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KR20210065141A - CRISPR/Cas 시스템을 기반으로 한 세포의 유전자 편집 방법 - Google Patents

CRISPR/Cas 시스템을 기반으로 한 세포의 유전자 편집 방법 Download PDF

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KR20210065141A
KR20210065141A KR1020217011835A KR20217011835A KR20210065141A KR 20210065141 A KR20210065141 A KR 20210065141A KR 1020217011835 A KR1020217011835 A KR 1020217011835A KR 20217011835 A KR20217011835 A KR 20217011835A KR 20210065141 A KR20210065141 A KR 20210065141A
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KR
South Korea
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cell
gene
antigen
receptor
grna
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020217011835A
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Inventor
쫑하이 리
자오후에이 리아오
Original Assignee
카파 테라퓨틱스 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

본 발명은CRISPR/Cas 시스템을 기반으로 한 세포의 유전자 편집 방법을 제공하되, 여기서, Cas 효소는 효소 활성이 0.1 ~ 1 nmol인 Cas9 효소이다. 본 발명은 범용형 T 세포의 구축 방법, 제조된 T 세포 및 이의 용도를 더 제공하되, 여기서, 유전자 편집 기술을 통해 TCR 유전자 및 MHC 유전자에 대해 유전자 편집을 진행한다. 본 발명은 gRNA 구축을 더 제공한다.

Description

CRISPR/Cas 시스템을 기반으로 한 세포의 유전자 편집 방법
본 발명은 유전자 편집 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 세포에 대해 유전자 편집을 진행하는 방법에 관한 것이다.
유전자 편집은 특정된 핵산 서열에 대한 결실, 삽입, 돌연변이 또는 치환을 통한 게놈의 변경을 포함한다. CRISPR-Cas 시스템은 크리스퍼(CRISPR, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 및 관련 Cas 단백질로 구성된다. RNA-유도 Cas 엔도뉴클레아제는 서열 의존적 방식으로 DNA를 특이적으로 표적화 및 절단하고(Jinek, M. 등, "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity," Science 337, 816-821(2012); Sternberg, S. H. 등, "DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9," Nature 507, 62(2014)), 다양한 생물학적 및 모델 시스템에서 유전자 편집에 광범위하게 사용되고 있다.
하지만, 유전자 편집 과정에서 여전히 유전자 편집 효율이 낮은 문제가 존재하는데, 예를 들어, CRISPR-Cas9가 T 세포를 편집할 경우, T 세포는 말단 분화된 일차 세포이므로, 체외 증폭을 위한 시간 윈도우가 제한되고, 유전자 형질감연 효율이 낮다. 예를 들어, Clin Cancer Res; 23(9) May 1, 2017에서 TCR 수용체를 코딩하는 유전자 또는 HLA 단백질을 코딩하는 유전자를 단독으로 녹아웃하는 효율이 최대 약 80 %일 수 있고, 양자를 동시에 녹아웃하는 효율은 약 60 %에 불과함을 공개하였다.
따라서, 어떻게 세포에 대해 유전자 녹아웃을 신속하고 효율적으로 진행하거나, 여러 유전자를 한 번에 신속하고 효율적으로 녹아웃할 것인가는 이 분야에서 어려운 과제로 되고 있다.
본 발명의 목적은, 세포에 대해 유전자 녹아웃을 신속하고 효율적으로 진행하고, 특히 여러 유전자를 한 번에 신속하고 효율적으로 녹아웃하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태에서, CRISPR/Cas 시스템을 기반으로 한 세포의 유전자 편집 방법을 제공하고, 상기 방법에서, Cas 효소와 gRNA의 복합체를 상기 세포에 도입하여 유전자 편집을 진행하되, 여기서, 상기 복합체 중 Cas 효와 gRNA의 비율은 1:3 ~ 1:5이다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 Cas 효소는 Cas9 효소이다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 Cas9 효소의 효소 활성은 0.1 ~ 1 nmol이고, 바람직하게, 0.2 ~ 0.7 nmol이며, 더 바람직하게, 0.3 ~ 0.5 nmol이고, 가장 바람직하게, 0.37 nmol이다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 Cas 효소는 Cas9 효소이고, 상기 복합체에서, Cas9 효소와 gRNA의 몰비는 1:1 ~ 1:10이며, 바람직하게, 1:3 ~ 1:5이고, 더 바람직하게, 1:4이다.
본 발명에서, 예를 들어 NEB 회사에서 구매한 Cas9 효소를 사용할 수 있고, 물론 본 기술분야의 통상의 기술자는 동일하거나 유사한 기능을 가지는 다른 Cas9 효소를 선택할 수도 있다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 Cas9 효소는, 30μ의 반응의 Cas9 효소 반응계(상기 반응계는 20 mM의 HEPES, 100 mM의 NaCl, 5 mM의 MgCl2, 0.1 mM의 EDTA를 포함하고, 25 →에서, pH는 6.5임)에서, 1 nM의 PvuII 선형화된 pBR322 DNA(하나의 표적 부위 CGCTTGTTTCGGCGTGGGTA), 40 nM의 sgRNA 및 20 nM의 Cas9 효소를 함유할 때, 37 →에서 1시간 동안 배양할 경우, 아가로스겔 전기영동을 통해 90 %의 pBR322 DNA가 분해됨을 확인하는 기능을 구현할 수 있다. 이런 반응계에서, 1 nmol의 기질(PvuII 선형화된 pBR322 DNA)을 1분 동안 촉매화하여 산물로 완전히 전환시키는 Cas9 효소량은 0.37 nmol이고, Cas9 효소 그램수는 59.57 ng이다. 상기 Cas9 효소의 효소 활성은 0.37 nmol(1 nmol의 기질을 1분 동안 촉매화하여 산물로 전환시키는 효소량)이다. 본 발명에서, NEB의 효소를 예로 들면, 상기 효소의 효소 활성은 0.37 nmol이다.
본 기술분야의 통상의 기술자는 본문에서 상기 Cas9 효소에 기반하여 Cas9 효소와 도입하고자 하는 gRNA의 몰비를 계산하고 복합체에 도입되는 Cas9 효소의 농도를 확인함을 이해할 수 있고, Cas9 효소의 활성이 변할 경우, 본 기술분야의 통상의 기술자는 상이한 효소의 설명서에서 활성에 대한 설명에 기반하여, 본문에서 결정한 비율에 기반하여 환산하여 Cas9 효소의 사용 농도, 및 이와 gRNA의 몰비를 선택할 수 있다.
본 기술분야의 통상의 기술자는 또한, 상기 효소의 효소 활성이 0.37 nmol인 Cas 효소는 단지 하나의 예일 뿐, 다른 Cas9 효소에 있어서, 효소의 효소 활성이 상기 Cas 효소와 상이할 경우, 본 기술분야의 통상의 기술자는 효소의 효소 활성으로 계산하여 Cas9 효소의 사용량, 및 이와 gRNA의 몰비를 확인할 수 있음을 이해할 수 있다.
구체적인 일 실시형태에서, 본 발명은 두 가지 유전자를 편집하는 방법에 관한 것이고, 구체적으로, Cas9 효소와 제1 gRNA의 복합체 1 및 Cas9 효소와 제2 gRNA의 복합체 2를 상기 세포에 도입하여 유전자 편집을 진행한다.
구체적인 일 실시형태에서, Cas9 효소, 제1 gRNA 및 제2 gRNA의 복합체 3을 동시에 상기 세포에 도입하여 유전자 편집을 진행한다.
구체적인 일 실시형태에서, 복합체 1 및 복합체 2를 먼저 상기 세포에 도입하여 유전자 편집을 진행한다.
상기 복합체 1 또는 복합체 2 또는 복합체 3에서, Cas9 효소와 gRNA의 몰비는 1:1 ~ 1:10이고, 바람직하게, 1:3 ~ 1:5이며, 더 바람직하게, 1:4이다.
예를 들어, 복합체 1 중 Cas9 효소와 gRNA의 몰비는 1:1 ~ 1:10이고, 바람직하게, 1:3 ~ 1:5이며, 더 바람직하게, 1:4이고, 복합체 2 중 Cas9 효소와 gRNA의 몰비는 1:1 ~ 1:10이고, 바람직하게, 1:3 ~ 1:5이며, 더 바람직하게, 1:4이다. 복합체 3에서, Cas9 효소와 제1 gRNA 및 제2 gRNA의 합의 몰비는 1:1 ~ 1:10이고, 바람직하게, 1:3 ~ 1:5이며, 더 바람직하게, 1:4이다.
본문에서, 상기 몰비는 Cas9 효소와 gRNA 물질의 양 사이의 비율을 의미하고, 여기서, Cas9 효소의 양 또는 효소 활성은 제조업체에서 제공한 Cas9 효소의 설명서에 기반하여 계산된 것이며, 대응되는 gRNA의 양은 RNA 염기 조성 및 체외 전사의 농도에 따라 계산된 것이다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 Cas 효소와 gRNA의 비율은 1:4이다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 세포는 진핵 세포이고; 구체적인 실시형태에서, 상기 진핵 세포는 면역 효과기 세포이며; 구체적인 실시형태에서, 상기 면역 효과기 세포는 T 세포이다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 Cas 효소와 gRNA의 복합체에서, 상기 Cas 효의 농도는 약 0.1 μM ~ 3 μM이고; 바람직하게, 약 0.125 μM ~ 3 μM이며; 더 바람직하게, 약 0.2 μM ~ 3 μM이고; 보다 더 바람직하게, 약 0.25 μM ~ 3 μM이며; 더 바람직하게, 약 0.5 μM ~ 3 μM이다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 Cas9 효소와 gRNA로 형성된 복합체 또는 복합체 1 또는 복합체 2 또는 복합체 3에서, 상기 Cas9 효소의 농도는 약 0.1 μM ~ 3 μM이고; 바람직하게, 약 0.125 μM ~ 3 μM이며; 더 바람직하게, 약 0.2 μM ~ 3 μM이고; 보다 더 바람직하게, 약 0.25 μM ~ 3 μM이며; 더 바람직하게, 약 0.5 μM ~ 3 μM이다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 Cas 효소와 gRNA의 복합체에서, 상기 Cas 효소의 농도는 약 0.1 μM ~ 2 μM이고; 바람직하게, 약 0.125 μM ~ 2 μM이며; 더 바람직하게, 약 0.5 μM ~ 2 μM이고; 더 바람직하게, 약 0.5 μM ~ 2 μM이며; 더 바람직하게, 약 0.5 μM ~ 2 μM이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 세포는 T 세포이고, 상기 CRISPR/Cas 시스템은 상기 T 세포의 유전자를 편집하며; 구체적인 일 실시형태에서, 상기 T 세포의 TCR의 α 사슬 및 β 사슬 중 어느 한 가닥 또는 두 가닥의 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하고; 구체적인 실시형태에서, TRAC에 대해 유전자 편집을 진행하며; 구체적인 실시형태에서, TRAC의 불변 영역에 대해 유전자 편집을 진행하고; 구체적인 실시형태에서, TRAC에 포함된 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 세포는 T 세포이고, 상기 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 상기 T 세포의 유전자를 편집하는 단계는,
상기 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 상기 T 세포의 TCR의 α 사슬 및 β 사슬 중 어느 한 가닥 또는 두 가닥의 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하고; 바람직하게, TRAC에 대해 유전자 편집을 진행하며; 더 바람직하게, TRAC의 불변 영역에 대해 유전자 편집을 진행하고; 보다 더 바람직하게, TRAC 중 SEQ ID NO: 45로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하며; 보다 더 바람직하게, TRAC에 포함된 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하는 단계; 및/또는
상기 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 상기 T 세포의 MHC 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하고, 바람직하게, B2M 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하며, 더 바람직하게, B2M 유전자 중 SEQ ID NO: 38로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하고, B2M 유전자에 포함된 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하는 단계를 포함한다.
구체적인 일 실시형태에서, SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열 중의 PAM 서열에 따라 gRNA를 설계한다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 gRNA는 약 15 ~ 50 bp이고, 바람직하게, 약 15 ~ 30 bp이며, 더 바람직하게, 약 17 ~ 21 bp이고, 보다 더 바람직하게 20 bp이다.
구체적인 일 실시형태에서, TRAC의 편집에 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 또는 5로 표시되는 서열이 포함되고; 바람직하게, 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 서열이 포함된다.
구체적인 일 실시형태에서, TRAC의 편집에 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 32, 33, 39 또는 40으로 표시되는 서열이 포함되고; 바람직하게, 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 2, 32 또는 33으로 표시되는 서열이 포함된다.
구체적인 일 실시형태에서, TRAC의 편집에 사용되는 gRNA는 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 32, 33, 39 또는 40으로 표시되는 서열이고; 바람직하게, 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 2, 32 또는 33으로 표시되는 서열이다.
구체적으로, 상기 제1 gRNA에는 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 32, 33, 39 또는 40으로 표시되는 서열이 포함될 수 있다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 Cas 효소의 농도는 약 0.1 μM ~ 0.5 μM이고; 바람직하게, 약 0.125 μM ~ 0.5 μM이며, 더 바람직하게, 약 0.25 μM ~ 0.5 μM이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 세포는 T 세포이고, 상기 CRISPR/Cas 시스템은 상기 T 세포의 B2M 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하며; 구체적인 실시형태에서, B2M 유전자에 포함된 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하고; 구체적인 실시형태에서, SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열 중의 PAM 서열에 따라 gRNA를 설계한다.
구체적인 일 실시형태에서, B2M 유전자의 편집에 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 11, 12, 13, 또는 14로 표시되는 서열이 포함되고; 바람직하게, 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 12로 표시되는 서열이 포함된다.
구체적인 일 실시형태에서, B2M 유전자의 편집에 사용되는 gRNA는 SEQ ID NO: 11, 12, 13, 또는 14로 표시되는 서열이고; 바람직하게, 사용되는 gRNA는 SEQ ID NO: 12로 표시되는 서열이다.
구체적으로, 상기 제2 gRNA에는 SEQ ID NO: 11, 12, 13, 또는 14로 표시되는 서열이 포함될 수 있다.
아래에서, 복합체 1, 복합체 2 또는 복합체 3에 대한 설명은 상술한 바와 같고, 제1 gRNA 및 제2 gRNA에 대한 설명도 상술한 바와 같으며, 복합체, 복합체 1, 복합체 2 또는 복합체 3은 상이한 복합체를 의미하고 그 번호는 임의의 우선순위가 없으며, 제1 gRNA 및 제2 gRNA도 마찬가지로 두 가지 상이한 gRNA를 의미하고, 한 가지 gRNA 및 다른 한 가지 gRNA로 표현할 수도 있는데, 즉 한 가지 gRNA에는 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 32, 33, 39 또는 40으로 표시되는 서열이 포함될 수 있고, 다른 한 가지 gRNA에는 SEQ ID NO: 11, 12, 13, 또는 14로 표시되는 서열이 포함될 수 있음을 이해해야 한다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 Cas 효소의 농도는 약 0.25 μM ~ 3 μM이고, 바람직하게, 약 0.5 μM ~ 3 μM이며, 보다 더 바람직하게, 약 1 μM ~ 3 μM이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 세포는 T 세포이고, 상기 CRISPR/Cas 시스템은 상기 T 세포의 TRAC 및 B2M 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하며; 구체적인 실시형태에서, TRAC 및 B2M 유전의 제1 엑손에 대해 유전자 편집을 진행한다.
구체적인 일 실시형태에서, TRAC 및/또는 B2M 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하고, TRAC 및/또는 B2M 유전자 침묵이 발생된다.
구체적인 일 실시형태에서, TRAC의 편집에 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 또는 5로 표시되는 서열이 포함되고, B2M 유전자의 편집에 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 11, 12, 13, 또는 14로 표시되는 서열이 포함되며; 바람직하게, TRAC의 편집에 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 서열이 포함되고, B2M 유전자의 편집에 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 12로 표시되는 서열이 포함된다.
구체적인 실시형태에서, 상기 gRNA는 약 15 ~ 50 bp이고, 바람직하게, 약 15 ~ 30 bp이며, 더 바람직하게, 약 20 bp이며; 구체적인 일 실시형태에서, 20 bp이다.
구체적인 일 실시형태에서, TRAC 및 B2M 유전자에 대해 유전자 편집을 진행할 경우, 사용되는 B2M을 편집하는 gRNA와 TRAC를 편집하는 gRNA의 비율은 약 1.5:1 ~ 0.5:1이고; 바람직하게, 약 1:1이다. 구체적인 일 실시형태에서, 상기 Cas 효소의 농도는 약 1 μM ~ 3 μ이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 T 세포에는 키메라 수용체, 외인성 시토카인, 억제성/활성화 수용체 또는 리간드, 공동자극 인자가 더 발현되어 있고; 구체적인 실시형태에서, 상기 T 세포에는 키메라 항원 수용체가 더 발현되어 있다.
본 발명의 제2 양태에서, CRISPR/Cas 시스템 기반의 T 세포의 TRAC 유전자에 대한 유전자 편집 방법을 제공하고, Cas 효소와 gRNA의 복합체를 상기 세포에 도입하여 유전자 편집을 진행하되, 여기서, Cas 효소와 gRNA의 비율은 1: 3 ~ 1:5이고; 구체적인 일 실시형태에서, 상기 Cas 효소는 Cas9 효소이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 T 세포의 TCR의 α 사슬 및 β 사슬 중 어느 한 가닥 또는 두 가닥의 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하고; 구체적인 실시형태에서, 상기 T 세포의 TRAC에 대해 유전자 편집을 진행하며; 구체적인 실시형태에서, 상기 T 세포의 TRAC의 불변 영역에 대해 유전자 편집을 진행하고; 구체적인 실시형태에서, 상기 T 세포의 TRAC에 포함된 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하며; 구체적인 실시형태에서, SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열 중의 PAM 서열에 따라 gRNA를 설계한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 Cas 효소와 gRNA의 비율은 1:4이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 Cas 효소의 농도는 약 0.1 μM ~ 0.5 μM이고; 바람직하게, 약 0.125 μM ~ 0.5 μM이며, 더 바람직하게, 약 0.25 μM ~ 0.5 μM이다.
구체적인 실시형태에서, TRAC의 편집에 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 또는 5로 표시되는 서열이 포함되고; 바람직하게, 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 서열이 포함된다.
구체적인 실시형태에서, TRAC를 편집할 경우, 상기 Cas 효소와 gRNA의 비율은 1:4이고; 상기 Cas 효소의 농도는 0.25 μM ~ 0.5 μM이며; 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 서열이 포함된다.
본 발명의 제3 양태에서, CRISPR/Cas 시스템 기반의 T 세포의 B2M 유전자에 대한 유전자 편집 방법을 제공하고, Cas 효소와 gRNA의 복합체를 상기 세포에 도입하여 유전자 편집을 진행하되, 여기서, Cas 효소와 gRNA의 비율은 1: 3 ~ 1:5이고; 구체적인 일 실시형태에서, 상기 Cas 효소는 Cas9 효소이다.
구체적인 실시형태에서, B2M 유전자에 포함된 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행한다.
구체적인 실시형태에서, SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열 중의 PAM 서열에 따라 gRNA를 설계한다. 구체적인 실시형태에서, 상기 Cas 효소와 gRNA의 비율은 1:4이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 Cas 효소의 농도는 약 0.25 μM ~ 3 μM이고, 바람직하게, 약 0.5 μM ~ 3 μM이며, 보다 더 바람직하게, 약 1 μM ~ 3 μM이다.
구체적인 실시형태에서, B2M 유전자의 편집에 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 11, 12, 13, 또는 14로 표시되는 서열이 포함되고; 바람직하게, 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 12로 표시되는 서열이 포함된다.
구체적인 실시형태에서, B2M 유전자를 편집할 경우, 상기 Cas 효소와 gRNA의 비율은 1:4이고; 상기 Cas 효소의 농는 1 μM ~ 3 μM이며; 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 12로 표시되는 서열이 포함된다.
본 발명의 제4 양태에서, CRISPR/Cas 시스템 기반의 T 세포의 TRAC 유전자 및 B2M 유전자에 대한 유전자 편집 방법을 제공하고, Cas 효소와 gRNA의 복합체를 상기 세포에 도입하되, 여기서, Cas 효소와 전체 gRNA의 비율은 1: 3 ~ 1:5이고; 구체적인 일 실시형태에서, 상기 Cas 효소는 Cas9 효소이다.
구체적인 실시형태에서, B2M 유전자에 포함된 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하고; 구체적인 실시형태에서, 구체적인 실시형태에서, SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열 중의 PAM 서열에 따라 gRNA를 설계한다.
구체적인 실시형태에서, TCR의 α 사슬 및 β 사슬 중 어느 한 가닥 또는 두 가닥의 사슬에 대해 유전자 편집을 진행하고; 구체적인 실시형태에서, TRAC에 대해 유전자 편집을 진행하며;
구체적인 실시형태에서, TRAC의 불변 영역에 대해 유전자 편집을 진행하고;
구체적인 실시형태에서, TRAC에 포함된 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하고; 구체적인 실시형태에서, 구체적인 실시형태에서, SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열 중의 PAM 서열에 따라 gRNA를 설계한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 Cas 효소와 전체 gRNA의 비율은 1:4이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 Cas 효소의 농도는 1 μM ~ 3 μM이다.
구체적인 실시형태에서, B2M 유전자의 편집과 TRAC의 편집에 사용되는 gRNA의 비율은 0.5:1 ~ 1.5:1이고, 바람직하게, 1:1이다.
구체적인 실시형태에서, B2M 유전자의 편집에 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 11, 12, 13, 또는 14로 표시되는 서열이 포함되고; 바람직하게, 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 12로 표시되는 서열이 포함된다.
구체적인 실시형태에서, TRAC의 편집에 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 또는 5로 표시되는 서열이 포함되고; 바람직하게, 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 서열이 포함된다.
구체적인 실시형태에서, 상기 Cas 효소와 전체 gRNA의 비율은 1:4이고; 상기 Cas 효소의 농도는 1 μM ~ 3 μM이며; 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 12로 표시되는 서열 및 SEQ ID NO: 2로 표시되는 서열이 포함된다.
구체적인 실시형태에서, 상기 제2 양태, 제3 양태, 제4 양태에 따른 T 세포에는 종양 항원 또는 병원체 항원을 식별하는 키메라 수용체가 더 발현되어 있으며, 상기 키메라 수용체는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 구비하고, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 표적 항원을 특이적으로 식별한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 표적 항원은 종양 항원이고, 상기 종양 항원은 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); CD171; CS-1; C형 렉틴 유사 분자-1; 갱글리어시드 GD3; Tn항원; CD19; CD20; CD 22; CD 30; CD 70; CD 123; CD 138; CD33; CD44; CD44v7/8; CD38; CD44v6; B7H3(CD276), B7H6; KIT(CD117); 인터류킨 13 수용체 서브 유닛 α(IL-13Rα); 인터류킨 11 수용체 α(IL-11R α); 전립선 줄기 세포 항원(PSCA); 전립선 특이적 막 항원(PSMA); 암배아 항원(CEA); NY-ESO-1; HIV-1 Gag; MART-1; gp100; 티로시나아제; 메소텔린; EpCAM; 프로테아제 세린21(PRSS21); 혈관내피성장인자 수용체; 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장인자 수용체 β(PDGFR-β); 발생단계 특이적 태아성 항원-4(SSEA-4); 세포 표면 관련 뮤신 1(MUC1), MUC6; 표피성장20인자 수용체 패밀리 및 이의 돌연변이체(EGFR , EGFR2 , ERBB3 , ERBB4 , EGFRvIII); 신경 세포 부착 분자(NCAM); 탄산무수화효소IX(CAIX); LMP2; A형 에프린 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴루이스 부착 분자(sLe); O-아세틸 GD2 갱글리어시드(OAcGD2); 갱글리어시드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer; TGS5; 고분자량 흑색종 관련 항원(HMWMAA); 엽산 수용체; 종양 혈관 내피 마커 251(TEM1/CD248); 종양 혈관 내피 마커 7 관련(TEM7R); Claudin6, Claudin18.2(CLD18A2) , Claudin18.1; ASGPR1; CDH16; 5T4; 8H9; αvβ6 인테그린; B세포 성숙화 항원(BCMA; CA9; κ경쇄(kappa light chain); CSPG4; EGP2, EGP40; FAP; FAR; FBP; 배아형 AchR; HLA-A1, HLA-A2; MAGEA1, MAGE3; KDR; MCSP; NKG2D 리간드; PSC1; ROR1; Sp17; SURVIVIN; TAG72; TEM1; 피브로넥틴; 테나신; 종양 괴사 부위의 암 배아 변이체; G 단백질 결합 수용체 클래스 C 그룹 5 멤버 D(GPRC5D); X 염색체 오픈 리딩 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나아제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이 유전자 1(PLAC1); globoH 글리코세라미드(glycoceramide)의 육탄당 부분(GloboH); 유방 분화 항원(NY-BR-1); 유로플라킨 2(uroplakin 2, UPK2); A 형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린 수용5체 β3 (ADRB3); 파넥신 3(pannexin 3, PANX3); G 단백질 결합 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합 유전자좌 K9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); T 세포 수용체 γ 대체 판독 프레임 단백질(TARP); 윌름스 종양 단백질(WT1); ETS 전위 변이 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리 멤버 1A(XAGE1); 안지오포이에틴 결합 세포 표면 수용체 2(Tie2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; p53 돌연변이10체; 인간 텔로머라제 역전사 효소(hTERT); 육종 전위 중단 점; 세포 사멸의 흑색종 억제제(ML-IAP); ERG(막관통 프로테아제 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 V(NA17); 페어 박스 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; V-myc 조류 골수증 바이러스 종양 유전자 신경 모세포종 유래 동족체(MYCN); Ras 동족체 패밀리 멤버 C(RhoC); 시토크롬 P450 1B1(CYP1B1); CCCTC 결합 인자 (아연 핑거 단백질) 유사 (BORIS); T 세포에 의해 식별되는 편평 세포 암종 항원 3(SART3); 페어 박스 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신(proacrosin) 결합 단백질 sp32(OYTES1); 림프구 특이 단백질 티로신 키나아제(LCK); A-키나제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 활막 육종 X 중단 점 2(SSX2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR); 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 서브 패밀리 멤버 2(LILRA2); CD300 분자 유사 패밀리 멤버 f(CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 멤버 A(CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF 유사 모듈 함유 뮤신 유사 호르몬 수용체 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸-3(GPC3); Fc 수용체 유사 5(FCRL5); 면역글로불린 람다 유사 펩타이드 1(IGLL1)로부터 선택되며;
구체적인 실시형태에서, 상기 표적 항원은 병원체 항원이고, 상기 병원체 항원은 바이러스, 세균, 진균, 원생 동물, 또는 기생충의 항원으로부터 선택되며; 일 실시예에서, 상기 바이러스 항원은 거대세포 바이러스 항원, EB 바이러스 항원, 인간 면역 결핍 바이러스 항원 또는 인플루엔자 바이러스 항원으로부터 선택된다.
구체적인 실시형태에서, 상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 항원 커플러(TAC)로부터 선택된다.
구체적인 실시형태에서, 상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 키메라 항원 수용체는,
(i) 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체, CD28 또는 CD8의 막관통 도메인, CD28의 공동자극 신호 도메인, 및 CD3ζ; 또는
(ii) 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체, CD28 또는 CD8의 막관통 도메인, CD137의 공동자극 신호 도메인, 및 CD3ζ; 또는
(iii) 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체, CD28 또는 CD8의 막관통 도메인, CD28의 공동자극 신호 도메인, CD137의 공동자극 신호 도메인, 및 CD3ζ를 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 키메라 수용체는 TAC이고,
(a) 항원 결합 도메인을 가지는 항체 도메인, 및 CD3에 결합하는 단일 사슬 항체를 포함하는 세포외 도메인;
(b) 막관통 도메인;
(c) 단백질 키나아제 LCK에 연결되는 세포내 도메인을 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 키메라 항원 수용체의 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 전장 항체, scFv, Fab, (Fab'), 또는 단일 도메인 항체이다.
본 발명의 제5 양태에서, 키메라 수용체가 발현되어 있는 T 세포를 제조하기 위한 상기 제2 양태, 제3 양태, 제4 양태에 따른 T 세포의 용도를 제공하고, 상기 키메라 수용체는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 구비하며, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 표적 항원을 특이적으로 식별한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 표적 항원은 종양 항원이고 또는 병원체 항원이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 표적 항원은 종양 항원이고, 상기 종양 항원은 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); CD171; CS-1; C형 렉틴 유사 분자-1; 갱글리어시드 GD3; Tn항원; CD19; CD20; CD 22; CD 30; CD 70; CD 123; CD 138; CD33; CD44; CD44v7/8; CD38; CD44v6; B7H3(CD276), B7H6; KIT(CD117); 인터류킨 13 수용체 서브 유닛 α(IL-13Rα); 인터류킨 11 수용체 α(IL-11R α); 전립선 줄기 세포 항원(PSCA); 전립선 특이적 막 항원(PSMA); 암배아 항원(CEA); NY-ESO-1; HIV-1 Gag; MART-1; gp100; 티로시나아제; 메소텔린; EpCAM; 프로테아제 세린21(PRSS21); 혈관내피성장인자 수용체; 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장인자 수용체 β(PDGFR-β); 발생단계 특이적 태아성 항원-4(SSEA-4); 세포 표면 관련 뮤신 1(MUC1), MUC6; 표피성장20인자 수용체 패밀리 및 이의 돌연변이체(EGFR , EGFR2 , ERBB3 , ERBB4 , EGFRvIII); 신경 세포 부착 분자(NCAM); 탄산무수화효소IX(CAIX); LMP2; A형 에프린 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴루이스 부착 분자(sLe); O-아세틸 GD2 갱글리어시드(OAcGD2); 갱글리어시드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer; TGS5; 고분자량 흑색종 관련 항원(HMWMAA); 엽산 수용체; 종양 혈관 내피 마커 251(TEM1/CD248); 종양 혈관 내피 마커 7 관련(TEM7R); Claudin6, Claudin18.2(CLD18A2), Claudin18.1; ASGPR1; CDH16; 5T4; 8H9; αvβ6 인테그린; B세포 성숙화 항원(BCMA); CA9; κ경쇄(kappa light chain); CSPG4; EGP2, EGP40; FAP; FAR; FBP; 배아형 AchR; HLA-A1, HLA-A2; MAGEA1, MAGE3; KDR; MCSP; NKG2D 리간드; PSC1; ROR1; Sp17; SURVIVIN; TAG72; TEM1; 피브로넥틴; 테나신; 종양 괴사 부위의 암 배아 변이체; G 단백질 결합 수용체 클래스 C 그룹 5 멤버 D(GPRC5D); X 염색체 오픈 리딩 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나아제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이 유전자 1(PLAC1); globoH 글리코세라미드(glycoceramide)의 육탄당 부분(GloboH); 유방 분화 항원(NY-BR-1); 유로플라킨 2(uroplakin 2, UPK2); A 형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린 수용5체 β3(ADRB3); 파넥신 3(pannexin 3, PANX3); G 단백질 결합 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합 유전자좌 K9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); T 세포 수용체 γ 대체 판독 프레임 단백질(TARP); 윌름스 종양 단백질(WT1); ETS 전위 변이 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리 멤버 1A(XAGE1); 안지오포이에틴 결합 세포 표면 수용체 2(Tie2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; p53 돌연변이10체; 인간 텔로머라제 역전사 효소(hTERT); 육종 전위 중단 점; 세포 사멸의 흑색종 억제제(ML-IAP); ERG(막관통 프로테아제 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 V(NA17); 페어 박스 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; V-myc 조류 골수증 바이러스 종양 유전자 신경 모세포종 유래 동족체(MYCN); Ras 동족체 패밀리 멤버 C(RhoC); 시토크롬 P450 1B1(CYP1B1); CCCTC 결합 인자 (아연 핑거 단백질) 유사 (BORIS); T 세포에 의해 식별되는 편평 세포 암종 항원 3(SART3); 페어 박스 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신(proacrosin) 결합 단백질 sp32(OYTES1); 림프구 특이 단백질 티로신 키나아제(LCK); A-키나제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 활막 육종 X 중단 점 2(SSX2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR); 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 서브 패밀리 멤버 2(LILRA2); CD300 분자 유사 패밀리 멤버 f(CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 멤버 A(CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF 유사 모듈 함유 뮤신 유사 호르몬 수용체 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸-3(GPC3); Fc 수용체 유사 5(FCRL5); 면역글로불린 람다 유사 펩타이드 1(IGLL1)로부터 선택되며;
구체적인 실시형태에서, 상기 표적 항원은 병원체 항원이고, 상기 병원체 항원은 바이러스, 세균, 진균, 원생 동물, 또는 기생충의 항원으로부터 선택되며; 일 실시예에서, 상기 바이러스 항원은 거대세포 바이러스 항원, EB 바이러스 항원, 인간 면역 결핍 바이러스 항원 또는 인플루엔자 바이러스 항원으로부터 선택된다.
구체적인 실시형태에서, 상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 항원 커플러(TAC)로부터 선택된다.
구체적인 실시형태에서, 상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이고;
구체적인 실시형태에서, 상기 키메라 항원 수용체는,
(i) 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체, CD28 또는 CD8의 막관통 도메인, CD28의 공동자극 신호 도메인, 및 CD3ζ; 또는
(ii) 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체, CD28 또는 CD8의 막관통 도메인, CD137의 공동자극 신호 도메인, 및 CD3ζ; 또는
(iii) 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체, CD28 또는 CD8의 막관통 도메인, CD28의 공동자극 신호 도메인, CD137의 공동자극 신호 도메인, 및 CD3ζ를 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 키메라 수용체는 TAC이고
(a) 항원 결합 도메인을 가지는 항체 도메인, 및 CD3에 결합하는 단일 사슬 항체를 포함하는 세포외 도메인;
(b) 막관통 도메인;
(c) 단백질 키나아제 LCK에 연결되는 세포내 도메인을 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 키메라 항원 수용체의 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 전장 항체, scFv, Fab, (Fab'), 또는 단일 도메인 항체이다.
본 발명에서, 전기적 전환 조건을 구체적으로 한정하지 않는데, 예를 들어, 상기 전기적 전환 조건은 예컨대 150 V ~ 600 V, 0.5 ms ~ 20 ms일 수 있고, 예를 들어, 바람직하게, 150 V ~ 300 V, 2 ms ~ 15 ms일 수 있다.
구체적인 일 실시형태에서, TCR 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하는 gRNA와 MHC 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하는 gRNA의 몰비는 약 1:5 ~ 5:1이고, 바람직하게, 1:2 ~ 2:1이며; 더 바람직하게, 약 1:1이다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 T 세포는 상기 양태에서 설명된 바와 같다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이고, 상기 키메라 항원 수용체는 상기 양태에서 설명된 바와 같다.
본 발명의 제7 양태는 상기 본 발명의 방법을 통해 구축되는 범용형 T 세포에 관한 것이다.
본 발명의 제8 양태는 TRAC 및/또는 B2M 유전자 침묵이 발생되는 범용형 T 세포에 관한 것이다.
구체적인 일 실시형태에서, TRAC 유전자 침묵은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열을 포함하는 서열에 대한 유전자 편집에 의해 구현되고, 더 바람직하게, TRAC 유전자 침묵은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열을 포함하는 SEQ ID NO: 45로 표시되는 서열에 대한 유전자 편집에 의해 구현되며;
B2M 유전자 침묵은 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열을 포함하는 서열에 대한 유전자 편집에 의해 구현되고, 더 바람직하게,B2M 유전자 침묵은 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열을 포함하는 SEQ ID NO: 38로 표시되는 서열에 대한 유전자 편집에 의해 구현된다.
구체적인 일 실시형태에서, TRAC 유전자 침묵은 gRNA가 SEQ ID NO: 2, 32 또는 33으로 표시되는 서열을 이용하여 TRAC 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하여 구현되고, B2M 유전자 침묵은 gRNA가 SEQ ID NO: 12로 표시되는 서열을 이용하여 B2M 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하여 구현된다.
구체적인 일 실시형태에서, 상기 T 세포에는 키메라 항원 수용체가 더 발현되어 있고, 바람직하게, 상기 T 세포에는 종양 항원 또는 병원체 항원을 식별하는 키메라 수용체가 더 발현되어 있으며, 상기 키메라 수용체는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 구비하고, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 표적 항원을 특이적으로 식별한다.
상기 T 세포는 상기 양태에서 설명된 바와 같다. 상기 키메라 항원 수용체는 상기 양태에서 설명된 바와 같다.
본 발명의 제9 양태는, SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 32, 33, 39, 40, 11, 12, 13, 또는 14 중 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 gRNA 구축물에 관한 것이다.
구체적인 일 실시형태에서, 본 발명의 gRNA 구축물은, SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 32, 33, 39 또는 40 중 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 및 SEQ ID NO: 11, 12, 13, 또는 14 중 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구체적인 일 실시형태에서, 본 발명의 gRNA 구축물은 SEQ ID NO: 2, 32 또는 33으로 표시되는 서열, 및/또는 SEQ ID NO: 12로 표시되는 서열로부터 선택되는 서열을 포함한다.
본 발명은 유전자 편집 기술을 이용하여 T 세포에 대해 변형을 진행하고, 여러 유전자에 대한 녹아웃을 통해 T 세포에서의 T 세포 항원 수용체(TCR) 및 주요조직 적합유전자 복합체(MHC)의 기능을 효과적으로 억제하며; TCR을 코딩하는 유전자는 TRAC이고, MHC I를 코딩하는 유전자는 B2M이다. Cas9/CRISPR 유전자 기술, 및 RNP(RNA 핵산 및 단백질 복합체)에 대한 전기적 전환 방식에 기반하여 개선 및 최적화함으로써, 단시간 내에 TRAC 및 B2M 이중 유전자를 한 번에 효율적으로 녹아웃할 수 있는데, 90 % 이상의 높은 녹아웃 효율에 도달한다.
도 1은 sgRNA와 TRAC 유전자 결합 부위 모식도이다.
도 2는 TRAC 녹아웃 효과에 대한 상이한 조성 비율의 RNP의 영향을 나타낸다.
도 3a, 도 3b는 TRAC 녹아웃 효과에 대한 상이한 gRNA 서열의 영향을 나타낸다.
도 4는 TRAC 녹아웃 효과에 대한 상이한 농도의 Cas9 효소의 영향을 나타낸다.
도 5는 gRNA와 B2M 유전자 결합 부위 모식도이다.
도 6은 B2M 유전자 녹아웃 효과에 대한 상이한 gRNA의 영향을 나타낸다.
도 7은 B2M 유전자 녹아웃 효과에 대한 상이한 농도의 Cas9 효소의 영향을 나타낸다.
도 8은 TRAC 및 B2M을 동시에 녹아웃할 경우, TRAC 및 B2M 이중 녹아웃에 대한 상이한 gRNA 조성 성분의 영향을 나타낸다.
도 9는 녹아웃 효율에 대한 표적 TRAC 및 B2M 유전자로 구성된 gRNA 혼합물과 Cas9 효소 사이에 형성된 RNP 복합체 농도의 영향을 나타낸다.
도 10(a) ~ (d)는 Tide 온라인 소프트웨어로 TRAC 및 B2M 유전자 돌연변이 효율을 예측한 것을 나타낸다.
도 11은 클론 시퀀싱으로 TRAC 및 B2M 유전자 돌연변이를 검증한 결과를 나타낸다.
도 12는 BCMA를 표적화하는 CAR T 세포 중 TRAC 및 B2M 유전자 녹아웃 효율을 나타낸다.
발명자는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 유전자 편집을 진행할 경우 gRNA의 선택, Cas9 효소와 gRNA의 비율 등이 편집 효율에 대한 영향이 아주 큰 것을 발견하였고, 이 기초상에서 본 발명을 완성하였다.
용어
본문에서 달리 정의되지 않은 한, 본문에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 유전자 치료, 생물 화학, 유전학 및 분자 생물학 분야의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본문에서 설명된 방법 및 재료와 유사하거나 등가적인 것은 모두 본 발명의 구현 또는 시험에 사용될 수 있고, 그 중 본문에서 설명된 것은 적합한 방법 및 재료이다. 본문에서 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 특허 및 다른 참조 문헌의 모든 내용은 참조로서 본문에 결합된다. 모순될 경우, 본 명세서에 포함된 정의를 기준으로 한다. 이 밖에, 달리 설명되지 않은 한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 설명적일 뿐 한정적이 아니다.
달리 설명되지 않은 한, 본 발명의 구현은 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자 변형 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 종래기술을 적용하는 것은 모두 본 기술분야의 기술 범위에 속한다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 해석되어 있다. 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology(FrederickM.AUSUBEL, 2000, Wileyand sonInc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition,(Sambrooketal, 2001, Cold Spring Harbor, NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited. , 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization(B. D. Harries & S. J. Higginseds. 1984); Transcription And Translation(B. D. Hames & S. J. Higginseds. 1984); Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY(J. Abelson 및 M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), 특히 Vols.154 및 155(Wuetal. eds.) 및 Vol.185, "Gene Expression Technology"(D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J. H. Miller 및 M. P. Caloseds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer 및 Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Hand book Of Experimental Immunology, 권 I-IV(D. M. Weir 및 C. C. Blackwell, eds., 1986); 및 Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)를 참조할 수 있다. 공개 내용에서, 보호하고자 하는 주제의 각 양태는 모두 범위 형태로 나타난다. 범위 형태의 설명은 편의성 및 간결함을 위한 것일 뿐, 보호하고자 하는 주제의 범위의 강제적 제한으로 해석되어서는 아니됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 모든 가능한 하위 범위 및 상기 범위 내의 단일 수치를 구체적으로 이미 공개한 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 값의 범위를 제공할 경우, 상기 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 중간 값 및 상기 범위 내의 임의의 다른 상기 또는 중간의 값은 모두 보호하고자 하는 주제 내에 속해야 하고 상기 범위의 상한과 하한도 보호하고자 하는 주제의 범위에 속해야 함을 이해해야 한다. 상기 범위의 상한과 하한을 명확하게 배제하지 않은 한, 상기 비교적 작은 범위는 이러한 비교적 작은 범위의 상한과 하한을 포함할 수 있고, 이들도 보호하고자 하는 주제의 범위에 속한다. 설정 범위가 하나 이상의 임계값을 포함할 경우, 보호하고자 하는 주제는 상기 임계값 중 하나 또는 2개를 배제한 범위도 포함한다. 이는 범위의 폭과 관계없이 적용된다.
본문에서 사용된 용어 "약”은 본 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 알 수 있는 각 값의 통상적인 오차 번위를 의미한다. 본문의 "약” 값 또는 변수는 상기 값 또는 변수 자체의 실시형태를 포함(설명)한다. 예를 들어, "약 X"관한 설명은 "X"에 관한 설명을 포함한다. 예를 들어, "약 " 또는 "포함”은 상기 기술분야의 실제 표준에 따라 편차가 1 이내 또는 1을 초과하는 것을 의미할 수 있다. 또는, "약 " 또는 "포함”은 10 %를 초과(즉, ±10 %)한 범위를 의미할 수 있다. 예를 들어, 약 5 μM은 4.5 μM과 5.5 μM 사이의 임의의 수치를 포함할 수 있다. 본원 발명과 출원 특허 범위에서 특정 값 또는 조성을 제공할 경우, 달리 설명되지 않은 한, "약” 또는 "포함”은 상기 특정 값 또는 조성의 허용 가능한 오차 범위 내인 것으로 가정해야 한다.
본문에 따른 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 설명되지 않은 한 상기 범위 내의 임의의 정수, 및 적절한 경우 이의 분수(예를 들어, 정수의 10분의 1 및 100분의 1)의 수치에 포함됨을 이해해야 한다.
본 발명을 더 잘 이해하도록, 관련 용어에 대해 하기와 같이 정의한다.
용어 "유전자 편집”은 특정 DNA 단편에 대한 녹아웃, 도입 등을 구현하기 위해 인간이 표적 유전자를 "편집”할 수 있는 것을 의미한다.
용어 "분자 침묵" 또는 "유전자 침묵"은 원래의 DNA를 손상시키지 않고 다양한 이유로 인해 유전자가 발현되거나 과소 발현되지 않는 현상을 의미한다. 유전자 침묵은 두 가지 수준에서 발생하는데, 하나는 DNA 메틸화, 이색 염색 및 위치 효과 등에 의해 야기되는 전사 수준에서의 유전자 침묵이고, 다른 하나는 전사 후 유전자 침묵, 즉 유전자 전사 후의 수준에서 표적 RNA에 대한 특이적 억제로 인한 안티센스 RNA, 공동 억제, 유전자 억제, RNA 간섭 및 마이크로 RNA 매개 번역 억제를 포함한 유전자 비활성화이다. CRISPR(Clustered regular interspaced short palindromicrepeats)은 짧은 회문 반복으로 정기적으로 클러스터링된다. Cas9 (CRISPRassociated nuclease)는 CRISPR 관련 뉴클레아제이며, CCRISPR/Cas9는 RNA에 의해 가이드된, Cas9 뉴클레아제를 사용하여 표적 유전자를 편집하는 새로운 기술이다.
"CRISPER/Cas9 시스템"은 Cas9 유전자를 코딩하는 서열, tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열 (예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr 페어링 서열("직접 반복”및 내인성 CRISPR 시스템 배경에서의 tracrRNA 가공의 부분 직접 반복을 포함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템 배경에서 "스페이서(spacer)"라고도 함, 즉 gRNA), 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사체를 포함하는, 전사체 및 Cas9 효소 유전자의 발현에 관여하거나 이의 활성을 가이드하는 다른 요소로 총칭한다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위(내인성 CRISPR 시스템의 배경에서 전방 영역이라고도 함)에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소를 특징으로 한다.
용어 "표적 서열"은 가이드 서열과 상보성을 갖는 서열을 의미하며, 표적 서열과 가이드 서열 사이의 상보적인 쌍은 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면 완전한 상보성은 필요하지 않습니다. 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드와 같은 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수있다.일부 실시예에서, 표적 서열은 세포의 세포핵 또는 세포질에 위치한다.
일반적으로 가이드 서열(gRNA)은 표적 서열과 혼성화하고 CRISPR 복합체와 상기 표적 서열의 서열 특이적 결합을 가이드하기에 충분한 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다.일부 실시예에서, 최적의 비교를 위해 적합한 비교 알고리즘이 사용되는 경우, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성의 정도는 약 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97.5 %, 99 % 또는 그 이상이다. 서열 비교를 위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 최적의 비교를 결정할 수 있으며, 그 비제한적인 구현예로 Smith-Waterman 알고리즘, Needleman-Wunsch 알고리즘, Burrows-Wheeler 변환 기반 알고리즘(예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign(Novocraft Technologies), ELAND(Illumina, 산티아고, 캘리포니아주), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 획득 가능) 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 획득 가능)를 포함한다.
일부 실시예에서, CRISPR 효소는 하나 이상의 이종 단백질 도메인(예를 들어, 상기 CRISPR 효소를 제외한 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 도메인)을 포함하는 융합 단백질의 일부이다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 다른 단백질을 포함할 수 있으며 선택적으로 2개의 도메인 사이의 연결 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 구현예에는 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 에피토프 태그의 비제한적인 구현예로는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 구현예로는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 겨자무과산화효소(HRP), 클로람페니콜아세틸트랜스퍼라제(CAT), β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자발적 형광 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. CRISPR 효소는 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있고, 상기 단백질 또는 단백질 단편은 DNA 분자에 결합되거나 다른 세포 분자에 결합되며, 이는 말토오스 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합물, GAL4 DNA 결합 도메인 융합물 및 단순 헤르페스 바이러스(HSV) BP16 단백질 융합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. CRISPR 효소를 함유하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있는 다른 도메인은 US 20110059502에 기재되어 있으며, 이는 본문에 참조로서 인용된다.
용어 "Cas9 효소"는 야생형 Cas9 또는 임의의 자연 발생 박테리아 Cas9 및 임의의 키메라, 돌연변이체, 동족체 또는 오르토로그를 포함하는 Cas9의 임의의 변형된 버전일 수 있다. Cas9 효소는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있으며 기능적 도메인에 대한 융합 유무에 관계없이 범용 DNA 결합 단백질로 사용될 수 있다. 이러한 돌연변이는 인위적으로 도입된 돌연변이이거나 기능획득 돌연변이 및 기능결실 돌연변이일 수 있다. 이들 돌연변이는 각각 RuvC 및 HNH 촉매 도메인에서 촉매 도메인(D10 및 H840) 중 하나의 돌연변이를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 예를 들어 NEB 사의 Cas9 효소를 사용할 수 있으며, 물론 본 기술분야의 통상의 기술자는 동일하거나 유사한 기능을 가진 다른 Cas9 효소를 선택할 수 있다. 본문에서 Cas9 효소가 구현할 수 있는 기능은 30 μl의 반응의 Cas9 효소 반응계(상기 반응계는 20 mM의 HEPES, 100 mM의 NaCl, 5 mM의 MgCl2, 0.1 mM의 EDTA를 포함하고, 온도는 25 →이며, pH는 6.5임)에서, 1 nM의 PvuII 선형화된 pBR322 DNA(표적 부위 CGCTTGTTTCGGCGTGGGTA), 40 nM의 sgRNA 및 20 nM의 Cas9 효소를 포함할 경우, 37 →에서 1 시간 동안 배양한 후 아가로스겔 전기영동을 통해 90 %의 pBR322 DNA가 분해되었음을 확인했다. 이 반응계에서, 1 nmol의 기질(PvuII 선형화된 pBR322 DNA)을 1분 동안 촉매화하여 생성물로 완전히 전환시키는 Cas9 효소의 양은 0.37 nmol이고 Cas9 효소의 양은 59.57 ng이다다. 상기 Cas9 효소의 효소 활성은 0.37 nmol(1 nmol의 기질을 1분 동안 촉매화하여 생성물로 전환시키는 효소의 양)이다.
본 기술분야의 통상의 기술자는 본문에서는 상기 Cas9 효소 활성에 기반하여 Cas9 효소와 도입할 gRNA의 몰비를 계산하고, 복합체에 도입되는 Cas9 효소의 농도를 확인함을 이해할 수 있고, Cas9 효소의 활성이 변할 경우,본 기술분야의 통상의 기술자는 상이한 효소에 대한 명세서에서의 활성에 대한 설명에 기반하여, 본문에서 결정된 비율에 기반하여 환산하여 Cas9 효소의 사용 농도, 및 이와 gRNA의 몰비를 선택할 수 있다.
일 양태에서, Cas 효소는 니카제이다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 Cas9는 mRNA 형태로 상기 세포에 전달된다. 이는 상기 효소의 일시적인 발현을 허용하여 독성을 감소시킨다. Cas9는 또한 Cas9 효소를 코딩하고 발현하는 뉴클레오티드 구축물의 세포에 전달될 수 있다. 이 밖에, Cas9는 유도형 프로모터의 제어하에 발현 될 수도 있다.
용어 CRISPR 및 Cas 효소는 달리 명시되지 않는 한 일반적으로 본문에서 호환하여 사용할 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 본문에 사용된 많은 잔기 번호는 화농연쇄상구균의 II 형 CRISPR 유전자좌로부터의 Cas9 효소를 의미한다. 그러나, 본 발명은 SpCas9, SaCa9, St1Cas9 등과 같은 다른 미생물 종으로부터 더 많은 Cas9를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 관련된 아미노산 서열을 비교함으로써 SpCas9 이외의 Cas9 효소에서 적절한 상응하는 잔기를 결정할 수 있을 것이다. 용어 sgRNA는 짧은 gRNA를 의미한다. 유전자 편집을 진행할 경우, 주어진 gRNA, tracr 페어링 서열 및 tracr 서열을 별도로 제공하거나 완전한 RNA 서열을 제공할 수 있다. Cas9 단백질과 gRNA의 결합은 특이한 부위에서 DNA를 절단할 수 있다. 화농연쇄상구균으로부터 유래된 CRISPR/Cas 시스템 인식 서열은 23bp이며 20bp를 표적화할 수 있다. 인식 부위의 마지막 3 개의 NGG 서열을 PAM(protospacer neighbor motif) 서열이라고 한다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 Cas 효소, CRISPR 효소, CRISPR 단백질, Cas 단백질 및 CRISPR Cas는 일반적으로 호환하여 사용할 수 있다.
Cas 유전자 변형은 담체(예를 들어, AAV, 아데노바이러스, 렌티바이러스) 및/또는 입자 및/또는 나노 입자 및/또는 전기 전달에 의해 전달될 수 있다.
일 실시예에서, CRISPER/Cas 기술은 TCR의 α 및 β 사슬 중 하나 또는 둘 모두의 불변 영역에서 상응하는 코딩 유전자의 엑손을 녹아웃하여 내인성 TCR이 비활성화되도록 사용되며, 바람직하게는 내인성 TCRα 사슬의 불변 영역의 제1 엑손이 녹아웃되도록 표적화된다.
B2M 또는 TCR의 발현을 "억제” 또는 "저지”한다는 것은 세포 중 B2M 또는 TCR의 발현이 적어도 1 %, 적어도 5 %, 적어도 10 %, 적어도 20 %, 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %가 감소됨을 의미한다. 보다 구체적으로, B2M의 발현을 "억제” 또는 "저지”한다는 것은 세포 중 B2M의 함량이 적어도 1 %, 적어도 5 %, 적어도 10 %, 적어도 20 %, 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %가 감소됨을 의미한다. 세포 중 단백질의 발현 또는 함량은 B2M 또는 TCR 특이적 항체를 사용하여 ELISA, 면역 조직 화학, 웨스턴 블롯팅(Western Blotting) 또는 유세포 분석과 같은 보노 기술분야에 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "변형"은 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드의 상태 또는 구조의 변화를 의미한다. 변형 방식은 화학적, 구조적, 기능적일 수 있다. T 세포 수용체(TCR)는 항원 제시에 대한 반응으로 T 세포 활성화에 참여하는 세포 표면 수용체이다. TCR은 일반적으로 2개의 사슬 α 및 β로 구성되며, 이는 결합하여 이종 이량체를 형성하고 상기 CD3 형질 도입 서브 유닛과 결합하여 세포 표면에 존재하는 T 세포 수용체 복합체를 형성할 수 있다. TCR의 α 사슬 및 β 사슬은 면역글로불린 유사 N-말단 가변 영역(V) 및 불변 영역(C), 소수성 막관통 도메인 및 짧은 세포질 영역으로 구성된다. 면역글로불린 분자의 경우, V(D)J 재조합에 의해 α 사슬과 β 사슬의 가변 영역이 생성되므로, T 세포 집단에서 대량의 다양한 항원 특이성이 생성된다. 그러나, 완전한 항원을 인식하는 면역글로불린과는 달리, T 세포는 MHC 분자와 연관된 가공된 펩티드 단편에 의해 활성화되고, T 세포를 추가적인 차원을 항원 인식에 도입하는 것을 MHC 제한이라고 한다. T 세포 수용체를 통해 공여체와 수용체 사이의 MHC 차이를 인식하면 세포 증식과 GVHD의 잠재적인 발달로 이어진다. TCR의 정상적인 표면 발현은 복합체의 7 개 구성 요소 모두의 시너지 합성 및 조립에 의존하는 것으로 아려졌다(Ashwell and Klusner 1990). TCRα 또는 TCRβ의 비활성화는 T 세포 표면에서 TCR을 제거하여 동종 항원 및 그에 따른 GVHD의 인식을 방지할 수 있다.
용어 "MHC"는 생체 적합성 복합체의 항원을 코딩하는 모든 유전자 그룹의 총칭인 조직 적합성 복합체이다. MHC 항원은 모든 고등 척추 동물의 조직에서 발현되며 인간 세포에서 HLA 항원이라고 한다. 반응에서 중요한 역할을 하고, 거부는 이식된 조직 표면의 조직 적합성 항원에 반응하는 T 세포에 의해 매개된다. MHC 단백질은 T 세포 자극에서 중요한 역할을 한다. 항원 제시 세포(일반적으로 수지상 세포)는 MHC의 세포 표면에서의 외인성 단백질의 분해 산물에 속하는 펩티드를 표시하며, 공동자극 신호가 있는 경우 T 세포가 활성화되고 동일한 펩티드/MHC 복합체를 표시하는 표적 세포에 작용한다. 예를 들어, 자극된 T 헬퍼 세포는 MHC에 결합된 항원을 표시하는 대식 세포를 표적화하거나, 세포 독성 T 세포(CTL)가 외인성 바이러스 펩티드를 표시하는 바이러스에 감염된 세포에 작용한다. MHC 항원은 NHC 클래스 I 항원과 MHC 클래스 II 항원으로 나뉜다. 인간에서 클래스 I HLA 유전자 클러스터는 3 개의 주요 유전자좌 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C와 여러 개의 부차적인 유전자좌를 포함한다. 클래스 II HLA 클러스터에는 HLA-DP, HLA-DQ 및 HLA-DR의 세 가지 주요 유전자좌도 포함된다.
용어 "인간 백혈구 항원"( Human leukocyte antigen, HLA)은 일련의 밀접하게 연결된 유전자좌를 포함하는 6번 염색체(6p21.31)에 위치한 인간 주요조직 적합유전자 복합체의 코딩 유전자이며, 인간 면역계의 기능과 밀접하게 관련된다. HLA에는 클래스 I, 클래스 II 및 클래스 III 유전자 부분이 포함된다. HLA 클래스 I 및 클래스 II 유전자에 의해 발현되는 항원은 세포막에 위치하며 MHC-I(HLA-A, HLA-B, HLA-C 부위 코딩) 및 MHC-II (HLA-D 영역 코딩)이다. 클래스 I는 인체의 모든 세포 표면에 거의 분포하며 중쇄(α 쇄)와 β2-마이크로글로불린(B2M)으로 구성된 이종 이량체이고, II 형은 주로 대식 세포와 B 림프구의 표면에 위치한 당 단백질이다.
용어 "B2M"은 MHC 클래스 I 분자의 경쇄인 B2M으로도 알려진 β-2 마이크로 글로불린이다. 인간에서, B2M은 6번 염색체에 있는 유전자 클러스터로서 위치한 다른 MHC 유전자와 달리 15번 염색체에 위치한 b2m 유전자에 의해 코딩된다. β-2 마이크로 글로불린 결핍의 마우스 모델은 B2M이 MHC 클래스 I의 세포 표면 발현 및 펩티드 결합 홈의 안정성에 필요함을 나타낸다. 또한 β-2 마이크로 글로불린 유전자의 표적화된 돌연변이로 인해 정상 세포 표면 MHC I 발현이 결핍한 마우스로부터의 조혈 이식편이 정상 마우스의 NK1.1+세포에 의해 거부되는데, 이는 MHC I 분자 결함 발현이 골수 세포가 숙주 면역 체계에 의해 쉽게 거부되게 만듬을 나타낸다(Bix et al. 1991).
따라서, 동종 반응성이 낮은 T 세포를 제공하기 위해, 본 발명에서 제공하는 T 세포는 하나의 TCR 유전자와 하나의 HLA 유전자를 불활성화 또는 돌연변이시킨 T 세포를 포함한다.
상기 "TCR 비활성화"는 내인성 TCR이 적어도 하나의 서브 유닛 유전자를 비활성화하는 것을 의미하고, 특히 TCRα 및/또는 TCRβ 유전자를 비활성화하고, 더 바람직하게, TCRα 유전자를 비활성화한다.
상기 "MHC 비활성화"는 내인성 MHC가 적어도 하나의 서브 유닛 유전자를 비활성화하는 것을 의미하고, 특히 MHC I의 유전자를 비활성화하고, 더 바람직하게, B2M 유전자를 비활성화한다.
용어 "T 세포 항원 커플러(T CELL ANTIGEN COUPLER, TAC)"는, 단일 사슬 항체, 설계된 안키린 반복 단백질(designed ankyrin repeat protein, DARPin) 또는 다른 표적화 그룹 2를 포함하는 종양 표적화 도메인; CD3에 결합하는 단일 사슬 항체로 인해 TAC 수용체가 다른 TCR 수용체에 가깝도록 하는 세포외 도메인; 막관통 도메인 및 CD4 공동 수용체의 세포내 도메인인 3 개의 기능적 도메인을 포함하고, 여기서, 세포 내부 도메인은 단백질 키나아제 LCK에 연결되어 있고, T 세포 활성화의 초기 단계로서 TCR 복합체의 면역 수용체 티로신 활성화 모티프(ITAM)의 인산화를 촉매화한다.
본문에서 사용된 용어 "활성화"는 및 문법적으로 다른 형태는 세포가 휴지 상태에서 활성 상태로 전환되는 과정을 의미할 수 있다. 이 과정에는 항원, 이동 및/또는 기능적 활동 상태의 표현형 또는 유전적 변화에 대한 반응이 포함될 수 있다. 예를 들어, 용어 "활성화"는 T 세포의 점진적인 활성화 과정을 의미할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 완전히 활성화되기 위해 적어도 2개의 신호가 필요할 수 있다. 제1 신호는 TCR이 항원-MHC 복합체에 의해 결합된 후에 발생할 수 있으며 제2 신호는 공동자극 분자의 접합을 통해 발생할 수 있다(표 1에 나열된 공동자극 분자를 참조). 체외에서, 항-CD3는 상기 제1 신호를 시뮬레이션할 수 있고, 항-CD28은 상기 제2 신호를 시뮬레이션할 수 있다. 예를 들어, 조작된 T 세포는 발현된 CAR에 의해 활성화될 수 있다. 본문에 사용된 T 세포 활성화 또는 T 세포 트리거링은 검출 가능한 세포 증식, 사이토카인 생산 및/또는 검출 가능한 효과기 기능을 유도하기에 충분히 자극된 T 세포의 상태를 의미할 수 있다.
용어 "키메라 수용체"는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 유전자 재조합 기술을 사용하여 상이한 유래의 DNA 단편 또는 단백질에 대응되는 cDNA를 연결함으로써 형성된 융합 분자를 의미한다. 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR), 변형된 T 세포(항원) 수용체(TCR), T 세포 융합 단백질(TFP) 및 T 세포 항원 커플러(TAC)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "공동자극 리간드"는 T 세포에서의 동일성 공동자극 분자에 특이적으로 결합하여 신호를 제공하는 항원 제시 세포(예를 들어, aAPC, 수지상 세포, B 세포 등)에서의 분자를 포함하고, 예를 들어, TCR/CD3 복합체와 펩티드가 로딩된 MHC 분자의 조합에 의해 제공되는 제1 신호는 증식, 활성화, 분화 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 T 세포 반응을 함께 매개한다. 공동자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L, PD-L2, 4-1BBL, OX40L 및 유도형 공동자극 리간드(ICOS-L), 세포 간 접착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림프 독소 β 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, Toll 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 공동자극 리간드는 또한 특히 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 등 T 세포에 존재하는 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
용어 "공동자극 분자”는 공동자극 리간드에 특이적으로 결합하는 T 세포에서의 동일성 결합 배우체를 의미하고, 이는 증식에 한정되지 않는 T 세포의 공동자극 반응을 매개한다. 공동자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "공동자극 신호”는 TCR/CD3과 같은 세포 자극성 신호 분자와 결합되거나 조합되어 T 세포 증식 및/또는 주요 분자의 상향 조절 또는 하향 조절을 유도하는 신호를 의미한다.
용어 "키메라 항원 수용체” 또는 "CAR"은 T 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 면역 세포에 의해 발현될 수 있는 공학 분자를 의미할 수 있다. CAR은 T 세포에서 발현되고 T 세포를 리디렉션하여 인공 수용체에 의해 결정된 특이성을 가진 표적 세포의 사멸을 유도할 수 있다. CAR의 세포외 결합 도메인은 뮤린, 인간화 또는 완전 인간 단일 클론 항체로부터 유래될 수 있다. 이가 면역 효과기 세포에 있을 경우, 상기 세포는 표적 세포(일반적으로 암세포)에 대해 특이성을 제공하고, 세포내 신호 발생 능력을 구비한다. CAR은 일반적으로 적어도 하나의 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 신호 전달 도메인(본문에서 "세포내 신호 전달 도메인”이라고도 함)을 포함하고, 이는 하기와 같이 정의되는 자극성 분자 및/또는 공동자극 분자로부터 유래되는 기능성 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩티드 그룹은 서로 인접된다. 폴리펩티드 그룹은 이합체화 분자가 존재할 경우 폴리펩티드를 서로 커플링시킬 수 있는 이합체화 스위스를 포함하는데, 예를 들어, 항원 결합 도메인을 세포내 신호 전달 도메인에 커플링시킬 수 있는 이합체화 스위스를 포함한다. 하나의 양태에서, 자극성 분자는 T 세포 수용체 복합물과 결합되는 ζ 사슬이다. 하나의 양태에서, 세포질 신호 전달 도메인은 하기와 같이 정의되는 적어도 하나의 공동자극 분자로부터 유래되는 하나 또는 복수 개의 기능성 신호 전달 도메인을 더 포함한다. 하나의 양태에서, 공동자극 분자는 예컨대 4-1BB(즉 CD137), CD27 및/또는 CD28 등 본문에 따른 공동자극 분자로부터 선택된다. 하나의 양태에서, CAR은 키메라 융합 단백질을 포함하고, 상기 융합 단백질은 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 자극성 분자로부터 유래되는 기능성 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서, CAR은 키메라 융합 단백질을 포함하고, 상기 융합 단백질은 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 공동자극 분자로부터 유래되는 기능성 신호 전달 도메인과 자극성 분자로부터 유래되는 기능성 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서에서, CAR은 키메라 융합 단백질을 포함하고, 상기 융합 단백질은 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 또는 복수 개의 공동자극 분자로부터 유래되는 2개의 기능성 신호 전달 도메인을 포함한다.
용어 "신호 전달 도메인”은 세포내 전달 정보를 통해 작용을 일으키는 단백질의 기능성 부분을 의미하고, 제2 메신저를 생성하거나 이러한 메신저에 응답하여 효과기로 작용하여 결정된 신호 전달 경로를 통해 세포의 활성을 조절한다.
용어 "세포” 및 어법에서의 다른 형태는 인간 또는 비인간 동물로부터 유래된 세포일 수 있다. 조작된 세포는 CAR을 발현할 수 있는 세포를 의미할 수도 있다.
용어 "형질감염"은 외인성 핵산을 진핵 세포에 도입하는 것을 의미한다. 형질감염은 인산칼슘-DNA 공침, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 폴리브렌 매개 형질 감염, 전기 천공, 미세 주입, 리포좀 융합, 지질 형질감염, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염 및 유전자총법(biolistics)을 포함하는 본 기술분야에 공지된 다양한 수단에 의해 구현될 수 있다.
용어 "안정한 형질감염" 또는 "안정적으로 형질감염"은 외인성 핵산, DNA 또는 RNA를 형질감염된 세포의 게놈에 도입하고 통합하는 것을 의미한다. 용어 "안정한 형질감염체"는 외래 DNA를 게놈 DNA에 안정적으로 통합하는 세포를 의미한다.
용어 "핵산 분자 코딩", "DNA 서열 코딩" 및 "DNA 코딩"은 데옥시리보핵산 사슬을 따른 데옥시리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 의미한다. 이러한 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드(단백질) 사슬을 따라 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서 핵산 서열은 아미노산 서열을 코딩한다.
용어 "대상"은 포유동물 또는 유대동물와 같은 임의의 동물을 의미한다. 본 발명의 개체는 인간, 비인간 영장류 동물(예를 들어, 붉은 털 원숭이 또는 다른 유형의 원숭이), 마우스, 돼지, 말, 당나귀, 소, 양, 래트 및 모든 종류의 가금을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "말초 혈액 단핵 세포"( peripheral blood mononuclear cell, PBMC)는 림프구, 단핵 세포 등을 포함하는 말초 혈액에 단핵 핵이 있는 세포를 의미한다.
용어 "T 세포 활성화" 및 문법적으로 다른 형태는 검출 가능한 세포 증식, 사이토카인 생성 및/또는 검출 가능한 효과기 기능을 유도하기에 충분히 자극된 T 세포의 상태를 의미할 수 있다. 일부 경우, "완전한 T 세포 활성화"는 T 세포의 세포 독성을 유발하는 것과 유사할 수 있다. 본 기술분야에 알려진 다양한 측정을 사용하여 T 세포 활성화를 측정할 수 있다. 상기 측정은 사이토카인 분비를 측정하기 위한 ELISA, ELISPOT, 세포내 사이토카인 발현을 측정하기 위한 유세포 분석(CD107), 증식을 측정하기 위한 유세포 분석, 및 표적 세포 제거를 결정하기 위한 세포 독성 측정(51Cr 방출 측정)일 수 있다. 상기 측정은 일반적으로 대조군과 비교한 조작된 세포의 상대적 활성화를 결정하기 위해 조작된 세포(CAR T)와 비교되는 대조군(조작되지 않은 세포)을 사용한다. 이 밖에, 상기 측정은 표적 항원을 발현하지 않는 표적 세포와 함께 배양되거나 접촉된 조작된 세포와 비교할 수 있다. 예를 들어, 상기 비교는 GPC3를 발현하지 않는 표적 세포와 함께 배양된 GPC3-CART 세포와의 비교일 수 있다.
뉴클레오티드 서열을 지칭하기 위해 사용되는 경우, 본문에서 사용된 용어 "서열" 및 문법적으로 다른 형태는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있으며 단일 사슬 또는 이중 사슬일 수 있다. 핵산 서열은 돌연변이될 수 있다. 핵산 서열은 임의의 길이를 가질 수 있다.
본문에서 사용된 용어 "유효량”은 치료 또는 예방적 이점을 제공하는 양을 의미한다.
본문에서 사용된 용어 "발현 담체"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 효과적으로 연결된 발현 조절 서열을 함유하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 함유하는 담체를 의미한다. 발현 담체는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소(cis-acting elements)를 포함하며, 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 체회 발현 시스템에 의해 제공될 수 있다. 발현 담체에는 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 네이키드 또는 리포솜에 포함됨) 및 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)와 같은 본 기술분야에 알려진 모든 것이 포함된다.
본문에서 사용된 용어 "렌티바이러스"는 레트로바이러스과의 속을 의미한다. 레트로바이러스는 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있는 측면에서 레트로바이러스 중에서 독특하다. 많은 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA에 전달할 수 있으므로 유전자 전달 담체에 가장 효과적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 구현예이다. 렌티 바이러스로부터 유래된 담체는 생체 내에서 상당한 수준의 유전자 전이를 달성하는 수단을 제공한다.
본문에서 사용된 용어 "담체"는 분리된 핵산을 함유하는 조성물이며 분리된 핵산을 세포 내부로 전달하는데 사용될 수 있다. 선형 폴리뉴클레오타이드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 담체가 본 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "담체"는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 폴리리신 화합물, 리포좀 등과 같은 핵산의 세포로의 전이를 촉진하는 비 플라스미드 및 비 바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 담체의 구현예는 아데노바이러스 담체, 아데노 관련 바이러스 담체, 레트로바이러스 담체 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본문에서 사용된 용어 서열 "동일성"은 비교 창(예를 들어, 적어도 20개의 위치)에 걸쳐 2 개의 가장 잘 매칭되는 서열을 비교함으로써 동일성 백분율을 결정하며, 여기서 비교 창에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는, 가장 잘 매칭되는 2개의 서열에 대한 참조 서열(추가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20 % 이하의 간격(예를 들어, 5 ~ 15 % 또는 10 ~ 12 %)과 같은 추가 또는 결실(즉, 간격)을 포함할 수 있다. 백분율은 일반적으로 2개의 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 개수를 결정하여 정확한 매칭 위치의 개수를 산출하여 계산하고, 정확한 매칭 위치의 개수를 참조 서열 중의 위치 개수(즉, 창의 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 생성한다.
본문에서 사용된 용어 "외인성"은 세포내에서 내인성 발현이 없거나 과발현될 때 갖는 기능을 달성하기에 발현 수준이 불충분한 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, "외인성"은 세포내에서 발현되는 재조합 핵산 분자 또는 폴리펩티드, 예컨대 외인성, 이종성 및 과발현된 핵산 분자 및 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "내인성"은 생물체 자체 게놈 내의 유전자로부터 유래된 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체이다. 본문에서 사용된 용어 "키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR)"는 T 세포를 활성화할 수 있는 세포내 신호 전달 도메인에 융합된 종양 항원 결합 도메인을 의미한다. 흔히, CAR의 세포외 결합 도메인은 마우스 또는 인간화 또는 인간 단일 클론 항체로부터 유래된다.
키메라 항원 수용체는 일반적으로 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 완전히 인간의 것일 수 있다. 다른 경우, 세포외 항원 결합 도메인은 인간화될 수 있다. 다른 경우, 세포외 항원 결합 도메인은 뮤린 유래일 수 있거나, 세포외 항원 결합 도메인의 키메라는 적어도 2 개의 상이한 동물의 아미노산 서열로 구성된다. 일부 실시형태에서, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 비인간의 것일 수 있다. 다양한 항원 결합 도메인을 설계할 수 있다. 비 제한적인 구현예는 항체로부터 유래 된 단일 사슬 가변 단편(scFv), 라이브러리로부터 선택된 단편의 항원 결합 도메인(Fab), 단일 도메인 단편, 또는 이들의 동족 수용체와 결합하는 천연 리간드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 scFv, Fab 또는 천연 리간드 및 이들의 임의의 유도체를 포함할 수 있다. 세포외 항원 결합 도메인은 완전한 항체의 일부를 포함할 수 있고 완전한 항체가 결합하는 항원에 결합할 수 있는 완전한 항체 이외의 분자를 의미할 수 있다. 항체 단편의 구현예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab') 2; 이중 기능 항체, 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자(예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로 형성된 다중 특이적 항체를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. scFv, Fab 또는 천연 리간드와 같은 세포외 항원 결합 도메인은 항원 특이성을 결정하는 CAR의 일부일 수 있다. 세포외 항원 결합 도메인은 어떤 상보적 표적에도 결합할 수 있다. 세포외 항원 결합 도메인은 알려진 가변 영역 서열을 갖는 항체로부터 유래될 수 있다. 세포외 항원 결합 도메인은 획득 가능한 마우스 하이브리도마로부터 얻은 항체 서열로부터 얻을 수 있다. 또는, 세포외 항원 결합 도메인은 종양 세포 또는 종양 침윤 림프구(TIL)와 같은 일차 세포로부터 전장 절단 시퀀싱을 통해 얻을 수 있다.
일부 경우, 세포외 항원 결합 도메인의 결합 특이성은 경쇄 CDR 또는 중쇄 CDR과 같은 상보성 결정 영역 또는 CDR에 의해 결정될 수 있다. 많은 경우, 결합 특이성은 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR에 의해 결정될 수 있다. 다른 참조 항원과 비교하여, 주어진 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR의 조합은 주어진 결합 포켓을 제공할 수 있으며, 이는 항원(예를 들어, GPC3)에 더 큰 친화력 및/또는 특이성을 부여할 수 있다. 예를 들어, 글리피칸-3에 특이적인 CDR은 CAR의 세포외 결합 도메인에서 발현될 수 있으므로 GPC3을 표적화하는 CAR은 GPC3을 발현하는 종양 세포에 T 세포를 표적화할 수 있다.
본문에 개시된 임의의 실시형태의 일부 측면에서, 세포외 항원 결합 도메인, 예컨대 scFv는 항원에 특이적인 경쇄 CDR을 포함할 수 있다. 경쇄 CDR은 CAR과 같은 항원 결합 단위의 scFv 경쇄의 상보성 결정 영역일 수 있다. 경쇄 CDR은 연속적인 아미노산 잔기 서열, 또는 비-상보성 결정 영역(예를 들어, 프레임워크 영역)에 의해 분리된 2 개 이상의 연속적인 아미노산 잔기 서열을 포함 할 수 있다. 일부 경우, 경쇄 CDR은 경쇄 CDR-1, CDR-2 등으로 지칭될 수 있는 2 개 이상의 경쇄 CDR을 포함할 수 있다. 일부 경우, 경쇄 CDR은 각각 경쇄 CDR-1, 경쇄 CDR-2 및 경쇄 CDR-3으로 지칭될 수 있는 3 개의 경쇄 CDR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 공통 경쇄에 존재하는 CDR 그룹을 경쇄 CDR이라고 총칭할 수 있다.
본문에 개시된 임의의 실시형태의 일부 측면에서, 세포외 항원 결합 도메인, 예컨대 scFv는 항원에 특이적인 중쇄 CDR을 포함할 수 있다. 중쇄 CDR은 항원 결합 단위, 에를 들어 scFv 중쇄의 상보성 결정 영역일 수 있다. 중쇄 CDR은 아미노산 잔기의 연속적인 서열, 또는 비-상보성 결정 영역(예를 들어, 프레임워크 영역)에 의해 분리된 2 개 이상의 아미노산 잔기의 연속적인 서열을 포함 할 수 있다. 일부 경우, 중쇄 CDR은 중쇄 CDR-1, CDR-2 등으로 지칭될 수 있는 2 개 이상의 중쇄 CDR을 포함할 수 있다. 일부 경우, 중쇄 CDR은 각각 중쇄 CDR-1, 중쇄 CDR-2 및 중쇄 CDR-3으로 지칭될 수 있는 3 개의 중쇄 CDR을 포함할 수 있다. 일부 경우, 공통 중쇄에 존재하는 CDR 그룹을 중쇄 CDR이라고 총칭할 수 있다.
유전자 공학을 이용하여 세포외 항원 결합 도메인을 다양한 방식으로 변형할 수 있다. 일부 경우, 세포외 항원 결합 도메인은 세포외 항원 결합 도메인이 그의 표적에 대해 더 높은 친화력을 갖도록 선택될 수 있도록 돌연변이될 수 있다. 일부 경우, 표적에 대한 세포외 항원 결합 도메인의 친화력은 정상 조직에서 낮은 수준으로 발현될 수 있는 표적을 최적화할 수 있다. 이 최적화는 잠재적인 독성을 최소화하기 위해 진행될 수 있다. 다른 경우, 표적의 막 결합 형태에 대해 더 높은 친화력을 갖는 세포외 항원 결합 도메인의 클론은 용해성 형태 대응물보다 우수할 수 있다. 다양한 수준의 용해성 형태의 표적도 검출될 수 있고 표적화가 바람직하지 않은 독성을 유발할 수 있기 때문에 이러한 변형이 가능하다.
일부 경우, 세포외 항원 결합 도메인은 힌지 또는 스페이서를 포함한다. 힌지와 스페이서라는 용어는 서로 호환하여 사용할 수 있다. 힌지는 세포외 항원 결합 도메인에 유연성을 제공하는데 사용되는 CAR의 일부로 간주될 수 있다. 일부 경우, 힌지는 세포의 세포 표면에서의 CAR을 검출하는데 사용될 수 있는데, 특히 세포외 항원 결합 도메인을 검출하는 항체가 비 효과적이거나 이용 가능한 경우에 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린으로부터 유래된 힌지의 길이는 세포외 항원 결합 도메인이 표적화하는 표적에서의 에피토프 위치에 따라 최적화되어야 할 수 있다.
일부 경우, 힌지는 면역글로불린에 속하지 않을 수 있지만 CD8α 분자의 자연 힌지와 같은 다른 분자에 속할 수 있다. CD8α 힌지는 CD8 공동 수용체와 MHC 분자의 상호 작용에서 역할을 하는 것으로 알려진 시스테인 및 프롤린 잔기를 포함할 수 있다. 시스테인 및 프롤린 잔기는 상기 CAR의 성능에 영향을 미칠 수 있다. CAR 힌지는 크기를 조절할 수 있다. T 세포와 표적 세포 사이의 면역 시냅스 형태는 또한 세포 표면 표적 분자에서의 막 원단 에피토프로 인해 CAR이 기능적 브리징을 진행할 수 없는 거리를 한정하는데, 짧은 힌지 CAR을 사용하여도 시냅스 거리가 신호가 전도 될 수 있는 대략적인 값에 도달하지 못한다. 마찬가지로, 막의 근단 CAR 표적 에피토프는 긴 힌지 CAR의 배경에서만 신호를 관찬할 수 있다. 사용되는 세포외 항원 결합 도메인에 따라 힌지를 조절할 수 있다. 힌지의 길이는 임의의 길이일 수 있다. 막관통 도메인은 CAR을 세포의 원형질막에 고정시킬 수 있다. CD28의 천연 막관통 부분은 CAR에 사용될 수 있다. 다른 경우에, CD8α의 천연 막관통 부분도 CAR에 사용될 수 있다. "CD8"은 NCBI 참조 번호: NP_001759 또는 자극 활성이 있는 이의 단편과 적어도 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 동일성을 갖는 단백질일 수 있다. "CD8 핵산 분자"는 CD8 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 경우, 막관통 도메인은 CD28의 천연 막관통 부분일 수 있다. "CD28"은 NCBI 참조 번호: NP_006130 또는 자극 활성이 있는 이의 단편과 적어도 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 동일성을 갖는 단백질일 수 있다. "CD28 핵산 분자"는 CD28 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 경우, 막관통 부분이 CD8α 영역을 포함할 수 있다. CAR의 세포내 신호 도메인은 CAR이 배치된 T 세포의 효과기 기능 중 적어도 하나를 활성화하는 역할을 할 수 있다. CAR은 T 세포의 효과기 기능을 유도할 수 있으며, 예를 들어, 상기 효과기 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 세포 용해 활성 또는 보조 활성이다. 따라서, 용어 "세포내 신호 도메인"은 효과기 기능 신호를 전달하고 세포가 특정 기능을 수행하도록 안내하는 단백질의 일부를 의미한다. 전체 세포내 신호 전달 도메인이 일반적으로 사용될 수 있지만, 많은 경우 신호 전달 도메인의 전체 사슬을 사용할 필요는 없다. 어떤 경우, 세포내 신호 전달 도메인의 잘린 부분이 사용된다. 일부 경우, 용어 세포내 신호 전달 도메인은 따라서 효과기 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호 전달 도메인의 임의의 잘린 부분을 포함하도록 의도된다.
CAR에서 사용되는 신호 도메인의 바람직한 구현예는 T 세포 수용체(TCR) 세포질 서열, 및 표적-수용체에 결합한 후 신호 전달을 시작하기 위해 협동적으로 작용하는 공동 수용체, 및 이들의 임의의 유도체 또는 변이체 서열 및 동일한 기능성을 가지는 이러한 서열의 임의의 합성 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우, 상기 세포내 신호 도메인은 알려진 면역 수용체 티로신 활성화 모티프(ITAM) 신호 모티프를 포함할 수 있다. 세포질 신호 전달 서열을 포함하는 ITAM의 구현예에는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d의 DAP10 또는 DAP12의 단백질로부터 유래된 기능적 신호 전달 도메인을 포함한다. 그러나 바람직한 실시형태에서, 세포내 신호 도메인은 CD3ζ 사슬로부터 유래된다. 하나 이상의 ITAM 모티프를 포함하는 T 세포 신호 도메인의 구현예는 T 세포 수용체 T3ζ 사슬 또는 CD247로도 알려진 CD3ζ 도메인이다. 상기 도메인은 T 세포 수용체-CD3 복합체의 일부이며, 여러 세포내 신호 전달 경로의 항원 인식과 T 세포의 주 효과 활성화를 결합하는 측면에서 중요한 역할을 한다. 본문에서 사용된 바와 같이, CD3ζ는 주로, 실질적으로 동일한 서열을 갖는 단백질을 포함하는 Swissprot 엔트리 P20963에서 공지된 바와 같이 주로 인간 CD3ζ 및 이의 동형을 의미한다. 키메라 항원 수용체의 일부로서 다시 한 번 전체 T 세포 수용체 T3ζ 사슬이 필요하지 않으며, T 세포 수용체 T3ζ 사슬의 신호 도메인을 포함하는 임의의 유도체(이의 기능적 등가물 포함)는 모두 적합하다.
세포내 신호 전달 도메인은 표 1의 도메인 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 일부 경우, 참조 도메인과의 동일성이 약 50 % 내지 약 100 %가 될 수 있도록 도메인을 변형할 수 있다. 표 1의 도메인 중 어느 하나는 변형된 형태가 약 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% , 99 % 또는 최대 약 100 %의 동일성을 포함할 수 있도록 변형될 수 있다. CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 하나 이상의 공동자극 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 세포내 신호 전달 도메인은 ζ 사슬(1 세대 CAR) 또는, CD28 또는 4-1BB(2 세대 CAR)와의 조합과 같은 단일 공동자극 도메인을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 CD28/OX40 또는 CD28/4-1BB(3 세대)와 같은 2개의 공동자극 도메인을 포함할 수 있다.
CD8과 같은 세포내 신호 도메인과 함께, 이러한 공동자극 도메인은 키나제 경로의 다운스트림 활성화를 생성하여 유전자 전사 및 기능적 세포 반응을 지원할 수 있다. CAR의 공동자극 도메인은 CD28(포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 3-키나제) 또는 4-1BB/OX40(TNF-수용체 관련 인자 링크 단백질) 경로 및 MAPK 및 Akt 활성화와 관련된 근단 신호 단백질을 활성화할 수 있다.
일부 경우, CAR에 의해 생성된 신호는 보조 또는 공동자극 신호와 결합될 수 있다. 공동자극 신호 도메인의 경우, 키메라 항원 수용체 유사 복합체는 여러 가능한 공동자극 신호 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 본 기술분야에 잘 알려진 바와 같이, 미숙한 T 세포에서, T 세포 수용체 결합만으로는 T 세포의 세포 독성 T 세포로의 완전한 활성화를 유도하기에 충분하지 않다. 완전한 생산성 T 세포의 활성화에는 제2 공동자극 신호가 필요하다. CD28, OX40, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11a / CD18), 4-1BBL, MyD88 및 4-1BB를 포함하지만 이에 한정되지 않는 T 세포 활성화를 위한 공동자극을 제공하는 여러 수용체가 보고되었다. 이러한 공동자극 분자에 의해 사용되는 신호 전달 경로는 모두 마스터 T 세포 수용체 활성화 신호와 함께 협동적으로 작용할 수 있다. 이러한 공동자극 신호 전달 영역에서 제공하는 신호는 하나 이상의 ITAM 모티프(예를 들어, CD3zeta 신호 전달 도메인)로부터 유래된 주 효과 활성화 신호와 협력할 수 있으며, T 세포 활성화에 대한 요구를 완성할 수 있다.
일부 경우, 키메라 항원 수용체 유사 복합체에 공동자극 도메인을 추가하면 조작된 세포의 효능 및 내구성을 향상시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, T 세포 신호 도메인 및 공동자극 도메인은 서로 융합되어 신호 전달 도메인을 형성한다.
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본문에서 사용된 용어 "조절"은 양성 또는 음성 변화를 의미한다. 조정의 예로는 1 %, 2 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % 또는 100 % 변경을 포함한다.
본문에서 사용된 용어 "치료"는 사람을 변화시키려고 시도하거나 세포에 의해 유발되는 질환을 치료하는 과정에서 임상적 개입을 의미하며, 이는 임상 병리학적 과정에서 예방 또는 개입에 사용될 수 있다. 치료 효과에는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상 감소, 질환의 직간접적 병리학적 결과 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도 저하, 병세 개선 또는 완화, 예후 완화 또는 개선 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
T 세포
본문에 기재된 T 세포는 본 발명의 방법에 의해 변형된 T 세포를 의미하고, 상기 T 세포의 내인성 TCR 유전자 및/또는 MHC 유전자 침묵이 발생된다.
일부 경우, T 세포는 CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L+ (L-셀렉틴), CD27+, CD28+ 및/또는 IL-7Rα+로 구성된 기억 줄기 TSCM 세포일 수 있고, 상기 기억 줄기 세포는 또한 CD95, IL-2Rβ, CXCR3 및/또는 LFA-1을 발현할 수 있으며, 상기 기억 줄기 세포와 다른 많은 기능적 속성을 보여준다. 또는, 면역 반응성 세포는 또한 L-셀렉틴 및 CCR7을 함유하는 중추 기억 TCM 세포일 수 있으며, 여기서 중추 기억 세포는 예를 들어 IFNγ 또는 IL-4가 아닌 IL-2를 분비할 수 있다. 면역 반응성 세포는 또한 L-셀렉틴 또는 CCR7을 포함하는 효과기 기억 TEM 세포일 수 있으며, 예를 들어 IFNγ 및 IL-4와 같은 효과기 사이토카인을 생성한다.
담체는 일반적으로 전신 투여(예를 들어, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하 또는 두개 내 주입)에 의해 전달되거나, 하기 기재된 바와 같이 대상 환자에게 투여함으로써 국소 적용된다. 또는, 담체는 대상 환자로부터 제거된 세포(를 들어, 림프구, T 세포, 골수 흡인물, 조직 생검)와 같은 생체 외 세포에 전달될 수 있으며, 다음 일반적으로 상기 담체에 통합된 세포를 선택한 후 다시 환자의 체내에 이식한다. 선택 전후에 세포를 증폭할 수 있다.
상기 T 세포는 PBMC, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직 및 감염 부위, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양의 조직을 포함한 많은 조직으로부터 얻을 수 있다. 일부 경우, FicollTM 분리와 같이 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 대상으로부터 수집된 혈액으로부터 T 세포를 얻을 수 있다. 일 실시형태에서, 대상의 순환 혈액으로부터의 세포는 단일 혈액 수집에 의해 얻어진다. 단일 수집 제품은 일반적으로 T 세포, 단핵 세포, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함한 림프구를 포함한다. 일 실시형태에서, 단일 수집에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하기 위해 세척되고 후속 가공 단계를 위해 적합한 완충액 또는 배지에 배치될 수 있다. 또는 암 진단을 받은 환자의 건강한 공여체로부터 세포를 추출할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 상이한 표현형 특징을 갖는 혼합 세포 집단의 일부일 수 있다. 전술한 방법에 따라 형질전환된 T 세포로부터 세포주를 얻는 것도 가능하다. 세포는 세포 치료 은행에서도 얻을 수 있다.
일부 경우, 적합한 일차 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 말초 혈액 림프구(PBL) 및 T 세포, 자연 살해 세포, 단핵 세포, 자연 킬러 T 세포, 단핵 세포 전구 세포, 조혈 줄기 세포 또는 비만능 줄기 세포와 같지만 이에 한정되지 않는 다른 혈액 세포 하위 집단을 포함합니. 일부 경우, 세포는 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 임의의 다른 유형의 T 세포와 같은 종양 침윤 세포(TIL)와 같은 임의의 T 세포일 수 있다. T 세포는 또한 기억 T 세포, 기억 줄기 T 세포 또는 효과기 T 세포를 포함할 수 있다. 전혈에서 T 세포를 선택하는 것과 같이 대규모 집단에서 T 세포를 선택할 수도 있다. T 세포는 또한 대규모 집단에서 증폭될 수도 있다. T 세포는 또한 특정 집단과 표현형에 경향이 있을 수 있다. 예를 들어, T 세포는 CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+) 및/또는 IL-7Rα(+)를 포함하는 표현형에 경향이 있을 수 있다. 적합한 세포는 CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+) 및/또는 IL-7Rα(+)에서 하나 이상의 마커에서 선택될 수 있다. 적합한 세포는 또한 줄기 세포, 예를 들어 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 적합한 세포는 인간 세포, 비인간 세포 및/또는 마우스 세포와 같은 임의의 수의 일차 세포를 포함할 수 있다. 적합한 세포는 전구 세포일 수 있다. 적합한 세포는 치료할 대상 (예를 들어, 환자)으로부터 유래될 수 있다.
환자에게 필요한 치료적으로 유효한 세포의 양은 세포의 생존력과 세포가 유 전적으로 변형되는 효율(예를 들어, 전이 유전자가 하나 이상의 세포에 통합되는 효율, 또는 전이 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현 수준)에 따라 달라질 수 있다. 일부 경우, 유전자 변형 후 세포 생존력의 산물(예를 들어, 배가) 및 전이 유전자가 통합되는 효율은 피험자에게 투여하기 위해 이용 가능한 세포의 치료량에 해당될 수 있다. 일부 경우, 유전자 변형 후 세포 생존력의 증가는 치료를 받을 때 환자에게 효과적인 필요한 세포의 양의 감소에 해당될 수 있다. 일부 경우, 전이 유전자를 하나 이상의 세포에 통합하는 효율의 증가는 환자에게 치료적 효과를 제공하는데 필요한 세포 수의 감소에 해당될 수 있다. 일부 경우, 필요한 치료적으로 유효한 세포의 양을 결정하는 것은 시간에 따른 세포의 변화와 관련된 기능을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, 필요한 치료적으로 유효한 세포의 양을 결정하는 것은 기능을 결정하는 것은 시간 관련 변수에 따라 하나 이상의 세포에 전이 유전자를 통합하는 효율 변화에 해당되는 기능(예를 들어, 세포 배양 시간, 전기 천공 시간, 세포 자극 시간)을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우, 치료적으로 유효한 세포는 세포 표면에서 약 30 % 내지 약 100 %의 키메라 수용체의 발현을 포함하는 세포 집단일 수 있다. 일부 경우, 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같이, 치료적으로 유효한 세포는 세포 표면에서 키메라 수용체를 약 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 %, 99.9 % 또는 약 99.9 % 이상을 발현할 수 있다.
약학 조성물
본 발명의 T 세포는 약학 조성물을 제조하는데 응용될 수 있다. 상기 약학 조성물은 유효량의 T 세포를 포함하는 이외에, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수도 있다. 용어 "약학적으로 허용 가능한”은 분자 실체 및 조성물이 동물 또는 인간에게 적절하게 투여될 때 유해, 알레르기 또는 다른 유해 반응을 일으키지 않음을 의미한다.
약학적으로 허용 가능한 담체 또는 이의 성분으로 사용될 수 있는 일부 물질의 구체적인 예는 항산화제, 방부제, 발열원이 없는 물, 등장성 염 용액 및 인산염 완충액 등이다.
본 발명의 조성물은 필요에 따라 다양한 제형으로 제조될 수 있으며, 의사는 환자의 유형, 연령, 체중, 일반적인 질환 상태, 투여 방식 등 요인에 따라 환자에게 유익한 복용량을 결정할 수 있다. 투여 방식은 예를 들어 비경구 투여(예를 들어, 주사) 또는 다른 치료 방식일 수 있다.
조성물의 "비경구" 투여는 예를 들어 피하(s.c.), 정맥 내(i.v.), 근육 내(i.m.) 또는 흉골 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
대상에게 투여되는 T 세포 집단 함유 제제는 특정 적응증 또는 질환을 치료 및/또는 예방하는데 효과적인 다수의 T 세포를 포함한다. 따라서, 치료적으로 유효한 면역 반응성 세포 집단을 대상에게 투여할 수 있다. 일반적으로, 약 1Х104 내지 약 1Х1010개의 면역 반응성 세포를 포함하는 제제를 투여한다. 대부분의 경우, 제제는 약 1Х105 내지 약 1Х109개의 면역 반응성 세포, 약 5Х105 내지 약 5Х108개의 면역 반응성 세포, 또는 약 1Х106 내지 약 1Х107개의 면역 반응성 세포를 포함한다. 그러나, 암의 위치, 원인, 신원, 정도 및 중증도, 치료받을 개인의 연령 및 신체 상태 등에 따라 대상에게 투여되는 CAR 면역 반응성 세포의 수는 광범위하게 달라질 수 있다. 의사는 최종적으로 사용할 적절한 복용량을 결정한다다.
일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체를 사용하여 면역 세포 매개 면역 반응을 자극한다. 예를 들어, T 세포 매개 면역 반응은 T 세포 활성화에 관한 면역 반응이다. 활성화된 항원 특이적 세포 독성 T 세포는 종양 항원을 표시하는 암 세포와 같이 표면에 외인성 항원 에피토프를 표시하는 표적 세포에서 세포 사멸을 유도할 수 있다. 다른 실시형태에서, 키메라 항원 수용체를 사용하여 포유동물에서 항 종양 면역을 제공한다. T 세포 매개 면역 반응으로 인해 피험자는 항 종양 면역을 생성할 것이다.
일부 경우, 암을 앓고 있는 피험자를 치료하는 방법은 치료를 필요로 하는 피험자에게 본 발명의 하나 이상의 T 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 T 세포는 종양 표적 분자와 결합하여 암 세포 사멸을 유도할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 치료적 유효량의 T 세포를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 병원체 감염을 치료하는 방법을 더 제공한다.
항 종양 약물과 병용
일부 실시형태에서, 본 발명의 T 세포는 다른 치료제와 병용하여 투여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 다른 치료제는 화학요법 약물이다. 본 발명의 T 세포과 병용할 수 있는 화학용법 약물은 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 노비빈(TM)(비노렐빈, 5'-탈수소 황화물)을 포함하는 유사 분열 억제제(빈카알칼로이드); CamptosarTM(이리노테칸 HCL), HycamtinTM(토포테칸 HCL) 및 캠프토테신 및 그 유사체로부터 유래된 다른 화합물을 포하하는 캠프토테신 화합물과 같은 토포이소머라아제 I 억제제; 에토포사이드, 테니포사이드 및 미독시조즈와 같은 포도필로톡신 유도체; 알킬화제시스플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌티오포스포라미드, 카르무스틴, 부설판, 클로람부실, 브리퀴 진, 우라실머스타드, 클로프로펜 및 다카르바진; 시타라빈, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 메르캅토퓨린, 아자티오프린 및 프로카르바진을 포하는 항 대사 산물; 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 마이시노마이신, 미토마이신, 사르코마이신 C 및 다우노루비신을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항생제; 및 항 종양 항체, 다카르바진, 아자시티딘, 암사캄, 멜팔란, 이포스파미드 및 미톡산트론을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 화학요법 약물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 T 세포와 병용할 수 있는 화학요법 약물은 항-VEGF 항체(인간화 및 키메라 항체, 항-VEGF 앱타머 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함), 및 안지오스타틴, 엔도스타틴, 인터페론, 레티노산 및 메탈로프로테이나제-1 및 -2의 조직 억제제와 같은 다른 혈관 신생 억제제를 포함하는 혈관 신생 억제제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
키트
본 발명은 본 발명의 T 세포를 포함하는 키트를 더 제공한다. 상기 키트는 암, 병원체 감염, 면역 병증 또는 동종 이식을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 단위 투여 형태를 포함하는 유효량의 T 세포를 함유하는 치료 또는 예방 조성물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 치료 또는 예방 조성물을 포함할 수 있는 멸균 용기를 포함한다.
일부 경우, 키트는 약 1Х104개의 세포 내지 약 1Х106개의 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우, 키트는 적어도 약 1Х105개의 세포, 적어도 약 1Х106개의 세포, 적어도 약 1Х107개의 세포, 적어도 약 4Х107개의 세포, 적어도 약 5Х107개의 세포, 적어도 약 6Х107개의 세포, 적어도 약 6Х107 개의 세포, 8Х107개의 세포, 적어도 약 9Х107개의 세포, 적어도 약 1Х108개의 세포, 적어도 약 2Х108 개의 세포, 적어도 약 3Х108개의 세포, 적어도 약 4Х108개의 세포, 적어도 약 5Х108개의 세포, 적어도 약 6Х108개의 세포, 적어도 약 6Х108세포, 적어도 약 8Х108개의 세포, 적어도 약 9Х108세포, 적어도 약 1Х109개의 세포, 적어도 약 2Х109개의 세포, 적어도 약 3Х109개의 세포, 적어도 약 4Х109개의 세포, 적어도 약 5Х109개의 세포, 적어도 약 6Х109개의 세포, 적어도 약 8Х109개의 세포, 적어도 약 9Х109개의 세포, 적어도 약 1Х1010개의 세포, 적어도 약 2Х1010개의 세포, 적어도 약 3Х1010개의 세포, 적어도 약 4Х1010개의 세포, 적어도 약 5Х1010개의 세포, 적어도 약 6Х1010개의 세포, 적어도 약 9Х1010개의 세포, 적어도 약 9Х1010개의 세포, 적어도 약 1Х1011개의 세포, 적어도 약 2Х1011개의 세포, 적어도 약 3Х1011 개의 세포, 적어도 약 4Х1011개의 세포, 적어도 약 5Х1011개의 세포, 적어도 약 8Х1011개의 세포, 적어도 약 9Х1011개의 세포, 또는 적어도 약 1Х1012개의 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 약 5Х1010개의 세포를 포함할 수 있다.
일부 경우, 키트는 동종 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우, 키트는 게놈 변형된 세포를 포할 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우, 키트는 "이미 갖추어진" 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우, 키트는 임상 용도로 증폭할 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우, 키트는 연구 목적의 내용물을 포함할 수 있다.
본 발명의 장점
본 발명의 방법에 따라 유전자 편집을 진행하면, 편집 효율이 높을 뿐만 아니라, 세포 생존율도 매우 좋다.
아래, 구체적인 실시예와 결부시켜 본 발명을 더 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하지 않음을 이해해야 한다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 주명하지 않은 실험 방법은 일반적으로 Sambrook.J. 등의 편저 "분자 클론 실험 지침서, 제3 판, 과학출판사, 2002"에 기재된 조건, 또는 제조업체에서 권장하는 조건을 따를 수 있다.
예시적으로, 하기 실시예에서, T 세포를 선택하여 본 발명의 방법을 설명한다.
T 세포의 획득: 건강한 기증자로부터 채취한 말초 혈액에서 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하고 CD3/CD28 항체 결합 비드(beads)를 첨가하여 활성화 한 다음 배양 및 증폭하여 T 세포를 얻는다.
실시예 1. TRAC 유전자를 표적화하는 sgRNA의 설계 및 합성
TRAC(TCRαC, T 세포 수용체α불변 유전자좌) 유전자의 첫 번째 엑손(뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시됨)에 대해, 도 1에 도시된 바와 같이, TRAC 유전자를 표적화하는 8가닥의 sgRNA 서열인 sg-TRAC-1(SEQ ID NO:2), sg-TRAC-2(SEQ ID NO:3), sg-TRAC-3(SEQ ID NO:4), sg-TRAC-4(SEQ ID NO:5), sg-TRAC-5(SEQ ID NO:32), sg-TRAC-6(SEQ ID NO:33), sg-TRAC-7(SEQ ID NO:39) 및 sg-TRAC-8(SEQ ID NO:40)을 설계하여 획득한다.
sg-TRAC-1(SEQ ID NO:2), sg-TRAC-2(SEQ ID NO:3), sg-TRAC-3(SEQ ID NO:4), sg-TRAC-5(SEQ ID NO:32), sg-TRAC-6(SEQ ID NO:33), sg-TRAC-7(SEQ ID NO:39) 및 sg-TRAC-8(SEQ ID NO:40)을 선택하여 실험한다. 체외에서 SEQ ID NO: 20 및 21로 표시되는 프라이머를 합성하고, 체외에서 gRNA 전사 키트(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하여 sg-TRAC-1을 전사 및 증폭해내며; 체외에서 SEQ ID NO: 22 및 23으로 표시되는 프라이머를 합성하고, 체외에서 gRNA 전사 키트(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하여 sg-TRAC-2를 전사 및 증폭해내며; 체외에서 SEQ ID NO: 24 및 25로 표시되는 프라이머를 합성하고, 체외에서 gRNA 전사 키트(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하여 sg-TRAC-3을 전사 및 증폭해내며, 체외에서 SEQ ID NO: 34 및 35로 표시되는 프라이머를 합성하고, 체외에서 gRNA 전사 키트(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하여 sg-TRAC-5를 전사 및 증폭해내며, 체외에서 SEQ ID NO: 36 및 37로 표시되는 프라이머를 합성하고, 체외에서 gRNA 전사 키트(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하여 sg-TRAC-6을 전사 및 증폭해내며, 체외에서 SEQ ID NO: 41 및 42로 표시되는 프라이머를 합성하고, 체외에서 gRNA 전사 키트(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하여 sg-TRAC-7을 전사 및 증폭해내며, 체외에서 SEQ ID NO: 43 및 44로 표시되는 프라이머를 합성하고, 체외에서 gRNA 전사 키트(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하여 sg-TRAC-8을 증폭해낸다.
TRAC-exon 1 서열(SEQ ID NO:1):
AACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGG ATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGA CAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTA AGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGA CTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCA
sg-TRAC-1(SEQ ID NO:2): AGAGTCTCTCAGCTGGTACA
sg-TRAC-2(SEQ ID NO:3): TCTCTCAGCTGGTACACGGC
sg-TRAC-3(SEQ ID NO:4): GAGAATCAAAATCGGTGAAT
sg-TRAC-4(SEQ ID NO:5): CTCTCAGCTGGTACACGGCA
sg-TRAC-5(SEQ ID NO:32): GTCTCTCAGCTGGTACA
sg-TRAC-6(SEQ ID NO:33): AGTCTCTCAGCTGGTACA
sg-TRAC-7(SEQ ID NO:39): TTAGAGTCTCTCAGCTGGTACA
sg-TRAC-8(SEQ ID NO:40): TTTAGAGTCTCTCAGCTGGTACA
실시예 2. 녹아웃 효율에 대한 상이한 Cas9 효소와 sg-TRAC의 비율의 영향
T 세포를 취해 세포 계수를 진행하고, 세포 밀도를 2Х107/ml로 조정한다. sg-TRAC-1(SEQ ID NO:2)을 선택하여 sgRNA로 사용한다.
각각 1:2, 1:3, 1:4 및 1:5의 몰비로 Cas9 효소(NEB에서 구입)와 sg-TRAC-1을 혼합하여 RNP 복합체를 형성한다. 실온에서 10분 동안 배양한 후, 1Х106의 T 세포(Cas9 효소의 최종 농도는 0.3 μM임)에 넣는다. 여기서, sg-TRAC-1의 몰수는 gRNA의 염기 조성 및 4.03 μg/μl(OD260/OD280=1.98)의 농도에 기반하여 계산한다.
BTX 전기 천공 기기(Harvard Apparatus)를 사용하여 RNP 복합체를 T 세포에 도입하며, 전기 천공 매개 변수는 250 V, 5 ms이다. 형질감염 5일째에, TCR 녹아웃의 효율을 검증하기 위해 T 세포를 취해 CD3 항체(BD Biosciences) 유세포 분석 염색을 진행한다. 유세포 분석 결과는 도 2 및 표 1에서 보여준 바와 같이, Cas 9 효소와 sg-TRAC-1의 몰비가 1:3 ~ 1:5일 때 녹아웃 효율은 70 % 이상이다. Cas9 효소와 sg-TRAC-1의 몰비가 1:4 일 때 녹아웃 효율이 가장 높아 87.2 %에 이르렀다. Cas 9 효소와 gRNA의 몰비가 1:4 일 때 최적의 유전자 녹아웃 효과를 가진다.
Figure pct00002
실시예 3. TRAC 유전자 녹아웃에 대한 상이한 sgRNA의 영향
TRAC 유전자를 표적화하는 3가닥의 상이한 sgRNA인 sg-TRAC-1, sg-TRAC-2, sg-TRAC-3을 선택하여, TRAC 유전자 녹아웃에 대한 영향을 측정한다. 실시예 1에서 합성한 sg-TRAC-1, sg-TRAC-2, sg-TRAC-3인 3가닥의 sgRNA를 각 Cas9 효소(0.5 μM)와 4:1의 비율로 혼합하여 RNP 복합체를 형성하고, Maxcyte 전기 천공 기기(Maxcyte사)를 이용하여 기기 매개 변수에 기반하여 전기 천공을 진행하여, RNP 복합체를 T 세포에 도입한다. 형질감염 5일째에, TCR 녹아웃의 효율을 검증하기 위해 T 세포를 취해 CD3 항체(BD Biosciences) 유세포 분석 염색을 진행한다. 유세포 분석 결과는 도 3 및 표 2에서 보여준 바와 같이, sg-TRAC-1의 녹아웃 효과는 sg-TRAC-2 및 sg-TRAC-3보다 현저히 높으므로 sg-TRAC-1이 최적의 녹아웃 효과를 가짐을 설명한다. 동시에, 녹아웃 효율에 대한 상이한 길이의 sg-TRAC-1의 영향을 측정하되, 각각 sg-TRAC-1(-3 bp)(sg-TRAC-5), sg-TRAC-1(-2 bp)(sg-TRAC-6), sg-TRAC-1(+3bp)(sg-TRAC-7), sg-TRAC-1(+2 bp)(sg-TRAC-8)인 4가닥의 sgRNA를 합성하여 각각 Cas9 효소(0.5 μM)와 4:1의 몰비로 RNP 복합체를 형성하고, 상기 조건을 T 세포에 도입한다. 형질감염 5일째에, TCR 녹아웃의 효율을 검증하기 위해 T 세포를 취해 CD3 항체유세포 분석 염색을 진행한다. 실험 결과는 도 3b에 도시된 바와 같이, 2개 또는 3개의 염기가 절단된 sg-TRAC-1이 TCR 녹아웃 효율에 대한 영향이 작지만, 2개 또는 3개의 염기를 증가시키면 TCR의 녹아웃 효율을 감소시키므로, 상기 부위의 sgRNA 길이에 대한 설계를 일정하게 변경할 수 있고, 특히 3개 이내의 염기를 절단하여도 비교적 높은 녹아웃 효과에 도달할 수 있음을 설명한다.
Figure pct00003
설명해야 할 것은, 공개된 문장에서, sg-TRAC-1도 TCR 녹아웃 효율이 90 %에 도달할 수 있도록 하지만, 상기 문장에서 사용된 방법은 최적화하여 2번의 전기 천공을 거치는 녹아웃 방법으로, 과정은 상대적으로 번거롭다(Clin Cancer Res. 2017 May 1;23(9):2255-2266을 참조하면, Fig1A에서 TCR 녹아웃률은 95.7 %임). 하지만, 본 발명에서는 한 번의 전기 천공만으로 90 % 이상의 녹아웃률에 도달할 수 있으므로, 현저한 우세를 가진다.
실시예 4. TRAC 유전자 녹아웃에 대한 Cas9 효소의 농도의 영향
sg-TRAC-1(SEQ ID NO:2)을 선택하여 sgRNA로 사용하고, Cas9 효소와 sg-TRAC-1의 몰비가 1:4일 때, 상이한 농도의 Cas9 효소(0.0625 μM, 0.125 μM, 0.25 μM, 0.5 μM)를 각각 설정하여 TRAC 유전자 녹아웃에 대한 영향을 측정한다.
실온에서 RNP 복합체를 10분 동안 배양한 후, Maxcyte 전기 천공 기기(Maxcyte사)를 이용하여 기기 설정 조건에 기반하여 RNP 복합체를 T 세포에 도입한다. 형질감염 5일째에, TCR 녹아웃의 효율을 검증하기 위해 T 세포를 취해 CD3 항체(BD Biosciences) 유세포 분석 염색을 진행한다.
유세포 분석 결과는 도 4 및 표 3에서 보여준 바와 같이, Cas9 효소의 농도가 0.1 μM보다 클 경우, TCR의 녹아웃 효율은 70 % 이상에 도달할 수 있고, 0.125 μM일 경우, TCR의 녹아웃 효율은 75 % 이상에 도달할 수 있으며; 특히, 0.2 μM보다 클 경우, TCR의 녹아웃 효율은 90 % 이상에 도달할 수 있고, 0.25 μM일 경우, TCR의 녹아웃 효율은 94.5 % 이상에 도달할 수 있으며; Cas9 효소의 농도가 0.3 ~ 0.5 μM일 경우, 95 % 이상에 도달할 수 있고, Cas9 효소의 농도가 0.5 μM일 경우, TCR의 녹아웃 효율은 97.4 %에 도달할 수 있으며, 세포 생존율은 모두 90 % 이상이다.
Figure pct00004
실시예 5. B2M 유전자를 표적화하는 sgRNA의 설계 및 합성
도 5에 도시된 바와 같이, B2M 유전자의 첫 번째 엑손 B2M-exon 1(뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:10으로 표시됨)에 따라, B2M 유전자를 표적화하는 4가닥의 sgRNA 서열인 sg-B2M-1(SEQ ID NO: 11), sg-B2M-2(SEQ ID NO: 12), sg-B2M-3(SEQ ID NO: 13), sg-B2M-4(SEQ ID NO: 14)를 획득한다.
sg-B2M-1, sg-B2M-2, sg-B2M-3을 선택하여 실험한다, 체외에서, SEQ ID NO: 26 및 27로 표시되는 프라이머를 합성하고, 체외에서 gRNA 전사 키트(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하여 sg-B2M-1을 전사 및 증폭해내며; 체외에서 SEQ ID NO: 28 및 29로 표시되는 프라이머를 합성하고, 체외에서 gRNA 전사 키트(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하여 sg-B2M-2를 전사 및 증폭해내며; 체외에서 SEQ ID NO: 30 및 31로 표시되는 프라이머를 하성하고, 체외에서 gRNA 전사 키트(Thermo Fisher에서 구입)를 사용하여 sg-B2M-3을 전사 및 증폭해낸다.
B2M-exon 1 서열(SEQ ID NO: 10):
AATATAAGTGGAGGCGTCGCGCTGGCGGGCATTCCTGAAGCTGACAGCATTCGGGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCTATCCAGC
sg-B2M-1(SEQ ID NO: 11): GGCCACGGAGCGAGACATCT
sg-B2M-2(SEQ ID NO: 12): GAGTAGCGCGAGCACAGCTA
sg-B2M-3(SEQ ID NO: 13): CGCGAGCACAGCTAAGGCCA
실시예 6. B2M 유전자 녹아웃에 대한 상이한 sgRNA 서열의 영향.
실시예 5에서 얻은 B2M 유전자를 표적화하는 sgRNA 서열 sg-B2M-1, sg-B2M-2 , sg-B2M-3에 대해, B2M 유전자 녹아웃에 대한 영향을 비교한다.
1:4의 몰비로 Cas9 효소(0.5 μM)와 gRNA를 혼합하여 RNP 복합체를 형성한 후, Maxcyte 전기 천공 기기(Maxcyte사)를 이용하여 기기 설정 조건에 기반하여 RNP 복합체를 T 세포에 도입한다.형질감염 5일째에, B2M 녹아웃의 효율을 검증하기 위해 T 세포를 취해 β2-마이크로글로불린 항체(BD Biosciences) 유세포 분석 염색을 진행한다.유세포 분석 결과는 도 6 및 표 4에서 보여준 바와 같이, sg-B2M-1 및 sg-B2M-2의 녹아웃 효과는 90 % 이상에 도달하여 sg-B2M-3보다 현저히 우수하므로, sg-B2M-1 및 sg-B2M-2가 모두 아주 좋은 녹아웃 효과를 가짐을 설명한다.
Figure pct00005
동일한 sg-B2M-1 서열을 사용하면, 공개된 바와 같이 녹아웃률은 50 ~ 60 %(Nature. 2017 Mar 2;543(7643):113-117, Fig3c에서 B2M 녹아웃률은 55 %임)밖에 안되지만, 본 발명의 방법으로 최적화한 후, B2M의 녹아웃률은 크게 향상되어 95 %에 도달할 수 있다.
실시예 7. 녹아웃 효율에 대한 Cas9 효소의 농도의 영향
sg-B2M-2를 선택하여 sgRNA로 사용하고, Cas9 효소와 sgRNA의 몰비가 1:4일 때, 상이한 농도의 Cas9 효소(0.125 μM, 0.25 μM, 0.5 μM, 1.0 μM, 2.0 μM, 3.0 μM)를 각각 설정하여 B2M 유전자 녹아웃에 대한 영향을 측정한다. 실온에서 RNP 복합체를 10분 동안 배양한 후, Maxcyte 전기 천공 기기(Maxcyte사)를 이용하여 기기의 전기 천공 조건에 기반하여 RNP 복합체를 T 세포에 도입하고, 형질감염 5일째에, B2M 녹아웃의 효율을 검증하기 위해 T 세포를 취해 B2M 항체(BD Biosciences) 유세포 분석 염색을 진행한다. 유세포 분석 결과는 도 7 및 표 5에서 보여준 바와 같이, Cas9 효소의 농도가 0.2 μM보다 클 경우, 녹아웃 효율은 70 % 이상에 도달할 수 있고, 0.25 μM일 경우,녹아웃 효율은 72.2 %이며; Cas9 효소의 농도가 1 μM보다 낮지 않을 경우, 녹아웃 효율은 90 % 이상에 도달할 수 있고, 1 μM ~ 3 μM일 경우, 모두 우수한 녹아웃 효율을 가지며, 특히 1 μM ~ 2 μM일 경우, 녹아웃 효율은 모두 약 93 %이다.
Figure pct00006
실시예 8. T 세포에서의 TRAC 및 B2M 유전자에 대한 효율적인 동시적 녹아웃
1. gRNA 조성 성분의 비율의 영향
현재 보고에 따르면, TCR 및 B2M 이중 녹아웃의 효율은 최대 약 60 %밖에 안된다(Clin Cancer Res. 2017 May 1;23(9):2255-2266에서의 도 3b 및 Oncotarget,2017,Vol.8,(No.10),pp:17007-17011에서의 도 3a를 참조). 따라서, 본 실시예에서 상기 최적화된 방법을 추가적으로 이용하여, B2M 및 TCR를 이중 녹아웃하는 조합을 선별하고자 한다.
TRAC 및 B2M 유전자 이중 녹아웃에 대한 sg-TRAC-1과 sg-B2M-2 사이의 비율의 영향을 측정하기 위해, Cas9 효소와 전체 gRNA의 몰비가 1:4일 때, sg-B2M-2와 sg-TRAC-1의 비율을 각각 1.5:1, 1:1 및 0.5:1로 설정하여 유전자 녹아웃에 대한 영향을 측정한다. Maxcyte 전기 천공 기기(Maxcyte사)를 이용하여 RNP 복합체를 T 세포에 도입한 후, 5일째에 CD3 항체 및 B2M 항체(BD Biosciences) 유세포 분석 염색을 진행한다. 유세포 분석 결과는 도 8 및 표 6에서 보여준 바와 같이, sg-B2M-2과 sg-TRAC-1의 비율이 1:1일 때, TRAC 및 B2M 유전자 이중 녹아웃의 효과가 가장 좋다.
Figure pct00007
2. RNP 농도의 최적화
TRAC 및 B2M 유전자 조성을 표적화하는 gRNA 혼합물과 Cas9 효소 사이에 형성된 RNP 복합체의 농도를 모색하기 위해, 최적화된 Cas9 효소와 gRNA의 몰비가 1:4일 때,상이한 농도의 Cas9 효소(0.25 μM, 0.5 μM, 1.0 μM, 2.0 μM, 3.0 μM)를 각각 설정하여 유전자 녹아웃에 대한 영향을 측정한다. Maxcyte 전기 천공 기기(Maxcyte사)를 이용하여 RNP 복합체를 T 세포에 도입한 후, 5일째에 CD3 항체 및 B2M 항체(BD Biosciences) 유세포 분석 염색을 진행한다.유세포 분석 결과는 도 9 및 표 7에서 보여준 바와 같이, Cas9 효소의 최종 농도가 1 μM보다 낮지 않을 경우, TRAC 및 B2M 이중 녹아웃의 효과는 모두 90 % 이상에 도달할 수 있고, 3 μM일 경우, 93.4 %에 도달한다.
Figure pct00008
실시예 9. T 세포에서의 TRAC 및 B2M 유전자에 대한 동시적 녹아웃 시 분자 수준의 검증
1. Tide 방법으로 TRAC 및 B2M 유전자 녹아웃을 검증한다.
T 세포에서 TRAC, B2M 단일 유전자 및 2 개의 유전자 녹아웃된 게놈 DNA를 각각 추출하고, PCR을 이용하여 녹아웃 부위 단편을 포함하는 유전자 단편을 증폭시킨다. PCR 산물을 겔 전기영동을 통해 정제 및 회수한 후 시퀀싱하고, 대조군 PCR 산물 중 TRAC 및 B2M 유전자의 시퀀싱 결과는 단일 피크이며, 녹아웃을 진행한 군에서, TRAC 및 B2M 유전자의 시퀀싱 결과는 대응되게 여러 개의 피크 세트가 나타났으므로, TRAC 및 B2M 유전자에 돌연변이가 발생되었음을 설명한다.
시퀀싱 결과를 분석을 위해 https://tide.deskgen.com/ 사이트에 제출하여, 예측된 돌연변이 효율을 얻은 결과는 도 10에 도시된 바와 같이, TCR 및 B2M이 모두 효과적으로 녹아웃됨을 설명한다.
2. 클론 시퀀싱을 통한 TRAC 및 B2M 유전자 녹아웃의 검증.
T 세포에서 TRAC, B2M 단일 유전자 및 2 개의 유전자 녹아웃된 게놈 DNA를 각각 추출하고, PCR을 이용하여 녹아웃 부위 단편을 포함하는 유전자 단편을 증폭시킨다. PCR 산물을 겔 전기영동을 통해 정제 및 회수하고, T 담체에 연결하여 형질전환시키며, 단일 클론 클로니를 랜덤으로 선택하여 시퀀싱 검증을 진행한다. 도 11에 도시된 바와 같이, 선택된 클론 시퀀싱을 비교한 결과, TRAC 및 B2M의 원래 서열에 비해, 녹아웃군의 서열에서 모두 염기의 결실 또는 삽입이 발생하였으므로, TRAC 및 B2M 유전자에 모두 돌연변이가 발생되었음을 설명한다.
실시예 10. TRAC 및 B2M 유전자에 대한 BCMA CAR-T 세포의 효율적 녹아웃
나아가, 제조된 BCMA CAR-T 세포를 이용하여 TRAC 및 이중 유전자 녹아웃의 효과를 측정하였다.
1. 표적 BCMA-CAR-T 세포의 제조
중국 발명 특허 201810065525.1을 참조하여, 항-BCMA 키메라 항원 수용체, T 세포 공동자극 인자 41-BB, T 세포 활성화 인자 CD3ζ를 포함하는 담체를 구축하고, 렌티바이러스를 패키징하여 PRRL-BCMA-BBZ(TM)로 명명한다. T 세포 활성화 및 증폭을 48시간 동안 진행한 후, 세포 밀도를 2Х106/mL로 조정하고, MOI=4의 비율에 따라 PRRL-BCMA-BBZ(TM) 렌티바이러스를 넣으며, 24시간 후 액체를 교체하여 표적 BCMA-CAR-T 세포를 얻는다.
2. 표적 BCMA CAR-T 세포에서의 TCR 및 B2M 유전자의 녹아웃
체외에서 CAR-T 세포를 48시간 동안 증폭시킨 후, 세포 밀도를 2Х107/mL로 조정한다. 1:4인 Cas9 효소와 gRNA의 비율에 따라, sg-TRAC-1, sg-B2M-2 및 sg-TRAC-1/sg-B2M-2의 혼합물을 각각 10분 동안 배양하고, 1Х106의 세포와 RNP를 혼합하며(Cas9 효소의 최종 농도는 3 μM임), maxcyte 전기 천공 기기를 이용하여 RNP 복합체를 CAR-T 세포에 도입한다. 각각 24시간, 48시간 및 72시간 동안 세포 생존 상태(표 8)를 측정하고, 전기 천공 후 CAR-T 세포는 잘 회복되었다. 전기 천공 5일째에, 유세포 분석을 이용하여 TRAC 및 B2M 유전자의 녹아웃 상황을 측정한 결과, TRAC 및 B2M 단 유전자 및 이중 유전자 녹아웃이 모두 90 % 이상에 도달하였으므로, TCR 및 B2M 이중 녹아웃을 효율적으로 구현함을 설명한다(도 12를 참조).
Figure pct00009
본문에서 사용된 서열은 하기와 같다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
SEQUENCE LISTING <110> CARSGEN THERAPEUTICS CO., LTD. <120> METHOD FOR GENE EDITING OF CELL ON THE BASIS OF CRISPR/CAS SYSTEM <130> FC00153PCT <141> 2019-09-23 <160> 45 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 274 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt 60 ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg 120 atgtgtatat cacagacaaa actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca 180 gtgctgtggc ctggagcaac aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca 240 ttattccaga agacaccttc ttccccagcc cagg 282 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 agagtctctc agctggtaca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 tctctcagct ggtacacggc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 gagaatcaaa atcggtgaat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ctctcagctg gtacacggca 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 ccgtgtacca gctgagagac tct 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 cctgccgtgt accagctgag aga 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 cctattcacc gattttgatt ctc 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ccctgccgtg taccagctga gag 23 <210> 10 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 aatataagtg gaggcgtcgc gctggcgggc attcctgaag ctgacagcat tcgggccgag 60 atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggaggct 120 atccagc 131 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 ggccacggag cgagacatct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 gagtagcgcg agcacagcta 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 ggccgagatg tctcgctccg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 aagtggaggc gtcgcgctgg 20 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 ccgagatgtc tcgctccgtg gcc 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 ccttagctgt gctcgcgcta ctc 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 ggccgagatg tctcgctccg tgg 23 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 aagtggaggc gtcgcgctgg cgg 23 <210> 19 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 gnwgaggtgc aattgctgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 60 ctctcctgtg cagcctccgg attcaccttt ggcggtaatg ccatgtcctg ggtccgccag 120 gctccaggga aggggctgga gtgggtctca gcaattagtg gtaatggtgg tagtacattc 180 tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 240 tatctgcaga tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgaaagtt 300 cgtccattct ggggtacttt cgactactgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcgagt 360 ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggttct ggcggtggcg gatcggaaat cgtgttaacg 420 cagtctccag gcaccctgtc tttgtctcca ggggaaagag ccaccctctc ttgcagggcc 480 agtcagagtg ttagcagcag ctacttagcc tggtaccagc agaaacctgg ccaggctccc 540 aggctcctca tctatggagc atccagcagg gccactggca tcccagacag gttcagtggc 600 agtggatccg ggacagactt cactctcacc atcagcagac tggagcctga agattttgca 660 gtgtattact gtcagcagta cttcaaccca ccagaataca cgttcggcca ggggaccaaa 720 gtggaaatca aacgt 735 <210> 20 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 taatacgact cactatagag agtctctcag ctggtaca 38 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 ttctagctct aaaactgtac cagctgagag actct 35 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 22 taatacgact cactatagtc tctcagctgg tacacggc 38 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 23 ttctagctct aaaacgccgt gtaccagctg agaga 35 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 24 taatacgact cactatagga gaatcaaaat cggtgaat 38 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 25 ttctagctct aaaacattca ccgattttga ttctc 35 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 26 taatacgact cactataggg ccacggagcg agacatct 38 <210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 27 ttctagctct aaaacagatg tctcgctccg tggcc 35 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 28 taatacgact cactatagga gtagcgcgag cacagcta 38 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 29 ttctagctct aaaactagct gtgctcgcgc tactc 35 <210> 30 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 30 taatacgact cactataggg ccgagatgtc tcgctccg 38 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 31 ttctagctct aaaaccggag cgagacatct cggcc 35 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 32 gtctctcagc tggtaca 17 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 33 agtctctcag ctggtaca 18 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 34 taatacgact cactatagtt agagtctctc agctggtaca 40 <210> 35 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 35 ttctagctct aaaactgtac cagctgagag actctaa 37 <210> 36 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 36 taatacgact cactatagtt tagagtctct cagctggtac a 41 <210> 37 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 37 ttctagctct aaaactgtac cagctgagag actctaaa 38 <210> 38 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 38 tagctgtgct cgcg 14 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 39 ttagagtctc tcagctggta ca 22 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 40 tttagagtct ctcagctggt aca 23 <210> 41 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 41 taatacgact cactatagag tctctcagct ggtaca 36 <210> 42 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 42 ttctagctct aaaactgtac cagctgagag act 33 <210> 43 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 43 taatacgact cactataggt ctctcagctg gtaca 35 <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 44 ttctagctct aaaactgtac cagctgagag ac 32 <210> 45 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 45 tgtaccagct gagag 15

Claims (30)

  1. CRISPR/Cas 시스템을 기반으로 한 세포의 유전자 편집 방법으로서,
    Cas 효소와 gRNA의 복합체를 상기 세포에 도입하여 유전자 편집을 진행하되, 상기 Cas 효소는 Cas9 효소이고, 상기 Cas9 효소의 효소 활성은 0.1 ~ 1 nmol이며, 바람직하게, 0.2 ~ 0.7 nmol이고, 더 바람직하게, 0.3 ~ 0.5 nmol이며;
    보다 더 바람직하게, 상기 복합체에서, Cas9 효소와 gRNA의 몰비는 1:1 ~ 1:10이고, 바람직하게, 1:3 ~ 1:5이며, 더 바람직하게, 1:4인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    Cas9 효소와 제1 gRNA의 복합체 1 및 Cas9 효소와 제2 gRNA의 복합체 2를 상기 세포에 도입하여 유전자 편집을 진행하고,
    바람직하게, Cas9 효소, 제1 gRNA 및 제2 gRNA의 복합체 3을 동시에 상기 세포에 도입하여 유전자 편집을 진행하며,
    상기 복합체 1 또는 복합체 2 또는 복합체 3에서, Cas9 효소와 gRNA의 몰비는 1:1 ~ 1:10이고, 바람직하게, 1:3 ~ 1:5이며, 더 바람직하게, 1:4인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 gRNA와 제2 gRNA의 몰비는 약 1:5 ~ 5:1이고, 바람직하게, 1:2 ~ 2:1이며; 더 바람직하게, 약 1:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Cas9 효소와 gRNA로 형성된 복합체 또는 복합체 1 또는 복합체 2 또는 복합체 3에서, 상기 Cas9 효소의 농도는 약 0.1 μM ~ 3 μM이고; 바람직하게, 약 0.125 μM ~ 3 μM이며; 더 바람직하게, 약 0.2 μM ~ 3 μM이고; 보다 더 바람직하게, 약 0.25 μM ~ 3 μM이며; 보다 더 바람직하게, 약 0.5 μM ~ 3 μM이고; 보다 더 바람직하게, 약 1 μM ~ 3 μM인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 진핵 세포이고; 바람직하게, 상기 진핵 세포는 면역 효과기 세포이며; 바람직하게, 상기 면역 효과기 세포는 T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 세포는 T 세포이고, 상기 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 상기 T 세포의 유전자를 편집하는 단계는,
    상기 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 상기 T 세포의 TCR의 α 사슬 및 β 사슬 중 어느 한 가닥 또는 두 가닥의 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하고; 바람직하게, TRAC에 대해 유전자 편집을 진행하며; 더 바람직하게, TRAC의 불변 영역에 대해 유전자 편집을 진행하고; 보다 더 바람직하게, TRAC 중 SEQ ID NO: 45로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하며; 보다 더 바람직하게, TRAC에 포함된 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하는 단계; 및/또는
    상기 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 상기 T 세포의 MHC 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하고; 바람직하게, B2M 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하며; 더 바람직하게, B2M 유전자 중 SEQ ID NO: 38로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하고; 보다 더 바람직하게, B2M 유전자에 포함된 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 gRNA는 약 15 ~ 50 bp이고, 바람직하게, 약 15 ~ 30 bp이며, 더 바람직하게, 약 17 ~ 21 bp이고, 보다 더 바람직하게 20 bp인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    TRAC의 편집에 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 32, 33, 39 또는 40으로 표시되는 서열이 포함되고; 바람직하게, 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 2, 32 또는 33으로 표시되는 서열이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    B2M 유전자의 편집에 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 11, 12, 13, 또는 14로 표시되는 서열이 포함되고; 바람직하게, 사용되는 gRNA에는 SEQ ID NO: 12로 표시되는 서열이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포에는 키메라 수용체, 외인성 시토카인, 억제성/활성화 수용체 또는 리간드, 공동자극 인자가 더 발현되어 있고, 바람직하게, 상기 T 세포에는 키메라 항원 수용체가 더 발현되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 범용형 T 세포의 구축 방법으로서,
    유전자 편집 기술을 통해 T 세포의 TCR 유전자 및 MHC 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하는 단계를 포함하되,
    T 세포의 TCR 유전자에 대한 유전자 편집에서, 바람직하게, T 세포의 TCR의 α 사슬 및 β 사슬 중 어느 한 가닥 또는 두 가닥의 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하고, 더 바람직하게, TRAC 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하며, 보다 더 바람직하게, TRAC의 불변 영역에 대해 유전자 편집을 진행하며, 보다 더 바람직하게, TRAC 중 SEQ ID NO: 45로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하고, 보다 더 바람직하게, TRAC에 포함된 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하며;
    T 세포의 MHC 유전자에 대한 유전자 편집에서, 바람직하게, T 세포의 B2M 유전자에 유전자 편집을 진행하고, 더 바람직하게, B2M 유전자 중 SEQ ID NO: 38로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하며, B2M 유전자에 포함된 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열에 대해 유전자 편집을 진행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 유전자 편집 기술은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 32, 33, 39 또는 40으로 표시되는 서열로부터 선택된 서열을 포함하는 gRNA를 상기 T 세포에 도입하여 T 세포의 TRAC 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하고, 바람직하게, SEQ ID NO: 2, 32 또는 33으로 표시되는 서열을 포함하는 gRNA를 상기 T 세포에 도입하여 T 세포의 TRAC 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    SEQ ID NO: 11, 12, 13, 또는 14로 표시되는 서열로부터 선택된 서열을 포함하는 gRNA를 상기 T 세포에 도입하여 T 세포의 MHC 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하고, 바람직하게, SEQ ID NO: 12로 표시되는 서열로 표시되는 서열을 포함하는 gRNA를 상기 T 세포에 도입하여 T 세포의 MHC 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 편집 기술을 통해 T 세포의 TCR 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하는 단계는 Cas9 효소와 gRNA의 제 1 복합체 1을 상기 세포에 도입하여 유전자 편집을 진행하는 단계를 통해 구현되고,
    유전자 편집 기술을 통해 T 세포의 MHC 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하는 단계는 Cas9 효소와 gRNA의 제 2 복합체 2를 상기 세포에 도입하여 유전자 편집을 진행하는 단계를 통해 구현되며,
    바람직하게, 복합체 1 및 복합체 2를 복합체 3의 형태로 동시에 상기 세포에 도입하여 유전자 편집을 진행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 복합체 1 또는 복합체 2 중 Cas9 효소와 gRNA의 몰비는 1:1 ~ 1:10이고, 바람직하게, 1: 3 ~ 1:5이며, 보다 더 바람직하게, Cas9 효소와 gRNA의 몰비는 1:4인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 복합체 1 또는 복합체 2 또는 복합체 3에서, 상기 Cas9 효소의 농도는 약 0.1 μM ~ 3 μM이고; 바람직하게, 약 0.125 μM ~ 3 μM이며; 더 바람직하게, 약 0.2 μM ~ 3 μM이고; 보다 더 바람직하게, 약 0.25 μM ~ 3 μM이며; 보다 더 바람직하게, 약 0.5 μM ~ 3 μM이고, 보다 더 바람직하게, 약 1 μM ~ 3 μM이며, 보다 더 바람직하게, 약 0.125 μM ~ 0.5 μM이고, 보다 더 바람직하게, 약 0.25 μM ~ 0.5 μM인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    TCR 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하는 gRNA와 MHC 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하는 gRNA의 몰비는 약 1:5 ~ 5:1이고, 바람직하게, 1:2 ~ 2:1이며; 더 바람직하게, 약 1:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포에는 키메라 항원 수용체가 더 발현되어 있고, 바람직하게, 상기 T 세포에는 종양 항원 또는 병원체 항원을 식별하는 키메라 수용체가 더 발현되어 있으며, 상기 키메라 수용체는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 구비하고, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 표적 항원을 특이적으로 식별하며;
    바람직하게, 상기 표적 항원은 종양 항원이고, 상기 종양 항원은 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); CD171; CS-1; C형 렉틴 유사 분자-1; 갱글리어시드 GD3; Tn항원; CD19; CD20; CD 22; CD 30; CD 70; CD 123; CD 138; CD33; CD44; CD44v7/8; CD38; CD44v6; B7H3(CD276), B7H6; KIT(CD117); 인터류킨 13 수용체 서브 유닛 α(IL-13Rα); 인터류킨 11 수용체 α(IL-11Rα); 전립선 줄기 세포 항원(PSCA); 전립선 특이적 막 항원(PSMA); 암배아 항원(CEA); NY-ESO-1; HIV-1 Gag; MART-1; gp100; 티로시나아제; 메소텔린; EpCAM; 프로테아제 세린21(PRSS21); 혈관내피성장인자 수용체; 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장인자 수용체 β(PDGFR-β); 발생단계 특이적 태아성 항원-4(SSEA-4); 세포 표면 관련 뮤신 1(MUC1), MUC6; 표피성장20인자 수용체 패밀리 및 이의 돌연변이체(EGFR, EGFR2, ERBB3, ERBB4, EGFRvIII); 신경 세포 부착 분자(NCAM); 탄산무수화효소IX(CAIX); LMP2; A형 에프린 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴루이스 부착 분자(sLe); O-아세틸 GD2 갱글리어시드(OAcGD2); 갱글리어시드 GM3; TGS5; 고분자량 흑색종 관련 항원(HMWMAA); 엽산 수용체; 종양 혈관 내피 마커 251(TEM1/CD248); 종양 혈관 내피 마커 7 관련(TEM7R); Claudin6, Claudin18.2(CLD18A2), Claudin18.1; ASGPR1; CDH16; 5T4; 8H9; αvβ6 인테그린; B세포 성숙화 항원(BCMA); CA9; κ경쇄(kappa light chain); CSPG4; EGP2, EGP40; FAP; FAR; FBP; 배아형 AchR; HLA-A1, HLA-A2; MAGEA1, MAGE3; KDR; MCSP; NKG2D 리간드; PSC1; ROR1; Sp17; SURVIVIN; TAG72; TEM1; 피브로넥틴; 테나신; 종양 괴사 부위의 암 배아 변이체; G 단백질 결합 수용체 클래스 C 그룹 5 멤버 D(GPRC5D); X 염색체 오픈 리딩 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나아제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이 유전자 1(PLAC1); globoH 글리코세라미드(glycoceramide)의 육탄당 부분(GloboH); 유방 분화 항원(NY-BR-1); 유로플라킨 2(uroplakin 2, UPK2); A 형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린 수용5체 β3(ADRB3); 파넥신 3(pannexin 3, PANX3); G 단백질 결합 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합 유전자좌 K9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); T 세포 수용체 γ 대체 판독 프레임 단백질(TARP); 윌름스 종양 단백질(WT1); ETS 전위 변이 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리 멤버 1A(XAGE1); 안지오포이에틴 결합 세포 표면 수용체 2(Tie2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; p53 돌연변이10체; 인간 텔로머라제 역전사 효소(hTERT); 육종 전위 중단 점; 세포 사멸의 흑색종 억제제(ML-IAP); ERG(막관통 프로테아제 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 V(NA17); 페어 박스 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; V-myc 조류 골수증 바이러스 종양 유전자 신경 모세포종 유래 동족체(MYCN); Ras 동족체 패밀리 멤버 C(RhoC); 시토크롬 P450 1B1(CYP1B1); CCCTC 결합 인자 (아연 핑거 단백질) 유사 (BORIS); T 세포에 의해 식별되는 편평 세포 암종 항원 3(SART3); 페어 박스 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신(proacrosin) 결합 단백질 sp32(OYTES1); 림프구 특이 단백질 티로신 키나아제(LCK); A-키나제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 활막 육종 X 중단 점 2(SSX2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR); 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 서브 패밀리 멤버 2(LILRA2); CD300 분자 유사 패밀리 멤버 f(CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 멤버 A(CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF 유사 모듈 함유 뮤신 유사 호르몬 수용체 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸-3(GPC3); Fc 수용체 유사 5(FCRL5); 면역글로불린 람다 유사 펩타이드 1(IGLL1)로부터 선택되며;
    바람직하게, 상기 표적 항원은 병원체 항원이고, 상기 병원체 항원은 바이러스, 세균, 진균, 원생 동물, 또는 기생충의 항원으로부터 선택되며; 일 실시예에서, 상기 바이러스 항원은 거대세포 바이러스 항원, EB 바이러스 항원, 인간 면역 결핍 바이러스 항원 또는 인플루엔자 바이러스 항원으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체는,
    (i) 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 도메인, CD28의 공동자극 신호 도메인, 및 CD3ζ; 또는
    (ii) 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 도메인, CD137의 공동자극 신호 도메인, 및 CD3ζ; 또는
    (iii) 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 도메인, CD28의 공동자극 신호 도메인, CD137의 공동자극 신호 도메인, 및 CD3ζ를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체의 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 전장 항체, scFv, Fab, (Fab'), 또는 단일 도메인 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 키메라 수용체가 발현되어 있는 T 세포를 제조하기 위한 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 제조된 T 세포의 용도로서,
    상기 키메라 수용체는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 구비하고, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 표적 항원을 특이적으로 식별하는 용도.
  24. 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 방법을 통해 구축되는 범용형 T 세포.
  25. TRAC 및/또는 B2M 유전자 침묵이 발생되는 범용형 T 세포.
  26. 제25항에 있어서,
    TRAC 유전자 침묵은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열을 포함하는 서열에 대한 유전자 편집에 의해 구현되고, 더 바람직하게, TRAC 유전자 침묵은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 서열을 포함하는 SEQ ID NO: 45로 표시되는 서열에 대한 유전자 편집에 의해 구현되며;
    B2M 유전자 침묵은 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열을 포함하는 서열에 대한 유전자 편집에 의해 구현되고, 더 바람직하게, B2M 유전자 침묵은 SEQ ID NO: 10으로 표시되는 서열을 포함하는 SEQ ID NO: 38로 표시되는 서열에 대한 유전자 편집에 의해 구현되는 것을 특징으로 하는 T 세포.
  27. 제25항에 있어서,
    TRAC 유전자 침묵은 gRNA가 SEQ ID NO: 2, 32 또는 33으로 표시되는 서열을 이용하여 TRAC 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하여 구현되고;
    B2M 유전자 침묵은 gRNA가 SEQ ID NO: 12로 표시되는 서열을 이용하여 B2M 유전자에 대해 유전자 편집을 진행하여 구현되는 T 세포.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포에는 키메라 항원 수용체가 더 발현되어 있고, 바람직하게, 상기 T 세포에는 종양 항원 또는 병원체 항원을 식별하는 키메라 수용체가 더 발현되어 있으며, 상기 키메라 수용체는 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 구비하고, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 표적 항원을 특이적으로 식별하는 T 세포.
  29. SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 32, 33, 39, 40, 11, 12, 13, 또는 14 중 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 gRNA 구축물.
  30. 제20항에 있어서,
    SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 32, 33, 39 또는 40 중 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 및
    SEQ ID NO: 11, 12, 13, 또는 14 중 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 gRNA 구축물.
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