 3'에서 코딩된 펩티드는 2A 서열 내 Pro 잔기 및 임의의 하류를 포함하는 아미노산 말단에서 추가의 아미노산으로 끝날 수 있다.
공자극 폴리펩티드
공자극 폴리펩티드 분자는 세포 생존 및 증식과 관련된 신호전달 경로의 활성화를 통해 세포 매개된 면역 반응을 증폭할 수 있다. 고려되는 공자극 단백질은, 예를 들어, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR: tumor necrosis factor recepter) 패밀리의 일원(즉, CD40, RANK/TRANCE-R, OX40, 4-1BB) 및 CD28 패밀리 일원(CD28, ICOS)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 공자극 단백질은 예를 들어, CD28, 4-1BB, OX40, 및 CD3 제타 사슬, 또는, 예를 들어, 이들의 세포질 영역을 포함할 수 있다. 하나 초과의 공자극 폴리펩티드, 또는 공자극 폴리펩티드 세포질 영역은 본원에서 논의되는 유도성 키메라 신호전달 분자에 사용될 수 있다. 예를 들어, 유도성 CSM은 CD28 세포질 폴리펩티드 및 4-1BB 세포질 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또는, 예를 들어, 유도성 CSM은 CD28 세포질 폴리펩티드 및 OX40 세포질 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또는, 예를 들어, 유도성 CSM은 CD3 제타 도메인 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다.
공자극 폴리펩티드는 NF-κB 경로, Akt 경로, 및/또는 p38 경로를 활성화하는 임의의 분자 또는 폴리펩티드를 포함한다. 세포 활성화 시스템은 하나 이상의 리간드 결합 도메인(즉, 소분자 결합 도메인)에 융합된 재조합 신호전달 분자의 이용을 기본으로 하며, 여기서 공자극 폴리펩티드는 올리고머화를 일으키는 리간드(즉, 지질 투과성의 유기 이량체화 약물)로 활성화되거나 조절된다. 공자극 폴리펩티드의 가교형성 또는 올리고머화에 이용될 수 있는 다른 시스템은 항체, 천연 리간드, 및/또는 인공 가교 반응 또는 합성 리간드를 포함한다. 게다가, 고려되는 또 다른 이량체화 시스템은 쿠머마이신/DNA 자이레이스 B 시스템을 포함한다.
이용될 수 있는 공자극 폴리펩티드는 NF-κB 및 다른 가변적인 신호전달 케스케이드, 예를 들어 p38 경로 및/또는 Akt 경로를 활성화하는 것들을 포함한다. 이같은 공자극 폴리펩티드는 CD28 패밀리 일원(예를 들어 CD28, ICOS), TNF 수용체(즉, CD40, RANK/TRANCE-R, OX40, 4-1BB)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 공자극 폴리펩티드의 유도성 형태(예를 들어, iCD28, i4-1BB, iCD3-제타)를 코딩하는 발현 구조물을 생산하는 유전적 물질의 조작을 수반한다. 상기 방법은 예를 들어, 각각의 세포질 도메인 및 이의 발현을 위한 수단을 코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물의 생성을 수반한다. 벡터는 적합한 보조 세포에서 복제될 수 있고, 바이러스 입자는 그로부터 생산될 수 있으며, 세포는 재조합 바이러스 입자로 감염될 수 있다.
따라서, 본원에서 제시된 공자극 분자는 예를 들어 세포 외 도메인이 결여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 외 도메인은 절단되거나 제거된다. 또한, 세포 외 도메인은 표준 돌연변이 생성법, 삽입, 결실, 또는 치환을 이용하여 변이되어 기능적인 세포 외 도메인을 갖지 않는 공자극 분자를 생성할 수 있는 것으로 생각된다.
일부 실시양태에서, 키메라 신호전달 분자는 예를 들어 [도 21]에 나타낸 CD40 세포질 영역 폴리펩티드 및 절단된 MyD88 폴리펩티드를 포함한다. CD40 세포질 영역 폴리펩티드 및 절단된 MyD88 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는, 이로써 그 전문이 본원에서 참고로 포함되는 2009년 9월 21일에 출원된 미국 특허 제12/563,991호, 발명의 명칭 "METHODS AND COMPOSITIONS FOR GENERATING AN IMMUNE RESPONSE BY INDUCING CD40 AND PATTERN RECOGNITION RECEPTOR ADAPTERS"에 논의된다.
유전자 요법의 문맥에서, 유전자는 벡터에 골격을 제공하는 바이러스 게놈 이외의 출처로부터 유래된 이종 폴리뉴클레오티드 서열일 것이다. 유전자는 원핵생물 또는 진핵생물 출처, 예를 들어 세균, 바이러스, 효모, 기생생물, 식물, 또는 동물로부터 유래된다. 이종 DNA는 또한 여러 출처(즉, 다중 유전자 구조물 또는 융합 단백질)로부터 유래된다. 이종 DNA는 또한 한 출처로부터 유래되는 조절 서열과 상이한 출처로부터의 유전자를 포함할 수 있다.
공자극 폴리펩티드는 본원에서 제공된 아미노산 서열을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 결실 또는 절단을 포함한 기능적 보존 돌연변이를 포함할 수 있고, 본원에서 제공된 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
리간드 결합 영역
발현 구조물의 리간드 결합("이량체화") 도메인은 천연 또는 비천연 리간드, 예를 들어 비천연 합성 리간드를 이용하여 유도를 가능하게 할 임의의 편리한 도메인일 수 있다. 다량체화 영역, 또는 리간드 결합 도메인은 구조물의 성질 및 리간드의 선택에 따라 세포막에 내부 또는 외부에 있을 수 있다. 수용체를 포함한 다양한 리간드 결합 단백질이 공지되어 있으며, 상기에 나타낸 세포질 영역과 연관된 리간드 결합 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "리간드 결합 도메인"은 용어 "수용체"와 호환적일 수 있다. 리간드(예를 들어, 작은 유기 리간드)가 공지되거나 쉽게 생산될 수 있는 리간드 결합 단백질이 특히 관심을 가질만하다. 이러한 리간드 결합 도메인 또는 수용체는 FKBP 및 사이클로필린 수용체, 스테로이드 수용체, 테트라사이클린 수용체, 상기 나타낸 기타 수용체 등뿐 아니라, 항체, 특히 중쇄 또는 경쇄 서브유닛, 이들의 변이된 서열, 추계 절차에 의해 얻어질 수 있는 임의 아미노산 서열, 조합 합성 등으로부터 얻어질 수 있는 "비천연 수용체"를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 FKBP 리간드 결합 영역, 사이클로필린 수용체 리간드 결합 영역, 스테로이드 수용체 리간드 결합 영역, 사이클로필린 수용체 리간드 결합 영역, 및 테트라사이클린 수용체 리간드 결합 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대개. 리간드 결합 영역은 FvFvls 서열을 포함한다. 때로는, Fv'Fvls 서열은 추가의 Fv' 서열을 더 포함한다. 예는 예를 들어, 문헌(Kopytek, S.J., et al., Chemistry & Biology 7:313-321 (2000) 및 Gestwicki, J.E., et al., Combinatorial Chem. & High Throughput Screening 10:667-675 (2007); Clackson T (2006) Chem Biol Drug Des 67:440-2; Clackson, T., in Chemical Biology: From Small Molecules to Systems Biology and Drug Design (Schreiber, s., et al., eds., Wiley, 2007))에 논의된 것을 포함한다.
대부분의 경우, 리간드 결합 도메인 또는 수용체 도메인은 천연 도메인 또는 이의 절단된 활성 부분으로서 약 50개 이상의 아미노산이고 약 350개 미만의 아미노산, 대개 200개 미만의 아미노산이 될 수 있다. 결합 도메인은 예를 들어, 작고(<25 kDa, 바이러스 벡터에서 효율적인 형질감염을 가능하게 하기 위해), 단량체이며, 비면역원성일 수 있고, 이량체화를 위해 배치될 수 있고 합성되기 쉬운 세포 투과성의 비독성 리간드를 갖는다.
수용체 도메인은 발현 구조물의 설계 및 적합한 리간드의 이용가능성에 따라 세포 내 또는 세포 외에 있을 수 있다. 소수성 리간드의 경우, 결합 도메인은 막의 양쪽 끝에 있을 것이지만, 친수성 리간드, 특히 단백질 리간드 경우, 결합 도메인은 결합에 이용할 수 있는 형태 안에 리간드를 내재화하기 위한 수송 시스템이 존재하지 않는다면 일반적으로 세포막 밖에 있을 것이다. 세포 내 수용체 경우, 구조물은 도메인 서열의 5' 또는 3'에 신호 펩티드 및 막관통 도메인을 코딩할 수 있거나 수용체 도메인 서열의 5'에 지질 부착 신호 서열을 가질 수 있다. 수용체 도메인이 신호 펩티드와 막관통 도메인 사이에 있는 경우, 수용체 도메인은 세포 외에 있을 것이다.
수용체를 코딩하는 발현 구조물의 일부분은 다양한 이유에서 돌연변이를 거칠 수 있다. 돌연변이된 단백질은 더 높은 결합 친화도를 제공하고, 자연 발생 수용체와 돌연변이된 수용체의 리간드에 의한 구별을 가능하게 하고, 수용체-리간드 쌍을 설계할 수 있는 기회를 제공할 수 있으며, 그 외에 기능도 할 수 있다. 수용체의 변화는 결합 부위에 있는 것으로 공지된 아미노산의 변화, 조합 기술을 이용한 임의 돌연변이 유발을 수반할 수 있으며, 여기서 결합 부위와 관련된 아미노산 또는 입체구조적인 변화와 관련된 다른 아미노산을 위한 코돈은 특정 아미노산의 코돈을 공지된 변화로 또는 무작위로 변화시키는 단계, 적합한 원핵 숙주에서 생성되는 단백질을 발현하는 단계, 결합에 대해 생성된 단백질을 스크링닝하는 단계에 의해 돌연변이 유발될 수 있다.
항체 및 항체 서브유닛, 예를 들어, 중쇄 또는 경쇄, 구체적으로 단편, 보다 구체적으로 가변 영역의 전체 또는 일부분, 또는 높은 친화도 결합을 생성하는 중쇄 및 경쇄의 융합이 결합 도메인으로 이용될 수 있다. 고려되는 항체는 에피토프적으로 발현되는 인간 산물인 것, 예를 들어 면역 반응을 유발하지 않고 일반적으로 주변에서 발현되지 않는(즉, CNS/뇌 영역 밖) 세포 외 도메인을 포함한다. 이러한 예는 저친화도 신경 성장 인자 수용체(LNGFR), 및 배아 표면 단백질(즉, 암태아성 항원)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 게다가, 항체는 생리학적으로 허용되는 합텐 분자에 대해 제조될 수 있으며, 개별 항체 서브유닛은 결합 친화도에 대해 스크리닝될 수 있다. 리간드에 대한 적합한 친화도를 갖는 결합 단백질 도메인을 얻기 위해서 서브유닛을 코딩하는 cDNA는 불변 영역의 결실, 가변 영역의 일부분, 가변 영역의 돌연변이 생성 등에 의해 단리되어 변형될 수 있다. 이러한 방법에서, 대부분 생리학적으로 허용되는 임의의 합텐 화합물은 리간드로서 이용되거나 리간드에 대한 에피토프를 제공하는데 이용될 수 있다. 결합 도메인이 공지되고 결합에 유용한 리간드가 있는 경우 천연 수용체는 항체 유닛 대신에 이용될 수 있다.
올리고머화
다른 결합 현상, 예를 들어 알로스테릭한 활성화가 신호를 개시하는데 이용될 수 있지만, 형질도입된 신호는 보통 키메라 단백질 분자의 리간드 매개된 올리고머화, 즉 리간드 결합 후 올리고머화의 결과로서 발생할 것이다. 키메라 단백질의 구조는 여러 도메인의 순서 및 개별 도메인의 반복 횟수에 따라 달라질 것이다.
수용체의 다량체화의 경우, 키메라 표면 막 단백질의 리간드 결합 도메인/수용체 도메인에 대한 리간드는 대개 각각이 리간드 수용체 도메인에 결합할 수 있는 적어도 두 개의 결합 부위를 가질 것이라는 점에서 다량체가 될 것이다. "다량체 리간드 결합 영역"은 다량체 리간드에 결합하는 리간드 결합 영역을 의미한다. 용어 "다량체 리간드"는 이량체 리간드를 포함한다. 이량체 리간드는 리간드 수용체 도메인에 결합할 수 있는 두 개의 결합 부위를 가질 것이다. 바람직하게는, 주요 리간드는 작은 합성 유기분자의 대략 테트라머보다 크지 않고, 개별 분자가 전형적으로 약 150 Da 이상이고 약 5 kDa 미만, 대개 약 3 kDa 미만인 이량체 또는 고차 올리고머일 것이다. 합성 리간드와 수용체의 다양한 쌍이 이용될 수 있다. 예를 들어, 천연 수용체와 관련된 실시양태에서, 이량체 FK506은 FKBP12 수용체와 이용될 수 있고. 이량체화된 사이클로스포린 A는 사이클로필린 수용체와 이용될 수 있고, 이량체화된 에스트로겐과 에스트로겐 수용체, 이량체화된 글루코코르티코이드와 글루코코르티코이드 수용체, 이량체화된 테트라사이클린과 테트라사이클린 수용체, 이량체화된 비타민 D와 비타민 D 수용체 등이 이용될 수 있다. 별법으로, 더 높은 차수의 리간드, 예를 들어 삼량체가 이용될 수 있다. 비천연 수용체, 예를 들어, 항체 서브유닛, 변형된 항체 서브유닛, 유연한 링커 도메인에 의해 분리된 나란한 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 또는 변형된 수용체, 및 이들의 변이된 서열 등과 관련된 실시양태에서, 임의의 매우 다양한 화합물이 사용될 수 있다. 이러한 리간드 유닛의 중요한 특징은 각 결합 부위가 고친화도로 수용체에 결합할 수 있다는 것과 화학적으로 이량체화될 수 있다는 것이다. 또한, 방법은 리간드가 기능적 수준으로 혈청에 용해되지만 대부분 적용에 경우 원형질막을 가로질러 확산될 수 있도록 리간드의 소수성/친수성의 균형을 유지하는데 이용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 방법은 조건에 따라 단백질 또는 폴리펩티드를 제어하여 생산하는 화학적으로 유도된 이량체화(CID: chemically induced dimerization) 기술을 이용한다. 상기 기술이 유도성이라는 것 외에도, 본 방법은 불안정한 이량체화제의 분해 또는 단량체의 경쟁적 억제제의 투여로 인해 가역적이다.
CID 시스템은 리간드 결합 도메인에 융합되는 신호전달 분자를 신속하게 가교결합하는 합성의 2가 리간드를 이용한다. 본 시스템을 이용하여 올리고머화 및 세포 표면의 활성화(Spencer, D. M., et al., Science, 1993. 262: p. 1019-1024; Spencer D. M. et al., Curr Biol 1996, 6:839-847; Blau, C. A. et al., Proc Natl Acad.Sci. USA 1997, 94:3076-3081), 또는 시토졸 단백질의 활성화(Luo, Z. et al., Nature 1996,383:181-185; MacCorkle, R. A. et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:3655-3660), 전사를 조정하기 위해 DNA 요소로 전사 인자의 동원(Ho, S. N. et al., Nature 1996, 382:822-826; Rivera, V. M. et al., Nat.Med. 1996, 2:1028-1032) 또는 신호전달을 자극하기 위해 원형질막으로 신호전달 물질의 동원(Spencer D. M. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1995, 92:9805-9809; Holsinger, L. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1995, 95:9810-9814)을 유발하였다.
CID 시스템은 표면 수용체 집합(aggregation)이 하류의 신호전달 케스케이드를 효과적으로 활성화한다는 개념에 기반한다. 가장 간단한 실시양태에서, CID 시스템은, 자신의 정상적인 생물활성은 잃지만, FK506-결합 단백질, FKBP12에 유전적으로 융합된 분자를 가교 결합할 수 있는 능력을 얻은, 지질 투과성의 면역억제제인 이량체 유사체, FK506를 이용한다. 하나 이상의 FKBP 및 미리스토일화 서열을 표적 수용체의 세포질 신호전달 도메인에 융합함으로써, 이량체화제 의존적이지만 리간드 및 엑토도메인 비의존적 방식으로 신호전달을 자극할 수 있다. 이것은 일시적 제어, 단량체 약물 유사체의 가역성, 및 향상된 특이성을 제공한다. 결합 도메인, FKBP12에 대한 3세대 AP20187/AP1903 CID의 고친화도는 내인성 FKBP12를 통한 비특이적 부작용의 유도 없이 생체 내에서 재조합 수용체의 특이적 활성화를 가능하게 한다. 이량체화제에 결합하는 아미노산 치환 및 결실을 갖는 FKBP12 변이체, 예를 들어 FKBP12v36이 또한 이용될 수 있다. 또한, 합성 리간드는 프로테아제 분해에 내성을 가지므로, 이는 대부분 전달되는 단백질 제제에 비해 수용체 활성화 시 리간드가 더 효율적으로 만든다.
사용된 리간드는 두 개 이상의 리간드 결합 도메인에 결합할 수 있다. 키메라 신호전달 분자는 하나 초과의 리간드 결합 도메인을 포함하는 경우 하나 초과의 리간드에 결합할 수 있다. 리간드는 전형적으로 비단백질 또는 화학물질이다. 대표적인 리간드는 이량체 FK506(예를 들어, FK1012)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다른 리간드 결합 영역은, 예를 들어, 이량체 영역, 또는 동요 치환을 갖는 변형된 리간드 결합 영역, 예를 들어, FKBP12(V36)이 될 수 있다: F36에서 V로 치환을 갖는 인간 12 kDa FK506-결합 단백질의 전체 성숙 코딩 서열(아미노산 1-107)은 합성 이량체화제 AP1903에 대한 결합 부위를 제공한다(Jemal, A. et al., CA Cancer J. Clinic. 58, 71-96 (2008); Scher, H.I. and Kelly, W.K., Journal of Clinical Oncology 11, 1566-72 (1993)). 단백질의 두 개의 나란한 카피는 또한 고차 올리고머가 AP1903에 의한 가교결합시 유도되도록 하는 구조물 내에 이용될 수 있다.
F36V'-FKBP: F36V'-FKBP는 F36V-FKBP의 코돈이 동요된 형태이다. 이것은 F36V-FKPB와 동일한 폴리펩티드 서열을 코딩한지만 뉴클레오티드 수준에서 단지 62% 상동성을 갖는다. F36V'-FKBP는 레트로바이러스 벡터에서 재조합을 감소하도록 설계되었다(Schellhammer, P.F. et al., J. Urol. 157, 1731-5 (1997)). F36V'-FKBP는 PCR 에셈블리 방법에 의해 제작되었다. 전이유전자는 한 카피의 F36V-FKBP에 직접적으로 연결된 한 카피의 F36V'-FKBP를 포함한다.
일부 실시양태에서, 리간드는 소분자이다. 선택된 리간드 결합 영역에 적합한 리간드가 선택될 수 있다. 대개, 리간드는 이량체이며, 때때로, 리간드는 이량체의 FK506 또는 이량체의 FK506 유사 유사체가다. 특정 실시양태에서, 리간드는 AP1903(CAS 명명법: 2-피페리딘카복실산, 1-[(2S)-1-옥소-2-(3,4,5-트리메톡시페닐)부틸]-1,2-에탄디일비스[이미노(2-옥소-2,1-에탄디일)옥시-3,1-페닐렌[(1R)-3-(3,4-디메톡시페닐)프로필리덴)]에스테르, [2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl) CAS 등록 번호:199514-63-7; 분자식: C78H98N4O20 분자량:1411.65)이다. 특정 실시양태에서 리간드는 AP20187이다. 특정 실시양태에서, 리간드는 예를 들어, AP1510과 같은 AP20187 유사체이다. 일부 실시양태에서, 특정 유사체는 FKBP12에 적합할 것이고, 특정 유사체는 FKBP12의 동요된 형태에 적합할 것이다. 특정 실시양태에서, 한 리간드 결합 영역은 키메라 단백질에 포함된다. 다른 실시양태에서, 두 개 이상의 리간드 결합 영역이 포함된다. 예를 들어, 리간드 결합 영역이 FKBP12인 경우, 2개의 상기 영역이 포함되는 경우, 하나는 예를 들어 동요된 형태일 수 있다.
고려되는 다른 이중체화는 쿠머마이신/DNA 자이레이즈 B 시스템을 포함한다. 쿠머마이신 유도된 이중체화는 변형된 Raf 단백질을 활성화하고 MAP 키나아제 케스케이드를 자극한다. 문헌(Farrar et al., 1996)을 참고한다.
막 표적화
막 표적화 서열은 세포 표면 막으로 키메라 단백질의 수송을 제공하며, 여기서 동일한 또는 다른 서열이 세포 표면 막에 키메라 단백질의 결합 부위를 코딩할 수 있다. 세포막과 관련된 분자는 막 결합을 촉진하는 특정 영역을 포함하고, 이러한 영역은 키메라 단백질 분자에 포함되어 막 표적화 분자를 생성할 수 있다. 예를 들어, 일부 단백질은 아실화된 N-말단 또는 C-말단에 서열을 포함하고, 이러한 아실 잔기는 막 결합을 촉진한다. 상기 서열은 아실트랜스퍼라제에 의해 인식되고 대개 특정 서열 모티프에 일치한다. 특정 아실화 모티프는 단일 아실 잔기로 변형될 수 있고(대개는 여러 양하전된 잔기(예를 들어 인간 c-Src: M-G-S-N-K-S-K-P-K-D-A-S-Q-R-R-R)이 이어져 음이온성 지질 헤드기(head group)과 결합을 향상시킴) 다른 것들은 다수의 아실 잔기로 변형될 수 있다. 예를 들어 단백질 티로신 키나아제 Src의 N-말단 서열은 단일 미리스토일 잔기를 포함할 수 있다. 이중의 아실화 영역은 Src 패밀리 일원의 서브세트(예를 들어, Yes, Fyn, Lck) 및 G 단백질의 알파 서브유닛과 같은 특정 단백질 키나아제의 N-말단 영역 내에 위치한다. 이같은 이중 아실화 영역은 대개 상기 단백질의 처음 18개 아미노산 내에 위치하고 서열 모티프 Met-Gly-Cys-Xaa-Cys에 일치하며, 여기서 Met는 절단되고, Gly은 N-아실화되고 Cys 잔기 중 하나는 S-아실화된다. Gly은 대개 미리스토일화되고 Cys는 팔미토일화될 수 있다. G-단백질 감마 서브유닛 및 기타 단백질의 C-말단으로부터 C15 또는 C10 이소프레닐 잔기로 변형될 수 있는 서열 모티프 Cys-Ala-Ala-Xaa(소위 "CAAX 박스")에 일치하는 아실화 영역(예를 들어, 월드 와이드 웹 주소ebi.ac.uk/interpro/DisplayIproEntry?ac=IPR001230)이 또한 이용될 수 있다. 이들 및 기타 아실화 모티프는 예를 들어 문헌(Gauthier-Campbell et al., Molecular Biology of Cell 15: 2205-2217 (2004); Glabati et al., Biochem. J. 303: 697-700 (1994) 및 Zlakine et al., J. Cell Science 110: 673-679 (1997)에 논의된 것을 포함하며, 키메라 분자에 포함되어 막 국소화를 유도할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아실화 모티프를 포함하는 단백질의 본래 서열이 키메라 단백질에 포함된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, Lck, Fyn 또는 Yes 또는 G-단백질 알파 서브유닛의 N-말단 부분, 예를 들어 상기 단백질로부터 처음 25개 이하 N-말단 아미노산(예를 들어, 선택적인 돌연변이를 갖는 본래 서열의 약 5 내지 약 20개 아미노산, 약 10 내지 약 19개 아미노산, 또는 약 15 내지 약 19개 아미노산)은 키메라 단백질의 N-말단 내에 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, CAAX 박스 모티프 서열을 포함하는 G-단백질 감마 서브유닛의 약 25개 이하 아미노산의 C-말단 서열(예를 들어, 선택적인 돌연변이를 갖는 본래 서열의 약 5 내지 약 20개 아미노산, 약 10 내지 약 18개 아미노산, 또는 약 15 내지 약 18개 아미노산)이 키메라 단백질의 C-말단에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아실 잔기는 +1 내지 +6의 log p를 가지며, 때로는 +3 내지 +4.5의 log p 값을 갖는다. log p 값은 소수성의 척도가 되며 대개 옥탄올/물 분배 연구에서 유래 되며, 여기서 더 높은 소수성을 갖는 분자는 더 높은 빈도로 옥탄올로 분배되고 더 높은 log p 값을 갖는 특징을 보인다. log p 값은 많은 지방친화성 분자에 대해 공개되어 있으며 log p 값은 공지된 분배 과정을 이용하여 계산될 수 있다(예를 들어, 문헌(Chemical Reviews, Vol. 71, Issue 6, page 599, entry 4493)은 라우르산이 4.2의 log p 값을 갖는 것을 보여준다). 임의의 아실 잔기는 상기에 논의된 펩티드 조성물에 연결되어 공지된 방법 및 이후에 논의되는 방법을 이용하여 항균 활성에 대해 검사될 수있다. 아실 잔기는 때로는 예를 들어 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, C2-C20 알키닐, C3-C6 사이클로알킬, C1-C4 할로알킬, C4-C12 사이클로알킬알킬, 아릴, 치환된 아릴, 또는 아릴(C1-C4) 알킬이다. 임의의 아실 함유 잔기는 때로는 지방산이며, 지방산 잔기의 예는 프로필(C3), 부틸(C4), 펜틸(C5), 헥실(C6), 헵틸(C7), 옥틸(C8), 노닐(C9), 데실(C10), 운데실(C11), 라우릴(C12), 미리스틸(C14), 팔미틸(C16), 스테아릴(C18), 아라키딜(C20), 베헤닐(C22) 및 리그노세릴 잔기(C24)이고, 각 잔기는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 불포화(즉, 이중 결합)을 포함할 수 있다. 아실 잔기는 때로는 지질 분자, 예를 들어 포스파티딜 지질(예를 들어, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 에타놀알민, 포스파티닐 콜린), 스핑고지질(예를 들어, 스핑고미엘린, 스핑고신, 세라미드, 강글리오시드, 세레브로시드), 또는 이들의 변형된 형태이다. 특정 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 또는 5 또는 그 이상의 아실 잔기가 막 결합 영역에 연결된다.
본원에서 키메라 단백질은 또한 단일 통과 또는 다중 통과 막관통 서열을 포함한다(예를 들어, 키메라 단백질의 N-말단 또는 C-말단에서). 단일 통과 막관통 영역은 특정 CD 분자, 티로신 키나제 수용체, 세린/트레오닌 키나제 수용체, TGF베타, BMP, 액티빈 및 포스파타제에서 발견된다. 단일 통과 막관통 영역은 대개 약 20 내지 약 25개 아미노산의 막관통 영역 및 신호 펩티드영역을 포함하며, 이들의 다수는 소수성 아미노산이며 알파 나선 구조를 형성할 수 있다. 양하전된 아미노산의 짧은 트랙은 대개 막관통 범위 뒤에 이어져 막 내에서 단백질을 고정한다. 다중 통과 단백질은 이온 펌프, 이온 채널, 및 수송체를 포함하고, 막에 여러 차례 걸쳐 있는 2개 이상의 나선 구조를 포함한다. 모든 또는 실질적으로 모든 다중 통과 단백질은 때로는 키메라 단백질에 포함될 수 있다. 단일 통과 및 다중 통과 막관통 영역을 위한 서열은 공지되어 있으며 키메라 단백질 분자에 포함하기 위해 선택될 수 있다.
숙주 내에서 기능을 하는 임의의 막 표적화 서열이 이용될 수 있거나, 키메라 단백질의 다른 도메인 중 하나에 결합될 수도, 결합되지 않을 수도 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 서열은 미리스토일화 표적화 서열, 팔미토일화 표적화 서열, 프레닐화 서열(즉, 파르네실화, 제라닐-제라닐화, CAAX 박스), 단백질-단백질 상호작용 모티프 또는 수용체로부터의 막관통 서열(신호 펩티드를 이용함)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예는 예를 들어, 문헌(ten Klooster JP et al, Biology of Cell (2007) 99, 1-12, Vincent, S., et al., Nature Biotechnology 21:936-40, 1098 (2003))에 논의되어 있는 것이 포함한다.
다양한 막에서 단백질 보유를 증가시킬 수 있는 추가의 단백질 도메인이 존재한다. 예를 들어, ~120개 아미노산의 플렉스트린 상동성(PH:pleckstrin homology) 도메인이 전형적으로 세포 내 신호전달에 관여하는 200가지 넘는 인간 단백질에서 발견된다. PH 도메인은 막 내의 여러 포스파티딜이노시톨(PI) 지질(예를 들어 PI (3,4,5)-P3, PI (3,4)-P2, PI (4,5)-P2)에 결합할 수 있어서 다양한 막 또는 세포구획으로 단백질을 동원하는데 중요한 역할을 할 수 있다. 대개, PI 지질의 인산화 상태는 예를 들어 PI-3 키나제 또는 PTEN에 의해서 조절되며, 따라서, PH 도메인을 갖는 막의 상호작용은 아실 지질에 의한 것만큼 안정하지 않다.
AP1903 API는 알포라 리서치 인코포레이션(Alphora Research Inc)에서 제조하고, 주사용 AP1903 완제품은 AAI 파마 서비스 코포레이션(AAI Pharma Services Corp.)에서 제조된다. 이것은 비이온성 가용화제 솔부톨(Solutol) HS 15(250 mg/mL, BASF) 25% 용액 중에 5 mg/mL AP1903 용액으로 제제화된다. 실온에서, 상기 제제는 투명한 용액이다. 냉장 보관시, 상기 제제는 보관이 길어지면 가역적인 상 전이가 일어나 희부연 용액이 된다. 상기 상 전이는 실온으로 재가온 시 역전된다. 가득찬 양은 10 mL 유리 바이알 내 8 mL이다(바이알 당 전체 주사시 ~40 mg AP1903).
사용 시, AP1903은 투여 전에 실온으로 가온되고 희석될 것이다. 50 kg 초과 체중의 피험체의 경우, AP1903은 100 mL 생리 식염수 중에 40 mg 용량을 희석하고 DEHP-프리 식염수 팩을 이용하여 i.v. 주입을 통해 2시간에 걸쳐 시간당 50 mL로 투여된다. 50 kg 미만의 피험체는 0.4 mg/kg AP1903을 투여받는다.
모든 연구 약제는 2℃와 8℃ 사이의 온도에서 유지되고 과도한 빛과 열로부터 보호되며, 접근 제한된 잠금 장치된 구역에 보관된다.
AP1903을 투여하고 치료 T 세포, 예를 들어 키메라 항원-수용체 및 유도성 키메라 신호전달 분자를 발현하는 T 세포를 활성화할 필요성이 판단되는 경우, 환자는 비-DEHP, 비-에틸렌 옥시드 멸균된 주입 세트를 이용하여 2시간에 걸쳐 IV 주입을 통해 주사용 AP1903을 단일 고정 용량(0.4 mg/kg)으로 투여받을 수 있다. AP1903의 용량을 모든 환자에 개별적으로 계산하고 체중이 ≥10%로 변동되는 경우 재계산한다. 계산된 투여량을 주입전에 0.9% 생리 식염수 100 mL에 희석한다.
앞선 AP1903의 제 I상 연구에서, 24명의 건강한 지원자는 단일 용량의 주사용 AP1903을 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 및 1.0 mg/kg의 용량 수준으로 2시간에 걸쳐 IV 주입하여 치료받았다. AP1903 혈장 수준은 0.01 - 1.0 mg/kg 용량 범위에 대해 대략 10 - 1275 ng/mL 범위의 평균 Cmax 값으로 용량에 정비례하였다. 초기 주입 기간에 이어, 혈액 농도는 투여 후 0.5, 2 및 10시간에 각각 최대 농도의 약 18, 7, 및 1%로 감소된 혈장 수준으로 신속한 분배 상태를 증명하였다. 주사용 AP1903은 안전하며 모든 용량 수준에서 허용된다는 것을 보였으며 바람직한 약물동력학 프로파일을 증명하였다(Iuliucci JD, et al., J Clin Pharmacol. 41: 870-9, 2001).
사용되는 주사용 AP1903의 고정 용량은 예를 들어, 2시간에 걸쳐 정맥 주입되어 0.4 mg/kg가 될 수 있다. 세포의 효과적인 신호전달을 위해 시험관 내에서 필요한 AP1903의 양은 약 10 - 100 nM(MW: 1412 Da)이다. 이것은 14 - 140 μg/L 또는 ~0.014 - 0.14 mg/kg (1.4 - 140 μg/kg)과 같다. 투여량은 적용에 따라 달라질 수 있으며, 특정 실시예에서는 0.1-10 nM 범위 또는 50-150 nM, 10-200 nM, 75-125 nM, 100-500 nM, 100-600 nM, 100-700 nM, 100-800 nM, 또는 100-900 nM 범위를 초과할 수 있다. 최대 1 mg/kg의 용량이 상기에 기재된 AP1903 제 I상 연구에서 허용되었다.
선별 마커
특정 실시양태에서, 발현 구조물은 발현 구조물 내에 마커를 포함함으로써 시험관 내 또는 생체 내에서 발현이 확인되는 핵산 구조물을 포함한다. 이러한 마커는 세포에 인식 가능한 변화를 부여하여 발현 구조물을 포함하는 세포를 쉽게 확인하도록 할 것이다. 통상적으로, 약물 선별 마커의 포함은 클로닝에서와 형질전환체 선별에 도움을 준다. 예를 들어, 네오마이신, 푸로마이신, 히그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자는 유용한 선별 마커가 된다. 별법으로, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제(tk)와 같은 효소가 이용된다. 세포 외, 비-신호전달 도메인 또는 여러 단백질(예를 들어 CD34, CD19, LNGFR)를 포함하는 면역학적 표면 마커도 이용되어 자성 또는 형광 항체 매개된 분류를 위한 간단한 방법을 가능하게 할 수 있다. 이용되는 선별 마커는 유전자 산물을 코딩하는 핵산과 동시에 발현될 수 있기만 한다면 중요하지 않다고 생각된다. 선별 마커의 또 다른 예는, 예를 들어, GFP, EGFP, 베타-gal 또는 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT: chloramphenicol acetyltransferase)와 같은 리포터 유전자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, CD19와 같은 마커 단백질은 예를 들어 면역 자성 선별법으로 수혈을 위한 세포의 선별에 유용하다.
제어 영역
1. 프로모터
관심의 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 제어하는데 이용되는 구체적인 프로모터는 프로모터가 표적 세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수만 있다면 중요하지 않다고 생각된다. 따라서, 인간 세포가 표적이 되는 경우, 폴리뉴클레오티드 서열-코딩 영역은 예를 들어 인간 세포에서 발현될 수 있는 프로모터에 인접하거나 이의 제어하에 배치될 수 있다. 개략적으로 말하자면, 이 같은 프로모터는 인간 또는 바이러스 프로모터를 포함할 수 있다.
여러 실시양태에서, 인간 거대세포 바이러스(CMV) 전초기(immediate early) 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터, 라우스 육종바이러스 긴 말단 반복 서열, β-액틴, 랫트 인슐린 프로모터 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제가 관심의 코딩 서열을 고수준 발현하기 위해 사용될 수 있다. 발현 수준이 주어진 목적에 충분하기만 하다면, 관심의 코딩 서열을 발현하기 위하여 당 업계에 잘 알려진 기타 바이러스 또는 포유동물 세포 또는 세균 파아지 프로모터가 또한 고려된다. 잘 알려진 특성을 가진 프로모터를 이용하여, 형질감염 또는 형질전환 후 관심 단백질의 발현 수준 및 패턴을 최적화할 수 있다.
특정 생리적 또는 합성 신호에 반응하여 조절되는 프로모터의 선택은 유전자 산물의 유도성 발현을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어 전이유전자, 다중시스트론 발현 벡터가 이용될 때 전이유전자 또는 전이유전자들의 발현이 벡터가 생산되는 세포에 독성을 가지는 경우, 하나 이상의 전이유전자의 발현을 억제하거나 감소시키는 것이 바람직하다. 생산 세포주에 독성을 갖는 전이유전자의 예는 프로아폽토시스 및 사이토카인 유전자이다. 여러 유도성 프로모터 시스템은 전이유전자 산물이 독성을 가지는 바이러스 벡터 생산에 이용 가능하다(더 많은 유도성 프로모터를 추가한다).
엑디손 시스템(Invitrogen, Carlsbad, CA)이 상기 시스템 중 하나이다. 이 시스템은 포유동물에서 관심 유전자의 조절된 발현을 허용하도록 설계된다. 이것은 전이유전자의 기저 수준 발현을 사실상 전혀 허용하지 않지만, 200배가 넘는 유도성을 허용하는 엄격하게 조절되는 발현 기전으로 이루어진다. 시스템은 초파리의 헤테로이량체 엑디손 수용체를 기반으로 하며, 엑티손 또는 무리스테론 A와 같은 유사체가 수용체에 결합할 때, 수용체는 하류의 전이유전자의 발현을 시작하게 하는 프로모터를 활성화하여 높은 수준의 mRNA 전사체를 얻는다. 이 시스템에서, 헤테로이량체 수용체의 두 단량체 모두는 한 벡터로부터 구성적으로 발현되는 반면, 관심 유전자 발현을 유도하는 엑디손 반응성 프로모터는 또 다른 플라스미드에 있다. 그러므로 관심의 유전자 전달 벡터 안으로 이러한 유형의 시스템의 조작은 유용할 것이다. 이어서, 생산 세포주에서 관심 유전자 및 수용체 단량체를 포함하는 플라스미드들의 동시 형질감염은 잠재적으로 독성인 전이유전자의 발현 없이 유전자 전달 벡터의 생산을 허용할 것이다. 적당한 때에, 전이유전자의 발현은 엑디손 또는 무리스테론 A로 활성화될 수 있다.
유용할 수 있는 또 다른 유도성 시스템은 본래 문헌(Gossen and Bujard Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551, 1992; Gossen et al., Science, 268:1766-1769, 1995)에 의해 개발된 Tet-Off™ 또는 Tet-On™ 시스템(Clontech, Palo Alto, CA)이다. 이 시스템은 또한 높은 수준의 유전자 발현이 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유도체, 예를 들어 독시사이클린에 반응하여 조절되도록 한다. Tet-On™ 시스템에서, 유전자 발현은 독시사이클린이 존재하는 경우에 개시되는 한편, Tet-Off™ 시스템에서, 유전자 발현은 독시사이클린이 없는 경우에 개시된다. 이러한 시스템들은 이. 콜라이의 테트라사이클린 내성 오페론으로부터 유래된 두 개의 조절 요소, 테트라사이클린 리프레서가 결합하는 테트라사이클린 작동유전자 서열 및 테트라사이클린 리프레서 단백질에 기반한다. 관심 유전자는 그 안에 존재하는 테트라사이클린 반응성 요소를 갖는 프로모터 뒤에서 플라스미드로 클로닝된다. 두 번째 플라스미드는 Tet-Off™ 시스템에서 단순 헤르페스 바이러스의 VP16 도메인 및 야생형의 테트라사이클린 리프레서로 이루어진 테트라사이클린-제어되는 트랜스작동인자로 불리는 조절 요소를 포함한다. 따라서, 독시사이클린이 존재하지 않는 경우에, 전사는 구성적으로 개시된다. Tet-On™ 시스템에서, 테트라사이클린 리프레서는 야생형이 아니고 독시사이클린이 존재하는 경우에 전사를 활성화한다. 유전자 요법 벡터 생산을 위해, Tet-Off™ 시스템이 사용될 수 있으며 생산 세포는 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 존재하에서 성장되어 잠재적으로 독성인 전이유전자의 발현을 억제하지만, 벡터가 환자에 도입되는 경우, 유전자 발현이 구성적으로 개시될 것이다.
일부 경우에, 유전자 요법 벡터 내 전이유전자의 발현을 조절하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 활성의 세기가 다른 다양한 바이러스 프로모터는 원하는 발현 수준에 따라 이용된다. 포유동물에서, CMV 전초기 프로모터는 대개 강한 전사 활성을 제공하는데 이용된다. CMV 프로모터는 문헌(Donnelly, J.J., et al., 1997. Annu. Rev. Immunol. 15:617-48)에 검토되어 있다. 덜 강한 CMV 프로모터의 변형된 형태는 또한 전이유전자의 감소된 수준의 발현을 원하는 경우 이용되었다. 조혈세포에서 전이유전자의 발현을 원하는 경우, 레트로바이러스 프로모터, 예를 들어 MLV 또는 MMTV의 LTR이 대개 사용된다. 원하는 효과에 따라 사용되는 기타 바이러스 프로모터는 SV40, RSV LTR, HIV-1 및 HIV-2 LTR, 예를 들어 E1A, E2A, 또는 MLP 영역의 아데노바이러스 프로모터, AAV LTR, HSV-TK, 및 조류 육정 바이러스를 포함한다.
다른 예에서, 발생적으로 조절되고 특정 분화된 세포에서 활성인 프로모터가 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 프로모터는 전분화능 줄기세포에서는 활성이 없을 수 있지만, 예를 들어, 전분화능 줄기세포가 보다 성숙한 세포로 분화되면 프로모터가 활성화될 수 있다.
유사하게 조직 특이적 프로모터는 비표적 조직에 잠재적인 독성 또는 부작용을 감소시키기 위해 특정 조직 또는 세포에서 전사에 영향을 주는데 사용된다. 이러한 프로모터는 CMV 프로모터와 같은 더 강한 프로모터에 비해 감소된 발현을 일으킬 수 있지만, 보다 제한된 발현 및 면역원성을 가져올 수도 있다(Bojak, A., et al., 2002. Vaccine 20:1975-79; Cazeaux., N., et al., 2002. Vaccine 20:3322-31). 예를 들어, PSA 연관 프로모터 또는 전립선 특이적 선 칼리크레인, 또는 근육 크레아틴 키나제 유전자와 같은 조직 특이적 프로모터가 적합한 경우 사용될 수 있다.
조직 특이적 또는 분화 특이적 프로모터의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: B29(B 세포); CD14(단핵구 세포); CD43(백혈구 및 혈소판); CD45(조혈 세포); CD68(대식세포); 데스민(근육); 엘라스타제-1(췌장 외분비 세포); 엔도글린(내피세포); 피브리넥틴(분화 세포, 치유 조직); 및 Flt-1(내피세포); GFAP(성상교세포).
특정 경우에는, 유전자 요법 벡터의 투여 후 특정 시기에 전사를 활성화하는 것이 바람직하다. 이는 조절 가능한 호르몬 또는 사이토카인의 프로모터와 같은 프로모터로 수행된다. 이용될 수 있는 사이토카인 및 염증성 단백질 반응성 프로모터는 K 및 T 키니노겐(Kageyama et al., (1987) J. Biol. Chem., 262, 2345-2351), c-fos, TNF-알파, C-반응성 단백질(Arcone, et al., (1988) Nucl. Acids Res., 16(8), 3195-3207), 합토글로빈(Oliviero et al., (1987) EMBO J., 6, 1905-1912), 혈청 아밀로이드 A2, C/EBP 알파, IL-1, IL-6 (Poli and Cortese, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86,8202-8206), 보체 C3 (Wilson et al., (1990) Mol. Cell. Biol., 6181-6191), IL-8, 알파-1 산 당단백질(Prowse and Baumann, (1988) Mol Cell Biol, 8,42-51), 알파-1 항트립신, 지질단백질 리파제(Zechner et al., Mol. Cell. Biol., 2394-2401, 1988), 안지오텐시노겐(Ron, et al., (1991) Mol. Cell. Biol., 2887-2895), 피브리노겐, c-jun (포르볼 에스테르, TNF-알파, UV 조사, 레티노산, 및 과산화수소에 의한 유도성), 콜라게나제(포르볼 에스테르 및 레티노산에 의해 유도됨), 메탈로티오네인(중금속 및 글루코코르티코이드 유도성), 스트로멜리신(포르볼 에스테르, 인터류킨-1 및 EGF에 의한 유도성), 알파-2 매크로글로불린 및 알파-1 항-키모트립신을 포함한다. 기타 프로모터는, 예를 들어, SV40, MMTV, 인간 면역결핍 바이러스(MV), 몰로니바이러스, ALV, 엡스타인 바이러스, 라우스 육종바이러스, 인간 액틴, 미오신, 헤모글로빈, 및 크레아틴을 포함한다.
단독 또는 다른 프로모터와 함께, 임의의 상기 프로모터는 원하는 작용에 따라 유용할 수 있을 것으로 생각된다. 프로모터 및 기타 조절 요소는 원하는 세포 또는 조직에 기능적인 것으로 선택된다. 또한, 상기 프로모터의 열거는 총망라되었다거나 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다; 다른 프로모터가 본원에 개시된 프로모터 및 방법과 함께 사용된다.
2. 인핸서
인핸서는 동일한 DNA 분자 상에 떨어진 위치에 위치하는 프로모터로부터 전사를 증가시키는 유전적 요소이다. 앞선 예는 면역글로불린 및 T 세포 수용체와 연관된 인핸서를 포함하며, 이는 코딩 서열의 측면에 배치되고 여러 인트론 내에서 발견된다. 한다. 많은 바이러스 프로모터, 예를 들어 CMV, SV40, 및 레트로바이러스 LTR은 인핸서 활성과 밀접하게 연관되어 있으며 대개 단일 요소처럼 다뤄진다. 인핸서는 프로모터와 많이 유사하게 구성된다. 즉, 인핸서는 각각이 하나 이상의 전사 단백질에 결합하는 많은 개별 요소로 구성된다. 인핸서와 프로모터 사이의 기본적인 차이는 작동성이다. 전체로서 인핸서 영역은 떨어져서 전사를 촉진하고 대개 방향과 무관하다; 이것은 프로모터 영역 또는 이의 구성요소에는 적용되서는 안된다. 한편, 프로모터는 특정 부위에서 RNA 합성의 개시를 지시하는 하나 이상의 요소를 가지는 반면 인핸서는 상기 특이성이 없다. 프로모터와 인핸서는 대개 겹치고 인접하며, 대개 매우 유사한 모듈식의 구성을 갖는 것처럼 보인다. 인핸서의 서브세트은 전사 활성을 증가시킬 뿐 아니라, 게놈에 통합되는 경우 인접 서열로부터 전사 요소를 격리시키는 것을 도울 수 있는 유전자좌 제어 영역(LCR: Locus control region)을 포함한다. 프로모터/인핸서 조합(진핵생물 프로모터 데이터 베이스 EPDB에 따라)이 유전자 발현을 유도하는데 사용될 수 있지만, 다수가 특정 세포 유형 또는 조직의 서브세트에 발현을 제한할 수 있다(예를 들어, 문헌(Kutzler, M.A., and Weiner, D.B., 2008. Nature Reviews Genetics 9:776-88)에 검토됨). 예로는 인간 액틴, 미오신, 헤모글로빈, 근육 크레아틴 키나제로부터의 인핸서, 및 바이러스 CMV, RSV, 및 EBV로부터의 인핸서를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 인핸서는 구체적인 적용에 따라 선택될 수 있다. 진핵 세포는 적합한 세균 폴리머라제가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가의 유전자 발현 구조물로서 제공되는 경우 특정 세균 프로모터로부터 세포질 전사를 지원할 수 있다.
3. 폴리아데닐화 신호
cDNA 삽입체가 이용되는 경우, 전형적으로 유전자 전사체의 적합한 폴리아데닐화에 효과를 주는 폴리아데닐화 신호를 포함하기를 원할 것이다. 폴리아데닐화 신호의 특성은 본 방법의 성공적인 실시에 중요하지 않을 것으로 생각되며, 이 같은 임의의 서열 예를 들어 인간 또는 소 성장 호르몬 및 SV40 폴리아데닐화 신호 및 LTR 폴리아데닐화 신호가 이용된다. 비제한적인 한 예는 pCEP3 플라스미드(Invitrogen, Carlsbad, California) 내 존재하는 SV40 폴리아데닐화 신호이다. 또한, 종결 인자는 발현 카세트의 요소로서 고려된다. 이들 요소는 정보 수준을 향상시키고 카세트로부터 다른 서열로 번역초과(read through)를 최소화하는 역할을 할 수 있다. 종결 또는 폴리(A) 신호 서열은, 예를 들어, mRNA의 3'말단에서 보존되는 서열(AAUAAA)로부터 하류 약 11-30 뉴클레오티드에 위치될 수 있다 (Montgomery, D.L., et al., 1993. DNA Cell Biol. 12:777-83; Kutzler, M.A., and Weiner, D.B., 2008. Nature Rev. Gen. 9:776-88).
4. 개시 신호 및 내부 리보솜 결합 부위
코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 또한 요구될 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열을 포함한다. ATG를 개시 코돈을 포함한 외인성 번역 제어 신호가 제공될 필요가 있을 수도 있다. 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 인프레임으로 배치된다. 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 또는 합성일 수 있다. 발현 효율은 적합한 전사 인핸서 요소를 포함함으로써 향상될 수 있다.
특정 실시양태에서 내부 리보솜 유입점(IRES: internal ribosome entry site) 요소를 이용하여 다중 유전자, 또는 폴리시스트론 정보를 생성한다. IRES 요소는 5' 메틸화된 캡 의존성 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고 내부 위치에서 번역을 시작할 수 있다(Pelletier and Sonenberg, Nature, 334:320-325, 1988). 피코르나바이러스 패밀리의 두 일원(소아마비 및 뇌심근염 바이러스)의 IRES 요소(Pelletier and Sonenberg, 1988), 및 포유동물 정보로부터 IRES(Macejak and Sarnow, Nature, 353:90-94, 1991)가 논의되었다. IRES 요소는 이종의 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 다중의 오픈 리딩 프레임이 함께 전사될 수 있고, 각각은 IRES로 분리되어 폴리스시트론 정보를 생성할 수 있다. IRES 요소에 의해, 각각의 오픈 리딩 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근된다. 다수의 유전자가 단일 정보를 전사하는 단일 프로모터/인핸서를 이용하여 효율적으로 발현될 수 있다(각각이 본원에서 참고에 포함되는 미국 특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호 참조).
서열 최적화
단백질 생산은 또한 전이유전자 내 코돈을 최적화함으로써 증가될 수 있다. 종 특이적 코돈 변화는 단백질 생산을 증가시키는데 이용될 수 있다. 또한, 코돈은 결과적으로 더 효율적 번역을 유발할 수 있는 최적화된 RNA를 생산하도록 최적화될 수 있다. RNA에 포함되는 코돈을 최적화함으로써 불안전성을 일으키는 2차 구조를 유도하는 것, 예를 들어 리보솜 결합을 억제할 수 있는 2차 mRNA 구조, 또는 mRNA의 핵 유출을 억제할 수 있는 잠재(cryptic) 서열과 같은 요소는 제거될 수 있다(Kutzler, M.A., and Weiner, D.B., 2008. Nature Rev. Gen. 9:776-88; Yan., J. et al., 2007. Mol. Ther. 15:411-21; Cheung, Y.K., et al., 2004. Vaccine 23:629-38; Narum., D.L., et al., 2001. 69:7250-55; Yadava, A., and Ockenhouse, C.F., 2003. Infect. Immun. 71:4962-69; Smith., J.M., et al., 2004. AIDS Res. Hum. Retroviruses 20:1335-47; Zhou, W., et al., 2002. Vet. Microbiol. 88:127-51; Wu, X., et al., 2004. Biochem. Biophys. Res. Commun. 313:89-96; Zhang, W., et al., 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 349:69-78; Deml, L.A., et al., 2001. J. Virol. 75:1099-11001; Schneider, R. M., et al., 1997. J. Virol. 71:4892-4903; Wang, S.D., et al., 2006. Vaccine 24:4531-40; zur Megede, J., et al., 2000. J. Virol. 74:2628-2635). 예를 들어, FBP12 또는 다른 다량체화 영역 폴리펩티드, 공자극 폴리펩티드 세포질 신호전달 영역, 및 CD19 서열은 코돈의 변화에 의해 최적화될 수 있다.
리더 서열
리더 서열은 mRNA의 안정성을 향상시켜 더 효율적인 번역을 유도하기 위해 첨가될 수 있다. 리더 서열은 mRNA를 소포체로 표적화하는데 관련된다. 예로는 자신의 절단을 지연하는 HIV-1 엔벨로프 당단백질(Env)의 신호 서열, 및 IgE 유전자 리더 서열을 포함한다(Kutzler, M.A., and Weiner, D.B., 2008. Nature Rev. Gen. 9:776-88; Li, V., et al., 2000. Virology 272:417-28; Xu, Z.L., et al. 2001. Gene 272:149-56; Malin, A.S., et al., 2000. Microbes Infect. 2:1677-85; Kutzler, M.A., et al., 2005. J. Immunol. 175:112-125; Yang., J.S., et al., 2002. Emerg. Infect. Dis. 8:1379-84; Kumar., S., et al., 2006. DNA Cell Biol. 25:383-92; Wang, S., et al., 2006. Vaccine 24:4531-40). IgE 리더 서열은 소포체로 삽입을 향상시키는데 사용될 수 있다(Tepler, I, et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:5912).
전이유전자의 발현은 발현을 최적화하는 적합한 방법의 선택에 의해 최적화되고/거나 제어될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 프로모터, 전달 방법 및 유전사 서열을 최적화하는 단계를 포함한다(예를 들어, 문헌(Laddy, D.J., et al., 2008. PLoS.ONE 3 e2517; Kutzler, M.A., and Weiner, D.B., 2008. Nature Rev. Gen. 9:776-88)에 제시됨).
핵산
본원에서 사용되는 "핵산"은 일반적으로 핵염기를 포함하는 DNA, RNA 또는 이의 유도체 또는 유사체의 분자(하나, 둘 또는 그 이상의 가닥)을 나타낸다. 핵염기는 예를 들어, DNA 또는 RNA 에서 발견되는 자연 발생 퓨린 또는 피리미딘 염기(예를 들어, DNA 경우 아데닌 "A," 구아닌 "G," 티민 "T" 또는 시토신 "C")(예를 들어, RNA 경우 A, G, 우라실 "U" 또는 C)를 포함한다. 용어 "핵산"은 각각이 "핵산"의 아속(subgenus)인 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"를 포함한다. 핵산은 길이가 최소한, 최대한, 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 또는 1000개 뉴클레오티드, 또는 그 안에서 추론할 수 있는 임의의 범위일 수 있다.
본원에서 제공되는 핵산은 또 다른 핵산과 동일성 또는 상보성의 영역을 가질 수 있다. 상보성 또는 동일성의 영역은 최소한 5개의 인접한 잔기일 수 있다고 생각되며, 그래도 영역은 구체적으로는 최소한, 최대한, 또는 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 또는 1000개의 인접한 뉴클레오티드라고 생각된다.
본원에서 사용되는 "혼성화", "혼성화하다" 또는 "혼성화할 수 있는"은 이중 또는 삼중 가닥 분자 또는 부분적인 이중 또는 삼중 가닥 특성을 갖는 분자를 형성하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 용어 "어닐링하다"는 "혼성화하다"와 동의어이다. 용어는 "혼성화", "혼성화하다" 또는 "혼성화할 수 있는"은 용어 "엄격한 조건" 또는 "높은 엄격성" 또는 "낮은 엄격성" 및 "낮은 엄격성 조건"을 포함한다.
본원에서 사용되는 "엄격한 조건(들)" 또는 "높은 엄격성"은 상보적인 서열(들)을 포함하는 하나 이상의 핵산 사슬(들) 사이 또는 내에서 혼성화를 허용하지만, 임의 서열의 혼성화는 못하게 하는 조건이다. 엄격한 조건이 존재하는 경우 핵산과 표적 가닥 사이에 불일치를 거의 허용하지 않는다. 이러한 조건은 공지되어 있으며, 대개 높은 선택성을 요구하는 적용에 사용된다. 비제한적인 적용은 유전자 또는 이의 핵산 분절과 같은 핵산의 단리, 또는 적어도 하나의 특이적 mRNA 전사체 또는 이의 핵산 분절의 검출 등을 포함한다.
엄격한 조건은 예를 들어 약 0.02 M 내지 약 0.5 M NaCl, 약 42℃ 내지 약 70℃에 의해 제공되는 저염 및/또는 고온 조건을 포함할 수 있다. 원하는 엄격성의 온도 및 이온 세기는 특정 핵산(들)의 길이, 표적 서열(들)의 길이 및 핵염기 함량, 핵산(들)의 전하 조성, 및 혼성화 혼합물 내에 포름아미드, 염화테트라메틸암모늄, 또는 다른 용매(들)의 존재 또는 농도에 의해 부분적으로 결정되는 것으로 이해된다.
혼성화를 위한 이러한 범위, 조성 및 조건은 비제한적인 예로서만 언급되는 것이며, 구체적인 혼성화 반응을 위한 바람직한 엄격성은 하나 이상의 양성 또는 음성 대조군과 비교하여 대개 실험적으로 결정된다는 것으로 이해된다. 계획하는 적용에 따라, 혼성화 조건의 변화는 표적 서열에 대한 핵산의 선택성의 정도를 변화시키는데 이용될 수 있다. 비제한적인 예에서, 엄격한 조건하에서 핵산에 혼성화하지 않는 관련된 표적 핵산은 저온 및/또는 높은 이온 세기에서 혼성화에 의해 확인 또는 단리될 수 있다. 이러한 조건을 "낮은 엄격성" 또는 "낮은 엄격성 조건"이라고 부르며, 낮은 엄격성의 비제한적인 예는 약 0.15 M 내지 약 0.9 M NaCl, 약 20℃ 내지 약 50 ℃의 온도 범위에서 수행되는 혼성화를 포함한다. 낮은 또는 높은 엄격성 조건은 구체적인 적용에 맞추어 추가로 변경될 수 있다.
"기능 보존 변이체"는 단백질 또는 효소의 전체적인 입체구조 및 기능을 변경하기 않으면서 주어진 아미노산 잔기가 변화된 단백질 또는 효소이다. 상기 변화는 극성 또는 비극성 특성, 크기, 모양 및 전하를 포함한 유사한 특성을 갖는 아미노산의 대체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 보편적으로 공지된 비유전적으로 코딩되는 많은 아미노산의 보존적 아미노산 치환은 당 업계에 잘 알려져 있다. 기타 비코딩되는 아미노산을 위한 보존적 치환은 유전적으로 코딩된 아미노산의 특성과 비교하여 이들의 물리적 특성을 기초로 하여 결정될 수 있다.
보존되는 것으로 나타낸 것 외의 아미노산이 단백질 또는 효소에서 달라질 수 있어서, 유사한 기능의 두 단백질 사이에 백분율의 단백질 또는, 아미노산 서열 유사성이 달라질 수 있고 예를 들어, 정렬 체계에 따라 결정되는 바에 따라, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이 될 수 있다. 본원에서 나타내는 "서열 유사성"은 뉴클레오티드 또는 단백질 서열이 연관된 정도를 의미한다. 두 서열 사이의 유사성 정도는 백분율의 서열 동일성 및/또는 보존성을 기본으로 할 수 있다. 본원에서 "서열 동일성"은 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 변함없는 정도를 의미한다. "서열 정렬"은 유사성의 정도를 평가하기 위해 최대 수준의 동일성(아미노산 서열의 경우, 보존성)을 이루도록 2개 이상의 서열을 일렬로 배열하는 과정을 의미한다. 서열을 정렬하고 유사성/동일성을 평가하는 많은 방법은 예를 들어 유사성이 MEGALIGN 알고리즘, 및 BLASTN, BLASTP, 및 FASTA를 기반으로 하는 클러스터 방법과 같이 당 업계에 공지되어 있다. 상기 프로그램을 이용하는 경우, 바람직한 설정이 최고의 서열 유사성을 결과로 가져오는 방법이다.
핵산 변형
하기에 논의되는 어떤 변형이든 핵산에 적용될 수 있다. 변형의 예는 RNA 또는 DNA 골격, 당 또는 염기, 및 이들의 여러 가지 조합의 변경을 포함한다. 핵산 내 골격 결합, 당 및/염기의 임의의 적당한 개수가 변형될 수 있다(예를 들어, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%까지 관계없이). 변형되지 않은 뉴클레오시드는 염기 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 또는 베타-D-리보푸라노스의 1' 탄소에 연결된 우라실 중 어느 하나이다.
변형된 염기는 1' 위치에서 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실 이외의 뉴클레오티드 염기이다. 변형된 염기의 비제한적인 예는 이노신, 퓨린, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 슈도우라실, 2, 4, 6-트리메톡시 벤젠, 3-메틸 우라실, 디히드로유리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬시스티딘(예를 들어, 5-메틸시스티딘), 5-알킬유리딘(예를 들어, 리보티미딘), 5-할로유리딘(예를 들어, 5-브로모유리딘) 또는 6-아자피리미딘 또는 6-알킬피리미딘(예를 들어, 6-메틸유리딘), 프로핀 등을 포함한다. 변형된 염기의 다른 비제한적 예는 니트로피롤릴(예를 들어, 3-니트로피롤릴), 니트로인돌릴(예를 들어, 4-, 5-, 6-니트로인돌릴), 히포잔티닐, 이소이노시닐, 2-아자-이노시닐, 7-데아자-이노시닐, 니트로이미다졸릴, 니트로피라졸릴, 니트로벤즈이미다졸릴, 니트로인다졸릴, 아미노인돌릴, 피롤로피리미디닐, 디플루오로톨릴, 4-플루오로-6-메틸벤즈이미다졸, 4-메틸벤즈이미다졸, 3-메틸 이소카보스티릴릴, 5-메틸 이소카보스티릴릴, 3-메틸-7-프로피닐 이소카보스티릴릴, 7-아자인돌릴, 6-메틸-7-아자인돌릴, 이미디조피리디닐, 9-메틸-이미디조피리디닐, 피롤로피리지닐, 이소카보스티릴릴, 7-프로피닐 이소카보스티릴릴, 프로피닐-7-아자인돌릴, 2,4,5-트리메틸페닐, 4-메틸인돌릴, 4,6-디메틸인돌릴, 페닐, 나프탈레닐, 안트라세닐, 페난트라세닐, 피레닐, 스틸베닐, 테트라세닐, 펜타세닐 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 핵산은 인산 골격의 변형을 갖는 변형된 핵산 분자를 포함할 수 있다. 골격 변형의 비제한적인 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 모르폴리노, 아미데이트 카바메이트, 카복시메틸, 아세트아미데이트, 폴리아미드, 술포네이트, 술폰아미드, 술파메이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈, 및/또는 알킬실릴 변형을 포함한다. 어떤 경우에는, 뉴클레오시드에서 자연적으로 발생하는 리보스 당 잔기가 헥소스 당, 폴리시클릭 헤테로알킬 고리, 또는 사이클로헥세닐 기로 치환된다. 어떤 경우에는, 헥소스 당인 알로스, 알트로스, 글루코스, 만노스, 글로스, 이도스, 갈락토스, 탈로스, 또는 이들의 유도체이다. 헥소스는 D-헥소스, 글루코스, 또는 만노스일 수 있다. 어떤 경우에는, 폴리시클릭 헤테로알킬 기가 고리 내에 하나의 산소 원자를 포함하는 비시클릭 고리일 수 있다. 어떤 경우에는, 폴리시클릭 헤테로알킬 기는 비사이클로[2.2.1]헵탄, 비사이클로[3.2.1]옥탄, 또는 비사이클로[3.3.1]노난이다.
니트로피롤릴 및 니트로인돌릴 핵염기는 보편적 염기로 공지된 화합물류의 일원이다. 보편적 염기는 용융 양상 또는 올리고뉴클레오티드 이중체의 활성에는 실질적으로 영향을 주지 않으면서 4가지의 자연 발생 염기 중의 하나를 대체할 수 있는 화합물이다. 자연 발생 핵염기와 연관된 안정한 수소 결합 상호작용에 비해, 3-니트로피롤릴 핵염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 이중체는 적층 상호작용에 의해서만 안정될 수 있다. 니트로피롤릴 핵염기와 중요한 수소 결합 상호작용의 부재는 특이적 상보성 염기에 대한 특이성을 없앤다. 또한, 4-, 5- 및 6-니트로인돌릴은 4가지 천연 염기에 대해 특이성을 거의 나타내지 않는다. 1-(2'-O-메틸-베타-D-리보푸라노실)-5-니트로인돌의 제조과정은 문헌(Gaubert, G.; Wengel, J. Tetrahedron Letters 2004, 45, 5629)에서 논의된다. 다른 보편적인 염기는 히포잔티닐, 이소이노시닐, 2-아자-이노시닐, 7-데아자-이노시닐, 니트로이미다졸릴, 니트로피라졸릴, 니트로벤즈이미다졸릴, 니트로인다졸릴, 아미노인돌릴, 피롤로피리미디닐, 및 이들의 구조적 유도체를 포함한다.
디플루오로톨릴은 보편적 염기로서 기능을 하는 비천연 핵염기이다. 디플루오로톨릴은 천연 핵염기 티민의 등배전자체이다. 그러나, 티미딘과 다르게, 디플루오로톨릴은 어떤 천연 염기에 대해 주목할 만한 선택성을 보이지 않는다. 보편적 염기로서 기능을 하는 기타 방향성 화합물은 4-플루오로-6-메틸벤즈이미다졸 및 4-메틸벤즈이미다졸이다. 또한, 상대적으로 소수성인 이소카보스티릴릴 유도체 3-메틸이소카보스티릴릴, 5-메틸 이소카보스티릴릴, 및 3-메틸-7-프로피닐 이소카보스티릴릴은 천연 염기만을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열에 비해 올리고뉴클레오티드 이중체에 약한 불안정성을 유발하는 보편적 염기이다. 기타 비천연 핵염기는 7-아자인돌릴, 6-메틸-7-아자인돌릴, 이미디조피리디닐, 9-메틸-이미디조피리디닐, 피롤로피리지닐, 이소카보스티릴릴, 7-프로피닐 이소카보스티릴릴, 프로피닐-7-아자인돌릴, 2,4,5-트리메틸페닐, 4-메틸인돌릴, 4,6-디메틸인돌릴, 페닐, 나프탈레닐, 안트라세닐, 페난트라세닐, 피레닐, 스틸베닐, 테트라세닐, 펜타세닐, 및 이들의 구조적 유도체를 포함한다. 디플루오로톨릴, 4-플루오로-6-메틸벤즈이미다졸, 4-메틸벤즈이미다졸, 및 상기에 언급된 비천연 염기의 합성 과정을 포함한 더 상세한 논의는 문헌(Schweitzer et al., J. Org. Chem., 59:7238-7242 (1994))을 참조한다.
또한, 화학 치환체, 예를 들어 가교제를 사용하여 반응에 안정성 또는 가역성을 추가로 더할 수 있다. 가교제의 비제한적인 예는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙시니미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살릴실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙시니미딜프로피오네이트)와 같은 디숙시니미딜 에스테르를 포함하는 호모이작용기 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이작용기 말레이미드, 및 메틸-3-([p-아지도페닐) 디티오프로피오이미데이트와 같은 제제를 포함한다.
뉴클레오티드 유사체는 또한 "잠금(locked)" 핵산을 포함할 수 있다. 특정 조성물을 사용하여 내인성 핵산을 특정 구조 안으로 필수적으로 "고정(anchor)"하거나 "잠금(locked)"할 수 있다. 고정 서열은 핵산 복합체의 해리를 방지하는 역할을 하므로, 복제를 방지할 수 있을 뿐 아니라 내인성 서열의 표지, 변형 및/또는 클로닝을 가능하게 할 수 있다. 잠금 구조는 유전자 발현(즉, 전사 또는 복제를 억제하거나 상승시킴)을 조절할 수 있거나, 내인성 핵산 서열을 표지하거나 그외 변형하는데 사용될 수 있는 안정한 구조로서 이용될 수 있거나, 내인성 서열의 단리, 즉 클로닝에 사용될 수 있다.
핵산 분자는 RNA 또는 DNA 만을 포함하는 분자에 제한될 필요는 없지만, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드를 더 포함한다. 비-뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드의 비율은 1% 내지 100%(예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95%)가 될 수 있다.
핵산 제조
일부 실시양태에서, 핵산은 예를 들어 분석, 또는 치료에 있어 대조군 또는 표준으로 사용하기 위해 제공된다. 핵산은 예를 들어, 화학적 합성, 효소적 생산 또는 생물학적 생산과 같이 당 업계에 공지된 임의의 기술에 의해 만들어질 수 있다. 핵산은 생물학적 시료로부터 회수 또는 단리될 수 있다. 핵산은 재조합일 수 있거나 세포에 천연 또는 내인성(세포의 게놈으로부터 생산된)일 수 있다. 생물학적 시료는 작은 핵산 분자의 회수율을 향상시키기 위한 방법으로 처리될 수 있다. 일반적으로, 방법은 구아니디늄 및 계면활성제를 포함하는 용액으로 세포를 용해하는 단계를 수반할 수 있다.
핵산 합성은 또한 표준 방법에 따라 수행될 수 있다. 합성 핵산(예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드)의 비제한적인 예는 포스포트리에스테르, 아인산염, 포스포라미디트 화학 및 고체상 기술을 이용하거나 데옥시뉴클레오시드 H-포스포네이트 중간물질을 통한 시험관 내 화학 합성에 의해 만들어진 핵산을 포함한다. 올리고뉴클레오티드 합성의 여러 다양한 기전은 다른 곳에서 개시되었다
핵산은 공지된 기술을 이용하여 단리될 수 있다. 특정 실시양태에서, 작은 핵산 분자의 단리 방법 및/또는 RNA 분자 단리 방법이 이용될 수 있다. 크로마토그래피는 단백질로부터 또는 다른 핵산으로부터 핵산을 분리하거나 단리하는데 이용되는 과정이다. 이 방법은 겔 매트릭스를 이용한 전기영동, 여과 컬럼, 알코올 침전 및/또는 기타 크로마토그래피를 수반할 수 있다. 세포로부터 핵산이 사용되거나 평가되는 경우, 방법은 일반적으로 특정 RNA군을 단리하는 과정을 이용하기 전에 변성제(예를 들어, 구아니디늄 이소티오시아네이트) 및/또는 계면활성제(예를 들어, N-라우로일 사르코신)으로 세포를 용해하는 단계를 수반한다.
방법은 핵산을 단리하는데 유기 용매 및/또는 알코올의 사용을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 용해물에 첨가되는 알코올의 양은 약 55% 내지 60%의 알코올 농도에 이른다. 다양한 알코올이 이용될 수 있으나, 에탄올이 잘 작용한다. 고상 지지체는 어떤 구조든 될 수 있고, 비드, 필터 및 컬럼을 포함하며, 음전하기를 갖는 미네랄 또는 중합체 지지체를 포함할 수 있다. 유리 섬유 필터 또는 컬럼이 상기 단리 과정에 효과적이다.
핵산 단리 과정은 때로는 다음 단계를 포함한다: a) 구아니디늄을 포함하는 용해액으로 시료 내 세포를 용해하는 단계, 여기서 적어도 약 1 M 구아니디늄의 농도를 갖는 용해액이 생성된다; b) 페놀을 포함하는 추출액으로 핵산분자를 용해액으로부터 추출하는 단계; c) 용해액/알코올 혼합물을 형성하기 위해 용해액에 알코올 용액을 첨가하는 단계, 여기서 혼합물 내의 알코올의 농도는 약 35% 내지 약 70% 사이이다.; d) 용해액/알코올 혼합물을 고상 지지체에 적용하는 단계; e) 이온액으로 고상 지지체로부터 핵산 분자를 용리하는 단계; 및 f) 핵산 분자를 수집하는 단계. 시료는 건조되거나 다음 조작에 적합한 액체와 부피로 재현탁될 수 있다.
유전자 전달 방법
세포에서 전이유전자의 발현 효과를 매개하기 위하여, 발현 구조물을 세포로 전달하는 것이 필요할 것이다. 이러한 전달은 유전자 전달의 바이러스 또는 비바이러스 방법을 이용할 수 있다. 이 부분은 유전자 전달의 방법 및 조성물에 대해 논의한다. 발현 벡터를 포함하는 형질전환된 세포는 세포에 발현 벡터를 도입함으로써 생성된다. 통용되는 방법으로 사용되는 세포 소기관, 세포, 조직 또는 생물체의 형질전환을 위해 적합한 폴리뉴클레오티드 전달 방법은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA)가 세포 소기관, 세포, 조직 또는 생물체에 도입될 수 있는 사실상 모든 방법을 포함한다.
숙주 세포는 벡터를 위한 수용체로서 사용될 수 있고, 사용되어 왔다. 숙주 세포는 원하는 결과가 벡터의 복제 또는 벡터-코딩되는 폴리뉴클레오티드 서열의 일부분 또는 전체의 발현인지에 따라 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유래될 수 있다. 수많은 세포주 및 배양물이 숙주 세포로서 사용 가능하고, 이들은 생존 배양물 및 유전 물질의 기록 보관소로서 역할을 하는 조직인 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC:American Type Culture Collection, Rockville, MD))을 통해 얻을 수 있다.
적합한 숙주가 결정될 수 있다. 일반적으로, 이는 벡터 골격 및 원하는 결과를 기초로 한다. 플라스미드 또는 코스미드는, 예를 들어, 많은 벡터의 복제를 위해 원핵생물 숙주 세포에 도입될 수 있다. 벡터 복제 및/또는 발현을 위한 숙주 세포로 사용되는 세균 세포는 DH5알파, JM109, 및 KC8 뿐 아니라, 슈어® 컴피턴트 셀(SURE® Competent Cell) 및 솔로팩 골드 셀(SOLOPACK Gold Cells)(STRATAGENE®, La Jolla, CA)과 같이 시판되는 많은 세균 숙주를 포함한다. 별법으로, 이. 콜라이 LE392와 같은 세균 세포는 파아지 바이러스를 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 숙주 세포로서 사용될 수 있는 진핵 세포는 효모, 곤충 및 포유동물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 벡터의 복제 및/또는 발현을 위한 포유동물 진핵 숙주 세포의 예는 HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, COS, CHO, Saos, 및 PC12를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 효모 균주의 예는 YPH499, YPH500 및 YPH501을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
핵산 백신은 예를 들어, 비바이러스 DNA 벡터, "네이키드(naked)" DNA 및 RNA, 및 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 상기 백신으로 세포를 형질전환하는 방법, 및 상기 백신에 포함된 유전자 발현을 최적화하는 방법은 공지되어 있고 본원에서 논의된다.
핵산 또는 바이러스 벡터 전달 방법의 예
임의의 적합한 방법을 이용하여 세포, 예를 들어, T 세포를 형질감염 또는 형질전환하거나, 본 발명의 방법의 뉴클레오티드 서열 또는 조성물을 투여할 수 있다. 특정 실시예는 본원에서 제시되며, 양이온 중합체, 지질 유사 분자, 및 특정 제품, 예를 들어, IN-VIVO-JET PEI을 이용한 전달과 같은 방법을 더 포함한다.
1. 생체 외 형질전환
생물체로부터 제거된 혈관 세포 및 조직을 생체 외 환경에서 형질감염시키는데 여러 가지 방법이 이용된다. 예를 들어, 개 내피세포를 시험관 내 레트로바이러스 유전자 전달에 의해 유전적으로 변경하여 개에 이식하였다(Wilson et al., Science, 244:1344-1346, 1989). 또 다른 예에서, 유카탄(Yucatan) 미니돼지 내피세포를 레트로바이러스로 시험관 내에서 형질감염시키고 이중 풍선 카테터를 이용하여 동맥에 이식하였다(Nabel et al., Science, 244(4910):1342-1344, 1989). 따라서, 세포 또는 조직을 제거하여 본원에서 제시된 폴리뉴클레오티드를 이용하여 생체 외에서 형질감염 시킬 수 있다고 생각된다. 특정 측면에서, 이식된 세포 또는 조직은 생물체에 배치될 수 있다. 동물의 수지상세포를 예를 들어, 발현 벡터로 세포를 형질감염한 후 형질감염 또는 형질전환된 세포를 동물에 다시 투여한다.
2. 주입
특정 실시양태에서, 항원 제시 세포 또는 핵산 또는 바이러스 벡터는 세포 소기관, 세포, 조직, 또는 생물체에 예를 들어 피하, 피내, 근육 내, 정맥 내, 전립선 내, 종양 내, 복강 내 등으로 1회 이상의 주입(즉, 바늘 주입)을 통해 전달될 수 있다. 주입 방법은, 예를 들어 식염수를 포함하는 조성물의 주입을 포함한다. 추가의 실시양태는 직접적인 미세주입에 의해 폴리뉴클레오티드의 도입을 포함한다. 사용되는 발현 벡터의 양은 항원의 특성 및 사용되는 세포 소기관, 세포, 조직 또는 생물체에 따라 달라질 것이다. 피내, 결절 내, 또는 림프관 내 주입은 DC 투여 중 가장 보편적으로 사용되는 방법의 일부이다. 피내 주입은 혈류 내로 낮은 흡수율을 보이지만 림프계로 빠른 흡수를 보이는 특징을 갖는다. 진피 내 많은 수의 랑게르한스 수지상 세포의 존재는 완전 항원 및 처리된 항원을 배출 림프절(draining lymph nodes)로 운반할 것이다. 적당한 부위 준비는 이를 정확하게 실시하기 위해 필수적이다(즉, 적당한 주사 위치를 확인하기 위해 털을 깎는다). 결절 내 주사는 항원을 림프 조직에 직접적인 전달을 가능하게 한다. 림프관 주입은 DC의 직접적인 투여를 가능하게 한다.
3. 전기천공
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 전기천공에 의해 세포 소기관, 세포, 조직 또는 생물체에 도입된다. 전기천공은 고전압 방전에 세포 및 DNA의 현탁액의 노출을 수반한다. 상기 방법의 일부 변이 형태로, 특정 세포벽 분해 효소, 예를 들어 펙틴 분해 효소를 이용하여 표적인 수용 세포가 미처리 세포에 비해 전기천공에 의한 형질전환에 더 감수성을 띠게 만든다(본원에서 참고에 포함되는 미국 특허 제5,384,253호).
전기천공을 이용하여 진핵 세포의 형질감염은 상당히 성공적이었다. 마우스 pre-B 림프구는 인간 카파 면역글로불린 유전자로 형질감염되었고(Potter et al., (1984) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81,7161-7165), 랫트 간세포는 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자(Tur-Kaspa et al., (1986) Mol. Cell Biol., 6,716-718)로 상기 방법으로 형질감염되었다.
백신 또는 eVac의 생체 내 전기천공은 간단한 주입 기술을 통해 임상적으로 이용된다. 종양 항원을 코딩하는 DNA 벡터는 환자의 피하에 주입된다. 이어서, 전극이 피하 공간에 전기 펄스를 적용하여 그곳에 국소화된 세포, 특히 상주 피부 수지상 세포가 DNA 벡터를 받아들여 코딩된 종양 항원을 발현하도록 유발한다. 계속해서 국소 감염에 의해 활성화된 이러한 종양 항원 발현 수지상 세포는 림프절로 이동하여 종양 항원을 제시하고 종양 항원 특이적 T 세포를 자극할 수 있다. 예를 들어, 그러나 제한되지 않으면서, 핵산이 전기천공에 의해 세포로 전달될 수 있는 경우 핵산의 주입 또는 임의의 다른 투여 방법 후에 전기천공을 이용하여 투여될 때 핵산은 전기천공으로 투여된다.
전기천공 방법은 예를 들어, 본원에서 그 전문으로 참고에 포함되는 문헌(Sardesai, N.Y., and Weiner, D.B., Current Opinion in Immunotherapy 23:421-9 (2011) 및 Ferraro, B. et al., Human Vaccines 7:120-127 (2011))에서 논의된다.
4. 인산칼슘
다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인산칼슘 침전을 이용하여 세포에 도입된다. 인간 KB 세포는 이 기술을 이용하여 아데노바이러스 5 DNA로 형질감염되었다(Graham and van der Eb, (1973) Virology, 52,456-467). 또한, 이 방법으로, 마우스 L(A9), 마우스 C127, CHO, CV-1, BHK, NIH3T3 및 HeLa 세포는 네오마이신 마커 유전자로 형질감염되었고(Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987), 랫트 간세포를 여러 가지 마커 유전자로 형질감염되었다(Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990).
5. DEAE -덱스트란
또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 DEAE-덱스트란, 이어서 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 세포로 전달된다. 이 방법으로, 리포터 플라스미드는 마우스 골수종 및 적백혈병 세포로 도입되었다(Gopal, T.V., Mol Cell Biol. 1985 May;5(5):1188-90).
6. 초음파처리 로딩
또 다른 실시양태는 직접적인 초음파 로딩에 의한 폴리뉴클레오티드의 도입을 포함한다. LTK-섬유모세포는 초음파처리 로딩에 의해 티미딘 키나제 유전자로 형질감염되었다(Fechheimer et al., (1987) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84,8463-8467).
7. 리포솜 매개 형질감염
또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드를 예를 들어 리포솜과 같은 지질 복합체에 넣을 수 있다. 리포솜은 인지질 이중막과 내부 수성 매질을 특징으로 하는 소포상 구조이다. 다층 리포솜은 수성 매질로 분리되는 다중 지질층을 갖는다. 이들은 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 저절로 형성된다. 지질 구성요소는 밀폐된 구조가 형성되기 전에 자가 재배열을 거치고 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용매를 가둔다(Ghosh and Bachhawat, (1991) In: Liver Diseases, Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Lignads. pp. 87-104). 리포펙타민(Lipofectamine)(Gibco BRL) 또는 수퍼펙트(Superfect)(Qiagen)와 복합체가 형성된 폴리뉴클레오티드도 고려된다.
8. 수용체 매개된 형질감염
게다가, 폴리뉴클레오티드는 수용체 매개된 전달 비히클에 의해 표적 세포에 전달될 수 있다. 이것은 표적 세포에서 발생할 수용체 매개된 엔도시토시스에 의한 거대분자의 선택적인 흡수를 이용한다. 다양한 수용체의 세포 유형 특이적인 분포를 고려할 때, 이 전달 방법은 또 다른 정도의 특이성을 추가한다. 특정 수용체 매개된 유전자 표적화 비히클은 세포 수용체 특이적 리간드와 폴리뉴클레오티드 결합제를 포함한다. 그 밖에는 전달되는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 부착된 세포 수용체 특이적 리간드를 포함한다. 여러 리간드가 기술의 실시 가능성을 확립하는 수용체 매개된 유전자 전달에 사용되어왔다(Wu and Wu, (1987) J. Biol. Chem., 262,4429-4432; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(9):3410-3414, 1990; Perales et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4086-4090, 1994; Myers, EPO 0273085). 또 다른 포유동물 세포 유형의 맥락에서 특이적 전달이 논의되었다(Wu and Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12:159-167, 1993; 본원에서 참고에 포함됨). 특정 측면에서, 리간드는 표적 세포 집단상에 특이적으로 발현되는 수용체에 대응하도록 선택된다. 다른 실시양태에서, 세포 특이적 폴리뉴클레오티드 표적화 비히클의 폴리뉴클레오티드 전달 비히클 구성요소는 리포솜과 함께 특이적 결합 리간드를 포함할 수 있다. 전달되는 폴리뉴클레오티드(들)은 리포솜 안에 보관되고 특이적 결합 리간드는 리포솜 막에 기능적으로 포함된다. 따라서, 리포솜은 표적 세포의 수용체(들)에 특이적으로 결합하여 세포에 내용물을 전달할 것이다. 이러한 시스템은 예를 들어, 상피세포 성장인자(EGF)가 세포에 폴리뉴클레오티드의 수용체 매개된 전달에 사용되어 EGF 수용체의 상향조절을 보이는 시스템을 이용하여 기능적임을 보였다.
추가의 실시양태에서, 표적화된 전달 비히클의 폴리뉴클레오티드 전달 비히클 구성요소는 예를 들어 세포 특이적 결합을 지시하는 하나 이상의 지질 또는 당단백질을 포함할 수 있는 리포솜 그 자체가 될 수 있다. 예를 들어, 락토실-세라마이드 갈락토스-말단 아시알로강글리오시드는 리포솜에 포함되어 간세포에 의한 인슐린 유전자의 흡수에 있어 증가를 보였다(Nicolau et al., (1987) Methods Enzymol., 149,157-176). 조직 특이적 형질전환 구조물은 유사한 방법으로 표적 세포에 특이적으로 전달될 수 있다고 생각된다.
9. 미립자 가속장치 충격
미립자 가속장치 충격 기술은 적어도 하나의 세포 소기관, 세포, 조직 또는 생물체에 폴리뉴클레오티드를 도입하는데 이용될 수 있다(미국 특허 제5,550,318호; 미국 특허 제5,538,880호; 미국 특허 제5,610,042호; 및 PCT 출원 94/09699호; 이들 각각은 본원에서 참고에 포함된다). 이 방법은 DNA-코팅된 미립자 가속장치를 그들이 세포막을 관통하고 세포를 사멸시키지 않으면서 세포에 들어가도록 하는 높은 속도로 가속시키는 능력에 의존한다(Klein et al., (1987) Nature, 327,70-73). 매우 다양한 미립자 가속장치 충격 기술이 당 업계에 공지되어 있으며, 그 중 많은 기술이 본 방법에 적용될 수 있다. 이러한 미립자 가속장치 충격에서, 하나 이상의 입자는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 코팅되어 추진력에 의해 세포 안으로 전달될 수 있다. 작은 입자를 가속시키기 위한 여러 장치가 개발되었다. 이러한 장치 중 하나는 고전압 방전에 의존하여 전류를 생산하고 차례로 추진력을 제공한다(Yang et al., (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 87,9568-9572). 사용되는 미립자 가속장치는 텅스텐 또는 금 입자 또는 비드와 같은 생물학적 불활성 물질로 이루어졌다. 대표적인 입자는 예를 들어 나노입자를 포함하는 텅스텐, 백금, 어떤 실시예에서는, 금으로 이루어진 것을 포함한다. 일부 경우에는 금속 입자 위에 DNA 침전이 미립자 가속장치 충격을 이용하여 수용 세포에 DNA를 전달하는데 필수적이지는 않을 것으로 생각된다. 그러나 입자는 DNA로 코팅되기보다는 DNA를 포함할 수 있는 것으로 생각된다. DNA 코팅된 입자는 입자 충격에 의해 DNA 전달 수준을 증가시킬 수 있으나, 그들 자체는 필수적이지 않다.
바이러스 벡터 매개된 전달 방법의 예
피험체 내 세포 또는 세포들이 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있도록 뉴클레오티드 서열, 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물을 세포 또는 피험체에게 투여하기에 적합한 어떤 바이러스 벡터든 본 발명에 이용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 전이유전자는 세포에 유전자 전달을 매개하는 바이러스 입자에 포함된다. 전형적으로, 바이러스는 생리 조건하에 적합한 숙주 세포에 단순히 노출되면 바이러스의 흡수를 허용할 것이다. 본 방법은 하기에 논의되는 바와 같이 다양한 바이러스 벡터를 이용하여 유리하게 사용된다.
1. 아데노바이러스
아데노바이러스는 이의 중간 크기의 DNA 게놈, 조작의 편의성, 높은 역가, 광범위한 표적 세포 범위, 및 높은 감염성으로 인해 유전자 전달 벡터로서 사용하기에 특히 적합하다. 대략 36 kb 바이러스 게놈은 바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필요한 시스 작용 요소에 포함되는 100-200 염기쌍(bp)의 역위 말단 반복서열(ITR: inverted terminal repeat)에 의해 경계를 이룬다. 상이한 전사 단위를 포함하는 게놈의 초기(E) 및 후기(L) 영역은 바이러스 DNA 복제 개시에 의해 나뉜다.
E1 영역(E1A 및 E1B)은 바이러스 게놈 및 약간의 세포 유전자의 전사 조절을 담당하는 단백질을 코딩한다. E2 영역(E2A 및 E2B)의 발현은 바이러스 DNA 복제를 위한 단백질의 합성을 일으킨다. 이들 단백질은 DNA 복제, 후기 유전자 발현, 및 숙주 세포 차단에 관여한다(Renan, M. J. (1990) Radiother Oncol., 19, 197-218). 대부분 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 후기 유전자(L1, L2, L3, L4 및 L5)는 주요 후기 프로모터(MPL; major late promoter)에 의해 생성되는 단일 1차 전사체의 중요한 프로세싱 후에만 발현된다. MLP(16.8 맵 유닛(map unit: 염색체 유전자 지도 단위)에 위치)는 감염의 후기 단계에서 특히 효율적이고, 상기 프로모터로부터 생성되는 모든 mRNA는 번역하기에 유용하게 만드는 5'의 3회 반복의 리더 서열(5' tripartite leader (TL) sequence)를 포함한다.
아데노바이러스가 유전자 요법에 최적화되도록 하기 위해서, 커다란 분절의 DNA가 포함될 수 있도록 수용력을 최대화할 필요가 있다. 또한, 특정 아데노바이러스 산물과 연관된 독성 및 면역학적 반응을 감소시키는 것이 바람직하다. 두 가지 목적은 아데노바이러스 유전자의 제거가 두가지 목적에 효과가 있다는 점에서 어느 정도 유사하다. 본 방법의 실시에 의해, 상대적으로 편리한 치료 구조물을 조작할 수 있는 능력을 유지하면서 상기 두 가지 목적을 달성할 수 있다.
바이러스 DNA 복제에 필요한 시스 요소가 모두 선형 바이러스 게놈의 양쪽 말단에 역위 말단 반복서열(ITR)(100-200 bp)에 위치하기 때문에 큰 DNA의 대체가 가능하다. ITR을 포함하는 플라스미드는 비결함의 아데노바이러스 존재하에서 복제할 수 있다(Hay, R.T., et al., J Mol Biol. 1984 Jun 5;175(4):493-510). 따라서, 아데노바이러스 벡터 내에 상기 요소의 포함은 복제를 허용할 수 있다.
또한, 바이러스 피막형성을 위한 패키징 신호는 바이러스 게놈의 왼쪽 말단 194-385 bp(0.5-1.1 맵 유닛) 사이에 위치한다(Hearing et al., J. (1987) Virol., 67, 2555-2558). 이 신호는 왼쪽 말단에 가깝지만 외가닥 말단(cohesive end) 바깥의 특이적 서열은 헤드 구조 안으로 DNA 삽입을 위해 필요한 단백질에 대한 결합을 매개하는 박테리오파지 람다 DNA에서 단백질 인식 부위와 유사하다. Ad의 E1 치환 벡터는 바이러스 게놈의 왼쪽 말단에 450 bp(0-1.25 맵 유닛) 단편이 293 세포에서 패키징을 지시할 수 있다는 것을 증명하였다(Levrero et al., Gene, 101:195-202, 1991).
이전에, 아데노바이러스 게놈의 특정 영역은 포유동물 세포의 게놈에 포함될 수 있고 유전자가 코딩됨으로써 발현될 수 있다는 것을 보였다. 이러한 세포주는 세포주에 의해 코딩되는 아데노바이러스 기능이 결여된 아데노바이러스 벡터의 복제를 지원할 수 있다. 또한, "보조" 벡터, 예를 들어 야생형 바이러스 또는 조건적 결함을 갖는 변이체에 의해 복제 결함의 아데노바이러스 벡터가 보완되었다는 보고가 있었다.
복제 결함의 아데노바이러스 벡터는 보조 바이러스에 의해 트랜스로 보완될 수 있다. 그러나 복제 기능을 제공하는데 요구되는 보조 바이러스의 존재가 제제를 오염시킬 것이기 때문에, 이 발견만으로는 복제 결합 벡터의 단리는 가능하지 않다. 따라서, 복제 결함 벡터의 복제 및/또는 패키징에 대한 특이성을 더해 줄 추가의 요소가 요구되었다. 그 요소는 아데노바이러스의 패키징 기능으로부터 유래된다.
아데노바이러스의 패키징 신호는 통상의 아데노바이러스 지도의 왼쪽 말단에 존재한다는 것이 밝혀졌다(Tibbetts et. al. (1977) 세포, 12,243-249). 이후의 연구는 게놈의 E1A(194-358 bp) 영역 내에 결실을 갖는 변이체가 초기(E1A) 기능을 보완하는 세포주에서 조차 잘 성장하지 않았다는 것을 보였다(Hearing and Shenk, (1983) J. Mol. Biol. 167,809-822). 상쇄하는 아데노바이러스 DNA(0-353 bp)가 변이체의 오른쪽 말단으로 재조합되는 경우, 바이러스는 정상적으로 패키징된다. 추가의 돌연변이 분석은 Ad5 게놈의 왼쪽 말단에 짧고 반복되는 위치 의존적 요소를 확인하였다. 반복서열의 한 카피는 게놈의 양쪽 말단에 존재하는 경우 효율적인 패키징에 충분하지만 Ad5 DNA 분자의 안쪽으로 이동되는 경우에는 그렇지 않았다(Hearing et al., J. (1987) Virol., 67, 2555-2558).
패키징 신호가 변이된 형태를 이용하여, 변화하는 효율을 갖는 패키징되는 보조 바이러스를 생성할 수 있다. 전형적으로, 돌연변이는 점돌연변이 또는 결실이다. 패키징 효율이 낮은 보조 바이러스가 보조 세포에서 배양되는 경우, 바이러스는 야생형 바이러스에 비해 감소된 속도이긴 하지만 패키징됨으로써 보조의 증식을 가능하게 한다. 하지만, 이러한 보조 바이러스가 야생형 패키징 신호를 포함하는 바이러스와 함께 세포 내에서 배양될 때, 야생형 패키징 신호가 변이 형태에 비해 우선적으로 인식된다. 패키징 인자의 양이 제한되는 경우, 야생형 신호를 포함하는 바이러스는 보조에 비해 선택적으로 패키징된다. 선호도가 충분히 큰 경우, 동질성에 접근하는 보존균주가 달성될 수 있다.
특정 조직 또는 종에 대한 ADV 구조물의 친화성을 향상시키기 위해, 수용체-결합 섬유 서열은 대개 아데노바이러스 단리체 사이에서 치환될 수 있다. 예를 들어 아데노바이러스 5에서 발견되는 콕사키-아데노바이러스 수용체(CAR) 리간드로 아데노바이러스 35의 CD46 결합 섬유 서열을 치환하여 인간 조혈 세포에 크게 향상된 결합 친화도를 갖는 바이러스를 만들 수 있다. 생성된 "슈도형" 바이러스, Ad5f35는 여러 임상적으로 개발된 바이러스 단리체의 기초가 되었다. 게다가, T 세포와 같은 표적 세포의 재표적화를 가능하도록 섬유를 변형하는 다양한 생화학적 방법이 존재한다. 방법은 양기능성 항체(CAR 리간드에 결합하는 한 말단과 표적 서열에 결합하는 한 말단을 가짐), 개별 맞춤된 아비딘-기반 키메라 리간드와 결합을 가능하게 하는 섬유의 대사적 비오틴화의 사용을 포함한다. 별법으로, 아데노바이러스 입자에 리간드(예를 들어, 헤테로양기능성 링커(예를 들어 PEG-포함)에 의해 항-CD205)를 부착할 수 있다.
2. 레트로바이러스
레트로바이러스는 역전사 과정에 의해 감염된 세포에서 자신의 RNA를 이중가닥 DNA로 전환하는 능력을 특징으로 하는 단일 가닥 RNA 바이러스 군이다(Coffin, (1990) In: Virology, ed., New York: Raven Press, pp. 1437-1500). 이어서 생성된 DNA는 프로바이러스로서 세포 염색체에 안정적으로 통합되어 바이러스 단백질의 합성을 지시한다. 통합은 결과적으로 수용 세포 및 이의 자손에서 바이러스 유전자 서열이 보유되도록 한다. 레트로바이러스 게놈은 캡시드 단백질, 폴리머라제 효소, 및 엔벨로프 구성요소를 각각 코딩하는 세 가지 유전자, gag, pol 및 env를 포함한다. psi로 불리는 gag 유전자의 상류에서 발견되는 서열은 게놈을 비리온으로 패키징하기 위한 신호로서 기능을 한다. 2개의 긴 말단 반복서열(LTR: Long terminal repeat)은 바이러스 게놈의 5'와 3' 말단에 존재한다. 이들은 강한 프로모터와 인핸서 서열을 포함하고 숙주 세포 게놈으로 통합에도 필요하다(Coffin, 1990). 따라서, 예를 들어, 본 기술은 세포를 형질도입하는데 사용되는 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈에 통합되는 세포를 포함한다.
레트로바이러스 벡터를 제작하기 위해서, 프로모터를 코딩하는 핵산을 바이러스 게놈에 특정 바이러스 서열 대신에 삽입하여 복제 결함인 바이러스를 생산한다. 비리온을 생산하기 위해서, gag, pol 및 env 유전자를 포함하나 LTR 및 psi 구성요소가 없는 패키징 세포주를 제작한다(Mann et al., (1983) Cell, 33,153-159). 레트로바이러스 LTR 및 psi 서열을 함께 인간 cDNA를 포함하는 재조합 플라스미드가 상기 세포주에 도입되면(예를 들어, 인산 칼슘 침전에 의해), psi 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자에 패키징된 후 배양 배지로 분비되도록 한다(Nicolas, J.F., and Rubenstein, J.L.R., (1988) In: Vetors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Rodriquez and Denhardt, Eds.). Nicolas and Rubenstein; Temin et al., (1986) In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188; Mann et al., 1983). 재조합 레트로바이러스를 포함하는 배지를 수집하고, 선택적으로 농축하여, 유전자 전달에 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 광범위한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나 많은 유형의 레트로바이러스의 통합 및 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다(Paskind et al., (1975) Virology, 67,242-248). 레트로바이러스 벡터를 특이적으로 표적화하도록 고안된 접근법은 최근에 바이러스 엔벨로프에 갈락토스 잔기를 화학적으로 첨가하는 레트로바이러스의 화학적 변형에 기초하여 개발되었다. 이러한 변형은 아시알로당단백질 수용체를 통해 간세포와 같은 세포의 특이적 감염을 허용할 수 있을 것이며, 이는 바람직할 수 있다.
레트로바이러스 엔벨로프 단백질 및 특이적 세포 수용체에 대한 비오틴화된 항체를 이용하는 재조합 레트로바이러스를 표적화하는 다양한 접근법이 고안되었다. 항체는 스트렙타비딘을 이용하여 비오틴 구성요소를 통해 결합되었다(Roux et al., (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86,9079-9083). 주조직적합성 복합체 I형 및 II형 항원에 대한 항체를 이용하여, 그러한 표면 항원을 가지는 다양한 인간 세포의 감염은 동종지향성 바이러스(ecotropic virus)로 시험관 내에서 증명되었다(Roux et al., 1989).
3. 아데노 연관 바이러스( Adeno -associated Virus)
AAV는 약 4700개 염기쌍의 선형의 단일 가닥 DNA를 이용한다. 역위 말단 반복서열이 게놈 측면에 위치한다. 두 개의 유전자는 게놈 내에 존재하여 다수의 상이한 유전자 산물을 생성한다. 첫째, 캡 유전자는 VP-1, VP-2 및 VP-3으로 나타내는 세 가지 상이한 비리온 단백질(VP)을 생산한다. 둘째 rep 유전자는 4개의 비구조 단백질(NS)을 코딩한다. 이들 rep 유전자 산물 중 하나 이상이 AAV 전사에 트랜스 활성화 작용에 역할을 한다. AAV 내 세 개의 프로모터는 게놈 내에 맵 유닛으로 이들의 위치로 표시된다. 이들은 왼쪽에서 오른쪽으로, p5, p19 및 p40이다. 전사는 세 개의 프로모터 각각에서 두 개가 개시되고 각 쌍 중 하나가 스플라이싱되어 6개의 전사체를 생성한다. 맵 유닛 42-46에서 유래된 스플라이스 부위는 각 전사체에 대해 동일하다. 4개의 비구조 단백질은 명백하게 더 긴 전사체로부터 유래하고 세개의 비리온 단백질 모두는 최단의 전사체에서 유래된다.
AAV는 인간에서 어떤 병리 상태와 연관되지 않는다. 흥미롭게도, 효율적인 복제를 위해, AAV는 단순 헤르페스 바이러스 I 및 II, 거대세포 바이러스, 슈도라비 바이러스 및, 물론, 아데노바이러스와 같은 바이러스로부터 "보조" 기능을 필요로 한다. 보조로 가장 특징적인 것은 아데노바이러스이고, 이 바이러스의 많은 "초기" 기능이 AAV 복제를 돕는다는 것을 보였다. AAV rep 단백질의 낮은 수준의 발현은 AAV 구조적 발현을 억제하는 것으로 생각되며, 보조 바이러스 감염은 이러한 억제를 제거하는 것으로 생각된다.
AAV 벡터의 말단 반복서열은 AVV 또는 플라스미드, 예를 들어 변형된 AAV 게놈을 포함하는 p201의 엔도뉴클레아제 분해에 의해(Samulski et al., J. Virol., 61:3096-3101 (1987)), 또는 AAV의 발표된 서열을 기초로 하여 말단 반복서열의 화학 합성 또는 효소 합성을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 방법에 의해 얻을 수 있다. 기능, 즉 안정적이고 부위 특이적 통합을 허용하는데 필요한 AAV ITR의 최소 서열 또는 일부분은 예를 들어 결실 분석에 의해 결정될 수 있다. 안정적이고 부위 특이적 통합을 지시하는 말단 반복서열의 능력을 유지하면서 허용될 수 있는 서열의 작은 변형이 또한 결정될 수 있다.
AAV-기반 벡터는 시험관 내 유전자 전달을 위해 안전하고 효과적인 비히클임이 입증되었으며 이들 벡터는 생체 외 및 생체 내 모두에서 가능한 유전자 요법에 있어 광범위한 적용을 위해 임상전 및 임상 단계에서 개발되고 시험되고 있다.(Carter and Flotte, (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci., 770; 79-90; Chatteijee, et al., (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci., 770,79-90; Ferrari et al., (1996) J. Virol., 70,3227-3234; Fisher et al., (1996) J. Virol., 70,520-532; Flotte et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90,10613-10617, (1993); Goodman et al. (1994), Blood, 84,1492-1500; Kaplitt et al., (1994) Nat'l Genet., 8,148-153; Kaplitt, M.G., et al., Ann Thorac Surg. 1996 Dec;62(6):1669-76; Kessler et al., (1996) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 93,14082-14087; Koeberl et al., (1997) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 94,1426-1431; Mizukami et al., (1996) Virology, 217,124-130).
폐에서 AAV-매개된 효율적인 유전자 전달 및 발현은 낭성 섬유종 치료에 대한 임상 시험으로 이어졌다(Carter and Flotte, 1995; Flotte et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90,10613-10617, (1993)). 유사하게, 골격근으로 디스트로핀 유전자의 AAV-매개된 유전자 전달에 의한 근이영양증의 치료, 뇌로 티로신 히드록실라제 유전자 전달에 의한 파킨슨병, 간으로 제 IX인자 유전자 전달에 의한 혈우병 B의 치료, 및 심장으로 혈관내피 성장 인자 유전자 전달에 의한 심근 경색증의 가능한 치료에 대한 전망은 상기 기관에서 AAV-매개된 전이유전자 발현이 최근 매우 효율적이라는 것을 보였기 때문에 유망한 것으로 보인다.(Fisher et al., (1996) J. Virol., 70,520-532; Flotte et al., 1993; Kaplitt et al., 1994; 1996; Koeberl et al., 1997; McCown et al., (1996) Brain Res., 713,99-107; Ping et al., (1996) Microcirculation, 3,225-228; Xiao et al., (1996) J. Virol., 70,8098-8108).
4. 기타 바이러스 벡터
기타 바이러스 벡터는 본 발명의 방법 및 조성물에서 발현 구조물로서 이용될 수 있다. 바이러스, 예를 들어 백시니아 바이러스(Ridgeway, (1988) In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, pp. 467-492; Baichwal and Sugden, (1986) In, Gene Transfer, pp. 117-148; Coupar et al., Gene, 68:1-10, 1988), 카나리 폭스바이러스, 및 헤르페스 바이러스로부터 유래된 벡터가 이용된다. 상기 바이러스는 여러 포유동물 세포로 유전자 전달에 사용되기 위한 여러 특징을 제공한다.
구조물이 세포로 전달되면, 전이유전자를 코딩하는 핵산은 상이한 위치에 배치되고 발현된다. 특정 실시양태에서, 전이유전자를 코딩하는 핵산은 세포의 게놈에 안정적으로 통합된다. 이러한 통합은 상동 재조합(유전자 대체)에 의해 동족 위치 및 방향으로 일어나거나, 임의의 비특이적 위치(유전자 증가)에 통합된다. 또 다른 실시양태에서, 핵산은 DNA의 별개의 에피솜 분절로서 세포에서 안정적으로 유지된다. 이러한 핵산 분절 또는 "에피솜"은 숙주 세포 주기와 무관하게 또는 동기화하여 유지하거나 복제하기에 충분한 서열을 코딩한다. 발현 구조물이 세포에 전달되는 방법 및 세포 내에 핵산이 남아있는 위치는 이용된 발현 구조물의 유형에 따라 결정된다.
질환의 치료 방법
본 방법은 또한 예를 들어 주입에 의해 세포의 투여가 유익할 수 있는 질환의 치료 또는 예방 방법을 포함한다.
세포, 예를 들어, T 세포, 종양 침윤 림프구, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포, 또는 전구 세포(progenitor cell), 예를 들어, 조혈 줄기세포, 중간엽 간질 세포, 줄기세포, 전분화능 줄기세포, 및 배아 줄기세포는 세포 요법에 사용될 수 있다. 세포는 공여자로부터 올 수 있거나, 환자로부터 얻어진 세포가 될 수 있다. 세포는 예를 들어, 병에 걸린 세포의 기능을 대체하는 재생에 사용될 수 있다. 세포는 또한 이종 유전자를 발현하도록 변형되어 생물학 제제가, 예를 들어, 병에 걸린 골수 또는 전이성 침착물과 같은 특정 미세 환경으로 전달될 수 있다. 중간엽 간질 세포는 또한, 예를 들어, 면역억제 활성을 제공하는데 사용될 수 있고, 이식편 vs 숙주질환 및 자가면역 장애의 치료에 사용될 수 있다. 본 출원에서 제공된 세포는 후속 세포 요법, 치료 세포의 활성이 증가 또는 감소될 필요가 있는 상황에서 매우 유익할 수 있는 안전성 스위치를 포함한다. 예를 들어, 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포가 환자에게 제공되는 경우, 어떤 상황에서는, 부작용, 예를 들어 탈표적(off-target) 독성이 있을 수 있다. 리간드의 투여를 중단하면 치료 T 세포는 비활성화 상태로 되돌아가 낮은 비독성 수준의 발현 상태가 될 것이다. 또는, 예를 들어, 치료 세포가 종양 세포, 또는 종양 크기를 감소시키는 작용을 할 수 있고, 더 이상 필요하지 않을 수 있다. 이러한 상황에서는, 리간드 투여를 중단하면 치료 세포가 더 이상 활성화되지 않을 것이다. 초기 요법 이후에 종양 세포가 되살아나거나 종양 크기가 증가하는 경우, 키메라 항원 수용체 발현 T 세포를 활성화하고 환자를 다시 치료하기 위해서 리간드는 다시 투여될 수 있다.
세포 요법에 사용되는 세포, 즉 병태 또는 질환을 치료하거나 예방하기 위해 피험체에게 투여되는 세포는 "치료 세포"를 의미한다.
접종물에 관한 것일 때 용어 "단위 용량"은 포유동물을 위한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 개별 단위를 나타내며, 원하는 희석제와 함께 원하는 면역원 자극 효과를 얻도록 계산된 예정된 양의 약학 조성물을 포함한다. 접종물의 단위 용량에 대한 구체적인 내용은 약학 조성물의 고유한 특성 및 달성될 구체적인 면역학적 효과에 의해서 영향을 받으며, 그에 따라 결정된다.
약학 조성물, 예를 들어 본원에 제시된 다량체 리간드의 유효량은 치료 세포의 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97% 초과 또는 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 또는 10% 미만이 활성화되도록 유도성 CSM 발현 T 세포를 활성화하는 상기 선택된 결과를 달성하는 양일 것이다. 용어는 또한 "충분한 양"과 동의어이다. 유효량은 또한 원하는 치료 반응, 예를 들어, 리간드 유도 인자가 투여되기 전과 비교하여 종양 크기의 감소, 종양 세포의 수준에 있어 감소, 또는 CD19 발현 백혈병 세포의 수준에 있어 감소를 달성하는 양이 될 수 있다.
구체적인 적용을 위한 유효량은 치료될 질환 또는 병태, 투여될 구체적인 조성물, 피험체의 크기, 및/또는 질환 또는 병태의 중증도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 과도한 실험 없이도 본원에 제시된 특정 조성물의 유효량은 경험적으로 결정될 수 있다.
세포, 조직, 또는 생물체에 적용되는 경우, 용어 "접촉된" 및 "노출된"은 본원에서 예를 들어 화학치료제 또는 방사선 치료제와 같은 약학 조성물 및/또는 또 다른 제제가 표적 세포, 조직 또는 생물체에 전달되거나 표적 세포, 조직 또는 생물체와 직접적인 근접 부위에 놓이는 과정을 기재하는데 사용된다. 세포 사멸 또는 정체를 달성하기 위하여, 약학 조성물 및/또는 추가 제제(들)은 세포(들)을 사멸하거나 세포가 분열하는 것을 방지하기에 효과적인 총량으로 하나 이상의 세포에 전달된다.
약학 조성물의 투여는 수분에서 수주의 범위의 간격으로 선행되거나, 동시에 진행하고/거나 뒤따를 수 있다. 약학 조성물 및 기타 제제(들)이 세포, 조직 또는 생물체에 별개로 적용되는 실시양태에서, 약학 조성물 및 제제(들)이 세포, 조직 또는 생물체에 유리한 병용 효과를 여전히 발휘할 수 있도록 하기 위해, 통상적으로는 반드시 각 전달 시간 사이에서 유의한 기간이 만료되지 않도록 해야 한다. 예를 들어, 이 경우에, 2, 3, 4 또는 그 이상의 종류의 세포, 조직 또는 생물체를 약학 조성물과 실질적으로 동시에(즉, 약 수 분 미만 내에) 접촉할 수 있을 것으로 생각된다. 또 다른 측면에서, 하나 이상의 제제는 약 1분에서 약 24시간, 약 7일, 약 1주, 약 8주, 또는 그 이상, 및 그 안에서 추론할 수 있는 어떤 범위까지 내에서 실질적으로 동시에 투여될 수 있다. 게다가, 본원에서 제시된 약학 조성물 및 하나 이상의 제제의 다양한 병용 요법이 이용될 수 있다.
최적화된 개인맞춤 치료법
리간드 유도 인자의 투여량 및 투여 일정은 치료될 질환 또는 병태의 수준을 결정함으로써 최적화될 수 있다. 예를 들어, 임의의 남아 있는 고형 종양의 크기, 또는 환자에 남아 있을 수 있는 표적화된 세포, 예를 들어 종양 세포 또는 CD19 발현 B 세포의 수준이 결정될 수 있다.
예를 들어, 환자가 초기 요법 후에 임상적으로 적절한 수준의 종양 세포 또는 고형 종양을 가진다는 것을 결정하는 단계는 다량체 리간드를 투여하여 세포를 활성화시킴으로써 키메라-항원 수용체를 발현하는 T 세포를 활성화시킬 필요가 있을 수 있다는 지시를 임상의에게 제공한다. 또 다른 실시예에서, 환자가 다량체 리간드로 치료 후 종양 세포 수준이 감소되거나 종양 크기의 감소되었다는 것을 결정하는 단계는 추가 용량의 다량체 리간드가 필요하지 않다는 것을 임상의에게 보여줄 수 있다. 유사하게, 다량체 리간드 치료 후에, 환자가 질환 또는 병태 증상을 계속해서 보인다거나 증상이 재발된다는 것을 결정하는 단계는 최소한 1회의 추가 용량의 다량체 리간드를 투여할 필요가 있을 수 있다는 것을 임상의에게 나타낼 수 있다. 용어 "투여량"은 투여되는 양 및 투여 빈도, 예를 들어 다음 투여 시기를 포함하여 의미한다. 용어 "투여 수준"은 피험체의 체중에 대해 투여되는 다량체 리간드의 양을 나타낸다. 따라서, 투여 수준의 증가는 피험체 체중에 비해 투여되는 리간드의 양의 증가를 의미한다. 또한, 예를 들어 연속 주입 펌프를 이용하여 다량체 리간드가 투여되는 경우 투여되는 용량의 농도의 증가는 분당, 또는 초당 투여되는 농도(따라서 투여되는 양)가 증가되는 것을 의미할 것이다.
따라서, 예를 들어, 특정 실시양태에서, 방법은 다량체 리간드의 투여 후 종양 크기 및/또는 종양 세포 수에 비해 피험체에서 종양 크기 증가 및/또는 종양 세포 수의 증가가 있는지 없는지를 판단하는 단계, 및 종양 크기 증가 및/또는 종양 세포 수의 증가가 있다고 판단되는 경우 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 방법은 또한 예를 들어 다량체 리간드의 투여 후 CD19 발현 B 세포의 수준에 비해 피험체에서 CD19 발현 B 세포에 있어 증가가 있는지 없는지를 판단하는 단계, 및 피험체에서 CD19 발현 B 세포의 증가가 있다고 판단되는 경우 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 실시양태에서, 예를 들어, 환자는 본원에서 제공된 방법에 따라 치료 세포 및 리간드로 치료받는다. 초기 치료 후에, 종양의 크기, 종양 세포 수, 또는 CD19 발현 B 세포의 수는, 예를 들어, 초기 치료 전에 비해 감소할 수 있다. 상기 초기 치료 후 특정 시간에, 환자는 다시 검사받거나, 환자는 질환 증상에 대해 계속적으로 모니터받을 수 있다. 종양의 크기, 종양 세포의 수, 또는 CD19 발현 B 세포의 수가, 예를 들어, 초기 치료 바로 후에 비해 증가하는 경우, 이어서 추가 용량의 리간드가 추가 투여될 수 있다. 유도성 CSM를 발현하는 치료 세포가 추가의 리간드가 없는 경우 상대적으로 불활성 상태이긴 하지만 환자에 남아있기 때문에 이러한 모니터링 및 치료 일정은 계속될 수 있다.
다음 약물 용량, 예를 들어 다량체 리간드의 다음 투여, 및/또는 다음 약물 투여량을 조정하거나 유지하는 지시는 임의의 편리한 방법으로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 지시는 도표 형태(예를 들어, 물리적 또는 전자 매체)로 제공될 수 있다. 예를 들어, 시료 내 종양 세포의 크기, 또는 종양 세포의 수준이 표로 제공될 수 있으며, 임상의는 질병의 단계의 리스트 또는 표로 증상을 비교할 수 있다. 이어서, 임상의는 표에서 다음 약물 용량의 지시를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 지시는 증상이 컴퓨터에 제공된 후(예를 들어, 컴퓨터 메모리에 입력되면) 컴퓨터에 의해 제시될 수 있다(예를 들어, 표시된다). 예를 들어, 이러한 정보는 컴퓨터에 제공될 수 있고(예를 들어 사용자에 의해 컴퓨터 메모리에 입력하거나 컴퓨터 네트워크로 원격 장치를 통해 컴퓨터로 전송된다), 컴퓨터의 소프트웨어가 다음 약물 용량을 조정하거나 유지하는 지시를 생성하고/거나 다음 약물 용량을 제공할 수 있다.
지시에 근거하여 다음 투여가 결정되면, 임상의는 다음 용량을 투여하거나 다른 사람 또는 존재에게 용량을 조정하도록 지시를 내릴 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "임상의"는 의사 결정자를 나타내며, 임상의는 특정 실시양태에서는 의료 전문가이다. 일부 실시양태에서 의사 결정자는 컴퓨터 또는 표시된 컴퓨터 프로그램 결과일 수 있고, 의료 서비스 제공자가 컴퓨터에 표시된 지시 또는 다음 약물 용량에 대해 조치를 취할 수 있다. 의사 결정자는 다음 용량을 직접(예를 들어, 피험체에게 다음 용량을 주입) 또는 원격으로(예를 들어, 의사 결정자가 펌프 파라미터를 원격으로 변경할 수 있다) 투여할 수 있다.
본원에서 제시된 방법은 활성화된 세포, 핵산 또는 핵산을 코딩하는 발현 구조물의 유효량의 전달을 제한 없이 포함한다. 약학 조성물의 "유효량"은 일반적으로 예를 들어, 질환 또는 이의 증상의 정도를 개선, 감소, 최소화 또는 제한하는, 언급된 원하는 결과를 검출 가능하게 반복적으로 달성하기에 충분한 양으로 정의된다. 질환의 제거, 박멸 또는 치유를 포함하여 다른 더 엄격한 정의가 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료의 효과를 평가하고 독성을 제어하기 위한 바이오마커를 모니터하는 단계가 있을 수 있다.
환자에게 투여하기 위한 제제 및 경로
임상 적용이 고려되는 경우, 원하는 적용을 위해 적합한 형태로 약학 조성물―발현 구조물, 발현 벡터, 융합된 단백질, 형질도입된 세포, 활성화 T 세포, 형질도입된 T 세포-를 제조하는 것인 필수적일 것이다. 일반적으로, 이는 인간 또는 동물에 유해할 수 있는 발열원, 및 기타 불순물이 반드시 존재하지 않는 조성물을 제조하는 단계를 수반할 것이다.
예를 들어, AP1903와 같은 다량체 리간드는 예를 들어, 약 0.01 내지 1 mg/kg 피험체 체중, 약 0.05 내지 0.5 mg/kg 피험체 체중, 0.1 내지 2 mg/kg 피험체 체중, 약 0.05 내지 1.0 mg/kg 피험체 체중, 약 0.1 내지 5 mg/kg 피험체 체중, 약 0.2 내지 4 mg/kg 피험체 체중, 약 0.3 내지 3 mg/kg 피험체 체중, 약 0.3 내지 2 mg/kg 피험체 체중, 또는 약 0.3 내지 1 mg/kg 피험체 체중, 예를 들어, 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mg/kg 피험체 체중의 용량으로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 투여 당 0.4mg/kg, 예를 들어 5mg/mL의 농도로 제공된다. 바이알 또는 기타 용기는 예를 들어, 바이알 당 약 0.25 ml 내지 약 10 ml, 예를 들어, 약 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 또는 10 ml, 예를 들어, 약 2 ml의 부피로 리간드를 포함하도록 제공될 수 있다.
일반적으로 전달 벡터를 안정하게 하고 표적 세포에 의한 흡수를 가능하게 하는 적합한 염 및 완충액을 이용하기를 원할 수 있다. 재조합 세포가 환자에 도입될 때에도 완충액이 이용될 수 있다. 수성 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산된 세포에 유효량의 벡터를 포함한다. 이러한 조성물을 또한 접종물이라고도 나타낸다. 구 "약학적으로 또는 약리학적으로 허용되는"은 동물 또는 인간에 투여될 때, 부작용, 알레르기 반응, 또는 기타 원하지 않는 반응을 일으키지 않는 분자체 및 조성물을 나타낸다. 약학적으로 허용되는 담체는 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질을 위한 상기 매질 및 제제의 사용은 공지되어 있다. 임의의 통상의 매질 또는 제제가 벡터 또는 세포와 적합하지 않은 경우를 제외하고는, 치료 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보충의 활성 성분은 조성물에 포함될 수 있다.
활성 조성물은 전형적인 약학 제제를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 표적 조직이 이용 가능한 한 모든 통상의 경로를 통해 투여될 것이다. 이는 예를 들어, 경구, 비강, 협측, 직장, 질 또는 피부 국소를 포함한다. 별법으로, 통상의 위치, 피내, 피하, 근육 내, 복강 내 또는 정맥 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 보통 본원에서 논의되는 약학적으로 허용되는 조성물로서 투여될 것이다.
주사 용도에 적합한 약제 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉각적인 조제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균 상태이며 용이한 주사능이 존재하는 정도로 유동적이다. 형태는 제조 및 보관 조건하에서 안정적이고 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존된다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 원하는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용은 여러 가지 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티머로졸, 등에 의해 방지될 수 있다. 특정 실시예에서, 등장제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨이 포함될 수 있다. 주사 조성물은 조성물 내에 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 지속적인 흡수를 달성할 수 있다.
경구 투여의 경우, 조성물은 부형제와 혼합되거나 삼키지 않는 구강청결제 및 치약제의 형태로 사용될 수 있다. 구강청결제는 원하는 양의 활성 성분을 적합한 용매, 예를 들어 붕산나트륨 용액(도벨액(Dobell's solution))에 혼합하여 제조될 수 있다. 별법으로, 활성 성분은 붕산나트륨, 글리세린 및 중탄산 칼륨을 포함하는 소독용 세척제에 포함될 수 있다. 활성 성분은 또한 예를 들어 겔, 페이스트, 분말 및 슬러리를 포함하는 치약에 분산될 수 있다. 활성 성분은 예를 들어 물,결합제, 마모제, 향미제, 발포제, 및 습윤제를 포함할 수 있는 페이스트 치약에 치료 유효량으로 첨가될 수 있다.
조성물은 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 예를 들어 산부가염(단백질의 유리 아미노기와 형성됨), 및 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 형성되는 산 부가염을 포함한다. 유리 카복실기와 형성되는 염은 또한 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 철의 수산화물과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.
제제화 시, 용액은 투여 제제와 적합한 방식으로 치료 유효량으로 투여될 것이다. 제제는 주사액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 제형으로 용이하게 투여된다. 수용액으로 비경구 투여의 경우, 용액은 필요한 경우 적당하게 완충될 수 있고 액체 희석제는 충분한 염분 또는 글루코스로 등장성으로 먼저 만들어질 수 있다. 이러한 특정 수용액은 정맥 내, 근육 내, 피하 및 복강 내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 멸균 수용성 매질이 이용될 수 있다. 예를 들어, 단일 투여량은 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해될 수 있고 1000 ml의 피하주입액에 첨가되거나 주입하기 위해 제안된 부위에서 주사될 수 있다(예를 들어, 문헌("Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 및 1570-1580) 참조). 치료받는 피험체의 병태에 따라 투여량에 있어 약간의 변화가 반드시 발생할 수 있다. 투여 책임자는 어떤 경우에든 개별 피험체에 적합한 용량을 결정할 것이다. 게다가, 인간 투여의 경우, 제제는 FDA 생물학제제 기준실에 의해 요구되는 멸균성, 발열원성, 및 일반적인 안전성 및 순도 기준을 충족할 수 있다.
투여 일정은 환자에 적절하게 결정될 수 있으며, 예를 들어 0주에 세포 투여 후, 이어서 이량체화의 화학 유도 인자의 투여에 의한 유도 후 추가의 세포와 유도 인자를 그 후 2주 간격으로 전체, 예를 들어, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 또는 30 주 동안 투여하는 투여 일정을 포함할 수 있다.
다른 투여 일정은 예를 들어 1회 용량의 세포 및 1회 용량의 유도 인자가 투여되는 일정을 포함한다. 또 다른 예에서, 일정은 세포와 유도 인자를 0주에 투여한 후 4주 간격으로 추가의 세포와 유도 인자의 투여를 전체, 예를 들어, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 또는 32 주 동안 투여하는 것을 포함할 수 있다.
세포 용량은 한 번에 또는 한 번 초과하여 투여될 수 있으나, 용어 용량은 리간드의 투여 전에 투여되는 세포의 총량을 나타낼 수 있다.
필요한 경우, 방법은 치료에 사용될 더 많은 세포를 얻기 위해 추가의 백혈구 성분채집술을 더 포함할 수 있다.
질환의 치료 방법
본 방법은 또한 병원성 미생물 및/또는 과증식 질환에 의해 유발되는 질환의 치료 또는 예방 방법을 포함한다.
치료되거나 예방될 수 있는 질환은 바이러스, 세균, 효모, 기생생물, 원생생물, 암세포 등에 의해 유발되는 질환을 포함한다. 약학 조성물(형질도입된 T 세포, 발현 벡터, 발현 구조물 등)은 일반화된 면역 인핸서(T 세포 활성화 조성물 또는 시스템)로서 사용될 수 있으며, 마찬가지로 질환을 치료하는데 있어 용도를 갖는다. 치료되고/되거나 예방될 수 있는 대표적인 질환은 HIV, 인플루엔자, 헤르페스, 바이러스성 간염, 엡스타인 바, 소아마비, 바이러스성 뇌염, 홍역, 수두, 거대세포 바이러스(CMV), 아데노바이러스(ADV), HHV-6(인간 헤르페스 바이러스 6, I), 유두종 바이러스 등과 같은 바이러스 병인의 감염; 또는 폐렴, 결핵, 매독 등과 같은 세균 병인의 감염; 또는 말라리아, 트리파노소마증, 리슈만편모충증, 트리코모나스증, 아메바증 등과 같은 기생생물 병인의 감염을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
약학 조성물(형질도입된 T 세포, 발현 벡터, 발현 구조물 등)을 이용하여 치료되거나 예방될 수 있는 종양전 또는 과다형성 상태는 결장 용종, 크론병, 궤양성 대장염, 유방 병변 등과 같은 종양전 또는 과다 형성 상태를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
약학 조성물을 이용하여 치료될 수 있는, 고형 종양을 포함한 암은 원발성 또는 전이성 흑색종, 선암종, 편평세포암종, 선편평상피 세포 암종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 결장암, 다발성 골수종, 신경모세포종, NPC, 방광암, 자궁경부암 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 제시된 T 세포 활성화 시스템을 이용하여 치료될 수 있는 고형 종양을 포함하는 기타 과증식 질환은 류마티스 관절염, 염증성 장질환, 골관절염, 평활근종, 선종, 지방종, 혈관종, 섬유종, 혈관폐쇄, 재협착, 죽상동맥경화, 종양전 병변(예를 들어, 선종 과다형성 및 전립선 상피내종양), 상피내암, 구강 모발 백반증, 또는 건선을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 치료 방법에 있어, 약학 조성물(발현 구조물, 발현 벡터, 융합된 단백질, 형질도입된 세포, 활성화 T 세포, 형질도입된 T 세포)의 투여는 "예방적" 또는 "치료적" 용도일 수 있다. 예방적으로 제공되는 경우, 약학 조성물은 어떤 증상 전에 제공된다. 약학 조성물의 예방적 투여는 차후의 어떤 감염 또는 질환을 예방하거나 개선하는 역할을 한다. 치료적으로 제공되는 경우, 약학 조성물은 감염 또는 질환의 증상의 개시 또는 그 후에 제공된다. 따라서, 본원에서 제시되는 조성물은 질환유발제 또는 질환 상태에 예상되는 노출 전 또는 감염 또는 질환의 개시 후에 제공될 수 있다.
예를 들어, 혈관 구조에서 PSA, 예를 들어, PSMA를 발현하는 종양, 예를 들어, 폐, 뼈, 간, 전립선, 또는 뇌에서 존재하는 고형 종양, 및 또한, 예를 들어, 유방, 난소, 장, 고환, 결장, 췌장, 신장, 방광, 신경내분비계, 연조직, 뼈 종괴, 및 림프계에 존재하는 고형 종양을 포함한 임의의 조직 또는 기관으로부터의 고형 종양이 본 방법을 이용하여 치료될 수 있다. 치료될 수 있는 기타 고형 종양은 예를 들어 교모세포종, 및 악성 골수종을 포함한다.
접종물에 관한 것일 때 용어 "단위 용량"은 포유동물을 위한 단일 투여량으로서 적합한 물리적인 개별 단위를 나타내며, 원하는 희석제와 함께 원하는 면역원성 효과를 얻도록 계산된 예정된 양의 약학 조성물을 포함한다. 접종물의 단위 용량에 대한 구체적인 내용은 약학 조성물의 고유한 특성 및 달성될 특정 면역학적 효과에 의해서 영향을 받으며, 그에 따라 결정된다.
유효량의 약학 조성물은 면역 반응을 향상시키는 상기 선택된 결과를 달성하는 양이 될 것이며, 이 같은 양은 결정될 수 있다. 면역계 결함을 치료하기 위한 유효량은 면역계의 활성화를 일으키는데 필수적인 양일 수 있으며, 결과적으로 항원에 노출시 항원 특이적 면역 반응으로 발전된다. 용어는 또한 "충분한 양"과 동의어이다.
구체적인 적용을 위한 유효량은 치료될 질환 또는 병태, 투여될 구체적인 조성물, 피험체의 크기, 및/또는 질환 또는 병태의 중증도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 과도한 실험 없이도 본원에 제시된 특정 조성물의 유효량은 경험적으로 결정될 수 있다.
A. 유전자 기반 요법
특정 실시양태에서, 예를 들어 T 세포 내에 본원에서 기재된 것과 같이, 공자극 폴리펩티드를 제공할 수 있는 발현 구조물을 가진 세포가 제공된다. 여기에서 이용되는 발현 벡터 및 유전적 요소에 대한 장황한 논의는 참고에 의해 상기 부분에 포함된다. 특정 실시예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스 및 레트로바이러스일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 벡터는 리포솜으로 피막형성된 발현벡터이다.
유전자 전달은 생체 내 및 생체 외 환경에서 모두 실시될 수 있다. 바이러스 벡터의 경우 일반적으로 바이러스 벡터 보존액으로 제조될 것이다. 생체 외 및 생체 내에서 바이러스 벡터 매개된 유전자 전달의 실시예는 본 출원에서 제시된다. 생체 내 전달의 경우, 바이러스의 종류 및 획득할 수 있는 역가에 따라, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 X 104, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 X 105, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 X 106, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 X 107, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 X 108, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 X 109, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 X 1010, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 X 1011 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 X 1012 개의 감염성 입자를 환자에게 전달할 것이다. 상대적인 흡수 효율을 비교하여 리포솜 또는 기타 비바이러스 제제에 대해 유사한 수치가 외삽될 수 있다. 약학적으로 허용되는 조성물로서의 제제는 하기에 논의한다. 예를 들어 AP1903과 같은 다량체 리간드는 예를 들어 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mg/kg 피험체 체중의 용량으로 전달될 수 있다.
B. 세포 기반 요법
고려되는 또 다른 요법은 형질도입된 T 세포의 투여이다. T 세포는 시험관 내에서 형질도입될 수 있다. 약학적으로 허용되는 조성물로서 제제가 본원에서 논의된다.
세포 기반 요법에서, 형질도입된 T 세포는 예를 들어 mRNA 또는 DNA과 같은 표적 항원 핵산 또는 단백질으로 형질감염될 수 있고; 세포 용해물, 단백질 또는 핵산으로 펄스될 수 있으며; 세포와 전기융합될 수 있다. 세포, 단백질, 세포 용해물, 또는 핵산은 종양 세포와 같은 세포, 또는 기타 병원성 미생물, 예를 들어, 바이러스, 세균, 원생동물 등으로부터 유래할 수 있다.
C. 병용요법
본원에서 제시된 발현 벡터의 효과를 증가시키기 위하여, 상기 조성물 및 방법을 질환 치료에 효과적인 제제와 조합하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항암제는 본 방법과 조합하여 사용될 수 있다. "항암"제는 예를 들어 하나 이상의 암세포를 사멸시키고, 하나 이상의 암세포에서 아폽토시스를 유발하고, 하나 이상의 암세포의 성장 속도를 감소시키고, 전이의 발생 또는 빈도를 감소시키고, 종양 크기를 감소시키고, 종양 성장을 억제하고, 종양 또는 하나 이상의 암세포에 혈액 공급을 감소시키고, 하나 이상의 암 세포 또는 종양에 대한 면역 반응을 촉진하고, 암의 진행을 방지하거나 억제하거나, 암에 걸린 피험체의 수명을 증가시켜 피험체에서 암에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 항암제는 예를 들어, 화학요법제(화학요법), 방사선 요법제(방사선요법), 외과적 처치(수술), 면역요법제(면역요법), 유전자 요법제(유전자요법), 호르몬 요법, 기타 생물학 제제(생물요법) 및 대체요법을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항생제는 감염 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 약학 조성물과 함께 사용될 수 있다. 이같은 항생제는 아미카신, 아미노글리코시드(예를 들어, 젠타마이신), 아목시실린, 암포테리신 B, 앰피실린, 안티모니알, 아토바쿠온 소듐 스티보글루코네이트, 아지트로마이신, 카프레오마이신, 세포탁심, 세폭시틴, 세프트리악손, 클로르암페니콜, 클라리트로마이신, 클린다마이신, 클로파지민, 사이클로세린, 댑손, 독시사이클린, 에탐부톨, 에티오아미드, 플루코나졸, 플루오로퀴놀론, 이소니아지드, 이트라코나졸, 카나마이신, 케토코나졸, 미노사이클린, 오플록사신, 파라-아미노살리실산, 펜타미딘, 폴리믹신 데핀신, 프로티온아마이드, 피라지나마이드, 피리메타민 술파디아진, 퀴놀론(예를 들어, 시프로플록사신), 리파부틴, 리팜핀, 스파르플록사신, 스트렙토마이신, 술폰아미드, 테트라사이클린, 티아세타존, 트리메타프림-술파메톡사졸, 비오마이신 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 보다 일반적으로, 상기 제제는 암세포 및/또는 미생물의 증식을 사멸하거나 억제하는데 효과적인 발현 벡터와 총량으로 제공될 것이다. 이러한 방법은 세포(들)을 제제(들) 및 약학 조성물과 동시에 또는 약학 조성물과 제제를 세포, 조직 또는 생물체에 분리 투여가 원하는 치료 효과를 가져 오는 기간 내에 접촉하는 단계를 수반할 수 있다. 상기 단계는 약학 조성물과 하나 이상의 제제 둘 다를 포함하는 단일 조성물 또는 약리학적 제제와 세포, 조직 또는 생물체를 접촉하는 단계에 의해, 또는 한 조성물은 약학 조성물을 포함하고, 다른 조성물은 하나 이상의 제제를 포함하는, 두 가지 이상의 상이한 조성물 또는 제제와 세포를 접촉하는 단계에 의해 달성될 수 있다.
세포, 조직, 또는 생물체에 적용되는 경우, 용어 "접촉된" 및 "노출된"은 본원에서 예를 들어 화학치료제 또는 방사선 치료제와 같은 약학 조성물 및/또는 또 다른 제제가 표적 세포, 조직 또는 생물체에 전달되거나 표적 세포, 조직 또는 생물체와 직접적인 근접 부위에 놓이는 과정을 기재하는데 사용된다. 세포 사멸 또는 정체를 달성하기 위하여, 약학 조성물 및/또는 추가 제제(들)은 세포(들)을 사멸하거나 세포가 분열하는 것을 방지하기에 효과적인 총량으로 하나 이상의 세포에 전달된다. 약학 조성물의 투여는 수분에서 수주의 범위의 간격으로 선행되거나, 동시에 진행하고/거나 뒤따를 수 있다. 약학 조성물 및 기타 제제(들)이 세포, 조직 또는 생물체에 분리하여 적용되는 실시양태에서, 약학 조성물 및 제제(들)인 세포, 조직 또는 생물체에 유리한 병용 효과를 여전히 발휘할 수 있도록 하기 위해, 통상적으로는 반드시 각 전달 시간 사이에서 유의한 기간이 만료되지 않도록 해야 한다. 예를 들어, 이 경우에, 2, 3, 4 또는 그 이상의 종류의 세포, 조직 또는 생물체를 약학 조성물과 실질적으로 동시에(즉, 약 수 분 미만 내에) 접촉할 수 있을 것으로 생각된다. 또 다른 측면에서, 하나 이상의 제제는 약 1분에서 약 24시간, 약 7일, 약 1주, 약 8주, 또는 그 이상, 및 그 안에서 추론할 수 있는 어떤 범위까지 실질적으로 동시에 투여될 수 있다. 게다가, 본원에서 제시된 약학 조성물 및 하나 이상의 제제의 다양한 병용 요법이 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학치료제는 탁소텔(도세탁셀), 또는 예를 들어 카바지탁셀과 같은 또 다른 탁산일 수 있다. 화학치료제는 치료 세포 및 유도 인자의 치료 전, 중 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 화학치료제는 T 세포의 최초 투여 전 약 1년, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 또는 4개월, 또는 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2주, 또는 1주에 투여될 수 있다. 또는, 예를 들어, 화학치료제는 T 세포 또는 유도 인자 투여 후 약 1주 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18주, 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개월 또는 1년에 투여될 수 있다.
화학치료제의 투여는 하나 초과의 화학치료제의 투여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 시스플라틴은 택소텔 또는 예를 들어 카바지탁셀과 같은 다른 탁산에 추가로 투여될 수 있다.
실시예
하기에 개시된 실시예는 특정 실시양태를 예시하며 본 기술을 제한하지 않는다.
하기 부분은 치료 세포, 예를 들어 T 세포에서 유도성 키메라 신호전달 분자의 발현 방법 및 형질전환된 세포의 이용의 실시예를 제공한다. 유도성 폴리펩티드의 발현 방법, 형질전환 또는 형질감염된 세포의 이용 방법, 및 분석 방법은 예를 들어, 이로써 본원에 그 전문으로 참고에 포함되는 문헌(Spencer, D. M., et al., Science 262: 1019-1024 (1993); 2008년 7월 29일에 특허받은 미국 특허 제7,404,950호, 발명의 명칭 "Induced Activation in Dendritic Cells,"; 2011년 4월 14일에 출원된 미국 특허 출원 제13/087,329호, 발명의 명칭 "Methods for Treating Solid Tumors,"; 2011년 5월 20일에 출원된 미국 특허 출원 제13/112,739호, 발명의 명칭 "Methods for Inducing Selective Apoptosis")에 논의되어 있다.
실시예 1: 유도성 키메라 신호전달 분자 발현 벡터의 제작 및 평가
벡터 제작 및 발현의 확인
치료제로 사용하기에 적합한 발현 벡터를 예를 들어, FKBP12v36과 같은 인간 FK506-결합 단백질(FKBP)에 융합된 신호전달 분자를 포함하도록 제작한다. 또한, 상기 방법을 이용하여 하나 이상의 공자극 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 유도성 CSM은 소분자 약제를 이용하여 이량체(또는 다량체)를 형성할 수 있다. 유도성 CSM을 코딩하는 핵산을 리간드 결합 도메인을 코딩하는 핵산에 융합하고, 형광 마커, GFP도 발현할 수 있는, SFG 레트로바이러스 또는 pLenti7.3 렌티바이러스 벡터에 삽입한다.
유도성 CSM 폴리펩티드는 2, 3, 또는 그 이상, 어떤 실시양태에서는, 2 또는 3개 FK506-결합 단백질(FKBP―예를 들어, F36V 돌연변이를 포함하는 FKBP12v36 변이체, 또는 FKBP12; GenBank AH002 818)을 포함하며, 이들은 CSM 서열에 Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser 링커로 연결된다. 하나 이상의 FKBP(Fv2)의 아미노산 서열은 코돈이 동요되어서(예를 들어, 각 아미노산 코돈의 3rd 뉴클레오티드는 본래 코딩되는 아미노산을 유지하는 잠재성 돌연변이로 변경된다) 레트로바이러스에서 발현될 때 상동성 재조합을 방지한다. 모든 구조물을 SFG 또는 pLenti7.3에 클로닝한다.
293T 세포를 상기 구조물 각각으로 형질감염시키고 마커 유전자 GFP 또는 ΔCD19의 형질도입 발현 후 48시간에 유세포 분석법으로 분석하였다. GFP 또는 ΔCD19 발현의 수준 외에도, 발현된 유전자 산물을 또한 웨스턴 블롯으로 분석하여 유도성 키메라 신호전달 분자의 발현을 확인한다. 예를 들어, 공자극 폴리펩티드에 결합하는 항체를 웨스턴 블롯에 사용할 수 있다.
형질감염된 293T 세포를 아프로티닌, 류펩틴, 및 페닐메틸술포릴 플루오리드(Boehringer, Ingelheim, Germany)를 포함하는 용해 완충액(50% Tris/Gly, 10% 도데실 황산나트륨[SDS:sodium dodecyl sulfate], 4% 베타-머캅토메탄올, 10% 글리세롤, 12% 물, 4% 브로모페놀 블루 0.5%에서)에 재현탁하고 얼음에서 30분간 인큐베이션한다. 30분 원심분리 후에, 상층액을 수거하고 레믈리(Laemmli) 완충액(Bio-Rad, Hercules, CA)과 1:2로 혼합하고, 끓여 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로딩한다. 막을 토끼 항-공자극 폴리펩티드 면역글로불린 G(IgG; Affinity BioReagents, Golden, CO; 1:500 희석) 및 마우스 항-GFP IgG(Covance, Berkeley, CA; 1:25,000 희석)로 프로브한다. 이어서 블롯을 적합한 페록시다아제 결합된 2차 항체에 노출하고 단백질 발현을 강화된 화학발광(ECL; enhanced chemiluminescence, Amersham, Arlington Heights, IL)으로 검출한다. 이어서 막을 떼어 염소 다클론 항액틴(Santa Cruz Biotechnology; 1:500 희석)으로 다시 프로브하여 로딩이 균등함을 확인한다.
유도성 CSM 발현 구조물의 평가
세포주
암 세포주 LNCaP, PC3, DU145 및 A549, 및 인간 신장 배아 세포주 HEK-293T는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 얻었다. 세포를 10% 소 태아 혈청(Hyclone, Waltham, MA), 및 2 mM L-글루타민을 포함하는 완전 IMDM(Sigma, St Louis, MO) 중에서 5% 이산화탄소(CO2)를 포함하는 가습 대기하 37℃에서 유지한다. 형질도입된 T 세포 및 PHA 모세포는 100 U/㎖ IL-2(Cellgenix)가 보충된 셀제닉스 DC(Cellgenix DC, Cellgenix) 배지에서 유지한다.
T 세포의 활성화
확장 및 형질도입을 위한 T 세포의 활성화를 가용성 αCD3 및 αCD28 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 실시한다. PBMC를 100 U/㎖ IL-2(Cellgenix)가 보충된 셀제닉스 DC(Cellgenix) 배지에 1x106 세포/㎖ 농도로 재현탁하고 0.2 μg/㎖ αCD3 및 0.5 μg/㎖ αCD28 가용성 항체로 자극한다. 이어서 세포를 37℃, 5% CO2에서 4일 동안 배양한다. 4일째, IL-2를 포함하는 신선 배지 1 ㎖를 첨가한다. 7일째, 세포를 수거하고 형질도입을 위해 셀제닉스 DC 배지에 재현탁한다.
레트로바이러스 및 렌티바이러스 구조물
PSMA, PSCA, MUC1 및 Her2/Neu을 표적화하는, 코돈이 최적화된 단일쇄 가변 단편으로 이루어진 유도성 CSM(iCSM) 및 CAR-CD3.제타 구조물을 블루 헤론 바이오(Blue Heron Bio, Bothell, WA)에 의해 합성한다. iCSM 구조물은 T 세포 수용체의 CD28, 4-1BB, 및 CD3 제타 사슬을 포함하는 공자극 엔도도메인에 인프레임으로 연결된 FKBP12v36 도메인으로 이루어진다. CAR 구조물을 인간 IgG1-Ch2Ch3 도메인 및 CD3-제타 사슬과 인프레임으로 scFv 단편을 클로닝하여 생성한다. iCSM 및 CAR-CD3.제타 구조물 둘 다를 에머랄드 GFP를 동시 발현하는 SFG 레트로바이러스 골격 또는 pLenti7.3 렌티바이러스 골격(Invitrogen)에 서브클로닝한다. iCSM의 자극 및 공자극 효과, 및 CAR-CD3.제타의 세포독성을 상기 전이유전자를 코딩하는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스로 T 세포를 단일 또는 동시 형질도입에 의해 평가한다.
레트로바이러스 형질도입
레트로바이러스의 일시적인 생산을 위해, 293T 세포를 gag-pol 및 RD 114 엔벨로프를 코딩하는 플라스미드와 함께 CSM 구조물로 진쥬스(GeneJuice) 형질감염 시약(Novagen, Madison, WI)을 이용하여 형질감염한다. 바이러스를 형질감염 후 48 내지 72시간에 수거하여, 급속 동결하고 사용할 때까지 -80℃에서 보관한다. 렌티바이러스의 일시적인 생산을 위해, 293T 세포를 플라스미드 pLP1 (gag/pol), pLP2 (rev) 및 pLP/VSVG (VSVG env)와 함께 iCAR 구조물로 진쥬스를 이용하여 형질감염한다. 바이러스를 형질감염 후 48 내지 72시간에 수거하여, 급속 동결하고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관한다. 대규모 레트로바이러스 생산을 위해, 안정된 FLYRD 18-유래된 레트로바이러스 생산주를 VSV-G 슈도형의 일시적인 레트로바이러스 상층액으로 여러차례 형질도입에 의해 생성한다. 최고의 전이유전자 발현의 FLYRD18 세포를 단일 세포로 분류하고, 최고의 바이러스 역가를 생산하는 클론을 확장하여 림프구 형질도입을 위한 바이러스 생산에 사용한다. 상기 클론의 전이유전자 발현, 기능, 및 레트로바이러스 역가를 8주 초과의 연속 배양 기간 동안 유지한다. 비조직 배양-처리된 24 웰 플레이트를 7 μg/ml 레트로넥틴(Takara Bio, Otsu, Shiga, Japan)으로 37℃에서 1시간 또는 4℃에서 밤새 코팅한다. 웰을 인산 완충 식염수(PBS)로 세척한 후 플레이트를 1.5㎖ 상층액으로 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 레트로바이러스 상층액으로 코팅한다. 계속해서, T 세포 모세포를 100 U/ml IL-2가 보충된 바이러스 상층액 중에 웰당 5 x105 세포로 플레이트한다. 60시간에 걸쳐 형질도입을 실시한다. 형질도입 후에, 세포를 수거하고 유세포 분석으로 CD19 또는 GFP에 대한 표현형을 결정한다.
iCSM /CAR-형질도입된 T 세포의 세포독성
각각의 형질도입된 T 세포주의 세포독성 활성을 앞서 제시된 표준 4시간 51Cr 방출 분석법으로 측정한다. iCSM, PSMA CAR-CD3.제타, 또는 iCSM과 CAR 바이러스 둘 다로 형질도입된 T 세포를 자기 유래의 피토헤마글루티닌(PHA) 자극된 림프구(PHA 모세포), LNCaP, PC3 또는 DU145 및 A549 암 세포주, 및 인간 PSMA를 발현하는 형질전환된 A549(A549-PSMA)를 포함한 Cr51-표지된 표적 세포에 대해 비교한다. 완전 배지 또는 1% Triton X-100(Sigma, St Louis, MO)에서 배양된 표적 세포를 사용하여 자발적인 최대 51Cr 방출을 각각 결정한다. 3회 반복된 웰의 특이적 용해률의 평균 백분율을 100 X (실험 방출 - 자발적인 방출) / (최대 방출 - 자발적인 방출)로 계산하였다. 크롬 방출 분석법 이외에, 공동 배양 실험을 실시한다. 여기서, 세포주 LNCaP, PC3, DU145, A549 및 A549-PSMA를 형질도입하여 형광 모란지(mOrange)를 발현하도록 하고 표적 세포로 사용한다. 모란지 발현 종양 세포를 형질도입되지 않거나 CAR 변형된 T 세포와 종양 세포 대 T 세포 1:10 비율로 완전 배지 중 IL-2 (50 U/ml) 존재하에 공동 배양한다. 24시간 후에, iCAR을 포함하는 T 세포를 100 nM AP1903으로 자극한다. 72시간 후에, 세포를 수집하고, 계수하고 CD3으로 표지하여 T 세포를 검출하고, 모란지 종양 세포 비율을 유세포 분석기(LSRII; BD)로 분석한다.
iCSM -형질도입된 T 세포의 표현형 결정 및 활성화 상태
iCAR 형질도입된 T 세포의 세포 표면 표현형을 다음 단클론 항체를 이용하여 조사한다: CD3, CD4, CD8, CD19, CD25, CD27, CD28, CD44, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD80, CD83, CD86, CD127, CD134, CD137, HLA-ABC 및 HLA-DR. iCSM 자극제로서 10-100 nM AP1903의 존재 및 부재 하에서 표현형을 결정한다. 적합하게 일치되는 이소형 대조군을 각 실험에 사용하고 세포를 LSRII 유세포 분석기(BD)로 분석한다. CAR 발현을 항-F(ab')2(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)을 이용하여 평가하였다.
iCSM -형질도입된 T 세포의 사이토카인 생산의 분석
100 nM AP1903 자극 전후 (24시간)에, T 세포 배양 상층액에서 인터페론-γ(IFN-γ), IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, 및 종양 괴사 인자-α(TNFα)의 농도를 인간 Th1/Th2 사이토카인 사이토메트릭 비드 어레이(cytometric Bead Array)(BD Pharmin-gen)를 이용하여 측정한다. 배양 상층액 내 유도된 사이토카인 생산을 효소 면역 분석법(ELISA; R&D Systems, Minneapolis, MN)에 의해 제조사의 지시에 따라 입증한다.
iCSM -형질도입된 T 세포의 증식
iCSM을 통한 AP1903-유도된 신호전달의 증식 효과를 AP1903에 노출 후 형질도입된 T 세포와 형질도입되지 않은 T 세포의 세포 성장을 측정하여 평가한다. T 세포를 10 μM 카복시플루오레신 디아세테이트, 숙시니미딜 에스테르(CFSE)로 37℃에서 10분간 표지한다. 인큐베이션 후에, 세포를 PBS로 세척한 후 셀제닉스 DC 배지에 재현탁한다. 1x106 CFSE-표지된 iCSM-변형된 T 세포 또는 형질도입되지 않은 T 세포를 계속해서 단독 셀제닉스 DC 배지에서 배양하거나, 100 nM AP1903으로 자극한다. 5일 후에, 세포를 수거하고 CD3-PerCP.Cy5.5 및 CD19-PE로 표지하고 CFSE 희석에 대해 유세포 분석기로 분석한다.
가용성 면역 글로불린이 CAR+ T 림프구의 증식 및 확장에 영향을 주는지를 평가하기 위하여, 세포를 건강한 공여자로부터 얻은 인간 혈장의 연속 희석액 또는 정제된 면역글로불린(Jackson ImmunoResearch)의 연속 희석액과 외인성 사이토카인의 첨가 없이 1×105 세포/웰로 배양한다. 72시간 후에, 세포를 1 μCi (0.037 MBq) 메틸-3[H]티미딘(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)으로 펄스를 주고 추가 15 시간동안 배양한다. 이어서 세포를 필터에 수거하고 건조하여 β-신틸레이션 계수기(TriCarb 2500 TR; Packard BioScience, Meridien, CT)로 분당 계수를 측정한다. 실험은 3회 반복 실시한다. 다른 실험에서, 대조군 및 CAR+ T 림프구를 배지 단독으로 또는 혈장 또는 정제된 면역글로불린의 연속 희석액을 2일에 한번 첨가한 배지로 배양한다. 이어서, 세포를 트립판 블루 배제법을 이용하여 3일에 한번 계수한다.
생체 내 실험
6 내지 8주령의 비비만성 당뇨 중증 복합 면역결핍증(NOC/SCID: non-obese diabetic severe combined immunodeficient) 마우스를 방사선 조사(250 rad)하고, 매트리겔(Matrigel, BD Bioscience) 중에 재현탁된 10 x 106 내지 15 x 106 LNCaP 종양 세포로 우측 옆구리에 피하 주사한다. 2주 후에 직경 약 0.5 cm인 종양을 갖는 마우스를 형질도입되지 않은 T 세포 또는 iCSM/CAR -형질도입된 T 세포 (총 15 x 106)으로 꼬리 정맥에 주사하였다. 마우스를 임의로 2그룹으로 분리한다. 한 그룹은 CID(50-125 μg AP1903, 복강내, 1주일에 2회)를 받고 한 그룹은 담체(16.7% 프로판디올, 22.5% PEG400, 및 1.25% Tween 80, 복강 내, 1주일에 2회)만을 받아 T 세포를 확장한다. 마우스를 21일에 캘리퍼 측정으로 종양 성장을 평가한다. 말초 혈액 시료를 눈 뒤 채혈에 의해 7일, 14일 및 21일에 얻어 인간 CD3/인간 CD19 발현 T 세포에 대한 유세포 분석을 이용하여 iCSM 또는 대조군 T 세포의 지속성 및 확장을 측정한다.
생체 내에서 iCSM -형질도입된 T 세포 특징의 평가
유도성 CSM의 발현이 T 세포 특징을 변경하지 않는다는 것을 확인하기 위하여, 형질도입되지 않은 또는 기능을 하지 못하는 유도성 CAR(PSMA CAR-CD3.제타 단독)의 표현형, 항원 특이성, 증식 가능성, 및 기능을 iCSM/CAR-형질도입된 T 세포와 비교한다. 형질도입된 세포 및 형질도입되지 않은 세포에서 CD4+, CD8+, CD56+, 및 TCR α/β + 세포의 수를 비교하고, 마찬가지로 IFN-γ, TNFα, IL-10, IL-4, IL-5, 및 IL-2를 포함한 사이토카인의 생산을 비교한다. 기하급수적으로 성장하는 CTL의 성장 특징, 및 증식을 위한 항원 및 IL-2의 의존도를 평가하고, 마찬가지로 항원 자극 시 TH1 및 TH2 형 사이토카인의 표현형 및 분비 자료를 평가한다.
실시예 2: 인간 세포에서 유도성 CSM의 치료법에 이용
발현 구조물 및 인간 세포에서 발현 구조물의 이용 방법은 상기 실시예에 제시되어 있다.
재료 및 방법
유전자 변형된 T 세포의 대규모 생성
T 세포를 건강한 지원자로부터 표준 방법을 이용하여 얻는다. 간략하게, 건강한 공여자 또는 암 환자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 가용성 αCD3 및 αCD28 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 확장 및 형질도입을 위해 활성화한다. PBMC를 100 U/ml IL-2 (Cellgenix)가 보충된 셀제닉스 DC 배지 중에 1x106 세포/ml로 재현탁하고 가용성 항체 0.2 μg/ml αCD3 및 0.5 μg/ml αCD28로 자극한다. 이어서 세포를 37℃, 5% CO2에서 4일간 배양한다. 4일째, IL-2를 포함하는 신선 배지 1 ml를 첨가한다. 7일째, 세포를 수거하고 형질도입을 위해 셀제닉스 DC 배지에 재현탁한다.
플라스미드 및 레트로바이러스
SFG 플라스미드는 절단된 인간 CD19에 절단 가능한 2A 유사 서열를 통해 연결된 유도성 CSM으로 이루어진다. 유도성 CSM은 Ser-Gly-Gly-Gly-Ser 링커를 통해 인간 CSM에 연결된 F36V 돌연변이를 갖는 인간 FK506-결합 단백질(FKBP12; GenBank AH002 818)로 이루어진다. F36V 돌연변이는 합성의 호모이량체화제, AP20187 또는 AP1903에 대한 결합 친화도를 증가시킨다. 2A 유사 서열은 토세아 아시그나 곤충 바이러스의 20개 아미노산 펩티드를 코딩하며, 이는 글리신과 말단 프롤린 잔기 사이에 95%> 절단을 매개하여 iCSM의 C 말단에 19개의 추가의 아미노산 및 CD19의 N 말단에 하나의 추가의 프롤린을 생성한다. CD19는 아미노산 333(TDPTRRF)에서 절단된 전장의 CD19(GenBank NM 001770)로 이루어지며, 이는 세포질 내 도메인을 242개에서 19개의 아미노산으로 단축하며, 인산화가 가능한 부위인 보존된 티로신 잔기 모두를 제거한다.
긴팔 원숭이(Gibbon ape) 백혈병 바이러스(Gal-V) 슈도형 레트로바이러스를 생산하는 안정한 PG13-기반 클론을 SFG 플라스미드로 피닉스(Phoenix) Eco 세포주(ATCC product #SD3444; ATCC, Manassas, VA)를 일시적으로 형질감염시켜 만든다. 이는 Eco-슈도형 레트로바이러스를 생산한다. PG13 팩키징 세포주(packaging cell line)(ATCC)를 Eco-슈도형 레트로바이러스로 3회 형질도입하여 세포 당 다수의 SFG 플라스미드 프로바이러스 통합체를 포함한 생산 주를 생성한다. 단일 세포 클로닝을 수행하고, 최고의 역가를 생산하는 PG13 클론을 확장하고 벡터 생산을 위해 사용한다.
레트로바이러스 형질도입
T 세포 활성화 및 확장을 위한 배양 배지는 100 U/ml IL-2(Cellgenix)가 보충된 무혈청 셀제닉스 DC 배지(Cellgenix)이다. T 세포를 레트로바이러스 벡터로 형질도입하기 전에 7일 동안 가용성 항-CD3 및 항-CD28 (Miltenyi Biotec)에 의해 활성화한다. 필요한 경우, 형질도입 후 4일에 ΔCD19의 면역자성 선별을 실시한다. 양성 분획을 추가 2일 동안 확장하고 저온 보존한다.
유전자 변형된 동종형고갈된 ( allodepleted ) 세포의 대규모 생산
임상 적용을 위한 형질도입 과정의 스케일 업은, 10 ml의 항-CD3 0.5μg/ml 및 항-CD28 0.2 μg/ml 또는 10ml의 피브로넥틴 7μg/ml으로 4℃에서 밤새 코팅되고, 비조직 배양 처리된 T75 플라스크(Nunc, Rochester, NY)를 이용한다. 세포 부착의 증가를 위해 관-처리된 플루오르화 에틸렌 프로필렌 백(2PF-0072AC, American Fluoroseal Corporation, Gaithersburg, MD)을 또한 사용한다. PBMC를 항-CD3, 항-CD28-코팅된 플라스크에 100 U/ml IL-2가 보충된 배지 중 1×106 세포/ml로 접종한다. 레트로바이러스 형질도입을 위해, 레트로넥틴-코팅된 플라스크 또는 백을 레트로바이러스 포함 상층액 10ml로 2 내지 3시간 동안 한번 로딩한다. 활성화 T 세포를 3:1 비율의 신선한 레트로바이러스 벡터 함유 배지와 T 세포 배양 배지 중에 100 U/ml IL-2를 보충하여 1×106 세포/ml로 접종한다. 다음날 아침 세포를 수거하고 100 U/ml IL-2가 보충된 배양 배지 중에 약 5×105 세포/ml 내지 8×105 세포/ml의 접종 농도로 조직 배양 처리된 T75 또는 T175 플라스크에서 확장한다.
CD19 면역자성 선별
CD19에 대해 면역 자성 선별을 실시할 수 있으며, 한 예로 형질도입 후 4일에 실시할 수 있다. 세포를 단클론 마우스 항-인간 CD19 항체로 접합된 상자성 마이크로비드 (Miltenyi Biotech, Auburn, CA)로 표지하고 소규모 실험에서는 MS 또는 LS 컬럼에서 대규모 실험에서는 클리니맥스 플러스(CliniMacs Plus) 자동화 선별 장치에서 선별한다. CD19-선별된 세포를 추가 4일 동안 확장하고 형질도입 후 8일에 저온 보존한다. 이러한 세포를 "유전자 변형된 세포"라고 나타낸다.
면역 표현형 결정 및 오량체 분석
유세포 분석(FACSCalibur 및 CellQuest 소프트웨어; Becton Dickinson)을 다음 항체를 이용하여 수행한다: CD3, CD4, CD8, CD19, CD25, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD56 및 CD62L. CD19-PE (클론 4G7; Becton Dickinson)이 최적의 염색을 나타낸다는 것을 확인하고 이어지는 모든 분석에 사용하였다. 형질도입되지 않는 대조군을 사용하여 CD19에 대한 음성 게이트를 설정한다. CAR 발현을 항-F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)를 이용하여 평가한다.
통계 분석
대응표본, 양측 스튜던트 t 검정을 이용하여 시료 사이의 차이의 통계학적 유의성을 결정한다. 모든 자료는 평균 ± 1 표준편차로 나타낸다.
실시예 3: AP1903 의존성 T 세포 활성화의 측정
목적: T 세포의 AP1903 활성화를 가능하게 하는 두 개의 FKBPv36 분자에 연결된 신호전달 분자를 코딩하는 레트로바이러스 벡터를 갖는 1차 T 세포를 형질도입하기 위하여. 본 실험에서, 이량체화에 반응하여 사이토카인의 생산을 다중 사이토카인 비드 어레이(bead array)를 이용하여 측정한다.
방법:
유도성 T 세포 분자의 설계 및 클로닝:
1. 두 가지 SFG-기반 레트로바이러스 벡터를 깁슨 클로닝에 의해 제작한다. 여기서, PCR 산물을 pAd1127-02-iMC로부터 증폭하고 LFv1.Fv2L DNA 단편 대신에 pBP0320-SFG-Myr.LFv1.Fv2L.2A.ΔCD19 구조물에 삽입하였다.
a. 첫 번째 벡터에서, 증폭된 PCR 산물은 Fv'Fv이었고, XhoI와 SalI 부위에서 LFv1.Fv2L을 대체하여 FKBPv36 단편만을 레트로바이러스 골격에 삽입하였다. 상기 벡터는 pBP0171-SFG-Myr.Fv'.Fv.2A.ΔCD19로 명명되며, 임의의 T 세포 신호전달 분자가 결여된 대조군 벡터이다.
b. 두 번째 벡터에서, 증폭된 PCR 산물은 MyD88/CD40.Fv'.Fv(또는 iMCnoE) 이었다. 이것을 LFv1.Fv2L DNA 서열 대신에 XhoI와 SalI 제한 부위에서 pBP0320 플라스미드에 삽입하였다. 상기 벡터를 pBP0172-SFG-Myr.iMCnoE.2A.ΔCD19로 명명하였다. "noE" 접미어는 상기 iMC DNA가 에피토프 태그를 코딩하지 않는다는 것을 나타낸다.
레트로바이러스의 생산
2. 레트로바이러스를 일시적인 형질감염 방법에 의해 생산하며, 여기서 HEK293T 세포를 하기 플라스미드로 형질감염하였다:
a. SFG 레트로바이러스 플라스미드(pBP0171 또는 pBP0172; 각각, RV-171 또는 RV-172)
b. 레트로바이러스 엔벨로프 플라스미드(RD114)
c. Gag/pol 플라스미드(pEQ-PAM-E)
3. 48 및 72 시간에, 복제 결함의 레트로바이러스를 포함하는 형질감염된 세포로부터의 상층액을 수집하여 건조 얼음/에탄올에서 급속 냉동하여 T 세포 형질도입할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
4. 1차 T 세포를 형질도입하기 위하여, 건강한 공여자의 PBMC를 100 U/ml IL-2가 보충된 T 세포 성장 배지에서 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화하였다. 3일 후에, T 세포를 활성화하고 수거하여 레트로바이러스 형질도입을 위해 준비하였다. T 세포를 형질도입하기 위하여, 비조직 배양 처리된 플레이트를 먼저 레트로넥틴으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 이어서, 레트로넥틴을 제거하고, 플레이트를 PBS로 세척하였다. 이어서, 레트로바이러스 상층액을 사용하여 레트로넥틴 플레이트를 코팅하였다. 이어서, 활성화 T 세포를 웰에 첨가하고 플레이트를 원심분리하여 바이러스 입자 결합 및 형질도입을 촉진하였다. 48시간 후에 T 세포를 수거하고 CD3 및 CD19 동시 발현에 대해 유세포분석으로 분석하여 바이러스 형질도입 효율을 결정하였다.
사이토카인 생산에 의한 AP1903 유도된 T 세포 활성화의 분석:
5. T 세포의 AP1903 의존성 T 세포 활성화를 평가하기 위하여, 1x105 형질도입되지 않은(NT) T 세포 또는 대조군 레트로바이러스(RV-171) 또는 iMC(RV-172)를 포함하는 레트로바이러스로 형질도입된 T 세포를 96웰 플레이트에 3회씩 플레이트하고 배지 단독, 또는 10 nM AP1903를 포함하는 배지와 함께 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
6. 24시간 후에, 세포를 서서히 혼합하고 플레이트를 원심분리하였다. 이어서, 상층액을 수집하고 바이오-플렉스(Bio-Plex) 인간 사이토카인/케모카인 27-플렉스 플레이트에 플레이트하여, 하기의 사이토카인 및 케모카인을 측정한다:
a. 기본-FGF, G-CSF, GM-CSF, IFN-감마, IL-1Ra, IL-1베타, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-17RA, 에오탁신, IP10, MCP-1, MIP-1알파, MIP-1베타, PDGF-bb, RANTES, TNF-알파 및 VEGF.
b. 계속하여 상층액 중의 사이토카인 및 케모카인을 바이오-플렉스 MAGPIX 멀티플렉스 리더(Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader)를 이용하여 측정하고 표준과 비교하였다.
결과:
형질도입 효율:
1. 두 명의 건강한 공여자의 T 세포를 레트로바이러스로 형질도입하였고, 48시간 후에, CD3+CD19+ 동시 발현에 대한 유세포 분석에 의해 결정된 효율은 다음과 같다:
a. 공여자 063
i. NT = 6.54%
ii. RV-171 = 73.9%
iii. RV-172 = 54.6%
b. 공여자 707
i. NT = 2.16%
ii. RV-171 = 85.2%
iii. RV-172 = 73.6%
2. 형질도입은 벡터 및 공여자 모두에 대해 상당히 높았으며, 이것으로 HEK293T 세포에 독성을 보이지 않는다는 것과 바이러스 역가가 우수하다는 것을 나타내었다.
사이토카인/케모카인 생산
3. 사이토카인 및 케모카인 분비 분석은 AP1903 이량체화에 대한 주목할 만한 의존성을 보였다. 다음 T 세포-생산된 사이토카인 및 케모카인은 24시간에 걸쳐 유도를 보였으나 대조군 벡터로 형질도입된 T 세포 또는 형질도입되지 않은 T 세포에서는 유도되지 않았다:
a. GM-CSF, IFN-감마, IL-13, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-1베타, IL-12p70, IP10, MIP-1알파, MIP-1베타, RANTES, 및 TNF-알파
4. 추가적으로, 기타 사이토카인 및 케모카인은 iMC의 AP1903 활성화에 의해 유도되지 않는 것으로 보였다. 상기는 다음을 포함한다:
a. 기본-FGF, G-CSF, IL-1Ra, IL-2, IL-7, IL-9, IL-10, IL-15, IL-17RA, 에오탁신, MCP-1, PDGF-bb 및 VEGF.
확실한 결과는 또한 [도 7] 내지 [도 15]에 도시하였다. NT = 형질도입되지 않은 활성화 T 세포
RV0171 = SFG-Myr.Fv'.Fv.2A.ΔCD19; RV0172 = SFG=Myr.MyD88/CD40.Fv'.Fv.2A. ΔCD19.
T 세포를 10 nM AP1903으로 24시간 동안 자극한 후 상층액을 사이토카인 수준에 대해 분석하였다.
실시예 4: AP1903 의존성 T 세포 세포독성의 측정:
목표: T 세포의 AP1903 활성화를 가능하게 하는 두 개의 FKBPv36 분자에 연결된 신호전달 분자를 코딩하는 레트로바이러스 벡터를 갖는 1차 T 세포를 형질도입하기 위하여. 본 실험에서, AP1903 활성화의 두 가지 측면을 조사하였다. 첫째, T 세포가 종양 세포와 매우 근접한 경우, 이들의 활성화가 종양 세포 사멸을 유도할 것인가?, 둘째, T 세포가 AP1903을 통해 활성화되는 경우, 그들은 증식할 것인가?
방법:
유도성 T 세포 분자의 설계 및 클로닝, 및 레트로바이러스의 생산
1. 방법은 상기 실시예 4와 필수적으로 동일하다. 동일한 세포를 본 분석에 사용하였다.
GFP-표지된 CAPAN-1(췌장 선암종) 세포주의 생성:
2. CAPAN-1을 ATCC로부터 구입하였다. 이어서, 세포주를 EGFP/반딧불이 루시퍼라제 융합 단백질, 및 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 pBP0168-pcDNA3.1-EGFPluc 플라스미드로 형질감염에 의해 유전자 변형하여 G418 항생제와 함께 배양함으로써 시간에 걸쳐 안정하게 형질감염된 세포의 선별을 가능하게 하였다. 배양 후, GFP 고발현 클론을 선별하고 >95% GFP인 세포주를 얻을 때까지 계대배양하였다.
CAPAN-1 종양 세포와 iMC 활성화 T 세포의 공동 배양:
3. 형질도입되지 않은 T 세포 또는 RV-171(대조군 벡터) 또는 RV-172(iMC 벡터)로 형질도입된 세포를 T 세포 대 종양 세포 5:1 비율로 10 nM AP1903의 존재 또는 부재하에 50 U/ml IL-2가 보충된 배지에서 배양하였다. 이어서 공동 배양물을 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 계속하여 배양물을 형광현미경 관찰에 의해 분석하고 0.25% 트립신/EDTA와 함께 배양물을 수거하고 유세포 분석에 의해 배양물 내 GFP+CD3- 종양 세포의 빈도를 측정하여, GFP+ 종양 세포의 존재에 대하여 분석하였다.
결과:
4. 공동 배양 웰의 검사 시, 커다란 T 세포 모세포 콜로니에 의해 입증된 두 가지 공여자 모두에서, AP1903으로 자극된 RV-172(iMC-포함 벡터)로 형질도입된 T 세포가 증식하고 있다는 것이 입증되었다. 또한, 형광 현미경 관찰에 의해, AP1903을 받은 RV-172-형질도입된 T 세포를 포함하는 공동 배양은 매우 약간의 생존 GFP+ 종양 세포를 보였다. 상기 초기 관찰 후에, T 세포 및 종양 세포를 수거하여 유세포분석에 의해 분석하여 잔여 CAPAN-1 GFP+ 종양 세포의 빈도를 측정하였다.
5. 현미경에 의해 관찰된 바와 같이, 유세포 분석은 AP1903-처리된, iMC-형질도입된(RV-172) T 세포를 포함하는 공동 배양에서 AP1903의 명백한 효과를 나타내었다. GFP+ 종양 세포의 감소는 상기 조건에서만 일어났으나, 대조군 벡터로 형질도입된 T 세포의 경우 일어나지 않았고, 이량체화제를 받지 않은 RV-172로 형질도입된 T 세포의 경우 더 적은 정도로 일어났다.
6. 종합해 보면, 상기 자료는 T 세포에서 iMC의 활성화는 T 세포 사멸을 유도할 수 있으며 AP1903-처리된 T 세포의 증식을 유도한다는 것을 시사한다. 총체적으로, 사이토카인/케모카인 생산과 관련한 관찰과 함께, 상기 자료는 iMC가 T 세포에서 활성화될 수 있다는 것과 T 세포는 iMC 이량체화 시 이들의 이펙터 기능을 보유하고 증가시킨다는 것을 나타낸다.
특정 결과는 또한 [도 16] 내지 [도 19]에 도시된다.
실시예 5: 생체 외에서 T 세포의 활성화 및 인간 피험체에게 투여
본 실시예에서 인간 치료법을 위한 변형된 T 세포의 이용 방법을 제시한다. 본 실시예에서, 공자극 폴리펩티드 세포질 영역은 CD40 및 MyD88로부터 유래된다. 본 방법은 예를 들어 NK 및 NKT 세포 및 종양 침윤 림프구와 같은 다른 세포에도 적용될 수 있고, 본원에서 논의된 다른 공자극 폴리펩티드 세포질 영역을 포함하는 유도성 CSM에도 적용될 수 있다.
재료 및 방법
유전자 변형된 T 세포의 대규모 생성
T 세포를 건강한 지원자로부터 표준 방법을 이용하여 얻는다. 간략하게, 건강한 공여자 또는 암 환자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 가용성 αCD3 및 αCD28 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 이용하여 확장 및 형질도입을 위해 활성화한다. PBMC를 100 U/ml IL-2 (Cellgenix)가 보충된 셀제닉스 DC 배지 중에 1x106 세포/ml로 재현탁하고 가용성 항체 0.2 μg/ml αCD3 및 0.5 μg/ml αCD28로 자극한다. 이어서 세포를 37℃, 5% CO2에서 4일간 배양한다. 4일째, IL-2를 포함하는 신선 배지 1 ml를 첨가한다. 7일째, 세포를 수거하고 형질도입을 위해 셀제닉스 DC 배지에 재현탁한다.
플라스미드 및 레트로바이러스
SFG 플라스미드는 절단된 인간 CD19에 절단 가능한 2A 유사 서열를 통해 연결된 유도성 CSM으로 이루어진다. 유도성 CSM은 Ser-Gly-Gly-Gly-Ser 링커를 통해 인간 CSM에 연결된 F36V 돌연변이를 갖는 인간 FK506-결합 단백질(FKBP12; GenBank AH002 818)로 이루어진다. F36V 돌연변이는 합성의 호모이량체화제, AP20187 또는 AP1903에 대한 결합 친화도를 증가시킨다. 2A 유사 서열은 토세아 아시그나 곤충 바이러스의 20개 아미노산 펩티드를 펩티드를 코딩하며, 이는 글리신과 말단 프롤린 잔기 사이에 99%> 절단을 매개하여 유도성 CSM의 C 말단에 19개의 추가의 아미노산 및 CD19의 N 말단에 하나의 추가의 프롤린을 생성한다. CD19는 아미노산 333(TDPTRRF)에서 절단된 전장의 CD19(GenBank NM 001770)로 이루어지며, 이는 세포질 내 도메인을 242개에서 19개의 아미노산으로 단축하며, 인산화가 가능한 부위인 보존된 티로신 잔기 모두를 제거한다.
긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(Gal-V) 슈도형 레트로바이러스를 생산하는 안정한 PG13-기반 클론을 SFG 플라스미드로 피닉스(Phoenix) Eco 세포주(ATCC product #SD3444; ATCC, Manassas, VA)를 일시적으로 형질감염시켜 만든다. 이는 Eco-유사형 레트로바이러스를 생산한다. PG13 팩키징 세포주(ATCC)을 Eco-슈도형 레트로바이러스로 3회 형질도입하여 세포 당 다수의 SFG 플라스미드 프로바이러스 통합체를 포함한 생산 주를 생성한다. 단일 세포 클로닝을 수행하고, 최고의 역가를 생산하는 PG13 클론을 확장하고 벡터 생산을 위해 사용한다.
레트로바이러스 형질도입
T 세포 활성화 및 확장을 위한 배양 배지는 100 U/ml IL-2 (Cellgenix)가 보충된 무혈청 셀제닉스 DC 배지(Cellgenix)이다. T 세포를 레트로바이러스 벡터로 형질도입하기 전에 7일 동안 가용성 항-CD3 및 항-CD28 (Miltenyi Biotec)에 의해 활성화한다. 필요한 경우, 형질도입 후 4일에 ΔCD19의 면역자성 선별을 실시한다. 양성 분획을 추가 2일 동안 확장하고 저온 보존한다.
유전자 변형된 동종형고갈된 세포의 대규모 생산
임상 적용을 위한 형질도입 과정의 스케일 업은, 10 ml의 항-CD3 0.5μg/ml 및 항-CD28 0.2 μg/ml 또는 10ml의 피브로넥틴 7μg/ml으로 4℃에서 밤새 코팅되고, 비조직 배양 처리된 T75 플라스크(Nunc, Rochester, NY)를 이용한다. 세포 부착의 증가를 위해 관-처리된 플루오르화 에틸렌 프로필렌 백(2PF-0072AC, American Fluoroseal Corporation, Gaithersburg, MD)을 또한 사용한다. PBMC를 항-CD3, 항-CD28-코팅된 플라스크에 100 U/ml IL-2가 보충된 배지 중 1×106 세포/ml로 접종한다. 레트로바이러스 형질도입을 위해, 레트로넥틴-코팅된 플라스크 또는 백을 레트로바이러스 포함 상층액 10ml으로 2 내지 3시간 동안 한번 로딩한다. 활성화 T 세포를 3:1 비율의 신선한 레트로바이러스 벡터 함유 배지와 T 세포 배양 배지 중에 10 U/ml IL-2를 보충하여 1×106 세포/ml로 접종한다. 다음날 아침 세포를 수거하고 100 U/ml IL-2가 보충된 배양 배지 중에 약 5×105 세포/ml 내지 8×105 세포/ml의 접종 농도로 조직 배양 처리된 T75 또는 T175 플라스크에서 확장한다.
CD19 면역자성 선별
필요한 경우 형질도입 후 4일에 CD19에 대해 면역자성 선별을 실시할 수 있다. 세포를 단클론 마우스 항-인간 CD19 항체로 접합된 상자성 마이크로비드 (Miltenyi Biotech, Auburn, CA)로 표지하고 소규모 실험에서는 MS 또는 LS 컬럼에서 대규모 실험에서는 클리니맥스 플러스 자동화 선별 장치에서 선별한다. CD19-선별된 세포를 추가 4일 동안 확장하고 형질도입 후 8일에 저온 보존한다. 이러한 세포를 "유전자 변형된 세포"라고 나타낸다.
실시예 6: 백혈병 환자의 치료
본 출원의 방법을 이용하여, 진행된 치료 난치성 백혈병에 걸린 백혈병 환자의 치료의 본 실시예는 다른 과증식 질환 또는 고형 종양과 같은 다른 병태 또는 질환에 또한 적용될 수 있다. 방법은 단일쇄 가변 단편은 표적 항원에 따라 변할 수 있다는 이해를 가지고 필수적으로 논의되는 바와 같이 이용될 수 있다.
T 세포를 유도성 키메라 신호전달 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산으로 형질도입한다. T 세포를 또한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산으로 형질도입한다. 유도성 CSM의 예는 CD28 폴리펩티드 세포질 자극 영역 및 4-1BB 폴리펩티드 세포질 신호전달 영역을 포함하는 [도 4]에 도시된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 유도성 CSM은 또한 CD3 제타 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체는 CD19를 인식하는 단일쇄 가변 단편을 포함한다.
환자는 림프구 고갈 조건화 후, 형질도입된 CD19-표적화 T 세포의 투여를 받는다. T 세포는 자기 유래의, 동종이형, 또는 비-동종이형이다. T 세포 투여 후, 리간드 유도 인자를 환자에게 투여하여, CD19-표적화 T 세포를 확장하기 위하여 키메라 신호전달 분자를 유도한다. 용량을 예를 들어 매일, 주 2회 또는 매주 제공할 수 있다. 종양 세포 수준을 모니터하고, 리간드 유도 인자, 예를 들어, AP1903, 투여 일정을 부하된 종양 세포를 기초로 하여 조정한다. 조절되지 않는 지나치게 빠른 속도로 T 세포 확장, 활성화 및 종양 세포 사멸이 일어나는 경우 불필요하게는 환자에게 유해한 더 심각한 사이토카인 폭풍을 일으킬 수 있다는 우려 때문에, 투여 일정을, 독성을 제한하는 속도로 완전하게 회복할 수 있도록 설계하여, 예를 들어 환자를 병원에서 집중 치료실 안에 들이지 않으면서 환자에게 광범위한 피해를 주지 않는다. 환자가 완전히 회복하고 정해진 일정 기간, 예를 들어 1개월, 3개월, 6개월 동안 질환이 없는 상태가 되면, AP1903의 투여를 중지한다. 치료 후, 리간드 유도 인자가 없는 경우, CD19-표적화 T 세포의 수가 감소된다. 낮은 수준의 기저 신호전달 상태가 될 수 있어 소수의 휴지의 CD19-표적화 T 세포가 생존하도록 한다. 리간드 유도 인자 없이, 이들 세포는 불활성인 상태가 되고 정상 B 세포가 회복할 수 있게 된다. 앞으로 언제인가, 환자는 백혈병 재발로 발전하는 경우, 리간드 유도 인자, AP1903의 투여를 재개하여, CD19-표적화 T 세포를 재활성화하여 환자에서 완전히 반응의 재유도를 유발할 것이다. 상기 추가 투여는 여러 차례 재발되는 경우 1회 초과하여 반복될 수 있다.
실시예 7: CAR 형질전환된 T 세포에서 iMC 활성의 측정
목표: T 세포의 AP1903 활성화를 가능하게 하는 두 개의 FKBPv36 분자에 연결된 신호전달 분자를 코딩하는 레트로바이러스 벡터를 갖는 1차 T 세포를 형질도입하기 위하여. 본 실험은 절단된 MyD88 및 CD40 폴리펩티드를 포함하는 유도성 공자극 분자가 CAPAN-1(췌장장 선암종) 종양 세포 상에 고발현되는 전립선 줄기세포 항원(PSCA)을 인식하는 CAR로도 형질도입된 T 세포에 의해 GFP 변형된 CAPAN-1의 사멸을 향상시키는지 조사하기 위해 고안된다.
방법:
유도성 T 세포 분자의 설계 및 클로닝:
1. T 세포의 형질도입은 RV-172 (SFG-Myr.MyD88/CD40.Fv.Fv'.2A.ΔCD19) 및 RV-89 (SFG.PSCAscFv.CH2CH3.CD28.zeta)로 실시한다. scFv는 인간화 단클론 항체, 1G8 (US2012077962 A1에서 인간화 항-PSCA로부터 유래)로부터 scFv를 이용하여 PSCA를 표적화한다. 이것은 인간 IgG1의 CH2CH3 영역에 연결되고, 차례로 분자의 막관통 및 세포질 부분을 둘 다 포함하는 CD28에 연결된다. CD28은 CD3 제타의 세포질 부분에 연결된다.
레트로바이러스의 생산:
2. 이전의 실시예에서와 필수적으로 동일하다.
GFP-표지된 CAPAN-1(췌장 선암종) 세포주의 생성:
3. CAPAN-1을 ATCC로부터 구입하였다. 이어서, 세포주를 EGFP/반딧불이 루시퍼라제 융합 단백질, 및 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 pBP0168-pcDNA3.1-EGFPluc 플라스미드로 형질감염에 의해 유전자 변형하여 G418 항생제와 함께 배양함으로써 시간에 걸쳐 안정하게 형질감염된 세포의 선별을 가능하게 한다. 배양 후, GFP 고발현 클론을 선별하고 >95% GFP인 세포주를 얻을 때까지 계대배양하였다.
CAPAN-1 종양 세포와 iMC 활성화 T 세포의 공동 배양:
3. 형질도입되지 않은 T 세포 또는 RV-89(PSCA CAR) 또는 RV-172(iMC 벡터)로 형질도입된 세포를 T 세포 대 종양 5:1 비율로 10 nM AP1903의 존재 또는 부재하에 50 U/ml IL-2가 보충된 배지에서 배양하였다. 이어서 공동 배양물을 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 계속하여 배양물을 형광현미경 관찰에 의해 분석하고 0.25% 트립신/EDTA와 함께 배양물을 수거하고 유세포분석에 의해 배양물 내 GFP+CD3- 종양 세포의 빈도를 측정하여, GFP+ 종양 세포의 존재에 대하여 분석하였다.
결과:
1. 세포를 형광 현미경 관찰법으로 조사하여 유도성 공자극 분자-및 키메라 항원 수용체-형질도입된 T 세포를 포함하고 AP1903 받은 웰에서 종양 세포 내 사멸에 있어 개선을 평가한다.
2. 유세포 분석을 이용하여 트립신 처리 후 배양물 중 GFP+ 세포를 분석하여 AP1903이 상기 단기간 배양 기간(72시간)에 종양 세포 수의 감소에 기여하는지를 판단한다. 배양 기간은 대략 5일로 연장될 수 있다. 유세포 분석 플롯은 두 바이러스 모두로 형질도입되고 AP1903을 받은, 5:1 비율에서 웰 내 GFP+ 세포의 감소를 나타낼 수 있다.
3. 잔여 생존 CAPAN-1-GFP 세포를 AP1903이 없는 NT T 세포의 조건에 정규화하여 종양 세포 사멸에 대한 iMC 활성화의 효과를 나타낸다
실시예 8: 구체적인 핵산 및 아미노산 서열의 예
하기 서열은 유도성 키메라 신호전달 분자(CSM) 서열에 차례로 사용된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 예를 제공한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
다음은 키메라 항원 수용체(CAR) 서열(차례로, scFV 단편 없이)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 예이다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
추가의 키메라 신호전달 분자 서열
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
유도성 MyD88 /CD40 키메라 폴리펩티드의 추가 서열
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 9: 대표적인 실시양태
본 기술의 특정 실시양태의 예를 아래에 제공한다.
A1. 키메라 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 조성물로서, 키메라 단백질이 막 표적화 영역, 다량체화 영역, 및 CD27, CD28, ICOS, 4-1BB, 및 OX40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공자극 폴리펩티드 세포질 신호전달 영역을 포함하는 것인 조성물.
A2. 실시양태 A1에 있어서, 키메라 단백질이 CD27, CD28, ICOS, 4-1BB, 및 OX40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 공자극 폴리펩티드 세포질 신호전달 영역을 더 포함하는 것인 조성물.
A3. 실시양태 A2에 있어서, 공자극 폴리펩티드 세포질 신호전달 영역이 CD28 세포질 신호전달 영역 및 4-1BB 세포질 신호전달 영역을 포함하는 것인 조성물.
A4. 실시양태 A2에 있어서, 공자극 폴리펩티드 세포질 신호전달 영역이 CD28 세포질 신호전달 영역 폴리펩티드 및 4-1BB 세포질 신호전달 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 조성물.
A5. 실시양태 A1 내지 A4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 키메라 단백질이 CD3ζ 폴리펩티드를 더 포함하는 것인 조성물.
A6. 실시양태 A1 내지 A5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체 리간드 결합 영역이 FKBP 리간드 결합 영역, 사이클로필린 수용체 리간드 결합 영역, 스테로이드 수용체 리간드 결합 영역, 사이클로필린 수용체 리간드 결합 영역, 및 테트라사이클린 수용체 리간드 결합 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
A7. 실시양태 A1 내지 A6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 리간드 결합 영역이 Fv'Fvls 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
A8. 실시양태 A1 내지 A6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 리간드 결합 영역이 FKBPv36 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
A9. 실시양태 A8에 있어서, 리간드 결합 영역이 Fv1 및 Fv2w 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
A10. 실시양태 A1 내지 A9 중 어느 한 실시양태에 있어서, 핵산이 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 것인 조성물.
A10.1. 실시양태 A10에 있어서, 프로모터가 발생적으로 조절되고 키메라 폴리펩티드가 발생적으로 분화된 세포에서 발현되는 것인 조성물.
A10.2. 실시양태 A10 또는 A10.1에 있어서, 프로모터가 조직 특이적이고 키메라 폴리펩티드가 특정 조직에서 발현되는 것인 조성물.
A10.3. 실시양태 A10에 있어서, 프로모터가 활성화 T 세포에서 활성화되는 것인 조성물.
A10.4. 실시양태 A10 내지 A10.3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 프로모터가 5'LTR 서열을 포함하는 것인 조성물.
A11. 실시양태 A1 내지 A10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 핵산이 바이러스 벡터에 포함되는 것인 조성물.
A12. 실시양태 A11에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 조성물.
A13. 실시양태 A1 내지 A10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 핵산이 플라스미드 내에 포함되는 것인 조성물.
A14. 실시양태 A1 내지 A13 중 어느 한 실시양태의 조성물로 형질전환 또는 형질감염된 세포.
A15. 실시양태 A14에 있어서, 세포가 T 세포, 종양 침윤 림프구, B 세포 또는 NK 세포인 세포.
A16. 실시양태 A15에 있어서, 세포가 신호 펩티드, 단일쇄 가변 단편, CH2-CH3 경첩 영역 및 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 형질전환 또는 형질도입되는 것인 세포.
A17. 실시양태 A16에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 종양 세포 상의 항원에 결합하는 것인 세포.
A18. 실시양태 A16에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 과증식 질환에 관련된 세포 상의 항원에 결합하는 것인 세포.
A19. 실시양태 A17 또는 A18 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 αPSMA, αPSCA, αMUC1, αCD19, αROR1, α메소텔린, αGD2 및 αHer2Neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포.
A20. 실시양태 A1 내지 A13, 또는 A14 내지 A17 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 이량체 리간드에 결합하는 것인 조성물 또는 세포.
A21. 실시양태 A20에 있어서, 리간드가 이량체 FK506, 또는 이량체 FK506 유사 유사체인 조성물 또는 세포.
A22. 실시양태 A21에 있어서, 리간드가 AP1903인 조성물 또는 세포.
A23. 면역 반응의 유도 방법으로서, 실시양태 A1 내지 A13 중 어느 한 실시양태의 조성물로 T 세포를 시험관 내 또는 생체 외 형질감염 또는 형질도입하는 단계를 포함하는 방법.
A24. 실시양태 A23에 있어서, 세포를 다량체화 영역에 결합하는 리간드와 접촉시켜, 다량체화를 유발하는 단계를 더 포함하는 방법.
A25. 실시양태 A24에 있어서, 리간드가 이량체인 방법.
A26. 실시양태 A24에 있어서, 리간드가 이량체 FK506, 또는 이량체 FK506 유사 유사체인 방법.
A27. 실시양태 A24에 있어서, 리간드가 AP1903인 방법.
A28. 실시양태 A23 내지 A27 중 어느 한 실시양태에 있어서, 형질감염 또는 형질전환된 세포를 피험체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
A29. 실시양태 A28에 있어서, 세포가 피 내 또는 피하 투여에 의해 피험체에게 투여되는 것인 방법.
A30. 생체 내 면역 반응의 유도 방법으로서, 피험체에게 실시양태 A1 내지 A13 중 어느 한 실시양태의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
A31. 실시양태 A30에 있어서, 피험체에게 다량체화 영역에 결합하는 리간드를 포함하는 조성물을 투여하여 다량체화를 유발하는 단계를 더 포함하는 방법.
A32. 실시양태 A31에 있어서, 리간드가 이량체인 방법.
A33. 실시양태 A31에 있어서, 리간드가 이량체 FK506, 또는 이량체 FK506 유사 유사체인 방법.
A34. 실시양태 A31에 있어서, 리간드가 AP1903인 방법.
A35. 실시양태 A28 내지 A34 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 과증식 질환을 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
A36. 실시양태 A28 내지 A34 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 종양을 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
B1. 유도성 키메라 신호전달 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로 형질전환 또는 형질감염된 세포로서, 유도성 키메라 신호전달 분자가 막 표적화 영역, 다량체화 영역, 및 TIR 도메인이 결여된 절단된 MyD88 폴리펩티드를 포함하는 것인 세포.
B1.1. 실시양태 B1에 있어서, 유도성 키메라 신호전달 분자가 세포외 도메인이 결여된 세포질 CD40 폴리펩티드를 더 포함하는 것인 세포.
B1.2. 유도성 키메라 신호전달 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로 형질전환 또는 형질감염된 세포로서, 유도성 키메라 신호전달 분자가 막 표적화 영역, 다량체화 영역, 및 세포 외 도메인이 결여된 세포질 CD40 폴리펩티드를 포함하는 것인 세포.
B2. 실시양태 B1 또는 B1.2중 어느 한 실시양태에 있어서, 절단된 MyD88 폴리펩티드가 서열 번호 86의 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 갖는 것인 세포.
B2.1. 실시양태 B1.1 또는 B1.2 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포질 CD40 폴리펩티드가 서열 번호 88의 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 갖는 것인 세포.
B3. 실시양태 B1 내지 B2.1 중 어느 한 실시양태에 있어서, 막 표적화 영역이 미리스토일화 표적화 서열인 세포.
B4-B6. 보류
B7. 실시양태 B1 내지 B3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 유도성 키메라 신호전달 분자가 CD3ζ 폴리펩티드를 더 포함하는 것인 세포.
B8. 실시양태 B1 내지 B7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 FKBP, 사이클로필린 수용체, 스테로이드 수용체, 테트라사이클린 수용체, 중쇄 항체 서브유닛, 경쇄 항체 서브유닛, 및 이들의 변이된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포.
B9. 실시양태 B1 내지 B8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 FKBP12 영역인 세포.
B10. 실시양태 B1 내지 B9 중 어느 한 실시양태에 있어서, FKB12 영역이 FKB12v36 영역인 세포.
B11. 실시양태 B1 내지 B8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 Fv'Fvls인 세포.
B12. 실시양태 B1 내지 B8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 FK506 이량체 및 이량체 FK506 유사체 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 리간드에 결합하는 것인 세포.
B13. 실시양태 B1 내지 B12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 리간드가 AP1903 또는 AP20187인 세포.
B14. 실시양태 B1 내지 B13 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 58의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 갖는 것인 세포.
B15. 실시양태 B1 내지 B14 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 57의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편에 의해 코딩되는 것인 세포.
B16. 실시양태 B14에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 세포.
B17. 실시양태 B15에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 59의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 세포.
B18. 실시양태 B14 또는 B16 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 세포.
B19. 실시양태 B15 또는 B17 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 59의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 세포.
B20. 실시양태 B14, B16, 또는 B18 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 58 또는 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 세포.
B21. 실시양태 B15, B17, 또는 B19 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 57 또는 서열 번호 59의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 세포.
B22. 실시양태 B1 내지 B21 중 어느 한 실시양태에 있어서, 핵산이 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것인 세포.
B23. 실시양태 B1 내지 B22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 핵산이 바이러스 벡터 내에 포함되는 것인 세포.
B24. 실시양태 B23에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인 세포.
B25. 실시양태 B24에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 쥐 백혈병 바이러스 벡터인 세포.
B26. 실시양태 B24에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 SFG 벡터인 세포.
B27. 실시양태 B23에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 세포.
B28. 실시양태 B23에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 세포.
B29. 실시양태 B1 내지 B22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 핵산이 플라스미드 내에 포함되는 것인 세포.
B30. 보류
B31. 실시양태 B1 내지 B30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 T 세포, 종양 침윤 림프구, NK-T 세포, 또는 NK 세포인 세포.
B32. 실시양태 B31에 있어서, 세포가 T 세포인 세포.
B33. 실시양태 B1 내지 B32 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 골수로부터 얻어지거나 제조되는 것인 세포.
B34. 실시양태 B1 내지 B32 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 제대혈로부터 얻어지거나 제조되는 것인 세포.
B35. 실시양태 B1 내지 B32 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 말초혈액으로부터 얻어지거나 제조되는 것인 세포.
B36. 실시양태 B1 내지 B32 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 말초 혈액 단핵 세포로부터 얻어지거나 제조되는 것인 세포.
B37. 실시양태 B31 내지 B36 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 인간세포인 세포.
B38. 실시양태 B1 내지 B37 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 신호 펩티드, 단일쇄 가변 단편, CH2-CH3 경첩 영역 및 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 유도성 키메라 신호전달 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산으로 추가로 형질전환 또는 형질도입되는 것인 세포.
B38.1. 실시양태 B38에 있어서, 유도성 키메라 신호전달 분자가 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하지 않는 것인 세포.
B38.2. 실시양태 B38 또는 B38.1에 있어서, 유도성 키메라 신호전달 분자가 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 것인 세포.
B39. 실시양태 B38 내지 B38.2 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 종양 세포 상의 항원에 결합하는 것인 세포.
B40. 실시양태 B38 내지 B38.2 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 과증식 질환에 관련된 세포 상의 항원에 결합하는 것인 세포.
B41. 실시양태 B38 내지 B40 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 αPSMA, αPSCA, αMUC1, αCD19, αROR1, α메소텔린, αGD2, αCD123, αMUC16, 및 αHer2/Neu 단일쇄 가변 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포.
B42. 실시양태 B38 내지 B40 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 αCD19 단일쇄 가변 단편인 세포.
B42.1. 실시양태 B38 내지 B40 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 αPSCA 단일쇄 가변 단편인 세포.
B43. 면역 반응의 유도 방법으로서, 실시양태 B1 내지 B42.1 중 어느 한 실시양태의 세포를 다량체화 영역에 결합하는 리간드와 접촉시켜, 유도성 키메라 신호전달 분자의 다량체화를 유발하는 단계를 포함하는 방법.
B44. 실시양태 B43에 있어서, 세포가 생체 내에서 리간드와 접촉되는 것인 방법.
B45. 실시양태 B43 또는 B44에 있어서, 리간드가 이량체인 방법.
B46. 실시양태 B45에 있어서, 리간드가 이량체 FK506, 또는 이량체 FK506 유사 유사체인 방법.
B47. 실시양태 B45에 있어서, 리간드가 AP1903 또는 AP20187인 방법.
B48. 실시양태 B43 내지 B47 중 어느 한 실시양태에 있어서, 형질감염 또는 형질전환된 세포를 피험체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
B49. 실시양태 B48에 있어서, 세포가 정맥 내 투여에 의해 피험체에게 투여되는 것인 방법.
B50-B56. 보류.
B56. 실시양태 B43-B49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 종양을 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
B57. 실시양태 B43 내지 B49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 암을 갖는 것인 방법.
B58 실시양태 B43 내지 B49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 고형 종양을 갖는 것인 방법.
B59. 실시양태 B58에 있어서, 세포가 종양 침윤 림프구 또는 T 세포인 방법.
B60. 실시양태 B58 또는 B59 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 종양상(tumor bed)에 전달되는 것인 방법.
B61. 실시양태 B57에 있어서, 암이 피험체의 혈액 또는 골수에 존재하는 것인 방법.
B62. 실시양태 B43 내지 B49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 혈액 또는 골수 질환을 갖는 것인 방법.
B63. 실시양태 B43 내지 B49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 줄기세포 이식에 의해 완화될 수 있는 임의의 병태 또는 장애를 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
B64. 실시양태 B43 내지 B49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 겸상 적혈구 빈혈증 또는 이염성 백질이영양증을 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
B65. 실시양태 B43 내지 B49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 환자가 원발성 면역결핍 질환, 혈구탐식성 림프조직구증(HLH) 또는 기타 혈구탐식성 장애, 유전성 골수 기능 부전증, 혈색소병증, 대사장애, 및 파골세포 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 병태를 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
B66. 실시양태 B43 내지 B49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 병태가 중증 복합 면역결핍증(SCID), 복합 면역결핍증(CID), 선천성 T 세포 결함/결핍증, 공통 가변성 면역결핍증(CVID), 만성 육아종증, IPEX 또는 IPEX 유사 질환, 비스코트-올드리치 증후군, CD40 리간드 결핍증, 백혈구 부착 결핍증, DOCK 8 결핍증, IL-10 결핍증/IL-10 수용체 결핍증, GATA 2 결핍증, X 연관 림프증식성 질환(XLP): 연골 털 형성 저하증, 슈바치만 다이아몬드 증후군, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 선천성 이상각화증, 판코니 빈혈증, 선천성 호중구 감소증, 겸상 적혈구병, 지중해 빈혈증, 점액 다당류증, 스핑고지질증, 및 골화석증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
B67. 피험체에서 백혈병의 치료 방법으로서, 실시양태 B1 내지 B42.1 중 어느 한 실시양태의 세포를 투여하는 단계, 및 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
B68. 실시양태 B67에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 CD19에 결합하는 것인 방법.
B69. 실시양태 B67 또는 B68에 있어서, 다량체 리간드가 AP1903 또는 AP20187인 방법.
B70. 실시양태 B67 내지 B69 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 T 세포인 방법.
B71. 실시양태 B43 내지 B70 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 인간인 방법.
B72. 실시양태 B43 내지 B71 중 어느 한 실시양태에 있어서, 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여해야 하는지를 판단하는 단계를 더 포함하는 방법.
B73. 실시양태 B43 내지 B72 중 어느 한 실시양태에 있어서, 질환 또는 병태 증상이 남아있거나 증상 감소 후에 확인되는 피험체에게 추가 용량의 다량체 리간드를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
B74. 실시양태 B73에 있어서, 피험체가 실시양태 1 내지 42.1 중 어느 한 실시양태의 세포의 투여 전에 질환 또는 병태를 갖는 것으로 진단받았고, 다량체 리간드의 투여 후에 질환 또는 병태가 확인되어, 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 것인 방법.
B75. 실시양태 B43 내지 B74 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체에서 병태 또는 질환의 존재, 부재 또는 단계를 확인하는 단계, 및 피험체에서 확인된 병태 또는 질환의 존재, 부재 또는 단계에 기초하여, 다량체 결합 영역에 결합하는 다량체 리간드를 투여하고, 환자에게 투여되는 다량체 리간드의 다음 투여량을 유지하거나 조정하기 위한 지시를 전달하는 단계를 더 포함하는 방법.
B76. 실시양태 B72 내지 B75 중 어느 한 실시양태에 있어서, 병태가 암인 방법.
B77. 실시양태 B72 내지 B75 중 어느 한 실시양태에 있어서, 병태가 백혈병인 방법.
B78. 실시양태 B72 내지 B75 중 어느 한 실시양태에 있어서, 병태가 고형 종양인 방법.
B79. 실시양태 B78에 있어서, 다량체 리간드의 투여 후 종양 크기 및/또는 종양 세포 수에 비해 피험체에서 종양 크기 증가 및/또는 종양 세포 수의 증가가 있는지 없는지를 판단하는 단계, 및 종양 크기 증가 및/또는 종양 세포 수의 증가가 있다고 판단되는 경우 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
B80. 실시양태 B77에 있어서, 다량체 리간드의 투여 후 CD19 발현 B 세포의 수준에 비해 피험체에서 CD19 발현 B 세포에 있어 증가가 있는지 없는지를 판단하는 단계, 및 CD19 발현 B 세포의 증가가 있다고 판단되는 경우 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
B81. 실시양태 B79에 있어서, 종양 크기 및/또는 종양 세포 수가 다량체 리간드의 투여 전의 종양 크기 및/또는 종양 세포 수에 비해 다량체 리간드의 투여 후에 감소되는 것인 방법.
B82. 실시양태 B80에 있어서, CD19 발현 B 세포의 수준이 다량체 리간드의 투여 전의 CD19 발현 B 세포의 수준에 비해 다량체 리간드의 투여 후에 감소되는 것인 방법.
B83. 실시양태 B43 내지 B74 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 HIV, 인플루엔자, 헤르페스, 바이러스성 간염, 엡스타인 바, 소아마비, 바이러스성 뇌염, 홍역, 수두, 거대세포 바이러스(CMV), 아데노바이러스(ADV), HHV-6(인간 헤르페스 바이러스 6, I), 및 유두종 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 병인의 감염을 갖는 것으로 진단받았거나, 폐렴, 결핵, 및 매독으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세균 병인의 감염을 갖는 것으로 진단받았거나, 또는 말라리아, 트리파노소마증, 리슈만편모충증, 트리코모나스증, 및 아메바증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기생생물 병인의 감염을 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
C1. 유도성 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로서, 유도성 키메라 항원 수용체가 다량체화 영역, TIR 도메인이 결여된 절단된 MyD88 폴리펩티드, 및 단일쇄 가변 단편을 포함하는 것인 조성물.
C1.1. 실시양태 C1에 있어서, 유도성 키메라 항원 수용체가 세포 외 도메인이 결여된 세포질 CD40 폴리펩티드를 더 포함하는 것인 조성물.
C1.2. 유도성 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로서, 유도성 키메라 항원 수용체가 다량체화 영역, 세포외 도메인이 결여된 세포질 CD40 폴리펩티드, 및 단일쇄 가변 단편을 포함하는 것인 조성물.
C2. 실시양태 C1 또는 C1.2 중 어느 한 실시양태에 있어서, 절단된 MyD88 폴리펩티드가 서열 번호 86의 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 갖는 것인 조성물.
C2.1. 실시양태 C1 또는 C1.2 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포질 CD40 폴리펩티드가 서열 번호 88의 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 갖는 것인 조성물.
C3-C6. 보류
C7. 실시양태 C1 내지 C2.1 중 어느 한 실시양태에 있어서, 유도성 키메라 항원 수용체가 CD3ζ 폴리펩티드를 더 포함하는 것인 조성물.
C8. 실시양태 C1 내지 C7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 FKBP, 사이클로필린 수용체, 스테로이드 수용체, 테트라사이클린 수용체, 중쇄 항체 서브유닛, 경쇄 항체 서브유닛, 및 이들의 변이된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
C9. 실시양태 C1 내지 C8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 FKBP12 영역인 조성물.
C10. 실시양태 C1 내지 C9 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 FKB12v36 영역인 조성물.
C11. 실시양태 C1 내지 C8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 Fv'Fvls인 조성물.
C12. 실시양태 C1 내지 C8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 FK506 이량체 및 이량체 FK506 유사체 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 리간드에 결합하는 것인 조성물.
C13. 실시양태 C1 내지 C12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 리간드가 AP1903 또는 AP20187인 조성물.
C14. 실시양태 C1 내지 C13 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 58의 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 갖는 것인 조성물.
C15. 실시양태 C1 내지 C14 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 57의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편에 의해 코딩되는 것인 조성물.
C16. 실시양태 C14에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 조성물.
C17. 실시양태 C15에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 59의 뉴클레오티드서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 조성물.
C18. 실시양태 C14 또는 C16에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 조성물.
C19. 실시양태 C15 또는 C17에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 59의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 조성물.
C20. 실시양태 C14, C16, 또는 C18 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 58 또는 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 조성물.
C21. 실시양태 C15, C17, 또는 C19 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 57 또는 서열 번호 59의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 조성물.
C22. 실시양태 C1 내지 C21 중 어느 한 실시양태에 있어서, 핵산이 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 것인 조성물.
C23. 실시양태 C1 내지 C22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 핵산이 바이러스 벡터 내에 포함되는 것인 조성물.
C24. 실시양태 C23에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인 조성물.
C25. 실시양태 C24에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 쥐 백혈병 바이러스 벡터인 조성물.
C26. 실시양태 C24에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 SFG 벡터인 조성물.
C27. 실시양태 C23에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 조성물.
C28. 실시양태 C23에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 조성물.
C29. 실시양태 C1 내지 C22 중 어느 한 실시양태에 있어서, 핵산이 플라스미드 내에 포함되는 것인 조성물.
C30. 실시양태 C1 내지 C29 중 어느 한 실시양태의 조성물로 형질도입 또는 형질전환된 세포.
C31. 실시양태 C30에 있어서, 세포가 T 세포, 종양 침윤 림프구, NK-T 세포, 또는 NK 세포인 세포.
C32. 실시양태 C31에 있어서, 세포가 T 세포인 세포.
C33. 실시양태 C1 내지 C3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 골수로부터 얻어지거나 제조되는 것인 세포.
C34. 실시양태 C1 내지 C3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 제대혈로부터 얻어지거나 제조되는 것인 세포.
C35. 실시양태 C1 내지 C3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 말초혈액으로부터 얻어지거나 제조되는 것인 세포.
C36. 실시양태 C1 내지 C3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 말초 혈액 단핵 세포로부터 얻어지거나 제조되는 것인 세포.
C37. 실시양태 C31 내지 C3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 인간 세포인 세포.
C38. 보류.
C39. 실시양태 C1 내지 C37 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 종양 세포 상의 항원에 결합하는 것인 세포.
C40. 실시양태 C1 내지 C37 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 과증식 질환에 관련된 세포 상의 항원에 결합하는 것인 세포.
C41. 실시양태 C1 내지 C40 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 αPSMA, αPSCA, αMUC1, αCD19, αROR1, α메소텔린, αGD2, αCD123, αMUC16, 및 αHer2/Neu 단일쇄 가변 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포.
C42. 실시양태 C1 내지 C40 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 αCD19 단일쇄 가변 단편인 세포.
C42.1. 실시양태 C1 내지 C40 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 αPSCA 단일쇄 가변 단편인 세포.
C43. 면역 반응의 유도 방법으로서, 실시양태 C1 내지 C42.1 중 어느 한 실시양태의 세포를 다량체화 영역에 결합하는 리간드와 접촉시켜, 유도성 키메라 항원 수용체의 다량체화를 유발하는 단계를 포함하는 방법.
C44. 실시양태 C43에 있어서, 세포가 생체 내에서 리간드와 접촉되는 것인 방법.
C45. 실시양태 C43 또는 C44에 있어서, 리간드가 이량체인 방법.
C46. 실시양태 C45에 있어서, 리간드가 이량체 FK506, 또는 이량체 FK506 유사 유사체인 방법.
C47. 실시양태 C45에 있어서, 리간드가 AP1903 또는 AP20187인 방법.
C48. 실시양태 C43 내지 C47 중 어느 한 실시양태에 있어서, 형질감염 또는 형질전환된 세포를 피험체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
C49. 실시양태 C48에 있어서, 세포가 정맥 내 투여에 의해 피험체에게 투여되는 것인 방법.
C50-C56. 보류.
C56. 실시양태 C43 내지 C49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 종양을 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
C57. 실시양태 C43 내지 C49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 암을 갖는 것인 방법.
C58 실시양태 C43 내지 C49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 고형 종양을 갖는 것인 방법.
C59. 실시양태 C58에 있어서, 세포가 종양 침윤 림프구 또는 T 세포인 방법.
C60. 실시양태 C58 또는 C59 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 종양상(tumor bed)에 전달되는 것인 방법.
C61. 실시양태 C57에 있어서, 암이 피험체의 혈액 또는 골수에 존재하는 것인 방법.
C62. 실시양태 C43 내지 C49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 혈액 또는 골수 질환을 갖는 것인 방법.
C63. 실시양태 C43 내지 C49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 줄기세포 이식에 의해 완화될 수 있는 임의의 병태 또는 장애를 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
C64. 실시양태 C43 내지 C49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 겸상 적혈구 빈혈증 또는 이염성 백질이영양증을 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
C65. 실시양태 C43 내지 C49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 환자가 원발성 면역결핍 질환, 혈구탐식성 림프조직구증(HLH) 또는 기타 혈구탐식성 장애, 유전성 골수 기능 부전증, 혈색소병증, 대사장애, 및 파골세포 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 병태를 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
C66. 실시양태 C43 내지 C49 중 어느 한 실시양태에 있어서, 병태가 중증 복합 면역결핍증(SCID), 복합 면역결핍증(CID), 선천성 T 세포 결함/결핍증, 공통 가변성 면역결핍증(CVID), 만성 육아종증, IPEX 또는 IPEX 유사 질환, 비스코트-올드리치 증후군, CD40 리간드 결핍증, 백혈구 부착 결핍증, DOCK 8 결핍증, IL-10 결핍증/IL-10 수용체 결핍증, GATA 2 결핍증, X 연관 림프증식성 질환(XLP): 연골 털 형성 저하증, 슈바치만 다이아몬드 증후군, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 선천성 이상각화증, 판코니 빈혈증, 선천성 호중구 감소증, 겸상 적혈구병, 지중해 빈혈증, 점액 다당류증, 스핑고지질증, 및 골화석증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
C67. 피험체에서 백혈병의 치료 방법으로서, 실시양태 C1 내지 C42.1 중 어느 한 실시양태의 세포를 투여하는 단계, 및 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
C68. 실시양태 C67에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 CD19에 결합하는 것인 방법.
C69. 실시양태 C67 또는 C68에 있어서, 다량체 리간드가 AP1903 또는 AP20187인 방법.
C70. 실시양태 C67 내지 C69 중 어느 한 실시양태에 있어서, 세포가 T 세포인 방법.
C71. 실시양태 C43 내지 C70 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 인간인 방법.
C72. 실시양태 C43 내지 C71 중 어느 한 실시양태에 있어서, 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여해야 하는지를 판단하는 단계를 더 포함하는 방법.
C73. 실시양태 C43 내지 C72 중 어느 한 실시양태에 있어서, 질환 또는 병태 증상이 남아있거나 증상 감소 후에 확인되는 피험체에게 추가 용량의 다량체 리간드를 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
C74. 실시양태 C73에 있어서, 피험체가 실시양태 1 내지 42.1 중 어느 한 실시양태의 세포의 투여 전에 질환 또는 병태를 갖는 것으로 진단받았고, 다량체 리간드의 투여 후에 질환 또는 병태가 확인되어, 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 것인 방법.
C75. 실시양태 C43 내지 C74 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체에서 병태 또는 질환의 존재, 부재 또는 단계를 확인하는 단계, 및 피험체에서 확인된 병태 또는 질환의 존재, 부재 또는 단계에 기초하여, 다량체 결합 영역에 결합하는 다량체 리간드를 투여하고, 환자에게 투여되는 다량체 리간드의 다음 투여량을 유지하거나 조정하기 위한 지시를 전달하는 단계를 더 포함하는 방법.
C76. 실시양태 C72 내지 C75 중 어느 한 실시양태에 있어서, 병태가 암인 방법.
C77. 실시양태 C72 내지 C75 중 어느 한 실시양태에 있어서, 병태가 백혈병인 방법.
C78. 실시양태 C72 내지 C75 중 어느 한 실시양태에 있어서, 병태가 고형 종양인 방법.
C79. 실시양태 C78에 있어서, 다량체 리간드의 투여 후 종양 크기 및/또는 종양 세포 수에 비해 피험체에서 종양 크기 증가 및/또는 종양 세포 수의 증가가 있는지 없는지를 판단하는 단계, 및 종양 크기 증가 및/또는 종양 세포 수의 증가가 있다고 판단되는 경우 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
C80. 실시양태 C77에 있어서, 다량체 리간드의 투여 후 CD19 발현 B 세포의 수준에 비해 피험체에서 CD19 발현 B 세포에 있어 증가가 있는지 없는지를 판단하는 단계, 및 CD19 발현 B 세포의 증가가 있다고 판단되는 경우 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
C81. 실시양태 C79에 있어서, 종양 크기 및/또는 종양 세포 수가 다량체 리간드의 투여 전의 종양 크기 및/또는 종양 세포 수에 비해 다량체 리간드의 투여 후에 감소되는 것인 방법.
C82. 실시양태 C80에 있어서, CD19 발현 B 세포의 수준이 다량체 리간드의 투여 전의 CD19 발현 B 세포의 수준에 비해 다량체 리간드의 투여 후에 감소되는 것인 방법.
C83. 실시양태 C43 내지 C74 중 어느 한 실시양태에 있어서, 피험체가 HIV, 인플루엔자, 헤르페스, 바이러스성 간염, 엡스타인 바, 소아마비, 바이러스성 뇌염, 홍역, 수두, 거대세포 바이러스(CMV), 아데노바이러스(ADV), HHV-6(인간 헤르페스 바이러스 6, I), 및 유두종 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 병인의 감염을 갖는 것으로 진단받았거나, 폐렴, 결핵, 및 매독으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세균 병인의 감염을 갖는 것으로 진단받았거나, 또는 말라리아, 트리파노소마증, 리슈만편모충증, 트리코모나스증, 및 아메바증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기생생물 병인의 감염을 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
본원에서 참조되는 각 특허, 특허 출원, 간행물 및 문서의 전문은 이로써 참고에 포함된다. 상기 특허, 특허 출원, 간행물 및 문서의 인용은 상기의 어떤 것도 적절한 선행 기술임을 인정하는 것은 아니며, 또한 상기 간행물 또는 문서의 내용 또는 날짜에 관해서도 전혀 인정하지 않는다.
상기 내용은 본 기술의 기본적인 측면을 벗어나지 않으면서 변형될 수 있다. 본 기술을 하나 이상의 구체적인 실시양태와 관련하여 실질적인 상세 내용으로 기재하였지만, 당 업자는 본 출원에 구체적으로 개시된 실시양태에 변화를 줄 수 있으나, 이러한 변형과 개선은 본 기술의 범위 및 취지 내에 있다는 것을 인식할 것이다.
본원에서 예시적으로 기재된 기술은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 어떤 요소(들)이 없는 경우에 적절하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에서 각각의 경우에 임의의 용어 "포함하는," "로 필수적으로 이루어진," 및 "로 이루어진"은 다른 두 용어 중 어느 것으로든 대체될 수 있다. 이용된 용어 및 표현은 설명하기 위하여 사용되지만 제한하기 위해 사용되지는 않으며, 이러한 용어 및 표현의 사용은 제시되고 기재된 특성의 임의의 등가물 또는 이의 일부분을 배제하지 않으며, 청구된 기술의 범위 내에서 여러 가지 변형이 가능하다. 용어 "하나"("a" 또는 "an")는 요소들 중 하나 또는 요소들 중 하나 초과 인지가 문맥적으로 명확하게 기재되지 않는 경우 그것이 수식하는 요소들 중 하나 또는 다수를 나타낼 수 있다(예를 들어, "시약(a reagent)"은 하나 이상의 시약을 의미할 수 있다). 본원에서 사용되는 용어 "약(about)"은 기본적인 파라미터의 10%(즉, ± 10%) 내에 있는 값을 나타내고, 일련의 값의 앞에 용어 "약"의 사용은 각각의 값을 수식한다(즉, "약 1, 2 및 3"은 약 1, 약 2 및 약 3을 나타낸다). 예를 들어, "약 100 그램"의 중량은 90 그램 내지 110 그램 사이의 중량을 포함할 수 있다. 또한, 본원에서 값을 열거하여 기재할 때(예를 들어, 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 또는 86%), 열거 값은 이들의 중간에 있는 모든 값 및 소수 값을 포함한다(예를 들어, 54%, 85.4%). 따라서, 본 기술이 대표적인 실시양태에 의해 구체적으로 개시되었지만 본원에서 개시된 개념의 선택적인 특징, 변형 및 변이는 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변이는 본 기술의 범위에 있는 것으로 간주되는 것으로 이해되어야 한다.
본 기술의 특정 실시양태는 이어지는 청구항에 개시된다.
SEQUENCE LISTING <110> BELLICUM PHARMACEUTICALS, INC. <120> METHODS FOR CONTROLLING T CELL PROLIFERATION <130> BEL-2010-PC <140> PCT/US2014/026734 <141> 2014-03-13 <150> 61/783,445 <151> 2013-03-14 <160> 115 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 atggggagta gcaagagcaa gcctaaggac cccagccagc gc 42 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Met Gly Ser Ser Lys Ser Lys Pro Lys Asp Pro Ser Gln Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ctcgagtctg gcggtggatc cggag 25 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 5 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 17 agtgtagtta aaagaggaag aaaaaagttg ctgtatatat ttaaacaacc atttatgaga 60 ccagtgcaaa ccacccaaga agaagacgga tgttcatgca gattcccaga agaagaagaa 120 ggaggatgtg aattg 135 <210> 18 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln 1 5 10 15 Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser 20 25 30 Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 45 <210> 19 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 acgcgt 6 <210> 20 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Thr Arg 1 <210> 21 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 21 cgggtcaaat tcagccggag tgctgacgcc ccagcatacc aacagggaca aaaccaactc 60 tacaacgagc tcaacctggg tagacgcgag gagtacgacg ttctggataa gaggcggggc 120 cgggacccag agatgggggg caaacctcag cggcggaaga acccgcagga gggtctttat 180 aacgagctcc agaaggacaa gatggcggaa gcctattcag aaattgggat gaaaggcgag 240 agacgcaggg gaaaaggtca cgatggtctg tatcaaggac tgtcaaccgc caccaaagac 300 acttacgatg cgctccacat gcaggccctc cctccccgc 339 <210> 22 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 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Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 54 <211> 590 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 54 tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat 60 ggaaaaatac ataactgaga atagagaagt tcagatcaag gtcaggaaca gatggaacag 120 ctgaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa 180 gaacagatgg aacagctgaa tatgggccaa acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc 240 ccggctcagg gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc cagccctcag cagtttctag 300 agaaccatca gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa atgaccctgt gccttatttg 360 aactaaccaa tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc ttctgctccc cgagctcaat 420 aaaagagccc acaacccctc actcggggcg ccagtcctcc gattgactga gtcgcccggg 480 tacccgtgta tccaataaac cctcttgcag ttgcatccga cttgtggtct cgctgttcct 540 tgggagggtc tcctctgagt gattgactac ccgtcagcgg gggtctttca 590 <210> 55 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 55 ctcgagtctg gcggtggatc cggaggcgtt caagtagaaa caatcagccc aggagacgga 60 aggactttcc ccaaacgagg ccaaacatgc gtagttcatt atactgggat gctcgaagat 120 ggaaaaaaag tagatagtag tagagaccga aacaaaccat ttaaatttat gttgggaaaa 180 caagaagtaa taaggggctg ggaagaaggt gtagcacaaa tgtctgttgg ccagcgcgca 240 aaactcacaa tttctcctga ttatgcttac ggagctaccg gccaccccgg catcataccc 300 cctcatgcca cactggtgtt tgacgtcgaa ttgctcaaac tggaagtcga gggagtgcag 360 gtggagacga ttagtcctgg ggatgggaga acctttccaa agcgcggtca gacctgtgtt 420 gtccactaca ccggtatgct ggaggacggg aagaaggtgg actcttcacg cgatcgcaat 480 aagcctttca agttcatgct cggcaagcag gaggtgatcc gggggtggga ggagggcgtg 540 gctcagatgt cggtcgggca acgagcgaag cttaccatct cacccgacta cgcgtatggg 600 gcaacggggc atccgggaat tatccctccc cacgctacgc tcgtattcga tgtggagctc 660 ttgaagcttg agtctggcgg tggatccgga gtcgac 696 <210> 56 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 56 Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser 1 5 10 15 Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val 20 25 30 His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg 35 40 45 Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile 50 55 60 Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala 65 70 75 80 Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro 85 90 95 Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu 100 105 110 Lys Leu Glu Val Glu Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp 115 120 125 Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr 130 135 140 Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn 145 150 155 160 Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp 165 170 175 Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr 180 185 190 Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile 195 200 205 Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Val Asp 225 230 <210> 57 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 57 ggcgttcaag tagaaacaat cagcccagga gacggaagga ctttccccaa acgaggccaa 60 acatgcgtag ttcattatac tgggatgctc gaagatggaa aaaaagtaga tagtagtaga 120 gaccgaaaca aaccatttaa atttatgttg ggaaaacaag aagtaataag gggctgggaa 180 gaaggtgtag cacaaatgtc tgttggccag cgcgcaaaac tcacaatttc tcctgattat 240 gcttacggag ctaccggcca ccccggcatc ataccccctc atgccacact ggtgtttgac 300 gtcgaattgc tcaaactgga a 321 <210> 58 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 58 Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro 1 5 10 15 Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp 20 25 30 Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe 35 40 45 Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala 50 55 60 Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr 65 70 75 80 Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr 85 90 95 Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu 100 105 <210> 59 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 59 ggagtgcagg tggagacgat tagtcctggg gatgggagaa cctttccaaa gcgcggtcag 60 acctgtgttg tccactacac cggtatgctg gaggacggga agaaggtgga ctcttcacgc 120 gatcgcaata agcctttcaa gttcatgctc ggcaagcagg aggtgatccg ggggtgggag 180 gagggcgtgg ctcagatgtc ggtcgggcaa cgagcgaagc ttaccatctc acccgactac 240 gcgtatgggg caacggggca tccgggaatt atccctcccc acgctacgct cgtattcgat 300 gtggagctct tgaagcttga g 321 <210> 60 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 60 Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro 1 5 10 15 Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp 20 25 30 Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe 35 40 45 Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala 50 55 60 Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr 65 70 75 80 Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr 85 90 95 Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu 100 105 <210> 61 <400> 61 000 <210> 62 <400> 62 000 <210> 63 <400> 63 000 <210> 64 <400> 64 000 <210> 65 <400> 65 000 <210> 66 <400> 66 000 <210> 67 <400> 67 000 <210> 68 <400> 68 000 <210> 69 <400> 69 000 <210> 70 <400> 70 000 <210> 71 <400> 71 000 <210> 72 <400> 72 000 <210> 73 <400> 73 000 <210> 74 <400> 74 000 <210> 75 <400> 75 000 <210> 76 <400> 76 000 <210> 77 <400> 77 000 <210> 78 <400> 78 000 <210> 79 <400> 79 000 <210> 80 <400> 80 000 <210> 81 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 atggggagta gcaagagcaa gcctaaggac cccagccagc gc 42 <210> 82 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Met Gly Ser Ser Lys Ser Lys Pro Lys Asp Pro Ser Gln Arg 1 5 10 <210> 83 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 ctcgag 6 <210> 84 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Leu Glu 1 <210> 85 <211> 516 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 85 atggccgctg ggggcccagg cgccggatca gctgctcccg tatcttctac ttcttctttg 60 ccgctggctg ctctgaacat gcgcgtgaga agacgcctct ccctgttcct taacgttcgc 120 acacaagtcg ctgccgattg gaccgccctt gccgaagaaa tggactttga atacctggaa 180 attagacaac ttgaaacaca ggccgacccc actggcagac tcctggacgc atggcaggga 240 agacctggtg caagcgttgg acggctcctg gatctcctga caaaactggg acgcgacgac 300 gtactgcttg aactcggacc tagcattgaa gaagactgcc aaaaatatat cctgaaacaa 360 caacaagaag aagccgaaaa acctctccaa gtcgcagcag tggactcatc agtaccccga 420 acagctgagc ttgctgggat tactacactc gacgacccac tcggacatat gcctgaaaga 480 ttcgacgctt tcatttgcta ttgcccctct gacata 516 <210> 86 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 86 Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser 1 5 10 15 Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr 35 40 45 Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu 50 55 60 Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly 65 70 75 80 Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Asp Leu Leu Thr Lys Leu 85 90 95 Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp 100 105 110 Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro 115 120 125 Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu 130 135 140 Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg 145 150 155 160 Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile 165 170 <210> 87 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 87 aagaaagttg caaagaaacc cacaaataaa gccccacacc ctaaacagga accccaagaa 60 atcaatttcc cagatgatct ccctggatct aatactgccg ccccggtcca agaaaccctg 120 catggttgcc agcctgtcac ccaagaggac ggaaaagaat cacggattag cgtacaagag 180 agacaa 186 <210> 88 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 88 Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn Lys Ala Pro His Pro Lys Gln 1 5 10 15 Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr 20 25 30 Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln 35 40 45 Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln Glu Arg Gln 50 55 60 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 89 gtcgagtctg gcggtggatc cgga 24 <210> 90 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 90 Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 91 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 91 ggcgttcaag tagaaacaat cagcccagga gacggaagga ctttccccaa acgaggccaa 60 acatgcgtag ttcattatac tgggatgctc gaagatggaa aaaaagtaga tagtagtaga 120 gaccgaaaca aaccatttaa atttatgttg ggaaaacaag aagtaataag gggctgggaa 180 gaaggtgtag cacaaatgtc tgttggccag cgcgcaaaac tcacaatttc tcctgattat 240 gcttacggag ctaccggcca ccccggcatc ataccccctc atgccacact ggtgtttgac 300 gtcgaattgc tcaaactgga a 321 <210> 92 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 92 Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro 1 5 10 15 Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp 20 25 30 Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe 35 40 45 Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala 50 55 60 Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr 65 70 75 80 Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr 85 90 95 Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu 100 105 <210> 93 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 93 gtcgag 6 <210> 94 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Val Glu 1 <210> 95 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 95 ggagtgcagg tggagacgat tagtcctggg gatgggagaa cctttccaaa gcgcggtcag 60 acctgtgttg tccactacac cggtatgctg gaggacggga agaaggtgga ctcttcacgc 120 gatcgcaata agcctttcaa gttcatgctc ggcaagcagg aggtgatccg ggggtgggag 180 gagggcgtgg ctcagatgtc ggtcgggcaa cgagcgaagc ttaccatctc acccgactac 240 gcgtatgggg caacggggca tccgggaatt atccctcccc acgctacgct cgtattcgat 300 gtggagctct tgaagcttga g 321 <210> 96 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 96 tctggcggtg gatccggagt cgac 24 <210> 97 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Val Asp 1 5 <210> 98 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 98 cgcgcaaagc gt 12 <210> 99 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 99 Arg Ala Lys Arg 1 <210> 100 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 100 ggaaaaccta tacctaatcc attgctgggc ttagactcaa ca 42 <210> 101 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 101 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10 <210> 102 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 ggcagcggaa gc 12 <210> 103 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Gly Ser Gly Ser 1 <210> 104 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 gcaacgaatt tttccctgct gaaacaggca ggggacgtag aggaaaatcc tggtcct 57 <210> 105 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 105 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 106 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 acgcgt 6 <210> 107 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 107 Thr Arg 1 <210> 108 <211> 1002 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 108 atgccccctc ctagactgct gtttttcctg ctctttctca ccccaatgga agttagacct 60 gaggaaccac tggtcgttaa agtggaagaa ggtgataatg ctgtcctcca atgccttaaa 120 gggaccagcg acggaccaac gcagcaactg acttggagcc gggagtcccc tctcaagccg 180 tttctcaagc tgtcacttgg cctgccaggt cttggtattc acatgcgccc ccttgccatt 240 tggctcttca tattcaatgt gtctcaacaa atgggtggat tctacctttg ccagcccggc 300 cccccttctg agaaagcttg gcagcctgga tggaccgtca atgttgaagg ctccggtgag 360 ctgtttagat ggaatgtgag cgaccttggc ggactcggtt gcggactgaa aaataggagc 420 tctgaaggac cctcttctcc ctccggtaag ttgatgtcac ctaagctgta cgtgtgggcc 480 aaggaccgcc ccgaaatctg ggagggcgag cctccatgcc tgccgcctcg cgattcactg 540 aaccagtctc tgtcccagga tctcactatg gcgcccggat ctactctttg gctgtcttgc 600 ggcgttcccc cagatagcgt gtcaagagga cctctgagct ggacccacgt acaccctaag 660 ggccctaaga gcttgttgag cctggaactg aaggacgaca gacccgcacg cgatatgtgg 720 gtaatggaga ccggccttct gctccctcgc gctaccgcac aggatgcagg gaaatactac 780 tgtcatagag ggaatctgac tatgagcttt catctcgaaa ttacagcacg gcccgttctt 840 tggcattggc tcctccggac tggaggctgg aaggtgtctg ccgtaacact cgcttacttg 900 attttttgcc tgtgtagcct ggttgggatc ctgcatcttc agcgagccct tgtattgcgc 960 cgaaaaagaa aacgaatgac tgaccctaca cgacgattct ga 1002 <210> 109 <211> 333 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 109 Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met 1 5 10 15 Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp 20 25 30 Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln 35 40 45 Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile 65 70 75 80 Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu 85 90 95 Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr 100 105 110 Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp 115 120 125 Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro 130 135 140 Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala 145 150 155 160 Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro 165 170 175 Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro 180 185 190 Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser 210 215 220 Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp 225 230 235 240 Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala 245 250 255 Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu 260 265 270 Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly 275 280 285 Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu 290 295 300 Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg 305 310 315 320 Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe 325 330 <210> 110 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 110 Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro 1 5 10 15 Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp 20 25 30 Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe 35 40 45 Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala 50 55 60 Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr 65 70 75 80 Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr 85 90 95 Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu 100 105 <210> 111 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Met Gly Ser Asn Lys Ser Lys Pro Lys Asp Ala Ser Gln Arg Arg Arg 1 5 10 15 <210> 112 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid <400> 112 Met Gly Cys Xaa Cys 1 5 <210> 113 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 113 Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 114 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 114 Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 115 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe 1 5

Claims (83)

  1. 유도성 키메라 신호전달 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함하는 조성물로서, 유도성 키메라 신호전달 분자가 막 표적화 영역, 다량체화 영역, 및 CD27, CD28, ICOS, 4-1BB, CD40, RANK/TRANCE-R, CD3 제타 사슬, 및 OX40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공자극 폴리펩티드 세포질 신호전달 영역을 포함하는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 막 표적화 영역이 미리스토일화 표적화 서열, 팔미토일화 표적화 서열, 프레닐화 서열(즉, 파르네실화, 제라닐-제라닐화, CAAX 박스), 단백질-단백질 상호작용 모티프 및 수용체로부터의 막관통 서열(신호 펩티드를 이용함)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 막 표적화 영역이 미리스토일화 표적화 서열인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 키메라 신호전달 분자가 CD27, CD28, ICOS, 4-1BB, CD40, RANK/TRANCE-R, CD3 제타 사슬, 및 OX40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 공자극 폴리펩티드 세포질 신호전달 영역을 더 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 공자극 폴리펩티드 세포질 신호전달 영역이 CD28 세포질 신호전달 영역 및 4-1BB 세포질 신호전달 영역을 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 공자극 폴리펩티드 세포질 신호전달 영역이 OX40 세포질 신호전달 영역 폴리펩티드 및 4-1BB 세포질 신호전달 영역 폴리펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 키메라 신호전달 분자가 CD3ζ 폴리펩티드를 더 포함하는 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 다량체화 영역이 FKBP, 사이클로필린 수용체, 스테로이드 수용체, 테트라사이클린 수용체, 중쇄 항체 서브유닛, 경쇄 항체 서브유닛, 및 이들의 변이된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 다량체화 영역이 FKBP12 영역인 조성물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, FKB12 영역이 FKB12v36 영역인 조성물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 다량체화 영역이 Fv'Fvls인 조성물.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 다량체화 영역이 FK506 이량체 및 이량체 FK506 유사체 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 리간드에 결합하는 것인 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 AP1903 또는 AP20187인 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 58 의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 갖는 것인 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 57의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 기능적 단편에 의해 코딩되는 것인 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 59의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 조성물.
  18. 제14항 또는 제16항에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 조성물.
  19. 제15항 또는 제17항에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 59의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 조성물.
  20. 제14항, 제16항, 또는 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 58 또는 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 조성물.
  21. 제15항, 제17항, 또는 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 다량체화 영역이 서열 번호 57 또는 서열 번호 59의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 더 포함하는 것인 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 것인 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 바이러스 벡터 내에 포함되는 것인 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 쥐 백혈병 바이러스 벡터인 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 쥐 백혈병 바이러스 벡터가 MoMLV 벡터인 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 SFG 벡터인 조성물.
  28. 제23항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인 조성물.
  29. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 플라스미드 내에 포함되는 것인 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환 또는 형질감염된 세포.
  31. 제30항에 있어서, 세포가 T 세포, 종양 침윤 림프구, B 세포, NK 세포, 또는 NK-T 세포인 세포.
  32. 제30항에 있어서, 세포가 T 세포인 세포.
  33. 제30항에 있어서, 세포가 골수로부터 얻어지거나 제조되는 것인 세포.
  34. 제30항에 있어서, 세포가 제대혈로부터 얻어지거나 제조되는 것인 세포.
  35. 제30항에 있어서, 세포가 말초 혈액으로부터 얻어지거나 제조되는 것인 세포.
  36. 제30항에 있어서, 세포가 말초 혈액 단핵 세포로부터 얻어지거나 제조되는 것인 세포.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 인간 세포인 세포.
  38. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 신호 펩티드, 단일쇄 가변 단편, CH2-CH3 경첩 영역 및 CD3ζ 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산으로 추가로 형질전환 또는 형질도입되는 것인 세포.
  39. 제38항에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 종양 세포 상의 항원에 결합하는 것인 세포.
  40. 제39항에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 과증식 질환에 관련된 세포 상의 항원에 결합하는 것인 세포.
  41. 제38항 내지 40항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 αPSMA, αPSCA, αMUC1, αCD19, αROR1, α메소텔린, αGD2, αCD123, αMUC16, 및 αHer2/Neu 단일쇄 가변 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포.
  42. 제38항 내지 40항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 αCD19 단일쇄 가변 단편인 세포.
  43. 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 세포를 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물로 시험관 내 또는 생체 외 형질감염 또는 형질도입하는 단계를 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 세포를 다량체화 영역에 결합하는 리간드와 접촉시켜, 유도성 키메라 신호전달 분자의 다량체화를 유발하는 단계를 더 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 리간드가 이량체인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 리간드가 이량체 FK506, 또는 이량체 FK506 유사 유사체인 방법.
  47. 제44항에 있어서, 리간드가 AP1903 또는 AP20187인 방법.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 형질감염 또는 형질전환된 세포를 피험체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 세포를 정맥 내 투여에 의해 피험체에게 투여하는 것인 방법.
  50. 생체 내 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 피험체에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 피험체에게 다량체화 영역에 결합하는 리간드를 포함하는 조성물을 투여하여, 유도성 키메라 신호전달 분자의 다량체화를 유발하는 단계를 더 포함하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 리간드가 이량체인 방법.
  53. 제51항에 있어서, 리간드가 이량체 FK506, 또는 이량체 FK506 유사 유사체인 방법.
  54. 제51항에 있어서, 리간드가 AP1903 또는 AP20187인 방법.
  55. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 과증식 질환을 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
  56. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 종양을 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
  57. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 암을 갖는 것인 방법.
  58. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 고형 종양을 갖는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 세포가 종양 침윤 림프구 또는 T 세포인 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 세포가 종양상(tumor bed)에 전달되는 것인 방법.
  61. 제57항에 있어서, 암이 피험체의 혈액 또는 골수에 존재하는 것인 방법.
  62. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 혈액 또는 골수 질환을 갖는 것인 방법.
  63. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 줄기세포 이식에 의해 완화될 수 있는 임의의 병태 또는 장애를 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
  64. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 겸상 적혈구 빈혈증 또는 이염성 백질이영양증을 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
  65. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 원발성 면역결핍 질환, 혈구탐식성 림프조직구증(HLH: hemophagocytosis lymphohistiocytosis) 또는 기타 혈구탐식성 장애, 유전성 골수 기능 부전증, 혈색소병증, 대사장애, 및 파골세포 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 병태를 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
  66. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 중증 복합 면역결핍증(SCID: Severe Combined Immune Deficiency), 복합 면역결핍증(CID), 선천성 T 세포 결함/결핍증, 공통 가변성 면역결핍증(CVID: Common Variable Immune Deficiency), 만성 육아종증, IPEX[면역결핍(Immune deficiency), 다발성 내분비병증(polyendocrinopathy), 장질환(enteropathy), X 연관(X-linked)] 또는 IPEX 유사 질환, 비스코트-올드리치 증후군, CD40 리간드 결핍증, 백혈구 부착 결핍증, DOCK 8 결핍증, IL-10 결핍증/IL-10 수용체 결핍증, GATA 2 결핍증, X 연관 림프증식성 질환(XLP: X-linked lymphoproliferative disease): 연골 털 형성 저하증, 슈바치만 다이아몬드 증후군, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 선천성 이상각화증, 판코니 빈혈증, 선천성 호중구 감소증, 겸상 적혈구병, 지중해 빈혈증, 점액 다당류증, 스핑고지질증, 및 골화석증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병태를 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
  67. 피험체의 백혈병을 치료하는 방법으로서, 피험체에게 제38항의 조성물을 투여하는 단계 및 다량체 리간드를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 단일쇄 가변 단편이 CD19에 결합하는 것인 방법.
  69. 제67항 또는 68항에 있어서, 다량체 리간드가 AP1903 또는 AP20187인 방법.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포인 방법.
  71. 제43항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 인간인 방법.
  72. 제43항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여해야 하는지를 판단하는 단계를 더 포함하는 방법.
  73. 제43항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 병태 증상이 남아있거나 증상 감소 후에 확인되는 피험체에게 추가 용량의 다량체 리간드를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 피험체가 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 조성물 또는 세포의 투여 전에 질환 또는 병태를 갖는 것으로 진단받았고, 다량체 리간드의 투여 후에 질환 또는 병태가 확인되어, 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 것인 방법.
  75. 제43항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
    피험체에서 병태 또는 질환의 존재, 부재 또는 단계를 확인하는 단계, 및
    피험체에서 확인된 병태 또는 질환의 존재, 부재 또는 단계에 기초하여, 다량체 결합 영역에 결합하는 다량체 리간드를 투여하고, 환자에게 투여되는 다량체 리간드의 다음 투여량을 유지하거나 조정하기 위한 지시를 전달하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  76. 제72항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 병태가 암인 방법.
  77. 제72항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 병태가 백혈병인 방법.
  78. 제72항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 병태가 고형 종양인 방법.
  79. 제78항에 있어서,
    다량체 리간드의 투여 후 종양 크기 및/또는 종양 세포 수에 비해 피험체에서 종양 크기 증가 및/또는 종양 세포 수의 증가가 있는지 없는지를 판단하는 단계, 및
    종양 크기 증가 및/또는 종양 세포 수의 증가가 있다고 판단되는 경우 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  80. 제77항에 있어서,
    다량체 리간드의 투여 후 CD19 발현 B 세포의 수준에 비해 피험체에서 CD19 발현 B 세포에 있어 증가가 있는지 없는지를 판단하는 단계, 및
    피험체에서 CD19 발현 B 세포의 증가가 있다고 판단되는 경우 추가 용량의 다량체 리간드를 피험체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  81. 제79항에 있어서, 종양 크기 및/또는 종양 세포 수가 다량체 리간드의 투여 전의 종양 크기 및/또는 종양 세포 수에 비해 다량체 리간드의 투여 후에 감소되는 것인 방법.
  82. 제80항에 있어서, CD19 발현 B 세포의 수준이 다량체 리간드의 투여 전의 CD19 발현 B 세포의 수준에 비해 다량체 리간드의 투여 후에 감소되는 것인 방법.
  83. 제48항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체가 HIV, 인플루엔자, 헤르페스, 바이러스성 간염, 엡스타인 바, 소아마비, 바이러스성 뇌염, 홍역, 수두, 거대세포 바이러스(CMV: Cytomegalovirus), 아데노바이러스(ADV: adenovirus), HHV-6(인간 헤르페스 바이러스 6, I: human herpesvirus 6, I), 및 유두종 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 병인의 감염을 갖는 것으로 진단받았거나, 폐렴, 결핵, 및 매독으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세균 병인의 감염을 갖는 것으로 진단받았거나, 또는 말라리아, 트리파노소마증, 리슈만편모충증, 트리코모나스증, 및 아메바증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기생생물 병인의 감염을 갖는 것으로 진단받은 것인 방법.
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