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KR20200099172A - 만성 염증성 질환의 치료 방법 - Google Patents

만성 염증성 질환의 치료 방법 Download PDF

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KR20200099172A
KR20200099172A KR1020207020120A KR20207020120A KR20200099172A KR 20200099172 A KR20200099172 A KR 20200099172A KR 1020207020120 A KR1020207020120 A KR 1020207020120A KR 20207020120 A KR20207020120 A KR 20207020120A KR 20200099172 A KR20200099172 A KR 20200099172A
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South Korea
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calcium lactate
composition
acid
active ingredient
polymer
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KR1020207020120A
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English (en)
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장종환
정근영
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(주) 메티메디제약
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Publication date
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Abstract

본 발명은 유효성분으로 칼슘 락테이트를 투여하여 이를 필요로 하는 대상체에서 만성 염증성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 칼슘 락테이트는 약학, 식품 또는 영양 조성물로 제공될 수 있다.

Description

만성 염증성 질환의 치료 방법
만성 염증성 질환(chronic inflammatory disease; CID)은 장기적이고 지속되는 전염증성 상태로 정의되는 만성 염증을 특징으로 하는 병리적 상태에 관한 것이다(1). CID는 호흡기 질환(예컨대, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐렴 및 폐섬유증)(2), 안질환(예컨대, 각막염 및 노인성 황반변성)(3), 자가면역질환(4), 신장병증(5), 신경퇴행성 질환(예컨대, 알츠하이머병, 뇌졸중, 파킨슨병 및 다발경화증)(6), 심혈관계 질환(예컨대, 죽상경화증, 동맥경화증 및 심근염)(7), 대사 장애(예컨대, 당뇨병 및 비만)(8), 근골격계 질환(예컨대, 류마티스 관절염 및 골다공증)(9, 10), 치주 질환(예컨대, 치수염 및 치주염)(11), 소화기 질환(예컨대, 비알콜성 지방간 질환, 위창자염 및 만성 염증성 장질환)(12) 및 피부 장애(예컨대, 건선 및 아토피성 피부염)(13, 14)과 같은, 많은 통상적 및 비통상적 CID를 포함한다.
역학적 연구에 따르면 CID는 지난 30년 동안 증가되어 온 전세계 주요 사망원인이다. 2030년 경에는 미국에서 1억7,100만명의 인구가 CID에 영향을 받을 것으로 예측된다(15). 아스피린, 항히스타민제, COX-2 억제제, 코르티코스테로이드 및 비스테로이드 항염증제(NSAID)와 같은 다양한 염증 치료용 항염증제가 존재한다. 그러나, 부작용 및 일시적 효능으로 인해 현존하는 약물의 장기 투약에는 한계가 존재한다.
치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 만성 염증성 질환의 치료방법이 본원에 개시된다.
치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머병, 파킨슨병, 죽상경화증 및/또는 뇌졸중의 치료방법이 본원에 개시된다.
또한, 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 다발경화증, 노인성 황반변성, 비알콜성 지방간(NAFLD) 및/또는 류마티스 관절염의 치료방법이 개시된다. 일부 구현예에서 방법은 NAFLD의 치료를 위한 것이고 NAFLD는 비알콜성 지방간염(NASH)이다.
또한, 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 치수염 및/또는 치주염의 치료방법이 개시된다.
추가로, 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장질환(IBD)의 치료방법이 개시된다. 일부 구현예에서, IBD는 크론병 또는 궤양성 대장염이다.
추가로, 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 척수손상, 뇌출혈, 심근경색, 각막염 및/또는 당뇨병성 망막병증의 치료방법이 개시된다.
치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 천식, 폐섬유증, 비만, 위창자염, 만성 염증성 장질환 및/또는 아토피성 피부염의 치료방법이 본원에 개시된다. 또한, 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 만성 폐쇄성 폐질환, 폐렴, 각막염, 죽상경화증, 동맥경화증, 심근염, 당뇨, 류마티스성 관졀염, 치수염, 치주염 및/또는 건선의 치료방법이 본원에 개시된다. 또한, 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머병, 뇌졸중, 파킨슨병, 다발경화증, 노인성 황반변성, 비알콜성 지방간 질환, 패혈증 및/또는 골다공증의 치료방법이 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, 칼슘 락테이트는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물로 투여된다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 액체, 분말, 에어로졸, 주사, 수액, 패치, 캡슐, 알약, 정제, 데포 또는 좌약으로 제형화된다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 유효성분으로 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트 및 약학적으로 허용되는 다당류, 폴리머, 지질 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 칼슘 락테이트 및 다당류를 포함한다. 일부 구현예에서, 칼슘 락테이트 대 다당류의 중량비는 1:<0.2 내지 1:5이다. 일부 구현예에서, 칼슘 락테이트 대 다당류의 중량비는 1:<0.2이다. 일부 구현예에서, 칼슘 락테이트 대 다당류의 중량비는 1:0.2 내지 1:5이다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 폴리머 및/또는 지질을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 폴리머 및 지질을 더 포함하고, 여기서 폴리머 대 지질의 중량비는 1:0.1 내지 1:50이다. 일부 구현예에서, 칼슘 락테이트 대 폴리머 및/또는 지질의 중량비는 1:5 이상이다. 일부 구현예에서, 칼슘 락테이트 대 폴리머 및/또는 지질의 중량비는 1:5 내지 1:30이다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 칼슘 락테이트 및 폴리머 및/또는 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 폴리머 및 지질을 포함하고, 여기서 폴리머 대 지질의 중량비는 1:0.1 내지 1:50이다. 일부 구현예에서, 칼슘 락테이트 대 폴리머 및/또는 지질의 중량비는 1:5 이상이다. 일부 구현예에서, 칼슘 락테이트 대 폴리머 및/또는 지질의 중량비는 1:5 내지 1:30이다.
일부 구현예에서, 조성물은 단기 작용성(short-acting)이다. 일부 구현예에서, 조성물은 장기 작용성(long-acting)이다. 일부 구현예에서, 조성물은 주사가능한 조성물이다.
일부 구현예에서, 다당류는 셀룰로오스 유도체, 펙틴, 히알루론산, 전분, 구아검, 키토산, 젤라틴, 콜라겐, 알기네이트, 알긴산 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 폴록사머, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리글리콜릭 락트산(PLGA) 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 지질은 모노- 또는 트리-지방산 글리세린 에스터 또는 폴리에틸렌 글리콜, 식물유의 폴리에틸렌 글리콜 에스터, 지방산 프로필렌 글리콜 에스터, 참깨유, 대두유, 캐스터유, 옥수수유, 팜유, 낙화생유, 카카오유, 면실유, 해바라기씨유, 홍화유, 아몬드유, 올리브유, 수소첨가유, 올레산, 리놀렌산, 리놀레산, 팔미트산, 팔미톨레인산, 아라카돈산, 미리스트산, 카프르산, 카프릴산, 라우르산, 스테아르산, 에틸 올리에이트, 이소프로필 팔미테이트, 옥틸도데실 미리스테이트, 세틸 팔미테이트, 라우릴 알콜, 올레일 알콜, 세틸 알콜, 스테아릴 알콜 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 40% 이상이 6 시간 후에 방출된다.
일부 구현예에서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 60% 이상이 12 시간 후에 방출된다.
일부 구현예에서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 80% 이상이 24 시간 후에 방출된다.
일부 구현예에서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 90% 이상이 48 시간 후에 방출된다.
일부 구현예에서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 40% 미만이 24 시간 후에 방출된다.
일부 구현예에서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 60% 미만이 48 시간 후에 방출된다.
일부 구현예에서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 80% 미만이 72 시간 후에 방출된다.
일부 구현예에서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 90% 미만이 144 시간 후에 방출된다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 멸균 유리 또는 폴리올레핀 용기에 보관된다.
일부 구현예에서, 칼슘 락테이트는 약학적으로 허용되는 장용 코팅제로 코팅된다. 일부 구현예에서, 장용 코팅제는 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트(HPMCP), 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(CAP), 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), 셀락, 메타크릴산 및 그의 에스터의 폴리머 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 칼슘 락테이트 대 장용 코팅제의 중량비는 10:0.5 내지 1:1.5이다. 일부 구현예에서, 37℃에서 50 rpm의 패들 속도의 USP 패들 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서, 조성물이 120 분 동안 0.1 N HCl에 배치된 후 포스페이트 완충액으로 pH 6.8로 조정될 경우 유효성분의 약 20% 미만이 30분 후에 방출된다. 일부 구현예에서, 7℃에서 50 rpm의 패들 속도의 USP 패들 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서, 조성물이 120 분 동안 0.1 N HCl에 배치된 후 포스페이트 완충액으로 pH 6.8로 조정될 경우 유효성분의 30% 미만이 60분 후에 방출된다. 일부 구현예에서, 37℃에서 50 rpm의 패들 속도의 USP 패들 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서, 조성물이 120 분 동안 0.1 N HCl에 배치된 후 포스페이트 완충액으로 pH 6.8로 조정될 경우 유효성분의 50% 미만이 120분 후에 방출된다. 일부 구현예에서, 37℃에서 50 rpm의 패들 속도의 USP 패들 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서, 조성물이 120 분 동안 0.1 N HCl에 배치된 후 포스페이트 완충액으로 pH 6.8로 조정될 경우 유효성분의 10% 미만이 120분 후에 방출된다.
일부 구현예에서, 칼슘 락테이트는 칼슘 락테이트를 포함하는 식품 또는 영양 조성물로 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 주사가능한 영양 보충제이다.
도 1은 인간 백혈병 단핵구(monocyte)에 대한 in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 저산소증 상태의 THP-1 세포(인간 백혈병 단핵구)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(NF-κb)가 감소했음을 나타낸다.
도 2는 대식세포(macrophage)로 분화된 인간 백혈병 단핵구에 대한 in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 정상산소증 및 저산소증 상태에서 PMA(포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트)에 의해 분화된 THP-1 세포(M0 대식세포)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(NF-κb)가 감소했음을 나타낸다.
도 3은 정상산소증 및 저산소증 상태에서 인터페론 감마(IFN-γ) 및 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 분화된 THP-1 세포(M1 대식세포)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(NF-κb)가 감소했음을 나타내는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 4는 정상산소증 및 저산소증 상태에서 인터루킨-4(IL-4) 및 인터루킨-10(IL-10)에 의해 분화된 THP-1 세포(M2 대식세포)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(NF-κb)가 감소했음을 나타내는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 5는 간 섬유증 in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 저산소증 상태의 LX-2 세포(인간 간 성상(stellate) 세포)에서 저산소증 유발 인자-1α(hypoxia inducible factor-1α; HIF-1α)가 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 감소했음을 나타낸다.
도 6은 인간 내피세포 in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 저산소증 상태의 인간 탯줄 정맥 내피세포(human umbilical vein endotheial cell)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 저산소증-매개 인자(락트산 탈수소효소(lactate dehydrogenase) A)가 감소했음을 나타낸다.
도 7은 인간 섬유아세포 in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 저산소증 상태의 CCD-18Co 세포(인간 대장 섬유아세포)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 락트산 탈수소효소 B가 증가했음을 나타낸다.
도 8은 뇌 CID in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 정상산소증 및 저산소증 상태의 SK-N-SH 세포(뇌 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 저산소증-매개 인자가 감소했음을 나타낸다.
도 9는 간 CID in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 저산소증 상태의 HepG2 세포(간 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 저산소증-매개 인자가 변화했음을 나타낸다.
도 10은 저산소증 상태의 HepG2 세포(간 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(TLR-4)가 감소했음을 나타내는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 11은 안구 CID in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 정상산소증 및 저산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 저산소증-매개 인자가 감소했음을 나타낸다.
도 12는 저산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 저산소증 유발 인자-1α(HIF-1α)가 감소했음을 나타내는 면역세포화학 결과를 나타낸다.
도 13는 정상산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 락트산 탈수소화효소 A가 감소했음을 나타내는 면역세포화학 결과를 나타낸다.
도 14는 저산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(핵 인자-카파(nuclear factor-kappa) B)가 감소했음을 나타내는 면역세포화학 결과를 나타낸다.
도 15는 저산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(톨 유사 수용체(toll like receptor) 4)가 감소했음을 나타내는 면역세포화학 결과를 나타낸다.
도 16은 저산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 락트산 탈수소효소 B가 증가했음을 나타내는 면역세포화학 결과를 나타낸다.
도 17은 저산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 드루젠 마커(drusen marker)(아포리포단백질(Apolipoprotein) E)가 감소했음을 나타내는 면역세포화학 결과를 나타낸다.
도 18은 저산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(NF-κb)가 감소했음을 나타내는 면역세포화학 결과를 나타낸다.
도 19는 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 독성이 나타나지 않음을 보여주는 사진이다. 칼슘 락테이트는 오직 손상된 상피 세포의 대사 변화에서 중요한 역할을 담당한다.
도 20은 간 CID (NASH) in vivo 실험을 나타낸다. 혈액 화학 결과는 2 mg/kg 칼슘 락테이트 처리에 의해 혈청 아스팔테이트 아미노기전달효소(AST) 및 알라닌 아미노기전달효소(ALT)가 상당히 감소했음을 나타낸다. **P < 0.001 vs. 메티오닌-콜린 결핍군(MCD). 결과는 평균 ±SD로 나타난다.
도 21은 간 지방증이 2 mg/kg 칼슘 락테이트 처리에 의해 예방되었음을 보여주는 면역조직화학 결과를 나타낸다.
도 22는 간 지질 소립(lipid droplet)이 메티오닌-콜린 결핍(MCD) 군에서 나타나는 반면, 2 mg/kg 칼슘 락테이트 처리군에서는 대조군과 유사하게 나타나지 않음을 보여주는 면역조직화학 결과를 나타낸다.
도 23은 간 면역 세포 침투가 메티오닌-콜린 결핍(MCD) 군에서는 면역 세포 침투가 증가한 반면, 2 mg/kg 칼슘 락테이트 처리군에서는 대조군과 유사하게 감소했음을 보여주는 면역조직화학 결과이다.
도 24는 간 섬유증이 메티오닌-콜린 결핍(MCD) 군에서는 나타나는 반면, 2 mg/kg 칼슘 락테이트 처리군에서는 대조군과 유사하게 나타나지 않음을 보여주는 면역조직화학 결과이다.
도 25는 망막 색소 상피의 조직에 2.5 mM 칼슘 락테이트를 처리함으로써 염증성 인자(NF-κB)가 감소했음을 나타내는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 26은 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 망막 색소 상피가 정상 대조군 상피와 유사한 형태로 회복되었음을 보여주는 면역조직화학 결과를 나타낸다.
도 27은 레이저-유도된 노인성 황반변성(AMD)에서 플랫-마운트 상의 맥락막(choroid) 내층의 병변에 대한 형광 이미지이다.
도 28은 레이저-유도된 노인성 황반변성(AMD)에서 플랫-마운트 상의 맥락막 내층 병변 및 신생혈관에 대한 형광 이미지이다.
도 29는 알츠하이머병 및 뇌졸중 확립을 위한 실험 도식이다.
도 30은 리포폴리사카라이드(LPS)에 의한 뇌손상의 대표 이미지이다. 반대측(Contralateral): 정상 영역. 동측(Ipsilateral): LPS 주사.
도 31은 손상된 뇌 조직의 회복 및 뇌 손상 이후 모집된 미세아교세포(microglia) 침투의 감소를 나타낸다.
도 32는 파킨슨병 확립을 위한 실험 도식이다.
도 33은 칼슘 락테이트 처리에 의한 도파민 뉴런의 회복을 나타낸다.
도 34는 다발경화증 확립을 위한 실험 도식이다.
도 35는 칼슘 락테이트 처리에 의한 탈수초화된 척수의 회복 및 미세아교세포 침투의 감소를 나타낸다.
도 36은 대동맥 조직의 대표적 조직 프로파일을 나타낸다. 좌측 및 중간 조직은헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 나타낸다. 우측 조직은 오일 레드 오(oil red o) 염색을 나타낸다.
도 37은 치주 조직에 대한 마손 삼색 염색(Masson's trichrome staining)을 나타낸다.
도 38은 윗 잇몸(upper gum)에 대한 마손 삼색 염색을 나타낸다.
도 39는 발 및 무릎 관절 조직에 대한 마손 삼색 염색을 나타낸다.
도 40은 크론병 유도를 위한 실험 도식이다.
도 41은 크론병의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색의 대표 이미지를 나타낸다.
도 42는 대장염 유도를 위한 실험 도식이다.
도 43은 대장염의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색의 대표 이미지를 나타낸다.
최근까지 많은 연구들이 CID가 노화와 관련되어 있고 만성 염증이 연령과 연관된 면역-노화 질환과 관련되어 있음을 제안했다(1-29). 만성 염증은 실질 세포(parenchymal cell) 및 간질 세포(stromal cell), 예컨대 면역 세포, 내피 세포 및 섬유아세포 간의 복합적 상호작용을 통해 발생한다고 설명된다. 그 중에서도, 미엘로이드 기원의 세포 예컨대 단핵구 및 활성화된 대식세포는 CID에서 주요 효과기 세포로 확인되었다. 박테리아 리포폴리사카라이드, IFN-감마 및 손상된 세포에 의한 활성화 후 대식세포는 핵 인자-카파(nuclear factor-kappa) B (NF-kB)에 의한 전사 제어를 통해 많은 염증성 사이토카인을 생산하고 내인성 및 외인성 염증성 물질을 클리어링한다. 또한, 대식세포는 더욱 특화된 대식세포 아형으로 더욱 극화된다. 그러나, 미엘로이드 세포의 정교하게 조절된 분화 및 활성화는 만성 염증에서는 제대로 조절되지 않는다. 국소 조직의 저산소증은 저산소증 유발 인자(HIF)의 유도를 통해 실질 세포 및 간질 세포와 같은 세포의 대사 변화를 유발한다. HIF, 특히 HIF-1은 대식세포의 비정상적 활성화에 기여하여 만성 염증 반응의 주요 원인이 된다.
대부분의 CID는 염증을 특징으로 한다. 손상된 조직은 혈류 및 산소 전달에 저항성을 갖게 되므로 저산소증 환경이 된다. 전염증성 매개자 및 저산소증 상태는 HIF-1의 유도를 통해 혈관형성(angiogenic) 반응을 이끌어낼 수 있다. 더욱이, 국소 염증 반응은 호흡기 질환(예컨대, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐렴 및 폐섬유증), 안질환(예컨대, 각막염 및 노인성 황반변성), 자가면역질환, 신장병증, 신경퇴행성 질환(예컨대, 알츠하이머병, 뇌졸중, 파킨슨병 및 다발경화증), 심혈관계 질환(예컨대, 죽상경화증, 동맥경화증 및 심근염), 대사성 장애(예컨대, 당뇨병 및 비만), 근골격계 질환(예컨대, 류마티스 관절염 및 골다공증), 치주 질환(예컨대, 치수염 및 치주염), 소화기 질환(예컨대, 비알콜성 지방간 질환, 위창자염 및 만성 염증성 장질환) 및 피부 장애(예컨대, 건선 및 아토피성 피부염)을 포함하는 대부분의 CID에 존재한다. 염증 도중에 혈관 침투성(vascular permeability)이 증가하고 단핵구, 대식세포, 혈소판, 비만세포 및 다른 백혈구가 케모카인의 유인 하에 모집된다. 따라서, 본원에는 HIF-1, NF-kB 및 락트산 탈수소효소(LAD) A 및 B의 표적화에 의한 대식세포의 활성화 및 세포외기질 분해의 조절을 표적화하는 치료적 접근법이 개시된다.
치료방법
치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 만성 염증성 질환의 치료방법이 본원에 개시된다.
치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머병, 파킨슨병, 죽상경화증 및/또는 뇌졸중의 치료방법이 본원에 개시된다.
치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 다발경화증, 노인성 황반변성, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD) 및/또는 류마티스 관절염의 치료방법이 또한 개시된다. 일부 구현예에서, 방법은 NAFLD의 치료를 위한 것이고 NAFLD는 비알콜성 지방간염(NASH)이다.
치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 치수염 및/또는 치주염의 치료방법이 또한 개시된다.
치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장질환(IBD)의 치료방법이 추가로 개시된다. 일부 구현예에서, IBD는 크론병 또는 궤양성 대장염이다.
치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 척수손상, 뇌출혈, 심근경색, 각막염 및/또는 당뇨병성 망막병증의 치료방법이 추가로 개시된다.
치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 천식, 폐섬유증, 비만, 위창자염, 만성 염증성 장질환 및/또는 아토피성 피부염의 치료방법이 본원에 개시된다. 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 만성 폐쇄성 폐질환, 폐렴, 각막염, 죽상경화증, 동맥경화증, 심근염, 당뇨병, 류마티스 관절염, 치수염, 치주염 및/또는 건선의 치료방법이 또한 본원에 개시된다. 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머병, 뇌졸중, 파킨슨병, 다발경화증, 노인성 황반변성, 비알콜성 지방간 질환 및/또는 패혈증의 치료방법이 또한 본원에 개시된다.
치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 골다공증의 치료방법이 또한 본원에 개시된다.
용어 "대상체" 또는 "환자"는 포유동물 및 비포유동물을 포함한다. 포유동물의 예는 포유동물 부류의 임의의 구성원: 인간, 침팬치와 같은 비인간 영장류, 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 소, 말, 양, 염소, 돼지와 같은 경작용 동물; 토끼, 개 및 고양이와 같은 가축; 래트, 마우스 및 기니피그와 같은 설치류를 포함하는 실험동물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비포유동물의 예는 조류, 어류 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에 제공되는 방법 및 조성물의 일부 구현예예서, 포유동물은 인간 또는 비인간이다.
본원에 이용된 바와 같은 약학 조성물의 투여에 의한 본원에 개시된 1종 이상의 질환의 "처리", "치료하는" 또는 "치료"는 영구적이든 일시적이든, 지속적이든 일시적이든, 조성물의 투여에 기인할 수 있거나 이와 관련이 있을 수 있는 본원에 개시된 1종 이상의 질환의 중증도의 약화, 개시의 지연, 진행의 둔화 또는 지속기간의 단축을 지칭한다.
본원에 이용된 바와 같은 용어 "병용 투여" 등은 단일 환자에게 선택된 두 개 이상의 유효성분을 투여하는 것을 의미하며, 약제가 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 또는 동일하거나 상이한 시기에 투여되는 치료 요법을 포함하는 것으로 의도된다.
본 개시의 약학 조성물은 치료학적 유효량으로 투여될 수 있으며, 본원에 이용된 바와 같은 용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 임의의 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 이득/위험 비율로 질병을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 지칭한다. 유효한 투여량 수준은 질병의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시기, 투여 경로 및 본 개시의 조성물의 배설 속도, 치료 기간, 본 개시의 조성물과 동시에 또는 조합하여 이용되는 약물, 및 기타 의학 분야에 공지된 인자에 따라 결정될 수 있다. 본 개시의 약학 조성물은 단독으로 또는 본원에 개시된 1종 이상의 질환 치료를 위해 공지된 다른 공지의 약물 또는 성분과 조합하여 투여될 수 있다. 상기 인자 모두를 고려하여, 부작용을 초래하지 않으면서 최대 효과를 나타낼 수 있는 최소량으로 조성물을 투여하는 것이 중요하다.
본 개시의 약학 조성물은 1일당 칼슘 락테이트 용량이 예컨대, 약 10 mg/kg 내지 약 1,000 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 250 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 75 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg 또는 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg이 되도록 투여될 수 있다. 조성물의 투여 빈도는 하루에 1회, 2회, 3회, 4회 등의 분할된 용량일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본원에 기술된 화합물(들)을 함유하는 조성물은 예방적 및/또는 치료학적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료학적 적용에서, 조성물은 이미 질병 또는 질환을 앓고 있는 환자에게 질병 또는 질환의 증상을 치유하거나 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 투여된다. 이러한 이용에 효과적인 양은 질병 또는 질환의 중증도 및 경과, 이전의 치료법, 환자의 건강 상태, 체중 및 약물에 대한 반응, 그리고 치료하는 의사의 판단에 달려 있을 것이다. (용량 증가 임상 시험을 포함하나 이에 한정되지 않는) 통상적인 실험에 의해 이러한 치료학적 유효량을 결정하는 것은 당해 분야의 기술 내에 충분히 속하는 것으로 간주된다.
예방적 적용에서, 본원에 기술된 유효성분을 함유하는 조성물은 본원에 개시된 1종 이상의 질환에 걸리기 쉽거나 그렇지 않으면 본원에 개시된 1종 이상의 질환의 위험이 있는 환자에게 투여된다. 이러한 양은 "예방적 유효량 또는 용량"으로 정의된다. 이러한 이용에서, 정확한 양은 또한 환자의 건강 상태, 체중 등에 의존한다. 통상적인 실험(예컨대, 용량 증가 임상 시험)에 의해 이러한 예방적 유효량을 결정하는 것은 당해 분야의 기술 내에 충분히 속하는 것으로 간주된다. 환자에게 이용될 때, 이러한 이용을 위한 유효량은 질병, 장애 또는 질환의 중증도 및 경과, 이전의 치료법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 그리고 치료하는 의사의 판단에 달려 있을 것이다.
환자의 상태가 개선되지 않는 경우, 의사의 재량에 따라, 본원에 기술된 유효성분의 투여는 환자의 질병 또는 질환을 경감시키거나 그렇지 않으면 이의 증상을 제어 또는 제한하기 위하여 만성적으로, 즉 환자가 살아있는 동안 전체를 포함하는 장기간 동안 투여될 수 있다.
그러한 양에 상응할 주어진 약제의 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그것의 중증도, 치료를 필요로 하는 대상체 또는 숙주의 특성(예컨대, 연령, 체중, 성별 등)과 같은 인자에 따라 다를 것이지만, 그럼에도 불구하고 예컨대, 투여될 구체적인 약제, 투여 경로, 치료될 질환 및 치료될 대상체 또는 숙주를 포함하는, 해당 사례를 둘러싼 특정 환경에 따라 당해 분야에 공지된 방식으로 통상적으로 결정될 수 있다.
약학 조성물
용어 "칼슘 락테이트"는 예컨대, 칼슘 이온이 락테이트에 결합된 C6H10O6Ca·5H2O로 표시되는 수화물로서 존재할 수 있는 락테이트 금속염의 유형을 말한다. 칼슘 락테이트는 실온에서 백색 분말 또는 과립의 형태, 120℃ 가열 조건에서 무수 형태일 수 있고, 5%(w/v)의 용해도를 갖는다.
칼슘 락테이트는 본원에 개시된 1종 이상의 질환의 치료를 위한 약학 조성물로 제형화될 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 1종 이상의 질환 치료를 위한 유효성분으로서 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트, 및 약학적으로 허용되는 다당류, 폴리머, 지질 또는 이의 조합을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 이 약학 조성물은 칼슘 락테이트 및 다당류를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 유효성분이 경구로 투여될 때, 유효성분이 위의 산성 환경으로부터 보호되고 대장에 도달하기 전에 소장에서 흡수되도록 하는 칼슘 락테이트의 장용성 코팅제를 제공한다.
또한, 본 발명은 칼슘 락테이트를 포함하는 단기 작용성 및 지속 작용성 약학 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 지속 작용하는 조성물은 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트(HPMCP), 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(CAP), 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), 셀락 및 메타크릴산 및 그의 에스터의 폴리머와 같은 하나 이상의 장용성 코팅 물질로 코팅된 칼슘 락테이트를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 투여를 위한 약학적 제제로 제형화될 수 있다. 제제의 예에는 분말, 정제, 캡슐, 과립 또는 시럽, 정제 및 캡슐이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 시험관 내에서 용액 또는 나노입자 형태로 남아 있을 수 있는 하이드로겔, 특히 메틸셀룰로오스, 폴록사머, 펙틴 및 알기네이트 하이드로겔의 제형이 본원에 제공되며, 겔은 신체 내로 주사될 때 형성될 수 있고 칼슘 락테이트의 지속적인 방출이 가능하다. 하이드로겔의 약점인 상대적으로 짧은 약물 방출 시간은 약물과 하이드로겔 사이의 상호 작용을 증가시킴으로써, 또는 하이드로겔에서 약물의 확산을 지연시킴으로써 개선되었다.
칼슘 락테이트 및 다당류의 중량비는 예컨대, 1:<0.2 내지 1:5, 1:0.01 내지 1:5, 1:0.05 내지 1:5 또는 1:0.1 내지 1:5일 수 있다. 칼슘 락테이트 및 다당류의 중량비는 1:<0.2일 수 있다. 칼슘 락테이트 및 다당류의 중량비는 1:0.2 내지 1:5일 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 폴리머 또는 지질을 더 포함한다. 칼슘 락테이트 및 폴리머 또는 지질의 중량비는 1:5 이상일 수 있다. 칼슘 락테이트 및 폴리머 또는 지질의 중량비는 1:5 내지 1:30, 예컨대 1:5 내지 1:30, 1:5 내지 1:20, 1:5 내지 1:10, 1:10 내지 1:30, 1:10 내지 1:20 또는 1:20 내지 1:30일 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 폴리머 및 지질을 더 포함한다. 칼슘 락테이트 및 폴리머 및 지질의 중량비는 1:5 이상일 수 있다. 칼슘 락테이트 및 폴리머 및 지질의 중량비는 1:5 내지 1:30, 예컨대 1:5 내지 1:30, 1:5 내지 1:20, 1:5 내지 1:10, 1:10 내지 1:30, 1:10 내지 1:20 또는 1:20 내지 1:30일 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 칼슘 락테이트 및 폴리머 또는 지질을 포함한다. 칼슘 락테이트 및 폴리머 또는 지질의 중량비는 1:5 이상일 수 있다. 칼슘 락테이트 및 폴리머 또는 지질의 중량비는 1:5 내지 1:30일 수 있다. 칼슘 락테이트 및 폴리머 또는 지질의 중량비는 1:5 내지 1:30, 예컨대 1:5 내지 1:30, 1:5 내지 1:20, 1:5 내지 1:10, 1:10 내지 1:30, 1:10 내지 1:20 또는 1:20 내지 1:30일 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 칼슘 락테이트 및 폴리머 및 지질을 포함한다. 칼슘 락테이트 및 폴리머 및 지질의 중량비는 1:5 이상일 수 있다. 칼슘 락테이트 및 폴리머 및 지질의 중량비는 1:5 내지 1:30일 수 있다. 칼슘 락테이트 및 폴리머 및 지질의 중량비는 1:5 내지 1:30, 예컨대 1:5 내지 1:30, 1:5 내지 1:20, 1:5 내지 1:10, 1:10 내지 1:30, 1:10 내지 1:20 또는 1:20 내지 1:30일 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리머 및 지질의 중량비는 1:0.1 내지 1:50, 1:0.1 내지 1:20, 1:0.1 내지 1:10, 1:0.1 내지 1:5, 1:0.1 내지 1:2, 1:0.1 내지 1:1, 1:0.1 내지 0.5 또는 1:0.1 내지 1:0.2일 수 있다.
조성물에 이용하기에 적합한 다당류는 셀룰로오스 유도체(예컨대, 카복시메틸 셀룰로오스(CMC), 에틸 셀룰로오스(EC), 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스(HPMC), 메틸 셀룰로오스(MC)), 펙틴, 히알루론산, 전분, 구아검, 키토산, 젤라틴, 콜라겐, 알기네이트, 알긴산 또는 이들의 조합일 수 있다.
조성물에 이용하기에 적합한 폴리머는 폴록사머 계열, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리글리콜릭 락트산(PLGA) 계열 또는 이들의 조합일 수 있다.
조성물에 이용하기에 적합한 지질은 모노- 또는 트리-지방산 글리세린 에스터 또는 폴리에틸렌 글리콜, 식물유의 폴리에틸렌 글리콜 에스터, 지방산 프로필렌 글리콜 에스터, 참깨유, 대두유, 캐스터유, 옥수수유, 팜유, 낙화생유, 카카오유, 면실유, 해바라기씨유, 홍화유, 아몬드유, 올리브유, 수소첨가유, 올레산, 리놀렌산, 리놀레산, 팔미트산, 팔미톨레인산, 아라카돈산, 미리스트산, 카프르산, 카프릴산, 라우르산, 스테아르산, 에틸 올리에이트, 이소프로필 팔미테이트, 옥틸도데실 미리스테이트, 세틸 팔미테이트, 라우릴 알콜, 올레일 알콜, 세틸 알콜, 스테아릴 알콜 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명은 추가로 본원에 개시된 1종 이상의 질환 치료를 위한 유효성분으로서 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트에 관한 것이며, 여기에서 칼슘 락테이트는 약학적으로 허용되는 장용성 코팅제로 코팅된다. 일부 구현예에서, 장용성 코팅제는 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트(HPMCP), 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(CAP), 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), 셀락, 메타크릴산 및 그의 에스터의 폴리머 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 칼슘 락테이트 및 장용성 코팅제의 중량비는 10:0.5 내지 10:15, 10:0.5 내지 1:1, 10:0.5 내지 10:5, 10:0.5 내지 10:3, 10:0.5 내지 10:2, 10:0.5 내지 10:1, 10:0.5 내지 1:0.8이다.
본원에 이용된 바와 같은 "약학적으로 허용되는"은 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 파괴하지 않으며 상대적으로 무독성인, 담체 또는 희석제와 같은 물질을 지칭하며, 즉 이 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하거나 그것이 함유되어 있는 조성물의 임의의 구성요소와 유해한 방식으로 상호 작용하지 않으면서 개체에 투여될 수 있다.
본원에 이용된 바와 같은 약학 조성물은 담체, 안정화제, 희석제, 붕해제, 현탁제, 증점제, 결합제, 항미생물제, 항미생물 보존제, 항산화제 및/또는 완충제와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 약학적으로 허용되는 다른 화학적 구성요소와 칼슘 락테이트의 혼합물을 지칭한다. 약학 조성물은 대상체로의 칼슘 락테이트의 투여를 용이하게 한다.
본원에 이용된 바와 같은 용어 "담체"는 화합물의 세포 또는 조직 내로의 혼입을 용이하게 하는 상대적으로 무독성인 화학적 화합물 또는 약제를 지칭한다. 용어 "희석제"는 운반하기 전 관심 화합물을 희석하는 데 이용되는 화학적 화합물을 지칭한다. 또한, 희석제는 더욱 안정한 환경을 제공할 수 있으므로, 화합물을 안정화하는 데 이용될 수 있다. 약학적으로 허용되는 첨가제는 당해 분야에 잘 알려진 희석제, 결합제, 가용화제, 용해도 증진제, 공극 형성제, 삼투제, 기체 형성제, 윤활제 및 유동화제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
희석제는 락토오스, 프룩토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 말토오스, 미세결정 셀룰로오스, 전분, 인산 수소 칼슘, 만니톨 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 희석제는 미세결정 셀룰로오스, 락토오스, 만니톨, 인산 칼슘 등을 포함한다.
결합제의 예는 포비돈, 하이드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐알콜, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 카복시메틸-셀룰로오스 나트륨 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
가용화제는 계면활성제, 시클로덱스트린 및 이의 유도체, 친유성 물질 또는 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
계면활성제는 수용성 또는 수 분산성 비이온성, 비극성 비이온성, 음이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 이온성 표면 활성화제 또는 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
붕해제의 예는 크로스포비돈, 크로스카멜로오스 나트륨, 글리콜산 전분 나트륨을 포함하고, 윤활제의 예는 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 벤질 알콜, 클로로부탄올, 페닐에틸 알콜, 페닐-머큐릭 아세테이트, 소르브산 칼륨 및 소르브산과 같은 항미생물제를 더 포함할 수 있다. 항진균제는 벤조산, 부틸파라벤, 에틸파라벤, 메틸파라벤, 프로필파라벤 및 벤조산 나트륨과 같은 화합물을 포함한다.
항미생물 보존제는 대개 조성물의 수성 상을 침입하지만 일부의 경우에 유성 상에서도 성장할 수 있는, 잠재적으로 유해한 미생물의 성장으로부터 본 발명의 약학 조성물을 보호하기 위하여 이에 첨가될 수 있다. 따라서, 수성 및 지질 용해도를 모두 갖는 보존제가 바람직하다. 적합한 항미생물 보존제는 예컨대, p-하이드록시벤조산의 알킬 에스테르, 프로피온산 염, 페녹시에탄올, 메틸파라벤 나트륨, 프로필파라벤 나트륨, 데하이드로아세트산 나트륨, 염화 벤잘코늄, 염화 벤제토늄, 벤질 알콜, 히단토인 유도체, 4차 암모늄 화합물 및 양이온성 폴리머, 이미다졸리디닐 우레아, 디아졸리디닐 우레아 및 에틸렌디아민 테트라아세트산 트리나트륨(EDTA)을 포함한다.
조성물 그 자체 또는 이용 환경에 존재하는 산화제, 예컨대 아녹소머, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸레이티드 하이드록시아니솔, 부틸레이티드 하이드록시톨루엔, 차아인산, 메타중아황산 칼륨, 프로필옥틸 및 도데실 갈레이트, 메타중아황산 나트륨, 이산화황 및 토코페롤에 의한 손상 또는 분해로부터 약학 조성물의 모든 활성성분을 보호하기 위하여 항산화제가 첨가될 수 있다.
완충제는 외부 약제의 효과 및 조성물의 구성요소의 평형 이동으로부터, 일단 확립된 약학 조성물의 원하는 pH를 유지하는 데 이용될 수 있다.
본원에 기술된 약학 조성물은 당해 분야에 공지된, 예컨대 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 1975; Liberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999)](전체가 참조로서 본원에 포함됨)에 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 단기 작용한다. 용어 "단기 작용(short-acting)"은 본원에 기술된 시험관 내 용출 시험에서 시험될 때, 48시간 이내, 예컨대 전달 시간 0시간부터 약 1시간 내지 약 48시간까지, 약 3시간 내지 약 24시간까지, 약 6시간 내지 약 24시간까지 또는 약 12시간 내지 약 24시간까지, 실질적으로 모든 유효성분을 방출하는 조성물을 지칭한다.
예컨대, 45 μm의 공극 크기의 나일론 필터를 이용하여 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질에서의 300 rpm의 용출 시험 방법(예컨대, 인도 뭄바이 Labfine Co.로부터)을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서 조성물을 배치할 때, 유효성분의 약 40% 이상은 6시간 후에 방출되고, 유효성분의 약 60% 이상은 12시간 후에 방출되고, 유효성분의 약 80% 이상은 24시간 후에 방출되고/방출되거나, 유효성분의 약 90% 이상은 48시간 이후에 방출된다. 일부 구현예에서, 45 μm의 공극 크기의 나일론 필터를 이용하여 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질에서의 300 rpm의 용출 시험 방법(예컨대, 인도 뭄바이의 Labfine Co.로부터)을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서 조성물을 배치할 때, 유효성분의 적어도 약 40% 내지 약 60%는 6시간 이후에 방출되고, 유효성분의 적어도 약 60% 내지 약 80%는 12시간 이후에 방출되고, 유효성분의 적어도 약 80% 내지 약 90%는 24시간 후에 방출되고/방출되거나 유효성분의 적어도 약 90% 내지 약 100%는 48시간 후에 방출된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 지속 작용한다. 용어 "지속 작용(long-acting)"은 초기 투여 이후에 서서히, 예컨대 전달 시간 0시간부터, 약 48시간 내지 약 192시간까지, 약 72시간 내지 약 192시간까지, 약 96시간 내지 약 192시간까지, 약 120시간 내지 약 192시간까지 또는 약 144시간 내지 약 192시간까지 유효성분을 방출하는 조성물을 의미하는 것으로 의도된다.
일부 구현예에서, 45 μm의 공극 크기의 나일론 필터를 이용하여 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질에서의 300 rpm의 용출 시험 방법(예컨대, 인도 뭄바이의 Labfine Co.로부터)을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서 조성물을 배치할 때, 유효성분의 약 40% 미만은 24시간 후에 방출되고, 유효성분의 약 60% 미만은 48시간 후에 방출되고, 유효성분의 약 80% 미만은 72시간 후에 방출되고, 유효성분의 약 90% 미만은 144시간 후에 방출된다. 일부 구현예에서, 45 μm의 공극 크기의 나일론 필터를 이용하여 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질에서의 300 rpm의 용출 시험 방법(예컨대, 인도 뭄바이의 Labfine Co.로부터)을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서 조성물을 배치할 때, 유효성분의 약 20% 내지 약 50%는 24시간 후에 방출되고, 유효성분의 약 20% 내지 약 40%는 24시간 후에 방출되고, 유효성분의 약 40% 내지 약 70%는 48시간 후에 방출되고, 유효성분의 약 40% 내지 약 60%는 48시간 후에 방출되고, 유효성분의 약 40% 내지 약 80%는 72시간 후에 방출되고, 유효성분의 약 50% 내지 약 80%는 72시간 후에 방출되고, 유효성분의 약 60% 내지 약 90%는 144시간 후에 방출되고 또는 유효성분의 약 70% 내지 약 90%는 144시간 후에 방출된다.
일부 구현예에서, 37℃에서 50 rpm의 패들 속도에서의 USP 패들 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치할 때, 조성물을 120분 동안 0.1 N HCl에 배치한 후 60분 동안 인산 완충액으로 pH 6.8로 조정하면, 유효성분의 약 20% 미만은 30분 후에 방출되고, 유효성분의 약 30% 미만은 약 60분 후에 방출되고, 유효성분의 약 50% 미만은 약 120분 후에 방출되고/방출되거나 유효성분의 약 10% 미만은 약 120분 후에 방출된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 주사 가능한 투여 형태(dosage form)이다. 비경구 주사의 경우, 적절한 제형은 바람직하게는 생리학적으로 적합한(physiologically compatible) 담체와 함께, 수용액 또는 비-수용액을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 약학적 제형은 수용성 형태의 활성 화합물(들)의 수용액을 포함한다. 추가적으로, 유효성분의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 지질 또는 친유성 담체는 참깨유과 같은 지방유, 또는 에틸 올리에이트 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포솜을 포함한다. 지질은 모노- 또는 트리-지방산 글리세린 에스터 또는 폴리에틸렌 글리콜, 식물유의 폴리에틸렌 글리콜 에스터, 지방산 프로필렌 글리콜 에스터, 참깨유, 대두유, 캐스터유, 옥수수유, 팜유, 낙화생유, 카카오유, 면실유, 해바라기씨유, 홍화유, 아몬드유, 올리브유, 수소첨가유, 올레산, 리놀렌산, 리놀레산, 팔미트산, 팔미톨레인산, 아라카돈산, 미리스트산, 카프르산, 카프릴산, 라우르산, 스테아르산, 에틸 올리에이트, 이소프로필 팔미테이트, 옥틸도데실 미리스테이트, 세틸 팔미테이트, 라우릴 알콜, 올레일 알콜, 세틸 알콜, 스테아릴 알콜 또는 이들의 조합일 수 있다.
하이드로겔의 의학적 적용 이후로, 많은 하이드로겔이 의학, 제약 및 화장품 산업을 포함한 많은 분야에서 개발 및 연구되었다. 하이드로겔은 일반적으로 생체에 적합하지만, 약물 전달을 제한하는 여러 가지 문제점이 있어, 이 문제점을 해결하기 위하여 여러 가지 노력을 하고 있다. 하이드로겔은 친수성 폴리머의 네트워크로 구성된 삼차원 구조체이다. 구성요소 중 90% 이상이 물로 구성되어 있다. 하이드로겔은 높은 수분 함량, 다공성 구조, 상대적으로 부드러운 특성, 그리고 생체적합성과 같은 생체 조직과의 유사점으로 인해 생체의학 분야에서 활발히 연구되었다. 하이드로겔은 주 사슬로서 이용되는 폴리머의 종류 또는 채택되는 가교 방법에 따라 다양한 특성을 나타낼 수 있다. 폴리아크릴산 계열의 폴리머 또는 폴리비닐 알콜과 같은 합성 화합물이 이용될 때, 생체적합성은 낮으나 화학적 변형이 쉬워, 공학적 응용이 매우 용이하다. 반면, 천연 화합물, 특히 펙틴, 알기네이트, 콜라겐, 피브린 및 히알루론산이 주 사슬로서 이용될 때, 화학적 변형은 어렵다. 그럼에도, 이는 임상적 응용에 적합하며 이식 시 면역 염증 반응과 같은 부작용이 적어, 생물학적으로 유래된 성분인 이들 물질을 이용하는 것에는 장점이 있다.
이용된 폴리머의 유형뿐만 아니라, 가교 방법 또한 하이드로겔의 특성에 영향을 미친다. 설령 동일한 폴리머가 주 사슬로서 이용되더라도, 가교 방법이 상이하면 전혀 다른 특성의 하이드로겔이 수득될 수 있다. 하이드로겔의 가교 방법은 크게 물리적 방법과 화학적 방법으로 나눌 수 있다. 물리적 가교 방법은 이온성 상호 작용, 소수성 상호 작용, 수소결합, 및 구조적인 얽힘에 의한 가역적인 가교를 포함한다. 이들 가교 방법은 별도의 화학 첨가제나 복잡한 과정 없이 3차원 네트워크 구조의 형성을 쉽게 유도할 수 있다. 반면, 화학적 가교 방법은 전형적으로 물리적 가교 방법과 비교하여 비가역적이고 안정적인 네트워크를 생성하는 공유 결합을 형성한다. 우수한 생체적합성 및 다양한 물리화학적 특성을 가진 하이드로겔은 약물 전달 및 조직 공학과 같은 생체의학 분야에서 광범위하게 연구되었다. 대부분의 하이드로겔은 높은 수분 함량으로 인해 다른 약물 전달 시스템보다 짧은 약물 방출 시간을 나타내며, 더 긴 약물 방출 시간을 가진 시스템을 개발할 필요가 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 경구 투여 형태이다. 경구 투여의 경우, 본원에 기술된 화합물은 유효성분을 당해 분야에 잘 알려진 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 배합하여 쉽게 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 치료되는 환자에 의한 경구 섭취를 위하여, 본원에 기술된 유효성분이 정제, 분말, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 엘릭서, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있게 한다.
경구용 약학적 제제는 하나 이상의 고체 담체를 본원에 기술된 화합물과 혼합하고, 선택적으로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 필요한 경우 적합한 보조제를 첨가한 후 과립의 혼합물을 가공처리하여 정제 또는 당의정 코어(dragee core)를 수득함으로써 수득 될 수 있다. 적합한 부형제는 락토오스, 수크로오스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당류와 같은 충전제; 예컨대, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트래거캔스 검, 메틸셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스 나트륨과 같은 셀룰로오스 제제; 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP 또는 포비돈) 또는 인산 칼슘과 같은 기타를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 필요한 경우, 가교된 크로스카멜로오스 나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 알긴산 나트륨과 같은 이의 염 등의 붕해제가 첨가될 수 있다.
당의정 코어는 적합한 코팅제와 함께 제공된다. 이러한 목적을 위하여, 농축된 당 용액이 이용될 수 있으며, 이는 선택적으로 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 라커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 정제 또는 당의정 코팅제에 염료 또는 색소를 첨가하여, 활성 화합물 용량의 상이한 조합을 확인하거나 특성화할 수 있다.
약학 조성물은 약학적으로 이용될 수 있는 제제로의 유효성분의 가공처리를 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 이용하여 기존의 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다. 임의의 잘 알려진 기술이 적합하고 당해 분야에서 이해되는 바와 같이 이용될 수 있다. 본원에 기술된 약학 조성물은, 오로지 예시로서, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 분쇄, 유화, 캡슐화, 포획 또는 압축 공정에 의해서와 같이, 통상적인 방식으로 제조될 수 있다.
또한, 수성 현탁액은 현탁제로서 하나 이상의 폴리머를 또한 함유할 수 있다. 폴리머는 폴록사머 계열, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리글리콜릭 락트산(PLGA) 계열 또는 이들의 조합일 수 있다. 기타 유용한 폴리머는 셀룰로오스성 폴리머, 예컨대 하이드록시프로필 셀룰로오스와 같은 수용성 폴리머 및 가교된 카복실-함유 폴리머와 같은 수 불용성 폴리머를 포함한다. 또한, 유용한 조성물은 예컨대, 카복시메틸셀룰로오스, 카보머(아크릴산 폴리머), 폴리(메틸메타크릴레이트), 폴리아크릴아미드, 폴리카보필, 아크릴산/부틸 아크릴레이트 코폴리머, 알긴산 나트륨 및 덱스트란으로부터 선택되는, 점막 부착성 폴리머를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 유효성분의 방출을 제어하기 위하여, 칼슘 락테이트 및 약학적으로 허용되는 장용성 코팅제를 포함하는 약학적 투여 형태가 제공된다. 일부 구현예에서, 코팅제는 필름이고, 또 다른 구현예에서 코팅제는 막이다. 장용성 코팅제, 예컨대 필름 또는 막은 위 이후까지 방출을 지연하고, 위액으로부터 유효성분을 보호하는 역할을 할 수 있다. 장용성 코팅제는 바람직하게는 폴리머 속성의 하나 이상의 물질(예컨대, 아래에서 더욱 상세히 기술되는 바와 같은 메타크릴레이트 등; 다당류 등) 또는 선택적으로 예컨대, 가소제와 같은 기타 부형제를 포함하는 2종 이상의 이러한 물질의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 장용성 코팅제는 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트(HPMCP), 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(CAP), 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), 셀락, 메타크릴산 및 그의 에스터의 폴리머 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 조성물은 하이드로겔 형성 폴리머, 및 유효성분의 방출에서 원하는 지연(또는 기타 변화)을 달성할 수 있는 추가의 폴리머를 포함한다.
경구용 정제의 경우, 일반적으로 이용되는 담체는 락토오스 및 옥수수 전분을 포함한다. 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여의 경우, 유용한 희석제는 락토오스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다.
또한, 멸균 주사용 제제는 지질과 같은 무독성의 비경구적으로 허용되는 담체 중의 멸균 주사용 현탁액일 수 있다.
약학 조성물에 포함되는 칼슘 락테이트의 양은 최종 조성물의 총 중량을 기준으로, 1wt% 내지 50wt%, 1wt% 내지 40wt%, 1wt% 내지 35wt%, 1wt% 내지 30wt%, 1wt% 내지 20wt%, 1wt% 내지 15wt% 또는 1wt% 내지 10wt%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 약학 조성물의 단일 용량에 포함되는 칼슘 락테이트의 농도는 2.5 mM 내지 100 mM, 2.5 mM 내지 50 mM, 2.5 mM 내지 25 mM, 5 mM 내지 100 mM, 5 mM 내지 50 mM, 5 mM 내지 25 mM, 10 mM 내지 100 mM, 10 mM 내지 50 mM 또는 10 mM 내지 25 mM일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
고체 경구 약학 조성물은 건식 과립화, 직접 압축, 습식 과립화, 압출 구형화, 용융 과립화 또는 압축 코팅과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 코팅제는 아래에 기술되는 바와 같이 도포될 수 있으며, 두께 및 밀도에 따라 달라질 수 있다. 코팅제의 양은 본 발명의 건조 조성물(예컨대, 칼슘 락테이트를 함유하는 비드 또는 코어)에 첨가된(증가된) 추가 중량으로 정의된다. 중량 증가(gain)는 0.1% 내지 50%, 1% 내지 20%, 1% 내지 15%, 3% 내지 10%, 5% 내지 12% 또는 8% 내지 12%의 범위 내일 수 있다.
코팅 공정은 예컨대, 조성물에 (특히 위에서 기술된 바와 같은) 폴리머 코팅 용액을 도포하는 코팅 기계의 이용에 의해서와 같이, 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있다. 코팅용 폴리머는 직접적인 이용을 위하여 기성품 용액으로 제조업체에 의해 제공되거나, 또는 제조업체의 설명서에 따라 이용 전에 제조될 수 있다.
단위 투여량 및 키트
용어 "단위 투여 형태(unit dosage form)"는 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 구분된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 적합한 약학적 부형제와 함께 미리 결정된 양의 활성 성분을 함유하며, 이로써 원하는 치료학적 효과, 예컨대 본원에 개시된 1종 이상의 질환의 치료를 위해 투약 요법 전반에 걸쳐 하나 이상의 단위 투여 형태가 이용된다.
본원에 기술된 약학 조성물은 정확한 투여량의 단일 투여에 적합한 단위 투여 형태일 수 있다. 단위 투여 형태에서, 제형은 적절한 양의 하나 이상의 유효성분을 함유하는 단위 용량으로 나뉜다. 단위 투여량은 별개의 양의 제형을 함유하는 패키지의 형태일 수 있다. 비제한적인 예는 포장된 정제 또는 캡슐, 그리고 바이알 또는 앰플 내의 분말이다. 수성 현탁액 조성물은 단일 용량의, 재밀봉 불가능한 용기에 포장될 수 있다. 대안적으로, 다중 용량의 재밀봉 가능한 용기가 이용될 수 있으며, 이 경우 조성물에 보존제를 포함하는 것이 일반적이다. 오로지 예시로서, 비경구 주사용 제형은 앰플을 포함하나 이에 한정되지 않는 단위 투여 형태로, 또는 다중 용량 용기에 존재할 수 있다.
칼슘 락테이트에 적절한 1일 투여량은 체중당 약 1 mg/kg 내지 약 1000 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 750 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 500 mg/kg 또는 약 100 mg/kg 내지 500 mg/kg일 수 있다. 인간을 포함하나 이에 한정되지 않는 더 큰 포유동물에서의 지시된 1일 투여량은 약 5 mg 내지 약 100,000 mg 범위 내이며, 1일 최대 4회를 포함하나 이에 한정되지 않는 분할된 용량으로 또는 지속 작용하는 형태로 편리하게 투여된다. 투여를 위한 적합한 단위 투여 형태는 약 10 mg 내지 약 1000 mg, 약 100 mg 내지 약 1000 mg, 약 500 mg 내지 약 750 mg, 약 25 mg 내지 약 250 mg, 약 50 mg 내지 약 100 mg, 약 10 mg 내지 약 200 mg 또는 약 10 mg 내지 약 250 mg의 유효성분을 포함한다. 본 개시의 조성물의 투여 빈도는 하루에 1회, 2회, 3회, 4회 등의 분할된 용량일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 임의의 개별적인 사례에서, 적절한 "유효"량은 용량 증가 연구와 같은 기술을 이용하여 결정될 수 있다.
전술한 범위는 개별적인 치료 계획과 관련하여 변수의 개수가 많아지고, 앞의 범위는 시사하는 것일 뿐이고, 이러한 권장 값으로부터의 상당한 이탈은 일반적이지 않다. 이러한 투여량은 이용되는 화합물의 활성, 치료될 질병 또는 질환, 투여 방식, 개별 대상체의 요건, 치료될 질병 또는 질환의 중증도에 한정되지 않는 변수의 수 및 의료진의 판단에 따라 변경될 수 있다.
이러한 치료 요법의 독성 및 치료 효능은 LD50(집단의 50%에 대해 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 유효한 용량)의 결정을 포함하나 이에 한정되지 않는, 세포 배양 또는 실험동물에서의 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료학적 효과 사이의 용량비가 치료 지수이며, 이는 LD50과 ED50 사이의 비율로서 나타내질 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 획득되는 데이터는 인간에 이용하기 위한 투여량 범위를 공식화하는 데 이용될 수 있다. 유효성분의 투여량은 바람직하게는 최소한의 독성을 나타내는, ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내이다. 투여량은 이용되는 투여 형태 및 활용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다.
본 발명에 따르면, 약학 조성물은 멸균 주사용 제제, 예컨대 멸균 주사용 수성 또는 유질 현탁액의 형태일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 경구적으로 허용되는 투여 형태로 경구 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 개시된 약학 조성물을 포함하는 멸균 유리 또는 폴리올레핀 용기에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 용기는 비-DEHP (비스(2-에틸헥실) 프탈레이트(디-2-에틸헥실 프탈레이트, 디에틸헥실 프탈레이트, DEHP; 디옥틸 프탈레이트, DOP) 또는 비-PVP (폴리비닐피롤리돈)이다.
키트는 박스, 개별 보틀, 백 또는 앰플과 같은 적합한 용기를 포함한다. 현탁액 조성물은 단일 용량의 재밀봉 불가능한 용기 또는 다중 용량의 재밀봉 가능한 용기에 포장될 수 있다.
2017년 12월 21일 공개된 US2017/0360727A1, 국제출원일을 2017년 7월 7일로 하는 PCT/IB2017/054091은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 2018년 1월 12일 출원된 미국 특허출원 제62/616,923호의 전체 내용 역시 본원에 참조로 포함된다.
<실시예>
실시예 1. 노인성 황반변성을 위한 세포 배양
인간 망막 색소 상피 세포주인 ARPE-19를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(Manassas, VA, USA)에서 구입했다. ARPE-19 세포를 10% 우태아 혈청(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA), 100 IU/mL 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(Welgene, Daegu, South Korea)을 함유하는 RPMI1640에서 유지했다.
실시예 2. 알츠하이머병을 위한 세포 배양
인간 뇌 세포주인 SK-N-SH를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(Manassas, VA, USA)에서 구입했다. SK-N-SH 세포를 10% 우태아 혈청(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA), 100 IU/mL 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(Welgene, Daegu, South Korea)을 함유하는 RPMI1640에서 유지했다.
실시예 3. 섬유아세포를 위한 세포 배양
인간 대장 섬유아세포주인 CCD-18-Co를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(Manassas, VA, USA)에서 구입했다. CCD-18Co 세포를 10% 우태아 혈청(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA), 100 IU/mL 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(Welgene, Daegu, South Korea)을 함유하는 DMEM에서 유지했다.
실시예 4. 비알콜성 지방간염(NASH)를 위한 세포 배양
인간 간세포 상피암 세포주인 HepG2를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(Manassas, VA, USA)에서 구입했다. HepG2 세포를 10% 우태아 혈청(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA), 100 IU/mL 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(Welgene, Daegu, South Korea)을 함유하는 RPMI 1640에서 유지했다.
실시예 5. 혈관 질환을 위한 세포 배양
인간 탯줄 정맥 내피 세포주인 HUVEC을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(Manassas, VA, USA)에서 구입했다. HUVEC 세포를 내피세포 성장 배지 2 서플리먼트(Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement) MIX(PromoCell, Heidelberg, Germany) 내 내피세포 성장 배지 2(Endothelial Cell Growth Medium 2)에서 유지했다.
실시예 6. 대식세포 배양
인간 간 성상 세포주인 LX-2를 시그마-알드리치(St Louis, MO, USA)에서 구입했다. LX-2 세포를 2% 우태아 혈청(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA), 100 IU/mL 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(Welgene, Daegu, South Korea)을 함유하는 DMEM에서 유지했다.
인간 단핵구 세포주인 THP-1를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(Manassas, VA, USA)에서 구입했다. THP-1 세포를 10% 우태아 혈청(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA), 100 IU/mL 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신(Welgene, Daegu, South Korea) 및 0.55 uM 2-머캡토에탄올을 함유하는 RPMI 1640에서 유지했다. 세포를 5% CO2 함유 37℃ 습윤화된 대기 조건과 1%, 5% 및 94% 산소로 유지되는 저산소증 배양 조건의 양 조건에서 배양했다.
실시예 7. 시약
칼슘 락테이트(CaLa) 및 리포폴리사카라이드(LPS)를 시그마-알드리치(St Louis, MO, USA)에서 구입했다. 2-머캡토에탄올을 지브코(Gibco)(Grand Island, NY, USA)에서 구입했다. 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)를 엔조 라이프사이언스(Enzo Lifesciences)(Enzo Diagnostic, NY, USA)에서 구입했다. 인간 인터페론-감마, 인간 인터루킨-4(IL4) 및 인간 인터루킨-10(IL-10)을 BPS 바이오사이언스(Bioscience)(San Diego, CA, USA)에서 구입했다. 파라포름알데히드(PFA) 용액(4%)을 바이오세상(Biosesang)(Biosesang Inc., Gyeonggi, Korea)에서 구입했다.
실시예 8. 세포 생존률 분석
ARPE-19 세포에서 실시간 세포 영상 분석기 JuLI™ Br(NanoEnTek Inc., Seoul, Korea)을 이용하여 CaLa의 독성을 확인했다. 세포를 배지 내 2.5 ×105 세포/웰의 농도로 6-웰 배양 플레이트에 시딩했다. 24 시간 인큐베이션 후, 세포를 12 시간 및 24 시간 동안 2.5 mM CaLa로 처리했다. 세포를 CaLa 처리 시간 동안 24 시간 동안 계속적으로 모니터링했다(30, 31).
실시예 9. 대식세포 분화
인간 단핵구 세포주 THP-1를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(Manassas, VA, USA)에서 구입했다. THP-1 세포를 10% 우태아 혈청(Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT, USA), 100 IU/ml 페니실린(Welgene, Daegu, South Korea), 100 μ스트렙토마이신(Welgene, Daegu, South Korea) 및 0.55 μ2-머캡토에탄올(Gibco, Grand Island, NY, USA)로 보충된 RPMI 1640 배지(Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT, USA)에서 유지했다. THP-1 세포를 37℃의 5% CO2 습윤화 대기에서 유지했다. THP-1 단핵구를 RPMI 1640 배지 내 100 μ포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)(Enzo Diagnostic, NY, USA)로 12 시간 인큐베이션하여 대식세포로 분화시켰다. 대식세포를 RPMI 1640 배지 내 20 ng/ml의 IFN-γ(BPS Bioscience, San Diego, CA, USA) 및 100 μ의 LPS(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)로 24 시간 인큐베이션하여 M1 대식세포로 극화시켰다. 대식세포 M2 극화는 RPMI 1640 배지 내 20 ng/ml의 IL-4(BPS Bioscience, San Diego, CA, USA) 및 20 ng/ml의 IL-10(BPS Bioscience, San Diego, CA, USA)로 24 시간 인큐베이션하여 얻었다.
실시예 10. 세포 생존률의 광학적 관측
ARPE-19 세포에서 실시간 세포 영상 분석기 JuLI™ Br (NanoEnTek Inc., Seoul, Korea)를 이용하여 CaLa의 독성을 확인했다. 세포를 배지 내 2.5 ×105 세포/웰의 농도로 6-웰 배양 플레이트에 시딩했다. 24 시간 인큐베이션 후, 세포를 12 시간 및 24 시간 동안 2.5 mM CaLa로 처리했다. 세포를 CaLa 처리 시간 동안 24 시간 동안 계속적으로 모니터링했다.
실시예 11. 웨스턴 블롯 분석
전체 세포 용해물을 준비하기 위해, 세포를 프로테아제 억제제 칵테일(Roche, Basel, Switzerland) 및 포스파테이즈 억제제(NA3VO4 1 mM, NaF 100 mM)를 포함하는 용해 완충액(1% NP-40, 0.25% 소듐 데옥시콜레이트, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10% 글리세롤)로 용해시켰다. 그 다음, 단백질 농도를 BCA(Bicinchoninic acid assay) 키트(Thermo Scientific, Waltham, MA)를 이용해 측정했다. 전체 세포 또는 세포핵 용해물을 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인(Merck Millipore, Billerica, MA, USA) 위에 트랜스퍼했다. 5% 비-지방 밀크(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 1 시간 동안 블로킹 후, 5% BSA 및 0.1% 소듐 아자이드(시그마-알드리치)가 첨가된, 시그마-알드리치에서 얻은 100 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1.5 M NaCl 및 0.5% 트윈(Tween)-20을 함유하는 TBST에 희석된 일차 항체로 멤브레인을 4℃에서 밤새 인큐베이션했다: HIF-1α (1:1000), HIF-2α (1:1000), LDH-A (1:1000), LDH-B (1:1000), TLR-4 (1:1000), NF-κB (1:1000), VEGF (1:1000), α-튜불린(tubulin) (1:1000), 액틴(Actin) (1:1000) 및 GAPDH (1:5000)에 대한 특이적 일차 항체. 다음날, 멤브레인을 TBST로 세척하고 항-토끼 이차 항체(1:10000)로 2 시간 동안 인큐베이션했다. 제조사 프로토콜에 따라 면역블롯을 웨스턴 블롯 검출 시약(Abclone, Seoul, Korea)을 이용하여 디벨로프하고 X-선 필름(Agfa, Leverkusen, Germany)에 노출했다.
실시예 12. 면역세포화학
ARPE-19 및 SK-N-SH 세포를 바이오-코팅된 커버슬립(BD bioscience, San Jose, CA, USA) 상에 4% PFA로 20 분 동안 고정한 다음, 일차 항체로 15 시간 동안 인큐베이션했다. 일차 항체는 다음과 같다: HIF-1α (1:300, BD Biosciences, San Jose, CA, USA); LDH-A (1:300, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); LDH-B (1:300, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); NF-κB (1:300, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); TLR-4 (1:300, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); apoE (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). PBS 세척 이후, 세포를 항-마우스 이차 바이오티닐화 항체(1:2000, Vector Laboratorie, Burlingame, CA, USA)로 인큐베이션하고, 플루오레신이 컨쥬게이션된 스트렙타비딘으로 시각화했다(Vector Laboratorie, Burlingame, CA, USA). 커버슬립을 DAPI(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)와 함께 VECTASHIELD®하드 세트(Hard Set)™ 마운팅 미디엄(Mounting Medium)으로 현미경 슬라이드 상에 마운팅했다. 60X 유침 렌즈 하에서 컨포컬 레이저 스캐닝 현미경(LSCM, Nikon A1+, Tokyo, Japan)으로 컨포컬 형광 이미지를 얻었다.
실시예 13. NASH를 위한 동물 모델
모든 실험은 가천대학교 동물실험윤리위원회에서 확립된 기관 가이드라인(IACUC-2017-0008)에 따라 수행했다. 암컷 5주령 C57BL/6 마우스를 KOATEC(Pyeongtaek, South Korea)에서 구입했고 메티오닌-콜린 식단(MCD)을 4 주 동안 섭취시켰다. 마우스가 각각 15 g 칭량되면 마우스를 랜덤하게 부검하여 비알콜성 지방간염(NASH)을 확인했다. 마우스에 칼슘 락테이트(2 mg/kg)를 피하로 4 주 동안 하루 2회(B.I.D) 주사했다.
실시예 14. 노인성 황반변성에 대한 동물 모델
모든 실험은 가천대학교 동물실험윤리위원회에서 확립된 기관 가이드라인(IACUC-2017-0008)에 따라 수행했다. 6주령 암컷 C57BL/6 마우스(20-25 g)를 오리엔트(Charles River Korea, Seoul, Korea)에서 구입했다. 모든 동물을 먹이와 물에 자유롭게 접근할 수 있는 상태에서 22℃ - 25℃에서 12 시간 명/암 사이클(점등, 08:00)로 유지했다. 마우스를 인덕션 챔버에 개별적으로 배치하고, 2% 이소플루란(HANA PHARM CO., Seoul, Korea)으로 마취를 유도했다. 레이저 광응고술(SDL405-700, SD Laser, China)로 마우스의 각 안구에 병변을 유도했다. 레이저 펄스는 블루 레이저(wavelength, 405 nm; SD Laser) 유래였다. 레이저 파라미터는 100 μ스폿 사이즈, 700 mw 출력 및 1 초 노출 시간이었다. 총 15 마리의 마우스를 세 그룹으로 랜덤화했다: (i) 레이저 유도를 받지 않은 그룹(n = 3); (ii) 레이저 화상을 받고 비히클 완충액을 주사받은 그룹(n = 5); 및 (iii) 레이저 화상을 받고 CaLa를 2 mg/kg/day (B.I.D)로 주사받은 그룹(n=7). CaLa 처리를 레이저 광응고술 이후 시작했고 14 일 동안 피하에 처리했다(33, 34).
실시예 15. NASH 모델에 대한 조직 분석
마우스 간 조직(n = 5)을 절제하고 4% 파라포름알데히드 PBS 용액으로 15 시간 동안 4℃에서 고정했다. 고정된 간 조직을 파라핀에 포매하고 10 μm로 절편화했다. 슬라이드를 55℃에서 2 h 동안 인큐베이션하고, 자일렌에서 후속 탈파라핀화하고 계열 농도의 에탄올로 재수화하여 헤마톡실린(Merck, Darmstadt, Germany) 및 에오신 염색(H&E)에 이용했다(35). H&E로 염색한 파라핀 절편(10 μm 두께)을 라이카(Leica) DM 1000 LED 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 이미징했다.
실시예 16. 노인성 황반변성을 위한 조직 분석
망막 병변의 조직병리 검사를 2 mg/kg의 CaLa 피하 투여 2 주 후 수행했다. 제핵된 안구를 4% 파라포름알데히드(PFA)로 4℃에서 24 시간 동안 고정하고, 전상엽구(anterior segment)를 제거하여 얻은 안구를 포스페이트-완충된 식염수로 세 차례 세척했다. 고정된 플랫-마운트를 계열 농도의 에탄올로 탈수하고 파라핀에 포매했다. 파라핀 절편(10 μm 두께)를 헤마톡실린(Merck, Darmstadt, Germany) 및 에오신(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 으로 염색하고 라이카 DM 1000 LED 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 이미징했다. 플랫-마운트 상의 맥락막 병변 및 신생혈관을 컨포컬 현미경으로 관측했다(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).
실시예 17. 마손 삼색 염색
마우스 간 조직(n = 5)을 절제하고 4℃에서 15 시간 동안 4% 파라포름알데히드 PBS 용액으로 고정했다. 고정된 조직을 파라핀에 포매하고 5 mm로 절편화했다. 슬라이드를 55℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 자일렌에서 후속 탈파라핀화하고, 계열 농도의 에탄올로 재수화하고, Bouin 용액에서 56℃에서 1 시간 동안 재고정하고, 수돗물로 5-10 분 세정하여 황색을 제거하고 비브리히 스칼렛(Biebrich scarlet)-산성 푹신(acid fuchsin) 용액으로 5 분 동안 염색한 다음 포스포몰리브덴(phosphomolybdic)-포스포텅스텐산(phosphotungstin acid) 용액(비 1: 1)으로 30 분 동안, 그리고 아닐린 블루 용액으로 15 분 동안 염색했다. 증류수로 짧게, 그리고 1% 아세트산 용액으로 2-5 분 동안 세정했다. 95% 에틸 알콜, 절대 알콜로 재수화하고 자일렌으로 클리어링했다. 마운팅 배지로 마운트했다. 라이카 DM 1000 LED 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 이미징했다.
실시예 18. 결과
도 1은 인간 백혈병 단핵구에 대한 in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 저산소증 상태의 THP-1 세포(인간 백혈병 단핵구)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(NF-κb)가 감소했음을 나타낸다.
도 2는 대식세포로 분화된 인간 백혈병 단핵구에 대한 in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 정상산소증 및 저산소증 상태에서 PMA(포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트)에 의해 분화된 THP-1 세포(M0 대식세포)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(NF-κb)가 감소했음을 나타낸다.
도 3은 정상산소증 및 저산소증 상태에서 인터페론 감마(IFN-γ) 및 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 분화된 THP-1 세포(M1 대식세포)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(NF-κb)가 감소했음을 나타내는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 4는 정상산소증 및 저산소증 상태에서 인터루킨-4(IL-4) 및 인터루킨-10(IL-10)에 의해 분화된 THP-1 세포(M2 대식세포)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(NF-κb)가 감소했음을 나타내는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 5는 간 섬유증 in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 저산소증 상태의 LX-2 세포(인간 간 성상 세포)에서 저산소증 유발 인자-1α(HIF-1α)가 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 감소했음을 나타낸다.
도 6은 인간 내피세포 in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 저산소증 상태의 인간 탯줄 정맥 내피세포에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 저산소증-매개 인자(락트산 탈수소효소 A)가 감소했음을 나타낸다.
도 7은 인간 섬유아세포 in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 저산소증 상태의 CCD-18Co 세포(인간 대장 섬유아세포)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 락트산 탈수소효소 B가 증가했음을 나타낸다.
도 8은 뇌 CID in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 정상산소증 및 저산소증 상태의 SK-N-SH 세포(뇌 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 저산소증-매개 인자가 감소했음을 나타낸다.
도 9는 간 CID in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 저산소증 상태의 HepG2 세포(간 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 저산소증-매개 인자가 변화했음을 나타낸다.
도 10은 저산소증 상태의 HepG2 세포(간 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(TLR-4)가 감소했음을 나타내는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 11은 안구 CID in vitro 실험을 나타낸다. 웨스턴 블롯 결과는 정상산소증 및 저산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 저산소증-매개 인자가 감소했음을 나타낸다.
도 12는 저산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 저산소증 유발 인자-1α(HIF-1α)가 감소했음을 나타내는 면역세포화학 결과를 나타낸다.
도 13는 정상산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 락트산 탈수소화효소 A가 감소했음을 나타내는 면역세포화학 결과를 나타낸다.
도 14는 저산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(핵 인자-카파 B)가 감소했음을 나타내는 면역세포화학 결과를 나타낸다.
도 15는 저산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(톨 유사 수용체 4)가 감소했음을 나타내는 면역세포화학 결과를 나타낸다.
도 16은 저산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 락트산 탈수소효소 B가 증가했음을 나타내는 면역세포화학 결과를 나타낸다.
도 17은 저산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 드루젠 마커(아포리포단백질 E)가 감소했음을 나타내는 면역세포화학 결과를 나타낸다.
도 18은 저산소증 상태의 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 염증성 인자(NF-κb)가 감소했음을 나타내는 면역세포화학 결과를 나타낸다.
도 19는 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 ARPE-19 세포(망막 색소 상피)에서 독성이 나타나지 않음을 보여주는 사진이다. 칼슘 락테이트는 오직 손상된 상피 세포의 대사 변화에서 중요한 역할을 담당한다.
도 25는 망막 색소 상피의 조직에 2.5 mM 칼슘 락테이트를 처리함으로써 염증성 인자(NF-κB)가 감소했음을 나타내는 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
실시예 19. 소화기 질환(NFALD, NASH) 표적화
재료 및 실험
간 질환을 위한 동물 모델: 모든 실험은 가천대학교 동물실험윤리위원회에서 확립된 기관 가이드라인(IACUC-2017-0008)에 따라 수행했다. 5주령 C57BL/6 마우스를 KOATEC(Pyeongtaek, South Korea)에서 구입했고 메티오닌-콜린(MCD) 식단을 4 주 동안 섭취시켰다. 마우스에게 4주 동안 칼슘 락테이트(2 mg/kg)를 일일 2회(B.I.D) 피하 주사했다.
조직 분석: 마우스 간 조직 (n = 5)을 절제하고 4% 포름알데히드 PBS 용액으로 15 시간 동안 4℃에서 고정했다. 고정된 간 조직을 파라핀에서 포매하고 10 μm로 절편화했다. 슬라이드를 55℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 자일렌으로 후속 탈파라핀화하고 계열 농도의 에탄올로 재수화하고 헤마톡실린(Merck, Darmstadt, Germany) 및 에오신 염색(H&E) 에 이용했다. H&E로 염색한 파라핀 절편(10 μm 두께)를 라이카 DM 1000 LED 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 이미징했다.
마손 삼색 염색: 마우스 간 조직(n = 5)을 절제하여 4% 파라포름알데히드 PBS 용액에 4℃에서 15 시간 동안 고정했다. 고정된 조직을 파라핀에 포매하고 5 mm로 절편화했다. 슬라이드를 55℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 자일렌에서 후속 탈파라핀화하고 계열 농도의 에탄올에서 재수화하고 Bouin 용액에서 56℃에서 1 시간 동안 재고정하고, 5~10 분 동안 수돗물로 세정하여 황색을 제거하고, 비브리히 스칼렛-산성 푹신 용액으로 5 분 동안 염색한 다음 포스포몰리브덴-포스포텅스텐산 용액(비 1: 1)으로 30 분 동안, 그리고 아닐린 블루 용액으로 15 분 동안 염색했다. 증류수로 짧게, 그리고 1% 아세트산 용액으로 2-5 분 동안 세정했다. 95% 에틸 알콜, 절대 알콜로 재수화하고 자일렌으로 클리어링했다. 마운팅 배지로 마운트했다. 라이카 DM 1000 LED 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 이미징했다.
도 20은 간 CID (NASH) in vivo 실험을 나타낸다. 혈액 화학 결과는 2 mg/kg 칼슘 락테이트 처리에 의해 혈청 아스팔테이트 아미노기전달효소(AST) 및 알라닌 아미노기전달효소(ALT)가 상당히 감소했음을 나타낸다. **P < 0.001 vs. 메티오닌-콜린 결핍군(MCD). 결과는 평균 ±SD로 나타난다.
도 21은 지질 소립(간 조직 내 하얀 구멍)이 메티오닌-콜린 결핍(MCD) 군에서 잘 관측되는 반면, 칼슘 락테이트 처리군에서는 관측되지 않음을 보여주는 면역조직화학 결과를 나타낸다. 지방증은 2 mg/kg 칼슘 락테이트 처리에 의해 예방되었다. 이 결과는 지방증이 칼슘 락테이트 처리에 의해 예정됨을 보여주는 결과이다.
도 22는 간 지질 소립(간 조직 내 하얀 구멍)이 메티오닌-콜린 결핍(MCD) 군에서 나타나는 반면, 2 mg/kg 칼슘 락테이트 처리군에서는 대조군과 유사하게 나타나지 않음을 보여주는 면역조직화학 결과를 나타낸다.
도 23은 간 면역 세포 침투가 메티오닌-콜린 결핍(MCD) 군에서는 면역 세포 침투가 증가한 반면, 2 mg/kg 칼슘 락테이트 처리군에서는 대조군과 유사하게 감소했음을 보여주는 면역조직화학 결과를 나타낸다.
도 24는 간 섬유증(콜라겐 축적 부위; 흰색 화살표)이 메티오닌-콜린 결핍(MCD) 군에서는 나타나는 반면, 2 mg/kg 칼슘 락테이트 처리군에서는 대조군과 유사하게 나타나지 않음을 보여주는 면역조직화학 결과를 나타낸다.
실시예 20. 안질환(노인성 황반변성(AMD), 각막염 및 당뇨병성 망막병증) 표적화
재료 및 방법
동물: 모든 실험은 가천대학교 동물실험윤리위원회에서 확립된 기관 가이드라인(IACUC-2017-0008)에 따라 수행했다. 6주령 C57BL 마우스를 오리엔트(Charles River Korea, Seoul, Korea)에서 구입했다. 모든 동물을 먹이와 물에 자유롭게 접근할 수 있는 상태에서 22℃ - 25℃에서 12 시간 명/암 사이클(점등, 08:00)로 유지했다.
칼슘 락테이트의 준비: 칼슘 락테이트를 시그마 알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. 2 mg/kg의 칼슘 락테이트를 매일 피하 주사(21 일)를 위해 식염수에 용해시켰다.
안질환을 위한 동물 모델: 마우스를 인덕션 챔버에 개별적으로 배치하고 2% 이소플루란(HANA PHARM CO., Seoul, Korea)으로 마취를 유도했다. 레이저 광응고술(SDL405-700, SD Laser, China)로 마우스 양쪽 안구에 브루흐 멤브레인(Bruch's membrane)의 레이저 유도 파열을 유도했다. 레이저 펄스는 녹색 레이저(파장 532 nm; Visulas, 532; SD 레이저) 유래였다. 레이저 파라미터는 100 μm 스폿 사이즈, 700 mw 출력 및 1초 노출시간이었다.
맥락막 플랫 마운트의 준비: 레이저 손상 후 21일 후, 각 그룹의 마우스를 마취시키고, 25 mg 플루오레신 이소티오시아네이트-덱스트란(시그마-알드리치, St.Louis, MO, USA)을 함유하는 1.0 mL PBS을 좌심실을 통해 관류했다. 안구를 제핵하고 4% 파라포름알데히드로 1 시간 동안 고정했다. 안구를 2등분한 후 렌즈, 유리체 및 망막이 전부 제거된 망막 색소 상피-맥락막-공막 세안컵(eyecup)을 준비했다. 적도면 가장자리부터 4 또는 5회의 방사산 절개를 생성하여 망막 색소 상피-맥락막-공막 세안컵을 플랫화하고, 아쿠아-마운트 내에 플랫 마운팅했다.
조직 분석: 고정된 플랫-마운트를 계열 농도의 에탄올로 재수화하고 파라핀에 포매했다. 파라핀 절편(10 μm 두께)을 헤마톡실린(Merck, Darmstadt, Germany) 및 에오신(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)(H&E)으로 염색하고 라이카 DM 1000 LED 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 이미징했다. 플랫 마운트 상의 맥락막 병변 및 신생혈관을 컨포칼 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관측했다.
결과
도 26은 맥락막 플랫 마운트의 내층 병변에 대한 H&E 염색 대표 이미지를 나타낸다. AMD 유도 후 망막 색소 상피의 비정상적 형태를 관측했다(중간 이미지). 2.5 mM 칼슘 락테이트 처리에 의해 망막 색소 상피의 형태가 정상 대조군 상피조직(좌측 이미지)과 유사한 방식으로 회복됐다(우측 이미지).
도 27은 레이저로 유도된 AMD에 의한 플랫-마운트 상의 맥락망 내층 병변에 대한 형광 이미지를 나타낸다. AMD 유도 후 맥락막 병변을 관측했다(중간 이미지). 맥락막 병변은 칼슘 락테이트 처리 후 회복됐다(우측 이미지).
도 28은 레이저로 유도된 AMD에 의한 플랫-마운트 상의 맥락막의 내층 병변 및 신생혈관에 대한 형광 이미지를 나타낸다. AMD 유도 이후 맥락막 병변 및 신생혈관을 관측했다(중간 이미지). 맥락막 병변 및 신생혈관은 정상 대조군(좌측 이미지)과 동일하게 칼슘 락테이트 처리 후 회복됐다(우측 이미지).
실시예 21. 알츠하이머 & 뇌졸중 표적화
재료 및 방법
동물: 모든 실험을 대한민국 법률(제11737호 2013. 4. 5. 일부개정) 및 가천대학교 동물실험윤리위원회에서 확립된 기관 가이드라인(LCDI-2018-0073)에 따라 수행했다. 8주령 수컷 스프래그-돌리(Sprague-Dawley)(SD) 래트를 샘타코(Osan, Gyeonggi-do, Republic of Korea)에서 얻었고, 무특이 병원체(SPF) 상태에서 번식시켰다. 모든 동물을 12 시간 동안 먹이와 물에 자유롭게 접근가능하도록 22-25℃의 명/암 사이클에서 유지했다.
리포폴리사카라이드(LPS) 및 칼슘 락테이트의 준비: 1 mg의 LPS 분말을 1 ml 식염수에 용해시켰다. 신선하게 이용 가능하도록 LPS를 얼음 위 튜브에 유지했다. 장기 보관을 위해서는 스크루 캡 바이알이 바람직하다. 분획물을 -20℃로 저장했다. 칼슘 락테이트를 시그마 알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. 2 mg/kg의 칼슘 락테이트를 매일 피하 주사(21 일)을 위해 식염수에 용해시켰다.
LPS의 두개 내 주사: 가스 마취제(2% 이소플루란, Spartanburg, SC, USA) 하에서 자유롭게 호흡하도록 동물을 마취 기계와 연동된 작은 아크릴 케이지에 배치했다. 전체 동물에 대해 마취 완료 후 (가스 마취를 유지한 채로) 후두부가 노출되도록 목의 상단(superior aspect)이 과신전되도록 수술 테이블에 배치했다. 동물 머리 털을 전기 클리퍼로 면도하고, 피부를 아이오딘으로 닦았다. LPS를 이용 전 얼음에서 유지했다. 모든 수술 재료를 70% 에탄올로 미감염 상태로 유지했다. 해밀턴 시린지통 내부공간을 증류수 및 70% 에탄올로 세척했다. 해밀턴 시린지를 시린지 홀더에 배치했다. 뇌 고정장치(stereotaxic apparatus)에 동물을 수평 위치로 놓아두었다. 머리 피부를 메스로 정중선 절개했다(약 1 cm). 해밀턴 시린지의 바늘을 정수리점(bregma)에 배치했다. 조종자에서 3 개의 좌표(AP: -3.6, LM: 2.0 및 DV: -3.8)를 판독하고(mm) 기록하여 이를 출발점으로 이용했다. 천천히, 주사점의 DV 좌표를 세팅하고 주사점까지 뇌로 바늘 팁을 삽입했다. LPS 용액(2 μl)을 유속 약 0.5 μl/분으로 방출했다. 주사 이후 바늘을 매우 천천히 제거했다. 상처 부위를 봉합하여 닫은 다음 소독약을 도포했다. 래트에 추가 식별을 위한 표시를 했다.
면역조직화학: 저온유지장치에서 뇌 조직을 5 μm로 절단하고 조직 검사를 위해 염색했다. 현미경 이미지를 200X 배율로 얻었다. 면역조직화학을 위해 절편을 상온에서 1 시간 동안 0.05 M PBS 내 1% BSA 및 10% NGS로 블로킹한 다음 4℃에서 토끼 항-Iba-1 항체(1:1000, Bioss, MA, USA)로 이틀 밤동안 반응시켰다. ABC 염색 시스템을 이용하여 절편 내 미세아교세포(Iba-1)를 시각화했다(Vector Laboratories, CA, USA).
결과
도 29는 알츠하이머 및 뇌졸중 질환 확립을 위한 실험 도식을 나타낸다. OMT-110은 칼슘 락테이트이다. 도 30은 LPS에 의한 뇌 손상을 보여주는 대표 이미지를 나타낸다. 반대측(Contralateral): 정상 영역. 동측(Ipsilateral): LPS 주사.
도 31은 손상된 뇌 조직의 회복과 뇌 손상 후 모집된 미세아교세포 침투의 감소를 보여준다. 이 결과는 알츠하이머 및 뇌졸중을 악화시키는 염증 반응이 대단히 감소했음을 보여준다.
실시예 22. 파킨슨병 표적화
재료 및 방법
동물: 모든 실험을 대한민국 법률(제11737호 2013. 4. 5. 일부개정) 및 가천대학교 동물실험윤리위원회에서 확립된 기관 가이드라인(LCDI-2018-0073)에 따라 수행했다. 8주령 수컷 스프래그-돌리(SD) 래트를 샘타코(Osan, Gyeonggi-do, Republic of Korea)에서 얻었고, 무특이 병원체(SPF) 상태에서 번식시켰다. 모든 동물을 12 시간 동안 먹이와 물에 자유롭게 접근가능하도록 22-25℃의 명/암 사이클에서 유지했다.
데시프라민, 6-OHDA 및 칼슘 락테이트의 준비: 데시프라민(12.5 mg/kg; 노르아드레날린 수송체 억제제; 시그마 알드리치, St. Louis, USA)를 복강내 주사를 위해 식염수에 용해시켰다. 6-OHDA (20 μg/래트, 시그마 알드리치, St. Louis, USA)를 두개내 주사를 위해 식염수에 용해시켰다. 2 mg/kg의 칼슘 락테이트(시그마 알드리치, St. Louis, USA))를 매일 피하 주사(21 일)를 위해 식염수에 용해시켰다.
데시프라민 및 6-OHDA의 주사: 동물을 6-OHDA 주사 30 분 전 복강(복강내 주사)에 데시프라민으로 주사했다. 데시프라민 주사 30분 후 가스 마취제(2% 이소플루란, Spartanburg, SC, USA) 하에서 자유롭게 호흡하도록 동물을 마취 기계와 연동된 작은 아크릴 케이지에 배치했다. 전체 동물에 대해 마취 완료 후 (가스 마취를 유지한 채로) 후두부가 노출되도록 목의 상단이 과신전되도록 수술 테이블에 배치했다. 동물 머리 털을 전기 클리퍼로 면도하고, 피부를 아이오딘으로 닦았다. 모든 수술 재료를 70% 에탄올로 미감염 상태로 유지했다. 해밀턴 시린지통 내부 공간을 증류수 및 70% 에탄올로 세척했다. 해밀턴 시린지를 시린지 홀더에 배치했다. 뇌 고정장치에 동물을 수평 위치로 배치했다. 머리 피부를 메스로 정중선 절개했다(약 1 cm). 해밀턴 시린지의 바늘을 정수리점에 배치했다. 조종자에서 3 개의 좌표(AP: -5.6, LM: 2.0 및 DV: -7.6)를 판독하고(mm) 기록하여 출발점으로 이용했다. 천천히 주사점의 DV 좌표를 세팅하고 주사점까지 뇌로 바늘 팁을 삽입했다. 6-OHDA 용액(20 μg/4 μl)을 유속 약 1 μl/분으로 방출했다. 주사 이후 바늘을 매우 천천히 제거했다. 상처 부위를 봉합하여 닫은 다음, 소독약을 도포했다. 래트에 추가 식별을 위한 표시를 했다.
면역조직화학: 저온유지장치에서 뇌 조직을 5 μm로 절단하고 조직 검사를 위해 염색했다. 현미경 이미지를 200X 배율로 얻었다. 면역조직화학을 위해 절편을 상온에서 1 시간 동안 0.05 M PBS 내 1% BSA 및 10% NGS로 블로킹한 다음 4℃에서 토끼 항-티로신 수산화효소-1 항체(1:500, Chemicon, Tokyo, Japan)로 이틀 밤동안 반응시켰다. ABC 염색 시스템을 이용하여 절편 내 도파민 뉴론을 시각화했다(Vector Laboratories, CA, USA).
결과
도 32는 파킨슨병 확립을 위한 실험 도식을 나타낸다. OMT-110은 칼슘 락테이트이다.
도 33은 칼슘 락테이트 처리에 의한 도파민 뉴런의 회복을 보여준다. 파킨슨병은 뇌의 특정 영역(흑질)에서 도파민 뉴런의 파괴에 의해 도파민 생산에 영향을 미치는 신경퇴행성 장애이다.
실시예 23. 다발경화증 및 척수손상 표적화
재료 및 방법
동물: 모든 실험을 대한민국 법률(제11737호 2013. 4. 5. 일부개정) 및 가천대학교 동물실험윤리위원회에서 확립된 기관 가이드라인(LCDI-2018-0073)에 따라 수행했다. 8주령 수컷 스프래그-돌리(SD) 래트를 샘타코(Osan, Gyeonggi-do, Republic of Korea)에서 얻었고, 무특이 병원체(SPF) 상태에서 번식시켰다. 모든 동물을 12 시간 동안 먹이와 물에 자유롭게 접근가능하도록 22-25℃의 명/암 사이클에서 유지했다.
리포폴리사카라이드(LPS) 및 칼슘 락테이트의 준비: 1 mg의 LPS 분말을 1 ml 식염수에 용해시켰다. LPS가 신선하게 이용되도록 얼음에 튜브를 유지했다. 장기 보관을 위해 스크루 캡 바이알이 바람직하다. 분획을 -20℃에 저장했다. 칼슘 락테이트를 시그마 알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. 2 mg/kg의 칼슘 락테이트를 매일 피하 주사(21 일)를 위해 식염수에 용해시켰다.
LPS의 척수내 주사: 가스 마취제(2% 이소플루란, Spartanburg, SC, USA) 하에서 자유롭게 호흡하도록 마취 기계와 연동된 작은 아크릴 케이지에 동물을 배치했다. 전체 동물의 마취 완료 후 (가스 마취를 유지한 채로) 수술 테이블에 배치했다. LPS의 척수내 주사를 위해, 래트의 척추후궁절제(laminectomy) 부위를 노출했다. 좌측 배측주(dorsal column) 위 경막에 1 mm 간격의 작은 구멍 2개를 만들었다. 1 μl 부피의 LPS 용액을 멸균 해밀턴 주사기로 조심스럽게 끌어올려 척수에 LPS 용액을 천천히 주사했다. 주사 부위로부터 역류를 방지하기 위해 시린지를 추가 2 분 동안 그 자리에 유지시켰다. 그 다음 주사 부위를 수술 클립으로 닫았다.
면역조직화학: 저온유지장치에서 뇌 조직을 5 μm로 절단하고 조직 검사를 위해 염색했다. 현미경 이미지를 200X 배율로 얻었다. 면역조직화학을 위해 절편을 상온에서 1 시간 동안 0.05 M PBS 내 1% BSA 및 10% NGS로 블로킹한 다음 4℃에서 토끼 항-Iba-1 항체(1:1000, Bioss, MA, USA)로 이틀 밤동안 반응시켰다. ABC 염색 시스템을 이용하여 절편 내 미세아교세포(Iba-1)를 시각화했다(Vector Laboratories, CA, USA).
결과
도 34는 다발경화증 확립을 위한 실험 도식을 나타낸다. OMT-110은 칼슘 락테이트이다.
도 35는 칼슘 락테이트 처리에 의한 탈수초 척수의 회복 및 미세아교세포 침투의 감소를 보여준다. 중추신경계의 탈수초화 및 면역 침투는 다발경화증 및 척수 손상을 포함한 많은 장애에서 염증과 함께 발생한다.
실시예 24. 혈관 질환(죽상경화증, 뇌출혈 및 심근경색) 표적화
재료 및 방법
동물: 모든 실험을 대한민국 법률(제11737호 2013. 4. 5. 일부개정) 및 경기 바이오센터 동물실험윤리위원회에서 확립된 기관 가이드라인(2017-11-0008, South Korea)에 따라 수행했다. 5주령 수컷 BALB/c ApoEshi 마우스를 일본 SLC Inc.(Shizuoka, Japan)에서 얻었고, 무특이 병원체(SPF) 상태에서 번식시켰다. 모든 동물을 12 시간 동안 먹이와 물에 자유롭게 접근가능하도록 22-25℃의 명/암 사이클에서 유지했다.
칼슘 락테이트의 준비: 칼슘 락테이트를 시그마 알드리치(St.Louis, MO, USA)에서 구입했다. 2 mg/kg의 칼슘 락테이트를 매일 피하 주사(21 일)를 위해 식염수에 용해시켰다.
혈관 질환을 위한 동물 모델: 혈관 질환의 자발적 유도를 위해 BALB/c ApoEshi 종을 이용했다. 이 연구에서는 고지방(40%) 식단을 4 주 동안 제공하여 강한 죽상경화증을 유도했다.
조직 분석: 흉부 대동맥을 절개하고, 대동맥 절반을 10% 중성 완충액 포르말린 고정액으로 고정했다. 그 다음 조직 분석을 수행했다. 조직 분석을 H&E 및 오일 레드 오 염색으로 수행했다. 대동맥 벽 두께, 죽상경화 플라크 영역, 거품세포(foam cell) 수치 및 지질화(lipidated) 영역을 분석했다.
통계 분석: 통계 분석을 SPSS 통계를 이용하여 수행하고, 결과를 스튜던트 t-테스트를 이용하여 분석했다. 조직 분석을 맨-휘트니 방법을 이용하여 수행했다. P < 0.05를 통계적으로 유의하다고 고려했다.
결과
표 1: 조직 분석에 대한 정량 분석. 죽상경화증에 대한 모든 임상적 표지자는 질환 유도 이후 상당히 증가했다. 반면, 칼슘 락테이트 처리 이후 표지자는 상당히 감소했다. *: G2 및 G1 간 유의한 차이, P < 0.05; ++: G2 및 G3 간 유의한 차이, P < 0.01; +: G2 및 G3간 유의한 차이, P < 0.05.
Figure pct00001
죽상경화증의 직접 표적화 증거
표 2: 임상 혈액 화학
Figure pct00002
콜레스테롤(TCHO), LDL 콜레스테롤(LDL), 트리글리세리드(TG) 및 HDL- 콜레스테롤(HDL)과 같은 병리 인자는 칼슘 락테이트에 의해 조절되지 않았다. 칼슘과 락테이트가 결합한 형태는 질환 부위에 직접적으로 단일 성분으로 작용한다(도 36 참조).
도 36은 대동맥 조직의 대표적 조직 프로파일을 나타낸다. 좌측 및 중간 조직 사진은 H&E 염색이다. 우측 조직 사진은 죽상경화증 병변을 구별하기 위한 오일 레드 염색이다. 죽상경화증 병변은 칼슘 락테이트 처리에 의해 감소했다.
실시예 25. 치주 질환(치수염 및 치주염) 표적화
재료 및 방법
동물: 모든 실험을 대한민국 법률(제11737호 2013. 4. 5. 일부개정) 및 가천대학교 동물실험윤리위원회에서 확립된 기관 가이드라인(LCDI-2018-0073)에 따라 수행했다. 8주령 수컷 스프래그-돌리(SD) 래트를 샘타코(Osan, Gyeonggi-do, Republic of Korea)에서 얻었고, 무특이 병원체(SPF) 상태에서 번식시켰다. 모든 동물을 12 시간 동안 먹이와 물에 자유롭게 접근가능하도록 22-25℃의 명/암 사이클에서 유지했다.
리포폴리사카라이드(LPS) 및 칼슘 락테이트의 준비: 1 mg의 LPS 분말을 100 μl 식염수에 용해시켰다. LPS가 신선하게 이용되도록 얼음에 튜브를 유지했다. 장기 보관을 위해 스크루 캡 바이알이 바람직하다. 분획을 냉동고(-20℃)에 저장했다. 칼슘 락테이트를 시그마 알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. 2 mg/kg의 칼슘 락테이트를 매일 피하 주사(21 일)를 위해 식염수에 용해시켰다.
치주 질환에 대한 동물 모델: 치주 질환을 멸균 식염수 내 LPS(1mg/100μl)의 잇몸내 주사로 도입했다. 미세한 피하주사기(hypodermic) 바늘을 제1 우측 하악 대구치(mandibular molar)의 측면부(mesiolateral aspect)에 삽입했고, 주사가 제1 및 제2 어금니 간의 치간 돌기에 삽입되도록 팁을 말단으로 이동시켰다. 천천히 주사하고 주사 후 10 초 동안 바늘을 그 자리에 유지시켜 LPS가 바늘 트랙을 통해 손실되지 않도록 확인했다.
조직 분석: 치아를 포함한 래트 잇몸을 절제하고 4℃에서 2일 동안 4% 파라포름알데히드로 고정했다. 고정된 조직을 파라핀에 포매하고 10 μm로 절편화했다. 슬라이드를 55℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 자일렌에서 후속 탈파라핀화하고, 계열 농도의 에탄올로 재수화하고, Bouin 용액에서 1 시간 동안 재고정하고, 수돗물로 5-10 분 세정하여 황색을 제거하고 비브리히 스칼렛-산성 푹신 용액으로 5 분 동안 염색한 다음 포스포몰리브덴-포스포텅스텐산 용액(비 1: 1)으로 30 분 동안, 그리고 아닐린 블루 용액으로 15 분 동안 염색했다. 증류수로 짧게, 그리고 1% 아세트산 용액으로 5 분 동안 세정했다. 95% 에틸 알콜, 절대 알콜로 재수화하고 자일렌으로 클리어링했다. 마운팅 배지로 마운트했다. 라이카 DM 1000 LED 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 이미징했다.
결과
도 37은 치주 조직에 대한 마손 삼색 염색을 보여준다. LPS 처리는 치주 질환을 유도했고, 이는 치아 뿌리 주위의 인대(ligament) 및 잇몸(gingiva) 손실을 발생시킨다(중간 이미지). 인대 및 잇몸은 정상 대조군(좌측 이미지)와 마찬가지로 칼슘 락테이트 처리 후 회복되었다(우측 이미지).
도 38은 윗 잇몸(upper gum)에 대한 마손 삼색 염색을 보여준다. LPS 처리된 치주 조직 주위의 윗 윗몸은 심한 염증에 의한 비정상적 형태를 보여준다(중간 이미지). 윗 잇몸의 형태는 정상 대조군(좌측 이미지)과 마찬가지로 칼슘 락테이트 처리 이후 회복되었다(우측 이미지).
실시예 26. 근골격 질환(류마티스 관절염) 표적화
재료 및 방법
동물: 모든 실험을 대한민국 법률(제11737호 2013. 4. 5. 일부개정) 및 경기 바이오센터 동물실험윤리위원회에서 확립된 기관 가이드라인(2017-11-0008, South Korea)에 따라 수행했다. 5주령 수컷 BALB/c ApoEshi 마우스를 일본 SLC Inc.(Shizuoka, Japan)에서 얻었고, 무특이 병원체(SPF) 상태에서 번식시켰다. 모든 동물을 12 시간 동안 먹이와 물에 자유롭게 접근가능하도록 22-25℃의 명/암 사이클에서 유지했다.
약제의 준비: 류마티스 관절염의 일차 유도를 위해 2 mg/mL Type II 콜라겐을 동일 부피의 컴플리트 프로인드 어쥬번트(complete Freund's adjuvant; CFA)와 혼합했다. 류마티스 관절염의 이차 유도를 위해 2 mg/mL Type II 콜라겐을 인컴플리트 프로인드 어쥬번트(incomplete Freund's adjuvant; IFA)와 혼합했다. 2 mg/kg의 칼슘 락테이트를 매일 피하 주사(21 일)를 위해 식염수 내에 용해시켰다.
류마티스 관절염을 위한 동물 모델
일차 유도: 0.1 mL의 혼합 용액(Type II 콜라겐 + CFA)을 마우스 꼬리의 기저로부터 1.5 cm 영역에 피하 주사했다. 모든 마우스에서 투여 부위 및 깊이는 동일했다.
이차 유도: 일차 유도 21일 후, 0.1 mL의 혼합 용액(Type II 콜라겐 + IFA)을 마우스 꼬리의 기저로부터 1.5 cm 영역에 피하 주사했다. 모든 마우스에서 투여 부위 및 깊이는 동일했다.
조직 분석: 마우스 발 및 무릎 관절을 절제하고 고정(4% 파라포름알데히드)하고 4℃에서 2 일 동안 탈칼슘화했다. 조직을 파라핀에 포매하고 15 μm로 절편화했다. 슬라이드를 55℃에서 2 h 동안 인큐베이션하고, 자일렌에서 후속 탈파라핀화하고, 계열 농도의 에탄올로 재수화하고, 비브리히 스칼렛-산성 푹신 용액으로 5 분 동안 염색한 다음 포스포몰리브덴-포스포텅스텐산 용액(비 1: 1)으로 30 분 동안, 그리고 아닐린 블루 용액으로 15 분 동안 염색했다. 증류수로 짧게, 그리고 1% 아세트산 용액으로 5 분 동안 세정했다. 95% 에틸 알콜, 절대 알콜로 재수화하고 자일렌으로 클리어링했다. 마운팅 배지로 마운트했다. 라이카 DM 1000 LED 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 이미징했다.
결과
도 39는 다리 및 무릎 관절 조직에 대한 마손 삼색 염색을 보여준다. 류마티스 관절염에 의해 염증성 부종이 발가락과 무릎 관절에서 관측되었다(중간 이미지). CaLa 처리 21 일 이후, 염증성 부종은 발가락 및 무릎 관절에서 명확히 감소했고(아래 아미지), 형태적으로 정상 대조군과 동일하게 회복됐다(위 이미지).
실시예 27. 소화기 질환(염증성 장질환: 크론병 및 대장염) 표적화
재료 및 방법
동물: 모든 실험을 대한민국 법률(제11737호 2013. 4. 5. 일부개정) 및 가천대학교 동물실험윤리위원회에서 확립된 기관 가이드라인(LCDI-2018-0073)에 따라 수행했다. 6주령 수컷 스프래그-돌리(SD) 래트를 샘타코(Osan, Gyeonggi-do, Republic of Korea)에서 얻었고, 무특이 병원체(SPF) 상태에서 번식시켰다. 모든 동물을 12 시간 동안 먹이와 물에 자유롭게 접근가능하도록 22-25℃의 명/암 사이클에서 유지했다.
약제 및 동물 모델: 크론병 및 대장염을 유도하기 위해, 인도메타신을 시그마 케미칼(St. Louis, Missouri, USA)에서 구입하여 식염수에 용해시켰다. 매일 피하 주사(21 일)를 위해 2 mg/kg의 칼슘 락테이트를 식염수에 용해시켰다. 두 종류의 염증성 장질환 모델을 이용했다. 매일 24 시간 간격으로, 인도메타신(7 mg/kg)의 경구 투여로 크론병을 유도했고, 인도메타신(7 mg/kg)의 피하 주사로 대장염을 유도했다(도 40 및 42).
조직 분석: 고정된 플랫-마운트를 계열 농도의 에탄올로 탈수화하고 파라핀에 포매했다. 파라핀 절편(5 μ 두께)를 헤마톡실린(Merck, Darmstadt, Germany) 및 에오신(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) (H&E)으로 염색하고 라이카 DM 1000 LED 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 이미징했다.
결과
도 40은 크론병 유도를 위한 실험 도식을 나타낸다.
도 41은 크론병의 H&E 염색의 대표 이미지를 나타낸다. 크론병 유도 이후 소장 내 경벽 염증(transmural inflammation) 및 선형 궤양화(linear ulceration)를 관측했다(중간 이미지). CaLa 처리 4 주 후, 경벽 염증 및 선형 궤양화는 소장 조직에서 명확히 감소했고(아래 이미지), 형태적으로 정상 대조군 수준으로 회복됐다(위 이미지).
도 42는 대장염 유도를 위한 실험 도식을 나타낸다.
도 43은 대장염의 H&E 염색 대표 이미지를 나타낸다. 대장염 유도 이후 소장 내 표면 궤양화(superficial ulceration), 폴립(polyp) 및 염증을 관측했다(중간 이미지). CaLa 처리 4 주 후, 표면 궤양화, 폴립 및 염증은 소장 조직에서 명확히 감소했고(아래 이미지), 형태적으로 정상 대조군 수준으로 회복됐다(위 이미지).
본원에 개시된 일부 추가적 구현예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
A. 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 천식, 폐섬유증, 비만, 위창자염, 만성 염증성 장질환 및/또는 아토피성 피부염의 치료방법.
B. 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 만성 폐쇄성 폐질환, 폐렴, 각막염, 죽상경화증, 동맥경화증, 심근염, 당뇨병, 류마티스 관절염, 치수염, 치주염 및/또는 건선의 치료방법.
C. 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머병, 뇌졸중, 파킨슨병, 다발경화증, 노인성 황반변성, 비알콜성 지방간 질환, 패혈증 및/또는 골다공증의 치료방법.
D. 구현예 A 내지 C 중 어느 하나의 방법에 있어서, 칼슘 락테이트가 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물로 투여되는 것인 방법.
E. 구현예 A 내지 D 중 어느 하나의 방법에 있어서, 약학 조성물이 액체, 분말, 에어로졸, 주사, 수액, 패치, 캡슐, 알약, 정제, 데포 또는 좌약으로 제형화되는 것인 방법.
F. 구현예 A 내지 D 중 어느 하나의 방법에 있어서, 약학 조성물이 유효성분으로 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트 및 약학적으로 허용되는 다당류, 폴리머, 지질 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
G. 구현예 F의 방법에 있어서, 약학 조성물이 칼슘 락테이트 및 다당류를 포함하는 것인 방법.
H. 구현예 G의 방법에 있어서, 칼슘 락테이트 대 다당류의 중량비가 1:<0.2 내지 1:5인 방법.
I. 구현예 G의 방법에 있어서, 칼슘 락테이트 대 다당류의 중량비가 1:<0.2인 방법.
J. 구현예 G의 방법에 있어서, 칼슘 락테이트 대 다당류의 중량비가 1:0.2 내지 1:5인 방법.
K. 구현예 F 내지 J 중 어느 하나의 방법에 있어서, 폴리머 및/또는 지질을 더 포함하는 것인 방법.
L. 구현예 K에 있어서, 폴리머 및 지질을 더 포함하고, 여기서 폴리머 대 지질의 중량비가 1:0.1 내지 1:50인 방법.
M. 구현예 K 내지 L 중 어느 하나의 방법에 있어서, 칼슘 락테이트 대 폴리머 및/또는 지질의 중량비가 1:5 이상인 방법.
N. 구현예 M의 방법에 있어서, 칼슘 락테이트 대 폴리머 및/또는 지질의 중량비가 1:5 내지 1:30인 방법.
O. 구현예 F의 방법에 있어서, 칼슘 락테이트 및 폴리머 및/또는 지질을 포함하는 것인 방법.
P. 구현예 O의 방법에 있어서, 폴리머 및 지질을 포함하고, 여기서 폴리머 대 지질의 중량비가 1:0.1 내지 1:50인 방법.
Q. 구현예 O 내지 P 중 어느 하나의 방법에 있어서, 칼슘 락테이트 대 폴리머 및/또는 지질의 중량비가 1:5 이상인 방법.
R. 구현예 O 내지 Q 중 어느 하나의 방법에 있어서, 칼슘 락테이트 대 폴리머 및/또는 지질의 중량비가 1:5 내지 1:30인 방법.
S. 구현예 O 내지 R 중 어느 하나의 방법에 있어서, 조성물이 단기 작용성(short-acting)인 방법.
T. 구현예 O 내지 R 중 어느 하나의 방법에 있어서, 조성물이 지속 작용성(long-acting)인 방법.
U. 구현예 F 내지 T 중 어느 하나의 방법에 있어서, 조성물이 주사가능한 조성물인 방법.
V. 구현예 F 내지 U 중 어느 하나의 방법에 있어서, 셀룰로오스 유도체, 펙틴, 히알루론산, 전분, 구아검, 키토산, 젤라틴, 콜라겐, 알기네이트, 알긴산 또는 이들의 조합인 다당류를 포함하는 것인 방법.
W. 구현예 F 내지 V 중 어느 하나의 방법에 있어서, 폴록사머, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리글리콜릭 락트산(PLGA) 또는 이들의 조합인 폴리머를 포함하는 것인 방법.
X. 구현예 F 내지 W 중 어느 하나의 방법에 있어서, 모노- 또는 트리-지방산 글리세린 에스터 또는 폴리에틸렌 글리콜, 식물유의 폴리에틸렌 글리콜 에스터, 지방산 프로필렌 글리콜 에스터, 참깨유, 대두유, 캐스터유, 옥수수유, 팜유, 낙화생유, 카카오유, 면실유, 해바라기씨유, 홍화유, 아몬드유, 올리브유, 수소첨가유, 올레산, 리놀렌산, 리놀레산, 팔미트산, 팔미톨레인산, 아라카돈산, 미리스트산, 카프르산, 카프릴산, 라우르산, 스테아르산, 에틸 올리에이트, 이소프로필 팔미테이트, 옥틸도데실 미리스테이트, 세틸 팔미테이트, 라우릴 알콜, 올레일 알콜, 세틸 알콜, 스테아릴 알콜 또는 이들의 조합인 지질을 포함하는 것인 방법.
Y. 구현예 F 내지 S 및 U 내지 X 중 어느 하나의 방법에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 40% 이상이 6 시간 후에 방출되는 것인 방법.
Z. 구현예 F 내지 S 및 U 내지 Y 중 어느 하나의 방법에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 60% 이상이 12 시간 후에 방출되는 것인 방법.
AA. 구현예 F 내지 S 및 U 내지 Z 중 어느 하나의 방법에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 80% 이상이 24 시간 후에 방출되는 것인 방법.
BB. 구현예 F 내지 S 및 U 내지 AA 중 어느 하나의 방법에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 90% 이상이 48 시간 후에 방출되는 것인 방법.
CC. 구현예 F 내지 H, J 내지 R 및 T 내지 X 중 어느 하나의 방법에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 40% 미만이 24 시간 후에 방출되는 것인 방법.
DD. 구현예 F 내지 H, J 내지 R 및 T 내지 CC 중 어느 하나의 방법에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 60% 미만이 48 시간 후에 방출되는 것인 방법.
EE. 구현예 F 내지 H, J 내지 R 및 CC 내지 DD 중 어느 하나의 방법에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 80% 미만이 72 시간 후에 방출되는 것인 방법.
FF. 구현예 F 내지 H, J 내지 R 및 CC 내지 EE 중 어느 하나의 방법에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 90% 미만이 144 시간 후에 방출되는 것인 방법.
GG. 구현예 F 내지 FF 중 어느 하나의 방법에 있어서, 조성물이 멸균 유리 또는 폴리올레핀 용기에 보관되는 것인 방법.
HH. 구현예 A 내지 D 중 어느 하나의 방법에 있어서, 칼슘 락테이트가 약학적으로 허용되는 장용 코팅제로 코팅되는 것인 방법.
II. 구현예 HH의 방법에 있어서, 장용 코팅제가 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트(HPMCP), 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(CAP), 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), 셀락, 메타크릴산 및 그의 에스터의 폴리머 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
JJ. 구현예 HH 내지 II 중 어느 하나의 방법에 있어서, 칼슘 락테이트 대 장용 코팅제의 중량비가 10:0.5 내지 1:1.5인 방법.
KK. 구현예 HH 내지 JJ 중 어느 하나의 방법에 있어서, 37℃에서 50 rpm의 패들 속도의 USP 패들 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서, 조성물이 120 분 동안 0.1 N HCl에 배치된 후 포스페이트 완충액으 pH 6.8로 조정될 경우 유효성분의 약 20% 미만이 30분 후에 방출되는 것인 방법.
LL. 구현예 HH 내지 KK 중 어느 하나의 방법에 있어서, 37℃에서 50 rpm의 패들 속도의 USP 패들 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서, 조성물이 120 분 동안 0.1 N HCl에 배치된 후 포스페이트 완충액으로 pH 6.8로 조정될 경우 유효성분의 30% 미만이 60분 후에 방출되는 것인 방법.
MM. 구현예 HH 내지 LL 중 어느 하나의 방법에 있어서, 37℃에서 50 rpm의 패들 속도의 USP 패들 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서, 조성물이 120 분 동안 0.1 N HCl에 배치된 후 포스페이트 완충액으로 pH 6.8로 조정될 경우 유효성분의 50% 미만이 120분 후에 방출되는 것인 방법.
NN. 구현예 HH 내지 MM 중 어느 하나의 방법에 있어서, 37℃에서 50 rpm의 패들 속도의 USP 패들 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서, 조성물이 120 분 동안 0.1 N HCl에 배치된 후 포스페이트 완충액으로 pH 6.8로 조정될 경우 유효성분의 10% 미만이 120분 후에 방출되는 것인 방법.
OO. 구현예 A 내지 B 중 어느 하나의 방법에 있어서, 칼슘 락테이트가 칼슘 락테이트를 포함하는 식품 또는 영양 조성물로 제공되는 것인 방법.
PP. 구현예 OO의 방법에 있어서, 조성물이 주사가능한 영양 보충제인 방법.
2018년 1월 12일 출원된 미국 특허출원 제62/616,923호의 전부가 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에 대한 전술한 설명은 본 발명의 일반적인 개념을 벗어나지 않으면서, 당업자의 지식 범위 내에서 지식을 적용함으로써 다른 이들이 다양한 적용을 위하여 쉽게 수정 및/또는 조정할 수 있는 본 발명의 일반적인 속성을 완전히 밝힐 것이다. 따라서, 이러한 조정 및 수정은 본원에 제시된 교시 및 지침에 기반하여, 개시된 구현예의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서의 어구 또는 용어는 본 명세서의 용어 또는 어구는 교시 및 지침의 견지에서 당업자에 의해 해석될 수 있도록 설명하기 위한 것으로 한정하고자 하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 폭 및 범위는 임의의 전술한 예시적 구현예 중 어느 것에 의해서도 제한되어서는 안 되며, 다음의 특허청구범위 및 그 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.
본원에 기술된 다양한 양태, 구현예 및 선택 사항 전부는 임의의 및 모든 변형과 조합될 수 있다.
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본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되도록 지시된 것과 동일함 범위로 참조에 의해 본원에 포함된다.

Claims (46)

  1. 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머병, 파킨슨병, 죽상경화증 및/또는 뇌졸중의 치료방법.
  2. 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 다발경화증, 노인성 황반변성, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD) 및/또는 류마티스 관절염의 치료방법.
  3. 제2항에 있어서, NAFLD의 치료를 위한 것이고 NAFLD는 비알콜성 지방간염(NASH)인 방법.
  4. 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 치수염 및/또는 치주염의 치료방법.
  5. 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장질환(IBD)의 치료방법.
  6. 제5항에 있어서, IBD가 크론병 또는 궤양성 대장염인 방법.
  7. 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 척수손상, 뇌출혈, 심근경색, 각막염 및/또는 당뇨병성 망막병증의 치료방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 락테이트가 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물로 투여되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 약학 조성물이 액체, 분말, 에어로졸, 주사, 수액, 패치, 캡슐, 알약, 정제, 데포 또는 좌약으로 제형화되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 약학 조성물이 유효성분으로 치료학적 유효량의 칼슘 락테이트 및 약학적으로 허용되는 다당류, 폴리머, 지질 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 약학 조성물이 칼슘 락테이트 및 다당류를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 칼슘 락테이트 대 다당류의 중량비가 1:<0.2 내지 1:5인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 칼슘 락테이트 대 다당류의 중량비가 1:<0.2인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 칼슘 락테이트 대 다당류의 중량비가 1:0.2 내지 1:5인 방법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머 및/또는 지질을 더 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 폴리머 및 지질을 더 포함하고, 여기서 폴리머 대 지질의 중량비가 1:0.1 내지 1:50인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 칼슘 락테이트 대 폴리머 및/또는 지질의 중량비가 1:5 이상인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 칼슘 락테이트 대 폴리머 및/또는 지질의 중량비가 1:5 내지 1:30인 방법.
  19. 제10항에 있어서, 칼슘 락테이트 및 폴리머 및/또는 지질을 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 폴리머 및 지질을 포함하고, 여기서 폴리머 대 지질의 중량비가 1:0.1 내지 1:50인 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 칼슘 락테이트 대 폴리머 및/또는 지질의 중량비가 1:5 이상인 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 락테이트 대 폴리머 및/또는 지질의 중량비가 1:5 내지 1:30인 방법.
  23. 제10항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 단기 작용성(short-acting)인 방법.
  24. 제10항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 지속 작용성(long-acting)인 방법.
  25. 제10항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 주사가능한 조성물인 방법.
  26. 제10항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 셀룰로오스 유도체, 펙틴, 히알루론산, 전분, 구아검, 키토산, 젤라틴, 콜라겐, 알기네이트, 알긴산 또는 이들의 조합인 다당류를 포함하는 것인 방법.
  27. 제10항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리글리콜릭 락트산(PLGA) 또는 이들의 조합인 폴리머를 포함하는 것인 방법.
  28. 제10항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 모노- 또는 트리-지방산 글리세린 에스터 또는 폴리에틸렌 글리콜, 식물유의 폴리에틸렌 글리콜 에스터, 지방산 프로필렌 글리콜 에스터, 참깨유, 대두유, 캐스터유, 옥수수유, 팜유, 낙화생유, 카카오유, 면실유, 해바라기씨유, 홍화유, 아몬드유, 올리브유, 수소첨가유, 올레산, 리놀렌산, 리놀레산, 팔미트산, 팔미톨레인산, 아라카돈산, 미리스트산, 카프르산, 카프릴산, 라우르산, 스테아르산, 에틸 올리에이트, 이소프로필 팔미테이트, 옥틸도데실 미리스테이트, 세틸 팔미테이트, 라우릴 알콜, 올레일 알콜, 세틸 알콜, 스테아릴 알콜 또는 이들의 조합인 지질을 포함하는 것인 방법.
  29. 제10항 내지 제23항 및 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 40% 이상이 6 시간 후에 방출되는 것인 방법.
  30. 제10항 내지 제23항 및 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 60% 이상이 12 시간 후에 방출되는 것인 방법.
  31. 제10항 내지 제23항 및 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 80% 이상이 24 시간 후에 방출되는 것인 방법.
  32. 제10항 내지 제23항 및 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 90% 이상이 48 시간 후에 방출되는 것인 방법.
  33. 제10항 내지 제12항, 제14항 내지 제22항 및 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 40% 미만이 24 시간 후에 방출되는 것인 방법.
  34. 제10항 내지 제12항, 제14항 내지 제22항, 제24항 내지 제28항 및 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 60% 미만이 48 시간 후에 방출되는 것인 방법.
  35. 제10항 내지 제12항, 제14항 내지 제22항, 제24항 내지 제28항 및 제33항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 80% 미만이 72 시간 후에 방출되는 것인 방법.
  36. 제10항 내지 제12항, 제14항 내지 제22항, 제24항 내지 제28항 및 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 45 μm의 공극 크기를 갖는 나일론 필터를 이용한 37℃에서 6.8의 pH를 갖는 200 ml 수성 매질 내 300 rpm의 용리 시험 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에 조성물을 배치한 후 유효성분의 약 90% 미만이 144 시간 후에 방출되는 것인 방법.
  37. 제10항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 멸균 유리 또는 폴리올레핀 용기에 보관되는 것인 방법.
  38. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 락테이트가 약학적으로 허용되는 장용 코팅제로 코팅되는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 장용 코팅제가 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트(HPMCP), 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(CAP), 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), 셀락, 메타크릴산 및 그의 에스터의 폴리머 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 칼슘 락테이트 대 장용 코팅제의 중량비가 10:0.5 내지 1:1.5인 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 37℃에서 50 rpm의 패들 속도의 USP 패들 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서, 조성물이 120 분 동안 0.1 N HCl에 배치된 후 포스페이트 완충액으로 pH 6.8로 조정될 경우 유효성분의 약 20% 미만이 30분 후에 방출되는 것인 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 37℃에서 50 rpm의 패들 속도의 USP 패들 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서, 조성물이 120 분 동안 0.1 N HCl에 배치된 후 포스페이트 완충액으로 pH 6.8로 조정될 경우 유효성분의 30% 미만이 60분 후에 방출되는 것인 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 37℃에서 50 rpm의 패들 속도의 USP 패들 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서, 조성물이 120 분 동안 0.1 N HCl에 배치된 후 포스페이트 완충액으로 pH 6.8로 조정될 경우 유효성분의 50% 미만이 120분 후에 방출되는 것인 방법.
  44. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 37℃에서 50 rpm의 패들 속도의 USP 패들 방법을 포함하는 시험관 내 용출 시험에서, 조성물이 120 분 동안 0.1 N HCl에 배치된 후 포스페이트 완충액으로 pH 6.8로 조정될 경우 유효성분의 10% 미만이 120분 후에 방출되는 것인 방법.
  45. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 락테이트가 칼슘 락테이트를 포함하는 식품 또는 영양 조성물로 제공되는 것인 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 조성물이 주사가능한 영양 보충제인 방법.
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