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KR20210150446A - 종양 항원 인식 수용체를 함유하는 면역 세포 및 이의 적용 - Google Patents

종양 항원 인식 수용체를 함유하는 면역 세포 및 이의 적용 Download PDF

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KR20210150446A
KR20210150446A KR1020217035351A KR20217035351A KR20210150446A KR 20210150446 A KR20210150446 A KR 20210150446A KR 1020217035351 A KR1020217035351 A KR 1020217035351A KR 20217035351 A KR20217035351 A KR 20217035351A KR 20210150446 A KR20210150446 A KR 20210150446A
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KR
South Korea
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immune effector
cells
effector cell
s1pr1
nucleic acid
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020217035351A
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English (en)
Inventor
쉬에메이 리아오
징웨이 후앙
주오 첸
만만 시에
앤디 리
양 리우
구앙신 시아
얀준 리우
잉 케
Original Assignee
상하이 파마슈티컬스 홀딩 컴퍼니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 상하이 파마슈티컬스 홀딩 컴퍼니 리미티드 filed Critical 상하이 파마슈티컬스 홀딩 컴퍼니 리미티드
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Abstract

변형된 면역 이펙터 세포 및 이의 용도, 면역 이펙터 세포를 함유하는 세포 집단, 및 약학적 조성물. 변형된 면역 이펙터 세포의 S1PR1 단백질의 발현 및/또는 활성은 상향 조절된다.

Description

종양 항원 인식 수용체를 함유하는 면역 세포 및 이의 적용
본 출원은 생물의학 분야에 관한 것으로, 특히 변형된 면역 이펙터 세포(immune effector cell) 및 이의 용도, 특히 S1PR1 단백질의 발현 및/또는 활성이 상향 조절된(up-regulated) 면역 이펙터 세포에 관한 것이다.
CAR-T(또는 TCR-T) 요법에서 기억(memory) CAR-T 세포는 기억 T 세포와 동일하며 림프절(lymph nodes)이 더 많이 있는 경향이 있다. (https://doi.org/10.1124/jpet.118.252858). 그러나, CAR-T 세포의 활성화는 항원 인식 영역에 의한 타겟(target) 세포막 항원의 직접적인 인식에 의존하기 때문에, 일반적으로 림프절의 고향인 기억 CAR-T 세포는 효과적으로 활성화될 수 없다. 그러나 기억 CAR-T 세포가 타겟 세포와 접촉하지 않고 장기간 림프절에 머무르면 효능이 영향을 받게 된다.
중추 기억 T 림프구는 예를 들어 귀소 수용체(homing receptors) CCR7 및 접착 분자 수용체(adhesion molecule receptors) CD62L의 발현으로 인해 말초 순환의 림프절에 더 자주 위치하는 경향이 있다. 림프절로 들어간 후 항원 제시 세포(예: DC 세포)에 의해 활성화되면 중추 기억 T 림프구가 양적으로 증식하고 분화하여 귀소 수용체의 발현을 감소시키는 이펙터 세포를 형성한다, 한편, 예를 들어 S1PR1(스핑고신-1-포스페이트 수용체 1(sphingosine-1-phosphate receptor 1))의 발현을 상향 조절하여 림프절 밖으로 이동하여 치료 부위에 도달한다. 전체 활성화 조건이 항원 제시 세포에 의존하지 않는 CAR-T 세포는 타겟 세포에 결합한 후 활성화된다. 따라서 림프절에 표적 세포가 없을 때 CAR-T 세포를 활성화시켜 림프절 밖으로 이동시키는 것은 어렵다. 결과적으로, CAR-T 세포는 림프절에 존재하고 기능하지 못한다. 그럼에도 불구하고, 림프절로부터 CAR-T(또는 TCR-T) 세포의 외부 이동을 촉진하는 방법에 대한 선행기술의 기록은 없다.
발명의 요약
본 출원은 변형된 면역 이펙터 세포 및 이의 용도를 제공하며, 여기서 변형된 면역 이펙터 세포의 S1PR1 단백질의 발현 및/또는 활성은 상향 조절된다. 본 출원의 면역 이펙터 세포는 기능을 수행하기 위한 치료 부위에 보다 쉽게 도달하기 위해 림프절로부터 더 이동할 수 있고, 강화된 항종양 능력(anti-tumor ability)을 더욱 달성하기 위해 강화된 면역 이펙터 기능이 있다. 본 출원은 면역 이펙터 세포 및 약학적 조성물(pharmaceutical composition)을 함유하는 세포 집단(cell population)을 추가로 제공한다.
하나의 면에서, 본 출원은 변형되지 않은 면역 이펙터 세포와 비교하여 S1PR1 단백질의 발현 및/또는 활성이 상향 조절되는, 변형된 면역 이펙터 세포를 제공한다.
일부 실시예에서, 면역 이펙터 세포는 T 세포, 림프구(lymphocyte), 과립구(granulocyte) 및/또는 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)를 포함한다.
일부 실시예에서, 면역 이펙터 세포는 기억 T 세포를 포함한다.
일부 실시예에서, 변형된 면역 세포에서, S1PR1 단백질을 엔코딩(encoding)하는 핵산 분자의 발현 및/또는 활성은 상향 조절된다.
일부 실시예에서, 변형된 면역 세포는 S1PR1 단백질을 추가로 함유한다.
일부 실시에에서, 변형된 면역 이펙터 세포는 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 추가로 함유한다.
일부 실시에에서, 변형된 면역 이펙터 세포는 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 벡터(vector)를 함유한다.
일부 실시예에서, 면역 이펙터 세포는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor:CAR)를 발현한다.
일부 실시예에서, 변형된 면역 이펙터 세포는 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 벡터를 함유한다.
일부 실시예에서, 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자 및 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자는 동일한 벡터에 위치된다.
일부 실시예에서, 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자는 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자의 5'-말단(5'-terminus)에 위치되며; 또는, 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자는 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자의 3'-말단(3'-terminus)에 위치된다.
일부 실시예에서, 키메릭 항원 수용체는 종양-특이적 항원(tumor-specific antigen)을 타겟팅(targeting) 하는 키메릭 항원 수용체를 포함하고, 상기 종양-특이적 항원은 다음으로 구성된 군에서 선택된다: EpCAM, 메조텔린(Mesothelin :MSLN), CEA, IL13, PDPN, VEGF, EGFR, EGFRvIII, PSMA, FAP, CD171, GD2, 글리피칸-2(Glypican-2), 글리피칸-3, HER2, HPV 항원, 사이클린 D1(cyclin D1), p53, MMP-7, IL13Ralpha2, MMP-2, MUC-1, G250, L1CAM, ROR1, 및 GPC3.
일부 실시예에서, 키메릭 항원 수용체는 종양-특이적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인(antigen-binding domain)을 함유한다.
일부 실시예에서, 항원-결합 도메인은 단일-사슬 항체(single-chain antibody)를 포함한다.
일부 실시예에서, 항원-결합 도메인은 GPC3 또는 MSLN을 타겟팅하는 단일-사슬 항체를 포함한다.
일부 실시예에서, 단일-사슬 항체는 서열번호 1 내지 서열번호 2 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 키메릭 항원 수용체는 막관통 도메인(transmembrane domain)을 함유한다.
일부 실시예에서, 막관통 도메인은 다음으로 구성된 군에서 선택된 단백질로부터 유래된 막관통 도메인을 포함한다: CD3ζ, CD28, 4-1BB, OX40, SLAMF4, CD127, NKG2D, ICOS, 및 FcγRIIIa.
일부 실시예에서, 키메릭 항원 수용체는 공동자극 도메인(costimulatory domain)을 함유한다.
일부 실시예에서, 공동자극 도메인은 다음의 단백질 또는 이의 조합으로부터 선택된 공동자극 도메인을 포함한다: CD137, CD28, OX40, ICOS, DAP10, 2B4, CD27, CD30, CD40, CD40L, TIM1, CD226, DR3, SLAM, NKG2D, CD244, FceRIγ, BTLA, GITR, HVEM, CD2, NKG2C, LIGHT, 및 DAP12.
일부 실시예에서, 키메릭 항원 수용체는 항원-결합 도메인 및 막관통 도메인을 연결하는 힌지 영역(hinge region)을 함유한다.
일부 실시예에서, 힌지 영역은 다음으로 구성된 군에서 선택된 단백질로부터 유래된 힌지 영역을 포함한다: CD8, CD28, IgG, 4-1BB, CD4, CD27, CD7, PD-1, 및 CH2CH3.
일부 실시예에서, 키메릭 항원 수용체는 서열번호 5 내지 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 함유한다.
일부 실시예에서, 면역 이펙터 세포는 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
일부 실시예에서, 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터는 서열 번호 7 내지 서열번호 9 중 어느 하나로 표시되는 염기서열을 함유한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 면역 이펙터 세포를 함유하는 세포 집단을 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 면역 이펙터 세포 및/또는 세포 집단, 및 임의로 약학적으로 허용되는 캐리어(carrier)를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 면에서, 본 출원은 종양 치료를 위한 약물의 제조에서, 면역 이펙터 세포, 세포 집단 및/또는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
일부 실시예에서, 종양은 고형(solid) 종양을 포함한다.
일부 실시예에서, 종양은 췌장암(pancreatic cancer), 신경교종(glioma), 간암(liver cancer) 및/또는 결장암(colon cancer)을 포함한다.
당업자는 이하의 상세한 설명으로부터 본 출원의 다른 측면 및 이점을 용이하게 인지할 수 있다. 아래의 상세한 설명은 단지 본 출원의 예시적인 실시예들을 도시하고 설명한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 출원의 내용은 당업자가 본 출원과 관련된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 개시된 특정 실시예를 변경할 수 있게 한다. 이에 따라, 본 출원의 명세서에서 첨부된 도면 및 설명은 제한적인 것이 아니라 단지 예시를 위한 것이다.
본 출원과 관련된 본 발명의 특정 특징은 첨부된 청구범위에 나열되어 있다. 본 출원과 관련된 본 발명의 특징 및 이점은 이하에서 상세하게 설명되는 실시예 및 첨부된 도면을 참조하면 더 잘 이해될 수 있다. 첨부된 도면을 간략히 설명하면 다음과 같다:
도 1은 본 출원의 CAR T 세포의 양성 비율(positive rate)을 나타낸다;
도 2는 이동 실험(migration experiment)에서 구배 농도(gradient concentration) S1P 하부 챔버(lower chamber)에서 본 출원의 GFP-양성 CAR T 세포의 유세포 분석(flow cytometry) 결과를 보여준다;
도 3은 이동 실험에서 구배 농도 S1P 하부 챔버에서 본 출원의 CAR T 세포의 GFP-양성 비율을 나타낸다;
도 4는 이동 실험의 하부 챔버에서 본 출원의 CAR T 세포의 이동 효율을 나타낸다;
도 5는 타겟 세포에 대한 본 출원의 CAR T 세포의 사멸 효율(killing efficiency)을 나타낸다;
도 6은 타겟 세포에 대한 본 출원의 CAR T 세포의 사멸 효율을 나타낸다;
도 7은 타겟 세포에 대한 본 출원의 CAR T 세포의 사멸 효율을 나타낸다;
도 8은 본 출원의 CAR T 세포가 타겟 세포의 자극 하에 사이토카인(cytokines)을 분비함을 나타내며, A는 IL-2를 나타내고 B는 IFN-γ를 나타낸다;
도 9는 본 출원의 CAR T 세포가 생체내에서 종양 성장을 억제한다는 것을 나타내며, A는 꼬리 정맥 투여(tail vein administration)를 나타내고 B는 종양내 주사 투여(intratumoral injection administration)를 나타낸다;
도 10은 생체 내 이동 실험에서 28일째의 말초 혈액 내 T 세포의 함량을 나타낸다;
도 11은 본 출원의 CAR T 세포가 생체 내에서 종양 성장을 억제한다는 것을 나타낸다; 및
도 12는 말초혈액 내 CD3+T 세포의 함량 및 종양 부피의 관계를 나타낸 것으로, A는 GC33CAR, B는 GC33CAR-IRES-S1PR1이다.
이하, 구체적인 예에 의해 본 출원 발명의 실시예를 예시한다. 이 기술에 정통한 사람은 명세서에 개시된 내용으로부터 본 출원 발명의 다른 이점 및 효과를 쉽게 이해할 수 있다.
용어 및 정의
본 출원에서, "S1PR1"이라는 용어는 일반적으로 내피 분화 유전자 1(endothelial differentiation gene 1:EDG1)로도 알려진 스핑고신-1-포스페이트 수용체 1(sphingosine-1-phosphate receptor 1)을 지칭한다. S1PR1은 생물학적 활성 신호 분자인 스핑고신 1-포스페이트(sphingosine 1-phosphate:S1P)에 결합하는 G 단백질-연결 수용체(G protein-coupled receptor)이다. 이 용어는 천연(natural) S1PR1 또는 이의 변이체(variants), 및 합성 S1PR1을 포함할 수 있다. S1PR1은 또한 전장(full-length) S1PR1, 또는 S1PR1의 절단된 형태(truncated forms), 접합된 형태(spliced forms) 또는 기능적 단편을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 출원에서 S1PR1은 전장 인간 S1PR1일 수 있다; 전장 인간 S1PR1 유전자의 염기서열은 NCBI 수탁번호 NM_001400에서 찾을 수 있다; 및 S1PR1 단백질의 아미노산 서열은 NCBI 수탁번호 NP_001391로 확인할 수 있다.
본 출원에서, "MSLN", "메조텔린(Mesothelin)" 및 "메조텔린스(Mesothelins)"라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있고 일반적으로 글리코실 포스파티딜 이노시톨(glycosyl phosphatidyl inositol:GPI)에 연결된 세포(예를 들어, 종양 세포) 표면상의 당단백질(glycoprotein)을 지칭한다. 용어 "MSLN"은 성숙한(mature) MSLN 단백질, MSLN 단백질의 다양한 서브타입(subtype) 및 이의 전구체(precursor) 단백질, 뿐만 아니라 천연 MSLN 단백질 또는 이의 변이체, 접합된 형태 및 절단된 형태, 또는 합성 MSLN 단백질을 포함할 수 있다. MSLN 전구체 단백질은 메조텔린 서브타입 1 전구체 단백질 및 메조텔린 서브타입 2 전구체 단백질을 포함할 수 있고, 이들 전구체 단백질은(예를 들어, 효소 소화에 의해) 처리되어 성숙한 MSLN을 생성할 수 있다. MSLN은 거핵세포-강화 인자(megakaryocyte-potentiating factor:MPF)와 연결될 수 있다. 메조텔린 서브타입 1 전구체 단백질의 아미노산 서열은 NCBI 수탁번호 NP_001170826 또는 NP_005814에서 찾을 수 있으며, 메조텔린 서브타입 2 전구체 단백질의 아미노산 서열은 NCBI 수탁번호 NP_037536에서 찾을 수 있다.
본 출원에서, "GPC3"이라는 용어는 글리피칸-3(glypican-3)이라고 하며, 일반적으로 단백질, 당 및 지질을 공유 결합(covalently linking)하여 형성된 복합체를 나타내며, 글리코실 포스파티딜 이노시톨(glycosyl phosphatidyl inositol:GPI)에 의해 세포 표면에서 발현될 수 있다. 이 용어는 천연 GPC3의 다양한 서브타입(예를 들어, 서브타입 1, 서브타입 2, 서브타입 3 및 서브타입 4), 변이체, 전구체 및 접합된 형태, 뿐만 아니라 합성 GPC3 또는 그의 기능 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, GPC3 서브타입 1의 전구체 형태의 아미노산 서열은 NCBI 수탁번호 NP_001158089에서 찾을 수 있다; GPC3 서브타입 3의 전구체 형태의 아미노산 서열은 NCBI 수탁번호 NP_001158090에서 찾을 수 있다; GPC3 서브타입 4의 전구체 형태의 아미노산 서열은 NCBI 수탁번호 NP_001158091에서 찾을 수 있다; 및 GPC3 서브타입 2의 전구체 형태의 아미노산 서열은 NCBI 수탁번호 NP_004475에서 찾을 수 있다.
본 출원에서, 용어 "키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor:CAR)"는 일반적으로 항원에 결합할 수 있는 세포외 도메인 및 적어도 하나의 세포내 도메인을 함유하는 융합 단백질(fusion protein)을 지칭한다. CAR은 키메릭 항원 수용체 T 세포(chimeric antigen receptor T cell:CAR-T)의 핵심 성분이며, 항원(예를 들어, 종양-특이적 항원 및/또는 종양-관련 항원) 결합 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 도메인, 및 세포내 신호 도메인을 포함할 수 있다. 본 출원에서, CAR은 항체의 항원(예를 들어, CD70) 특이성에 기초하여 T 세포 수용체의 활성화된 세포내 도메인과 조합될 수 있다. CAR을 발현하는 유전적으로 변형된 T 세포는 타겟 항원을 발현하는 악성 세포를 특이적으로 인식하고 제거할 수 있다. CAR 및 CAR-T 세포에 대한 설명은 예를 들어, Sadelain M, Brentjens R, Rivi `ere I를 참조할 수 있다. 키메릭 항원 수용체 디자인의 기본 원리. 암 발견(Cancer Discov). 2013;3(4):388-398; Turtle CJ, Hudecek M, Jensen MC, Riddell SR. 항암 치료를 위해 조작된(Engineered) T 세포. Curr Opin Immunol. 2012;24(5):633-639; Dotti G,Gottschalk S, Savoldo B, Brenner MK. 키메릭 항원 수용체-발현 T 세포를 이용한 치료법의 디자인 및 개발. Immunol Rev. 2014;257(1):107-126; 및 WO2013154760, WO2016014789.
본 출원에서, 용어 "항원-결합 도메인(antigen-binding domain)"은 일반적으로 타겟 항원에 결합할 수 있는 도메인을 지칭한다. 항원-결합 도메인은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 키메릭 항원 수용체 및 이의 단편, 또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 항원-결합 도메인은 천연 공급원(source), 합성 공급원, 반합성 공급원, 또는 재조합 공급원일 수 있다. 일부 경우에, 항원-결합 도메인은 단일-사슬 항체(single-chain antibody)를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "항체(antibody)"는 일반적으로 특정 항원을 특이적으로 인식 및/또는 중화(neutralize)할 수 있는 폴리펩티드(polypeptide) 분자를 지칭한다. 예를 들어, 항체는 이황화 결합(disulfide bonds)으로 연결된 적어도 2개의 중쇄(heavy chains)(H) 및 2개의 경쇄(light chains)(L)로 구성된 면역글로불린(immunoglobulin)을 포함할 수 있고, 그의 항원 결합 부분을 포함하는 임의의 분자를 포함할 수 있다. 용어 "항체"는 단일클론(monoclonal) 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체(derivatives)를 포함하고, 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 단일 도메인 항체(예:dAb), 단일-사슬 항체(예:scFv), 및 항원에 결합하는 항체 단편(예:Fab, Fab' 및 (Fab) 2개 단편)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 용어 "항체"는 또한 모든 재조합 형태의 항체, 예를 들어 원핵 세포(prokaryotic cells)에서 발현되는 항체, 당화되지 않은(unglycosylated) 항체, 및 본 출원에 기재된 바와 같은 임의의 항원-결합 항체 단편 및 그의 유도체를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(heavy-chain variable region:VH) 및 중쇄 불변 영역(heavy-chain constant region)으로 구성될 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(light-chain variable region:VL) 및 경쇄 불변 영역으로 구성될 수 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(framework regions:FR)이라고 하는 보다 보존된 영역에 산재된 상보성 결정 영역(complementarity determining regions:CDR)이라고 하는 초가변 영역( hypervariable regions)으로 추가로 구별될 수 있다. 각각의 VH 또는 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR 영역으로 구성될 수 있으며, 이는 아미노 말단(amino terminus)에서 카르복시 말단(carboxy terminus)까지 다음 순서로 배열될 수 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다.
본 출원에서, 용어 "단일-사슬 항체(single-chain antibody)(scFv)"는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 링커(linker)로 연결하여 형성된 항체일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "막관통 도메인(transmembrane domain)"은 일반적으로 세포막을 가로지르는 CAR 내의 도메인을 지칭하며, 이는 세포내 신호전달 도메인과 연결되어 신호를 전달하는 역할을 한다.
본 출원에서, 용어 "공동자극 도메인(costimulatory domain)"은 일반적으로 항원에 대한 효과적인 반응을 위해 림프구를 필요로 하는 세포 표면 분자인 면역 공동자극 분자를 제공할 수 있는 세포내 도메인을 의미한다.
본 출원에서, 용어 "힌지 영역(hinge region)"은 일반적으로 항원-결합 도메인 및 막관통 영역 사이의 링커 영역을 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "신호전달 도메인(signaling domain)"은 일반적으로 신호를 전달할 수 있는 세포 내 도메인을 지칭한다. 본 출원에서, 세포 내 신호전달 도메인은 신호를 세포로 전송할 수 있다. 일반적으로, 신호전달 도메인은 단백질 타겟팅을 지시하기 위한 임의의 연속적인 아미노산 서열이다. 예를 들어, 세포 내 신호전달 도메인은 키메릭 항원 수용체의 세포 내 신호전달 도메인이다.
본 출원에서, 용어 "면역 이펙터 세포(immune effector cell)"는 일반적으로 면역 반응에 참여하고 이펙터 기능을 수행하는 면역 세포를 지칭한다. 예를 들어, 상기 이펙터 기능을 수행하는 것은 외래 항원 제거, 면역 이펙터 반응 촉진 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역 이펙터 세포는 타겟 세포 표면의 항원에 의해 자극되어 면역 반응을 생성하며, 예를 들어, 사이토카인(cytokines)을 분비할 수 있다. 면역 세포의 예에는 다음이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다: 형질 세포(plasma cells), T 세포, B 세포, 자연 살해(natural killer:NK) 세포, 자연 살해 T(natural killer T:NKT) 세포, 비만 세포(mast cells), 과립구(granulocytes), 단핵구(monocytes), 림프구(lymphocytes), 수지상 세포(dendritic cells) 및 대식세포(macrophages). 이 용어는 또한 세포의 전체 유전 물질에 DNA 또는 RNA 형태의 외인성(exogenous) 유전 물질을 추가하여 유전적으로 변형된 면역 세포와 같은 조작된 면역 세포를 포함한다.
본 출원에서, 용어 "T 세포 수용체(T cell receptor:TCR)"는 일반적으로 T 세포 표면의 특정 수용체를 지칭한다. T 세포 수용체는 이종이량체(heterodimer)이며 두 개의 다른 서브유닛(subunits)으로 구성될 수 있다. 대부분의 T 세포 수용체(예를 들어, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상 등)는 α 서브유닛 및 β 서브유닛으로 구성되며, 각각의 펩티드 사슬(peptide chain)은 가변 영역(V 영역), 불변 영역(C 영역), 막관통 영역 및 세포질 영역(cytoplasmic region)을 포함하는 부분으로 분할될 수 있다. 본 출원에서, 용어 "폴리펩티드(polypeptide)", "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)"은 상호교환적으로 사용될 수 있고 일반적으로 임의의 길이의 아미노산을 갖는 중합체(polymer)를 지칭한다. 선형(liner) 또는 분지형(branched)의 이러한 중합체는 변형된 아미노산을 함유할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 이러한 용어는 변형된 아미노산 중합체도 포함한다. 이러한 변형은 다음이 포함될 수 있다: 이황화 결합의 형성, 글리코실화(glycosylation), 지질화(lipidation), 아세틸화(acetylation), 인산화(phosphorylation), 또는 기타 조작(예: 표지된 구성요소에 대한 결합). 용어 "아미노산(amino acid)"는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산(글리신(glycine) 및 D- 및 L-광학 이성질체(optical isomers) 포함), 뿐만 아니라 아미노산 유사체(analogs) 및 펩티드 모방체(mimetics)를 포함한다.
본 출원에서, 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)", "뉴클레오티드(nucleotide)", "뉴클레오티드(염기) 서열(nucleotide sequence)", "핵산(nucleic acid)" 및 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 상호교환적으로 사용될 수 있고 일반적으로 데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오티드(ribonucleotide), 또는 이들의 유사체와 같은 임의의 길이의 뉴클레오시드(nucleoside)의 폴리메트릭(polymetric) 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며 알려진 또는 알려지지 않은 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 암호화(coding) 또는 비-암호화(non-coding) 영역, 연결 분석에 의해 정의된 다중 유전좌위(multiple loci)(하나의 유전좌위), 엑손(exons), 인트론(introns), 메신저 RNA(messenger RNA:mRNA), 트랜스퍼 RNA(transfer RNA), 리보솜 RNA(ribosomal RNA), 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA:siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA:shRNA), 마이크로 RNA(micro-RNA:miRNA), 리보자임(ribozyme), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드(plasmid), 벡터(vector), 임의의 서열의 단리된(isolated) DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브(nucleic acid probes), 및 프라이머(primers). 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 만약 있다면, 뉴클레오티드 구조는 폴리머 조립 전이나 후에 변형될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 중합 후 표지된 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
본 출원에서, "벡터(vector)"는 일반적으로 적합한 숙주에서 자가-복제(self-replication)할 수 있는 핵산 분자를 말하며, 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 간에 전달하는 데 사용된다. 벡터는 주로 DNA 또는 RNA를 세포에 삽입하는 벡터, 주로 DNA 또는 RNA를 복제하는 벡터, 및 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역을 주로 발현하는 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 또한 위에서 정의한 다양한 기능을 갖는 캐리어(carrier)를 포함한다. 벡터는 적합한 숙주 세포 내로 도입될 때 폴리펩티드로 전사 및 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일반적으로, 벡터는 벡터를 함유하는 적합한 숙주 세포를 배양함으로써 원하는 발현 생성물을 생성할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)"는 일반적으로 RNA 바이러스 벡터를 지칭한다. 렌티바이러스 벡터는 생물학적 안전성을 달성하기위해 렌티바이러스의 게놈(genome)을 기반으로 게놈에서 바이러스 활성과 관련된 많은 서열 구조를 삭제하고, 그 다음 실험에 필요한 타겟 유전자의 서열 및 발현 구조를 게놈 골격에 도입하여 제조한 벡터이다. 렌티바이러스를 통한 형질감염(transfection)으로, 자가 게놈 및 운반된 외인성 유전자는 숙주 세포의 게놈에 무작위 및 안정적으로 통합될 수 있다. 예를 들어, CAR 분자는 숙주 세포에 통합될 수 있다.
본 출원에서, "치료(treatment)"라는 용어는 일반적으로 진행을 늦추거나 개선, 중증도 및/또는 증식성 장애의 지속기간, 또는 증식성 장애의 하나 이상의 증상(예를 들어, 하나 이상의 구별 가능한 증상)을 개선하기 위한 하나 이상의 요법(예를 들어, 본 출원에 따른 핵산 분자 및/또는 면역 이펙터 세포와 같은 하나 이상의 치료제)의 투여를 의미한다. 본 출원에서, "치료"라는 용어는 환자가 식별할 수 있는지 여부에 관계없이 증식성 장애의 적어도 하나의 측정 가능한 물리적 매개변수(예: 종양 성장)의 개선을 의미할 수도 있다. 본 출원에서 용어 "치료"는 또한, 물리적 방법으로, 예를 들어, 식별가능한 증상을 안정화하고, 또는 생리학적 방법으로, 예를 들어, 물리적 매개변수를 안정화하고, 또는 두 가지 방법 모두에 의해 증식성 장애의 진행을 억제할 수 있다. 일부 경우에, "치료"라는 용어는 종양 크기 또는 암세포 수의 감소 또는 안정화를 의미할 수 있다.
본 출원에서, "및/또는(and/or)"이라는 용어는 선택 항목 중 하나 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 출원에서, "함유하는(containing)"이라는 용어는 일반적으로 명시적으로 지정된 기능의 포함을 의미하지만 다른 요소를 제외하는 것은 아니다.
본 출원에서, "대략(approximately)"이라는 용어는 일반적으로 지정된 값보다 높거나 낮은 0.5%-10% 범위 내의 변동을 나타내며, 예를 들어, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 및 10% 범위 내에서 지정된 값 이상 또는 이하의 변동을 의미한다.
발명의 상세한 설명
본 출원이 해결하고자 하는 기술적 과제는 CAR-T(또는 TCR-T) 세포가 타겟 세포와 접촉하지 않고 장기간 림프절에 잔류하여 결과적으로 치료 효과에 영향을 미친다는 종래 기술의 결함을 해결하는 것이고, 종양 항원 인식 수용체를 함유하는 면역 세포 및 이의 용도가 제공된다. 과발현된 S1PR1 및 함유된 종양 항원 인식 수용체로, 본 출원에 따른 면역 세포(예를 들어, CAR/TCR-T 세포)는 기능을 수행하기 위한 치료 부위에 보다 쉽게 도달하기 위해 림프절로부터 보다 쉽게 이동할 수 있고, 강한 생존성을 갖는다. 본 출원의 발명자는 면역 세포(예: 기억 CAR-T 세포)에서 S1PR1을 창의적으로 과발현시키면서 면역 세포가 종양 항원 인식 수용체를 함유하도록 하고, 표적 세포와 접촉하지 않고 장기간 림프절 내부에 상주하는 CAR-T 세포를 피하면서 CAR-T 세포의 기억을 보존할 수 있다. 결과적으로, 면역 세포는 림프절에서 더 쉽게 이동하여 치료 부위에 도달할 수 있다. 2개의 단백질 CAR 및 S1PR1이 연결될 때, S1PR1의 과발현이 CAR-T 세포의 생존성을 증가시킨다는 것이 예상외로 발견되었다. 종래 기술에 비해, 본 출원의 기술적 솔루션(technical solutions)은 CAR-T 세포의 기억 형성 및 후속 기능을 효과적으로 향상시키고, 결과적으로 항종양 효과를 향상시킨다.
본 출원은 주로 다음과 같은 기술적 솔루션을 통해 상기 기술적 문제를 해결한다.
본 발명은 S1PR1이 면역 세포에서 과발현되는, 종양 항원 인식 수용체를 함유하는 면역 세포를 제공한다.
종양 항원 인식 수용체는 당업계의 통상적인 종양 항원 인식 수용체, 예를 들어 키메릭 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)일 수 있다.
CAR은 당업계에 통상적인 CAR일 수 있으며, 예를 들어, 세포내 영역, 힌지 영역 및 막관통 영역을 포함할 수 있다; 및 포함된 모든 세포내 영역, 힌지 영역, 및 막관통 영역은 당업계에서 통상적일 수 있다. 본 출원에서 사용되는 세포내 도메인의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 표면 수용체의 세포질 부분, 공동자극 분자, T 세포에서 신호 전달을 개시하기 위해 합동으로 작용하는 모든 분자, 및 이러한 요소의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 모든 합성 서열.
본 출원에 기재된 세포내 도메인, 예를 들어, TCR, CD3ζ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD86, 일반(ordinary) FcRγ, FcRβ(FcεR1b), CD79a, CD79b, FcγRIIa, DAP10, DAP12, T 세포 수용체(TCR), CD8, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX9, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, KIR 패밀리 단백질(family proteins), 림프구 기능 관련 항원-1(lymphocyte function associated antigen-1:LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드(ligands), CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHT), SLAMF7, NKp80(KLRG1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(촉각(Tactile)), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, Toll-유사 수용체1(Toll-like receptor1:TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, 또는 다른 공동자극 분자의 단편 또는 도메인은 본 출원에 기재된 임의의 항원-결합 도메인, 본 출원에 기재된 임의의 막관통 도메인, 또는 CAR에 포함될 수 있는 본 출원에 기재된 임의의 다른 도메인과 조합될 수 있다. 예를 들어, 이들 세포내 도메인은 CD3ζ, CD28, 4-1BB, OX40, SLAMF4, CD127, NKG2D, ICOS 및 FcγRIIIa 중 하나 이상에서 유래할 수 있다.
예를 들어, CAR의 세포내 영역은 인간 4-1BB 세포내 영역 및/또는 인간 CD28 세포내 영역, 및 인간 CD3ζ 세포내 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포내 영역은 상기 인간 4-1BB 세포내 영역, 인간 CD28 세포내 영역, 및 인간 CD3ζ 세포내 영역을 포함할 수 있다.
CAR에 의해 인식되는 항원은 예를 들어, EpCAM, 메조텔린, CEA, IL13, PDPN, VEGF, EGFR, EGFRvIII, PSMA, FAP, CD171, GD2, 글리피칸-2, 글리피칸-3, HER2, HPV 항원, 사이클린 D1, p53, MMP-7, IL13Ralpha2, MMP-2, MUC-1, G250, L1CAM, ROR1, GPC3, 또는 MSLN 등과 같은 당업계의 통상적인 항원일 수 있다. 일부 경우에, 본 출원에 기재된 CAR에 의해 인식되는 항원은 GPC3, 메조텔린, EGFRVIII, IL13Ra2, GPC, 또는 CEA로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 예를 들어, GPC3에 대한 CAR 유전자는 서열목록에 제시된 바와 같은 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.
여기서, S1PR1 단백질은 NCBI 수탁번호 NP_001391에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, S1PR1 유전자는 NCBI 수탁번호 NM_001400에 기재된 염기서열을 포함할 수 있다.
면역 세포에서, S1PR1 유전자 및 CAR 또는 TCR은 동일한 발현 벡터 또는 상이한 발현 벡터에 위치될 수 있다.
S1PR1 유전자 및 CAR 또는 TCR이 동일한 벡터에 위치될 때, 발현 벡터는 S1PR1, IRES를 엔코딩하는 염기서열 및 CAR을 엔코딩하는 염기서열을 순차적으로 포함할 수 있고; 또는 S1PR1, IRES를 엔코딩하는 염기서열 및 TCR을 엔코딩하는 염기서열을 순차적으로 포함할 수 있고; 또는 S1PR1, 2A를 엔코딩하는 염기서열 및 CAR을 엔코딩하는 염기서열을 순차적으로 포함할 수 있고; 또는 S1PR1, 2A를 엔코딩하는 염기서열 및 TCR을 엔코딩하는 염기서열을 순차적으로 포함할 수 있고; 또는 CAR, IRES를 엔코딩하는 염기서열 및 S1PR1을 엔코딩하는 염기서열을 순차적으로 포함할 수 있고; 또는 TCR, IRES를 엔코딩하는 염기서열 및 S1PR1을 엔코딩하는 염기서열을 순차적으로 포함할 수 있고; 또는 CAR, 2A를 엔코딩하는 염기서열 및 S1PR1을 엔코딩하는 염기서열을 순차적으로 포함할 수 있고; 또는 TCR, 2A를 엔코딩하는 염기서열 및 S1PR1을 엔코딩하는 염기서열을 순차적으로 포함할 수 있다. 여기서, IRES의 염기서열은 서열목록의 서열번호 13으로 표시될 수 있고; 2A의 염기서열은 서열목록의 서열번호 14로 표시될 수 있다.
본 출원에 기재된 면역 세포는 T 세포, 예를 들어, 기억 T 세포일 수 있다.
본 출원은 추가로 종양이 췌장암, 신경교종, 간암 또는 결장암을 포함할 수 있는 종양 치료용 약물의 제조에서 상기 정의된 면역 세포의 용도를 제공한다.
본 출원은 상기 정의된 면역 세포를 함유하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다.
본 출원은 종양 항원 인식 수용체를 함유하는 면역 세포의 제조에서 S1PR1의 용도를 추가로 제공한다. 예를 들어, 종양 항원 인식 수용체는 키메릭 항원 수용체 또는 T 세포 수용체일 수 있다.
상기 모든 조건은 본 출원의 모든 실시예를 얻기 위해 당업계의 상식에 따라 무작위로 조합될 수 있다.
본 출원에 사용된 시약 및 원료는 모두 상업적으로 입수할 수 있다.
본 출원은 다음과 같은 긍정적인 진행 효과를 갖는다:
과발현된 S1PR1 및 함유된 종양 항원 인식 수용체로, 본 출원에 따른 면역 세포(예를 들어, CAR/TCR-T 세포)는 기능을 수행하기 위한 치료 부위에 보다 쉽게 도달하기 위해 림프절로부터 더 이동할 수 있다; 종양 항원 인식 수용체를 포함하는 면역 세포(예: CAR-T 세포)의 생체 내/시험관 생존성을 증가시킬 수 있다; 및 또한, 이는 CAR-T 세포의 기억 형성 및 후속 기능을 향상시켜 결과적으로 항종양 효과를 향상시키는 데 도움이 된다.
S1PR1
하나의 면에서, 본 출원은 변형되지 않은 면역 이펙터 세포와 비교하여 S1PR1 단백질의 발현 및/또는 활성이 상향 조절된, 변형된 이펙터 세포를 제공한다. 일부 경우에, 변형되지 않은 면역 이펙터 세포는 S1PR1 단백질을 발현하지 않을 수 있다. 일부 경우에, 변형되지 않은 면역 이펙터 세포는 S1PR1의 기능 및 효과가 발휘되지 않을 정도의 상대적으로 낮은 함량으로 S1PR1 단백질을 발현할 수 있다. 예를 들어, 변형되지 않은 면역 이펙터 세포와 비교하여, 변형된 면역 이펙터 세포의 S1PR1 단백질의 발현이 상향 조절되고, S1PR1 신호 경로와 관련된 단백질의 발현은 상향 조절된다. BCA 정량법(quantitative method), Bradford 정량법, Lowry 검출법(detection method), 및 분광광도법(spectrophotometric method) 같은 단백질 정량법을 이용하여 세포의 단백질 발현 정도를 검출할 수 있다. 예를 들어, 변형되지 않은 면역 이펙터 세포와 비교하여, 변형된 면역 이펙터 세포의 S1PR1 단백질의 활성이 증가되며, 이는 변형된 면역 이펙터 세포의 S1P에 대한 친화도(affinity)가 증가된 것으로 반영될 수 있고, S1PR1 신호 경로의 활성이 상향 조절되며, 면역 이펙터 기능이 향상된다.
예를 들어, S1PR1 단백질의 발현 및/또는 활성을 상향 조절할 수 있는 시약이 면역 이펙터 세포에 투여될 수 있다. 시약은 거대분자(macromolecule)(DNA, RNA, 폴리펩티드 또는 단백질과 같은), 바이러스, 플라스미드, 유기(organic) 또는 무기 미세분자(inorganic micromolecule), 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포는 S1PR1 단백질을 추가로 함유할 수 있다. 면역 이펙터 세포는 변형 전에 S1PR1 단백질을 포함하지 않을 수 있으며, 변형 후, S1PR1 단백질의 발현은 변형된 면역 이펙터 세포에서 검출될 수 있다. 일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포의 S1PR1은 단백질 수준에서 직접 과발현될 수 있다. 예를 들어, S1PR1 단백질은 S1PR1 단백질을 발현할 수 있도록 S1PR1을 발현하지 않는 면역 이펙터 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, S1PR1 단백질은 S1PR1 단백질의 발현 수준을 증가시키기 위해 낮은 수준으로 S1PR1을 발현하는 면역 이펙터 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, S1PR1 유전자는 S1PR1 단백질을 발현할 수 있도록 S1PR1을 발현하지 않는 면역 이펙터 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, S1PR1 유전자는 S1PR1 단백질의 발현 수준을 증가시키기 위해 낮은 수준으로 S1PR1을 발현하는 면역 이펙터 세포에 도입될 수 있다.
본 출원에서, 변형된 면역 이펙터 세포에서 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자의 발현 및/또는 활성은 변형된지 않은 면역 이펙터 세포와 비교하여 상향 조절된다. 일부 경우에, 면역 이펙터 세포는 변형 전에 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 함유하지 않을 수 있다; 다른 경우에; 면역 이펙터 단백질은 변형 전 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 함유할 수 있지만 발현하지 않을 수 있다; 및 다른 경우에, 면역 이펙터 단백질은 변형 전 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 함유할 수 있지만 낮은 발현 수준이다.
일부 경우에, 변형된 면역 이펙터 세포는 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 추가로 함유한다. 예를 들어, S1PR1을 엔코딩하는 핵산 분자는 면역 이펙터 세포 내로 도입될 수 있고(예를 들어, 하기에 기술된 것과 같은 벡터에 의해), 변형된 면역 세포는 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 추가로 함유한다.
예를 들어, 시약은 면역 이펙터 세포에 투여될 수 있으며, 여기서 시약은 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자의 번역 또는 전사를 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 변형된 면역 이펙터 세포의 S1PR1은 DNA 및/또는 RNA에서 과발현될 수 있다. 예를 들어, 시약은 거대분자(예를 들어, DNA, RNA, 폴리펩티드 또는 단백질), 바이러스, 플라스미드, 유기 또는 무기 미세분자, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, S1PR1 유전자는 면역 이펙터 세포 내로 도입되어, 면역 세포가 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어, S1PR1 유전자는 전장 S1PR1 단백질을 함유 및 엔코딩하는 핵산 분자, 또는 S1PR1의 엔코딩 영역을 함유하는 핵산 분자일 수 있다. 예를 들어, S1PR1 유전자는 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 구축된, 다음 면역 세포에 도입된다. S1PR1 단백질은 전장 S1PR1 단백질, 또는 전장 S1PR1 단백질의 절단된 형태, 접합된 형태 또는 기능적 단편일 수 있다. 예를 들어, S1PR1 단백질은 전장 인간 S1PR1 단백질이고, 전장 인간 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자는 NCBI 수탁 번호 NM_001400에 표시된 염기서열을 포함할 수 있다.
CAR
본 출원에서, 본 출원에 기재된 면역 세포는 키메릭 항원 수용체(CAR) 및/또는 T 세포 수용체(TCR)를 포함할 수 있다.
본 출원에서, CAR은 종양-특이적 항원을 타겟팅 하는 키메릭 항원 수용체를 포함할 수 있고, 여기서 종양-특이적 항원은 다음으로 구성된 군에서 선택될 수 있다: EpCAM, 메조텔린(MSLN), CEA, IL13, PDPN, VEGF, EGFR, EGFRvIII, PSMA, FAP, CD171, GD2, 글리피칸-2, 글리피칸-3, HER2, HPV 항원, 사이클린 D1, p53, MMP-7, IL13Ralpha2, MMP-2, MUC-1, G250, L1CAM, ROR1 및 GPC3.
일부 경우에, CAR은 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다. 항원-결합 도메인은 종양-특이적 항원에 결합할 수 있고, 여기서 종양 특이적 항원은 다음으로 구성된 군에서 선택된다: EpCAM, 메조텔린(MSLN), CEA, IL13, PDPN, VEGF, EGFR, EGFRvIII, PSMA, FAP, CD171, GD2, 글리피칸-2, 글리피칸-3, HER2, HPV 항원, 사이클린 D1, p53, MMP-7, IL13Ralpha2, MMP-2, MUC-1, G250, L1CAM, ROR1 및 GPC3. 일부 경우에, 항원-결합 도메인은 단일-사슬 항체 scFv를 포함할 수 있다. 예들 들어, 단일-사슬 항체는 GPC3을 타겟팅하는 단일-사슬 항체 GC33을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일-사슬 항체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일-사슬 항체는 MSLN을 타겟팅하는 단일-사슬 항체 P4G2를 포함할 수 있고, 예를 들어, 단일-사슬 항체는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, CAR은 막관통 도메인을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 다음으로 구성된 군에서 선택된 단백질로부터 유래된 막관통 도메인을 포함할 수 있다: CD3ζ, CD28, 4-1BB, OX40, SLAMF4, CD127, NKG2D, ICOS 및 FcγRIIIa.
본 출원에서, CAR은 공동자극 도메인을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 공동자극 도메인은 다음의 단백질 또는 이들의 조합으로부터 선택된 공동자극 도메인을 포함할 수 있다: CD137, CD28, OX40, ICOS, DAP10, 2B4, CD27, CD30, CD40, CD40L, TIM1, CD226, DR3, SLAM, NKG2D, CD244, FceRIγ, BTLA, GITR, HVEM, CD2, NKG2C, LIGHT 및 DAP12.
본 출원에서, CAR은 힌지 영역을 함유할 수 있고, 이는 항원-결합 도메인 및 막관통 도메인을 연결한다. 일부 경우에, 힌지 영역은 다음으로 구성된 군에서 선택된 단백질로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다: CD8, CD28, IgG, 4-1BB, CD4, CD27, CD7, PD-1 및 CH2CH3.
본 출원에서, CAR은 항원-결합 도메인, 힌지 영역, 막관통 도메인, 공동자극 도메인, 및/또는 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR은 서열번호 5 내지 서열번호 6 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에 기재된 변형된 면역 세포는 CAR을 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR은 서열번호 5 내지 서열번호 6 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에 기재된 변형된 면역 세포는 CAR을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR을 엔코딩하는 핵산 분자는 서열번호 3 내지 서열번호 4 중 어느 하나로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.
면역 이펙터 세포 및 세포 집단
본 출원에서, 변형된 면역 이펙터 세포는 벡터를 함유할 수 있고, 이는 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 본 출원에서, 변형된 면역 이펙터 세포는 벡터를 함유할 수 있고, 이는 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자 및 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자는 동일한 벡터에 위치될 수 있다. 다른 경우에, 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자 및 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자는 다른 벡터에 위치될 수 있다.
키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자 및 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자가 동일한 벡터에 위치될 때, 일부 경우에, 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자는 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자의 5'-말단에 위치될 수 있고; 또는, 다른 경우에, 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자는 변형된 면역 이펙터 세포의 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자의 3'-말단에 위치될 수 있다.
키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자 및 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자는 임의의 실행 가능한 링커(linker)(예를 들어, IRES 또는 2A와 같은 절단 가능한 펩티드)에 의해 연결될 수 있다. 예를 들어, IRES의 염기서열은 서열목록의 서열번호 13으로 표시되고; 및 2A의 염기서열은 서열목록의 서열번호 14로 표시된다.
예를 들어, 벡터는 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자, 링커 및 5'-말단에서 3'-말단까지 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자를 순차적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자, 링커 및 5'-말단에서 3'-말단까지 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 순차적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 서열번호 7 내지 서열번호 9 중 어느 하나로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 출원에 기재된 변형된 면역 이펙터 세포는 서로 다른 유형의 링커 및 서로 다른 연결 서열이 포함되는 경우를 포함하며, 이들 모두는 본 출원에 기재된 유익한 효과를 갖는다. 변형된 면역 이펙터 세포에서, S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자가 항원-엔코딩 키메릭 수용체의 N-말단 및 C-말단에 부착되는 경우, 또는 다른 유형의 링커가 투여될 때, 변형된 면역 이펙터 세포는 생체내 또는 시험관내에서 항종양 효과를 갖는다. 예를 들어, 시험관내 킬링 실험(killing experiment)에서, 변형된 면역 이펙터 세포는 타겟 세포를 죽일 수 있고 사이토카인 분비 능력이 증가하고 이동 능력이 향상된다. 예를 들어, 시험관내 실험에서, 변형된 면역 이펙터 세포는 종양 성장을 억제할 수 있으며, 림프절에서 이동하는 효과가 향상되었다.
면역 이펙터 세포는 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, NKT 세포, 단핵구, 수지상 세포, 과립구, 림프구, 백혈구 및/또는 말초혈액단핵세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 면역 세포는 T 림프구를 포함할 수 있다. T 림프구는 흉선 세포(thymocyte), 천연 T 림프구, 미성숙 T 림프구, 성숙한 T 림프구, 휴지기(resting) T 림프구, 또는 활성화된 T 림프구를 포함할 수 있다. T 세포는 보조 T 세포 1(helper T cell 1:Th1) 또는 보조 T 세포 2(Th2)와 같은 보조 T 세포(Th)일 수 있다. T 림프구는 CD4+ 보조 T 세포(HTL; CD4+ T 세포), 세포독성(cytotoxic) T 세포(CTL; CD8+ T 세포), 종양 침윤(tumor infiltrating) 세포독성 T 세포(TIL; CD8+ T 세포), CD4+/CD8+ T 세포, CD4-/CD8-T 세포, 또는 임의의 다른 T 림프구 서브타입일 수 있다. T 림프구는 중앙 기억(central memory) T 세포(TCM세포), 이펙터 기억(effector memory) T 세포(TEM세포), 조직 상주 기억(tissue resident memory) T 세포(TRM), 가상 기억(virtual memory) T 세포(TVM세포), 줄기 기억(stem memory) T 세포(TSCM세포), 또는 일반적으로 CD45RO를 발현하지만 CD45RA 기억 T 세포가 부족할 수 있는 다른 CD4+ 또는 CD8+와 같은 기억 T 세포일 수 있다.
또 다른 면에서, 본 출원은 본 출원에서 정의된 면역 이펙터 세포를 함유할 수 있는 세포 집단을 제공한다. 일부 경우에, 세포 집단의 면역 이펙터 세포가 20% 이상(예를 들어, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 그 이상)에 도달하면, 세포 집단은 종양 부위(예를 들어, 종양 조직 내부)로 이동할 수 있다. 예를 들어, 생체내 실험에서, 마우스(mice)에 세포 집단을 주입하고, S1PR1을 발현하지 않는 CAR T 세포 집단과 비교하면, 말초혈액 내 T 세포 함량의 증가는 본 출원에 기재된 세포 집단에서 검출된다. 예를 들어, 시험관내 실험에서, S1PR1을 발현하는 CAR T 세포는 하부 챔버로 이동할 수 있다. 또 다른 예에서, 생체내 실험에서, 말초 혈액에서 T 세포의 함량을 감지하기 위해 마우스에 세포 집단을 주입했다. S1PR1을 발현하는 CAR T 세포 집단의 T 세포는 말초 혈액 및 종양 조직 내부에 더 많이 분포하는 경향이 있고; 및 S1PR1을 발현하지 않는 CAR T 세포 집단의 T 세포는 말초 혈액, 림프절 및 종양 조직 내부에 분포하는 경향이 있다.
약학적 조성물, 방법, 용도 및 캐리어
또 다른 면에서, 본 출원은 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 본 출원에 따른 면역 이펙터 세포 및/또는 세포 집단, 및 임의로 약학적으로 허용되는 캐리어를 함유할 수 있다. 본 출원에서, 용어 "약학적으로 허용되는 캐리어(pharmaceutically acceptable carrier)"는 일반적으로 본 출원에 따른 면역 세포 및/또는 세포 집단의 투여와 양립가능한 용매(solvents), 분산 매질(dispersion media), 코팅(coatings), 항균(antibacterial) 및 항진균제(antifungal agents), 등장제(isotonic agents) 및 흡수 지연제(absorption delay agents) 및 기타 모든 것을 지칭한다. 본 출원에 기재된 면역 이펙터 세포 및/또는 세포 집단과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 임의의 통상적인 배지 또는 시약은 본 출원의 약학적 조성물에 사용되기 위해 고려될 수 있다.
어떤 면에서, 본 출원에 따른 방법은 CAR 및/또는 CAR을 함유하는 벡터 중 하나 이상을 숙주 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포)에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 출원에 따른 방법은 S1PR1 및/또는 S1PR1을 함유하는 벡터를 숙주 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포)에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 출원에 따른 방법은 CAR 및/또는 TCR 및 S1PR1을 함유하는 하나 이상의 벡터를 숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)에 전달하는 단계를 추가로 포함한다. 어떤 면에서, 본 출원은 또한 상기 방법에 의해 생산된 세포 및 상기 세포를 포함하거나 상기 세포로부터 생산된 유기체(예를 들어, 동물, 식물 또는 곰팡이)를 제공한다. 일부 경우에, S1PR1에 연결된 CAR은 세포로 전달될 수 있다. 포유동물 세포 또는 타겟 조직에 핵산 서열을 도입하기 위해 기존의 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달방법이 사용될 수 있다.
또 다른 면에서, 본 출원은 단리된 핵산 분자를 함유할 수 있는 벡터를 제공한다.
본 출원에서, 벡터는 플라스마드, 레트로바이러스 벡터, 및 렌티바이러스 벡터 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 따른 벡터는 5'-말단으로부터 다음의 염기서열을 순차적으로 함유한다: S1PR1을 엔코딩하는 유전자, IRES를 엔코딩하는 유전자, 및 CAR을 엔코딩하는 유전자. 또 다른 예로, 본 출원에 따른 벡터는 5'-말단으로부터 다음의 염기서열을 순차적으로 함유한다: S1PR1을 엔코딩하는 유전자, 2A를 엔코딩하는 유전자, 및 CAR을 엔코딩하는 유전자. 또 다른 예로, 본 출원에 따른 벡터는 5'-말단으로부터 다음의 염기서열을 순차적으로 함유한다: CAR을 엔코딩하는 유전자, IRES를 엔코딩하는 유전자, 및 S1PR1을 엔코딩하는 유전자. 또 다른 예로, 본 출원에 따른 벡터는 5'-말단으로부터 다음의 염기서열을 순차적으로 포함한다: CAR을 엔코딩하는 유전자, 2A를 엔코딩하는 유전자, 및 S1PR1을 엔코딩하는 유전자. 또한, 벡터는 또한 다른 유전자, 예를 들어, 적절한 숙주 세포 및 적절한 조건하에서 벡터를 선택하도록 허용되는 마커(marker) 유전자를 함유할 수 있다. 또한, 벡터는 또한 코딩(coding) 영역이 적합한 숙주에서 올바르게 발현되도록 하는 발현 제어 요소(expression control element)를 포함할 수 있다. 이러한 제어 요소는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 프로모터(promoter), 리보솜 결합 부위(ribosome binding site), 인핸서(enhancer) 및 유전자 전사 또는 mRNA 번역을 조절하는 기타 제어 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 발현 제어 서열은 조절 가능한 요소이다. 발현 제어 서열의 구체적인 구조는 종의 기능 또는 세포 유형에 따라 다를 수 있으며, 그러나 일반적으로 각각 전사 및 번역 개시에 참여하는 5'비-전사 서열(5'non-transcribed sequence) 및 5' 및 3'비-번역 서열(5' and 3'non-translated sequences), 예를 들어, TATA 박스(TATA box), 캡핑 서열(capped sequence), CAAT 서열(CAAT sequence) 등을 포함한다. 예를 들어, 5' 비-전사 발현 제어 서열은 프로모터 영역을 포함할 수 있고, 프로모터 영역은 전사 제어를 위해 핵산에 기능적으로 연결되는 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 본 출원에 기재된 하나 이상의 핵산 분자는 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다.
핵산의 비-바이러스 전달을 위한 방법에는 리포펙션(lipofection), 핵 형질감염(nuclear transfection), 미세주사(microinjection), 유전자 총(gene gun), 바이러스 입자(viral particles), 리포솜(liposomes), 면역리포솜(immunoliposomes), 복수양이온(polycations) 또는 지질 핵산 접합체(lipid nucleic acid conjugates), 네이키드 DNA(naked DNA), 인공적 비리온(artificial virions), 및 DNA 흡수를 향상시키기 위한 시약이 포함된다. 핵산은 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템을 사용하여 전달할 수 있다. 예를 들어, 생체 내에서 특정 세포를 타겟팅 삼을 수 있는 바이러스의 특성으로 인해, 바이러스는 효과적으로 탑재되어 핵으로 운반된다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접(생체 내) 투여되거나 간접적인 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 시험관 내에서 세포를 치료하는 데 사용되고, 그런 다음 치료된 세포가 환자에게 투여된다(시험관 내). 기존의 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터(adenovirus vector), 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated virus vector), 단순 헤르페스바이러스 벡터(herpes simplex virus vector)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노 관련 바이러스는 유전자를 숙주 게놈에 전달 및 통합하는데 사용될 수 있고, 삽입된 유전자가 장기간 발현될 수 있게 한다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포(non-dividing cell)를 형질도입 또는 감염시킬 수 있고 일반적으로 더 높은 바이러스 역가(titer)를 생성할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 렌티바이러스 벡터는 긴 말단 반복(long terminal repeat) 5'LTR 및 절단된 3'LTR, RRE, rev 반응 요소(rev response element)(cPPT), 중심 종결 서열(central termination sequence:CTS) 및/또는 번역 후 조절 요소(post-translational regulatory element:WPRE)를 포함할 수 있다. 분자는 BamHI 및 XbaI 분해에 의해 렌티바이러스 벡터에 구성될 수 있다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 타겟 조직에 따라 달라진다.
본 출원에 따른 방법은 본 출원에 기재된 벡터를 면역 이펙터 세포에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 벡터는 T 세포, 림프구, 과립구 및/또는 말초혈액단핵세포와 같은 면역 이펙터 세포에 도입될 수 있다. 일부 실시예에서, 각각의 유형 또는 각각의 세포는 본 출원에 기재된 벡터의 하나 또는 하나의 유형을 함유할 수 있다. 일부 실시예에서, 각각의 유형 또는 각각의 세포는 본 출원에 기재된 복수(예를 들어, 2개 이상) 또는 복수 유형(예를 들어, 2개 이상)의 벡터를 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 벡터는 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 면역 이펙터 세포는 바이러스 게놈을 융합 단백질을 인코딩하는 핵산과 함께 숙주 게놈 내로 통합하기 위해 레트로바이러스 벡터에 의해 형질감염될 수 있고, 따라서 타겟 유전자의 장기적이고 안정적인 발현을 보장한다. 본 출원에서, 본 출원에 기재된 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산을 갖는 벡터는 전기천공법(electroporation)(네온 전기청공기(Neon electroporator)) 및 리포솜 형질감염(liposome transfection)과 같은 당업계의 공지된 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
또 다른 면에서, 본 출원은 종양 치료를 위한 약물의 제조에서 정의된 바와 같은 면역 이펙터 세포, 정의된 바와 같은 세포 집단 및/또는 정의된 바와 같은 약학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 경우에, 종양은 고형 종양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양은 췌장암, 신경교종, 간암 및/또는 결장암을 포함한다. 특정 이론에 얽매이는 것은 아니며, 다음의 실시예는 본 출원에 따른 융합 단백질, 제조 방법 및 용도 등을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
■ 실시예
■ 실시예 1 렌티바이러스 벡터의 구성 및 페키징 (packaging)
1.1 렌티바이러스 벡터의 구성
S1PR1(NCBI GenBank에서 수탁번호 NM_001400을 가짐), IRES(서열목록의 서열번호 13으로 표시된 염기서열을 가짐), 및 GFP 유전자(서열목록의 서열번호 15로 표시된 염기서열을 가짐)는 유전자-전체 합성법(gene-wide synthesis method)을 이용한 합성을 통해 순차적으로 연결된다; BamHI 제한 부위 서열(restriction site sequence)은 S1PR1의 다운스트림(downstream)에 추가되고; XbaI 제한 부위 서열은 GFP 유전자의 업스트림(upstream)에 추가되며, 그런 다음 벡터 pLVX-EF1α-IRES-Puro EcoRI/MluI의 두 제한 부위 사이의 위치에 클로닝되고; 그 다음, S1PR1-IRES-GFP(서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 가짐) 플라스미드를 구성하였다.
항-GPC3 CAR 유전자 GC33CAR는 항-GPC3 단일-사슬 항체 GC33(서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가짐)인 유전자 전체 합성을 통해 제조되었으며, 힌지 영역 CD8a, 막관통 영역 CD8, 세포내 영역 CD137(4-1BB), 및 세포내 영역 CD3z는 순서대로 직렬 연결되었다. GC33CAR의 염기서열은 서열번호 3으로 표시된다. GC33CAR는 S1PR1-IRES-GFP에서 각각 S1PR1 및 GFP를 대체하여 GC33CAR-IRES-GFP(서열번호 11로 표시되는 염기서열을 가짐) 및 S1PR1-IRES-GC33CAR(서열번호 12로 표시되는 염기서열을 가짐) 플라스미드를 구성하기 위해 사용된다.
S1PR1-IRES-GC33CAR에서 IRES를 대체하기 위해 2A(서열번호 14로 표시되는 염기서열을 가짐)는 사용되며, S1PR1-2A-GC33CAR(서열번호 8로 표시되는 염기서열을 가짐) 플라스미드를 제조하기 위해 벡터가 삽입된다.
S1PR1는 GC33CAR-IRES-GFP에서 GFP를 대체하는데 사용되고, GC33CAR-IRES-S1PR1(서열번호 7로 표시되는 염기서열을 가짐) 플라스미드를 제조하기 위해 벡터가 삽입된다.
GC33CAR 유전자는 GC33CAR 플라스미드를 제조하기 위해 벡터에 삽입된다.
항-MSLN CAR 유전자 P4G2CAR은 항-MSLN 단일-사슬 항체 P4G2(서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가짐)인 유전자-전체 합성을 통해 제조되고, 힌지 영역 CD8a, 막관통 영역 CD8, 세포내 영역 CD137(4-1BB), 및 세포내 영역 CD3z는 순서대로 직렬 연결된다. P4G2CAR의 염기서열은 서열번호 4로 표시된다. P4G2CAR은 S1PR1-2A-GC33CAR에서 GC3CAR을 대체하여 S1PR1-2A-P4G2CAR(서열번호 9로 표시되는 염기서열을 가짐) 플라스미드를 제조하기 위해 사용된다.
P4G2 유전자는 P4G2 플라스미드를 제조하기 위해 벡터에 삽입된다.
1.2 렌티바이러스의 페키징
렌티바이러스는 3-플라스미드 시스템(three-plasmid system)을 통해 패키징된다.
■ 실시예 2 CAR 발현의 확인
CAR-T 세포는 GC33CAR-IRES-GFP, S1PR1-IRES-GC33CAR, 및 S1PR1-IRES-GFP 렌티바이러스를 사용하여, PBMC 세포(CD3 및 CD28에 의해 활성화됨)를 감염 및 활성화함으로써 구축된다. 바이러스에 감염된 CAR-T 세포의 CAR-양성 비율(CAR-positive rate)을 검출하기 위해 유세포 분석(Flow cytometry)이 사용되고, 여기서 S1PR1-IRES-GFP로 형질감염된 면역 T 세포의 CAR-양성 비율은 대안적으로 GFP에 의해 검출되었다. 결과는 표 1 및 도 1에 표시된다. 결과는 GC33CAR-IRES-GFP를 함유하는 CAR-T 세포의 CAR-양성 비율이 56.68%임을 보여준다(도 1A); S1PR1-IRES-GFP(대조군)로 형질감염된 면역 T 세포의 양성 비율은 50.93%(도 1B)이고; S1PR1-IRES-GC33CAR을 함유하는 CAR-T 세포의 CAR-양성 비율은 30.24%(도 1C)로 가장 낮았다.
CAR-T(또는 T) 세포의 양성 비율
[GFP+] % Gated [CAR+] % Gated
GC33CAR-IRES-GFP 59.03 56.68
S1PR1-IRES-GFP 50.93 0.2
S1PR1-IRES- GC33CAR 0.69 30.24
■ 실시예 3 시험관 내 S1PR1 이동 기능 확인
CAR-T 세포의 이동 능력은 Transwell 실험(Transwell experiment)에 의해 S1P의 구배 농도(0, 1, 10, 100, 1000nM) 하에서 확인되었다. GFP-양성 비율이 70%인 S1PR1-IRES-GFP-형질감염된 면역 T 세포(2.5×106 세포) 200㎕는 배양 용액(culture solution)으로서 1640와 함께 3415 Transwell 챔버의 상부 챔버에 첨가되고; 구배 농도의 S1P 500㎕는 배양 용액으로서 1.5% FBS+1640과 함께 하부 챔버에 첨가되었다. 면역 T 세포는 인큐베이터(incubator)에서 3시간 동안 배양되고(incubated), 하부 챔버로 이동한 세포의 GFP-양성 비율은 유세포 분석에 의해 검출되었다. 결과는 100nM과 1000nM에서 S1P 처리로 하부 챔버로 이동한 양성 CAR-T 세포의 비율이 유의하게 증가함을 보여준다. 즉, S1PR1을 발현하는 면역 T 세포는 S1P에 의해 영향을 받는 세포의 이동 능력을 향상시킬 수 있다(도 2 및 도 3).
GC33CAR 또는 GC33CAR-IRES-S1PR1로 형질감염된 1x106 면역 T 세포는 배양 용액으로서 1640과 함께 3415 Transwell 챔버의 상부 챔버에 넣어졌고; 500μl의 100nM S1P는 배양 용액으로서 1640과 함께 하부 챔버에 첨가되었고; 배양은 3시간 동안 인큐베이터에서 수행되었다. S1P는 대조군으로 첨가되지 않았다. 하부 챔버에 있는 세포의 양은 세포 계수기(cell counter)로 계산되었으며, 이동 능력%=하부 챔버의 세포 양/(1×106)×100%. 결과는 S1PR1을 발현하는 CAR T 세포는 세포 이동 능력을 향상시킬 수 있고, S1P가 양성인 경우 전달 효율이 높다는 것을 보여준다(도 4).
■ 실시예 4 타겟 세포에 대한 사멸 능력 확인
4.1 S1PR1-IRES-GFP, GC33CAR-IRES-GFP 및 S1PR1-IRES-GC33CAR로 감염된 T 세포의 사멸 능력
루시퍼라제 단백질(luciferase protein:Luc)을 발현하는 타겟 세포 Huh7(Chinese Academy of Sciences의 Cell Bank에서 구입)에 대한 S1PR1-IRES-GFP, GC33CAR-IRES-GFP 및 S1PR1-IRES-GC33CAR 렌티바이러스에 감염된 T(또는 CAR-T) 세포의 사멸 능력은 T 세포 사멸 실험에 의해 확인되었다. 타겟 세포에 대한 이펙터 세포의 비율은 다음과 같다: 20:1, 10:1, 5:1, 2.5:1, 1.25:1 및 0.625:1. 다음 군이 설정된다: DMEM(2% FBS) 배양 용액의 블랭크 대조군; CAR-T 이펙터 세포군; 이펙터 세포 및 Huh7 타겟 세포군, 여기서 타겟 세포는 웰(well)당 1 x 104 세포이고, 이펙터 세포는 이펙터 세포/타겟 세포 비율을 기준으로 첨가됨; 타겟 세포군(Huh7) 및 최대 용해 속도군(maximum lysis rate group)(Huh7-max), 웰당 1x104 세포. 배양은 37°C에서 4시간 동안 수행되었다. 처리는 3.5시간 동안 진행하였고, Huh7-max 군에 대해 20 μl의 용해 완충액(lysis buffer)은 각 웰에 첨가되었다. 30분 동안 배양은 계속되었으며, 플레이트(plate)는 300g에서 5분 동안 원심분리되었다. 원래 플레이트 순서에 따라, 각 웰에서 50㎕의 상등액(supernatant)은 추출되고 COSTAR 3300 웰 플레이트에 넣었다. 상온에서 30분간 반응시키기 위해 기질 50μl는 첨가되고, 그런 다음 50μl의 STOP 완충액(cytoTox 96 Non-radioactive Cytotoxicity kit, promega)이 첨가되었다. 컴퓨터에서 OD490 판독값이 감지되었고, 타겟 세포에 대한 CAR-T 세포의 사멸 효율은 다음 공식으로 계산되었다: 특정 사멸% = (실험군-이펙터 세포의 자가 방출-타겟 세포의 자가 방출)/(타겟 세포의 최대 방출-타겟 세포의 자가 방출)×100%. 결과는 S1PR1-IRES-GC33CAR을 함유하는(또는 형질감염된) CAR-T 세포는 타겟 세포에 대해 가장 강력한 사멸 능력을 가진다는 것을 보여주었고, 그 다음은 GC33CAR-IRES-GFP를 함유하는 CAR-T 세포이고, 반면 S1PR1-IRES-GFP로 형질감염된 CAR-T 세포는 타겟 세포에 대해 유의한 사멸 능력을 갖지 않았다(도 5).
4.2 GC33CAR-IRES-S1PR1, S1PR1-2A-GC33CAR 및 GC33CAR에 감염된 T 세포의 사멸 능력
4.1의 방법을 기반으로, 타겟 세포 Huh7-Luc에 대한 GC33CAR-IRES-S1PR1, S1PR1-2A-GC33CAR 및 GC33CAR 렌티바이러스에 감염된 T(또는 CAR-T) 세포의 사멸 능력은 확인되었다. GC33CAR-감염된 T 세포 및 야생형 T 세포는 대조군으로 선택되었다. 결과는 도 6으로 표시된다. 5'-말단에 S1PR1을 발현하는 CAR 세포 및 3'-말단에 S1PR1을 발현하는 CAR T 세포 모두 타겟 세포에 대한 사멸 능력을 나타내었고, S1PR1 및 CAR 사이에 다른 연결 펩티드를 가진 T 세포는 타겟 세포에 대한 사멸 능력을 보여주었다.
4.3 S1PR1-2A-P4G2CAR에 감염된 T 세포의 사멸 능력
4.1의 방법을 기반으로, 타겟 세포 Huh7-Luc에 대한 S1PR1-2A-P4G2CAR 렌티바이러스에 감염된 T 세포의 사멸 능력은 확인되었다. P4G2CAR로 감염된 T 세포는 대조군으로 선택되었다. 결과는 도 7로 표시된다. S1PR1을 발현하는 CAR T 세포는 타겟 세포에 대한 사멸 능력을 나타내고, 이는 대조군 T 세포보다 높았다.
■ 실시예 5 시험관내 사이토카인 분비 확인
CAR-T 세포는 P4G2 및 S1PR1-2A-P4G2CAR 렌티바이러스를 사용하여 PBMC 세포(CD3 및 CD28에 의해 활성화됨)를 감염 및 활성화하여 T 세포가 시험관 내에서 사이토카인을 분비하는 능력을 확인함으로써 구축되었다.
요컨대, MSLN-발현 CF-APC-1 세포 CF-APC-1-MSLN이 먼저 구축되었고; MSLN의 염기서열은 NCBI 데이터베이스에서 수탁번호 NM_005823으로부터 획득되었고; MSLN-IRES-puro 합성되었고; MSLN-IRES-puro를 과발현하는 렌티바이러스는 패키징되었고; CF-APC-1 세포(Chinese Academy of Sciences의 Cell Bank로부터, TCHu112)는 제조된 렌티바이러스로 감염되었고; 48시간 후, 안정적인 형질전환 균주(transgenic strain)를 얻기 위해 5ug/ml 퓨로마이신(puromycin)으로 스크리닝(screening)이 수행되었다.
CF-APC-1 세포(Chinese Academy of Sciences의 Cell Bank로부터, TCHu112), CF-APC-1-MSLN 세포, 인간 췌장암 세포(human pancreatic cancer cells:PANC)(Chinese Academy of Sciences의 Cell Bank로부터), 및 타겟 세포로서 MSLN(Chinese Academy of Sciences의 Cell Bank로부터, TCHu 98)을 발현하는 PANC 세포는 세척되고, 1x105 cells/mL로 DMEM(2% FBS 함유)배지에 현탁되었으며(suspended), 각각의 타겟 세포는 96-웰 플레이트에 1x105개 세포/웰로 첨가되었다. CAR-T 세포는 세척되고 DMEM(2% FBS 함유) 배지에 1x105개 세포/웰로 현탁되었다. 또한, CAR을 발현하지 않는 야생형 T 세포를 대조군으로 하였다. 96웰 플레이트는 37°C에서 24시간 동안 배양되었다. 그런 다음 상등액은 수확되고, 인간 TH1/TH2 사이토카인 검출 키트(BD CBA, 카탈로그 번호 551809)는 IL-2 및 IFN-γ의 유세포 분석 측정에 사용되었다. 결과는 P4G2CAR만을 발현하는 T 세포와 비교하여 MSLN을 발현하는 타겟 세포의 자극 하에서, S1PR1-2A-P4G2CAR을 발현하는 T 세포는 사이토카인 IL-2(도 8A) 및 IFN-γ(도 8B)를 분비하는 능력이 향상된 것을 보여준다.
■ 실시예 6 생체 내 종양 억제의 실험적 확인
CAR-T 세포는 GC33CAR 및 GC33CAR-IRES-S1PR1 렌티바이러스를 사용하여 PBMC 세포(CD3 및 CD28에 의해 활성화됨)를 감염 및 활성화함으로써 구축되었다. 요컨대, 루시페라제를 발현하는 자가 구축된 타겟 종양 세포는 피하 주사(subcutaneous injection)에 의해 유도된 NSG 마우스 종양에 접종되었고; 2×106개의 상기 타겟 세포는 100㎕의 인산염 완충 식염수 용액(phosphate buffered saline solution)에 재현탁되고(resuspended) 피하 주사되었다. 또는, 루시퍼라제를 발현하는 자가 구축된 타겟 종양 세포는 정맥 주사(intravenous injection)로 유도된 NSG 마우스 종양에 접종되었고; 2x106개의 상기 표적 세포는 100㎕의 인산염 완충 식염수 용액에 재현탁되고 마우스에 피하 주사되었다. 종양은 3-4일마다 버니어 캘리퍼스(vernier caliper)로 측정되었으며, 종양 부피=길이*폭*폭/2이다.
종양 형성 14일 후, PBS로 세척된 CAR T 세포는 무혈청(serum-free) 배양 용액에 재현탁되어 200μl/마우스로 마우스에 정맥내 주사(i.v.)하기 위해 세포 밀도를 1x107/ml로 조정하고, 또는 50㎕/마우스로 마우스에 종양내 주사(i.t.)를 위해 세포 밀도를 1×108/ml로 조정한다. 야생형 T 세포를 대조군으로 하였다. 주사 후, 종양 부피를 3일마다 측정하였다. 종양 부피는 다음과 같이 계산된다: 종양 부피(mm3) = 0.5×긴 종양 직경(diameter)×짧은 종양 직경2. 28일째에 마우스의 말초혈액은 채취되고 유세포분석기로 CD3+ 세포의 양은 측정되었다.
결과는 GC33CAR-형질감염된 T 세포 및 GC33CAR-IRES-S1PR1-형질감염된 T 세포 모두 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다(도 8). 도 9A 내지 도 9B는 CAR T 세포가 다른 주입 수단으로 주입되었기 때문에 마우스의 종양 부피는 감소했음을 보여준다.
■ 실시예 7 생체 내 S1PR1 이동 기능 확인
실시예 6의 방법에 기초하여 마우스 모델을 구축하고, 그룹화하고, 종양 형성 14일 후에 GC33CAR T 세포 및 GC33CAR-IRES-S1PR1 T 세포를 주사하였다. 28일째에 마우스의 말초혈액을 채취하고 유세포분석기로 CD3+ 세포의 양을 측정하였다.
결과는 GC33CAR-IRES-S1PR1이 형질감염된 T 세포를 투여한 마우스의 말초혈액 내 T 세포의 양이 GC33CAR-형질감염된 T 세포를 투여한 군보다 많았음을 보여준다(도 10). S1PR1을 발현하는 CAR T 세포는 세포 이동 능력을 향상시킬 수 있다.
■ 실시예 8 S1PR1 및 CAR 사이의 시너지 효과 확인
실시예 7 및 실시예 8의 방법에 기초하여 마우스 종양 모델을 구축하고, 종양 형성 14일 후 CAR T 세포를 주입하였다. 이후 3일마다 종양 부피를 측정하였고, 말초혈액을 채취하였고 CD3+ T 세포의 양을 측정하였다. 도 11은 마우스에서 종양 형성 이후 종양 부피의 변화를 보여준다. 본 출원에 따른 CAR T 세포를 주입한 후, 종양 부피가 감소하였다. GC33CAR-IRES-S1PR1 형질감염된 T 세포군에서, 말초 혈액 내 CD3+ T 세포의 양은 종양 부피와 음의 상관관계(negatively correlated)가 있었고(도 12B), 이는 GC33CAR-IRES-S1PR1-형질감염된 T 세포가 말초 혈액 및 종양 조직에 더 많이 분포하는 경향이 있음을 나타낸다. GC33CAR-형질감염된 T 세포와 관련하여 그러한 상관관계는 없고(도 12A), 이는 GC33CAR로 형질감염된 T 세포가 말초 혈액, 림프절 및 종양 조직에 분포하는 경향이 있기 때문일 수 있다. 이러한 데이터는 S1PR1 및 CAR이 생체 내에서 항종양 시너지 효과를 나타내는 것을 보여준다.
<110> SHANGHAI PHARMACEUTICALS HOLDING CO., LTD <120> IMMUNE CELL CONTAINING TUMOR ANTIGEN RECOGNITION RECEPTOR AND APPLICATION THEREOF <130> 0124-PA-002 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GC33 <400> 1 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 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ctgctgggca ccgctcttca tcctgctcct gctggatgtg 840 ggctgcaagg tgaagacctg tgacatcctc ttcagagcgg agtacttcct ggtgttagct 900 gtgctcaact ccggcaccaa ccccatcatt tacactctga ccaacaagga gatgcgtcgg 960 gccttcatcc ggatcatgtc ctgctgcaag tgcccgagcg gagactctgc tggcaaattc 1020 aagcgaccca tcatcgccgg catggaattc agccgcagca aatcggacaa ttcctcccac 1080 ccccagaaag acgaagggga caacccagag accattatgt cttctggaaa cgtcaactct 1140 tcttccggaa gcggaggaag cggagagggc agaggaagtc tgctaacatg cggtgacgtc 1200 gaggagaatc ctggacctat ggctctgccc gtgaccgctc tgctgctgcc tctcgctctg 1260 ctgctgcatg ccgccagacc cggctcccaa gtgcaactcc agcaatccgg acccggactg 1320 gtgacaccct cccaaacact gtccctcaca tgcgccatca gcggagattc cgtgtcctcc 1380 aacagcgcta catggaattg gattagacag agcccttcca gaggactgga gtggctcgga 1440 agaacatact acagatccaa gtggtataac gactacgccg tgtccgtgaa gtctagaatg 1500 agcatcaacc ccgacaccag caagaaccag ttttctctgc agctgaacag cgtgacaccc 1560 gaggacaccg ctgtgtacta ctgcgccaga ggcatgatga cctactacta cggcatggac 1620 gtctggggac aaggcaccac cgtgacagtg agcagcggca ttctgggctc cggaggaggc 1680 ggaagcggag gcggaggcag cggaggcggc ggaagccaac ccgtgctcac acaaagctcc 1740 tctctgagcg ctagccccgg cgcctccgct tctctgacat gtacactgag gagcggcatc 1800 aacgtcggac cctatagaat ctactggtac cagcagaagc ccggcagccc cccccaatat 1860 ctgctgaact acaagtccga ctccgacaag cagcaaggca gcggcgtgcc ttctagattc 1920 agcggcagca aggacgctag cgccaacgcc ggagtgctgc tgatctccgg actgagaagc 1980 gaggacgagg ccgactacta ttgcatgatc tggcactcca gcgccgctgt ctttggagga 2040 ggcacacagc tgacagtgct gagcgccagc ttcgtgcccg tgttcctccc cgccaaaccc 2100 accacaacac ccgcccctag accccctaca cccgccccta ccatcgcttc ccagcctctg 2160 tctctgagac ccgaggcttg tagacccgcc gctggaggag ctgtgcatac aagaggactg 2220 gacttcgctt gcgacatcta tatttgggct cccctcgctg gaacatgcgg agtgctgctg 2280 ctgtctctgg tgatcacact gtactgcaac catagaaaca gattctccgt ggtgaagaga 2340 ggaagaaaga aactgctcta catcttcaag cagcccttca tgaggcccgt gcagaccaca 2400 caagaggagg acggatgtag ctgtagattc cccgaagagg aggagggagg atgtgagctg 2460 agagtgaagt tctctagatc cgccgatgcc cccgcctacc agcaaggcca gaaccagctc 2520 tataacgagc tcaatctggg aagaagagag gagtacgacg tgctggacaa gaggagggga 2580 agagaccccg aaatgggcgg caagcccaga aggaaaaacc cccaagaggg actgtacaac 2640 gaactgcaga aggacaagat ggctgaggcc tacagcgaaa tcggcatgaa aggcgagagg 2700 aggagaggca aaggacacga cggactctat caaggcctca gcaccgccac caaggacacc 2760 tacgatgctc tgcatatgca agctctgccc cctagataa 2799 <210> 10 <211> 2484 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S1PR1-IRES-GFP <400> 10 atggggccca ccagcgtccc gctggtcaag gcccaccgca gctcggtctc tgactacgtc 60 aactatgata tcatcgtccg gcattacaac tacacgggaa agctgaatat cagcgcggac 120 aaggagaaca gcattaaact gacctcggtg gtgttcattc tcatctgctg ctttatcatc 180 ctggagaaca tctttgtctt gctgaccatt tggaaaacca agaaattcca ccgacccatg 240 tactatttta ttggcaatct ggccctctca gacctgttgg caggagtagc ctacacagct 300 aacctgctct tgtctggggc caccacctac aagctcactc ccgcccagtg gtttctgcgg 360 gaagggagta tgtttgtggc cctgtcagcc tccgtgttca gtctcctcgc catcgccatt 420 gagcgctata tcacaatgct gaaaatgaaa ctccacaacg ggagcaataa cttccgcctc 480 ttcctgctaa tcagcgcctg ctgggtcatc tccctcatcc tgggtggcct gcctatcatg 540 ggctggaact gcatcagtgc gctgtccagc tgctccaccg tgctgccgct ctaccacaag 600 cactatatcc tcttctgcac cacggtcttc actctgcttc tgctctccat cgtcattctg 660 tactgcagaa tctactcctt ggtcaggact cggagccgcc gcctgacgtt ccgcaagaac 720 atttccaagg ccagccgcag ctctgagaag tcgctggcgc tgctcaagac cgtaattatc 780 gtcctgagcg tcttcatcgc ctgctgggca ccgctcttca tcctgctcct gctggatgtg 840 ggctgcaagg tgaagacctg tgacatcctc ttcagagcgg agtacttcct ggtgttagct 900 gtgctcaact ccggcaccaa ccccatcatt tacactctga ccaacaagga gatgcgtcgg 960 gccttcatcc ggatcatgtc ctgctgcaag tgcccgagcg gagactctgc tggcaaattc 1020 aagcgaccca tcatcgccgg catggaattc agccgcagca aatcggacaa ttcctcccac 1080 ccccagaaag acgaagggga caacccagag accattatgt cttctggaaa cgtcaactct 1140 tcttccggaa gcggataagg atcccgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc 1200 cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg 1260 ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct 1320 aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca 1380 gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg 1440 aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct 1500 gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa 1560 tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt 1620 atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa 1680 aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa 1740 gcttgccaca acccacaatc tagaatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 1800 gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 1860 gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 1920 aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 1980 agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 2040 tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 2100 gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 2160 gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 2220 atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 2280 gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 2340 cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 2400 aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 2460 ggcatggacg agctgtacaa gtaa 2484 <210> 11 <211> 2844 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GC33CAR-IRES-GFP <400> 11 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggacgtgg tgatgaccca gagcccttta tctttacccg ttacacccgg tgagcccgct 120 agcatctctt gtagaagcag ccagtcttta gtgcacagca acggcaacac atatttacac 180 tggtatttac agaagcccgg tcagagcccc cagctgctga tctacaaggt gagcaatcgt 240 ttctccggcg tgcccgatag attcagcggc agcggctccg gaaccgactt cactttaaag 300 atcagcagag tggaggccga ggacgtgggt gtgtactact gctcccagaa cacccacgtg 360 ccccctacat tcggtcaagg taccaaactg gagatcaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 420 ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaagtt cagctggtgc agagcggcgc cgaggtcaaa 480 aaacccggag ccagcgtgaa ggtgtcttgt aaagccagcg gctacacctt taccgactat 540 gagatgcact gggtgagaca agctcccggt caaggtctgg aatggatggg cgctttagac 600 cccaagactg gtgacacagc ctactcccag aagttcaagg gtcgtgtgac tttaacagcc 660 gacgagtcca ccagcacagc ctacatggaa ctgagctctt taaggagcga ggacaccgcc 720 gtgtattact gcactcgttt ctacagctac acctactggg gccaaggtac tttagtgaca 780 gtgagcagct tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 840 ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900 cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 960 atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 1020 tactgcaacc acaggaaccg tttctctgtt gttaaacggg gcagaaagaa gctcctgtat 1080 atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1140 tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1200 gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1260 cgaagagagg agtacgatgt tttggacaaa agaagaggcc gggaccctga gatgggggga 1320 aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1380 gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1440 ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1500 gccctgcccc ctcgctaagg atcccgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc 1560 cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg 1620 ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct 1680 aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca 1740 gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg 1800 aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct 1860 gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa 1920 tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt 1980 atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa 2040 aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa 2100 gcttgccaca acccacaatc tagaatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 2160 gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 2220 gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 2280 aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 2340 agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 2400 tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 2460 gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 2520 gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 2580 atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 2640 gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 2700 cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 2760 aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 2820 ggcatggacg agctgtacaa gtaa 2844 <210> 12 <211> 3282 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S1PR1-IRES-GC33CAR <400> 12 atggggccca ccagcgtccc gctggtcaag gcccaccgca gctcggtctc tgactacgtc 60 aactatgata tcatcgtccg gcattacaac tacacgggaa agctgaatat cagcgcggac 120 aaggagaaca gcattaaact gacctcggtg gtgttcattc tcatctgctg ctttatcatc 180 ctggagaaca tctttgtctt gctgaccatt tggaaaacca agaaattcca ccgacccatg 240 tactatttta ttggcaatct ggccctctca gacctgttgg caggagtagc ctacacagct 300 aacctgctct tgtctggggc caccacctac aagctcactc ccgcccagtg gtttctgcgg 360 gaagggagta tgtttgtggc cctgtcagcc tccgtgttca gtctcctcgc catcgccatt 420 gagcgctata tcacaatgct gaaaatgaaa ctccacaacg ggagcaataa cttccgcctc 480 ttcctgctaa tcagcgcctg ctgggtcatc tccctcatcc tgggtggcct gcctatcatg 540 ggctggaact gcatcagtgc gctgtccagc tgctccaccg tgctgccgct ctaccacaag 600 cactatatcc tcttctgcac cacggtcttc actctgcttc tgctctccat cgtcattctg 660 tactgcagaa tctactcctt ggtcaggact cggagccgcc gcctgacgtt ccgcaagaac 720 atttccaagg ccagccgcag ctctgagaag tcgctggcgc tgctcaagac cgtaattatc 780 gtcctgagcg tcttcatcgc ctgctgggca ccgctcttca tcctgctcct gctggatgtg 840 ggctgcaagg tgaagacctg tgacatcctc ttcagagcgg agtacttcct ggtgttagct 900 gtgctcaact ccggcaccaa ccccatcatt tacactctga ccaacaagga gatgcgtcgg 960 gccttcatcc ggatcatgtc ctgctgcaag tgcccgagcg gagactctgc tggcaaattc 1020 aagcgaccca tcatcgccgg catggaattc agccgcagca aatcggacaa ttcctcccac 1080 ccccagaaag acgaagggga caacccagag accattatgt cttctggaaa cgtcaactct 1140 tcttccggaa gcggataagg atcccgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc 1200 cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg 1260 ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct 1320 aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca 1380 gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg 1440 aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct 1500 gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa 1560 tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt 1620 atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa 1680 aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa 1740 gcttgccaca acccacaatc tagaatggcc ttaccagtga ccgccttgct cctgccgctg 1800 gccttgctgc tccacgccgc caggccggac gtggtgatga cccagagccc tttatcttta 1860 cccgttacac ccggtgagcc cgctagcatc tcttgtagaa gcagccagtc tttagtgcac 1920 agcaacggca acacatattt acactggtat ttacagaagc ccggtcagag cccccagctg 1980 ctgatctaca aggtgagcaa tcgtttctcc ggcgtgcccg atagattcag cggcagcggc 2040 tccggaaccg acttcacttt aaagatcagc agagtggagg ccgaggacgt gggtgtgtac 2100 tactgctccc agaacaccca cgtgccccct acattcggtc aaggtaccaa actggagatc 2160 aaaggtggcg gtggctcggg cggtggtggg tcgggtggcg gcggatctca agttcagctg 2220 gtgcagagcg gcgccgaggt caaaaaaccc ggagccagcg tgaaggtgtc ttgtaaagcc 2280 agcggctaca cctttaccga ctatgagatg cactgggtga gacaagctcc cggtcaaggt 2340 ctggaatgga tgggcgcttt agaccccaag actggtgaca cagcctactc ccagaagttc 2400 aagggtcgtg tgactttaac agccgacgag tccaccagca cagcctacat ggaactgagc 2460 tctttaagga gcgaggacac cgccgtgtat tactgcactc gtttctacag ctacacctac 2520 tggggccaag gtactttagt gacagtgagc agcttcgtgc cggtcttcct gccagcgaag 2580 cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 2640 ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 2700 ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 2760 ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aaccacagga accgtttctc tgttgttaaa 2820 cggggcagaa agaagctcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 2880 actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 2940 ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 3000 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caaaagaaga 3060 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 3120 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 3180 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 3240 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 3282 <210> 13 <211> 574 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES <400> 13 cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60 tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120 gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180 aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240 aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300 ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360 cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420 ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480 cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540 ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataa 574 <210> 14 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A <400> 14 gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg acct 54 <210> 15 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP <400> 15 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720 720

Claims (30)

  1. 변형되지 않은 면역 이펙터 세포(immune effector cell)와 비교하여 S1PR1 단백질의 발현 및/또는 활성이 상향 조절된(up-regulated), 변형된 면역 이펙터 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역 이펙터 세포는 T 세포, 림프구(lymphocyte), 과립구(granulocyte) 및/또는 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)를 포함하는 면역 이펙터 세포.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 이펙터 세포는 기억 T 세포(memory T cell)를 포함하는 면역 이펙터 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포에서, S1PR1 단백질을 엔코딩(encoding)하는 핵산 분자의 발현 및/또는 활성이 상향 조절된 면역 이펙터 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포는 S1PR1 단백질을 추가로 함유하는 면역 이펙터 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역 이펙터 세포는 상기 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 추가로 함유하는 면역 이펙터 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역 이펙터 세포는 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 벡터(vector)를 함유하는 면역 이펙터 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 이펙터 세포는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor) CAR 및/또는 T 세포 수용체(T cell receptor:TCR)를 발현하는 면역 이펙터 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역 이펙터 세포는 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 상기 핵산 분자를 포함하는, 벡터를 함유하는 면역 이펙터 세포.
  10. 제9항에 있어서, 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 상기 핵산 분자 및 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 상기 핵산 분자는 동일한 벡터에 위치된 면역 이펙터 세포.
  11. 제10항에 있어서, 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 상기 핵산 분자는 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 상기 핵산 분자의 5'-말단(5'-terminus)에 위치되고; 또는, 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 상기 핵산 분자는 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 상기 핵산 분자의 3'-말단(3'-terminus)에 위치된 면역 이펙터 세포.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 종양-특이적(tumor-specific) 항원을 타겟팅(targeting)하는 키메릭 항원 수용체를 포함하고, 상기 종양-특이적 항원은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 면역 이펙터 세포: EpCAM, 메조텔린(Mesothelin:MSLN), CEA, IL13, PDPN, VEGF, EGFR, EGFRvIII, PSMA, FAP, CD171, GD2, 글리피칸-2(Glypican-2), 글리피칸-3, HER2, HPV 항원, 사이클린 D1(cyclin D1), p53, MMP-7, IL13Ralpha2, MMP-2, MUC-1, G250, L1CAM, ROR1, 및 GPC3.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 상기 종양-특이적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인(antigen-binding domain)을 함유하는 면역 이펙터 세포.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인은 단일-사슬 항체(single-chain antibody)를 포함하는 면역 이펙터 세포.
  15. 제13항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인은 GPC3 또는 MSLN을 타겟팅하는 단일-사슬 항체를 포함하는 면역 이펙터 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 단일-사슬 항체는 서열번호 1 내지 서열번호 2 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 면역 이펙터 세포.
  17. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 막관통 도메인(transmembrane domain)을 포함하는 면역 이펙터 세포.
  18. 제17항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 다음으로 구성된 군에서 선택된 단백질로부터 유래된 막관통 도메인을 포함하는 면역 이펙터 세포: CD3ζ, CD28, 4-1BB, OX40, SLAMF4, CD127, NKG2D, ICOS 및 FcγRIIIa.
  19. 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 공동자극 도메인(costimulatory domain)을 포함하는 면역 이펙터 세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 공동자극 도메인은 다음의 단백질 또는 이들의 조합으로부터 선택된 공동자극 도메인을 포함하는 면역 이펙터 세포: CD137, CD28, OX40, ICOS, DAP10, 2B4, CD27, CD30, CD40, CD40L, TIM1, CD226, DR3, SLAM, NKG2D, CD244, FceRIγ, BTLA, GITR, HVEM, CD2, NKG2C, LIGHT, 및 DAP12.
  21. 제8항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 상기 항원 결합 도메인 및 상기 막관통 도메인을 연결하는, 힌지 영역(hinge region)을 포함하는 면역 이펙터 세포.
  22. 제21항에 있어서, 상기 힌지 영역은 다음으로 구성된 군에서 선택된 단백질로부터 유래된 한지 영역을 포함하는 면역 이펙터 세포: CD8, CD28, IgG, 4-1BB, CD4, CD27, CD7, PD-1, 및 CH2CH3.
  23. 제8항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 서열번호 5 내지 서열번호 6 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 면역 이펙터 세포.
  24. 제8항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산 분자를 포함하는 면역 이펙터 세포.
  25. 제24항에 있어서, 키메릭 항원 수용체를 엔코딩하는 상기 핵산 분자 및 S1PR1 단백질을 엔코딩하는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터는 서열번호 7 내지 서열번호 9 중 어느 하나로 표시되는 염기서열을 포함하는 면역 이펙터 세포.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 면역 이펙터 세포를 포함하는 세포 집단(cell population).
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 면역 이펙터 세포 및/또는 제26항의 세포 집단, 및 임의로 약학적으로(pharmaceutically) 허용되는 캐리어(carrier)를 포함하는 약학적 조성물.
  28. 종양 치료를 위한 약물의 제조에서, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 면역 이펙터 세포, 제26항의 세포 집단 및/또는 제27항의 약학적 조성물의 용도.
  29. 제28항에 있어서, 상기 종양은 고형(solid) 종양을 포함하는 용도.
  30. 제28항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 췌장암(pancreatic cancer), 신경교종(glioma), 간암(liver cancer) 및/또는 결장암(colon cancer)을 포함하는 용도.
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