KR20210107014A

KR20210107014A - 페가스파가제의 동결건조 조성물

Info

Publication number: KR20210107014A
Application number: KR1020217019672A
Authority: KR
Inventors: 타타가타 무커르지; 프라벤 쿠마르 아가르왈; 산자이 싱
Original assignee: 젠노바 바이오파마슈티컬스 리미티드
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2019-05-20
Publication date: 2021-08-31
Also published as: CO2021008047A2; SA521422366B1; PE20220492A1; JP2022514942A; BR112021011956A2; WO2020136666A1; ZA202103379B; JP2024028905A; AU2019412580A1; CL2021001379A1; EP3867369A4; EP3867369A1; EA202191646A1; MX2021007654A; US20220080033A1

Abstract

본 발명은 페가스파가제의 신규하고 경제적으로 실행 가능하며 저장 안정성이 있고 동결건조된 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 페가스파가제, 동결 방지제, 증량제, 완충제를 포함하고, 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 약제학적으로 허용가능한 부형제를 선택적으로 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 임의의 상당한 양의 불순물의 존재 없이 상당한 온도 범위에 걸쳐 연장된 기간 동안 안정하다. 본 발명은 또한 저장 안정한 페가스파가제 조성물의 생산을 위한 경제적으로 실행 가능하고 확장 가능한 동결건조 방법에 관한 것이다.

Description

페가스파가제의 동결건조 조성물

본 발명은 생물 약제학 분야에 관한 것이다. 특히, 동결건조된 페가스파가제 (pegaspargase) 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

단백질 약물 전달은 인 비보에서 나타나는 단백질의 본질적인 불안정성 때문에 생물 약제학 산업의 주요 과제로 남아 있다. 경구로 투여된 단백질은 소화관에서 소화되기 쉬운 반면, 비경구 투여된 단백질은 일반적으로 신장 청소율 (renal clearance) 및 단백질 분해 (proteolysis)가 발생하기 쉽다. 전형적으로 단백질 약물과 관련된 다른 문제는 낮은 용해도, 짧은 순환 반감기, 면역원성, 응집 등이다. 결과적으로, 체내 단백질의 지속성 (sustainability)이 손상된다. 면역원성을 감소시키고 단백질 분해 절단 부위를 제거하기 위한 아미노산 서열의 변경, 혈청 단백질에 단백질의 접합, 항체와의 융합, 서방출을 위한 리포좀으로의 통합, 천연 또는 합성 중합체와의 접합 등과 같이 인 비보에서 단백질의 지속성을 달성하기 위한 여러 가지 접근법이 시도되어 왔다.

폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 중합체와 치료용 단백질의 접합은 오랜 기간 생물 약제학 산업에서 성공적으로 사용되어 왔으며, 순환 반감기 증가, 면역원성 감소를 위한 단백질의 안전한 변형으로 받아들여지고 있고, 이에 관한 개시는 US 4,179,337에서 찾아볼 수 있다. 이 접합 과정을 페길화 (pegylation)라고 한다. PEG는 USFDA 및 WHO와 같은 규제 기관에서 '일반적으로 안전하다고 인정되는 (Generally Recognized as Safe)'(GRAS) 화합물로 분류되었다.

PEG는 선형 또는 분지형 중합체며 수용성 (분자량 증가에 따라 용해도 증가), 친유성 및 무독성이다. PEG의 친유성 특성은 치료 단백질에 대한 준비된 접합을 위해 기 관능화 (group functionalization)를 종료할 수 있게 한다. PEG의 각 분자는 전형적으로 에틸렌 옥사이드 단위당 2-3 개의 물 분자를 결합한다. 따라서, 페길화는 단백질의 표면을 가리고 폴리펩타이드의 분자 크기를 증가시켜 항체 또는 항원 처리 세포의 접근을 방지하고, 단백질 분해 효소에 의한 분해도 줄여서 순환 반감기를 증가시킨다. 또한, 크기의 증가 (유체역학적 반경의 증가에 기인함)는 신장 청소율을 감소시켜 이의 순환 시간을 연장시킨다.

급성 림프모구성 백혈병 (ALL)에 관여하는 것과 같은 많은 유형의 암성 세포 (cancerous cells)에서, 상기 암성 세포는 아미노산 L-아스파라긴을 드 노보로 합성할 수 없으며 (아미노산 L-아스파르테이트를 L-아스파라긴으로 효소적 변환을 촉매하는 효소인 아스파라긴 합성효소 가 결여되어 있거나 낮은 수준을 갖기 때문임), 세포 성장을 위해 이를 혈액으로부터 흡수한다. L-아스파라기나제는 암모니아 방출과 함께 L-아스파라긴을 L-아스파르테이트로 가수 분해를 촉매하는 효소이다. L-아스파라기나제는 혈액에서 L-아스파라긴 수준을 고갈시켜 암/종양 세포에 의한 이의 흡수를 막아 궁극적으로 세포의 사멸을 유도한다. L-아스파라기나제는 박테리아, 효모, 곰팡이, 방선균 및 식물을 포함한 여러 공급원으로부터 얻을 수 있다. 이는 단백질 합성을 위해 L-아스파라긴에 의존하는 종양 또는 암 치료에 유용하다. 특히, 급성 림프모구성 백혈병과 같은 백혈병 치료에 사용되며, 특정 임상 상황에서 단독으로 이용할 수 있지만 전형적으로 다른 항종양 또는 항암 요법과 복합적으로 사용된다.

그러나, L-아스파라기나제 그 자체는 높은 청소율 속도, 짧은 반감기, 단백질 분해, 및 이 효소로 치료 받은 환자에서 비인간 기원으로 인해 면역 반응 유도 잠재성과 같은, 단백질의 통상적인 단점을 가지고 있다. 이러한 약점은 장기간 치료 또는 반복 투여를 위한 이 효소의 사용을 제한한다. 앞에서 논의 했듯이 이러한 문제는 페길화로 극복할 수 있다. L-아스파라기나제 (E. coli에서 유래)는 5 kDa 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)과 공유적으로 접합하여 변형된다. 생성된 페가스파가제는 실질적으로 비항원이라는 장점을 가지며 순환으로부터의 감소된 청소율 속도를 나타낸다.

일반적으로 750 IU/mL 농도로 5 mL 팩 크기의 액체 조성물로 제공되는 페가스파가제는 L-아스파라기나제의 천연 형태에 대해 과민 반응이 발생한 환자에서, 급성 림프모구성 백혈병의 적응증에 대해 1994 년에 미국-FDA에 의해 최초로 승인되었고, Oncaspar®라는 브랜드 명칭으로 상품화되었다. 나중에 2006 년에 Oncaspar®는 다제 화학요법 치료법 (multiagent chemotherapy regimen)의 일 요소로 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 환자의 1 차 치료에 대한 승인을 받았다. Oncaspar®는 5 kDa 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG) 숙시니미딜 숙시네이트 PEG (SS-PEG라고도 함)의 페길화에 의해 제조되었다. 페길화 아스파라기나제는 US 5,122,614; 5,324,844; 5,612,460; US20120100121A1; CN105802946A 출원에 개시되어 있다.

모든 장점을 가지고 있음에도 불구하고 페가스파가제의 액체 조성물은 열적 안정성, 콜드체인 유지에 대한 엄격한 요건, 더 짧은 유통기한 (shelf-life) 등과 같은 문제를 갖는 것으로 보고되었다. 페길화된 단백질, 특히 숙시네이트 링커와 연결된 것은 수성 조성물에서 PEG 및 숙시네이트 링커 사이의 에스테르 결합의 가수분해 결과로 이의 액체 조성물에서 분해되어 유리 PEG 및 숙시닐화된 단백질을 초래하는 경향이 있는 것으로 보고되었다. 임상 실무에서 이러한 위태로운 약물에 접근하려면 제조 도중 및 클리닉에 배포하는 동안에도 온도 변동을 유지할 수 있는 장기간 저장될 수 있는 조성물이 필요하다.

대개 액체 조성물에서 단백질과 관련된 안정성 문제는 고체 조성물로 이를 제공함으로써 극복할 수 있다. 모든 주요 분해 반응 (탈아미드화, 가수분해, 단백질 분해 등)이 수용액에서 발생하기 때문에 물 제거는 종종 효과적인 것으로 입증되었다. 액체에서 고체로의 변환에 가장 널리 사용되는 방법은 냉동건조 (freeze-drying) 또는 동결건조 (lyophilization)이다. 동결건조는 페가스파가제를 안정화하고 문제를 극복하는 데 도움이 될 수 있는 방법이다. 상품화된 생물학적 기원 치료제의 절반 이상이 동결건조 조성물로 제공된다.

동결건조 사이클은 주로 동결, 1 차 건조 및 2 차 건조의 세 단계로 구성되며, 동결과 1 차 건조 사이의 선택적 어닐링 (annealing) 단계가 있다. 동결건조 방법은 스트레스가 없지 않으며 생물 약제학적 생성물의 유통기한 연장을 항상 보장하는 것은 아니다. 동결건조 단계와 관련된 스트레스는 단백질의 물리적 (변성, 응집, 침전 등)뿐만 아니라 화학적 분해 (산화, 메일라드 반응 (Maillard reaction), 공유 응집 등)를 모두 유발할 수 있다. 이러한 분해 경로는 궁극적으로 생물 활성의 손실을 유도하며 종종 하나가 다른 것으로 이어지고 두 분해 경로가 다소 연결되어 있기 때문에 상호 배타적이지는 않다.

동결건조 사이클의 설계는 단백질의 농도, 조성물에 존재하는 증량제 (bulking agents), 안정화제 및 다른 부형제의 성질 및 양에 의존한다. 겉보기 유리 전이 온도 (Tg'), 증량제의 결정화 온도 등과 같은 중요한 열적 파라미터는 통상적으로 동결건조 사이클의 각 단계에서 램프 및 유지 시간을 포함하여 각 단계에 대한 온도 및 압력 파라미터를 설정하기 위한 가이드 지점을 제공하기 때문에 과정의 설계 전에 조성물에 대해 결정된다.

페길화된 단백질은, 무정형 또는 결정질인 PEG의 상태, 상호 작용에 이용될 수 있는 자유 수(free water)의 양, 저장 온도, 동결건조 파라미터, PEG에 대한 단백질의 비율과 같이 최종 동결건조 방법을 결정하기 위해 해결해야 하는 다른 복잡성을 나타내며, 이들 모두는 동결건조 후 냉동 건조된 단백질의 활성에 영향을 미치고 모든 페길화 제품에 대한 보편적인 해결책은 없다.

따라서, 하나의 단백질에 적합한 방법 및 조성물이 다른 단백질에 효과적이지 않을 수 있으므로 각 단백질에 대해 고유한 방법 및 조성물을 만드는 것이 중요하다.

US 6,180,096 및 US 7,632,491 B2는 동결건조 사이클이 더 길고 수분 함량이 높은 페길화된 인터페론 2b의 조성물을 개시한다. US 8,367,054 B2는 동결건조 사이클이 더 짧은 Peg-인터페론 2b용 조성물을 개시한다. 이들 문헌은 동결건조 방법의 중요성을 개시하며 동결건조 사이클에 기초하여 제품의 품질에 변화가 있음을 시사하고 있다.

CN105796507A는 소르비톨, 보호제, 완충제 및 계면활성제를 함유하는 페가스파가제의 안정한 조성물을 개시한다. 그러나, 상기 조성물은 액체 형태에서의 안정성 및 동결 중 보호를 다루고 있다. 상기 출원은 안정한 냉동건조 조성물을 제공하지 못했다.

WO2018017190은 L-아스파라기나제에 링커에 의해 공유 결합된 폴리알킬렌 옥사이드 기; 완충제; 염; 및 당 (sugar)을 포함하는 폴리알킬렌 옥사이드-아스파라기나제를 포함하는 동결건조된 저장 안정 조성물을 개시하고 있다.

그러나 WO'190에 개시된 방법은 길고 (~ 5 일) 경제적이지 않다. 또한, 다량의 부형제를 이용하여 부형제 비용을 ~ 50 %까지 증가시켜 최종 생성물의 비용을 증가시킬 수 있기 때문에 이는 바람직하지 않다.

페가스파가제는 희귀 의약품 (orphan drug)으로 분류되며 가격이 비싸다. 이러한 저장 안정성이 있는 제품의 제조 방법은 동결건조뿐만 아니라 추가적인 부형제의 비용을 추가시켜 제품을 더욱 비싸게 만들 것이다.

따라서, 이의 유통기한 동안 물리적 특성 및 생물학적 활성을 유지하는 최적의 저장 안정성 동결건조 페가스파가제 조성물 및 이러한 조성물에 대한 동결건조 방법이 필요하다.

본 발명의 목적은 이의 유통기한 동안 물리화학적 안정성 및 생물학적 활성을 나타내는 페가스파가제를 포함하는 최적의 저장 안정성 동결건조 조성물 및 이러한 조성물을 위한 동결건조 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 이의 유통기한 동안 물리화학적 안정성 및 생물학적 활성을 나타내는 페가스파가제를 포함하는 최적의 저장 안정성 동결건조 조성물 및 이러한 조성물을 위한 동결건조 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물은 임의의 상당한 양의 불순물 (impurities)/분해물 (degradants)의 존재 없이 상당한 온도 범위에 걸쳐 장기간 동안 안정하다. 본 발명은 또한 저장 안정성 페가스파가제 조성물의 생산을 위한 경제적으로 실행 가능하고 확장 가능한 (scalable) 동결건조 방법에 관한 것이다.

조성물

본 발명의 동결건조 조성물은 페가스파가제를 유효 성분으로 포함한다. 본 발명의 동결건조 조성물은 페가스파가제, 동결 방지제 (cryoprotectant), 증량제, 완충제를 포함하고 선택적으로 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 약제학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있다.

본 발명의 동결건조 조성물은 링커에 의해 아스파라기나제에 공유 결합된 폴리알킬렌 옥사이드 기를 포함하는 페길화된 아스파라기나제를 포함한다.

본 발명의 조성물은 페길화된 아스파라기나제에 대한 것이다. 페가스파가제로도 알려진 페길화된 아스파라기나제는 분자량이 바람직하게는 4 - 6 kDa, 보다 바람직하게는 4.5 - 5.5 kDa, 가장 바람직하게는 4.8 - 5.2 kDa인 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)을 포함하며, 이는 L-아스파라기나제의 하나 이상의 1 차 아민 기 (말단 아민 및 라이신 측쇄의 ε-아미노산)에 아미드 결합을 통해 숙시네이트 링커에 의해 공유 결합된다.

L-아스파라기나제는 E. coli 또는 Erwinia chrysanthemi와 같은 기타 박테리아 공급원으로부터 자연적으로 얻거나, 재조합 기술을 통해 유전적으로 조작된 E. coli를 통해 얻을 수 있다.

mPEG 및 L-아스파라기나제의 접합 반응은 L-아스파라기나제의 단량체 당 1-12 mPEG, 바람직하게는 L-아스파라기나제의 단량체 당 5-10 mPEG, 보다 바람직하게는 L-아스파라기나제의 단량체 당 7-10 mPEG 및 가장 바람직하게는 L-아스파라기나제의 단량체 당 7-9 mPEG의 공유 부착을 초래한다.

본 발명의 페가스파가제의 양은 조성물의 2 - 32 %; 보다 바람직하게는 5 - 20 %, 가장 바람직하게는 6 - 14 %의 농도 (총 중량 백분율)로 존재할 수 있다.

본원에 설명된 동결건조 방법은 상기 방법에 이용되는 부형제의 최적의 양 측면에서 신규하고 진보하다. 본 발명의 부형제는 본 발명의 조성물이 유통기한 동안 물리화학적으로 안정하고 생물학적으로 활성이 되도록 한다. 상기 부형제는 또한 본 발명의 생성물을 얻기 위해 짧고 경제적인 동결건조 사이클의 설계를 가능하게 한다. 본원에 설명된 바와 같은 페가스파가제 및 부형제를 함유하는 본 발명의 조성물은 상승작용적 (synergistic)이다.

본 발명의 조성물은 동결 방지제를 포함한다. 상기 동결 방지제는 당, 폴리올, 중합체 및 아미노산으로부터 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 동결 방지제는 당이다. 가장 바람직하게는, 상기 동결 방지제는 수크로오스이다. 상기 동결 방지제는 조성물의 9 - 91 %; 보다 바람직하게는 본 발명의 조성물의 20 - 60 %, 가장 바람직하게는 32 - 41 %의 범위로 존재할 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않고, 본 발명의 조성물은 사이클 동안 부형제의 부담을 감소시키기 위해 동결 방지제 및 동결 보호제 (lyoprotectant) 둘 모두로 작용할 수 있는 동결 방지제를 고려한다. 이는 안정화제로도 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 증량제를 포함한다. 본 발명의 증량제는 당, 폴리올, 중합체 및 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 증량제는 글리신, 히스티딘, 아르기닌을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이고; 바람직하게는 상기 아미노산은 글리신이다. 본 발명의 증량제는 조성물의 1 - 78 %; 보다 바람직하게는 본 발명의 조성물의 20 - 60 %, 가장 바람직하게는 38 - 50 %의 범위로 존재할 수 있다.

본 발명의 조성물은 완충제를 포함한다. 상기 완충제는 인산 소듐 완충제 (인산 이수소 나트륨 (Sodium dihydrogen phosphate) - 인산 수소 이나트륨 (disodium hydrogen phosphate)) 또는 인산 칼륨 완충제 (인산 이수소 칼륨 (potassium dihydrogen phosphate) - 인산 수소 이칼륨 (dipotassium hydrogen phosphate)), TRIS, 시트레이트 완충제와 같은 인산염 완충제를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으며; 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 인산염 완충제를 포함한다. 동결건조 전, 및 동결건조된 생성물의 재구성 후 생성물의 pH는 6 - 8일 수 있다. 본 발명의 완충제는 조성물의 3 - 33 %; 보다 바람직하게는 본 발명의 조성물의 3 - 15 %, 가장 바람직하게는 4 - 6 %의 범위로 존재할 수 있다.

본 발명의 조성물은 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 바람직하게는 소듐 클로라이드를 포함하는 군으로부터 선택된 염을 선택적으로 포함할 수 있다. 조성물 중의 염의 양은 본 발명의 조성물의 0 - 40 %, 바람직하게는 0 - 10 %, 보다 바람직하게는 0 - 0.5 %의 범위로 존재할 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않고, 본 발명의 조성물은 염을 적게 포함하거나 염이 없는 것을 특징으로 하며, 즉 본 발명의 조성물은 종래 기술의 조성물과 달리 매우 적은 양의 염을 포함할 수 있고 또한 염이 없을 수 있다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 250 - 600 mOsm/Kg, 보다 바람직하게는 250 - 500 mOsm/Kg, 가장 바람직하게는 250 - 450 mOsm/Kg 범위의 삼투압을 갖는다.

동결건조 방법

동결건조 방법은 부형제 및 활성 성분에 대해 고유하며, 상기 방법은 각 조성물에 대해 별도로 개발되어야 한다. 더욱이, 종래 기술의 방법은 길고, 높은 비율의 부형제를 사용하며 경제적이지 않다.

본 발명의 동결건조 방법은 얻어진 동결건조 생성물이 하기 특성을 갖도록 활성 약제학적 물질을 제제화한다.

a. 바이알의 측면에 달라붙지 않는 엘레강스 케이크 (Elegant cake)

b. 일관된 수분 함량

c. 유통기한 연장 (실온에서)

d. 재구성 시 쉽게 용해되고 투명한 용액 생성

e. 단백질의 활성은 온전함

f. 단백질 구조 변경 없음

g. pH 유지

h. 재구성된 용액은 비경구 투여에 허용가능한 삼투압 범위 내에 있다.

동결건조 사이클은 주로 동결, 1 차 건조 및 2 차 건조의 세 단계로 구성되며, 동결과 1 차 건조 사이에 선택적 어닐링 단계가 있다. 이러한 각 단계는 본 발명의 조성물에 최적화되었다. 또한, 본원에 설명된 방법은 활성 성분으로서 페가스파가제를 포함하는 유사한 조성물에도 적용될 수 있을 것으로 예상된다.

본 발명에서 동결건조 방법의 총 시간은 바람직하게는 2880 분 (48 시간) 내지 5790 분 (96.5 시간), 보다 바람직하게는 3120 분 (52 시간) 내지 4980 분 (83 시간), 가장 바람직하게는 3120 분 (52 시간) 내지 4200 분 (70 시간)이다. 본 발명의 동결건조 방법은 바람직하게는 -60 ℃ 내지 30 ℃, 보다 바람직하게는 -50 ℃ 내지 30 ℃, 가장 바람직하게는 -40 ℃ 내지 25 ℃의 온도 변화를 포함한다. 본 발명에서 동결건조 방법의 압력 변화는 바람직하게는 0.037 Torr 내지 760 Torr이다.

사전 동결건조 (PRE-LYOPHILIZATION)

동결건조 전 조성물에 존재하는 페가스파가제의 농도는 바람직하게는 조성물의 4 - 25 % 범위, 보다 바람직하게는 6 - 20 % 범위, 가장 바람직하게는 8 - 16 % 범위이다.

동결건조 전의 충전 부피는 바람직하게는 0.5 내지 5 ml 범위, 보다 바람직하게는 0.5 내지 4 ml 범위, 가장 바람직하게는 0.5 내지 3 ml 범위이다.

충전 부피 및 재구성 후 부피를 기준으로, 적절한 농도의 첨가제 (있는 경우)를 첨가하여 투여 전에 동결건조된 제품의 재구성 후 첨가제의 원하는 농도를 얻는 것이 필요하다.

동결건조 사이클

단계 - 1 - 동결

본 발명의 동결건조 방법은 바람직하게는 -10 ℃ 내지 -60 ℃, 보다 바람직하게는 -20 ℃ 내지 -50 ℃, 가장 바람직하게는 -35 ℃ 내지 -45 ℃의 동결 단계의 최저 온도를 포함한다. 본 발명에서 동결건조 방법의 동결 단계 총 시간은 바람직하게는 150 분 내지 500 분, 보다 바람직하게는 200 분 내지 400 분, 가장 바람직하게는 240 분 내지 350 분이다. 본 발명에서 동결건조 방법 동결 단계의 최저 동결 온도에 도달하는데 필요한 시간은 바람직하게는 20 분 내지 180 분, 보다 바람직하게는 30 분 내지 120 분, 가장 바람직하게는 45 분 내지 90 분이다. 본 발명의 동결건조 방법 동결 단계의 최저 동결 온도에서의 유지 시간은 바람직하게는 120 분 내지 480 분, 보다 바람직하게는 250 분 내지 360 분, 가장 바람직하게는 200 분 내지 300 분이다.

단계 - 2 - 1 차 건조

본 발명의 동결건조 방법은 바람직하게는 10 ℃ 내지 -50 ℃, 보다 바람직하게는 0 ℃ 내지 -45 ℃, 가장 바람직하게는 -30 ℃ 내지 -40 ℃의 1 차 건조 단계의 시작 온도를 포함한다. 본 발명의 동결건조 방법의 1 차 건조 단계의 총 시간은 바람직하게는 35 - 80 시간, 보다 바람직하게는 40 - 75 시간, 가장 바람직하게는 50 - 60 시간이다. 본 발명의 동결건조 방법의 1 차 건조 단계의 시작 온도에 도달하는데 필요한 시간은 바람직하게는 100 분 내지 1000 분, 보다 바람직하게는 250 분 내지 500 분, 가장 바람직하게는 300 분 내지 400 분이다. 본 발명의 동결건조 방법의 1 차 건조 단계 초기 압력은 바람직하게는 50 mTorr 내지 200 mTorr이다. 본 발명의 동결건조 방법의 1 차 건조 단계 종료 시의 최고 온도는 바람직하게는 5 ℃ 내지 25 ℃, 보다 바람직하게는 8 ℃ 내지 22 ℃, 가장 바람직하게는 10 ℃ 내지 20 ℃이다. 본 발명의 동결건조 방법의 1 차 건조 단계의 최대 온도에서의 유지 시간은 바람직하게는 5 - 72 시간, 보다 바람직하게는 8 - 24 시간, 가장 바람직하게는 10 - 14 시간이다. 본 발명의 동결건조 방법의 1 차 건조 단계 종료 시 압력은 바람직하게는 37 mTorr 내지 112 mTorr, 보다 바람직하게는 50 mTorr 내지 90 mTorr, 가장 바람직하게는 60 mTorr 내지 80 mTorr이다.

본 발명의 동결건조 방법의 1 차 건조 단계는 또한 하나 이상의 중간 건조 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 동결건조 방법의 중간 건조 단계의 온도는 바람직하게는 -5 ℃ 내지 15 ℃, 보다 바람직하게는 0 ℃ 내지 10 ℃, 가장 바람직하게는 3 ℃ 내지 7 ℃이다. 본 발명의 동결건조 방법의 중간 건조 단계에서의 유지 시간은 바람직하게는 2 - 24 시간, 보다 바람직하게는 5 - 12 시간, 가장 바람직하게는 8 - 10 시간이다. 본 발명의 동결건조 방법의 중간 건조 단계에서의 압력은 바람직하게는 75 mTorr 내지 200 mTorr, 가장 바람직하게는 100 mTorr 내지 120 mTorr이다.

3 단계 - 2 차 건조

1 차 건조 사이클의 종료 시 건조된 분말은 전형적으로 10 %의 수분을 유지하며, 이는 2 차 사이클의 도입에 의해 제거되어야 한다. 이는 동결건조 방법의 마지막 사이클이며, 동결되지 않은 물, 즉 무정형 상태와 관련된 물을 제거하여 제품을 더 건조시키고 잔류 수분 함량을 줄인다.

본 발명의 동결건조 방법은 바람직하게는 10 ℃ 내지 37 ℃, 보다 바람직하게는 15 ℃ 내지 35 ℃, 가장 바람직하게는 20 ℃ 내지 30 ℃의 2 차 건조 단계의 온도를 포함한다. 본 발명의 동결건조 방법의 2 차 건조 단계의 총 시간은 바람직하게는 3 - 24 시간, 보다 바람직하게는 4 - 16 시간, 가장 바람직하게는 4 - 7 시간이다. 본 발명의 동결건조 방법의 2 차 건조 단계의 유지 시간은 바람직하게는 3 - 24 시간, 보다 바람직하게는 4 - 16 시간, 가장 바람직하게는 4 - 7 시간이다. 본 발명의 동결건조 방법의 2 차 건조 단계의 압력은 바람직하게는 37 mTorr 내지 50 mTorr이다.

동결건조 후 (POST-LYOPHILIZATION)

동결건조 후 바이알 당 재구성 부피는 재구성 후 원하는 용량 및 동결건조 전 샘플의 초기 농도에 따라 1 - 5.5 mL일 수 있다. 동결건조된 제품을 필요한 부피로 재구성한 후 페가스파가제의 농도는 750 ± 20 % IU/ml 범위이다.

활용

본 발명의 또 다른 양상에서, 본 발명의 조성물은 제품이 상당한 시간 간격에 대해 30 ℃ 및 37 ℃뿐만 아니라 실온에서도 안정하기 때문에 취급 및 운송 중에 발생하는 온도 변동에도 불구하고 장기간 동안 안정하다는 것이 관찰되었다. 이론에 제한되지 않고, 상기 비율로 다양한 성분을 최적으로 사용하여 동결건조 동안 및 동결건조 후에도 조성물의 안정성을 유지하여 보다 안정적인 제품을 만드는 것이 제안된다. 본 발명의 조성물은 물리적 온전성, 생물학적 활성 및 화학적 안정성을 유지하는 동결건조 제품을 달성할 수 있게 한다.

또한, 본 발명의 조성물은 동결건조 후 95 % 초과의 순도를 갖는 페가스파가제를 함유한다. 이 높은 백분율 순도로 조성이 잘 안정화되고 가속 및 실시간 안정성 조건 모두에서 열화 (deterioration )가 최소화된다.

본 발명의 조성물은 또한, 본원의 원리에 따라 성분들이 함께 구성될 때, 성분들이 유통기한 동안 적절한 활성 및 안정성을 갖는 조성물을 생성한다는 점에서 상승작용적이다.

본 발명의 조성물의 장점

1. 본 발명의 조성물은 케이크 구조에 원하는 기계적 지지를 제공하여 페가스파가제의 조성물에 안정성을 부여하고 동결건조 방법의 스트레스를 취급하는 능력을 증가시켜 저장 안정성 제품을 생성하도록 한다.

2. 본 발명의 방법은 동결건조 시간이 다른 종래 기술의 방법보다 상당히 감소되어 동결건조기 및 설비 활용의 가동 시간이 거의 2 일 미만이 되므로 경제적으로 실행 가능한 방법으로 가는 길을 만든다. 본 발명에 설명된 바와 같이 페가스파가제의 신규한 조성물에 최적화된 동결건조 방법은 3 일 이내에 완료되며, 이는 거의 5 일 (112.5 시간) 동결건조하는 방법에 대한 현저한 개선이다.

3. 본 발명의 조성물은 동결건조된 페가스파가제의 조성물에 염이 없거나 낮은 농도를 사용할 수 있게 하여 공융 (eutectic) 및 유리 전이 온도 측면에서 이점을 제공한다.

4. 본 발명에서 언급한 신규한 조성물은 고온에서도 저장 안정성이 있는 제품을 생산한다. 30 ℃에서 18 개월 동안, 37 ℃에서 3 개월 동안 동결건조된 페가스파가제의 안정성은 액체 제제에 비해 열 안정성의 개선을 명확하게 입증한다. 대상 조성물의 물리적, 화학적 및 생물학적 열화는 가속 및 실시간 저장 조건 모두에서 최소화된다. 동결건조된 페가스파가제의 이 신규한 조성물은 운송 및 취급 중에 온도 변동을 허용하기 때문에 이는 개발 도상국에 특히 중요하다.

5. 본 발명에서 동결건조된 페가스파가제의 조성물은 동결건조 방법과 함께 공동 개발되어 제품에 대한 동결건조 조건의 스트레스를 감소시킨다. 신규한 조성물에서 페가스파가제의 높은 백분율 순도, 및 단백질에 대한 동결건조 방법에 의해 유발된 스트레스의 결과로 종종 생성되는 분해 산물의 부재는 제품의 면역원성 (제품 관련 불순물의 존재에 기인함 - 주로 분해 산물)을 감소시킨다. 추가로, 소듐 도데실 설페이트 - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)으로 분석될 때; 본 발명은 다른 종래 기술 제품의 경우에서 관찰된 바와 같은 더 높은 분자량 종을 초래하는 어떠한 스트레스 유도 응집도 초래하지 않는다. 선행 기술 제품의 액체 조성물은 더 높은 분자량 종의 존재를 나타내지 않았다는 점에 유의해야 한다. 본 발명에 설명된 바와 같은 조성물에 맞는 신규한 동결건조 방법을 사용하여 개발된 동결건조 페가스파가제의 신규한 조성물은 어떠한 더 높은 분자량 종도 나타내지 않는다.

6. 최적의 부형제 양 및 최적화된 동결건조 방법에 기초하여, 본 발명은 최적의 비용으로 저장 안정성 동결건조 제품을 생성한다.

도 1은 본 발명의 범위 내의 조성물에 대한 케이크 구조를 도시하고 있다.
도 2는 소듐 도데실 설페이트 - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 및 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)에 의해 각각 평가된 페가스파가제, 동결건조 전 및 후 (도 2(B))의 온전성 (integrity) 및 순도를 나타내는 분석 데이터를 도시하고 있다.
도 3은 페가스파가제의 종래 기술 액체 조성물 (도 3(A))의 안정성을 본 발명의 동결건조된 조성물 (도 3(B))과 비교한 소듐 도데실 설페이트 - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 평가된 분석 데이터를 도시하고 있다.
도 4는 쿠마시 염색 (도 4(A)), 요오드 염색 (도 4(B))에 의해 본 발명의 동결건조된 조성물과 함께 종래 기술로 동결건조된 페가스파가제 조성물에 존재하는 고분자량 불순물의 존재를 입증하는 소듐 도데실 설페이트 - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 평가된 분석 데이터를 도시하고 있다. 도 4(C) 및 도 4(D)는 각각 항-아스파라기나제 항체 및 항-PEG 항체에 대한 샘플의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.

본 발명은 본원의 실시예를 통해 설명된다. 실시예는 본 발명의 조성물과 동결건조 및 저장 동안 페가스파가제의 보호에 대한 설명을 제공한다. 실시예는 본 발명의 일 구체예의 예시이며 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되지 않을 수 있다.

실시예

이전에 반복한 바와 같이, 저장 안정성 제품을 생산하는 동결건조 방법이 결국 동결건조 후 제품의 운명을 결정하는 제제의 조성에 의존하기 때문에, 동결건조 사이클 및 조성물이 공동 개발되어야 한다. 실시예 1 및 2는 동결건조 방법 및 조성물의 상호 의존성을 상세히 설명한다.

실시예 1: 부형제의 효과

1.1 동결 방지제

페가스파가제 벌크를 50 mM 인산 소듐 완충 식염수, pH 7.4로 완충액 교체하였다. 벌크 (약물 물질)는 (조성물의) 다양한 중량 백분율의 동결 방지제, 즉 수크로오스 및 트레할로오스로 제제화하였다. 1 ml의 제제화된 페가스파가제 벌크를 사전 멸균된 탈발열원성 (depyrogenated) USP 유형 I, 2 ml 유리 바이알 (비경구용으로 권장됨)에 채우고 13 mm 회색 브로모부틸 코팅 고무 마개로 절반을 막았다. 바이알을 절반 마개로 막고 동결건조 방법을 거쳤다.

동결건조 방법의 동결 단계는 초기 동결을 -40 ℃에서 1 시간 동안 수행하여 1.08 ℃/분의 동결 속도에 도달하였으며 바이알을 3 시간 동안 유지하였다. 1 차 건조 단계에서 온도를 112 mTorr 하에서 0.028 ℃/분의 속도로 -5 ℃로 하였고 그 온도에서 6 시간 동안 유지시켰다. 온도를 0.006 ℃/분의 속도로 0 ℃로 추가로 증가시켰고 112 mTorr 압력 하에서 6 시간 동안 0 ℃에서 유지하였다. 마지막으로, 온도를 0.03 ℃/분의 속도로 20 ℃까지 추가로 증가시켰고 112 mTorr 압력 하에서 5 시간 동안 20 ℃로 유지하였다. 2 차 건조 단계에서 압력을 37 mTorr로 추가로 낮추고 온도를 0.17 ℃/분의 속도로 25 ℃로 높이고 5 시간 동안 유지하였다. 동결건조 방법의 총 시간은 76.5 시간이다.

동결건조 방법이 완료된 후, 선반을 위로 이동하여 바이알을 완전히 마개하였다. 그런 다음 동결건조 챔버에 멸균 질소 가스를 도입하여 압력을 해제하였다. 이어서 동결건조된 바이알을 13 mm 플립 오프 씰 (flip off seals)로 밀봉하고 분석 특성 규명을 수행하였다. 동결건조된 제품에 대해 케이크 구조, 재구성 시간, 재구성 후 투명도 (clarity) 및 상대 활성 (사전 동결건조된 샘플과 비교)을 측정하였다. 다양한 동결 방지제를 갖는 페가스파가제의 다양한 조성물에 대한 동결건조 방법의 결과는 표 1에 표로 작성하였다.

표 1: 페가스파가제의 동결건조 제제의 조성물에서 다양한 백분율을 갖는 상이한 동결 방지제의 효과

동결건조된 제품의 다양한 백분율의 조성물과 함께 상이한 동결 방지제의 존재 하에서 모든 제제화된 페가스파가제의 케이크 구조는 만족스럽지 못하였다. 따라서, 만족스러운 결과를 얻기 위해 증량제의 첨가가 필요하였다.

1.2 증량제

페가스파가제 벌크를 50 mM 인산 소듐 완충 식염수, pH 7.4로 완충액 교체하였다. 벌크 (약물 물질)는 (조성물의) 다양한 중량 백분율의 동결 방지제, 즉 만니톨 및 글리신으로 제제화하였다. 1 ml의 제제화된 페가스파가제 벌크를 사전 멸균된 탈발열원성 USP 유형 I, 2 ml 유리 바이알 (비경구용으로 권장됨)에 채우고 13 mm 회색 브로모부틸 코팅 고무 마개로 절반을 막았다. 바이알을 절반 마개로 막고 동결건조 방법을 거쳤다.

동결건조 방법의 동결 단계는 초기 동결을 -40 ℃에서 1 시간 동안 수행하여 1.08 ℃/분의 동결 속도에 도달하였으며 바이알을 3 시간 동안 유지하였다. 1 차 건조 단계에서 온도를 112 mTorr 하에서 0.028 ℃/분의 속도로 -35 ℃로 하였고 그 온도에서 10 시간 동안 유지시켰다. 온도를 0.11 ℃/분의 속도로 5 ℃로 추가로 증가시켰고 112 mTorr 압력 하에서 9 시간 동안 5 ℃에서 유지하였다. 마지막으로, 온도를 0.13 ℃/분의 속도로 15 ℃까지 추가로 증가시켰고 75 mTorr 감소된 압력 하에서 12 시간 동안 15 ℃로 유지하였다. 2 차 건조 단계에서 압력을 37 mTorr로 추가로 낮추고 온도를 0.33 ℃/분의 속도로 25 ℃로 높이고 5 시간 동안 유지하였다. 동결건조 방법의 총 시간은 53 시간이다.

동결건조 방법이 완료된 후, 선반을 위로 이동하여 바이알을 완전히 마개하였다. 그런 다음 동결건조 챔버에 멸균 질소 가스를 도입하여 압력을 해제하였다. 이어서 동결건조된 바이알을 13 mm 플립 오프 씰로 밀봉하고 분석 특성 규명을 수행하였다. 동결건조된 제품에 대해 케이크 구조, 재구성 시간, 재구성 후 투명도, 및 상대 활성 및 순도 (사전 동결건조된 샘플과 비교)을 측정하였다. 다양한 증량제를 갖는 페가스파가제의 다양한 조성물에 대한 동결건조 방법의 결과는 표 2에 표로 작성하였다.

표 2: 페가스파가제의 동결건조된 제제의 조성물에서 다양한 백분율을 갖는 상이한 증량제의 효과

케이크의 구조는 도 1에 나타내었다. 데이터 세트로부터 증량제 글리신이 케이크 구조에 실질적으로 기여하고 또한 허용 한계 (600 IU/mL 내지 900 IU/mL) 내에서 활성을 유지한다는 것이 분명하다. 이 동결건조 방법을 위한 증량제가 없는 케이크 구조는 약제학적으로 허용 가능하지만 페가스파가제의 활성 및 순도는 매우 나빴다. 만니톨을 증량제로 사용하면 활성 및 순도를 유지하지만, 이 동결건조 방법에 좋은 케이크 구조를 나타내지 않았다.

1.3 염의 효과

페가스파가제 벌크를 50 mM 인산 소듐 완충 식염수, pH 7.4로 완충액 교체하고, 수크로오스 (동결/냉동 보호제), 상이한 양의 증량제 - 다양한 양 (조성물의 중량 %)의 염을 갖는 글리신으로 제제화하였다. 2 ml의 제제화된 벌크를 사전 멸균된 탈발열원성 USP 유형 I, 5 ml 유리 바이알 (비경구용으로 권장됨)에 채우고 20 mm 회색 브로모부틸 코팅 고무 마개로 절반을 막았다. 바이알을 절반 마개로 막고 최적화된 동결건조 방법을 거쳤다.

동결건조 방법의 동결 단계는 -40 ℃에서 4 시간 동안 수행하였다. 1 ℃/분의 동결 속도로 동결 온도에 도달하였다. 1 차 건조 단계에서 온도를 112 mTorr 하에서 0.014 ℃/분의 속도로 -35 ℃로 하였고 그 온도에서 10 시간 동안 유지시켰다. 온도를 0.06 ℃/분의 속도로 5 ℃로 추가로 증가시켰고 112 mTorr 압력 하에서 9 시간 동안 5 ℃에서 유지하였다. 압력을 75 mTorr로 감소시키고 온도를 0.02 ℃/분의 속도로 15 ℃로 하였고 12 시간 동안 유지시켰다. 2 차 건조 단계에서 압력을 37 mTorr로 추가로 낮추고 온도를 0.33 ℃/분의 속도로 25 ℃로 높이고 5 시간 동안 유지하였다.

동결건조 방법이 완료된 후, 선반을 위로 이동하여 바이알을 완전히 마개하였다. 그런 다음 동결건조 챔버에 멸균 질소 가스를 도입하여 압력을 해제하였다. 이어서 동결건조된 바이알을 20 mm 플립 오프 씰로 밀봉하였다. 동결건조 생성물을 5 mL 주사용수로 재구성하고 분석 특성 규명을 수행하였다. 동결건조된 제품에 대해 케이크 구조, 재구성 시간, 재구성 후 투명도, 상대 활성 (사전 동결건조된 벌크와 비교), 절대 순도 (크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)로 측정되며 백분율로 표현함)을 측정하였다. 페가스파가제의 다양한 조성물에 대한 동결건조 방법의 결과는 표 3에 표로 작성하였다.

표 3: 페가스파가제의 동결건조화에 대한 NACL 및 글리신의 효과

최적화된 동결건조 방법은 중요한 제품 속성을 변경하지 않고도 염 농도가 낮고 염이 없는 조성물에 대해 사용될 수 있음이 명백하다.

실시예 2: 동일한 조성물에 대한 상이한 동결건조 사이클의 효과

페가스파가제 벌크를 50 mM 인산 나트륨 완충 식염수, pH 7.4에서 완충액 교체하였다. 벌크 (약물 물질)를 수크로오스 (조성물의 34.3 %로 동결/냉동-보호제) 및 글리신 (조성물의 51.5 %로 증량제)과 함께 제제화하였다. 1 ml의 제제화된 벌크를 사전 멸균된 탈발열원성 USP 유형 I, 2 ml 유리 바이알 (비경구용으로 권장됨)에 채우고 13 mm 회색 브로모부틸 코팅 고무 마개로 절반을 막았다. 바이알을 절반 마개로 막고 다양한 동결건조 방법을 거쳤다.

다양한 동결건조 방법의 동결 단계는 다양한 기간 및 온도에 대해 수행하였다. 어떤 경우에는 단일 단계 동결을 수행한 반면 다른 경우에는 다단계 동결을 수행하였다. 한 사이클에서 초기 동결은 2 시간 동안 -15 ℃에서 수행하였으며 1.16 ℃/분의 동결 속도로 도달하였다. 이어서 온도를 -25 ℃로 추가 감소시켰으며, 0.33 ℃/분의 동결 속도로 달성하였으며 여기서 바이알을 3 시간 동안 유지시켰다. 마지막으로, 온도를 -40 ℃로 낮추고 0.5 ℃/분의 동결 속도로 달성하였으며 여기서 바이알을 2 시간 동안 유지시켰다. 총 동결 단계 기간은 8.5 시간이었다. 다른 사이클에서 동결건조 방법의 동결 단계는 3 시간 동안 -40 ℃에서 수행하였다. 동결 온도는 1 ℃/분의 동결 속도로 도달하였다. 총 동결 단계 기간은 4 시간이었다. 다른 사이클에서 동결건조 방법의 동결 단계는 -40 ℃에서 6 시간 동안 수행하였다. 동결 온도는 0.5 ℃/분의 동결 속도로 도달하였다. 총 동결 단계 기간은 8 시간이었다. 또 다른 사이클에서 동결건조 방법의 동결 단계는 -40 ℃에서 4 시간 동안 수행하였다. 동결 온도는 1 ℃/분의 동결 속도로 도달하였다. 총 동결 단계 기간은 5 시간이었다.

동결건조 사이클의 1 차 건조 단계도 온도, 압력 및 시간을 다양하게 하였다. 한 사이클에서 1 차 건조 단계의 경우 112 mTorr 하에서 0.028 ℃/분의 속도로 온도를 -5 ℃로 하고 그 온도에서 6 시간 동안 유지하였다. 온도를 0.006 ℃/분의 속도로 0 ℃로 추가로 증가시켰고 112 mTorr 압력 하에서 6 시간 동안 0 ℃에서 유지시켰다. 마지막으로, 온도를 0.03 ℃/분의 속도로 20 ℃까지 추가로 증가시켰고 112 mTorr 압력 하에서 5 시간 동안 20 ℃로 유지시켰다. 총 1 차 건조 단계 기간은 61.5 시간이었다. 1 차 건조 단계의 다른 사이클에서 온도를 112 mTorr 하에서 0.15 ℃/분의 속도로 -5 ℃로 하였고 그 온도에서 14 시간 동안 유지하였다. 온도를 0.06 ℃/분의 속도로 5 ℃까지 추가로 증가시켰고 112 mTorr 압력 하에서 9 시간 동안 5 ℃로 유지시켰다. 마지막으로, 압력을 75 mTorr로 낮추고 온도를 0.067 ℃/분의 속도로 15 ℃로 하였고 6 시간 동안 유지시켰다. 총 1 차 건조 단계 기간은 38.5 시간이었다. 1 차 건조 단계의 다른 사이클에서 온도를 112 mTorr 하에서 0.027 ℃/분의 속도로 -35 ℃로 하였고 그 온도에서 10 시간 동안 유지하였다. 온도를 0.11 ℃/분의 속도로 5 ℃로 추가로 증가시켰고 112 mTorr 압력 하에서 9 시간 동안 5 ℃로 유지시켰다. 마지막으로, 압력을 75 mTorr로 낮추고 온도를 0.067 ℃/분의 속도로 15 ℃로 하였고 12 시간 동안 유지시켰다. 총 1 차 건조 단계 기간은 42.5 시간이었다. 1 차 건조 단계의 또 다른 사이클에서 온도를 112 mTorr 하에서 0.027 ℃/분의 속도로 -35 ℃로 하였고 그 온도에서 10 시간 동안 유지하였다. 온도를 0.11 ℃/분의 속도로 5 ℃로 추가로 증가시켰고 112 mTorr 압력 하에서 9 시간 동안 5 ℃에서 유지시켰다. 온도를 0.014 ℃/분의 속도로 10 ℃까지 추가로 증가시켰고 112 mTorr 압력 하에서 24 시간 동안 10 ℃로 유지시켰다. 마지막으로, 압력을 75 mTorr로 낮추고 온도를 0.033 ℃/분의 속도로 15 ℃로 하였고 12 시간 동안 유지시켰고. 총 1 차 건조 단계 기간은 72.5 시간이었다. 1 차 건조 단계의 또 다른 사이클에서 온도를 112 mTorr에서 0.027 ℃/분의 속도로 -35 ℃로 하였고 그 온도에서 6 시간 동안 유지시켰다. 온도를 0.138 ℃/분의 속도로 15 ℃까지 추가로 증가시켰고 112 mTorr 압력 하에서 9 시간 동안 15 ℃로 유지하였다. 마지막으로, 압력을 15 ℃에서 5 시간에 걸쳐 75 mTorr로 감소시키고 12 시간 동안 유지하였다. 총 1 차 건조 단계 기간은 38.5 시간이었다.

동결건조 사이클의 2 차 건조 단계도 온도, 압력 및 시간을 다양하게 하였다. 한 사이클에서 2 차 건조 단계의 경우 압력을 37 mTorr로 추가로 낮추고 온도를 0.16 ℃/분의 속도로 25 ℃로 높이고 5 시간 동안 유지하였다. 총 2 차 건조 단계 기간은 5.5 시간이었다. 한 사이클에서 2 차 건조 단계의 경우 압력을 37 mTorr로 추가로 낮추고 온도를 0.33 ℃/분의 속도로 25 ℃로 높이고 5 시간 동안 유지하였다. 총 2 차 건조 단계 기간은 5.5 시간이었다. 다른 한 사이클에서 2 차 건조 단계의 경우 압력을 37 mTorr로 추가로 낮추고 온도를 0.33 ℃/분의 속도로 25 ℃로 높이고 9 시간 동안 유지하였다. 총 2 차 건조 단계 기간은 9.5 시간이었다.

동결건조 방법의 완료 시간은 48 시간에서 83.5 시간까지 다양하였다.

동결건조 방법이 완료된 후, 선반을 위로 이동하여 바이알을 완전히 마개하였다. 그런 다음 동결건조 챔버에 멸균 질소 가스를 도입하여 압력을 해제하였다. 이어서 동결건조된 바이알을 13 mm 플립 오프 씰로 밀봉하고, 분석 특성 규명을 거쳤다. 동결건조된 제품에 대해 케이크 구조, 재구성 시간, 재구성 후 투명도, 상대 활성 (사전 동결건조된 벌크와 비교), 상대 순도 (크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)로 측정되며 사전 동결건조된 벌크와 비교) 및 삼투압을 측정하였다. 동결건조된 제품은 만족스러운 케이크 형성, 허용 가능한 재구성 시간 (2 분 미만)으로 우수하였으며 재구성된 샘플은 투명하고 무색이었다. 그러나, 상대 활성 및 순도는 표 4에 나타난 바와 같이 상당히 다양하였다. 이 결과는 동결건조 방법의 변화로 인해 동일한 조성물에 부여된 상이한 스트레스 조건에서 기인한 것으로 예상된다.

표 4: 다양한 동결건조 조건을 갖는 동일한 제제의 상대 순도 및 활성

실시예 3: 본 발명의 조성물의 예시적인 실시예 - 적은 염

페가스파가제 벌크를 50 mM 인산 소듐 완충 식염수, pH 7.4로 완충액 교체하였다. 필요한 벌크를 동결/냉동 보호제로서 수크로오스 및 증량제로서 글리신을 사용하여 제제화하였고 최종적으로 희석하여 1875 IU/mL를 달성하였다. 최종 제제는 각각의 조성물에서 페가스파가제, 수크로오스, 글리신, 제 1 인산 소듐 (sodium phosphate monobasic), 이염기성 인산 소듐 (sodium phosphate dibasic), 및 13.67% 내지 7.04%, 39.60% 내지 36.78%, 47.52% 내지 44.13%, 0.95% 내지 0.88%, 4.42% 내지 4.10% 및 0.47% 내지 0.43%로 소듐 클로라이드를 포함하였다. 2 ml의 제제화된 벌크를 사전 멸균된 탈발열원성 USP 유형 I, 5 ml 유리 바이알 (비경구용으로 권장)에 채우고 20 mm 회색 브로모부틸 코팅 고무 마개로 절반을 막았다. 바이알을 절반 마개하고 최적화된 동결건조 방법을 거쳤다.

동결건조 방법의 동결 단계는 -40 ℃에서 4 시간 동안 수행하였다. 동결 온도는 1 ℃/분의 동결 속도로 도달하였다. 1 차 건조 사이클에서 온도를 112 mTorr 하에서 0.014 ℃/분의 속도로 -35 ℃로 하였고 그 온도에서 10 시간 동안 유지시켰다. 온도를 0.06 ℃/분의 속도로 5 ℃까지 추가로 증가시켰고 112 mTorr 압력 하에서 9 시간 동안 5 ℃로 유지시켰다. 압력을 75 mTorr로 낮추고 온도를 0.02 ℃/분의 속도로 15 ℃로 하고 12 시간 동안 유지하였다. 2 차 건조 사이클 동안 압력을 37 mTorr로 추가로 낮추고 온도를 0.33 ℃/분의 속도로 25 ℃로 높이고 5 시간 동안 유지하였다. 동결건조 방법의 총 시간은 66.5 시간이었다.

동결건조 방법이 완료된 후, 선반을 위로 이동하여 바이알을 완전히 마개하였다. 그런 다음 동결건조 챔버에 멸균 질소 가스를 도입하여 압력을 해제하였다. 동결건조된 바이알을 20 mm 플립 오프 씰로 밀봉하였다. 동결건조된 생성물을 5 mL의 주사용수로 재구성하고 분석 특성 규명을 수행하였다 (표 5).

표 5. 동결건조된 페가스파가제의 분석 특성

도 2는 각각 소듐 도데실 설페이트 - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 및 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)에 의해 측정된 동결건조 전 및 후 동결건조 페가스파가제의 온전성 및 순도를 나타내었다.

동결건조 사이클 및 조성의 공정 견고성 (robustness)은 여러 배치에 걸쳐 검증되었다. 동결건조된 제품에 대해 케이크 구조, 재구성 시간, 재구성 후 투명도, 절대 활성, 상대 활성 (사전 동결건조 벌크와 비교), 절대 순도 (크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)에 의해 측정되며 백분율로 표현됨), 상대 순도 (사전 동결건조 벌크와 비교), 삼투압 및 수분 함량을 측정하였다. 제품 특성은 3 개의 대표적인 배치에 대해 표 6에 나타낸 바와 같이 허용 기준을 준수한다.

표 6. 동결건조된 페가스파가제 3 개 로트의 분석 특성

동결건조된 제품을 ICH 품질 가이드라인 (Q1A)에 따라 5 ℃ ± 3 ℃에서 24 개월 동안 장기 안정성 연구, 25 ℃ ± 2 ℃/60 % ± 5 % 상대 습도에서 6 개월 동안 가속 안정성 (accelerated stability) 연구를 수행하였다. 주변 온도 (5 ℃ ± 3 ℃) 및 25 ℃ ± 2 ℃/60 % ± 5 % 상대 습도로 다양한 시점에서 페가스파가제 제품에 대한 동결건조 방법의 결과는 각각 표 7 및 표 8에 표로 작성하였다.

표 7. 5 ℃ ± 3 ℃에서 24 개월 동안 동결건조된 페가스파가제의 장기 안정성 연구.

표 8. 25 ℃ ± 3 ℃ / 60 % ± 5 % 상대 습도에서 6 개월 동안 동결건조된 페가스파가제의 가속 안정성 연구.

제품 특성은 전체 기간 동안 허용 기준을 준수하여 제품이 24 개월 동안 5 ℃ ± 3 ℃, 6 개월 동안 25 ℃ ± 2 ℃/60 % ± 5 % 상대 습도에서 안정적이라는 것을 나타낸다. 또한, 제품을 30 ℃ ± 2 ℃/65 % ± 5 % 상대 습도에서 18 개월 동안 장기 안정성 연구를 수행하고 37 ℃ ± 2 ℃/75 % ± 5 % 상대 습도에서 3 개월 동안 가속 안정성 연구를 수행한 고온에서 동결건조된 제품의 안정성을 평가하였다. 30 ℃ ± 2 ℃/65 % ± 5 % 상대 습도 및 37 ℃ ± 2 ℃/75 % ± 5 % 상대 습도로 다양한 시점에서 페가스파가제 제품에 대한 동결건조 방법의 결과는 각각 표 9 및 표 10에 표로 작성하였다. 제품 특성은 제품이 30 ℃ ± 2 ℃/65 % ± 5 % 상대 습도에서 18 개월 동안 및 37 ℃ ± 2 ℃/75 % ± 5 % 상대 습도에서 3 개월 동안 안정적임을 나타내어 전체 기간 동안 허용 기준을 준수한다.

표 9. 18 개월 동안 30 ℃ ± 2 ℃/65 % ± 5 % 상대 습도에서 동결건조된 페가스파가제의 장기 안정성 연구

표 10: 3 개월 동안 37 ℃ ± 2 ℃ / 75 % ± 5 % 상대 습도에서 동결건조된 페가스파가제의 가속 안정성 연구

실시예 4: 본 발명의 조성물의 예시적인 실시예 - 무염

페가스파가제 벌크를 50 mM 인산 소듐 완충제, pH 7.4로 완충액 교체하였다. 필요한 농축된 벌크를 동결/냉동 보호제로서 수크로오스 및 증량제로서 글리신을 사용하여 제제화하였고 최종적으로 희석하여 1875 IU/mL를 달성하였다. 최종 제제는 각각의 조성물에서 페가스파가제, 수크로오스, 글리신, 제 1 인산 소듐, 및 12.57% 내지 9.60%, 38.71% 내지 37.43%, 46.45% 내지 44.92%, 0.93% 내지 0.90% 및 4.32% 내지 4.18%로 이염기성 인산 소듐을 포함하였다. 2 ml의 제제화된 벌크를 사전 멸균된 탈발열원성 USP 유형 I, 5 ml 유리 바이알 (비경구용으로 권장)에 채우고 20 mm 회색 브로모부틸 코팅 고무 마개로 절반을 막았다. 바이알을 절반 마개하고 최적화된 동결건조 방법을 거쳤다.

동결건조 방법이 완료된 후, 선반을 위로 이동하여 바이알을 완전히 마개하였다. 그런 다음 동결건조 챔버에 멸균 질소 가스를 도입하여 압력을 해제하였다. 동결건조된 바이알을 20 mm 플립 오프 씰로 밀봉하였다. 동결건조된 생성물을 5 mL의 주사용수로 재구성하고 분석 특성 규명을 수행하였다 (표 11).

표 11. 무염 조성물로서 동결건조된 페가스파가제의 분석 특성

동결건조 사이클 및 조성물의 공정 견고성은 여러 배치에 걸쳐 검증되었다. 동결건조된 제품에 대해 케이크 구조, 재구성 시간, 재구성 후 투명도, 절대 활성, 상대 활성 (사전 동결건조 벌크와 비교), 절대 순도 (크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)에 의해 측정되며 백분율로 표현함), 상대 순도 (사전 동결건조된 벌크와 비교함), 삼투압 및 수분 함량을 측정하였다. 제품 특성은 3 개의 대표적인 배치에 대해 표 12에 나타낸 바와 같이 허용 기준을 준수한다.

표 12. 무염 조성물로서 3 개 로트의 동결건조된 페가스파가제의 분석 특성

염이 없는 동결건조된 제품은 5 ℃ ± 3 ℃에서, 25 ℃ ± 2 ℃/60 % ± 5 %에서, 30 ℃ ± 2 ℃/65 % ± 5 % 상대습도에서 및 37 ℃ ± 2 ℃/75 % ± 5 % 상대 습도에서 장기 안정성 연구를 수행하였으며, 데이터는 1 개월에 대해 표 13에, 3 개월에 대해 표 14에 제시하였다.

표 13: 1 개월에 본 발명의 조성물의 구체예의 안정성

표 14: 3 개월에 본 발명의 조성물의 구체예의 안정성

실시예 5: 본 발명과 종래 기술의 조성물 비교

5.1 종래 기술의 액체 조성물 VS 본 발명의 고체 조성물

종래 기술에서 보고된 페가스파가제는 일반적으로 액체 조성물로 제공되며 더 긴 기간 및 더 높은 온도에서 안정적으로 저장되지 않는다. 본 발명은 다양한 온도에서 저장 안정한 동결건조 조성물을 개시한다. 페가스파가제가 더 긴 기간에 안정하지 않다는 것은 종래 기술에서 언급된다. 본 발명은 이러한 한계를 극복하고 저장 안정한 조성물을 제공한다. 종래 기술의 제품은 25 ℃ ± 2 ℃/60 % ± 5 % 상대 습도에서 3 개월 이내에 실질적으로 분해된다. 도 3에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE로 분석 시 액체 조성물에 대해 25 ℃ ± 2 ℃/60 % ± 5 % 상대 습도에서 여러 밴드가 존재하여 액체 제제의 분해가 명확하다 (도 3(A)). 본 발명은 25 ℃ ± 2 ℃/60 % ± 5 % 상대 습도, 30 ℃ ± 2 ℃/65 % ± 5 % 상대 습도 및 37 ℃ ± 2 ℃/75 % ± 5 % 상대 습도에서 안정한 저장 안정성 제제를 생산한다. 본 조성물의 안정성은 도 3(B)에 나타낸 바와 같이 적절한 분자량에서 단일 확산 밴드의 존재로부터 명백하다.

5.2 종래 기술의 고체 조성물 VS 본 발명의 고체 조성물

종래 기술은 저장 안정한 조성물을 개시하지만 동결건조된 제품은 고분자량 응집체 측면에서 제한이 있다. 본 개시 내용은 본 발명의 방법 및 개선된 조성물을 사용하고, 임의의 추가적인 응집/고분자 불순물을 갖지 않는다 (도 4 참조). 도 4는 본 발명에 따른 종래 기술 동결건조 조성물의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. SDS-PAGE 겔은 단백질에 대한 쿠마시 염색 (도 4(A)) 및 PEG에 대한 요오드 염색 (도 4(B))으로부터 명백한 바와 같이 고분자량 불순물의 존재를 확인한다. 또한, 항-아스파라기나제 항체 (도 4(C)) 및 항-PEG 항체 (도 4(B))를 사용한 웨스턴 블롯 분석은 제품 관련 불순물의 존재를 확인한다. 이는 동결건조 방법과 제제의 조성물의 상승작용적 관계를 더욱 강조한다. 선행 기술 제품의 액체 조성물은 고분자량 종의 존재를 나타내지 않았다는 점에 유의해야 한다.

Claims

페가스파가제 (pegaspargase), 동결 방지제 (cryoprotectant), 증량제 (bulking agent), 완충제를, 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 최적의 저장 안정성 동결건조 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 페가스파가제는 링커에 의해 아스파라기나제에 공유 결합된 폴리알킬렌 옥사이드 기를 포함하는 페길화된 아스파라기나제이고; 상기 폴리알킬렌 옥사이드는 분자량이 바람직하게는 4 - 6 kDa, 보다 바람직하게는 4.5 - 5.5 kDa, 가장 바람직하게는 4.8 - 5.2 kDa인 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)이고, 접합 (conjugation)을 통해 L-아스파라기나제의 하나 이상의 1 차 아민 기에 아미드 결합을 통해 숙시네이트 링커에 의해 공유 결합되고; 여기서, mPEG 및 L-아스파라기나제의 접합 반응은 L-아스파라기나제의 단량체 당 1 - 12 mPEG, 바람직하게는 L-아스파라기나제의 단량체 당 5 - 10 mPEG, 보다 바람직하게는 L-아스파라기나제의 단량체 당 7 - 10 mPEG 및 가장 바람직하게는 L-아스파라기나제의 단량체 당 7 - 9 mPEG의 공유 부착을 유발하는 것인 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 L-아스파라기나제는 E. coli 또는 Erwinia chrysanthemi로 구성된 군으로부터 선택된 박테리아 공급원으로부터 유래하거나, 또는 재조합 기술을 통한 유전적으로 조작된 E. coli를 통해 얻어지는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물 중 페가스파가제의 양은 조성물의 2 - 32 %; 보다 바람직하게는 5 - 20 % 및 가장 바람직하게는 6 - 14 %인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 동결 방지제는 당, 폴리올, 중합체 및 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 당이고; 상기 당은 수크로오스이고; 상기 동결 방지제는 조성물의 9 - 91 %; 바람직하게는 20 - 60 %, 가장 바람직하게는 32 - 41 %의 범위로 존재하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 증량제는 당, 폴리올, 중합체 및 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 아미노산이고; 및 상기 아미노산은 글리신, 히스티딘, 아르기닌을 포함하는 군으로부터 선택되고; 바람직하게는 상기 아미노산은 글리신이고; 상기 증량제는 조성물의 1 - 78 %; 보다 바람직하게는 20 - 60 % 및 가장 바람직하게는 38 - 50 %의 범위로 존재하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 완충제는 인산 완충제, 인산 나트륨 완충제 (인산 이수소 나트륨 - 인산 수소 이나트륨), 인산 칼륨 완충제 (인산 이수소 칼륨 - 인산 수소 이칼륨), TRIS, 시트레이트를 포함하는 군으로부터 선택되고; 바람직하게는, 인산염 완충제이고; 상기 완충제는 조성물의 3 - 33 %; 보다 바람직하게는 3 - 15 % 및 가장 바람직하게는 4 - 6 %의 범위인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 부형제는 염인 것인 조성물.
청구항 8에 있어서, 상기 염은 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드를 포함하는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 소듐 클로라이드이고; 여기서 조성물 중의 염의 양은 조성물의 0 - 40 %, 바람직하게는 0 - 10 %, 보다 바람직하게는 0 - 0.5 %의 범위인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 동결건조 전 및 동결건조 제품의 재구성 후 제품의 pH가 6 - 8이고; 삼투압은 바람직하게는 250 - 600 mOsm/Kg, 보다 바람직하게는 250 - 500 mOsm/Kg 및 가장 바람직하게는 250 - 450 mOsm/Kg의 범위인 것인 조성물.
a. 동결,
b. 선택적으로 어닐링 (annealing);
c. 1 차 건조 및
d. 2 차 건조로 구성된, 청구항 1에 따른 조성물을 제조하는 방법.
청구항 11에 있어서, 동결건조 방법의 총 시간이 바람직하게는 2880 분 (48 시간) 내지 5790 분 (96.5 시간), 보다 바람직하게는 3120 분 (52 시간) 내지 4980 분 (83 시간), 가장 바람직하게는 3120 분 (52 시간) 내지 4200 분 (70 시간)이고; 온도 변화는 -60 ℃ 내지 30 ℃, 보다 바람직하게는 -50 ℃ 내지 30 ℃, 가장 바람직하게는 -40 ℃ 내지 25 ℃이고, 압력 변화는 바람직하게는 0.037 Torr 내지 760 Torr인 방법.
청구항 11에 있어서, 동결은 동결 단계의 최저 온도 -10 ℃ 내지 -60 ℃, 보다 바람직하게는 -20 ℃ 내지 -50 ℃, 가장 바람직하게는 -35 ℃ 내지 -45 ℃에서 수행되고; 총 시간은 바람직하게는 150 분 내지 500 분, 보다 바람직하게는 200 분 내지 400 분, 가장 바람직하게는 240 분 내지 350 분이고; 최저 동결 온도는 바람직하게는 20 분 내지 180 분, 보다 바람직하게는 30 분 내지 120 분, 가장 바람직하게는 45 분 내지 90 분이고; 최저 동결 온도에서의 유지 시간은 바람직하게는 120 분 내지 480 분, 보다 바람직하게는 250 분 내지 360 분, 가장 바람직하게는 200 분 내지 300 분인 것인 방법.
청구항 11에 있어서, 1 차 건조가 10 ℃ 내지 -50 ℃, 보다 바람직하게는 0 ℃ 내지 -45 ℃, 가장 바람직하게는 -30 ℃ 내지 -40 ℃이고; 총 시간은 바람직하게는 35 - 80 시간, 보다 바람직하게는 40 - 75 시간, 가장 바람직하게는 50 - 60 시간이고; 시작 온도에 도달하는데 필요한 시간은 바람직하게는 100 분 내지 1000 분, 보다 바람직하게는 250 분 내지 500 분, 가장 바람직하게는 300 분 내지 400 분이고; 초기 압력은 바람직하게는 50 mTorr 내지 200 mTorr이고; 1 차 건조 단계 종료 시 최대 온도는 바람직하게는 5 ℃ 내지 25 ℃, 보다 바람직하게는 8 ℃ 내지 22 ℃, 가장 바람직하게는 10 ℃ 내지 20 ℃이고; 본 발명의 동결건조 방법의 1 차 건조 단계의 최대 온도에서 유지 시간은 바람직하게는 5 - 72 시간, 보다 바람직하게는 8 - 24 시간, 가장 바람직하게는 10 - 14 시간이고; 본 발명의 동결건조 방법의 1 차 건조 단계 종료 시 압력은 바람직하게는 37 mTorr 내지 112 mTorr, 보다 바람직하게는 50 mTorr 내지 90 mTorr, 가장 바람직하게는 60 mTorr 내지 80 mTorr인 것인 방법.
청구항 11에 있어서, 2 차 건조 단계가 10 ℃ 내지 37 ℃, 보다 바람직하게는 15 ℃ 내지 35 ℃, 가장 바람직하게는 20 ℃ 내지 30 ℃의 온도이고; 총 시간은 바람직하게는 3 - 24 시간, 보다 바람직하게는 4 - 16 시간, 가장 바람직하게는 4 - 7 시간이고; 동결건조의 2 차 건조 단계의 유지 시간은 바람직하게는 3 - 24 시간, 보다 바람직하게는 4 - 16 시간, 가장 바람직하게는 4 - 7 시간이고; 압력은 바람직하게는 37 mTorr 내지 50 mTorr인 방법.
청구항 11에 따른 방법으로부터 얻은 동결건조 조성물.
청구항 1 또는 16에 있어서, 동결건조 후 바이알 당 재구성 부피가 1 - 5.5 mL이고, 동결건조 전 바람직하게는 조성물의 4 - 25 %의 범위, 보다 바람직하게는 6 - 20%의 범위, 가장 바람직하게는 8 - 16 % 범위이고 페가스파가제의 최종 농도는 750 ± 20 % IU/ml의 범위인 것인 조성물.