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KR20200130392A - 관절 염증의 지속적인 관절내 치료를 위한 다가 펩티드 컨쥬게이트 - Google Patents

관절 염증의 지속적인 관절내 치료를 위한 다가 펩티드 컨쥬게이트 Download PDF

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KR20200130392A
KR20200130392A KR1020207028855A KR20207028855A KR20200130392A KR 20200130392 A KR20200130392 A KR 20200130392A KR 1020207028855 A KR1020207028855 A KR 1020207028855A KR 20207028855 A KR20207028855 A KR 20207028855A KR 20200130392 A KR20200130392 A KR 20200130392A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
conjugate
kda
polymer
molecular weight
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020207028855A
Other languages
English (en)
Inventor
웨슬리 엠. 잭슨
마비쉬 모하메드
리비아 더블유. 브라이어
케빈 이. 힐리
Original Assignee
발리터 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 발리터 인코포레이티드 filed Critical 발리터 인코포레이티드
Publication of KR20200130392A publication Critical patent/KR20200130392A/ko
Pending legal-status Critical Current

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Abstract

본 개시는 펩티드-중합체 컨쥬게이트, 및 관절내 질병 또는 장애를 치료하는데 있어서 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

관절 염증의 지속적인 관절내 치료를 위한 다가 펩티드 컨쥬게이트
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2018년 3월 9일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/640,749에 대한 우선권을 주장하며, 그 전문은 모든 목적을 위해 본원에 포함된다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록은 종이 사본 대신 텍스트 형식으로 제공되며, 이로써 본 명세서에 참조로서 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 명칭은 052566-504001WO_SL-ST25.txt이다. 텍스트 파일은 14,890 바이트이고, 2019년 3월 8일에 만들어졌으며, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되고 있다.
발명의 배경
약물 요법을 관절의 조직에 전달하는데 사용될 수 있는 2개의 투여 경로가 있다: (1) 전신 투여(즉, 경구, 피하, 및 정맥내), 또는 (2) 관절내 주사.
전신 투여의 장점은 종종 환자가 집에서 쉽게 수행할 수 있으므로, 환자에게 재투여하는 것이 어렵지 않다는 것이다. 그러나, 강력한 약물 제품의 경우, 병적인 관절에서 치료 용량을 유지하는데 필요한 높은 전신 수준이 신체의 다른 곳에서도 위험한 부작용을 유발할 수 있기 때문에 높은 전신 수준의 약물은 바람직하지 않을 수 있다.
관절내 투여의 장점은 강력한 약물이 병적인 관절에 직접 전달될 수 있다는 것이다. 관절로 직접 전달되는 용량은 약물이 표적 조직에 국소적으로 투여되었기 때문에 전신 투여 후 동일한 치료 효과를 달성하는데 필요한 것보다 낮을 수 있다. 그러나, 관절내 투여는 관절 조직에 안전하게 주사를 제공하기 위해 전문가를 필요로 한다. 따라서, 관절내 주사는 실질적으로 더 부담스럽고 투여 비용이 많이 든다.
많은 관절로의 투여에 대한 추가 문제는 관절 조직 주변에 생성된 유체역학적 압력으로 인해 단백질 및 소분자가 관절의 체액에서 빠르게 제거된다는 것이다. 실제로, 관절을 둘러싼 윤활막 조직은 관절 공간에서 배출되는 유체 및 다른 물질을 쉽게 수집할 수 있는 림프관을 포함한다. 결과적으로, 관절내 공간에 투여되는 약물은 관절에서 혈류로 빠르게 제거되어 더 이상 병적인 조직에 효과적으로 작용할 수 없다. 따라서, 관절내 주사로 전달되는 약물은 효능을 유지하기 위해 자주 재투여되어야 한다.
따라서, 관절 조직에 일상적으로 주사되는 약물의 관절내 체류 시간을 개선하려는 강한 동기가 있다. 관절내 공간 내에서의 체류 시간을 늘리기 위해 기존 약물을 변형하는 것이 유용할 수 있다. 약물의 관절내 투여 빈도를 줄임으로써, 약물의 만성 투여와 관련된 합병증의 전반적인 위험을 줄일 수 있다. 생체활성 기간을 늘리면 또한 약물에 대한 치료 결과도 향상될 수 있다.
관절내 체류 시간이 더 긴 약물은 동등한 치료 기능을 위해 더 자주 투여되어야 하는 대체 약물 제품에 비해 환자에 의해 선호될 것이다. 관절내 주사는 국소 마취하에 수행되며 일반적으로 고통스럽지 않은 것으로 간주되지만, 환자가 주사를 위해 임상의의 사무실을 자주 방문해야 하는 부담이 있다. 주사 부위에 단기 자극이 있을 수도 있다. 따라서, 환자는 보다 적은 관절내 주사를 필요로 하는 동등한 요법을 선호할 가능성이 높다.
생물학적 활성 폴리펩티드 약물과 생체적합성 중합체를 포함하는 컨쥬게이트는 생체적합성 중합체에 컨쥬게이션되지 않은 생물학적 활성 폴리펩티드의 관절내 반감기보다 더 큰 관절내 반감기를 나타낸다. 약물의 반감기를 늘리면 약물이 효과적인 치료 반응을 생성하는데 필요한 농도 임계값을 초과하는 시간의 양을 늘리는 효과가 있다.
관절에서 컨쥬게이트의 증가된 반감기는 환자의 부담 감소; 감소된 투여 횟수 및/또는 빈도; 안전성 증가; 감염 발생률 감소; 환자 순응도 증가; 및 효능 증가를 포함하는 특정 이점을 제공한다. 또한, 이러한 컨쥬게이트는 컨쥬게이션되지 않은 형태로는 관절에 충분한 시간 동안 유지되지 않는 관절 질병 및 장애의 치료용 폴리펩티드를 사용 가능하게 할 수도 있다.
발명의 개요
관절 내에 국한된 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 이 방법은 생체중합체 및 항체와 같은 생체활성 펩티드의 다중 복사체를 포함하는 생체컨쥬게이트를 관절내 투여하여, 질병 또는 장애를 치료하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 관절의 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 분자량이 약 0.1 MDa 내지 약 3 MDa인 생체적합성 중합체; 및 복수의 펩티드를 포함하는 유효량의 컨쥬게이트를 관절에 주사하는 단계를 포함하고, 여기서 펩티드는 약 5 kDa 내지 약 150 kDa의 분자량을 갖고; 각각의 펩티드는 중합체에 공유 결합되고, 컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비는 적어도 약 5:1이다.
일부 구체예에서, 본 발명은 분자량이 약 0.1 MDa 내지 약 3 MDa인 생체적합성 중합체; 및 복수의 펩티드의 컨쥬게이트를 제공하고, 여기서 펩티드는 약 5 kDa 내지 약 150 kDa의 분자량을 갖고; 각각의 펩티드는 중합체에 공유 결합되고, 컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비는 적어도 약 5:1이다.
한 구체예에서, 본 개시는 분자량이 약 0.1 MDa 내지 약 2 MDa인 생체적합성 중합체; 및 복수의 펩티드를 포함하는 컨쥬게이트를 제공하고, 여기서 펩티드는 약 5 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖고; 각각의 펩티드는 중합체에 공유 결합되고, 중합체의 분자량은 펩티드 당 약 5 kDa 내지 약 50 kDa이고, 컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비는 적어도 약 5:1이다.
추가로 본 개시의 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제, 및/또는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
본 개시는 또한 관절의 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 치료적 유효량의 본원에 기재된 컨쥬게이트 또는 컨쥬게이트를 포함하는 약학적 조성물을 관절 내로 주사하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 관절의 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 분자량이 약 0.1 MDa 내지 약 3 MDa인 생체적합성 중합체; 및 복수의 펩티드를 포함하는 유효량의 컨쥬게이트를 관절에 주사하는 단계를 포함하고, 여기서 펩티드는 약 5 kDa 내지 약 150 kDa의 분자량을 갖고; 각각의 펩티드는 중합체에 공유 결합되고, 컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비는 적어도 약 5:1이다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 약 0.1 MDa 내지 약 2 MDa의 분자량을 갖고; 그리고 복수의 펩티드, 여기서 펩티드는 약 5 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖고; 각각의 펩티드는 중합체에 공유 결합되고, 중합체의 분자량은 펩티드 당 약 5 kDa 내지 약 50 kDa이고, 컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비는 적어도 약 5:1이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 개시의 방법에 사용하기 위한 항염증성 생체컨쥬게이트를 생성하기 위한 컨쥬게이션 반응에 대한 일반화된 개략도를 보여준다. 단계 1은 반응성 가교제를 적합한 생체중합체 상의 특정 작용기에 공유적으로 첨가하는 것으로 구성된다. 이 예에서 생체중합체의 화학 구조는 HyA이고, 가교제 EMCH는 카르복실산 작용기에 카르보디이미드 화학을 통해 첨가된다. 단계 2에서, 반응성 생체중합체는 화학적 가교제에 대한 공유 결합을 표적화하는 잔기를 포함하는 항염증성 펩티드와 반응할 수 있다. 이 예에서, 펩티드는 컨쥬게이션에 대한 표적으로서 티올을 제공하는 잔기를 함유한다.
도 2A는 항염증성 항-TNFα VHH 항체(SEQ ID NO:7)가 다양한 MW의 HyA에 공유 결합하는 것을 확인하기 위해 사용된 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 겔은 비공유 상호작용을 역전시키는 환원 조건하에서 진행되었으므로, 항염증성 생체컨쥬게이트는 분해 겔의 상단에 남게 될 것이다. 도 2B는 항염증성 항-TNFα 아피바디(SEQ ID NO:6)가 HyA 및 CMC에 공유 결합하는 것을 확인하기 위해 사용된 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 도 2C는 항염증성 항-TNFα VHH 항체(SEQ ID NO:7)가 CM 키토산에 공유 결합하는 것을 확인하기 위해 사용된 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 도 2D는 항염증성 항-IL-1β scFv(SEQ ID NO:9) 항체가 HyA 및 CMC에 공유 결합하는 것을 확인하기 위해 사용된 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 도 2E는 항염증성 항-TNFα VHH(SEQ ID NO:7) 항체가 CMC에 공유 결합하는 것을 확인하기 위해 사용된 SDS-PAGE 겔을 보여준다.
도 3A는 펩티드 공급 비에 기반하여 다양한 생체중합체에 대한 항염증성 펩티드 결합가를 나타내기 위한 다가 컨쥬게이트의 특성화를 나타낸다. 이 예에서, VHH 컨쥬게이션 효율은 62±10%이고 HyA 분자량과 무관하다. 도 3B는 컨쥬게이션 반응 후 생체컨쥬게이트의 HyA 성분의 최종 분포를 보여준다. 도 3C는 크기 배제 컬럼을 사용한 분리 후 항염증성 생체컨쥬게이트의 UV 흡수 및 정적 광산란 크로마토그램의 예를 보여준다. 도 3D는 도 3D에 도시된 크로마토그램의 피크에 대해, 정적 광산란 분석에 의해 결정된 항염증성 생체컨쥬게이트에 대한 회전 반경(Rg,z)을 보여준다.
도 4A는 항-TNFα VHH(SEQ ID NO:7) + HyA(850 kDa) 생체컨쥬게이트의 TNFα 결합 친화도가, 생물층 간섭계(ForteBio Octet, n=3인 스튜던트 t-테스트)에 의해 결정시, 컨쥬게이션되지 않은 항-TNFα VHH 항체의 결합 친화도보다 크다는 것을 보여준다. 도 4B는 경쟁 ELISA(n=5)를 이용한 용액 내에서 TNFα에 결합하는 항-TNFα VHH(SEQ ID NO:7) + HyA(850 kDa) 생체컨쥬게이트 및 컨쥬게이션되지 않은 항-TNFα VHH의 능력을 비교한 것을 보여준다. 도 4C는 L929 섬유모세포에서 TNFα-유도된 아폽토시스를 억제하는 생물검정에서 항-TNFα VHH(SEQ ID NO:7) +HyA(850 kDa) 생체컨쥬게이트 및 컨쥬게이션되지 않은 항-TNFα VHH의 생체활성을 비교한다. 도 4D는 도 4C 데이터의 적합도로부터 계산된 IC50에 기반하여, 항-TNFα VHH + HyA 생체컨쥬게이트의 효능이 컨쥬게이션되지 않은 VHH 항체보다 약 10배 더 컸음을 보여준다(n=4인 스튜던트 t-테스트).
도 5A는 48시간에 걸쳐 다양한 시점에 유창 막을 포함하는 챔버 내부에 부하된 항-TNFα VHH 및 항-TNFα VHH(SEQ ID NO:7) + HyA(850 kDa) 생체컨쥬게이트의 농도를 보여준다. 막의 평균 기공 크기는 직경이 약 20 nm 또는 100 nm였다. 도 5B는 2개의 막 기공 크기 각각에 대한 지수적 감쇠 적합도(R2>0.9000)에 의해 결정된 VHH 및 생체컨쥬게이트의 수송 반감기를 보여준다. 막을 가로지르는 다가컨쥬게이트의 확산은 변형되지 않은 VHH 항체에 비해 상당히 느렸다(a-b, a-c, a-c: p<0.005, ANOVA, n=4).
도 6A는 항-TNFα VHH 항체(SEQ ID NO:7; n=4) 및 MW가 350 kDa(n=3), 750 kDa(n=3), 850 kDa(n=3), 및 2000 kDa(n=4)인 HyA에 컨쥬게이션된 항-TNFα VHH(SEQ ID NO:7)로부터 제조된 항염증성 생체컨쥬게이트의 관절내 반감기를 보여준다. 관절내 반감기는 96시간에 걸쳐 적외선-태깅된 처리 펩티드의 ROI 복사 효율의 지수적 감쇠 적합도를 사용하여 계산되었다. 850 kDa 및 2000kDa HyA를 사용하여 제조된 생체컨쥬게이트의 반감기는 컨쥬게이션되지 않은 VHH보다 상당히 길었다(a-b: p<0.05, a-c: p<0.0001, b-c: p<0.0005, 일원 ANOVA). 도 6B는 항-TNFα VHH 항체(n=4) 및 700 kDa CMC에 컨쥬게이션된 항-TNFα VHH(SEQ ID NO:7)로부터 제조된 항염증성 생체컨쥬게이트(n=3)의 관절내 반감기를 보여준다. 이 생체컨쥬게이트의 반감기는 컨쥬게이션되지 않은 VHH와 크게 다르지 않았다(p=0.32, 스튜던트 t-테스트). 도 6C는 항-TNFα VHH 항체(n=3) 및 850 kDa HyA에 컨쥬게이션된 항-TNFα VHH로부터 제조된 항염증성 생체컨쥬게이트(n=3)의 관절내 반감기를 보여준다. 이 생체컨쥬게이트의 반감기는 컨쥬게이션되지 않은 VHH보다 훨씬 길었다(p<0.05, 스튜던트 t-테스트).
도 7은 약물이 치료 임계값 아래로 떨어질 때를 예측하는 확립된 약리학 모델을 보여준다. 이 모델은 약물의 초기 용량을 표준화하여 상이한 치료의 생체활성 및 분자량의 차이를 설명할 수 있다. 통상적으로, 항염증성 IgG 항체(150 kDa)는 염증성 관절 질환을 개선하는데 효과적이려면 대략 주 1회 투여되어야 한다. 본 발명자의 방법을 사용한 생체컨쥬게이션 후 효능(도 4A-D) 및 IA 반감기(도 5A-B)의 증가를 입증하는 데이터에 기반하여, 본 발명자는 이전 임상 연구에서 사용된 IgG와 동등한 생체활성을 갖는 VHH 항체(15 kDa)를 사용하여 제조된 생체컨쥬게이트의 질량-등가 용량은 동등한 치료 효과를 위해 11-12주마다 한 번씩 재투여되어야 할 것으로 예상한다.
발명의 상세한 설명
I. 총론
본 발명은 그 중에서도 고분자량의 중합체 및 컨쥬게이션되지 않은 펩티드보다 큰 효능을 갖는 복수의 펩티드의 컨쥬게이트를 제공하며, 증가된 반감기는 컨쥬게이트로 하여금 관절내 질병 및 장애를 치료할 수 있도록 한다.
II. 정의
구체적으로 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 또한, 본원에 기재된 방법 또는 물질과 유사하거나 동등한 임의의 방법 또는 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 다음 용어를 정의한다.
본원에서 사용되는 "HyA"는 히알루론산을 지칭한다.
"CMC"는 카르복시메틸셀룰로스를 지칭한다.
"scFV"는 작은 사슬 가변 단편 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "VHH"는 단일-도메인 중쇄 항체를 지칭한다.
"DARPin"은 설계된 안키린 반복 단백질을 지칭하며, 이는 고도로 특이적이고 높은-친화력 표적 단백질 결합을 나타낼 수 있는 유전적으로 조작된 항체 모방 단백질이다.
본원에서 사용되는 "관절(articular joint)"은 섬유성 또는 연골성 관절을 지칭하며, 이는 2개 이상의 뼈가 서로 연결되는 섬유성 또는 연골성 영역이다.
본원에서 사용되는 "치료적 유효량"은 투여시 치료 효과를 생성하는 용량을 지칭한다. 정확한 용량은 치료 목적에 따라 달라지며, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다(예를 들어, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1 3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins 참조). 민감화된 세포에서, 치료적 유효 용량은 종종 민감화되지 않은 세포에 대한 통상적인 치료적 유효 용량보다 낮을 수 있다.
본원에서 사용되는 "생체적합성 중합체"는 주사 부위의 관절에 적합한 중합체를 지칭한다. 대표적인 생체적합성 중합체는 다당류, 글리코사미노글리칸, 및 히알루론산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "중합체 분자량"은 중합체의 분자량을 지칭한다.
"펩티드", "폴리펩티드," 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이의 자연 발생 및 합성 아미노산 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 이종 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질, N-말단 메티오닌 잔기가 있거나 없는 이종 및 상동 리더 서열을 갖는 융합체; 면역학적으로 태깅된 단백질 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 융합 단백질을 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는 번역 후 변형된 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 "조절하다"는 관련 활성(예를 들어, 면역 세포 기능)의 기능 또는 활성을 증가 또는 감소시키는 화합물의 능력을 지칭한다.
"면역 세포 기능"은, 예를 들어, 면역 반응의 조절을 포함하다. 조절은 면역억제성 또는 면역자극성일 수 있다. 면역 반응의 예는 체액성 면역 반응, 세포-매개 면역 반응, 또는 염증 반응을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "억제", "억제하다" 및 "억제제"는 특정 작용 또는 기능을 금지하는 화합물 또는 금지하는 방법을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "항체"는 항원에 특이적으로 결합하고 인지하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 지칭한다. 인지된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론, 및 뮤 불변 영역 유전자 뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되며, 차례로 면역글로불린 부류 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE를 각각 정의한다. 항체는 호르몬 수용체, 말초 벤조디아제핀 수용체와 같은 약물 표적, 및 담체 단백질을 포함하는 다양한 수용체를 대표한다. 대표적인 항체는 모노클로날 IgG 항체, IgG 항체 단편, 단일 사슬 scFv 항체, 단일-도메인 중쇄 VHH 항체, 또는 애드넥틴, 아피바디, 안티칼린, DARPin, 및 조작된 Kunitz-유형 억제제와 같은 조작된 항체-유사 스캐폴드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 예는 또한 종양 괴사 인자-α 및 IL-1β, IL-6, 또는 인터페론-γ와 같은 면역조절 사이토카인의 유인 수용체를 포함한다.
본원에서 사용되는 "설파이드 결합"은 황 공유 결합을 갖는 임의의 모이어티를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "링커"는 중합체에 폴리펩티드를 직접 또는 간접적으로 공유 결합시키는 화학적 모이어티를 지칭한다. 본 발명에서 유용한 링커는 약 100 Da 내지 500 Da일 수 있다. 본 발명의 링커의 유형은 이미드, 아미드, 아민, 에스테르, 카르바메이트, 우레아, 티오에테르, 티오카르바메이트, 티오카르보네이트 및 티오우레아를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 당업자는 다른 유형의 링커가 본 발명에서 유용함을 인지할 것이다.
본원에서 사용되는 "확산 반감기"는 주어진 부피 또는 공간내 컨쥬게이트의 초기 농도가 절반으로 감소하는데 걸리는 시간을 지칭하며, 여기서 농도 감소는 농도 구배의 함수이다.
본원에서 사용되는 "관절내 반감기"는 특정 관절내 컨쥬게이트의 초기 농도가 절반으로 감소하는데 걸리는 시간을 지칭하며, 여기서 관절 외부로의 수송은 대류를 통해 이루어진다. 대류 수송은 확산과 이류를 통한 수송의 조합이며, 이류 수송은 벌크 운동에 의한 물질의 수송이다.
본원에서 사용되는 "약학적 조성물"은 특정량의 특정 성분을 포함하는 생성물 뿐만 아니라 특정량의 특정 성분의 조합으로부터 직접 또는 간접적으로 생성되는 임의의 생성물을 지칭한다. 약학적 조성물은 일반적으로 생물학적 사용에 안전하다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체" 및 "약학적으로 허용되는 부형제"는 대상체에 의한 흡수에 대해 활성제의 투여를 돕는 물질을 지칭한다. 본 발명에서 유용한 약학적 담체 및/또는 부형제는 결합제, 충전제, 붕해제, 윤활제, 코팅제, 감미제, 착향제 및 착색제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 당업자는 다른 약학적 담체 및/또는 부형제가 본 발명에서 유용함을 인지할 것이다.
III. 펩티드-중합체 컨쥬게이트
본 발명은 고분자량의 중합체 및 컨쥬게이션되지 않은 펩티드의 유사한 농도보다 큰 효능을 갖는 복수의 펩티드의 컨쥬게이트를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 분자량이 약 0.1 MDa 내지 약 3 MDa인 생체적합성 중합체; 및 복수의 펩티드의 컨쥬게이트를 제공하고, 여기서 펩티드는 약 5 kDa 내지 약 150 kDa의 분자량을 갖고; 각각의 펩티드는 중합체에 공유 결합되고, 컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비는 적어도 약 5:1이다.
일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 약 0.1 MDa 내지 약 2 MDa의 분자량을 갖고; 그리고 복수의 펩티드, 여기서 펩티드는 약 5 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖고; 각각의 펩티드는 중합체에 공유 결합되고, 중합체의 분자량은 펩티드 당 약 5 kDa 내지 약 50 kDa이고, 컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비는 적어도 약 5:1이다.
생체적합성 중합체
본 발명의 컨쥬게이트에 유용한 중합체는 임의의 적합한 생체적합성 중합체를 포함한다. 생체적합성 중합체는 일반적으로 면역 반응을 유발하지 않는 친수성 중합체이다. 적합한 생체적합성 중합체는 다당류, 글리코사미노글리칸, 히알루론산 및 이의 유도체, 셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 및 이의 유도체, 헤파린 및 이의 유도체, 더마틴, 전분 및 변형 전분, 콘드로이틴, 키토산, 카르복시메틸 키토산 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 생체적합성 중합체는 또한 폴리비닐클로라이드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에테르설폰, 폴리에틸렌, 폴리에테르에테르케톤, 폴리설폰, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리우레탄, 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체, 콜라겐, 폴리 이소부틸렌, 에틸렌 비닐 알콜 공중합체, 폴리에틸렌 폴리카르보네이트, 폴리카프로락톤, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 카르보머, 폴리에스테르, 폴리에테르, 폴리안하이드라이드, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 피롤리돈, 다당류(예를 들어, 히알루론산, 하이드록시알킬셀룰로스, 카르복시알킬셀룰로스, 또는 이의 유도체), 폴리에테르, 이의 유도체 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 생체적합성 중합체는 황화, 설폰화, 중수소화 등과 같은 방법에 의해 추가로 변형될 수 있다.
생체적합성 중합체로서 유용한 다당류는 특히 셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 키틴, 글리코사미노글리칸, 콘드로이틴 설페이트, 히알루로난(히알루론산), 헤파린, 헤파란 설페이트 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 다당류일 수 있다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 글리코사미노글리칸일 수 있다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 히알루론산일 수 있다.
본 발명의 생체적합성 중합체는 임의의 적합한 분자량을 가질 수 있다. 예를 들어, 적합한 생체적합성 중합체는 약 0.1 MDa 내지 약 3 MDa, 또는 약 100 kDa 내지 약 3,000 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 중합체 분자량은 통상적으로 수평균 분자량(Mn) 또는 중량 평균 분자량(Mw)으로 표현될 수 있다. 수평균 분자량은 개별 거대분자의 분자 질량에 대한 수학적 평균이다. 중량 평균 분자량은 더 큰 분자의 영향을 받으므로 수평균 분자량보다 더 큰 수이다. Mw/Mn의 비율은 중합체의 다분산도이며 중합체 샘플에서 분자량의 폭을 나타낸다. 본 발명에서 분자량에 대한 언급은 달리 언급되지 않는 한 중량 평균 분자량(Mw)을 의미한다.
생체적합성 중합체에 유용한 분자량은 약 0.1 MDa 내지 약 3 MDa, 약 0.1 MDa 내지 약 2 MDa, 약 0.2 MDa 내지 약 1.5 MDa, 약 0.8 MDa 내지 약 3 MDa, 약 1 MDa 내지 약 3 MDa, 약 1.5 MDa 내지 약 3 MDa, 또는 약 1 MDa 내지 약 2 MDa를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 약 0.1 MDa 내지 약 3 MDa의 분자량을 갖는다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 약 0.1 MDa 내지 약 2 MDa의 분자량을 갖는다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 약 0.2 MDa 내지 약 1.5 MDa의 분자량을 갖는다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 약 0.8 MDa 내지 약 3 MDa의 분자량을 갖는다. 생체적합성 중합체는 약 0.1 MDa, 또는 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 약 3 MDa의 분자량을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 적어도 약 0.85 MDa의 분자량을 갖는다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 약 0.9 MDa의 분자량을 갖는다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 적어도 약 1 MDa의 분자량을 갖는다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 약 2 MDa의 분자량을 갖는다.
생체적합성 중합체는 펩티드 당 약 5 kDa 내지 약 600 kDa, 또는 펩티드 당 약 5 kDa 내지 500 kDa, 약 5 kDa 내지 약 400 kDa, 약 5 kDa 내지 약 300 kDa, 약 5 kDa 내지 약 200 kDa, 약 5 kDa 내지 약 100 kDa, 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 약 5 kDa 내지 약 40 kDa, 약 5 kDa 내지 약 30 kDa, 약 5 kDa 내지 약 20 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 10 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 생체적합성 중합체는 펩티드 당 약 5 kDa, 또는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 약 100 kDa의 분자량을 가질 수 있다.
펩티드
본 발명에서 적합한 펩티드는 분자량이 적어도 약 2 kDa인 것들이고, 삼차 구조를 나타낸다. 대표적인 펩티드는 폴리펩티드, 하나 이상의 앱타머, 인간 A 도메인 스캐폴드에 기반한 아비머 스캐폴드, 디아바디, 카멜리드, 상어 IgNAR 항체, 변형된 특이성을 갖는 피브로넥틴 유형 III 스캐폴드, 항체, 항체 단편, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특히 유용한 한 구체예에서, 펩티드는 치료용 단백질이다. 비제한적으로 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), GM-CSF, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인간 성장 호르몬, 및 이미글루세라제와 같은 수많은 치료용 단백질이 출원 전반에 걸쳐 개시된다.
한 구체예에서, 펩티드는 Aβ, 아갈시다제, 알레파셉트, 알칼리 포스파타제, 아스파라기나제, 암독소버(DAPD), 안티드, 베카플러민, 타입 A 및 B를 포함하는 보툴리눔 독소 및 보툴리눔 독소 활성을 갖는 저분자량 화합물, 칼시토닌, 시아노비린, 데닐류킨 디프티톡스, 에리트로포이에틴(EPO), EPO 효능제, 도르나제 알파, 적혈구형성 자극 단백질(NESP), 응고 인자, 예를 들어, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XII, 인자 XIII, 본 빌레브란트 인자; 세레다제, 세레자임, 알파-글루코시다제, N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파나제, 콜라겐, 사이클로스포린, 알파 데펜신, 베타 데펜신, 데스모프레신, 엑센딘-4, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 트롬보포이에틴(TPO), 알파-1 프로테이나제 억제제, 엘카토닌, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 피브리노겐, 필그라스팀, 성장 호르몬 인간 성장 호르몬(hGH), 소마트로핀, 성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH), GRO-베타, GRO-베타 항체, 골형성 단백질, 예를 들어, 골형성 단백질-2, 골형성 단백질-6, 부갑상샘 호르몬, 부갑상샘 호르몬 관련 펩티드, OP-1; 산성 섬유모세포 성장 인자, 염기성 섬유모세포 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자 21, CD-40 리간드, 헤파린, 인간 혈청 알부민, 저분자량 헤파린(LMWH), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 오메가, 인터페론 타우, 컨센서스 인터페론, 인간 리실 옥시다제-유사-2(LOXL2); 인터루킨 및 인터루킨 수용체, 예를 들어, 인터루킨-1 수용체, 인터루킨-2, 인터루킨-2 융합 단백질, 인터루킨-1 수용체 길항제, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-4 수용체, 인터루킨-6, 인터루킨-8, 인터루킨-12, 인터루킨-17, 인터루킨-21, 인터루킨-23, p40, 인터루킨-13 수용체, 인터루킨-17 수용체; 락토페린 및 락토페린 단편, 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 인슐린, 프로-인슐린, 인슐린 유사체, 렙틴, 그렐린, 아밀린, C-펩티드, 소마토스타틴, 옥트레오티드를 포함하는 소마토스타틴 유사체, 바소프레신, 난포 자극 호르몬(FSH), 이미글루세라제, 인플루엔자 백신, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인슐린트로핀, 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 플라스미노겐 활성제, 예를 들어, 알테플라제, 유로키나제, 레테플라제, 스트렙토키나제, 팔미테플라제, 라노테플라제, 및 테네테플라제; 신경 성장 인자(NGF), 오스테오프로테게린, 혈소판-유래 성장 인자, 조직 성장 인자, 형질전환 성장 인자-1, 혈관 내피 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 각질세포 성장 인자(KGF), 아교세포 성장 인자(GGF), T 세포 수용체, CD 분자/항원, 종양 괴사 인자(TNF)(예를 들어, TNF-α 및 TNF-β), TNF 수용체(예를 들어, TNF-α 수용체 및 TNF-β 수용체), CTLA4, CTLA4 수용체, 단핵구 화학주성 단백질-1, 내피 성장 인자, 부갑상샘 호르몬(PTH), 글루카곤-유사 펩티드, 소마토트로핀, 티모신 알파 1, 라스부리카제, 티모신 알파 1 IIb/IIIa 억제제, 티모신 베타 10, 티모신 베타 9, 티모신 베타 4, 알파-1 항트립신, 포스포디에스테라제(PDE) 화합물, VLA-4(초후기 항원-4), VLA-4 억제제, 비스포스포네이트, 호흡기 세포융합 바이러스 항체, 낭포성 섬유증 막통과 조절제(CFTR) 유전자, 데옥시리보누클레아제(Dnase), 살균/투과성 증가 단백질(BPI), 및 항-CMV 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 구체적으로 확인된 단백질 또는 펩티드 제제로부터 선택될 수 있다. 예시적인 모노클로날 항체는 에타너셉트(IgG1의 Fc 단백질에 결합된 인간 75 kD TNF 수용체의 세포외 리간드-결합 부분으로 구성된 이량체 융합 단백질), 아브식시맙(abciximab), 아달리무맙(adalimumab), 아펠리모맙(afelimomab), 알렘투주맙(alemtuzumab), B-림프구에 대한 항체, 아틀리주맙(atlizumab), 바실릭시맙(basiliximab), 베바시주맙(bevacizumab), 비시로맙(biciromab), 베르틸리무맙(bertilimumab), CDP-484, CDP-571, CDP-791, CDP-860, CDP-870, 세툭시맙(cetuximab), 클레놀릭시맙(clenoliximab), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에드레콜로맙(edrecolomab), 에팔리주맙(efalizumab), 에프라투주맙(epratuzumab), 폰톨리주맙(fontolizumab), 가빌리모맙(gavilimomab), 겜투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin), 이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan), 인플릭시맙(infliximab), 이놀리모맙(inolimomab), 켈릭시맙(keliximab), 라베투주맙(labetuzumab), 레르델리무맙(lerdelimumab), 올리주맙(olizumab), 방사성표지된 lym-1, 메텔리무맙(metelimumab), 메폴리주맙(mepolizumab), 미투모맙(mitumomab), 무로모나드(muromonad)-CD3, 네바쿠맙(nebacumab), 나탈리주맙(natalizumab), 오둘리모맙(odulimomab), 오말리주맙(omalizumab), 오레고보맙(oregovomab), 팔리비주맙(palivizumab), 펨투모맙(pemtumomab), 펙셀리주맙(pexelizumab), rhuMAb-VEGF, 리툭시맙(rituximab), 사투모맙 펜데티드(satumomab pendetide), 세비루맙(sevirumab), 시플리주맙(siplizumab), 토시투모맙(tositumomab), I.sup.131토시투모맙, 트라스투주맙(trastuzumab), 투비루맙(tuvirumab), 비실리주맙(visilizumab), 및 이의 단편 및 모방체를 포함한다.
한 구체예에서, 펩티드는 융합 단백질이다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 펩티드는 하나 이상의 특정 유용한 서열에 융합된 면역글로불린 또는 면역글로불린의 일부일 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 항체 Fc 단편을 함유할 수 있다. 한 구체예에서, 펩티드는 CTLA4 융합 단백질이다. 예를 들어, 펩티드는 Fc-CTLA4 융합 단백질일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 펩티드는 인자 VIII 융합 단백질이다. 예를 들어, 펩티드는 Fc-인자 VIII 융합 단백질일 수 있다.
특히 유용한 한 구체예에서, 펩티드는 인간 단백질 또는 인간 폴리펩티드, 예를 들어, 이종 생산된 인간 단백질 또는 인간 폴리펩티드이다. 상응하는 인간 형태가 존재하는 수많은 단백질 및 폴리펩티드가 본원에 개시된다(즉, 단백질 또는 펩티드는 일반적으로 인체의 인간 세포에서 생산된다). 따라서, 한 구체예에서, 펩티드는 인간 형태가 존재하는 본원에 개시된 각각의 단백질 및 폴리펩티드의 인간 형태이다. 그러한 인간 단백질의 예는 인간 항체, 인간 효소, 인간 호르몬 및 인간 사이토카인, 예를 들어, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 인터페론(예를 들어, 알파 인터페론 및 베타 인터페론), 인간 성장 호르몬 및 에리트로포이에틴을 비제한적으로 포함한다.
치료용 단백질의 다른 예는 인자 VIII, b-도메인 결실된 인자 VIII, 인자 VIIa, 인자 IX, 항응고제; 히루딘, 알테플라제, tpa, 레테플라제, tpa, 5개 중 3개 도메인이 결실된 tpa, 인슐린, 인슐린 리스프로, 인슐린 아스파르트, 인슐린 글라르긴, 장기-작용 인슐린 유사체, hgh, 글로카곤, tsh, 폴리트로핀-베타, fsh, gm-csf, pdgh, ifn 알파2, ifn 알파2a, ifn 알파2b, inf-알파1, 컨센서스 ifn, ifn-베타, ifn-베타 1b, ifn-베타 1a, ifn-감마(예를 들어, 1 및 2), ifn-람다, ifn-델타, il-2, il-11, hbsag, ospa, t-림프구 항원에 대해 유도된 뮤린 mab, tag-72에 대해 유도된 뮤린 mab, 종양-관련 당단백질, 혈소판 표면 수용체 gpII(b)/III(a)에 대해 유도된 키메라 mab로부터 유래된 fab 단편, 종양-관련 항원 cal 25에 대해 유도된 뮤린 mab 단편, 인간 암배아 항원에 대해 유도된 뮤린 mab 단편, cea, 심장 미오신에 대해 유도된 뮤린 mab 단편, 종양 표면 항원 psma에 대해 유도된 뮤린 mab 단편, hmw-maa에 대해 유도된 뮤린 mab 단편(fab/fab2 믹스), 암종-관련 항원에 대해 유도된 뮤린 mab 단편(fab), nca 90에 대해 유도된 mab 단편(fab), 표면 과립구 비특이적 교차 반응 항원, b 림프구의 표면에서 발견된 cd20 항원에 대해 유도된 키메라 mab, il2 수용체의 알파 사슬에 대해 유도된 인간화된 mab, il2 수용체의 알파 사슬에 대해 유도된 키메라 mab, tnf-알파에 대해 유도된 키메라 mab, 호흡기 세포융합 바이러스의 표면 상의 에피토프에 대해 유도된 인간화된 mab, her 2에 대해 유도된 인간화된 mab, 인간 상피 성장 인자 수용체 2, 사이토케라틴 종양-관련 항원 항-ctla4에 대해 유도된 인간 mab, b 림프구 도르나제-알파 dnase의 cd 20 표면 항원에 대해 유도된 키메라 mab, 베타 글루코세레브로시다제, tnf-알파, il-2-디프테리아 독소 융합 단백질, tnfr-lgg 단편 융합 단백질 라로니다제, dnaase, 알레파셉트, 다르베포에틴 알파(콜로니 자극 인자), 토시투모맙, 뮤린 mab, 알렘투주맙, 라스부리카제, 아갈시다제 베타, 테리파라티드, 부갑상샘 호르몬 유도체, 아달리무맙(lgg1), 아나킨라, 생물학적 개질제, 네시리티드, 인간 b-타입 나트륨이뇨 펩티드(hbnp), 콜로니 자극 인자, 페그비소만트, 인간 성장 호르몬 수용체 길항제, 재조합 활성화 단백질 c, 오말리주맙, 면역글로불린 e(lge) 차단제, 이브리투모맙 티욱세탄, ACTH, 글루카곤, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 티모신, 부갑상샘 호르몬, 색소성 호르몬, 소마토메딘, 에리트로포이에틴, 황체형성 호르몬, 융모성 생식선 자극호르몬, 시상하부 방출 인자, 에타너셉트, 항이뇨 호르몬, 프로락틴 및 갑상샘 자극 호르몬을 비제한적으로 포함한다. 그리고 이들 중 어느 것도 자연(예를 들어, 세린에서 시스테인으로의 치환)(예를 들어, Redwood Biosciences의 포르밀알데히드 방법에 따라) 또는 비자연 아미노산을 사용하여 부위-특이적 컨쥬게이션 지점(N-말단, 또는 C-말단, 또는 다른 위치)을 갖도록 변형될 수 있다.
본 발명에서 유용한 치료용 항체(또는 이들의 개개 scFv 또는 Fab 단편)의 예는 항-TNF 억제제, 예를 들어, TNF 유인 수용체 에타너셉트 및 모노클로날 항체 아달리무맙, 인플릭시맙, 골리무맙, 및 세르톨리주맙, IL-6 모노클로날 항체 억제제 실툭시맙, IL-17 모노클로날 항체 억제제 세쿠키누맙(secukinumab) 및 익세키주맙(ixekizumab), IL-12/23 모노클로날 항체 억제제 우스테키누맙(ustekinumab), 인테그린 수용체 길항제, 예를 들어, 모노클로날 항체 억제제 나탈리주맙 및 에트롤리주맙, CLTA 수용체 길항제 아바타셉트, IL-13 모노클로날 항체 억제제 트랄로키누맙, 케모카인 억제제, 예를 들어, 모노클로날 항체 엘데루맙 및 베르틸루맙, 및 IL-1 억제제, 예를 들어, 유인 수용체 릴로나셉트 및 예를 들어 모노클로날 항체 카나키누맙을 비제한적으로 포함한다.
본 발명에서 유용한 치료용 항체(또는 이들의 개개 scFv 또는 Fab 단편)의 다른 예는 전이성 유방암 환자를 치료하기 위한 인간화된 항-HER2 모노클로날 항체인 HERCEPTIN™(트라스투주맙)(Genentech, CA); 응고 형성을 방지하기 위한 혈소판 상의 항-당단백질 IIb/IIIc 수용체인 REOPRO™(아브식시맙)(Centocor); 급성 신장 동종이식편 거부를 예방하기 위한 면역억제성 인간화된 항-CD25 모노클로날 항체인 ZENAPAX™(다클리주맙)(Roche Pharmaceuticals, Switzerland); 뮤린 항-17-IA 세포 표면 항원 IgG2a 항체인 PANOREX™(Glaxo Wellcome/Centocor); 뮤린 항-이디오타입(GD3 에피토프) IgG 항체인 BEC2(ImClone System); 키메라 항-EGFR IgG 항체인 IMC-C225(ImClone System); 인간화된 항-αVβ3 인테그린 항체인 VITAXIN™(Applied Molecular Evolution/MedImmune); Campath; 인간화된 항-CD52 IgG1 항체인 Campath 1H/LDP-03(Leukosite); 인간화된 항-CD33 IgG 항체인 Smart M195(Protein Design Lab/Kanebo); 키메라 항-CD2O IgG1 항체인 RITUXAN™(IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku); 인간화된 항-CD22 IgG 항체인 LYMPHOCIDE™(Immunomedics); 인간화된 항-ICAM3 항체인 ICM3(ICOS Pharm); 영장류 항-CD80 항체인 IDEC-114(IDEC Pharm/Mitsubishi); 방사성표지된 뮤린 항-CD20 항체인 ZEVALIN™(IDEC/Schering AG); 인간화된 항-CD40L 항체인 IDEC-131(IDEC/Eisai); 영장류화된 항-CD4 항체인 IDEC-151(IDEC); 영장류화된 항-CD23 항체인 IDEC-152(IDEC/Seikagaku); 인간화된 항-CD3 IgG인 SMART 항-CD3(Protein Design Lab); 인간화된 항-보체 인자 5(CS) 항체인 5G1.1(Alexion Pharm); 인간화된 항-TNF-α 항체인 D2E7(CATIBASF); 인간화된 항-TNF-α Fab 단편인 CDP870(Celltech); 영장류화된 항-CD4 IgG1 항체인 IDEC-151(IDEC Pharm/SmithKline Beecham); 인간 항-CD4 IgG 항체인 MDX-CD4(Medarex/Eisai/Genmab); 인간화된 항-TNF-α IgG4 항체인 CDP571(Celltech); 인간화된 항-α4β7 항체인 LDP-02(LeukoSite/Genentech); 인간화된 항-CD4 IgG 항체인 OrthoClone OKT4A(Ortho Biotech); 인간화된 항-CD40L IgG 항체인 ANTOVA™(Biogen); 인간화된 항-VLA-4 IgG 항체인 ANTEGREN™(Elan); CAT-152, 인간 항-TGF-β.sub.2 항체(Cambridge Ab Tech); 모노클로날 항-EGF 수용체 (EGFr) 항체인 세툭시맙(BMS); 항-VEGF 인간 모노클로날 항체인 베바시주맙(Genentech); 자가면역 질환을 치료하는데 사용되는 키메라(마우스 및 인간) 모노클로날 항체인 인플릭시맙(Centocore, JJ); 화학요법에 사용되는 모노클로날 항체인 겜투주맙 오조가미신(Wyeth); 및 황반 변성을 치료하는데 사용되는 키메라(마우스 및 인간) 모노클로날 항체인 라니비주맙(Genentech)을 비제한적으로 포함한다.
본원에 개시된 단백질 및 펩티드는 시험관내 합성에 의한 생산 및 생물학적 시스템에서의 생산을 포함하는 임의의 유용한 방법에 의해 생산될 수 있다. 당 분야에 잘 알려진 시험관내 합성 방법의 통상적인 예는 고체상 합성("SPPS") 및 고체상 단편 축합("SPFC")을 포함한다. 단백질 생산에 사용되는 생물학적 시스템도 당 분야에 잘 알려져 있다. 박테리아(예를 들어, E. 콜리(E. coli) 및 바실러스 종(Bacillus sp.)), 효모(예를 들어, 사카로마이세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)) 담배 잎(담배 모자이크 바이러스를 통해)은 이종 단백질의 생산에 널리 사용된다. 또한, 본원에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 펩티드의 생산을 위한 이종 유전자 발현은 포유동물 세포주(예를 들어, CHO 세포)와 같은 동물 세포주를 사용하여 달성될 수 있다. 특히 유용한 한 구체예에서, 펩티드는 소, 양, 염소 및 새(예를 들어, 닭, 메추라기, 오리 및 칠면조)와 같은 트랜스제닉 또는 클로닝된 동물에서 생산되며, 각각은 당 분야에서 이해되는 바와 같다. 예를 들어, 문헌[U.S. Pat. No. 6,781,030, issued Aug. 24, 2004, 이의 개시는 그 전체가 본원에 참조로서 포함됨] 참조.
본 발명에서 유용한 단백질 또는 폴리펩티드는 또한 단백질 및 폴리펩티드에서 발견되는 일반적인 자연 발생 아미노산에 더하여 비자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질의 특성을 변경할 목적으로 존재하는 것 외에도, 비자연 발생 아미노산은 단백질 또는 폴리펩티드를 무작위 공중합체에 직접 연결하는데 사용될 수 있는 작용기를 제공하기 위해 도입될 수 있다. 또한, 자연 발생 아미노산, 예를 들어, 시스테인, 티로신, 트립토판이 이러한 방식으로 사용될 수 있다.
비자연 발생 아미노산은 다양한 방법으로 단백질 및 펩티드에 도입될 수 있다. 비자연 아미노산의 도입을 위한 기술 중 일부는 미국 특허 번호 5,162,218에서 논의되며, 이의 개시는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 첫째, 비자연 발생 아미노산은 아미노산 측쇄 또는 아미노 말단 또는 카르복실 말단에서의 폴리펩티드 또는 단백질의 화학적 변형에 의해 도입될 수 있다. 단백질 또는 펩티드의 화학적 변형의 비제한적인 예는 디아조메탄과 같은 제제에 의한 메틸화, 또는 리신의 측쇄에 존재하는 아미노기 또는 펩티드 또는 단백질의 아미노 말단에 아세틸화를 도입하는 것일 수 있다. 비자연 아미노산을 제조하기 위한 단백질/폴리펩티드 아미노기 변형의 또 다른 예는 메틸 3-메르캅토프로피온이미데이트 에스테르 또는 2-이미노티올란을 사용하여 일차 아민을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드의 위치에 연결된 티올(설프하이드릴, --SH) 보유 작용기를 도입하는 것이다. 일단 도입되면, 그러한 기는 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 공유 결합을 형성하는데 사용될 수 있다.
둘째, 비자연 발생 아미노산은 화학적 합성 중에 단백질 및 폴리펩티드에 도입될 수 있다. 합성 방법은 통상적으로 약 200개 미만의 아미노산, 일반적으로 약 150개 미만의 아미노산, 및 보다 일반적으로 100개 이하의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용된다. 약 75개 미만 또는 약 50개 미만의 아미노산을 갖는 더 짧은 단백질 또는 폴리펩티드가 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.
요망되는 위치에 비자연 아미노산을 삽입하는데 특히 편리한 합성 제조 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 적합한 합성 폴리펩티드 제조 방법은 아미노산이 성장 사슬에 순차적으로 첨가되는 Merrifield 고체상 합성 방법에 기반할 수 있다(Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156). 그러한 기술에 의해 폴리펩티드를 합성하기 위한 자동화 시스템은 현재 Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif. 94404; New Brunswick Scientific, Edison, N.J. 08818; and Pharmacia, Inc., Biotechnology Group, Piscataway, N.J. 08854와 같은 공급업체로부터 상업적으로 이용 가능하다.
폴리펩티드의 화학적 합성 중에 도입될 수 있는 비자연 발생 아미노산의 예는 20개 자연 발생 아미노산의 D-아미노산 및 D 및 L-형태의 혼합물, N-포르밀 글리신, 오르니틴, 노르류신, 하이드록시프롤린, 베타-알라닌, 하이드록시발린, 노르발린, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, t-부틸글리신(t-류신, 2-아미노-3,3-디메틸부탄산), 하이드록시-t-부틸글리신, 아미노 부티르산, 사이클로류신, 4-하이드록시프롤린, 피로글루탐산(5-옥소프롤린), 아제티딘 카르복실산, 피페콜린산, 인돌린-2-카르복실산, 테트라하이드로-3-이소퀴놀린 카르복실산, 2,4-디아미노부티르산, 2,6-디아미노피멜산, 2,4-디아미노부티르산, 2,6-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, 5-하이드록시리신, 뉴라민산, 및 3,5-디요오도티로신을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
셋째, 비자연 발생 아미노산은 생체내 또는 시험관내에서 생물학적 합성을 통해 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열(예를 들어, 유전자)에서 비자연 아미노산이 삽입될 위치에 대응하는 코돈에 넌센스 코돈(예를 들어, 앰버 또는 오커 코돈)을 삽입함으로써 도입될 수 있다. 그러한 기술은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,162,218 및 6,964,859에서 논의되며, 이의 개시는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이유발을 포함하는 돌연변이 코돈을 삽입하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 변경된 서열은 후속하여 요망되는 비자연 발생 아미노산으로 화학적 또는 효소적으로 아실화된 넌센스 코돈에 대해 유도된 억제자 tRNA를 제공하는 시스템에서 생체내 또는 시험관내 전사되고 번역된다. 합성 아미노산은 넌센스 코돈에 대응하는 위치에 삽입될 것이다. 더 크고/크거나 당화된 폴리펩티드의 제조를 위해, 이러한 유형의 재조합 제조 기술이 일반적으로 바람직하다. 이러한 방식으로 도입될 수 있는 아미노산 중에는 포르밀 글리신, 플루오로알라닌, 2-아미노-3-메르캅토-3-메틸부탄산, 호모시스테인, 호모아르기닌 등이 있다. 단백질에서 비자연 아미노산을 얻기 위한 다른 유사한 접근법은 메티오닌 치환 방법을 포함한다.
비자연 발생 아미노산이 선택적 변형에 민감한 작용기를 갖는 경우, 이들은 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 공유 결합을 형성하는데 특히 유용하다. 작용기가 선택적 변형에 민감한 상황은 상기 작용기가 고유하거나 관심 조건하에서 반응할 수 있는 다른 작용기가 입체화학적으로 또는 다른 방식으로 방해받는 상황을 포함한다.
단일 도메인 항체와 같은 다른 항체가 본 발명에서 유용하다. 단일 도메인 항체(sdAb, Ablynx에 의해 나노바디로 불림)는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 구성된 항체 단편이다. 전체 항체와 마찬가지로, sdAb는 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 분자량이 12-15 kDa에 불과한 단일 도메인 항체는 일반적인 전체 항체(150-160 kDa)보다 훨씬 작다. 단일 도메인 항체는 중쇄 항체 또는 공통 IgG의 하나의 가변 도메인(VH)을 포함하는 약 110개 아미노산 길이의 펩티드 사슬이다.
전체 항체와 달리, VHH와 같은 단일 도메인 항체(sdAb)는 Fc 영역이 없기 때문에 보체 시스템 유발 세포독성을 나타내지 않는다. 낙타 및 어류 유래된 sdAb는 전체 항체에 접근할 수 없는 숨겨진 항원, 예를 들어, 효소의 활성 부위에 결합할 수 있다.
sdAb는 단봉 낙타, 낙타, 라마, 알파카 또는 상어를 요망되는 항원으로 면역화 및 중쇄 항체를 코딩하는 mRNA의 후속 분리에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로 합성 라이브러리를 스크리닝하여 만들 수 있다. 낙타는 틸로포다(Tylopoda) 아목의 유일한 살아있는 과인 생물학적 과 카멜리대(Camelidae)의 구성원이다. 낙타, 단봉 낙타, 쌍봉 낙타, 라마, 알파카, 비쿠나, 및 과나코가 이 그룹에 속한다.
본 발명에서 유용한 펩티드는 또한 거대고리 펩티드, 사이클로티드, LDL 수용체 A-도메인, 가용성 수용체, 효소, 펩티드 다량체, 도메인 다량체, 항체 단편 다량체, 및 융합 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구체예에서, 펩티드는 면역 세포 기능의 활성을 조절한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 종양 괴사 인자-α, 인터루킨-1β, 인터루킨-6, 또는 인터페론-γ를 억제한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 종양 괴사 인자-α를 억제한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 모노클로날 IgG 항체, IgG 항체 단편, 단일-사슬 가변 영역 항체, 단일-도메인 중쇄 항체, 애드넥틴, 아피바디, 안티칼린, DARPin, Kunitz-유형 억제제, 또는 유인 수용체이다.
일부 구체예에서, 펩티드는 항-TNFα 단일-도메인 중쇄(VHH) 항체일 수 있다. 일부 구체예에서, 펩티드는 항-TNFα 아피바디일 수 있다. 일부 구체예에서, 펩티드는 항-TNFα 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin)일 수 있다. 일부 구체예에서, 펩티드는 항-IL-1B 단일-사슬(scFv) 항체일 수 있다. 일부 구체예에서, 펩티드는 가용성 인터루킨 수용체 2(sILR2)일 수 있다. 일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:11인 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 또는 SEQ ID NO:10인 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:11인 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, 또는 SEQ ID NO:11인 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, 또는 SEQ ID NO:9인 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:6인 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:7인 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩티드는 SEQ ID NO:9인 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명에서 유용한 펩티드는 분자량이 적어도 2 kDa이고 삼차 구조를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 펩티드의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 150 kDa, 약 5 kDa 내지 약 150 kDa, 약 5 kDa 내지 약 100 kDa, 약 2 kDa 내지 약 50 kDa, 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 약 5 kDa 내지 약 30 kDa, 약 10 kDa 내지 약 30 kDa, 또는 약 10 kDa 내지 약 20 kDa일 수 있다. 펩티드의 대표적인 분자량은 약 2 kDa, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 약 150 kDa을 포함한다.
컨쥬게이트
본 발명의 컨쥬게이트는 하기 화학식 I의 화합물로 기술될 수 있다:
(X-Y)n-Z (I)
상기 식에서, X는 상기 설명된 바와 같은 펩티드이고, Z는 상기 설명된 바와 같은 생체적합성 중합체이고, Y는 선택적 링커이고, 아래첨자 n은 5 내지 500이다.
본 발명의 펩티드-중합체 컨쥬게이트는 펩티드 대 중합체의 몰비가 적어도 5:1인 펩티드 및 생체적합성 중합체의 임의의 적합한 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유용한 펩티드 대 생체적합성 중합체의 대표적인 몰비는 5:1 내지 약 1000:1, 5:1 내지 약 500:1, 5:1 내지 약 400:1, 약 10:1 내지 약 500:1, 약 10:1 내지 약 400:1, 약 10:1 내지 약 300:1, 약 10:1 내지 약 200:1, 약 10:1 내지 약 100:1, 약 20:1 내지 약 100:1, 약 30:1 내지 약 100:1, 약 50:1 내지 약 100:1, 약 10:1 내지 약 50:1, 약 20:1 내지 약 50:1, 또는 약 30:1 내지 약 50:1을 포함한다. 본 발명에서 유용한 펩티드 대 생체적합성 중합체의 다른 몰비는 약 50:1 내지 약 500:1, 약 50:1 내지 약 400:1, 약 50:1 내지 약 300:1, 또는 약 50:1 내지 약 200:1을 포함한다. 펩티드 대 생체적합성 중합체의 대표적인 몰비는 약 10:1, 또는 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 125:1, 150:1, 175:1, 200:1, 250:1, 300:1, 350:1, 450:1 또는 약 500:1을 포함한다.
각각의 펩티드는 항체-약물 컨쥬게이트를 형성하기 위해 당 분야에 일반적으로 알려진 다양한 링커, 예를 들어, San Diego, CA의 BroadPharm에 의해 제공되는 것들에 의해 생체적합성 중합체에 연결될 수 있다. 생체컨쥬게이트 결합을 형성하는 방법은 문헌[Bioconjugate Techniques, 3rd Edition, Greg T. Hermanson]에 설명되어 있다. 링커는 아민, 카르보닐, 카르복실 및 활성화된 에스테르와 반응성일 수 있거나, Click-화학(구리 유무에 관계없이)을 통해 반응할 수 있거나, 티올과 반응성일 수 있다.
예를 들어, 펩티드는 어떠한 링커도 없이 생체적합성 중합체에 직접 공유 결합될 수 있다. 또는 펩티드는 카르복실레이트 및 암모늄 이온을 통하는 것과 같은 이온성 결합의 형성에 의해 생체적합성 중합체에 결합될 수 있다. 펩티드를 생체적합성 중합체에 공유 결합하기 위해 링커가 사용되는 경우, 대표적인 링커는 아미드 또는 디설파이드를 포함하거나, 숙신산 무수물, 숙신이미드, N-하이드록시 숙신이미드, N-클로로숙신이미드, N-브로모숙신이미드, 말레산 무수물, 말레이미드, 히단토인, 프탈이미드 등과 같은 반응성 기로부터 형성된다. 본 발명에서 유용한 링커는 작고 일반적으로 말레이미드 및 아민 또는 하이드라지드로 구성된 2개의 작용기를 함유하는 약 100 Da 내지 약 500 Da의 분자량을 갖는다. 일부 구체예에서, 펩티드는 약 100 Da 내지 약 500 Da의 분자량을 갖는 링커 및 설파이드 결합을 통해 중합체에 공유 결합된다. 일부 구체예에서, 링커는 약 100 Da 내지 약 300 Da의 분자량을 갖는다. 일부 구체예에서, 링커는 숙신이미드를 포함한다. 일부 구체예에서, 링커는 N-베타-말레이미도프로피온산 하이드라지드(BMPH), N-엡실론-말레이미도카프로산 하이드라지드(EMCH), N-아미노에틸말레이미드, N-카파-말레이미도운데칸산 하이드라지드(KUMH), 하이드라지드-PEG2-말레이미드, 아민-PEG2-말레이미드, 하이드라지드-PEG3-말레이미드, 또는 아민-PEG3-말레이미드를 사용하여 형성된다.
화학식 I에서 대표적인 링커 기 Y는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다:
Figure pct00001
일부 구체예에서, 링커 기 Y는 N-엡실론-말레이미도카프로산 하이드라지드(EMCH)일 수 있다:
Figure pct00002
본 발명의 컨쥬게이트에서 유용한 링커는 또한 짧은 펩티드일 수 있다. 가요성, 반가요성, 강성 펩티드 링커가 항염증성 펩티드 서열의 일부로 포함될 수 있다.
본 발명의 생체적합성 중합체의 펩티드의 컨쥬게이트는 컨쥬게이션되지 않은 펩티드와 비교하여 더 긴 확산 반감기를 가질 수 있다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 펩티드보다 적어도 2배 더 길거나, 펩티드보다 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 적어도 100배 더 긴 확산 반감기를 가질 수 있다. 컨쥬게이트의 확산 반감기는 펩티드보다 약 2 내지 약 100배 더 길거나, 펩티드보다 약 2 내지 약 50배, 약 10 내지 약 100배, 약 25 내지 약 100배, 약 50 내지 약 100배 더 길 수 있다. 일부 구체예에서, 컨쥬게이트의 확산 반감기는 펩티드보다 적어도 약 2배 더 길다. 일부 구체예에서, 컨쥬게이트의 확산 반감기는 펩티드보다 약 2 내지 약 100배 더 길다.
본 발명의 컨쥬게이트는 또한 컨쥬게이션되지 않은 펩티드와 비교하여 더 긴 관절내 반감기를 가질 수 있다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 컨쥬게이션되지 않은 펩티드보다 적어도 20% 더 길거나, 컨쥬게이션되지 않은 펩티드보다 적어도 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000% 더 긴 관절내 반감기를 가질 수 있다. 컨쥬게이트의 관절내 반감기는 컨쥬게이션되지 않은 펩티드보다 약 20% 내지 약 1000% 더 길거나, 컨쥬게이션되지 않은 펩티드보다 약 100% 내지 약 1000%, 또는 약 100% 내지 약 500%, 또는 약 100% 내지 약 300% 더 길 수 있다. 일부 구체예에서, 컨쥬게이트의 관절내 반감기는 펩티드보다 적어도 약 20% 더 길다. 일부 구체예에서, 컨쥬게이트의 관절내 반감기는 펩티드보다 약 20% 내지 약 1000% 더 길다.
일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 약 0.8 MDa 내지 약 3 MDa의 분자량을 갖고; 각각의 펩티드는 약 5 kDa 내지 약 50 kDa의 분자량을 갖고; 여기서 각각의 펩티드는 중합체에 공유 결합되고, 컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비는 적어도 약 10:1이다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 약 0.8 MDa 내지 약 2 MDa의 분자량을 갖고; 각각의 펩티드는 약 5 kDa 내지 약 50 kDa의 분자량을 갖고; 여기서 각각의 펩티드는 중합체에 공유 결합되고, 컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비는 적어도 약 10:1이다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 약 1 MDa 내지 약 2 MDa의 분자량을 갖고; 각각의 펩티드는 약 5 kDa 내지 약 50 kDa의 분자량을 갖고; 여기서 각각의 펩티드는 중합체에 공유 결합되고, 컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비는 적어도 약 10:1이다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 약 1 MDa 내지 약 2 MDa의 분자량을 갖고; 각각의 펩티드는 약 5 kDa 내지 약 50 kDa의 분자량을 갖고; 여기서 각각의 펩티드는 중합체에 공유 결합되고, 컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비는 적어도 약 20:1이다. 일부 구체예에서, 생체적합성 중합체는 약 2 MDa의 분자량을 갖고; 각각의 펩티드는 약 5 kDa 내지 약 50 kDa의 분자량을 갖고; 여기서 각각의 펩티드는 중합체에 공유 결합되고, 컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비는 적어도 약 50:1이다.
일부 구체예에서, 본 발명은 (항-TNFα VHH 항체-EMCH)13-HyA(200 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)17-HyA(350 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)23-HyA(750 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)46-HyA(850 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)88-HyA(1350 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)184-HyA(2000 kDa), (항-(마우스)TNFα VHH 항체-EMCH)273-HyA(2000 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)41-CMC(90 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)37-CMC(250 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)42-CMC(700 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)5-CM 키토산(200 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)13-HyA(200 kDa), (항-TNFα 아피바디-EMCH)21-HyA(850 kDa), (항-TNFα 아피바디-EMCH)22-CMC(700 kDa), (항-IL-1β scFv 항체-EMCH)15-HyA(2000 kDa), 또는 (항-IL-1β scFv 항체-EMCH)13-CMC(700 kDa)의 컨쥬게이트를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 (항-TNFα VHH 항체-EMCH)13-HyA(200 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)17-HyA(350 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)23-HyA(750 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)46-HyA(850 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)88-HyA(1350 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)184-HyA(2000 kDa), (항-(마우스)TNFα VHH 항체-EMCH)273-HyA(2000 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)37-CMC(250 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)42-CMC(700 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)5-CM 키토산(200 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)13-HyA(200 kDa), (항-TNFα 아피바디-EMCH)21-HyA(850 kDa), (항-TNFα 아피바디-EMCH)22-CMC(700 kDa), (항-IL-1β scFv 항체-EMCH)15-HyA(2000 kDa), 또는 (항-IL-1β scFv 항체-EMCH)13-CMC(700 kDa)의 컨쥬게이트를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 (항-TNFα VHH 항체-EMCH)46-HyA(850 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)88-HyA(1350 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)184-HyA(2000 kDa), (항-(마우스)TNFα VHH 항체-EMCH)273-HyA(2000 kDa), (항-TNFα 아피바디-EMCH)21-HyA(850 kDa), 또는 (항-IL-1β scFv 항체-EMCH)15-HyA(2000 kDa)의 컨쥬게이트를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 (항-TNFα VHH 항체-EMCH)46-HyA(850 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)88-HyA(1350 kDa), (항-TNFα VHH 항체-EMCH)184-HyA(2000 kDa), (항-(마우스)TNFα VHH 항체-EMCH)273-HyA(2000 kDa), (항-TNFα 아피바디-EMCH)21-HyA(850 kDa), 또는 (항-IL-1β scFv 항체-EMCH)15-HyA(2000 kDa)의 컨쥬게이트를 제공한다.
IV. 약학적 조성물
일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
A. 제형
본 발명의 컨쥬게이트로부터 약학적 조성물을 제조하기 위해, 약학적으로 허용되는 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 고체 형태 제조물은 분말, 샤쉐, 및 분산성 과립을 포함한다. 고체 담체는 희석제, 결합제, 보존제, 붕해제, 또는 캡슐화 물질로도 작용할 수 있는 하나 이상의 물질일 수 있다. 제형화 및 투여를 위한 기술에 대한 세부사항은 과학 및 특허 문헌에 충분히 기재되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co, Easton PA ("Remington's")]의 최신판을 참조한다.
분말에서, 담체는 미분된 활성 성분과 혼합된 미분된 고체이다. 정제에서, 활성 성분은 필요한 결합 특성을 갖는 담체와 적합한 비율로 혼합되고, 요망되는 형태 및 크기로 압축된다. 분말 및 정제는 바람직하게는 5% 또는 10% 내지 70%의 본 발명의 컨쥬게이트를 함유한다.
액체 형태 제조물은 용액, 현탁액, 및 에멀젼, 예를 들어, 물 또는 물/프로필렌 글리콜 용액을 포함한다. 비경구 주사를 위해, 액체 제조물은 폴리에틸렌 글리콜 수용액 중의 용액으로 제형화될 수 있다.
경구 사용에 적합한 수용액은 물에 본 발명의 컨쥬게이트를 용해시키고 요망되는 적합한 착색제, 착향제, 안정화제, 및 증점제를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 경구 사용에 적합한 수성 현탁액은 미분된 활성 성분을 점성 물질, 예를 들어, 천연 또는 합성 검, 수지, 메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 소듐 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 검 트라가칸트 및 검 아카시아, 및 분산제 또는 습윤제, 예를 들어, 자연 발생 포스파티드(예를 들어, 레시틴), 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 생성물(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물(예를 들어, 헵타데카에틸렌 옥시세타놀), 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트), 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)과 함께 물에 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들어, 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 착향제 및 하나 이상의 감미제, 예를 들어, 수크로스, 아스파탐 또는 사카린을 함유할 수 있다. 제형은 삼투압농도에 대해 조정될 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 형태 제조물로 사용 직전에 전환되도록 의도된 고체 형태 제조물이 또한 포함된다. 그러한 액체 형태는 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함한다. 이러한 제조물은 활성 성분 이외에, 착색제, 착향제, 안정화제, 완충제, 인공 및 천연 감미제, 분산제, 증점제, 가용화제 등을 함유할 수 있다.
오일 현탁액은 본 발명의 컨쥬게이트를 식물성 오일, 예를 들어, 땅콩유, 올리브유, 참기름 또는 코코넛 오일, 또는 무기질유, 예를 들어, 액체 파라핀; 또는 이들의 혼합물에 현탁시킴으로써 제형화될 수 있다. 오일 현탁액은 증점제, 예를 들어, 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 풍미가 좋은 경구 제조물을 제공하기 위해 감미제, 예를 들어, 글리세롤, 소르비톨 또는 수크로스가 첨가될 수 있다. 이러한 제형은 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산의 첨가에 의해 보존될 수 있다. 주사 가능한 오일 비히클의 예로서, 문헌[Minto, J. Pharmacol. Exp. Ther. 281 :93-102, 1997]을 참조한다. 본 발명의 약학적 제형은 또한 수중유 에멀젼의 형태일 수 있다. 유성상은 상기 기재된 식물성 오일 또는 무기질유, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 에멀젼화제는 자연 발생 검, 예를 들어, 아카시아 검 및 트라가칸트 검, 자연 발생 포스파티드, 예를 들어, 대두 레시틴, 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 에스테르 또는 부분 에스테르, 예를 들어, 소르비탄 모노올레에이트, 및 이러한 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트를 포함한다. 에멀젼은 또한 시럽 및 엘릭서의 제형에서와 같이 감미제 및 착향제를 함유할 수 있다. 그러한 제형은 또한 점활제, 보존제, 또는 착색제를 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 체내에서의 느린 방출을 위한 미세구로 전달될 수 있다. 예를 들어, 미세구는 피하로 천천히 방출되는 약물-함유 미세구의 피내 주사를 통한 투여를 위해(문헌[Rao, J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7:623-645, 1995] 참조); 생물분해성이고 주사 가능한 겔 제형으로(예를 들어, 문헌[Gao Pharm. Res. 12:857-863, 1995] 참조); 또는 경구 투여용 미세구로(예를 들어, 문헌[Eyles, J. Pharm. Pharmacol. 49:669-674, 1997] 참조) 제형화될 수 있다. 경피 및 피내 경로 둘 모두는 수주 또는 수개월 동안 일정한 전달을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 관절의 관절내 공간과 같은 체강으로의 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 투여를 위한 제형은 일반적으로 약학적으로 허용되는 담체에 용해된 본 발명의 조성물의 용액을 포함할 것이다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물 및 링거액, 등장성 소듐 클로라이드가 있다. 또한, 용매 또는 현탁 매질로서 멸균 고정유가 통상적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 부드러운 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 주사제의 제조에서 지방산, 예를 들어, 올레산이 마찬가지로 사용될 수 있다. 이러한 용액은 멸균성이고 일반적으로 원하지 않는 물질을 비함유한다. 이러한 제형은 통상적인 널리 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 제형은 생리학적 조건과 비슷하게 만들기 위해 필요한 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, pH 조정제 및 완충제, 독성 조절제, 예를 들어, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소듐 락테이트 등을 함유할 수 있다. 이러한 제형에서의 본 발명의 조성물의 농도는 광범위하게 변할 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 필요에 따라 주로 유체 부피, 점도, 체중 등에 기반하여 선택될 것이다. IV 투여를 위해, 제형은 멸균성 주사 가능한 제조물, 예를 들어, 멸균성 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 이용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균성 주사 가능한 제조물은 또한 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균성 주사 가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 1,3-부탄디올의 용액일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물의 제형은 세포막과 융합되거나 세포내이입되는 리포솜의 사용에 의해, 즉, 세포내이입을 발생시키는 세포의 표면 막 단백질 수용체에 결합하는 올리고뉴클레오티드에 직접 부착되거나 리포솜에 부착된 리간드를 이용함으로써 전달될 수 있다. 리포솜을 사용함으로써, 특히 리포솜 표면이 표적 세포에 특이적이거나, 달리 특정 기관에 우선적으로 유도되는 리간드를 운반하는 경우, 생체내에서 본 발명의 조성물을 표적 세포로 전달하는데 집중할 수 있다. (예를 들어, Al-Muhammed, J. Microencapsul. 13:293-306, 1996; Chonn, Curr. Opin. Biotechnol. 6:698-708, 1995; Ostro, Am. J. Hosp. Pharm. 46: 1576-1587, 1989 참조).
지질-기반 약물 전달 시스템은 지질 용액, 지질 에멀젼, 지질 분산액, 자가-에멀젼화 약물 전달 시스템(SEDDS) 및 자가-마이크로에멀젼화 약물 전달 시스템(SMEDDS)을 포함한다. 특히, SEDDS 및 SMEDDS는 수성 매질에서 자발적으로 분산되어, 미세 에멀젼(SEDDS) 또는 마이크로에멀젼(SMEDDS)을 형성할 수 있는 지질, 계면활성제 및 공동-계면활성제의 등방성 혼합물이다. 본 발명의 제형에서 유용한 지질은 참기름, 올리브유, 피마자유, 땅콩유, 지방산 에스테르, 글리세롤 에스테르, Labrafil®, Labrasol®, Cremophor®, Solutol®, Tween®, Capryol®, Capmul®, Captex® 및 Peceol®을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 자연 또는 합성 지질을 포함한다.
B. 투여
본 발명의 컨쥬게이트 및 조성물은 경구, 비경구 및 국소 방법을 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 전달될 수 있다. 일부 구체예에서, 전달 방법은 관절내 전달이다.
약학적 제조물은 바람직하게는 단위 투여 형태이다. 그러한 형태에서, 제조물은 적절한 양의 본 발명의 컨쥬게이트 및 조성물을 함유하는 단위 용량으로 세분된다. 단위 투여 형태는 패키징된 제조물, 별개의 양의 제조물을 함유하는 패키지, 예를 들어, 패킹된 정제, 캡슐, 및 바이알 또는 앰풀 내의 분말일 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트 및 조성물은 다른 제제와 공동-투여될 수 있다. 공동-투여는 다른 제제의 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 또는 24시간 이내에 본 발명의 컨쥬게이트 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 공동-투여는 또한 동시에, 거의 동시에(예를 들어, 서로 약 1, 5, 10, 15, 20 또는 30분 이내), 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명의 컨쥬게이트 및 조성물은 하루에 바람직한 투여량 수준을 제공하도록 하루에 1회, 또는 하루에 2회, 3회 이상 각각 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 공동-투여는 공동-제형화, 즉, 본 발명의 컨쥬게이트 및 조성물 및 임의의 다른 제제를 포함하는 단일한 약학적 조성물을 제조함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 다양한 성분이 별도로 제형화될 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트 및 조성물, 및 임의의 다른 제제는 임의의 적합한 양으로 존재할 수 있고, 이는 대상체의 체중 및 연령, 질병 상태 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 요인에 좌우될 수 있다. 적합한 투여량 범위는 약 0.1 mg 내지 약 10,000 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 1000 mg, 또는 약 10 mg 내지 약 750 mg, 또는 약 25 mg 내지 약 500 mg, 또는 약 50 mg 내지 약 250 mg을 포함한다. 적합한 투여량은 또한 약 1 mg, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 mg을 포함한다. 조성물은 또한 다른 적합한 치료제를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 컨쥬게이트는 서로 조합하여, 글루코코르티코이드 수용체를 조절하는데 유용한 것으로 알려진 다른 활성제와 함께, 또는 단독으로는 효과적이지 않을 수 있지만 활성제의 효능에 기여할 수 있는 보조제와 함께 사용될 수 있다.
V. 방법
본 발명은 본 발명의 펩티드-중합체 컨쥬게이트를 사용하여 관절의 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 관절의 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 분자량이 약 0.1 MDa 내지 약 3 MDa인 생체적합성 중합체; 및 복수의 펩티드를 포함하는 유효량의 컨쥬게이트를 관절에 주사하는 단계를 포함하고, 여기서 펩티드는 약 5 kDa 내지 약 150 kDa의 분자량을 갖고; 각각의 펩티드는 중합체에 공유 결합되고, 컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비는 적어도 약 5:1이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 관절의 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 분자량이 약 0.1 MDa 내지 약 2 MDa인 생체적합성 중합체; 및 복수의 펩티드를 포함하는 유효량의 컨쥬게이트를 관절에 주사하는 단계를 포함하고, 여기서 펩티드는 약 5 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖고; 각각의 펩티드는 중합체에 공유 결합되고, 중합체의 분자량은 펩티드 당 약 5 kDa 내지 약 50 kDa이고, 컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비는 적어도 약 5:1이다.
본 발명은 또한 본 발명의 컨쥬게이트를 사용하여 관절 조직의 질병 및 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 관절 조직의 질병 및 장애의 예는 류마티스 관절염, 마모-관련 골관절염, 연령-관련 골관절염, 외상후 골관절염, 건선 관절염, 및 무균 임플란트 이완, 관절 삼출, 강직척추염, 윤활낭염, 통풍, 반응 관절염, 윤활막염, 및 무혈관 괴사를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 질병 또는 장애는 류마티스 관절염, 마모-관련 골관절염, 연령-관련 골관절염, 외상후 골관절염, 건선 관절염, 및 무균 임플란트 이완, 관절 삼출, 강직척추염, 윤활낭염, 통풍, 반응 관절염, 윤활막염, 또는 무혈관 괴사이다.
많은 폴리펩티드는 면역 세포 기능을 약화시키는 약물로 사용되어 많은 관절 질환 치료에 상당한 유용성을 가지고 있다. 관절 조직은, 이러한 공격에 대한 통상적인 세포 반응, 즉, 염증 매개체의 상향조절이 또한 관절 연골의 이화작용을 촉진하고 기본 뼈 조직의 재흡수를 촉진하는 신호이기 때문에 특히 부상과 질병에 취약하다. 관절 표면의 퇴행은 관절 조직의 손상을 악화시키고 염증 매개체의 상향조절을 더욱 촉진한다. 시간이 지남에 따라, 이러한 메커니즘은 관절 조직에 누적 손상을 초래하는 피드-포워드 루프를 생성한다.
본 발명의 방법 및 컨쥬게이트를 사용하여 인체 또는 동물체의 모든 관절을 치료할 수 있다. 대표적인 관절은 섬유성 관절, 연골 관절, 윤활 관절, 후관절, 부동 관절, 불전동 관절, 및 가동 관절을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 관절은 2개의 관절 표면을 갖는 단관절, 3개 이상의 관절 표면을 갖는 다관절, 또는 2개 이상의 관절 표면 및 관절 무릎 또는 반월판을 갖는 복합 관절일 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 해부학적 관절은 손가락을 포함하는 손 관절, 팔꿈치 관절, 손목 관절, 어깨 관절, 흉골 및 쇄골 관절, 척추 관절, 턱 및 두개골 관절, 골반 및 고관절, 무릎 관절, 발목 관절 및 발가락을 포함하는 발 관절을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 관절은 또한 평면 관절, 볼 및 소켓 관절, 경첩 관절, 중쇠 관절, 융기 관절 및 안장 관절로 분류될 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트 및 방법은 결합 조직, 연골, 관절 표면, 윤활강, 반월판 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 관절의 조직을 치료하는데 사용될 수 있다.
면역 세포 기능을 약화시키도록 설계된 약물의 예는 종양 괴사 인자-α 및 IL-1β, IL-6, 또는 인터페론-γ를 방해할 수 있는 항체를 포함한다. 다른 예는 T 세포 및 B 세포 기능의 선택적인 항체 억제제를 포함한다. 이러한 항체는 모노클로날 IgG 항체, IgG 항체 단편, 단일-사슬 scFv 항체, 단일-도메인 중쇄 VHH 항체, 또는 애드넥틴, 아피바디, 안티칼린, DARPin, 및 조작된 Kunitz-유형 항체와 같은 조작된 항체-유사 스캐폴드일 수 있다. 다른 예는 또한 종양 괴사 인자-α 및 IL-1β, IL-6, 또는 인터페론-γ와 같은 면역조절 사이토카인의 유인 수용체를 포함한다.
상기 열거된 것들과 같은 항염증성 약물 사용의 일반적인 부작용 중 하나는 감염 위험이 더 높다는 것이다. 이들은 신체의 면역 반응을 약화시키기 때문에, 박테리아, 바이러스, 및 기생충과 싸우기 위한 면역 시스템이 손상된다. 따라서, 이러한 약물의 전신 사용의 이점은 전신 면역 억제와 관련된 위험과 신중하게 비교되어야 한다. 류마티스 관절염과 같이 전신이 과다면역 질환의 영향을 받는 질환인 경우, 면역 약화 약물의 전신 사용은 정당화될 수 있다. 그러나, 단 하나 또는 제한된 수의 관절에만 영향을 미치는 상태인 경우, 시스템 감염 위험은 이러한 약물의 전신 사용을 종종 정당화하지 못한다.
대안으로, 골관절염과 관련된 염증의 장기간 영향을 예방하거나 억제하기 위해 면역 조절 약물의 관절내(IA) 투여가 제안되었다. 그러나, 이러한 약물은 관절 공간에서 빠르게 제거되며 IA 투여 후 적당한 치료 기간을 제공하지 않는다. IA 주사 후, 윤활막에서 항염증성 단백질의 반감기는 짧다(<1.5시간). 이것은 인플릭시맙 및 에타너셉트를 포함하는 염증 억제제가 다양한 관절 질환에 대해 인간에게 IA 주사로 투여된 임상 연구에서 분명하다. 이러한 연구 중 일부는 관절 염증의 현저한 감소를 보고하지만, 성공적인 결과를 위해서는 빈번한(예를 들어, 매주) 투여가 필요하다는 것을 인정한다. 따라서, 기존 약물을 이용한 IA 항염증성 요법은 높은 비용과 빈번한 IA 투여의 불편함으로 인해 제한될 것이다. 명백하게, 관절 장애를 치료하기 위한 이러한 치료적 접근법을 가능하게 하기 위해서는 윤활액 내에서 항염증성 약물 생체활성을 연장하는 방법이 필요하다.
관절 장애와 관련된 주요 증상은 통증, 삼출, 제한된 운동 범위, 및 관절 해부학의 병리학적 재형성이다. 관절 장애를 치료하기 위한 치료의 효능에는 시각적 평가 점수와 같은 일반화된 평가에 의해 측정된 통증 감소가 포함될 수 있다. 효능은 또한 골관절염에 대한 WOMAC 점수, 류마티스 관절염에 대한 ACR20, 건선 관절염에 대한 건선 관절염 삶의 질, 또는 강직척추염에 대한 SASSS와 같은 특정 관절 장애에 특이적인 시스템을 사용하여 개선된 점수에 기반하여 결정될 수 있다. 효능은 또한 통증 없는 보행 거리의 증가 또는 관절 운동 범위의 증가와 같은 기능적 산출량을 사용하여 측정될 수 있다. 효능은 또한 정상적인 관절 해부학의 회복을 보여주는 방사선촬영 증거를 기반으로 측정될 수 있다.
컨쥬게이트는 상기 논의된 바와 같은 임의의 적합한 빈도 또는 양으로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 대략 한 달에 한 번 정도로 관절에 주사된다. 일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 대략 한 달에 한 번 내지 6개월에 한 번으로 관절에 주사된다. 일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 2개월에 한 번 또는 3개월에 한 번으로 관절에 주사된다.
A. 골관절염
2015년에, 약 775만 명의 미국인이 알려진 관절 손상과 관련될 수 있는 골관절염(OA)의 증상을 경험한 것으로 추정되었다. 외상후 OA(PTOA)는 전체 OA 병증의 적어도 15%를 차지하지만, 많은 다른 OA 진단이 이전 관절 외상과 관련이 있을 수도 있다고 가정된다. 질병 변형 요법의 부족으로 인해, 관절 교체 수술은 종종 관련 불편함을 제거하고 움직임을 회복하는 유일한 치료 옵션이다. 그러나, PTOA는 종종 관절 교체가 실행 가능한 옵션이 아닌 젊은 환자에서 진단된다. 전반적으로, 이러한 PTOA 환자를 치료하는 비용은 매년 의료 비용에서 40억불을 초과한다.
부상-관련 염증의 단기 억제는 PTOA의 장기 증상을 제한할 것이다. 탈구, 인대 파열, 반월판 손상, 및 관절내 골절을 포함하는 많은 유형의 관절 손상이 PTOA와 관련되어 있다. 초기 손상은 급성일 수 있지만, 이 손상은 염증 매개체의 캐스케이드를 개시하기에 충분하다. 결과적인 만성 전체-관절 염증은 관절 연골의 이화작용을 촉진하여, 시간이 지남에 따라 축적되어 PTOA로 나타나는 추가 조직 손상을 초래할 수 있다. TNFα 및 IL-1β는 관절 염증을 매개함에 있어 잘 알려진 역할을 한다. 이러한 사이토카인은 연골 기질 성분의 발현을 하향조절하고 기질 금속단백분해효소(MMP)의 발현을 상향조절함으로써 발생하는 연골 파괴를 촉진하도록 상호작용한다. TNFα는 또한 파골세포 동원을 자극하고, 염증 환경에서 뼈-형성 골모세포의 아폽토시스를 유도하여, 관절 연골 조직의 미란에 기여한다. TNFα 및 IL-1β는 관절 손상에 대한 염증 반응을 완화시키는 강력한 표적이다. 관절 환경에서 이러한 주요 급성 염증성 사이토카인을 억제하는 것은 PTOA의 진행을 지연시키기 위한 조기 개입을 위해 제안되었다.
B. 관절내 미세입자에 대한 면역 반응으로 인한 염증
관절의 관절 표면들 사이에 발생하는 마모는 관절 염증과 뼈용해를 유도하는 미크론 규모의 입자를 생성할 수 있다. 골화 연골 병변, 뼈곁돌기(골극), 또는 노출된 연골하 골 병변과 같은 내인성 표면들 사이의 마모로 인해 마모 입자가 생성될 수 있다. 이러한 유형의 마모 입자 생성은 OA의 후기 단계에서 자주 발생하여, 심한 관절 통증 및 부동성을 초래한다. 이러한 추가 염증 반응은 OA에서 관절 조직의 퇴행 속도를 가속화한다.
인공 관절의 표면들 사이에도 마모 입자가 형성될 수 있다. 2015년에, 7백만 명이 넘는 미국인이 인공 관절을 이식한 채 살고 있었다. 이들 개체 중 약 25만 명은 결국 장치를 둘러싼 뼈의 뼈용해로 인해 재수술을 필요로 하며, 결국 장치가 느슨해져 실패한다.
마모-관련 염증은 관절 표면에서 흘러 나온 다른 비활성 미세입자에 대한 이물질 반응에서 비롯된다. 윤활막 내층 안의 대식세포는 미세입자를 이물질로 쉽게 인지하고, 다른 활성 면역 세포를 윤활막으로 동원하는 전-염증성 인자를 방출하고, 골 형성을 억제하는 동시에 파골세포 확장을 자극한다. 따라서, 지속적인 염증은 연골 퇴행 및 뼈용해가 관절 표면들 사이에 더 많은 마멸 그리고 차례로 더 많은 입자를 생성하는 더 많은 움직임 및 물리적 스트레스로 이어지는 피드-포워드 주기를 유발한다.
일부 구체예에서, 펩티드는 면역 세포 기능의 활성을 조절한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 종양 괴사 인자-α, 인터루킨-1β, 인터루킨-6, 또는 인터페론-γ를 억제한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 종양 괴사 인자-α를 억제한다.
종양 괴사 인자(TNFα)는 이물질 반응을 제어하는 강력한 표적이다. TNFα는 관절 염증을 매개함에 있어 잘 알려진 역할을 한다. TNFα는 또한 파골세포 동원을 자극하고, 염증 환경에서 골-형성 골모세포의 아폽토시스를 유도하여, 연골하 뼈의 뼈용해를 발생시킨다. 전신 항-TNFα와 관련된 위험은 일반적으로 국소적인 조건에서는 허용되지 않는 것으로 간주되지만, 전신 투여된 수용체 길항제(에타너셉트)를 사용한 TNFα의 억제는 마우스에서 마모 입자에 의해 유도되는 골 재흡수를 감소시키는 것으로 나타났다. 대안으로, IA 항-TNFα 요법이 관절내 마모 입자에 대한 뼈용해 반응을 예방하거나 억제하는 것으로 제안되었다.
일부 구체예에서, 펩티드는 모노클로날 IgG 항체, IgG 항체 단편, 단일-사슬 가변 영역 항체, 단일-도메인 중쇄 항체, 애드넥틴, 아피바디, 안티칼린, DARPin, Kunitz-유형 억제제, 또는 유인 수용체이다.
본 발명의 방법은 분자량이 약 0.1 MDa 내지 약 2 MDa인 생체적합성 중합체; 및 각각 약 5 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖는 복수의 펩티드를 포함하는 펩티드-중합체 컨쥬게이트를 포함하고, 여기서 각각의 펩티드는 중합체에 공유 결합되고, 모든 펩티드에 대해 약 50 kDa의 중합체 내지 약 5 kDa의 중합체가 존재하며, 펩티드 대 중합체의 몰비는 적어도 5:1이다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 SEQ ID NO:3 내지 SEQ ID NO:5에 따른 CDR을 갖는 펩티드를 포함한다.
Figure pct00003
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 SEQ ID NO:1에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함한다:
Figure pct00004
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 SEQ ID NO:2에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함한다:
Figure pct00005
본 발명의 컨쥬게이트는 관절 근처에서 발생하는 염증을 완화시켜 후속 연골 퇴행 및 뼈용해를 억제하기에 유리한 위치에 있다. 이러한 컨쥬게이트는 관절 내에 유지되는 윤활액의 거대분자와 일치하는 생물물리학적 속성을 나타내도록 설계되었다. 또한, 다중 복사체 또는 생체활성 폴리펩티드를 컨쥬게이션하는 것은 표적과의 다가 상호작용을 통해 이들의 효능을 증가시키기에 충분하다. 따라서, 본 발명은 다양한 질병의 치료를 위해 관절에 국소적으로 장기-작용하는 약물을 투여하는 방법을 가능하게 하는데 매우 적합하다.
생체컨쥬게이트 약물의 한 예시적인 목표 시장은 관절 손상 후 만성 염증 및 삼출을 경험하여 PTOA 발병 위험이 있는 환자의 약 25% 환자이다. 이러한 환자를 위한 옵션은 현재 전신 진통 및 국소 코르티코스테로이드 치료로 제한된다. 연장된 염증 단계를 해결하지 못하면 관절 연골의 이화작용으로 이어질 수 있으며 시간이 지남에 따라 축적되는 추가 손상을 초래할 수 있다. 항염증성 생체컨쥬게이트에 기반하여 3개월마다(또는 심지어 덜 빈번하게) 투여하도록 설계된 치료는 장기간 관절 염증의 영향을 완화시켜, 통증을 줄이고 값비싼 수술의 필요성을 지연 또는 방지할 수 있다. 이러한 이점은 감염 위험, 환자의 불편함, 및 수술 비용을 포함할 수 있는 반복적인 IA 주사(연간 무려 4회나 됨)의 단점을 능가할 것이다.
생체컨쥬게이트 약물의 또 다른 예시적인 목표 시장은 석회화 연골 병변, 골극, 또는 연골하 골 병변이 발생하여 만성 염증과 통증을 경험하는 환자이다. 수술적 복구는 통증의 급성 원인을 제거할 수 있지만, 기존 염증, 수술로 인한 염증, 및 추가 마모 입자에 대한 염증은 관절 손상 및 퇴행을 가속화할 것이다. 이러한 환자를 위한 장기간 옵션은 현재 전신 진통 및 국소 코르티코스테로이드 치료로 제한된다. 연장된 염증 단계를 해결하지 못하면 관절 표면이 손상될 수 있어, 환자를 신체 활동으로 되돌리려면 관절 교체 수술이 필요하다. 항염증성 생체컨쥬게이트에 기반하여 3개월마다(또는 심지어 덜 빈번하게) 투여하도록 설계된 치료는 장기간 관절 염증의 영향을 완화시켜, 통증을 줄이고 값비싼 수술의 필요성을 지연 또는 방지할 수 있다. 이러한 이점은 감염 위험, 환자의 불편함, 및 수술 비용을 포함할 수 있는 반복적인 IA 주사(연간 무려 4회나 됨)의 단점을 능가할 것이다.
생체컨쥬게이트 약물의 또 다른 예시적인 목표 시장은 관절 교체 후 통증 및 삼출을 경험하지만 이러한 증상을 설명할 임플란트-주변 감염의 증거가 입증되지 않은 인공 관절 환자의 약 25%이다. 이러한 환자를 위한 옵션은 현재 후속적인 뼈용해가 장치 실패로 이어질 때까지 진통 및 임상 모니터링으로 제한된다. 항염증성 생체컨쥬게이트에 기반하여 3개월마다 투여되거나 덜 빈번하게 투여하도록 설계된 치료는 마모 입자에 대한 반응을 완화시켜, 통증을 줄이고 값비싼 재수술의 필요성을 지연 또는 방지할 수 있다. 이러한 이점은 감염 위험, 환자의 불편함, 및 수술 비용을 포함할 수 있는 만성 IA 주사(연간 무려 4회나 됨)의 단점을 능가할 것이다.
다가 항체 컨쥬게이트는 관절 손상이나 마모 입자에 대한 노출로 인해 발생하는 염증을 개선하고 후속적인 이화 조직 손상을 억제하기에 유리한 위치에 있다. 높은 효능을 나타내는 것 외에도, 컨쥬게이트는 관절 내에서 유지되는 특정 거대분자 특성을 갖도록 조작될 수 있다. 윤활막과 함께 유지될 수 있을 정도로 충분히 큰 HyA에 항염증성 펩티드를 컨쥬게이션함으로써, 컨쥬게이션된 항체의 생체활성 반감기는 동등한 컨쥬게이션되지 않은 항체에 비해 상당히 연장될 수 있다.
VI. 실시예
실시예 1. 컨쥬게이트의 제조
일반적 방법. 항염증성 생체컨쥬게이트는 이전에 설명한 방법(PMID: 28679037)에 따라 제조되었다. 150kDa-2.0 MDa 범위의 MW에 걸친 중합체가 수득되었으며, 이는 제조업체에서 지정한 대로 중량 평균 MW에 기반하여 본원에서 지칭된다. pH를 5.5-8.5의 범위로 유지하기 위해 0.1-1M의 적절한 완충제를 포함하는 수용액, 예를 들어, MES, 포스페이트 완충제, His 완충제, MOPS, 글루쿠론산, 시트레이트, 아세테이트 HEPES를 사용하여 중합체를 용액에 넣었다.
다음 부형제 중 하나 이상을 용액에 첨가하여 중합체를 용액으로 촉진시켰다: 50-500 mM NaCl, 0.0001-0.1% Tween-20, 0.0001-0.1%Tween-80, 1-10% 수크로스, 1-10% 만노스, 1-10% 트레할로스, 1-10%, 1-10% 만니톨, 1-10% 소르비톨, 1-10% 글리세롤 등. 다음의 교반 방법 중 하나 이상을 사용하여 이들이 용액으로 들어가도록 촉진시켰다: 흔들기, 궤도 진탕, 회전, 또는 교반(예를 들어, 교반 막대 또는 수직 교반기 사용).
중합체 상의 카르복실산 측기의 카르보디이미드 치환이 개시되어 항염증성 펩티드에 대한 컨쥬게이션 핸들을 생성하였다. 각 3 mg의 중합체에 대해, 다음: 1-10 mg/mL 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 다음 중 하나: 0.25-2.5 mg/mL N-ε-말레이미도카프로산 하이드라지드(EMCH), 0.25-2.5 mg/mL BMPH, 0.25-2.5 mg/mL 하이드라지드-PEG2-말레이미드, 또는 0.25-2.5 mg/mL 아민-PEG2-말레이미드를 용액에 첨가하였다. 카르보디이미드 반응을 촉진하기 위해 다음 중 하나를 첨가하였다: 0.1-3 mg/mL 설포-NHS, 0.1-3 mg/mL Oxyma, 또는 0.01-0.1 mg/mL HOBt. 용액을 4℃ 또는 주위 온도에서 2시간 동안 반응시켰다. 제거된 미반응 컨쥬게이션 반응물을 열거된 완충액 중 하나에 대해 50 kDa MWCO 막으로 투석하였다. 투석 완충제는 4시간 후 2회 교체한 다음 24시간 후 1회 교체하였다. 이 반응의 생성물은 이용 가능한 카르복실산 반응성 기의 0.5-5%에 말레이미드 반응성 기를 첨가한 중합체였다.
말레이미드-활성화된 중합체를 이후 항염증성 펩티드와 반응시켰다. 염증을 억제하기 위해 허용되는 표적 및 펩티드 모이어티는 본 명세서의 다른 곳에 열거되어 있다. 펩티드는 C-말단 또는 N-말단에 컨쥬게이션에 사용 가능한 시스테인을 포함하도록 조작되었다. 가요성, 반가요성, 강성 펩티드 링커가 항염증성 펩티드 서열의 일부로 포함될 수 있다. HIS6, FLAG 또는 스트렙타비딘과 같은 추가적인 펩티드를 또한 펩티드 정제를 촉진하기 위해 항염증성 펩티드 서열에 첨가할 수 있고, 이들은 컨쥬게이션 전에 절단되거나 절단되지 않을 수 있다. E. 콜리, 효모, CHO 세포, 담배 잎 등과 같은 적절한 재조합 발현 시스템을 사용하여 펩티드를 생성하였다.
다수의 결합가에 걸쳐 컨쥬게이션된 펩티드를 갖는 항염증성 생체컨쥬게이트를 얻기 위해, 고정된 농도의 펩티드를 중합체와 PBS에서 다양한 정의된 공급 비율로 조합시키고 4℃ 또는 주위 온도에서 4시간 동안 반응시켰다. 컨쥬게이션 반응 동안, 다음 중 하나 이상을 첨가하여 반응 효율을 개선하였다: 펩티드 사이에 디설파이드 결합을 최소화하기 위한 0.5-5 mM TCEP 및/또는 유리 티올 산화를 최소화하기 위한 0.5-5 mM EDTA. 다음 방법 중 하나 이상에 의해 미반응 펩티드를 펩티드-중합체 컨쥬게이트로부터 제거하였다: 상기 열거된 완충제 중 하나에 대해 50-100 kDa MWCO로 4℃에서 4시간 동안 2회 및 24시간 동안 1회 투석, 상기 열거된 완충제 중 하나에 대한 접선 흐름 여과, 크기 배제 컬럼을 사용한 FPLC 연마, 컨쥬게이트의 중합체 성분과 결합하도록 설계된 친화성 크로마토그래피 컬럼을 사용한 FPLC 연마, 또는 컨쥬게이트의 에탄올 침전.
표 1에 기재된 모든 예시적인 컨쥬게이트의 제조는 다음 방법을 사용하여 합성되었다(도 1). 먼저, 각 생체중합체의 4 mg/mL 용액을 MES 완충제(0.1 M, pH 5.7)에서 제조하고 용액을 주위 온도에서 회전(약 5 RPM)에 의해 24시간 동안 교반하여 중합체가 완전히 용액이 되게 하였다. 각 4 mg의 중합체에 대해, 다음을 용액에 첨가하였다: 8.8 mg/mL 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC), 0.8 mg/mL N-ε-말레이미도카프로산 하이드라지드(EMCH), 및 0.04 mg/mL HOBt. 용액을 주위 온도에서 회전(약 5 RPM)에 의해 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 미반응 컨쥬게이션 시약은 다음 완충액 각각에 대해 순서대로 50 kDa MWCO 막을 사용하여 투석에 의해 제거되었다: 첫 번째, 4시간 동안 50 mM 글리신이 첨가된 포스페이트 완충된 염수(pH 6.5), 두 번째, 밤새 포스페이트 완충된 염수(pH 6.5), 그리고 세 번째, 4시간 동안 10% 글리세롤이 첨가된 포스페이트 완충된 염수(pH 6.5). EMCH-활성화된 중합체의 각 용액에, 0.01%의 최종 농도가 되도록 60:1 펩티드:중합체 몰 공급 비의 펩티드 및 Tween-20을 첨가하였다. 용액을 주위 온도에서 회전(약 5 RPM)에 의해 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 미반응 펩티드는 다음 완충액 각각에 대해 순서대로 100 kDa MWCO 막을 사용하여 투석에 의해 제거되었다: 첫 번째, 4시간 동안 0.01% Tween-20과 함께 포스페이트 완충된 염수(pH 7), 두 번째, 밤새 0.01% Tween-20과 함께 포스페이트 완충된 염수(pH 7), 그리고 4시간 동안 0.01% Tween-20과 함께 포스페이트 완충된 염수(pH 7).
실시예 2. 컨쥬게이트의 특성화
염증성 관절 질환 또는 장애가 있는 개체에 대해 기술된 치료 방법에 적합한 물질의 조성을 평가하기 위해 다양한 방법이 사용되었다. 컨쥬게이션 반응에서 펩티드 함량의 농도는 단백질 농도에 대한 표준 방법, 예를 들어, BCA, Bradford, 및/또는 A280에서의 UV 흡수를 사용하여 결정되었다. 컨쥬게이션 반응에서 중합체 함량의 농도는 A204에서의 UV 흡수를 사용하여 결정되었다. 중합체 함량의 농도는 또한 황산으로 분해한 다음 페놀과 함께 인큐베이션하여 비색 분석으로 분석되고 표준 곡선과 비교될 수 있는 생성물을 유도함으로써 측정될 수 있다. 펩티드 및 중합체의 농도는 또한 효소 또는 산 분해에 의한 중합체 성분의 완전한 탈중합반응 후 질량 분석법에 의해 분석될 수 있다. 농도 측정으로부터 결정된 중합체 대 펩티드의 몰비는 각 컨쥬게이트의 결합가를 추정하는데 사용되었다.
반응의 생성물을 환원 및 비환원 조건하에서 SDS-PAGE 겔 상에서 진행시켜 펩티드와 중합체 사이의 공유 화학 컨쥬게이션을 확인하였다. 이러한 방법은 컨쥬게이션 반응의 생성물이 임의의 컨쥬게이션되지 않은 펩티드 또는 불안정하고 표적을 벗어난 반응 부위에서 중합체와 반응한 펩티드를 함유하는지 확인하기에 충분하다. 겔은 코마시 블루 염색 또는 더 높은 해상도의 SYPRO 루비 염색을 사용하여 염색될 수 있다. 컨쥬게이션된 단백질은 로딩 웰의 상부 근처에 남아 있는 반면, 컨쥬게이션되지 않거나 불안정-결합된 펩티드는 이들의 분자량에 기반하여 예상되는 대로 겔을 통해 이동할 것이다. 이 방법에 의해, 컨쥬게이션 반응 생성물에서 검출된 펩티드의 총 농도의 약 0.1%까지 컨쥬게이션되지 않은 펩티드의 대략적인 근사치를 낼 수 있다. 대안적으로, 컨쥬게이션 반응 생성물을 HPLC를 사용하여 크기 배제 컬럼(SEC)을 통해 통과시켜 컨쥬게이션되지 않은 펩티드로부터 컨쥬게이션된 펩티드를 분리하고 정량화할 수 있었다. 이 방법은 또한 펩티드-중합체 컨쥬게이트의 크기에 대한 대략적인 추정치를 제공할 것이다.
펩티드-중합체 컨쥬게이트의 크기를 계산하기 위해 광 산란법을 사용하였다. 예를 들어, 정적 다각도 레이저 광 산란(MALLS) 방법은 SEC에 의한 분리 후 컨쥬게이션 생성물에 사용되어 펩티드-중합체 컨쥬게이트의 수 및 중량 평균 분자량을 결정하였다. 추가로, 인-라인 UV 검출기와 시차 굴절계를 사용하여 크기-분리된 컨쥬게이트의 흡수율 굴절률을 또한 측정함으로써, 펩티드 또는 중합체 성분으로 구성되어 있는 컨쥬게이트의 비율을 추정하였다. 따라서, SEC-MALLS 분석은 컨쥬게이션된 중합체의 최종 수 평균 및 중량 평균 분자량의 추정치 뿐만 아니라 펩티드 결합가(즉, 중합체에 대한 펩티드의 비율)의 독립적 추정치를 제공할 수 있었다. SEC-MALLS 분석은 또한 컨쥬게이트에 대한 평균 회전 반경(Rg) 및 Rg의 분포를 산출할 것이다. 동적 광 산란은 컨쥬게이트의 평균 유체역학적 반경(Rh) 및 Rh의 분포를 추정하는데 사용되었다.
표 1. 컨쥬게이트
Figure pct00006
각 샘플의 펩티드가 생체중합체 백본에 공유적으로 컨쥬게이션되었는지 확인하기 위해, 컨쥬게이션 반응의 생성물을 2.5% 베타 메르캅토에탄올을 첨가시킨 환원 조건에서 12% 아크릴아미드 겔 진행을 사용하여 SDS-PAGE(Mini Protean System, BioRad)로 분석하였다. 이러한 조건은 비공유 결합으로 인한 펩티드 상호작용을 분리할 수 있다. SYPRO 루비(BioRad)를 사용하여 펩티드를 겔에서 가시화하였다. 컨쥬게이션되지 않은 펩티드는 펩티드 참조 사다리에 기반하여 예상대로 겔을 통해 이동한 반면, 각 생체컨쥬게이트에 대한 일차 단백질 밴드는 너무 커서 분해 겔에 들어가지 못했다. 생체컨쥬게이트 레인에는 미량의 컨쥬게이션되지 않은 펩티드(샘플 당 총 펩티드의 2% 미만)만이 밴드로 나타났다. 따라서, 펩티드는 시험된 각각의 생체컨쥬게이트에 대해 생체중합체 백본에 공유적으로 컨쥬게이션되었다.
펩티드 분자량(도 3A), HyA MW(도 3B), 크기-배제 크로마토그램(도 3C), 및 회전 반경(Rg,z)은 크기 배제 크로마토그래피 다각도 광 산란을 위해 확립된 방법을 사용하여 측정되었다(SEC-MALS; Bioconjug Chem. 2012;23(9):1794). 또한 HyA MW의 범위에 걸쳐 단백질 결합가의 분포를 보다 정확하게 계산하기 위해 선형 생체중합체로부터 단백질 분지를 가정하는 분지 분석 방법을 사용하였다(Biomacromolecules. 2016;17(10):3162). 이전 실험에 기반하여, 표적 컨쥬게이트 결합가를 달성하는데 필요한 공급 비율을 예측하기 위해 경험적 데이터를 사용할 수 있다.
실시예 3. 항염증성 생체컨쥬게이트의 생체활성
단백질-중합체 컨쥬게이트의 생체활성을 측정하기 위해 다음 방법 중 하나 이상을 사용하였다. 일례로, BioLayer 간섭계(BLI; ForteBio Octet Red)를 사용하여 각각의 펩티드 및 펩티드-중합체 컨쥬게이트의 이들의 표적에 대한 결합 친화력을 결정하였다. 이 검정의 경우, 펩티드 표적은 유리 BLI 프로브 상에 흡착된다. 가장 일반적으로 비오틴과 컨쥬게이션되거나 비오틴을 함유하는 융합 펩티드로 발현되는 표적을 사용하여 이들을 공유-결합된 스트렙타비딘 표면 층으로 사전-처리된 BLI 프로브에 흡착시킨다. 이후 표적과 함께 흡착된 프로브를 공지된 농도의 펩티드 또는 펩티드-중합체 컨쥬게이트의 용액에 넣는다. 이후 레이저 광이 BLI 프로브의 길이로 전해지고, 프로브 팁에서 표적에 결합하는 펩티드 또는 컨쥬게이트에 의해 생성된 레이저 광 간섭은 결합된 펩티드 또는 컨쥬게이트의 질량과 직접 연관될 수 있다. 시간 경과에 따른 간섭 데이터를 사용하여 k-on 결합 동역학을 계산할 수 있다. 이후 어떤 펩티드 또는 컨쥬게이트도 함유하지 않는 용액에 프로브를 넣음으로써, 레이저-광 간섭이 역전되고, 그 동역학을 사용하여 k-off를 결정할 수 있다. 따라서, 이 BLI 방법은 각각의 펩티드 및 컨쥬게이트의 이의 표적에 대한 결합 친화력(kD)을 측정할 수 있다.
항염증성 항체의 다가 제시는 효능을 향상시키기에 충분하다. 일례로, 항-TNFα 단백질은 인간 TNFα에 반응성인 단일-도메인(VHH) 카멜리드 항체에 대한 공개된 서열을 사용하여 생성되었다(기존 TNF 억제제와 유사한 IC50 = 20 nM(예를 들어, 인플릭시맙: IC50 = 12 nM; Ann Rheum Dis. 2010;69(2):443). 이러한 항체를 HyA에 컨쥬게이션하여 상이한 MW HyA 백본(215 및 860 kDa)에서 항-TNF 생체컨쥬게이트를 생성한 다음 고정된 농도의 TNFα를 프로브에 흡착시키고 항체/컨쥬게이트의 농도 범위에 걸쳐 항-TNFα 항체 또는 항-TNF 생체컨쥬게이트의 결합 친화력을 측정함으로써 BioLayer 간섭계(BLI; ForteBio Octet Red)를 사용하여 생체활성을 평가하였다(도 4A). 어느 한 MW HyA 백본과 항-TNFα의 다가 컨쥬게이션 후, 항-TNF 생체컨쥬게이트는 컨쥬게이션되지 않은 항체와 비교하여 TNFα 결합에 대해 더 높은 효능을 나타내었다. 추가 생체활성 데이터는 표 2에 제공된다.
표 2. 생체활성 데이터
Figure pct00007
대안적으로 경쟁적인 ELISA 검정을 사용하여 각 펩티드 및 펩티드-중합체 컨쥬게이트의 이의 표적에 대한 결합 친화력을 검증하였다(도 4B). 이 검정의 경우, 낮은 검출 한계까지 펩티드 표적을 검출하도록 설계된 샌드위치 ELISA 시스템을 사용하였다. 검정을 시작하기 전에, 다양한 농도에 걸친(예를 들어, 50-0.005 ng/mL) 각각의 펩티드 또는 컨쥬게이트를 고정된 농도(예를 들어, 0.5 ng/mL)의 표적 펩티드와 함께 인큐베이션한다. 항염증성 펩티드 또는 컨쥬게이트에 의해 결합된 표적 펩티드는 ELISA에 의해 검출되는 ELISA 항체에 의해 샌드위치될 수 없으므로, 이 검정은 독립적인 펩티드 및 컨쥬게이트 생체활성의 검증 뿐만 아니라 펩티드 및 컨쥬게이트의 상대적인 결합 활성을 비교하는 수단을 제공한다.
마지막으로, 항염증성 펩티드 및 펩티드-중합체 컨쥬게이트의 생체활성을 세포-기반 약리학 검정을 사용하여 정량화하였다. 예를 들어, L929 섬유모세포 사용에 기반한 세포 생존 검정은 TNFα의 신호전달 활성을 차단함으로써 작용하는 항염증성 펩티드의 생체활성을 시험하는데 사용될 수 있다(도 4C). 이 검정을 위해, 세포를 고정된 농도(50 ng/mL)의 TNFα 및 다양한 펩티드 농도(예를 들어, 500-0.05 ng/mL)에 걸친 TNFα 펩티드 억제제 또는 TNFα 펩티드-중합체 컨쥬게이트 억제제로 처리한 다음, 24-72시간 후에 세포 생존을 평가하였다. 세포 생존을 검출하는 방법은 TUNEL, 악티노마이신 D, 카스파제 검출 등과 같은 세포 아폽토시스에 대한 표준 검정을 포함할 수 있었다. 세포 생존은 또한 상이한 농도의 TNFα 억제제에 노출된 세포 집단으로부터 상대적인 성장률을 비교함으로써 검출될 수 있다. 각 처리의 IC50은 이 데이터를 4-파라미터 로지스틱 핏에 핏팅함으로써 계산될 수 있다(도 4D).
두 번째 예로서, D10 림프구 사용에 기반한 세포 증식 검정을 사용하여 IL-1β의 신호전달 활성을 차단함으로써 작용하는 항염증성 펩티드의 생체활성을 시험할 수 있다. 이 검정을 위해, 세포를 고정된 농도(1 ng/mL)의 IL-1β 및 다양한 펩티드 농도(예를 들어, 100-0.01 ng/mL)에 걸친 IL-1β 펩티드 억제제 또는 IL-1β 펩티드-중합체 컨쥬게이트 억제제로 처리한 다음, 24-72시간 후에 세포 증식을 평가하였다(도 2B). 세포 생존을 검출하는 방법은 CyQuant, 세포 계수, 또는 유세포분석과 같은 세포 정량화를 위한 표준 검정을 포함할 수 있었다.
실시예 4. 유창 막을 가로질러 항염증성 생체컨쥬게이트의 확산
다가 컨쥬게이트는 유창 막을 가로질러 더 느린 확산성을 나타낸다. 윤활액은 글리코사미노글리칸 분자의 막에 의해 관절 공간 내에 유지되는 고분자량 거대분자를 함유한다. 이 막에는 소분자 및 단백질이 관절 공간 밖으로 통과할 수 있게 하지만 거대분자는 유지하는 구멍이 있다.
펩티드-중합체 컨쥬게이트가 유창 막을 통과하는 속도는 벤치탑 검정을 사용하여 측정되었다. 이러한 실험에서, 대략 1 mL 부피의 원통형 챔버가 얻어졌고 약 10-100 nm 범위의 평균 직경을 갖는 구멍을 가진 막으로부터 구성되었다. 챔버를 알려진 농도의 항염증성 펩티드 또는 단백질-중합체를 함유하는 용액으로 채우고, 막을 적어도 200 mL의 완충액의 저장소에 넣었다. 막을 가로지르는 펩티드 또는 컨쥬게이트의 수송을 촉진하기 위해 이러한 저장소를 교반 막대에 의해 교반하였다. 24시간마다, 최대 7일 동안, 저장소 내부의 용액에서 샘플을 취하고, BCA, Bradford, 또는 A260에서의 UV 흡수와 같은 통상적인 단백질 정량화 방법을 사용하여 펩티드 농도를 측정하였다. 챔버 내부의 펩티드 질량은 1-단계 지수적 감쇠와 일치하는 속도로 떨어졌다. 따라서, 챔버 내의 각 펩티드 또는 컨쥬게이트의 반감기를 추정하기 위해 펩티드 농도를 사용하였다.
다가 항-TNFα VHH 생체컨쥬게이트(40 VHH:1 860 kDa HyA) 또는 컨쥬게이션되지 않은 항-TNFα VHH의 용액을 상기 설명한 바와 같은 막을 포함하는 챔버에 넣고, 시간이 지남에 따라 이 장벽을 가로질러 확산되는 VHH 컨쥬게이트 및 컨쥬게이션되지 않은 VHH의 농도를 측정하였다(도 5A). 다가 컨쥬게이트는 컨쥬게이션되지 않은 단백질과 비교하여 막을 가로질러 실질적으로 더 느리게 확산되었다. 또한, 컨쥬게이트 확산 속도는 기공 크기에 따라 달라졌다(도 5B).
실시예 5. 항염증성 생체컨쥬게이트의 약동학
항-TNF 바이오컨쥬게이트의 IA 반감기를 측정하기 위해 관절에서 단백질의 제거율을 평가하는 잘 알려진 래트 모델을 사용하였다(Arthritis Rheum. 1999;42(10):2094). 이 검정을 위해, 래트를 마취하고 뒷다리의 무릎을 멸균 주사를 위해 준비하였다. 30 G 바늘을 사용하여, 각 무릎 관절의 윤활막을 통해 주사하고, 멸균 완충된 40 μL 주사를 윤활액 내로 수행하였다. 각각의 오른쪽 무릎에서, 주사는 또한 항염증성 펩티드, 또는 동등한 총 펩티드 농도의 항염증성 펩티드를 함유하였다. 일반적으로, 이 실험에 사용된 펩티드는 일상적인 펩티드 태깅 방법을 사용하여 근적외선 형광단(예를 들어, Alexa Fluor 750)으로 태깅되었다. 주사 후 최대 10일 동안 다양한 시점에, 무릎에서 형광 신호의 강도(예를 들어, 평균 복사 효율)를 결정하기 위해 생체내 이미징 시스템(예를 들어, Perkin Elmer IVIS Spectrum)을 사용하여 래트를 이미징하였다. 각 왼쪽 무릎은 반대쪽 이미징 대조군으로 사용되었다. 근적외선 리포터는 생체내 이미징 시스템을 사용하여 고감도로 래트 무릎에서 검출될 수 있으며, 이는 관절에서 피코그램 양의 단백질까지 검출되게 할 수 있다. 각 처리의 반감기는 광학 생체내 이미징에 대해 확립된 지수적 감쇠 계산을 사용하여 IA 주사 후 결정되었다(Pharmaceutical research. 2013;30(1):257). 따라서, 투여 후 관절 내의 각 펩티드 또는 컨쥬게이트의 관절내 반감기를 추정하기 위해 펩티드 농도를 사용하였다. 윤활액은 무릎 관절에서 펩티드의 최종 농도를 측정하기 위해 질량 분광법을 통한 프로테오믹 분석을 위해 실험이 끝날 때 수집될 수 있다. 투여하기 전에, 제조업체 프로토콜에 따라 Alexa Fluor 750 근적외선 프로브(ThermoFisher)로 펩티드를 태깅하였다. 간단히 말해서, 프로브:펩티드의 2:1 비로 펩티드를 설포-Cy7-NHS 에스테르와 혼합하였다. 프로브를 실온에서 1시간 동안 펩티드와 반응시킨 후, 반응 용액 각 10부에 1부의 1.5M Tris를 첨가하여 켄칭시켰다. NAP-10 탈염 컬럼을 사용하고 PBS(pH 7.0)로 용리시켜 펩티드를 정제하였다.
모든 그룹에 IA 주사 프로토콜(40 μL의 250 μg/mL 용액: 총 10 μg)에 따라 각 오른쪽 무릎에 동일한 용량의 총 항-TNFα 항체를 투여하였다. 이 IA 항-TNFα 항체 농도(약 80 μg/mL 또는 4.5 μM)는, 임상 연구에서 관절 염증을 개선하기 위해 오프-라벨로 평가될 때(통상적으로 1.5-17.5 μM), 인플릭시맙 및 에타너셉트와 같은 항-TNF 제제의 초기 IA 농도와 비슷하다.
한 세트의 실험(도 6A)에서, 항-TNFα VHH 항체(n=4)의 관절내 반감기를 MW가 350 kDa(n=3), 750 kDa(n=3), 850 kDa(n=3), 및 2000 kDa(n=4)인 HyA에 컨쥬게이션된 항-TNFα VHH에서 제조된 항염증성 생체컨쥬게이트의 반감기와 비교하였다. 850 kDa 및 2000 kDa HyA를 사용하여 제조된 생체컨쥬게이트의 반감기는 컨쥬게이션되지 않은 VHH보다 훨씬 길었다. 독립적인 실험(도 6B)에서, 항-TNFα VHH 항체(n=4)의 관절내 반감기를 700 kDa CMC에 컨쥬게이션된 항-TNFα VHH에서 제조된 항염증성 생체컨쥬게이트(n=3)의 반감기와 비교하였다. 이 생체컨쥬게이트의 반감기는 컨쥬게이션되지 않은 VHH와 크게 다르지 않았다. 또 다른 독립적인 실험에서, 항-TNFα VHH 항체(n=3)의 관절내 반감기를 850 kDa HyA에 컨쥬게이션된 항-TNFα VHH에서 제조된 항염증성 생체컨쥬게이트(n=3)의 반감기와 비교하였다. 이 생체컨쥬게이트의 반감기는 컨쥬게이션되지 않은 VHH보다 현저히 길었다.
실시예 6. 항염증성 생체컨쥬게이트의 투여 프로토콜에 대한 약리학적 모델
효과적인 치료 용량을 유지하기 위해 필요한 항염증성 펩티드의 필요한 재투여 빈도를 예측하기 위한 모델이 개발되었다. 이 모델은 상이한 국소 조직 반감기를 고려하여 표적 결합 친화도 범위에 걸쳐 눈에서 필요한 항-VEGF 약물을 예측하기 위해 원래 개발된 모델을 기반으로 한다. 이 모델에 적용된 주요 가정은 약물이 1-단계 지수적 감쇠 후 표적 조직에서 제거된다는 것이고, 이는 관절내 투여 후 본 발명의 항염증성 중합체-펩티드 컨쥬게이트에 대해 입증되었다(실시예 3 참조). 임상 조사 연구 결과(PMID: 20642840, 17216015, 18415775)를 사용하여 인간 관절에 효과적인 반응을 제공하기 위한 항염증성 펩티드의 재투여 빈도를 확립하였다(1-2주마다 주사).
관절내 투여 후에 펩티드 약물의 관절내 반감기에 대한 추정치를 감안하면, 치료 농도는 처리 농도와 관련하여 예측될 수 있다. 항염증성 펩티드의 등가 용량(mg/관절)의 투여 빈도를 예측하기 위해, 임상 연구에 사용된 약물에 비해 펩티드의 크기 차이를 고려하여 몰농도의 차이를 설명해야 한다(예를 들어, VHH 항체의 몰 용량은 전통적인 IgG 항체 약물의 등가 질량보다 12배 더 높다). 더욱이, 펩티드가 모델에서 참조로서 사용된 시판 항염증성 IgG와 동등한 결합 친화력을 갖고 있다면, 펩티드-중합체 컨쥬게이트는 시판 IgG보다 10배 더 강력할 것이다. 모델에서, 이것은 참조 약물에 대한 투여량보다 10배 높은 시작 몰 농도를 갖는 것과 동일하다. 이러한 인자들을 종합하면, 펩티드-중합체 컨쥬게이트에 기반하여 항염증성 약물의 재투여를 추정할 수 있다.
실시예 7. 임상 프로토콜
본 개시의 방법으로 치료하기에 적합한 대상체는 염증성 관절 질환 또는 장애, 예를 들어, 상기 열거된 임의의 관절 질환 또는 장애를 갖는 것으로 진단된 개체를 포함한다.
본 개시의 방법으로 치료하기에 적합한 개체는 염증성 관절 질환 또는 장애로 인해 관절 통증 또는 관절 운동 범위가 감소된 개체를 포함한다. 본 개시의 방법으로 치료하기에 적합한 개체는 염증성 관절 질환 또는 장애로 인한 삼출이 있는 개체를 포함한다. 본 개시의 방법으로 치료하기에 적합한 개체는 염증성 관절 질환 또는 장애로 인한 관절에서의 관절 표면 손상을 갖는 개체를 포함한다. 본 개시의 방법으로 치료하기에 적합한 개체는 염증성 관절 질환 또는 장애로 인한 골극에 대한 관절 마모, 석회화 연골, 또는 연골하 골 병변을 갖는 개체를 포함한다.
본 개시의 방법에 의한 치료는 다른 전신 또는 관절내 약물 또는 외과적 개입에 의한 치료를 포함하여, 염증성 관절 질환 또는 장애의 증상을 완화시키는 다른 방법과 조합될 수 있다.
본 개시의 방법으로 치료 후 관절 통증을 측정하기에 적합한 방법은 다음 방법 중 하나 이상을 사용하여 통증의 점수를 매기는 것이다: Western Ontario 및 McMaster Universities 골관절염 지수(WOMAC), 환자 종합 평가(PTGA), 임상 관찰자 종합 평가(COGA), 또는 시각적 유사체 척도(VAS). 본 개시의 방법으로 치료 후 관절 통증을 완화시키는 효능을 측정하기에 적합한 방법은 다음 방법 중 하나 이상을 사용하여 통증의 점수를 매기는 것이다: 구조 진통제의 재사용까지의 시간 및 50보 걷기 후 VAS에 의한 통증 평가. 본 개시의 방법으로 치료 후 관절 운동의 범위를 측정하기에 적합한 방법은 다음 기구 중 하나 이상을 사용하는 것을 포함한다: 고니오미터 또는 이미지 모션 트래킹. 본 개시의 방법으로 치료 후 전반적 환자 이동성 및 삶의 질을 측정하기에 적합한 방법은 다음 방법 중 하나 이상을 사용하여 통증의 점수를 매기는 것이다: 건강 평가 설문지(HAQ) 또는 약식 36(SF-36) 설문지를 이용한 평가. 본 개시의 방법으로 치료 후 관절 손상 부위의 개선을 측정하기에 적합한 방법은 다음 방법 중 하나 이상을 사용하여 통증의 점수를 매기는 것이다: 총 예리 점수(TSS), 관절 미란 점수, 관절 공간 협착(JSN) 점수, 또는 골광물 정량.
이러한 진단 연구 중 하나 이상에서 이상을 보이는 대상체(예를 들어, 건강한 관절에 대해 정상으로 간주되는 범위를 벗어난 대상체)는 본 개시에 따라 치료될 수 있다.
실시예 8. 생체컨쥬게이트 효능을 평가하기 위한 비임상 프로토콜
골관절염-유도된 연골 이화작용을 예방하기 위한 본 개시의 방법에 기반한 치료의 효능은 이전에 기재된 바와 같은 비임상 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 연골 이화작용 바이오마커, 연골 올리고머 기질 단백질(COMP) 및 콜라겐 타입 II의 C-텔로펩티드(CTX-II)의 정확한 종방향 측정을 가능하게 하기 위해서는 이 연구에 성체(> 5개월령) 래트가 필요하다. 마취하에, 래트를 2개의 로딩 플래튼으로 구성된 경골 압박 시스템에 부하시킨다: 하부 플래튼은 구부러진 무릎을 고정하고 상부 플래튼은 발목을 30
Figure pct00008
로 구부린 상태로 발을 고정한다. 축력 시험기(Bose ElectroForce 3200)는 1 mm/s의 속도로 단일 12-N 압박 하중을 가한다. 이 하중 방법은 원위 대퇴골에 비해 경골의 일시적인 전방 아탈구를 통해 마우스에서 일관된 압박 손상을 생성하기에 충분하였다.25 래트는 체중에 따라 무작위화된 3개 그룹으로 나뉘며, 각 그룹은 다음 치료 중 하나를 받는다: 항염증성 생체컨쥬게이트, 컨쥬게이션되지 않은 항염증성 펩티드, 또는 비히클 염수.
부상 직후, 그리고 4, 7 및 10주가 시작될 때, 항-TNFα 치료제 및 대조군을 오른쪽 무릎에 40 μL IA 주사로 투여한다. 모든 치료 그룹에 동일한 용량의 총 항-TNFα 항체(관절 당 총 10 μg의 총 항체에 대해 250 μg/mL)를 투여하여, 약 80 μg/mL(약 4.5 μM)의 IA 농도를 산출한다. 부상 24시간 후, 양 무릎에 IA 주사를 통해 MMP 활성에 대한 형광 리포터(MMPSense750; 2 nmol/관절)를 주사하고, 2, 4, 및 7일에 관절에서 MMP 생체활성을 측정한다. 1, 2, 3, 6, 및 9주의 끝에, 각 래트로부터 약 300 μL의 혈액을 수집한다. 12주의 끝에(84일), 모든 래트를 희생시키고, 두 뒷다리의 대퇴골 및 경골을 수집하고, 이미징 분석을 위해 포르말린에 고정한다. 견본의 이미징은 방사선사진(Faxitron) 또는 μCT 스캐닝(Inveon MM CT)으로 수행될 수 있다. 이후 견본을 일상적인 탈회 조직학을 위해 준비하고 관절의 골관절염 정도를 평가하기 위해 헤마톡살린/에오신 및 Safranin O/Fast 그린으로 염색한다. 조직형태측정 점수는 OA의 래트 모델에 대한 OARSI 지침에 따라 수행된다.
관절 염증을 최소화하기 위한 본 개시의 방법에 기반한 치료의 효능은 이전에 기술된 바와 같이 비임상 전방 십자 인대(ACL) 횡절단(ACLT) 모델 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 간단히 말해서, 래트(300-400g)의 오른쪽 무릎에서 피막절개술을 수행하여 수술용 스캘펄로 ACL을 횡절단한 다음, 수술 부위를 닫는다. 왼쪽 무릎에 ACLT 없이 가짜 수술이 수행되며, 이는 내부 음성 대조군으로 사용된다. ACLT 24시간 후, 래트를 3개의 그룹으로 나누고, 각 그룹은 다음 치료 중 하나를 받는다: 항염증성 생체컨쥬게이트, 컨쥬게이션되지 않은 항염증성 펩티드, 또는 비히클 대조군. 4, 7 및 10주가 시작될 때, 각 치료/대조군의 추가 용량이 양쪽 무릎에 IA 주사로 투여된다. 기준선 및 6 및 9주의 끝에, 염증성 바이오마커 분석을 위해 혈액을 수집하고 연골 이화작용의 대사 마커를 위해 소변을 수집한다. 12주의 끝에, 최종 소변 샘플은 바이오마커 분석을 위한 최종 혈액 수집 전에 수집된다. 두 뒷다리의 대퇴골 및 경골을 수확하여 방사선사진(Faxitron), μCT 스캐닝(Inveon MM CT), 및 MRI(BioSpec 7T)에 의해 이미징한다. 이후 견본을 일상적인 탈회 조직학을 위해 준비하고 관절의 골관절염 정도를 평가하기 위해 헤마톡살린/에오신 및 Safranin O/Fast 그린으로 염색한다. 조직형태측정 점수는 OA의 래트 모델에 대한 OARSI 지침에 따라 수행된다. 혈청 바이오마커 분석은 염증성 사이토카인에 대한 Luminex 멀티플렉시드 ELISA 어레이를 사용하여 수행된다. 이 어레이는 관절 염증을 나타낼 것으로 예상되는 것들을 포함하여: IL-1β, IL-6, IL-10, 및 TNFα, 염증과 관련된 28개의 혈액 인자를 검출한다. 혈청 연골 올리고머 기질 단백질(COMP) 및 콜라겐 타입 II의 C-텔로펩티드(CTX-II)는 연골 이화작용을 정량화하기 위해 ELISA를 사용하여 검출된다.
관절내 마모 입자로 인한 관절 염증 및 뼈용해를 예방하기 위한 본 개시의 방법에 기반한 치료의 효능은 이전에 기술된 바와 같은 비임상 검정을 사용하여 평가될 수 있다(PMID: 22275163 및 2460476) 대퇴 막대(15 mm x 1.5 mm 직경)는 상업적으로 순수한 티타늄으로 만들어졌고(Goodfellow USA) 이중 산 에칭에 의해 이식을 위해 준비된다. 폴리에틸렌 미세입자(1.75 μm 중간 직경; Ceridust VP 3610)를 준비하고 LPS로 도핑하고 이전에 기술된 대로 정량화하여 검증한다.9 티타늄 막대는 래트(300-400g)의 원위 대퇴골에 이식된다. 이식 수술 하루 후, LPS-도핑된 미세입자(주사 당 4.75x107개 입자)의 40 μL 관절내 주사가 매주 수행된다. 이후 래트를 3개의 그룹으로 나누고, 각 그룹은 다음 치료 중 하나를 받는다: 항염증성 생체컨쥬게이트, 컨쥬게이션되지 않은 항염증성 펩티드, 또는 대조군으로서 비히클 염수. 1, 4, 7 및 10주가 시작될 때, 치료 및 대조군의 양쪽 무릎에 40 μL IA 주사를 투여한다. 기준선 및 6 및 9주의 끝에, 염증성 바이오마커 분석을 위해 혈액을 수집한다. 12주의 끝에, 바이오마커 분석을 위한 최종 혈액 수집을 위해 래트를 희생시키고 방사선 분석(Faxitron)을 위해 양쪽 뒷다리의 대퇴골 및 경골을 수확한다. 한 뒷다리의 뼈를 고정하는 한편 다른 뒷다리 뼈는 μCT 스캐닝 및 기계적 시험을 위해 냉동한다. μCT 스캔(Scanco 모델 50)은 뼈-임플란트 접촉을 평가하기 위해 1.5 μm 복셀 크기를 사용하고 임플란트 주변 해면골 및 피질 뼈를 평가하기 위해 10 μm 복셀을 사용하여 임플란트의 장축에 수직인 3개 위치에서 수행된다. 기계적 인발 시험은 다른 곳에서 상세히 설명된 대로 수행된다(Instron 8847 testing System). 정적 조직형태 측정의 경우, 고정된 견본의 절반은 플라스틱 포매, 견본의 미러 피니쉬로의 분쇄, 및 이어서 염기성 푹신 및 톨루이딘 블루로 표면 염색하여 비탈회 조직학을 위해 처리된다. 견본의 나머지 절반은 골-임플란트 계면에서 미세입자의 존재 및 분포를 확인하거나(헤마톡살린 및 에오신 및 편광 현미경) 타르트레이트-내성 산성 포스파타제(TRAP) 염색에 의해 임플란트 주변 영역의 파골세포 수를 확인하기 위해 일상적인 탈회 조직학을 위해 처리된다. 혈청 바이오마커 분석은 염증성 사이토카인에 대한 Luminex 멀티플렉시드 ELISA 어레이를 사용하여 수행된다. 이 어레이는 만성 관절 염증을 나타낼 것으로 예상되는 것들을 포함하여: IL-1, IL-6, IL-10, 및 TNFα, 염증과 관련된 28개의 혈액 인자를 검출한다.5 본 발명자는 이러한 사이토카인이 LPS-도핑된 미세입자에 대한 관절내 노출 후 혈청에서 어떻게 검출 가능하게 상향조절되는지를 보여주는 파일럿 데이터를 가지고 있다.
전술한 본 발명은 이해의 명료함을 위해 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 기재되었으나, 당업자는 첨부된 청구항의 범위 내에서 특정한 변화 및 변형이 실시될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 본원에 제공된 각각의 참고문헌은 각각의 참고문헌이 개별적으로 참조로서 포함되는 것과 동일한 정도로 전체내용이 참조로서 포함된다. 본 출원과 본원에 제공된 참고문헌 사이에 상충되는 부분이 있는 겅우, 본 출원이 우선한다.
서열
SEQ ID NO:1 (항-TNFα 단일-도메인 중쇄(VHH) 항체)
Figure pct00009
SEQ ID NO:2 (항-TNFα 단일-도메인 중쇄(VHH) 항체)
Figure pct00010
SEQ ID NO:3
Figure pct00011
SEQ ID NO:4
Figure pct00012
SEQ ID NO:5
Figure pct00013
SEQ ID NO:6 (항-TNFα 아피바디)
Figure pct00014
SEQ ID NO:7 (항-TNFα 단일-도메인 중쇄(VHH) 항체)
Figure pct00015
SEQ ID NO:8 (항-TNFα 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin))
Figure pct00016
SEQ ID NO:9 (항-IL-1β 단일-사슬(scFv) 항체)
Figure pct00017
SEQ ID NO:10 (가용성 인터루킨 수용체 2(sILR2))
Figure pct00018
SEQ ID NO:11 항-(마우스)TNFα 단일-도메인 중쇄(VHH) 항체
Figure pct00019
SEQUENCE LISTING <110> Valitor, Inc. Jackson, Wesley M. Mohamed, Mavish Brier, Livia W. Healy, Kevin E. <120> MULTIVALENT PEPTIDE CONJUGATES FOR SUSTAINED <130> 052566-504001WO <150> 62/640,749 <151> 2018-03-09 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <223> Anti-TNFa Single-Domain Heavy-chain (VHH) Antibody <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys 35 40 45 Glu Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Asn Thr Tyr 50 55 60 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Ile Ala 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Asp Leu Thr Met Asn Asn Leu Glu Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser 100 105 110 Val Glu Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 2 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 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Claims (57)

  1. 분자량이 약 0.1 MDa 내지 약 3 MDa인 생체적합성 중합체; 및 복수의 펩티드를 포함하는 유효량의 컨쥬게이트를 관절에 주사하는 단계를 포함하는 관절의 질병 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 펩티드가 약 5 kDa 내지 약 150 kDa의 분자량을 갖고;
    이 때
    각각의 펩티드가 중합체에 공유 결합되고,
    컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비가 적어도 약 5:1인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 분자량이 약 0.1 MDa 내지 약 2 MDa인 생체적합성 중합체; 및 복수의 펩티드를 포함하고, 상기 펩티드가 약 5 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖고;
    이 때
    각각의 펩티드가 중합체에 공유 결합되고,
    중합체의 분자량이 펩티드 당 약 5 kDa 내지 약 50 kDa이고,
    컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비가 적어도 약 5:1인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 생체적합성 중합체가 다당류인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 중합체가 글리코사미노글리칸인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 중합체가 히알루론산인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 중합체가 약 0.2 MDa 내지 약 1.5 MDa의 분자량을 갖는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 중합체가 약 0.9 MDa의 분자량을 갖는 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 중합체가 약 0.8 MDa 내지 약 3 MDa의 분자량을 갖는 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 중합체가 약 2 MDa의 분자량을 갖는 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 면역 세포 기능의 활성을 조절하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 종양 괴사 인자-α, 인터루킨-1β, 인터루킨-6, 또는 인터페론-γ를 억제하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 종양 괴사 인자-α를 억제하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 모노클로날 IgG 항체, IgG 항체 단편, 단일-사슬 가변 영역 항체, 단일-도메인 중쇄 항체, 애드넥틴, 아피바디, 안티칼린, DARPin, Kunitz-유형 억제제, 또는 유인 수용체인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 약 5 kDa 내지 약 30 kDa의 분자량을 갖는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 약 10 kDa 내지 약 20 kDa의 분자량을 갖는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:11로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 SEQ ID NO:1에 따른 아미노산 서열을 갖는 방법:
    Figure pct00020
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 대 중합체의 몰비가 약 5:1 내지 약 400:1인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 대 중합체의 몰비가 약 10:1 내지 약 100:1인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 대 중합체의 몰비가 약 30:1 내지 약 50:1인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 약 100 Da 내지 약 500 Da의 분자량을 갖는 링커 및 설파이드 결합을 통해 중합체에 공유 결합되는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 링커가 약 100 Da 내지 약 300 Da의 분자량을 갖는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 링커가 숙신이미드를 포함하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트의 확산 반감기가 펩티드보다 적어도 약 2배 더 긴 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트의 확산 반감기가 펩티드보다 약 2배 내지 약 100배 더 긴 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트의 관절내 반감기가 펩티드보다 적어도 약 20% 더 긴 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트의 관절내 반감기가 펩티드보다 약 20% 내지 약 1000% 더 긴 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 질병 또는 장애가 류마티스 관절염, 마모-관련 골관절염, 연령-관련 골관절염, 외상후 골관절염, 건선 관절염, 및 무균 임플란트 이완, 관절 삼출, 강직척추염, 윤활낭염, 통풍, 반응 관절염, 윤활막염, 또는 무혈관 괴사인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트가 대략 한 달에 한 번 정도로 관절에 주사되는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트가 한 달에 대략 한 번 내지 6개월에 한 번으로 관절에 주사되는 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트가 2개월에 한 번 또는 3개월에 한 번으로 관절에 주사되는 방법.
  32. 분자량이 약 0.1 MDa 내지 약 3 MDa인 생체적합성 중합체; 및 복수의 펩티드를 포함하는 컨쥬게이트로서, 상기 펩티드가 약 5 kDa 내지 약 150 kDa의 분자량을 갖고;
    이 때
    각각의 펩티드가 중합체에 공유 결합되고,
    컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비가 적어도 약 5:1인 컨쥬게이트.
  33. 제32항에 있어서, 분자량이 약 0.1 MDa 내지 약 2 MDa인 생체적합성 중합체; 및 복수의 펩티드를 포함하고, 상기 펩티드가 약 5 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖고;
    이 때
    각각의 펩티드가 중합체에 공유 결합되고,
    중합체의 분자량이 펩티드 당 약 5 kDa 내지 약 50 kDa이고,
    컨쥬게이트에서 펩티드 대 중합체의 몰비가 적어도 약 5:1인 컨쥬게이트.
  34. 제32항에 있어서, 생체적합성 중합체가 다당류인 컨쥬게이트.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 중합체가 글리코사미노글리칸인 컨쥬게이트.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 중합체가 히알루론산인 컨쥬게이트.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 중합체가 약 0.2 MDa 내지 약 1.5 MDa의 분자량을 갖는 컨쥬게이트.
  38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 중합체가 약 0.9 MDa의 분자량을 갖는 컨쥬게이트.
  39. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 중합체가 약 0.8 MDa 내지 약 3 MDa의 분자량을 갖는 컨쥬게이트.
  40. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 중합체가 약 2 MDa의 분자량을 갖는 컨쥬게이트.
  41. 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 면역 세포 기능의 활성을 조절하는 컨쥬게이트.
  42. 제32항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 종양 괴사 인자-α, 인터루킨-1β, 인터루킨-6, 또는 인터페론-γ를 억제하는 컨쥬게이트.
  43. 제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 종양 괴사 인자-α를 억제하는 컨쥬게이트.
  44. 제32항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 모노클로날 IgG 항체, IgG 항체 단편, 단일-사슬 가변 영역 항체, 단일-도메인 중쇄 항체, 애드넥틴, 아피바디, 안티칼린, DARPin, Kunitz-유형 억제제, 또는 유인 수용체인 컨쥬게이트.
  45. 제32항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 약 5 kDa 내지 약 30 kDa의 분자량을 갖는 컨쥬게이트.
  46. 제32항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 약 10 kDa 내지 약 20 kDa의 분자량을 갖는 컨쥬게이트.
  47. 제32항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 및 SEQ ID NO:10으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 컨쥬게이트.
  48. 제32항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 다음 서열을 갖는 컨쥬게이트:
    Figure pct00021
  49. 제32항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 대 중합체의 몰비가 약 5:1 내지 약 400:1인 컨쥬게이트.
  50. 제32항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 대 중합체의 몰비가 약 10:1 내지 약 100:1인 컨쥬게이트.
  51. 제32항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 대 중합체의 몰비가 약 30:1 내지 약 50:1인 컨쥬게이트.
  52. 제32항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 약 100 Da 내지 약 500 Da의 분자량을 갖는 링커 및 설파이드 결합을 통해 중합체에 공유 결합되는 컨쥬게이트.
  53. 제52항에 있어서, 링커가 약 100 Da 내지 약 300 Da의 분자량을 갖는 컨쥬게이트.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 링커가 숙신이미드를 포함하는 컨쥬게이트.
  55. 제32항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트의 확산 반감기가 펩티드보다 적어도 약 2배 더 긴 컨쥬게이트.
  56. 제32항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트의 확산 반감기가 펩티드보다 약 2배 내지 약 100배 더 긴 컨쥬게이트.
  57. 제32항 내지 제56항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
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