KR20210028142A - 마이크로어레이 기반 멀티플렉스 병원체 분석 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에서는 DNA 서열 검출 및 분석을 위한 3차원 격자 마이크로어레이 시스템 및 그 구성요소를 포함하는 키트가 제공된다. 시스템에서 고체 지지체는, 각각 상부 도메인 및 하부 말단을 갖고, 하부 말단에 부착되고, 선택적으로 형광 표지를 갖는 다수의 이작용성 중합체 링커 및 다수의 이작용성 중합체 링커의 상부 도메인에 부착된 다수의 핵산 프로브를 갖는다. 또한, 마이크로어레이 시스템을 제작하는 방법 및 식물 샘플에서 병원체를 검출 및 확인하거나, 합성 DNA의 인지된 카피 수를 내부 표준으로 사용하여 비정제 핵산 샘플에서 병원체 DNA의 카피 수를 측정하는 방법이 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 국제 출원은 둘 모두 2018년 3월 8일에 출원된 계류 중인 출원 U.S. 15/916,036 및 U.S. 15/916,062의 35 U.S.C. §120 하의 부분계속출원이고, 2018년 10월 11일에 출원된 계류 중인 출원 U.S. 16/158,276의 35 U.S.C. §120 하의 우선권 이익을 주장하며, 상기 문헌 모두는 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 DNA 기반 병원체 및 식물 분석의 기술 분야이다. 더욱 구체적으로, 본 개시내용은 핵산 프로브 (probe)를 고정하기 위한 멀티플렉스 (multiplex) 분석 및 3차원 격자 마이크로어레이 기술을 사용하는 식물, 농업, 식품 및 음료수 물질(water material)에 대한 병원체 분석 기술 분야이다.
미생물 병원체를 확인하기 위해 사용되는 현재 기술은 확립된 임상 미생물 모니터링에 의존한다. 병원체 확인은 표준 배양 및 민감도 시험을 사용하여 수행된다. 이러한 시험에는 불안정한 산물뿐만 아니라, 상당한 시간, 노력, 비용 투자가 필요하다. 현재 기술은 많은 수의 샘플을 시험하는데 적합하지 않다. 배양 기반 시험은 위양성 및 위음성 모두를 포함하는 부정확성과 콜로니 형성 단위 (CFU)의 신뢰할 수 없는 정량화의 문제가 많다. 생존 가능하지만 배양 불가능한 미생물의 존재가 문제가 되며, 이는 통상의 배양 방법을 사용하는 경우 나타나지 않는다. 유해한 종과 무해한 종 둘 모두의 검출 측면에서 특정 배양 시험은 비특이적이므로, 시험할 샘플에 유해 요소가 존재하는지 측정하는 시험의 유용성을 감소시킨다.
위양성 및 미생물 배양을 포함하는 문제에 대응하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 기술과 같은 DNA 기반 진단 방법이 개발되었다. PCR을 사용하여 병원체를 분석하려면 분석 전에 물질로부터 DNA를 추출해야하는데, 이는 시간과 비용이 많이 드는 단계이다.
PCR의 사전 분석 추출 단계를 제거하기 위해 콜로니 PCR이 개발되었다. 플레이트 또는 액체 배양으로부터의 콜로니로부터 직접 획득된 세포를 사용하는 경우, 콜로니 PCR에 의해, 샘플 제조 없이 박테리아 세포를 PCR할 수 있다. 이 기술은 부분적으로 성공했지만, 배양만큼 민감하지 않았으며, 이는 표본의 성분에 의한 PCR 간섭에 대한 가능한 문제를 나타낸다. 이 가능한 간섭이 수행된 시험의 유용성을 무효화할만큼 충분히 중요하지 않을 수 있지만, 이러한 간섭은 특정 유형의 시험에서 고도의 민감성 병원체 검출에 중요할 수 있다. 결과적으로, 콜로니 PCR은 특히 고도의 민감성 병원체 검출을 위한 PCR 사용을 위한 사전 분석 추출 단계를 제거하지 못하였다.
박테리아의 16s DNA와 효모 또는 곰팡이 DNA의 내부 전사 스페이서 (spacer) 2 (ITS2) 유전자 좌위는 PCR 증폭이 가능하며, 증폭되면 분석하여 식물 물질 내부 또는 그 표면의 특정 박테리아 또는 특정 곰팡이 또는 효모 오염에 대한 정보를 제공할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 또한 혈액, 배설물 및 기타 특정 샘플의 경우, 임의의 DNA 추출이 부재하는 샘플의 DNA에 대해 PCR을 수행할 수 있다. 그러나 혈액의 경우 이러한 직접 PCR의 결과는 혈액 분석물에 의한 억제로 인해 샘플 간 변이가 상당한 것으로 공지되어 있다. 또한, 식물 성분에 의한 PCR의 과도한 억제로 인해 식물 물질에 대한 직접 PCR 분석을 수행하려는 시도는 일반적으로 실패하였다.
시간이 지남에 따라 병원체의 시기 적절하고 특이적인 검출 및 확인 문제를 개선하기 위해 추가의 방법과 기술이 개발되었다. 면역 분석 기술은 특정 분석을 제공한다. 그러나 이 기술은 화학 소모품을 사용하는데 비용이 많이 들고 반응 시간이 길다. 광학 센서 기술은 고속 실시간 검출을 생성하지만, 병원체가 일반적으로 양성 백그라운드와 광학적으로 유사하므로, 일반적인 검출 기능을 제공하기 때문에, 이러한 센서는 확인 특이성이 부족하다. 정량적 중합효소 연쇄 반응 (qPCR) 기술은 1시간 미만 내에 DNA 샘플을 증폭 및 검출할 수 있다. 그러나 qPCR은 단일 병원체의 분석으로 크게 제한된다. 결과적으로 식물, 농업, 식품 및 음료수의 경우와 같이 많은 병원체를 동시에 분석해야하는 경우, 상대적으로 많은 수의 개별 시험이 병렬 수행된다.
생물학적 마이크로어레이는 DNA를 검출 및 분석하는데 사용되는 광범위한 도구에서 핵심 메커니즘이 되었다. 마이크로어레이 기반 검출은 DNA 증폭과 마이크로어레이 기술의 광범위한 스크리닝 기능을 조합한다. 이로 인해 특이적 검출 및 개선된 공정 속도가 획득된다. 박테리아 및 진핵 세포, 예컨대 효모 및 곰팡이에서 DNA의 특정 절편을 혼성화하여 조사할 수 있는 기능을 갖는 DNA 마이크로어레이가 제작될 수 있다. 그러나 하류 마이크로어레이 적용을 위해 많은 수의 PCR 반응을 처리하려면 비용이 많이 들고 복잡한 조직 지원을 갖춘 고도로 숙련된 개인이 필요하다. 이러한 문제로 인해 마이크로어레이 기술은 하류 적용 분야 개발로 이어지지 않았다.
DNA 분석을 위해 DNA를 고체 지지체에 연결할 수 있다는 것은 널리 공지되어 있다. 이러한 경우 표면 관련 DNA는 일반적으로 "올리고뉴클레오타이드 프로브" (핵산 프로브, DNA 프로브)로 지칭되며, 프로브가 결합하도록 설계된 동종 파트너는 혼성화 표적 (DNA 표적)으로 지칭된다. 이러한 장치에서 DNA 표적의 검출 및-또는 정량화는 "DNA 혼성화 (혼성화)"로도 언급되는 공정인 이중체 형성을 통해 표면 결합 프로브에 대한 표적의 결합을 관찰하여 획득된다.
고체 지지체에 대한 핵산 프로브 연결은 핵산 프로브가 셀룰로스와 같은 중성 표면에 흡착되는 경우 또는 핵산 프로브가 양이온성 표면, 예컨대 아미노-실란 코팅 유리 또는 플라스틱에 흡착되는 경우, 발생하는 것과 같이 표면에의 직접적인 DNA의 비공유 흡착에 의해 달성될 수 있다. 지지체에 대한 핵산 프로브의 직접 비공유 흡착에는 다수의 한계가 있다. 기저 표면 상의 핵산 프로브의 직접적 물리적 흡착에 의해 근본적으로 억제되는 상호작용으로, 적절한 (결합된) 표적 프로브 복합체가 결합된 프로브 DNA 주위에 표적 DNA 표적이 둘러싸는 경우에만 형성될 수 있는 이중가닥 나선이므로, 핵산 프로브는 반드시 표면과 직접 물리적으로 접촉하여 위치하여, DNA 표적과의 결합에 입체적 제약이 제공된다.
핵산 프로브 연결은 또한 핵산 프로브와 표면의 공유결합 부착을 통해 이루어질 수 있다. 이는 반응성 기 (예를 들어, 1차 아민)를 프로브에 도입한 다음, 에폭시기 또는 이소시아네이트기와 같이, 표면에 위치한 아민 반응성 모이어티 (moiety)에 아민을 통해 프로브를 공유결합 부착시켜, 각각 2차 아민 또는 우레아 연결을 형성함으로써, 유도될 수 있다. DNA는 일반적으로 에폭사이드 또는 이소시아네이트 또는 기타 유사한 표준 친핵성 치환과 반응하지 않기 때문에, DNA 프로브를 먼저 1차 아민 또는 티올과 같은 "비천연" 리간드로 화학적으로 변형시켜야 한다. 이러한 화학 반응은 올리고뉴클레오타이드 합성 동안 용이하게 구현될 수 있지만, 변형 화학 반응과 관련된 비용으로 인해 DNA 프로브의 비용이 2배 초과하여 증가한다. 관련된 UV 가교결합 기반 접근 방식은 비천연 염기 화학 반응에 대한 필요성을 우회하며, 프로브 DNA 내의 티민의 아민 표면에의 광화학적 첨가에 의해 매개되는 DNA의 직접적인 UV 가교결합을 통해 프로브 DNA를 표면에 연결하여, 2차 아민 부산물을 형성할 수 있다. 그러나 효율적인 가교결합을 위한 고 에너지 UV의 필요성은 사용을 넘어서 핵산 프로브를 손상시킬 수 있는 실질적인 부반응을 초래한다. 흡착 연결의 경우와 같이, 변형된 핵산 프로브와 반응성 표면 사이에 가능한 공유결합 연결은 10개 미만의 회전 가능한 결합으로 짧아서 핵산 프로브를 기저 표면의 2 nm 내에 위치시킨다. 표준 핵산 프로브의 길이가 20개 염기 초과인 경우 (10 nm 길이 초과), 10/1 초과의 프로브/링커 (linker) 길이 비는 또한 적절한 표적-프로브 이중체의 후속 형성의 불안정화 억제를 제공한다.
이러한 문제를 해결하려는 이전의 시도는 성공하지 못하였다. 특히 아크릴아미드와 다당류를 중합하여 생성된 것과 같은 3차원 겔상으로의 포획을 통해 표면과 핵산 프로브의 부착은 겔상의 밀도가 높은 특성으로 인해 문제가 되었다. 이들 겔의 기공 크기 (약 10nm)는 겔 내에서 핵산 프로브의 포획 및/또는 부착을 가능하게 하지만, 일반적으로 핵산 프로브보다 몇배 더 긴 용액상 DNA 표적은 겔 매트릭스를 투과할 수 없음으로써, 표적 DNA에 대한 저조한 용액상 접근으로 인해 이러한 겔상 시스템의 사용이 제한된다.
따라서, 종래기술에는 더 적은 화학물질 및 불안정한 산물을 사용하고, 처리 단계를 감소시키고, 정확도, 특이성 및 신뢰성을 유지하면서 더 빠른 결과를 제공하는 병원체 DNA를 검출 및 확인하기 위한 시스템 및 방법이 부재한다. 종래 기술에는 또한 다수의 병원체를 포함하는 비정제 핵산 샘플에서 병원체 특이적 DNA의 절대 카피 수(copy number)를 측정하는 방법이 부재한다. 본 발명은 당 업계의 이러한 오랜 필요성과 요구를 충족시킨다.
본 발명은 3차원 격자 마이크로어레이 시스템(three-dimensional lattice microarray system)에 관한 것이다. 본 시스템은 전면 및 후면을 갖는 고체 지지체를 포함한다. 각각 상부 도메인 및 하부 말단을 갖는 다수의 이작용성 중합체 링커(bifunctional polymer linker)는 하부 말단에서 고체 지지체에 부착된다. 다수의 핵산 프로브는 다수의 이작용성 중합체 링커 각각의 상부 도메인에 부착된다. 본 발명은 다수의 이작용성 중합체 링커 각각 상의 상부 도메인의 상부 말단에 공유결합에 의해 부착되거나, 내부적으로 공유결합에 의해 부착된 형광 표지를 추가로 포함하는 관련 3차원 마이크로어레이에 관한 것이다. 본 발명은 고체 지지체의 전면에 부착된 다수의 화학적으로 활성화 가능한 기를 추가로 포함하는 또 다른 관련 3차원 마이크로어레이에 관한 것이며, 다수의 이작용성 중합체 링커는 각각의 다수의 화학적으로 활성화 가능한 기에 그의 하부 말단에 의해 공유결합에 의해 부착된다.
본 발명은 또한 3차원 격자 마이크로어레이 시스템의 제조 방법에 관한 것이다. 본 방법에서 본 명세서에 기재된 3차원 격자 마이크로어레이 시스템 내의 고체 지지체는 다수의 핵산 프로브, 다수의 이작용성 중합체 링커 및 물 및 100℃ 이상의 비등점을 갖는 수혼화성 액체를 포함하는 용매 혼합물을 포함하는 제형과 접촉된다. 다수의 이작용성 중합체 링커 각각의 하부 말단은 제1 부착 반응으로서 고체 지지체의 전면에 부착된다. 용매 혼합물 내의 물을 증발시킴으로써, 고체 지지체에 부착된 다수의 이작용성 중합체 링커 및 다수의 핵산 프로브를 농축시킨다. 각각의 핵산 프로브는 제2 부착 반응으로서 다수의 이작용성 중합체 링커 각각의 상부 도메인에 부착된다. 고체 지지체를 적어도 1회 세척하여, 비부착 이작용성 중합체 링커 및 핵산 프로브를 제거함으로써, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템을 제조한다.
본 발명은 추가로 주문 제작 가능 마이크로어레이 키트(microarray kit)에 관한 것이다. 마이크로어레이 키트는 본 명세서에 기재된 3차원 격자 마이크로어레이 시스템 내에 고체 지지체 및 다수의 이작용성 중합체 링커, 각각 병원체, 식물 또는 동물의 시그니처 (signiture) 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는 다수의 핵산 프로브, 용매 혼합물, 및 키트 사용 설명서를 포함한다.
본 발명은 추가로 식물 샘플 중 병원체 검출 방법에 관한 것이다. 본 방법에서, 식물 조직 샘플을 수확(harvesting)하고, 식물 조직 샘플로부터 DNA를 포함하는 전체 핵산을 단리한다. 제1 증폭을 각각 적어도 하나의 병원체의 DNA에 선택적인 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 적어도 하나의 제1 프라이머 쌍(primer pair)을 사용하여 단일 분석에서 탠뎀 (tandem) 방식으로 수행함으로써, 하나 이상의 병원체-특이적 제1 앰플리콘 (amplicon)을 획득할 수 있다. 제2 증폭을 주형으로서 병원체-특이적 제1 앰플리콘 및 각각의 프라이머 쌍은 형광 표지로 표지되고, 병원체-특이적 제1 앰플리콘 내의 내부 측접 영역(internal flanking region)에 상보적인 서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍을 사용하여 탠뎀 방식으로 수행함으로써, 형광 표지 제2 앰플리콘을 획득한다. 본 명세서에 기재된 3차원 격자 마이크로어레이 시스템을 사용하여, 제2 앰플리콘을 병원체 DNA 내의 시그니처 서열 결정자(signature sequence determinant)에 특이적인 핵산 프로브와 혼성화시키고, 핵산 프로브를 각각 다수의 이작용성 중합체 링커 각각을 통해 3차원 격자 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에 고정시키며, 마이크로어레이를 적어도 1회 세척한다. 마이크로어레이를 영상화(imaging)하여, 형광 표지 제2 앰플리콘으로부터의 형광 신호를 검출함으로써, 식물 샘플 내의 병원체를 검출한다. 본 발명은 다수의 이작용성 중합체 링커 각각이 형광 표지를 포함하는 관련 방법에 관한 것이며, 본 방법은 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 형광 신호를 검출하는 단계 및 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 신호 상에 형광 표지 제2 앰플리콘의 신호를 중첩(superimposing)시킴으로써, 식물 샘플 중 검출된 병원체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 추가로 단일 분석에서 식물 및 병원체의 DNA를 동시에 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 방법에서, 잠재적으로 하나 이상의 병원체를 포함하는 식물 조직 샘플을 수확하고, 적어도 식물 조직 및 하나 이상의 병원체의 DNA를 포함하는 DNA를 포함하는 전체 핵산을 단리한다. 제1 증폭을 적어도 하나의 병원체 DNA-선택적 제1 프라이머 쌍 및 식물 DNA-선택적 제1 프라이머 쌍을 사용하여 전체 핵산에 대한 단일 분석에서 탠뎀 방식으로 수행함으로써, 병원체-특이적 제1 앰플리콘 및 식물-특이적 제1 앰플리콘을 획득한다. 제2 증폭을 주형으로서 병원체-특이적 제1 앰플리콘 및 식물-특이적 제1 앰플리콘 및 형광 표지로 표지되고, 병원체-특이적 제1 앰플리콘 내의 내부 측접 영역에 상보적인 서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍 및 형광 표지로 표지되고, 식물-특이적 제1 앰플리콘 내의 내부 측접 영역에 상보적인 서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍을 사용하여 탠뎀 방식으로 수행함으로써, 형광 표지 병원체-특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 식물-특이적 제2 앰플리콘을 획득한다. 본 명세서에 기재된 3차원 격자 마이크로어레이 시스템을 사용하여, 형광 표지 병원체-특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 식물 특이적 제2 앰플리콘을 병원체 DNA 및 식물 DNA의 시그니처 서열 결정자에 특이적인 핵산 프로브와 혼성화시키고, 상기 핵산을 형광 표지 이작용성 중합체 링커를 통해 3차원 격자 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에 고정시키며, 마이크로어레이를 적어도 1회 세척한다. 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 병원체 특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 식물 특이적 제2 앰플리콘으로부터의 형광 신호를 검출함으로써, 샘플 중 병원체 및 식물을 동시에 검출한다. 본 발명은 다수의 이작용성 중합체 링커 각각이 형광 표지를 포함하는 관련 방법에 관한 것이며, 본 방법은 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 형광 신호를 검출하는 단계 및 형광 표지 식물 특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 병원체 특이적 제2 앰플리콘의 신호를 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 신호에 중첩시킴으로써, 식물 샘플 내에서 검출되는 병원체 및 식물을 동시에 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 추가로 식물 샘플에서 하나 이상의 병원체 DNA에 대해 카피 수를 정량화하는 방법에 관한 것이다. 본 방법에서, 잠재적으로 병원체를 갖는 식물 조직 샘플을 수확하고, DNA를 포함하는 전체 핵산을 단리한다. 내부 기준 표준으로서, 적어도 하나의 합성 DNA 서열의 인지된 카피 수를 단리된 전체 핵산에 첨가하고, 각각의 합성 DNA 서열은 병원체 DNA에서의 시그니처 서열 결정자와 별개의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 중심 영역 및 병원체 DNA에서의 공통 서열(consensus sequence)과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5' 말단 및 3' 말단을 포함한다. 제1 증폭을 각각 병원체 DNA에 선택적인 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 적어도 하나의 제1 프라이머 쌍을 사용하여 전체 핵산에 대한 단일 분석에서 탠뎀 방식으로 수행함으로써, 하나 이상의 병원체 DNA-특이적 제1 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제1 앰플리콘을 획득한다. 제2 증폭을 주형으로서 병원체-특이적 제1 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제1 앰플리콘 및 각각의 프라이머 쌍은 형광 표지로 표지되고, 병원체-특이적 제1 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제1 앰플리콘 내의 내부 측접 영역에 상보적인 서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머를 갖는 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍을 사용하여 탠뎀 방식으로 수행함으로써, 각각 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘을 획득한다.
본 명세서에 기재된 3차원 격자 마이크로어레이 시스템을 사용하여, 제2 앰플리콘을 각각 병원체 DNA 및 합성 DNA 내의 시그니처 서열 결정자에 특이적인 핵산 프로브와 혼성화시키고, 핵산 프로브를 형광 표지 이작용성 중합체 링커를 통해 3차원 격자 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에 고정시키며, 마이크로어레이를 적어도 1회 세척한다. 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 이작용성 중합체 링커를 통해 마이크로어레이 상의 인식된 특이적 위치에 고정된 핵산 프로브에 해당하는 형광 신호, 및 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘 각각의 형광 신호를 검출한다. 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘의 형광 신호의 이미지를 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 이미지 상에 중첩시켜, 중첩된 신호 이미지를 획득하고, 마이크로어레이 상의 하나 이상의 중첩 신호 위치의 핵산 프로브의 서열을 다수의 병원체 DNA의 시그니처 서열 결정자의 데이터베이스와 비교함으로써, 샘플 중 병원체를 확인한다. 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘의 형광 신호로부터의 형광 신호 강도 및 단리된 전체 핵산에 첨가된 합성 DNA의 인지된 카피 수의 상관관계를 수학적으로 확인함으로써, 샘플 내의 병원체 DNA의 카피 수를 정량화한다.
본 발명은 추가로 단일 분석으로 식물 조직 샘플 중 하나 이상의 병원체 및 식물의 DNA의 카피 수를 동시에 정량화하는 방법에 관한 것이다. 본 방법에서, 잠재적으로 하나 이상의 병원체를 포함하는 식물 조직 샘플을 수확하고, 적어도 식물 조직 DNA 및 병원체 DNA를 포함하는 전체 핵산을 단리한다. 내부 기준 표준으로서, 적어도 하나의 합성 DNA 서열의 인지된 카피 수를 단리된 전체 핵산에 첨가하고, 각각의 합성 DNA 서열은 병원체 DNA 및 식물 DNA에서의 시그니처 서열 결정자와 별개의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 중심 영역 및 병원체 DNA에서의 공통 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5' 말단 및 3' 말단을 포함한다. 제1 증폭을 적어도 하나의 병원체-특이적 제1 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 합성 DNA-특이적 제1 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 식물-특이적 제1 프라이머 쌍을 사용하여 전체 핵산에 대한 단일 분석에서 탠뎀 방식으로 수행함으로써, 병원체 DNA-특이적 제1 앰플리콘, 식물 DNA-특이적 제1 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제1 앰플리콘을 획득한다. 제2 증폭을 주형으로서 제1 앰플리콘, 각각의 프라이머 쌍은 형광 표지로 표지되고, 각각 제1 앰플리콘 내의 내부 측접 영역에 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 병원체 DNA-특이적 제2 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 식물 DNA-특이적 제2 프라이머 쌍을 사용하여 탠뎀 방식으로 수행함으로써, 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 형광 표지 식물 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘을 획득한다.
본 명세서에 기재된 3차원 격자 마이크로어레이 시스템을 사용하여, 제2 앰플리콘을 각각 병원체 DNA, 식물 DNA 및 합성 DNA의 시그니처 서열 결정자에 특이적인 핵산 프로브와 혼성화시키고, 핵산 프로브를 형광 표지 이작용성 중합체 링커를 통해 3차원 격자 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에 고정시키고, 마이크로어레이를 적어도 1회 세척한다. 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 이작용성 중합체 링커를 통해 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에 고정된 핵산 프로브에 해당하는 형광 신호 및 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 형광 표지 식물 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘 각각에 해당하는 형광 신호를 검출한다. 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 형광 표지 식물 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘의 신호를 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 이미지 신호 상에 중첩시켜, 중첩된 신호 이미지를 획득하고, 마이크로어레이 상의 하나 이상의 중첩된 신호 위치의 핵산 프로브의 서열을 다수의 병원체 DNA 및 식물 DNA의 시그니처 서열 결정자의 데이터베이스와 비교하여, 샘플 중 병원체 및 식물을 확인한다. 식물 DNA-특이적 제2 앰플리콘으로부터의 형광 신호 강도와 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘으로부터의 형광 신호 강도 및 합성 DNA의 인지된 카피 수의 상관관계를 확인함으로써, 샘플 내의 식물 DNA의 카피 수를 정량화한다.
본 개시내용의 실시형태의 이들 및 다른 특징, 양상 및 이점은 첨부 도면을 참조하여 다음의 상세한 설명을 읽을 때 더 잘 이해될 것이며, 첨부 도면에서 유사한 문자는 도면 전체에 걸쳐 유사한 부분을 나타낸다:
본 개시내용의 실시형태의 이들 및 다른 특징, 양상 및 이점은 첨부 도면을 참조하여 다음의 상세한 설명을 읽을 때 더 잘 이해될 것이며, 첨부 도면에서 유사한 문자는 도면 전체에 걸쳐 유사한 부분을 나타낸다:
도 1a 내지 도 1d는 활성화된 표면에 프린팅된 프로브 및 이작용성 표지를 포함하는 공유 마이크로어레이 시스템을 도시한다. 도 1a는 구성요소 - 물 및 고 비등점 수혼화성 액체를 포함하는 용매 중 비변형 핵산 프로브, 아민-작용화된 (NH) 이작용성 중합체 링커 및 아민-작용화된 (NH) 형광 표지 이작용성 중합체 링커 및 화학적으로 활성화 가능한 기 (X)를 갖는 고체 지지체를 보여준다. 도 1b는 이작용성 중합체 링커와 화학적으로 활성화된 고체 지지체의 제1 단계 반응을 보여주며, 이작용성 중합체 링커는 아민 기에 의해 고체 지지체 상의 화학적으로 활성화된 기에 공유결합에 의해 부착된다. 도 1c는 반응물 - 핵산 프로브 및 이작용성 중합체 링커의 농도를 증가시키기 위해 용매로부터 물의 증발을 통한 농축의 제2 단계를 보여준다. 도 1d는 티미딘 염기를 통한 핵산 프로브의 증발된 표면 내의 이작용성 중합체 링커로의 UV 가교결합의 제3 단계를 보여주며, 일부 경우에는 이는 또한 핵산 프로브에 대한 가교결합을 통해 인접한 이작용성 중합체 링커를 함께 공유결합에 의해 연결하는 역할을 한다.
도 2a 내지 도 2d는 프로브 및 이작용성 중합체 링커를 포함하는 흡착성 마이크로어레이 시스템을 도시한다. 도 2a는 구성요소; 물 및 고 비등점 수혼화성 액체를 포함하는 용매 중 비변형 핵산 프로브 및 작용화된 (Rn) 이작용성 중합체 링커 및 유사하게 작용화된 형광 표지 이작용성 중합체 링커 및 고체 지지체를 보여주며, Rn 기는 고체 지지체 표면에의 흡착에 적합하다. 도 2b는 고체 지지체 상의 이작용성 중합체 링커의 제1 단계 흡착을 보여주며, 이작용성 중합체 링커는 Rn 기에 의해 고체 지지체에 비공유결합에 의해 부착된다. 도 2c는 반응물 - 핵산 프로브 및 이작용성 중합체 링커의 농도를 증가시키기 위해 용매로부터의 물의 증발을 통한 농축의 제2 단계를 보여준다. 도 2d는 티미딘 염기를 통한 핵산 프로브의 증발된 표면 내의 이작용성 중합체 링커 및 다른 핵산 프로브로의 UV 가교결합의 제3 단계를 보여주며, 일부 경우에는 이는 또한 핵산 프로브에 대한 가교결합을 통해 인접한 이작용성 중합체 링커를 함께 공유결합에 의해 연결하는 역할을 한다.
도 3a 내지 도 3c는 공유 마이크로어레이 시스템을 사용한 실험 데이터를 보여준다. 본 발명의 이 실시예에서, 이작용성 중합체 링커는 에폭시실란으로 이의 표면에서 화학적으로 활성화된 보로실리케이트 유리 고체 지지체와의 공유결합 연결에 적합한 이의 5' 말단에 Cy5 형광 염료가 부착되어 있고, 이의 3' 말단에 아미노기가 부착되어 있는 화학적으로 변형된 40개의 염기 길이의 올리고 데옥시티미딘 (올리고dT)이었다. 핵산 프로브는 용액 상태 표적에의 결합에 적합한 비변형 DNA 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 각각의 올리고뉴클레오타이드는 약 5 내지 7개의 티미딘으로 종결되어 중합체 (올리고dT) 링커의 상부 도메인 내의 티미딘과의 광화학적 가교결합(photochemical crosslinking)을 가능하게 한다.
도 3a는 635nm에서 시각화된 바와 같은 혼성화 및 세척 후 영상화된 마이크로어레이를 보여준다. 635nm 이미지는 각 마이크로어레이 스폿에서 위치 마커가 마이크로어레이 제작 동안 도입된 이작용성 중합체 링커 (올리고dT)의 5' 말단에 부착된 (적색) CY5 fluor의 신호로부터 도출된다.
도 3b는 532nm에서 시각화된 바와 같이 혼성화 및 세척 후 영상화된 마이크로어레이를 보여준다. 532nm 이미지는 DNA 포함 샘플의 PCR 반응 #2로부터 획득된 PCR 증폭 DNA의 5' 말단에 부착된 (녹색) CY3 fluor 신호로부터 도출된다.
도 3c는 532nm 및 635nm 이미지가 중첩되어 시각화된 바와 같이, 혼성화 및 세척 후 영상화된 마이크로어레이를 보여준다. 중첩된 이미지는 CY3 표지된 PCR 산물의 서열 특이적 결합과 관련된 Cy5 표지된 올리고dT 위치 마커의 병렬 부착의 유용성을 보여준다.
도 4a는 대마초 세척액 및 관련 식물 세척액으로부터 획득된 비정제 박테리아 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 16s 유전자 좌위 (모든 박테리아) 내에서 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 박테리아 분석을 위해 이러한 샘플로부터 표지 DNA를 증폭 및 염색하는데 사용된다.
도 4b는 대마초 세척액 및 관련 식물 세척액으로부터 획득된 비정제 박테리아 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 stx1 유전자 좌위 (병원성 E. 콜라이 (E. coli)) 내에서 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 박테리아 분석을 위해 이러한 샘플로부터 표지 DNA를 증폭 및 염색하는데 사용된다.
도 5a는 대마초 세척액 및 관련 식물 세척액으로부터 획득된 비정제 박테리아 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 stx2 유전자 좌위 (병원성 E. 콜라이) 내에서 2단계 PCR 반응으로 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 박테리아 분석을 위해 이러한 샘플로부터 표지 DNA를 증폭 및 염색하는데 사용된다.
도 5b는 대마초 세척액 및 관련 식물 세척액으로부터 획득된 비정제 박테리아 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 invA 유전자 좌위 (살모넬라) 내에서 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 박테리아 분석을 위해 이러한 샘플로부터 표지 DNA를 증폭 및 염색하는데 사용된다.
도 6은 대마초 세척액 및 관련 식물 세척액으로부터 획득된 비정제 박테리아 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 tuf 유전자 좌위 (E. 콜라이) 내에서 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 박테리아 분석을 위해 이러한 샘플로부터 표지 DNA를 증폭 및 염색하는데 사용된다.
도 7은 대마초 세척액 및 관련 식물 세척액으로부터 획득된 비정제 효모, 곰팡이 및 진균 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 ITS2 유전자 좌위 (효모 및 곰팡이) 내에서 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 효모 및 곰팡이 분석을 위해 이러한 샘플로부터 표지 DNA를 증폭 및 염색하는데 사용된다.
도 8은 대마초 세척액으로부터 획득된 비정제 DNA를 PCR 증폭하는데 사용되는 ITS1 유전자 좌위 (대마초 식물 대조군) 내에서 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 DNA 분석을 위해 이러한 샘플로부터 표지 DNA를 증폭 및 염색하는데 사용된다. 이 PCR 반응은 혼성화를 통해 내부 식물 숙주 제어 신호를 생성하는데 사용되며, 이는 동일한 마이크로어레이에서 마이크로어레이 분석에 의해 획득된 박테리아, 효모, 곰팡이 및 진균 신호를 정규화하는데 사용된다.
도 9는 비정제 대마초 세척액 또는 대마초 (및 관련 식물 물질)로부터의 다른 표면 샘플을 처리하여 미가공 대마초 또는 관련 식물 물질을 PCR 증폭한 다음, 해당 물질에 대한 마이크로어레이 분석을 수행하여 그 식물 샘플의 병원체 보체를 분석하는 과정을 도시하는 흐름도이다.
도 10은 핵산 프로브를 구현하는데 사용되는 마이크로어레이 형식의 대표적인 이미지이다. 이 대표적인 형식은 유리 슬라이드에 프린팅된 12개의 마이크로어레이로 구성되며 각 마이크로어레이는 Teflon 분할기로 분리된다 (좌측). 각 마이크로어레이는 전체 병원체 검출 패널을 4중 반복 실험으로 조회한다. 또한 대마초 및 관련 식물 물질의 병원체 분석을 위한 이러한 마이크로어레이 하나의 확대 이미지 (우측)를 보여준다. 각 마이크로어레이에 대한 Teflon 경계는 혼성화 분석을 위해 약 50 μL 유체 샘플을 위치화하는데 적합하며, 형광 표지 앰플리콘을 실온에서 30분 동안 마이크로어레이에 배치한 다음, 실온에서 세척한 후, 염료 표지화된 병원체 및 숙주 대마초 DNA를 마이크로어레이 이미지 스캐닝한다.
도 11a 및 도 11b는 정제된 박테리아 DNA 표준 (도 11a) 및 정제된 진균 DNA 표준 (도 11b)으로부터 획득된 대표적인 마이크로어레이 혼성화 데이터를 보여준다. 각각의 경우, 정제된 박테리아 DNA를 비정제 DNA와 같이, PCR 증폭한 다음, 상기에 기재된 마이크로어레이 프로브를 통해 마이크로어레이에서 혼성화한다. 데이터는 이 마이크로어레이 형식에서 각 박테리아가 실온 혼성화 및 세척을 통해 특이적으로 확인될 수 있음을 보여준다. 유사하게, 정제된 진균 DNA를 비정제 DNA와 같이, PCR 증폭된 다음, 상기에 기재된 마이크로어레이 프로브를 통해 마이크로어레이에서 혼성화한다. 데이터는 이 마이크로어레이 형식에서 각각의 진균 DNA가 실온 혼성화 및 세척을 통해 특이적으로 확인될 수 있음을 보여준다.
도 12는 5개의 대표적인 미가공 대마초 세척 샘플로부터 획득된 대표적인 마이크로어레이 혼성화 데이터를 보여준다. 각각의 경우, 이들 5개 샘플의 미가공 병원체 보체를 PCR 증폭한 다음, 상기에 기재된 마이크로어레이 프로브를 통해 마이크로어레이에서 혼성화한다. 데이터는 이 마이크로어레이 형식에서 특이적 박테리아, 효모, 곰팡이 및 진균 오염원이 실온 혼성화 및 세척을 통해 특이적으로 확인될 수 있음을 보여준다.
도 13은 대표적인 (미가공) 고도로 특성화된 칸디다 샘플과 비교하여 대표적인 미가공 대마초 세척 샘플로부터 획득된 대표적인 마이크로어레이 혼성화 데이터를 보여준다. 각각의 경우, 각 샘플의 미가공 병원체 보체를 PCR 증폭한 다음 상기에 기재된 마이크로어레이 프로브를 통해 마이크로어레이에서 혼성화한다. 데이터는 이 마이크로어레이 형식에서 특이적 진균 오염원이 미가공 대마초 세척액 또는 클로닝된 진균 샘플에서의 실온 혼성화 및 세척을 통해 특이적으로 확인될 수 있음을 보여준다.
도 14는 E. 콜라이를 포함하는 엔테로박테리아세아과의 박테리아의 저수준 검출을 위한 실시형태의 변형에 사용된 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 분석을 위해 표적화된 유기체로부터의 표지 DNA를 선택적으로 증폭 및 염색하는데 사용된다.
도 15a는 후물루스 루풀루스 (Humulus lupulus) (홉 식물)에 스파이킹 (spiking)된 특이적 박테리아의 열거된 콜로니로 구성된 검증된 기준 물질로부터 E. 콜라이 O157:H7의 저수준의 검출을 보여주는 마이크로어레이 혼성화 데이터를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15b는 후물루스 루풀루스 (홉 식물)에 스파이킹된 특이적 박테리아의 열거된 콜로니로 구성된 검증된 기준 물질로부터 E. 콜라이 O1111의 저수준의 검출을 보여주는 마이크로어레이 혼성화 데이터를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15c는 후물루스 루풀루스 (홉 식물)에 스파이킹된 특이적 박테리아의 열거된 콜로니로 구성된 검증된 기준 물질로부터 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica)의 저수준의 검출을 보여주는 마이크로어레이 혼성화 데이터를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 2개의 방법으로부터 샘플 수집 및 제조를 위한 다이어그램을 보여준다. 테이프 풀 (tape pull) 및 세척 방법은 모두 마이크로어레이 분석을 통한 미생물 검출 방법을 제공하기 위해 샘플을 처리하는데 사용된다.
도 17a는 대마초 세척액 또는 관련 식물 세척액에서 비정제 박테리아 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 2세트의 PCR 프라이머가 사용된다. 정방향 프라이머 (forward primer; FP) 및 역방향 프라이머 (reverse primer; RP)의 제1 세트는 "유전자 좌위 PCR" 단계를 지원하며, 이는 박테리아 재조합 DNA (rDNA)의 증폭이 모든 박테리아에 존재하는 16s 유전자 좌위를 기반으로 한다. 제2 프라이머 세트는 "표지화 PCR" 단계를 지원하며, 프라이머는 염료로 표지되고, 대상 박테리아에 특이적이다. 본 발명의 2개의 PCR 단계는 도 4a 및 도 4b와 상이하고, 1차 PCR을 수행하기 전에 내부 기준 표준으로서 합성 DNA 서열의 인지된 카피 수를 샘플에 첨가하고, 합성 DNA 서열은 샘플의 박테리아 서열과 구별되고, FP 및 RP의 서열에 상보적인 말단 서열을 가지며, 합성 DNA 서열은 샘플의 박테리아 서열과 공동 증폭된다.
도 17b는 대마초 세척액 또는 관련 식물 세척액에서 비정제 박테리아 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 2세트의 PCR 프라이머가 사용된다. 정방향 프라이머 (FP) 및 역방향 프라이머 (RP)의 제1 세트는 "유전자 좌위 PCR" 단계를 지원하며, 박테리아 게놈 DNA (DNA)의 증폭은 모든 박테리아에 존재하는 16s 유전자 좌위를 기반으로 한다. 제2 프라이머 세트는 "표지화 PCR" 단계를 지원하고, 프라이머는 염료로 표지되고, 대상 박테리아에 특이적이다. 본 발명의 2개의 PCR 단계는 도 4a 및 도 4b와 상이하고, 1차 PCR을 수행하기 전에 내부 기준 표준으로서 합성 DNA 서열의 인지된 카피 수를 샘플에 첨가하고, 합성 DNA 서열은 샘플의 박테리아 서열과 구별되고, FP 및 RP의 서열에 상보적인 말단 서열을 가지며, 합성 DNA 서열은 샘플의 박테리아 서열과 공동 증폭된다.
도 18은 대마초 세척액 또는 관련 식물 세척액에서 비정제 진핵생물 (예를 들어, 효모 또는 곰팡이) 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 2세트의 PCR 프라이머가 사용된다. 정방향 프라이머 (FP) 및 역방향 프라이머 (RP)의 제1 세트는 "유전자 좌위 PCR" 단계를 지원하며, 진핵생물 DNA의 증폭은 모든 진핵생물에 존재하는 ITS2 유전자 좌위를 기반으로 한다. 제2 프라이머 세트는 "표지화 PCR" 단계를 지원하고, 프라이머는 염료로 표지되고, 대상 진핵생물에 특이적이다. 본 발명의 2개의 PCR 단계는 도 4a 및 도 4b와 상이하고, 1차 PCR을 수행하기 전에 내부 기준 표준으로서 합성 DNA 서열의 인지된 카피 수를 샘플에 첨가하고, 합성 DNA 서열은 샘플의 진핵생물 서열과 구별되고, FP 및 RP의 서열에 상보적인 말단 서열을 가지며, 합성 DNA 서열은 샘플의 진핵생물 서열과 공동 증폭된다.
도 19a는 내부 기준 표준으로서 전체 효모 및 곰팡이 정량 대조군 (TYM Quant 대조군)의 3000개의 카피 (인지된 양)의 존재 하에 아스퍼길루스용 전체 효모 및 곰팡이 핵산 프로브 및 내부 표준용 TYM Quant 대조군 프로브를 사용하여 수행된 PCR 반응당 대략 0 내지 30,000개의 카피를 전달하도록 변이된 아스퍼길루스 플라부스 (Aspergillus flavus) 내의 ITS2 영역의 계산된 카피를 도시한다. 아스퍼길루스 (미지의 카피 수) 및 TYM 내부 기준 표준 (인지된 카피 수)의 적정 곡선 사이의 아스퍼길루스 및 TYM Quant 대조군 (화살표) 각각에 대한 3000개 카피의 교차 지점은 샘플에서 아스퍼길루스 DNA의 카피 수를 나타낸다.
도 19b는 내부 기준 표준으로서 전체 효모 및 곰팡이 정량 대조군 (TYM Quant 대조군)의 3000개의 카피 (인지된 양)의 존재 하에 아스퍼길루스용 전체 효모 및 곰팡이 핵산 프로브 및 내부 표준용 TYM Quant 대조군 프로브를 사용하여 수행된 PCR 반응당 대략 0 내지 30,000개의 카피를 전달하도록 변이된 사카로마이세스 세레비시아에 (Sacharomyces cerevisiae) 내의 ITS2 영역의 계산된 카피를 도시한다. 아스퍼길루스 (미지의 카피 수) 및 TYM 내부 기준 표준 (인지된 카피 수)의 적정 곡선 사이의 아스퍼길루스 및 TYM Quant 대조군 (화살표) 각각에 대한 3000개 카피의 교차 지점은 샘플에서 아스퍼길루스 DNA의 카피 수를 나타낸다.
본 개시내용의 실시형태의 이들 및 다른 특징, 양상 및 이점은 첨부 도면을 참조하여 다음의 상세한 설명을 읽을 때 더 잘 이해될 것이며, 첨부 도면에서 유사한 문자는 도면 전체에 걸쳐 유사한 부분을 나타낸다:
도 1a 내지 도 1d는 활성화된 표면에 프린팅된 프로브 및 이작용성 표지를 포함하는 공유 마이크로어레이 시스템을 도시한다. 도 1a는 구성요소 - 물 및 고 비등점 수혼화성 액체를 포함하는 용매 중 비변형 핵산 프로브, 아민-작용화된 (NH) 이작용성 중합체 링커 및 아민-작용화된 (NH) 형광 표지 이작용성 중합체 링커 및 화학적으로 활성화 가능한 기 (X)를 갖는 고체 지지체를 보여준다. 도 1b는 이작용성 중합체 링커와 화학적으로 활성화된 고체 지지체의 제1 단계 반응을 보여주며, 이작용성 중합체 링커는 아민 기에 의해 고체 지지체 상의 화학적으로 활성화된 기에 공유결합에 의해 부착된다. 도 1c는 반응물 - 핵산 프로브 및 이작용성 중합체 링커의 농도를 증가시키기 위해 용매로부터 물의 증발을 통한 농축의 제2 단계를 보여준다. 도 1d는 티미딘 염기를 통한 핵산 프로브의 증발된 표면 내의 이작용성 중합체 링커로의 UV 가교결합의 제3 단계를 보여주며, 일부 경우에는 이는 또한 핵산 프로브에 대한 가교결합을 통해 인접한 이작용성 중합체 링커를 함께 공유결합에 의해 연결하는 역할을 한다.
도 2a 내지 도 2d는 프로브 및 이작용성 중합체 링커를 포함하는 흡착성 마이크로어레이 시스템을 도시한다. 도 2a는 구성요소; 물 및 고 비등점 수혼화성 액체를 포함하는 용매 중 비변형 핵산 프로브 및 작용화된 (Rn) 이작용성 중합체 링커 및 유사하게 작용화된 형광 표지 이작용성 중합체 링커 및 고체 지지체를 보여주며, Rn 기는 고체 지지체 표면에의 흡착에 적합하다. 도 2b는 고체 지지체 상의 이작용성 중합체 링커의 제1 단계 흡착을 보여주며, 이작용성 중합체 링커는 Rn 기에 의해 고체 지지체에 비공유결합에 의해 부착된다. 도 2c는 반응물 - 핵산 프로브 및 이작용성 중합체 링커의 농도를 증가시키기 위해 용매로부터의 물의 증발을 통한 농축의 제2 단계를 보여준다. 도 2d는 티미딘 염기를 통한 핵산 프로브의 증발된 표면 내의 이작용성 중합체 링커 및 다른 핵산 프로브로의 UV 가교결합의 제3 단계를 보여주며, 일부 경우에는 이는 또한 핵산 프로브에 대한 가교결합을 통해 인접한 이작용성 중합체 링커를 함께 공유결합에 의해 연결하는 역할을 한다.
도 3a 내지 도 3c는 공유 마이크로어레이 시스템을 사용한 실험 데이터를 보여준다. 본 발명의 이 실시예에서, 이작용성 중합체 링커는 에폭시실란으로 이의 표면에서 화학적으로 활성화된 보로실리케이트 유리 고체 지지체와의 공유결합 연결에 적합한 이의 5' 말단에 Cy5 형광 염료가 부착되어 있고, 이의 3' 말단에 아미노기가 부착되어 있는 화학적으로 변형된 40개의 염기 길이의 올리고 데옥시티미딘 (올리고dT)이었다. 핵산 프로브는 용액 상태 표적에의 결합에 적합한 비변형 DNA 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 각각의 올리고뉴클레오타이드는 약 5 내지 7개의 티미딘으로 종결되어 중합체 (올리고dT) 링커의 상부 도메인 내의 티미딘과의 광화학적 가교결합(photochemical crosslinking)을 가능하게 한다.
도 3a는 635nm에서 시각화된 바와 같은 혼성화 및 세척 후 영상화된 마이크로어레이를 보여준다. 635nm 이미지는 각 마이크로어레이 스폿에서 위치 마커가 마이크로어레이 제작 동안 도입된 이작용성 중합체 링커 (올리고dT)의 5' 말단에 부착된 (적색) CY5 fluor의 신호로부터 도출된다.
도 3b는 532nm에서 시각화된 바와 같이 혼성화 및 세척 후 영상화된 마이크로어레이를 보여준다. 532nm 이미지는 DNA 포함 샘플의 PCR 반응 #2로부터 획득된 PCR 증폭 DNA의 5' 말단에 부착된 (녹색) CY3 fluor 신호로부터 도출된다.
도 3c는 532nm 및 635nm 이미지가 중첩되어 시각화된 바와 같이, 혼성화 및 세척 후 영상화된 마이크로어레이를 보여준다. 중첩된 이미지는 CY3 표지된 PCR 산물의 서열 특이적 결합과 관련된 Cy5 표지된 올리고dT 위치 마커의 병렬 부착의 유용성을 보여준다.
도 4a는 대마초 세척액 및 관련 식물 세척액으로부터 획득된 비정제 박테리아 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 16s 유전자 좌위 (모든 박테리아) 내에서 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 박테리아 분석을 위해 이러한 샘플로부터 표지 DNA를 증폭 및 염색하는데 사용된다.
도 4b는 대마초 세척액 및 관련 식물 세척액으로부터 획득된 비정제 박테리아 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 stx1 유전자 좌위 (병원성 E. 콜라이 (E. coli)) 내에서 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 박테리아 분석을 위해 이러한 샘플로부터 표지 DNA를 증폭 및 염색하는데 사용된다.
도 5a는 대마초 세척액 및 관련 식물 세척액으로부터 획득된 비정제 박테리아 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 stx2 유전자 좌위 (병원성 E. 콜라이) 내에서 2단계 PCR 반응으로 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 박테리아 분석을 위해 이러한 샘플로부터 표지 DNA를 증폭 및 염색하는데 사용된다.
도 5b는 대마초 세척액 및 관련 식물 세척액으로부터 획득된 비정제 박테리아 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 invA 유전자 좌위 (살모넬라) 내에서 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 박테리아 분석을 위해 이러한 샘플로부터 표지 DNA를 증폭 및 염색하는데 사용된다.
도 6은 대마초 세척액 및 관련 식물 세척액으로부터 획득된 비정제 박테리아 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 tuf 유전자 좌위 (E. 콜라이) 내에서 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 박테리아 분석을 위해 이러한 샘플로부터 표지 DNA를 증폭 및 염색하는데 사용된다.
도 7은 대마초 세척액 및 관련 식물 세척액으로부터 획득된 비정제 효모, 곰팡이 및 진균 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 ITS2 유전자 좌위 (효모 및 곰팡이) 내에서 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 효모 및 곰팡이 분석을 위해 이러한 샘플로부터 표지 DNA를 증폭 및 염색하는데 사용된다.
도 8은 대마초 세척액으로부터 획득된 비정제 DNA를 PCR 증폭하는데 사용되는 ITS1 유전자 좌위 (대마초 식물 대조군) 내에서 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 DNA 분석을 위해 이러한 샘플로부터 표지 DNA를 증폭 및 염색하는데 사용된다. 이 PCR 반응은 혼성화를 통해 내부 식물 숙주 제어 신호를 생성하는데 사용되며, 이는 동일한 마이크로어레이에서 마이크로어레이 분석에 의해 획득된 박테리아, 효모, 곰팡이 및 진균 신호를 정규화하는데 사용된다.
도 9는 비정제 대마초 세척액 또는 대마초 (및 관련 식물 물질)로부터의 다른 표면 샘플을 처리하여 미가공 대마초 또는 관련 식물 물질을 PCR 증폭한 다음, 해당 물질에 대한 마이크로어레이 분석을 수행하여 그 식물 샘플의 병원체 보체를 분석하는 과정을 도시하는 흐름도이다.
도 10은 핵산 프로브를 구현하는데 사용되는 마이크로어레이 형식의 대표적인 이미지이다. 이 대표적인 형식은 유리 슬라이드에 프린팅된 12개의 마이크로어레이로 구성되며 각 마이크로어레이는 Teflon 분할기로 분리된다 (좌측). 각 마이크로어레이는 전체 병원체 검출 패널을 4중 반복 실험으로 조회한다. 또한 대마초 및 관련 식물 물질의 병원체 분석을 위한 이러한 마이크로어레이 하나의 확대 이미지 (우측)를 보여준다. 각 마이크로어레이에 대한 Teflon 경계는 혼성화 분석을 위해 약 50 μL 유체 샘플을 위치화하는데 적합하며, 형광 표지 앰플리콘을 실온에서 30분 동안 마이크로어레이에 배치한 다음, 실온에서 세척한 후, 염료 표지화된 병원체 및 숙주 대마초 DNA를 마이크로어레이 이미지 스캐닝한다.
도 11a 및 도 11b는 정제된 박테리아 DNA 표준 (도 11a) 및 정제된 진균 DNA 표준 (도 11b)으로부터 획득된 대표적인 마이크로어레이 혼성화 데이터를 보여준다. 각각의 경우, 정제된 박테리아 DNA를 비정제 DNA와 같이, PCR 증폭한 다음, 상기에 기재된 마이크로어레이 프로브를 통해 마이크로어레이에서 혼성화한다. 데이터는 이 마이크로어레이 형식에서 각 박테리아가 실온 혼성화 및 세척을 통해 특이적으로 확인될 수 있음을 보여준다. 유사하게, 정제된 진균 DNA를 비정제 DNA와 같이, PCR 증폭된 다음, 상기에 기재된 마이크로어레이 프로브를 통해 마이크로어레이에서 혼성화한다. 데이터는 이 마이크로어레이 형식에서 각각의 진균 DNA가 실온 혼성화 및 세척을 통해 특이적으로 확인될 수 있음을 보여준다.
도 12는 5개의 대표적인 미가공 대마초 세척 샘플로부터 획득된 대표적인 마이크로어레이 혼성화 데이터를 보여준다. 각각의 경우, 이들 5개 샘플의 미가공 병원체 보체를 PCR 증폭한 다음, 상기에 기재된 마이크로어레이 프로브를 통해 마이크로어레이에서 혼성화한다. 데이터는 이 마이크로어레이 형식에서 특이적 박테리아, 효모, 곰팡이 및 진균 오염원이 실온 혼성화 및 세척을 통해 특이적으로 확인될 수 있음을 보여준다.
도 13은 대표적인 (미가공) 고도로 특성화된 칸디다 샘플과 비교하여 대표적인 미가공 대마초 세척 샘플로부터 획득된 대표적인 마이크로어레이 혼성화 데이터를 보여준다. 각각의 경우, 각 샘플의 미가공 병원체 보체를 PCR 증폭한 다음 상기에 기재된 마이크로어레이 프로브를 통해 마이크로어레이에서 혼성화한다. 데이터는 이 마이크로어레이 형식에서 특이적 진균 오염원이 미가공 대마초 세척액 또는 클로닝된 진균 샘플에서의 실온 혼성화 및 세척을 통해 특이적으로 확인될 수 있음을 보여준다.
도 14는 E. 콜라이를 포함하는 엔테로박테리아세아과의 박테리아의 저수준 검출을 위한 실시형태의 변형에 사용된 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 이러한 PCR 프라이머는 마이크로어레이 혼성화를 통한 분석을 위해 표적화된 유기체로부터의 표지 DNA를 선택적으로 증폭 및 염색하는데 사용된다.
도 15a는 후물루스 루풀루스 (Humulus lupulus) (홉 식물)에 스파이킹 (spiking)된 특이적 박테리아의 열거된 콜로니로 구성된 검증된 기준 물질로부터 E. 콜라이 O157:H7의 저수준의 검출을 보여주는 마이크로어레이 혼성화 데이터를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15b는 후물루스 루풀루스 (홉 식물)에 스파이킹된 특이적 박테리아의 열거된 콜로니로 구성된 검증된 기준 물질로부터 E. 콜라이 O1111의 저수준의 검출을 보여주는 마이크로어레이 혼성화 데이터를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15c는 후물루스 루풀루스 (홉 식물)에 스파이킹된 특이적 박테리아의 열거된 콜로니로 구성된 검증된 기준 물질로부터 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica)의 저수준의 검출을 보여주는 마이크로어레이 혼성화 데이터를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 2개의 방법으로부터 샘플 수집 및 제조를 위한 다이어그램을 보여준다. 테이프 풀 (tape pull) 및 세척 방법은 모두 마이크로어레이 분석을 통한 미생물 검출 방법을 제공하기 위해 샘플을 처리하는데 사용된다.
도 17a는 대마초 세척액 또는 관련 식물 세척액에서 비정제 박테리아 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 2세트의 PCR 프라이머가 사용된다. 정방향 프라이머 (forward primer; FP) 및 역방향 프라이머 (reverse primer; RP)의 제1 세트는 "유전자 좌위 PCR" 단계를 지원하며, 이는 박테리아 재조합 DNA (rDNA)의 증폭이 모든 박테리아에 존재하는 16s 유전자 좌위를 기반으로 한다. 제2 프라이머 세트는 "표지화 PCR" 단계를 지원하며, 프라이머는 염료로 표지되고, 대상 박테리아에 특이적이다. 본 발명의 2개의 PCR 단계는 도 4a 및 도 4b와 상이하고, 1차 PCR을 수행하기 전에 내부 기준 표준으로서 합성 DNA 서열의 인지된 카피 수를 샘플에 첨가하고, 합성 DNA 서열은 샘플의 박테리아 서열과 구별되고, FP 및 RP의 서열에 상보적인 말단 서열을 가지며, 합성 DNA 서열은 샘플의 박테리아 서열과 공동 증폭된다.
도 17b는 대마초 세척액 또는 관련 식물 세척액에서 비정제 박테리아 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 2세트의 PCR 프라이머가 사용된다. 정방향 프라이머 (FP) 및 역방향 프라이머 (RP)의 제1 세트는 "유전자 좌위 PCR" 단계를 지원하며, 박테리아 게놈 DNA (DNA)의 증폭은 모든 박테리아에 존재하는 16s 유전자 좌위를 기반으로 한다. 제2 프라이머 세트는 "표지화 PCR" 단계를 지원하고, 프라이머는 염료로 표지되고, 대상 박테리아에 특이적이다. 본 발명의 2개의 PCR 단계는 도 4a 및 도 4b와 상이하고, 1차 PCR을 수행하기 전에 내부 기준 표준으로서 합성 DNA 서열의 인지된 카피 수를 샘플에 첨가하고, 합성 DNA 서열은 샘플의 박테리아 서열과 구별되고, FP 및 RP의 서열에 상보적인 말단 서열을 가지며, 합성 DNA 서열은 샘플의 박테리아 서열과 공동 증폭된다.
도 18은 대마초 세척액 또는 관련 식물 세척액에서 비정제 진핵생물 (예를 들어, 효모 또는 곰팡이) 오염을 PCR 증폭하는데 사용되는 PCR 프라이머의 위치를 그래프로 나타낸 것이다. 2세트의 PCR 프라이머가 사용된다. 정방향 프라이머 (FP) 및 역방향 프라이머 (RP)의 제1 세트는 "유전자 좌위 PCR" 단계를 지원하며, 진핵생물 DNA의 증폭은 모든 진핵생물에 존재하는 ITS2 유전자 좌위를 기반으로 한다. 제2 프라이머 세트는 "표지화 PCR" 단계를 지원하고, 프라이머는 염료로 표지되고, 대상 진핵생물에 특이적이다. 본 발명의 2개의 PCR 단계는 도 4a 및 도 4b와 상이하고, 1차 PCR을 수행하기 전에 내부 기준 표준으로서 합성 DNA 서열의 인지된 카피 수를 샘플에 첨가하고, 합성 DNA 서열은 샘플의 진핵생물 서열과 구별되고, FP 및 RP의 서열에 상보적인 말단 서열을 가지며, 합성 DNA 서열은 샘플의 진핵생물 서열과 공동 증폭된다.
도 19a는 내부 기준 표준으로서 전체 효모 및 곰팡이 정량 대조군 (TYM Quant 대조군)의 3000개의 카피 (인지된 양)의 존재 하에 아스퍼길루스용 전체 효모 및 곰팡이 핵산 프로브 및 내부 표준용 TYM Quant 대조군 프로브를 사용하여 수행된 PCR 반응당 대략 0 내지 30,000개의 카피를 전달하도록 변이된 아스퍼길루스 플라부스 (Aspergillus flavus) 내의 ITS2 영역의 계산된 카피를 도시한다. 아스퍼길루스 (미지의 카피 수) 및 TYM 내부 기준 표준 (인지된 카피 수)의 적정 곡선 사이의 아스퍼길루스 및 TYM Quant 대조군 (화살표) 각각에 대한 3000개 카피의 교차 지점은 샘플에서 아스퍼길루스 DNA의 카피 수를 나타낸다.
도 19b는 내부 기준 표준으로서 전체 효모 및 곰팡이 정량 대조군 (TYM Quant 대조군)의 3000개의 카피 (인지된 양)의 존재 하에 아스퍼길루스용 전체 효모 및 곰팡이 핵산 프로브 및 내부 표준용 TYM Quant 대조군 프로브를 사용하여 수행된 PCR 반응당 대략 0 내지 30,000개의 카피를 전달하도록 변이된 사카로마이세스 세레비시아에 (Sacharomyces cerevisiae) 내의 ITS2 영역의 계산된 카피를 도시한다. 아스퍼길루스 (미지의 카피 수) 및 TYM 내부 기준 표준 (인지된 카피 수)의 적정 곡선 사이의 아스퍼길루스 및 TYM Quant 대조군 (화살표) 각각에 대한 3000개 카피의 교차 지점은 샘플에서 아스퍼길루스 DNA의 카피 수를 나타낸다.
본 발명의 일 실시형태에서, 전면 및 후면을 갖는 고체 지지체; 각각 상부 도메인 및 하부 말단을 가지며, 하부 말단이 고체 지지체에 부착된 다수의 이작용성 중합체 링커; 및 다수의 이작용성 중합체 링커 각각의 상부 도메인에 부착된 다수의 핵산 프로브를 포함하는 3차원 격자 마이크로어레이 시스템이 제공된다.
본 실시형태에서, 당 업계에 공지된 임의의 적합한 물질이 고체 지지체를 포함할 수 있으나, 고체 지지체는 보로실리케이트 유리, 불활성 금속, 열가소성 아크릴 수지, 사이클로올레핀 중합체, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리카보네이트, 나일론, 세라믹, 조작된 탄소 표면(engineered carbon surface) 또는 이의 조합일 수 있다. 예를 들어, 적합한 열가소성 아크릴 수지는 폴리(메틸메타크릴레이트-VSUVT (PMMA-VSUVT)이고, 적합한 사이클로올레핀 중합체는 ZEONOR® 1060R이고, 적합한 불활성 금속은 금, 백금, TiO2, 인듐 주석 산화물 (ITO)이며, 적합한 조작된 탄소 표면은 그래핀 (graphene)이다.
또한, 본 실시형태에서, 고체 지지체는 그의 전면에 부착된 화학적으로 활성화 가능한 다수의 기를 추가로 포함할 수 있으며, 다수의 이작용성 중합체 링커는 그의 하부 말단에 의해 화학적으로 활성화 가능한 다수의 기 각각에 공유결합에 의해 부착된다. 특히, 화학적으로 활성화 가능한 기는 에폭시실란기, 말레이미도기, 아미노기, 활성화된 카복실산 에스테르, 이소시아네이트, 숙신이미드, 카보디이미드, 또는 알데하이드일 수 있다. 바람직하게는, 고체 지지체는 에폭시실란 작용화된 보로실리케이트 유리 지지체이다. 이는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 당업자는 기재된 바와 같은 이러한 지지체 중 임의의 것을 용이하게 작용화할 수 있다.
또한 본 실시형태에서, 각각의 이작용성 중합체 링커는 상부 도메인의 말단에 공유결합에 의해 부착되거나, 내부에 공유결합에 의해 부착된 형광 표지를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 형광 표지는 Cy5, DYLIGHT DY647, ALEXA FLUOR 647, Cy3, DYLIGHT DY547, 또는 ALEXA FLUOR 550일 수 있다. 특히, 다수의 이작용성 중합체 링커 각각은 올리고뉴클레오타이드, 아미노 다당류, 폴리아민 또는 폴리아미노산이다. 올리고뉴클레오타이드의 예는 올리고dT, 5'- 올리고dT, 5'-디곡시제닌 올리고dT, 5'-피렌 올리고dT 또는 5'-Cy5 올리고dT이고, 아미노 다당류의 예는 키토산이고, 폴리아민의 예는 스페르민 (spermine), 스페르미딘 (spermidine), 카다베린 (cadaverine) 및 푸트레신 (putrescine)이고, 폴리아미노산의 예는 리신 또는 히스티딘을 포함할 수 있거나, 이작용성 중합체 링커는 상부 도메인 상의 핵산 프로브 및 하부 말단 상에 화학적으로 활성화 가능한 고체 지지체에 부착될 수 있는 2중 작용기를 갖는 임의의 다른 중합체 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 이작용성 중합체 링커는 5' 말단에 아민기를 갖는 올리고dT이다.
본 실시형태의 일 양상에서, 다수의 이작용성 중합체 링커 각각은 고체 지지체 내의 화학적으로 활성화 가능한 기에 공유결합에 의해 부착되는 하부 말단의 제1 반응성 모이어티 또는 각각의 다수의 핵산에 공유결합에 의해 부착된 상부 도메인의 제2 반응성 모이어티 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 특히, 제1 반응성 모이어티는 아미노기, 티올기, 알데하이드기 또는 카복실레이트, 바람직하게는, 아미노기일 수 있다. 특히, 제2 반응성 모이어티는 뉴클레오타이드 염기, 아미노산 또는 아미노당류(aminosaccharide)일 수 있다. 예를 들어, 제2 반응성 모이어티는 티미딘, 아데닌, 구아닌, 시티딘, 우라실 또는 브로모데옥시우리딘일 수 있다. 대안적으로, 제2 반응성 모이어티는 시스테인, 페닐알라닌, 티로신, 글리신, 세린, 트립토판, 시스틴, 메티오닌, 히스티딘, 아르기닌, 리신 또는 아미노당류일 수 있다. 이러한 반응성 기의 화학 반응은 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 당업자는 형광 표지를 부착시키기 위해 선택된 이작용성 중합체 링커 상의 적합한 기를 용이하게 확인할 수 있다. 바람직하게는, 이작용성 중합체 링커는 고체 지지체 상의 활성화된 표면에 공유결합 부착을 위해 이의 3' 말단에 부착된 아미노기를 갖는 Cy5-표지 올리고dT이다.
본 실시형태의 또 다른 양상에서, 다수의 이작용성 중합체 링커 각각은 고체 지지체에 비공유결합에 의해 부착되는 하부 말단에 흡착성 기를 가질 수 있다. 이러한 양상에서, 흡착성 기는 단일 가닥 핵산, 아민-다당류 또는 연장된 평면 소수성 기일 수 있다. 일반적으로, 흡착성 기는 고체 지지체의 전면과의 비공유결합 흡착성 부착에 적합한 하나 이상의 작용기 ("Rn"으로 지정됨)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 가닥 핵산 적합성 흡착성 R기는 올리고dT일 수 있거나, 아민-다당류 적합성 흡착성 R기는 키토산일 수 있거나, 연장된 평면 소수성 기 적합성 흡착성 R기는 디곡시제닌, 피렌, 또는 Cy-5 염료일 수 있다.
또한 본 실시형태에서, 각각의 다수의 핵산 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 적어도 3개의 말단 티미딘 염기를 가질 수 있다. 일 양상에서 티미딘 염기는 다수의 이작용성 중합체 링커 각각 상의 제2 반응성 모이어티에 공유결합에 의해 부착될 수 있다. 또한 핵산 프로브는 병원체, 식물 또는 동물의 시그니처 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있다.
관련 실시형태에서, 전면 및 후면을 갖는 고체 지지체; 각각 상부 도메인 및 하부 말단을 가지고, 형광 표지가 상부 도메인의 말단에 공유결합에 의해 부착되거나, 내부에 공유결합에 의해 부착되고, 하부 말단이 고체 지지체에 부착된 다수의 이작용성 중합체 링커; 및 다수의 이작용성 중합체 링커 각각의 상부 도메인에 부착된 다수의 핵산 프로브를 포함하는 3차원 격자 마이크로어레이 시스템이 제공된다.
또한 이 실시형태에 고체 지지체는 그의 전면에 부착된 화학적으로 활성화 가능한 다수의 기를 포함하고, 다수의 이작용성 중합체 링커는 다수의 화학적으로 활성화 가능한 기에 공유결합에 의해 부착된다. 이러한 추가의 실시형태에서, 화학적으로 활성화 가능한 기는 에폭시실란기, 말레이미도기, 아미노기 또는 활성화된 카복실산 에스테르일 수 있다. 두 실시형태 모두에서 고체 지지체는 보로실리케이트 유리, 불활성 금속, 열가소성 아크릴 수지, 사이클로올레핀 중합체, 폴리에렌 테레프탈레이트, 폴리카보네이트, 나일론, 세라믹, 조작된 탄소 표면 또는 이의 조합일 수 있다. 모든 실시형태에서, 화학적으로 활성화 가능한 기 대 이작용성 중합체 링커의 몰비는 약 10 초과이다.
두 실시형태 모두의 일 양상에서, 다수의 이작용성 중합체 링커는 고체 지지체 내의 화학적으로 활성화 가능한 기에 공유결합에 의해 부착되는 하부 말단의 제1 반응성 모이어티 또는 다수의 핵산에 공유결합에 의해 부착된 상부 도메인의 제2 반응성 모이어티 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 제1 반응성 모이어티는 아미노기, 티올기, 알데하이드기 또는 카복실레이트일 수 있다. 제2 반응성 모이어티는 뉴클레오타이드 염기, 아미노산 또는 아미노당류일 수 있다. 뉴클레오타이드 염기의 예는 티미딘, 아데닌, 구아닌, 시티딘, 우라실 또는 브로모데옥시우리딘이다. 아미노산의 예는 시스테인, 페닐알라닌, 티로신 글리신, 세린, 트립토판, 시스틴, 메티오닌, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신이다.
두 실시형태 모두의 또 다른 양상에서, 이작용성 중합체는 이의 하부 말단에 흡착성 기를 포함할 수 있다. 이러한 양상에서, 흡착성 기는 단일 가닥 핵산, 아민-다당류 또는 연장된 평면 소수성 기일 수 있다. 단일 가닥 핵산의 예는 올리고dT 또는 균등한 티미딘 다존재 핵산이다. 아민-다당류의 예는 키토산이다. 연장된 평면 소수성 기의 예는 피렌, 디곡시제닌, 또는 Cy5 염료이다.
그의 실시형태 및 양상 둘 모두에서, 이작용성 중합체 링커는 올리고뉴클레오타이드, 아미노 다당류, 폴리아민 또는 폴리아미노산일 수 있다. 특히, 올리고뉴클레오타이드는 올리고dT 또는 비균등한 티미딘 다존재 핵산이다. 또한 이작용성 중합체 링커 대 핵산 프로브 사이의 몰비는 0.1 초과일 수 있다.
또한 그의 실시형태 및 양상 둘 모두에서, 각각의 다수의 핵산 프로브는 이의 5' 말단 및 3' 말단에 적어도 3개의 말단 티미딘 염기를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태 및 양상에서, 티미딘 염기는 이작용성 중합체 링커 상의 제2 반응성 모이어티에 공유결합에 의해 부착될 수 있다. 또한 핵산 프로브는 병원체, 식물 또는 동물의 시그니처 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있다.
또 다른 관련 실시형태에서, 전면 및 후면을 갖는 고체 지지체; 각각 상부 도메인 및 하부 말단을 가지며, 하부 말단이 고체 지지체에 부착된 다수의 이작용성 중합체 링커; 및 이작용성 중합체 링커의 상부 도메인에 부착된 병원체, 식물 또는 동물 내의 시그니처 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는 다수의 핵산 프로브를 포함하는 공유결합에 의해 결합된 3차원 격자 마이크로어레이 시스템이 제공된다.
또한 이 실시형태에 고체 지지체는 이의 전면에 부착된 화학적으로 활성화 가능한 다수의 기를 포함하며, 다수의 이작용성 중합체 링커는 다수의 화학적으로 활성화 가능한 기에 공유결합에 의해 부착된다. 이러한 추가의 실시형태에서, 화학적으로 활성화 가능한 기, 이작용성 중합체 링커에 대한 이의 몰비 및 고체 지지체는 상기 기재된 바와 같다.
또 다른 추가의 실시형태에서, 이작용성 중합체 링커는 이의 상부 도메인의 말단에 공유결합에 의해 부착되거나, 내부에 공유결합에 의해 부착된 형광 표지를 포함할 수 있다. 이러한 추가의 실시형태에서, 이작용성 중합체 링커, 이에 부착된 제1 반응성 모이어티, 이에 부착된 제2 반응성 모이어티, 이에 부착된 형광 표지, 흡착성 기, 및 이작용성 중합체 링커 대 핵산 프로브의 몰비는 상기 기재된 바와 같다.
또한 모든 실시형태 및 이의 양상에서, 각각의 다수의 핵산 프로브는 이의 5' 말단 및 3' 말단에 적어도 3개의 말단 티미딘 염기를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태 및 양상에서, 티미딘 염기는 이작용성 중합체 링커 상의 제2 반응성 모이어티에 공유결합에 의해 부착될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템의 제조 방법으로서, 상기 기재된 바와 같은 3차원 격자 마이크로어레이 시스템 내의 고체 지지체와 다수의 핵산 프로브를 포함하는 제형을 접촉시키는 단계; 다수의 이작용성 중합체 링커; 및 물 및 100℃ 이상의 비등점을 갖는 수혼화성 액체를 포함하는 용매 혼합물; 제1 부착 반응으로서 고체 지지체의 전면에 이작용성 중합체 링커의 하부 말단을 부착시키는 단계; 용매 혼합물 내의 물을 증발시켜, 다수의 핵산 프로브 및 고체 지지체에 부착된 다수의 이작용성 중합체 링커를 농축시키는 단계; 제2 부착 반응으로서 이작용성 중합체 링커의 상부 도메인에 각각의 핵산 프로브를 공유결합에 의해 부착시키는 단계; 및 고체 지지체를 적어도 1회 세척하여, 비부착 이작용성 중합체 링커 및 핵산 프로브를 제거하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 실시형태에서, 일 양상에서, 고체 지지체에 대한 다수의 이작용성 중합체 링커의 제1 부착 반응은 다수의 이작용성 중합체 링커의 하부 말단 상의 제1 반응성 모이어티 및 고체 지지체 상의 화학적으로 활성화 가능한 기 사이의 공유결합 연결에 의해 이루어진다. 이러한 양상에서, 화학적으로 활성화 가능한 기 대 이작용성 중합체 링커의 몰비는 10 초과이다. 또 다른 양상에서, 제1 부착은 다수의 이작용성 중합체 링커의 하부 말단 및 고체 지지체의 전면 사이의 흡착 또는 정전기적 결합에 의해 이루어질 수 있다. 본 실시형태 및 이의 양상에서, 제1 부착 반응은 0℃ 내지 40℃의 온도에서 이루어질 수 있다. 또한 제1 부착 반응은 약 5분 내지 약 100분 동안 이루어진다. 또한 물의 증발 단계는 20℃ 내지 40℃의 온도에서 이루어진다. 추가로 물의 증발 단계는 약 1시간 내지 약 24시간 동안 이루어진다.
또한 본 실시형태에서, 제2 부착 반응은 다수의 핵산 프로브에 대한 다수의 이작용성 중합체 링커 각각의 상부 도메인의 제2 반응성 모이어티의 광화학적 가교결합에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어 광화학적 가교결합은 다수의 이작용성 중합체 링커의 상부 도메인에 존재하는 말단 티미딘 염기를 통해 이루어진다. 본 실시형태에서, 광화학적 가교결합은 자외선 또는 레이저 공급원에의 노출에 의해 이루어진다. 특히, 자외선은 254 nm의 파장 및 300 mjoule의 에너지를 가질 수 있다. 본 실시형태에서, 이작용성 중합체 링커 대 핵산 프로브의 몰비는 0.1 초과일 수 있다. 본 실시형태에서, 제2 부착 반응은 0℃ 내지 40℃의 온도에서 이루어질 수 있다. 또한 제2 부착은 약 1분 내지 약 10분 동안 이루어진다.
또한 본 실시형태에서, 농축 단계는 표준 프린팅 기술, 예를 들어, 압전 프린팅, 밀착 프린팅, 잉크젯 프린팅 (ink jet printing) 또는 피펫팅 (pipetting)을 포함할 수 있으며, 이는 활성화된 지지체 상의 제형의 균일한 적용을 가능하게 한다. 고체 지지체는 보로실리케이트 유리, 폴리카보네이트, 그래핀, 금, 열가소성 아크릴 수지, 예컨대 폴리(메틸메타크릴레이트-VSUVT (PMMA-VSUVT) 및 사이클로올레핀 중합체, 예컨대 ZEONOR® 1060R일 수 있다.
추가로 본 실시형태에서, 용매 혼합물은 약 10:1 내지 약 100:1의 물 대 수혼화성 액체 부피 비를 포함할 수 있다. 또한 수혼화성 액체는 글리세롤, DMSO 또는 프로판디올일 수 있다. 대안적으로, 액체는 물보다 비등점이 더 높아서, 증발 단계 동안 모든 용매가 손실되지 않는 임의의 적합한 수혼화성 액체일 수 있다. 이는 분자 반응물 - 핵산 프로브 및 이작용성 링커가 증발 동안 점진적으로 농축될 수 있도록 한다. 이렇게 제어된 증발은 본 발명에 중요하며, 이는 이에 의해 핵산 프로브 사이의 수직 간격을 제어하여, 혼성화 단계 동안 입체 장애를 방지함으로써, 마이크로어레이의 정확도 및 정밀도가 개선되기 때문이다. 물 대 고 비등점 용매의 비는 10:1 내지 100:1로 유지됨으로써, 양 상하한의 경우에 평형 상태에서 유체상의 부피는 물 증발로 인해 원래 부피의 1/100 내지 1/10 사이로 감소하여 100배 내지 10배의 반응물 농축 증가가 발생한다. 바람직한 실시형태에서, 수혼화성 용매는 프로판디올이고, 물 대 프로판디올 비는 100:1이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 기재된 바와 같은 3차원 격자 마이크로어레이 시스템 내의 고체 지지체 및 다수의 이작용성 중합체 링커, 각각 병원체, 식물 또는 동물의 시그니처 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는 다수의 핵산 프로브, 용매 혼합물 및 키트 사용 설명서를 포함하는 주문 제작 가능 마이크로어레이 키트가 제공된다.
본 실시형태에서, 핵산 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 적어도 3개의 말단 티미딘 염기를 가질 수 있다. 또한 본 실시형태에서, 용매 혼합물은 약 10:1 내지 약 100:1의 부피비의 물 및 글리세롤, 디메틸 술폭사이드 (DMSO) 또는 프로판디올 중 하나의 혼합물을 포함할 수 있다.
이러한 키트를 구성하는 구성요소 각각은 최종 사용자의 목적을 기반으로 하여, 운반 전에 개별적으로 사용자 지정될 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 변형되지 않을 수 있으며, 이작용성 중합체 링커 내의 기에 비공유결합 부착될 수 있는 특성을 갖는다. 대안적으로, 고체 지지체는 전면 상에서 화학적으로 활성화 가능한 기에 의해 활성화될 수 있다. 티미딘 염기는 화학적, 광화학적 또는 열적 연결에 의해 핵산 프로브와 이작용성 중합체 링커의 공유결합 부착을 가능하게 한다. 바람직하게는, 핵산 프로브와 이작용성 중합체 링커의 공유결합 부착은 자외선을 사용하여 광화학적 수단에 의해 이루어진다.
키트는 식물, 동물 또는 병원체 내의 서열 결정자를 확인하기 위해 설계된 다수의 핵산 프로브를 제공하고, 식물, 동물 또는 병원체 내의 서열 결정자의 DNA 카피 수를 정량화하기 위해 샘플에 첨가되는 합성 DNA 내부 기준 표준을 포함할 수 있다. 합성 DNA는 조회되는 미지의 DNA 내의 시그니처 서열 결정자와 별개의 뉴클레오타이드 서열의 중심 영역 및 미지의 DNA 내의 공통 서열과 실질적으로 동일한 5' 및 3' 말단 서열을 갖는다. 예를 들어, 공통 서열은 서열번호 152 및 153에 제시된 서열일 수 있다. 합성 DNA의 이러한 구조는 조회되는 미지의 DNA의 초가변 영역을 증폭시키는데 사용되는 동일한 PCR 프라이머 쌍에 의해 합성 DNA의 증폭을 가능하게 한다. 예를 들어, 사용될 수 있는 합성 DNA는 서열번호 154 내지 157에 제시된 서열을 가질 수 있다.
관련 실시형태에서, 상기 기재된 바와 같은 3차원 격자 마이크로어레이 시스템 내의 고체 지지체, 각각 상부 도메인 및 하부 말단을 가지고, 형광 표지가 상부 도메인의 말단에 공유결합에 의해 부착되거나, 내부에 공유결합에 의해 부착된 다수의 이작용성 중합체 링커; 각각 병원체, 식물 또는 동물의 시그니처 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는 다수의 핵산 프로브, 용매 혼합물 및 키트 사용 설명서를 포함하는 주문 제작 가능 마이크로어레이 키트가 제공된다.
본 실시형태에서, 고체 지지체, 이작용성 중합체 링커 및 형광 표지는 상기 기재된 바와 같다. 또한 본 실시형태에서, 핵산 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 적어도 3개의 말단 티미딘 염기를 가질 수 있다. 또한 본 실시형태에서, 용매 혼합물은 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 식물 샘플 중 병원체 검출 방법으로서, 식물 조직 샘플을 수확하는 단계; 식물 조직 샘플로부터 DNA를 포함하는 전체 핵산을 단리하는 단계; 각각 적어도 하나의 병원체의 DNA에 선택적인 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 적어도 하나의 제1 프라이머 쌍을 사용한 단일 분석에서 탬덤 방식으로 제1 증폭을 수행함으로써, 하나 이상의 병원체-특이적 제1 앰플리콘을 획득하는 단계; 주형으로서 병원체-특이적 제1 앰플리콘 및 각각의 프라이머 쌍은 형광 표지로 표지되고, 병원체-특이적 제1 앰플리콘 내의 내부 측접 영역에 상보적인 서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍을 사용하여 탠뎀 방식으로 제2 증폭을 수행함으로써, 형광 표지 제2 앰플리콘을 획득하는 단계 및 상기에 기재된 바와 같은 3차원 격자 마이크로어레이 시스템을 사용하여, 병원체 DNA 내의 시그니처 서열 결정자에 특이적인 핵산 프로브와 제2 앰플리콘을 혼성화하는 단계로서, 핵산 프로브를 이작용성 중합체 링커를 통해 3차원 격자 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에 고정시키는 단계; 마이크로어레이를 적어도 1회 세척하는 단계; 및 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 제2 앰플리콘으로부터 형광 신호를 검출함으로써, 식물 샘플 중 병원체를 검출하는 단계를 수행하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한 이 실시형태에, 이작용성 중합체 링커는 형광 표지를 포함하고, 본 방법은 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 형광 신호를 검출하는 단계 및 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 신호 상에 형광 표지 제2 앰플리콘의 신호를 중첩시킴으로써, 식물 샘플 중 검출된 병원체를 확인하는 단계를 포함한다. 본 실시형태에서, 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 내의 형광 표지는 형광 표지 이작용성 중합체 링커 내의 형광 표지와 상이하다.
두 실시형태 모두에서, 이의 일 양상에서, 식물을 물로 세척하여, 병원체를 회수한 후, 멸균 0.4 ㎛ 필터에서의 여과에 의해 농축시켜, 식물 표면에 존재하는 병원체를 수확할 수 있다. 두 실시형태 모두의 또 다른 양상에서, 식물 조직 내의 병원체를 유동화시킨 후, 원심분리하여, 식물 세포 및 병원체 세포의 펠릿을 획득함으로써, 식물 조직 샘플 및 병원체를 수확할 수 있다. 실시형태에서, 수확된 샘플을 파괴하여, 전체 핵산을 방출시켜, 추가의 정제 없이 후속 단계에 사용한다.
두 실시형태 모두에서, 병원체 (외부 병원체)로부터의 핵산 또는 병원체 및 식물 (내부 병원체) 둘 모두로부터의 핵산을 포함하는 샘플을 사용하여, 병원체-특이적 제1 프라이머 쌍을 사용하여, 병원체 DNA의 제1 증폭을 수행함으로써, 하나 이상의 병원체-특이적 제1 앰플리콘을 획득한다. 샘플 내 DNA 보체를 선택적으로 증폭시킬 수 있는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 루프 매개 등온 증폭 (LAMP)을 포함하는 임의의 DNA 증폭 방법이 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 증폭은 PCR에 의해 이루어진다.
두 실시형태 모두에서, 형광 표지 제2 앰플리콘은 상기의 상세한 설명에 기재된 바와 같이, 다수의 핵산 프로브를 갖는 3차원 격자 마이크로어레이 시스템에서 혼성화된다. 일 양상에서, 이작용성 중합체 링커는 부착된 형광 표지 (제2 앰플리콘 상의 표지와 상이함)를 갖고, 혼성화 및 세척 후 마이크로어레이를 영상화하여, 2개의 개별 형광 신호 - 제작 동안 핵산 프로브에 공유결합 연결되고, 마이크로어레이에 포함되는 각각의 스폿에서 검출되는 형광 이작용성 중합체 링커로부터의 신호 및 핵산 프로브 서열이 제2 앰플리콘 (처음에 샘플 중 병원체 DNA로부터의 증폭에 의해 유래됨)에 상보적인 스폿에서만 검출되는 제2 앰플리콘 신호를 생성한다. 따라서, 컴퓨터를 사용한 2개의 이미지의 중첩은 본 발명에 청구된 시스템 및 방법에 유리한 특성을 제공하며, 이는 데이터베이스로부터 샘플에 포함된 식물 또는 병원체를 용이하게 확인할 수 있고, 식물 또는 병원체 내의 인지된 DNA 시그니처를 갖는 서열의 마이크로어레이 위치 및 핵산 프로브 서열의 상관관계를 확인할 수 있기 때문이다.
그의 실시형태 및 양상 둘 모두에서, 병원체는 박테리아, 진균, 바이러스, 조류 또는 원생동물 또는 이들 병원체의 조합이다. 이러한 병원체는 식물 샘플이 성장하는 토양, 무토양 성장 배지, 수중 재배 성장 배지 또는 물의 성분으로서 존재할 수 있다. 식물은 토양, 무토양 배지, 수중 재배 성장 배지 또는 물에서 성장하는 육생 식물, 에컨대 후물루스 (Humulus) 또는 대마초, 수생 식물, 착생 식물 또는 암생 식물일 수 있다. 바람직하게는, 식물은 대마초이다.
일 양상에서, 병원체는 박테리아이고, 제1 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 1 및 2, 또는 서열번호 3 및 4, 또는 서열번호 5 및 6 또는 서열번호 7 및 8, 또는 서열번호 9 및 10, 또는 서열번호 11 및 12, 또는 서열번호 137 및 138에 제시된 서열을 갖고, 제2 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 19 및 20, 또는 서열번호 21 및 22, 또는 서열번호 23 및 24 또는 서열번호 25 및 26, 또는 서열번호 27 및 28, 또는 서열번호 29 및 30, 또는 서열번호 141 및 30에 제시된 서열을 갖고, 핵산 프로브는 서열번호 37 내지 85에 제시된 서열을 갖는다.
또 다른 양상에서, 병원체는 진균이고, 제1 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 13 및 14, 또는 서열번호 15 및 16, 또는 서열번호 135 및 136에 제시된 서열을 갖고, 제2 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 31 및 32, 또는 서열번호 33 및 34, 또는 서열번호 139 및 140에 제시된 서열을 갖고, 핵산 프로브는 서열번호 86 내지 125에 제시된 서열을 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 단일 분석에서 식물 및 병원체의 DNA를 동시에 검출하는 방법으로서, 잠재적으로 하나 이상의 병원체를 포함하는 식물 조직 샘플을 수확하는 단계; 적어도 식물 조직 및 하나 이상의 병원체로부터의 DNA를 포함하는 전체 핵산을 단리하는 단계; 적어도 하나의 병원체 DNA-선택적 제1 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 식물 DNA-선택적 제1 프라이머 쌍을 사용한 전체 핵산에 대한 단일 분석에서 탠뎀 방식으로 제1 증폭을 수행함으로써, 병원체-특이적 제1 앰플리콘 및 식물-특이적 제1 앰플리콘을 획득하는 단계; 주형으로서 병원체-특이적 제1 앰플리콘 및 식물-특이적 제1 앰플리콘 및 형광 표지로 표지되고, 병원체-특이적 제1 앰플리콘 내의 내부 측접 영역에 상보적인 서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍 및 형광 표지로 표지되고, 식물-특이적 제1 앰플리콘 내의 내부 측접 영역에 상보적인 서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍을 사용하여 탠뎀 방식으로 제2 증폭을 수행함으로써, 형광 표지 병원체-특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 식물-특이적 제2 앰플리콘을 획득하는 단계; 상기에 기재된 바와 같은 3차원 격자 마이크로어레이 시스템을 사용하여, 형광 표지 병원체-특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 식물 특이적 제2 앰플리콘과 병원체 DNA 및 식물 DNA의 시그니처 서열 결정자에 특이적인 핵산 프로브를 혼성화하는 단계로서, 상기 핵산을 형광 표지 이작용성 중합체 링커를 통해 3차원 격자 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에 고정시키는 단계, 마이크로어레이를 적어도 1회 세척하는 단계 및 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 병원체 특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 식물 특이적 제2 앰플리콘으로부터 형광 신호를 검출함으로써, 샘플 중 병원체 및 식물을 동시에 검출하는 단계를 수행하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한 이 실시형태에, 다수의 이작용성 중합체 링커 각각은 형광 표지를 포함하고, 본 방법은 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 형광 신호를 검출하는 단계 및 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 신호 상에 형광 표지 식물 특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 병원체 특이적 제2 앰플리콘의 신호를 중첩시킴으로써, 식물 샘플 중 검출된 병원체 및 식물을 동시에 확인하는 단계를 포함한다.
두 실시형태 모두에서, 본 방법은 상기에 기재된 바와 같이, 잠재적으로 하나 이상의 병원체를 포함하는 식물 조직 샘플을 수확하는 단계, 식물 조직 샘플 및 하나 이상의 병원체를 유동화하는 단계 및 적어도 식물 조직으로부터의 DNA 및 하나 이상의 병원체로부터의 DNA를 포함하는 전체 핵산을 단리하는 단계를 포함한다. 또한 두 실시형태 모두에서 비정제 전체 핵산 샘플의 제1 증폭 및 제1 증폭에 의해 생성된 병원체-특이적 제1 앰플리콘 및 식물-특이적 제1 앰플리콘의 제2 증폭은 상기 기재된 바와 같고, 원래의 수확된 샘플 내의 각각의 병원체 및 식물 DNA에 해당하는 형광 표지 병원체-특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 식물-특이적 제2 앰플리콘을 생성한다.
두 실시형태 모두에서, 병원체는 인간 병원체, 동물 병원체 또는 식물 병원체 특히 박테리아, 진균, 바이러스, 효모, 조류 또는 원생동물 또는 이의 조합일 수 있다. 특히 병원체는 박테리아 또는 진균일 수 있고, 제1 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍 서열, 제2 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍 서열 및 핵산 프로브 서열은 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 식물 샘플에서 하나 이상의 병원체 DNA에 대해 카피 수를 정량화하는 방법으로서, 잠재적으로 병원체를 갖는 식물 조직 샘플을 수확하는 단계; DNA를 포함하는 전체 핵산을 단리하는 단계; 단리된 전체 핵산에 내부 기준 표준으로서 적어도 하나의 합성 DNA 서열의 인지된 카피 수를 첨가하는 단계로서, 각각의 합성 DNA 서열은 병원체 DNA에서의 시그니처 서열 결정자와 별개의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 중심 영역 및 병원체 DNA에서의 공통 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 단계; 각각 병원체 DNA에 선택적인 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 적어도 하나의 제1 프라이머 쌍을 사용한 전체 핵산에 대한 단일 분석에서 탠뎀 방식으로 제1 증폭을 수행함으로써, 하나 이상의 병원체 DNA-특이적 제1 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제1 앰플리콘을 획득하는 단계; 주형으로서 병원체-특이적 제1 앰플리콘 및 각각의 프라이머 쌍은 형광 표지로 표지되고, 병원체-특이적 제1 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제1 앰플리콘 내의 내부 측접 영역에 상보적인 서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 합성 DNA-특이적 제1 앰플리콘 및 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍을 사용하여 탠뎀 방식으로 제2 증폭을 수행함으로써, 각각 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘을 획득하는 단계; 상기에 기재된 바와 같이 3차원 격자 마이크로어레이 시스템을 사용하여, 각각 병원체 DNA 및 합성 DNA 내의 시그니처 서열 결정자에 특이적인 핵산 프로브와 제2 앰플리콘을 혼성화하는 단계로서, 핵산 프로브를 형광 표지 이작용성 중합체 링커를 통해 3차원 격자 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에 고정시키는 단계, 마이크로어레이를 적어도 1회 세척하는 단계, 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 이작용성 중합체 링커를 통해 마이크로어레이 상의 인식된 특이적 위치에 고정된 핵산 프로브에 해당하는 형광 신호, 및 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘 각각의 형광 신호를 검출하는 단계를 수행하는 단계; 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 이미지 상에 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘의 형광 신호의 이미지를 중첩시킴으로써, 중첩된 신호 이미지를 획득하는 단계; 다수의 병원체 DNA의 시그니처 서열 결정자의 데이터베이스와 마이크로어레이 상의 하나 이상의 중첩된 신호 위치의 핵산 프로브의 서열을 비교함으로써, 샘플 중 병원체를 확인하는 단계; 및 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘의 형광 신호로부터의 형광 신호 강도 및 단리된 전체 핵산에 첨가된 합성 DNA의 인지된 카피 수의 상관관계를 수학적으로 확인함으로써, 샘플 내의 병원체 DNA의 카피 수를 정량화하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일반적인 본 실시형태에서, 청구되는 방법에 사용되는 방법, 예컨대 수확, 전체 핵산 단리, 제1 및 제2 증폭 및 3차원 격자 마이크로어레이 시스템은 상기 기재된 바와 같다. 일반적으로, 식물, 병원체, 형광 표지, 및 프라이머 쌍 서열은 상기 기재된 바와 같다.
본 실시형태에서, 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘 내의 형광 표지는 형광 표지 이작용성 중합체 링커 내의 형광 표지와 상이하다. 혼성화 후 마이크로어레이를 영상화하고, 이미지를 중첩시켜, 2개의 형광 신호 - 제작 동안 핵산 프로브에 공유결합 연결되고, 마이크로어레이에 포함되는 각각의 스폿에서 검출되는 형광 이작용성 중합체 링커로부터의 신호 및 핵산 프로브 서열이 병원체 특이적 제2 앰플리콘 (처음에 샘플 중 병원체 DNA로부터의 증폭에 의해 유래됨) 및 합성 DNA 특이적 제2 앰플리콘에 상보적인 위치 (스폿)에서만 검출되는 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘으로부터의 신호를 생성한다. 따라서, 컴퓨터를 사용한 신호의 중첩은 본 발명에 청구된 시스템 및 방법에 유리한 특성을 제공하며, 이는 데이터베이스로부터 샘플에 포함된 식물 또는 병원체를 용이하게 확인할 수 있고, 식물 또는 병원체 내의 인지된 DNA 시그니처를 갖는 서열의 마이크로어레이 위치 및 핵산 프로브 서열의 상관관계를 확인할 수 있기 때문이다.
또한 본 실시형태에서, 수학적 상관관계 확인 단계는 다음 수학식을 사용하여 수행될 수 있다:
Cn/Co = P(Sn/So)x,
상기 식에서,
Cn = 마이크로어레이 분석을 위한 앰플리콘을 제조하는데 사용된 2개의 탠뎀 PCR 반응 중 첫 번째에 첨가된 원래 샘플 혼합물에 존재하는 각 유형 (n)의 미생물 DNA 카피의 수;
Co = 마이크로어레이 분석을 위해 앰플리콘을 제조하는데 사용된 2개의 PCR 반응 중 첫 번째에 첨가된 인지된 합성 DNA 카피의 수 (내부 기준 표준), Co는 존재할 수 있는 미지의 미생물 카피의 범위에 따라 예를 들어, 100, 500, 3,000 및 5,000의 값으로 설정될 수 있다. 바람직한 실시형태에서 Co = 3000이고;
Sn = n번째 미생물 종의 PCR 증폭 및 마이크로어레이 혼성화 다음 이미지 분석 후 획득된 상대적 형광 단위 (RFU) 신호 데이터;
So = 합성 DNA 종의 PCR 증폭 및 마이크로어레이 혼성화 다음 이미지 분석 후 획득된 상대적 형광 단위 (RFU) 신호 데이터;
X = 실험 마이크로어레이 데이터 비 (Sn/So) 대 원래 샘플에 존재하는 미생물 DNA 카피 대 합성 DNA 표준 카피의 기본적 비 (Cn/Co) 사이의 함수적 관계를 규정하는 복합 지수 인자. X는 그 자체가 증폭 매개변수의 함수 및 마이크로어레이 분석 및 영상화 조건인 선형 함수 또는 지수 또는 관계 함수 형태 또는 상수일 수 있다. 일 양상에서, X는 약 1 내지 약 3의 범위의 지수 인지아고;
P = 실험 마이크로어레이 데이터 비 (Sn/So) 대 마이크로어레이에 결합하는 증폭된 PCR 산물의 농도의 관계 상수. 일 양상에서, P는 약 0.1 내지 약 10의 범위일 수 있다.
또한 본 실시형태에서, 합성 DNA는 서열번호 154 내지 157에 제시된 서열을 가질 수 있다. 합성 DNA는 조회되는 미지의 DNA의 시그니처 서열 결정자와 별개의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 중심 영역 및 미지의 DNA의 공통 서열과 실질적으로 동일한 5' 및 3' 말단 서열을 갖는다. 예를 들어, 공통 서열은 서열번호 152 및 153에 제시된 서열일 수 있다. 합성 DNA의 이러한 구조는 조회되는 미지의 DNA의 초가변 영역을 증폭하는데 사용되는 동일한 PCR 프라이머 쌍에 의한 합성 DNA의 증폭을 가능하게 한다.
본 실시형태의 일 양상에서, 병원체는 박테리아일 수 있고, 공통 서열은 서열번호 153에 제시되고, 제1 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 1 및 2, 또는 서열번호 3 및 4, 또는 서열번호 5 및 6 또는 서열번호 7 및 8, 또는 서열번호 9 및 10, 또는 서열번호 11 및 12, 또는 서열번호 137 및 138에 제시된 서열을 갖고, 공통 서열은 서열번호 153에 제시되고, 제2 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 19 및 20, 또는 서열번호 21 및 22, 또는 서열번호 23 및 24 또는 서열번호 25 및 26, 또는 서열번호 27 및 28, 또는 서열번호 29 및 30, 또는 서열번호 141 및 30에 제시된 서열을 갖고, 박테리아에 특이적인 핵산 프로브는 서열번호 37 내지 85에 제시된 서열을 갖고, 합성 DNA는 서열번호 155, 서열번호 156 및 서열번호 157에 제시된 서열을 갖고, 이는 각각 서열번호 142, 서열번호 143 및 서열번호 144에 제시된 서열을 갖는 합성 DNA 특이적 핵산 프로브에 혼성화된다.
본 실시형태의 또 다른 양상에서, 병원체는 진균일 수 있고, 공통 서열은 서열번호 152에 제시되고, 제1 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 13 및 14, 또는 서열번호 15 및 16, 또는 서열번호 135 및 136에 제시된 서열을 갖고, 공통 서열은 서열번호 152에 제시되고, 제2 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 31 및 32, 또는 서열번호 33 및 34, 또는 서열번호 139 및 140에 제시된 서열을 갖고, 진균에 특이적인 핵산 프로브는 서열번호 86 내지 125에 제시된 서열을 갖고, 합성 DNA는 서열번호 154에 제시된 서열을 갖고, 이는 서열번호 145에 제시된 서열을 갖는 합성 DNA 특이적 핵산 프로브에 혼성화된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 단일 분석으로 식물 조직 샘플 중 하나 이상의 병원체 및 식물의 DNA의 카피 수를 동시에 정량화하는 방법으로서, 잠재적으로 하나 이상의 병원체를 갖는 식물 조직 샘플을 수확하는 단계; 적어도 식물 조직 DNA 및 병원체 DNA를 포함하는 전체 핵산을 단리하는 단계; 단리된 전체 핵산에 내부 기준 표준으로서 적어도 하나의 합성 DNA 서열의 인지된 카피 수를 첨가하는 단계로서, 각각의 합성 DNA 서열은 병원체 DNA에서의 시그니처 서열 결정자와 별개의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 중심 영역 및 식물 DNA, 병원체 DNA에서의 공통 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 단계; 적어도 하나의 병원체-특이적 제1 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 합성 DNA-특이적 제1 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 식물-특이적 제1 프라이머 쌍을 사용한 전체 핵산에 대한 단일 분석에서 탠뎀 방식으로 제1 증폭을 수행함으로써, 병원체 DNA-특이적 제1 앰플리콘, 식물 DNA-특이적 제1 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제1 앰플리콘을 획득하는 단계; 주형으로서 제1 앰플리콘, 각각의 프라이머 쌍은 형광 표지로 표지되고, 각각 제1 앰플리콘 내의 내부 측접 영역에 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 병원체 DNA-특이적 제2 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 식물 DNA-특이적 제2 프라이머 쌍을 사용하여 탠뎀 방식으로 제2 증폭을 수행함으로써, 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 형광 표지 식물 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘을 획득하는 단계; 상기에 기재된 바와 같이 3차원 격자 마이크로어레이 시스템을 사용하여, 각각 병원체 DNA, 식물 DNA 및 합성 DNA 내의 시그니처 서열 결정자에 특이적인 핵산 프로브와 제2 앰플리콘을 혼성화하는 단계로서, 핵산 프로브를 형광 표지 이작용성 중합체 링커를 통해 3차원 격자 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에 고정시키는 단계, 마이크로어레이를 적어도 1회 세척하는 단계, 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 이작용성 중합체 링커를 통해 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에 고정된 핵산 프로브에 해당하는 형광 신호, 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 형광 표지 식물 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘 각각에 해당하는 형광 신호를 검출하는 단계를 수행하는 단계; 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 이미지 신호 상에 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 형광 표지 식물 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘의 신호를 중첩시킴으로써, 중첩된 신호 이미지를 획득하는 단계; 다수의 병원체 DNA 및 식물 DNA의 시그니처 서열 결정자의 데이터베이스와 마이크로어레이 상의 하나 이상의 중첩된 신호 위치의 핵산 프로브의 서열을 비교함으로써샘플 내의 병원체 및 식물을 확인하는 단계; 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘의 형광 신호 강도 및 합성 DNA의 인지된 카피 수의 상관관계를 수학적으로 확인함으로써, 샘플 내의 병원체 DNA의 카피 수를 정량화하는 단계; 및 식물 DNA-특이적 제2 앰플리콘의 형광 신호 강도와 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘으로부터의 형광 신호 강도 및 합성 DNA의 인지된 카피 수의 상관관계를 수학적으로 확인함으로써, 샘플 내의 식물 DNA의 카피 수를 정량화하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일반적인 본 실시형태에서, 청구되는 방법에 사용되는 방법, 예컨대 수확, 전체 핵산 단리, 제1 및 제2 증폭, 및 중첩 및 3차원 격자 마이크로어레이 시스템은 상기 기재된 바와 같다. 일반적으로, 식물, 병원체, 형광 표지, 및 프라이머 쌍 서열은 상기 기재된 바와 같다.
본 실시형태에서, 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 형광 표지 식물 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘 내의 형광 표지는 형광 표지 이작용성 중합체 링커 내의 형광 표지와 상이하다.
또한 본 실시형태에서, 수학적 상관관계 확인 단계는 상기에 기재된 바와 같은 수학식 Cn/Co = P(Sn/So)x에 의해 수행한다.
본 실시형태의 일 양상에서, 병원체는 박테리아일 수 있고, 공통 서열은 서열번호 153에 제시되고, 제1 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 1 및 2, 또는 서열번호 3 및 4, 또는 서열번호 5 및 6 또는 서열번호 7 및 8, 또는 서열번호 9 및 10, 또는 서열번호 11 및 12, 또는 서열번호 137 및 138에 제시된 서열을 갖고, 공통 서열은 서열번호 153에 제시되고, 제2 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 19 및 20, 또는 서열번호 21 및 22, 또는 서열번호 23 및 24 또는 서열번호 25 및 26, 또는 서열번호 27 및 28, 또는 서열번호 29 및 30, 또는 서열번호 141 및 30에 제시된 서열을 갖고, 박테리아에 특이적인 핵산 프로브는 서열번호 37 내지 85에 제시된 서열을 갖고, 합성 DNA는 서열번호 155, 서열번호 156 및 서열번호 157에 제시된 서열을 갖고, 이는 각각 서열번호 142, 서열번호 143 및 서열번호 144에 제시된 서열을 갖는 합성 DNA 특이적 핵산 프로브에 혼성화된다.
본 실시형태의 또 다른 양상에서, 병원체는 진균일 수 있고, 공통 서열은 서열번호 152에 제시되고, 제1 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 13 및 14, 또는 서열번호 15 및 16, 또는 서열번호 135 및 136에 제시된 서열을 갖고, 공통 서열은 서열번호 152에 제시되고, 제2 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 31 및 32, 또는 서열번호 33 및 34, 또는 서열번호 139 및 140에 제시된 서열을 갖고, 진균에 특이적인 핵산 프로브는 서열번호 86 내지 125에 제시된 서열을 갖고, 합성 DNA는 서열번호 154에 제시된 서열을 갖고, 이는 서열번호 145에 제시된 서열을 갖는 합성 DNA 특이적 핵산 프로브에 혼성화된다.
다음의 실시예는 본 발명의 다양한 실시형태를 예시하기 위해 제공되며 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1
3차원 격자 마이크로어레이 시스템의 제작
본 발명은 이작용성 중합체 링커를 사용하여 핵산 프로브를 고체 지지체 표면에 연결하는 방법을 교시한다. 핵산 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 PCR 앰플리콘, 합성 올리고뉴클레오타이드, 등온 증폭 산물, 플라스미드 또는 게놈 DNA 단편일 수 있다. 본 발명은 핵산 프로브가 연결되는 기저 표면의 특성에 기초하여 2개의 부류로 세분될 수 있다.
활성화된 고체 지지체를 갖는 공유결합 마이크로어레이 시스템
이러한 핵산 프로브 중 어느 하나의 공유결합 부착은 기저 표면에 직접 이루어지지 않고, 대신 표면과의 화학 반응을 모두 가능하게 하고, 또한 핵산 프로브와의 효율적인 UV-개시 가교결합이 가능한 비교적 긴 이작용성 중합체 링커를 통해 매개된다. 이 공정의 메커니즘은 자발적인 3D 자체 조립이며, 도 1a 내지 도 1d에 도시되어 있다. 도 1a에서 볼 수 있듯이, 이 마이크로어레이 시스템을 제작하는데 필요한 구성요소는 다음과 같다:
(a) 올리고뉴클레오타이드, PCR 또는 등온 앰플리콘, 플라스미드 또는 게놈 DNA와 같은 비변형 핵산 프로브 (3);
(b) 에폭시실란, 이소시아네이트, 숙신이 미드, 카보디이미드, 알데하이드와 같은 1차 아민과의 반응에 적합한 화학적으로 활성화 가능한 기 ("X"로 지정됨)를 갖는 화학적으로 활성화 가능한 표면 (1);
(c) 각각 형광 표지 (4)가 부착되고, 지지체 표면 상의 화학적으로 활성화 가능한 기와의 커플링에 적합한 천연 또는 변형된 올리고dT, 아미노 다당류, 아미노 폴리펩타이드와 같은 이작용성 중합체 링커 (2); 및
(d) 물 및 고 비등점, 수혼화성 액체, 예컨대 글리세롤, DMSO 또는 프로판디올을 포함하는 용매 (물 대 용매 비 10:1 내지 100:1).
표 1은 이작용성 중합체 링커 상의 화학적으로 활성화 가능한 기 및 매칭된 반응성 기의 예를 단지 예시적으로 보여주며, 매칭된 반응성 쌍의 다른 조합의 사용을 어떤 식으로든 배제하지 않는다.
본 발명에 사용되는 경우, 화학적으로 활성화 가능한 표면, 이작용성 중합체 링커 및 비변형 핵산 프로브는 밀착 프린팅, 압전 프린팅, 잉크젯 프린팅, 또는 피펫팅과 같은 DNA 혼성화 시험을 생성하기 위해 사용되는 일반적인 제조 방법에 의해 화학적으로 활성화된 표면 (4)에 적용될 용액으로 포함된다.
마이크로어레이 제작은 화학적으로 활성화 가능한 표면, 이작용성 중합체 링커 및 비변형 핵산 프로브의 혼합물을 표면에 적용하는 것으로 시작된다. 제1 단계는 활성화된 표면에 대한 이작용성 링커의 반응 및 공유결합 부착이다 (도 1b). 일반적으로, 이작용성 링커의 화학적 농도를 표면의 반응성 부위의 100% 미만이 이작용성 링커에 대한 공유결합 연결이 형성되도록 설정한다. 이러한 저밀도에서, 이작용성 링커 분자 사이의 평균 거리는 격자 폭으로 표시된 간격 (도 1b에서 "LW")을 규정한다.
제2 단계에서, 용매의 물을 증발시켜, 용매로부터 물의 증발을 통해 DNA 및 이작용성 링커를 농축시킨다 (도 1c). 일반적으로 매트릭스 제작 동안 용매로 순수한 물을 사용하면 표면적/부피 비가 높기 때문에 증발에 의해 물이 빠르게 제거되어 불리하다. 이를 극복하기 위해 본 발명에서는 글리세린, DMSO, 프로판디올과 같은 고 비등점 수혼화성 용매와 물의 혼합물을 용매로 사용하였다. 이 경우 증발시 물 구성요소는 증발하지만 고 비등점 용매는 증발하지 않는다. 결과적으로 분자 반응물 - DNA 및 이작용성 링커는 물이 증발로 손실됨에 따라 점진적으로 농축된다. 본 발명에서 물 대 고 비등점 용매의 비는 10:1 내지 100:1로 유지된다. 따라서 양 상하한의 경우, 평형 상태에서 유체상의 부피는 물 증발로 인해 원래 부피의 1/100 내지 1/10 사이로 감소하여 100배 내지 10배의 반응물 농축 증가가 발생한다. 이렇게 제어된 증발은 증발 농도의 정도와 반비례하는 핵산 프로브 사이의 수직 간격 (수직 분리, 도 1c에서 "VG")을 제어하기 때문에 본 발명에 중요하다.
제3 단계에서, 핵산 프로브의 말단 티미딘 염기는 증발된 표면 내에서 이작용성 링커에 UV 가교결합된다 (도 1d). 이 공정은 널리 공지된 티미딘 염기의 광화학적 반응성에 의해 매개되어, DNA 내의 다른 티미딘 염기에 대한 공유결합 연결의 형성 또는 단백질 및 탄수화물과의 광화학적 반응을 유발한다. 이작용성 가교결합제가 올리고dT인 경우, 가교결합 반응은 양방향으로 이루어질 것이며, 즉, 핵산 프로브 또는 이작용성 올리고dT 링커에서 광화학 반응이 개시될 수 있다. 반면에, 이작용성 링커가 그 내부에 리신 또는 히스티딘이 포함된 폴리아미노산 또는 키토산과 같은 아미노 다당류인 경우, 광화학 반응은 핵산 프로브에서 개시되며, 이작용성 링커는 광화학 반응의 표적이 된다.
비공유결합 부착을 위한 비변형 고체 지지체를 갖는 마이크로어레이 시스템
이 마이크로어레이 시스템에서, 핵산 프로브의 부착은 기저 표면에 직접 이루어지지 않고, 대신 고체 지지체와 비공유결합에 의해 결합하지만, UV-개시 가교결합을 통해 핵산 프로브와 공유결합에 의해 결합하는 비교적 긴 이작용성 중합체 링커를 통해 매개된다. 이 공정의 메커니즘은 자발적인 3D 자체 조립이며, 도 2a 내지 도 2d에 도시되어 있다. 도 2a에서 볼 수 있듯이, 이 마이크로어레이 시스템을 제작하는데 필요한 구성요소는 다음과 같다.
(1) 올리고뉴클레오타이드, PCR 또는 등온 앰플리콘, 플라스미드 또는 게놈 DNA와 같은 비변형 핵산 프로브 (3);
(2) 비변형 고체 지지체 (1)
(3) 각각 형광 표지 (4)를 갖고, 고체 지지체에 대한 흡착 결합에 적합한 작용기 ("R"로 지정됨)를 본질적으로 갖거나 갖도록 변형된 올리고dT 또는 아미노 다당류, 아미노 폴리펩타이드와 같은 이작용성 중합체 링커 (2); 및
(4) 물 및 글리세롤, DMSO 또는 프로판디올과 같은 고 비등점, 수혼화성 액체를 포함하는 용매 (물 대 용매 비 10:1 내지 100:1).
표 2는 이작용성 중합체 링커 상의 비변형 지지체 표면 및 매칭된 흡착 기의 예를 단지 예시적으로 보여주며, 이들의 다른 조합의 사용을 어떤 식으로든 배제하지 않다.
본 발명에 사용되는 경우, 구성요소 (1) 내지 (3)은 밀착 프린팅, 압전 프린팅, 잉크젯 프린팅, 또는 피펫팅과 같은 DNA 혼성화 시험을 생성하는데 사용되는 일반적인 제작 방법에 의해 고체 지지체 표면에 적용될 용액으로 포함된다.
마이크로어레이 제작은 구성요소 (1) 내지 (3)의 혼합물을 표면에 적용하는 것으로 시작된다. 제1 단계는 이작용성 링커를 지지체 표면에 흡착시키는 것이다 (도 2b). 이작용성 링커의 농도를 이작용성 링커 분자 사이의 평균 거리가 격자 폭 (도 2b에서 "LW")으로 표시된 간격을 규정하도록 설정한다.
제2 단계에서, 용매의 물을 증발시켜, 용매로부터 물의 증발을 통해 DNA 및 이작용성 링커를 농축시킨다 (도 2c). 일반적으로 매트릭스 제작 동안 용매로 순수한 물을 사용하면 표면적/부피 비가 높기 때문에 증발에 의해 물이 빠르게 제거되어 불리하다. 이를 극복하기 위해 본 발명에서는 글리세린, DMSO, 프로판디올과 같은 고 비등점 수혼화성 용매와 물의 혼합물을 용매로 사용하였다. 이 경우 증발시 물 구성요소는 증발하지만 고 비등점 용매는 증발하지 않는다. 결과적으로 분자 반응물 - DNA 및 이작용성 링커는 물이 증발로 손실됨에 따라 점진적으로 농축된다. 본 발명에서 물 대 고 비등점 용매의 비는 10:1 내지 100:1로 유지된다. 따라서 양 상하한의 경우, 평형 상태에서 유체상의 부피는 물 증발로 인해 원래 부피의 1/100 내지 1/10 사이로 감소하여 100배 내지 10배의 반응물 농축 증가가 발생한다.
제3 단계에서, 핵산 프로브의 말단 티미딘 염기는 증발된 표면 내에서 이작용성 링커에 UV 가교결합된다 (도 2d). 이 공정은 널리 공지된 티미딘 염기의 광화학적 반응성에 의해 매개되어, DNA 내의 다른 티미딘 염기에 대한 공유결합 연결의 형성 또는 단백질 및 탄수화물과의 광화학적 반응을 유발한다. 이작용성 가교결합제가 올리고dT인 경우, 가교결합 반응은 양방향으로 이루어질 것이며, 즉, 핵산 프로브 또는 이작용성 올리고dT 링커에서 광화학 반응이 개시될 수 있다. 반면에, 이작용성 링커가 그 내부에 리신 또는 히스티딘이 포함된 폴리아미노산 또는 키토산과 같은 아미노 다당류인 경우, 광화학 반응은 핵산 프로브에서 개시되며, 이작용성 링커는 광화학 반응의 표적이 된다.
제1 단계에 기재된 이러한 비공유 흡착은 일반적으로 약하고 가역적이지만, 단리시 발생하는 경우, 본 발명에서는 이작용성 중합체 링커와 기저 표면 사이에 이렇게 약한 다수의 흡착 사건이 밀접하게 발생하는 경우, 및 밀접하게 패킹 (packing)된 중합체 링커가 이후에 티미딘 매개 광화학적 가교결합을 통해 서로 연결되는 경우, 새로 생성된 확장된 다분자 (가교결합된) 복합체가 표면에서 추가로 안정화되어, 그 표면에 대한 직접적인 공유 결합이 부재하는 경우 그 표면과의 안정한 복합체가 형성될 것이라고 생각된다.
본 발명은 미생물 DNA 표적의 분석을 위한 마이크로어레이 기반 혼성화 장치를 생성하기 위한 핵산 프로브로서 합성 올리고뉴클레오타이드의 연결을 위해 효율적으로 작동한다. 그러나, 동일한 발명이 PCR 앰플리콘, 합성 올리고뉴클레오타이드, 등온 증폭 산물, 플라스미드 DNA 또는 게놈 DNA 단편을 핵산 프로브로 연결하는데 사용될 수 있음이 분명하다. 마이크로어레이가 아닌 혼성화 장치를 제조하는데 동일한 기술을 사용할 수 있음이 또한 분명하다.
DNA 핵산 프로브를 표 3에 기재된 바와 같이 제형화하여, 상기 기재된 바와 같이, 도 1 또는 도 2에 도시된 바와 같이 배치하였다. 미생물 DNA의 다양한 서열 결정자에 대해 특이적인 48개의 이러한 프로브 세트 (표 4)를 설계하였으며, UV-가교결합을 용이하게 하기 위해 각 말단에 5 내지 7개의 T 염기 가닥을 제공하여, 각각을 제작하고, 상기 기재되고, 도 1에 도시된 바와 같이 공유결합에 의해 연결된 마이크로어레이 요소를 형성하였다. 48개의 상이한 프로브 각각을 3중 반복 실험으로 프린팅하여 표 3에 제시된 서열을 갖는 144개의 요소 (12 x 12) 마이크로어레이를 생성하였다.
표 4의 48개의 상이한 프로브 세트를 표 3에 기재된 바와 같이 제형화한 다음, 스폿 (spot)당 약 1 nL의 제형을 침착시키는 Arrayit SMP 핀이 장착된 Gentics Q-Array 미니 밀착 프린터를 사용하여 에폭시실란 코팅된 보로실리케이트 유리 상에 프린팅하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 이렇게 프린팅된 어레이를 실온에서 에폭시실란 표면과 반응시킨 다음, 또한 실온에서 증발시켜, 자유수를 제거하였다. 증발 단계 (일반적으로 밤새)가 완료되면 공기 건조된 마이크로어레이를 STATOLINKER® UV 조사 시스템에서 UV 처리하였다: 254 nm에서 300 mjoules의 조사를 통해 티미딘 매개 가교결합을 개시시켰다. 그러면 마이크로어레이를 사용할 준비가 된 것이므로 추가의 세척이나 캡핑 (capping)이 필요하지 않다.
실시예 2
DNA 분석을 위한 3차원 격자 마이크로어레이 시스템 사용
샘플 처리
식물 표면으로부터 병원체의 수확은 다음 단계를 포함한다:
1. 1x 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 식물 샘플 또는 테이프 풀을 세척한다.
2. 식물 물질/테이프를 제거한다.
3. 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 상청액을 따라낸다.
4. 샘플 분해 완충액과 사전 혼합된 PathogenDx® 샘플 프렙 완충액에 재현탁시킨다.
5. 55℃에서 45분 동안 가열한다.
6. 교반하여 펠릿을 분산시킨다.
7. 95℃에서 15분 동안 가열한다.
8. PCR에 사용하기 전에 잠깐동안 교반 및 원심분리한다.
PCR에 의한 증폭
증폭 및 혼성화 분석에 사용된 샘플은 허가된 대마초 연구소로부터의 대마초 꽃 세척액이었다. 세척된 꽃 물질을 원심분리에 의해 펠릿화했다. 그 다음 펠릿을 단백질 분해효소 K로 분해시킨 다음, PCR 증폭 전에 인지된 양의 살모넬라 DNA로 스파이킹하였다.
살모넬라 DNA 스파이킹 샘플을 탠뎀 PCR 반응에서 엔테로박테리아세아 (Enterobacteriaceae)의 16s 영역에 특이적인 PCR 프라이머 (P1 - 표 5)로 증폭하여, 먼저 표적 영역 (PCR 반응 #1) 및 또한 PCR 프라이머 (P1-표 5)를 단리하였으며, 증폭된 대마초 DNA (ITS)의 절편을 양성 대조군으로 사용하였다.
PCR 반응 #1 산물 (1 μL)을 제2 PCR 반응 (PCR 반응 #2)에 적용하여, 추가로 증폭시키고, 2개의 표적화된 영역 (16s, ITS)을 녹색 CY3 형광단 표지된 프라이머 (P2 - 표 5)로 표지시켰다. PCR 반응 #2 산물 (50 μL)을 혼성화 완충액 (4x SSC + 5x Denhardt 용액)으로 1-1로 희석한 다음, 혼성화를 위해 마이크로어레이에 직접 적용하였다.
혼성화
종래 기술의 마이크로어레이 제조 방법은 마이크로어레이 표면을 전처리할 필요없이 혼성화를 통해 DNA를 분석할 수 있기 때문에, 마이크로어레이의 사용은 간단하고, 6개의 수동 또는 자동 피펫팅 단계를 포함한다.
1) 증폭된 DNA + 결합 완충액을 마이크로어레이에 피펫팅한다.
2) 30분 동안 배양하여, DNA를 마이크로어레이에 결합시킨다 (일반적으로 실온, RT).
3) 피펫팅으로 DNA + 결합 완충액을 제거한다.
4) 50 μL의 세척 완충액을 마이크로어레이 (0.4x SSC + 0.5x Denhardt)에 피펫팅하고, RT에서 5분 동안 인큐베이션한다.
5) 피펫팅으로 세척 완충액을 제거한다.
6) 단계 4 및 5를 반복한다.
7) 532 nm 및 635 nm에서 이미지 분석을 수행하여, 프로브 스폿 위치 (532 nm) 및 PCR 산물 혼성화 (635 nm)를 검출한다.
이미지 분석
다음 영상화 조건: 33% 레이저 출력, 400PMT 설정 532 nm/33% 레이저 출력, 700PMT 설정 635 nm를 사용하여, 래스터 (raster) 기반 공초점 스캐너: GenePix 4000B 마이크로어레이 스캐너에서 두 파장 (532 nm 및 635 nm)에서 이미지 분석을 수행하였다. 도 3은 마이크로어레이의 구조 및 혼성화 성능의 예를 보여준다.
도 3a는 635nm에서 시각화된 바와 같이 혼성화 및 세척 후 상기에 기재된 대표적인 마이크로어레이의 이미지를 보여준다. 635nm 이미지는 각 마이크로어레이 스폿에서 위치 마커로 마이크로어레이 제작 동안 도입된 이작용성 중합체 링커 올리고dT의 5' 말단에 부착된 (적색) CY5 fluor의 신호로부터 도출된다 (도 1 및 표 3 참조). 도 3a의 데이터는 Cy5-표지된 올리고dT가 도 1에 기재된 바와 같이 이작용성 링커의 조합된 활성 및 후속 UV-가교결합을 통해 마이크로어레이 표면에 영구적으로 연결되었음을 확인시킨다.
도 3b는 532nm에서 시각화된 바와 같이 혼성화 및 세척 후 상기에 기재된 대표적인 마이크로어레이의 이미지를 보여준다. 532nm 이미지는 PCR 반응 #2 동안 획득된 PCR 증폭 DNA의 5' 말단에 부착된 (녹색) CY3 fluor의 신호로부터 도출된다. 48개의 개별 프로브 중 작은 하위세트만이 Cy3-표지된 PCR 산물에 결합한다는 것이 도 3b로부터 분명하여, 따라서 이는 핵산 프로브를 연결하여 마이크로어레이를 생성하는 본 방법 (도 1)이 (동종) 용액 상태 표적에 대한 서열 특이적 결합이 가능한 마이크로어레이 산물을 생성함을 확인시킨다. 도 3b의 데이터는 기본적으로 데이터의 3회 반복을 보여준다 (즉, 어레이는 최종 48 x 3 = 144 요소 마이크로어레이를 생성하기 위해 3개의 별개의 하위 어레이로 3회 프린팅된 동일한 48개의 프로브 세트임). 3개의 반복된 하위 도메인으로서 동일한 48개의 프로브 세트가 3회 프린팅될 수 있다는 관찰 결과는 본 발명이 재현 가능한 마이크로어레이 산물을 생성함을 보여준다.
도 3c는 532nm 및 635nm 이미지 둘 모두가 중첩되어 시각화된 바와 같이, 혼성화 및 세척 후 상기에 기재된 대표적인 마이크로어레이의 이미지를 보여준다. 중첩된 이미지는 CY3 표지된 PCR 산물의 서열 특이적 결합과 관련된 Cy5 표지된 올리고dT 위치 마커의 병렬 부착의 유용성을 보여준다.
실시예 3
증폭, 혼성화 및 마이크로어레이 분석
도 4a는 제1 PCR 단계의 예를 보여준다. 표준에 따라 이러한 PCR 반응을 PCR 프라이머의 투여에 의해 개시시켰다. 프라이머는 PCR 기반 DNA 증폭 반응의 개시 및 종결 지점을 규정한다. 본 실시형태에서, 필요한 DNA 증폭을 지원하기 위해 한 쌍의 PCR 반응이 사용된다. 일반적으로, 이러한 PCR 증폭은 일련의 방식으로 수행된다: 도 4a에서 접미사 "P1"로 표시된 제1 PCR 쌍을 사용하여, 예를 들어 미가공 대마초 잎 세척액과 같은 임의의 비정제 DNA 샘플 약 1 μL을 증폭시킨다. 제1 PCR 반응의 산물 약 1 μL는 DNA에 형광 염료 표지를 부착하는데 사용되는 제2 PCR 반응의 기질로 사용되므로, 이 표지는 마이크로어레이에 혼성화함으로써 결합되는 경우, PCR 산물을 검출하는데 사용될 수 있다. 제1 및 제2 PCR의 프라이머 서열은 표 6에 나와 있다. 이 2 단계 반응의 역할은 분석할 병원체 DNA를 정제할 필요성을 방지하는 것이다. 프라이머 "P1"을 사용하는 제1 PCR 반응은 미가공 출발 물질을 수용하도록 최적화되며, 제2 PCR 프라이머 쌍 "P2"는 제1 반응의 산물로부터 최대 DNA 수율과 염료 표지를 획득하기 위해 최적화된다. 이를 종합하면, 2 반응의 합에 의해 대상 병원체 DNA를 정제하거나 특성화할 필요가 없다.
도 4a는 후속적으로 혼성화에 의해 조사될 수 있는 영역을 단리 및 증폭하기 위해 일 실시형태에서 증폭된 16s rDNA 영역을 저 해상도로 보여준다. 이 16s rDNA 영역의 DNA 서열은 상이한 박테리아 종에 따라 크게 달라지는 것으로 공지되어 있다. 결과적으로, 2 단계 PCR에 의해 이 영역을 증폭한 후, 그 서열 변이를 후속 마이크로어레이 혼성화 단계에 의해 조사할 수 있다.
도 4b는 E. 콜라이의 가장 중요한 병원체 균주에 존재하고, Shigatoxin 1을 인코딩하는 stx1 유전자 좌위를 나타낸다. 동일한 2 단계 PCR 접근 방식을 사용하여, 이를 탠뎀 방식으로 사용하여, 비처리 박테리아 샘플을 증폭 및 표지하여, 마이크로어레이 기반 DNA 혼성화에 의한 분석을 위한 stx1 유전자 좌위를 제공할 수 있는 2개의 PCR 프라이머 쌍 세트를 설계하였다.
도 5a는 또한 E. 콜라이의 가장 중요한 병원체 균주에 존재하고, Shigatoxin 2를 인코딩하는 stx2 유전자 좌위를 나타낸다. 동일한 2 단계 PCR 접근 방식을 사용하여, 이를 탠뎀 방식으로 사용하여, 비처리 박테리아 샘플을 증폭 및 표지하여, 마이크로어레이 기반 DNA 혼성화에 의한 분석을 위한 stx2 유전자 좌위를 제공할 수 있는 2개의 PCR 프라이머 쌍 세트를 설계하였다.
도 5b는 모든 살모넬라 균주에 존재하고, InvAsion A 유전자 산물을 인코딩하는 invA 유전자 좌위를 나타낸다. 동일한 2 단계 PCR 접근 방식을 사용하여, 이를 탠뎀 방식으로 사용하여, 비처리 박테리아 샘플을 증폭 및 표지하여, 마이크로어레이 기반 DNA 혼성화에 의한 분석을 위한 invA 유전자 좌위를 제공할 수 있는 2개의 PCR 프라이머 쌍 세트를 설계하였다.
도 6은 모든 E. 콜라이 균주에 존재하고, 리보솜 연장 인자 Tu를 인코딩하는 tuf 유전자 좌위를 나타낸다. 동일한 2 단계 PCR 접근 방식을 사용하여, 이를 탠뎀 방식으로 사용하여, 비처리 박테리아 샘플을 증폭 및 표지하여, 마이크로어레이 기반 DNA 혼성화에 의한 분석을 위한 tuf 유전자 좌위를 제공할 수 있는 2개의 PCR 프라이머 쌍 세트를 설계하였다.
도 7은 효모 및 곰팡이의 모든 균주를 포함하여 모든 진핵생물에 존재하고, 리보솜 유전자 5.8S와 28S 사이의 유전자 사이 영역을 인코딩하는 ITS2 유전자 좌위를 나타낸다. ITS2는 서열이 매우 가변적이며, 이 서열 변이를 사용하여, 효모 및 곰팡이의 균주 차이를 확인할 수 있다. 동일한 2 단계 PCR 접근 방식을 사용하여, 이를 탠뎀 방식으로 사용하여, 비처리 효모 및 곰팡이 샘플을 증폭 및 표지하여, 마이크로어레이 기반 DNA 혼성화에 의한 분석을 위한 ITS2 유전자 좌위를 제공할 수 있는 2개의 PCR 프라이머 쌍 세트를 설계하였다.
도 8은 모든 식물 및 동물을 포함하는 모든 진핵생물에 존재하고, 리보솜 유전자 18S와 5.8S 사이의 유전자 사이 영역을 인코딩하는 ITS1 유전자 좌위를 나타낸다. ITS1은 고등 식물 사이에 서열이 매우 가변적이며, 그 서열 변이를 사용하여 식물 종을 확인할 수 있다. 동일한 2 단계 PCR 접근 방식을 사용하여, 이를 탠뎀 방식으로 사용하여, 비처리 대마초 샘플을 증폭 및 표지하여, 마이크로어레이 기반 DNA 혼성화에 의한 분석을 위한 ITS1 유전자 좌위를 제공할 수 있는 2개의 PCR 프라이머 쌍 세트를 설계하였다. ITS1의 대마초 서열 변이체의 확인 및 정량화는 동일한 대마초 샘플로부터 회수된 병원체 분석에서 내부 정규화 표준으로 사용된다.
표 7은 도 4에 기재된 바와 같이 박테리아 16s 유전자 좌위의 DNA 마이크로어레이 기반 분석을 위한 일 실시형태에서 마이크로어레이 프로브로 사용되는 대표적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 이들 프로브의 서열은 다양하여, 박테리아 간의 종 차이의 함수로 발생하는 동종 서열 변이를 포함한다. 모든 경우에 프로브 서열은 각 말단에서 일련의 T 가닥으로 종결되어, 마이크로어레이 제조시 마이크로어레이 표면에 대한 프로브 부착의 효율성이 향상된다. 표 8은 마이크로어레이에서 사용되는 보정 및 음성 대조군의 서열을 보여준다.
표 9는 도 7에 기재된 바와 같이 ITS2 유전자 좌위를 기반으로 한 진핵 병원체 (진균, 효모 및 곰팡이)의 DNA 마이크로어레이 기반 분석을 위한 실시형태에서 마이크로어레이 프로브로 사용되는 대표적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 표 8에 제시된 서열은 대조군으로 사용된다. 이들 프로브의 서열은 다양하여, 진균, 효모 및 곰팡이 간의 종 차이의 함수로 발생하는 동종 서열 변이를 포함한다. 모든 경우에 프로브 서열은 각 말단에서 일련의 T 가닥으로 종결되어, 마이크로어레이 제조시 마이크로어레이 표면에 대한 프로브 부착의 효율성이 향상된다.
표 10은 ITS1 유전자 좌위에서 대마초 (대마초 종)의 DNA 마이크로어레이 기반 분석을 위한 일 실시형태에서 마이크로어레이 프로브로 사용되는 대표적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
| 서열번호 126 | 대마초 ITS1 DNA 대조군 1 | TTTTTTAATCTGCGCCAAGGAACAATATTTTTTT |
| 서열번호 127 | 대마초 ITS1 DNA 대조군 2 | TTTTTGCAATCTGCGCCAAGGAACAATATTTTTT |
| 서열번호 128 | 대마초 ITS1 DNA 대조군 3 | TTTATTTCTTGCGCCAAGGAACAATATTTTATTT |
표 11은 박테리아 병원체 (stx1, stx2, invA, tuf)의 DNA 마이크로어레이 기반 분석 및 ITS1 유전자 좌위에 존재하는 숙주 대마초 (대마초 종)의 DNA 분석을 위한 실시형태에서 마이크로어레이 프로브로 사용되는 대표적인 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. ITS1 서열이 변형된 이와 동일한 접근 방식을 사용하여 이러한 추출물에서 다른 식물 숙주의 존재를 분석할 수 있다.
| 서열번호 81 | stx1 유전자 | TTTTTTCTTTCCAGGTACAACAGCTTTTTT |
| 서열번호 82 | stx2 유전자 | TTTTTTGCACTGTCTGAAACTGCCTTTTTT |
| 서열번호 59 | etuf 유전자 | TTTTTTCCATCAAAGTTGGTGAAGAATCTTTTTT |
| 서열번호 61 | invA 유전자 | TTTTTTTATTGATGCCGATTTGAAGGCCTTTTTT |
| 서열번호 126 | 대마초 ITS1 DNA 대조군 1 | TTTTTTAATCTGCGCCAAGGAACAATATTTTTTT |
도 9는 대마초 또는 관련 식물 샘플의 박테리아 병원체 또는 효모 및 곰팡이 보체를 분석하기 위해 실시형태에 사용되는 방법을 기재하는 흐름도를 보여준다. 표면 결합 병원체를 테이프 풀링하거나, 잎 또는 새싹 또는 줄기를 간단히 세척한 다음, 단일 멀티플렉스 "유전자 강화" 멀티플렉스 PCR 반응 후, 단일 멀티플렉스 "표지화 PCR"에 의해 대마초 식물 물질로부터 병원체 샘플을 수확할 수 있다. 진균, 효모 및 곰팡이를 분석하는데 사용되는 2 단계 PCR 반응 쌍과는 다른 2 단계 PCR 반응 쌍을 박테리아 분석에 사용한다. 모든 경우에, 표적 박테리아 또는 진균, 효모 및 곰팡이의 DNA를 2 단계 PCR 전에 DNA의 추출 또는 특성화없이 PCR 증폭시킨다. 유전자 좌위 강화 및 표지화 PCR 단계 후, 생성된 PCR 산물을 결합 완충액으로 희석한 다음 마이크로어레이 시험에 적용한다. 분석 (혼성화 및 세척)에 필요한 후속 마이크로어레이 단계를 실험실 주변 온도에서 수행한다.
도 10은 일 실시형태에 사용되는 마이크로어레이의 대표적인 구현예의 이미지를 제공한다. 이 구현예에서 대마초 DNA 대조군 (표 7 및 10)과 함께 박테리아 분석에 필요한 모든 핵산 프로브를 표 10에 제시된 것과 같은 추가의 박테리아 및 대마초 프로브와 함께 단일 144 요소 (12x12) 마이크로어레이로 제작한다. 이 구현예에서 대마초 DNA 대조군과 함께 진균, 효모 및 곰팡이 분석에 필요한 모든 핵산 프로브를 표 9에 제시된 추가의 진균 프로브와 함께 단일 144 요소 (12x12) 마이크로어레이로 제작하였다. 이 어레이를 6개의 동일한 마이크로어레이의 2개의 컬럼으로서 PTRE 코팅 유리 상에 제조한다. 12개의 동일한 마이크로어레이 각각은 사용된 핵산 프로브에 따라 완전한 마이크로어레이 기반 분석 박테리아 분석 또는 진균, 효모 및 곰팡이에 대한 완전한 마이크로어레이 기반 분석을 수행할 수 있다. 핵산 프로브를 압전 또는 밀착 기반 또는 이와 균등한 미세 유체 프린팅를 통해 유리 지지체에 연결시켰다. 개별 마이크로어레이를 이 경우 소수성 PTFE 코팅에 의해 다른 11개로부터 유체적으로 단리하지만, 다른 물리적 단리 방법을 사용할 수 있다.
도 11a 및 도 11b는 일 실시형태의 대표적인 DNA 마이크로어레이 분석을 나타낸다. 이 경우, 2 단계 PCR 반응 및 마이크로어레이 기반 혼성화 분석 후 정제된 박테리아 DNA 또는 정제된 진균 DNA를 사용하여, 친화도 및 특이성을 시험하였다. 인식할 수 있는 바와 같이, 박테리아 DNA (상부) 또는 진균 DNA (하부) 각각을 검출하기 위해 설계된 핵산 프로브를 혼성화를 통해 표적 DNA에 정확하게 결합시켜, 박테리아 또는 효모를 정확하게 검출하였다. 도 12는 일 실시형태의 대표적인 DNA 마이크로어레이 분석을 나타낸다. 이 경우, 2 단계 PCR 반응 및 마이크로어레이 기반 혼성화 분석 후 5개의 상이한 비정제 미가공 대마초 잎 세척 샘플을 사용하여 친화도 및 특이성을 시험하였다. 각 샘플을 반으로 나눈 후 박테리아 분석 또는 진균, 효모 및 곰팡이 분석을 위해 각각 처리함으로써, 5개의 잎 세척 샘플 모두에 대해 박테리아 및 진균 분석을 수행하였다. 도 12의 데이터는 두 분석의 결과를 조합하여 획득된 것이다. 도 12는 도 9에 기재된 바와 같이 2 단계 PCR 및 마이크로어레이 혼성화 분석의 조합을 통상적인 대마초 잎 세척액의 병원체 보체를 분석하는데 사용할 수 있음을 보여준다. 예상되지만 임의의 식물 물질의 이러한 세척이 유사하게 수행될 수 있는 것으로 나타나지 않았다.
도 13은 일 실시형태의 대표적인 DNA 마이크로어레이 분석을 나타낸다. 이 경우, 하나의 비정제 (미가공) 대마초 잎 세척 샘플을 사용하고, 시중에서 입수한 생 칸디다 (Candida)의 균질 효모 시험관 배양으로부터 획득된 데이터와 비교하여 2 단계 PCR 반응 및 마이크로어레이 기반 혼성화 분석 후 친화도 및 특이성을 시험하였다. 대마초 잎 세척액 및 배양된 진균 분석을 둘 모두 진균에 특이적인 프로브를 통해 분석을 위해 각각 처리하여 수행하였다 (표 9 및 표 11 참조).
도 13의 데이터는 잎 세척액 및 효모 시험관 배양 샘플 둘 모두의 분석 결과를 조합하여 획득된 것이다. 도 13의 데이터는 도 9에 기재된 바와 같이 2 단계 PCR 및 마이크로어레이 혼성화 분석의 조합을 사용하여, 순수한 (생) 진균 샘플로 수행할 수 있는 것과 같이 적절한 통상적인 대마초 잎 세척액의 진균 보체를 조사할 수 있음을 보여준다. 식물 물질의 이러한 세척을 통한 진균 분석을 유사하게 수행할 수 있을 것으로 예상된다.
도 14는 E. 콜라이를 포함하는 엔테로박테리아세아 과에서 저수준의 박테리아 검출을 위한 실시형태의 변형에 사용되는 PCR 프라이머의 위치의 대표적인 그래프를 보여준다. 이러한 PCR 프라이머를 사용하여, 마이크로어레이 혼성화를 통한 분석을 위해 표적화된 유기체의 표지 DNA를 선택적으로 증폭 및 염색한다.
도 15a 내지 도 15c는 다양한 미생물 입력에 대한 분석 감도를 보여주는 대표적인 DNA 마이크로어레이 분석을 도시한다. 이 경우 E. 콜라이 O157:H7, E. 콜라이 O111 (도 15a 및 도 15b) 및 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica) (도 15c)의 열거된 박테리아 콜로니로 구성된 인증된 참조 물질을 홉 (hop) 식물 대용물 매트릭스에 일련 희석으로 스파이킹한 다음, 도 14에 대해 기재된 분석 버전을 사용하여 매트릭스를 처리한다. 도 7의 관련 프로브로부터의 혼성화 결과가 제시된다. x축의 큰 숫자는 각 홉 식물 샘플에 스파이킹된 박테리아 콜로니 형성 단위 (CFU)의 총 수를 나타내며, x축의 작은 숫자는 실제로 분석에 입력된 스파이킹 물질의 CFU의 수치를 나타낸다. 원래 스파이킹된 홉 샘플 부피의 약 1/50만이 실제로 분석되었다. 도 15a 내지 도 15c의 x축의 작은 숫자는 총 (더 낮은) 값의 정확히 1/50이다. 인식할 수 있는 바와 같이, 도 15a 내지 도 15c는 실시형태의 마이크로어레이 시험이 마이크로어레이 분석당 1 CFU 미만을 검출할 수 있음을 보여준다. 도 15a 내지 도 15c에 제시된 박테리아 게놈 내의 핵산 표적은 16s rDNA를 포함한다. 이러한 각 박테리아 유기체에는 16s rDNA 유전자의 다수의 카피가 존재하며, 이는 1 CFU 미만의 수준에서 검출될 수 있다. 콜로니 형성 단위는 대부분의 경우 단일 박테리아에 근사하기 때문에, 도 15a 내지 도 15c의 데이터는 본 마이크로어레이 분석이 분석당 단일 (또는 소수)의 박테리아를 검출하는 능력에 접근하는 감도를 가짐을 나타낸다. 모든 박테리아 및 진핵 미생물에 대해 유사한 감도가 예상되는데, 이는 모두 세포당 리보솜 rDNA 유전자의 다수의 카피를 제공한다는 점에서 공지되어 있다.
표 12a 및 표 12b는 비교를 위한 비농축 및 18시간 농축의 분말 건조 식품 샘플로부터 획득된 대표적인 마이크로어레이 혼성화 데이터의 종합 결과를 보여준다. 데이터는 농축할 필요없이 박테리아 미생물이 본 발명의 마이크로어레이에서 성공적으로 검출되었음을 보여준다.
도 16 및 표 13 내지 표 15는 과일 분석을 위한 실시형태, 채소 분석을 위한 실시형태 및 다른 식물 물질의 분석을 위한 실시형태를 기재한다. 위의 교시내용은, 예를 들어 대마초 및 홉의 비처리 잎 및 새싹 샘플을 수용액에서 세척하여, 미생물 병원체를 포함하는 물 세척액을 생성한 후, 이를 본 RSG 및 마이크로어레이의 조합을 통해 분석할 수 있음을 보여준다.
과일 및 채소의 신선한 잎, 꽃, 줄기 또는 뿌리 물질을 또한 동일한 방식으로 수용액에서 세척된 경우 (신선한 경우 또는 건조 및 분쇄 또는 기타 유형 또는 가공 후), 그 후 RSG 및 마이크로어레이 분석의 본 조합에 의해 다른 식물 물질 중 해당 미생물의 DNA 보체를 회수 및 분석할 수 있다.
과일과 채소에 대해 적어도 2개의 샘플 수집 방법이 가능한다. 한 가지 방법은 위에서 대마초에 대해 기재된 바와 같이 과일을 간단히 세정하는 것이다. 과일 및 채소로부터 샘플을 수집하는 또 다른 방법은 "테이프 풀"이며, 이는 표준 법의학 테이프 조각을 과일 표면에 붙인 다음 떼어내는 것이다. 떼어내면, 그 후 테이프를 상기에 기재된 표준 세척 완충액에 담가 테이프에 부착된 미생물을 현탁시킨다. 테이프 세척 단계 이후, 처리 및 분석의 다른 모든 양상 (즉, 미가공 샘플 유전자형 분석, PCR, 이 후 마이크로어레이 분석)은 상기에 기재된 것과 동일한다.
[표 12a]
[표 12b]
표 13 내지 표 15의 데이터는 과일의 간단한 세척 및 과일의 테이프 풀 샘플링이 유사한 미생물 데이터를 생성함을 나타낸다. 보트리티스는 블루베리에서 널리 공지된 진균 오염원이므로, 예상된 바와 같이, 블루베리 샘플은 보트리티스 (Botrytis)에 양성인 것으로 나타났다. 페니실리움 (Penicillium)은 레몬에 대해 널리 공지된 진균 오염원이므로, 예상된 바와 같이 레몬 샘플은 페니실리움에 양성인 것으로 나타났다.
도 16 및 표 13 내지 표 15에 구현된 데이터는 과일 표면 (이 경우 블루베리 및 레몬)에서 효모 미생물의 회수 및 분석을 위한 실시형태의 사용을 보여주지만, 실시형태는 박테리아 및 진균 오염의 분석을 위해 다른 과일 및 채소로 확장될 수 있다.
표 16은 환경용수 샘플/표본의 분석을 위한 실시형태를 보여준다. 상기 교시내용은 예를 들어 대마초 및 홉의 비처리 잎 및 새싹 샘플을 수용액에서 세척하여 미생물 병원체를 포함하는 물 세척액을 생성한 다음 미가공 샘플 유전자형 분석 (RSG) 및 마이크로어레이의 본 조합을 통해 분석할 수 있음을 보여준다. 미생물이 포함된 물 샘플을 환경 공급원 (예를 들어, 우물물, 해수, 토양 유출수 또는 지역 사회 상수도에서 나온 물)으로부터 획득한 다음 직접 분석하거나, 필터의 표면 상에 미생물 보체를 농축시키기 위한 일반적인 물 여과 후 분석하는 경우, RSG 및 마이크로어레이 분석의 본 조합이 이러한 미생물의 DNA 보체를 회수 및 분석할 수 있음을 보여준다.
표 16에 구현된 데이터는 "음성 대조군"으로 지칭되는 2개의 milliQ 실험실 용수 샘플 (역삼투를 통해 획득됨)과 함께 5개의 우물물 샘플 (2H, 9D, 21, 23, 25로 지정됨)로부터 획득되었다. 모든 샘플을 멸균 0.4 um 필터에서 여과하였다. 여과 후, 포획되었을 수 있는 임의의 미생물 오염원이 포함된 필터를 대마초 및 과일 세척액에 대해 상기에 기재된 바와 동일하게 표준 세척 용액으로 세척하였다. 세척 후, 세척 용액에 현탁된 미생물을 정확히 동일한 조합의 원심분리를 적용한 다음 (미생물 펠릿을 생성하기 위함), 비처리 펠릿-용해물의 용해 및 PCR을 (대마초에 대해 상기에 기재된 바와 동일하게) 수행한 다음, 또한 대마초에 대해 기재된 바와 같이 PCR 및 마이크로어레이 분석을 수행하였다.
표 16에 나타난 데이터는 환경용수 샘플의 여과액에 수집된 미생물을 동일한 조합의 미가공 샘플 유전자형 분석 후, 대마초 및 과일 세척액에 사용된 PCR 및 마이크로어레이 분석을 통해 분석할 수 있음을 보여준다. 표 16의 사체 요소는 5개의 비처리 우물물 샘플 모두에 호기성 박테리아와 담즙 내성 그람 음성 박테리아가 포함되어 있음을 보여준다. 비처리 (미가공) 우물물에는 두 종류의 박테리아가 모두 존재할 것으로 예상된다. 따라서, 표 16의 데이터는 본 발명의이 실시형태가 환경 관련 물 샘플의 분석에 사용될 수 있음을 나타낸다.
상기 교시내용은 대마초 및 홉의 비처리 잎 및 새싹 샘플을 수용액에서 세척하여 미생물 병원체를 포함하는 물 세척액을 생성할 수 있으며, 그 후 이를 RSG 및 마이크로어레이의 본 조합을 통해 분석할수 있음을 보여준다. 상기 데이터는 또한 환경 관련 우물물 샘플이 실시형태에 의해 분석될 수 있음을 보여준다. 또한, 미생물이 포함된 물 샘플을 산업 가공 공급원 (예를 들어, 과일, 채소, 곡물, 육류 가공시 유출수)으로부터 획득한 다음 직접 분석하거나, 필터의 표면 상에 미생물 보체를 농축시키기 위한 일반적인 물 여과 후 분석하는 경우, RSG 및 마이크로어레이 분석의 본 조합이 이러한 미생물의 DNA 보체를 회수 및 분석할 수 있음을 보여준다.
또한, 에어로졸 또는 공기 중 먼지에 흡착된 미생물을 포함하는 공기 샘플을 일반적인 공기 필터 (예를 들어, 농업 또는 식품 가공 공장 또는 공장 바닥 또는 공공 건물 또는 개인 가정의 공기 여과에 사용되는 것) 상의 공기 여과에 의해 획득한 경우, 그 후 식물 물질에 대해 나타낸 바와 같이 이러한 공기 필터를 수용액으로 세척하여 미생물 포함 필터 용출액을 생성할 수 있고, 미가공 샘플 유전자형 분석 (RSG) 및 마이크로어레이 분석의 본 조합에 의해 이러한 미생물의 DNA 보체를 회수 및 분석할 수 있다.
실시형태에 대한 전술한 기재내용은 당업자가 현재 최적의 방식으로 고려하는 것을 제조 및 사용할 수 있게 하지만, 당업자는 본 명세서의 특정 실시형태, 방법 및 실시예의 변형, 조합 및 균등물의 존재를 이해하고 인식할 것이다. 따라서, 본 개시내용은 상기 기재된 실시형태, 방법 및 실시예에 의해 제한되지 않고, 본 개시내용의 범위 및 사상 내의 모든 실시형태 및 방법에 의해 제한되어야 한다.
실시예 4
3차원 격자 마이크로어레이 시스템을 이용한 정량적 DNA 분석 방법
샘플 처리
식물 표면으로부터의 미생물의 수확은 다음 단계를 포함한다:
1. 1x 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 식물 샘플 또는 테이프 풀을 세척한다.
2. 식물 물질/테이프를 제거한다.
3. 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 상청액을 따라낸다.
4. 샘플 분해 완충액과 사전 혼합된 PathogenDx® 샘플 프렙 완충액에 재현탁시킨다.
5. 55℃에서 45분 동안 가열한다.
6. 교반하여 펠릿을 분산시킨다.
7. 95℃에서 15분 동안 가열한다.
8. 잠깐동안 교반 및 원심분리하여, 하나 이상의 유형의 미생물로부터의 DNA를 포함하는 샘플을 획득한다.
처리된 샘플에의 합성 DNA 첨가
상기 기재된 샘플 처리 단계로부터 획득된 샘플에 합성 DNA의 인지된 양 (인지된 카피 수)을 첨가한다. 합성 DNA는 증폭되는 16s (박테리아) 또는 ITS2 (진핵생물) DNA 서열과 유사한 길이 및 서열 구조를 갖지만, 샘플 중 박테리아 및 진핵생물 DNA와 구별되는 별개의 중심 영역 서열을 가지고 있다. 합성 DNA의 5' 및 3' 말단 서열을 조회되는 미지의 박테리아 또는 미지의 진핵생물 DNA의 공통 서열과 실질적으로 동일하도록 설계하여, 샘플 중 미지의 DNA의 증폭에 사용되는 동일한 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 증폭할 수 있다. 이러한 공통 서열의 예는 서열번호 152 및 서열번호 153에 제시되어 있다 (표 17). 이러한 특징을 통해 샘플에서 합성 DNA와 미지의 미생물 풀 DNA 둘 모두의 비편중 증폭이 가능한다. 합성 DNA 서열의 예는 서열번호 154 내지 서열번호 157에 제시되어 있다 (표 17).
PCR에 의한 증폭
유전자 좌위 특이적 프라이머 쌍 (표 6 및 표 18)을 사용하여, 합성 DNA 서열을 포함하는 샘플을 증폭시켰다 (PCR 반응 #1). 표지화 프라이머 쌍 (표 6 및 표 18)을 사용하여, PCR 반응 #1 산물 (1 μL)을 제2 PCR 반응 (PCR 반응 #2)에 적용하여, 추가로 증폭시키고, 2개의 표적화된 영역 을 형광단 표지된 앰플리콘을 생성하였다. PCR 반응 #2 산물 (50 μL)을 혼성화 완충액 (4x SSC + 5x Denhardt 용액)으로 1-1로 희석한 다음, 혼성화를 위해 마이크로어레이에 직접 적용하였다.
혼성화
종래 기술의 마이크로어레이 제조 방법은 마이크로어레이 표면을 전처리할 필요없이 혼성화를 통해 DNA를 분석할 수 있기 때문에, 마이크로어레이의 사용은 간단하고, 6개의 수동 또는 자동 피펫팅 단계를 포함한다.
1) 증폭된 DNA + 결합 완충액을 조회되는 병원체 유전자에 대한 올리고뉴클레오타이드 프로브 서열 및 내부 기준 표준으로 사용되는 합성 DNA (표 7 내지 표 11 및 표 19)가 고정된 마이크로어레이에 피펫팅한다.
2) 30분 동안 인큐베이션하여 DNA를 마이크로어레이에 결합시킨다 (일반적으로 실온, RT).
3) 피펫팅으로 DNA + 결합 완충액을 제거한다.
4) 마이크로어레이 (0.4x SSC + 0.5x Denhardt)에 50 μL의 세척 완충액을 피펫팅하고 RT에서 5분 동안 인큐베이션한다.
5) 피펫팅으로 세척 완충액을 제거한다.
6) 단계 4 및 5를 반복한다.
7) 532 nm 및 635 nm에서 이미지 분석을 수행하여, 프로브 스폿 위치 (532 nm) 및 PCR 산물 혼성화 (635 nm)를 검출한다.
이미지 분석
다음 영상화 조건: 33% 레이저 출력, 400PMT 설정 532 nm/33% 레이저 출력, 700PMT 설정 635 nm를 사용하여, 래스터 기반 공초점 스캐너: GenePix 4000B 마이크로어레이 스캐너에서 두 파장 (532 nm 및 635 nm)에서 이미지 분석을 수행하였다. 도 3은 마이크로어레이의 구조 및 혼성화 성능의 예를 보여준다.
도 3a는 635nm에서 시각화된 바와 같이 혼성화 및 세척 후 상기에 기재된 대표적인 마이크로어레이의 이미지를 보여준다. 635nm 이미지는 각 마이크로어레이 스폿에서 위치 마커로 마이크로어레이 제작 동안 도입된 이작용성 중합체 링커 올리고dT의 5' 말단에 부착된 (적색) CY5 fluor의 신호로부터 도출된다 (도 1 및 표 3 참조). 도 3a의 데이터는 Cy5-표지된 올리고dT가 도 1에 기재된 바와 같이 이작용성 링커의 조합된 활성 및 후속 UV-가교결합을 통해 마이크로어레이 표면에 영구적으로 연결되었음을 확인시킨다.
도 3b는 532nm에서 시각화된 바와 같이 혼성화 및 세척 후 상기에 기재된 대표적인 마이크로어레이의 이미지를 보여준다. 532nm 이미지는 PCR 반응 #2 동안 획득된 PCR 증폭 DNA의 5' 말단에 부착된 (녹색) CY3 fluor의 신호로부터 도출된다. 48개의 개별 프로브 중 작은 하위세트만이 Cy3-표지된 PCR 산물에 결합한다는 것이 도 3b로부터 분명하여, 따라서 이는 핵산 프로브를 연결하여 마이크로어레이를 생성하는 본 방법 (도 1)이 (동종) 용액 상태 표적에 대한 서열 특이적 결합이 가능한 마이크로어레이 산물을 생성함을 확인시킨다. 도 3b의 데이터는 기본적으로 데이터의 3회 반복을 보여준다 (즉, 어레이는 최종 48 x 3 = 144 요소 마이크로어레이를 생성하기 위해 3개의 별개의 하위 어레이로 3회 프린팅된 동일한 48개의 프로브 세트임). 3개의 반복된 하위 도메인으로서 동일한 48개의 프로브 세트가 3회 프린팅될 수 있다는 관찰 결과는 본 발명이 재현 가능한 마이크로어레이 산물을 생성함을 보여준다.
도 3c는 532nm 및 635nm 이미지 둘 모두가 중첩되어 시각화된 바와 같이, 혼성화 및 세척 후 상기에 기재된 대표적인 마이크로어레이의 이미지를 보여준다. 중첩된 이미지는 CY3 표지된 PCR 산물의 서열 특이적 결합과 관련된 Cy5 표지된 올리고dT 위치 마커의 병렬 부착의 유용성을 보여준다.
실시예 5
절대 DNA 카피 수의 정량화
본 발명에 개시된 바와 같이 샘플 중 대상 미생물에 대한 절대 DNA 카피 수의 정량를 제1 PCR 증폭 단계 전에 합성 DNA의 인지된 카피 수를 샘플에 도입함으로써 수행한다. 합성 DNA는 제1 PCR (도 17a, 도 17b 및 도 18)에서 생성된 16s (박테리아) 또는 ITS2 (진핵생물) DNA 앰플리콘과 유사한 길이 및 서열 구조를 갖지만, 샘플 중 박테리아 및 진핵생물 DNA와 구별되는 별개의 중심 영역 서열을 가지고 있다. 합성 DNA의 5' 및 3' 말단 서열을 조회되는 미지의 박테리아 또는 미지의 진핵생물 DNA의 공통 서열과 실질적으로 동일하도록 설계하여, 샘플 중 미지의 DNA의 증폭에 사용되는 동일한 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 증폭할 수 있다. 이러한 특징을 통해 조회되는 미지의 미생물의 초가변 영역을 증폭하는데 사용되는 동일한 PCR 프라이머 쌍에 의해 합성 DNA를 증폭시킬 수 있다. 결과적으로, 합성 DNA는 제1 및 제2 PCR 증폭 반응 동안 프라이머/주형 혼성화와 관련하여 샘플 중 미생물 풀 DNA와 구별되지 않는다. 이렇게 하면 합성 (내부 기준 표준) 및 미생물 (미지의) DNA의 비편중 증폭이 보장되어, 조회된 DNA 및 합성 DNA의 앰플리콘에 대한 신호 강도 각각이 각각의 DNA의 원래 카피 수에 비례한다 (하기에서 논의됨). 이러한 공통 서열의 예는 서열번호 152 및 서열번호 153에 제시되어 있다 (표 17). 합성 DNA 서열의 예는 서열번호 154 내지 서열번호 157에 제시되어 있다 (표 17).
본 마이크로어레이 기반 분석에서 전개되는 바와 같은 PCR은 일반적으로 일종의 종결 지점 PCR로 수행된다. 가장 간단한 근사치로 중합효소 연쇄 반응 (PCR)은 일종의 연쇄 반응으로 기재되었으며, 이는 PCR 반응 과정의 개시시 DNA 표적 가닥이 극도로 희석되면, PCR의 각 주기가 일반적으로, 각각의 새로운 PCR 열 주기당 증폭된 DNA 산물이 거의 정확히 2배 증가하는 산물 DNA의 기하학적 증가를 야기할 것이기 때문이다. 이러한 2배 증가가 무기한으로 발생한다면 증폭된 DNA 산물의 농도는 이론적으로 기하급수적으로 무한대로 증가해야 한다. 그러나 실제로, 그러한 DNA 산물의 무한대 증가는 일어나지 않고, 널리 공지된 "S자형" 시그모이드 (sigmoidal) PCR 반응 곡선이 관찰되며, PCR 반응물 혼합물의 하나 이상의 구성요소 또는 PCR 산물 혼합물의 하나 이상의 구성요소가 앰플리콘 생성의 포화를 초래한다. 일반적으로 이러한 "평탄한" S자형 PCR 곡선은 반응 혼합물에서 PCR 프라이머의 소모로 인해 발생한다고 여겨진다. 따라서 본 발명에서는 두 PCR 반응 (제1 유전자 좌위 PCR 및 제2 표지화 PCR, 도 17a 및 도 17b 및 도 18 참조)에서 PCR 프라이머의 농도를 의도적으로 과량의 큰 몰수로 유지하므로, 프라이머 고갈은 PCR 증폭의 포화에 관련될 수 없다. 그러나 과량의 PCR 반응물이 있어도 두 PCR 모두로부터 생성된 앰플리콘의 "수준의 감소"가 지속되어, 복잡한 "종결 지점" PCR이 생성되고, 앰플리콘의 수는 반응물의 농도가 증가해도 더 이상 증가하지 않는 것으로 관찰되었다. 반응의 이러한 포화는 효소적 최종 산물 억제로 인해 발생한다. 본 발명에서, 이러한 억제는 상당한 양의 PCR 산물을 생성할 수 있게 하여 마이크로어레이 혼성화가 샘플의 낮은 미생물 밀도에 대해 매우 선택적이고 민감하게 유지되도록 보장한다.
따라서 본 발명의 핵심은 상기 언급된 합성 DNA 내부 기준 표준의 배치를 기반으로 하여, PCR 반응이 최종 산물 억제 (또는 다른 임의의 PCR 수준 제어 메커니즘)에 의해 포화되는 경우에도, 미지의 양의 미생물 공급원으로부터 유래된 임의의 DNA의 상대적 존재량을 내부 기준 표준과 직접 비교할 수 있으므로, 인지된 합성 DNA (내부 기준 표준)에 상대적인 미지의 DNA의 존재량은 PCR 반응의 정도에 대해 민감하지 않게 된다. 하기에서 논의되는 바와 같이 이 효과는 PCR 반응이 포화 (최종 산물 억제와 관련됨)에 근접함에 따라, 다양한 증폭된 종의 양이 상호작용하기 시작한다는 이해의 관점에서 본 발명에서 이용되었다.
i) 미지의 DNA 카피 = 표준 DNA 카피
합성 DNA (표준 종)의 카피 수가 원래 샘플의 미생물 DNA (미지 종)의 카피 수와 같을 때, 미생물 DNA 대 합성 DNA의 비는 PCR 반응의 시작 (증폭이 기하급수적인 경우)에서 PCR 반응의 종결 지점 (최종 산물 억제를 통해 증폭이 포화되기 시작하는 경우)까지 1과 같을 것이다.
Cn/Co = Sn/So
상기 식에서,
Cn = 마이크로어레이 분석을 위한 앰플리콘을 제조하는데 사용된 2개의 탠뎀 PCR 반응 중 첫 번째에 첨가된 원래 샘플 혼합물에 존재하는 각 유형 (n)의 미생물 DNA 카피의 수,
Co = 마이크로어레이 분석을 위해 앰플리콘을 제조하는데 사용된 2개의 PCR 반응 중 첫 번째에 첨가된 인지된 합성 DNA 카피의 수 (내부 기준 표준),
Sn = n번째 미생물 종의 PCR 증폭 및 마이크로어레이 혼성화 다음 이미지 분석 후 획득된 상대적 형광 단위 (RFU) 신호 데이터,
So = 합성 DNA 종의 PCR 증폭 및 마이크로어레이 혼성화 다음 이미지 분석 후 획득된 상대적 형광 단위 (RFU) 신호 데이터,
ii) 미지의 DNA 카피 > 표준 DNA 카피
미생물 DNA (미지의 종)가 인지된 합성 DNA (표준 종)보다 훨씬 과량으로 존재하는 경우, 미생물 DNA 대 합성 DNA의 비는 1을 초과할 것이다. 이 상황에서 PCR 반응의 개시시, 앰플리콘 (PCR 산물)의 상대적 존재량은 원래 입력 가닥 비 (미지:표준)을 정확하게 나타낸다. 그러나 반응이 포화를 향해 진행됨에 따라, 더 다량의 종 (이 경우에는 미지의 종)이 하나 이상의 반응물 소모 또는 PCR 반응 산물 - 피로포스페이트 및/또는 앰플리콘에 의한 효소 억제로 인해 최종 산물 포화에 먼저 근접할 것이다. 결과적으로 상대적으로 더 소량의 표준 종의 증폭이 억제될 것이다. 이 상황에서 증폭된 DNA 산물 종의 존재량은 "미지의 종 > 표준 종"의 정확한 정성적 관계를 유지하며, DNA 산물의 비는 더 이상 원래 입력 샘플 중 미지:표준 비와 선형적으로 관련되지 않을 것이다.
Cn/Co ≠ Sn/So
입력과 반응 사이의 이러한 비선형 관계는 화학 필름 또는 전하 결합 소자 (CCD)에서 입자 밀도 대 광자 노출 간의 관계와 같은 화학적 및 물리적 분석에서 널리 공지되어 있고, 영상 입력의 상대 명도는 생성된 이미지에서 상대적인 순위 순서로 유지되지만, 반응 데이터 (증폭 및 마이크로어레이 혼성화 후 PCR 산물 신호와 유사)로부터 원래 입력 (원래 샘플의 DNA 카피 수와 유사)의 상대적 존재량을 예측하기 위해 비선형 반응에 대한 자세한 이해가 필요하다.
iii) 미지의 DNA 카피 < 표준 DNA 카피
미생물 DNA (미지의 종)가 인지된 합성 DNA (표준 종)보다 더 소량으로 존재하는 경우, 미생물 DNA 대 합성 DNA의 비는 1 미만이 될 것이다. 이 상황에서 PCR 반응의 개시시, 앰플리콘 (PCR 산물)의 상대적 존재량은 원래 입력 가닥 비 (미지:표준)을 정확하게 나타낸다. 그러나 반응이 포화를 향해 진행됨에 따라, 더 다량의 종 (이 경우에는 표준 종)이 하나 이상의 반응물 소모 또는 PCR 반응 산물 - 피로포스페이트 및/또는 앰플리콘에 의한 효소 억제로 인해 최종 산물 포화에 먼저 근접할 것이다. 결과적으로 상대적으로 더 소량의 미지의 종의 증폭이 억제될 것이다. 이 상황에서 증폭된 DNA 산물 종의 존재량은 "미지의 종 > 표준 종"의 정확한 정성적 관계를 유지하며, DNA 산물의 비는 더 이상 원래 입력 샘플 중 미지:표준 비와 선형적으로 관련되지 않을 것이다;
Cn/Co ≠ Sn/So
입력과 반응 사이의 이러한 비선형 관계는 화학 필름 또는 전하 결합 소자 (CCD)에서 입자 밀도 대 광자 노출 간의 관계와 같은 화학적 및 물리적 분석에서 널리 공지되어 있고, 영상 입력의 상대 명도는 생성된 이미지에서 상대적인 순위 순서로 유지되지만, 반응 데이터 (증폭 및 마이크로어레이 혼성화 후 PCR 산물 신호와 유사)로부터 원래 입력 (원래 샘플의 DNA 카피 수와 유사)의 상대적 존재량을 예측하기 위해 비선형 반응에 대한 자세한 이해가 필요하다.
상기에 기재된 비선형 관계는 화학 필름 또는 전하 결합 소자 (CCD)에서 입자 밀도 대 광자 노출 간의 관계와 같은 화학적 및 물리적 분석에서 관찰되는 것과 유사하고, 영상 입력의 상대 명도는 생성된 이미지에서 상대적인 순위 순서로 유지되지만, 반응 데이터 (증폭 및 마이크로어레이 혼성화 후 PCR 산물 신호와 유사)로부터 원래 입력 (원래 샘플의 DNA 카피 수와 유사)의 상대적 존재량을 예측하기 위해 비선형 반응에 대한 자세한 이해가 필요하다. 본 발명에서, 미지의 미생물 DNA와 표준 DNA 사이의 관찰된 경쟁은 도 19a에 표시된 종류의 유용하고 일반적으로 예상치 못한 "X자형" 관계를 나타내는 것으로 측정된다.
PCR-마이크로어레이에 의한 미생물 DNA (rDNA 또는 ITS2) 카피 수 분석
도 19a 및 도 19b에 도시된 종류의 "교차" 적정 데이터는 본 출원에 기재된 PCR-마이크로어레이 분석에 고유한 것으로 측정되었다. 표적 미생물 DNA 카피 수가 증가함에 따라, 합성 DNA 카피 수가 일정하게 유지되고, 미생물 DNA 카피 수가 증가함에 따라, 미생물 PCR 반응의 산물, 따라서 마이크로어레이 표면의 동종 프로브와 이러한 산물의 결합으로 인한 신호가 증가하고, (고정) 매칭된 내부 기준 표준으로부터 획득되는 신호는 동시에 감소한다 (도 19a 및 도 19b). 2개의 곡선은 미생물 DNA 카피의 수가 내부 기준 표준 DNA 카피의 수와 동일하게 되는 카피 수 등가성 또는 그 부근에서 교차한다 (화살표, 도 19a 및 도 19b).
본 발명과 일치하는 PCR 조건의 범위 (즉, 미지의 미생물 DNA와 첨가된 DNA 표준 사이의 경쟁으로 인해 포화되는 PCR 신호의 조건)에 걸쳐 DNA 입력과 출력 사이의 관계는 다음과 같이 근사화될 수 있다:
Cn/Co = P(Sn/So)x
방정식 #1,
상기 식에서,
Cn = 마이크로어레이 분석을 위한 앰플리콘을 제조하는데 사용된 2개의 탠뎀 PCR 반응 중 첫 번째에 첨가된 원래 샘플 혼합물에 존재하는 각 유형 (n)의 미생물 DNA 카피의 수,
Co = 마이크로어레이 분석을 위해 앰플리콘을 제조하는데 사용된 2개의 PCR 반응 중 첫 번째에 첨가된 인지된 합성 DNA 카피의 수 (내부 기준 표준),
Sn = n번째 미생물 종의 PCR 증폭 및 마이크로어레이 혼성화 다음 이미지 분석 후 획득된 상대적 형광 단위 (RFU) 신호 데이터,
So = 합성 DNA 종의 PCR 증폭 및 마이크로어레이 혼성화 다음 이미지 분석 후 획득된 상대적 형광 단위 (RFU) 신호 데이터,
X = 실험 마이크로어레이 데이터 비 (Sn/So) 대 원래 샘플에 존재하는 미생물 DNA 카피 대 합성 DNA 표준 카피의 기본적 비 (Cn/Co) 사이의 함수적 관계를 규정하는 복합 지수 인자.
P = 실험 마이크로어레이 데이터 비 (Sn/So) 대 마이크로어레이에 결합하는 증폭된 PCR 산물의 농도의 관계 상수. 일반적으로 본 명세서에 제시된 실시예 (도 19a 및 도 19b)의 경우 P = 1이다.
일반적으로 X는 그 자체가 PCR 매개변수의 함수 및 마이크로어레이 분석 및 영상화 조건인 선형 함수 또는 지수 또는 관계 함수 형태 또는 상수일 수 있다. 본 발명에서 나타낸 대표적인 데이터를 기반으로 하여, X는 2에 근접한 값을 갖는 상수로 근사화된다.
| Cn/Co PCR-마이크로어레이에 의해 분석될 원래 샘플 중 측정된 DNA 카피2 수 비 Co = 3000 카피 |
(Sn/So)2 X=2를 사용하여 조정된 실험 마이크로어레이 데이터 비 |
Sn/So 측정된 실험 마이크로어레이 데이터 비 |
| 0.01 | 0.01 | 0.1 (5,000 RFU /45,000 RFU) |
| 0.1 | 0.25 | 0.5 (20,000 RFU /40,000 RFU) |
| 1 |
1 | 1 (32,000 RFU /32,000 RFU) |
| 10 | 5.3 | 2.3 (40,000 RFU /15,000 RFU) |
일반적으로, 함수 (X)는 원래의 DNA 카피 수 비 (Cn/Co) 대 마이크로어레이 혼성화 RFU 신호 데이터로부터 생성된 실험 마이크로어레이 데이터 비 (Sn/So)의 수학식이다. 함수 (X)는 PCR 반응 및 마이크로어레이 혼성화의 세부 사항에 따라 상이한 함수 형태를 가질 수 있다. 그러나 (1) 모든 미생물 DNA PCR 반응이 내부 기준 표준과 동일한 PCR 프라이머 쌍을 사용하는 경우; (2) 마이크로어레이 표면에 적용된 모든 혼성화 프로브가 PCR 반응에 의해 생성된 동종 DNA 서열에 대해 동일한 친화도를 가지고 있는 경우; (3) 모든 PCR 산물이 광학 검출을 위해 동일한 형광 염료로 표지된 경우; 그 후, X는 상수에 근접할 것으로 측정되며, 도 19a에 제시된 데이터에서 2에 가까운 값이 가정된다. 이러한 조건 하에서 방정식 #1은 다음과 같이 단순화될 수 있다:
Cn = Co (Sn/So)2
방정식 #2
상기 식에서,
Cn = 원래 샘플에 존재하는 미생물 DNA 카피의 수.
Co = 합성 DNA 표준의 인지된 카피 수를 원래 샘플에 첨가하여 조정한다.
X = 2 도 19a에서와 같은 실험 데이터로부터 추정된다.
P = 1 도 19a에서와 같은 실험에 의해 측정된 바와 같다.
도 19a에서, 합성 DNA 기준 표준 카피 수 (Co)를 의도적으로 3,000으로 유지하였지만, 존재할 수 있는 미지의 미생물 카피의 범위에 따라 예를 들어 100, 500, 3,000 또는 5,000으로 설정할 수 있다.
식품 또는 대마초 또는 다른 식물 물질의 미생물 시험 또는 물 시험을 위한 본 발명의 특정 구현예에서, 미국 주 또는 연방 규정은 미생물 오염에 대한 특정 최소 허용 값을 요구할 수 있다. 미생물 게놈당 rDNA 또는 ITS-2 DNA 카피의 수의 정보 및 규제된 값을 기반으로 하여, PCR 및 마이크로어레이 혼성화 단계 이전에 원래 샘플에 첨가된 조정 가능한 표준 카피 수 값 Co는 규제 표준을 PCR-마이크로어레이 분석에 직접 "수치 적용"하는 방식의 값을 갖는 것으로 볼 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> PathogenDx, Inc.
<120> Microarray Based Multiplex Pathogen Analysis and Uses
Thereof
<130> IPA201297-US
<141> 2019-03-08
<150> US 16/158,276
<151> 2018-10-11
<150> US 15/916,036
<151> 2018-03-08
<150> US 15/916,036
<151> 2018-03-08
<160> 157
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the 16S rDNA HV3 locus
in all bacteria
<400> 1
tttcacaytg gractgagac acg 23
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the 16S rDNA HV3 locus
in all bacteria
<400> 2
tttgactacc agggtatcta atcctgt 27
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the Stx1 locus in
pathogenic Escherichia coli
<400> 3
tttataatct acggcttatt gttgaacg 28
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the Stx1 locus in
pathogenic Escherichia coli
<400> 4
tttggtatag ctactgtcac cagacaatg 29
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the Stx2 locus in
pathogenic Escherichia coli
<400> 5
tttgatgcat ccagagcagt tctgcg 26
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the Stx2 locus in
pathogenic Escherichia coli
<400> 6
tttgtgaggt ccacgtctcc cggcgtc 27
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the InvA locus in all
Salmonella
<400> 7
tttattatcg ccacgttcgg gcaattcg 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the InvA locus in all
Salmonella
<400> 8
tttcttcatc gcaccgtcaa aggaaccg 28
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the tuf locus in
all Escherichia coli
<400> 9
tttcagagtg ggaagcgaaa atcctg 26
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the tuf locus in
all Escherichia coli
<400> 10
tttacgccag tacaggtaga cttctg 26
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the 16S rDNA HV3 locus
in Enterobacteriaceae
<400> 11
ttaccttcgg gcctcttgcc atcrgatgtg 30
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the 16S rDNA HV3 locus
in Enterobacteriaceae
<400> 12
ttggaattct acccccctct acragactca agc 33
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the ITS2 locus in all
yeast and mold/fungi
<400> 13
tttactttya acaayggatc tcttgg 26
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the ITS2 locus in all
yeast and mold/fungi
<400> 14
tttcttttcc tccgcttatt gatatg 26
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the ITS2 locus in
Aspergillus spp
<400> 15
tttaaaggca gcggcggcac cgcgtccg 28
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the ITS2 locus in
Aspergillus spp
<400> 16
ttttcttttc ctccgcttat tgatatg 27
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the ITS1 locus in
Cannabis/plant
<400> 17
tttgcaacag cagaacgacc cgtga 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the ITS1 locus in
Cannabis/plant
<400> 18
tttcgataaa cacgcatctc gattg 25
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the 16S rDNA HV3 locus
in all bacteria
<400> 19
tttactgaga cacggyccar actc 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the 16S rDNA HV3 Locus
in all bacteria
<400> 20
tttgtattac cgcggctgct ggca 24
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the Stx1 locus in
pathogenic Escherichia coli
<400> 21
tttatgtgac aggatttgtt aacaggac 28
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the Stx1 locus in
pathogenic Escherichia coli
<400> 22
tttctgtcac cagacaatgt aaccgctg 28
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the Stx2 locus in
pathogenic Escherichia coli
<400> 23
tttttgtcact gtcacagcag aag 24
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the Stx2 locus in
pathogenic Escherichia coli
<400> 24
tttgcgtcat cgtatacaca ggagc 25
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the InvA locus in all
Salmonella us
<400> 25
ttttatcgtt attaccaaag gttcag 26
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the InvA locus in all
Salmonella
<400> 26
tttcctttcc agtacgcttc gccgttcg 28
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the tuf locus in
all Escherichia coli
<400> 27
tttgttgtta ccggtcgtgt agaac 25
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the tuf locus in
all Escherichia coli
<400> 28
tttcttctga gtctctttga taccaacg 28
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the 16S rDNA HV3 locus
in Enterobacteriaceae
<400> 29
ttatattgca caatgggcgc aagcctgatg 30
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the 16S rDNA HV3 locus
in Enterobacteriaceae
<400> 30
ttttgtatta ccgcggctgc tggca 25
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the ITS2 locus in all
yeast and mold/fungi
<400> 31
tttgcatcga tgaagarcgy agc 23
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the ITS2 locus in all
yeast and mold/fungi
<400> 32
tttcctccgc ttattgatat gc 22
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the ITS2 locus in
Aspergillus spp
<400> 33
tttcctcgag cgtatggggc tttgtc 26
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the ITS2 locus in
Aspergillus spp
<400> 34
tttttcctcc gcttattgat atgc 24
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplification of the ITS1 locus in
Cannabis plant
<400> 35
tttcgtgaac acgttttaaa cagcttg 27
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplification of the ITS1 locus in
Cannabis/plant
<400> 36
tttccaccgc acgagccacg cgat 24
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus for total aerobic
bacteria with high sensitivity
<400> 37
tttttttttc ctacgggagg cagttttttt 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus for total aerobic
bacteria with medium sensitivity
<400> 38
ttttttttcc ctacgggagg catttttttt 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus for total aerobic
bacteria with low sensitivity
<400> 39
tttattttcc ctacgggagg cttttatttt 30
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Enterobacteriaceae
with low sensitivity
<400> 40
tttattctat tgacgttacc catttatttt 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Enterobacteriaceae
with medium sensitivity
<400> 41
ttttttctat tgacgttacc cgtttttttt 30
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Escherichia coli and
Shigella
<400> 42
ttttctaata cctttgctca ttgactcttt 30
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Escherichia
coli and Shigella
<400> 43
ttttttaagg gagtaaagtt aatatttttt 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Escherichia coli and
Shigella
<400> 44
ttttctcctt tgctcattga cgttattttt 30
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Bacillus spp. Group 1
<400> 45
tttttcagtt gaataagctg gcactctttt 30
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Bacillus spp. Group 2
<400> 46
ttttttcaag taccgttcga atagtttttt 30
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in bile-tolerant gram
negative bacteria with high sensitivity
<400> 47
tttttctatg cagtcatgct gtgtgtrtgt cttttt 36
<210> 48
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in bile-tolerant gram
negative bacteria with medium sensitivity
<400> 48
tttttctatg cagccatgct gtgtgtrttt tttt 34
<210> 49
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in bile-tolerant gram
negative bacteria with low sensitivity
<400> 49
tttttctatg cagtcatgct gcgtgtrttt tttt 34
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Campylobacter spp.
<400> 50
ttttttatga cacttttcgg agctcttttt 30
<210> 51
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Chromobacterium spp.
<400> 51
ttttattttc ccgctggtta atacccttta tttt 34
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Citrobacter spp.
<400> 52
ttttttcctt agccattgac gttatttttt 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Clostridium spp.
<400> 53
ttttctggam gataatgacg gtacagtttt 30
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Coliform and
Enterobacteriaceae
<400> 54
ttttttctat tgacgttacc cgcttttttt 30
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Aeromonas salmonicida
Aeromonas hydrophilia
<400> 55
tttttgccta atacgtrtca actgcttttt 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Aeromonas spp.
<400> 56
ttattttctg tgacgttact cgcttttatt 30
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Alkanindiges spp.
<400> 57
tttttaggct actgrtacta atatcttttt 30
<210> 58
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Bacillus pumilus
<400> 58
tttatttaag tgcragagta actgctattt tatt 34
<210> 59
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for bacterial etuf gene
<400> 59
ttttttccat caaagttggt gaagaatctt tttt 34
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Hafnia spp.
<400> 60
ttttttctaa ccgcagtgat tgatcttttt 30
<210> 61
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for bacterial InvA gene
<400> 61
tttttttatt gatgccgatt tgaaggcctt tttt 34
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Klebsiella oxytoca
<400> 62
ttttttctaa ccttattcat tgatcttttt 30
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Klebsiella pneumoniae
<400> 63
ttttttctaa ccttggcgat tgatcttttt 30
<210> 64
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Legionella spp.
<400> 64
tttattctga taggttaaga gctgatcttt attt 34
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Listeria spp.
<400> 65
ttttctaagt actgttgtta gagaattttt 30
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Panteoa agglomerans
<400> 66
ttttttaacc ctgtcgattg acgccttttt 30
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Panteoa stewartii
<400> 67
ttttttaacc tcatcaattg acgccttttt 30
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Pseudomonas aeruginosa
<400> 68
tttttgcagt aagttaatac cttgtctttt 30
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Pseudomonas cannabina
<400> 69
tttttttacg tatctgtttt gactcttttt 30
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Pseudomonas spp.
<400> 70
ttttttgttac cracagaata agcattttt 30
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Pseudomonas spp.
<400> 71
ttttttaagc actttaagtt gggatttttt 30
<210> 72
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Pseudomonas spp.
<400> 72
tttattttaa gcactttaag ttgggatttt attt 34
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Salmonella bongori
<400> 73
tttttttaat aaccttgttg attgtttttt 30
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Salmonella enterica
<400> 74
tttttttgtt gtggttaata accgattttt 30
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Salmonella enterica
<400> 75
tttttttaac cgcagcaatt gactcttttt 30
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Salmonella enterica
<400> 76
ttttttctgt taataaccgc agcttttttt 30
<210> 77
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Serratia spp.
<400> 77
tttattctgt gaacttaata cgttcatttt tatt 34
<210> 78
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Staphylococcus aureus
<400> 78
tttattttca tatgtgtaag taactgtttt attt 34
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Staphylococcus aureus
<400> 79
ttttttcata tgtgtaagta actgtttttt 30
<210> 80
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Streptomyces spp.
<400> 80
ttttatttta agaagcgaga gtgactttta tttt 34
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for bacterial stx1 gene
<400> 81
ttttttcttt ccaggtacaa cagctttttt 30
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for bacterial stx2 gene
<400> 82
ttttttgcac tgtctgaaac tgcctttttt 30
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Vibrio spp.
<400> 83
ttttttgaag gtggttaagc taattttttt 30
<210> 84
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Xanthamonas spp.
<400> 84
ttttttgtta atacccgatt gttctttttt 30
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the 16S locus in Ysernia pestis
<400> 85
tttttttgag tttaatacgc tcaacttttt 30
<210> 86
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in total yeast and mold
with high sensitivity
<400> 86
ttttttttga atcatcgart ctttgaacgc attttttt 38
<210> 87
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in total yeast and mold
with low sensitivity
<400> 87
ttttttttga atcatcgart ctcctttttt t 31
<210> 88
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in total yeast and mold
with medium sensitivity
<400> 88
ttttttttga atcatcgart ctttgaacgt tttttt 36
<210> 89
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Alternaria spp.
<400> 89
ttttttcaaa ggtctagcat ccattaagtt tttt 34
<210> 90
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Aspergillus flavus
<400> 90
ttttttcgca aatcaatctt tttccagtct tttt 34
<210> 91
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Aspergillus flavus
<400> 91
tttttttctt gccgaacgca aatcaatctt tttttttttt 40
<210> 92
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Aspergillus fumigatus
<400> 92
tttcttttcg acacccaact ttatttcctt attt 34
<210> 93
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Aspergillus fumigatus
<400> 93
tttttttgcc agccgacacc cattcttttt 30
<210> 94
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Aspergillus nidulans
<400> 94
ttttttggcg tctccaacct tacccttttt 30
<210> 95
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Aspergillus niger
<400> 95
ttttttcgac gttttccaac catttctttt 30
<210> 96
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Aspergillus niger
<400> 96
ttttttttcg acgttttcca accatttctt tttt 34
<210> 97
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Aspergillus niger
<400> 97
tttttttcgc cgacgttttc caattttttt 30
<210> 98
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Aspergillus terreus
<400> 98
tttttcgacg catttatttg caaccctttt 30
<210> 99
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Blumeria spp.
<400> 99
tttatttgcc aaaamtcctt aattgctctt tttt 34
<210> 100
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Botrytis spp.
<400> 100
tttttttcat ctctcgttac aggttctcgg ttcttttttt 40
<210> 101
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Candida albicans
<400> 101
tttttttttg aaagacggta gtggtaagtt tttt 34
<210> 102
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Candida spp. Group 1
<400> 102
tttttttgtt tggtgttgag cratacgtat tttt 34
<210> 103
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Candida spp. Group 2
<400> 103
ttttactgtt tggtaatgag tgatactctc atttt 35
<210> 104
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Chaetomium spp.
<400> 104
tttcttttgg ttccggccgt taaaccattt tttt 34
<210> 105
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Cladosporium spp.
<400> 105
ttttttttgt ggaaactatt cgctaaagtt tttt 34
<210> 106
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Erysiphe spp.
<400> 106
tttcttttta cgattctcgc gacagagttt tttt 34
<210> 107
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Fusarum oxysporum
<400> 107
tttttttctc gttactggta atcgtcgttt tttt 34
<210> 108
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Fusarium spp.
<400> 108
ttttttttaa cacctcgcra ctggagattt tttt 34
<210> 109
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Golovinomyces spp.
<400> 109
ttttttccgc ttgccaatca atccatctct tttt 34
<210> 110
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Histoplasma
capsulatum
<400> 110
tttatttttg tcgagttccg gtgccctttt attt 34
<210> 111
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Isaria spp.
<400> 111
tttatttttc cgcggcgacc tctgctcttt attt 34
<210> 112
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Monocillium spp.
<400> 112
tttcttttga gcgacgacgg gcccaatttt cttt 34
<210> 113
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Mucor spp.
<400> 113
ttttctccaw tgagyacgcc tgtttctttt 30
<210> 114
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Myrothecium spp.
<400> 114
tttattttcg gtggccatgc cgttaaattt tatt 34
<210> 115
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Oidiodendron spp.
<400> 115
tttttttgcg tagtacatct ctcgctcatt tttt 34
<210> 116
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Penicillium oxalicum
<400> 116
ttttttacac catcaatctt aaccaggcct tttt 34
<210> 117
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Penicillium paxilli
<400> 117
ttttttcccc tcaatcttta accaggcctt tttt 34
<210> 118
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Penicillium spp.
<400> 118
ttttttcaac ccaaattttt atccaggcct tttt 34
<210> 119
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Phoma/Epicoccum ssp.
<400> 119
tttttttgca gtacatctcg cgctttgatt tttt 34
<210> 120
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Podosphaera spp.
<400> 120
ttttttgacc tgccaaaacc cacataccat tttt 34
<210> 121
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Podosphaera spp.
<400> 121
ttttttttag tcaygtatct cgcgacagtt tttt 34
<210> 122
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Phythium oligandrum
<400> 122
ttttatttaa aggagacaac accaattttt attt 34
<210> 123
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Rhodoturula spp.
<400> 123
ttttttctcg ttcgtaatgc attagcactt tttt 34
<210> 124
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Stachybotrys spp.
<400> 124
tttcttctgc atcggagctc agcgcgtttt attt 34
<210> 125
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for the ITS2 locus in Trichoderma spp.
<400> 125
tttttcctcc tgcgcagtag tttgcacatc tttt 34
<210> 126
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for ITS1 locus in Cannabis species
<400> 126
ttttttaatc tgcgccaagg aacaatattt tttt 34
<210> 127
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for ITS1 locus in Cannabis species
<400> 127
tttttgcaat ctgcgccaag gaacaatatt tttt 34
<210> 128
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for ITS1 locus in Cannabis species
<400> 128
tttatttctt gcgccaagga acaatatttt attt 34
<210> 129
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for image calibration with high sensitivity
<400> 129
ttttctatgt atcgatgttg agaaattttt tt 32
<210> 130
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for image calibration with low sensitivity
<400> 130
ttttctagat acttgtgtaa gtgaattttt tt 32
<210> 131
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for image calibration with medium
sensitivity
<400> 131
ttttctaagt catgttgttg aagaattttt tt 32
<210> 132
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for negative control
<400> 132
ttttttctac tacctatgct gattcactct tttt 34
<210> 133
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward universal preamplification primer for fungus and
bacteria
<400> 133
ttcagcctct gtacgtgctt catg 24
<210> 134
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse universal preamplification primer for fungus and
bacteria
<400> 134
ttcagcctct gatcgtgctt ctag 24
<210> 135
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward RSG Primer for amplification all fungus
<400> 135
tttactttca acaayggatc tcttgg 26
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse RSG Primer for amplification of all fungus
<400> 136
cttttcctcc gcttattgat atg 23
<210> 137
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward RSG Primer for amplification of all bacteria
<400> 137
tttcacactg gractgagac acg 23
<210> 138
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse RSG Primer for amplification of all bacteria
<400> 138
ttttgtatta ccgcggctgc tggc 24
<210> 139
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer for amplification of all fungus
<400> 139
tttgcatcga tgaagaacgc agc 23
<210> 140
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer for amplification of all fungus
<400> 140
ttttcctccg cttattgata tgc 23
<210> 141
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer for amplification of all bacteria
<400> 141
tttcacactg gractgagac acgg 24
<210> 142
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal reference probe sequence for total aerobic
bacteria
<400> 142
tttttttttc catcgggagc gagttttttt 30
<210> 143
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal reference probe sequence for bile-tolerant gram-
negative bacteria
<400> 143
tttttctatg tattcctgat gtagatrtgt cttttt 36
<210> 144
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal reference probe sequence for Enterobacteriaceae
and Coliform bacteria
<400> 144
ttttttctct tgagcttacc ccgttttttt 30
<210> 145
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal reference probe sequence for total yeast and mold
<400> 145
ttttttttgc atcatagaaa ctttgtacgc attttttt 38
<210> 146
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for Golovinomyces spp.
<400> 146
tttatttaat caatccatca tctcaagtct tttt 34
<210> 147
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for Listeria spp.
<400> 147
tttattttga taagagtaac tgcttgcttt attt 34
<210> 148
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for Mucor spp.
<400> 148
ttttttctcc awtgagyacg cctgtttcag tatctttttt 40
<210> 149
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for Saccharomyces spp.
<400> 149
tttatcttag gcgaacaatg ttcttaaatc tttt 34
<210> 150
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for Aspergillus terreus
<400> 150
ttttttacgc atttatttgc aacttgcctt tttt 34
<210> 151
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe sequence for Podosphaera spp.
<400> 151
tttttcgtcc cctaaacata gtggcttttt 30
<210> 152
<211> 440
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Consensus sequence of ITS2 domain in eukaryotes
<220>
<221> misc_feature
<222> 1..37, 86..120, 146..379, 403..440
<223> n is any of a, c, t, or g
<400> 152
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnact tycaacaayg 50
gatctcttgg ttctggcatc gatgaagaac gcagcnnnnn nnnnnnnnnn 100
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtgaatcatc gartctttga acgcannnnn 150
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 200
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 250
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 350
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng catatcaata agcggaggaa 400
aannnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 440
<210> 153
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Consensus sequence of rDNA domain in prokaryotes
<220>
<221> misc_feature
<222> 1..37, 59..64, 85..114, 137..203, 218..241, 263..333
<223> n is any of a, c, t, or g
<400> 153
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnncac aytggractg 50
agacacggnn nnnnctccta cgggaggcag cagtnnnnnn nnnnnnnnnn 100
nnnnnnnnnn nnnnayssag cmaygccgcg tgdrbgnnnn nnnnnnnnnn 150
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 200
nnnattgacg ttacccgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ntgccagcag 250
ccgcggtaat acnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnn 333
<210> 154
<211> 439
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal reference sequence for use with the ITS2 domain
in eukaryotes
<400> 154
tactattcag cctctgtacg tgcttcatgt aaattgaact ttcaacaacg 50
gatctcttgg ttctggcatc gatgaagaac gcagcgactt gcgataagta 100
atgtgaattg cagaattcag tgcatcatag aaactatgta cgcaaattgc 150
gccccttggt attccggggg gcatgcctgt tcgagcgtca tttcaaccct 200
caagcttagc ttggtattga gtctatgtca gtaatggcag gctctaaaat 250
cagtggcggc gccgctgggt cctgaacgta gtaatatttc ttgtcaccgt 300
ttctaggtgt gcttctgtct atacccaaat tcttctatgg ttgacctcgg 350
atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc atatcaataa gcggaggaaa 400
agcacgccgt ctagaagcac gatcagaggc tgaatacta 439
<210> 155
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal reference sequence for use with the rDNA domain
in prokaryotes
<400> 155
tactattcag cctctgtacg tgcttcatgt aaattgacac actggaactg 50
agacacggtc cagactccat cgggagcgag catgggggaa tattgcacaa 100
tgggcgcaag cctgatggac cctagccgcc actatgaaga aggccttcgg 150
gttgtaaagt actttcagcg gggaggaggg aatgaaagta tatacctttc 200
gtcatgtacg ttactcgcag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag 250
ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgcacg 300
ccgtctagaa gcacgatcag aggctgaata cta 333
<210> 156
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal reference sequence for use with the rDNA domain
in prokaryotes.
<400> 156
tactattcag cctctgtacg tgcttcatgt aaattgacac actggaactg 50
agacacggtc cagactcctg caggagacgg cagtggggaa tattgcacaa 100
tgggcgcaag cctgatgtat ccctgacgca gatatgaaga aggccttcgg 150
gttgtaaagt actttcagcg gggaggaagg tcgtaaaact aatacacttg 200
ctgtttgaac ttacccagag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag 250
ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgcacg 300
ccgtctagaa gcacgatcag aggctgaata cta 333
<210> 157
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Internal reference sequence for use with the rDNA domain
in prokaryotes
<400> 157
tactattcag cctctgtacg tgcttcatgt aaattgacac actggaactg 50
agacacggtc cagactccta gcggagcgag cagtggggaa tattgcacaa 100
tgggcgcaag cctgatgacg ccagtccgct ggtatgaaga aggccttcgg 150
gttgtaaagt actttcagcg gggaggaagg aggtaaatgt aatactcttg 200
ctacttgagc ttaccccgag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag 250
ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgcacg 300
ccgtctagaa gcacgatcag aggctgaata cta 333
Claims (45)
- 3차원 격자 마이크로어레이 시스템 (three-dimensional lattice microarray system)으로서,
전면 및 후면을 갖는 고체 지지체;
각각 상부 도메인 및 하부 말단을 가지며, 하부 말단이 고체 지지체에 부착된 다수의 이작용성 중합체 링커 (bifunctional polymer linker); 및
다수의 이작용성 중합체 링커 각각의 상부 도메인에 부착된 다수의 핵산 프로브 (probe)
를 포함하는, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템. - 제1항에 있어서, 다수의 이작용성 중합체 링커 각각은 그의 상부 도메인의 말단에 공유결합에 의해 부착되거나, 내부에 공유결합에 의해 부착된 형광 표지(fluorescent label)를 추가로 포함하는, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 고체 지지체는 그의 전면에 부착된 화학적으로 활성화 가능한 다수의 기를 추가로 포함하고, 다수의 이작용성 중합체 링커는 그의 하부 말단에 의해 화학적으로 활성화 가능한 다수의 기 각각에 공유결합에 의해 부착된, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템.
- 제3항에 있어서, 화학적으로 활성화 가능한 기는 에폭시실란기, 말레이미도기, 아미노기 또는 활성화된 카복실산 에스테르인, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템.
- 제1항에 있어서, 다수의 이작용성 중합체 링커 각각은 고체 지지체 내의 화학적으로 활성화 가능한 기에 공유결합에 의해 부착되는 하부 말단의 제1 반응성 모이어티 (moiety) 또는 각각의 다수의 핵산에 공유결합에 의해 부착되는 상부 도메인의 제2 반응성 모이어티 또는 이의 조합을 포함하는, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템.
- 제5항에 있어서, 제1 반응성 모이어티는 아미노기, 티올기, 알데하이드기 또는 카복실레이트인, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템.
- 제5항에 있어서, 제2 반응성 모이어티는 뉴클레오타이드 염기, 아미노산 또는 아미노당류(aminosaccharide)인, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템.
- 제1항에 있어서, 다수의 이작용성 중합체 링커 각각은 고체 지지체에 비공유결합에 의해 부착되는 하부 말단에 흡착성 기를 갖는, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템.
- 제8항에 있어서, 흡착성 기는 단일 가닥 핵산, 아민-다당류, 또는 연장된 평면 소수성 기인, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템.
- 제1항에 있어서, 다수의 이작용성 중합체 링커 각각은 올리고뉴클레오타이드, 아미노 다당류, 폴리아민 또는 폴리아미노산인, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템.
- 제1항에 있어서, 각각의 다수의 핵산 프로브(probe)는 5' 말단 및 3' 말단에 적어도 3개의 말단 티미딘 염기를 갖는, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템.
- 제11항에 있어서, 티미딘 염기는 다수의 이작용성 중합체 링커 각각 상의 제2 반응성 모이어티에 공유결합에 의해 부착된, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템.
- 제1항에 있어서, 핵산 프로브는 병원체, 식물 또는 동물의 시그니처 (signiture) 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템.
- 제1항에 있어서, 고체 지지체는 보로실리케이트 유리, 불활성 금속, 열가소성 아크릴 수지, 사이클로올레핀 중합체, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리카보네이트, 나일론, 세라믹, 조작된 탄소 표면(engineered carbon surface) 또는 이의 조합인, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템.
- 3차원 격자 마이크로어레이 시스템의 제조 방법으로서,
제1항의 시스템 내의 고체 지지체를
(i) 다수의 핵산 프로브;
(ii) 다수의 이작용성 중합체 링커; 및
(iii) 물 및 100℃ 이상의 비등점을 갖는 수혼화성 액체를 포함하는 용매 혼합물
을 포함하는 제형과 접촉시키는 단계;
제1 부착 반응으로서 고체 지지체의 전면에 다수의 이작용성 중합체 링커 각각의 하부 말단을 부착시키는 단계;
용매 혼합물 내의 물을 증발시켜, 다수의 핵산 프로브 및 고체 지지체에 부착된 다수의 이작용성 중합체 링커를 농축시키는 단계;
제2 부착 반응으로서 다수의 이작용성 중합체 링커 각각의 상부 도메인에 각각의 핵산 프로브를 공유결합에 의해 부착시키는 단계; 및
고체 지지체를 적어도 1회 세척하여, 비부착 이작용성 중합체 링커 및 핵산 프로브를 제거함으로써, 3차원 격자 마이크로어레이 시스템을 제조하는 단계
를 포함하는 방법. - 제15항에 있어서, 제1 부착 반응은 흡착인, 방법.
- 제15항에 있어서, 제1 부착 반응은 고체 지지체 상의 화학적으로 활성화 가능한 기와 다수의 이작용성 중합체 링커 각각의 하부 말단 상의 제1 반응성 모이어티 사이의 공유결합 연결에 의해 이루어지는, 방법.
- 제15항에 있어서, 수혼화성 액체는 글리세롤, 디메틸 술폭사이드 (DMSO), 프로판디올 또는 이의 조합인, 방법.
- 제15항에 있어서, 제1 부착 반응은 0℃ 내지 40℃의 온도에서 발생하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 제2 부착은 0℃ 내지 40℃의 온도에서 발생하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 제2 부착 반응은 다수의 핵산 프로브에 대한 다수의 이작용성 중합체 링커 각각의 상부 도메인의 제2 반응성 모이어티의 광화학적 가교결합(photochemical crosslinking)에 의한 것인, 방법.
- 주문 제작 가능 마이크로어레이 키트(microarray kit)로서,
제1항의 3차원 격자 마이크로어레이 시스템 내의 고체 지지체 및 다수의 이작용성 중합체 링커;
각각 병원체, 식물 또는 동물의 시그니처 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는 다수의 핵산 프로브;
용매 혼합물; 및
키트 사용 설명서
를 포함하는 주문 제작 가능 마이크로어레이 키트. - 제22항에 있어서, 핵산 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 적어도 3개의 말단 티미딘 염기를 갖는, 주문 제작 가능 마이크로어레이 키트.
- 제22항에 있어서, 용매 혼합물은 약 10:1 내지 약 100:1의 부피비의 물 과, 글리세롤, 디메틸 술폭사이드 (DMSO) 또는 프로판디올 중 하나의 혼합물을 포함하는, 주문 제작 가능 마이크로어레이 키트.
- 식물 샘플 중 병원체의 검출 방법으로서,
a) 식물 조직 샘플을 수확(harvesting)하는 단계;
b) 식물 조직 샘플로부터 DNA를 포함하는 전체 핵산을 단리하는 단계;
c) 각각 적어도 하나의 병원체의 DNA에 선택적인 정방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 적어도 하나의 제1 프라이머 쌍(primer pair)을 사용한 단일 분석에서 탠뎀 (tandem) 방식으로 제1 증폭을 수행하여, 하나 이상의 병원체-특이적 제1 앰플리콘 (amplicon)을 획득하는 단계;
d) 주형으로서 병원체 특이적 제1 앰플리콘 및, 각각의 프라이머 쌍은 형광 표지로 표지되고, 병원체-특이적 제1 앰플리콘 내의 내부 측접 영역(internal flanking region)에 상보적인 서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍을 사용하여 제2 증폭을 수행하여, 형광 표지 제2 앰플리콘을 획득하는 단계; 및
e) 제1항의 3차원 격자 마이크로어레이 시스템을 사용하여
(i) 제2 앰플리콘을 병원체 DNA의 시그니처 서열 결정자(signature sequence determinant)에 특이적인 핵산 프로브와 혼성화하는 단계로서, 핵산 프로브를 다수의 이작용성 중합체 링커 각각을 통해 3차원 격자 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에 고정시키는 단계;
(ii) 마이크로어레이를 적어도 1회 세척하는 단계; 및
(iii) 마이크로어레이를 영상화(imaging)하여, 형광 표지 제2 앰플리콘으로부터 형광 신호를 검출함으로써, 식물 샘플 중 병원체를 검출하는 단계
를 수행하는 단계를 포함하는, 방법. - 제25항에 있어서, 다수의 이작용성 중합체 링커 각각은 형광 표지를 포함하는 방법으로서, 본 방법은 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 형광 신호를 검출하는 단계 및 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 신호 상에 형광 표지 제2 앰플리콘의 신호를 중첩시킴으로써, 식물 샘플 중 검출된 병원체를 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제25항에 있어서, 병원체는 박테리아, 진균, 바이러스, 조류 또는 원생동물 또는 이의 조합인, 방법.
- 제27항에 있어서, 병원체는 박테리아이고, 제1 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 1 및 2, 또는 서열번호 3 및 4, 또는 서열번호 5 및 6 또는 서열번호 7 및 8, 또는 서열번호 9 및 10, 또는 서열번호 11 및 12, 또는 서열번호 137 및 138에 제시된 서열을 갖고, 제2 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 19 및 20, 또는 서열번호 21 및 22, 또는 서열번호 23 및 24 또는 서열번호 25 및 26, 또는 서열번호 27 및 28, 또는 서열번호 29 및 30, 또는 서열번호 141 및 30에 제시된 서열을 갖고, 핵산 프로브는 서열번호 37 내지 85에 제시된 서열을 갖는, 방법.
- 제27항에 있어서, 병원체는 진균이고, 제1 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 13 및 14, 또는 서열번호 15 및 16, 또는 서열번호 135 및 136에 제시된 서열을 갖고, 제2 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 31 및 32, 또는 서열번호 33 및 34, 또는 서열번호 139 및 140에 제시된 서열을 갖고, 핵산 프로브는 서열번호 86 내지 125에 제시된 서열을 갖는, 방법.
- 제25항에 있어서, 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 내의 형광 표지는 형광 표지 이작용성 중합체 링커 내의 형광 표지와 상이한, 방법.
- 단일 분석에서 식물 및 병원체로부터의 DNA를 동시에 검출하는 방법으로서,
a) 잠재적으로 하나 이상의 병원체를 포함하는 식물 조직 샘플을 수확하는 단계;
b) 적어도 식물 조직 및 하나 이상의 병원체로부터의 DNA를 포함하는 전체 핵산을 단리하는 단계;
c) 적어도 하나의 병원체 DNA-선택적 제1 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 식물 DNA-선택적 제1 프라이머 쌍을 사용한 전체 핵산에 대한 단일 분석에서 탠뎀 방식으로 제1 증폭을 수행함으로써, 병원체-특이적 제1 앰플리콘 및 식물-특이적 제1 앰플리콘을 획득하는 단계;
d) 주형으로서 병원체-특이적 제1 앰플리콘 및 식물-특이적 제1 앰플리콘 및, 형광 표지로 표지되고, 병원체-특이적 제1 앰플리콘 내의 내부 측접 영역에 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍 및 형광 표지로 표지되고, 식물-특이적 제1 앰플리콘 내의 내부 측접 영역에 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍을 사용하여 탠뎀 방식으로 제2 증폭을 수행함으로써, 형광 표지 병원체-특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 식물-특이적 제2 앰플리콘을 획득하는 단계;
e) 제1항의 3차원 격자 마이크로어레이 시스템을 사용하여
(i) 형광 표지 병원체-특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 식물 특이적 제2 앰플리콘과 병원체 DNA 및 식물 DNA의 시그니처 서열 결정자에 특이적인 핵산 프로브를 혼성화하는 단계로서, 상기 핵산을 형광 표지 이작용성 중합체 링커를 통해 3차원 격자 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에 고정시키는 단계;
(ii) 마이크로어레이를 적어도 1회 세척하는 단계; 및
(iii) 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 병원체 특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 식물 특이적 제2 앰플리콘으로부터 형광 신호를 검출함으로써, 샘플 중 병원체 및 식물을 동시에 검출하는 단계
를 수행하는 단계를 포함하는, 방법. - 제31항에 있어서, 다수의 이작용성 중합체 링커 각각은 형광 표지를 포함하고, 본 방법은 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 형광 신호를 검출하는 단계 및 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 신호 상에 형광 표지 식물 특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 병원체 특이적 제2 앰플리콘의 신호를 중첩시킴으로써, 식물 샘플 중 검출된 병원체 및 식물을 동시에 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제31항에 있어서, 병원체는 박테리아이고, 제1 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 1 및 2, 또는 서열번호 3 및 4, 또는 서열번호 5 및 6 또는 서열번호 7 및 8, 또는 서열번호 9 및 10, 또는 서열번호 11 및 12, 또는 서열번호 137 및 138에 제시된 서열을 갖고, 제2 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 19 및 20, 또는 서열번호 21 및 22, 또는 서열번호 23 및 24 또는 서열번호 25 및 26, 또는 서열번호 27 및 28, 또는 서열번호 29 및 30, 또는 서열번호 141 및 30에 제시된 서열을 갖고, 핵산 프로브는 서열번호 37 내지 85에 제시된 서열을 갖는, 방법.
- 제31항에 있어서, 병원체는 진균이고, 제1 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 13 및 14, 또는 서열번호 15 및 16, 또는 서열번호 135 및 136에 제시된 서열을 갖고, 제2 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 31 및 32, 또는 서열번호 33 및 34, 또는 서열번호 139 및 140에 제시된 서열을 갖고, 핵산 프로브는 서열번호 86 내지 125에 제시된 서열을 갖는, 방법.
- 식물 샘플에서 하나 이상의 병원체 DNA에 대해 카피 수(copy number)를 정량화하는 방법으로서,
a) 잠재적으로 병원체를 갖는 식물 조직 샘플을 수확하는 단계;
b) DNA를 포함하는 전체 핵산을 단리하는 단계;
c) 단리된 전체 핵산에 내부 기준 표준으로서 적어도 하나의 합성 DNA 서열의 인지된 카피 수를 첨가하는 단계로서, 각각의 합성 DNA 서열은
병원체 DNA에서의 시그니처 서열 결정자와 별개의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 중심 영역; 및
병원체 DNA에서의 공통 서열(consensus sequence)과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5' 말단 및 3' 말단을 포함하는 단계;
d) 각각 병원체 DNA에 선택적인 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 적어도 하나의 제1 프라이머 쌍을 사용한 전체 핵산에 대한 단일 분석에서 탠뎀 방식으로 제1 증폭을 수행함으로써, 하나 이상의 병원체 DNA-특이적 제1 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제1 앰플리콘을 획득하는 단계;
e) 주형으로서 병원체-특이적 제1 앰플리콘 및, 각각의 프라이머 쌍은 형광 표지로 표지되고, 병원체-특이적 제1 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제1 앰플리콘 내의 내부 측접 영역에 상보적인 서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 합성 DNA-특이적 제1 앰플리콘 및 적어도 하나의 제2 프라이머 쌍을 사용하여 탠뎀 방식으로 제2 증폭을 수행함으로써, 각각 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘을 획득하는 단계;
f) 제1항의 3차원 격자 마이크로어레이 시스템을 사용하여
(i) 각각 병원체 DNA 및 합성 DNA 내의 시그니처 서열 결정자에 특이적인 핵산 프로브와 제2 앰플리콘을 혼성화하는 단계로서, 핵산 프로브를 형광 표지 이작용성 중합체 링커를 통해 3차원 격자 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에 고정시키는 단계;
(ii) 마이크로어레이를 적어도 1회 세척하는 단계;
(iii) 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 이작용성 중합체 링커를 통해 마이크로어레이 상의 인식된 특이적 위치에 고정된 핵산 프로브에 해당하는 형광 신호, 및 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘 각각의 형광 신호를 검출하는 단계
를 수행하는 단계;
g) 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 이미지 상에 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘의 형광 신호의 이미지를 중첩시킴으로써, 중첩된 신호 이미지를 획득하는 단계;
h) 다수의 병원체 DNA의 시그니처 서열 결정자의 데이터베이스와 마이크로어레이 상의 하나 이상의 중첩된 신호 위치의 핵산 프로브의 서열을 비교함으로써, 샘플 중 병원체를 확인하는 단계; 및
i) 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘의 형광 신호로부터의 형광 신호 강도 및 단리된 전체 핵산에 첨가된 합성 DNA의 인지된 카피 수의 상관관계를 수학적으로 확인함으로써, 샘플 내의 병원체 DNA의 카피 수를 정량화하는 단계를 포함하는, 방법. - 제35항에 있어서, 합성 DNA는 서열번호 154 내지 157에 제시된 서열을 갖는, 방법.
- 제35항에 있어서, 병원체는 박테리아이고, 공통 서열은 서열번호 153에 제시되고, 제1 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 1 및 2, 또는 서열번호 3 및 4, 또는 서열번호 5 및 6 또는 서열번호 7 및 8, 또는 서열번호 9 및 10, 또는 서열번호 11 및 12, 또는 서열번호 137 및 138에 제시된 서열을 갖고, 공통 서열은 서열번호 153에 제시되고, 제2 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 19 및 20, 또는 서열번호 21 및 22, 또는 서열번호 23 및 24 또는 서열번호 25 및 26, 또는 서열번호 27 및 28, 또는 서열번호 29 및 30, 또는 서열번호 141 및 30에 제시된 서열을 갖고, 박테리아에 특이적인 핵산 프로브는 서열번호 37 내지 85에 제시된 서열을 갖고, 합성 DNA는 서열번호 155, 서열번호 156 및 서열번호 157에 제시된 서열을 갖고, 이는 각각 서열번호 142, 서열번호 143 및 서열번호 144에 제시된 서열을 갖는 합성 DNA 특이적 핵산 프로브에 혼성화되는, 방법.
- 제35항에 있어서, 병원체는 진균이고, 공통 서열은 서열번호 152에 제시되고, 제1 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 13 및 14, 또는 서열번호 15 및 16, 또는 서열번호 135 및 136에 제시된 서열을 갖고, 공통 서열은 서열번호 152에 제시되고, 제2 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 31 및 32, 또는 서열번호 33 및 34, 또는 서열번호 139 및 140에 제시된 서열을 갖고, 진균에 특이적인 핵산 프로브는 서열번호 86 내지 125에 제시된 서열을 갖고, 합성 DNA는 서열번호 154에 제시된 서열을 갖고, 이는 서열번호 145에 제시된 서열을 갖는 합성 DNA 특이적 핵산 프로브에 혼성화되는, 방법.
- 제35항에 있어서, 수학적 상관관계 확인 단계는 다음 수학식을 사용하여 수행되고:
Cn/Co = P(Sn/So)x
상기 식에서,
Cn은 정량화될 병원체 종(pathogen species)의 각각의 유형 n의 병원체 DNA의 카피 수이고, Co는 제1 증폭 단계를 수행하기 전에 샘플에 첨가된 합성 DNA의 인지된 카피 수이고, Sn은 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치의 병원체 DNA 특이적 핵산 프로브에 혼성화되는 병원체 DNA 특이적 형광 표지 제2 앰플리콘으로부터의 병원체 종의 각각의 유형 n의 형광 신호 강도 (상대 형광단위, RFU)이고, So는 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에서 합성 DNA 특이적 핵산 프로브에 혼성화되는 합성 DNA 특이적 제2 앰플리콘으로부터의 형광 신호 강도 (RFU)이고, P는 약 0.1 내지 약 10 범위의 상수이며, X는 약 1 내지 약 3의 범위의 지수 인자인, 방법. - 제35항에 있어서, 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘 내의 형광 표지는 형광 표지 이작용성 중합체 링커 내의 형광 표지와 상이한, 방법.
- 단일 분석으로 식물 조직 샘플 중 하나 이상의 병원체 및 식물에 대한 DNA의 카피 수를 동시에 정량화하는 방법으로서, 본 방법은
a) 잠재적으로 하나 이상의 병원체를 포함하는 식물 조직 샘플을 수확하는 단계;
b) 적어도 식물 조직 DNA 및 병원체 DNA를 포함하는 전체 핵산을 단리하는 단계;
c) 단리된 전체 핵산에 내부 기준 표준으로서 적어도 하나의 합성 DNA 서열의 인지된 카피 수를 첨가하는 단계로서, 각각의 합성 DNA 서열은
병원체 DNA 및 식물 DNA에서의 시그니처 서열 결정자와 별개의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 중심 영역; 및
병원체 DNA에서의 공통 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5' 말단 및 3' 말단
을 포함하는 단계;
d) 적어도 하나의 병원체-특이적 제1 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 합성 DNA-특이적 제1 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 식물-특이적 제1 프라이머 쌍을 사용한 전체 핵산에 대한 단일 분석에서 탠뎀 방식으로 제1 증폭을 수행함으로써, 병원체 DNA-특이적 제1 앰플리콘, 식물 DNA-특이적 제1 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제1 앰플리콘을 획득하는 단계;
e) 주형으로서 제1 앰플리콘, 각각의 프라이머 쌍은 형광 표지로 표지되고, 각각 제1 앰플리콘 내의 내부 측접 영역에 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 병원체 DNA-특이적 제2 프라이머 쌍 및 적어도 하나의 식물 DNA-특이적 제2 프라이머 쌍을 사용하여 탠뎀 방식으로 제2 증폭을 수행함으로써, 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 형광 표지 식물 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘을 획득하는 단계;
f) 제1항의 3차원 격자 마이크로어레이 시스템을 사용하여,
(i) 각각 병원체 DNA, 식물 DNA 및 합성 DNA 내의 시그니처 서열 결정자에 특이적인 핵산 프로브와 제2 앰플리콘을 혼성화하는 단계로서, 핵산 프로브를 형광 표지 이작용성 중합체 링커를 통해 3차원 격자 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에 고정시키는 단계;
(ii) 마이크로어레이를 적어도 1회 세척하는 단계; 및
(iii) 마이크로어레이를 영상화하여, 형광 표지 이작용성 중합체 링커를 통해 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에 고정된 핵산 프로브에 해당하는 형광 신호 및 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 형광 표지 식물 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘 각각에 해당하는 형광 신호를 검출하는 단계
를 수행하는 단계;
g) 형광 표지 이작용성 중합체 링커의 이미지 신호 상에 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 형광 표지 식물 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘의 신호를 중첩시킴으로써, 중첩된 신호 이미지를 획득하는 단계;
h) 다수의 병원체 DNA 및 식물 DNA의 시그니처 서열 결정자의 데이터베이스와 마이크로어레이 상의 하나 이상의 중첩된 신호 위치의 핵산 프로브의 서열을 비교함으로써, 샘플 내의 병원체 및 식물을 확인하는 단계;
i) 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘의 형광 신호 강도 및 합성 DNA의 인지된 카피 수의 상관관계를 수학적으로 확인함으로써, 샘플 내의 병원체 DNA의 카피 수를 정량화하는 단계; 및
j) 식물 DNA-특이적 제2 앰플리콘으로부터의 형광 신호 강도와 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘으로부터의 형광 신호 강도 및 합성 DNA의 인지된 카피 수의 상관관계를 수학적으로 확인함으로써, 샘플 내의 식물 DNA의 카피 수를 정량화하는 단계를 포함하는, 방법. - 제41항에 있어서, 병원체는 박테리아이고, 공통 서열은 서열번호 153에 제시되고, 제1 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 1 및 2, 또는 서열번호 3 및 4, 또는 서열번호 5 및 6 또는 서열번호 7 및 8, 또는 서열번호 9 및 10, 또는 서열번호 11 및 12, 또는 서열번호 137 및 138에 제시된 서열을 갖고, 공통 서열은 서열번호 153에 제시되고, 제2 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 19 및 20, 또는 서열번호 21 및 22, 또는 서열번호 23 및 24 또는 서열번호 25 및 26, 또는 서열번호 27 및 28, 또는 서열번호 29 및 30, 또는 서열번호 141 및 30에 제시된 서열을 갖고, 박테리아에 특이적인 핵산 프로브는 서열번호 37 내지 85에 제시된 서열을 갖고, 합성 DNA는 서열번호 155, 서열번호 156 및 서열번호 157에 제시된 서열을 갖고, 이는 각각 서열번호 142, 서열번호 143 및 서열번호 144에 제시된 서열을 갖는 합성 DNA 특이적 핵산 프로브에 혼성화되는, 방법.
- 제41항에 있어서, 병원체는 진균이고, 공통 서열은 서열번호 152에 제시되고, 제1 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 13 및 14, 또는 서열번호 15 및 16, 또는 서열번호 135 및 136에 제시된 서열을 갖고, 공통 서열은 서열번호 152에 제시되고, 제2 증폭 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 각각 서열번호 31 및 32, 또는 서열번호 33 및 34, 또는 서열번호 139 및 140에 제시된 서열을 갖고, 진균에 특이적인 핵산 프로브는 서열번호 86 내지 125에 제시된 서열을 갖고, 합성 DNA는 서열번호 154에 제시된 서열을 갖고, 이는 서열번호 145에 제시된 서열을 갖는 합성 DNA 특이적 핵산 프로브에 혼성화되는, 방법.
- 제41항에 있어서, 상관관계를 수학적으로 확인하는 단계는 다음 수학식을 사용하여 수행되고:
Cn/Co = P(Sn/So)x
상기 식에서,
Cn은 정량화될 병원체 또는 식물 종의 각각의 유형 n의 병원체 DNA 또는 식물 DNA의 카피 수이고, Co는 제1 증폭 단계를 수행하기 전에 샘플에 첨가된 합성 DNA의 인지된 카피 수이고, Sn은 병원체 종의 각각의 유형 n의 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치의 병원체 DNA 특이적 핵산 프로브에 혼성화되는 병원체 DNA 특이적 형광 표지 제2 앰플리콘으로부터의 형광 신호 강도 (상대 형광단위, RFU), 또는 식물 종의 각각의 유형 n의 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치의 식물 DNA 특이적 핵산 프로브에 혼성화되는 식물 DNA 특이적 제2 앰플리콘으로부터의 형광 신호 강도 (RFU)이고, So는 마이크로어레이 상의 인지된 특이적 위치에서 합성 DNA 특이적 핵산 프로브에 혼성화되는 합성 DNA 특이적 제2 앰플리콘으로부터의 형광 신호 강도 (RFU)이고, P는 약 0.1 내지 약 10 범위의 상수이며, X는 약 1 내지 약 3의 범위의 지수 인자인, 방법. - 제41항에 있어서, 형광 표지 병원체 DNA-특이적 제2 앰플리콘, 형광 표지 식물 DNA-특이적 제2 앰플리콘 및 형광 표지 합성 DNA-특이적 제2 앰플리콘 내의 형광 표지는 형광 표지 이작용성 중합체 링커 내의 형광 표지와 상이한, 방법.
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