KR20220004019A

KR20220004019A - 내산화성을 갖는 변형된 글루카곤 분자 및 제형 및 이를 이용하는 방법 및 키트

Info

Publication number: KR20220004019A
Application number: KR1020217031474A
Authority: KR
Inventors: 엘리자베스 엠. 탑; 마크. 엘. 하이만
Original assignee: 퍼듀 리서치 파운데이션; 모논 바이오벤처스, 엘엘씨
Priority date: 2019-03-15
Filing date: 2020-03-16
Publication date: 2022-01-11
Also published as: EP3937970A1; JP2022526716A; WO2020190857A1; EP3937970A4; US20220153803A1

Abstract

변형된 글루카곤 분자 및 완충액 및/또는 부형제 용액이 제공되어 글루카곤 분자가 실질적으로 중성인 pH에서 저장될 때 산화에 저항력이 있게 된다. 이러한 변형된 글루카곤 분자는 27번 위치에 치환을 포함하고, 천연 메티오닌은 메티오닌 모방 유사체, 노르류신, 또는 전술한 것 중 어느 하나의 이성질체로 대체된다. 선택적으로, 변형된 글루카곤 분자는 추가로 인산화되어 실질적으로 중성인 pH에서 향상된 용해도 및 피브릴화에 대한 저항성을 초래할 수 있다. 약제학적 조성물 및 치료 키트에서 이러한 분자를 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

내산화성을 갖는 변형된 글루카곤 분자 및 제형 및 이를 이용하는 방법 및 키트

우선권

본원은 2019년 3월 15일자로 출원된 미국 임시 특허 출원 일련 번호 62/818,826(Topp 등)의 우선권 이점과 관련되고 그를 주장한다. 본원은 추가로 62/195,537(Topp 등, 2015년 7월 22일 출원)와 관련되고 그의 우선권 이점을 주장하는 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/043495(Topp 등, 2016년 7월 22일 출원)의 371 국내 단계 출원이고, 그의 우선권 이점을 주장하는 미국 특허 출원 일련 번호 15/745,483(Topp 등, 2018년 1월 17일 출원, 및 현재 미국 특허 번호 10,308,701로 특허됨)와 관련되지만 그에 대한 우선권을 주장하지 않는다 (집합적으로, "관련된 개시내용"). 전술한 출원의 내용은 그 전체가 본 개시내용에 참조로 포함된다.

정부 지원의 진술

본 발명은 National Institute of Health Small Business Innovation Research에서 수여한 R44DK121594-01 하에 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.

당뇨병은 췌장이 충분한 인슐린을 생산하지 못하거나 신체가 생산한 인슐린을 효과적으로 사용할 수 없을 때 발생하는 만성 질환이다. 인슐린은 혈당을 조절하는 호르몬이다. 제1형 당뇨병은 인슐린 생산이 결핍되어 매일 인슐린을 투여할 필요가 있음을 특징으로 한다. 제1형 당뇨병의 원인은 현재 알려져 있지 않으며 현재 지식으로는 예방할 수 없지만; 병태를 관리할 수 있다. 제2형 당뇨병은 신체의 비효율적인 인슐린 사용으로 인해 발생한다. 제2형 당뇨병은 전 세계 당뇨병 환자의 대다수를 차지한다.

추정 3천만 명의 미국인이 제1형 또는 제2형 당뇨병을 앓고 있으며 미국에서는 매년 150만 명이 새로 진단된다. 이러한 개체는 혈당이 건강한 수준으로 유지되도록 식이 요법, 운동, 의약품 및 혈당 모니터링을 수반하는 엄격한 일상을 유지해야 한다. 이 엄격한 레지멘을 따르지 않으면, 당뇨병 환자는 중증에서 중등도의 저혈당을 경험할 수 있다. 경증에서 중등도의 저혈당증의 증상에는 두통, 시야 흐림, 현기증, 발한, 쇠약 및 혼란이 포함되고; 이러한 경우 혈당 수준는 일반적으로 탄수화물 섭취로 회복될 수 있다. 그러나 심각한 저혈당증(제1형 당뇨병의 40% 및 제2형 당뇨병의 20%에서 적어도 1년에 한 번 발생)에서는, 발작과 의식불명을 경험하는 개체의 증상이 훨씬 더 쇠약해진다.

심각한 저혈당증의 경우, 저장된 글리코겐을 글루코스로 전환하여 혈류로 방출하는 호르몬인 글루카곤을 개체에게 근육내 또는 피하 주사해야 한다. 글루카곤은 혈당 수준를 회복시키는 데 효과적이지만, 저혈당증 이벤트는 투여가 지연되거나 부적절하게 수행되면 코마 또는 사망을 초래할 수 있다. 이러한 사례는 심각한 경제적 영향으로 이어진다: 심각한 저혈당증 에피소드를 치료하기 위해 매년 1억 2천만 달러의 응급실 방문과 수십억 달러의 입원이 지출된다. 이러한 비용은 당뇨병 환자의 인구 증가로 인해 증가할 것으로 예상된다.

글루카곤은 생명을 위협하는 저혈당증 치료에서 중요한 케어 의약으로 오랫동안 사용되어 왔다. 글루카곤은 글루코스 대사에 중요한 역할을 하는 췌장 a-세포에서 분비되는 29개 잔기의 펩타이드 호르몬이다. 당뇨병 환자가 휴대할 수 있는 키트로 상업적으로 제공되며 일반적으로 투여 직전에 묽은 염산 수용액에 용해되도록 의도된 동결건조 분말로 제공된다.

글루카곤의 중요한 문제는 분자가 중성 pH에서 물에 대한 용해도가 낮고 산성 pH에서 가용화되어야 한다는 것이다. 그러나 불용성 아밀로이드 β-피브릴을 비가역적으로 형성하는 산성 용액에서도 안정하지 않다. 글루카곤 아밀로이드 피브릴 형성은 약물의 효능을 손상시키고 독성 효과를 생성할 가능성이 있으며 용액 점도를 증가시켜 주입 펌프 또는 주입 펜을 사용하여 제형을 전달하는 데 어려움을 야기한다.

따라서, 이러한 용해도 및 안정성 문제로 인해, 상업적으로 입수가능한 키트는 동결건조 분말로 제형화된 글루카곤과 용매가 미리 채워진 주사기로 구성되어 있어, 투여 직전에 글루카곤을 재구성하고 투여 직후 잉여 용액을 폐기할 수 있다.

개체가 심각한 저혈당을 겪을 때, 그것은 높은 스트레스, 응급 상황이다. 따라서 응급 키트를 사용하는 기존 접근 방식은 제3자가 스트레스가 많은 조건에서 글루카곤을 성공적으로 재구성하고 용량을 투여하기 위해 여러 단계 절차를 탐색해야 한다. 제3자의 불안은 키트 미사용이나 투여 오류로 이어질 수 있으며, 키트 사용의 30% 이상에서 오류가 발생한다. 기존 제형과 관련된 바늘 노출의 불편함과 위험 및 투약 오류로 인해 글루카곤의 저혈당증 치료에 대한 안전성 및 효능에도 불구하고 글루카곤의 활용도가 저조하였다. 또한, 개체가 크기 때문에 휴대하기가 번거롭다고 느끼기 때문에 필요할 때 키트를 사용할 수 없는 경우가 많으며, 이는 저혈당증 구조를 위해 응급실에 대한 의존도를 증가시킨다. 기존 키트의 활용도가 낮고 이러한 키트 사용의 오류율은 글루카곤 구조 전략의 개선 필요성을 강조한다. 실제로, 심각한 저혈당증 이벤트를 경험하는 개체의 결과를 개선하고 전반적인 건강관리 비용을 줄이려면 더 광범위하고 효과적인 사용을 촉진하는 간단하고 사용하기 쉽고 비용 효율적인 솔루션이 필요하다.

또한, 글루카곤 용해도 및 안정성 문제는 폐쇄 루프 인공 췌장 장치의 개발을 방해하였다. 이러한 장치는 혈당 변동에 반응하여 인슐린과 글루카곤을 자동으로 투여할 수 있으며 당뇨병 환자의 삶의 질을 크게 개선할 수 있다. 동결건조된 글루카곤 제형을 인공 췌장에 사용하는 것은 비현실적이며, 혈당 변동에 따라 조절 가능한 양의 글루카곤 용액을 즉시 투여해야 한다. 따라서, 당뇨병 환자의 치료에 인공 췌장 장치의 잠재적인 이점을 실현하기 위해서는 안정적이고 안전한 글루카곤 대안이 필요하다.

본 개시내용은 실질적으로 중성 pH의 수용액에 가용성이고 내산화성인 변형된 글루카곤 분자 및 제형을 제공한다. 글루카곤에 대한 기존의 용해도 및 안정성 문제는 부분적으로 글루카곤 피브릴가 아밀로이드 β-피브릴을 형성하기 때문에 발생한다. 아밀로이드 β-피브릴은 β-스파인(spine)으로 알려진 긴 β-시트이고, 측쇄가 얽혀 나란히 상호 작용하여, 입체 지퍼를 형성한다. 본 개시내용의 양태는 입체 지퍼를 형성하기 위해 서로 상호작용하는 글루카곤 분자의 특정 아미노산 잔기를 변형시키는 것에 기초한다. 이들 아미노산의 상호작용을 방지하는 방식으로 아미노산을 변형하면 피브릴 형성이 억제되어, 분자의 용해도가 촉진된다. 또한, 특정 구현예에서, 내산화성을 촉진하기 위해 천연 글루카곤 또는 포스포글루카곤을 항산화 제형에 저장하거나 글루카곤 및/또는 포스포글루카곤을 변형시켜 메티오닌 잔기를 대체한다. 글루카곤을 안정한 용액으로 제형화하는 것은 현재의 용도에 대한 활용을 촉진할 뿐만 아니라 인공 췌장 장치 등을 통해 글루카곤의 치료 이점을 확대하기 위한 주요 단계이다.

본 개시내용의 적어도 하나의 예시적 구현예에서, 분자가 실질적으로 중성인 pH에서 가용성 및/또는 산화(시간 경과에 따른) 저항성이도록 변형된 서열번호:1(천연 글루카곤)을 포함하는 펩타이드가 제공된다. 예시적인 변형은 하나 이상의 아미노산이 가역적으로 인산화되어 아밀로이드 피브릴의 형성을 방지하고 추가로 27번 위치에 있는 메티오닌이 시간 경과에 따른 산화를 감소시키기 위해 치환된 변형이다. 27번 위치는 내산화성 메티오닌 모방 유사체 또는 그의 이성질체로 치환될 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, 메티오닌 모방 유사체는 노르류신 또는 그의 이성질체, 또는 메톡시닌 또는 그의 이성질체를 포함한다. 적어도 하나의 예시적인 구체예에서, 펩타이드는 서열번호:2를 포함하고, 여기서 X는 노르류신 또는 그의 이성질체, 또는 메톡시닌 또는 그의 이성질체를 포함한다.

펩타이드가 하나 이상의 아미노산에서 인산화되는 경우, 이러한 아미노산은 His¹, Ser², Thr⁵, Thr⁷, Ser⁸, Tyr¹⁰, Ser¹¹, Tyr^l3, Ser¹⁶, Thr²⁹, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

약제학적 조성물도 제공된다. 적어도 하나의 구현예에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 변형된 펩타이드 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염으로서, 변형된 펩타이드는 (a) 27번 위치의 아미노산이 내산화성 메티오닌 모방 유사체 또는 그의 이성질체로 치환되고, (b) 변형된 펩타이드의 아미노산 중 하나 이상은 (예를 들어, 및 비제한적으로, 상기에 열거된 아미노산 잔기에서) 인산화되거나, 또는 (c) (a) 및 (b) 둘 모두이도록 변형된 서열번호: 1을 포함하는 변형된 펩타이드 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.

특정 구현예에서, 이러한 약제학적 조성물은 항산화제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 항산화제는 아스코르브산, 시스테인, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 메티오닌, 및/또는 전술한 항산화제 중 임의의 것의 이성질체를 포함할 수 있다. 하나 이상의 예시적 구현예에서, 약제학적 조성물은 1 내지 5 mM의 EDTA이 현탁된 인산염-완충 염수 (PBS), 0.5 mM 내지 50 mM의 L-메티오닌이 현탁된 PBS, 1 내지 5 mM의 EDTA가 현탁된 히스티딘 완충액, 또는 0.5 mM 내지 50 mM의 L-메티오닌이 현탁된 히스티딘 완충액을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 조성물은 전구약물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 전구약물에서, 각각의 인산염 기는 전구약물의 투여 시에 화학적으로 또는 효소적으로 절단된다.

약제학적 조성물은 실질적으로 중성 pH의 수용액을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 약제학적 조성물은 1 mg/mL 내지 50 mg/mL 또는 그 사이의 농도로 변형된 펩타이드를 포함할 수 있다.

본 개시내용의 변형된 펩타이드 및 제형을 사용하여 병태를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 적어도 하나의 구현예에서, 상기 방법은 병태(예를 들어, 위장 운동성 또는 당뇨병성 병태)를 치료하기에 효과적인 양으로 변형된 글루카곤을 포함하는 안정한 제형을 대상체에게 투여함으로써 병태 또는 그의 합병증을 치료하는 것을 포함한다. 거기에서, 글루카곤은 (a) 27번 위치의 아미노산이 내산화성 메티오닌 모방 유사체 또는 그의 이성질체로 치환되고, (b) 글루카곤의 하나 이상의 아미노산이 인산화되거나, 또는 (c) (a) 및 (b) 둘 모두이도록 변형된다. 변형된 글루카곤은 서열번호: 2를 포함하고, 여기서 X는 노르류신 또는 그의 이성질체 또는 메톡시닌 또는 그의 이성질체이다. 추가로 또는 대안적으로, 안정한 제형은 본원에 언급된 특정 제형 중 임의의 것을 사용하여 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항산화제를 추가로 포함한다: 아스코르브산, 시스테인, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, EDTA, 메티오닌, 또는 전술한 것들 임의의 것의 이성질체.

추가 방법은 대상에게 인슐린을 투여하는 방법을 제공한다. 적어도 하나의 구현예에서, 변형된 글루카곤 및 인슐린의 안정한 제형은 대상체의 혈당 수준을 모니터링하고 필요에 따라 두 약물을 독립적으로 투여하는 장치를 통해 상이한 시간에 투여된다.

본 개시내용의 안정한 제형을 포함하는 병태를 치료하기 위한 키트가 또한 제공된다. 적어도 하나의 예시적인 구현예에서, 안정한 제형은 실질적으로 중성인 pH의 수용액이다. 이러한 키트는 바이알, 카트리지, 자동주사기 장치, 펌프 또는 비강 분무 장치를 추가로 포함할 수 있으며, 이들 모두는 안정한 제형을 저장할 수 있다(즉, 사전 혼합/사전 충전됨). 예를 들어, 그리고 제한 없이, 키트는 주사기를 포함할 수 있으며, 여기서 주사기는 안정한 제형으로 미리 충전되어 있고 안정한 제형은 항산화제를 추가로 포함한다. 추가로, 안정한 제형은 치료적 유효량의 변형된 펩타이드를 포함할 수 있다.

본 명세서에 포함된 개시된 구현예 및 다른 특징, 이점 및 양태, 그리고 그것들을 달성하는 문제는 본 개시내용의 다양한 구현예에 대한 하기의 상세한 설명에 비추어 명백해질 것이다. 이러한 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 취해질 때 더 잘 이해될 것이며, 여기서:
도 1, 서브파트 A는 고소수성 코어가 있는 천연 글루카곤 피브릴 입체 지퍼 영역에 대해 에너지적으로 유리한 구조의 예를 도시하는 반면, 서브파트 B는 소수성 코어의 중간에 하전된 그룹을 배치하여 입체 지퍼 형성을 방지하는 Ser⁸(소수성 코어 내에 묻힌 잔류물)에 인산염 에스테르가 있는 글루카곤 분자 모델을 도시한다.
도 2는 천연 글루카곤의 아미노산 서열(서열번호:1)을 예시하고, 10개의 아미노산은 밑줄로 표시된 쉽게 인산화가능한 측쇄로 확인되고;
도 3은 포스포르-Ser⁸-글루카곤 유사체의 1개월 안정성 샘플에서 Met²⁷ 산화 상대 퍼센트를 나타내는 그래픽 표현을 도시하고, Met²⁷ 산화는 질량 스펙트럼에서 산화되지 않은 종에 대한 산화 종의 피크 높이를 측정하여 정량화되었다.
도 4는 천연 글루카곤 또는 포스포글루카곤(각 테스트 그룹에 대해 n=8)의 투여에 대한 반응으로 랫트의 혈당 측정의 그래픽 표현을 도시하고;
도 5a 내지 5i는 0주부터 12주까지의 CD 스펙트럼 결과를 도시하며, 도 5a는 포스포-Thr⁵-글루카곤을 대표하고, 도 5b는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 용액 중 포스포-Thr⁵-글루카곤을 도시하고, 도 5c는 포스포-Thr⁷-글루카곤을 도시하고, 도 5d는 EDTA 용액 중 포스포-Thr⁷-글루카곤을 도시하고, 도 5e는 포스포-Ser⁸-글루카곤을 도시하고, 도 5f는 EDTA 용액 중 포스포-Ser⁸-글루카곤을 도시하고; 도 5g는 Nle²⁷을 치환한 Met²⁷을 갖는 포스포-Thr⁵-글루카곤을 도시하고; 도 5h는 Nle²⁷를 치환한 Met²⁷을 갖는 포스포-Thr⁷-글루카곤을 도시하고, 도 5i는 Nle²⁷을 치환한 Met²⁷을 갖는 포스포-Ser⁸-글루카곤을 도시하고;
도 6a 및 6b는 도 5a 내지 5i의 샘플의 질량 분광계 결과를 도시하며, 이는 12주차까지 메티오닌 치환 및 항산화제 시험 샘플에서 산화 또는 분해가 전혀 또는 최소로 발생하지 않았음을 뒷받침한다.

서열 목록의 간단한 설명

서열번호:1은 천연 글루카곤의 아미노산 서열: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT이고; 그리고

서열번호:2는 메티오닌 치환된 글루카곤의 인공 아미노산 서열이며, 여기서 X는 노르류신 또는 이의 이성질체, 또는 메톡시닌 또는 이의 이성질체: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLXNT를 포함하나 이에 제한되지 않는 메티오닌의 모방 유사체이다.

전술한 것에 더하여, 위에서 기재된 서열은 본 명세서에 제출되고 본 명세서에 참고로 포함된 파일에 인코딩된 컴퓨터 판독 가능 형태로 제공된다. 컴퓨터가 읽을 수 있는 형식으로 기록된 정보는 37 C.F.R. § 1.821(f)에 따라 위에 제공된 서면 서열 목록과 동일하다.

상세한 설명

본 개시내용의 원리에 대한 이해를 촉진하기 위한 목적으로, 이제 도면에 예시된 구현예를 참조할 것이며, 특정 언어는 이를 기재하기 위해 사용될 것이다. 그럼에도 불구하고 이러한 구현예의 설명에 의해 범위의 제한이 의도되지 않음이 이해될 것이다. 반대로, 본 개시내용은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 분원의 취지 및 범위 내에 포함될 수 있는 대안, 수정 및 등가물을 포함하도록 의도된다. 이전에 언급된 바와 같이, 이 기술은 하나 이상의 바람직한 구현예에서 예시되고 설명될 수 있지만, 본 발명의 조성물, 시스템 및 방법은 많은 상이한 구성, 형태, 재료 및 부속품을 포함할 수 있다.

다음 설명에서, 본 개시내용의 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 제시된다. 특정 예는 이러한 특정 세부사항의 일부 또는 전부 없이 구현될 수 있으며, 본 개시내용은 물론 변할 수 있는 특정 생물학적 시스템에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.

달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 관련 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 분원의 주제의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 본 명세서에 기재되어 있다. 또한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 내용이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 또한, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 백분율의 경우 ±10%의 값 범위 및 단위 값의 경우 ±1.0 단위를 나타내며, 예를 들어 약 1.0은 0.9 내지 1.1의 값 범위를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 포유동물이다. 바람직하게는 인간이지만, 용어는 또한 비-인간 포유동물, 예컨대 마우스, 고양이, 개, 원숭이, 말, 소, 염소, 또는 양을 지칭할 수 있으며, 남성, 여성, 성인 및 소아를 포함한다.

본원에 사용된 "당뇨병성 병태"라는 문구는 제한 없이 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 전당뇨병, 저혈당증 및 대사 증후군을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "요법"은 치유적 및/또는 예방적 치료를 포함한다. 보다 구체적으로, 치유적 치료는 특정 장애의 증상의 진행 지연뿐만 아니라 증상의 완화, 개선 및/또는 제거, 감소 및/또는 안정화(예를 들어, 더 진행된 단계로의 진행 실패) 중 하나를 지칭한다. 예방적 치료는 다음 중 하나를 지칭한다: 특정 장애의 발병 중지, 발병 위험 감소, 발병률 감소, 발병 지연, 발병 감소, 및 증상의 발병 시간 증가.

본원에 사용된 "치료적 유효량", "치료적 유효량" 및 "유효량"이라는 문구는 (달리 구체적으로 언급되지 않는 한) 1회 또는 치료 주기의 과정에 걸쳐 투여되는 경우에, 대상체의 건강, 웰빙 또는 사망에 영향을 미치는 화합물의 양 (예를 들어, 및 비제한적으로, 당뇨병성 상태와 연관된 효과의 약화 또는 예방)을 의미한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 질환, 병태 또는 장애(당뇨병성 병태를 포함하나 이에 제한되지 않음)를 치료하기 위해 대상체에게 투여되는 펩타이드 약물 또는 기타 화합물의 적절한 복용량 또는 양은 치료되고 있는 병태의 유형 및 중증도, 질병 병리가 얼마나 진행되었는지, 조성물의 제형, 환자 반응, 처방의 또는 건강관리 제공자의 판단, 및 환자 또는 치료되고 있는 대상체의 특징 (예컨대 일반적인 건강, 연령, 성별, 체중, 및 약물 내성)을 포함하는 몇 개의 인자에 따라 변할 것이다. 치료적 유효량은 또한 치료제의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료학적으로 유익한 효과를 증가하는 양이다.

또한, 당뇨병성 병태 또는 다른 질병 또는 장애를 치료하기 위한 본원에 기재된 펩타이드 약물에 대한 투여 복용량은 당업자에 의해 실시되는 복용량 및 일정 레지멘에 따른다. 본 방법에 사용되는 모든 약리학적 제형의 적절한 복용량에 대한 일반적인 안내는 Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Edition, 2006(상동) 및 Physicians' Desk Reference(PDR), 예를 들어 71st (2017) Ed. 또는 온라인(PDR.net), PDR Network, LLC 이후의 것들에 제공되고, 이들 각각은 여기에 참조로 포함된다.

유효량 또는 용량을 결정하는 것은 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용에 비추어 당업자의 능력 범위 내에 있다. 일반적으로, 이러한 용량을 전달하기 위한 제형은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 펩타이드 또는 펩타이드 유사체(집합적으로, 펩타이드 유사체가 명시적으로 배제되지 않는 한 총칭하여 "펩타이드")를 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 펩타이드는 제형 내 펩타이드의 용해도 한계까지 약 0.1 mg/mL의 농도로 존재한다. 이 농도는 바람직하게는 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 예를 들어, 약 1 mg/mL, 약 5 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 15 mg/mL, 약 20 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 30 mg/mL, 약 35 mg/mL, 약 40 mg/mL, 약 50 mg/mL, 약 55 mg/mL, 약 60 mg/mL, 약 65 mg/mL, 약 70 mg/mL, 약 75 mg/mL, 약 80 mg/mL, 약 85 mg/mL, 약 90 mg/mL, 약 95 mg/mL, 또는 약 100 mg/mL이다.

용어 "약제학적 조성물"은 본원에 기재된 바와 같은 화합물 및 제형의 특성에 따라 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 아쥬반트, 부형제, 또는 비히클, 예컨대 보존제, 충전제, 붕해제, 습윤제, 유화제, 현탁화제, 감미제, 풍미제, 방향제, 항균제, 항진균제, 윤활제, 및 분산제를 포함하는 적어도 하나의 성분을 포함하는 조성물을 의미한다.

조성물, 담체, 희석제, 시약 등을 지칭하는 용어 "약제학적으로 허용되는" 및 이의 문법적 변형은 상호교환적으로 사용되며, 물질이 과도한 독성, 자극, 알러지성 반응, 및/또는 합리적인 유익/유해 비율에 상응하는 메스꺼움, 현기증, 위장 장애 등과 같은 바람직하지 않은 생리학적 효과의 생성 없이 포유동물에 또는 그 상에 투여될 수 있음을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포스포글루카곤"은 관련 개시내용 및 본원에 기재된 바와 같이 그의 하나 이상의 아미노산 측쇄에서 인산화된 글루카곤 분자 유도체를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전구약물"은 예를 들어 혈액에서 가수분해에 의해 모 화합물(여기서는 천연 글루카곤)을 생성하기 위해 생체내에서 빠르게 변형되는 화합물을 지칭한다. 가수분해, 대사 절단 또는 기타 반응에 의해 생체내에서 빠르게 변형될 수 있는 작용기는 전구약물(즉, "프로모이어티")에 대한 유도체화제로 사용될 수 있다. 프로미에티(Promiety)에는 알카노일 (예컨대 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 등), 비치환된 및 치환된 아로일 (예컨대 벤조일 및 치환된 벤조일), 알콕시카보닐 (예컨대 에톡시카보닐), 트리알킬실릴 (예컨대 트리메틸- 및 트리에틸실릴), 디카복실산 (예컨대 석시닐)으로 형성된 모노에스테르, 인산염 에스테르, 설페이트 에스테르 등과 같은 기를 비제한적으로 포함한다. 본 개시내용에 따라 유용한 화합물의 대사적으로 절단가능한 기가 생체내에서 쉽게 절단되기 때문에, 이러한 기를 보유하는 화합물은 전구약물로서 작용한다. 대사적으로 절단가능한 기를 보유하는 화합물은 대사적으로 절단가능한 기가 존재함으로써 모 화합물에 부여된 향상된 용해도 및/또는 흡수율의 결과로서 개선된 생체이용률 또는 기타 바람직한 특성을 나타낼 수 있다는 이점이 있다. "진정한(true) 전구약물"은 유도체화된 형태에서 약리학적으로 비활성이며, 프로모이어티가 제거된 경우에만 활성을 얻는다. 그러나, 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이, "전구약물"은 이러한 화합물이 유도체화된 형태에서 활성을 나타내는지 여부에 관계없이 생체내에서 화학적으로 또는 효소적으로 절단될 수 있는 프로모이어티로 유도체화된 화합물을 지칭한다. 따라서, 용어 "전구약물"은 "진정한 전구약물" 및 유도체화된 형태로 활성을 나타내는 절단 가능한 프로모이어티를 갖는 유도체를 모두 포괄한다.

본원에 사용된 "중성 pH"는 약 7의 pH를 지칭한다. "실질적으로 중성인 pH"는 정확히 pH 7이 아닐 수 있지만, 4와 9 사이의 pH 범위를 포함하고 그 사이의 임의의 값을 포함하는 pH이다. 실질적으로 중성인 pH는 약 7.4의 생리학적 중성 pH를 포함한다.

본 명세서에 사용된 "화학적 안정성"이라는 문구는 치료제와 관련하여, 제형이 특정 조건 하에서 저장될 때 산화 또는 가수분해와 같은 화학적 경로에 의해 생성된 분해 생성물의 허용 가능한 백분율이 형성됨을 의미한다.

일부 구현예에서, 화학적으로 안정한 제형은 생성물의 의도된 보관 조건에서 장기간 보관 후에 형성된 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만의 분해 생성물을 갖는다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "물리적 안정성"은 치료제와 관련하여 허용 가능한 백분율의 응집체(예를 들어, 이량체, 삼량체 및 더 큰 형태) 및 기타 물리적 분해물(예를 들어, 침전물)이 형성됨을 의미한다. 일부 구현예에서, 물리적으로 안정한 제형은 생성물의 의도된 보관 조건에서 장기간 보관 후에 형성된 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만의 응집체 또는 기타 물리적 분해 생성물을 갖는다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "안정한 제형"은, 제형가 생성물의 의도된 보관 조건에서 장기간 보관 후에 활성 약제학적 성분(예를 들어, 포스포글루카곤 및/또는 메티오닌 치환된 글루카곤)의 화학적 및 물리적 안정성을 허용 가능한 한도 내로 유지함을 의미한다. 일부 구현예에서, 안정한 제형은 2년에 걸쳐 10% 미만의 분해 또는 2년에 걸쳐 5% 미만의 분해를 갖는다.

"단리된"이라는 용어는 물질이 원래 환경, 예를 들어 자연적으로 발생하는 경우 천연 환경에서 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 유기체 내에 존재하는 자연 발생 폴리펩타이드는 단리되지 않지만, 자연계에 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리펩타이드는 단리된다.

"정제된"이라는 용어는 절대적인 순도를 요구하지 않고; 대신 상대적인 정의로 의도된다.

본 개시내용의 본 발명의 개념은 일반적으로 천연 글루카곤 및 종래 기술을 사용하여 저장된 이전에 기재된 포스포글루카곤 유도체와 비교하여 가용화된 글루카곤의 안정성을 향상시키는 방법, 조성물, 및 변형된 펩타이드에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 전략은 글루카곤의 산화를 최소화하여 이러한 향상된 안정성을 달성한다. 이러한 방법, 조성물, 및 변형된 펩타이드는 출발점으로서 천연 글루카곤과 함께 이용될 수 있거나, 예시적인 구현예에서 관련 개시내용에 기재된 포스포글루카곤 기술과 함께 적용되어 향상된 안정성 뿐만 아니라 중성 pH에서 향상된 용해도를 달성할 수 있다.

천연 글루카곤(서열번호:1) pH 3 이하 및 pH 10 이상에서 용해되는 것으로 밝혀졌다. 특정 이론이나 작용 기전에 얽매이지 않고, 실질적으로 중성인 pH에서 천연 글루카곤과 관련된 용해도 및 안정성 문제는 중성에 가까운 등전점(PI)과 글루카곤이 아밀로이드 β-피브릴을 피브릴화하고 형성하기 때문인 것으로 여겨진다. 아밀로이드 β-피브릴은 "입체 지퍼"를 형성하는 측쇄의 얽힘에 의해 나란히 상호 작용하는 β-스파인으로 알려진 긴 β-시트이다.

관련 개시내용에 상세히 기재된 바와 같이, 특정 아미노산 측쇄에 인산염의 첨가를 통해 천연 글루카곤에 의해 형성된 입체 지퍼를 파괴하면 천연 글루카곤과 비교하여 변형된 글루카곤 분자의 용해도 및 안정성이 개선되는 것으로 결정되었다. 중성 pH에서, 인산화는 지퍼를 형성하는 측쇄에 음전하(-2)를 도입하여, 전하 반발을 통해 글루카곤 자가 결합 및 피브릴화를 억제하여 중성 pH에서 용해도를 증가시킨다.

도 1, 서브파트 A 및 B는 글루카곤 분자의 소수성 코어에 묻힌 잔기가 인산화될 수 있는 방법을 도시한다(이 예에서는 Ser⁸). 인산화는 소수성 코어의 중간에 하전된 그룹을 배치하여, 입체 지퍼 형성을 방지한다. 컴퓨터 모델은 Thr⁵ 또는 Ser⁸의 인산화가 Ser²보다 더 효과적이라고 시사하는데, 그 이유는 이러한 부위가 측면과는 대조적으로 입체 지퍼의 중앙에 전하를 배치하기 때문이다. 따라서, 특정 아미노산 잔기의 인산화는 실질적으로 중성 pH(즉, pH 약 4-9)에서 가용성이고 안정한 변형된 글루카곤을 생성하였다.

또한, 인산염 기가 혈청 조건에 가까운 포스파타제 효소 농도에서 효소적으로 쉽게 제거되어 유리 천연 글루카곤이 생성됨을 또한 확인하였다. 즉, 주사 시, 인산염 모이어티는 몸 전체에 자연적으로 존재하는 포스파타제 효소에 의해 절단되어, 천연 글루카곤을 재생하고 글리코겐의 글루코스로의 전환을 촉진하여 혈당 수준을 회복시킨다.

이것은 본질적으로 소분자 약물(예를 들어, 포스페나이토인)의 용해도를 개선하기 위해 오랫동안 사용된 전구약물 접근 방식이며 여기에서는 글루카곤 피브릴화를 억제하는 데 적용된다. 위에서 암시된 바와 같이, 인산화는 또한 등전점(PI)을 이동시켜 중성 pH에서 글루카곤의 용해도를 증가시킨다. 글루카곤의 이론적인 PI는 7에 가까우므로, 분자는 본질적으로 전하를 띠지 않고 중성 수용액에 가장 잘 녹지 않는다. 단일 인산염 기를 추가하면 순 전하가 2까지 감소하여, 중성 pH에서 용해도가 증가시킨다.

인산화 과정은 당업계에 잘 알려져 있고 공지된 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 한 구현예에서, 표적화된 아미노산의 인산화는 ATP가 포스포릴 공여체로서 작용하는 과정에서 키나제 및 포스파타제 효소를 포함하는 가역적 효소 과정으로서 달성될 수 있다. 전체 반응은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

인산화: E + ATP →→ E-P + ADP

또한, 포스포글루카곤은 시약으로서 하나 이상의 인산화된 아미노산을 사용하여 고체상 또는 기타 잘 알려진 펩타이드 합성 절차에 의해 제조될 수 있다.

이들 아미노산에 대한 유도체화를 제한하지 않고, 천연 글루카곤(즉, His¹, Ser², Thr⁵, Thr⁷, Ser⁸, Tyr¹⁰, Ser¹¹, Tyr^l3, Ser¹⁶, Thr²⁹)에 10개의 쉽게 인산화 가능한 아미노산 측쇄가 있음이 주목된다(도 2 참조). 10개 잔기 중에서, 2개는 사슬 말단(His¹및 Thr²⁹)에 있고 피브릴 형성에 관여할 가능성이 적다. 그럼에도 불구하고, 10개의 단일 인산화, 45개의 이중 인산화 및 120개의 삼중 인산화 가능한 글루카곤 전구약물이 이러한 쉽게 인산화 가능한 부위에 1개에서 3개의 인산염 기을 운반하며, 이는 총 175개의 별개의 분자이다. 최대 10개의 인산화 부위를 허용하면, 쉽게 인산화 가능한 측쇄를 기반으로 하는 별개의 포스포글루카곤 유도체의 수가 1,023개로 증가한다. 이러한 포스포글루카곤 유도체는 천연 글루카곤 대응물보다 향상된 용해도와 안정성을 갖는 것으로 입증되었다. 또한, 이러한 화합물은 생체 내에서 효과적이다. 사실, 본원에 제공된 데이터 및 관련 개시내용은 본 발명의 포스포글루카곤이 대상체에 투여된 후 용이하게 탈인산화되어, 천연 글루카곤으로 되돌아가는 것을 보여준다. 또한 생체 내 성능은 천연 글루카곤과 비슷한다.

천연 글루카곤(서열번호:1) 따라서 이전에 기재된 포스포글루카곤은 27번 위치에 메티오닌 잔기를 포함하며, 이는 반응성 산소 종(ROS)에 의해 산화되기 쉬운 아미노산이다. 산화는 단백질의 미스폴딩으로 이어질 수 있으며, 이는 글루카곤의 안정성에 부정적인 영향을 미치고 생물학적 기능을 손상시키고 면역원성에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 포스포글루카곤에 관한 유리한 예비 연구에도 불구하고, 포스포글루카곤 유사체는 보호되지 않은 제형에서 30일 동안 보관한 후 Met²⁷이 메티오닌 설폭사이드 및 (더 적은 정도의) 메티오닌 설폰으로 산화되는 것으로 나타났다. 제형의 저장수명을 연장하고 포스포글루카곤 및/또는 천연 글루카곤을 다른 적용(예를 들어, 인공 췌장에 사용하기 위한 용도)로 수정할 수 있도록 하려면, 현재 제형의 안정성을 더욱 확장해야 한다. 본 명세서에 제시된 바와 같이, 이는 인산화된 글루카곤 또는 천연 글루카곤의 메티오닌 잔기의 변형을 통해 및/또는 신규 항산화제가 풍부한 제형의 사용을 통해 달성될 수 있다.

안정성 문제를 다루기 위해, 본 개시내용의 적어도 하나의 예시적인 구현예에서, 분자(서열번호:2)의 화학적 안정성을 향상시키기 위해 27번 위치(메티오닌 또는 Met²⁷)에 아미노산 치환을 포함하는 글루카곤 분자가 제공된다. 예를 들어, Met²⁷은 산화 안정성 메티오닌 모방 유사체 또는 그의 이성질체로 치환될 수 있다.

본 개시내용의 특정 구현예에서, 노르류신(Mox²⁷), 메톡시닌(Mox²⁷)(또한 소위 호모세린 메틸 에테르), 또는 Nle 또는 Mox의 이성질체가 Mox²⁷을 대체할 수 있다. 노르류신은 여러 면에서 메티오닌과 유사하지만 측쇄가 다르기 때문에 산화에 덜 민감한다. Met→Nle 스위치는 소수성 상호작용에 중요한 아미노산 측쇄의 길이를 보존하지만, 수소 결합 특성은 보존하지 않는다. 마찬가지로, Met→Mox 치환은 Met의 전자적 특성과 매우 유사한다. 중요하게는, 이러한 변형된 글루카곤 분자는 본 개시내용의 천연 글루카곤 및/또는 비치환된 포스포글루카곤 유도체와 비교하여 산화를 감소시키는 것으로 나타났으며, 따라서 생성된 제형 및/또는 약제학적 조성물의 연장된 저장 수명을 초래한다. 또한, 생성된 글루카곤 유도체에는 천연 글루카곤의 생물학적 활성이 보존된다.

특정 치환이 기술되어 있지만, 변형된 글루카곤의 생물학적 활성이 유의하게 보존되는 한 임의의 적합한 내산화성 아미노산이 사용될 수 있음을 인정할 것이다. 특히 사용 중인 의학적 용도의 경우, 변형된 펩타이드가 천연 글루카곤과 동일하거나 실질적으로 유사한 특성을 나타내도록 가능한 한 천연 글루카곤에 가까운 것이 바람직하다. 작은 변화가 단백질의 물리적, 화학적 성질에 상당한 변화를 일으킬 수 있으며, 이는 생성된 펩타이드의 반감기와 면역원성에 큰 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 천연 글루카곤은 근육내 용량의 경우 약 20-26분, 비강 분말 용량의 경우 약 30-45분, 피하 자동주사기 또는 사전 충전된 용량의 경우 약 28-35분의 반감기를 갖는다. 유사하게, 모든 글루카곤 유도체는 적어도 (또는 이상적으로는) 천연 글루카곤보다 항원성이 낮아야 한다. 글루카곤 분자의 27번 위치만을 변형함으로써, 본 발명의 변형된 펩타이드의 예시적인 구현예는 천연 글루카곤에 필적하는 반감기 및 항원성을 나타내는 동시에 상당한 내산화성을 부여하고 생성된 생성물의 저장 수명을 연장시킨다. 따라서, 본 개시내용의 변형된 펩타이드는 천연 글루카곤에 대한 실행 가능한 치환이며 또한 장기간에 걸쳐 안정성을 유지할 수 있어, 그의 저장 수명을 상당히 향상시킨다.

본 발명의 변형된 글루카곤 펩타이드는 입체 지퍼 형성에 관여하는 하나 이상의 아미노산 측쇄의 인산화를 선택적으로 포함하여, 글루카곤 분자가 실질적으로 중성 pH(상기 및 관련 개시내용에 기재된 바와 같음)에서 가용성이 되도록 할 수 있다. 이러한 구현예에서, 글루카곤의 Met²⁷은 상기 기재된 바와 같이 치환되거나 치환되지 않을 수 있고; 그러나 메티오닌이 치환되지 않은 경우, 내산화성을 제공하기 위해 새로운 항산화 제형이 사용될 수 있다. 이러한 구현예는 메티오닌 Met²⁷을 메티오닌 Nle²⁷, Mox²⁷, 또는 임의의 다른 적절한 산화-안정성 아미노산 또는 그의 이성질체로 대체함으로써 야기될 수 있는 잠재적 독성(존재하는 경우)을 피한다는 점에서 특히 유리할 수 있다. 보다 구체적으로, 특정 구현예에서, 글루카곤 펩타이드 및/또는 포스포글루카곤 펩타이드(하기 더 상세히 기재됨)는 하나 이상의 항산화제를 포함하는 완충액 또는 부형제에 현탁될 수 있다. 적용 시, 항산화제는 경쟁적 억제형와 유사하게 작용하고; 항상화제가 먼저 산화되어 글루카곤의 메티오닌을 산화로부터 보호하는 제형 내 농도로 존재한다. 다시 말해서, 항산화제는 제형 내에서 ROS와 반응하여 용액 내에서 ROS 농도를 감소시키거나 제거하는 산소 스캐빈저일 수 있다.

제형에 사용되는 항산화제는 실질적으로 중성인 pH에서 효과적인 생물학적 및 의학적 제형에 적합한 임의의 항산화제를 포함할 수 있으며, 이는 제한 없이 아스코르브산 (예를 들어, L-(+)-아스코르브산), 시스테인 (예를 들어, N-아세틸-L-시스테인), 폴리소르베이트 20 및/또는 80, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 메티오닌 (예를 들어, L-메티오닌)을 포함한다. 항산화제의 농도는 원하는 대로 그리고 사용된 정확한 항산화제 및/또는 항산화제 조합에 따라 조정될 수 있으며, 예를 들어 제한 없이 약 0.5 mM 내지 100 mM(그 안에 임의의 값 포함)을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 예시적인 구체예에서, 항산화제의 농도는 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM 또는 약 20 mM을 포함한다.

적어도 하나의 구현예에서, 제형은 약 1 내지 5 mM의 EDTA를 갖는 PBS에서 제조된 포스포글루카곤 펩타이드(약 1 mg/mL)를 포함한다. 대안적 구현예에서, 제형은 약 0.5 mM 내지 50 mM의 L-메티오닌을 갖는 PBS, 약 1 내지 5 mM의 EDTA를 갖는 히스티딘 완충액, 또는 약 0.5 mM 내지 50 mM의 L-메티오닌을 갖는 히스티딘 완충액에서 제조된 포스포글루카곤 펩타이드(약 1 mg/mL)를 포함할 수 있다.

고유한 펩타이드 및 이의 제형은 기존 접근 방식의 여러 이점을 제공한다. 많은 종래의 기술이 무기 용매를 사용하는데, 이는 응급 구조 용도로는 허용될 수 있지만 장기간의 일관된 정량 주입(예를 들어, 인공 췌장)에는 이상적이지 않는다. 또한, 종래의 응용 분야에서 유기 용매를 사용하는 경우, 천연 글루카곤이 사용되었으며 시간 경과에 따른 용해도 및 안정성과 관련하여 전술한 문제가 발생한다. 본 발명의 펩타이드 및 관련 제형, 조성물, 및 방법은 기존의 접근 방식에서 경험한 모든 장애물을 극복하고 당뇨병성 병태의 치료에 효과적인 사용하기 쉽고 안전한 대안을 제공한다.

본 개시내용의 신규한 펩타이드 및/또는 완충액 및 부형제를 포함하는 제형은 피하, 진피내, 비강내, 근육내, 또는 정맥내 투여(예를 들어, 주사 또는 주입)를 위한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 제형은 피하로 투여된다. 또한, 본 개시내용의 제형은 임의의 적합한 장치를 사용한 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 예를 들어, 본 개시내용의 제형은 주사기, 펜 주사 장치, 비강 스프레이 전달 장치, 자동주사기 장치, 또는 펌프 장치에 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 주사 장치는 저혈당증의 응급 치료를 위한 단일 용량 주사기 또는 펜 장치이다. 다른 구현예에서, 주사 장치는 다중-용량 주입기 펌프 장치 또는 다중-용량 자동-주사 장치이다. 제형은 펩타이드 약물을 전달하기 위해 자동주사기 또는 분무 장치와 같은 주사 장치의 작동 시 제형이 바늘에서 쉽게 흘러 나올 수 있는 방식으로 장치에 제공된다. 적합한 펜/자동주사기 장치는 문헌[Becton-Dickenson, Swedish Healthcare Limited(SHL Group), YpsoMed Ag 등]에 의해 제조된 펜/스프레이/자동주사기 장치를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적절한 펌프 장치는 문헌[Tandem Diabetes Care, Inc., Delsys Pharmaceuticals, Medtronic MiniMed, Inc. 등]에 의해 제조된 펌프 장치를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 신규 펩타이드 및/또는 완충액 및 부형제를 포함하는 제형은 바이알, 카트리지 또는 사전 충전된 주사기로 투여할 준비가 되어 제공된다.

본 개시내용의 화합물이 인간 및 다른 포유동물에게 약제로서 투여되는 경우, 이들은 그 자체로 또는 예를 들어 약 0.1 내지 99.5%(더 바람직하게는 약 0.5 내지 90%)의 활성 성분, 즉, 신규 항산화 제형이 사용되는 경우 적어도 천연 글루카곤, 및/또는 메티오닌 치환된 글루카곤 펩타이드 및/또는 본원에 기재된 다른 글루카곤 유도체 중 하나를 약제학적으로 허용되는 담체와 조합하여 함유하는 약제학적 조성물로서 제공될 수 있다. 추가로, 이러한 약제는 또한 추가적인 내산화성이 요구되는 항산화 제형을 포함할 수 있다.

일반적으로, 본 개시내용의 약제학적 화합물의 적합한 1일 용량은 치료 효과를 생성하는데 효과적인 가장 낮은 용량인 화합물의 양일 것이다. 이러한 유효량은 일반적으로 치료적 유효 용량과 관련하여 상기 기재된 인자에 의존할 것이다. 원하는 경우, 활성 화합물의 유효 1일 용량은 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 초과의 하위 용량으로 하루 전체에 걸쳐 적절한 간격으로 별도로 투여될 수 있으며, 선택적으로 단위 투여 형태로 투여될 수 있다.

또한, 혈당(BG) 농도의 자동화된 제어는 당뇨병성 병태에서 오랫동안 추구해 온 목표였다. 일반적으로 폐쇄 루프 제어 시스템은 대상체의 BG 농도를 측정하고 증가된 BG 수준의 검출에 대한 반응으로 필요에 따라 인슐린을 피하 전달한다. 고농도의 생물학적으로 허용되는 용액에 글루카곤을 저장하는 종래 기술의 불가능으로 인해, 필요에 따라 인슐린과 글루카곤을 모두 전달할 수 있는 실행 가능한 이중 호르몬 폐쇄 루프 시스템이 지금까지 이용 가능하지 않았다. 그러나, 본 개시내용의 펩타이드, 조성물 및 방법을 통해 달성된 글루카곤 용해도 및 안정성의 진보의 관점에서, 이러한 이중-호르몬, 폐쇄-루프 시스템(즉, 인공 췌장)은 이제 현실이 된다. 실제로, 본원에 기재된 신규 제형을 사용하여, 포스포글루카곤은 실질적으로 중성인 pH의 수용액에 고농도로 저장되어, 이러한 이중 호르몬 폐쇄 루프 시스템에 의해 필요에 따라 자동으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 변형된 펩타이드 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 변형된 글루카곤 화합물의 안정한 제형을 포함하는 키트를 제공한다. 예를 들어, 적어도 하나의 예시적인 구현예에서, 본 개시내용의 화합물은 실질적으로 중성 pH(즉, pH 4 내지 9 포함)의 수용액 중 바이알에 저장될 것이다. 수용액은 인간과 다른 포유동물과 생체적합성이 될 것이다. 일부 구현예에서, 키트는 펜 주사 장치, 자동주사기 장치, 펌프, 또는 비강 분무 장치의 일부인 주사기를 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, 주사기는 안정한 제형으로 사전 충전된다.

이러한 키트는 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 지침은 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 급성 저혈당증 또는 다른 당뇨병성 병태를 경험하는 대상체)를 치료하기 위해 안정한 제형의 투여를 지시할 수 있다.

본 발명의 펩타이드 및 이의 제형을 사용하여 병태를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 적어도 하나의 구현예에서, 개체에게 병태의 치료에 효과적인 양으로 변형된 글루카곤 분자를 포함하는 안정한 제형을 투여함으로써 병태 또는 그의 합병증을 치료하는 방법이 제공된다. 변형된 펩타이드는 치환된 메티오닌을 포함하는 글루카곤(예를 들어, 내산화성 메티오닌 모방 유사체로 전환됨)을 포함하는, 본원에 기재된 글루카곤 유도체 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 변형된 펩타이드는 단순히 포스포글루카곤을 포함할 수 있다. 추가로, 적어도 하나의 예시적인 구체예에서, 변형된 펩타이드는 치환된 메티오닌을 포함할 수 있고 또한 하나 이상의 아미노산에서 인산화될 수 있다. 그러나 글루카곤이 전혀 변형되지 않을 수도 있다는 점도 언급될 것이고; 대신, 본 개시내용의 이점은 항산화제가 풍부한 용액에 현탁된 천연 글루카곤을 포함하는 제형을 통해 달성될 수 있다.

상기 방법의 적어도 하나의 구현예에서, 안정한 형성은 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 항산화제를 추가로 포함할 수 있고, 이러한 항산화제의 포함은 그의 산화를 방지함으로써 변형된 펩타이드의 안정성을 향상시킨다.

또한, 방법이 이중 호르몬 폐쇄 루프 시스템(즉, 인공 췌장)과 관련하여 사용되는 경우, 방법은 대상체에게 인슐린을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 변형된 글루카곤 및 인슐린의 안정한 제형은 혈액 내 BG의 검출된 수준에 반응하여 시스템을 통해 상이한 시간에 투여된다. 예를 들어, 시스템이 확립된 기준선과 비교하여 증가된 BG 수준을 검출하는 경우, 시스템은 자동으로 인슐린을 투여할 것이다. 반대로, 시스템이 확립된 기준선과 비교하여 감소된 수준의 BG를 감지하는 경우, 시스템은 변형된 글루카곤의 안정적인 제형을 자동으로 투여할 것이다. 이러한 용량의 시기 및 이의 농도는 정의된 알고리즘에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있음이 이해될 것이다. 이러한 방식으로 당뇨병성 병태의 양방향 관리가 달성될 수 있다. 이러한 치료는 통상적인 글루카곤이 고농도로, 수용액에서 및/또는 실질적으로 중성인 pH에서 저장될 수 없기 때문에 현재까지 달성할 수 없었다.

마지막으로, 본 개시내용의 변형된 글루카곤, 제형 및 키트의 다른 으료 응용도 실현될 것이다. 예를 들어, 글루카곤은 종종 위 영상 양식을 받는 대상체의 위장 운동을 늦추거나 중지하는 데 사용된다(즉, 그 영역의 움직임으로 인해 이미지가 흐려질 수 있음). 본원에서 논의된 펩타이드 및 제형의 이점은 일정 기간 동안 수성 및 실질적으로 중성인 pH에 저장된 글루카곤의 1회 이상의 용량을 사용하는 것이 유리할 수 있는 이 적용 또는 임의의 다른 적용과 관련하여 또한 유용할 수 있다.

펩타이드, 약제학적 조성물, 및 이의 방법의 다양한 구체예가 상당히 상세하게 기재되어 있지만, 구체예는 단지 비제한적인 예로서 제공된다. 본원에 기재된 구현예의 많은 변형 및 수정은 본 개시내용에 비추어 본 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있고 균등물이 그의 요소에 대해 대체될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 실제로, 본 개시내용은 완전하거나 너무 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 본 개시내용의 범위는 첨부된 청구범위 및 그 균등물에 의해 정의된다.

또한, 대표적인 구현예를 기재함에 있어서, 본 개시내용은 방법 및/또는 공정을 특정 순서의 단계로서 제시할 수 있다. 그러나, 방법 또는 공정이 본원에 기재된 특정 순서의 단계에 의존하지 않는 한, 방법 또는 공정은 설명된 특정 순서의 단계로 제한되어서는 안 된다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 단계의 다른 순서가 가능할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 단계의 특정 순서는 청구범위에 대한 제한으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 방법 및/또는 공정에 대한 청구항은 기재된 순서대로 단계의 수행으로 제한되어서는 안 되며, 당업자는 서열이 다양할 수 있고 여전히 본 개시내용의 사상 및 범위 내에 있다는 것을 용이하게 인식할 수 있다.

따라서, 이 설명 및 첨부된 청구범위는 본 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백한 모든 수정 및 변경을 포함하도록 의도된다.

포스포글루카곤 연구

예비 연구에서, 단일 인산화된 글루카곤 유사체는 확립된 고체상 합성 기술을 사용하여 맞춤 합성(GenScript)되었으며, 각각은 Ser², Thr⁵, Thr⁷, Ser⁸, Tyr¹⁰, Ser¹¹, Tyr^l3, 및 Ser¹⁶ 중 하나에서 인산화되었다. 이어서, 하기 및 관련 개시내용에 기재된 바와 같이 유사체를 용해도 및 안정성에 대해 평가하였다. 인산화된 아래의 예는 1개 내지 2개의 인산염 기를 함유하는 포스포글루카곤 유도체(본원에 기재된 접근법을 입증하는 역할을 함)에 초점을 맞추지만, 본 개시내용은 1개 또는 2개의 인산염 기만을 함유하는 포스포글루카곤 유도체에 제한되지 않지만, 대신 더 높은 수준의 유도체화도 포함함을 이해할 것이다.

실시예 1

포스포글루카곤의 용해도.

저혈당증 구제를 위한 이상적인 글루카곤은 중성 pH의 수용액에서 적절한 용해도를 가질 것이다. 천연 인간 글루카곤 및 이의 포스포글루카곤 유사체의 대략적인 용해도는, 완전히 용해될 때까지(시각 관찰에 의해 확인됨) 알려진 양의 펩타이드에 50 mM의 인산염 완충액 (pH 7.4) 또는 50 mM의 인산염-완충 염수 (pH 7.4)를 적가하여 실온에서 측정하였다. 용해되었다.

보다 구체적으로, 탁도 측정을 위해, 100 μL의 여과된 안정성 샘플을 96-웰 미세적정 플레이트(3중)로 옮기고 최종 부피는 50 mM의 인산나트륨(pH 7.4)으로 만들었고 405 nm 및 280 nm의 UV 흡광도를 사용하여 응집 지수를 계산하였다. 탁도는 탁도를 초기 값의 50%만큼 증가시키는 데 필요한 시간(일수)으로 보고된다. 형광 측정을 위해, 글루카곤 및 포스포글루카곤 용액을 3.2 mM의 HCL, 0.9% NaCl (w/v) (pH 2.5) 또는 50 mM의 인산나트륨 (pH 7.4)에서 1 mg/mL로 제조하고, 샘플을 원심분리하고 여과하고, 96웰 블랙 플랫 바닥 마이크로타이터 플레이트에서 3중으로 배치하고, 50 μM의 티오플라빈-T (ThT) 최종 농도와 함께 인큐베이션하였다. ThT의 형광 강도를 결정하기 위해, 여기 및 방출 파장을 각각 440 nm 및 482 nm로 설정하였다. Trp-25(고유 형광, IF)로부터의 형광 방출의 변화를 결정하기 위해, 여기 및 방출 파장을 각각 295 nm 및 355 nm로 설정하였다. 모든 형광 판독은 24시간 동안 15분 간격으로 수행되었으며 100,000(오버플로) 초과의 형광 신호는 시각화 목적으로 100,000으로 설정되었다. ThT 및 IF에 대한 결과는 초기 판독값과 비교하여 신호를 50%까지 줄이는 데 필요한 시간으로 보고된다.

알려진 양의 펩타이드를 완전히 용해시키는 데 필요한 완충액의 부피를 사용하여 펩타이드 농도를 mg/mL로 계산하였다(표 1). 구조용 글루카곤의 표준 용량은 1mg이며 1mL의 용액으로 전달되어; 1 mg/mL는 이러한 연구의 표적 용해도 역할을 하였다.

표 1. 포스포글루카곤 유사체에 대한 용해도 및 안정성 측정의 요약.

^a실온에서 pH 7.4인 50 mM의 인산나트륨(PB)에 대한 용해도.^b50 mM, pH 7.4에서 수행. PB = 인산염 완충액. NS = 용해되지 않음. ND = 35일 연구 기간 동안 검출되지 않음.

용해도 연구는 많은 포스포글루카곤 유사체가 중성 pH에서 높은 용해도(> 1 mg/mL)를 나타내는 반면, 예상대로 천연 글루카곤은 이 pH에서 본질적으로 불용성임을 입증하였다.

실시예 2

포스포글루카곤의 안정성

중성 pH에서의 용해도 외에도 포스포글루카곤의 의학적 영향 및 상업적 생존력은 용액에서의 안정성에 달려 있다. 포스포-Thr5-, 포스포-Thr7-, 및 포스포-Ser8-글루카곤은 포스포글루카곤 유사체의 가장 큰 용해도를 가졌기 때문에 물리적 안정성, 구조적 안정성 및 화학적 안정성의 평가를 포함하는 안정성 연구를 위해 선택되었다. 안정성 연구를 위해, 포스포글루카곤 용액 샘플을 50 mM의 인산나트륨(pH 7.4)에서 1 mg/mL로 제조하고 14,000rpm에서 5분 동안 원심분리하고 0.1μm 필터를 통해 여과하여 불용성 물질을 제거하였다. 샘플을 300 μl로 2 mL 바이알에 분취하고 질소 가스 하에 밀봉하고 실온의 어두운 곳에 35일 동안 보관하였다. 탁도 측정; 원적외선(far-UV) 원형 이색성(CD) 분광법 및 형광 측정에 의한 구조적 안정성; 및 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC/MS)에 의한 화학적 안정성을 사용하여 물리적 안정성을 모니터링하기 위해 규칙적 간격으로 바이알을 회수하였다.

보다 구체적으로, 안정성 샘플을 0.1% 포름산(FA)에 희석하고 약 60 pmol의 포스포글루카곤을 펩타이드 마이크로트랩에 주입하였다. 샘플을 15% 아세토니트릴, 85% 물 및 0.1% FA로 2분 동안 탈염하였다. ESI-LC/MS 시스템(1200 시리즈 LC, 6520 Q-TOF)을 사용하여 m/z 범위 100-1700에 걸쳐 질량 스펙트럼을 수득하였다. 원시 데이터를 처리하고 데이터 분석 소프트웨어(MassHunter Software)를 사용하여 질량을 분석하였다. Met²⁷ 산화는 질량 스펙트럼에서 산화되지 않은 종에 대한 산화된 종의 피크 높이를 측정하여 정량화되었다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 모두 3종의 포스포글루카곤 유사체는 35일의 시험 기간 동안 검출가능한 피브릴화가 없는 포스포-Thr5- 및 포스포-Ser8-글루카곤과 함께 우수한 안정성을 나타내었다. CD 분광법은 포스포글루카곤의 구조가 안정성 연구 1일차부터 35일차까지 거의 변하지 않음을 보여주었다. 포스포글루카곤의 물리적 및 구조적 안정성은 양호했지만, LC/MS 분석은 검출 가능한 수준의 메티오닌(Met²⁷) 산화를 나타내었다(도 3 참조). 하기에 기재된 본 개시내용의 구현예는 산화 반응을 최소화하기 위한 본 발명의 제형 전략을 사용하고 및/또는 메티오닌 잔기를 대체하기 위한 포스포글루카곤 서열의 변형을 통해 이러한 불순물을 다룬다.

실시예 3

포스포글루카곤의 탈인산화

글루카곤 인산화가 포스파타제 효소에 노출되어 역전될 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 포스포-Thr⁵- 및 포스포-Ser⁸-글루카곤을 사용하여 탈인산화의 동역학을 조사하였다. 이 연구를 위해, 유리 인산염이 BIOMOL 녹색 시약과 반응하여 유리 인산염 농도에 정비례하는 색 변화(노란색에서 녹색으로)를 생성하는 비색계 인산분해효소 분석(BIOMOL)이 수행되었다. 구체적으로, 2nmol의 유사체를 검정 완충액(50 mM Tris, pH 7.4)에서 0.009 단위의 소 알칼리 포스파타제와 함께 최종 부피가 50μL가 되도록 별대로 인큐베이션하였다. 반응은 37℃에서 5 내지 480분에 걸쳐 96-웰 결정-투명 미세적정 플레이트에서 수행되었다. 100 μL의 BIOMOL 녹색 시약(말라카이트 그린)을 첨가하여 반응을 켄칭하고 620 nm에서 판독하였다. 인산염 농도가 알려진 샘플을 사용하여 인산염 표준 곡선을 수득하였다.

표 2. 탈인산화 연구 요약.

결과는 탈인산화가 쉽게 일어난다는 것을 뒷받침한다. 실제로, 표 2에 나타낸 바와 같이, 약 1.5시간 이내에, 포스포글루카곤의 대략 절반이 탈인산화되었다.

실시예 4

포스포글루카곤의 생체내 활성

인산화가 글루카곤의 약리 활성을 억제하거나 방지하지 않는다는 것을 입증하기 위해, 대표적인 포스포글루카곤이 랫트에서 혈당 수준을 증가시키는 능력을 천연 글루카곤에 의해 유발된 상승과 비교하였다.

포스포글루카곤 유사체를 50 mM의 인산나트륨 완충액(pH 7.4)에서 투석하였다. 그 후, 16시간 동안 절식시킨 수컷 위스타 랫트에 약 7.1 nmol/kg의 천연 글루카곤 또는 포스포글루카곤을 피하 주사하였다. 총 혈당 수준은 규칙적 간격(5 내지 120분)으로 혈액을 채취하여 측정하고 Freestyle Lite^® 글루코스 시험계(Abbott)를 사용하여 테스트하였다.

도 4는 천연 글루카곤 또는 포스포글루카곤 투여에 대한 반응으로 랫트에서 측정된 혈당 측정치를 나타낸다. 중요하게도, 포스포글루카곤은 공복 혈당을 천연 글루카곤과 비교하여 유사한 수준으로 증가시켰고 증가는 비슷한 속도로 발생하였다. 이와 같이, 이 데이터는 본 개시내용의 본 발명의 포스포글루카곤이 천연 글루카곤에 대해 생체내에서 필적할만한 성능을 나타낸다는 것을 뒷받침한다.

따라서, 관련 개시내용에서 상기 제시된 포스포글루카곤 데이터는 저혈당증 구제 방법론 및 관련 키트를 위한 안정한 용액 제형에서 포스포글루카곤을 사용하는 가능성을 입증한다. 구체적으로, 이러한 데이터는 하기인 글루카곤에 대한 여러 인산화 부위를 설정한다: (1) 중성 pH(> 1 mg/mL)에서 적절한 용해도를 제공하고, (2) 시험관 내 피브릴화를 억제하고, 그리고 (3) 천연 글루카곤에 의해 영향을 받는 것과 유사한 랫트의 혈당 상승 효과를 나타낸다.

산화 안정성 연구

전술한 포스포글루카곤 데이터를 배경으로, 메티오닌 산화로 인한 안정성 문제를 글루카곤 및/또는 포스포글루카곤 제형 모두의 저장 수명 연장 목표로 다루었다. 예비 노력에서 확인된 4개의 포스포글루카곤 후보는 두 가지 개별 접근 방식을 사용하여 산화 안정성을 개선하기 위해 변형되었다. (1) Met²⁷을 노르류신(Nle²⁷)으로 대체하도록 포스포글루카곤 서열을 변형하는 것; 및 (2) 변형되지 않은 포스포글루카곤에서 산화를 최소화하기 위한 제형 전략 평가. 생성된 제형 및 Nle²⁷-변형 포스포글루카곤은 시험관내 안정성 및 생체내 기능성에 대해 평가되었으며, 포스포글루카곤은 안정성 및 기능성에 대한 미리 결정된 메트릭스에 대한 준수에 따라 순위가 매겨졌다.

실시예 5

제형 및 구조적 변형을 통한 포스포글루카곤 및 천연 글루카곤 안정성 최적화

인산화에도 불구하고, 여기에서 확인된 포스포글루카곤 유사체는 보호되지 않은 제형에서 30일 동안 보관한 후 Met²⁷이 메티오닌 설폭사이드 및 (더 적은 정도) 메티오닌 설폰으로 산화되는 것으로 나타났다. 제형의 저장 수명을 연장하고 포스포글루카곤 및/또는 천연 글루카곤을 기타 적용(예를 들어, 인공 췌장에 사용)에 맞게 수정하려면 현재 제형의 안정성을 연장해야 한다. 원하는 향상된 안정성은 제형의 변화(즉, 특정 완충액 및/또는 부형제의 첨가) 및/또는 글루카곤 아미노산 사슬의 메티오닌 잔기의 변형을 통해 달성되었다.

향상된 안정성을 입증하기 위해, Met²⁷을 노르류신으로 치환하여, 메티오닌을 노르류신으로 치환(즉, Met²⁷ → Nle²⁷)하거나 치환하지 않고 3가지 주요 포스포글루카곤(포스포-Thr⁵-글루카곤, 포스포-Thr⁷-글루카곤, 및 포스포-Ser⁸-글루카곤)을 합성하였다. 모든 펩타이드는 확립된 고체상 합성 기술을 사용하여 GenScript에 의해 맞춤 합성된 후, 2개의 완충액(히스티딘 및 1X PBS)에서 1 mg/mL 농도로 제형화되었다. Nle-유사체의 용해도가 추정되었고, 대조군으로 천연 글루카곤을 사용하여 이전에 기술된 기술을 사용하여 임의의 피브릴화를 모니터링하였다.

Met²⁷에서 Nle²⁷로의 변형 연구와 병행하여, 산화로 알려진 포스포글루카곤(예를 들어, 포스포-Ser⁸-글루카곤, 도 3 참조)을 사용하여 Met²⁷의 산화를 억제하는 능력에 대해 여러 완충액 및 부형제를 평가하였다. 구체적으로, 위에서 확인된 3가지 포스포글루카곤 각각의 샘플을 다음 완충액: 1-5 mM의 EDTA를 갖는 PBS에서 1 mg/mL 용액으로 제조하였다. 용해도 및 피브릴화(암실에서 실온에서 30일)는 위에 제시된 포스포글루카곤 연구에 설명된 대로 평가되었다. 포스포-Ser⁸-글루카곤의 산화를 성공적으로 억제한 완충액은 다른 주요 포스포글루카곤과 관련하여 평가되었다.

도 5a 내지 5i는 그러한 연구의 결과를 예시한다. Met²⁷ 치환 및 완충액/부형제 연구(도 5b, 5d 및 5f 내지 5i) 모두에서, 포스포글루카곤 유도체는 이전 반복 및 기존 기술과 비교하여 중성 pH에서 바람직하고 개선된 안정성을 달성할 수 있었다. 실제로, 30℃에서 3개월 후 샘플에서 10% 미만의 산화가 관찰되었으며 피브릴화는 검출되지 않았거나 무시할 수 있었다. 또한, 중성 pH에서 약 1g/mL 이상의 용해도가 시험 샘플에서 달성되었다.

실시예 6

메티오닌 치환 글루카곤 유사체의 안정성 및 생체 내 활성

천연 글루카곤 및 중성 pH에서 약 1 mg/mL 이상의 용해도를 나타내고 30일 동안 산화 또는 피브릴화가 거의 또는 전혀 없는 실시예 5의 상부 제형을 3개월 안정성 및 생체내 활성에 대해 평가하였다.

위에 표시된 메티오닌 치환 펩타이드는 GenScript에 의해 합성되었으며, 각각은 각각은 노르류신을 치환한 메티오닌을 갖는 변형된 글루카곤 및/또는 포스포글루카곤 유도체를 포함한다. 구체적으로, 위에서 확인된 1개의 글루카곤 및 8개의 포스포글루카곤 제형을 제조하고, 바이알에 분취하고, 안정성을 평가하기 위해 30℃에서 3개월 동안 두었다. 각 제형의 3개 바이알을 안정성 분석을 위해 매주 뽑아내며, 고유 형광, ThT 형광 및 탁도(UV) 측정(예비 연구에서와 같이)을 사용하여 피브릴화의 정도를 모니터링하고 모두 글루카곤 대조군과 비교하였다. 피브릴화는 또한 모 피크의 손실로서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 모니터링되었다.

산화 생성물의 검출을 위해, ESI LC/MS를 사용하여 메티오닌 설폭사이드(+16) 및/또는 메티오닌 설폰(+32)을 식별하였다. 산화 정도는 펩타이드 종의 총 면적의 분획으로서 EIC에서 산화 생성물의 상대적 면적으로 정량화되었다. 그런 다음, 시점과 제형 전략 간의 안정성 차이를 ANOVA를 사용하여 결정한 다음, 다중 비교 테스트(Duncan's)를 수행하였다.

테스트한 샘플 중에서, 메티오닌으로 치환되지 않았거나 항산화제 용액에 있는 3개의 포스포글루카곤만이 상당한 산화를 나타내었다(도 6a에서 화살표로 표시). 나머지 메티오닌으로 치환된 샘플과 메티오닌으로 치환되지 않았지만 항산화제 용액 내에 있는 샘플은 30℃에서 3개월 동안 보관할 때 약 10% 미만의 산화를 나타내었고 이 기간 동안 피브릴화를 나타내지 않았거나 무시할 수 있는 수준이었다. (도 6a 및 6b 참조).

그 다음, 다양한 제형(제형 변경 및 노르류신 치환 제형 둘 모두 포함)에 대해 안정성 평가를 수행하였다. 하나의 접근법 또는 다른 접근법과 관련하여 천연 글루카곤과 비교하여 관찰된 측정 가능한 차이에 더하여, 이러한 접근법의 조합이 생성된 제형에서 상당히 향상된 안정성을 달성했음을 주목해야 한다.

실시예 7

랫트를 사용하여 변형된 포스포글루카곤의 약력학적 특성 및 기능성의 결정

실시예 6으로부터의 포스포글루카곤 제형(예를 들어, 포스포-Thr⁵-글루카곤 + EDTA; 포스포-Thr⁵-글루카곤 + Met²⁷ 치환; 포스포-Thr⁷-글루카곤 + EDTA; 포스포-Thr⁷-글루카곤 + Met²⁷ 치환; 포스포-Ser⁸-글루카곤 + EDTA; 포스포-Ser⁸-글루카곤 + Met²⁷ 치환)을 생체 내에서 평가하여 펩타이드가 전체 생체 내 생물학적 활성을 나타내는지 확인하였다(즉, 빠른 작용 시작과 짧은 작용 지속 시간으로 천연 글루카곤과 유사한 속도로 혈당을 증가시킨다). 이것은 포스포글루카곤 연구와 관련하여 예비 결과 섹션에 설명된 방법을 사용하여 랫트에서 평가되었다. 포스포글루카곤 제형, 천연 글루카곤 및 비히클 대조군에 대해 8마리의 위스타 랫트(수컷 4마리 및 암컷 4마리, 16시간 금식)를 사용하였고 모든 처리는 근육내 주사를 통해 전달하였다. 최고 혈당 수준까지의 시간(t_max), 최고 혈당 수준(C_max) 및 작용 지속 시간(예를 들어, 기준 혈당의 약 +/- 10%로 돌아가는 시간)을 각 제형에 대해 결정하고 이전에 기재한 연구에 기재된 대로 비교하였다.

변형된 메티오닌을 포함하는 포스포글루카곤 샘플은 천연 글루카곤(속도 및 정도)과 유사한 증가된 혈당으로 확인되었으며, 메티오닌 치환이 없는 포스포글루카곤도 (놀랍지 않게) 확인되었다(이전의 포스포글루카곤 연구 참조). 구체적으로, 랫트에서 ~ 7nmol/kg IM 용량에 따른 생체내 반응에 대한 정량적 기준점은 다음과 같다: (i) 약 15분 이하에서 40mg/dL의 혈당 상승 및 (ii) 약 2시간 이내에서 +/- 10%로 기준 혈당 수준 복귀.

실시예 8

혈장 내 포스포글루카곤 검출 및 정량 분석 방법의 개발 및 검증

포스포글루카곤 검출 방법의 신뢰성을 입증하고 궁극적으로 PK 연구를 지원하기 위해, 모든 측정항목(metrics)에 대해 재현성 및 편향이 <20% CV가 되도록 혈장에서 변형된 메티오닌으로 포스포글루카곤을 검출 및 정량화하는 방법이 개발되었다. 이러한 방법 개발은 본원에 기재된 포스포글루카곤이 투여된 랫트로부터 수집된 혈장을 사용하여 후속적으로 입증된 LC-MS 접근법에 중점을 두었다.

다중화된 LC-MS/MS 검정을 사용하여 포스포글루카곤 전구약물 후보뿐만 아니라 해당하는 탈인산화된 글루카곤 및 글루카곤 유사체를 공개된 방법에 따라 측정하였다. 유기 용매를 사용한 단백질 침전 및 미리 결정된 최적의 단백질 침전 및 고체상 추출 조건에서 이온 교환 고정상을 사용한 고체상 추출(SPE)에 의해 펩타이드 분석물을 혈장으로부터 분리하였다. 글루카곤을 단리하기 위한 정확한 전략은 다양한 추출 용매 및 고체상 추출 조건을 스크리닝하여 결정되었다. 또한 글루카곤은 여러 전하 상태로 존재할 가능성이 높기 때문에, 각 유사체의 측정에 사용하기 위한 최적의 전하 상태를 신호 강도 및 안정성을 기준으로 평가하고 순위를 매겼다.

피분석물 회수는 용매 스크리닝을 통해 최적화되었으며 분석 성능을 갖는 모든 문제는 내부 표준을 통해 쉽게 수정되었다. 피분석물의 직접 분석은 C_max 및 정상 상태 수준 모두를 결정하기에 충분한 혈장에서 5000-50ng/mL의 동적 범위를 갖도록 설계된 검정과 함께 고해상도 질량 분광계를 사용하여 수행되었다. 이 LC-MS 방법의 이상적인 구현예는 펩타이드의 5개 반감기를 포괄하는 범위를 허용하는 혈장 매트릭스에서 포스포글루카곤에 대한 검출 한계가 50 nm/mL였다.

이 분석적 접근을 검증하기 위해, 평가를 위해 1개의 비인산화 글루카곤 대조군과 함께 4개의 포스포글루카곤 후보가 선택되었다. 모든 샘플을 50ng/mL 내지 5000ng/mL 범위의 농도로 랫트의 혈장에 스파이킹하고 고체상 추출을 통해 추출한 다음, LC-MS로 분석하였다. 검정은 재현성, 펩타이드 안정성, 선형성, 정량화 하한 및 간섭에 대해 평가되었다. 일간(interday), 일중(intraday) 및 총 CV를 결정하여 여러 날에 걸쳐 여러 번 주사하여 재현성을 결정하였다.

펩타이드 안정성을 위해, 삼중 샘플의 편향 및 CV를 외삽 값과 비교했으며, 정량의 하한은 노이즈의 3배 이상으로 설정하였다. 간섭은 임상적으로 관련된 잠재적 간섭을 추가하여 결정되었다. 스파이킹(spiking)의 희석(간섭 용액에 따라 5% 내지 50% 희석)을 설명할 때 삼출 스파이킹된 샘플 및 편향의 CV를 또한 예상된 값과 비교하였다. 샘플 안정성과 관련된 모든 문제는 프로테아제 억제형을 사용하고 온도를 낮추는 샘플 처리 기술을 사용하여 해결되었다.

실시예 9

포스포글루카곤 제형의 장기간 안정성 연구

이어서, 실시예 8로부터의 변형된 메티오닌을 포함하는 하기 4개의 변형된 포스포글루카곤을 제조하고 장기간 안정성 연구를 위해 분취하였다. 각 유도체의 샘플을 4℃, 25℃ 및 40℃에서 18개월 동안 저장하고 각 샘플의 6개 복제물을 매월 저장 장치에서 제거하고 위의 실시예 6에 설명된 프로토콜에 따라 안정성을 평가하였다. 시점과 제형 전략 간의 안정성 측정 차이는 ANOVA를 사용하여 평가한 다음, 다중 비교 테스트(Duncan's)를 수행하였다.

이 연구의 성공 기준은 모두 18개월 동안 40℃에서 보관할 때 10% 미만의 산화를 나타내고 4℃에서 보관할 때 2% 미만을 나타내는 제형을 식별하는 것이었다. 또한 이 기간 동안 피브릴화가 검출되지 않아야 한다. 대안적 저장 바이알 및 변형된 저장 조건은 또한 본 발명의 제형의 안정성에 잠재적으로 영향을 미치는 것과 관련하여 고려되었다.

실시예 10

포스포글루카곤 제형의 PK/PD 특성 평가

랫트에서 변형된 메티오닌을 포함하는 4가지 주요 포스포글루카곤의 동역학을 평가하기 위해, 4가지 변형된 포스포글루카곤 각각의 PK/PD 특성을 비강내(IN) 또는 근육내(IM) 전달(IN의 경우 2개, IN의 경우 2개)을 통해 생체내에서 평가하였다. 가장 안정하고 가용성인 두 후보는 IN 제제로 평가되었고 다른 두 후보는 IM 투여에 대해 평가되었다. 천연 글루카곤의 IM 전달은 잘 특성화되어 있고 IM 후보에 대한 기준점 역할을 할 수 있지만, IN은 덜 특성화되고; 따라서 IN 연구에 대한 추가 용량은 PD 특성이 완전히 정의되었는지 확인하기 위해 평가되었다.

투여 전에, 절식된(16시간) 위스타 랫트를 경정맥 카테터를 통해 카테터 삽입하여 다양한 시점에서 혈액 샘플을 수집할 수 있게 하였다. 각 랫트는 적절한 경로(IM 또는 IN, 4마리 수컷 및 4마리 암컷/그룹)를 통해 각각의 변형된 포스포글루카곤의 단일 용량을 받았다. 비히클 또는 천연 글루카곤(7.1 nmol/kg)을 받은 그룹이 대조군으로 사용되었다. IM을 통해 전달된 변형된 포스포글루카곤의 경우, 약 2.5, 5.0, 7.1, 또는 10 nmol/kg의 변형된 포스포글루카곤을 의식이 있는 랫트에게 근육내 주사하였다. 유사하게, IN의 6가지 농도가 평가되었으며, 마취(3L/min O₂ 유량에서 3% 이소플루란) 하에 IN 그룹에 있는 랫트의 왼쪽 콧구멍으로 피펫을 통해 전달된 변형된 포스포글루카곤 약 5.0, 7.1, 10, 15, 20 및 40 nmol/kg은 전체 용량의 전달을 보장한다. 더 적은 부피의 약물이 전달되도록 IN 그룹에서 더 큰 용량 범위를 평가하였다. IN 투여 후, 동물을 수직 위치에서 최소 30초 동안 유지하여 투약 용액이 부비동을 통해 흐를 수 있도록 하였다.

정의된 연구 메트릭스을 충족하는 각 전달 경로(IM 및 IN)에 대한 상위 포스포글루카곤 제형은 플래깅되고 아래에 기재된 예비 안전성 및 면역원성 프로필 연구로 진행되었다. 총 혈당 수준은 규칙적 간격(5 내지 120분)으로 혈액을 채취하여 측정하고, FREESTYLE LITE(글루코스 시험계, Abbott, Chicago, IL)를 사용하여 테스트하였다.투약 전 및 투약 후 10개의 시점에서 혈액 샘플을 수집하였다(기준선, 80분까지 10분마다, 그 다음에는 120분에).

특정 샘플은 1) 혈당 상승 정도; 2) 최고 혈당 수준에 도달하는 데 필요한 시간; 및 3) 기준선(저점) 수준에 도달하는 시간과 관련하여 천연 글루카곤과 유사한 프로파일을 가졌다. 생체 내에서, 가장 낮은 유효량(혈당 측정에 의해 결정됨)을 받은 그룹의 혈장 샘플에서 변형된 포스포글루카곤 및 탈인산화 전구 약물의 농도는 검정을 포함한 추가 연구를 위해 플래깅되었다. Duncan의 ANOVA는 기준선 또는 공복 혈당 값과 관련된 시점의 차이의 중요성을 결정하는 데도 사용되었다.

실시예 11

독성 연구

각 경로에 대해 실시예 10에서 확인된 상부 변형 포스포글루카곤을 평가하여 투여 부위에서의 독성을 평가하였다. 주로, IN 및 IM 투여 후, 선택된 각각의 변형된 포스포글루카곤의 국소 염증 반응을 결정하기 위해, IM 치료를 위해, 각각의 진행된 변형된 포스포글루카곤의 실시예 10에서 사용된 것의 유효 농도의 약 2x를 마취(3L/분 O₂ 유속에서 3% 이소플루란 흡입) 하에 수컷 및 암컷 스프라그-다우리 랫트(6마리 주사/동물; 3마리 수컷, 및 3 마리 암컷)에 피하(SC) 주사하였다. 구체적으로, 각 랫트의 면도된 등에 그리드(2개의 정사각형 폭 Х 3개의 정사각형 높이)가 그려져 있고, 각 그리드 정사각형에 단일 SC 주사가 투여되었다. 또한, 각각의 진행된 변형 포스포글루카곤의 실시예 10에서 사용된 유효 농도의 약 10배가 마취(3L/min O₂ 유량에서 3% 이소플루란 흡입) 하에 2마리의 수컷 및 2마리의 암컷 스프래그-다우리 랫트의 왼쪽 콧구멍으로 전달되었다. IN 투여 후, 동물을 수직 위치에서 최소 30초 동안 유지하여 투약 용액이 부비동을 통해 흐를 수 있도록 하였다. 비히클을 받는 그룹은 대조군 역할만 하였다.

투여 4시간 후, IN 처리를 받은 동물을 마취시키고 1X PBS로 비강 세척을 받았다. 세척액을 원심분리하고 펠릿을 재현탁하고 사이토스핀 컬럼에 적용하여 세포 수 및 차등 분석을 위해 샘플을 농축하였다. 또한, 조직학을 위해 비갑개를 수집하였다.

SC 처리를 받은 동물을 안락사시키고, 등 피부를 제거하고, 존재하는 자극을 평가할 수 있도록 지방과 근막을 세정하였다. 관찰된 적열상태 및 염증의 수준을 기준으로 0에서 3까지의 주관적인 점수를 생성하였으며, 0은 무반응, 3은 가장 큰 반응을 나타내었다. 피부 샘플도 조직학을 위해 처리되었다. 조직학 및 주관적 평점은 맹검이었다.

후보는 심각한 조직 부위 염증 반응을 일으키지 않았다(즉, 3 미만의 점수). IN 투여는 IM 전달에 비해 바람직하지 않은 반응을 일으킬 가능성이 더 크지만; 심각한 조직 부위 염증 반응을 유도하지 않은 후보는 1) 생체 내에서 천연 글루카곤으로 빠르게 탈인산화되었고; 2) 변형된 포스포글루카곤은 약간의 변형을 가짐으로써 천연 글루카곤과 유사한 안전성 프로파일을 생성하고; 3) 제형이 서방성 또는 다중 투여용으로 설계되지 않았기 때문에 그럴 것 같지 않았다.

실시예 12

항-약물 항체 및 면역원성 연구

각 경로에 대해 실시예 10에서 확인된 상부 변형 포스포글루카곤을 또한 면역원성 잠재력과 관련하여 평가하였고; 즉, 약물 활성을 방지할 수 있는 항체의 생산을 평가하였다. 혈장 샘플은 향후 분석을 위해 실시예 11에서 급성 독성의 조직학적 결정으로부터 보유되었다. 염증의 조직학적 징후가 확인된 경우, 단백질 A/G를 사용하여 해당 혈장 샘플에서 면역글로불린을 강화하였다. 풍부해지면, 글루카곤 검출 항체가 첨가되어 샌드위치 ELISA가 생성되었다. 양성 신호는 항-약물 항체 및 변형된 포스포글루카곤 투여로 인한 천연 글루카곤에 대한 중화 항체의 존재를 시사한다. 항체를 검출하기 전에 추가된 알려진 농도의 항-글루카곤 항체는 정량의 하한을 결정하는 데 사용되는 노이즈 수준의 3배인 신호와 함께 양성 대조군 및 검정 검증 역할을 하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Purdue Research Foundation Monon Bioventures, LLC <120> MODIFIED GLUCAGON MOLECULES AND FORMULATIONS WITH OXIDATION RESISTANCE AND METHODS AND KITS EMPLOYING THE SAME <130> 68556-02 <150> US 62/818,826 <151> 2019-03-15 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Methionine substituted glucagon, where X is a memetic analog of methionine or an isomer thereof <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Xaa Asn Thr 20 25

Claims

27번 위치의 아미노산이 내산화성 메티오닌 모방 유사체 또는 그의 이성질체로 치환되도록 변형된 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 메티오닌 모방 유사체는 노르류신 또는 그의 이성질체, 또는 메톡시닌 또는 그의 이성질체를 포함하는, 펩타이드.
제2항에 있어서, 서열번호:2를 포함하고, 여기서 X는 노르류신 또는 그의 이성질체, 또는 메톡시닌 또는 그의 이성질체를 포함하는, 펩타이드.
제1항에 있어서, 하나 이상의 인산화된 아미노산을 추가로 포함하는 펩타이드.
제4항에 있어서, 하나 이상의 인산화된 아미노산이 His¹, Ser², Thr⁵, Thr⁷, Ser⁸, Tyr¹⁰, Ser¹¹, Tyr^l3, Ser¹⁶, Thr²⁹ 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 펩타이드.
다음을 포함하는 약제학적 조성물:
변형된 펩타이드 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염으로서, 변형된 펩타이드는 (a) 27번 위치의 아미노산이 내산화성 메티오닌 모방 유사체 또는 그의 이성질체로 치환되고, (b) 변형된 펩타이드의 아미노산 중 하나 이상은 인산화되거나, 또는 (c) (a) 및 (b) 둘 모두가 되도록 변형된 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는, 변형된 펩타이드 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및
약제학적으로 허용되는 담체.
제6항에 있어서, 변형된 펩타이드는 하나 이상의 인산화된 아미노산을 포함하고, 약제학적 조성물은 항산화제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
제6항에 있어서, 하나 이상의 인산화된 아미노산이 His¹, Ser², Thr⁵, Thr⁷, Ser⁸, Tyr¹⁰, Ser¹¹, Tyr^l3, Ser¹⁶, Thr²⁹, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 전구약물인, 약제학적 조성물.
제9항에 있어서, 각각의 인산염 기는 전구약물의 투여 시에 화학적으로 또는 효소적으로 절단되는, 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 항산화제가 아스코르브산, 시스테인, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 메티오닌, 및 전술한 항산화제 중 임의의 것의 이성질체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
제11항에 있어서, 약제학적 조성물은 1 내지 5 mM의 EDTA이 현탁된 인산염-완충 염수 (PBS), 0.5 mM 내지 50 mM의 L-메티오닌이 현탁된 PBS, 1 내지 5 mM의 EDTA가 현탁된 히스티딘 완충액, 또는 0.5 mM 내지 50 mM의 L-메티오닌이 현탁된 히스티딘 완충액을 포함하는, 약제학적 조성물.
제6항에 있어서, 실질적으로 중성 pH의 수용액을 포함하는, 약제학적 조성물.
제6항에 있어서, 1 mg/mL 내지 50 mg/mL 또는 그 사이의 농도로 변형된 펩타이드를 포함하는, 약제학적 조성물.
병태를 치료하는 방법으로서,
병태의 치료에 효과적인 양으로 변형된 글루카곤을 포함하는 안정한 제형을 대상체에게 투여함으로써 병태 또는 그의 합병증을 치료하는 것을 포함하되;
글루카곤은 (a) 27번 위치의 아미노산이 내산화성 메티오닌 모방 유사체 또는 그의 이성질체로 치환되고, (b) 글루카곤의 하나 이상의 아미노산은 인산화되고, (c) 또는 (a) 및 (b) 둘 모두이도록 변형되는, 방법.
제15항에 있어서, 변형된 글루카곤이 서열번호: 2를 포함하되, X는 노르류신 또는 그의 이성질체 또는 메톡시닌 또는 그의 이성질체인, 방법.
제15항에 있어서, 안정한 제형이 아스코르브산, 시스테인, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 메티오닌, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 이성질체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 항산화제를 추가로 포함하는, 방법.
제17항에 있어서, 안정한 제형은 1 내지 5 mM의 EDTA이 현탁된 인산염-완충 염수 (PBS), 0.5 mM 내지 50 mM의 L-메티오닌이 현탁된 PBS, 1 내지 5 mM의 EDTA가 현탁된 히스티딘 완충액, 또는 0.5 mM 내지 50 mM의 L-메티오닌이 현탁된 히스티딘 완충액을 포함하는, 방법.
제17항에 있어서, 변형된 글루카곤의 하나 이상의 아미노산이 인산화되고 하나 이상의 인산화된 아미노산이 His¹, Ser², Thr⁵, Thr⁷, Ser⁸, Tyr¹⁰, Ser¹¹, Tyr^l3, Ser¹⁶, Thr²⁹, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제15항에 있어서, 대상체에게 인슐린을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 변형된 글루카곤 및 인슐린의 안정한 제형은 대상체의 혈당 수준을 모니터링하고 필요에 따라 두 약물을 독립적으로 투여하는 장치를 통해 상이한 시간에 투여되는, 방법.
제15항에 있어서, 병태가 당뇨병성 병태 또는 위장 운동성을 포함하는, 방법.
병태를 치료하기 위한 키트로서, 제6항 약제학적 조성물의 안정한 제형을 포함하고, 안정한 제형은 실질적으로 중성 pH의 수용액인, 키트.
제23항에 있어서, 바이알, 카트리지, 자동주사기 장치, 펌프, 또는 비강 분무 장치를 추가로 포함하는, 키트.
제23항에 있어서, 주사기를 추가로 포함하고, 주사기는 안정한 제형으로로 미리 충전되어 있고 안정한 제형은 항산화제를 추가로 포함하는, 키트.
제23항에 있어서, 안정한 제형이 치료적 유효량의 변형된 펩타이드를 포함하는, 키트.