CN112154215A

CN112154215A - 基于微阵列的多重病原体分析及其应用

Info

Publication number: CN112154215A
Application number: CN201980030521.2A
Authority: CN
Inventors: M·E·霍根; M·R·梅; F·H·埃格斯
Original assignee: Passergendes Ltd
Current assignee: Passergendes Ltd
Priority date: 2018-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2020-12-29
Also published as: WO2019173695A2; JP2021516995A; WO2019173695A3; EP3762508A2; CA3093451A1; KR20210028142A; ZA202006213B; MX2020009282A; EP3762508A4; AU2019231794A1

Abstract

本文提供了用于DNA序列检测和分析的三维晶格微阵列系统及包括其组分的试剂盒。在该系统中，固体支持物具有多个双功能聚合物接头，每个接头具有顶端结构域和底部末端，可选地具有连接到底部末端的荧光标记，并且在多个双功能聚合物接头的顶端结构域上连接多个核酸探针。还提供了一种用于制造微阵列系统的方法和检测和识别植物样品中的病原体的方法或通过使用合成的DNA的已知拷贝数作为内部标准来确定未纯化的核酸样品中的病原体DNA的拷贝数的方法。

Description

基于微阵列的多重病原体分析及其应用

相关技术的描述

用于识别微生物病原体的当前技术依赖于已建立的临床微生物学监测。使用标准培养和药敏试验进行病原体识别。这些试验需要投入大量的时间、精力、成本以及不稳定的产品。对于试验大批量的样品，当前的技术是不理想的。基于培养的试验充满了误差，包括假阳性和假阴性，以及菌落形成单位(CFU)的不可靠的定量。存在存活的但不可培养的微生物的问题，这些微生物不能使用常规培养方法培养。在检测有害和无害物种方面，某些培养试验是非特异性的，这削弱了试验确定被测样品中是否存在威胁的效用。

为了应对包括假阳性和微生物培养在内的挑战，建立了基于DNA的诊断方法，例如聚合酶链反应(PCR)扩增技术。为了使用PCR分析病原体，在分析之前先从材料中提取DNA，这是一个耗时且昂贵的步骤。

为了消除PCR的分析前提取步骤，建立了菌落PCR。直接使用来自平板或液体培养物的菌落的细胞，菌落PCR可以对细菌细胞进行PCR，而无需样品制备。这项技术取得了部分成功，但不如培养技术敏感，这表明样品中的成分可能干扰PCR的问题。尽管这种可能的干扰可能不足以使执行的试验的效用无效，但对于某些类型的试验，这种干扰对于病原体的高敏感性检测可能非常重要。因此，菌落PCR并没有消除使用PCR的分析前提取步骤，特别是对于病原体的高敏感性检测。

众所周知，细菌中的16s DNA和酵母或霉菌DNA中的内部转录间隔区2(ITS2)基因位点可以进行PCR扩增，一旦扩增后就可以进行分析，以提供关于植物材料内或植物上特定细菌或特定霉菌或酵母菌污染的信息。此外，对于某些样品，例如血液、粪便和其他，可以在不提取DNA的情况下，对此类样品中的DNA进行PCR。然而，对于血液，众所周知，由于血液分析物的抑制，这种直接PCR的结果易于导致样品之间的实质差异。另外，由于植物成分对PCR的严重抑制，对植物物质进行直接PCR分析的尝试通常是不成功的。

随着时间的流逝，建立了其他方法和技术，来改善对病原体的及时和特异性检测和识别所带来的挑战。免疫测试技术提供了专门的分析。然而，该技术在化学消耗品的使用中成本高并且响应时间长。光学传感器技术可产生快速的实时检测，但由于其具有通用的检测能力，因此这种传感器缺乏识别特异性，因为病原体通常在光学上与其良性背景相似。定量聚合酶链反应(qPCR)技术能够在不到一个小时的时间内扩增和检测DNA样品。但是，qPCR在很大程度上仅限于单次病原体的分析。因此，如果要同时分析许多病原体(如植物、农业、食品和水材料的情况)，则要平行地进行相当大量的单次试验。

生物微阵列已成为用于检测和分析DNA的多种工具的关键机制。基于微阵列的检测将DNA扩增与微阵列技术的广泛筛选功能结合在一起。这样可以进行特异性的检测并提高处理速度。可以制造DNA微阵列，使其具有通过杂交来探究细菌和真核细胞(如酵母和霉菌)中的DNA的某些片段的能力。然而，为下游微阵列应用处理大量PCR反应是昂贵的，并且需要具有复杂组织支持的高技能个体。由于这些挑战，微阵列技术尚未导致下游应用程序的发展。

众所周知，出于DNA分析的目的，DNA可以与固体支持物连接。在那些情况下，与表面相关的DNA通常称为“寡核苷酸探针”(核酸探针，DNA探针)，其同源配偶体(探针被设计为与其结合)称为杂交靶标(DNA靶标)。在这样的设备中，通过观察靶标通过双链体(duplex)形成与表面结合的探针的结合，来获得DNA靶标的检测和/或定量，该过程也称为“DNA杂交”(杂交)。

当核酸探针吸附到中性表面(例如纤维素)时，或当核酸探针吸附到阳离子表面(例如氨基硅烷涂层的玻璃或塑料)时，DNA会直接非共价地吸附到表面，可以实现核酸探针与固体支持物的连接。核酸探针直接、非共价地吸附到支持物上有几个限制。核酸探针必须直接与表面物理接触，从而对与DNA靶标的结合产生空间限制，因为所需的(结合)靶标-探针复合物是双螺旋，其只能通过将靶标DNA链包裹在结合的探针DNA周围来形成：核酸探针直接物理吸附在下面的表面上，从根本上抑制了相互作用。

核酸探针连接也可以通过核酸探针与表面的共价连接而发生。可以通过将反应性基团(例如伯胺)引入探针中，然后通过胺将探针共价连接到表面上的胺反应性部分(例如环氧基或异氰酸酯基)上来诱导分别形成仲胺或脲键。由于DNA通常不与环氧化物或异氰酸酯或其他类似的标准的亲核取代基反应，因此DNA探针必须首先用“非天然”配体(例如伯胺或硫醇)进行化学改性。尽管在寡核苷酸合成过程中可以很容易地实现这种化学反应，但是由于与改性化学反应相关的成本，DNA探针的成本增加了两倍以上。一种基于UV交联的相关方法避免了对非天然碱化学的需求，其中探针DNA可以通过DNA的直接UV交联而与DNA表面连接，这是通过探针DNA内的胸腺嘧啶的光化学加成到胺表面上而形成的仲胺加合物。然而，需要高能UV以进行有效的交联会导致大量副反应，该副反应会损坏核酸探针，使其无法使用。与吸附性连接一样，改性的核酸探针与反应性表面之间的共价键可能较短，大约少于10个可旋转键，从而将核酸探针置于下层表面2nm内。假定标准的核酸探针的长度>20个碱基(>10nm长)，则探针/接头长度比>10/1，还可稳定抑制随后形成所需的靶-探针双链体。

先前解决这些问题的尝试并未取得成功。由于凝胶相的致密性质，通过将核酸探针截留到三维凝胶相(例如，通过聚合丙烯酰胺和多糖而产生的三维凝胶相)而连接到表面上一直是存在问题的。尽管这些凝胶中的孔径(约10nm)允许核酸探针在凝胶中截留和/或连接，但溶液相的DNA靶标通常比核酸探针长很多倍，其被阻止穿透凝胶基质，从而由于对靶靶标DNA的溶液相接触不良，而限制了这些凝胶相系统的使用。此外。

因此，现有技术缺乏用于检测和识别病原体DNA的系统和方法，其使用较少的化学和不稳定产物，减少了处理步骤并提供了更快的结果，同时保持了准确性、特异性和可靠性。现有技术还缺乏确定包含多种病原体的未纯化核酸样品中的病原体特异性的DNA的绝对拷贝数的方法。本发明满足了本领域中这种长期的需求和要求。

发明内容

本发明涉及三维晶格微阵列系统。该系统包括具有前表面和后表面的固体支持物。多个双功能聚合物接头(每个接头具有顶部结构域和底部末端)在底部末端连接到固体支持物上。多个核酸探针连接到多个双功能聚合物接头的每个接头的顶部结构域。本发明涉及相关的三维微阵列，其进一步地共价连接到顶部结构域的顶端或内部共价地连接在多个双功能聚合物接头的每个接头上的荧光标记。本发明涉及另一种相关的三维微阵列，其进一步地包含多个连接在固体支持物前表面的化学可活化基团，其中多个双功能聚合物接头通过它们的底部末端共价地连接到多个化学可活化基团的每个上。

本发明还涉及制造三维晶格微阵列系统的方法。在该方法中，使本文所述的三维晶格微阵列系统中的固体支持物与制剂接触，所述制剂包含多个核酸探针、多个双功能聚合物接头和溶剂混合物，所述溶剂混合物包含水和沸点高于100℃的水溶性液体。将多个双功能聚合物接头的每个接头的底部末端连接到固体支持物的前表面，作为第一连接反应。将溶剂混合物中的水蒸发，从而浓缩多个核酸探针和连接到固体支持物的多个双功能聚合物接头。将每个核酸探针连接到多个双功能聚合物接头的每个接头的顶部结构域，作为第二连接反应。至少洗涤固体支持物一次，以除去未连接的双功能聚合物接头和核酸探针，以制造三维晶格微阵列系统。

本发明还涉及可定制的微阵列试剂盒。该微阵列试剂盒包括在本文所述的三维晶格微阵列系统中的固体支持物和多个双功能聚合物接头、多个核酸探针(每个核酸探针具有与病原体、植物或动物中的特征(signature)核苷酸序列互补的序列)、溶剂混合物和使用试剂盒的说明书。

本发明还涉及一种用于检测植物样品中的病原体的方法。在该方法中，采集植物组织样品，并从植物组织样品中分离包含DNA的总核酸。使用至少一个第一引物对(每个第一引物对包含对至少一种病原体的DNA具有选择性的正向和反向引物)在单次测试中串联地(in tandem)进行第一扩增，以获得一个或多个病原体特异性的第一扩增子。使用病原体特异性的第一扩增子作为模板，和至少一个第二引物对(每个引物对均标记有荧光标记并包含具有与病原体特异性第一扩增子中的内部侧翼区互补的序列的正向和反向引物)串联地进行第二扩增，以获得荧光标记的第二扩增子。使用本文所述的三维晶格微阵列系统，将第二扩增子与对病原体DNA中的特征序列决定子具有特异性的核酸探针杂交，其中通过多个双功能聚合物接头中的每个接头将核酸探针固定在三维晶格微阵列上的特定已知位置，并将微阵列至少洗涤一次。使微阵列成像，以检测来自荧光标记的第二扩增子的荧光信号，从而检测植物样品中的病原体。本发明涉及一种相关方法，其中多个双功能聚合物接头中的每个接头都包含荧光标记，并且该方法进一步地包括使微阵列成像以检测荧光标记的双功能聚合物接头的荧光信号和将荧光标记的第二扩增子的信号叠加到荧光标记的双功能聚合物接头的信号上，从而识别植物样品中检测到的病原体。

本发明还涉及一种在单次测试中同时检测来自植物和病原体的DNA的方法。在该方法中，采集可能包含一种或多种病原体的植物组织样品，并且分离包括DNA的总核酸，所述DNA包含至少来自植物组织和一种或多种病原体的DNA。使用至少一个病原体DNA选择性第一引物对和植物DNA选择性第一引物对，在单次测试中在总核酸上串联地进行第一扩增，以获得病原体特异性第一扩增子和植物特异性第一扩增子。使用病原体特异性第一扩增子和植物特异性第一扩增子作为模板，和标记有荧光标记且具有与病原体特异性第一扩增子中的内部侧翼区互补的序列的至少一个第二引物对和标记有荧光标记且具有与植物特异性第一扩增子中的内部侧翼区互补的序列的至少一个第二引物对，串联地进行第二扩增，以获得荧光标记的病原体特异性第二扩增子和荧光标记的植物特异性第二扩增子。使用本文所述的三维晶格微阵列系统，将荧光标记的病原体特异性第二扩增子和荧光标记的植物特异性第二扩增子与对病原体DNA和植物DNA中的特征序列决定子特异性的核酸探针杂交，其中通过荧光标记的双功能聚合物接头，将核酸固定在三维晶格微阵列上的特定已知位置，并且将微阵列洗涤至少一次。使微阵列成像，以检测来自荧光标记的病原体特异性第二扩增子和来自荧光标记的植物特异性第二扩增子的荧光信号，从而同时检测样品中的病原体和植物。本发明涉及一种相关方法，其中多个双功能聚合物接头中的每个接头均包括荧光标记，并且该方法进一步包括使微阵列成像以检测荧光标记的双功能聚合物接头的荧光信号，和将荧光标记的植物特异性第二扩增子和荧光标记的病原体特异性第二扩增子的信号叠加到荧光标记的双功能聚合物接头的信号上，从而同时识别在植物样品中检测到的病原体和植物。

本发明还涉及一种用于定量植物样品中的一种或多种病原体DNA的拷贝数的方法。在该方法中，采集可能具有病原体的植物组织样品，并分离包含DNA的总核酸。将至少一个合成的DNA序列的已知的拷贝数作为内部参考标准添加到分离的总核酸中，其中每个合成的DNA序列均包含中央结构域，该中央结构域的核苷酸序列与病原体DNA中的特征序列决定子不同，并且5'端和3'端的核苷酸序列与病原体DNA中的共有序列基本相同。使用至少一个第一引物对(每个第一引物对均包含对病原体DNA有选择性的正向和反向引物)在单次测试中在总核酸上串联地进行第一扩增，以获得一个或多个病原体DNA特异性的第一扩增子和合成的DNA特异性的第一扩增子。使用病原体特异性的第一扩增子和合成的DNA特异性的第一扩增子作为模板，和至少一个第二引物对(每个引物对都标记有荧光标记且包括具有与病原体特异性第一扩增子和合成的DNA特异性第一扩增子中的内部侧翼区互补的序列的正向和反向引物)串联地进行第二扩增，以分别获得荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子。

使用本文所述的三维晶格微阵列系统，将第二扩增子分别与对病原体DNA和合成的DNA中的特征序列决定子具有特异性的核酸探针杂交，其中通过荧光标记的双功能聚合物接头，将核酸探针固定在三维晶格微阵列的特定已知位置，并且将微阵列至少洗涤一次。使微阵列成像，以检测与核酸探针相对应的荧光信号和每个病原体DNA特异性第二扩增子和合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号，所述核酸探针通过荧光标记的双功能聚合物接头固定在微阵列上的特定已知位置。将病原体DNA特异性第二扩增子和合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号图像叠加到荧光标记的双功能聚合物接头的图像上，以获得叠加的信号图像，和将在微阵列上的一个或多个叠加信号位置处的核酸探针的序列与多种病原体DNA的特征序列决定子数据库进行比较，从而识别样品中的病原体。数学上相关联地，将来自病原体DNA特异性第二扩增子和合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号的荧光信号强度与添加到分离的总核酸中的合成的DNA的已知拷贝数进行数学关联，从而定量样品中的病原体DNA的拷贝数。

本发明还涉及一种在单次测试中同时定量植物组织样品中的一种或多种病原体和植物的DNA拷贝数的方法。在该方法中，采集可能包含一种或多种病原体的植物组织样品，并将至少包含植物组织DNA和病原体DNA的总核酸分离。将至少一个合成的DNA序列的已知拷贝数作为内部参考标准添加到分离的总核酸中，其中每个合成的DNA序列均包含中央结构域，该中央结构域的核苷酸序列不同于病原体DNA中的特征序列决定子，并且5'端和3'端的核苷酸序列与病原体DNA中的共有序列基本相同。使用至少一个病原体特异性第一引物对和至少一个合成的DNA特异性第一引物对和至少一个植物特异性第一引物对在单次测试中在总核酸上串联地进行第一扩增，以获得病原体DNA特异性第一扩增子、植物DNA特异性第一扩增子和合成的DNA特异性第一扩增子。使用第一扩增子作为模板，至少一个病原体DNA特异性第二引物对和至少一个植物DNA特异性第二引物对(每个引物对均标记有荧光标记且分别具有与第一扩增子中的内部侧翼区互补的序列)串联地进行第二扩增，以获得荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子、荧光标记的植物DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子。

使用本文所述的三维晶格微阵列系统，将第二扩增子分别与对病原体DNA、植物DNA和合成的DNA中的特征序列决定子具有特异性的核酸探针杂交，其中通过荧光标记的双功能聚合物接头将核酸探针固定在三维晶格微阵列上的特定已知位置，并将微阵列至少洗涤一次。使微阵列成像，以检测对应于核酸探针的荧光信号和对应于每个荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子、荧光标记的植物DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号，所述核酸探针通过荧光标记的双功能聚合物接头固定在微阵列上的特定已知位置，以及。将荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子、荧光标记的植物DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子的信号叠加到荧光标记的双功能聚合物接头的图像信号上，从而获得叠加信号图像，和将微阵列上的一个或多个叠加信号位置处的核酸探针的序列与多种病原体DNA和植物DNA的特征序列决定子数据库进行比较，从而识别样品中的病原体和植物。将来自植物DNA特异性第二扩增子的荧光信号强度和来自合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号强度与合成的DNA的已知拷贝数相关联，从而定量样品中的植物DNA的拷贝数。

附图说明

当参考附图阅读以下详细描述时，将更好地理解本发明的实施例的这些和其他特征、方面和优点，其中在整个附图中，相同的字符表示相同的部分，其中：

图1A-1D示出了共价的微阵列系统，其包括探针和印刷在活化表面上的双功能标记。图1A示出了在包含水和高沸点的水溶性液体的溶剂中的组分-未改性的核酸探针、胺官能化(NH)双功能聚合物接头和胺官能化(NH)荧光标记的双功能聚合物接头，以及具有化学可活化基团(X)的固体支持物。图1B示出了双功能聚合物接头与化学活化的固体支持物的第一步反应，其中双功能聚合物接头通过胺基团共价地连接到固体支持物上的化学活化基团上。图1C示出了通过从溶剂中蒸发水提高反应物–核酸探针和双功能聚合物接头的浓度来进行浓缩的第二步。图1D示出了核酸探针通过胸腺嘧啶核苷碱基与蒸发表面内的双功能聚合物接头进行UV交联的第三步，在某些情况下，其还用于通过交联至核酸探针，将相邻的双功能聚合物接头共价地连接在一起。

图2A-2D示出了包括探针和双功能聚合物接头的吸附性微阵列系统。图2A示出了组分；在包含水和高沸点的水溶性液体的溶剂中的未改性的核酸探针和官能化的(R_n)双功能聚合物接头和类似官能化的的荧光标记的双功能聚合物官能化的，以及固体支持物，其中R_n基团适合吸附到固体支持物表面。图2B示出了双功能聚合物接头在固体支持物上的第一步吸附，其中双功能聚合物接头通过R_n基团非共价地连接到固体支持物上。图2C示出了通过从溶剂中蒸发水提高反应物–核酸探针和双功能聚合物接头的浓度来进行浓缩的第二步。图2D示出了核酸探针通过胸腺嘧啶核苷碱基与双功能聚合物接头和蒸发表面内的其他核酸探针进行UV交联的第三步，在某些情况下，其还用于通过交联至核酸探针，将相邻的双功能聚合物接头共价地连接在一起。

图3A-3C示出了使用共价微阵列系统的实验数据。在本发明的该实施例中，双功能聚合物接头是化学改性的40个碱基长的寡脱氧胸腺嘧啶核苷(OligodT)，其具有在5'末端连接的Cy5荧光染料和在3'末端连接的氨基，适合与表面用环氧硅烷化学活化的硼硅酸盐玻璃固体支持物共价连接。核酸探针包含未改性的DNA寡核苷酸，适于结合至溶液状态的靶标，每个寡核苷酸终止于约5至7个胸腺嘧啶核苷，以允许与聚合的(oligodT)接头的顶部结构域中的胸腺嘧啶核苷进行光化学交联。

图3A示出了杂交和洗涤后，在635nm处观察到的微阵列的成像。635nm处的成像源自与双功能聚合物接头(OligodT)5'末端连接的(红色)CY5荧光的信号，其在微阵列制造过程中作为每个微阵列点中的位置标记引入。

图3B示出了杂交和洗涤后，在532nm处观察到的微阵列的成像。532nm处的成像源自(绿色)CY3荧光的信号，其与含DNA样品的PCR反应#2期间获得的PCR扩增DNA的5'末端连接。

图3C示出了杂交和洗涤后，在532nm和635nm处图像叠加的微阵列的成像。叠加的图像示出了相对于CY3标记的PCR产物的序列特异性结合，Cy5标记的OligodT位置标记平行连接的效用。

图4A是在16s基因位点(所有细菌)中使用的PCR引物的位置的图示，其用于PCR扩增从大麻洗涤液和相关植物洗涤液获得的未纯化的细菌污染。这些PCR引物用于扩增和染色此类样品中的DNA标记，以通过微阵列杂交进行细菌分析。

图4B是在stx1基因位点(致病性大肠杆菌)中使用的PCR引物的位置的图示，其用于PCR扩增从大麻洗涤液和相关植物洗涤液获得的未纯化的细菌污染。这些PCR引物用于扩增和染色此类样品中的标记DNA，以通过微阵列杂交进行细菌分析。

图5A是用作stx2基因位点(致病性大肠杆菌)中的两步PCR反应的PCR引物的位置的图示，其用于PCR扩增从大麻洗涤液和相关植物洗涤液获得的未纯化的细菌污染。这些PCR引物用于扩增和染色此类样品中的标记DNA，以通过微阵列杂交进行细菌分析。

图5B是在invA基因位点(沙门氏菌)中使用的PCR引物的位置的图示，其用于PCR扩增从大麻洗涤液和相关植物洗涤液获得的未纯化的细菌污染。这些PCR引物用于扩增和染色此类样品中的标记DNA，以通过微阵列杂交进行细菌分析。

图6是用于在tuf基因位点(大肠杆菌)中使用的PCR引物的位置的图示，其用于PCR扩增从大麻洗涤液和相关植物洗涤液获得的未纯化的细菌污染。这些PCR引物用于扩增和染色此类样品中的标记DNA，以通过微阵列杂交进行细菌分析。

图7是在ITS2基因位点(酵母和霉菌)中使用的PCR引物的位置的图示，其用于PCR扩增从大麻洗涤液和相关植物洗涤液获得的未纯化的酵母、霉菌和真菌污染。这些PCR引物用于扩增和染色此类样品中的D标记NA，以通过微阵列杂交进行酵母和霉菌分析。

图8是在ITS1基因位点(大麻植物对照)中使用的PCR引物的位置的图示，其用于PCR扩增从大麻洗涤液获得的未纯化的DNA。这些PCR引物用于扩增和染色来自此类样品的标记DNA，以通过微阵列杂交进行DNA分析。该PCR反应用于通过杂交产生内部植物宿主对照信号，用于标准化通过在同一微阵列上进行微阵列分析而获得的细菌、酵母、霉菌和真菌信号。

图9是流程图，其示出处理来自大麻(和相关植物材料)的未纯化的大麻洗涤液或其他表面采样，以便PCR扩增原始大麻或相关植物材料，然后对该材料进行微阵列分析，以便分析那些植物样品的病原体补体。

图10是用于实施核酸探针的微阵列形式的代表性图像。该代表性格式包括印刷在载玻片上的12个微阵列，每个微阵列均由特氟龙分隔器(左)隔开。每个微阵列一式四份查询完整的病原体检测面板。此外，还示出了一种用于分析大麻和相关植物材料中的病原体的微阵列的放大图(右)。每个微阵列的特氟龙边界适合于定位约50μL液体样品以进行杂交分析，其中荧光标记的扩增子在室温下放置在微阵列上30分钟，然后在室温下洗涤，然后对染料标记的病原体和宿主大麻DNA进行微阵列图像扫描。

图11A-11B示出了从纯化的细菌DNA标准品(图11A)和纯化的真菌DNA标准品(图11B)获得的代表性微阵列杂交数据。在每种情况下，都将纯化的细菌DNA当作未纯化的DNA进行PCR扩增，然后通过上述微阵列探针在微阵列上杂交。数据表明，以这种微阵列形式，可以通过室温杂交和洗涤来特异性识别每种细菌。类似地，将纯化的真菌DNA当作未纯化的DNA一样进行PCR扩增，然后通过上述微阵列探针在微阵列上杂交。数据表明，以这种微阵列形式，可以通过室温杂交和洗涤来特异性识别每种真菌DNA。

图12示出了从5种代表性的原始大麻洗涤样品中获得的代表性的微阵列杂交数据。在每种情况下，将这5种样品的原始病原体补体进行PCR扩增，然后通过上述微阵列探针在微阵列上杂交。数据表明，以这种微阵列形式，可以通过室温杂交和洗涤来特异性识别特异性的细菌、酵母、霉菌和真菌污染物。

图13示出了从代表性的原始大麻洗涤样品与代表性的(原始)高度表征的念珠菌样品相比，所获得的代表性的微阵列杂交数据。在每种情况下，将每个样品的原始病原体补体进行PCR扩增，然后通过上述微阵列探针在微阵列上杂交。数据表明，以这种微阵列形式，可以通过室温杂交和在原始大麻洗涤液或克隆的真菌样品上洗涤，来特异性识别特异性的真菌污染物。

图14示出了在包括大肠杆菌的肠杆菌科族群的细菌的低水平检测的实施方案的变体中采用的PCR引物的位置的图示。这些PCR引物用于选择性扩增和染色靶标生物的标记DNA，以通过微阵列杂交进行分析。

图15A是微阵列杂交数据的图形表示，其示出了从经认证的参考材料中低水平检测大肠杆菌O157：H7，该参考材料由加标在啤酒花(蛇麻草植物)上的特异性的细菌的计数菌落组成。

图15B是微阵列杂交数据的图形表示，其示出了从经认证的参考材料中低水平检测大肠杆菌O1111，该参考材料由加标在啤酒花(蛇麻草植物)上的特异性的细菌的计数菌落组成。

图15C是微阵列杂交数据的图形表示，其示出了从认证的参考材料中低水平检测肠道沙门氏菌，该参考材料由加标在啤酒花(蛇麻草植物)上的特异性的细菌的计数菌落组成。

图16示出了用于从两种方法收集和制备样品的图。撕拉胶带(tape pull)和清洗方法都用于处理样品，以提供通过微阵列分析进行微生物检测的解决方案。

图17A是用于PCR扩增在大麻洗涤液或相关植物洗涤液中的未纯化的细菌污染的PCR引物的位置的图示。使用两组PCR引物。第一组正向引物(FP)和反向引物(RP)支持“基因位点PCR”步骤，其中细菌重组DNA(rDNA)的扩增基于所有细菌中存在的16s基因位点。第二组引物支持“标记PCR”步骤，其中引物被染料标记且对靶标细菌具有特异性。本发明中的两个PCR步骤与图4A和4B的不同之处在于：在进行第一PCR之前，向样品中添加已知拷贝数的合成的DNA序列作为内部参考标准，其中合成的DNA序列可与样品中的细菌序列区分开并具有与FP和RP中的序列互补的末端序列，从而使合成的DNA序列与样品中的细菌序列共同扩增。

图17B是用于PCR扩增在大麻洗涤液或相关植物洗涤液中的未纯化细菌污染的PCR引物位置的图示。使用两组PCR引物。第一组正向引物(FP)和反向引物(RP)支持“基因位点PCR”步骤，其中细菌基因组DNA(DNA)的扩增基于所有细菌中存在的16s基因位点。第二组引物支持“标记PCR”步骤，其中引物被染料标记且对靶标细菌具有特异性。本发明中的两个PCR步骤与图4A和4B的不同之处在于：在进行第一PCR之前，向样品中添加已知拷贝数的合成的DNA序列作为内部参考标准，其中合成的DNA序列可与样品中的细菌序列区分开并具有与FP和RP中的序列互补的末端序列，从而使合成的DNA序列与样品中的细菌序列共同扩增。

图18是用于PCR扩增在大麻洗涤液或相关植物洗涤液中的未纯化的真核(例如酵母或霉菌)污染的PCR引物位置的图示。使用两组PCR引物。第一组正向引物(FP)和反向引物(RP)支持“基因位点PCR”步骤，其中真核DNA的扩增基于所有真核生物中存在的ITS2基因位点。第二组引物支持“标记PCR”步骤，其中引物被染料标记且对靶标真核生物具有特异性。本发明中的两个PCR步骤与图4A和4B不同之处在于：在进行第一PCR之前，向样品中添加已知拷贝数的合成的DNA序列作为内部参考标准，其中合成的DNA序列可与样品中的真核序列区分开且具有与FP和RP中的序列互补的末端序列，从而使合成的DNA序列与样品中的真核序列共同扩增。

图19A示出了使用用于曲霉的总的酵母菌和霉菌核酸探针和用于内标的TYM定量对照探针，在3000拷贝(已知量)的总酵母和霉菌定量对照品(TYM定量对照)的存在下作为内部参考标准，每次PCR反应变化大约为0至30,000拷贝的情况下，黄曲霉中ITS2区域的计算拷贝数。交叉点为3000个拷贝，每个分别用于在曲霉(未知拷贝数)的滴定曲线和TYM内部参考标准(已知拷贝数)之间的曲霉和TYM定量对照(箭头)，示出了样品中曲霉DNA的拷贝数。

图19B示出了使用用于曲霉的总酵母菌和霉菌核酸探针和用于内标的TYM定量对照探针，在3000拷贝(已知量)的总酵母和霉菌定量对照(TYM定量对照)存在下作为内部参考标准，每次PCR反应的变化大约为0至30,000拷贝的情况下，酿酒酵母中ITS2区域的计算拷贝数。交叉点为3000个拷贝，每个分别用于在曲霉(未知拷贝数)的滴定曲线和TYM内部参考标准(已知拷贝数)之间的曲霉和TYM定量对照(箭头)，示出了样品中曲霉DNA的拷贝数。

具体实施方式

在本发明的一个实施方案中，提供了一种三维晶格微阵列系统，其包括具有前表面和后表面的固体支持物；多个双功能聚合物接头，每个接头具有顶部结构域和底部末端，底部末端与固体支持物连接；和与多个双功能聚合物接头的每个接头的顶部结构域连接的多个核酸探针。

在该实施方案中，固体支持物可以是硼硅酸盐玻璃、惰性金属、热塑性丙烯酸树脂、环烯烃聚合物、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、尼龙、陶瓷、工程化的碳表面或其组合，尽管本领域已知的任何合适的材料都可以包含固体支持物。例如，合适的热塑性丙烯酸树脂是聚(甲基丙烯酸甲酯-VSUVT(PMMA-VSUVT)，合适的环烯烃聚合物是

，合适的惰性金属是金、铂、TiO₂、氧化铟锡(ITO)，以及合适的工程化的碳表面是石墨烯。

同样，在该实施方案中，固体支持物可进一步地包含连接到其前表面的多个化学可活化基团，其中多个双功能聚合物接头通过它们的底部末端与多个化学可活化基团的每个化学可活化基团共价连接。特别地，化学可活化基团可以是环氧硅烷基、马来酰亚胺基、氨基、活化的羧酸酯、异氰酸酯、琥珀酰亚胺、碳二亚胺或醛。优选地，固体支持物是环氧硅烷官能化的硼硅酸盐玻璃支持物。这些在本领域中是众所周知的，并且本领域普通技术人员将能够容易地根据需要使这些支持物中的任何一种官能化。

同样在该实施方案中，每个双功能聚合物接头可以进一步地包含与顶部结构域的末端共价连接或内部共价连接的荧光标记。例如，荧光标记可以是Cy5、DYLIGHT DY647、ALEXA FLUOR 647、Cy3、DYLIGHT DY547或ALEXA FLUOR 550。特别地，多个双功能聚合物接头中的每个接头是寡核苷酸、氨基多糖、聚胺或聚氨基酸。寡核苷酸的实施例是OligodT、5'-OligodT、5'-洋地黄毒苷OligodT(5’-digoxigenin OligodT)、5'-芘OligodT或5'-Cy5OligodT，氨基多糖的实施例是壳聚糖，聚胺的实施例是精胺、亚精胺、尸胺和腐胺，聚氨基酸的实施例可以包括赖氨酸或组氨酸，或者双功能聚合物接头可以是任何其他具有双官能团的聚合物，它们可以在底部末端连接到化学可活化的固体支持物上，核酸探针在顶部结构域上。优选地，双功能聚合物接头是在5’末端具有胺基的OligodT。

在该实施方案的一个方面，多个双功能聚合物接头的每个接头可包含在底部末端的第一反应性部分或在顶部结构域的第二反应性部分或其组合，所述第一反应性部分与固体支持物中的化学可活化基团共价连接，所述第二反应性部分与多个核酸的每个核酸共价连接。特别地，第一反应性部分可以是氨基、硫醇基、醛基或羧酸酯，优选地为氨基。特别地，第二反应性部分可以是核苷酸碱基、氨基酸或氨基糖。例如，第二反应性部分可以是胸腺嘧啶核苷、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞苷、尿嘧啶或溴脱氧尿苷。可选地，第二反应性部分可以是半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丝氨酸、色氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸或氨基糖。此类反应性基团的化学性质在本领域中是众所周知的，并且普通技术人员可以容易地在所选的双功能聚合物接头上识别用于连接到荧光标记的合适基团。优选地，双功能聚合物接头是Cy5标记的OligodT，其在它的3'末端连接有氨基，以共价地连接到固体支持物的活化表面上。

在该实施方案的另一方面，多个双功能聚合物接头的每个接头可以在底部末端具有吸附基团，以非共价地连接到固体支持物上。在这方面，吸附基团可以是单链核酸、胺-多糖或延伸的平面疏水基团。通常地，吸附基团可包含一个或多个官能团(由“R_n”表示)，该官能团与固体支持物前表面的非共价吸附性连接是相容的。例如，单链核酸相容的吸附性R基团可以是OligodT，胺-多糖相容的吸附性R基团可以是壳聚糖，或延伸的平面疏水基团相容的吸附性R基团可以是洋地黄毒苷、芘或Cy-5染料。

另外，在该实施方案中，多个核酸探针中的每个核酸探针可以在5'端和3'端具有至少三个末端胸腺嘧啶核苷碱基。在一方面，胸腺嘧啶核苷碱可以共价地连接到多个双功能聚合物接头的每个接头的第二反应性部分。核酸探针还可以具有与病原体、植物或动物中的特征核苷酸序列互补的序列。

在相关的实施方案中，提供了三维晶格微阵列系统，其包括具有前表面和后表面的固体支持物；多个双功能聚合物接头，每个接头具有顶部结构域和底部末端和共价地连接到顶部结构域的末端或内部共价地连接的荧光标记，该底部末端连接到固体支持物；以及与多个双功能聚合物接头的每个接头的顶部结构域相连的多个核酸探针。

进一步地，对于该实施方案，固体支持物包括连接到其前表面的多个化学可活化基团，其中多个双功能聚合物接头共价地连接到多个化学可活化基团。在该进一步的实施方案中，化学可活化的基团可以是环氧硅烷基、马来酰亚胺基、氨基或活化的羧酸酯。在两个实施方案中，固体支持物可以是硼硅酸盐玻璃、惰性金属、热塑性丙烯酸树脂、环烯烃聚合物、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、尼龙、陶瓷、工程化的碳表面或其组合。在所有实施方案中，化学可活化基团与双功能聚合物接头的摩尔比大于约10。

在两个实施方案的一方面，多个双功能聚合物接头可包括在底部末端的第一反应性部分或在顶部结构域的第二反应性部分或其组合，所述第一反应性部分与固体支持物中的化学可活化基团共价连接，所述第二反应性部分与多个核酸共价连接。第一反应性部分可以是氨基、硫醇基、醛基或羧酸酯。第二反应性部分可以是核苷酸碱基、氨基酸或氨基糖。核苷酸碱基的实施例是胸腺嘧啶核苷、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞苷、尿嘧啶或溴脱氧尿苷。氨基酸的实施例是半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丝氨酸、色氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸。

在两个实施方案的另一方面，双功能聚合物可包含在其底部末端的吸附基团。在这方面，吸附基团可以是单链核酸、胺-多糖或延伸的平面疏水基团。单链核酸的实施例是OligodT或等价的富含胸腺嘧啶核苷的核酸。胺多糖的实施例是壳聚糖。延伸的平面疏水基团的实施例是芘、洋地黄毒苷或Cy5染料。

在两个实施方案及其方面，双功能聚合物接头可以是寡核苷酸、氨基多糖、聚胺或聚氨基酸。特别地，寡核苷酸是OligodT或等价的富含胸腺嘧啶核苷的核酸。双功能聚合物接头与核酸探针之间的摩尔比也可以大于0.1。

同样在其两个实施方案及其方面中，多个核酸探针的每个核酸探针可以在其5'端和3'端包含至少三个末端胸腺嘧啶核苷碱基。在这些实施方案和方面中，胸腺嘧啶核苷碱基可以共价地连接到双功能聚合物接头上的第二反应性部分。另外，核酸探针可以具有与病原体、植物或动物中的特征核苷酸序列互补的序列。

在另一个相关的实施方案中，提供了一种共价键合的三维晶格微阵列系统，该系统包括具有前表面和后表面的固体支持物；多个双功能聚合物接头，每个接头具有顶部结构域和底部末端，该底部末端连接到固体支持物上；以及与双功能聚合物接头的顶部结构域连接的多个核酸探针，其具有与病原体、植物或动物中的特征核苷酸互补的序列。

进一步地，对于该实施方案，固体支持物包括连接到其前表面的多个化学可活化基团，其中多个双功能聚合物接头共价地连接到多个化学可活化基团上。在该进一步的实施方案中，化学可活化基团、化学可活化基团与双功能聚合物接头的摩尔比和固体支持物如上文所述。

在另一个进一步的实施方案中，双功能聚合物接头可包含共价地连接到其顶部结构域的末端或内部共价地连接的荧光标记。在该进一步的实施方案中，双功能聚合物接头、连接到其上的第一反应性部分、连接到其上的第二反应性部分，连接到其上的荧光标记、吸附基团和双功能聚合物接头与核酸探针的摩尔比如上所述。

同样在其所有实施方案和方面中，多个核酸探针的每个核酸探针可在其5'端和3'端包含至少三个末端胸腺嘧啶核苷碱基。在这些实施方案和方面中，胸腺嘧啶核苷碱基可以共价地连接到双功能聚合物接头上的第二反应性部分。

在本发明的另一实施方案中，提供了一种制造三维晶格微阵列系统的方法，该方法包括如下步骤：使如上所述的三维晶格微阵列系统中的固体支持物与制剂接触，所述制剂包括多个核酸探针、多个双功能聚合物接头和溶剂混合物，所述溶剂混合物包括水和沸点高于100℃的水溶性液体；将双功能聚合物接头的底部末端连接到固体支持物的前表面作为第一连接反应；将溶剂混合物中的水蒸发从而浓缩多个核酸探针和连接在固体支持物上的多个双功能聚合物接头；将每个核酸探针共价地连接到双功能聚合物接头的顶部结构域作为第二连接反应；和洗涤固体支持物至少一次，以除去未连接的双功能聚合物接头和核酸探针。

在该实施方案的一方面，多个双功能聚合物接头与固体支持物的第一连接反应是通过固体支持物上的化学可活化基团和多个双功能聚合物接头的底部末端上的第一反应性部分之间的共价偶联而实现的。在这个方面，化学可活化基团与双功能聚合物接头的摩尔比大于10。在另一方面，第一连接可以通过固体支持物的前表面与多个双功能聚合物接头的底部末端之间的吸附或静电结合而实现。在该实施方案及其方面，第一连接反应可以在0℃和40℃之间的温度下进行。第一连接反应也进行约5分钟至约100分钟。另外，蒸发水的步骤在20℃和40℃之间的温度下进行。此外，蒸发水的步骤进行约1小时至约24小时。

同样在该实施方案中，第二连接反应可以通过在多个双功能聚合物接头的每个接头的顶部结构域处的第二反应性部分与多个核酸探针的光化学交联而实现。例如，通过存在于多个双功能聚合物接头的顶部结构域上的末端胸腺嘧啶核苷碱基，进行光化学交联。在该实施方案中，通过暴露于紫外线或激光源而进行光化学交联。特别地，紫外线可以具有254nm的波长和300毫焦耳的能量。在该实施方案中，双功能聚合物接头与核酸探针的摩尔比可以大于0.1。在该实施方案中，第二连接反应可以在0℃和40℃之间的温度下进行。另外，第二进行约1分钟至约10分钟。此外。

另外，在该实施方案中，接触步骤可以包括标准印刷技术，例如压电印刷、接触印刷、喷墨印刷或移液，其允许将制剂均匀地施加在活化的支持物上。固体支持物可以是硼硅酸盐玻璃、聚碳酸酯、石墨烯、金、热塑性丙烯酸树脂(例如聚(甲基丙烯酸甲酯-VSUVT(PMMA-VSUVT))和环烯烃聚合物(例如

)。

此外，在该实施方案中，溶剂混合物可包含水与水溶性液体，体积比为约10:1至约100:1。水溶性液体也可以是甘油、DMSO或丙二醇。可选地，该液体可以是沸点高于水的沸点的任何合适的水溶性液体，从而在蒸发步骤中不会损失所有溶剂。这使得分子反应物-核酸探针和双功能接头在蒸发过程中逐渐浓缩。这种受控的蒸发对本发明至关重要，因为它控制了核酸探针之间的垂直间隔，避免了杂交步骤中的空间位阻，从而提高了微阵列的准确性和精密度。水与高沸点溶剂的比例保持在10:1到100:1之间，因此，在两种极端情况下，平衡时，由于水的蒸发，液相的体积将减少到原始体积的1/100至1/10，因此反应物浓度增加了100倍至10倍。在优选的实施方案中，与水溶性溶剂是丙二醇，并且水与丙二醇的比例为100:1。

在本发明的又一实施方案中，提供了一种可定制的微阵列试剂盒，其包括在如上所述的三维晶格微阵列系统中的固体支持物和多个双功能聚合物接头、多个核酸探针(每个核酸探针具有与病原体、植物或动物中的特征核苷酸序列互补的序列)、溶剂混合物和使用试剂盒的说明书。

在该实施方案中，核酸探针可在5'端和3'端具有至少三个末端胸腺嘧啶核苷碱基。同样在该实施方案中，溶剂混合物可以包含水与甘油、二甲基亚砜(DMSO)或丙二醇中的其中一种的混合物，其体积比为约10:1至约100:1。

根据最终用户的目标，构成该试剂盒的每个组分都可以在发货前单独定制。例如，固体支持物可以是未改性的并且具有能够非共价地连接到双功能聚合物接头中的基团的性质。可选地，可以用化学可活化基团在前表面上活化固体支持物。通过化学、光化学或热偶联，胸腺嘧啶核苷碱基允许将核酸探针共价地连接到双功能聚合物接头上。优选地，通过使用紫外线的光化学方法实现核酸探针与双功能聚合物接头的共价连接。

该试剂盒提供了设计为旨在识别植物、动物或病原体中的序列决定子的多个核酸探针，并且可以包括合成的DNA内部参考标准，将其添加到样品中以定量植物、动物或病原体中的序列决定子的DNA拷贝数。合成的DNA具有中央结构域，该结构域的核苷酸序列不同于所查询的未知DNA中的特征序列决定子，并且5'和3'末端序列与未知DNA中的共有序列基本相同。例如，共有序列可以是SEQ ID NO：152和153所示的序列。合成的DNA的这种结构允许通过用于扩增待查询的未知DNA的高变区的同一对PCR引物，对合成的DNA进行扩增。例如，使用的合成的DNA可以具有如SEQ ID NO：154-157所示的序列。

在相关的实施方案中，提供了可定制的微阵列试剂盒，其包括如上所述的三维晶格微阵列系统中的固体支持物、多个双功能聚合物接头(每个接头具有顶部结构域和底部末端和共价地连接到顶部结构域的末端或内部共价连接的荧光标记)多个核酸探针(每个核酸探针具有与病原体、植物或动物中的特征核苷酸序列互补的序列)、溶剂混合物和使用试剂盒的说明书。

在该实施方案中，固体支持物、双功能聚合物接头和荧光标记如上所述。同样在该实施方案中，核酸探针可以在5'端和3'端具有至少三个末端胸腺嘧啶核苷碱基。另外，在该实施方案中，溶剂混合物如上所述。

在本发明的又一实施方案中，提供了一种用于检测植物样品中的病原体的方法，包括：采集植物组织样品；从植物组织样品中分离包含DNA的总核酸；使用至少一个第一引物对在单次测试中串联地进行第一扩增，以获得一个或多个病原体特异性的第一扩增子，所述第一引物对包含对至少一种病原体的DNA具有选择性的正向和反向引物；使用病原体特异性第一扩增子作为模板和至少一个第二引物对串联地进行第二扩增以获得荧光标记的第二扩增子，每个第二引物对都标记有荧光标记并包含具有与病原体特异性第一扩增子中的内部侧翼区域互补的序列的正向和反向引物；使用如上所述的三维晶格微阵列系统进行以下步骤：将第二扩增子与对病原体DNA中的特征序列决定子具有特异性的核酸探针杂交，其中通过双功能聚合物接头将核酸探针固定在三维晶格微阵列上的特定已知位置；洗涤微阵列至少一次；和使微阵列成像以检测来自荧光标记的第二扩增子的荧光信号，从而检测植物样品中的病原体。

进一步地，关于该实施方案，双功能聚合物接头包括荧光标记，该方法包括使微阵列成像以检测荧光标记的双功能聚合物接头的荧光信号，和将荧光标记的第二扩增子的信号叠加到荧光标记的双功能聚合物接头的信号上，从而识别在植物样品中检测到的病原体。在该实施方案中，荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子中的荧光标记与荧光标记的双功能聚合物接头中的荧光标记不同。

在两个实施方案中，在其一方面中，可通过用水洗涤植物以回收病原体，然后通过在无菌的0.4μm过滤器上过滤而浓缩，来采集存在于植物表面上的病原体。在两个实施方案的另一方面，可通过使植物组织样品和病原体流体化，然后通过离心，以获得植物细胞和病原体细胞的沉淀物来采集植物组织内的病原体。在任一实施方案中，将采集的样品破坏以释放总核酸，其无需进一步纯化即可用于后续步骤。

在两个实施方案中，使用包含来自病原体(外部病原体)的核酸或来自病原体和植物(内部病原体)的核酸的样品，使用病原体特异性第一引物对，进行病原体DNA的第一扩增，以获得一个或多个病原体特异性的第一扩增子。可以采用可以选择性地扩增样品中的DNA补体的任何DNA扩增方法，包括环介导等温扩增(LAMP)或聚合酶链反应(PCR)。在一个优选的实施方案中，通过PCR进行扩增。

在两个实施方案中，荧光标记的第二扩增子在具有如上所述的多个核酸探针的三维晶格微阵列系统上杂交。一方面，双功能聚合物接头具有连接在其上的荧光标记(与第二扩增子上的标记不同)，导致在杂交和洗涤后对微阵列成像，会产生两种不同的荧光信号—来自在制造过程中与核酸探针共价连接的荧光双功能聚合物接头的信号，可以在微阵列中的每个斑点中检测到该信号，以及第二扩增子信号，其仅在核酸探针序列与第二扩增子(最初源自样品中的病原体DNA的扩增)互补的那些斑点中检测到。因此，使用计算机叠加两个图像为本发明要求保护的系统和方法提供了有益的属性，因为人们可以容易地从数据库中识别出样品中包含的植物或病原体，该数据库将核酸探针序列和该序列的微阵列位置与植物或病原体中的已知DNA特征相关联。

在两个实施方案及其方面，病原体是细菌、真菌、病毒、藻类或原生动物或这些病原体的组合。这些病原体可作为土壤、无土生长培养基、水培生长培养基或植物样品生长的水的成分存在。该植物可以是在土壤、无土培养基、水培生长培养基或水中生长的陆生植物，例如啤酒花或大麻、水生植物、附生植物或石生植物。优选地，植物是大麻。

一方面，病原体是细菌，并且第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，或SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，或SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138所示的序列，第二扩增正向和反向引物对分别具有SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：20，或SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，或SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，或SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28，或SEQ ID NO：29和SEQID NO：30，或SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：30所示的序列，其中核酸探针具有SEQ ID NO：37-85所示的序列。

在另一方面，病原体是真菌，并且第一扩增正向和反向引物分别具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，或SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，或SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136所示的序列，第二扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，或SEQID NO：33和SEQ ID NO：34，或SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140所示的序列，其中核酸探针具有SEQ ID NO：86-125所示的序列。

在本发明的又一个实施方案中，提供了在单次测试中同时检测来自植物和病原体的DNA的方法，该方法包括采集可能包含一种或多种病原体的植物组织样品；将包含来自至少植物组织和一种或多种病原体的DNA的总核酸分离；使用至少一个病原体DNA选择性第一引物对和至少一个植物DNA选择性第一引物对在单次测试中在总核酸上串联地进行第一扩增，以获得病原体特异性第一扩增子和植物特异性第一扩增子；使用病原体特异性第一扩增子和植物特异性第一扩增子作为模板，和至少一个第二引物对(所述第二引物对标记有荧光标记且具有与病原体特异性第一扩增子中的内部侧翼区互补的序列)，和至少一个第二引物对(所述第二引物对标记有荧光标记并且具有与植物特异性第一扩增子中的内部侧翼区互补的序列)串联地进行第二扩增，以获得荧光标记的病原体特异性第二扩增子和荧光标记的植物特异性第二扩增子；使用本文所述的三维晶格微阵列系统，进行以下步骤：将荧光标记的病原体特异性第二扩增子和荧光标记的植物特异性第二扩增子与核酸探针杂交，所述核酸探针对病原体DNA和植物DNA中的特征序列决定子具有特异性，其中所述核酸通过荧光标记的双功能聚合物接头固定在三维晶格微阵列上的特定已知位置；洗涤微阵列至少一次；和使微阵列成像，以检测来自荧光标记的病原体特异性第二扩增子和来自荧光标记的植物特异性第二扩增子的荧光信号，从而同时检测样品中的病原体和植物。

进一步地，对于该实施方案，多个双功能聚合物接头的每个接头均包含荧光标记，该方法包括以下步骤：使微阵列成像以检测荧光标记的双功能聚合物接头的荧光信号；和将荧光标记的植物特异性第二扩增子和荧光标记的病原体特异性第二扩增子的信号叠加到荧光标记的双功能聚合物接头的信号上，从而同时识别植物样品中检测到的病原体和植物。

在两个实施方案中，如上所述，该方法包括采集可能包含一种或多种病原体的植物组织样品，将该植物组织样品和一种或多种病原体流体化，和将包含至少来自植物组织的DNA和来自一种或多种病原体的DNA的总核酸分离。同样在两个实施方案中，未纯化的总核酸样品的第一扩增及病原体特异性第一扩增子和第一扩增产生的植物特异性第一扩增子的第二扩增如上文所述，并且产生分别与原始采集的样品中的病原体和植物DNA相对应的荧光标记的病原体特异性第二扩增子和荧光标记的植物特异性第二扩增子。

在两个实施方案中，病原体可以是人体病原体、动物病原体或植物病原体，特别是细菌、真菌、病毒、酵母、藻类或原生动物或其组合。特别地，病原体可以是细菌或真菌，且第一扩增正向和反向引物对序列、第二扩增正向和反向引物对序列和核酸探针序列如上文所述。

在本发明的又一个实施方案中，提供了一种用于定量植物样品中的一种或多种病原体DNA的拷贝数的方法，其包括采集可能具有病原体的植物组织样品；分离包含DNA的总核酸；将至少一个合成的DNA序列的已知拷贝数作为内部参考标准添加到分离的总核酸中，每个合成的DNA序列均包含中央结构域，该中央结构域的核苷酸序列不同于病原体DNA中的特征序列决定子且5'末端和3'末端具有与病原体DNA中的共有序列基本相同的核苷酸序列；使用至少一个第一引物对(每个第一引物对包含对病原体DNA具有选择性的正向引物和反向引物)在单次测试中在总核酸上串联地进行第一扩增，以获得一个或多个病原体DNA特异性第一扩增子和合成的DNA特异性第一扩增子；使用病原体特异性第一扩增子和合成的DNA特异性第一扩增子作为模板，和至少一个第二引物对(每个引物对都标记有荧光标记并包含具有与病原体特异性第一扩增子和合成的DNA特异性第一扩增子中的内部侧翼区域互补的序列的正向和反向引物)串联地进行第二扩增，以分别获得荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子；使用如上文所述的三维晶格微阵列系统，进行以下步骤：将第二扩增子分别与对病原体DNA和合成的DNA中的特征序列决定子具有特异性的核酸探针杂交，通过荧光标记的双功能聚合物接头将核酸探针固定在三维晶格微阵列的特定已知位置；洗涤微阵列至少一次；使微阵列成像，以检测与通过荧光标记的双功能聚合物接头固定在微阵列上的特定已知位置的核酸探针相对应的荧光信号及每个病原体DNA特异性第二扩增子和合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号；将病原体DNA特异性第二扩增子和合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号图像叠加到荧光标记的双功能聚合物接头的图像上，以获得叠加的信号图像；将微阵列上的一个或多个叠加信号位置处的核酸探针的序列与多种病原体DNA的特征序列决定子数据库进行比较，从而识别样品中的病原体；和将来自病原体DNA特异性第二扩增子和合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号的荧光信号强度与添加到分离的总核酸中的合成的DNA的已知拷贝数进行数学关联，从而定量样品中的病原体DNA的拷贝数。

通常地，在该实施方案中，在要求保护的方法中使用的方法，如采集、总核酸分离、第一和第二扩增以及三维晶格微阵列系统如上文所述。通常地，植物、病原体、荧光标记和引物对序列如上文所述。

在该实施方案中，荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子中和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子中的荧光标记与荧光标记的双功能聚合物接头中的荧光标记不同。杂交后，使微阵列成像并叠加图像，会产生两个荧光信号—来自在制造过程中与核酸探针共价连接的荧光双功能聚合物接头的信号，该荧光信号可以在微阵列中的每个斑点中检测到；和来自荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子的信号，该荧光信号仅在核酸探针序列与病原体特异性第二扩增子(最初源自样品中的病原体DNA的扩增)和合成的DNA特异性第二扩增子互补的那些位置(斑点)中检测到。因此，使用计算机叠加信号为本发明所要求保护的系统和方法提供了有益的属性，因为人们可以很容易地从数据库中识别样品中包含的植物或病原体，该数据库将核酸探针序列和该序列的微阵列位置与植物或病原体中已知的DNA特征相关联。

同样在该实施例中，可以使用以下关系式执行数学关联的步骤：

Cn/Co＝P(Sn/So)x，其中：

C_n＝存在于原始样品混合物中的每种类型(n)的微生物DNA拷贝数，该样品混合物添加到用于制备微阵列分析的扩增子的两个串联PCR反应的第一个中；

C_o＝合成DNA的已知拷贝数(内部参考标准)，合成DNA添加到用于制备微阵列分析的扩增子的两个PCR反应的第一个中，且C₀可以根据可能遇到的未知微生物拷贝的范围设置为，例如100、500、3,000和5,000。在一个优选的实施方案中，C_o＝3000；

S_n＝PCR扩增，和第n种微生物物种的微阵列杂交，然后进行图像分析后，获得的相对荧光单位(RFU)信号数据；

S_o＝PCR扩增，和合成的DNA物种的微阵列杂交，然后进行图像分析后，获得的相对荧光单位(RFU)信号数据；

X＝复杂的指数因子，其定义了实验微阵列数据比例(S_n/S_o)与原始样品中存在的微生物DNA拷贝与合成的DNA标准拷贝(C_n/C_o)的潜在比例之间的函数关系。X可以是线性函数或指数或相关的函数形式或常数，其本身是扩增参数和微阵列分析和成像条件的函数。一方面，X是在约1至约3的范围内的指数因子；以及

P＝常数，其将实验微阵列数据比例(S_n/S_o)与微阵列结合的扩增PCR产物的浓度相关，在一方面，P的范围可以从约0.1到约10。

另外，在该实施方案中，合成的DNA可以具有SEQ ID NO：154-157所示的序列。合成的DNA具有中央结构域，该中央结构域的核苷酸序列不同于所查询的未知DNA中的特征序列决定子，并且5'和3'末端序列与未知DNA中的共有序列基本相同。例如，共有序列可以是SEQID NO：152和153所示的序列。合成的DNA的这种结构允许通过用于扩增待查询的未知DNA的高变区域的同一对PCR引物对合成的DNA进行扩增。

在该实施方案的一个方面，病原体可以是细菌，其中共有序列在SEQ ID NO：153中示出，第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10，或SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，或SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138所示的序列，其中共有序列在SEQ ID NO：153中示出，第二扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，或SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，或SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24，或SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，或SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28，或SEQID NO：29和SEQ ID NO：30，或SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：30所示的序列，对细菌具有特异性的核酸探针具有SEQ ID NO：37-85所示的序列，其中具有SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156和SEQ ID NO：157所示的序列的合成的DNA分别与具有SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：144所示的序列的合成的DNA特异性核酸探针杂交。

在该实施方案的另一方面，病原体可以是真菌，其中共有序列在SEQ ID NO：152中所出，第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，或SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，或SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136所示的序列，其中共有序列在SEQID NO：152中示出，第二扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，或SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34，或SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140所示的序列，对真菌具有特异性的核酸探针具有SEQ ID NO：86-125所示的序列，其中具有SEQ ID NO：154所示的序列的合成的DNA与具有SEQ ID NO：145所示的序列的合成的DNA特异性核酸探针杂交。

在本发明的又一个实施方案中，提供了一种在单次测试中同时定量植物组织样品中的一种或多种病原体和植物中的DNA拷贝数的方法，该方法包括以下步骤：采集可能包含一种或多种病原体的植物组织样品；将至少包含植物组织DNA和病原体DNA的总核酸分离；将至少一个合成的DNA序列的已知拷贝数作为内部参考标准添加到分离的总核酸中，每个合成的DNA序列均包含中央结构域，该中央结构域的核苷酸序列不同于病原体DNA和植物DNA中的特征序列决定子，5'端和3'端的核苷酸序列与病原体DNA中的共有序列基本相同；使用至少一个病原体特异性第一引物对和至少一个合成的DNA特异性第一引物对和至少一个植物特异性第一引物对在单次测试中在总核酸上串联进行第一扩增，以获得病原体DNA特异性第一扩增子、植物DNA特异性第一扩增子和合成的DNA特异性第一扩增子；使用第一扩增子作为模板，至少一个病原体DNA特异性第二引物对和至少一个植物DNA特异性第二引物对，串联进行第二扩增，以获得荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子、荧光标记的植物DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子，其中每个引物对都标记有荧光标记且分别具有与第一扩增子中的内部侧翼区互补的序列；使用上文所述的三维晶格微阵列系统进行以下步骤：将第二扩增子分别与对病原体DNA、植物DNA和合成的DNA中的特征序列决定子具有特异性的核酸探针杂交，其中通过荧光标记的双功能聚合物接头将核酸探针固定在三维晶格微阵列上的特定已知位置；洗涤微阵列至少一次；使成像，以检测对应于通过荧光标记的双功能聚合物接头固定在微阵列上的特定已知位置的核酸探针的荧光信号和对应于每种荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子、荧光标记的植物DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号；将荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子、荧光标记的植物DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子的信号叠加到荧光标记的双功能聚合物接头的图像信号上，以获得叠加的信号图像；将微阵列上的一个或多个叠加信号位置处的核酸探针的序列与多种病原体DNA和植物DNA的特征序列决定子数据库进行比较，从而识别样品中的病原体和植物；将来自病原体DNA特异性第二扩增子和合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号强度与合成的DNA的已知拷贝数进行数学关联，从而定量样品中的病原体DNA的拷贝数；和将来自植物DNA特异性第二扩增子的荧光信号强度和来自合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号强度与合成的DNA的已知拷贝数进行数学关联，从而定量样品中的植物DNA的拷贝数。

通常地，在该实施方案中，在要求保护的方法中使用的方法，例如采集、总核酸分离、第一和第二扩增，以及叠加和三维晶格微阵列系统都如上文所述。通常地，植物、病原体、荧光标记和引物对序列都如上所述。

在该实施方案中，荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子、荧光标记的植物DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子中的荧光标记与荧光标记的双功能聚合物接头中的荧光标记不同。

同样在该实施例中，如上所述，以关系式Cn/Co＝P(Sn/So)x执行数学关联的步骤。

在该实施方案的另一方面，病原体可以是真菌，其中共有序列在SEQ ID NO：152中示出，第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，或SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，或SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136所示的序列，其中共有序列在SEQID NO：152中示出，第二扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，或SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34，或SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140所示的序列，对真菌具有特异性的核酸探针具有SEQ ID NO：86-125所示的序列，其中具有SEQ ID NO：154所示的序列的合成的DNA与具有SEQ ID NO：145所示的序列的合成的DNA特异性核酸探针杂交。

给出以下实施例是为了说明本发明的各种实施方案，并不意味着以任何方式限制本发明。

实施例1

三维晶格微阵列系统的制造

本发明教导了通过使用双功能聚合物接头将核酸探针连接到固体支持物表面的方法。核酸探针可以是单链或双链形式的PCR扩增子、合成的寡核苷酸、等温扩增产物、质粒或基因组DNA片段。基于将与核酸探针连接的下层表面的性质，本发明可分为两类。

具有活化的固体支持物的共价微阵列系统

这些核酸探针中的任何一种核酸探针的共价连接都不会直接发生在下层表面上，而是通过相对较长的双功能聚合接头介导的，该接头既能够与表面发生化学反应也能够与核酸探针进行有效的紫外线引发的交联。该过程的机制是自发的3D自组装，并在图1A-1D中进行说明。如图1A所示，制造此微阵列系统所需的组分是：

(a)未改性的核酸探针3，例如寡核苷酸、PCR或等温扩增子、质粒或基因组DNA；

(b)具有与伯胺反应相容的化学可活化基团(称为“X”)的化学可活化表面1，例如环氧硅烷、异氰酸酯、琥珀酰亚胺、碳二亚胺、醛。

(c)双功能聚合物接头2，例如天然或改性的OligodT、氨基多糖、氨基多肽，它们适用于与支持物表面上的化学可活化基团偶联，每个均连接有荧光标记4；和

(d)包含水和高沸点的水溶性液体(例如甘油、DMSO或丙二醇)的溶剂(水与溶剂的比例在10:1至100:1之间)。

表1示出了双功能聚合物接头上的化学可活化基团和匹配的反应性基团的实施例，其仅出于说明目的，并不以任何方式排除使用匹配的反应性对的其他组合。

表1.双功能聚合物接头与活化表面的共价连接

当用于本发明中时，通过用于产生DNA杂交测试的常规制造方法，例如接触印刷、压电印刷、喷墨印刷或移液，将包括化学可活化的表面、双功能聚合物接头和未改性的核酸探针的溶液施加到化学活化的表面4上。

微阵列制造开始于将化学可活化表面、双功能聚合物接头和未改性的核酸探针的混合物施加到表面上。第一步是双功能接头与活化的表面的反应和共价连接(图1B)。通常地，将双功能接头的化学浓度设定为，使得表面上少于100％的反应性位点与双功能接头形成共价键。在这样的低密度下，双功能接头分子之间的平均距离限定了表示为晶格宽度的间隔(图1B中的“LW”)。

在第二步中，将溶剂中的水蒸发，以通过蒸发溶剂中的水来浓缩DNA和双功能接头(图1C)。通常地，在基体制造过程中使用纯水作为溶剂是不利的，因为由于高的表面积/体积比，水通过蒸发被快速去除。为了克服该问题，在本发明中，将水与高沸点的水溶性溶剂(例如甘油、DMSO或丙二醇)的混合物用作溶剂。在这种情况下，蒸发时，水成分将蒸发，而高沸点溶剂则不会蒸发。结果，随着蒸发的进行水逐渐失去，分子反应物—DNA和双功能接头逐渐浓缩。在本发明中，水与高沸点溶剂的比例保持在10:1至100:1之间。因此，在两种极端情况下，平衡时，由于水的蒸发，液相的体积将减少到原始体积的1/100至1/10之间，从而使反应物增加100倍至10倍浓度。这种受控的蒸发对本发明是至关重要的，因为它控制了核酸探针之间的垂直间隔(垂直间距离，图1C中的“VG”)，其与蒸发浓度的大小成反比。

在第三步中，将核酸探针中的末端胸腺嘧啶核苷碱基进行UV交联到蒸发表面内的双功能接头上(图1D)。该过程由胸腺嘧啶核苷碱基的众所周知的光化学反应性介导，该反应导致在DNA中与其他胸腺嘧啶核苷碱基形成共价键或与蛋白质和碳水化合物发生光化学反应。如果双功能交联剂是OligodT，则交联反应将是双向的，即，光化学可以在核酸探针或双功能OligodT接头中引发。另一方面，如果双功能接头是其中包含赖氨酸或组氨酸的氨基多糖(如壳聚糖或聚氨基酸)，则光化学将在核酸探针中引发，双功能接头是光化学的目标。

具有未改性的固体支持物的微阵列系统，用于非共价连接

在该微阵列系统中，核酸探针的连接不会直接发生在下层表面，而是通过相对较长的双功能聚合物接头介导，该接头与固体支持物非共价地结合，但通过紫外线引发的交联与核酸探针共价地结合。该过程的机制是自发的3D自组装，并在图2A-2D中进行说明。如图2A所示，制造此微阵列系统所需的组分是：

(1)未改性的核酸探针3，例如寡核苷酸、PCR或等温扩增子、质粒或基因组DNA；

(2)未改性的固体支持物1

(3)双功能聚合物接头2，例如OligodT或氨基多糖、氨基多肽，它们固有地具有或被改性为具有与固体支持物的吸附性结合相容的官能团(称为“R”)，每个均具有荧光标记4；和

(4)包含水和高沸点的水溶性液体(例如甘油、DMSO或丙二醇)的溶剂(水与溶剂的比例在10:1至100:1之间)。

表2.双功能聚合物接头与惰性表面的非共价连接

表2示出了双功能聚合物接头上未改性的支持物表面和匹配的吸收性基团的实施例，仅出于说明目的，并不以任何方式排除使用它们的其他组合。

当用于本发明中时，，通过用于产生DNA杂交测试的常规制造方法，例如接触印刷、压电印刷、喷墨印刷或移液，将包括组分1-3的溶液施加到固体支持物表面上。

微阵列制造开始于将组分(1)-(3)的混合物施加到表面上。第一步是将双功能接头吸附到支持物表面上(图2B)。设定双功能接头的浓度，使得双功能接头分子之间的平均距离定义了一间距，该间距表示为晶格宽度(图2B中的“LW”)。

在第二步中，将溶剂中的水蒸发，以通过蒸发溶剂中的水来浓缩DNA和双功能接头(图2C)。通常地，在基体制造过程中使用纯水作为溶剂是不利的，因为由于高的表面积/体积比，水通过蒸发被快速去除。为了克服该问题，在本发明中，将水与高沸点的水溶性溶剂(例如甘油、DMSO或丙二醇)的混合物用作溶剂。在这种情况下，蒸发时，水成分将蒸发，而高沸点溶剂则不会蒸发。结果，随着蒸发的进行水逐渐失去，分子反应物—DNA和双功能接头逐渐浓缩。在本发明中，水与高沸点溶剂的比例保持在10:1至100:1之间。因此，在两种极端情况下，平衡时，由于水的蒸发，液相的体积将减少到原始体积的1/100至1/10之间，从而使反应物增加100倍至10倍浓度。

在第三步中，将核酸探针中的末端胸腺嘧啶核苷碱基进行UV交联到蒸发表面内的双功能接头上(图2D)。该过程由胸腺嘧啶核苷碱基的众所周知的光化学反应性介导，该反应导致在DNA中与其他胸腺嘧啶核苷碱基形成共价键或与蛋白质和碳水化合物发生光化学反应。如果双功能交联剂是OligodT，则交联反应将是双向的，即，光化学可以在核酸探针或双功能OligodT接头中引发。另一方面，如果双功能接头是其中包含赖氨酸或组氨酸的氨基多糖(如壳聚糖或聚氨基酸)，则光化学将在核酸探针中引发，双功能接头是光化学的目标。

尽管第一步中描述的这种非共价吸附通常很弱且是可逆的，但是当单独发生时，在本发明中，其教导了，如果在双功能聚合物接头与下层表面之间紧密地发生许多这样的弱吸附事件，并且如果紧密结合的聚合物接头随后通过胸腺嘧啶核苷介导的光化学交联而彼此连接，则新产生的延伸的、多分子(交联的)复合物将在表面上进一步稳定，从而在没有直接共价结合到该表面的情况下，可与该表面形成稳定的复合物。

本发明有效地用于合成寡核苷酸作为核酸探针的连接，以形成用于分析微生物DNA靶标的基于微阵列的杂交装置。然而，很清楚地，可以使用同一发明来连接PCR扩增子、合成的寡核苷酸、等温扩增产物、质粒DNA或基因组DNA片段，作为核酸探针。同样清楚的是，可以使用相同的技术来制造非微阵列的杂交设备。

如表3中所述配制DNA核酸探针，如上所述和图1或图2所示进行部署。设计了一组48个此类探针(表4)，这些探针对微生物DNA的各种序列决定子具有特异性，并且制造每种探针使得在每个末端均具有5-7个T碱基的串，以促进它们的UV交联形成共价地连接的微阵列元件，如上文所述且如图1所示。48个不同探针中的每个均一式三份进行印刷，以形成具有表3所示序列的144个元素(12x 12)的微阵列。

表3.使用本发明的代表性条件

表4.通过本发明连接到微阵列表面的核酸探针

如表3所述，配制表4的48个不同探针组，然后使用带有Arrayit SMP针的GenticsQ-Array微型接触式打印机，将其打印到环氧硅烷涂覆的硼硅酸盐玻璃上，每个点沉积约1nL的制剂。如图1所示，如此打印的阵列然后允许在室温下与环氧硅烷表面反应，然后在室温下蒸发以除去游离水。蒸发步骤完成后(通常为一整夜)，然后在

辐射系统中对空气干燥的微阵列进行UV处理：以254nm辐射300毫焦耳，以引发胸腺嘧啶核苷介导的交联。然后即可使用微阵列，而无需额外清洗或加盖。

实施例2

使用三维晶格微阵列系统进行DNA分析

样品处理

从植物表面采集病原体包括以下步骤：

1.在1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)中清洗植物样品或撕拉胶带

2.去除植物材料/胶带

3.离心沉淀细胞并弃去上清液

4.重悬于与样品消化缓冲液预混合的

样品制备缓冲液(Sample PrepBuffer)中

5.在55℃下加热45分钟

6.涡旋以分散沉淀

7.在95℃下加热15分钟

8.在PCR使用之前，简略地涡旋和离心

PCR扩增

用于扩增和杂交分析的样品来自获许可的大麻实验室的大麻花洗涤液。然后将洗涤过的花材料通过离心沉淀。然后将沉淀用蛋白酶K消化，然后在PCR扩增之前掺入已知量的沙门氏菌DNA。

表5.扩增中使用的PCR引物和PCR条件

然后在串联PCR反应中用对的肠杆菌科16s区域具有特异性的PCR引物(P1-表5)扩增沙门氏菌DNA加标样品，以首先分离靶标区域(PCR反应#1)和PCR引物(P1-表5)，其扩增了用作阳性对照的大麻DNA片段(ITS)。

然后将PCR反应#1的产物(1μL)进行第二PCR反应(PCR反应#2)，其用绿色CY3荧光标记的引物另外扩增和标记两个靶标区域(16s，ITS)(P2-表5)。然后用杂交缓冲液(4x SSC+5x Denhardt溶液)将PCR反应#2的产物(50μL)稀释1-1，然后直接应用于微阵列进行杂交。

杂交

因为微阵列制造的现有技术方法允许通过杂交分析DNA，而无需对微阵列进行预处理在表面上，微阵列的使用非常简单，涉及6个手动或自动移液步骤。

1)用移液管将扩增的DNA+结合缓冲液吸取到微阵列上

2)孵育30分钟，以使DNA与微阵列结合(通常地在室温下，RT)

3)通过移液管吸取除去DNA+结合缓冲液

4)用移液管吸取50μL洗涤缓冲液(0.4x SSC+0.5x Denhardt)到微阵列上，并在室温下孵育5分钟。

5)通过移液管吸取除去洗涤缓冲液

6)重复步骤4和5

7)在532nm和635nm处进行图像分析，以检测探针斑点位置(532nm)和PCR产物杂交(635nm)。

图像分析

在基于光栅的共聚焦扫描仪上的两处波长(532nm和635nm)上进行图像分析：GenePix4000B微阵列扫描仪，具有以下成像条件：33％的激光功率，532nm处设置400PMT/33％的激光功率，635nm处设置700PMT。图3示出了微阵列的结构和杂交性能的实施例。

图3A示出了杂交和洗涤后，在635nm处观察到的上述代表性微阵列的图像。635nm处图像源自与双功能聚合物接头OligodT 5'末端连接的(红色)CY5荧光的信号，其是在微阵列制造过程中，作为每个微阵列点中的位置标记引入的(参见图1和表3)。图3A中的数据证实了，通过双功能接头的结合活性和随后的UV交联，Cy5标记的OligodT已经永久地连接到微阵列表面，如图1所示。

图3B示出了杂交和洗涤后，在532nm处观察到的上述代表性微阵列的图像。532nm处图像源自与在PCR反应#2中获得的PCR扩增DNA的5'末端连接的(绿色)CY3荧光的信号。从图3B可清楚地看见，在48个离散探针中，只有一小部分与Cy3标记的PCR产物结合，因此证实了本发明的连接核酸探针形成微阵列的方法(图1)产生了能够与(同源)溶液状态的靶标特异性结合的序列。图3B中的数据示出了数据的潜在3倍重复(即，该阵列是一组相同的48个探针，被打印为3个不同的子阵列，进行了3次打印，形成了最终的48x3＝144个元素的微阵列。观察到同一组48个探针可以打印3次，这是因为三个重复的子区域示出本发明产生了可重复的微阵列产物。

图3C示出了杂交和洗涤后，在532nm和635nm处图像叠加观察到的上述代表性微阵列的成像。叠加的图像示出了相对于CY3标记的PCR产物的序列特异性结合，Cy5标记的OligodT位置标记平行连接的效用。

实施例3

扩增、杂交和微阵列分析

图4A示出了第一PCR步骤的实施例。按照标准，这种PCR反应通过施用PCR引物来引发。引物定义了基于PCR的DNA扩增反应的起点和终点。在该实施方案中，利用PCR反应对来支持所需的DNA扩增。通常地，这种PCR扩增是连续进行的：第一PCR对，在图4A中后缀“P1”用于扩增大约1μL的任何未纯化的DNA样品，例如原始大麻叶洗涤液。将大约1μL的该第一PCR反应产物用作第二PCR反应的底物，用于将荧光染料标记附着到DNA，因此当该标记通过杂交与微阵列结合时，该标记可用于检测PCR产物。第一和第二PCR的引物序列在表6中示出。此两步反应的作用是避免需要纯化待分析的病原体DNA。将带有引物“P1”的第一PCR反应优化，以适应原料，同时将第二PCR引物对“P2”优化，以获得最大的DNA产量，以及从第一反应的产物中进行染料标记。总体而言，这两个反应的总和，不需要纯化或表征标标病原体DNA。

图4A以低分辨率示出了在实施方案中扩增的16s rDNA结构域，以分离和扩增随后可通过杂交询问(interogate)的结构域。已知该16s rDNA结构域的DNA序列在不同细菌物种之间差异很大。因此，已经通过两步PCR扩增了该区域，随后的微阵列杂交步骤可以询问该序列变异。

表6：第一和第二PCR引物

图4B示出了stx1基因位点，其存在于大肠杆菌的最重要的致病性菌株中并编码志贺毒素(Shigatoxin)1。采用相同的两步PCR方法设计了一组两个PCR引物对，其可以串联使用以扩增并标记未处理的细菌样品，从而呈现stx1基因位点，通过基于微阵列的DNA杂交进行分析。

图5A示出了stx2基因位点，其也存在于大肠杆菌的最重要的致病性菌株中并编码志贺毒素2。采用相同的两步PCR方法设计了一组两个PCR引物对，其可以串联使用以扩增并标记未处理的细菌样品，从而呈现stx2基因位点，通过基于微阵列的DNA杂交进行分析。

图5B示出了invA基因位点，其存在于沙门氏菌的所有菌株中并编码InvAsion A基因产物。采用相同的两步PCR方法设计了一组两个PCR引物对，其可以串联使用以扩增并标记未处理的细菌样品，从而呈现invA基因位点，通过基于微阵列的DNA杂交进行分析。

图6示出了tuf基因基因位点，其存在于大肠杆菌的所有菌株中并编码核糖体延伸因子Tu。采用相同的两步PCR方法，设计了一组两个PCR引物对，其可以串联使用，以扩增并标记未处理的细菌样品，从而呈现tuf基因位点，通过基于微阵列的DNA杂交进行分析。

图7示出了ITS2基因位点，其存在于所有真核生物中(包括所有酵母和霉菌菌株)并编码核糖体基因5.8S和28S之间的基因间区域。ITS2的序列高度地可变，该序列变异可用于解决酵母和霉菌中的菌株差异。采用相同的两步PCR方法设计了一组两个PCR引物对，其可以串联使用以扩增并标记未处理的酵母和霉菌样品，从而呈现ITS2基因座，通过基于微阵列的DNA杂交进行分析。

图8示出了ITS1基因位点，其存在于所有真核生物中(包括所有植物和动物)并编码核糖体基因18S和5.8S之间的基因间区域。ITS1在高等植物中的序列差异很大，该序列变异可用于识别植物种类。采用相同的两步PCR方法设计了一组两个PCR引物对，其可以串联使用以扩增和标记未处理的大麻样品，从而呈现ITS1基因位点，通过基于微阵列的DNA杂交进行分析。ITS1的大麻序列变体的识别和定量用作内部标准化标准，用于分析从相同大麻样品中回收的病原体。

表7示出了代表性的寡核苷酸序列，其在实施方案中用作微阵列探针，用于如图4所示的基于DNA微阵列的细菌16s基因位点分析。已经改变这些探针的序列以适应作为细菌之间物种差异的函数的同源序列的变化。在所有情况下，在每端，探针序列均以一串T终止，以提高探针与微阵列表面的连接的有效性。表8示出了微阵列中使用的校准和阴性对照的序列。

表9示出了代表性的寡核苷酸序列，其在实施方案中用作微阵列探针，用于基于DNA微阵列的ITS2基因位点的真核病原体(真菌、酵母和霉菌)分析，如图7所示。将表8所示的序列用作对照。已经改变这些探针的序列以适应作为真菌、酵母和霉菌之间物种差异的函数的同源序列的变化。在所有情况下，在每端，探针序列均以一串T终止，以提高在微阵列制造时探针与微阵列表面的连接的有效性。

表7. 16s基因位点的寡核苷酸探针序列

表8.校准和阴性对照

SEQ ID NO:129	成像仪校准(高)	TTTTTTCTTTCCAGGTACAACAGCTTTTTT
			SEQ ID NO:130	成像仪校准(低)	TTTTTTGCACTGTCTGAAACTGCCTTTTTT
SEQ ID NO:131	成像仪校准(中)	TTTTTTCCATCAAAGTTGGTGAAGAATCTTTTTT
			SEQ ID NO:132	阴性对照	TTTTTTTATTGATGCCGATTTGAAGGCCTTTTTT

表9.ITS2基因位点的寡核苷酸探针序列

表10示出了代表性的寡核苷酸序列，其在ITS1基因位点(大麻属)的基于DNA微阵列的大麻分析的实施方案中用作微阵列探针。

表10.大麻ITS1基因位点的寡核苷酸探针序列

表11示出了代表性的寡核苷酸序列，其在细菌病原体(stx1、stx2、invA、tuf)的基于DNA微阵列的分析和ITS1基因位点(大麻属)上存在的宿主大麻的DNA分析的实施方案中用作微阵列探针。应当注意的是，对ITS1序列进行改性的相同方法可用于分析此类提取物中其他植物宿主的存在。

表11.代表性的微阵列探针设计：细菌毒素，ITS1(大麻)

图9示出了描述如何用实施方案分析大麻或相关植物样品的细菌病原体或酵母菌和霉菌补体的流程图。可以通过通过胶带撕拉表面结合的病原体或简单清洗叶或芽或茎从大麻植物材料中采集病原体样品，然后进行单次多重“基因位点增强”多重PCR反应，然后再进行单次多重“标记PCR”。与用于分析真菌、酵母和霉菌的两步PCR反应对相比，采用不同的两步PCR反应对用分析细菌。在所有情况下，将靶标细菌或真菌、酵母和霉菌的DNA进行PCR扩增，而无需在两步PCR之前提取或识别DNA。在基因位点增强和标记PCR步骤之后，将所得PCR产物简单地稀释到结合缓冲液中，然后应用于微阵列测试。在实验室环境温度下进行分析(杂交和洗涤)所需的后续微阵列步骤。

图10提供了在实施方案中使用的微阵列的代表性应用的图像。在此实施方案中，将细菌分析所需的所有核酸探针和大麻DNA对照(表7和10)与其他细菌和大麻探针(如表10中的那些)一起制成单次144元素(12x12)微阵列。在此实施方案中，将真菌、酵母和霉菌分析所需的所有核酸探针和大麻DNA对照与表9中所示的其他真菌探针一起制成单次144元素(12x12)微阵列。在PTFE涂层的载玻片上将阵列制成两列6个相同的微阵列。根据所用的核酸探针，12种相同的微阵列中的每种均能执行完整的基于微阵列分析的细菌分析或完整的基于微阵列的真菌、酵母和霉菌分析。核酸探针通过微流体打印(基于压电或基于接触的或其等价物)连接到玻璃支持物上。在这种情况下，通过疏水性PTFE涂层，，可以将各个微阵列与其他11个微阵列流体隔离，但是也可以采用其他物理隔离方法。

图11A-11B示出了实施方案的代表性DNA微阵列分析。在这种情况下，在两步PCR反应和基于微阵列的杂交分析之后，使用了纯化的细菌DNA或纯化的真菌DNA来测试亲和力和特异性。可以看出，设计用于检测每个细菌DNA(顶部)或真菌DNA(底部)的核酸探针已经通过杂交正确地结合到靶标DNA，从而正确地检测出细菌或酵母菌。图12示出了实施方案的代表性DNA微阵列分析。在这种情况下，在两步PCR反应和基于微阵列的杂交分析之后，使用5种不同的未纯化的原始大麻叶洗涤样品来测试亲和力和特异性。通过将每个样品分成两半，然后分别处理它们以进行细菌分析或进行真菌、酵母和霉菌分析，对所有5种叶子洗涤样品进行了细菌和真菌分析。通过结合两种测试的结果获得图12的数据。图12示出了两步PCR和微阵列杂交分析的结合(如图9所示)可用于分析常规大麻叶洗涤液的病原体补体。可以预期(但未示出)可以类似地进行任何植物材料的这种洗涤。

图13示出了实施方案的代表性DNA微阵列分析。在这种情况下，使用了一种未纯化的(原始)大麻叶洗涤样品并将其与从商业获得的活念珠菌的均质酵母体外培养物中获得的数据进行了比较，以在两步PCR反应和基于微阵列的杂交分析之后测试亲和力和特异性。大麻叶洗涤液和培养真菌的分析，均通过将其加工成真菌特异性探针进行分析(见表9和11)。

图13的数据通过结合叶子洗涤液和酵母菌培养物样品的分析结果获得。图13的数据示出了两步PCR和微阵列杂交分析的结合(如图9所示)可用于询问常规大麻叶洗涤液的真菌补体，就象对纯(活)真菌样品所做的一样。可以预期通过这样的任何植物材料的洗涤，可以类似地进行真菌分析。

图14示出了在实施方案的变体中，用于低水平检测肠杆菌科(包括大肠杆菌)中的细菌的PCR引物的位置的图示。使用这些PCR引物选择性扩增和染色来自靶标生物的标记DNA，以通过微阵列杂交进行分析。

图15A-15C示出了代表性DNA微阵列分析，其证明了在一定范围的微生物输入上的测试敏感性。在这种情况下，将由大肠杆菌O157：H7、大肠杆菌O111(图15A-15B)和肠道沙门氏菌(图15C)的计数细菌菌落组成的认证参考材料作为稀释系列，加标到蛇麻草植物替代基质上，然后使用针对图14所述的分析方式进行处理。示出了来自图7的相关探针的杂交结果。x轴上的较大数字表示加标到每种蛇麻草植物样品上的细菌菌落形成单位(CFU)的总数，而x轴上的较小数字表示实际输入到测试中的加标物质的CFU数。实际上仅分析了原始加标蛇麻草样品体积的约1/50。在图15A-15C的x轴上的较小数字恰好是总(较低)值的1/50。可以看到，图15A-15C示出了实施方案的微阵列测试可以在每个微阵列测试中检测到少于1个CFU。在图15A-15C中示出的细菌基因组内的核酸靶标包含16s rDNA。在这些细菌生物体中的每个中都有16s rDNA基因的多个拷贝，可在<1CFU水平下进行检测。由于在许多情况下，菌落形成单位接近单个细菌，因此图15A-15C的数据表明，本发明的微阵列测定法的敏感性接近每次测定法检测单个(或少量)细菌的能力。由于已知所有细菌和真核微生物的每个细胞都呈现多个拷贝的核糖体rDNA基因，因此预期它们具有相似的敏感性。

表12A和12B示出了从没有富集(enrichment)和富集18小时的粉末状干食品样品中获得的代表性微阵列杂交数据的集合，以进行比较。数据表明，不需要富集，就可以在本发明的微阵列上成功检测出细菌微生物。

图16和表13-15描述了用于分析水果的实施方案、用于分析蔬菜的实施方案和用于分析其他植物物质的实施方案。以上教导示出，例如，可以在水溶液中洗涤大麻和蛇麻草中未处理的叶和芽样品，以产生含有微生物病原体的水洗涤液，然后可以通过本发明的RSG和微阵列的组合对其进行分析。

如果也以相同的方式(当新鲜时，或经过干燥、研磨或其他类型或处理后)在水溶液中洗涤水果和蔬菜的新鲜叶、花、茎或根材料，则本发明的RSG和微阵列分析的组合将能够回收和分析其他植物材料中的这些微生物的DNA补体。

对于水果和蔬菜，至少有两种采样方法是可行的。一种方法是简单冲洗水果，就像上面针对大麻所述的那样。从水果和蔬菜中采集样品的另一种方法是“撕拉胶带”，其中将一条标准的法医胶带(forensic tape)贴在水果表面上，然后拉下。拉下后，将胶带浸入上述标准洗涤缓冲液中，以使连接在胶带上的微生物悬浮。在洗涤胶带步骤之后，处理和分析的所有其他方面(即原始样品基因分型、PCR，然后进行微阵列分析)完全如上所述。

表12A从粉末干食品样品中获得的代表性微阵列数据。

表12B从粉末干食品样品获得的代表性微阵列数据

表13-15的数据表明，对水果的简单洗涤和对水果的撕拉胶带彩样，产生了相似的微生物数据。如所预期的那样，蓝莓样品显示出对葡萄孢属呈阳性，因为葡萄孢属是蓝莓上众所周知的真菌污染物。正如预期的那样，柠檬样品显示出对青霉菌呈阳性，因为青霉菌是柠檬的众所周知的真菌污染物。

表13.从蓝莓和柠檬洗涤液中获得的代表性微阵列杂交数据。

表14.从蓝莓洗涤液和撕拉胶带法获得的代表性微阵列杂交数据

在图16和表13-15中呈现的数据证明了实施方案的用途，即用于回收和分析水果(在这种情况下为蓝莓和柠檬)表面上的酵母微生物，但是可以将实施方案扩展到其他水果和蔬菜用于分析细菌和真菌污染。

表15.从柠檬洗涤液和撕拉胶带法获得的代表性微阵列杂交数据

表16示出了用于分析环境水样品/样品的实施方案。上述教导通过实施例，示出了可以在水溶液中洗涤大麻和蛇麻草中未经处理的叶和芽样品，从而产生含有微生物病原体的水洗涤液，然后可以通过本发明的原始样品基因分型(RSG)和微阵列的组合来进行分析。如果从环境源(例如井水、海水、土壤径流或社区供水中的水)中获取含有微生物的水样，然后直接进行分析，或者过滤普通水后将微生物补体浓缩在过滤器表面，则本发明的RSG和微阵列分析的组合能够回收和分析这些微生物的DNA补体。

表16中呈现的数据是从5种井水样品(命名为2H、9D、21、23、25)以及2种MilliQ实验室水样品(通过反渗透获得)获得的，这些样品被称为“阴性对照”。将所有样品在无菌的0.4μm过滤器上过滤。过滤后，然后用标准洗涤液洗涤过滤器及其可能捕获的任何微生物污染物，完全与上述大麻和水果的洗涤相同。洗涤后，将洗涤液中的悬浮微生物进行完全相同的离心分离(产生微生物沉淀)，然后对未处理的沉淀裂解物进行裂解和PCR(与上述大麻完全相同)，然后进行PCR和微阵列分析，也如大麻所描述的。

表16.来自原水滤液的代表性微阵列数据

表16续来自原水滤液的代表性微阵列数据

表16中示出的数据表明，可以通过原始样品基因分型，然后用于大麻和水果清洗的PCR和微阵列分析的相同组合，来分析从环境水样品的滤液中收集的微生物。表16的斜体元素表明，5种未处理的井水样品均包含需氧菌和耐胆汁酸革兰氏阴性菌。对于未处理的(原始)井水，预期会存在两种细菌。因此，表16的数据证明本发明的该实施方案可用于分析环境衍生的水样品。

上述教导表明，可以在水溶液中洗涤大麻和蛇麻草中未处理的叶和芽样品，以产生含有微生物病原体的水洗涤液，然后可以通过本发明的RSG和微阵列的组合对其进行分析。上述数据还表明，可以通过实施方案来分析环境衍生的井水样品。进一步的，如果从工业处理源(如处理水果、蔬菜、谷物、肉类的废水)中获得含有微生物的水样品，然后直接进行分析，或者过滤普通水后将微生物补体浓缩在过滤器表面，则本发明的RSG和微阵列分析的组合能够回收和分析这些微生物的DNA补体。

此外，如果通过将空气过滤到普通空气过滤器上(例如用于农业或食品处理厂，或工厂车间，或公共建筑或私人住宅中的空气过滤)而获得含有作为气溶胶或吸附至浮尘的微生物的空气样品，从而这样的空气过滤器然后可以用水溶液清洗(如植物物质所示范)，产生含微生物的滤出液，这样，本发明的原始样品基因分型(RSG)和微阵列分析的组合能够回收和分析那些微生物的DNA补体。

尽管前面对实施例的书面描述使本领域普通技术人员能够制作和使用当前被认为是其最佳模式的内容，但是本领域普通技术人员将通晓并理解特定实施例、方法和实施例的变体、组合和等价物的存在。因此，本发明不应限定于上述实施方案、方法和实施例，而应限定于本发明的范围和精神内的所有实施方案和方法。

实施例4

使用三维晶格微阵列系统进行定量DNA分析的方法

样品处理

从植物表面采集微生物包括以下步骤：

1.在1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)中清洗植物样品或撕拉胶带

2.去除植物材料/胶带

3.离心沉淀细胞并弃去上清液

4.重悬于与样品消化缓冲液预混合的

样品制备缓冲液中

5.在55℃下加热45分钟

6.涡旋以分散沉淀

7.在95℃下加热15分钟

8.简略地涡旋和离心，以获得包含来自一种或多种微生物的DNA的样品。

向处理后的样品中添加合成的DNA

将已知量(已知拷贝数)的合成的DNA添加到上述样品处理步骤中获得的样品中。合成的DNA的长度和序列结构与被扩增的16s(细菌)或ITS2(真核生物)DNA序列的长度和序列结构相似，但具有的中央结构域序列是不同的，以将其与样品中的细菌和真核DNA区别开。将合成的DNA的5'和3'末端序列，设计为与要查询的未知细菌或未知真核DNA中的共有序列基本相同，从而允许使用用于扩增样品中未知DNA的同一对PCR引物进行扩增。此类共有序列的实例在SEQ ID NO：152和SEQ ID NO：153(表17)中示出。这些特征允许样品中合成的DNA和未知微生物库DNA的无偏扩增。合成的DNA序列的实例在SEQ ID NO：154至SEQ IDNO：157(表17)中示出。

PCR扩增

使用基因位点特异性引物对(表6和18)扩增包含合成的DNA序列的样品(PCR反应#1)。然后使用标记引物对(表6和表18)对PCR反应#1的产物(1μL)进行第二PCR反应(PCR反应#2)，其还扩增并标记了两个靶标结构域，以生成标记的荧光团扩增子。然后用杂交缓冲液(4x SSC+5x Denhardt溶液)将PCR反应#2的产物(50μL)稀释1-1，然后直接用于微阵列进行杂交。

杂交

因为微阵列制造的现有技术方法允许通过杂交来分析DNA，而不需要对微阵列表面进行预处理，所以微阵列的使用很简单，并且涉及6个手动或自动移液步骤。

1)用移液管将扩增的DNA+结合缓冲液吸取到微阵列上，该微阵列上已固定了待查询的病原体基因的寡核苷酸探针序列和用作内部参考标准的合成的DNA(表7-11和19)。

2)孵育30分钟，使DNA与微阵列结合(通常在室温，RT)。

3)通过移液管吸取除去DNA+结合缓冲液。

4)用移液管吸取50μL的洗涤缓冲液(0.4x SSC+0.5x Denhardt)到微阵列上，并在RT下孵育5分钟。

5)通过移液管吸取除去洗涤缓冲液。

6)重复步骤4和5。

表17.共有序列和合成的DNA序列

表18：用于基因位点的PCR和标记PCR扩增反应的引物

表19.寡核苷酸探针序列

图像分析

图3A示出了杂交和洗涤后，在635nm处观察到的上述代表性微阵列的图像。635nm处的图像源自与双功能聚合物接头OligodT 5'末端连接的(红色)CY5荧光的信号，其是在微阵列制造期间作为每个微阵列点中的位置标记引入(参见图1和表3)。图3A中的数据证实了，通过双功能接头的结合活性和随后的UV交联，Cy5标记的OligodT已经永久地连接到微阵列表面，如图1所示。

图3C示出了在杂交和洗涤后，在532nm和635nm处图像叠加观察到的上述代表性微阵列的图像。叠加的图像示出了相对于CY3标记的PCR产物的序列特异性结合，Cy5标记的OligodT位置标记平行连接的效用。

实施例5

绝对DNA拷贝数的定量

通过在第一PCR扩增步骤之前将合成的DNA的已知拷贝数引入样品中，来实现本发明中公开的样品中的靶标微生物的绝对DNA拷贝数的定量。合成的DNA的长度和序列结构类似于在第一PCR中产生的16s(细菌)或ITS2(真核生物)DNA扩增子的长度和序列结构(图17A、17B和18)，但具有不同的中央结构域的序列，使其与样品中的细菌和真核DNA区别开来。将合成的DNA的5'和3'末端序列设计成与待查询的未知细菌或未知真核DNA中的共有序列基本相同，从而允许使用用于扩增样品中未知DNA的同一对PCR引物进行扩增。这些特征使得合成的DNA能够被用于扩增待查询的未知微生物的高变结构域的同一对PCR引物扩增。结果，就第一和第二PCR扩增反应期间的引物/模板杂交而言，合成的DNA与样品中的微生物库DNA没有区别。这确保了合成的(内部参考标准品)和微生物(未知)DNA的无偏扩增，从而使来自所查询DNA和合成的DNA的扩增子的信号强度分别与每个DNA的原始拷贝数成正比(如下所述)。此类共有序列的实例在SEQ ID NO：152和SEQ ID NO：153(表17)中示出。合成的DNA序列的实例在SEQ ID NO：154至SEQ ID NO：157(表17)中示出。

如本发明的基于微阵列的分析中所部署的，PCR通常地作为端点PCR进行。尽管最简单地将聚合酶链式反应(PCR)描述为一种链式反应，因为在PCR反应过程的开始，当DNA靶标链极度稀释时，PCR的每个循环通常会导致产物DNA的几何的增加，对于每个新的PCR热循环，扩增的DNA产物几乎增加了2倍。如果无限地发生这种2倍增加，则理论上扩增的DNA产物的浓度应指数地增加至无穷大。然而，实际上，这种无限的DNA产物不会增加，并且观察到众所周知的“S形”PCR反应曲线，其中PCR反应混合物的一种或多种组分，或PCR产物混合物的一种或多种组分导致扩增子产量饱和。通常认为，由于反应混合物中PCR引物的消耗，出现了这种“变平(leveled-off)”的S形PCR曲线。因此，在本发明中，有意地将两个PCR反应中(第一，基因位点PCR和第二，标记PCR，参见图17A-17B和18)的PCR引物的浓度保持在大的摩尔过量，因此引物的消耗不能促进PCR扩增的饱和。但是，即使PCR反应物过量，也观察到从两个PCR产生的扩增子继续“变平”以产生复杂的“端点”PCR，其中尽管反应物的浓度增加，但扩增子的数量将不再增加。由于酶促终产物抑制，因此发生这种饱和反应。在本发明中，这种抑制能够产生大量的PCR产物，从而确保微阵列杂交保持高选择性并对样品中的低微生物密度敏感。

因此，本发明的关键是基于上述合成的DNA内部参考标准的部署，从而即使PCR反应通过终产物抑制(或PCR水平的任何其他机制)而饱和，也可以将来自未知数量微生物来源的任何DNA的相对丰度直接地与内部参考标准品的相对丰度进行比较，因此相对于已知合成的DNA(内部参考标准品)而言，未知DNA的丰度对PCR反应的程度变得不敏感。在理解本发明时利用以下效果，因为随着PCR反应接近饱和(与最终产物抑制相关)，各种扩增物种的数量开始相互作用，如下所述：

i)未知的DNA拷贝＝标准的DNA拷贝

当合成的DNA(标准的物种)的拷贝数等于原始样品中微生物DNA(未知的物种)的拷贝数时，从PCR反应开始(扩增为指数级)到PCR反应结束(通过终产物抑制，扩增开始饱和)时，微生物DNA与合成DNA的比例将等于1。

C_n/C_o＝S_n/S_o其中

C_n＝存在于原始样品混合物中的每种类型(n)的微生物DNA拷贝数，该样品混合物添加到用于制备微阵列分析的扩增子的两个串联PCR反应的第一个中，

C_o＝合成DNA的已知拷贝数(内部参考标准)，该合成的DNA添加到用于制备微阵列分析的扩增子的两个PCR反应的第一个中，

S_n＝PCR扩增，，和第n种微生物物种的微阵列杂交，然后进行图像分析后，获得的相对荧光单位(RFU)信号数据，

S_o＝PCR扩增，和合成DNA物种的微阵列杂交，然后进行图像分析后，获得的相对荧光单位(RFU)信号数据，

ii)未知的DNA拷贝>标准的DNA拷贝

当微生物DNA(未知的物种)大量超过已知合成的DNA(标准的物种)时，微生物DNA与合成的DNA的比例将>1。在这种情况下，在PCR反应开始时，扩增子(PCR产物)的相对丰度将真实地表示原始输入链比例(未知的：标准的)。但是，随着反应进行到饱和，较丰富的物种(在这种情况下为未知的物种)将首先达到最终产物饱和，这是由于一种或多种反应物的消耗，或由于PCR反应产物—焦磷酸盐和/或扩增子的酶抑制作用。结果，相对较少的标准的物种的扩增将受到抑制。在这种情况下，大量扩增的DNA产物物种将保留“未知的物种>标准的物种”的正确定性关系，而DNA产物的比例将不再与原始输入样品中的未知的：标准的比例呈线性相关。

C_n/C_o≠S_n/S_o

输入和响应之间的这种非线性关系在化学和物理分析中是公知的，例如化学薄膜或电荷耦合器件(CCD)中颗粒密度与光子曝光之间的关系，其中摄影输入的相对亮度在结果图像中按相对等级顺序保持，然而，需要从响应数据(类似于扩增和微阵列杂交后的PCR产物信号)来预测原始输入的相对丰度(类似于原始样品中的DNA拷贝数)才能对非线性响应有详细的了解。

iii)未知的DNA拷贝<标准的DNA拷贝

当微生物DNA(未知的物种)少于已知合成的DNA(标准的物种)时，微生物DNA与合成的DNA的比例将小于1。在这种情况下，在PCR反应开始时，扩增子(PCR产物)的相对丰度将真实地表示原始输入链比例(未知的：标准的)。但是，随着反应进行到饱和，较丰富的物种(在这种情况下为标准的物种)将首先达到最终产物饱和，这是由于一种或多种反应物的消耗，或由于PCR反应产物-焦磷酸盐和/或扩增子的酶抑制作用。结果，相对较少的未知的物种的扩增将受到抑制。在这种情况下，大量扩增的DNA产物物种将保留“未知的物种>标准的物种”的正确定性关系，而DNA产物的比例则不再与原始输入样品中的未知的：标准的比例呈线性相关；

C_n/C_o≠S_n/S_o

上述非线性关系类似于在化学和物理分析中观察到的非线性关系，例如化学薄膜或电荷耦合器件(CCD)中颗粒密度与光子曝光之间的关系，其中摄影输入的相对亮度在结果图像中按相对等级顺序保持，然而，需要从响应数据(类似于扩增和微阵列杂交后的PCR产物信号)来预测原始输入的相对丰度(类似于原始样品中的DNA拷贝数)才能对非线性响应有详细的了解。在本发明中，确定观察到的未知微生物DNA与标准DNA之间的竞争示出有用的且通常是出乎意料的“X形”关系，如图19A所示。

通过PCR-微阵列分析微生物DNA(rDNA或ITS2)拷贝数

图19A和19B所示的“交叉”滴定数据是本申请中描述的PCR-微阵列分析所固有的。随着靶标微生物DNA拷贝数的增加，在合成的DNA拷贝数保持不变的情况下，微生物PCR反应的产物和由于这些产物与微阵列表面上的同源探针结合而产生的信号将随着微生物DNA拷贝数的增加而增加，而从(固定的)匹配的内部参考标准获得的信号会一致下降(图19A-19B)。两条曲线在拷贝数当量或接近拷贝数当量时交叉(箭头，图19A-19B)，这时微生物DNA拷贝数变得等于内部参考标准DNA拷贝数。

在符合本发明的PCR条件的范围内(即，由于未知微生物DNA和添加的DNA标准品之间的竞争导致PCR信号饱和的条件)，DNA输入和输出之间的关系可以近似为：

C_n/C_o＝P(S_n/S_o)^x 公式#1，

其中，

X＝复杂的指数因子，其定义了实验微阵列数据比例(S_n/S_o)与原始样品中存在的微生物DNA拷贝与合成的DNA标准拷贝的潜在比例(C_n/C_o)之间的函数关系。

P＝常数，其将实验性微阵列数据比(S_n/S_o)与结合至微阵列的扩增PCR产物的浓度相关。通常地，对于此处呈现的实施例(图19A-19B)，P＝1。

通常地，X可以是线性函数或指数或相关的函数形式或常数，其本身是PCR参数和微阵列分析和成像条件的函数。基于本发明中所示的代表性数据，将X近似为常数，其值接近2。

表20来自图19A中的代表性PCR-微阵列验证研究的实验数据S_n/S_o作为实验拷贝数数据C_n/C_o的函数。

通常地，函数(X)将原始DNA拷贝数比例(C_n/C_o)与从微阵列杂交RFU信号数据生成的实验微阵列数据比(S_n/S_o)相关。函数(X)可以具有不同的函数形式，取决于PCR反应和微阵列杂交的细节。但是，已确定，如果(1)所有微生物DNA的PCR反应均使用与内部参考标准相同的PCR引物对；和(2)所有应用于微阵列表面的杂交探针对其通过PCR反应产生的同源DNA序列具有相同的亲和力；以及(3)所有PCR产物均标记有相同的荧光染料以进行光学检测；然后，X将接近一个常数，该常数在图19A所示的数据中假定为一个接近2的值。在这些条件下，公式#1可以简化为：

C_n＝C_o(S_n/S_o)² 公式#2

其中

C_n＝原始样品中存在的微生物DNA拷贝数。

C_o＝通过在原始样品中添加已知数量的合成的DNA标准拷贝进行调整。

X＝2，通过实验数据估算，如图19A所示。

P＝1，通过实验确定，如图19A所示。

对于图19A，合成的DNA参考标准拷贝数(C_o)被有意地保持为3,000，但是可以根据可能遇到的未知微生物拷贝的范围设置为，例如100、500、3,000或5,000。

在用于食品或大麻或其他植物基质中的微生物测试或水测试的本发明的具体实施中，州或联邦法规可能要求微生物污染的特定最小允许值。基于该调节值和对每个微生物基因组rDNA或ITS-2DNA拷贝数的了解，在PCR和微阵列杂交步骤之前添加到原始样品中的可调节标准拷贝数值C_o可以被视为具有价值，可以直接将调节标准物“拨号”到PCR微阵列测试中。

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<151> 2018-10-11

<150> US 15/916,036

<151> 2018-03-08

<150> US 15/916,036

<151> 2018-03-08

<160> 157

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增所有细菌中的16S rDNA HV3基因位点的正向引物

<400> 1

tttcacaytg gractgagac acg 23

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有细菌中的16S rDNA HV3基因位点的反向引物

<400> 2

tttgactacc agggtatcta atcctgt 27

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增致病性大肠杆菌中的Stx1基因位点的正向引物

<400> 3

tttataatct acggcttatt gttgaacg 28

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增致病性大肠杆菌中的Stx1基因位点的反向引物

<400> 4

tttggtatag ctactgtcac cagacaatg 29

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增致病性大肠杆菌中的Stx2基因位点的正向引物

<400> 5

tttgatgcat ccagagcagt tctgcg 26

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增致病性大肠杆菌中的Stx2基因位点的反向引物

<400> 6

tttgtgaggt ccacgtctcc cggcgtc 27

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有沙门氏菌中的InvA基因位点的正向引物

<400> 7

tttattatcg ccacgttcgg gcaattcg 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有沙门氏菌中的InvA基因位点的反向引物

<400> 8

tttcttcatc gcaccgtcaa aggaaccg 28

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有大肠杆菌中的tuf基因位点的正向引物

<400> 9

tttcagagtg ggaagcgaaa atcctg 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有大肠杆菌中的tuf基因位点的反向引物

<400> 10

tttacgccag tacaggtaga cttctg 26

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增肠杆菌科中的16S rDNA HV3基因位点的正向引物

<400> 11

ttaccttcgg gcctcttgcc atcrgatgtg 30

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增肠杆菌科中的16S rDNA HV3基因位点的反向引物

<400> 12

ttggaattct acccccctct acragactca agc 33

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有酵母和霉菌/真菌中的ITS2基因位点的正向引物

<400> 13

tttactttya acaayggatc tcttgg 26

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有酵母和霉菌/真菌中的ITS2基因位点的反向引物

<400> 14

tttcttttcc tccgcttatt gatatg 26

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增曲霉属中的ITS2基因位点的正向引物

<400> 15

tttaaaggca gcggcggcac cgcgtccg 28

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增曲霉属中的ITS2基因位点的反向引物

<400> 16

ttttcttttc ctccgcttat tgatatg 27

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增大麻/植物中的ITS1基因位点的正向引物

<400> 17

tttgcaacag cagaacgacc cgtga 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增大麻/植物中的ITS1基因位点的反向引物

<400> 18

tttcgataaa cacgcatctc gattg 25

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有细菌中的16S rDNA HV3基因位点的正向引物

<400> 19

tttactgaga cacggyccar actc 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有细菌中的16S rDNA HV3基因位点的反向引物

<400> 20

tttgtattac cgcggctgct ggca 24

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增致病性大肠杆菌中的Stx1基因位点的正向引物

<400> 21

tttatgtgac aggatttgtt aacaggac 28

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增致病性大肠杆菌中的Stx1基因位点的反向引物

<400> 22

tttctgtcac cagacaatgt aaccgctg 28

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增致病性大肠杆菌中的Stx2基因位点的正向引物

<400> 23

tttttgtcact gtcacagcag aag 24

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增致病性大肠杆菌中的Stx2基因位点的反向引物

<400> 24

tttgcgtcat cgtatacaca ggagc 25

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有沙门氏菌中的InvA基因位点的正向引物

<400> 25

ttttatcgtt attaccaaag gttcag 26

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有沙门氏菌中的InvA基因位点的反向引物

<400> 26

tttcctttcc agtacgcttc gccgttcg 28

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有大肠杆菌中的tuf基因位点的正向引物

<400> 27

tttgttgtta ccggtcgtgt agaac 25

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有大肠杆菌中的tuf基因位点的反向引物

<400> 28

tttcttctga gtctctttga taccaacg 28

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增肠杆菌科中的16S rDNA HV3基因位点的正向引物

<400> 29

ttatattgca caatgggcgc aagcctgatg 30

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增肠杆菌科中的16S rDNA HV3基因位点的反向引物

<400> 30

ttttgtatta ccgcggctgc tggca 25

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 31

tttgcatcga tgaagarcgy agc 23

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 32

tttcctccgc ttattgatat gc 22

<210> 33

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增曲霉属中的ITS2基因位点的正向引物

<400> 33

tttcctcgag cgtatggggc tttgtc 26

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增曲霉属中的ITS2基因位点的反向引物

<400> 34

tttttcctcc gcttattgat atgc 24

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增大麻植物中的ITS1基因位点的正向引物

<400> 35

tttcgtgaac acgttttaaa cagcttg 27

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增大麻/植物中的ITS1基因位点的反向引物

<400> 36

tttccaccgc acgagccacg cgat 24

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于高敏感性的总的需氧菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 37

tttttttttc ctacgggagg cagttttttt 30

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于中敏感性的总的需氧菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 38

ttttttttcc ctacgggagg catttttttt 30

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于低敏感性的总的需氧菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 39

tttattttcc ctacgggagg cttttatttt 30

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于低敏感性的肠杆菌科中的16S基因位点的探针序列

<400> 40

tttattctat tgacgttacc catttatttt 30

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于中敏感性的肠杆菌科中的16S基因位点的探针序列

<400> 41

ttttttctat tgacgttacc cgtttttttt 30

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于大肠杆菌和志贺氏菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 42

ttttctaata cctttgctca ttgactcttt 30

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于大肠杆菌和志贺氏菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 43

ttttttaagg gagtaaagtt aatatttttt 30

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于大肠杆菌和志贺氏菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 44

ttttctcctt tgctcattga cgttattttt 30

<210> 45

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于芽孢杆菌属第1组中的16S基因位点的探针序列

<400> 45

tttttcagtt gaataagctg gcactctttt 30

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于芽孢杆菌属第2组中的16S基因位点的探针序列

<400> 46

ttttttcaag taccgttcga atagtttttt 30

<210> 47

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于高敏感性的耐胆汁酸革兰氏阴性菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 47

tttttctatg cagtcatgct gtgtgtrtgt cttttt 36

<210> 48

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于中敏感性的耐胆汁酸革兰氏阴性菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 48

tttttctatg cagccatgct gtgtgtrttt tttt 34

<210> 49

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于低敏感性的耐胆汁酸革兰氏阴性菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 49

tttttctatg cagtcatgct gcgtgtrttt tttt 34

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于弯曲杆菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 50

ttttttatga cacttttcgg agctcttttt 30

<210> 51

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于色杆菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 51

ttttattttc ccgctggtta atacccttta tttt 34

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于柠檬杆菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 52

ttttttcctt agccattgac gttatttttt 30

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于梭菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 53

ttttctggam gataatgacg gtacagtttt 30

<210> 54

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于大肠菌和肠杆菌科中的16S基因位点的探针序列

<400> 54

ttttttctat tgacgttacc cgcttttttt 30

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于杀鲑气单胞菌亲水气单胞菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 55

tttttgccta atacgtrtca actgcttttt 30

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于气单胞菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 56

ttattttctg tgacgttact cgcttttatt 30

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于布兰汉氏菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 57

tttttaggct actgrtacta atatcttttt 30

<210> 58

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于短小芽孢杆菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 58

tttatttaag tgcragagta actgctattt tatt 34

<210> 59

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于细菌etuf基因的探针序列

<400> 59

ttttttccat caaagttggt gaagaatctt tttt 34

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于哈夫尼菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 60

ttttttctaa ccgcagtgat tgatcttttt 30

<210> 61

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于细菌InvA基因的探针序列

<400> 61

tttttttatt gatgccgatt tgaaggcctt tttt 34

<210> 62

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于产酸克雷伯菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 62

ttttttctaa ccttattcat tgatcttttt 30

<210> 63

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于肺炎克雷伯菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 63

ttttttctaa ccttggcgat tgatcttttt 30

<210> 64

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于军团菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 64

tttattctga taggttaaga gctgatcttt attt 34

<210> 65

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于李斯特菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 65

ttttctaagt actgttgtta gagaattttt 30

<210> 66

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于成团泛菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 66

ttttttaacc ctgtcgattg acgccttttt 30

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于斯氏泛菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 67

ttttttaacc tcatcaattg acgccttttt 30

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于铜绿假单胞菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 68

tttttgcagt aagttaatac cttgtctttt 30

<210> 69

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于大麻假单胞菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 69

tttttttacg tatctgtttt gactcttttt 30

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于假单胞菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 70

ttttttgttac cracagaata agcattttt 30

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于假单胞菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 71

ttttttaagc actttaagtt gggatttttt 30

<210> 72

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于假单胞菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 72

tttattttaa gcactttaag ttgggatttt attt 34

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于邦戈尔沙门氏菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 73

tttttttaat aaccttgttg attgtttttt 30

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于肠道沙门氏菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 74

tttttttgtt gtggttaata accgattttt 30

<210> 75

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于肠道沙门氏菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 75

tttttttaac cgcagcaatt gactcttttt 30

<210> 76

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于肠道沙门氏菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 76

ttttttctgt taataaccgc agcttttttt 30

<210> 77

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于沙雷氏菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 77

tttattctgt gaacttaata cgttcatttt tatt 34

<210> 78

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于金黄色葡萄球菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 78

tttattttca tatgtgtaag taactgtttt attt 34

<210> 79

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于金黄色葡萄球菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 79

ttttttcata tgtgtaagta actgtttttt 30

<210> 80

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于链霉菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 80

ttttatttta agaagcgaga gtgactttta tttt 34

<210> 81

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于细菌stx1基因的探针序列

<400> 81

ttttttcttt ccaggtacaa cagctttttt 30

<210> 82

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于细菌stx2基因的探针序列

<400> 82

ttttttgcac tgtctgaaac tgcctttttt 30

<210> 83

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于弧菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 83

ttttttgaag gtggttaagc taattttttt 30

<210> 84

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于黄单胞菌属中的16S基因位点的探针序列

<400> 84

ttttttgtta atacccgatt gttctttttt 30

<210> 85

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于鼠疫耶尔森菌中的16S基因位点的探针序列

<400> 85

tttttttgag tttaatacgc tcaacttttt 30

<210> 86

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于高敏感性的总的酵母和霉菌中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 86

ttttttttga atcatcgart ctttgaacgc attttttt 38

<210> 87

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于低敏感性的总的酵母和霉菌中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 87

ttttttttga atcatcgart ctcctttttt t 31

<210> 88

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于中敏感性的总的酵母和霉菌中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 88

ttttttttga atcatcgart ctttgaacgt tttttt 36

<210> 89

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于链格孢属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 89

ttttttcaaa ggtctagcat ccattaagtt tttt 34

<210> 90

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于黄曲霉中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 90

ttttttcgca aatcaatctt tttccagtct tttt 34

<210> 91

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于黄曲霉中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 91

tttttttctt gccgaacgca aatcaatctt tttttttttt 40

<210> 92

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于烟曲霉中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 92

tttcttttcg acacccaact ttatttcctt attt 34

<210> 93

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于烟曲霉中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 93

tttttttgcc agccgacacc cattcttttt 30

<210> 94

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于构巢曲霉中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 94

ttttttggcg tctccaacct tacccttttt 30

<210> 95

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于黑曲霉中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 95

ttttttcgac gttttccaac catttctttt 30

<210> 96

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于黑曲霉中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 96

ttttttttcg acgttttcca accatttctt tttt 34

<210> 97

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于黑曲霉中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 97

tttttttcgc cgacgttttc caattttttt 30

<210> 98

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于土曲霉中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 98

tttttcgacg catttatttg caaccctttt 30

<210> 99

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于布氏白粉属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 99

tttatttgcc aaaamtcctt aattgctctt tttt 34

<210> 100

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于葡萄孢属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 100

tttttttcat ctctcgttac aggttctcgg ttcttttttt 40

<210> 101

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于白色念珠菌中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 101

tttttttttg aaagacggta gtggtaagtt tttt 34

<210> 102

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于念珠菌属第1组中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 102

tttttttgtt tggtgttgag cratacgtat tttt 34

<210> 103

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于念珠菌属第2组中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 103

ttttactgtt tggtaatgag tgatactctc atttt 35

<210> 104

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于毛壳菌属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 104

tttcttttgg ttccggccgt taaaccattt tttt 34

<210> 105

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于枝孢属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 105

ttttttttgt ggaaactatt cgctaaagtt tttt 34

<210> 106

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于白粉菌属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 106

tttcttttta cgattctcgc gacagagttt tttt 34

<210> 107

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于尖孢镰刀菌中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 107

tttttttctc gttactggta atcgtcgttt tttt 34

<210> 108

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于镰刀菌科中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 108

ttttttttaa cacctcgcra ctggagattt tttt 34

<210> 109

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于高氏白粉菌属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 109

ttttttccgc ttgccaatca atccatctct tttt 34

<210> 110

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于荚膜组织胞浆菌中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 110

tttatttttg tcgagttccg gtgccctttt attt 34

<210> 111

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于棒束孢属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 111

tttatttttc cgcggcgacc tctgctcttt attt 34

<210> 112

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于单核菌属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 112

tttcttttga gcgacgacgg gcccaatttt cttt 34

<210> 113

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于毛霉菌属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 113

ttttctccaw tgagyacgcc tgtttctttt 30

<210> 114

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于漆斑菌属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 114

tttattttcg gtggccatgc cgttaaattt tatt 34

<210> 115

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于树粉孢属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 115

tttttttgcg tagtacatct ctcgctcatt tttt 34

<210> 116

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于草酸青霉中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 116

ttttttacac catcaatctt aaccaggcct tttt 34

<210> 117

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于青霉中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 117

ttttttcccc tcaatcttta accaggcctt tttt 34

<210> 118

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于青霉属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 118

ttttttcaac ccaaattttt atccaggcct tttt 34

<210> 119

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于茎点霉菌/附球菌属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 119

tttttttgca gtacatctcg cgctttgatt tttt 34

<210> 120

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于叉丝单囊壳菌中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 120

ttttttgacc tgccaaaacc cacataccat tttt 34

<210> 121

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于叉丝单囊壳菌中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 121

ttttttttag tcaygtatct cgcgacagtt tttt 34

<210> 122

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于腐霉中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 122

ttttatttaa aggagacaac accaattttt attt 34

<210> 123

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于红景天属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 123

ttttttctcg ttcgtaatgc attagcactt tttt 34

<210> 124

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于葡萄穗霉属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 124

tttcttctgc atcggagctc agcgcgtttt attt 34

<210> 125

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于木霉属中的ITS2基因位点的探针序列

<400> 125

tttttcctcc tgcgcagtag tttgcacatc tttt 34

<210> 126

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于大麻物种中的ITS1基因位点的探针序列

<400> 126

ttttttaatc tgcgccaagg aacaatattt tttt 34

<210> 127

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于大麻物种中的ITS1基因位点的探针序列

<400> 127

tttttgcaat ctgcgccaag gaacaatatt tttt 34

<210> 128

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于大麻物种中的ITS1基因位点的探针序列

<400> 128

tttatttctt gcgccaagga acaatatttt attt 34

<210> 129

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于高敏感性的图像校正的探针序列

<400> 129

ttttctatgt atcgatgttg agaaattttt tt 32

<210> 130

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于低敏感性的图像校正的探针序列

<400> 130

ttttctagat acttgtgtaa gtgaattttt tt 32

<210> 131

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于中敏感性的图像校正的探针序列

<400> 131

ttttctaagt catgttgttg aagaattttt tt 32

<210> 132

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于阴性对照的探针序列

<400> 132

ttttttctac tacctatgct gattcactct tttt 34

<210> 133

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于真菌和细菌中的正向通用前置扩增引物

<400> 133

ttcagcctct gtacgtgctt catg 24

<210> 134

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于真菌和细菌中的反向通用前置扩增引物

<400> 134

ttcagcctct gatcgtgctt ctag 24

<210> 135

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有真菌的正向RSG引物

<400> 135

tttactttca acaayggatc tcttgg 26

<210> 136

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有真菌的反向RSG引物

<400> 136

cttttcctcc gcttattgat atg 23

<210> 137

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有细菌的正向RSG引物

<400> 137

tttcacactg gractgagac acg 23

<210> 138

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有细菌的反向RSG引物

<400> 138

ttttgtatta ccgcggctgc tggc 24

<210> 139

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有真菌的正向引物

<400> 139

tttgcatcga tgaagaacgc agc 23

<210> 140

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有真菌的反向引物

<400> 140

ttttcctccg cttattgata tgc 23

<210> 141

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于扩增所有细菌的正向引物

<400> 141

tttcacactg gractgagac acgg 24

<210> 142

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于总的需氧细菌中的内部参考探针序列

<400> 142

tttttttttc catcgggagc gagttttttt 30

<210> 143

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于耐胆汁酸革兰氏阴性菌中的内部参考探针序列

<400> 143

tttttctatg tattcctgat gtagatrtgt cttttt 36

<210> 144

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于肠杆菌科和大肠菌中的内部参考探针序列

<400> 144

ttttttctct tgagcttacc ccgttttttt 30

<210> 145

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于总的酵母菌和霉菌中的内部参考探针序列

<400> 145

ttttttttgc atcatagaaa ctttgtacgc attttttt 38

<210> 146

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于高氏白粉菌属中的探针序列

<400> 146

tttatttaat caatccatca tctcaagtct tttt 34

<210> 147

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于李斯特菌属中的探针序列

<400> 147

tttattttga taagagtaac tgcttgcttt attt 34

<210> 148

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于毛霉菌属中的探针序列

<400> 148

ttttttctcc awtgagyacg cctgtttcag tatctttttt 40

<210> 149

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>用于酿酒酵母属中的探针序列

<400> 149

tttatcttag gcgaacaatg ttcttaaatc tttt 34

<210> 150

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于土曲霉中的探针序列

<400> 150

ttttttacgc atttatttgc aacttgcctt tttt 34

<210> 151

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于叉丝单囊壳属中的探针序列

<400> 151

tttttcgtcc cctaaacata gtggcttttt 30

<210> 152

<211> 440

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于真核生物中的ITS2结构域的共有序列

<220>

<221> 各种_特征

<222> 1..37, 86..120, 146..379, 403..440

<223> n是a、c、 t或 g的任一个

<400> 152

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnact tycaacaayg 50

gatctcttgg ttctggcatc gatgaagaac gcagcnnnnn nnnnnnnnnn 100

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtgaatcatc gartctttga acgcannnnn 150

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 200

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 250

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 350

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng catatcaata agcggaggaa 400

aannnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 440

<210> 153

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>原核生物中的rDNA结构域的共有序列

<220>

<221>各种_特征

<222> 1..37, 59..64, 85..114, 137..203, 218..241, 263..333

<223> n是a、c、t或 g的任一个

<400> 153

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnncac aytggractg 50

agacacggnn nnnnctccta cgggaggcag cagtnnnnnn nnnnnnnnnn 100

nnnnnnnnnn nnnnayssag cmaygccgcg tgdrbgnnnn nnnnnnnnnn 150

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 200

nnnattgacg ttacccgcnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ntgccagcag 250

ccgcggtaat acnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnn 333

<210> 154

<211> 439

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用作真核生物中的ITS2结构域的内部参考序列

<400> 154

tactattcag cctctgtacg tgcttcatgt aaattgaact ttcaacaacg 50

gatctcttgg ttctggcatc gatgaagaac gcagcgactt gcgataagta 100

atgtgaattg cagaattcag tgcatcatag aaactatgta cgcaaattgc 150

gccccttggt attccggggg gcatgcctgt tcgagcgtca tttcaaccct 200

caagcttagc ttggtattga gtctatgtca gtaatggcag gctctaaaat 250

cagtggcggc gccgctgggt cctgaacgta gtaatatttc ttgtcaccgt 300

ttctaggtgt gcttctgtct atacccaaat tcttctatgg ttgacctcgg 350

atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc atatcaataa gcggaggaaa 400

agcacgccgt ctagaagcac gatcagaggc tgaatacta 439

<210> 155

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用作原核生物中的rDNA结构域的内部参考序列

<400> 155

tactattcag cctctgtacg tgcttcatgt aaattgacac actggaactg 50

agacacggtc cagactccat cgggagcgag catgggggaa tattgcacaa 100

tgggcgcaag cctgatggac cctagccgcc actatgaaga aggccttcgg 150

gttgtaaagt actttcagcg gggaggaggg aatgaaagta tatacctttc 200

gtcatgtacg ttactcgcag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag 250

ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgcacg 300

ccgtctagaa gcacgatcag aggctgaata cta 333

<210> 156

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用作原核生物中的rDNA结构域的内部参考序列

<400> 156

tactattcag cctctgtacg tgcttcatgt aaattgacac actggaactg 50

agacacggtc cagactcctg caggagacgg cagtggggaa tattgcacaa 100

tgggcgcaag cctgatgtat ccctgacgca gatatgaaga aggccttcgg 150

gttgtaaagt actttcagcg gggaggaagg tcgtaaaact aatacacttg 200

ctgtttgaac ttacccagag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag 250

ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgcacg 300

ccgtctagaa gcacgatcag aggctgaata cta 333

<210> 157

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>用于原核生物中的rDNA结构域的内部参考序列

<400> 157

tactattcag cctctgtacg tgcttcatgt aaattgacac actggaactg 50

agacacggtc cagactccta gcggagcgag cagtggggaa tattgcacaa 100

tgggcgcaag cctgatgacg ccagtccgct ggtatgaaga aggccttcgg 150

gttgtaaagt actttcagcg gggaggaagg aggtaaatgt aatactcttg 200

ctacttgagc ttaccccgag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag 250

ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgcacg 300

ccgtctagaa gcacgatcag aggctgaata cta 333

Claims

1.一种三维晶格微阵列系统，其包括：

具有前表面和背面的固体支持物；

多个双功能聚合物接头，每个接头具有顶部结构域和底部末端，所述底部末端与固体支持物连接；和

多个核酸探针，所述核酸探针与多个双功能聚合物接头的每个接头的顶部结构域连接。

2.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，多个双功能聚合物接头中的每个接头还包含与其顶部结构域的末端共价连接或内部共价连接的荧光标记。

3.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，所述固体支持物进一步地包括多个连接到其前表面的化学可活化基团，其中所述多个双功能聚合物接头通过它们的底部末端与多个化学可活化基团中的每个化学可活化基团共价连接。

4.根据权利要求3所述的三维晶格微阵列系统，其中所述化学可活化基团是环氧硅烷基、马来酰亚胺基、氨基或活化的羧酸酯。

5.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，其中多个双功能聚合物接头中的每个接头包括在底部末端的第一反应性部分或在顶部结构域的第二反应性部分或其组合，所述第一反应性部分与所述固体支持物中的化学可活化基团上共价连接，所述第二反应性部分与多个核酸中的每个核酸共价连接。

6.根据权利要求5所述的三维晶格微阵列系统，其中所述第一反应性部分是氨基、硫醇基、醛基或羧酸酯。

7.根据权利要求5所述的三维晶格微阵列系统，其中所述第二反应部分是核苷酸碱基、氨基酸或氨基糖。

8.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，其中多个双功能聚合物接头中的每个接头在底部末端具有吸附基团，以非共价地连接到所述固体支持物。

9.根据权利要求8所述的三维晶格微阵列系统，其中所述吸附基团是单链核酸、胺-多糖，或延伸的平面疏水基团。

10.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，其中多个双功能聚合物接头中的每个接头是寡核苷酸、氨基多糖、聚胺或聚氨基酸。

11.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，多个核酸探针中的每个核酸探针在5'端和3'端具有至少三个末端胸腺嘧啶核苷碱基。

12.根据权利要求11所述的三维晶格微阵列系统，其中所述胸腺嘧啶核苷碱基与多个双功能聚合物接头中的每个接头上的第二反应性部分共价连接。

13.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，所述核酸探针具有与病原体、植物或动物中的特征核苷酸序列互补的序列。

14.根据权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，其中所述固体支持物是硼硅酸盐玻璃、惰性金属、热塑性丙烯酸树脂、环烯烃聚合物、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、尼龙、陶瓷、工程化的碳表面或其组合。

15.一种制造三维晶格微阵列系统的方法，其包括以下步骤：

使权利要求1所述的系统中的固体支持物与制剂接触，所述制剂包含：

(i)多个核酸探针；

(ii)多个双功能聚合物接头；和

(iii)溶剂混合物，其包含水和沸点高于100℃的水溶性的液体；

将多个双功能聚合物接头中的每个接头的底部末端连接到固体支持物的前表面作为第一连接反应；

将溶剂混合物中的水蒸发，从而浓缩多个核酸探针和连接到固体支持物上的多个双功能聚合物接头；

将每个核酸探针共价连接到多个双功能聚合物接头的每个接头的顶部结构域作为第二连接反应；和

至少洗涤固体支持物一次以除去未连接的双功能聚合物接头和核酸探针，以制造三维晶格微阵列系统。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一连接反应是吸附。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一连接反应是通过固体支持物上的化学可活化基团与多个双功能聚合物接头的每个接头的底部末端上的第一反应性部分之间的共价偶联而实现的。

18.根据权利要求15所述的方法，其中水溶性的液体是甘油、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇或其组合。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一连接反应在0℃和40℃之间的温度下发生。

20.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二连接在0℃和40℃之间的温度下发生。

21.根据权利要求15所述的方法，其中第二连接反应是通过在多个双功能聚合物接头中的每个接头的顶部结构域处的第二反应性部分与多个核酸探针的光化学交联而实现的。

22.一种可定制的微阵列试剂盒，其包括：

权利要求1所述的三维晶格微阵列系统中的固体支持物和多个双功能聚合物接头；

多个核酸探针，每个核酸探针具有与病原体、植物或动物中的特征核苷酸序列互补的序列；

溶剂混合物；和

使用试剂盒的说明书。

23.根据权利要求22所述的可定制的微阵列试剂盒，其中所述核酸探针在5'端和3'端具有至少三个末端胸腺嘧啶核苷碱基。

24.根据权利要求22所述的可定制的微阵列试剂盒，其中所述溶剂混合物包括水与甘油、二甲基亚砜(DMSO)或丙二醇中的其中一种的混合物，其体积比为约10:1至约100:1。

25.一种检测植物样品中病原体的方法，其包括：

a)采集植物组织样品；

b)从植物组织样品中分离包含DNA的总核酸；

c)使用至少一个第一引物对在单次测试中串联地进行第一扩增，以获得一个或多个病原体特异性的第一扩增子，其中每个第一引物对包含对至少一种病原体的DNA有选择性的正向引物和反向引物；

d)使用病原体特异性的第一扩增子作为模板和至少一个第二引物对串联地进行第二扩增，以获得荧光标记的第二扩增子，其中每个引物对都标记有荧光标记并包含具有与病原体特异性第一扩增子的内部侧翼区互补的序列的正向和反向引物；和

e)使用权利要求1所述的三维晶格微阵列系统执行以下步骤：

(i)将第二扩增子与对病原体DNA中的特征序列决定子具有特异性的核酸探针进行杂交，其中通过多个双功能聚合物接头中的每个接头将核酸探针固定在三维晶格微阵列上的特定已知位置；

(ii)至少洗涤微阵列一次；和

(iii)使微阵列成像以检测来自荧光标记的第二扩增子的荧光信号，从而检测植物样品中的病原体。

26.根据权利要求25所述的方法，其中多个双功能聚合物接头中的每个接头包括荧光标记，该方法进一步地包括使微阵列成像以检测荧光标记的双功能聚合物接头的荧光信号和将荧光标记的第二扩增子的信号叠加到荧光标记的双功能聚合物接头的信号上，从而识别在植物样品中检测到的病原体。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述病原体是细菌、真菌、病毒、藻类或原生动物或其组合。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述病原体是细菌，所述第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，或SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12，或SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138所示的序列，第二扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，或SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，或SEQID NO：23和SEQ ID NO：24，或SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，或SEQ ID NO：27和SEQ IDNO：28，或SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30，或SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：30所示的序列，并且其中核酸探针具有SEQ ID NO：37-85所示的序列。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述病原体是真菌，所述第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，或SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，或SEQ IDNO：135和SEQ ID NO：136所示的序列，第二扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，或SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34，或SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140所示的序列，并且其中核酸探针具有SEQ ID NO：86-125所示的序列。

30.根据权利要求25所述的方法，其中荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子中的荧光标记与荧光标记的双功能聚合物接头中的荧光标记不同。

31.一种在单次测试中同时检测来自植物和病原体的DNA的方法，其包括：

a)采集可能包含一种或多种病原体的植物组织样品；

b)将包含来自至少植物组织和一种或多种病原体的DNA的总核酸分离；

c)使用至少一个病原体DNA选择性第一引物对和至少一个植物DNA选择性第一引物对在单次测试中在总核酸上串联地进行第一扩增，以获得病原体特异性第一扩增子和植物特异性第一扩增子；

d)使用病原体特异性第一扩增子和植物特异性第一扩增子作为模板和标记有荧光标记并具有与病原体特异性第一扩增子的内部侧翼区互补的序列的至少一个第二引物对和标记有荧光标记并且具有与植物特异性第一扩增子中的内部侧翼区互补的序列的至少一个第二引物对，串联进行第二扩增，以获得荧光标记的病原体特异性第二扩增子和荧光标记的植物特异性第二扩增子；

e)使用权利要求1所述的三维晶格微阵列系统执行以下步骤：

(i)将荧光标记的病原体特异性第二扩增子和荧光标记的植物特异性第二扩增子与对病原体DNA和植物DNA中的特征序列决定子具有特异性的核酸探针杂交，其中通过荧光标记的双功能聚合物接头将核酸固定在三维晶格微阵列上的特定已知位置；

(ii)至少洗涤微阵列一次；和

(iii)使微阵列成像以检测来自荧光标记的病原体特异性第二扩增子和来自荧光标记的植物特异性第二扩增子的荧光信号，从而同时检测样品中的病原体和植物。

32.根据权利要求31所述的方法，其中多个双功能聚合物接头中的每个接头均包括荧光标记，所述方法进一步地包括以下步骤：使微阵列成像以检测荧光标记的双功能聚合物接头的荧光信号，和将荧光标记的植物特异性第二扩增子和荧光标记的病原体特异性第二扩增子的信号叠加到荧光标记的双功能聚合物接头的信号上从而同时识别在植物样品中检测到的病原体和植物。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述病原体是细菌，所述第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，或SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12，或SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138所示的序列，第二扩增正向和反向引物对分别具有在SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，或SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，或SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24，或SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，或SEQ ID NO：27和SEQID NO：28，或SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30，或SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：30所示的序列，并且其中核酸探针具有SEQ ID NO：37-85所示的序列。

34.根据权利要求31所述的方法，其中所述病原体是真菌，所述第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，或SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，或SEQ IDNO：135和SEQ ID NO：136所示的序列，第二扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，或SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34，或SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140所示的序列，并且核酸探针具有SEQ ID NO：86-125所示的序列。

35.一种定量植物样品中的一种或多种病原体DNA的拷贝数的方法，其包括：

a)采集可能含有病原体的植物组织样品；

b)将包含DNA的总核酸分离；

c)将至少一个合成的DNA序列的已知拷贝数作为内部参照标准添加到分离的总核酸中，每个合成的DNA序列包括：

中央结构域，其核苷酸序列与病原体DNA中的特征序列决定子不同；和

5'末端和3'末端具有与病原体DNA中的共有序列基本相同的核苷酸序列；

d)使用至少一个第一引物对在单次测试中在总核酸上串联地进行第一扩增，以获得一个或多个病原体DNA特异性第一扩增子和合成的DNA特异性第一扩增子，其中每个第一引物对包含对病原体DNA有选择性的正向引物和反向引物；

e)使用病原体特异性第一扩增子和合成的DNA特异性第一扩增子作为模板和至少一个第二引物对串联地进行第二扩增，以分别获得荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子，其中每个引物对都标记有荧光标记并包含具有与病原体特异性第一扩增子和合成的DNA特异性第一扩增子的内部侧翼区互补的序列的正向和反向引物；

f)使用权利要求1所述的三维晶格微阵列系统，执行以下步骤：

(i)将第二扩增子分别与对病原体DNA和合成的DNA中的特征序列决定子具有特异性的核酸探针进行杂交，其中通过荧光标记的双功能聚合物接头将核酸探针固定在三维晶格微阵列的特定已知位置；

(ii)至少洗涤微阵列一次；

(iii)使微阵列成像，以检测与通过荧光标记的双功能聚合物接头固定在微阵列上的特定已知位置的核酸探针相对应的荧光信号以及每个病原体DNA特异性第二扩增子和合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号；

g)将病原体DNA特异性第二扩增子和合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号的图像叠加到荧光标记的双功能聚合物接头的图像上，以获得叠加的信号图像；

h)将微阵列上的一个或多个叠加信号位置处的核酸探针的序列与多种病原体DNA的特征序列决定子数据库进行比较，从而识别样品中的病原体；和

i)将来自病原体DNA特异性第二扩增子和合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号的荧光信号强度与添加到分离的总核酸中的合成的DNA的已知拷贝数进行数学关联，从而定量样品中的病原体DNA的拷贝数。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述合成的DNA具有SEQ ID NO：154-157所示的序列。

37.根据权利要求35所述的方法，其中所述病原体是细菌，其中所述共有序列在SEQ IDNO：153中示出，所述第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，或SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，或SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138所示的序列，其中共有序列在SEQ ID NO：153中示出，第二扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，或SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，或SEQID NO：23和SEQ ID NO：24，或SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，或SEQ ID NO：27和SEQ IDNO：28，或SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30，或SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：30所示的序列，对细菌具有特异性的核酸探针具有SEQ ID NO：37-85所示的序列，其中具有SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156和SEQ ID NO：157所示的序列的合成的DNA分别与具有SEQ ID NO：142、SEQID NO：143和SEQ ID NO：144所示的序列的合成的DNA特异性核酸探针杂交。

38.根据权利要求35所述的方法，其中所述病原体是真菌，其中所述共有序列在SEQ IDNO：152中示出，所述第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，或SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，或SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136所示的序列，其中共有序列在SEQ ID NO：152中示出，第二扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：31和SEQID NO：32，或SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34，或SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140所示的序列，对真菌具有特异性的核酸探针具有SEQ ID NO：86-125所示的序列，其中具有SEQ IDNO：154所示的序列的合成的DNA与具有SEQ ID NO：145所示的序列的合成的DNA特异性核酸探针杂交。

39.根据权利要求35所述的方法，其中，使用以下关系式，执行数学关联的步骤：

Cn/Co＝P(Sn/So)x其中，

Cn是待定量的每种类型n病原体物种的病原体DNA的拷贝数，Co是在执行第一扩增步骤之前添加到样品中的合成的DNA的已知拷贝数，Sn是每种类型n病原体物种的来自病原体DNA特异性荧光标记的第二扩增子的以相对荧光单位(RFU)表示的荧光信号强度，所述病原体DNA特异性荧光标记的第二扩增子与在微阵列上特定已知位置的病原体DNA特异性核酸探针杂交，So是来自合成的DNA特异性第二扩增子以RFU表示的荧光信号强度，所述DNA特异性第二扩增子与在微阵列上特定已知位置的合成DNA特异性核酸探针杂交，P是约0.1到约10的常数，且X是约1到约3的指数因子。

40.根据权利要求35所述的方法，其中荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子中的荧光标记与荧光标记的双功能聚合物接头中的荧光标记不同。

41.一种用于在单次测试中同时定量植物组织样品中的一种或多种病原体和植物中的DNA拷贝数的方法，该方法包括以下步骤：

a)采集可能包含一种或多种病原体的植物组织样品；

b)将至少包含植物组织DNA和病原体DNA的总核酸分离；

c)将至少一个合成的DNA序列的已知拷贝数作为内部参考标准添加到分离的总核酸中，每个合成的DNA序列包括：

中央结构域，其具有与病原体DNA和植物DNA中的特征序列决定子不同的核苷酸序列；以及

d)使用至少一个病原体特异性第一引物对和至少一个合成的DNA特异性第一引物对和至少一个植物特异性第一引物对在单次测试中在总核酸上串联地进行第一扩增，以获得病原体DNA特异性第一扩增子、植物DNA特异性第一扩增子和合成的DNA特异性第一扩增子；

e)使用第一扩增子作为模板，至少一个病原体DNA特异性第二引物对和至少一个植物DNA特异性第二引物对串联地进行第二扩增，以获得荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子、荧光标记的植物DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子，其中每个引物对都标记有荧光标记并分别具有与第一扩增子的内部侧翼区互补的序列；

(i)将第二扩增子分别与对病原体DNA、植物DNA和合成的DNA中的特征序列决定子具有特异性的核酸探针杂交，其中通过荧光标记的双功能聚合物接头将核酸探针固定在三维晶格微阵列上的特定已知位置；

(ii)至少洗涤微阵列一次；和

(iii)使微阵列成像，以检测对应于通过荧光标记的双功能聚合物接头固定在微阵列上的特定已知位置的核酸探针的荧光信号和对应于每种荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子、荧光标记的植物DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号；

g)将荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子、荧光标记的植物DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子的信号叠加到荧光标记的双功能聚合物接头的图像信号上，从而获得叠加的信号图像；

h)将微阵列上的一个或多个叠加信号位置处的核酸探针的序列与多种病原体DNA和植物DNA的特征序列决定子数据库进行比较，从而识别样品中的病原体和植物；

i)将来自病原体DNA特异性第二扩增子和合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号强度与合成的DNA的已知拷贝数进行数学关联，从而定量样品中的病原体DNA的拷贝数；和

j)将来自植物DNA特异性第二扩增子的荧光信号强度和来自合成的DNA特异性第二扩增子的荧光信号强度与合成的DNA的已知拷贝数进行数学关联，从而定量样品中的植物DNA的拷贝数。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述病原体是细菌，其中所述共有序列在SEQ IDNO：153中示出，所述第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，或SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，或SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138所示的序列，其中共有序列在SEQ ID NO：153中示出，第二扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，或SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，或SEQID NO：23和SEQ ID NO：24，或SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，或SEQ ID NO：27和SEQ IDNO：28，或SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30，或SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：30所示的序列，对细菌具有特异性的核酸探针具有SEQ ID NO：37-85所示的序列，其中具有SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156和SEQ ID NO：157所示的序列的合成的DNA分别与具有SEQ ID NO：142、SEQID NO：143和SEQ ID NO：144所示的序列的合成的DNA特异性核酸探针杂交。

43.根据权利要求41所述的方法，其中所述病原体是真菌，其中所述共有序列在SEQ IDNO：152中示出，所述第一扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，或SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，或SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136所示的序列，其中共有序列在SEQ ID NO：152中示出，第二扩增正向和反向引物对分别具有SEQ ID NO：31和SEQID NO：32，或SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34，或SEQ ID NO：139和SEQ ID NO：140所示的序列，对真菌具有特异性的核酸探针具有SEQ ID NO：86-125所示的序列，其中具有SEQ IDNO：154所示的序列的合成的DNA与具有SEQ ID NO：145所示的序列的合成的DNA特异性核酸探针杂交。

44.根据权利要求41所述的方法，其中使用以下关系式执行数学关联的步骤：

Cn/Co＝P(Sn/So)x，其中，

Cn是待定量的每种类型n病原体或植物物种的病原体DNA或植物DNA的拷贝数，Co是在执行第一扩增步骤之前添加到样品中的合成的DNA的已知拷贝数，Sn是每种类型n病原体物种的来自病原体DNA特异性荧光标记的第二扩增子的以相对荧光单位(RFU)表示的荧光信号强度，所述病原体DNA特异性荧光标记的第二扩增子与在微阵列上的特定已知位置的病原体DNA特异性核酸探针杂交，或是每种类型n植物物种的来自植物DNA特异性第二扩增子的以RFU表示的荧光信号强度，所述植物DNA特异性第二扩增子与在微阵列上的特定已知位置的植物DNA特异性核酸探针杂交，So是来自合成的DNA特异性第二扩增子以RFU表示的的荧光信号强度，所述合成的DNA特异性第二扩增子与在微阵列上特定已知位置的合成DNA特异性核酸探针杂交，P是约0.1到约10的常数，X是约1至约3的指数因子。

45.根据权利要求41所述的方法，其中荧光标记的病原体DNA特异性第二扩增子、荧光标记的植物DNA特异性第二扩增子和荧光标记的合成的DNA特异性第二扩增子中的荧光标记与荧光标记的双功能聚合物接头中的荧光标记不同。