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CN110964121B - 一种分泌il-7、il-15因子的cd19-car-t细胞及其应用 - Google Patents

一种分泌il-7、il-15因子的cd19-car-t细胞及其应用 Download PDF

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CN110964121B CN201911324848.9A CN201911324848A CN110964121B CN 110964121 B CN110964121 B CN 110964121B CN 201911324848 A CN201911324848 A CN 201911324848A CN 110964121 B CN110964121 B CN 110964121B
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Qilu Cell Therapy Technology Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种分泌IL‑7、IL‑15因子的CD19‑CAR‑T细胞，其中嵌合抗原受体，包括特异性结合CD19的抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述的嵌合抗原受体还包括与所述胞内结构域连接并可共表达的IL‑7元件和IL‑15元件。所述分泌IL‑7、IL‑15因子的CD19‑CAR‑T细胞提高了细胞杀伤、促进了IL‑2、INF‑γ细胞因子分泌等方面的特性，而且能够提高CD8+T细胞的数量，延长回输后细胞的存活时间以及记忆性T细胞的形成，增加其有效性；可用于治疗急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病。

Description

一种分泌IL-7、IL-15因子的CD19-CAR-T细胞及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种分泌IL-7和IL-15因子的CD19-CAR-T细胞。
背景技术
针对CD19的嵌合抗原受体修饰的T细胞(anti-CD19chimeric antigen receptorTcells，简称CD19 CAR-T细胞)在难治性的B细胞恶性肿瘤的治疗中已取得巨大成功；而靶向其他肿瘤靶点的CAR-T技术在其它实体瘤的治疗中也显示了良好的应用前景。影响CD19CAR-T疗法的有效性的是其回输后细胞的存活时间以及记忆性T细胞的形成的数量。
对于回输CAR-T细胞在患者体内存活的时间，现有研究表明CAR-T构建中采用CD28或者4-1BB可能会影响细胞在体内的寿命。也有研究认为，回输的细胞主要是终末分化的效应性T细胞，而能够长期生存的记忆性T细胞含量较少。已经有大量文献证明，外源添加特定的细胞因子在促进增殖、活化和调节免疫细胞内环境平衡方面有重要作用。
目前IL-7和IL-15价格昂贵，会显著增加细胞培养的成本，增加患者的经济负担。因此，我们希望能够让CAR-T细胞自己分泌这一抗体。
因此，对T细胞进行改造，使其自分泌细胞，提高CAR-T细胞的有效性和记忆性T细胞的比例，从而达到回输的CAR-T细胞在患者体内长期存活和有效性是目前需要解决的问题。
发明内容针对记忆T细胞比例低、CAR-T细胞有效性差的问题，本发明提供一种靶向CD19表型的能够自表达IL-7和IL-15的CAR-T细胞，能够有效提高记忆T细胞的比例，提高CAR-T细胞回输后有效性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种嵌合抗原受体，包括抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述抗原结合结构域特异性结合CD19；所述的嵌合抗原受体还包括与所述胞内结构域连接并可共表达的IL-7元件和IL-15元件。
所述嵌合抗原受体的核酸序列结构如下式所示：
Z1-T-H-TM-C-Z2-Z3-P1-Z4-P2；
式中，
“-”为连接键；
Z1为无或信号肽；
T为靶向CD19的单链抗体；
H为无或铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号；
Z2为CD3ζ的胞浆信号；
Z3为2A肽；
P1为IL-7；
Z4为核糖体进入位点；
P2为IL-15。
所述的Z1为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4或CD137。
所述的H为选自以下蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137或其组合。
所述的TM选自以下蛋白的跨膜区：CD3epsilon、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD137、CTLA-4、PD-1或LAG-3。
所述C为选自以下蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1或其组合。
所述2A选自T2A、P2A、E2A、F2A。
优选的，所述嵌合抗原受体的结构如下：
CD8信号肽-靶向CD19的单链抗体-CD8跨膜区-4-1BB信号-CD3ζ的胞浆信号-P2A肽-IL-7-IRES-IL-15。
所述嵌合抗原受体包括如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列。
一种基因表达盒，所述基因表达盒的结构包含启动子和上述嵌合抗原受体。优选的，所述启动子为SFFV。
一种包含上述基因表达盒的载体。所述的载体选自质粒、噬菌体、病毒或转座子。优选的，所述载体为病毒；更优选为慢病毒。
一种包含上述载体的T淋巴细胞。
上述嵌合抗原受体、基因表达盒、载体或T淋巴细胞可用于制备预防和/或治疗和/或辅助治疗恶性肿瘤的药物。所述恶性肿瘤选自急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病。
本发明具有以下优点：
本发明提供的CD19-CAR-T细胞可以自分泌IL-7和IL15，提高了细胞杀伤、促进了IL-2、INF-γ细胞因子分泌等方面的特性，而且能够提高CD8+T细胞的数量，延长回输后细胞的存活时间以及记忆性T细胞的形成，增加其有效性。
本发明中所涉及的一些常用术语说明如下：
“嵌合抗原受体”是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞；
“单链抗体”(single-chain antibody variable region fragment,scFv)是指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段；
“铰链”是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性；
“基因表达盒”是指能够表达目的基因的最小单位，包括启动子-目的基因-终止子；
“CD19”是指人白细胞分化抗原19，它在NCBI GenBank的ID号为930，有2个异构体(cDNA序列/蛋白序列)，分别为NM_001178098.1/NP_001171569.1，NM_001770.5/NP_001761.3。当提及CD19的氨基酸序列时，其包括，CD19蛋白的全长或者具有CD19功能的CD19的片段；还包括所述全长或片段的融合蛋白。并且，本领域技术人员理解，在CD19的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。并且，当描述CD19的蛋白序列片段时，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段；
“IL-7因子”是指含有177个氨基酸的IL-7蛋白质，是相对分子量为25kDa的糖蛋白。在T细胞的生长、存活及分化方面有重要作用；
“IL-15因子”是指含有162个氨基酸的IL-15蛋白质，是相对分子量为18kDa的糖蛋白，它在NCBI GenBank的ID号为3600。在T细胞的生长、记忆性T细胞的分化方面有重要作用；
“2A肽”是指自裂解多肽，是一段长度介于18到22个氨基酸之间的多肽，首先发现于小RNA病毒，继而在昆虫病毒，轮状病毒等中都有发现，其可应用在多顺反子载体构建中，并且具有结构短小，上下游基因表达平衡性好，可用于共表达多个蛋白等优点，是一种构建多顺反子载体的有效工具；
“IRES”是指内部核糖体进入位点序列(Internal ribosome entry site)，一种富含二级结构的RNA序列，这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译。在IRES前面的蛋白翻译后，核糖体不脱离mRNA，可与IRES结合，使翻译继续进行，因此一条mRNA可翻译两种蛋白。
附图说明
图1：pHR-antiCD19CAR-4-1BB-CD3ζ-P2a-IL-7-IRES-IL-15表达载体的结构图；
图2：慢病毒CD19CAR-IL-7-IL-15感染K562后滴度流式检测图；
图3：CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞阳性率流式检测图；
图4：CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞培养8天后效应性记忆性T细胞流式检测图；
图5：CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞培养8天后CD8 T细胞流式检测图；
图6：CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞增殖倍数图；
图7：CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞杀伤功能流式检测图(24h各组细胞杀伤率)；
图8：ELISA检测CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞IL-2分泌图；
图9：ELISA检测CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞IFN-γ分泌图；
图10：ELISA检测CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞IL-7分泌图；
图11：ELISA检测CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞IL-15分泌图；
图12：CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞移植至B细胞淋巴瘤移植瘤小鼠模型后，负荷瘤小鼠生存曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
实施例1含IL-7基因的CD19 CAR慢病毒表达载体的构建
1.含IL-7、IL-15基因的CD19 CAR质粒构建
按照CD8穿膜信号肽、anti-CD19 scFv、CD8跨膜区、4-1BB共刺激信号区、CD3ζTCR激活区、P2a、IL-7顺序合成基因，并在5’和3’两端分别添加MluI酶切位点(ACGCGT)和NotI酶切位点(CGCCGGCG)，然后经MluI、NotI双酶切后链接到同样双酶切的慢病毒骨架质粒pHR-Mcherry中。检测阳性质粒命名为pHR-antiCD19CAR-4-1BB-CD3ζ-P2a-IL-7备用，将IRES、IL-15顺序合成基因，并在5’和3’两端分别添加NotI酶切位点(CGCCGGCG)通过NotI酶切后连接到同样经NotI酶切的pHR-antiCD19CAR-4-1BB-CD3ζ-P2a-IL-7中，检测阳性质粒命名为pHR-antiCD19CAR-4-1BB-CD3ζ-P2a-IL-7-IRES-IL-15，其结构图如图1所示。
2.慢病毒的包装及浓缩
将步骤1中获得的含IL-7和IL-15基因的CD19 CAR质粒、pCMV载体和pMD.2G载体混合后转染到293FT细胞中，转染后6h后更换为完全培养基培养，48h后收集培养液，离心后保留上清并将所述上清用0.45μm滤器过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液。慢病毒浓缩根据Lenti-XTMConcentrator(Takara，Cat.631231)说明书进行。
3.慢病毒滴度检测
1640培养基重悬细胞至1×106/mL。37℃、5％CO2培养箱培养6-8h，离心换液为新鲜K562细胞增殖培养液。每2-3天加入新鲜K562细胞增殖培养液，维持细胞密度在0.5×106/mL左右。24孔板中每孔铺1×105个K562细胞，取病毒原液，分别加入1μL、3μL、10μL病毒，病毒感染48h后，应用流式细胞仪检测CAR阳性的细胞比例，每个样品加FITC-Labeled HumanCD19(20-291)Protein(品牌：Acro，Cat.：CD9-HF2H2 10μL)，4度避光孵育1h，洗涤3遍，离心，沉淀用200μL PBS重悬后上机检测(Millipore guava easyCyte HT)，结果如图3所示，随着病毒加入量的增加，阳性细胞的比例逐渐增大。当阳性率≤10％，认为病毒颗粒数与细胞数相等，因此病毒滴度为7.47×106pfu/mL。
实施例2 CD19 CAR-IL-7-IL-15-T细胞的制备
新鲜分离的PBMC用CTSTM AIM VTM SFM培养基(GIBCO，货号A3021002)中。该培养基需添加5％ICS(GIBCO，A2596101)。同时添加CD3单抗(ebioscience，货号：160037-85)和CD28单抗(ebioscience，货号：160288-85)终浓度为50ng/mL来激活T淋巴细胞，37℃5％CO2培养48小时。取2×106的细胞，按照MOI＝2.5加入步骤2中浓缩的慢病毒，同时加入终浓度为250U/mL IL-2(泉港)和4ug/mL polybrene(Sigma)，混匀，37℃5％CO2培养6-8小时，300g离心5min换液为新鲜CTSTM AIM VTM SFM培养基(含250U/mL IL-2)。每2-3天加入新鲜T细胞增殖培养液，维持细胞密度在1×106/mL左右，扩增10-12天。
病毒感染48h后，应用流式细胞仪检测CAR阳性的细胞比例(FITC-LabeledHumanCD19(20-291)Protein)。如图4所示，含IL-7和IL-15基因的CD19CAR-T细胞的比例约为63.3％。表明含IL-7和IL-15基因的CD19CAR-T细胞已成功获得。命名为CD19CAR-IL-7-IL-15-T。
实施例3 CD19 CAR-IL-7-IL-15-T细胞功能检测
1.对记忆性T细胞形成的促进
采用实施例1和实施例2中同样的方法获得CD19 CAR-IL-7-T细胞，然后将其与将实施例2中获得的CD19 CAR-IL-7-IL-15-T细胞分别培养至第8天，取约1×106个细胞，应用流式细胞仪检测T细胞中的CD8细胞和记忆性T细胞比例：加CD8-PE(品牌：Biolegend，Cat.：344706)和CCR7-FITC(品牌：Biolegend，Cat.：353216)、CD45RA-APC(品牌：Biolegend，Cat.：304112)各1μL，室温避光孵育15min，洗涤1遍，离心，沉淀用200μL PBS重悬后上机检测(Millipore guava easyCyte HT)，如图5所示。结果表明：第8天CD19CAR-T细胞中记忆性T细胞的比例约为38.9％，CD19CAR-IL-7-T细胞中记忆性T细胞的比例约为59.9％，CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞中记忆性T细胞70.1％，即表达IL-7和IL-15后，CAR-T在体外培养中有促进记忆性T细胞形成的作用。如图6所示。结果表明：第8天CD19CAR-T细胞中CD8 T细胞的比例约为58.8％，CD19CAR-IL-7-T细胞中CD8 T细胞的比例约为78.6％，CD19 CAR-IL-7-IL-15-T细胞中CD8 T细胞91.8％，即表达IL-7和IL-15后，CAR-T在体外培养中有促进CD8 T细胞形成的作用。
CD19 CAR-IL-7-IL-15-T细胞组和CD19 CAR-IL-7-T细胞组在细胞培养过程中培养0d、7d、9d、11d、14d分别计数T细胞数量，绘制T细胞增殖曲线。如图7所示，CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞组、CD19 CAR-IL-7-T细胞组、CD19 CAR-T细胞组细胞分别增殖778倍、566倍、122倍，三组之间有显著差异。即表达IL-7和IL-15基因后，CAR-T在体外培养中有明显促进记忆T细胞增殖的作用。
2.CD19CAR-IL-7-IL-15-T的杀伤功能检测
2.1表达CD19的K562细胞的制备
(1)合成CD19胞外区及CD8跨膜区的DNA序列(SEQ ID NO:2)，两端添加MluI和NotI酶切位点，经酶切后插入经同样酶切的pHR-Mcherry载体，构建获得的载体命名为pHR-CD19；
(2)将pHR-CD19载体、pCMV载体和pMD.2G载体混合后转染到293FT细胞中，转染后6-8h更换为完全培养基培养，48h后收集培养液，离心后保留上清并将所述上清用0.45μm滤器过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液。慢病毒浓缩根据Lenti-XTMConcentrator(Takara，Cat.631231)说明书进行；
(3)1640(Gibco)培养基重悬K562细胞至1×106/mL，加入慢病毒(MOI 5)，37℃、5％CO2培养箱培养6h，离心换液为新鲜K562细胞增殖培养液。每2-3天加入新鲜K562细胞增殖培养液，维持细胞密度在0.5×106个/mL左右。5代后，应用有限稀释法进行单克隆筛选。待单克隆细胞长至一定数量后，通过流式细胞仪进行筛选(anti-CD19PE，biolegend，Cat：302254)，表达量高且纯度高的细胞克隆，即为稳定表达CD19的K562细胞，命名为K562-CD19，作为靶细胞。
2.2 CD19 CAR-IL-7-T的杀伤功能检测
将K562细胞及K562-CD19细胞按1:1接种于96孔板中，按E:T＝1:1、3:1分别接种培养9天的CD19CAR-IL-7-IL-15-T、CD19 CAR-IL-7-T细胞、CD19 CAR-T细胞和T细胞。37℃5％CO2培养24小时，取每孔细胞的上清，冻到-80℃冰箱备用。剩下的每孔细胞加入PE anti-human CD19(Biolegend Cat.：302254)和FITC anti-human CD3(Biolegend Cat.：300306)各1μL，室温避光孵育15min，离心，沉淀用200μL PBS重悬后上机检测(Millipore guavaeasyCyte HT)。用T细胞组作为阴性对照组，用CD19 CAR-IL-7-T细胞组和CD19 CAR-T细胞组作为阳性对照组。
如图7所示，以无特异性杀伤的T细胞组作为阴性对照组，该组在理论上的特异性杀伤为0。E:T＝3:1时，CD19 CAR-IL-7-T细胞组、CD19 CAR-IL-7-IL-15-T细胞组杀伤率均为100％，CD19 CAR-T细胞组杀伤率均为95％。E:T＝1:1时，CD19 CAR-IL-7-T细胞组的杀伤率为90.7％、CD19 CAR-IL-7-IL-15-T细胞组的杀伤率为92％，无明显组间差异，CD19CAR-T细胞组的杀伤率为41.2％，有明显组间差异。统计学结果表明，CD19 CAR-IL-7-IL-15-T细胞组和CD19 CAR-T细胞组杀伤率有显著性差异，与CD19 CAR-IL-7-T细胞组杀伤率无显著差异。因此，CD19 CAR-IL-7-IL-15-T细胞和CD19CAR-T细胞相比有明显的杀伤优势，即和CD19 CAR-T细胞组相比，表达IL-7、IL-15的CD19 CAR-T细胞会促进CAR-T细胞的杀伤功能，和CD19 CAR-IL-7-T细胞组相比，表达IL-7、IL-15的CD19 CAR-T细胞不会影响CAR-T细胞的杀伤功能。
3.CD19 CAR-IL-7-IL-15-T细胞细胞因子分泌
将步骤2.2中的杀伤上清用于ELISA检测细胞因子分泌(human IL-2ELISA-Kit，Biolegend Cat.：431804；human IFN-γELISA-Kit，Biolegend Cat.：430104；human IL-7ELISA-Kit，联科生物，Cat.：EK1072；human IL-15ELISA-Kit，品牌R&D Cat.：DY247-05)。用T细胞组和K562+K562-CD19细胞组作为阴性对照组，用CD19 CAR-IL-7-T细胞组和CD19CAR-T细胞组作为阳性对照组。如图8所示，CD19 CAR-IL-7-IL-15-T细胞组、CD19 CAR-IL-7-T细胞组和CD19 CAR-T细胞组IL-2的释放量分别为4022pg/mL、3627pg/mL和1535pg/mL。CD19 CAR-IL-7-IL-15-T细胞组与CD19 CAR-IL-7-T细胞组相比无显著性差异，与CD19CAR-T细胞组相比差异显著。即和CD19 CAR-IL-7-T细胞组相比，表达IL-15的CD 19CAR-T不影响IL-2的释放；和CD19CAR-T细胞组相比，表达IL-7和IL-15的CD19 CAR-T细胞会促进IL-2的释放。如图9所示，CD19 CAR-IL-7-IL-15-T细胞组、CD19 CAR-IL-7-T细胞组和CD19CAR-T细胞组INF-γ的释放放量分别为45170pg/mL、31902pg/mL和12510pg/mL。即和CD19CAR-IL-7-T细胞组相比，表达IL-7和IL-15的CD19CAR-T细胞会增加IFN-γ的释放，但影响不显著；和CD19 CAR-T细胞组相比，表达IL-7和IL-15的CD19CAR-T细胞会显著提高IFN-γ的释放。如图10所示，CD19CAR-IL-7-T细胞组、CD19 CAR-IL-7-IL-15-T细胞组IL-7的释放量分别为1382.7pg/mL和1362.5pg/mL，无显著性差异，即和CD19 CAR-IL-7-T细胞组相比，CD19 CAR-IL-7-IL-15-T细胞组表达IL-15不影响IL-7的表达；并且CD19CAR-T细胞组无IL-7的释放。如图11所示，CD19CAR-T细胞组、CD19CAR-IL-7-T细胞组、CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞组IL-15的释放量分别为2.3pg/mL、2.37pg/mL和1139.3pg/mL，有显著性差异。即和CD19CAR-T细胞组、CD19CAR-IL-7-T细胞组相比，CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞组IL-15释放量显著增加。
4.CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞动物试验
将CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞、CD19CAR-IL-7-T细胞、CD19CAR-T细胞、GFP-T细胞，37℃、5％CO2培养箱培养144h备用。40只雄性SPF级NCG小鼠(品种品系：基因工程小鼠)中，32只尾静脉注射接种人Raji细胞(第0天)0.3mL/只造模，造模后第4天存活的32只小鼠按体重均分组为4组，即Group1(CD19CAR-T细胞组)、Group2(CD19CAR-IL-7-T细胞组)、Group3(CD19CAR-IL-7-IL-15-T细胞组)和Group4(Mock-GFP CAR-T细胞组)；另有8只小鼠未接种人Raji细胞设为Group5(空白对照组)。给药日，阴性对照组(Group1)小鼠尾静脉注射0.9％氯化钠注射液。第0-60天每日观察动物一般体征并记录。濒死或中途死亡小鼠及观察至第60天的小鼠颈椎脱臼处死。观察试验期间各组动物体征变化，绘制生存曲线。应用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析和曲线绘制，如图11所示。
试验期间体征观察结果显示，Group4动物均在造模后25天之内全部死亡。在本试验条件下，从动物生存时间和生存曲线比较结果可见，与阴性对照组患病小鼠模型相比，CD19CAR-T细胞组、CD19-CAR-IL-7-T细胞、CD19-CAR-IL-7-IL-15-T细胞在经单次尾静脉注射给药0.5mL/只(CAR阳性T细胞数量3×107细胞/mL)后可明显改善接种人Raji细胞NCG小鼠疾病模型的体征表现，并可延长疾病模型小鼠的生存时间，CD19-CAR-IL-7-IL-15-T细胞组的小鼠存活率，优于CD19 CAR-IL-7-T细胞组的小鼠的存活率，无显著性差异；优于CD19CAR-T细胞组的小鼠的存活率，并有显著性差异。
序列表
<110> 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司
<120> 一种分泌IL-7、IL-15因子的CD19-CAR-T细胞及其应用
<130> 20191211
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3208
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL 7-IL 15-antiCD19 CAR
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggagcaga agctgatcag cgaggaggac ctggacatcc agatgacaca gactacatcc 120
tccctgtctg cctctctggg agacagagtc accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt 180
agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac 240
catacatcaa gattacactc aggagtccca tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca 300
gattattctc tcaccattag caacctggag caagaagata ttgccactta cttttgccaa 360
cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga ggggggacca agctggagat cacaggtggc 420
ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca 480
ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc 540
tcattacccg actatggtgt aagctggatt cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg 600
ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca tactataatt cagctctcaa atccagactg 660
accatcatca aggacaactc caagagccaa gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact 720
gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa cattattact acggtggtag ctatgctatg 780
gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga 840
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 960
atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 1020
tactgctccc taaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 1080
agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 1140
gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtacaag 1200
cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1260
ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1320
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1380
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1440
acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgcggcgaa 1500
ttcggaagcg gagctactaa cttcagcctg ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac 1560
cctggaccta tgttccatgt ttcttttagg tatatctttg gacttcctcc cctgatcctt 1620
gttctgttgc cagtagcatc atctgattgt gatattgaag gtaaagatgg caaacaatat 1680
gagagtgttc taatggtcag catcgatcaa ttattggaca gcatgaaaga aattggtagc 1740
aattgcctga ataatgaatt taactttttt aaaagacata tctgtgatgc taataaggaa 1800
ggtatgtttt tattccgtgc tgctcgcaag ttgaggcaat ttcttaaaat gaatagcact 1860
ggtgattttg atctccactt attaaaagtt tcagaaggca caacaatact gttgaactgc 1920
actggccagg ttaaaggaag aaaaccagct gccctgggtg aagcccaacc aacaaagagt 1980
ttggaagaaa ataaatcttt aaaggaacag aaaaaactga atgacttgtg tttcctaaag 2040
agactattac aagagataaa aacttgttgg aataaaattt tgatgggcac taaagaacac 2100
taagcggccg ccgcccctct ccctcccccc cccctaacgt tactggccga agccgcttgg 2160
aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt tattttccac catattgccg tcttttggca 2220
atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc 2280
ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag 2340
cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg 2400
gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac 2460
aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa 2520
gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc 2580
tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaaa cgtctaggcc 2640
ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataagct tgccacaacc 2700
cacaaggaga cgaccttcca tgagaatttc gaaaccacat ttgagaagta tttccatcca 2760
gtgctacttg tgtttacttc taaacagtca ttttctaact gaagctggca ttcatgtctt 2820
cattttgggc tgtttcagtg cagggcttcc taaaacagaa gccaactggg tgaatgtaat 2880
aagtgatttg aaaaaaattg aagatcttat tcaatctatg catattgatg ctactttata 2940
tacggaaagt gatgttcacc ccagttgcaa agtaacagca atgaagtgct ttctcttgga 3000
gttacaagtt atttcacttg agtccggaga tgcaagtatt catgatacag tagaaaatct 3060
gatcatccta gcaaacaaca gtttgtcttc taatgggaat gtaacagaat ctggatgcaa 3120
agaatgtgag gaactggagg aaaaaaatat taaagaattt ttgcagagtt ttgtacatat 3180
tgtccaaatg ttcatcaaca cttcttga 3208
<210> 2
<211> 960
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD19-CD8
<400> 2
atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60
gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120
gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180
ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240
tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300
cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360
ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420
tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480
aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540
aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600
ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660
gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720
gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780
tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccagtacta 840
tggcactggc tgctgaggac tggtggctgg aaggtctcag ctgtgacttt ggcttatctg 900
atcttctgcc tgtgttccct tgtgggcatt cttcatcttc aaagagccct ggtcctgagg 960

Claims (9)

1.一种嵌合抗原受体，包括抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其特征在于，所述抗原结合结构域特异性结合CD19；所述的嵌合抗原受体还包括与所述胞内结构域连接并可共表达的IL-7元件和IL-15元件；
所述的嵌合抗原受体的核酸序列结构包括下式所示序列：
Z1-T-H-TM-C-Z2-Z3-P1-Z4-P2；
式中，
“-”为连接键；
Z1为无或信号肽；
T为靶向CD19的单链抗体；
H为无或铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号；
Z2为CD3ζ的胞浆信号；
Z3为2A肽；
P1为IL-7；
Z4为核糖体进入位点；
P2为IL-15；
所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.一种包含如权利要求1所述嵌合抗原受体的基因表达盒。
3.一种包含如权利要求2所述基因表达盒的载体。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体选自质粒、噬菌体、病毒或转座子。
5.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为病毒。
6.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为慢病毒。
7.一种包含如权利要求3-6任一所述的载体的T淋巴细胞。
8.如权利要求1所述嵌合抗原受体、如权利要求2所述基因表达盒、如权利要求3-6任一所述的载体或如权利要求7所述的T淋巴细胞在制备预防和/或治疗恶性肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤选自急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113528449A (zh) * 2020-04-20 2021-10-22 浙江瑞加美生物科技有限公司 一种制备通用型人源化car19-dnt细胞的技术及其应用
CN117157390A (zh) * 2021-02-24 2023-12-01 杭州启函生物科技有限公司 用于增强的免疫疗法的系统和组合物及其方法
CN114934071B (zh) * 2021-04-30 2023-10-17 四川大学华西医院 一种表达免疫调节因子的car载体及其应用
CN113735981B (zh) * 2021-09-30 2023-08-15 深圳博雅感知药业有限公司 Cd19-car-t细胞及其制备方法
WO2023056915A1 (en) * 2021-10-08 2023-04-13 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Polynucleotides encoding interleukin-12 (il-12) and related composition and methods thereof
CN114410689B (zh) * 2022-03-29 2022-06-17 北京循生生物医学研究有限公司 一种增强肿瘤浸润淋巴细胞杀伤力的制备方法
CN114921496B (zh) * 2022-04-29 2023-03-10 上海驯鹿生物技术有限公司 一种具有nk细胞及adcc能力的人源化免疫系统动物模型的构建方法及其应用
CN116410336B (zh) * 2023-06-02 2023-09-22 云南赛元生物技术有限公司 一种嵌合抗原受体的编码核苷酸、car-nk细胞及其构建方法和应用
CN118547010B (zh) * 2024-06-03 2025-03-25 广州达博生物制品有限公司 基于靶向胞膜表面受体的稳定高表达人源悬浮细胞系的构建方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108103105A (zh) * 2017-12-29 2018-06-01 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种car-t细胞的制备方法、制得的car-t细胞及其应用
CN108530542A (zh) * 2017-03-03 2018-09-14 武汉波睿达生物科技有限公司 一种针对cd19的嵌合抗原受体（car）的重组基因构建及其应用
CN109722420A (zh) * 2019-03-15 2019-05-07 江苏艾洛特医药研究院有限公司 一种改良嵌合抗原受体t细胞的制备及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108530542A (zh) * 2017-03-03 2018-09-14 武汉波睿达生物科技有限公司 一种针对cd19的嵌合抗原受体（car）的重组基因构建及其应用
CN108103105A (zh) * 2017-12-29 2018-06-01 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种car-t细胞的制备方法、制得的car-t细胞及其应用
CN109722420A (zh) * 2019-03-15 2019-05-07 江苏艾洛特医药研究院有限公司 一种改良嵌合抗原受体t细胞的制备及其应用

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