KR20200013247A - 아그레칸 결합 면역글로불린 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아그레칸에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 및 보다 특히 폴리펩타이드, 이러한 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산; 이러한 폴리펩타이드를 제조하는 방법; 예방, 치료 또는 진단 목적을 위한 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 및 특히 약학 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 면역글로불린은 아그레칸의 활성을 억제한다.
Description
본 발명은 아그레칸(Aggrecan)에 결합하는 면역글로불린 및 보다 특히 하나 이상의 이러한 면역글로불린을 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되는 폴리펩타이드(본원에서 각각 "본 발명의 면역글로불린(들)", 및 "본 발명의 폴리펩타이드"로도 지칭됨)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 면역글로불린 또는 폴리펩타이드뿐만 아니라 이러한 면역글로불린 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산(본원에서 "본 발명의 핵산(들)"으로도 지칭됨)을 포함하는 구조체(construct); 이러한 면역글로불린, 폴리펩타이드 및 구조체를 제조하는 방법; 이러한 면역글로불린 또는 폴리펩타이드를 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포; 이러한 면역글로불린, 폴리펩타이드, 구조체, 핵산 및/또는 숙주 세포를 포함하는 조성물, 및 특히 약학 조성물; 및 특히 예방 및/또는 치료 목적, 예컨대 본원에 언급된 예방 및/또는 치료 목적을 위한, 면역글로불린, 폴리펩타이드, 구조체, 핵산, 숙주 세포 및/또는 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태, 구현예, 이점 및 적용은 본원의 추가 설명으로부터 명확해질 것이다.
골관절염(osteoarthritis)은 전 세계적으로 장애의 가장 흔한 원인 중 하나이다. 그것은 3천만 명의 미국인에게 영향을 미치며 가장 흔한 관절 장애이다. 그것은 2025년까지 미국 인구의 20% 초과에 영향을 미칠 것으로 예상된다. 상기 질환은 모든 관절, 주로 무릎, 엉덩이, 손 및 척추에서 발생할 수 있다. 골관절염(OA)은 관절 증상, 관절 연골 결함에서 비롯되는 징후 및 뼈, 힘줄 및 근육을 포함하는 인접 조직의 변화의 조합을 특징으로 하는 다양한 병태군으로서 정의될 수 있다. OA는 관절 연골(뼈를 덮는 연골)의 점진적인 침식을 특징으로 한다. 결국, 상기 질환은 관절 연골의 완전한 파괴, 밑에 있는 뼈의 경화, 골극(osteophyte) 형성 등을 야기하여, 운동 상실 및 통증으로 이어진다. 통증은 OA의 가장 두드러진 증상이며, 이는 주로 환자가 의학적 도움을 구하는 이유이다.
아그레칸(Aggrecan)은 관절 연골의 주요 프로테오글리칸(proteoglycan)이다(Kiani et al. 2002 Cell Research 12:19-32). 이 분자는 연골에게 하중을 견디는 특성을 부여하는 수화된 겔 구조를 제공하기 때문에 관절 연골의 적절한 기능에 중요하다. 아그레칸은 연골세포(chondrocyte)에 의해 발현되는 큰 다중모듈 분자(2317개 아미노산)이다. 그의 코어 단백질은 3개의 구형 도메인(G1, G2 및 G3)과 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan) 사슬 부착을 위한 G2 및 G3 사이의 큰 확장 영역으로 구성된다. 이 확장 영역은 2개의 도메인을 포함하는데, 하나는 케라탄 설페이트(keratan sulfate) 사슬로 치환되고(KS 도메인), 하나는 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate) 사슬로 치환된다(CS 도메인). CS 도메인은 100-150개의 글리코사미노글리칸(GAG) 사슬이 부착되어 있다. 아그레칸은 히알루로난(Hyaluronan)과 큰 복합체를 형성하며, 여기서 50-100개의 아그레칸 분자는 G1 도메인 및 링크 단백질(Link Protein)을 통해 하나의 히알루로난 분자와 상호작용한다. 물의 흡수시(GAG 함량으로 인해) 이들 복합체는 압축에 저항하는 가역적으로 변형가능한 겔을 형성한다. 관절 연골의 구조, 체액 보유 및 기능은 아그레칸의 매트릭스 함량, 및 온전한 코어 단백질에 결합된 콘드로이틴 설페이트의 양과 관련이 있다.
OA는 1) 도메인 G3 및 G2를 점진적으로 방출하는 아그레칸의 분해(연골의 '수축(deflation)'을 초래함) 및 결국 G1 도메인의 방출 및 2) 연골 구조를 비가역적으로 파괴하는 콜라겐의 분해를 특징으로 한다.
노화, 비만 및 관절 손상이 골관절염을 유발하는 위험 인자로서 확인되었지만, OA의 원인은 알려져 있지 않으며, 질환 진행을 멈추거나 관절을 치유하는 약리학적 치료법은 현재 없다. 큰 관절의 경우, 통증과 같은 잠재적인 부작용을 제한하는 것을 돕기 위해 약물이 관절 내로 주사될 수 있다. 치료 전략은 주로 통증을 감소시키고 관절 기능을 개선하는 것을 목표로 한다. 비오피오이드(non-opioid) 항-NGF 통증 치료제인 파시누맙(Fasinumab)은 II/III기 시험 동안 주요 통증 스코어를 개선시키는 것으로 나타났다. 둘록세틴(Duloxetine)은 골관절염으로 인한 만성 무릎 통증의 치료를 위해 승인받았고, 미국 류마티스 학회(American College of Rheumatology)에 의해 조건부로 권장되었다. 스트론튬 라넬레이트(Strontium ranelate)는 관절 공간 폭의 감소 속도를 유의하게 감소시킬 뿐만 아니라 증상성 무릎 골관절염 환자의 큰 다기관(multicenter) 연구에서 위약과 비교하여 통증 스코어를 개선하는 것으로 나타났다. 그러나, 현재 생물학적 제제 인터루킨-1 수용체 길항제 및 항종양 괴사 인자 항체는 효과가 없었고 골관절염의 과정을 변경하는 것으로 나타나지 않았다(Smelter Hochberg 2013 Current Opin. Rheumatol. 25:310). 따라서, 이러한 많은 요법들은 효과가 없고/거나 부작용과 관련이 있다. 궁극적으로, 환자는 통증이 제어될 수 없는 경우 무릎 관절 또는 고관절 전치환 요법(total knee or hip replacement therapy)을 받을 것이다.
약리학적 요법은 NSAIDS 또는 COX-2 억제제 및 약한 오피오이드와 조합된 파라세타몰(paracetamol)의 경구 투여로 시작한다. 약물의 경구 투여의 주요 단점은 관심 부위에서의 제한된 생체이용률 및 부작용, 예컨대 간 손상, 위장관(GI) 궤양, GI 출혈 및 변비의 위험성이다.
OA는 국소적인 성질을 가지기 때문에, 약물의 관절 내 투여는 치료를 개선할 우수한 기회를 제공한다. 그러나, 새롭게 개발된 질환 변형 골관절염 약물(DMOAD)의 대부분은 관절 내에 투여되는 경우에도 관절에서 짧은 체류 시간을 갖는다(Edwards 2011 Vet. J. 190:15-21; Larsen et al. 2008 J Pham Sci 97:4622-4654). 치료 단백질의 관절 내(IA) 전달은 관절 공간으로부터 이들의 빠른 제거 및 연골 내에서 보유 부족에 의해 제한되었다. 관절에서 약물의 활액 체류 시간은 종종 24시간 미만이다. 대부분의 IA 주사 약물의 빠른 제거로 인해, 효과적인 농도를 유지하기 위해 빈번한 주사가 필요할 것이다(Owen et al. 1994 Br. J. Clin Pharmacol. 38:349-355). 그러나, 빈번한 IA 주사는 환자 순응을 어렵게 만들 수 있는 통증 및 불편함뿐만 아니라 관절 감염을 일으킬 위험성 때문에 바람직하지 않다.
로프레도 등(Loffredo et al.)은 헤파린 결합 도메인(heparin-binding domain)과의 융합에 의한 연골로의 표적화 전달이 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)의 생체내 기능을 연장하는 데 충분한지 시험하였다. 헤파린은 비만 세포(mast cell)에 존재한다. 그러나, 헤파린의 자연적인 역할은 알려져 있지 않지만, 그것은 혈액 희석제(blood-thinner)로서 널리 사용된다(Loffredo et al. 2014 Arthritis Rheumatol. 66:1247-1255).
추가적인 연골 고정 단백질(cartilage anchoring protein, CAP)이 여전히 필요하다.
본 발명자들은 치료 약물을 관절 내에 약물을 "고정(anchor)"시켜 약물의 보유를 증가시키지만 상기 치료 약물의 효능을 방해하지 않는 모이어티(본원에서 "연골 고정 단백질" 또는 "CAP"로도 표시됨)에 치료 약물을 결합시킴으로써 치료 약물의 효능이 현저히 증가할 수 있다고 가설을 세웠다. 이 고정 개념은 독성 및 부작용을 감소시킴으로써 약물의 효능뿐만 아니라 병에 걸린 관절에 대한 작동 특이성을 증가시켜, 가능한 유용한 약물의 수를 넓힐 것이다. 본 발명자들은 관절 내 연골에 영향을 미치는 다양한 장애에서 아그레칸이 심하게 글리코실화되고 분해됨에도 불구하고, 아그레칸 결합제가 이러한 고정물질(anchor)로서 잠재적으로 기능할 수 있다고 추가로 가설을 세웠다. 또한, 약물이 병원에 들어가기 전에 요구되는 다양한 동물 모델에서의 비용 및 광범위한 시험의 관점에서, 이러한 아그레칸 결합제는 우선적으로 광범위한 교차 반응성을 가져야 하며, 예컨대, 아그레칸 결합제는 다양한 종의 아그레칸에 결합해야 한다.
다양한 독창적인 면역화, 스크리닝 및 특성화 방법을 사용하여, 본 발명자들은 우수한 선택성, 안정성 및/또는 특이성 특징을 갖는 다수의 아그레칸 결합제를 확인할 수 있었고, 이는 관절에서 연장된 보유 및 활성을 가능하게 하였다.
따라서, 본 발명은 아그레칸에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인(immunoglobulin single variable domain, ISV)에 관한 것으로서, 바람직하게는 상기 ISV는 인간 아그레칸(서열번호: 125)에 특이적으로 결합하고/거나, 상기 ISV는 개 아그레칸(서열번호: 126), 소 아그레칸(서열번호: 127), 랫트 아그레칸(서열번호: 128), 돼지(코어) 아그레칸(서열번호: 129), 마우스 아그레칸(서열번호: 130), 토끼 아그레칸(서열번호: 131), 시노몰구스(cynomolgus) 아그레칸(서열번호: 132) 및/또는 레서스(rhesus) 아그레칸(서열번호: 133)에 특이적으로 결합하며, 더욱 더 바람직하게는, 상기 ISV는 뉴로칸(Neurocan)(서열번호: 134) 및/또는 브레비칸(Brevican)(서열번호: 135)에 실질적으로 결합하지 않는다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, ISV는 아그레칸에의 결합에 대해 뉴로칸 및/또는 브레비칸보다 10배 초과, 100배 초과, 바람직하게는 1000배 초과의 선택성을 갖고/거나, 상기 ISV는 바람직하게는 연골 및/또는 반월상 연골(meniscus)과 같은 연골 조직에 결합하고/거나, 상기 ISV는 37℃에서 활액(SF)에서 적어도 7일, 예컨대 14일, 21일, 1개월, 2개월 또는 심지어 3개월의 안정성을 갖고/거나, 상기 ISV는 연골 보유 분석(cartilage retention assay)에서 적어도 2, 예컨대 적어도 3, 4, 5 또는 6 RU의 연골 보유를 갖고/거나, 상기 ISV는 적어도 5 μm, 예컨대 적어도 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm 또는 심지어 그 초과로 연골 내로 침투하고/거나, 상기 ISV는 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된(camelized) VH 서열, 또는 친화도 성숙(affinity maturation)에 의해 수득된 VHH 서열로 본질적으로 구성된다.
일 양태에서, 본 발명은 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 본질적으로 구성된 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, CDR1은 서열번호: 24, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 및 109로 이루어진 군으로부터 선택되고; CDR2는 서열번호: 42, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 및 110으로 이루어진 군으로부터 선택되며; CDR3은 서열번호: 60, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는 아그레칸의 G1 도메인에 결합하고, 바람직하게는 상기 ISV는 8 초과의 pI를 갖고/거나, 상기 ISV는 2 * 10-2 s-1 미만의 Koff를 갖고/거나 상기 ISV는 1 * 10-6 M 미만의 EC50을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 본질적으로 구성된 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 여기서
i) CDR1은 a) 서열번호: 24, 20, 또는 21; 또는 b) 서열번호: 24의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 2에서 S는 R, F, I, 또는 T로 변경되었고/거나; 위치 3에서 T는 I로 변경되었고/거나; 위치 5에서 I는 S로 변경되었고/거나; 위치 6에서 I는 S, T, 또는 M으로 변경되었고/거나; 위치 7에서 N은 Y, 또는 R로 변경되었고/거나; 위치 8에서 V는 A, Y, T, 또는 G로 변경되었고/거나; 위치 9에서 V는 M으로 변경되었고/거나; 위치 10에서 R은 G, K, 또는 A로 변경된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
ii) CDR2는 c) 서열번호: 42, 38, 또는 39; 또는 d) 서열번호: 42의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 1에서 T는 A, 또는 G로 변경되었고/거나; S 또는 N이 위치 3과 위치 4 사이에 삽입되고/거나(위치 2a 표 1.3B); 위치 3에서 S는 R, W, N, 또는 T로 변경되었고/거나; 위치 4에서 S는 T 또는 G로 변경되었고/거나; 위치 5에서 G는 S로 변경되었고/거나; 위치 6에서 G는 S, 또는 R로 변경되었고/거나; 위치 7에서 N은 S, T, 또는 R로 변경되었고/거나; 위치 8에서 A는 T로 변경되었고/거나; 위치 9에서 N은 D 또는 Y로 변경된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
iii) CDR3은 e) 서열번호: 60, 56 또는 57; 또는 f) 서열번호: 60의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 1에서 P는 G, R, D, 또는 E로 변경되었거나 부재이고/거나; 위치 2에서 T는 R, L, P, 또는 V로 변경되었거나 부재이고/거나; 위치 3에서 T는 M, S, 또는 R로 변경되었거나 부재이고/거나; 위치 4에서 H는 D, Y, G, 또는 T로 변경되었고/거나; 위치 5에서 Y는 F, V, T 또는 G로 변경되었고/거나; 위치 6에서 G는 L, D, S, Y, 또는 W로 변경되었고/거나; R, T, Y 또는 V가 위치 6과 위치 7 사이에 삽입되고/거나(위치 6a 표 1.3C); 위치 7에서 G는 P, 또는 S로 변경되었고/거나; 위치 8에서 V는 G, T, H, R, L, 또는 Y로 변경되었고/거나; 위치 9에서 Y는 R, A, S, D 또는 G로 변경되었고/거나; 위치 10에서 Y는 N, E, G, W, 또는 S로 변경되었고/거나; W는 위치 10과 위치 11 사이에 삽입되고/거나(위치 10a 표 1.3C); 위치 11에서 G는 S, K, 또는 Y로 변경되었고/거나; 위치 12에서 P는 E, 또는 D로 변경되었거나 부재이고/거나; 위치 13에서 Y는 L로 변경되었거나 부재인 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는, CDR1은 서열번호: 24, 20, 21, 25, 27, 29, 31, 34, 35, 36, 37 및 109로 이루어진 군으로부터 선택되고; CDR2는 서열번호: 42, 38, 39, 43, 45, 47, 49, 50, 53, 54, 55, 및 110으로 이루어진 군으로부터 선택되며; CDR3은 서열번호: 60, 56, 57, 61, 63, 65, 67, 71, 72, 73, 74, 및 111로 이루어진 군으로부터 선택되는 ISV의 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는,
- CDR1은 서열번호: 24이고, CDR2는 서열번호: 42이며, CDR3은 서열번호: 60이고;
- CDR1은 서열번호: 20이고, CDR2는 서열번호: 38이며, CDR3은 서열번호: 56이고;
- CDR1은 서열번호: 21이고, CDR2는 서열번호: 39이며, CDR3은 서열번호: 57이고;
- CDR1은 서열번호: 25이고, CDR2는 서열번호: 43이며, CDR3은 서열번호: 61이고;
- CDR1은 서열번호: 27이고, CDR2는 서열번호: 45이며, CDR3은 서열번호: 63이고;
- CDR1은 서열번호: 29이고, CDR2는 서열번호: 47이며, CDR3은 서열번호: 65이고;
- CDR1은 서열번호: 31이고, CDR2는 서열번호: 49이며, CDR3은 서열번호: 67이고;
- CDR1은 서열번호: 34이고, CDR2는 서열번호: 50이며, CDR3은 서열번호: 71이고;
- CDR1은 서열번호: 35이고, CDR2는 서열번호: 53이며, CDR3은 서열번호: 72이고;
- CDR1은 서열번호: 36이고, CDR2는 서열번호: 54이며, CDR3은 서열번호: 73이고;
- CDR1은 서열번호: 37이고, CDR2는 서열번호: 55이며, CDR3은 서열번호: 74인 ISV의 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 본질적으로 구성된 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 여기서
i) CDR1은 a) 서열번호: 24 및 109; 또는 b) 서열번호: 24의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 7에서 N은 S로 변경되었고/거나; 위치 9에서 V는 M으로 변경된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
ii) CDR2는 c) 서열번호: 42 및 110; 또는 d) 서열번호: 42의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 1에서 T는 A로 변경되었고/거나; 위치 3에서 S는 R로 변경되었고/거나; 위치 4에서 S는 T로 변경되었고/거나; 위치 8에서 A는 T로 변경되었고/거나; 위치 9에서 N은 D로 변경된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
iii) CDR3은 e) 서열번호: 60 및 111; 또는 f) 서열번호: 60의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 4에서 H는 R로 변경되었고/거나; 위치 8에서 V는 D로 변경된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는, CDR1은 서열번호: 24 및 109로 이루어진 군으로부터 선택되고; CDR2는 서열번호: 42 및 110으로 이루어진 군으로부터 선택되며; CDR3은 서열번호: 60 및 111로 이루어진 군으로부터 선택되는 ISV의 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는 에피토프 빈(epitope bin) 1 또는 에피토프 빈 4에 속하고, 바람직하게는 상기 ISV는 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 본질적으로 구성되고, 여기서
i) CDR1은 a) 서열번호: 36; 및 b) 서열번호: 36의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 3에서 T는 S로 변경되었고; 위치 6에서 T는 S로 변경되었고; 위치 8에서 T는 A로 변경되었고/거나; 위치 9에서 M은 V로 변경된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
ii) CDR2는 c) 서열번호: 54; 및 d) 서열번호: 54의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 1에서 A는 I로 변경되었고/거나; 위치 4에서 W는 R로 변경되었고/거나; 위치 7에서 G는 R로 변경되었고/거나; 위치 8에서 T는 S로 변경된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
iii) CDR3은 e) 서열번호: 73; 및 f) 서열번호: 73의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 1에서 R은 G로 변경되었고/거나; 위치 2에서 P는 R 또는 L로 변경되었고/거나; 위치 3에서 R은 L 또는 S로 변경되었고/거나; 위치 5에서 Y는 R로 변경되었고/거나; 위치 6에서 Y는 S 또는 A로 변경되었고/거나; 위치 7에서 Y는 T로 변경되었거나 부재이고/거나; 위치 8에서 S는 P로 변경되었고/거나; 위치 9에서 L은 H 또는 R로 변경되었고/거나; 위치 10에서 Y는 P 또는 A로 변경되었고/거나; 위치 11에서 S는 A 또는 Y로 변경되었고/거나; 위치 12에서 Y는 D로 변경되었고/거나; 위치 13에서 D는 F로 변경되었고/거나; 위치 14에서 Y는 G로 변경되었거나 부재이고/거나; 위치 14 뒤에 S가 삽입되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는 CDR1은 서열번호: 20, 29, 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되고; CDR2는 서열번호: 38, 47, 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되며; CDR3은 서열번호: 56, 65, 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ISV의 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열이 아그레칸의 G1 도메인에 결합하는 것을 교차 차단한다.
일 양태에서, 본 발명은 아그레칸의 G1-도메인의 에피토프 빈 1에 결합하고 본원에 기재된 ISV와 아그레칸의 G1 도메인에의 결합에 대해 경쟁하는, ISV, 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 본질적으로 구성된 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 여기서 i) CDR1은 a) 서열번호: 24; 및 b) 서열번호: 24의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 2에서 S는 I 또는 F로 변경되었고; 위치 5에서 I는 S로 변경되었고; 위치 6에서 I는 S 또는 M으로 변경되었고; 위치 7에서 N은 R 또는 Y로 변경되었고; 위치 8에서 V는 A 또는 Y로 변경되었고; 위치 9에서 V는 M으로 변경되었고/거나; 위치 10에서 R은 K로 변경된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나; ii) CDR2는 c) 서열번호: 42; 및 d) 서열번호: 42의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 1에서 T는 A 또는 G로 변경되었고/거나; N이 위치 2와 위치 3 사이에 삽입되고/거나(위치 2a 표 2.3B); 위치 7에서 N은 R로 변경되었고/거나; 위치 8에서 A는 T로 변경되었고/거나; 위치 9에서 N은 D로 변경된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나; iii) CDR3은 e) 서열번호: 60; 및 f) 서열번호: 60의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 1에서 P는 부재이고/거나; 위치 2에서 T는 R로 변경되었거나 부재이고/거나; 위치 3에서 T는 M으로 변경되었거나 부재이고/거나; 위치 4에서 H는 D 또는 Y로 변경되었고/거나; 위치 5에서 Y는 F 또는 V로 변경되었고/거나; 위치 6에서 G는 L 또는 D로 변경되었고/거나; 위치 8에서 V는 G 또는 T로 변경되었고/거나; 위치 9에서 Y는 R로 변경되었고/거나; 위치 10에서 Y는 N 또는 E로 변경되었고/거나; 위치 11에서 G는 S 또는 K로 변경되었고/거나; 위치 12에서 P는 E로 변경되었거나 부재이고/거나; 위치 13에서 Y는 L로 변경되었거나 부재인 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고; 바람직하게는 CDR1은 서열번호: 24, 25, 및 27로 이루어진 군으로부터 선택되고; CDR2는 서열번호: 42, 43, 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되며; CDR3은 서열번호: 60, 61, 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 더욱 더 바람직하게는, 상기 ISV는 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열이 아그레칸의 G1 도메인에 결합하는 것을 교차 차단한다.
일 양태에서, 본 발명은 아그레칸의 G1-도메인의 에피토프 빈 4에 결합하고, 본원에 기재된 ISV와 아그레칸의 G1 도메인에의 결합에 대해 경쟁하는, 본원에 기재된 ISV, 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는 서열번호: 5, 1, 2, 6, 8, 10, 12, 16, 17, 18, 및 19를 갖는 ISV, 및 서열번호: 5, 1, 2, 6, 8, 10, 12, 16, 17, 18, 및 19 중 어느 하나와 80% 초과, 예컨대 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 ISV로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는 아그레칸의 G1-IGD-G2 도메인에 결합하고, 바람직하게는 상기 ISV는 8 초과의 pI를 갖고/거나 2*10-2 s-1 미만의 Koff를 갖고/거나 1*10-6 M 미만의 EC50을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, i) CDR1은 a) 서열번호: 32, 30 및 23; 및 b) 서열번호: 32의 아미노산 서열과 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 2에서 R은 L로 변경되었고/거나; 위치 6에서 S는 T로 변경되었고/거나; 위치 8에서 T는 A로 변경된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나; ii) CDR2는 c) 서열번호: 50, 41, 48 및 51; 및 d) 서열번호: 50의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 7에서 G는 S 또는 R로 변경되었고/거나; 위치 8에서 R은 T로 변경된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나; iii) CDR3은 e) 서열번호: 68, 59, 66 및 69; 및 f) 서열번호: 68의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 4에서 R은 V, 또는 P로 변경되었고/거나; 위치 6에서 A는 Y로 변경되었고/거나; 위치 7에서 S는 T로 변경되었고/거나; 위치 8에서 S는 부재이고/거나; 위치 9에서 N은 P로 변경되었고/거나; 위치 10에서 R은 T 또는 L로 변경되었고/거나; 위치 11에서 G는 E로 변경되었고/거나; 위치 12에서 L은 T 또는 V로 변경된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는, 상기 ISV는, CDR1은 서열번호: 32, 30 및 23으로 이루어진 군으로부터 선택되고; CDR2는 서열번호: 50, 41, 48 및 51로 이루어진 군으로부터 선택되며; CDR3은 서열번호: 68, 59, 66 및 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 ISV의 군으로부터 선택되고, 더욱 더 바람직하게는, 상기 ISV는, CDR1은 서열번호: 32이고, CDR2는 서열번호: 50이며, CDR3은 서열번호: 68이고; CDR1은 서열번호: 32이고, CDR2는 서열번호: 51이며, CDR3은 서열번호: 69이고; CDR1은 서열번호: 30이고, CDR2는 서열번호: 48이며, CDR3은 서열번호: 66이고; CDR1은 서열번호: 23이고, CDR2는 서열번호: 41이며, CDR3은 서열번호: 59인 ISV의 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는 서열번호: 13, 4, 11 및 14를 갖는 ISV, 및 서열번호: 13, 4, 11 및 14 중 어느 것과 80% 초과, 예컨대 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 ISV로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열이 아그레칸의 G1-IGD-G2 도메인에 결합하는 것을 교차 차단한다. 일 양태에서, 본 발명은 아그레칸의 G1-IGD-G2 도메인에 결합하고 본원에 기재된 ISV와 아그레칸의 G1-IGD-G2 도메인에의 결합에 대해 경쟁하는, ISV, 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는 아그레칸의 G2 도메인에 결합하고, 바람직하게는 상기 ISV는 8 초과의 pI를 갖고/거나, 2 * 10-2 s-1 미만의 koff를 갖고/거나 1 * 10-6 M 미만의 EC50을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, i) CDR1은 a) 서열번호: 28; 및 b) 서열번호: 28의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 1에서 G는 R로 변경되었고; 위치 2에서 P는 S 또는 R로 변경되었고; 위치 3에서 T는 I로 변경되었고; 위치 5에서 S는 N으로 변경되었고; 위치 6에서 R은 N, M, 또는 S로 변경되었고; 위치 7에서 Y는 R로 변경되었거나 부재이고; 위치 8에서 A는 F로 변경되었거나 부재이고; 및/또는 위치 10에서 G는 Y로 변경된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는 ii) CDR2는 c) 서열번호: 46; 및 d) 서열번호: 46의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 1에서 A는 S, 또는 Y로 변경되었고; 위치 4에서 W는 L로 변경되었고; 위치 5에서 S는 N으로 변경되었고; 위치 6에서 S는 부재이고; 위치 7에서 G는 부재이고; 위치 8에서 G는 A로 변경되었고; 위치 9에서 R은 S, D, 또는 T로 변경되었고; 및/또는 위치 11에서 Y는 N 또는 R로 변경된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는 iii) CDR3은 e) 서열번호: 64; 및 f) 서열번호: 64의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 위치 1에서 A는 R, 또는 F로 변경되었고; 위치 2에서 R은 I, 또는 L로 변경되었고; 위치 3에서 I는 H, 또는 Q로 변경되었고; 위치 4에서 P는 G, 또는 N으로 변경되었고; 위치 5에서 V는 S로 변경되었고; 위치 6에서 R은 G, N, 또는 F로 변경되었고; 위치 7에서 T는 R, W, 또는 Y로 변경되었고; 위치 8에서 Y는 R, 또는 S로 변경되었거나 부재이고; 위치 9에서 T는 S로 변경되었거나 부재이고; 위치 10에서 S는 E, K로 변경되었거나 부재이고; 위치 11에서 E는 N, A로 변경되었거나 부재이고; 위치 12에서 W는 D로 변경되었거나 부재이고; 위치 13에서 N은 D로 변경되었거나 부재이고; 위치 14에서 Y는 부재이고; 및/또는 D 및/또는 N은 서열번호: 64의 위치 14 뒤에 부가된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고; 바람직하게는 상기 ISV는, CDR1은 서열번호: 28, 22, 26, 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택되고; CDR2는 서열번호: 46, 40, 44, 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되며; CDR3은 서열번호: 64, 58, 62, 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ISV의 군으로부터 선택되고, 더욱 더 바람직하게는, 상기 ISV는, CDR1은 서열번호: 28이고, CDR2는 서열번호: 46이며, CDR3은 서열번호: 64이고; CDR1은 서열번호: 22, CDR2는 서열번호: 40이며, CDR3은 서열번호: 58이고; CDR1은 서열번호: 26이고, CDR2는 서열번호: 44이며, CDR3은 서열번호: 62이고; CDR1은 서열번호: 33이고, CDR2는 서열번호: 52이며, CDR3은 서열번호: 70인 ISV의 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는 서열번호: 9, 3, 7 및 15를 갖는 ISV, 및 서열번호: 9, 3, 7 및 15 중 어느 것과 80% 초과, 예컨대 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 ISV로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열이 아그레칸의 G2 도메인에 결합하는 것을 교차 차단한다. 일 양태에서, 본 발명은 아그레칸의 G2-도메인에 결합하고 본원에 기재된 ISV와 아그레칸의 G2 도메인에의 결합에 대해 경쟁하는, ISV, 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는 서열번호: 1-19 및 114-118 및 서열번호: 1-19 및 114-118 중 어느 것과 80% 초과, 예컨대 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 ISV로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 적어도 하나의 ISV를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 바람직하게는 상기는 본원에 기재된 적어도 2개의 ISV를 포함하고, 상기 적어도 2개의 ISV는 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게는, 상기 적어도 2개의 ISV는 독립적으로 서열번호: 1-19 및 114-118로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 적어도 2개의 ISV는 서열번호: 5, 6, 8 및 114-117로 이루어진 군으로부터 선택되거나 상기 적어도 2개의 ISV는 서열번호: 13 및 118로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 일 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 적어도 하나의 추가 ISV, 예컨대, 치료적 ISV를 포함한다. 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 추가 ISV는 세린프로테아제 패밀리의 구성원, 카텝신, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)/매트릭신(Matrixin) 또는 트롬보스폰딘 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs; ADAMTS), 바람직하게는 MMP8, MMP13, MMP19, MMP20, ADAMTS5(아그레카나제-2), ADAMTS4(아그레카나제-1) 및/또는 ADAMTS11에 결합하고; 상기 적어도 하나의 추가 ISV, 예컨대, 치료적 ISV는 바람직하게는 활성을 보유한다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 추가 ISV, 예컨대 치료적 ISV는 세린프로테아제 패밀리의 구성원, 카텝신, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)/매트릭신 또는 ADAMTS(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs), 바람직하게는 MMP8, MMP13, MMP19, MMP20, ADAMTS5(아그레카나제-2), ADAMTS4(아그레카나제-1) 및/또는 ADAMTS11의 활성을 억제한다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 폴리펩타이드는 37℃에서 활액(SF)에서 적어도 7일, 예컨대 적어도 14일, 21일, 1개월, 2개월 또는 심지어 3개월의 안정성을 갖고/거나, 연골 보유 분석에서 적어도 2, 예컨대 적어도 3, 4, 5 또는 6 RU의 연골 보유를 갖고/거나, 적어도 5 μm, 예컨대 적어도 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm 또는 심지어 그 초과로 연골 내로 침투한다.
일 양태에서, 본 발명은 혈청 단백질 결합 모이어티 또는 혈청 단백질을 추가로 포함하는, 본원에 기재된 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 바람직하게는 상기 혈청 단백질 결합 모이어티는 혈청 알부민에 결합하고; 더욱 더 바람직하게는 상기 혈청 단백질 결합 모이어티는 혈청 알부민 결합 ISV이며; 더욱 더 바람직하게는, 상기 혈청 알부민 결합 ISV는 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 본질적으로 구성되고, 여기서 CDR1은 SFGMS이고, CDR2는 SISGSGSDTLYADSVKG이며, CDR3은 GGSLSR이고; 더욱 더 바람직하게는 상기 혈청 알부민 결합 ISV는 Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb135, Alb11, Alb11(S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82-GGG를 포함한다(표 C 참고). 일 양태에서, 본 발명은 혈청 단백질 결합 모이어티 또는 혈청 단백질을 추가로 포함하는, 본원에 기재된 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 혈청 단백질 결합 모이어티는 비항체 기반 폴리펩타이드이다. 일 양태에서, 본 발명은 PEG를 추가로 포함하는, 본원에 기재된 폴리펩타이드에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 ISV는 서로 직접 연결되거나 링커를 통해 연결된다. 일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 제1 ISV 및/또는 제2 ISV 및/또는 가능하게는 제3 ISV 및/또는 가능하게는 제4 ISV 및/또는 가능하게는 상기 혈청 알부민 결합 ISV는 링커(들)를 통해 연결되고; 바람직하게는 상기 링커는 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS 및 35GS의 링커로 이루어진 군으로부터 선택된다(표 D 참고).
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 폴리펩타이드는 각각 표 E-1 및 표 E-2에 표시된 표적에 결합하는 ISV 및 표시된 1개 또는 2개의 아그레칸에 결합하는 ISV를 포함하는 폴리펩타이드 및/또는 구조체의 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV, 또는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되고, 선택적으로 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 선택적으로 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하는 구조체에 관한 것으로서; 바람직하게는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV, 본원에 기재된 폴리펩타이드, 또는 본원에 기재된 구조체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산, 또는 본원에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 ISV 또는 본원에 기재된 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 적어도 a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서, 본원에 기재된 핵산을 발현하는 단계; 선택적으로 이후에: b) 본원에 기재된 ISV, 또는 본원에 기재된 폴리펩타이드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 적어도 하나의 ISV, 본원에 기재된 폴리펩타이드, 본원에 기재된 구조체, 또는 본원에 기재된 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것으로서; 바람직하게는 상기 조성물은 바람직하게는 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 보조제를 추가로 포함하고, 선택적으로 1종 이상의 추가의 약학적 활성 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 포함하는 약학 조성물이다.
일 양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 본원에 기재된 조성물, 본원에 기재된 ISV, 본원에 기재된 폴리펩타이드, 또는 본원에 기재된 구조체에 관한 것이다. 바람직하게는, 본원에 기재된 조성물, ISV, 폴리펩타이드, 또는 구조체는 관절증(arthropathy) 및 연골이영양증(chondrodystrophy), 관절염 질환(arthritic disease), 예컨대 골관절염(osteoarthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 통풍성 관절염(gouty arthritis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 외상성 파열(traumatic rupture) 또는 분리(detachment), 연골무형성증(achondroplasia), 갈비연골염(costo-chondritis), 척추골단골간단이형성증(Spondyloepimetaphyseal dysplasia), 추간판 탈출증(spinal disc herniation), 요추간판 퇴행 질환(lumbar disk degeneration disease), 퇴행성 관절 질환(degenerative joint disease), 및 재발성 다발성연골염(relapsing polychondritis)을 예방하거나 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 관절증 및 연골이영양증, 관절염 질환, 예컨대 골관절염, 류마티스성 관절염, 통풍성 관절염, 건선성 관절염, 외상성 파열 또는 박리, 연골무형성증, 갈비연골염, 척추골단골간단이형성증, 추간판 탈출증, 요추간판 퇴행 질환, 퇴행성 관절 질환, 및 재발성 다발성연골염을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본원에 기재된 적어도 조성물, ISV, 폴리펩타이드, 또는 구조체의 약학적 유효량을 이를 필요로 하는 사람에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 연골 조직으로부터 화합물, 폴리펩타이드 또는 구조체의 유출(efflux)을 감소하고/거나 억제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본원에 기재된 적어도 하나의 폴리펩타이드, 본원에 기재된 화합물 또는 구조체, 또는 본원에 기재된 조성물의 약학적 유효량을 이를 필요로 하는 사람에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 ADAMTS5 활성 및/또는 MMP13 활성을 억제하고/거나 차단하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본원에 기재된 적어도 하나의 폴리펩타이드, 본원에 기재된 구조체, 또는 본원에 기재된 조성물의 약학적 유효량을 이를 필요로 하는 사람에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 관절증 및 연골이영양증, 관절염 질환, 예컨대 골관절염, 류마티스성 관절염, 통풍성 관절염, 건선성 관절염, 외상성 파열 또는 박리, 연골무형성증, 갈비연골염, 척추골단골간단이형성증, 추간판 탈출증, 요추간판 퇴행 질환, 퇴행성 관절 질환, 및 재발성 다발성연골염을 치료하거나 예방하기 위한 약학 조성물의 제조에 있어서, 본원에 기재된 ISV, 본원에 기재된 폴리펩타이드, 본원에 기재된 구조체, 또는 본원에 기재된 조성물의 용도에 관한 것이다.
폴리펩타이드 및 조성물의 다른 양태, 이점, 적용 및 용도는 본원의 추가 개시내용으로부터 명확해질 것이다. 몇몇 문헌이 본 명세서의 문서 전반에 인용된다. 본원에 인용된 각각의 문헌(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조사의 설명서, 지침 등 포함)은 상기 또는 하기에 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 본원의 어느 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 이러한 개시내용보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
도 1: 125I-표지된 ALB26-CAP 구조체로 주사 후 2 또는 4주에 랫트 관절의 절편의 자기방사법(autoradiography) 이미지의 예. 주사 후 2주 결과 및 주사 후 4주 결과 각각에 대해: 좌측 패널: 조직학적 절편; 우측 패널: 자기방사법.
도 2: 대표적인 MARG 이미지. 특이적 MARG 염색은 검은 입자로 나타나며, 화살표로 표시된다.
도 3: 항-MMP13-CAP 나노바디(C010100754) 또는 항-ADAMTS5-CAP 나노바디(C010100954)를 사용하여 랫트 MMT 모델에서 나노바디에 의한 연골 분해의 억제. 치료는 IA 주사에 의해 수술 후 3일에 시작하였다. 조직병리학은 수술 후 42일에 수행하였다. 내측(medial) 및 총 실질적인 연골 변성 폭뿐만 아니라 연골 변성의 백분율 감소를 결정하였다. 그룹당 20마리의 동물을 사용하였다.
도 4: 관절(우측 무릎)당 400 μg 나노바디의 단일 관절 내 주사를 받는, 골관절염 랫트 및 건강한 랫트에서 혈청 농도(평균 농도 ng/ml) 대 폴리펩타이드의 1차 투여 후 경과 시간(h). 점은 건강한 동물에서의 개별 농도를 나타내고; 삼각형은 OA 동물에서의 개별 농도를 나타내며; 선은 평균 농도를 나타낸다.
도 2: 대표적인 MARG 이미지. 특이적 MARG 염색은 검은 입자로 나타나며, 화살표로 표시된다.
도 3: 항-MMP13-CAP 나노바디(C010100754) 또는 항-ADAMTS5-CAP 나노바디(C010100954)를 사용하여 랫트 MMT 모델에서 나노바디에 의한 연골 분해의 억제. 치료는 IA 주사에 의해 수술 후 3일에 시작하였다. 조직병리학은 수술 후 42일에 수행하였다. 내측(medial) 및 총 실질적인 연골 변성 폭뿐만 아니라 연골 변성의 백분율 감소를 결정하였다. 그룹당 20마리의 동물을 사용하였다.
도 4: 관절(우측 무릎)당 400 μg 나노바디의 단일 관절 내 주사를 받는, 골관절염 랫트 및 건강한 랫트에서 혈청 농도(평균 농도 ng/ml) 대 폴리펩타이드의 1차 투여 후 경과 시간(h). 점은 건강한 동물에서의 개별 농도를 나타내고; 삼각형은 OA 동물에서의 개별 농도를 나타내며; 선은 평균 농도를 나타낸다.
달리 나타내거나 정의하지 않는 한, 사용된 모든 용어는 당업계에서의 일반적인 의미를 가질 것이며, 이는 당업자에게 명확할 것이다. 예를 들어 문헌[Sambrook 등(Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), F. Ausubel 등(Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987), Lewin(Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985), Old 등(Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981); Roitt 등(Immunology (6th Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001), Roitt 등(Roitt's Essential Immunology (10th Ed.) Blackwell Publishing, UK, 2001), 및 Janeway 등(Immunobiology (6th Ed.) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York, 2005)]과 같은 표준 핸드북뿐만 아니라 본원에 인용된 일반적인 배경 기술을 참조한다.
달리 나타내지 않는 한, 구체적으로 설명되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 당업자에게 명백한 바와 같이 자체 공지된 방식으로 수행될 수 있고 수행되었다. 예를 들어 본원에 언급된 표준 핸드북 및 일반 배경 기술 및 그 안에 인용된 추가 문헌뿐만 아니라 예를 들어 하기 검토[Presta (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56, 2006), Levin and Weiss (Mol. Biosyst. 2(1): 49-57, 2006), Irving et al. (J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001), Schmitz 등(Placenta 21 Suppl. A: S106-12, 2000), Gonzales 등(Tumour Biol. 26(1): 31-43, 2005)]를 참고하며, 이는 친화도 성숙과 같은 단백질 조작을 위한 기술 및 면역글로불린과 같은 단백질의 특이성 및 다른 원하는 특성을 개선하기 위한 다른 기술을 설명한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "서열"(예를 들어 "면역글로불린 서열", "항체 서열", "가변 도메인 서열", "VHH 서열" 또는 "단백질 서열"과 같은 용어에서)은 맥락이 보다 제한적인 해석을 요구하지 않는 한, 일반적으로 관련된 아미노산 서열뿐만 아니라 이를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오타이드 서열 모두를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
아미노산 서열은 맥락에 따라 단일 아미노산 또는 둘 이상의 아미노산의 비분지된 서열을 의미하는 것으로 해석된다. 뉴클레오타이드 서열은 3개 이상의 뉴클레오타이드의 비분지된 서열을 의미하는 것으로 해석된다.
아미노산은 자연 발생 단백질에서 일반적으로 발견되는 L-아미노산이다. 아미노산 잔기는 표준 3문자 또는 1문자 아미노산 코드에 따라 표시될 것이다. 예를 들어 WO 제08/020079호의 48페이지의 표 A-2를 참고한다. D-아미노산을 함유하는 아미노산 서열은 이 정의에 포함되지 않는 것으로 의도된다. 번역 후 변형된 아미노산을 함유하는 임의의 아미노산 서열은 변형된 위치, 예컨대 하이드록실화 또는 글리코실화를 갖는 이 표 A-2에 나타낸 기호를 사용하여 초기에 번역된 아미노산 서열로서 기술될 수 있으나, 이들 변형은 아미노산 서열에 명시적으로 나타나지 않을 것이다. 서열 변형된 연결, 가교 및 말단 캡, 비펩타이드 결합 등으로 표현될 수 있는 임의의 펩타이드 또는 단백질이 이 정의에 포함된다.
용어 "단백질", "펩타이드", "단백질/펩타이드", 및 "폴리펩타이드"는 개시내용 전반에 상호교환적으로 사용되며, 각각은 이 개시내용의 목적을 위해 동일한 의미를 갖는다. 각각의 용어는 둘 이상의 아미노산의 선형 사슬로 만들어진 유기 화합물을 지칭한다. 상기 화합물은 10개 이상의 아미노산; 25개 이상의 아미노산; 50개 이상의 아미노산; 100개 이상의 아미노산, 200개 이상의 아미노산, 및 심지어 300개 이상의 아미노산을 가질 수 있다. 폴리펩타이드를 단백질과 구별하는 당업계에서 인식되는 아미노산의 수의 구분점이 없음에도 불구하고, 당업자는 폴리펩타이드가 일반적으로 단백질보다 더 적은 아미노산을 포함한다는 것; 폴리펩타이드가 화학적 합성 또는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다는 것; 및 단백질이 일반적으로 당업계에 공지된 재조합 방법에 의해 시험관내 또는 생체내에서 제조된다는 것을 이해할 것이다.
핵산 또는 아미노산 서열은 - 예를 들어, 그것이 수득된 반응 배지 또는 배양 배지와 비교하여 - 그것이 또 다른 핵산, 또 다른 단백질/폴리펩타이드, 또 다른 생물학적 성분 또는 거대분자 또는 적어도 하나의 오염 물질, 불순물 또는 미량의 성분과 같이, 상기 공급원 또는 배지 내에서 일반적으로 결합된 적어도 하나의 다른 성분으로부터 분리될 때 "(본질적으로) 단리된 (형태)"인 것으로 간주된다. 특히, 핵산 또는 아미노산 서열은 그것이 적어도 2배, 특히 적어도 10배, 보다 특히 적어도 100배, 및 최대 1000배 이상으로 정제되었을 때 "(본질적으로) 단리된" 것으로 간주된다. "(본질적으로) 단리된 형태"인 핵산 또는 아미노산은 적합한 기술, 예컨대 적합한 크로마토그래피 기술, 예컨대 폴리아크릴아미드-겔 전기영동을 사용하여 결정된 바와 같이, 바람직하게는 본질적으로 균질하다
뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열이 각각 또 다른 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 "포함한다"고 하거나, 또 다른 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열로 "본질적으로 구성된다"고 할 때, 이것은 후자의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열이 각각 먼저 언급된 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열 내에 포함되었다는 것을 의미할 수 있지만, 보다 일반적으로 이것은, 먼저 언급된 서열이 실제로 어떻게 생성 또는 수득되었는지에 관계없이(이는, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 적합한 방법에 의할 수 있음), 먼저 언급된 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열이 각각 그의 서열 내에 후자의 서열과 동일한 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 갖는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 스트레치를 포함한다는 것을 일반적으로 의미한다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 폴리펩타이드가 면역글로불린 단일 가변 도메인("ISV")을 포함한다고 할 때, 이것은 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인 서열이 본 발명의 폴리펩타이드의 서열 내에 포함되었다는 것을 의미할 수 있지만, 보다 일반적으로 이것은, 상기 본 발명의 폴리펩타이드가 어떻게 생성 또는 수득되었는지에 관계없이, 본 발명의 폴리펩타이드가 그의 서열 내에 ISV의 서열을 함유한다는 것을 의미한다. 또한, 핵산 또는 뉴클레오타이드 서열이 또 다른 뉴클레오타이드 서열을 포함한다고 할 때, 먼저 언급된 핵산 또는 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는, 그것이 발현 생성물(예컨대, 폴리펩타이드)로 발현될 때, 후자의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열이 상기 발현 생성물의 일부를 형성하도록 하는 것이다(다시 말하면, 후자 뉴클레오타이드 서열은 먼저 언급된 더 큰 핵산 또는 뉴클레오타이드 서열과 동일한 리딩 프레임 내에 있음). 또한, 본 발명의 구조체가 폴리펩타이드 또는 ISV를 포함한다고 할 때, 이것은 상기 구조체가 각각 상기 폴리펩타이드 또는 ISV를 적어도 포함한다는 것을 의미할 수 있지만, 보다 일반적으로 이것은, 상기 폴리펩타이드 또는 ISV가 상기 기, 잔기(예컨대, 아미노산 잔기), 모이어티 및/또는 결합 단위에 어떻게 연결되는지에 관계없이 그리고 상기 구조체가 어떻게 생성 또는 수득되었는지에 관계없이, 상기 구조체가 상기 폴리펩타이드 또는 ISV 외에도 기, 잔기(예컨대, 아미노산 잔기), 모이어티 및/또는 결합 단위를 포함한다는 것을 의미한다.
"본질적으로 구성된다"는 본 발명의 방법에 사용된 ISV가 본 발명의 ISV와 정확히 동일하거나 또는 ISV의 아미노 말단, 카복시 말단, 또는 아미노 말단 및 카복시 말단 모두에 부가된, 제한된 수의 아미노산 잔기, 예컨대 1-20개의 아미노산 잔기, 예를 들어 1-10개의 아미노산 잔기 및 바람직하게는 1-6개의 아미노산 잔기, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 잔기를 갖는 본 발명의 ISV에 상응한다는 것을 의미한다.
둘 이상의 뉴클레오타이드 서열을 비교하기 위해, 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열 사이의 "서열 동일성"의 백분율은 [제2 뉴클레오타이드 서열 내의 상응하는 위치에 있는 뉴클레오타이드와 동일한 제1 뉴클레오타이드 서열 내의 뉴클레오타이드의 수]를 [제1 뉴클레오타이드 서열 내의 뉴클레오타이드의 총 수]로 나누고 [100%]을 곱함으로써 계산될 수 있고, 여기서 제2 뉴클레오타이드 서열 내의 뉴클레오타이드의 각각의 결실, 삽입, 치환 또는 부가는 - 제1 뉴클레오타이드 서열과 비교하여 - 단일 뉴클레오타이드(위치)에서의 차이로서 간주된다. 대안적으로, 둘 이상의 뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 동일성의 정도는 표준 설정을 사용하여, 서열 정렬을 위한 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예컨대, NCBI Blast v2.0을 사용하여 계산될 수 있다. 서열 동일성의 정도를 결정하기 위한 일부 다른 기술, 컴퓨터 알고리즘 및 설정은 예를 들어 WO 제04/037999호, EP 제0967284호, EP 제1085089호, WO 제00/55318호, WO 제00/78972호, WO 제98/49185호 및 GB 제2357768호에 기재되어 있다. 일반적으로, 상술한 계산 방법에 따라 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 "서열 동일성"의 백분율을 결정하기 위해, 가장 많은 수의 뉴클레오타이드를 갖는 뉴클레오타이드 서열이 "제1" 뉴클레오타이드 서열로 취급되고, 다른 뉴클레오타이드 서열이 "제2" 뉴클레오타이드 서열로 취급될 것이다.
둘 이상의 아미노산 서열을 비교하기 위해, 제1 아미노산 서열 및 제2 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"(본원에서 "아미노산 동일성"으로도 지칭됨)의 백분율은 [제2 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기와 동일한 제1 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 수]를 [제1 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 총 수]로 나누고 [100%]를 곱함으로써 계산될 수 있고, 여기서 제2 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 각각의 결실, 삽입, 치환 또는 부가는 - 제1 아미노산 서열과 비교하여 - 단일 아미노산 잔기(위치)에서의 차이, 즉, 본원에 정의된 바와 같은 "아미노산 차이"로 간주된다. 대안적으로, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성의 정도는, 표준 설정을 사용하여, 뉴클레오타이드 서열에 대한 서열 동일성의 정도를 결정하기 위한 상기 언급된 것과 같은 공지된 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 계산될 수 있다. 일반적으로, 상술한 계산 방법에 따라 2개의 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"의 백분율을 결정하기 위해, 가장 많은 수의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열이 "제1" 아미노산 서열로 취급되고, 다른 아미노산 서열이 "제2" 아미노산 서열로 취급될 것이다.
또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성의 정도를 결정하는 데 있어서, 당업자는 소위 "보존적(conservative)" 아미노산 치환을 고려할 수 있으며, 이는 일반적으로 아미노산 잔기가 유사한 화학적 구조의 또 다른 아미노산 잔기로 치환되고 폴리펩타이드의 기능, 활성 또는 다른 생물학적 특성에 거의 또는 본질적으로 영향을 미치지 않는 아미노산 치환으로서 기술될 수 있다. 이러한 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어 WO 제04/037999호, GB 제335768호, WO 제98/49185호, WO 제00/46383호 및 WO 제01/09300호로부터 당업계에 널리 공지되어 있으며; 이러한 치환의 (바람직한) 유형 및/또는 조합은, 예컨대, WO 제04/037999호 또는 예컨대, WO 제98/49185호 및 그 안에 언급된 추가 참고문헌으로부터의 관련 교시에 기초하여 선택될 수 있다.
이러한 보존적 치환은 바람직하게는 하기 그룹 (a)-(e) 내의 하나의 아미노산이 동일한 그룹 내의 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 치환이다: (a) 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (b) 극성, 음으로 하전된 잔기 및 이들의 (하전되지 않은) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (c) 극성, 양으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; (d) 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (e) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp. 특히 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala에서 Gly로 또는 Ser로; Arg에서 Lys로; Asn에서 Gln로 또는 His로; Asp에서 Glu로; Cys에서 Ser로; Gln에서 Asn으로; Glu에서 Asp로; Gly에서 Ala로 또는 Pro로; His에서 Asn으로 또는 Gln으로; Ile에서 Leu로 또는 Val로; Leu에서 Ile로 또는 Val로; Lys에서 Arg로, Gln으로 또는 Glu로; Met에서 Leu로, Tyr로 또는 Ile로; Phe에서 Met로, Leu로 또는 Tyr로; Ser에서 Thr로; Thr에서 Ser로; Trp에서 Tyr로; Tyr에서 Trp로; 및/또는 Phe에서 Val로, Ile로 또는 Leu로.
본원에 기재된 폴리펩타이드에 적용되는 임의의 아미노산 치환은 또한 예를 들어, Schulz 등("Principles of Protein Structure", Springer-Verlag, 1978)에 의해 개발된 상이한 종의 상동성 단백질 사이의 아미노산 편차의 빈도의 분석, 예컨대, Chou 및 Fasman(Biochemistry 13: 211, 1974; Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978)에 의해 개발된 구조 형성 잠재력의 분석, 및 예컨대, Eisenberg 등(Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984), Kyte 및 Doolittle(J. Molec. Biol. 157: 105-132, 1981) 또는 Goldman 등(Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986)에 의해 개발된 단백질의 소수성 패턴의 분석에 기초할 수 있으며, 이들 모두는 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다. 나노바디의 1차, 2차 및 3차 구조에 대한 정보는 본원의 설명 및 상기 언급된 배경 기술에 제공되어 있다. 또한, 이 목적을 위해, 라마로부터의 VHH 도메인의 결정 구조는, 예를 들어 Desmyter 등(Nature Structural Biology, 3: 803, 1996), Spinelli 등(Natural Structural Biology, 3: 752-757, 1996) 또는 Decanniere 등(Structure, 7(4): 361, 1999)에 의해 제공된다. 종래의 VH 도메인에서 VH/VL 계면을 형성하는 일부 아미노산 잔기 및 이들 위치 상에서 잠재적인 낙타화 치환에 관한 추가 정보는 상기 인용된 선행 기술에서 발견될 수 있다.
아미노산 서열 및 핵산 서열은 이들이 이들 전체 길이에서 100% 서열 동일성(본원에 정의된 바와 같음)을 갖는 경우 "정확히 동일하다"고 한다.
2개의 아미노산 서열을 비교하는 경우, 용어 "아미노산(들) 차이"는 제2 서열과 비교하여, 제1 서열의 위치 상의 단일 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 지칭하며; 그것은 2개의 아미노산 서열이 1개, 2개 이상의 이러한 아미노산 차이를 함유할 수 있는 것으로 이해된다. 보다 특히, 본 발명의 아미노산 서열 및/또는 폴리펩타이드에서, 용어 "아미노산(들) 차이"는 각각 a), c) 또는 e)의 CDR 서열과 비교하여, b), d) 또는 f)에 특정된 CDR 서열의 위치 상의 단일 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 지칭하며; 그것은 b), d) 및 f)의 CDR 서열이 각각 a), c) 또는 e)의 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 최대 5개의 이러한 아미노산 차이를 함유할 수 있는 것으로 이해된다.
"아미노산(들) 차이"는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드의 특성을 개선하거나 적어도 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드의 원하는 특성 또는 원하는 특성의 균형 또는 조합을 너무 많이 손상시키지 않는 임의의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 최대 5개의 치환, 결실 또는 삽입, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 이와 관련하여, 생성된 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드는, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 최대 5개의 치환, 결실 또는 삽입이 없는 하나 이상의 CDR 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 동일하거나, 거의 동일하거나, 또는 더 높은 친화도로 아그레칸에 결합해야 하며, 상기 친화도는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정된 바와 같다.
이와 관련하여, b), d) 및/또는 f)에 따른 CDR의 아미노산 서열은 자체 공지된 친화도 성숙의 하나 이상의 기술을 사용하여 친화도 성숙에 의해 각각 a), c) 및/또는 e)에 따라 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열일 수 있다.
예를 들어, 그리고 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는 데 사용되는 숙주 유기체에 따라, 이러한 결실 및/또는 치환은, 당업자의 능력 내에서와 같이, 번역후 변형을 위한 하나 이상의 부위(예컨대, 하나 이상의 글리코실화 부위)가 제거되는 방식으로 설계될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "나노바디 패밀리", "VHH 패밀리" 또는 "패밀리"는 동일한 길이를 갖고(즉, 이들은 이들의 서열 내에 동일한 수의 아미노산을 가짐), 이들 중 위치 8 및 위치 106(카바트 넘버링에 따름) 사이의 아미노산 서열이 89% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 나노바디 및/또는 VHH 서열의 군을 지칭한다.
상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "에피토프(epitope)" 및 "항원 결정기(antigenic determinant)"는 면역글로불린, 통상적인 항체, 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드와 같은 항원 결합 분자에 의해, 보다 특히 상기 분자의 항원 결합 부위에 의해 인식되는 폴리펩타이드 또는 단백질과 같은 거대분자의 일부를 지칭한다. 에피토프는 면역글로불린을 위한 최소 결합 부위를 정의하고, 따라서 면역글로불린의 특이성의 표적을 나타낸다.
에피토프를 인식하는 항원 결합 분자의 일부(예컨대, 면역글로불린, 통상적인 항체, 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드)는 "파라토프(paratope)"로 불린다.
특정 에피토프, 항원 또는 단백질(또는 이의 적어도 하나의 부분, 단편 또는 에피토프)에 "결합"하거나 "특이적으로 결합"할 수 있는, "친화도를 갖는" 및/또는 "특이성을 갖는" 아미노산 서열(예컨대, 본 발명의 ISV, 항체, 폴리펩타이드, 또는 일반적으로 항원 결합 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 이의 단편)은 상기 에피토프, 항원 또는 단백질에 "대한" 것이라고 하거나 이러한 에피토프, 항원 또는 단백질에 대한 "결합" 분자이거나, 또는 "항"-에피토프, "항"-항원 또는 "항"-단백질(예컨대, "항"-아그레칸)이라고 한다.
친화도는 분자 상호작용의 강도 또는 안정성을 나타낸다. 친화도는 일반적으로 KD, 또는 해리 상수로 제공되며, 이는 몰/리터(또는 M)의 단위를 갖는다. 친화도는 또한 결합 상수 KA로서 표현될 수 있으며, 이는 1/KD이고, (몰/리터)-1(또는 M-1)의 단위를 갖는다. 본 명세서에서, 2개의 분자 사이의 상호작용의 안정성은 주로 이들의 상호작용의 KD 값의 측면에서 표현될 것이며; 관계 KA =1/KD에 비추어, 분자 상호작용의 강도를 그의 KD 값에 의해 특정하는 것이 또한 상응하는 KA 값을 계산하는 데 사용될 수 있음이 당업자에게 명백하다. KD-값은 잘 알려진 관계 DG=RT.ln(KD)(동일하게 DG=-RT.ln(KA))에 의해 결합의 자유 에너지(DG)의 변화와 관련이 있기 때문에 또한 열역학적 의미에서 분자 상호작용의 강도를 특성화하며, 여기서 R은 기체 상수이고, T는 절대 온도이며, ln은 자연 로그를 나타낸다.
의미있는(예컨대, 특이적인) 것으로 간주되는 생물학적 상호작용에 대한 KD는 전형적으로 10-12 M(0.001 nM) 내지 10-5 M(10000 nM) 범위이다. 상호작용이 더 강할수록 그의 KD는 더 낮다.
KD는 또한 koff로 표시되는 복합체의 해리 속도 상수 대 kon으로 표시되는 그의 결합 속도의 비율로서 표현될 수 있다(따라서, KD =koff/kon 및 KA = kon/koff). 오프-속도 koff는 단위 s-1을 갖는다(여기서, s는 초의 SI 단위 표기법임). 온-속도 kon은 단위 M-1s-1.를 갖는다. 온-속도는 102 M-1s-1 내지 약 107 M-1s-1로 달라질 수 있고, 이분자 상호작용에 대한 확산-제한 결합 속도 상수에 접근한다. 오프-속도는 관계 t1/2=ln(2)/koff에 의해 주어진 분자 상호작용의 반감기와 관련이 있다. 오프-속도는 10-6 s-1(며칠의 t1/ 2을 갖는 거의 비가역적인 복합체) 내지 1 s-1(t1/2=0.69 s)로 달라질 수 있다.
항원 또는 항원 결정기에 대한 ISVD와 같은 항원 결합 단백질의 특이적 결합은, 예를 들어, 포화 결합 분석 및/또는 경쟁적 결합 분석, 예컨대 방사선-면역분석(RIA), 효소 면역분석(EIA) 및 샌드위치 경쟁 분석, 및 당업계에 자체 공지된 이의 상이한 변형; 뿐만 아니라 본원에 언급된 다른 기술을 포함하는, 자체 공지된 임의의 적합한 방식으로 결정될 수 있다.
2개의 분자 사이의 분자 상호작용의 친화도는 널리 공지된 표면 플라스몬 공명(SPR) 바이오센서 기술(예를 들어 Ober et al. 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559 참고)과 같은 자체 공지된 상이한 기술을 통해 측정될 수 있고, 여기서 하나의 분자는 바이오센서 칩 상에 고정되고 다른 분자는 유동 조건 하에 고정된 분자 위로 통과하여, kon, koff 측정값 및 따라서 KD(또는 KA) 값을 산출한다. 이것은 예를 들어 잘 알려진 BIACORE® 기기(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 수행될 수 있다. 동역학 배제 분석(KINEXA®)(Drake et al. 2004, Analytical Biochemistry 328: 35-43)은 결합 파트너를 표지화하지 않고 용액 내의 결합 사건을 측정하고 복합체의 해리를 동역학적으로 배제하는 것에 기초한다. 용액내 친화도(In-solution affinity) 분석은 자동 생물분석 및 신속한 샘플 처리시간(turnaround)을 위한 플랫폼을 제공하는 GYROLAB® 면역분석 시스템(Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74), 또는 ELISA를 사용하여 수행될 수 있다.
측정 과정이 예를 들어 하나의 분자의 바이오센서 상의 코팅과 관련된 인공물에 의해 포함된 분자의 고유 결합 친화도에 어떻게든 영향을 미치는 경우, 측정된 KD가 겉보기 KD(apparent KD)에 상응할 수 있음이 당업자에게 또한 명백할 것이다. 또한, 겉보기 KD는 하나의 분자가 다른 분자에 대한 둘 이상의 인식 부위를 함유하는 경우 측정될 수 있다. 이러한 상황에서, 측정된 친화도는 2개의 분자에 의한 상호작용의 결합활성(avidity)에 의해 영향을 받을 수 있다. 특히, KD의 정확한 측정은 매우 노동 집약적일 수 있으며, 그 결과, 종종 겉보기 KD 값이 2개의 분자의 결합 강도를 평가하기 위해 결정된다. 모든 측정이 일관된 방식으로(예컨대, 분석 조건이 변경되지 않는) 수행되는 한, 겉보기 KD 측정값은 실제 KD의 근사치로서 사용될 수 있으므로, 본 문서에서의 KD 및 겉보기 KD는 동일한 중요성 또는 관련성을 가지고 취급되어야 함에 유의한다.
용어 "특이성"은 특정 항원 결합 분자 또는 항원 결합 단백질(예컨대, 본 발명의 ISVD 또는 폴리펩타이드) 분자가 결합할 수 있는 상이한 유형의 항원 또는 항원 결정기의 수를 지칭한다. 항원 결합 단백질의 특이성은, 예를 들어 또한 항원 결합 분자(예컨대, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 ISVD) 및 관련된 항원 사이의 결합을 측정하는 일부 바람직한 기술을 설명하는 WO 제08/020079호(본원에 참조로 포함됨)의 53-56페이지에 기재된 바와 같이, 친화도 및/또는 결합활성에 기초하여 결정될 수 있다. 전형적으로, 항원 결합 단백질(예컨대, 본 발명의 ISVD 및/또는 폴리펩타이드)은 10-5 내지 10-12 몰/리터 이하, 및 바람직하게는 10-7 내지 10-12 몰/리터 이하 및 보다 바람직하게는 10-8 내지 10-12 몰/리터의 해리 상수(KD)로(즉, 105 내지 1012 리터/몰 이하, 및 바람직하게는 107 내지 1012 리터/몰 이상 및 보다 바람직하게는 108 내지 1012 리터/몰의 결합 상수(KA)로) 이들의 항원에 결합할 것이다. 10-4 몰/리터 초과의 임의의 KD 값(또는 104 리터/몰보다 낮은 임의의 KA 값)은 일반적으로 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 바람직하게는, 본 발명의 1가 ISVD는 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만, 예컨대, 10 내지 5 pM 이하의 친화도로 원하는 항원에 결합할 것이다. 또한 WO 제08/020079호의 53-56페이지의 단락 n)을 참고한다.
ISV 및/또는 폴리펩타이드는 ISVD 및/또는 폴리펩타이드가 제2 표적 또는 항원에 결합하는 친화도보다 적어도 10배, 예컨대 적어도 100배, 및 바람직하게는 적어도 1000배 이상인 친화도(상기 기재되고, 적합하게는 KD 값, KA 값, Koff 속도 및/또는 Kon 속도로 표시된 바와 같음)로 제1 항원에 결합할 때 또 다른(제2) 표적 또는 항원과 비교하여 (제1) 표적 또는 항원에 "특이적"이라고 한다. 예를 들어, ISVD 및/또는 폴리펩타이드는 상기 ISV 및/또는 폴리펩타이드가 제2 표적 또는 항원에 결합하는 KD보다 적어도 10배 미만, 예컨대 적어도 100배 미만, 및 바람직하게는 적어도 1000배 미만 또는 심지어 그 미만인 KD 값으로 제1 표적 또는 항원에 결합할 수 있다. 바람직하게는, ISV 및/또는 폴리펩타이드가 제2 표적 또는 항원과 비교하여 제1 표적 또는 항원에 "특이적"인 경우, 그것은 상기 제2 표적 또는 항원에 대한 것이 아니라 상기 제1 표적 또는 항원에 대한(본원에 정의된 바와 같음) 것이다.
항원 또는 항원 결정기에 대한 항원 결합 단백질의 특이적 결합은, 예를 들어, 포화 결합 분석 및/또는 경쟁적 결합 분석, 예컨대 방사선면역분석(RIA), 효소 면역분석(EIA) 및 당업계에 공지된 이의 상이한 변형; 뿐만 아니라 본원에 언급된 다른 기술을 포함하는, 자체 공지된 임의의 적합한 방식으로 결정될 수 있다.
친화도를 평가하기 위해 사용될 수 있는 바람직한 접근법은 Friguet 등 1985(J. Immunol. Methods 77: 305-19)의 2단계 ELISA(효소 결합 면역흡착 분석) 절차이다. 이 방법은 용액 상 결합 평형 측정을 확립하고 플라스틱과 같은 지지체 상의 분자 중 하나의 흡착과 관련된 가능한 인공물을 피한다. 당업자에게 명백할 바와 같이, 해리 상수는 실제 또는 겉보기 해리 상수일 수 있다. 해리 상수를 결정하는 방법은 당업자에게 명백할 것이며, 이는 예를 들어 WO 제08/020079호의 53-56페이지에 언급된 기술을 포함한다.
마지막으로, 많은 상황에서 숙련된 과학자는 일부 참조 분자와 비교하여 결합 친화도를 결정하는 것이 편리하다고 판단할 수 있음에 유의해야 한다. 예를 들어, 분자 A와 B 사이의 결합 강도를 평가하기 위해, 예컨대, B에 결합하는 것으로 알려져 있고 ELISA 또는 FACS(형광 활성화 세포 분류)에서의 쉬운 검출을 위한 바이오틴 또는 다른 포맷(형광 검출을 위한 형광단, 광 흡수 검출을 위한 발색단, 스트렙타비딘 매개 ELISA 검출을 위한 바이오틴)과 같은 형광단 또는 발색단 기 또는 다른 화학적 모이어티로 적합하게 표지된 참조 분자 C를 사용할 수 있다. 전형적으로, 참조 분자 C는 고정된 농도로 보유되고, A의 농도는 B의 주어진 농도 또는 양에 대해 변한다. 그 결과, A의 부재하에 C에 대해 측정된 신호가 절반이 되는 A의 농도에 상응하는 IC50 값이 수득된다. 참조 분자의 KD인 KD ref 뿐만 아니라 참조 분자의 총 농도 cref가 알려진 경우, 상호작용 A-B에 대한 겉보기 KD는 하기 식으로부터 수득될 수 있다: KD =IC50/(1+cref/KDref). cref << KD ref이면, KD 
IC50임에 유의한다. 비교되는 결합제에 대해 IC50의 측정이 일관된 방식으로(예컨대, cref를 고정된 상태로 유지하는) 수행되는 경우, 분자 상호작용의 강도 또는 안정성의 차이는 IC50을 비교함으로써 평가될 수 있고, 이 측정은 이 문서 전체에서 KD 또는 겉보기 KD와 동등한 것으로 판단된다.
절반 최대 억제 농도(IC50)는 또한 생물학적 또는 생화학적 기능, 예컨대, 약리학적 효과를 억제하는 데 있어서의 화합물의 유효성의 척도일 수 있다. 이 정량적 측정값은 주어진 생물학적 과정(또는 과정의 성분, 즉 효소, 세포, 세포 수용체, 화학주성(chemotaxis), 역형성(anaplasia), 전이, 침습성 등)을 절반까지 억제하기 위해 얼마나 많은 폴리펩타이드 또는 ISV(예컨대, 나노바디)가 필요한지 나타낸다. 다시 말하면, 그것은 물질의 절반 최대(50%) 억제 농도(IC)(50% IC, 또는 IC50)이다. IC50 값은 작용제의 최대 생물학적 반응의 절반을 억제하는 데 필요한 농도를 결정함으로써 주어진 길항제, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드 또는 ISV(예컨대, 나노바디)에 대해 계산될 수 있다. 약물의 KD는 용량-반응 곡선을 구축하고 상이한 농도의 길항제, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드 또는 ISV(예컨대, 나노바디)가 작용제 활성을 역전시키는데 미치는 효과를 조사함으로써 결정될 수 있다.
용어 절반 최대 유효 농도(EC50)는 특정 노출 시간 후 기준선과 최대값 사이의 중간의 반응을 유도하는 화합물의 농도를 지칭한다. 본 맥락에서, 그것은 폴리펩타이드, ISV(예컨대, 나노바디)의 효능의 척도로서 사용된다. 단계별 용량 반응 곡선의 EC50은 그의 최대 효과의 50%가 관찰되는 화합물의 농도를 나타낸다. 농도는 바람직하게는 몰 단위로 표현된다.
생물학적 시스템에서, 리간드 농도의 작은 변화는 전형적으로 반응의 빠른 변화를 초래하며, 시그모이드 함수를 따른다. 리간드 농도 증가에 따른 반응 증가가 느려지기 시작하는 변곡점이 EC50이다. 이것은 최적 적합(best-fit) 선의 미분에 의해 수학적으로 결정될 수 있다. 추정을 위해 그래프에 의존하는 것은 대부분의 경우에 편리하다. EC50이 실시예 섹션에 제공되는 경우, 실험은 KD를 가능한 정확하게 반영하도록 설계되었다. 다시 말하면, EC50 값은 이후에 KD 값으로 간주될 수 있다. 용어 "평균 KD"는 적어도 1개, 바람직하게는 1개를 초과하는, 예컨대 적어도 2개의 실험에서 수득된 평균 KD 값에 관한 것이다. 용어 "평균"은 수학적 용어 "평균"(데이터의 합을 데이터 내의 항목의 수로 나눈 값)을 지칭한다.
그것은 또한 화합물의 억제(50% 억제)의 척도인 IC50과 관련이 있다. 경쟁 결합 분석 및 기능적 길항제 분석의 경우, IC50은 용량-반응 곡선의 가장 일반적인 요약 척도이다. 작용제/자극제 분석의 경우, 가장 일반적인 요약 척도는 EC50이다.
억제 상수(Ki)는 억제제가 얼마나 강력한지에 관한 지표이며; 그것은 절반 최대 억제를 생성하는 데 필요한 농도이다. 실험 조건에 따라 변할 수 있는 IC50과 달리, Ki는 절대 값이며, 종종 약물의 억제 상수로 지칭된다. 억제 상수 Ki는 쳉-프루소프(Cheng-Prusoff) 방정식을 사용하여 계산될 수 있다:
상기 식에서, [L]은 리간드의 고정 농도이다.
ISV 및/또는 폴리펩타이드는 ISV 및/또는 폴리펩타이드가 제2 표적 또는 항원에 결합하는 친화도보다 적어도 10배, 예컨대 적어도 100배, 및 바람직하게는 적어도 1000배 이상인 친화도(상기 기재되고, 적합하게는 KD 값, KA 값, Koff 속도 및/또는 Kon 속도로 표현된 바와 같음)로 제1 항원에 결합할 때 또 다른(제2) 표적 또는 항원와 비교하여 (제1) 표적 또는 항원에 "특이적"이라고 한다. 예를 들어, ISV 및/또는 폴리펩타이드는 상기 ISV 및/또는 폴리펩타이드가 제2 표적 또는 항원에 결합하는 KD보다 적어도 10배 미만, 예컨대 적어도 100배 미만, 및 바람직하게는 적어도 1000배 미만 또는 심지어 그 미만의 KD 값으로 제1 표적 또는 항원에 결합할 수 있다. 바람직하게는, ISV 및/또는 폴리펩타이드가 제2 표적 또는 항원과 비교하여 제1 표적 또는 항원에 "특이적"인 경우, 그것은 상기 제2 표적 또는 항원에 대한 것이 아니라 상기 제1 표적 또는 항원에 대한(본원에 정의된 바와 같음) 것이다.
용어 "(교차) 차단하다", "(교차) 차단된", "(교차) 차단하는 것", "경쟁적 결합", "(교차) 경쟁하다", "(교차) 경쟁하는 것" 및 "(교차) 경쟁"은 면역글로불린, 항체, ISV, 폴리펩타이드 또는 다른 결합제가 주어진 표적에 대한 다른 면역글로불린, 항체, ISV, 폴리펩타이드 또는 결합제의 결합을 방해하는 능력을 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 면역글로불린, 항체, ISV, 폴리펩타이드 또는 다른 결합제가 표적에 대한 또 다른 것의 결합을 방해할 수 있는 정도, 및 따라서 그것이 본 발명에 따라 교차 차단한다고 할 수 있는지 여부는, 당업계에 일반적인 경쟁 결합 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 특히 적합한 정량적 교차 차단 분석은 세포 상에서 발현된 아그레칸을 이용한 ELISA 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 결합 분석을 포함한다. FACS 설정에서, (교차) 차단의 정도는 (감소된) 채널 형광에 의해 측정될 수 있다.
표적에 대한 면역글로불린, 항체, ISV, 폴리펩타이드 또는 다른 결합제가 본원에 정의된 바와 같이 교차 차단하거나, 교차 차단할 수 있거나, 경쟁적으로 결합하거나 교차 경쟁적인지 여부를 결정하는 방법은, 예컨대, Xiao-Chi Jia 등(Journal of Immunological Methods 288: 91-98, 2004), Miller 등(Journal of Immunological Methods 365: 118-125, 2011) 및/또는 본원에 기재된 방법(예컨대, 실시예 2.3 참고)에 기재되어 있다.
아미노산 서열은, 그것이 (본원에 정의된 바와 같은) 이러한 상이한 항원 또는 항원 결정기에 특이적인 경우, 2개의 상이한 항원 또는 항원 결정기(예컨대, 상이한 종의 포유동물로부터의 아그레칸, 예컨대, 인간 아그레칸, 개 아그레칸, 소 아그레칸, 랫트 아그레칸, 돼지 아그레칸, 마우스 아그레칸, 토끼 아그레칸, 시노몰구스 아그레칸, 및/또는 레서스 아그레칸)에 "교차반응성"이라고 한다.
본 발명의 맥락에서, "조절하는" 또는 "조절하는 것"은 일반적으로 적합한 시험관내, 세포, 생체외 또는 생체내 분석(예컨대 본원에 언급된 것)을 사용하여 측정할 때, 본 발명의 ISV, 폴리펩타이드 또는 구조체에 의해, 세린프로테아제 패밀리의 구성원, 카텝신, 매트릭스 메탈로-프로테이나제(MMP)/매트릭신 또는 ADAMTS(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs), 바람직하게는 MMP8, MMP13, MMP19, MMP20, ADAMTS5(아그레카나제-2), ADAMTS4(아그레카나제-1), ADAMTS11 및/또는 전염증성 사이토카인, 예컨대, 인터루킨-1α, 및 -β, 인터루킨-6 및 TNF-α의 활성을 감소시키거나 억제하는 것을 의미한다. 특히, "조절하는" 또는 "조절하는 것"은 본 발명의 면역글로불린 또는 폴리펩타이드의 존재 없이 동일한 조건 하에 동일한 분석에서 전술한 구성원의 활성과 비교하여, 적합한 시험관내, 세포, 생체외 또는 생체내 분석(예컨대, 본원에 언급된 것)을 사용하여 측정할 때 전술한 구성원의 활성을 적어도 1%, 바람직하게는 적어도 5%, 예컨대 적어도 10% 또는 적어도 25%, 예를 들어 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 90% 이상 감소시키거나 억제하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "향상시키는" 또는 "향상시키는 것"은 일반적으로 적합한 시험관내, 세포, 생체외 또는 생체내 분석(예컨대, 본원에 언급된 것)을 사용하여 측정할 때, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 구조체의 활성을 증가, 강화 또는 촉진하는 것을 의미한다. 특히, 적합한 시험관내, 세포, 생체외 또는 생체내 분석(예컨대, 본원에 언급된 것)을 사용하여 측정할 때, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대, 아그레칸에 결합하는 ISV의 존재 없이 동일한 조건 하에 동일한 분석에서의 구조체 또는 폴리펩타이드의 활성과 비교하여, 본 발명의 펩타이드 또는 구조체의 활성을 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 이상, 예컨대 100% 증가시키거나 향상시키는 것을 의미한다.
2개의 화합물의 "상승적 효과(synergistic effect)"는 2개의 제제의 조합의 효과가 이들의 개별 효과의 합보다 크고, 바람직하게는 대조군 및 단일 약물과 통계적으로 상이한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 본 발명의 ISV 또는 폴리펩타이드의 "효능"은, 예컨대, 연골 내로의 침투, 아그레칸에의 특이적 결합 및/또는 연골 보유와 같은 특정 효과가 발생하는 데 필요한 본 발명의 ISV 또는 폴리펩타이드의 양의 기능이다. 그것은 당업자에게 공지된 방법에 의해, 그리고 예를 들어 실시예 섹션에 사용된 바와 같이 간단하게 측정될 수 있다.
대조적으로, 본 발명의 ISV 또는 폴리펩타이드의 "효능"은 포화 ISV 또는 폴리펩타이드 농도에서, 효과의 최대 강도 자체를 측정한다. 효능은 본 발명의 ISV 또는 폴리펩타이드로부터 달성될 수 있는 최대 반응을 나타낸다. 그것은, 예컨대, 아그레칸에의 결합 또는 아그레칸에의 보유, 및/또는 ADAMTS 패밀리 구성원 또는 MMP 패밀리 구성원의 활성의 억제와 같은 원하는 (치료적) 효과를 생성하는 ISV 또는 폴리펩타이드의 능력을 지칭한다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 구조체의 "반감기"는, 예를 들어 구조체 또는 폴리펩타이드의 분해 및/또는 자연 메커니즘에 의한 구조체 또는 폴리펩타이드의 제거 또는 격리로 인해, 구조체 또는 폴리펩타이드의 혈청 농도가 생체내에서 50%까지 감소하는 데 걸리는 시간을 지칭하며, 예컨대, WO 제08/020079호의 57페이지의 단락 o)를 참고한다. 본 발명의 구조체 또는 폴리펩타이드의 생체내 반감기는, 예컨대 약동학적 분석에 의해서와 같이, 자체 공지된 임의의 방식으로 결정될 수 있다. 적합한 기술은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 일반적으로 WO 제08/020079호의 57페이지의 단락 o)에 기재된 바와 같을 수 있다. WO 제08/020079호의 57페이지의 단락 o)에 언급된 바와 같이, 반감기는 t1/2-알파, t1/2-베타 및 곡선 하 면적(AUC)과 같은 파라미터를 사용하여 표현될 수 있다. 예를 들어, Kenneth 등(Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, John Wiley & Sons Inc, 1986) 및 M Gibaldi 및 D Perron(("Pharmacokinetics", Marcel Dekker, 2nd Rev. Edition, 1982)과 같은 표준 핸드북을 참고한다. 용어 "반감기 증가" 또는 "증가된 반감기"는, 예를 들어 WO 제08/020079호의 57페이지의 단락 o)에 기재된 바와 같이, t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 모두가 증가되거나 증가되지 않는 t1/2-베타의 증가를 지칭한다.
달리 나타내지 않는 한, 용어 "면역글로불린" 및 "면역글로불린 서열"은 - 중쇄 항체 또는 일반적인 4-사슬 항체를 지칭하기 위해 본원에 사용되든지 간에 - 전체 크기 항체, 이의 개별 사슬뿐만 아니라 이의 모든 부분, 도메인 또는 단편(각각 비제한적으로 항원 결합 도메인 또는 단편, 예컨대 VHH 도메인 또는 VH/VL 도메인 포함) 모두를 포함하기 위해 일반 용어로서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 (폴리펩타이드 또는 단백질의) "도메인"은 단백질의 나머지와 독립적으로 그의 삼차 구조를 유지하는 능력을 갖는 접힌 단백질 구조를 지칭한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 담당하며, 많은 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능의 손실 없이 부가되거나, 제거되거나, 다른 단백질에 전달될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "면역글로불린 도메인"은 항체 사슬(예컨대, 일반적인 4-사슬 항체의 사슬 또는 중쇄 항체의 사슬)의 구형 영역, 또는 이러한 구형 영역으로 본질적으로 구성되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 면역글로불린 도메인은 항체 분자의 면역글로불린 접힘 특성을 유지하는 것을 특징으로 하며, 이는 선택적으로 보존된 디설파이드 결합에 의해 안정화된, 2개의 베타-시트로 배열된 약 7개의 역평행 베타-가닥의 2층 샌드위치로 구성된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "면역글로불린 가변 도메인"은 각각 "프레임워크 영역 1" 또는 "FR1"; "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2"; "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3"; 및 "프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로서 당업계에 그리고 하기 본원에 지칭되는 4개의 "프레임워크 영역"으로 본질적으로 구성되는 면역글로불린 도메인을 의미하고; 이 프레임워크 영역은 각각 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"로서 당업계에 그리고 하기 본원에 지칭되는 3개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"에 의해 중단된다. 따라서, 면역글로불린 가변 도메인의 일반적인 구조 또는 서열은 하기와 같이 표시될 수 있다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. 그것은 항원 결합 부위, 및 특히 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 가짐으로써 항체에게 항원에 대한 특이성을 부여하는 면역글로불린 가변 도메인(들)이다.
"단일 가변 도메인"과 함께 상호교환적으로 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"("ISV" 또는 "ISVD")은 항원 결합 부위가 단일 면역글로불린 도메인 상에 존재하고 단일 면역글로불린 도메인에 의해 형성되는 분자를 정의한다. 이는 ISV를 "종래의" 면역글로불린 또는 이들의 단편을 분리시키며, 여기서 2개의 면역글로불린 도메인, 특히 2개의 가변 도메인은 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 전형적으로, 종래의 면역글로불린에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)은 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 이 경우, VH 및 VL 모두의 상보성 결정 영역(CDR)은 항원 결합 부위에 기여할 것이며, 즉 총 6개의 CDR이 항원 결합 부위 형성에 관여할 것이다.
상기 정의에 비추어 볼 때, 종래의 4-사슬 항체의 항원 결합 도메인(예컨대, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자; 당업계에 공지됨) 또는 이러한 종래의 4-사슬 항체로부터 유래된 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 예컨대 디설파이드 연결된 Fv 또는 scFv 단편, 또는 디아바디(모두 당업계에 공지됨)의 항원 결합 도메인은 일반적으로 ISV로 간주되지 않을 것인데, 이 경우 항원의 각각의 에피토프에 대한 결합이 하나의(단일) 면역글로불린 도메인에 의해 발생하는 것이 아니라 (결합하는) 면역글로불린 도메인, 예컨대 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 쌍에 의해, 즉, 각각의 항원의 에피토프에 공동으로 결합하는 면역글로불린 도메인의 VH-VL 쌍에 의해 발생할 것이기 때문이다.
대조적으로, ISV는 부가적인 면역글로불린 가변 도메인과 쌍을 형성하지 않고 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. ISV의 결합 부위는 단일 VH/VHH 또는 VL 도메인에 의해 형성된다. 따라서, ISV의 항원 결합 부위는 3개 이하의 CDR에 의해 형성된다.
이와 같이, 단일 가변 도메인은, 단일 항원 결합 단위(즉, 단일 가변 도메인으로 본질적으로 구성되는 기능적 항원 결합 단위, 이로써 단일 항원 결합 도메인은 또 다른 가변 도메인과 상호작용하여 기능적 항원 결합 단위를 형성할 필요가 없음)를 형성할 수 있는 한, 경쇄 가변 도메인 서열(예컨대, VL-서열) 또는 이의 적합한 단편; 또는 중쇄 가변 도메인 서열(예컨대, VH-서열 또는 VHH 서열) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, ISV는 중쇄 가변 도메인 서열(예컨대, VH-서열)이고; 보다 구체적으로, ISV는 종래의 4-사슬 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열 또는 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열일 수 있다.
예를 들어, ISV는 (단일) 도메인 항체, (단일) 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산, (단일) 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, "dAb" 또는 sdAb, 또는 dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산, 또는 나노바디(본원에 정의된 바와 같으며, 비제한적으로 VHH 포함); 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열, 다른 단일 가변 도메인, 면역글로불린 단일 중쇄 가변 도메인 또는 이의 임의의 하나의 임의의 적합한 단편일 수 있다.
특히, ISV는 나노바디®(본원에 정의된 바와 같음) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다. [참고: 나노바디® 및 나노바디즈®는 Ablynx N.V.의 등록 상표이다]. 나노바디의 일반적인 설명을 위해, 하기의 추가 설명뿐만 아니라, 예컨대 WO 제08/020079호(16 페이지)에 기재된 바와 같은 본원에 언급된 선행 기술을 참조한다.
VHH, VHH 도메인, VHH 항체 단편, 및 VHH 항체로도 알려진 "VHH 도메인"은 원래 "중쇄 항체"의(즉, "경쇄가 없는 항체"의; Hamers-Casterman et al. Nature 363: 446-448, 1993) 항원 결합 면역글로불린(가변) 도메인으로서 기재되었다. 용어 "VHH 도메인"은 종래의 4-사슬 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인으로부터의 이들 가변 도메인(본원에서 "VH 도메인" 또는 "VH 도메인"로 지칭됨)과 종래의 4-사슬 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인으로부터의 이들 가변 도메인(본원에서 "VL 도메인" 또는 "VL 도메인"로 지칭됨)을 구별하기 위해 선택되었다. VHH 및 나노바디의 추가 설명을 위해, 예를 들어 Muyldermans(Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001)에 의한 검토 논문뿐만 아니라 일반 배경 기술로서 언급된 하기 특허 출원: Vrije Universiteit Brussel의 WO 제94/04678호, WO 제95/04079호 및 호; Unilever의 WO 제94/25591호, WO 제99/37681호, WO 제00/40968호, WO 제00/43507호, WO 제00/65057호, WO 제01/40310호, WO 제01/44301호, EP 제1134231호 및 WO 제02/48193호; Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)의 WO 제97/49805호, WO 제01/21817호, WO 제03/035694호, WO 제03/054016호 및 WO 제03/055527호; Algonomics N.V. 및 Ablynx N.V.의 WO 제03/050531호; National Research Council of Canada에 의한 WO 제01/90190호; the Institute of Antibodies에 의한 WO 제03/025020호(= EP 제1433793호); 뿐만 아니라 Ablynx N.V.에 의한 WO 제04/041867호, WO 제04/041862호, WO 제04/041865호, WO 제04/041863호, WO 제04/062551호, WO 제05/044858호, WO 제06/40153호, WO 제06/079372호, WO 제06/122786호, WO 제06/122787호 및 WO 제06/122825호 및 Ablynx N.V.에 의한 추가 공개된 특허 출원을 참고한다. 또한 이들 출원에 언급된 추가 선행 기술, 및 특히 국제 출원 WO 제06/040153호의 41-43페이지에 언급된 참고문헌의 목록을 참고하며, 이 목록 및 참고문헌은 본원에 참고로 포함되어 있다. 이들 문헌에 기재된 바와 같이, ISV, 나노바디(특히, VHH 서열 및 부분적으로 인간화된 나노바디)는 특히 하나 이상의 프레임워크 서열에서 하나 이상의 "특징(Hallmark) 잔기"의 존재를 특징으로 할 수 있다. ISV, 나노바디의 인간화 및/또는 낙타화를 포함하는 나노바디뿐만 아니라 다른 변형, 부분 또는 단편, 유도체 또는 "나노바디 융합", 다가 구조체(링커 서열의 일부 비제한적인 예 포함) 및 ISV, 나노바디 및 이들의 제제의 반감기를 증가시키기 위한 상이한 변형의 추가 설명은, 예컨대, WO 제08/101985호 및 WO 제08/142164호에서 발견될 수 있다. 나노바디의 추가 일반 설명을 위해, 예컨대, WO 제08/020079호(16 페이지)에 기재된 본원에 인용된 선행 기술을 참조한다.
"Dab"(들), "도메인 항체", 및 "dAb"로도 알려진 "도메인 항체"(용어 "도메인 항체" 및 "dAb"는 GlaxoSmithKline 그룹사의 상표로 사용됨)는 예컨대, EP 제0368684호, Ward 등(Nature 341: 544-546, 1989), Holt 등(Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003) 및 WO 제03/002609호뿐만 아니라 예를 들어 WO 제04/068820호, WO 제06/030220호, WO 제06/003388호 및 Domantis 사의 다른 공개된 특허 출원에 기재되었다. 도메인 항체는 본질적으로 비낙타과 포유동물, 특히 인간 4-사슬 항체의 VH 또는 VL 도메인에 상응한다. 단일 항원 결합 도메인으로서, 즉, 각각 VL 또는 VH 도메인과 쌍을 형성하지 않고, 에피토프에 결합하기 위해, 예컨대, 인간 단일 VH 또는 VL 도메인 서열의 라이브러리를 사용함으로써 이러한 항원 결합 특성에 대한 특이적 선택이 필요하다. 도메인 항체는 VHH와 같이 대략 13 내지 대략 16 kDa의 분자량을 가지며, 완전한 인간 서열로부터 유래되는 경우, 예컨대, 인간에서의 치료 용도를 위해 인간화가 필요없다.
또한 포유동물 기원이 아니기 때문에 본 발명의 맥락에서 덜 바람직하긴 하지만, 단일 가변 도메인은 특정 종의 상어로부터 유래될 수 있음에 유의해야 한다(예를 들어, 이른바 "IgNAR 도메인", 예를 들어 WO 제05/18629호 참고).
따라서, 본 발명의 의미에서, 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인" 또는 "단일 가변 도메인"은 비인간 공급원, 바람직하게는 낙타과, 바람직하게는 낙타과 중쇄 항체로부터 유래된 폴리펩타이드를 포함한다. 이들은 이전에 기재된 바와 같이 인간화될 수 있다. 더욱이, 상기 용어는 예컨대, 문헌[Davies and Riechmann(FEBS 339: 285-290, 1994; Biotechnol. 13: 475-479, 1995; Prot. Eng. 9: 531-537, 1996) 및 Riechmann and Muyldermans(J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)]에 기재된 바와 같이, "낙타화된" 비낙타과 공급원, 예컨대, 마우스 또는 인간으로부터 유래된 폴리펩타이드를 포함한다.
VHH 도메인의 아미노산 잔기는 예컨대, 문헌[Riechmann and Muyldermans(J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)]의 도 2에 나타난 바와 같이, 낙타과로부터의 VHH 도메인에 적용된 바와 같이, 카바트 등("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)에 의해 주어진 VH 도메인에 대한 일반 넘버링에 따라 번호가 매겨진다. 또한 VHH 도메인과 유사한 방식으로 적용될 수 있는 VH 도메인의 아미노산 잔기를 넘버링하기 위한 대안적인 방법이 당업계에 공지되어 있다. 그러나, 본 명세서, 청구범위 및 도면에서, 달리 나타내지 않는 한 상기 기재된 바와 같이 VHH 도메인에 적용된 카바트에 따른 넘버링이 뒤따를 것이다.
VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당업계에 공지된 바와 같이, 각각의 CDR 내의 아미노산 잔기의 총 수는 달라질 수 있고 카바트 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기의 총 수에 상응하지 않을 수 있음에 유의해야 한다(즉, 카바트 넘버링에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열에서 점유되지 않을 수 있거나, 실제 서열은 카바트 넘버링에 의해 허용된 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있음). 이것은, 일반적으로, 카바트에 따른 넘버링이 실제 서열에서 아미노산 잔기의 실제 넘버링에 해당하거나 해당하지 않을 수 있음을 의미한다. VH 도메인 및 VHH 도메인에서의 아미노산 잔기의 총 수는 일반적으로 110 내지 120, 종종 112 내지 115의 범위일 것이다. 그러나 더 적거나 더 긴 서열이 또한 본원에 기재된 목적에 적합할 수 있음에 유의해야 한다.
CDR 영역의 결정은 또한 상이한 방법에 따라 수행될 수 있다. 카바트에 따른 CDR 결정에서, VHH의 FR1은 위치 1-30에 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 CDR1은 위치 31-35에 아미노산 잔기를 포함하며, VHH의 FR2는 위치 36-49에 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 CDR2는 위치 50-65에 아미노산 잔기를 포함하며, VHH의 FR3은 위치 66-94에 아미노산 잔기를 포함하고, VHH의 CDR3은 위치 95-102에 아미노산 잔기를 포함하며, VHH의 FR4는 위치 103-113에 아미노산 잔기를 포함한다.
그러나, 본 출원에서, CDR 서열은 문헌[Kontermann 및 Dubel(Eds., Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51, 2010)]에 따라 결정되었다. 이 방법에 따르면, FR1은 위치 1-25에 아미노산 잔기를 포함하고, CDR1은 위치 26-35에 아미노산 잔기를 포함하며, FR2는 위치 36-49에 아미노산을 포함하고, CDR2는 위치 50-58에 아미노산 잔기를 포함하며, FR3은 위치 59-94에 아미노산을 포함하고, CDR3은 위치 95-102에 아미노산 잔기를 포함하며, FR4는 위치 103-113에 아미노산 잔기를 포함한다(카바트 넘버링에 따름).
도메인 항체 및 나노바디(VHH 도메인 포함)과 같은 ISV는 인간화될 수 있다. 특히, 인간화된 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디(VHH 도메인 포함)는 일반적으로 이전 단락에서 정의된 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있지만, 인간화 치환(본원에 정의된 바와 같음)이고/거나 이에 상응하는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 존재한다(및 특히, 적어도 하나의 프레임워크 잔기). 잠재적으로 유용한 인간화 치환은 자연 발생 VHH 서열의 프레임워크 영역의 서열을 하나 이상의 밀접하게 관련된 인간 VH 서열의 상응하는 프레임워크 서열과 비교함으로써 확인될 수 있고, 이후 이렇게 결정된 잠재적으로 유용한 하나 이상의 인간화 치환(또는 이의 조합)이 상기 VHH 서열 내로 도입될 수 있고(본원에 추가로 기재된 바와 같이, 자체 공지된 임의의 방식으로), 생성된 인간화된 VHH 서열은 표적에 대한 친화도, 안정성, 발현 용이성 및 수준, 및/또는 다른 원하는 특성에 대해 시험될 수 있다. 이러한 방식으로, 제한된 정도의 시행 착오에 의해, 다른 적합한 인간화 치환(또는 이의 적합한 조합)이 본원의 개시내용에 기초하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 또한, 상기에 기초하여, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 나노바디(VHH 도메인 포함)(의 프레임워크 영역)는 부분적으로 인간화되거나 완전히 인간화될 수 있다.
도메인 항체 및 나노바디(VHH 도메인 및 인간화된 VHH 도메인 포함)와 같은 ISV는 또한 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열에 하나 이상의 변경을 도입함으로써 친화도 성숙될 수 있으며, 이 변경은 각각의 모(parent) 분자와 비교하여, 그의 각각의 항원에 대한 생성된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화도를 개선한다. 본 발명의 친화도 성숙된 면역글로불린 단일 가변 도메인 분자는, 예를 들어, 문헌[Marks 등(Biotechnology 10:779-783, 1992), Barbas 등(Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994), Shier 등(Gene 169: 147-155, 1995), Yelton 등(Immunol. 155: 1994-2004, 1995), Jackson 등(J. Immunol. 154: 3310-9, 1995), Hawkins 등(J. MoI. Biol. 226: 889 896, 1992), Johnson and Hawkins (Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996)]에 의해 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
도메인 항체 또는 나노바디와 같은 ISV로부터 출발하여 폴리펩타이드를 설계/선택 및/또는 제조하는 과정은 상기 ISV를 "포맷"하는 것으로도 지칭되며; 폴리펩타이드의 일부로 제조된 ISV는 "포맷된" 것이라 하거나 상기 폴리펩타이드의 "포맷"이라고 한다. ISV가 포맷될 수 있는 방식의 예 및 이러한 포맷의 예는 본원의 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백할 것이며; 이러한 포맷된 ISV는 본 발명의 추가 양태를 형성한다.
예를 들어, 및 비제한적으로, 하나 이상의 ISV는 폴리펩타이드의 제조를 위한 "결합 단위", "결합 도메인" 또는 "빌딩 블록"(이들 용어는 상호교환적으로 사용됨)으로서 사용될 수 있고, 이는 선택적으로 결합 단위(즉, 아그레칸 상의 동일한 또는 또 다른 에피토프에 대한 및/또는 아그레칸 이외의 하나 이상의 다른 항원, 단백질 또는 표적에 대한)로서 작용할 수 있는 하나 이상의 추가 ISV를 함유할 수 있다.
본 발명은 아그레칸에 대해 특이성을 갖고/거나 아그레칸에 결합하는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV(본원에서 "본 발명의 ISV"로도 지칭됨) 및/또는 폴리펩타이드(본원에서 "본 발명의 폴리펩타이드"로도 지칭됨)를 제공한다.
아그레칸은 아그레칸 1, ACAN, AGC1, AGCAN, CSPGCP, MSK16, SEDK, 연골-특이적 프로테오글리칸 코어 단백질(CSPCP) 또는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 1(CSPG1)로도 알려져 있다. 아그레칸은 인간에서 염색체 Chr 15: q26.1에 위치한 ACAN 유전자에 의해 코딩된다.
아그레칸은 큰 다중모듈 분자(2317개 아미노산)이다. 그의 코어 단백질은 3개의 구형 도메인(G1, G2 및 G3) 및 다수의 N-연결된 올리고당 및 콘드로이틴 설페이트 사슬 및 케라탄 설페이트 사슬이 부착된 G2 및 G3 사이에 큰 확장 영역(CS)으로 구성된다. 아그레칸은 관절 연골 내의 주요 프로테오글리칸이다. 그것은 히알루로난 및 링크 단백질과 상호작용을 통해 수화된 겔 구조를 제공하여 연골에 하중을 지탱하는 특성을 부여함으로써 관절 연골의 적절한 기능에 중요한 역할을 한다. G1 도메인은 히알루로난산 및 링크 단백질과 상호작용하여, 세포외 매트릭스(ECM)에서 안정한 3원 복합체를 형성한다. G2 도메인은 G1 및 연결 단백질의 탠덤 반복(tandem repeat)에 상동이며, 생성물 가공에 관여한다. G3은 코어 단백질의 카복실 말단을 구성하고, 글리코사미노글리칸 변형 및 생성물 분비를 향상시킨다. 또한, G3 도메인은 프로테오글리칸 응집체를 ECM 단백질(피불린(fibulin) 및 테나신(tenascin))에 연결시킨다. 아그레칸의 분해는 C-말단에서 시작하는 것으로 보인다. G3 도메인이 없는 아그레칸 분자의 집단은 노화에 따라 증가한다. 아그레칸은 라미닌, 피브로넥틴, 테나신, 및 콜라겐과 상호작용하지만, 그것은 또한 다양한 ADAMTS(A Disintegrin And Metalloprotease with Thrombo-spondin Motifs), 예컨대 ADAMTS4, ADAMTS5 및 ADAMTS11 및 매트릭스 메탈로-프로테이나제(MMP), 예컨대 MMP8, MMP13, MMP19 및 MMP20의 효소 기질이다.
일 양태에서, 본 발명은 아그레칸 결합제, 예컨대 아그레칸에 특이적으로 결합하는 ISV 및 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명의 아그레칸 결합제는 결국 인간에서 약제로서 사용하도록 의도된다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 아그레칸 결합제, 예컨대 인간 아그레칸(서열번호: 125)에 특이적으로 결합하는 ISV 및 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명자들은 매우 개선된 종간 교차 반응성 및 정교한 선택성 특성을 갖는 아그레칸 결합제를 확인하였다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 아그레칸 결합제는 인간 아그레칸(P16112; 서열번호: 125), 개 아그레칸(Q28343; 서열번호: 126), 소 아그레칸(P13608; 서열번호: 127), 랫트 아그레칸(P07897; 서열번호: 128); 돼지 아그레칸(코어; Q29011, 서열번호: 129); 마우스 아그레칸(Q61282; 서열번호: 130), 토끼 아그레칸(G1U677-1; 서열번호: 131); 시노몰구스 아그레칸(XP_005560513.1; 서열번호: 132) 및/또는 레서스 아그레칸(XP_002804990.1; 서열번호: 133)(표 B 참고)에 특이적으로 결합한다.
본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드가 선행 기술 분자에 비해 유리한 특징을 갖고; 이들이 관절에서 안정적이며, 이들이 연골에서 연장된 기간 동안 보유되고 이들이 연골 조직에 특이적이며, 예컨대, 뉴로칸(O14594, 서열번호: 134) 및/또는 브레비칸(Q96GW7, 서열번호: 135)(표 B 참고)에 실질적으로 결합하지 않는다는 것을 발견하였다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 아그레칸 결합제는 뉴로칸(O14594, 서열번호: 134) 및/또는 브레비칸(Q96GW7, 서열번호: 135)에 실질적으로 결합하지 않고, 바람직하게는 상기 아그레칸은 10-5 몰/리터 초과, 예컨대 10-4 몰/리터의 KD 값으로 뉴로칸 및/또는 브레비칸에 결합한다.
일 양태에서, 본 발명은 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV에 관한 것으로서, 상기 아그레칸 결합제는 아그레칸에의 결합에 대해 뉴로칸 및/또는 브레비칸보다 10배 초과, 100배 초과, 바람직하게는 1000배 초과의 선택성을 갖는다.
본 발명의 바람직한 아그레칸 결합제는 면역글로불린(예컨대, 중쇄 항체, 종래의 4-사슬 항체(예컨대, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자), Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 예컨대 디설파이드 연결된 Fv 또는 scFv 단편, 또는 이러한 종래의 4-사슬 항체로부터 유래된 디아바디, 이의 개별 사슬뿐만 아니라 이의 모든 부분, 도메인 또는 단편(비제한적으로 항원 결합 도메인 또는 단편, 예컨대 면역글로불린 단일 가변 도메인 포함), 본 발명의 1가 폴리펩타이드, 또는 다른 결합제)을 포함한다.
본 발명의 아그레칸 결합제는 하나의 예외만을 가지고, 8을 초과하는 pI를 가진 것으로 관찰되었다(표 2.2 참고). 이론에 구속되지 않고, 본 발명자들은 아그레칸의 높은 양전하가, 즉 다중특이적 폴리펩타이드에서와 같은 또 다른 빌딩 블록에 결합될 때에도, 전체 모이어티의 보유 및 연골 침투에 영향을 미칠 수 있다고 가정하였다. 따라서, 본 발명은 8 초과, 예컨대 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0 또는 그 초과, 예컨대 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8 또는 심지어 9.8의 pI를 갖는, 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV, 폴리펩타이드 또는 구조체, 바람직하게는 본 발명의 ISV에 관한 것이다.
아그레칸에 대한 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드의 결합은 당업계에 일반적으로 알려진 다양한 결합 분석에서 측정될 수 있다. 전형적인 분석은 (비제한적으로) 형광 리간드 결합 분석, 형광 활성화 세포 분류(FACS), 방사선리간드 결합 분석, 표면 플라스몬 공명(SPR), 플라스몬-도파관 공명(PWR), 친화도 기반 바이오센서의 SPR 이미징, 위스퍼링 갤러리 마이크로공진기(Whispering gallery microresonator(WGM)), 공진 도파관 격자(Resonant waveguide grating(RWG)), 생물층 간섭계 바이오센서(BIB) 분석, 핵 자기 공명(NMR), X-선 결정학, 열 변성 분석(TDA), 등온 적정 열량측정(ITC), ELISA 및 전체 세포 리간드 결합 분석, 예컨대 표면 음향파(SAW) 바이오센서 및 RWG 바이오센서 분석을 포함한다. 아그레칸에 대한 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드의 결합을 측정하는 바람직한 분석은 SPR, 예컨대, 아그레칸에 대한 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드의 결합이 결정된 실시예에 기재된 바와 같은 SPR이다. 아그레칸에 대한 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드의 결합에 대한 일부 바람직한 KD 값은 본원의 추가 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이다. 또 다른 특히 바람직한 분석은 실시예(실시예 1.2 및 2.4 참고)에 상세히 설명된 ELISA이다.
아그레칸에 대한 본 발명의 아그레칸 결합제의 결합은 또한 바람직하게는 아그레칸 표적의 입체형태를 보존하는 결합 분석에서 측정될 수 있다. 전형적인 분석은 (비제한적으로) 아그레칸이 세포 표면(예컨대, CHO 세포) 상에 노출되는 분석을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 바람직하게는 표면 플라스몬 공명에 측정할 때, 적어도 약 102 M-1s-1, 적어도 약 103 M-1s-1, 적어도 약 104 M-1s-1, 적어도 약 105 M-1s-1, 적어도 약 106 M-1s-1, 107 M-1s-1, 적어도 약 108 M-1s-1, 적어도 약 109 M-1s-1, 및 적어도 약 1010 M-1s-1로 이루어진 군으로부터 선택된 상기 아그레칸에의 결합에 대한 온 속도 상수(Kon)를 갖는다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 바람직하게는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정할 때, 최대 약 10-3 s-1, 최대 약 10-4 s-1, 최대 약 10-5 s-1, 최대 약 10-6 s-1, 최대 약 10-7 s-1, 최대 약 10-8 s-1, 최대 약 10-9 s-1, 및 최대 약 10-10 s-1로 이루어진 군으로부터 선택된 상기 아그레칸에의 결합에 대한 오프 속도 상수(koff)를 갖는다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 100 nM 내지 10 pM의 평균 KD 값으로, 예컨대 90 nM 이하의 평균 KD 값으로, 더욱 더 바람직하게는 80 nM 미만, 예컨대 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM 또는 심지어 그 미만, 예컨대 4, 3, 2, 또는 1 nM 미만, 예컨대 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 pM 미만, 또는 심지어 그 미만, 예컨대 10 pM 미만의 평균 KD 값으로 상기 아그레칸에 결합한다. 바람직하게는, KD는, 예를 들어 프로테온(Proteon)에 의해 결정된 바와 같이, SPR에 의해 결정된다.
아그레칸에 대한 본 발명의 면역글로불린 및/또는 폴리펩타이드의 결합에 대한 일부 바람직한 EC50 값은 본원의 추가 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이다.
ELISA 결합 분석에서, 바람직하게는 G1 도메인 및/또는 G1-IGD-G2 도메인에 결합하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 10-9 M 이하, 또는 심지어 10-10 M 이하의 인간 아그레칸 결합에서의 EC50 값을 가질 수 있다. 예를 들어, 이러한 ELISA 결합 분석에서, 본 발명의 면역글로불린 및/또는 폴리펩타이드는 10-10 M 내지 10-8 M, 예컨대 10-9 M 내지 10-8 M 또는 10-10 M 내지 10-9 M의 인간 아그레칸 결합에서의 EC50 값을 가질 수 있다.
이러한 ELISA 결합 분석에서, 바람직하게는 G1 도메인 및/또는 G1-IGD-G2 도메인에 결합하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 10-7 M 이하, 바람직하게는 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 10-9 M 이하, 또는 심지어 10-10 M 이하의 시노몰구스(cyno) 아그레칸 결합에서의 EC50 값을 가질 수 있다. 예를 들어, 이러한 ELISA 결합 분석에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 10-10 M 내지 10-7 M, 예컨대 10-10 M 내지 10-8 M, 10-10 M 내지 10-9 M의 시노 아그레칸 결합에서의 EC50 값을 가질 수 있다.
이러한 ELISA 결합 분석에서, 바람직하게는 G1 도메인 및/또는 G1-IGD-G2 도메인에 결합하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 10-6 M 이하, 바람직하게는 10-7 M 이하, 바람직하게는 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 10-9 M 이하, 또는 심지어 10-10 M 이하의 랫트 아그레칸 결합에서의 EC50 값을 가질 수 있다. 예를 들어, 이러한 ELISA 결합 분석에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 10-10 M 내지 10-6 M, 예컨대 10-10 M 내지 10-7 M, 10-10 M 내지 10-8 M, 10-10 M 내지 10-9 M의 랫트 아그레칸 결합에서의 EC50 값을 가질 수 있다.
이러한 ELISA 결합 분석에서, 바람직하게는 G1 도메인 및/또는 G1-IGD-G2 도메인에 결합하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 10-6 M 이하, 바람직하게는 10-7 M 이하, 바람직하게는 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 10-9 M 이하, 또는 심지어 10-10 M 이하의 개 아그레칸 결합에서의 EC50 값을 가질 수 있다. 예를 들어, 이러한 ELISA 결합 분석에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 10-10 M 내지 10-6 M, 예컨대 10-10 M 내지 10-7 M, 10-10 M 내지 10-8 M, 10-10 M 내지 10-9 M의 개 아그레칸 결합에서의 EC50 값을 가질 수 있다.
이러한 ELISA 결합 분석에서, 바람직하게는 G1 도메인 및/또는 G1-IGD-G2 도메인에 결합하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 10-6 M 이하, 바람직하게는 10-7 M 이하, 바람직하게는 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 10-9 M 이하, 또는 심지어 10-10 M 이하의 소 아그레칸 결합에서의 EC50 값을 가질 수 있다. 예를 들어, 이러한 ELISA 결합 분석에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 10-10 M 내지 10-6 M, 예컨대 10-10 M 내지 10-7 M, 10-10 M 내지 10-8 M, 10-10 M 내지 10-9 M의 소 아그레칸 결합에서의 EC50 값을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "연골 조직(cartilaginous tissue)"은 탄성 연골(elastic cartilage), 유리질 연골(hyaline cartilage) 및 섬유연골(fibrocartilage)을 포함하는 연골을 지칭하며, 이는 세포(연골세포) 대 세포내 공간의 비율 및 콜라겐 및 프로테오글리칸의 상대적 양에 의해 정의된다. "관절 연골(articular cartilage)"은 뼈의 관절 표면 상에서 발견되는 연골이며, 주로 유리질 연골이다. 반월상 연골(Meniscus)은 전적으로 섬유연골로 만들어진다. 아그레칸은 세포외 매트릭스(ECM) 내의 주요 프로테오글리칸이며, 총 단백질 함량의 약 50%를 차지한다(다른 약 50%는 콜라겐 II 및 일부 작은 단백질, 예컨대, 콜라겐 IX임).
본 발명의 아그레칸 결합제는 활막, 힘줄, 및/또는 근외막(epimysium)과 같은 비연골 조직보다 연골 및 반월상 연골과 같은 관절 내의 연골 조직에의 결합에 대해 선호도를 입증하였다. 따라서, 본 발명은 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 아그레칸 결합제는 비연골 조직과 비교하여 바람직하게는 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배 이상, 바람직하게는 연골 및/또는 반월상 연골과 같은 연골 조직에 결합한다.
관절은 둘 이상의 뼈가 만나는 영역인 것으로 이해된다. 대부분의 관절은 움직여, 뼈를 움직이게 한다. 관절은 하기로 구성된다: 연골, 활막, 인대, 힘줄, 점액낭(bursa) 및 활액. 일부 관절은 또한 반월상 연골을 갖는다.
실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 아그레칸 결합제는 다양한 연골 보유 특징을 가지며, 이는 특정 요구에 따라 관절에서의 보유를 맞출 수 있다(실시예 2.2 참고). 바람직하게는, 아그레칸 결합제는, 관절내 주사시 예상될 수 있는 아그레칸 결합제의 연골에의 상대적으로 짧은 노출 후, 연장된 기간 동안 연골에서 보유되는 능력을 갖는다. 연골 보유는 실시예 섹션에 제시된 바와 같이 생체외 연골 보유 분석을 통해 측정될 수 있다. 보유 정도는 웨스턴 블롯의 육안 검사에 의해 또는 농도계 정량을 통해 측정될 수 있다. 보유 정도를 결정하는 데 사용되는 척도는 당업자에 의해 정의될 수 있고, 예를 들어 0 내지 6 RU(보유 단위)의 척도이며, 이 분석에서 0은 보유 안됨이고, 6은 완전 보유이다. 필요한 경우, 척도는 본 발명의 아그레칸 결합제를 사용하여 정량화될 수 있고, 각각의 아그레칸 결합제에게 스코어가 할당되고, 예컨대, 완전 보유 및 보유 안됨은 고정된다. 대안적으로, 척도는 다양한 중간 스코어에 의해 설정될 수 있으며, 이는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대, 2개의 114F08 = 6 RU 및 더미(dummy) 아그레칸 결합제, 예컨대, ALB26-ALB26 = 0 RU를 포함하는 아그레칸 결합제; 또는 2개의 114F08 = 6을 포함하는 아그레칸 결합제; 608A05 = 5를 포함하는 아그레칸 결합제; 아그레칸 결합제 604G01 = 4; 2개의 601D02 = 3을 포함하는 아그레칸 결합제; 2개의 606A07 = 2를 포함하는 아그레칸 결합제; 아그레칸 결합제 112A01 = 1; 및 더미 아그레칸 결합제, 예컨대, ALB26-ALB26 = 0을 통해 할당된다(표 2.2 참고). 따라서, 본 발명은 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명에 따른 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 아그레칸 결합제는 연골 보유 분석에서 적어도 2, 예컨대 적어도 3, 4, 5 또는 6 RU의 연골 보유를 갖는다.
본 발명의 아그레칸 결합제는 바람직하게는 안정해야 한다. 첫 번째 전제조건으로서, 아그레칸 결합제의 생물물리학적 특성을 실시예 3에 상세히 설명된 바와 같이 시험하였고, 이들 아그레칸 결합제는 높은 용융 온도 및 응집 및 다량체화의 징후의 부재에 의해 나타난 바와 같은 유리한 안정성 특징을 나타내었음이 입증되었다. 다음으로, 아그레칸 결합제를 37℃에서 활액에서 배양하여 연장된 기간 동안 관절에서의 이들의 활성에 대해 시험하였다(실시예 6 참고). 임의의 구조체의 분해가 검출되지 않았고, 이는 구조체가 생체내 환경을 모방하는 환경 하에서 안정적이었음을 나타낸다.
일 양태에서, 본 발명은 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV에 관한 것으로서, 상기 아그레칸 결합제는 37℃에서 활액(SF)에서 적어도 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 예컨대 14일, 21일, 1개월, 2개월 또는 심지어 3개월의 안정성을 갖는다.
본 발명은 특히 아그레칸에 결합하는 데 적합한 아미노산 잔기(서열번호: 20-37 및 109, 서열번호: 38-55 및 110, 및 서열번호: 56-74 및 111; 표 A-2)의 스트레치(stretch)를 제공한다. 특히, 본 발명은 인간 아그레칸에 결합하는 아미노산 잔기의 스트레치를 제공하며, 상기 스트레치가 상기 아그레칸에 결합하는 것은 (상기 기재된 바와 같이) 연골 조직에서의 존재를 유지한다. 이러한 아미노산 잔기의 스트레치는, 특히 이들이 본 발명의 폴리펩타이드의 항원 결합 부위(의 부분)를 형성하는 방식으로, 본 발명의 구조체 또는 폴리펩타이드에 존재하고/거나 본 발명의 구조체 또는 폴리펩타이드 내로 통합될 수 있다. 이러한 아미노산 잔기의 스트레치는 아그레칸에 대해 발생한 중쇄 항체 또는 VHH 서열의 CDR 서열로서 생성되었다. 이러한 아미노산 잔기의 스트레치는 본원에서 "본 발명의 CDR 서열(들)"(각각 "본 발명의 CDR1 서열(들)", " 본 발명의 CDR2 서열(들)" 및 "본 발명의 CDR3 서열(들)")로도 지칭된다.
그러나 가장 넓은 의미에서 본 발명은, 이들 아미노산 잔기의 스트레치가 본 발명의 폴리펩타이드를 원하는 친화도 및 효능으로 아그레칸에 결합하게 하는 한, 이들 아미노산 잔기의 스트레치가 본 발명의 펩타이드에서 가질 수 있는 특정 구조적 역할 또는 기능에 제한되지 않는다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 일반적으로, 가장 넓은 의미에서 본 발명은 특정한 명시된 친화도, 결합활성, 효력 및/또는 효능으로 아그레칸에 결합할 수 있고, 전체 폴리펩타이드가 아그레칸에 결합할 수 있는 결합 도메인 및/또는 결합 단위를 형성하도록, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR 서열 및, 특히 하나 이상의 추가의 아미노산 서열을 통해 서로 적합하게 연결된 둘 이상의 이러한 CDR 서열의 적합한 조합을 포함하는 폴리펩타이드(본원에서 "본 발명의 폴리펩타이드(들)"로도 지칭됨)를 제공한다. 그러나 또한 본 발명의 폴리펩타이드 내의 이러한 오직 하나의 CDR 서열의 존재가 그 자체로 이미 본 발명의 폴리펩타이드에게 아그레칸에 대한 결합 능력을 제공하는 데 충분할 수 있다는 것에 유의해야 하며; 예를 들어 WO 제03/050531호에 기재된 이른바 "신속한 단편(Expedite fragments)"을 참조한다.
구체적이지만 비제한적인 양태에서, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 적어도 하나의 스트레치로 본질적으로 구성되거나 이를 포함할 수 있다:
i) CDR1 서열:
a) 서열번호: 24, 32, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37 및 109; 및
b) 서열번호: 24의 아미노산 서열과 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열;
및/또는
ii) CDR2 서열:
c) 서열번호: 42, 50, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55 및 110; 및
d) 서열번호: 42의 아미노산 서열과 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열;
및/또는
iii) CDR3 서열:
e) 서열번호: 60, 68, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 74 및 111; 및
f) 서열번호: 60의 아미노산 서열과 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열,
바람직하게는, 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
추가의 양태에서, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 ISV는 서열번호: 20-74 및 109-111로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 적어도 하나의 스트레치를 포함할 수 있다.
특히, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 ISV는 하나의 항원 결합 부위를 포함하는 아그레칸 결합제일 수 있으며, 상기 항원 결합 부위는 상기 기재된 바와 같은 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열(또는 이의 임의의 적합한 조합)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 적어도 하나의 스트레치를 포함한다. 그러나, 바람직한 양태에서, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 ISV는 본 발명의 CDR1 서열, 본 발명의 CDR2 서열 및/또는 본 발명의 CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 1개 초과, 예컨대 둘 이상의 스트레치를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 ISV는 각각 본 발명의 CDR1 서열, 본 발명의 CDR2 서열 및 본 발명의 CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 3개의 스트레치를 포함한다. 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 ISV에 바람직한 것으로 본원에 언급된 CDR의 조합은 표 A-2에 열거되어 있으며, 즉 바람직하게는 CDR 조합은 상기 표에서 단일 행에 나타나 있다.
상기 기재된 CDR을 갖는 본 발명의 대표적인 폴리펩타이드가 표 A-1(서열번호: 1-19 및 114-118)에 나타나 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
- CDR1은 서열번호: 24, 32, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37 및 109로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- CDR2는 서열번호: 42, 50, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55 및 110으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
- CDR3은 서열번호: 60, 68, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 74 및 111로 이루어진 군으로부터 선택되고,
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
- CDR1은 서열번호: 24이고, CDR2는 서열번호: 42이며, CDR3은 서열번호: 60이거나;
- CDR1은 서열번호: 32이고, CDR2는 서열번호: 50이며, CDR3은 서열번호: 68 이거나;
- CDR1은 서열번호: 20이고, CDR2는 서열번호: 38이며, CDR3은 서열번호: 56 이거나;
- CDR1은 서열번호: 21이고, CDR2는 서열번호: 39이며, CDR3은 서열번호: 57 이거나;
- CDR1은 서열번호: 22이고, CDR2는 서열번호: 40이며, CDR3은 서열번호: 58 이거나;
- CDR1은 서열번호: 23이고, CDR2는 서열번호: 41이며, CDR3은 서열번호: 59 이거나;
- CDR1은 서열번호: 25이고, CDR2는 서열번호: 43이며, CDR3은 서열번호: 61 이거나;
- CDR1은 서열번호: 26이고, CDR2는 서열번호: 44이며, CDR3은 서열번호: 62 이거나;
- CDR1은 서열번호: 27이고, CDR2는 서열번호: 45이며, CDR3은 서열번호: 63 이거나;
- CDR1은 서열번호: 28이고, CDR2는 서열번호: 46이며, CDR3은 서열번호: 64 이거나;
- CDR1은 서열번호: 29이고, CDR2는 서열번호: 47이며, CDR3은 서열번호: 65 이거나;
- CDR1은 서열번호: 30이고, CDR2는 서열번호: 48이며, CDR3은 서열번호: 66 이거나;
- CDR1은 서열번호: 31이고, CDR2는 서열번호: 49이며, CDR3은 서열번호: 67 이거나;
- CDR1은 서열번호: 32이고, CDR2는 서열번호: 51이며, CDR3은 서열번호: 69 이거나;
- CDR1은 서열번호: 33이고, CDR2는 서열번호: 52이며, CDR3은 서열번호: 70 이거나;
- CDR1은 서열번호: 34이고, CDR2는 서열번호: 50이며, CDR3은 서열번호: 71 이거나;
- CDR1은 서열번호: 35이고, CDR2는 서열번호: 53이며, CDR3은 서열번호: 72 이거나;
- CDR1은 서열번호: 36이고, CDR2는 서열번호: 54이며, CDR3은 서열번호: 73 이거나;
- CDR1은 서열번호: 37이고, CDR2는 서열번호: 55이며, CDR3은 서열번호: 74 이거나;
- CDR1은 서열번호: 109이고, CDR2는 서열번호: 110이며, CDR3은 서열번호: 111이고;
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV에 관한 것으로서, 상기 ISV는 서열번호: 117, 5, 118, 13, 114-116, 1-4, 6-12 및 14-19로 이루어진 군으로부터 선택되었다.
본 발명은 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드(또는 이를 발현하는 데 사용되는 본 발명의 핵산)의 기원뿐만 아니라 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드, 또는 본 발명의 핵산이 생성 또는 수득되는(수득된) 방식에 제한되지 않는다는 것에 추가로 유의해야 한다. 따라서, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 자연 발생 ISV(임의의 적합한 종으로부터의) 또는 합성 또는 반합성 ISV 및/또는 폴리펩타이드일 수 있다.
또한, 비제한적으로 인간 스캐폴드 또는 비면역글로불린 스캐폴드를 포함하는 다른 "스캐폴드" 상에 상기 언급된 CDR 중 하나 이상을 "이식"할 수 있음이 당업자에게 또한 명백할 것이다. 이러한 CDR 이식을 위한 적합한 스캐폴드 및 기술은 당업자에게 명백할 것이고, 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어 US 제7,180,370호, WO 제01/27160호, EP 제0605522호, EP 제0460167호, US 제7,054,297호, Nicaise 등(Protein Science 13: 1882-1891, 2004), Ewert 등(Methods 34: 184-199, 2004), Kettleborough 등(Protein Eng. 4: 773-783, 1991), O'Brien 및 Jones(Methods Mol. Biol. 207: 81-100, 2003), Skerra(J. Mol. Recognit. 13: 167-187, 2000) 및 Saerens 등(J. Mol. Biol. 352: 597-607, 2005) 및 그 안에 언급된 추가의 참고 문헌을 참고한다. 예를 들어, 인간 프레임워크 및 스캐폴드 상에 마우스 또는 랫트 CDR을 이식하기 위한 자체 공지된 기술은 본 발명의 1가 폴리펩타이드에 대해 본원에 정의된 하나 이상의 CDR 서열 및 하나 이상의 인간 프레임워크 영역 또는 서열을 포함하는 키메라 단백질을 제공하기 위해 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 아미노산 서열을 제시하기 위한 적합한 스캐폴드는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 면역글로불린(즉, 본원에 이미 기재된 면역글로불린 서열 이외)에 기반하거나 이로부터 유래된 결합 스캐폴드, 단백질 A 도메인으로부터 유래된 단백질 스캐폴드(예컨대 Affibodies™), 텐다미스타트(tendamistat), 피브로넥틴, 리포칼린(lipocalin), CTLA-4, T-세포 수용체, 디자인된 안키린 반복(designed ankyrin repeat), 아비머(avimer) 및 PDZ 도메인(Binz et al. Nat Biotech 23:1257, 2005), 및 비제한적으로 DNA 또는 RNA 앱타머를 포함하는 DNA 또는 RNA에 기반한 결합 모이어티(Ulrich et al. Com Chem High Throughput Screen 9:619-32, 2006)를 포함한다.
본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드에서, CDR은 추가 아미노산 서열에 연결될 수 있고/거나 아미노산 서열을 통해 서로 연결될 수 있고, 여기서 상기 아미노산 서열은 바람직하게는 프레임워크 서열이거나 프레임워크 서열로서 작용하거나 CDR을 제시하기 위해 함께 스캐폴드를 형성하는 아미노산 서열이다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 적어도 2개의 프레임워크 서열에 연결된 적어도 3개의 CDR 서열을 포함하며, 바람직하게는 3개의 CDR 서열 중 적어도 하나는 CDR3 서열이고, 다른 2개의 CDR 서열은 CDR1 또는 CDR2 서열이며, 바람직하게는 하나의 CDR1 서열 및 하나의 CDR2 서열이다. 하나의 구체적으로 바람직하지만 비제한적인 구현예에 따르면, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 가지며, CDR1, CDR2 및 CDR3은 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 대해 본원에 정의된 바와 같고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다. 이러한 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드에서, 프레임워크 서열은 임의의 적합한 프레임워크 서열일 수 있고, 적합한 프레임워크 서열의 예는, 예를 들어 표준 핸드북 및 본원의 추가 개시내용 및 본원에 언급된 선행 기술에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다.
따라서, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는, 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하고,
(i) CDR1은
(a) 서열번호: 24, 32, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37 및 109; 및
(b) 서열번호: 24의 아미노산 서열 또는 서열번호: 20-23, 25-37 및 109 중 어느 것과 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
(ii) CDR2는
(c) 서열번호: 42, 50, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53, 54, 55 및 110; 및
(d) 서열번호: 42의 아미노산 서열 또는 서열번호: 38-41, 43-55 및 110 중 어느 것과 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
(iii) CDR3은
(e) 서열번호: 60, 68, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 74 및 111; 및
(f) 서열번호: 60의 아미노산 서열 또는 서열번호: 56-59, 61-74 및 111 중 어느 것과 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고,
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
본 발명의 아그레칸 결합제는 아그레칸의 G1-영역, G1-IGD-G2 영역 또는 G2 영역에 대해 맵핑될 수 있다.
따라서, 본 발명은 아그레칸의 G2 도메인에 결합하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 실시예에 제시된 바와 같이, 이러한 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 다양한 바람직한 특징을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 8 초과의 pI를 갖고/거나 2 * 10-2 s-1 미만의 koff를 갖고/거나 1 * 10-6 M 미만의 EC50을 갖는다.
본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드의 CDR의 비교는 아그레칸의 G2 도메인에 대한 결합을 유지하면서 CDR에서 많은 허용 가능한 아미노 변화를 밝혀내었다. 참조로 사용된 601D02의 CDR에 대한 모든 클론의 CDR의 서열 가변성은 표 1.5A, 1.5B 및 1.5C에 도시되어 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
i) CDR1은
a) 서열번호: 28, 22, 26, 및 33; 및
b) 서열번호: 28의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서; 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 1에서 G는 R로 변경되었고;
- 위치 2에서 P는 S 또는 R로 변경되었고;
- 위치 3에서 T는 I로 변경되었고;
- 위치 5에서 S는 N으로 변경되었고;
- 위치 6에서 R은 N, M, 또는 S로 변경되었고;
- 위치 7에서 Y는 R로 변경되었거나 부재이고;
- 위치 8에서 A는 F로 변경되었거나 부재이고; 및/또는
- 위치 10에서 G는 Y로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는
ii) CDR2는
c) 서열번호: 46, 40, 44, 및 52; 및
d) 서열번호: 46의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서; 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 1에서 A는 S, 또는 Y로 변경되었고;
- 위치 4에서 W는 L로 변경되었고;
- 위치 5에서 S는 N으로 변경되었고;
- 위치 6에서 S는 부재이고;
- 위치 7에서 G는 부재이고;
- 위치 8에서 G는 A로 변경되었고;
- 위치 9에서 R은 S, D, 또는 T로 변경되었고; 및/또는
- 위치 11에서 Y는 N 또는 R로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는
iii) CDR3은
e) 서열번호: 64, 58, 62, 및 70; 및
f) 서열번호: 64의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서; 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 1에서 A는 R, 또는 F로 변경되었고;
- 위치 2에서 R은 I, 또는 L로 변경되었고;
- 위치 3에서 I는 H, 또는 Q로 변경되었고;
- 위치 4에서 P는 G, 또는 N으로 변경되었고;
- 위치 5에서 V는 S로 변경되었고;
- 위치 6에서 R은 G, N, 또는 F로 변경되었고;
- 위치 7에서 T는 R, W, 또는 Y로 변경되었고;
- 위치 8에서 Y는 R 또는 S로 변경되었거나 부재이고;
- 위치 9에서 T는 S로 변경되었거나 부재이고;
- 위치 10에서 S는 E, K로 변경되었거나 부재이고;
- 위치 11에서 E는 N, A로 변경되었거나 부재이고;
- 위치 12에서 W는 D로 변경되었거나 부재이고;
- 위치 13에서 N은 D로 변경되었거나 부재이고;
- 위치 14에서 Y는 부재이고; 및/또는
- D 및 N은 서열번호: 64의 위치 14 뒤에 부가되는 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
일 양태에서, 본 발명은
- CDR1은 서열번호: 28, 22, 26, 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- CDR2는 서열번호: 46, 40, 44, 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되며;
- CDR3은 서열번호: 64, 58, 62, 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 아그레칸 결합제의 군으로부터 선택된 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
일 양태에서, 본 발명은
- CDR1은 서열번호: 28이고, CDR2는 서열번호: 46이며, CDR3은 서열번호: 64이고;
- CDR1은 서열번호: 22이고, CDR2는 서열번호: 40이며, CDR3은 서열번호: 58이고;
- CDR1은 서열번호: 26이고, CDR2는 서열번호: 44이며, CDR3은 서열번호: 62이고;
- CDR1은 서열번호: 33이고, CDR2는 서열번호: 52이며, CDR3은 서열번호: 70인 아그레칸 결합제의 군으로부터 선택된 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호: 9, 3, 7 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아그레칸 결합제, 및 서열번호: 9, 3, 7 및 15 중 어느 것과 80% 초과, 예컨대 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 아그레칸 결합제의 군으로부터 선택된 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열이 아그레칸의 G2 도메인에 결합하는 것을 교차 차단하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 아그레칸의 G2-도메인에 결합하고, 바람직하게는 서열번호: 9, 3, 7 및 15 중 어느 하나에 의해 표시되는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드와 아그레칸의 G2 도메인에의 결합에 대해 경쟁하는, 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열에 관한 것이다.
본 발명은 또한 아그레칸의 G1-IGD-G2 도메인에 결합하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 실시예에 제시된 바와 같이, 이러한 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 다양한 바람직한 특징을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 8 초과의 pI를 갖고/거나 2 * 10-2 s-1 미만의 koff를 갖고/거나 1 * 10-6 M 미만의 EC50을 갖는다
본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드의 CDR의 비교는 아그레칸의 G1-IGD-G2 도메인에 대한 결합을 유지하면서 CDR에서 많은 허용 가능한 아미노 변화를 밝혀내었다. 참조로 사용된 604F02의 CDR에 대한 모든 클론의 CDR의 서열 가변성은 표 1.4A, 1.4B 및 1.4C에 도시되어 있다.
일 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
i) CDR1은
a) 서열번호: 32, 30 및 23; 및
b) 서열번호: 32의 아미노산 서열과 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 2에서 R은 L로 변경되었고;
- 위치 6에서 S는 T로 변경되었고; 및/또는
- 위치 8에서 T는 A로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는
ii) CDR2는
c) 서열번호: 50, 41, 48 및 51; 및
d) 서열번호: 50의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 7에서 G는 S 또는 R로 변경되었고; 및/또는
- 위치 8에서 R은 T로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는
iii) CDR3은
e) 서열번호: 68, 59, 66 및 69; 및
f) 서열번호: 68의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 4에서 R은 V, 또는 P로 변경되었고;
- 위치 6에서 A는 Y로 변경되었고;
- 위치 7에서 S는 T로 변경되었고;
- 위치 8에서 S는 부재이고;
- 위치 9에서 N은 P로 변경되었고;
- 위치 10에서 R은 T 또는 L로 변경되었고;
- 위치 11에서 G는 E로 변경되었고; 및/또는
- 위치 12에서 L은 T 또는 V로 변경된 아미노산 서열
하기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, 여기서 FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
- CDR1은 서열번호: 32, 30 및 23으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- CDR2는 서열번호: 50, 41, 48 및 51로 이루어진 군으로부터 선택되며;
- CDR3은 서열번호: 68, 59, 66 및 69로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
일 양태에서, 본 발명은
- CDR1은 서열번호: 32이고, CDR2는 서열번호: 50이며, CDR3은 서열번호: 68이고;
- CDR1은 서열번호: 32이고, CDR2는 서열번호: 51이며, CDR3은 서열번호: 69이고;
- CDR1은 서열번호: 30이고, CDR2는 서열번호: 48이며, CDR3은 서열번호: 66이고;
- CDR1은 서열번호: 23이고, CDR2는 서열번호: 41이며, CDR3은 서열번호: 59인 아그레칸 결합제의 군으로부터 선택된 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호: 118, 13, 4, 11 및 14를 갖는 아그레칸 결합제, 및 서열번호: 118, 13, 4, 11 및 14 중 어느 하나와 80% 초과, 예컨대 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 아그레칸 결합제로 이루어진 군으로부터 선택된 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열이 아그레칸의 G1-IGD-G2 도메인에 결합하는 것을 교차 차단하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 아그레칸의 G1-IGD-G2 도메인에 결합하고, 바람직하게는 서열번호: 118, 13, 4, 11 및 14 중 어느 하나로 표시되는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드와 아그레칸의 G1-IGD-G2 도메인에의 결합에 대해 경쟁하는, 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열에 관한 것이다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 아그레칸의 G1 도메인에 결합하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 실시예에 제시된 바와 같이, 이러한 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 다양한 바람직한 특징을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 8 초과의 pI를 갖고/거나 2 * 10-2 s-1 미만의 koff를 갖고/거나 1 * 10-6 M 미만의 EC50을 갖는다.
본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드의 CDR의 비교는 아그레칸의 G1 도메인에 대한 결합을 유지하면서 CDR에서 많은 허용 가능한 아미노 변화를 밝혀내었다. 참조로 사용된 114F08의 CDR에 대한 모든 클론의 CDR의 서열 가변성은 표 1.3A, 1.3B 및 1.3C에 도시되어 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
i) CDR1은
a) 서열번호: 24, 20, 21, 25, 27, 29, 31, 34, 35, 36, 및 37; 및
b) 서열번호: 24의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 2에서 S는 R, F, I, 또는 T로 변경되었고;
- 위치 3에서 T는 I로 변경되었고;
- 위치 5에서 I는 S로 변경되었고;
- 위치 6에서 I는 S, T, 또는 M으로 변경되었고;
- 위치 7에서 N은 Y, 또는 R로 변경되었고;
- 위치 8에서 V는 A, Y, T, 또는 G로 변경되었고;
- 위치 9에서 V는 M으로 변경되었고; 및/또는
- 위치 10에서 R은 G, K, 또는 A로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는
ii) CDR2는
c) 서열번호: 42, 38, 39, 43, 45, 47, 49, 50, 53, 54, 및 55; 및
d) 서열번호: 42의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 1에서 T는 A, 또는 G로 변경되었고;
- S 또는 N이 위치 3과 위치 4 사이에 삽입되고(위치 2a, 표 1.3B);
- 위치 3에서 S는 R, W, N, 또는 T로 변경되었고;
- 위치 4에서 S는 T 또는 G로 변경되었고;
- 위치 5에서 G는 S로 변경되었고;
- 위치 6에서 G는 S, 또는 R로 변경되었고;
- 위치 7에서 N은 S, T, 또는 R로 변경되었고;
- 위치 8에서 A는 T로 변경되었고; 및/또는
- 위치 9에서 N은 D 또는 Y로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는
iii) CDR3은
e) 서열번호: 60, 56, 57, 61, 63, 65, 67, 71, 72, 73 및 74; 및
f) 서열번호: 60의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 1에서 P는 G, R, D, 또는 E로 변경되었거나 부재이고;
- 위치 2에서 T는 R, L, P, 또는 V로 변경되었거나 부재이고;
- 위치 3에서 T는 M, S, 또는 R로 변경되었거나 부재이고;
- 위치 4에서 H는 D, Y, G, 또는 T로 변경되었고;
- 위치 5에서 Y는 F, V, T 또는 G로 변경되었고;
- 위치 6에서 G는 L, D, S, Y, 또는 W로 변경되었고;
- R, T, Y 또는 V가 위치 6과 위치 7 사이에 삽입되고(위치 6a, 표 1.3C);
- 위치 7에서 G는 P, 또는 S로 변경되었고;
- 위치 8에서 V는 G, T, H, R, L, 또는 Y로 변경되었고;
- 위치 9에서 Y는 R, A, S, D 또는 G로 변경되었고;
- 위치 10에서 Y는 N, E, G, W, 또는 S로 변경되었고;
- W가 위치 10과 위치 11 사이에 삽입되고(위치 10a, 표 1.3C);
- 위치 11에서 G는 S, K, 또는 Y로 변경되었고;
- 위치 12에서 P는 E, 또는 D로 변경되었거나 부재이고; 및/또는
- 위치 13에서 Y는 L로 변경되었거나 부재인 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
바람직한 양태에서, 본 발명은, CDR1은 서열번호: 24, 20, 21, 25, 27, 29, 31, 34, 35, 36, 37 및 109로 이루어진 군으로부터 선택되고; CDR2는 서열번호: 42, 38, 39, 43, 45, 47, 49, 50, 53, 54, 55, 및 110으로 이루어진 군으로부터 선택되며; CDR3은 서열번호: 60, 56, 57, 61, 63, 65, 67, 71, 72, 73, 74, 및 111로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 아그레칸 결합제의 군으로부터 선택된 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
바람직한 양태에서, 본 발명은
- CDR1은 서열번호: 24이고, CDR2는 서열번호: 42이며, CDR3은 서열번호: 60이고;
- CDR1은 서열번호: 20이고, CDR2는 서열번호: 38이며, CDR3은 서열번호: 56이고;
- CDR1은 서열번호: 21이고, CDR2는 서열번호: 39이며, CDR3은 서열번호: 57이고;
- CDR1은 서열번호: 25이고, CDR2는 서열번호: 43이며, CDR3은 서열번호: 61이고;
- CDR1은 서열번호: 27이고, CDR2는 서열번호: 45이며, CDR3은 서열번호: 63이고;
- CDR1은 서열번호: 29이고, CDR2는 서열번호: 47이며, CDR3은 서열번호: 65이고;
- CDR1은 서열번호: 31이고, CDR2는 서열번호: 49이며, CDR3은 서열번호: 67이고;
- CDR1은 서열번호: 34이고, CDR2는 서열번호: 50이며, CDR3은 서열번호: 71이고;
- CDR1은 서열번호: 35이고, CDR2는 서열번호: 53이며, CDR3은 서열번호: 72이고;
- CDR1은 서열번호: 36이고, CDR2는 서열번호: 54이며, CDR3은 서열번호: 73이고;
- CDR1은 서열번호: 37이고, CDR2는 서열번호: 55이며, CDR3은 서열번호: 74이고;
- CDR1은 서열번호: 109이고, CDR2는 서열번호: 110이며, CDR3은 서열번호: 111인 아그레칸 결합제의 군으로부터 선택된 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
예시적인 클론 114F08이 특히 바람직한 특징을 갖는다는 것이 실시예 섹션에서 입증되었다. 클론 114F08은 클론 114A09(서열번호: 114) 및 114B04(서열번호: 115)를 추가로 포함하는 클론의 패밀리 또는 세트를 나타내며, 이는 기능적 특징의 유사성으로 해석되는 CDR의 유사성에 기초하여 분류되었다(표 A-2 및 표 3.3A, 3.3B, 및 3.3C 참고). 따라서, 또 다른 특히 바람직한 양태에서, 본 발명은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
i) CDR1은
a) 서열번호: 24 및 109; 및
b) 서열번호: 24의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 7에서 N은 S로 변경되었고; 및/또는
- 위치 9에서 V는 M으로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는
ii) CDR2는
c) 서열번호: 42 및 110; 및
d) 서열번호: 42의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 1에서 T는 A로 변경되었고;
- 위치 3에서 S는 R로 변경되었고;
- 위치 4에서 S는 T로 변경되었고;
- 위치 8에서 A는 T로 변경되었고; 및/또는
- 위치 9에서 N은 D로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는
iii) CDR3은
e) 서열번호: 60 및 111; 및
f) 서열번호: 60의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 4에서 H는 R로 변경되었고; 및/또는
- 위치 8에서 V는 D로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
일 양태에서, 본 발명은
- CDR1은 서열번호: 24 및 109로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- CDR2는 서열번호: 42 및 110으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
- CDR3은 서열번호: 60 및 111로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 아그레칸 결합제의 군으로부터 선택된 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
아그레칸의 G1 영역에 결합하고 에피토프 빈 1 또는 에피토프 빈 4에 속하는 아그레칸 결합제가 연골 보유 분석에서 특히 효과적이라는 것이 실시예 섹션에서 추가로 입증되었다. 일 양태에서, 본 발명은 에피토프 빈 1 또는 에피토프 빈 4에 속하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
에피토프 빈 1에 속하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드의 CDR의 비교는 아그레칸의 G1 도메인에 대한 결합을 유지하면서 CDR에서 많은 허용 가능한 아미노 변화를 밝혀내었다. 참조로 사용된 608A05의 CDR에 대한 모든 클론의 CDR의 서열 가변성은 표 2.3D, 2.3E 및 2.3F에 도시되어 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
i) CDR1은
a) 서열번호: 36, 20 및 29; 및
b) 서열번호: 36의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 3에서 T는 S로 변경되었고;
- 위치 6에서 T는 S로 변경되었고;
- 위치 8에서 T는 A로 변경되었고; 및/또는
- 위치 9에서 M은 V로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는
ii) CDR2는
c) 서열번호: 54, 38 및 37; 및
d) 서열번호: 54의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 1에서 A는 I로 변경되었고;
- 위치 4에서 W는 R로 변경되었고;
- 위치 7에서 G는 R로 변경되었고; 및/또는
- 위치 8에서 T는 S로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는
iii) CDR3은
e) 서열번호: 73, 56 및 65; 및
f) 서열번호: 73의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 1에서 R은 G로 변경되었고;
- 위치 2에서 P는 R 또는 L로 변경되었고;
- 위치 3에서 R은 L 또는 S로 변경되었고;
- 위치 5에서 Y는 R로 변경되었고;
- 위치 6에서 Y는 S 또는 A로 변경되었고;
- 위치 7에서 Y는 T로 변경되었거나 부재이고;
- 위치 8에서 S는 P로 변경되었고;
- 위치 9에서 L은 H 또는 R로 변경되었고;
- 위치 10에서 Y는 P 또는 A로 변경되었고;
- 위치 11에서 S는 A 또는 Y로 변경되었고;
- 위치 12에서 Y는 D로 변경되었고;
- 위치 13에서 D는 F로 변경되었고;
- 위치 14에서 Y는 G로 변경되었거나 부재이고; 및/또는
- 위치 14 뒤에 S가 삽입된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
일 양태에서, 본 발명은
- CDR1은 서열번호: 20, 29, 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- CDR2는 서열번호: 38, 47, 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되며;
- CDR3은 서열번호: 56, 65, 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인아그레칸 결합제의 군으로부터 선택된 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
일 양태에서, 본 발명은 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열이 아그레칸의 G1 도메인에 결합하는 것을 교차 차단하는 에피토프 빈 1에 속하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 아그레칸의 G1-도메인의 에피토프 빈 1에 결합하고, 바람직하게는 예컨대, 서열번호: 1, 10 및 18 중 어느 하나로 표시되는, 에피토프 빈 1에 속하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드와 아그레칸의 G1 도메인에의 결합에 대해 경쟁하는, 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열에 관한 것이다.
에피토프 빈 4에 속하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드의 CDR의 비교는 아그레칸의 G1 도메인에 대한 결합을 유지하면서 CDR에서 많은 허용 가능한 아미노 변화를 밝혀내었다. 참조로 사용된 114F08의 CDR에 대한 모든 클론의 CDR의 서열 가변성은 표 2.3A, 2.3B 및 2.3C에 도시되어 있다.
일 양태에서, 본 발명은 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
i) CDR1은
a) 서열번호: 24, 25 및 27; 및
b) 서열번호: 24의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 2에서 S는 I 또는 F로 변경되었고;
- 위치 5에서 I는 S로 변경되었고;
- 위치 6에서 I는 S 또는 M으로 변경되었고;
- 위치 7에서 N은 R 또는 Y로 변경되었고;
- 위치 8에서 V는 A 또는 Y로 변경되었고;
- 위치 9에서 V는 M으로 변경되었고; 및/또는
- 위치 10에서 R은 K로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는
ii) CDR2는
c) 서열번호: 42, 43 및 45; 및
d) 서열번호: 42의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 1에서 T는 A 또는 G로 변경되었고;
- N이 위치 2와 위치 3 사이에 삽입되고(위치 2a 표 2.3B);
- 위치 7에서 N은 R로 변경되었고;
- 위치 8에서 A는 T로 변경되었고; 및/또는
- 위치 9에서 N은 D로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는
iii) CDR3은
e) 서열번호: 60, 61 및 63; 및
f) 서열번호: 60의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서, 아미노산 차이(들)는 하기와 같이 정의되고:
- 위치 1에서 P는 부재이고;
- 위치 2에서 T는 R로 변경되었거나 부재이고;
- 위치 3에서 T는 M으로 변경되었거나 부재이고;
- 위치 4에서 H는 D 또는 Y로 변경되었고;
- 위치 5에서 Y는 F 또는 V로 변경되었고;
- 위치 6에서 G는 L 또는 D로 변경되었고;
- 위치 8에서 V는 G 또는 T로 변경되었고;
- 위치 9에서 Y는 R로 변경되었고;
- 위치 10에서 Y는 N 또는 E로 변경되었고;
- 위치 11에서 G는 S 또는 K로 변경되었고;
- 위치 12에서 P는 E로 변경되었거나 부재이고; 및/또는
- 위치 13에서 Y는 L로 변경되었거나 부재인 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고;
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
일 양태에서, 본 발명은
- CDR1은 서열번호: 24, 25, 및 27로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- CDR2는 서열번호: 42, 43, 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되며;
- CDR3은 서열번호: 60, 61, 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인아그레칸 결합제의 군으로부터 선택된 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서,
바람직하게는 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 구조 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하고, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 프레임워크 서열이다.
일 양태에서, 본 발명은 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열이 아그레칸의 G1 도메인에 결합하는 것을 교차 차단하는 에피토프 빈 4에 속하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 아그레칸의 G1-도메인의 에피토프 빈 4에 결합하고, 예컨대 서열번호: 117, 114, 115, 116, 5, 6 및 8 중 어느 하나로 표시된, 에피토프 빈 4에 속하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드와 아그레칸의 G1 도메인에의 결합에 대해 경쟁하는, 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호: 117, 118, 116, 114, 115, 5, 13, 1, 2, 6, 8, 10, 12, 16, 17, 18, 및 19로 표시되는 아그레칸 결합제, 및 서열번호: 117, 118, 116, 114, 115, 5, 13, 1, 2, 6, 8, 10, 12, 16, 17, 18, 및 19 중 어느 것과 80% 초과, 예컨대 90% 또는 95%, 또는 심지어 그 초과의 서열 동일성을 갖는 ISV로이루어진 군으로부터 선택되는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
구체적이지만 비제한적인 양태에서, 본 발명의 아그레칸 결합제는 적합한 조건(예컨대, 생리학적 조건) 하에서 면역글로불린 접힘(즉, 접힘에 의해)을 형성할 수 있는 면역글로불린 접힘 또는 아그레칸 결합제를 포함하는 아미노산 잔기의 스트레치일 수 있다. 특히, 문헌[Halaby 등(J. Protein Eng. 12: 563-71, 1999)]에 의한 검토를 참조한다. 바람직하게는, 면역글로불린 접힘을 형성하기 위해 적절하게 접힐 때, 아미노산 잔기의 스트레치는 아그레칸에 결합하기 위한 항원 결합 부위를 적절하게 형성할 수 있다. 따라서, 바람직한 양태에서 본 발명의 아그레칸 결합제는 면역글로불린, 예컨대 면역글로불린 단일 가변 도메인이다.
따라서, 프레임워크 서열은 바람직하게는 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 면역글로불린 프레임워크 서열로부터 유래된(예를 들어, 인간화 또는 낙타화와 같은 서열 최적화에 의해) 프레임워크 서열(의 적합한 조합)이다. 예를 들어, 프레임워크 서열은 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 경쇄 가변 도메인(예컨대, VL-서열)으로부터 유래된 프레임워크 서열 및/또는 중쇄 가변 도메인(예컨대, VH-서열)으로부터 유래된 프레임워크일 수 있다. 하나의 특히 바람직한 양태에서, 프레임워크 서열은 VHH-서열로부터 유래된 프레임워크 서열(상기 프레임워크 서열은 선택적으로 부분적으로 또는 완전히 인간화될 수 있음) 또는 낙타화된(본원에 정의된 바와 같이) 종래의 VH 서열이다.
프레임워크 서열은 바람직하게는 본 발명의 아그레칸 결합제가 도메인 항체(또는 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열); 단일 도메인 항체(또는 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산); "dAb"(또는 dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산); 나노바디®; VHH 서열; 인간화된 VHH 서열; 낙타화된 VH 서열; 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열과 같은 ISV인 것일 수 있다. 또한, 적합한 프레임워크 서열은, 예를 들어 표준 핸드북 및 추가 개시내용 및 본원에 언급된 선행 기술에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 ISV의 또 다른 특히 바람직한 부류는 자연 발생 VH 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만, 즉 종래의 4-사슬 항체로부터의 자연 발생 VH 도메인의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 잔기를 중쇄 항체의 VHH 도메인 내의 상응하는 위치(들)에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나 이상에 의해 대체함으로써, "낙타화된" 아미노산 서열을 갖는 ISV를 포함한다. 이것은 자체 공지된 방식으로 수행될 수 있고, 이는 예를 들어 본원의 설명에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 "낙타화" 치환은 바람직하게는 VH-VL 계면을 형성하고/거나 VH-VL 계면에 존재하고/거나 당업자에게 널리 공지되고 예를 들어 WO 제94/04678호 및 Davies 및 Riechmann(1994 및 1996)에 정의된 이른바 낙타과 특징 잔기에 존재하는 아미노산 위치에 삽입된다. 바람직하게는, 낙타화된 ISV를 생성 또는 설계하기 위한 출발 물질 또는 출발 점으로서 사용되는 VH 서열은 바람직하게는 포유동물로부터의 VH 서열, 보다 바람직하게는 인간의 VH 서열, 예컨대 VH3 서열이다. 그러나, 이러한 본 발명의 낙타화된 ISV는 자체 공지된 임의의 적합한 방식으로 수득될 수 있고, 따라서 출발 물질로서 자연 발생 VH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하여 수득된 폴리펩타이드에 엄격하게 제한되지 않는다는 것에 유의해야 한다.
예를 들어, 또한 본원에 추가로 기재된 바와 같이, "인간화" 및 "낙타화"는 각각 자연 발생 VHH 도메인 또는 VH 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한 다음, 새로운 뉴클레오타이드 서열이 각각 본 발명의 "인간화된" 또는 "낙타화된" ISV를 코딩하는 방식으로, 상기 뉴클레오타이드 서열 내의 하나 이상의 코돈을 자체 공지된 방식으로 변화시킴으로써 수행될 수 있다. 이후, 이 핵산은 본 발명의 원하는 ISV를 제공하기 위해, 자체 공지된 방식으로 발현될 수 있다. 대안적으로, 각각 자연 발생 VHH 도메인 또는 VH 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 각각 본 발명의 원하는 인간화된 또는 낙타화된 ISV의 아미노산 서열이 설계된 다음 자체 공지된 펩타이드 합성을 위한 기술을 사용하여 새롭게 합성될 수 있다. 또한, 각각 자연 발생 VHH 도메인 또는 VH 도메인의 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 기초하여, 각각 본 발명의 원하는 인간화된 또는 낙타화된 ISV를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 설계된 다음 자체 공지된 핵산 합성을 위한 기술을 사용하여 새롭게 합성될 수 있고, 이후 상기 수득된 핵산은 본 발명의 원하는 ISV를 제공하기 위해 자체 공지된 방식으로 발현될 수 있다.
특히, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 존재하는 프레임워크 서열은 예를 들어 WO 제08/020079호(표 A-3 내지 A-8)에 정의된 바와 같은 하나 이상의 특징 잔기를 함유할 수 있으므로, 본 발명의 아그레칸 결합제는 나노바디이다. 이러한 프레임워크 서열(의 적합한 조합)의 일부 바람직하지만 비제한적인 예는 본원의 추가 기재내용으로부터 명백해질 것이다(예컨대, 표 A-2 참고). 일반적으로, 나노바디(특히 VHH 서열 및 부분적으로 인간화된 나노바디)는 특히 하나 이상의 프레임워크 서열에서의 하나 이상의 "특징 잔기"의 존재를 특징으로 할 수 있다(예컨대, WO 제08/020079호, 61페이지, 24행 내지 98페이지, 3행에 추가로 기재된 바와 같음). 본원에 사용된 바와 같이, 임의의 서열번호의 맥락에서 "로 표시된"은 상기 서열번호를 "포함하거나 구성되는"과 동등하고 바람직하게는 상기 서열번호로 "구성되는"과 동등하다.
보다 특히, 본 발명은 하기 (일반) 구조를 갖는 아미노산 서열인 적어도 하나의 ISV를 포함하는 아그레칸 결합제를 제공하며,
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
여기서 FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 지칭하고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭하고,
i) 서열번호: 117, 116, 118, 116, 115, 114 및 1-19의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 80%, 보다 바람직하게는 90%, 더욱 더 바람직하게는 95% 아미노산 동일성을 갖고(표 A-2 참고), 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시된다. 이와 관련하여, 서열번호: 117, 118, 116, 115, 114 및 1-19의 면역글로불린 단일 가변 도메인의 프레임워크 1 서열(서열번호: 119, 120 및 75-84), 프레임워크 2 서열(서열번호: 121 및 85-93), 프레임워크 3 서열(서열번호: 123, 124, 122, 94-104 및 112-113) 및 프레임워크 4 서열(서열번호: 105-108)을 열거하는, 표 A-2를 또한 참고하거나;
ii) 표 A-2에 도시된 바와 같은 프레임워크 서열의 조합;
및
iii) 바람직하게는 카바트 넘버링에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서 아미노산 잔기 중 하나 이상은 예컨대, WO 제08/020079호의 표 A-3 내지 표 A-8에 언급된 바와 같은, 특징 잔기로부터 선택된다.
따라서, 본 발명은 ISV 및/또는 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 ISV는 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 상기 3개의 상보성 결정 영역 CDR1 내지 CDR3으로 본질적으로 구성되고, 예컨대, 아그레칸에 특이적으로 결합하는 ISV는 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 상기 3개의 상보성 결정 영역 CDR1 내지 CDR3으로 구성되며, 치료적 ISV, 예컨대, 세린프로테아제 패밀리의 구성원, 카텝신, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)/매트릭신 또는 ADAMTS(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs), 바람직하게는 MMP8, MMP13, MMP19, MMP20, ADAMTS5(아그레카나제-2), ADAMTS4(아그레카나제-1) 및/또는 ADAMTS11에 결합하는 ISV는 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 상기 3개의 상보성 결정 영역 CDR1 내지 CDR3으로 구성되고; 혈청 알부민 결합 ISV는 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 본질적으로 구성된다.
본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 또한 "개선된 면역글로불린 가변 도메인"이라는 명칭의 하기 공동 계류 중인 US 가출원에 기재된 특정 돌연변이/아미노산 잔기를 함유할 수 있다: 2014년 5월 16일에 출원된 US 제61/994552호; 2014년 6월 18일에 출원된 US 제61/014,015호; 2014년 8월 21일 출원된 US 제62/040,167호; 및 2014년 9월 8일에 출원된 US 제62/047,560호(모두 Ablynx N.V.에 양도됨).
특히, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 적합하게는 (i) 위치 112에서 K 또는 Q; 또는 (ii) 위치 11에서 V와 조합된 위치 110에서 K 또는 Q; 또는 (iii) 위치 89에서 T; 또는 (iv) 위치 110에서 K 또는 Q와 함께 위치 89에서 L; 또는 (v) 위치 11에서 V 및 위치 89에서 L; 또는 (i) 내지 (v)의 임의의 적합한 조합을 포함할 수 있다.
또한 상기 공동 계류 중인 US 가출원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드가 상기 (i) 내지 (v)(또는 이의 적합한 조합) 중 하나에 따른 돌연변이를 함유하는 경우:
위치 11에서의 아미노산 잔기는 바람직하게는 L, V 또는 K로부터 선택되고(가장 바람직하게는 V임);
위치 14에서의 아미노산 잔기는 바람직하게는 A 또는 P로부터 적합하게 선택되고;
위치 41에서의 아미노산 잔기는 바람직하게는 A 또는 P로부터 적합하게 선택되고;
위치 89에서의 아미노산 잔기는 바람직하게는 T, V 또는 L로부터 적합하게 선택되고;
위치 108에서의 아미노산 잔기는 바람직하게는 Q 또는 L로부터 적합하게 선택되고;
위치 110에서의 아미노산 잔기는 바람직하게는 T, K 또는 Q로부터 적합하게 선택되고;
위치 112에서의 아미노산 잔기는 바람직하게는 S, K 또는 Q로부터 적합하게 선택된다.
상기 공동 계류중인 US 가출원에 언급된 바와 같이, 상기 돌연변이는 본 발명의 ISV, 폴리펩타이드 및 구조체에 대한 이른바 "기존 항체"의 결합을 방지하거나 예방하는 데 효과적이다. 이 목적을 위해, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 또한 (선택적으로 상기 돌연변이와 조합되어) C-말단 연장(X)n(여기서 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5(및 바람직하게는 1 또는 2, 예컨대 1)이고; 각각의 X는 독립적으로 선택된, 및 바람직하게는 독립적으로 알라닌(A), 글리세린(G), 발린(V), 류신(L) 또는 이소류신(I)으로 이루어진 군으로부터 선택된 (바람직하게는 자연 발생) 아미노산 잔기이며), 이를 위해 상기 US 가출원 뿐만 아니라 WO 제12/175741호를 또한 참조한다. 특히, 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드는 그것이 단백질, 폴리펩타이드 또는 다른 화합물 또는 이를 포함하는 구조체의 C-말단을 형성하는 경우 이러한 C-말단 연장을 함유할 수 있다(또한, 예컨대, 상기 US 가출원뿐만 아니라 WO 제12/175741호에 추가로 기재된 바와 같음).
본 발명의 아그레칸 결합제는 임의의 적합한 방식으로 그리고 임의의 적합한 공급원으로부터 유래된, 면역글로불린, 예컨대 ISV일 수 있고, 예를 들어 자연 발생 VHH 서열(즉, 낙타과의 적합한 종으로부터의) 또는 합성 또는 반합성 아미노산 서열일 수 있으며, 이는 비제한적으로 "인간화된"(본원에 정의된 바와 같음) 나노바디 또는 VHH 서열, "낙타화된"(본원에 정의된 바와 같음) 면역글로불린 서열(및 특히 낙타화된 중쇄 가변 도메인 서열)뿐만 아니라 친화도 성숙(예를 들어, 합성, 무작위 또는 자연 발생 면역글로불린 서열로부터 시작하는), CDR 이식, 비니어링(veneering), 상이한 면역글로불린 서열로부터 유래된 단편을 조합하는 것, 오버랩핑 프라이머를 사용한 PCR 조립, 및 당업자에게 널리 알려진 면역글로불린 서열을 조작하기 위한 유사한 기술; 또는 본원에 추가로 기재된 바와 같은 임의의 전술한 것의 임의의 적합한 조합과 같은 기술에 의해 수득된 나노바디를 포함한다. 또한, 면역글로불린이 VHH 서열을 포함하는 경우, 상기 면역글로불린은 본 발명의 하나 이상의 추가의 (부분적으로 또는 완전히) 인간화된 면역글로불린을 제공하기 위해, 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 적합하게 인간화될 수 있다. 유사하게, 면역글로불린이 합성 또는 반합성 서열(예컨대, 부분적으로 인간화된 서열)을 포함하는 경우, 상기 면역글로불린은 선택적으로 또한 본 발명의 하나 이상의 추가의 (부분적으로 또는 완전히) 인간화된 면역글로불린을 제공하기 위해, 또한 본원에 기재된 바와 같이, 추가로 적합하게 인간화될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 ISV를 제공하며, 상기 아그레칸 결합제는 서열번호: 117, 118, 116, 115, 114 및 1-19로 이루어진 군으로부터 선택된다.
ISV는 폴리펩타이드의 제조를 위한 "빌딩 블록"으로서 사용될 수 있고, 이는 선택적으로 하나 이상의 추가의 "빌딩 블록", 예컨대 아그레칸 상의 동일한 또는 또 다른 에피토프에 대한 및/또는 아그레칸 이외의 하나 이상의 다른 항원, 단백질 또는 표적에 대한 ISV, 예컨대 치료 작용 방식을 갖는 빌딩 블록, 예컨대 치료적 ISV를 함유할 수 있다.
일반적으로, 단일 빌딩 블록, 단일 ISV 또는 단일 나노바디를 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되는 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 구조체는 각각 본원에서 "1가" 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 "1가 구조체"로서 지칭될 것이다. 둘 이상의 빌딩 블록 또는 결합 단위(예컨대, ISV)를 포함하는 폴리펩타이드 또는 구조체는 또한 본원에서 "다가" 폴리펩타이드 또는 구조체로 지칭될 것이고, 이러한 폴리펩타이드 또는 구조체에 존재하는 빌딩 블록/ISV는 또한 본원에서 "다가 포맷"인 것으로 지칭될 것이다. 예를 들어, "2가" 폴리펩타이드는 선택적으로 링커 서열을 통해 연결된 2개의 ISV을 포함할 수 있는 반면, "3가" 폴리펩타이드는 선택적으로 2개의 링커 서열을 통해 연결된 3개의 ISV를 포함할 수 있는 반면; "4가" 폴리펩타이드는 선택적으로 3개의 링커 서열을 통해 연결된 4개의 ISV를 포함할 수 있다.
다가 폴리펩타이드 또는 구조체에서, 둘 이상의 ISV, 예컨대 나노바디는 동일하거나 상이할 수 있고, 동일한 항원 또는 항원 결정기에 대한(예를 들어 동일한 부분(들) 또는 에피토프(들)에 대한 또는 상이한 부분 또는 에피토프에 대한) 것일 수 있거나 또는 대안적으로 상이한 항원 또는 항원 결정기에 대한 것일 수 있거나; 또는 이의 임의의 적합한 조합일 수 있다. 적어도 하나의 빌딩 블록은 제1 항원(즉, 아그레칸)에 대한 것이고 적어도 하나의 빌딩 블록은 제2 항원(즉, 예컨대, 치료 표적과 같이, 아그레칸과 상이함)에 대한 것인 적어도 2개의 빌딩 블록(예컨대, ISV)을 함유하는 폴리펩타이드 또는 구조체는 또한 본원에서 각각 "다중특이적" 폴리펩타이드 또는 다중특이적 구조체로 지칭될 것이고, 이러한 폴리펩타이드 또는 구조체에 존재하는 빌딩 블록(예컨대, ISV)은 또한 본원에서 "다중특이적 포맷"인 것으로 지칭될 것이다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 "이중특이적" 폴리펩타이드는 제1 항원(즉, 아그레칸)에 대한 적어도 하나의 ISV 및 제2 항원(즉, 예컨대 치료 표적과 같이, 아그레칸과 상이함)에 대한 적어도 하나의 추가 ISV를 포함하는 폴리펩타이드인 반면, 본 발명의 "삼중특이적" 폴리펩타이드는 제1 항원(즉, 아그레칸)에 대한 적어도 하나의 ISV, 제2 항원(즉, 예컨대 예컨대, 치료 표적과 같이, 아그레칸과 상이함)에 대한 적어도 하나의 추가 ISV 및 제3 항원(즉, 아그레칸 및 제2 항원 모두와 상이함)에 대한 적어도 하나의 추가 ISV 등을 포함하는 폴리펩타이드이다.
"다중파라토프성(multiparatopic)" 폴리펩타이드 및 "다중파라토프성" 구조체, 예컨대, "이중파라토프성(biparatopic)" 폴리펩타이드 또는 구조체 및 "삼중파라토프성(triparatopic)" 폴리펩타이드 또는 구조체는 각각 상이한 파라토프를 갖는 둘 이상의 빌딩 블록을 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성된다.
따라서, 아그레칸에 결합하는 본 발명의 아그레칸은 본질적으로 단리된 형태(본원에 정의된 바와 같음)일 수 있거나, 또는 이들은 구조체 또는 폴리펩타이드의 부분을 형성할 수 있고, 이는 아그레칸에 결합하는 하나 이상의 ISV를 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되고 선택적으로 하나 이상의 추가의 아미노산 서열(모두 선택적으로 하나 이상의 적합한 링커를 통해 연결됨)을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 아그레칸에 결합하는, 본 발명에 따른 적어도 하나의 ISV, 예컨대 본 발명의 하나 이상의 ISV(또는 이의 적합한 단편)를 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되는 폴리펩타이드 또는 구조체에 관한 것이다.
본 발명의 하나 이상의 ISV는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 1가, 다가 또는 다중파라토프성 폴리펩타이드 또는 구조체를 각각 제공하기 위해, 이러한 폴리펩타이드 또는 구조체에서 결합 단위 또는 빌딩 블록으로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 하나의 1가 폴리펩타이드 또는 ISV를 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되는 1가 구조체인 폴리펩타이드에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 둘 이상의 ISV를 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되는, 예컨대 2가 또는 3가 폴리펩타이드 또는 구조체와 같은, 각각 다가 폴리펩타이드 또는 다가 구조체인 폴리펩타이드 또는 구조체에 관한 것이다(하나 이상의 VHH 도메인을 함유하는 다가 및 다중특이적 폴리펩타이드 및 이들의 제조에 대해, 예컨대, 또한 Conrath 등(J. Biol. Chem. 276: 7346-7350, 2001), 뿐만 아니라 예를 들어 WO 제96/34103호, WO 제99/23221호 및 WO 제2010/115998호를 참고한다).
본 발명은 추가로 아그레칸, 바람직하게는 인간 아그레칸에 대한 적어도 하나의 ISV, 예컨대 1개 또는 2개의 ISV(또는 이의 적합한 단편), 및 1개의 부가적인 ISV를 포함하거나 (본질적으로) 구성되는 다가 폴리펩타이드(본원에서 "본 발명의 다가 폴리펩타이드(들)"로도 지칭됨)에 관한 것이다.
일 양태에서, 가장 간단한 형태에서, 본 발명의 다가 폴리펩타이드 또는 구조체는 아그레칸에 대한 제1 ISV, 예컨대 나노바디, 및 아그레칸에 대한 동일한 제2 ISV, 예컨대 나노바디를 포함하는 본 발명의 2가 폴리펩타이드 또는 구조체이며, 상기 제1 및 상기 제2 ISV, 예컨대 나노바디는 선택적으로 링커 서열(본원에 정의된 바와 같음)을 통해 연결될 수 있다. 또 다른 형태에서, 본 발명의 다가 폴리펩타이드 또는 구조체는 아그레칸에 대한 제1 ISV, 예컨대 나노바디, 아그레칸에 대한 동일한 제2 ISV, 예컨대 나노바디 및 예컨대 치료 표적과 같이, 아그레칸과 상이한 항원에 대한 제3 ISV, 예컨대 나노바디를 포함하는, 본 발명의 3가 폴리펩타이드 또는 구조체일 수 있고, 상기 제1, 제2 및 제3 ISV, 예컨대 나노바디는 선택적으로 하나 이상, 및 특히 2개의 링커 서열을 통해 연결될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 다가 폴리펩타이드 또는 구조체는 아그레칸에 대한 제1 ISV, 예컨대 나노바디, 및 예컨대 치료 표적과 같은 제2 항원에 대한 제2 ISV, 예컨대 나노바디를 포함하는, 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드 또는 구조체일 수 있고, 상기 제1 및 제2 ISV, 예컨대 나노바디는 선택적으로 링커 서열(본원에 정의된 바와 같음)을 통해 연결될 수 있는 반면; 본 발명의 다가 폴리펩타이드 또는 구조체는 또한 아그레칸에 대한 제1 ISV, 예컨대 나노바디, 예컨대 치료 표적과 같은 제2 항원에 대한 제2 ISV, 예컨대 나노바디, 및 상기 제2 항원과 상이한, 예컨대 치료 표적과 같은 제3 항원에 대한 제3 ISV, 예컨대 나노바디를 포함하는, 본 발명의 삼중특이적 폴리펩타이드 또는 구조체일 수 있고, 상기 제1, 제2 및 제3 ISV, 예컨대 나노바디는 선택적으로 하나 이상, 및 특히 2개의 링커 서열을 통해 연결될 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 구조체는 각각 3가 이중특이적 폴리펩타이드 또는 구조체이다. 가장 간단한 형태의 본 발명의 3가 이중특이적 폴리펩타이드 또는 구조체는 아그레칸에 대한 2개의 동일한 ISV, 예컨대 나노바디, 및 예컨대 치료 표적과 같은 또 다른 항원에 대한 제3 ISV, 예컨대 나노바디를 포함하는, 본 발명의 3가 폴리펩타이드 또는 구조체(본원에 정의된 바와 같음)일 수 있고, 상기 제1, 제2 및 제3 ISV, 예컨대 나노바디는 선택적으로 하나 이상, 및 특히 2개의 링커 서열을 통해 연결될 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 구조체는 각각 3가 이중특이적 폴리펩타이드 또는 구조체이다. 본 발명의 3가 이중특이적 폴리펩타이드 또는 구조체는 아그레칸에 대한 2개의 ISV, 예컨대 나노바디로서, 상기 아그레칸에 대한 ISV는 동일하거나 상이할 수 있는 ISV 및 예컨대 치료 표적과 같은 또 다른 항원에 대한 제3 ISV, 예컨대 나노바디를 포함하는, 본 발명의 3가 폴리펩타이드 또는 구조체(본원에 정의된 바와 같음)일 수 있고, 상기 제1, 제2 및 제3 ISV, 예컨대 나노바디는 선택적으로 하나 이상, 및 특히 2개의 링커 서열을 통해 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 3가, 이중특이적 폴리펩타이드 또는 구조체는 본원에 기재된 실시예 및 표 E-1 및 E-2에 나타난 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 이중특이적 폴리펩타이드 또는 구조체이다. 가장 간단한 형태의 본 발명의 이중특이적 폴리펩타이드 또는 구조체는 아그레칸에 대한 ISV, 예컨대 나노바디 및 예컨대 치료 표적과 같은 또 다른 항원에 대한 제2 ISV, 예컨대 나노바디를 포함하는, 본 발명의 2가 폴리펩타이드 또는 구조체(본원에 정의된 바와 같음)일 수 있고, 상기 제1 및 제2 ISV, 예컨대 나노바디는 선택적으로 링커 서열을 통해 연결될 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 다가 폴리펩타이드 또는 구조체는 아그레칸에 대한 둘 이상의 ISV를 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성된다. 일 양태에서, 본 발명은 아그레칸에 결합하는, 본 발명에 따른 적어도 2개의 ISV, 예컨대 2, 3 또는 4개의 ISV(또는 이의 적합한 단편)를 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되는 폴리펩타이드 또는 구조체에 관한 것이다. 둘 이상의 ISV는 선택적으로 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다.
본 발명의 다가 폴리펩타이드 또는 구조체에 존재하는 둘 이상의 ISV는 경쇄 가변 도메인 서열(예컨대, VL-서열)로 구성되거나 중쇄 가변 도메인 서열(예컨대, VH-서열)로 구성될 수 있고; 이들은 종래의 4-사슬 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열로 구성되거나 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열로 구성될 수 있다. 바람직한 양태에서, 이들은 도메인 항체(또는 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산), 단일 도메인 항체(또는 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산), "dAb"(또는 dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산), 나노바디®(비제한적으로 VHH 포함), 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열; 또는 친화도 성숙에 수득된 VHH 서열로 구성된다. 둘 이상의 ISV는 부분적으로 또는 완전히 인간화된 나노바디 또는 부분적으로 또는 완전히 인간화된 VHH로 구성될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 다중파라토프성(바람직하게는 이중파라토프성 또는 삼중파라토프성) 폴리펩타이드 또는 구조체에 존재하는 제1 ISV 및 제2 ISV는 아그레칸에의 결합에 대해 서로 (교차) 경쟁하지 않으며, 이와 같이, 상이한 패밀레 속한다. 따라서, 본 발명은 둘 이상의 ISV를 포함하는 다중파라토프성(바람직하게는 이중파라토프성) 폴리펩타이드 또는 구조체에 관한 것으로서, 각각의 ISV는 상이한 패밀리에 속한다. 일 양태에서, 본 발명의 이러한 다중파라토프성(바람직하게는 이중파라토프성) 폴리펩타이드 또는 구조체의 제1 ISV는 본 발명의 이러한 다중파라토프성(바람직하게는 이중파라토프성) 폴리펩타이드 또는 구조체의 제2 ISV의 아그레칸에의 결합을 교차 차단하지 않고/거나 제1 ISV는 제2 ISV에 의해 아그레칸에의 결합으로부터 교차 차단되지 않는다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 다중파라토프성(바람직하게는 이중파라토프성) 폴리펩타이드 또는 구조체의 제1 ISV는 본 발명의 이 다중파라토프성(바람직하게는 이중파라토프성) 폴리펩타이드 또는 구조체의 제2 ISV의 아그레칸에의 결합을 교차 차단하고/거나 제1 ISV는 제2 ISV에 의해 아그레칸에의 결합으로부터 교차 차단되지 않는다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 구조체는 둘 이상의 ISV를 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되고, 이들 중 적어도 하나의 ISV는 아그레칸에 대한 것이다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 구조체는 3개 이상의 ISV를 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되고, 이들 중 적어도 2개의 ISV는 아그레칸에 대한 것이다. 아그레칸에 대한 상기 적어도 2개의 ISV는 동일하거나 상이할 수 있고, 아그레칸의 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프에 대한 것일 수 있고, 동일한 에피토프 빈 또는 상이한 에피토프 빈에 속할 수 있고/거나, 아그레칸의 동일하거나 상이한 도메인에 결합할 수 있음이 이해될 것이다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 구조체는 적어도 2개의 ISV를 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되고, 상기 적어도 2개의 ISV는 동일하거나 상이할 수 있고, 이는 독립적으로 서열번호: 117, 118, 116, 115 및 1-19로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 적어도 2개의 ISV는 서열번호: 117, 5, 6, 8, 114-116으로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나 상기 적어도 2개의 ISV는 서열번호: 118 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 서열번호: 117, 118, 114, 115, 116 및 1-19 중 어느 하나에 의해 결합된 바와 같은 동일한 에피토프(들)에 결합하는 아그레칸에 대한 둘 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 다중파라토프성(바람직하게는 이중파라토프성) 폴리펩타이드 또는 구조체에 관한 것이다.
임상 용도를 위한 분자의 최종 포맷은 아그레칸에 결합하는, 1개 또는 2개의 빌딩 블록, 예컨대 ISV 및 치료 작용 방식을 갖는 하나 이상의 빌딩 블록, 예컨대 ISV, 및 가능하게는 추가의 모이어티를 포함하는 것으로 예상된다. 실시예 섹션에서, 이러한 포맷은 아그레칸 결합 및 보유 특성뿐만 아니라 치료 효과, 예컨대, 효소적 및/또는 억제 기능을 유지하는 것으로 입증된다. 치료 작용 방식을 갖는 하나 이상의 빌딩 블록, 예컨대 ISV는 아그레칸이 관련된 질환, 예컨대 관절염 질환, 골관절염, 척추골단골간단이형성증, 요추간판 퇴행 질환, 퇴행성 관절 질환, 류마티스성 관절염, 박리성 골연골염(osteochondritis dissecans), 아그레칸병증(aggrecanopathy)과 같이 아그레칸이 관련되고/거나 아그레칸이, 예컨대 관절과 같은 원하는 부위에서, 다른, 예컨대 치료적, 빌딩 블록을 지향, 고정 및/또는 보유하는 데 사용되는 질환에서 치료 효과를 갖는 임의의 빌딩 블록("치료 빌딩 블록" 또는 "치료 ISV")일 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 구조체에 관한 것으로서, 하나 이상의 추가 빌딩 블록(들), 예컨대, 추가 ISV(들)는 활성을 유지한다.
본 발명은 아그레칸에 결합하는, 본 발명에 따른 적어도 하나의 ISV, 예컨대 본 발명의 하나 이상의 ISV(또는 이의 적합한 단편), 및 적어도 하나의 추가 ISV, 특히 치료적 ISV를 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되는 폴리펩타이드 또는 구조체에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 추가 ISV는 바람직하게는 치료 표적에 결합하고, 예컨대 세린프로테아제 패밀리의 구성원, 카텝신, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)/매트릭신 또는 ADAMTS(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs), 바람직하게는 MMP8, MMP13, MMP19, MMP20, ADAMTS5(아그레카나제-2), ADAMTS4(아그레카나제-1) 및/또는 ADAMTS11에 결합한다.
일 양태에서, 본 발명은 아그레칸에 결합하는 적어도 하나의 ISV 및 치료 효과를 갖는 적어도 하나의 추가 ISV, 예컨대, 치료적 빌딩 블록으로 본질적으로 구성되거나 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 구조체에 관한 것이다. 치료 효과는 하기에 추가로 상세히 설명될 바와 같이 질환을 개선, 치료 또는 예방하는 임의의 원하는 효과일 수 있다. 바람직하게는 추가 ISV, 예컨대, 치료적 ISV는 프로테아제 활성을 억제하거나 감소시키고, 예컨대 치료 표적의 활성, 즉 세린프로테아제 패밀리의 구성원, 카텝신, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)/매트릭신 또는 ADAMTS(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs), 바람직하게는 MMP8, MMP13, MMP19, MMP20, ADAMTS5(아그레카나제-2), ADAMTS4(아그레카나제-1) 및/또는 ADAMTS11의 활성을 억제하거나 감소시킨다. 활성을 억제하거나 감소시키는 것은 활성 부위에 결합함으로써 또는 프로테아제 또는 프로테이나제의 구조를 변형시킴으로써 달성될 수 있고, 이에 의해 프로테아제 또는 프로테이나제의 표적 단백질의 가수 분해를 방지 및/또는 감소시킬 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 표 E-1 및 표 E-2의 폴리펩타이드 및 구조체로부터 선택된 본 발명의 폴리펩타이드 또는 구조체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 37℃에서 활액(SF)에서 적어도 7일, 예컨대 적어도 14일, 21일, 1개월, 2개월 또는 심지어 3개월의 안정성을 갖는 본 발명의 ISV, 폴리펩타이드 또는 구조체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 연골 보유 분석에서 적어도 2, 예컨대 적어도 3, 4, 5 또는 6 RU의 연골 보유를 갖는 본 발명의 ISV, 폴리펩타이드 또는 구조체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 적어도 5 μm, 예컨대 적어도 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm 또는 심지어 그 초과로 연골 내로 침투하는 본 발명의 ISV, 폴리펩타이드 또는 구조체에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드, 구조체 또는 ISV의 안정성은 당업자에게 공지된 일상적인 분석에 의해 측정될 수 있다. 전형적인 분석은 (비제한적으로) 상기 폴리펩타이드, 구조체 또는 ISV의 활성이 결정된 후, 원하는 시간 동안 활액에서 배양하고, 이후 예를 들어 실시예 섹션(실시예 6 참고)에 상세히 기재된 바와 같이 활성이 다시 결정되는 분석을 포함한다.
본 발명의 다가 폴리펩타이드 또는 구조체 내의 치료적 빌딩 블록의 원하는 활성은 당업자에게 공지된 일상적인 분석에 의해 측정될 수 있다. 전형적인 분석은 실시예 섹션(실시예 8 참고)에 상세하게 기재된 바와 같이 GAG 방출이 분석되는 분석을 포함한다.
상대적 친화도는 폴리펩타이드에서의 ISVD의 위치에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드에서의 IDVD의 순서(배향)는 당업자의 요구에 따라 선택될 수 있음이 이해될 것이다. 개별 ISVD의 순서뿐만 아니라 폴리펩타이드가 링커를 포함하는지 여부는 설계 선택의 문제이다. 링커가 있거나 없는 일부 배향은 다른 배향과 비교하여 바람직한 결합 특징을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드에서 제1 ISV(예컨대, ISV 1) 및 제2 ISV(예컨대, ISV 2)의 순서는 (N-말단에서 C-말단으로): (i) ISV 1(예컨대, 나노바디 1) - [링커] - ISV 2(예컨대, 나노바디 2) - [C-말단 연장]; 또는 (ii) ISV 2(예컨대, 나노바디 2) - [링커]- ISV 1(예컨대, 나노바디 1) - [C-말단 연장]일 수 있다(여기서 꺾쇠 괄호 사이의 모이어티, 즉 링커 및 C-말단 연장은 선택적임). 모든 배향이 본 발명에 포함된다. 원하는 결합 특징을 제공하는 ISV의 배향을 함유하는 폴리펩타이드는, 예를 들어 실시예 섹션에 예시된 바와 같이, 일상적인 스크리닝에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 바람직한 순서는 N-말단에서 C-말단으로 치료 ISV - [링커] - 아그레칸에 결합하는 ISV - [C-말단 연장]이고, 여기서 꺾쇠 괄호 사이의 모이어티는 선택적이다. 또 다른 바람직한 순서는 N-말단에서 C-말단으로 치료 ISV - [링커] - 아그레칸에 결합하는 ISV - [링커] - 아그레칸에 결합하는 ISV - [C-말단 연장]이고, 여기서 꺾쇠 괄호 사이의 모이어티는 선택적이다.
본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 ISV는 하나 이상의 다른 기, 잔기(예컨대, 아미노산 잔기), 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하거나 포함하지 않을 수 있다(이들 아그레칸 결합제, 예컨대 폴리펩타이드 및/또는 ISV(부가적인 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 갖거나 갖지 않는)는 모두 "본 발명의 화합물(들)", "본 발명의 구조체(들)" 및/또는 "본 발명의 폴리펩타이드(들)"로 지칭됨). 존재하는 경우, 이러한 추가의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 아그레칸 결합제, 예컨대 폴리펩타이드 및/또는 ISV에 추가의 기능성을 제공하거나 제공하지 않을 수 있고 아그레칸 결합제, 예컨대 폴리펩타이드 및/또는 ISV의 특성을 변형하거나 변형하지 않을 수 있다.
예를 들어, 이러한 추가의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 하나 이상의 부가적인 아미노산 서열일 수 있으므로, 생성된 폴리펩타이드는 (융합) 폴리펩타이드이다. 바람직하지만 비제한적인 양태에서, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 면역글로불린이다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산, 나노바디(예컨대, VHH, 인간화된 VHH 또는 낙타화된 VH 서열)로 이루어진 군으로부터 선택된 ISV가다.
상기 기재된 바와 같이, 상이한 항원 특이성을 갖는 ISV와 같은 부가적인 결합 단위는 연결되어 다중특이적 폴리펩타이드를 형성할 수 있다. 둘 이상의 특이성의 ISV를 조합함으로써, 이중특이성, 삼중특이성 등의 폴리펩타이드 또는 구조체가 형성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 아그레칸에 대한 하나, 둘 이상의 ISV 및 또 다른 표적에 대한 적어도 하나의 ISV 도메인를 포함할 수 있다. 당업자가 쉽게 구상할 수 있는 이러한 구조체 및 이의 변형은 모두 본원에 사용된 용어 "본 발명의 화합물, 본 발명의 구조체 및/또는 본 발명의 폴리펩타이드"에 포함된다.
상기 기재된 화합물, 구조체 및/또는 폴리펩타이드에서, 1개, 2개, 3개 이상의 ISV 및 하나 이상의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 서로 직접 및/또는 하나 이상의 적합한 링커 또는 스페이서를 통해 연결될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 아미노산 서열인 경우, 링커는 또한 아미노산 서열일 수 있으므로, 생성된 폴리펩타이드는 융합 (단백질) 또는 융합 (폴리펩타이드)이다.
하나 이상의 추가의 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 임의의 적합한 및/또는 원하는 아미노산 서열일 수 있다. 추가의 아미노산 서열은 본 발명의 폴리펩타이드의 (생물학적) 특성을 변화시키거나, 변경시키거나, 또는 영향을 미칠 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수 있고, 본 발명의 폴리펩타이드에게 추가의 기능성을 부가하거나 부가하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 추가의 아미노산 서열은 본 발명의 폴리펩타이드에게 하나 이상의 원하는 특성 또는 기능성을 부여하는 것이다.
이러한 아미노산 서열의 예는 당업자에게 명백할 것이며, 일반적으로 종래의 항체 및 이의 단편(비제한적으로 ScFv 및 단일 도메인 항체 포함)에 기초하여 펩타이드 융합에 사용되는 모든 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 문헌[Holliger and Hudson(Nature Biotechnology 23: 1126-1136, 2005)]에 의한 검토를 참고한다.
예를 들어, 이러한 아미노산 서열은, 본 발명의 폴리펩타이드 자체와 비교하여, 반감기, 용해도, 또는 흡수를 증가시키고, 면역원성 또는 독성을 감소시키고, 바람직하지 않은 부작용을 제거 또는 약화시키고/거나 본 발명의 화합물, 구조체 및/또는 폴리펩타이드에게 다른 유리한 특성을 부여하고/거나 본 발명의 화합물, 구조체 및/또는 폴리펩타이드의 원하지 않는 특성을 감소시키는 아미노산 서열일 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 일부 비제한적인 예는 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민(예를 들어, WO 제00/27435호 참고) 또는 합텐 분자(예를 들어, 순환 항체에 의해 인식되는 합텐, 예를 들어, WO 제98/22141호 참고)이다.
본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 구조체 또는 폴리펩타이드는 모이어티가 없는 본 발명의 상응하는 구조체 또는 폴리펩타이드와 비교하여, 증가된 반감기를 부여하는 모이어티를 가질 수 있다. 본 발명의 이러한 구조체 및 폴리펩타이드의 일부 바람직하지만 비제한적인 예는 본원의 추가 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 이의 반감기를 증가시키기 위해 화학적으로 변형된(예를 들어, 페길화에 의해) 본 발명의 ISV 또는 폴리펩타이드; 혈청 단백질(예컨대, 혈청 알부민)에 결합하기 위한 적어도 하나의 부가적인 결합 부위를 포함하는 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대 본 발명의 ISV 및/또는 폴리펩타이드; 또는 본 발명의 아미노산 서열의 반감기를 증가시키는 적어도 하나의 모이어티(및 특히 적어도 하나의 아미노산 서열)에 연결된 본 발명의 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 반감기 연장 모이어티 또는 ISV를 포함하는 본 발명의 구조체, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드의 예는 본원의 추가 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어, 비제한적으로, 본 발명의 하나 이상의 ISV가 하나 이상의 혈청 단백질 또는 이의 단편(예컨대, (인간) 혈청 알부민 또는 이의 적합한 단편)에 적합하게 연결되거나 또는 혈청 단백질에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 단위(예컨대, 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 ISV, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 ISV, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 ISV, 또는 혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민), 혈청 면역글로불린, 예컨대 IgG, 또는 트랜스페린; 추가 설명 및 본원에 언급된 참고문헌 참고)에 결합할 수 있는 나노바디에 적합하게 연결된 폴리펩타이드; 본 발명의 아미노산 서열이 Fc 부분(예컨대, 인간 Fc) 또는 이의 적합한 부분 또는 단편에 연결된 폴리펩타이드; 또는 본 발명의 하나 이상의 ISV가, 예를 들어, WO 제91/01743호, WO 제01/45746호, WO 제02/076489호, WO제2008/068280호, WO제2009/127691호 및 제PCT/EP2011/051559호에 기재된 단백질 및 펩타이드과 같은 혈청 단백질에 결합할 수 있는 하나 이상의 작은 단백질 또는 펩타이드에 적합하게 연결된 폴리펩타이드를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 구조체, 예컨대 폴리펩타이드를 제공하며, 상기 폴리펩타이드는 혈청 단백질 결합 모이어티 또는 혈청 단백질을 추가로 포함한다.
바람직하게는, 상기 혈청 단백질 결합 모이어티는 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민에 결합한다.
일반적으로, 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 구조체 또는 폴리펩타이드는 바람직하게는 본 발명의 상응하는 구조체 또는 폴리펩타이드 자체, 즉 증가된 반감기를 부여하는 모이어티가 없는 본 발명의 상응하는 구조체 또는 폴리펩타이드 자체의 반감기보다 적어도 1.5배, 바람직하게는 적어도 2배, 예컨대 적어도 5배, 예를 들어 적어도 10배 또는 20배 초과로 큰 반감기를 갖는다. 예를 들어, 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 구조체 또는 폴리펩타이드는 본 발명의 상응하는 구조체 또는 폴리펩타이드 자체, 즉 증가된 반감기를 부여하는 모이어티가 없는 본 발명의 상응하는 구조체 또는 폴리펩타이드 자체와 비교하여, 1시간 초과, 바람직하게는 2시간 초과, 보다 바람직하게는 6시간 초과, 예컨대 12시간 초과, 또는 심지어 24, 48 또는 72시간 초과로 증가된, 예컨대, 인간에서의 반감기를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직하지만 비제한적인 양태에서, 본 발명의 구조체, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드는 본 발명의 상응하는 구조체 또는 폴리펩타이드 자체, 즉 증가된 반감기를 부여하는 모이어티가 없는 본 발명의 상응하는 구조체 또는 폴리펩타이드 자체와 비교하여, 1시간 초과, 바람직하게는 2시간 초과, 보다 바람직하게는 6시간 초과, 예컨대 12시간 초과, 또는 심지어 24, 48 또는 72시간 초과로 증가된, 예컨대 인간에서의 혈청 반감기를 갖는다.
본 발명의 또 다른 바람직하지만 비제한적인 양태에서, 본 발명의 이러한 구조체, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드는 적어도 약 12시간, 바람직하게는 적어도 24시간, 보다 바람직하게는 적어도 48시간, 더욱 더 바람직하게는 적어도 72시간 이상의 인간에서의 혈청 반감기를 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩타이드는 적어도 5일(예컨대, 약 5 내지 10일), 바람직하게는 적어도 9일(예컨대 약 9 내지 14일), 보다 바람직하게는 적어도 약 10일(예컨대, 약 10 내지 15일), 또는 적어도 약 11일(예컨대 약 11 내지 16일), 보다 바람직하게는 적어도 약 12일(예컨대, 약 12 내지 18일 이상), 또는 14일 초과(예컨대, 약 14 내지 19일)의 반감기를 가질 수 있다.
본 발명의 특히 바람직하지만 비제한적인 양태에서, 본 발명은, 아그레칸에 결합하는 하나 이상의 빌딩 블록 및 가능하게는 하나 이상의 치료적 빌딩 블록 외에, 혈청 알부민에 결합하는 적어도 하나의 빌딩 블록, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 인간 혈청 알부민을 포함하는 혈청 알부민 결합 ISV을 포함하는, 본 발명의 구조체, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드를 제공하며, 상기 혈청 알부민 결합 ISV는 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)을 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되고, 여기서 CDR1은 SFGMS이고, CDR2는 SISGSGSDTLYADSVKG이며, CDR3은 GGSLSR이다. 바람직하게는, 상기 인간 혈청 알부민 결합 ISV는 Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb135, Alb11, Alb11(S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82-GGG, Alb92 또는 Alb223으로 이루어진 군으로부터 선택된다(표 C 참고).
일 구현예에서, 본 발명은 혈청 단백질 결합 모이어티를 포함하는 본 발명의 구조체, 예컨대 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 혈청 단백질 결합 모이어티는 비항체 기반 폴리펩타이드이다.
일 양태에서, 본 발명은, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 구조체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 반감기 연장을 부여하는 모이어티를 포함하는 본 발명의 구조체, 예컨대 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 모이어티는 PEG이다. 따라서, 본 발명은 PEG를 포함하는 본 발명의 구조체 또는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
추가의 아미노산 잔기는 본 발명의 폴리펩타이드의 다른 (생물학적) 특성을 변화시키거나, 변경하거나, 영향을 미칠 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있고, 본 발명의 폴리펩타이드에게 추가의 기능성을 부가하거나 부가하지 않을 수 있다. 예를 들어, 이러한 아미노산 잔기는
a) 예를 들어 이종 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현의 결과로서, N-말단 Met 잔기를 포함할 수 있다;
b) 합성시 숙주 세포로부터 폴리펩타이드의 분비를 유도하는 신호 서열 또는 리더 서열을 형성할 수 있다(예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는 데 사용된 숙주 세포에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드의 예비(pre)-, 전(pro)- 또는 예비전(prero)- 형태를 제공하기 위해). 적합한 분비 리더 펩타이드는 당업자에게 명백할 것이며, 본원에 추가로 기재된 바와 같을 수 있다. 일반적으로, 이러한 리더 서열은 폴리펩타이드의 N-말단에 연결될 것이지만, 본 발명은 광의의 개념에서 이에 제한되지 않는다;
c) 예를 들어 상기 서열 또는 잔기에 대한 친화도 기술을 사용하여, 폴리펩타이드의 정제를 허용하거나 용이하게 하는 "태그(tag)", 예를 들어 아미노산 서열 또는 잔기를 형성할 수 있다. 이후, 상기 서열 또는 잔기는 제거되어(예컨대, 화학적 또는 효소적 절단에 의해) 폴리펩타이드를 제공할 수 있다(이 목적을 위해, 태그는 절단가능한 링커 서열을 통해 아미노산 서열 또는 폴리펩타이드 서열에 연결되거나 절단가능한 모티프를 함유할 수 있음). 이러한 잔기의 일부 바람직하지만 비제한적인 예는 다수의 히스티딘 잔기, 글루타티온 잔기 및 myc-태그, 예컨대 AAAEQKLISEEDLNGAA이다;
d) 기능화되었고/거나 작용기의 부착을 위한 부위로서 작용할 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 적합한 아미노산 잔기 및 작용기는 당업자에게 명백할 것이며, 비제한적으로, 본 발명의 폴리펩타이드의 유도체를 위해 본원에 언급된 아미노산 잔기 및 작용기를 포함한다.
본 발명의 구조체, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드에서, 둘 이상의 빌딩 블록, 예컨대, ISV, 및 선택적으로 하나 이상의 다른 기, 약물, 제제, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 (예를 들어 WO 제99/23221호에 기재된 바와 같이) 서로 직접 연결될 수 있고/거나 하나 이상의 적합한 스페이서 또는 링커, 또는 이의 임의의 조합을 통해 서로 연결될 수 있다. 다가 및 다중특이적 폴리펩타이드에서 사용하기 위한 적합한 스페이서 또는 링커는 당업자에게 명백할 것이며, 일반적으로 아미노산 서열을 연결하기 위해 당업계에 사용되는 임의의 링커 또는 스페이서일 수 있다. 바람직하게는, 상기 링커 또는 스페이서는 약학적 용도를 위한 구조체, 단백질 또는 폴리펩타이드를 제작하는 데 사용하기에 적합하다.
예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는, 예를 들어, 아그레칸에 결합하는, 하나의 빌딩 블록, 예컨대 ISV, 하나의 치료적 빌딩 블록, 예컨대 ISV, 및 (인간) 혈청 알부민에 결합하는, 하나의 빌딩 블록, 예컨대 ISV를 포함하는, 3가, 삼중특이적 폴리펩타이드일 수 있고, 상기 제1, 제2 및 제3 빌딩 블록, 예컨대 ISV는 선택적으로 하나 이상, 및 특히 2개의 링커 서열을 통해 연결될 수 있다. 또한, 본 발명은 아그레칸에 결합하는 제1 ISV 및/또는 제2 ISV 및/또는 가능하게는 제3 ISV 및/또는 가능하게는 혈청 알부민 결합 ISV을 포함하는 본 발명의 구조체 또는 폴리펩타이드를 제공하며, 상기 제1 ISV 및/또는 상기 제2 ISV 및/또는 가능하게는 상기 제3 ISV 및/또는 가능하게는 상기 혈청 알부민 결합 ISV는 링커를 통해 연결된다.
일부 특히 바람직한 스페이서는 항체 단편 또는 항체 도메인을 연결하기 위해 당업계에 사용되는 스페이서 및 링커를 포함한다. 이들은 상기 언급된 일반 배경 기술에 언급된 링커뿐만 아니라 예를 들어 디아바디 또는 ScFv 단편을 제작하기 위해 당업계에서 사용되는 링커를 포함한다(그러나, 이와 관련하여, 디아바디 및 ScFv 단편에서, 사용된 링커 서열은 관련된 VH 및 VL 도메인을 합하여 완전한 항원 결합 부위를 형성하게 하는 길이, 가요성의 정도 및 다른 특성을 가져야 하는 반면, 각각의 ISV, 예컨대 나노바디는 그 자체로 완전한 항원 결합 부위를 형성하므로, 본 발명의 폴리펩타이드에 사용된 링커의 길이 또는 가요성에 대한 특별한 제한은 없다는 것에 유의해야 함).
예를 들어, 링커는 적합한 아미노산 서열, 및 특히 1 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 30개, 예컨대 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열일 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 일부 바람직한 예는, 예를 들어 유형 (glyxsery)z, 예컨대, WO 제99/42077호에 기재된 바와 같은 (gly4ser)3 또는 (gly3ser2)3의 gly-ser 링커 및 본원에 언급된 Ablynx의 출원(예를 들어, WO 제06/040153호 및 WO 제06/122825호 참고)에 기재된 GS30, GS15, GS9 및 GS7 링커, 뿐만 아니라 힌지 유사 영역, 예컨대 자연 발생 중쇄 항체의 힌지 영역 또는 유사한 서열(예를 들어, WO 제94/04678호에 기재된 바와 같음)을 포함한다. 바람직한 링커는 표 D(서열번호: 154-170)에 나타나 있다.
다른 적합한 링커는 일반적으로 유기 화합물 또는 중합체, 특히 약학적 용도를 위해 단백질에 사용하기에 적합한 것을 포함한다. 예를 들어, 폴리(에틸렌글리콜) 모이어티가 항체 도메인을 연결하는 데 사용되어 왔으며, 예를 들어 WO 제04/081026호를 참고한다.
사용된 링커(들)의 길이, 가요성 정도 및/또는 다른 특성(그것은 일반적으로 ScFv 단편에 사용되는 링커에 대한 것이기 때문에 중요하지 않지만)이 케모카인, 또는 하나 이상의 다른 항원에 대한 친화도, 특이성 또는 결합활성을 포함하는, 본 발명의 최종 구조체, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드의 특성에 약간의 영향을 미칠 수 있다는 것이 본 발명의 범위에 포함된다. 본원의 개시내용에 기초하여, 당업자는 선택적으로 일부 제한된 일상적인 실험 후에, 본 발명의 특정 구조체, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드에 사용하기 위한 최적 링커(들)를 결정할 수 있을 것이다.
예를 들어, 아그레칸 및 또 다른 표적에 대한 빌딩 블록, ISV 또는 나노바디를 포함하는 본 발명의 다가 폴리펩타이드에서, 링커의 길이 및 가요성은 바람직하게는 폴리펩타이드에 존재하는 본 발명의 각각의 빌딩 블록, 예컨대 ISV를 그의 동족 표적, 예컨대, 각각의 표적 상의 항원 결정기에 결합하게 하는 것이다. 또한, 본원의 개시내용에 기초하여, 당업자는 선택적으로 일부 제한된 일상적인 실험 후에, 본 발명의 특정 구조체, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드에 사용하기 위한 최적 링커(들)를 결정할 수 있을 것이다.
사용된 링커(들)가 본 발명의 구조체, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드에게 하나 이상의 다른 유리한 특성 또는 기능성을 부여하고/거나 유도체의 형성을 위한 및/또는 작용기(예컨대, 본 발명의 ISV의 유도체를 위해 본원에 기술된 바와 같은)의 부착을 위한 하나 이상의 부위를 제공하는 것 역시 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들어, 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기를 함유하는 링커는 개선된 친수성 특성을 제공할 수 있는 반면, 작은 에피토프 또는 태그를 형성하거나 함유하는 링커는 검출, 확인 및/또는 정제의 목적을 위해 사용될 수 있다. 또한, 본원의 개시내용에 기초하여, 당업자는 선택적으로 일부 제한된 일상적인 실험 후에, 본 발명의 특정 폴리펩타이드에 사용하기 위한 최적 링커를 결정할 수 있을 것이다.
마지막으로, 둘 이상의 링커가 본 발명의 폴리펩타이드와 같은 구조체에 사용되는 경우, 이들 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 본원의 개시내용에 기초하여, 당업자는 선택적으로 일부 제한된 일상적인 실험 후에, 본 발명의 특정 구조체 또는 본 발명의 폴리펩타이드에 사용하기 위한 최적 링커를 결정할 수 있을 것이다.
일반적으로, 발현 및 생산의 용이성을 위해, 본 발명의 구조체, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드는 선형 폴리펩타이드일 것이다. 그러나, 가장 광의의 의미에서 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 구조체, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드가 3개 이상의 빌딩 블록, ISV 또는 나노바디를 포함하는 경우, 3개 이상의 "암(arm)"을 갖는 링커를 사용하여 이들을 연결할 수 있고, 각각의 "암"은 "별 모양" 구조체를 제공하기 위해 빌딩 블록, ISV 또는 나노바디에 연결될 수 있다. 일반적으로 덜 바람직하긴 하지만 원형 구조체를 사용할 수도 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 구조체, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 ISV는 서로 직접 연결되거나 링커를 통해 연결된다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 구조체, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 제1 ISV 및/또는 제2 ISV 및/또는 가능하게는 혈청 알부민 결합 ISV는 링커를 통해 연결된다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 구조체, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 링커는 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS, 35GS, poly-A, 8GS, 40GS, G1 힌지, 9GS-G1 힌지, 라마 상부 긴 힌지 영역, 및 G3 힌지의 링커로 이루어진 군으로부터 선택된다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 구조체, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 폴리펩타이드는 표 E-1 및 표 E-2의 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한 본 발명의 ISV 또는 폴리펩타이드를 포함하고 태그 또는 다른 기능적 모이어티, 예컨대, 독소, 표지, 방사화학물질 등을 추가로 포함하는 화합물, 구조체 및/또는 폴리펩타이드가 본 발명에 포함된다.
다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 예를 들어 화학적 기, 잔기, 모이어티일 수 있고, 이는 그 자체가 생물학적으로 및/또는 약리학적으로 활성이거나 활성이 아닐 수 있다. 예를 들어, 및 비제한적으로, 이러한 기는 본 발명의 폴리펩타이드 "유도체"를 제공하기 위해 본 발명의 하나 이상의 ISV 또는 폴리펩타이드에 연결될 수 있다.
따라서, 광의의 의미에서 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드의 유도체인 화합물, 구조체 및/또는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 유도체는 일반적으로 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 본 발명의 폴리펩타이드를 형성하는 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형, 및 특히 화학적 및/또는 생물학적(예컨대, 효소적) 변형에 의해 수득될 수 있다.
이러한 변형의 예뿐만 아니라 이러한 방식으로 변형될 수 있는(즉, 단백질 백본상에서, 그러나 바람직하게는 측쇄 상에서) 폴리펩타이드 서열 내의 아미노산 잔기, 이러한 변형을 도입하기 위해 사용될 수 있는 방법 및 기술 및 이러한 변형의 잠재적인 용도 및 장점의 예는 당업자에게 명백할 것이다(또한 Zangi et al., Nat Biotechnol 31(10):898-907, 2013 참고).
예를 들어, 이러한 변형은 본 발명의 폴리펩타이드 내로 또는 상으로 하나 이상의 (기능적) 기, 잔기 또는 모이어티, 및 특히 본 발명의 폴리펩타이드에게 하나 이상의 원하는 특성 또는 기능성을 부여하는 하나 이상의 작용기, 잔기 또는 모이어티의 도입(예컨대, 공유 연결에 의해 또는 임의의 다른 적합한 방식으로)을 포함할 수 있다. 이러한 작용기의 예는 당업자에게 명백할 것이다.
예를 들어, 이러한 변형은 본 발명의 폴리펩타이드의 반감기, 용해도 및/또는 흡수를 증가시키고, 본 발명의 폴리펩타이드의 면역원성 및/또는 독성을 감소시키고, 본 발명의 폴리펩타이드의 임의의 바람직하지 않은 부작용을 제거 또는 약화시키고/거나, 및/또는 본 발명의 폴리펩타이드에게 다른 유리한 특성을 부여하고/거나 본 발명의 폴리펩타이드의 원하지 않는 특성을 감소시키는 하나 이상의 작용기의 도입(예컨대, 공유 연결에 의해 또는 임의의 다른 적합한 방식으로); 또는 전술한 것의 둘 이상의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이를 도입하기 위한 이러한 작용기 및 기술의 예는 당업자에게 명백할 것이며, 일반적으로 상기 인용된 일반 배경 기술에 언급된 모든 작용기 및 기술뿐만 아니라 약학적 단백질의 변형을 위한, 및 특히 항체 또는 항체 단편(ScFv 및 단일 도메인 항체 포함)의 변형을 위한 자체 공지된 작용기 및 기술을 포함할 수 있고, 이를 위해 예를 들어 문헌[Remington(Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980)]을 참고한다. 이러한 작용기는, 당업자에게 또한 명백한 바와 같이, 예를 들어 본 발명의 폴리펩타이드에 직접(예를 들어 공유적으로), 또는 선택적으로 적합한 링커 또는 스페이서를 통해, 연결될 수 있다.
하나의 특정 예는 본 발명의 유도체 폴리펩타이드로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 이의 반감기를 증가시키기 위해 화학적으로 변형되었다(예를 들어, 페길화에 의해). 이것은 약학적 단백질의 반감기를 증가시키고/거나 면역원성을 감소시키기 위해 가장 널리 사용되는 기술 중 하나이며 적합한 약리학적으로 허용 가능한 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 또는 이의 유도체(예컨대 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 mPEG)의 부착을 포함한다. 일반적으로, 페길화의 임의의 적합한 형태, 예컨대 항체 및 항체 단편, 예컨대, (단일) 도메인 항체 및 ScFv를 위해 당업계에 사용되는 페길화가 사용될 수 있고; 예를 들어 문헌[Chapman(Nat. Biotechnol. 54: 531-545, 2002), Veronese 및 Harris(Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453-456, 2003), Harris 및 Chess(Nat. Rev. Drug. Discov. 2: 214-221, 2003)] 및 WO 제04/060965호를 참고한다. 단백질의 페길화를 위한 다양한 시약은 또한, 예를 들어 Nektar Therapeutics, USA로부터 상업적으로 이용가능하다.
바람직하게는, 부위 지향적 페길화가, 특히 시스테인 잔기를 통해 사용된다(예를 들어 Yang 등(Protein Engineering 16: 761-770, 2003 참고). 예를 들어, 이 목적을 위해, 당업자에게 자체 공지된 단백질 조작 기술을 사용하여, PEG가 본 발명의 폴리펩타이드에 자연적으로 존재하는 시스테인 잔기에 부착될 수 있거나, 본 발명의 폴리펩타이드가 PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 적합하게 도입하기 위해 변형될 수 있거나, 또는 PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 서열이 본 발명의 폴리펩타이드의 N- 및/또는 C-말단에 융합될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드의 경우, 5000 초과, 예컨대 10,000 초과 및 200,000 미만, 예컨대 100,000 미만; 예를 들어 20,000-80,000 범위의 분자량을 갖는 PEG가 사용된다.
또 다른, 일반적으로 덜 바람직한 변형은 본 발명의 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 사용된 숙주 세포에 따라, 일반적으로 공동 번역 및/또는 번역 후 변형의 일부로서, N-연결된 또는 O-연결된 글리코실화를 포함한다.
또 다른 변형은 본 발명의 표지된 폴리펩타이드의 의도된 용도에 따라, 하나 이상의 검출가능한 표지 또는 다른 신호 생성 기 또는 모이어티의 도입을 포함할 수 있다. 이들 부착, 사용 및 검출하기 위한 적합한 표지 및 기술은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어, 비제한적으로, 형광 표지(예컨대, 플루오레세인(fluorescein), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 피코에리트린(phycoerythrin), 피코시아닌(phycocyanin), 알로피코시아닌(allophycocyanin), o-프탈데하이드(o-phthaldehyde), 및 플루오레사민(fluorescamine) 및 형광 금속, 예컨대, 152Eu 또는 란탄족 시리즈로부터의 기타 금속), 인광 표지, 화학발광 표지 또는 생물발광 표지(예컨대, 루미날(luminal), 이소루미놀(isoluminol), 써로마틱 아크리디늄 에스테르(theromatic acridinium ester), 이미다졸, 아크리디늄 염, 옥살레이트 에스테르, 디옥세탄 또는 GFP 및 그의 유사체), 방사성 동위원소(예컨대 3H, 125I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36Cl, 57Co, 58Co, 59Fe, 및 75Se), 금속, 금속 킬레이트 또는 금속 양이온(예를 들어, 금속 양이온, 예컨대 99mTc, 123I, 111In, 131I, 97Ru, 67Cu, 67Ga, 및 68Ga 또는 생체내, 시험관내 또는 현장진단 및 이미징에 사용하기에 특히 적합한 다른 금속 또는 금속 양이온, 예컨대(157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, 및 56Fe)), 뿐만 아니라 발색단 및 효소(예컨대, 말레이트 탈수소효소(malate dehydrogenase), 스타필로코커스 뉴클레아제(staphylococcal nuclease), 델타-V-스테로이드 이소머라제(delta-V-steroid isomerase), 효모 알콜 탈수소효소(yeast alcohol dehydrogenase), 알파-글리세로포스페이트 탈수소효소(alpha-glycerophosphate dehydrogenase), 트리오스 포스페이트 이소머라제(triose phosphate isomerase), 바이오틴아비딘 퍼옥시다제(biotinavidin peroxidase), 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase), 아스파라지나제(asparaginase), 글루코스 옥시다제(glucose oxidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase), 리보뉴클레아제(ribonuclease), 우레아제(urease), 카탈라제(catalase), 글루코스-VI-포스페이트 탈수소효소(glucose-VI-phosphate dehydrogenase), 글루코아밀라제(glucoamylase) 및 아세틸콜린 에스테라제(acetylcholine esterase))를 포함할 것이다. 다른 적합한 표지는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 NMR 또는 ESR 분광학을 사용하여 검출될 수 있는 모이어티를 포함한다.
본 발명의 이러한 표지된 폴리펩타이드는 예를 들어 특정 표지의 선택에 따라, 시험관내, 생체내 또는 현장 분석(자체 공지된 면역분석, 예컨대 ELISA, RIA, EIA 및 다른 "샌드위치 분석" 등 포함) 뿐만 아니라 생체내 진단 및 이미징 목적을 위해 사용될 수 있다.
당업자에게 명백할 바와 같이, 또 다른 변형은, 예를 들어 상기 언급된 금속 또는 금속 양이온 중 하나를 킬레이트화하기 위해, 킬레이트기의 도입을 포함할 수 있다. 적합한 킬레이트 기는, 예를 들어, 비제한적으로, 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 포함한다.
또 다른 변형은 특정 결합 쌍, 예컨대 바이오틴-(스트렙트)아비딘 결합 쌍의 하나의 부분인 작용기의 도입을 포함할 수 있다. 이러한 작용기는 본 발명의 폴리펩타이드를, 즉 결합 쌍의 형성을 통해, 결합 쌍의 다른 절반에 결합된 또 다른 단백질, 폴리펩타이드 또는 화학적 화합물에 연결하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는 바이오틴에 접합되고, 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합된 또 다른 단백질, 폴리펩타이드, 화합물 또는 담체에 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이러한 접합된 폴리펩타이드는, 예를 들어 검출가능한 신호 생성제가 아비딘 또는 스트렙타비딘에 접합된 진단 시스템에서, 리포터로서 사용될 수 있다. 이러한 결합 쌍은 예를 들어 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 약학적 목적에 적합한 담체를 포함하는 담체에 결합시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cao and Suresh(Journal of Drug Targeting 8: 257, 2000)]에 의해 기재된 리포솜 제제를 참조한다. 이러한 결합 쌍은 또한 치료적 활성제를 본 발명의 폴리펩타이드에 연결하는 데 사용될 수 있다.
다른 잠재적인 화학적 및 효소적 변형은 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한 연구 목적을 위해(예컨대, 기능-활성 관계를 연구하기 위해) 도입될 수 있다. 예를 들어 문헌[Lundblad and Bradshaw(Biotechnol. Appl. Biochem. 26: 143-151, 1997)]을 참고한다.
바람직하게는, 화합물, 구조체, 폴리펩타이드 및/또는 유도체는 본원에 정의된 바와 같은(즉 본 발명의 폴리펩타이드에 대해 정의된 바와 같은) 친화도(본원에 추가로 기재된 바와 같이, KD-값(실제 또는 겉보기), KA-값(실제 또는 겉보기), kon-속도 및/또는 koff -속도로서, 또는 대안적으로 IC50 값으로서, 적합하게 측정 및/또는 표현된)로 아그레칸에 결합하는 것이다.
본 발명의 이러한 화합물, 구조체 및/또는 폴리펩타이드 및 이의 유도체는 또한 본질적으로 단리된 형태일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 ISV 또는 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되고, 선택적으로 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결된, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가로 포함하는, 본 발명의 구조체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 본 발명의 구조체에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 화합물, 구조체, 폴리펩타이드, 핵산, 숙주 세포, 및 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다가 폴리펩타이드는 일반적으로 본 발명의 다가 폴리펩타이드를 제공하기 위해 본 발명의 ISV 및/또는 1가 폴리펩타이드를 선택적으로 하나 이상의 적합한 링커를 통해 하나 이상의 추가 ISV에 적합하게 연결하는 단계를 적어도 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 일반적으로 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공하는 단계, 상기 핵산을 적합한 방식으로 발현시키는 단계, 및 본 발명의 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 적어도 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 자체 공지된 방식으로 수행될 수 있고, 이는, 예를 들어 본원에 추가로 기재된 방법 및 기술에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 다가 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 본 발명의 둘 이상의 ISV 및 예를 들어 하나 이상의 링커를 적합한 방식으로 연결하는 단계를 적어도 포함할 수 있다. 본 발명의 ISV(및 링커)는 당업계에 공지되고 본원에 추가로 기재된 바와 같은 임의의 방법에 의해 커플링될 수 있다. 바람직한 기술은 본 발명의 ISV(및 링커)를 코딩하는 핵산 서열을 연결하여 다가 폴리펩타이드를 발현하는 유전적 구조체를 제조하는 것을 포함한다. 아미노산 또는 핵산을 연결하기 위한 기술은 당업자에게 명백할 것이며, 표준 핸드북, 예컨대 상기 언급된 Sambrook 등 및 Ausubel 등뿐만 아니라 하기 실시예를 또한 참고한다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 다가 폴리펩타이드를 제조하는 데 있어서 본 발명의 ISV의 용도에 관한 것이다. 다가 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 본 발명의 ISV를 선택적으로 하나 이상의 링커를 통해 본 발명의 적어도 하나의 추가 ISV에 연결하는 것을 포함할 것이다. 이후, 본 발명의 ISV는 2개(예컨대, 2가 폴리펩타이드에서), 3개(예컨대, 3가 폴리펩타이드에서), 4개(예컨대, 4가에서) 또는 초과(예컨대, 다가 폴리펩타이드에서)의 빌딩 블록을 포함하는 다가 폴리펩타이드를 제공 및/또는 제조하는 데 있어서 결합 도메인 또는 빌딩 블록으로서 사용된다. 이와 관련하여, 본 발명의 ISV는 2, 3, 4개 이상의 빌딩 블록을 포함하는 본 발명의 다가, 예컨대 2가, 3가 또는 4가 폴리펩타이드를 제공 및/또는 제조하는 데 있어서 결합 도메인 또는 결합 단위로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 다가 폴리펩타이드를 제조하는 데 있어서 (본원에 기재된 바와 같은) 본 발명의 ISV 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 다가 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 본 발명의 ISV를, 선택적으로 하나 이상의 링커를 통해, 본 발명의 적어도 하나의 추가 ISV에 연결하는 것을 포함할 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 핵산은 본원의 추가 설명으로부터 당업자에게 명백한 바와 같이 자체 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는 항체의 제조를 위해 그리고 특히 항체 단편(비제한적으로 (단일) 도메인 항체 및 ScFv 단편 포함)의 제조를 위해 자체 공지된 임의의 방식으로 제조될 수 있다. 폴리펩타이드 및 핵산을 제조하기 위한 일부 바람직하지만 비제한적인 방법은 본원에 기재된 방법 및 기술을 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
- 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체(본원에서 "본 발명의 숙주"로도 지칭됨) 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서, 상기 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산(본원에서 "본 발명의 핵산"으로도 지칭됨)을 발현시키는 단계,
선택적으로 이후에:
- 상기 수득된 본 발명의 폴리펩타이드를 단리 및/또는 정제하는 단계.
특히, 이러한 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
- 상기 본 발명의 숙주가 본 발명의 적어도 하나의 폴리펩타이드를 발현하고/거나 생산하는 조건 하에 본 발명의 숙주를 배양 및/또는 유지하는 단계; 선택적으로 이후에:
- 상기 수득된 본 발명의 폴리펩타이드를 단리 및/또는 정제하는 단계.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드, ISV 또는 구조체를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오타이드 서열("본 발명의 핵산"으로도 지칭됨)에 관한 것이다.
본 발명의 핵산은 단일 또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA의 형태일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산은 본원에 정의된 바와 같은 본질적으로 단리된 형태이다. 본 발명의 핵산은 또한 벡터, 예컨대, 발현 벡터, 예컨대 플라스미드, 코스미드 또는 YAC의 형태이고, 그 안에 존재하고/거나 이의 일부일 수 있으며, 이는 또한 본질적으로 단리된 형태일 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 핵산은 본원에 제공된 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 정보에 기초하여, 자체 공지된 방식으로 제조되거나 수득될 수 있고/거나 적합한 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 또한, 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 핵산을 제조하기 위해, 또한 몇 개의 뉴클레오타이드 서열, 예컨대 본 발명의 ISV를 코딩하는 적어도 2개의 핵산 및 예를 들어 하나 이상의 링커를 코딩하는 핵산은 적합한 방식으로 연결될 수 있다. 본 발명의 핵산을 생성하는 기술은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어, 비제한적으로, 자동화된 DNA 합성; 부위 지향적 돌연변이생성; 둘 이상의 자연 발생 및/또는 합성 서열(또는 이의 둘 이상의 부분)을 조합하는 것, 절단된 발현 생성물의 발현을 유도하는 돌연변이의 도입; 하나 이상의 제한 부위의 도입(예컨대, 적합한 제한 효소를 사용하여 쉽게 소화되고/거나 결찰될 수 있는 카세트 및/또는 영역을 생성하기 위해), 및/또는 하나 이상의 "불일치된" 프라이머를 사용한 PCR 반응에 의한 돌연변이의 도입을 포함할 수 있다. 이들 및 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이며, 또한 표준 핸드북, 예컨대 상기 언급된 Sambrook 등 및 Ausubel 등뿐만 아니라 하기 실시예를 참고한다.
바람직하지만 비제한적인 구현예에서, 본 발명의 유전적 구조체는
b) 하나 이상의 조절 요소, 예컨대 프로모터 및 선택적으로 적합한 터미네이터에 작동 가능하게 연결된
a) 본 발명의 적어도 하나의 핵산; 및 선택적으로 또한
c) 자체 공지된 유전적 구조체의 하나 이상의 추가 요소
를 포함하고;
용어 "조절 요소", "프로모터", "터미네이터" 및 "작동 가능하게 연결된"은 당업계에서의 이들의 일반적인 의미를 갖는다.
본 발명의 유전적 구조체는 일반적으로, 예를 들어 일반 핸드북, 예컨대 상기 언급된 Sambrook 등 및 Ausubel 등에 기재된 기술을 사용하여, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열(들)을 상기 기재된 하나 이상의 추가의 요소에 적합하게 연결함으로써 제공될 수 있다.
본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 유전적 구조체는, 즉, 본 발명의 폴리펩타이드의 발현 및/또는 생산을 위해, 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 적합한 숙주 또는 숙주 세포는 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 임의의 적합한 진균, 원핵 또는 진핵 세포 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균, 원핵 또는(비인간) 진핵 유기체 뿐만 아니라 당업자에게 명백한 항체 및 항체 단편(비제한적으로 (단일) 도메인 항체 및 ScFv 단편 포함)의 발현 및 생산을 위해 자체 공지된 모든 다른 숙주 세포 또는(비인간) 숙주일 수 있다. 또한 상기 인용된 일반 배경 기술, 뿐만 아니라, 예를 들어, WO 제94/29457호; WO 제96/34103호; WO 제99/42077호; Frenken 등(Res Immunol. 149: 589-99, 1998); 상기 Riechmann 및 Muyldermans(1999); van der Linden(J. Biotechnol. 80: 261-70, 2000); Joosten 등(Microb. Cell Fact. 2: 1, 2003); Joosten 등(Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 384-92, 2005); 및 본원에 인용된 추가 참고문헌을 참고한다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 무세포 발현 시스템에서 발현 및/또는 생산될 수 있고, 이러한 시스템의 적합한 예는 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 숙주 또는 숙주 세포를 형질전환하기 위한 적합한 기술은 당업자에게 명백할 것이며, 사용될 의도된 숙주 세포/숙주 유기체 및 유전적 구조체에 좌우될 수 있다. 또한 상기 언급된 핸드북 및 특허 출원을 참고한다. 형질전환된 숙주 세포(이는 안정한 세포의 형태일 수 있음) 또는 숙주 유기체(안정한 돌연변이체 주 또는 균주의 형태일 수 있음)는 본 발명의 추가의 양태를 형성한다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산, 또는 본 발명에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 이들 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 본 발명의 폴리펩타이드(및 숙주 유기체의 경우: 이의 적어도 하나의 세포, 부분, 조직 또는 장기 내의)를 발현하거나 (적어도) 발현할 수 있는(예컨대, 적합한 조건 하에) 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 숙주 세포 또는 숙주 유기체의 추가 세대, 자손 및/또는 자식을 포함하며, 이는 예를 들어 세포 분열에 의해 또는 유성 또는 무성 생식에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 생성/수득하기 위해, 형질전환된 숙주 세포 또는 형질전환된 숙주 유기체는 일반적으로 본 발명의 (원하는) 폴리펩타이드가 발현/생산되는 조건 하에 유지되고/거나 배양될 수 있다. 적합한 조건은 당업자에게 명백할 것이며, 일반적으로 사용된 숙주 세포/숙주 유기체뿐만 아니라 본 발명의 (관련) 뉴클레오타이드 서열의 발현을 제어하는 조절 요소에 좌우될 것이다. 또한, 본 발명의 유전적 구조체의 단락에서 상기 언급된 핸드북 및 특허 출원을 참고한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 이후에 자체 공지된 단백질 단리 및/또는 정제 기술, 예컨대 (분취성) 크로마토그래피 및/또는 전기영동 기술, 분별 침전 기술, 친화도 기술(예컨대, 본 발명의 폴리펩타이드와 융합된 특정한 절단가능한 아미노산 서열을 사용하여) 및/또는 분취성 면역학적 기술(즉, 단리될 폴리펩타이드에 대한 항체를 사용하여)을 사용하여 숙주 세포/숙주 유기체로부터 및/또는 상기 숙주 세포 또는 숙주 유기체가 배양된 배지로부터 단리될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은: (a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서, 본 발명에 따른 핵산 서열을 발현시키는 단계; 선택적으로 이후에 (b) 본 발명에 따른 구조체, 폴리펩타이드 또는 ISV를 단리 및/또는 정제하는 단계를 적어도 포함하는, 본 발명에 따른 구조체, 폴리펩타이드 또는 ISV를 생산하는 방법에 관한 것이다.
일 양태에서 본 발명은 본 발명에 따른 구조체, 폴리펩타이드, ISV 또는 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일반적으로, 약학적 용도를 위해, 본 발명의 구조체, 폴리펩타이드 및/또는 ISVD는 본 발명의 적어도 하나의 구조체, 폴리펩타이드 및/또는 ISVD 및 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 보조제, 및 선택적으로 하나 이상의 약학적 활성 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 포함하는 약학적 제제 또는 조성물로서 제제화될 수 있다. 비제한적인 예로서, 이러한 제제는 경구 투여, 비경구 투여(예컨대, 정맥내, 근육내 또는 피하 주사 또는 정맥내 주입에 의해), 국소 투여(예컨대, 관절 내 투여), 흡입에 의한 투여, 피부 패치에 의한 투여, 임플란트에 의한 투여, 좌제에 의한 투여 등에 적합한 형태일 수 있고, 관절 내 투여가 바람직하다. 이러한 적합한 투여 형태 - 투여 방식에 따라 고체, 반고체 또는 액체일 수 있음 - 뿐만 아니라 이의 제조에 사용하기 위한 방법 및 담체는 당업자에게 명백할 것이며, 본원에 추가로 기재되어 있다. 이러한 약학적 제제 또는 조성물은 일반적으로 본원에서 "약학 조성물"로서 지칭될 것이다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 구조체, 적어도 하나의 본 발명의 폴리펩타이드, 적어도 하나의 본 발명의 ISV, 또는 적어도 하나의 본 발명의 핵산 및 적어도 하나의 적합한 담체, 희석제 또는 부형제(즉, 약학적 용도에 적합한), 및 선택적으로 하나 이상의 추가의 활성 물질을 적어도 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 구조체, 폴리펩타이드, ISV 또는 핵산, 바람직하게는 표 E-1 또는 표 E-2 중 적어도 하나 및 적어도 하나의 적합한 담체, 희석제 또는 부형제(즉, 약학적 용도에 적합한), 및 선택적으로 하나 이상의 추가의 활성 물질을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
일반적으로, 본 발명의 구조체, 폴리펩타이드, 및/또는 ISV는 자체 공지된 임의의 적합한 방식으로 제제화되고 투여될 수 있다. 예를 들어 상기 인용된 일반 배경 기술(및 특히 WO 제04/041862호, WO 제04/041863호, WO 제04/041865호, WO 제04/041867호 및 WO 제08/020079호) 뿐만 아니라 표준 핸드북, 예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005); 또는 Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007(예를 들어 252-255 페이지 참고)의 핸드북을 참고한다.
특정 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 구조체, 폴리펩타이드, ISV 또는 핵산을 포함하고, 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 보조제를 추가로 포함하며, 선택적으로 1종 이상의 추가의 약학적 활성 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 구조체, 폴리펩타이드, 및/또는 ISV는 종래의 항체 및 항체 단편(ScFv 및 디아바디 포함) 및 다른 약학적 활성 단백질을 위해 자체 공지된 임의의 방식으로 제제화되고 투여될 수 있다. 이러한 제제 및 이의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 비경구 투여(예컨대, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 관내(intraluminal), 동맥내 또는 척추강내 투여) 또는 국소(예컨대, 관절 내, 경피 또는 피내) 투여에 적합한 제제를 포함한다.
비경구 투여를 위한 제제는 예를 들어 주입 또는 주사에 적합한 멸균 용액, 현탁액, 분산액 또는 유화액일 수 있다. 이러한 제제를 위한 적합한 담체 또는 희석제는, 예를 들어 WO 제08/020079호의 143페이지에 언급된 것을 포함한다. 일반적으로, 수용액 또는 현탁액이 바람직할 것이다.
본 발명의 구조체, 폴리펩타이드, 및/또는 ISV는 또한 유전자 요법으로부터 공지된 전달 방법을 사용하여 투여될 수 있고, 예컨대, 그의 유전자 요법 전달 방법에 대해 참조로 포함된 미국 특허 제5,399,346호를 참고한다. 유전자 요법 전달 방법을 사용하여, 본 발명의 구조체, 폴리펩타이드, 및/또는 ISV를 코딩하는 유전자로 형질감염된 일차 세포는 특이적 장기, 조직, 이식편, 종양, 관절 또는 세포를 표적화하기 위해 조직 특이적 프로모터로 부가적으로 형질감염될 수 있고 하부세포 국소화된 발현을 위해 신호 및 안정화 서열로 부가적으로 형질감염될 수 있다.
본 발명의 구조체, 폴리펩타이드, 및/또는 ISV는 또한 주입 또는 주사에 의해 정맥내로, 관절 내로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 특정 예는 WO 제08/020079호의 144 및 145페이지에 또는 제PCT/EP2010/062975호(전체 문서)에 추가로 기재된 바와 같다.
본 발명의 구조체, 폴리펩타이드, 및/또는 ISV의 유용한 투여량은 동물 모델에서 이들의 시험관내 활성, 및 생체내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스, 및 다른 동물에서의 효과적인 투여량을 인간에 외삽(extrapolation)하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 US 제4,938,949호를 참고한다.
치료에 사용하는 데 필요한 본 발명의 구조체, 폴리펩타이드, 및/또는 ISV의 양은 선택된 특정 ISV, 폴리펩타이드, 화합물 및/또는 구조체뿐만 아니라 투여 경로, 치료되는 병태의 특성 및 환자의 연령 및 상태에 따라 달라질 것이며, 궁극적으로 담당 의사나 임상의의 재량에 따를 것이다. 또한 본 발명의 구조체, 폴리펩타이드, 및/또는 ISV의 투여량은 표적 세포, 종양, 관절, 조직, 이식편, 또는 장기에 따라 달라진다.
원하는 용량은 단일 용량으로 또는 예를 들어, 하루에 2, 3, 4개 이상의 하위 용량으로서 적절한 간격으로 투여되는 분할 용량으로서 간편하게 제공될 수 있다. 하위 용량 자체는, 예컨대, 다수의 분리된 느슨하게 이격된 투여로 추가 분할될 수 있다. 바람직하게는, 용량은 매주 1회 또는 훨씬 덜 빈번하게, 예컨대 2주에 1회, 3주에 1회, 매월 1회 또는 심지어 2개월에 1회 투여된다.
투여 요법은 장기 치료를 포함할 수 있다. "장기(long-term)"는 적어도 2주 및 바람직하게, 몇 주, 몇 개월, 또는 몇 년의 지속시간을 의미한다. 이 투여량 범위에서의 필요한 변형은 본원의 교시를 고려하여 일상적인 실험만을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(Martin, E.W., ed. 4th), Mack Publishing Co., Easton, PA]을 참고한다. 투여량은 또한 임의의 합병증의 경우 개별 의사에 의해 조정될 수 있다.
당업계는 골관절염과 같이 관절에 영향을 미치는 장애에 대한 보다 효과적인 요법이 필요하다. 관절 내로 투여되는 경우에도, 영향을 받은 연골을 치료하기 위한 대부분의 약물의 체류 시간은 충분하지 않다. 본 발명자들은 치료 약물의 효능이 관절에 약물을 "고정"시켜 약물의 보유를 증가시키지만 상기 치료 약물의 효능을 파괴하지 않는 모이어티("연골 고정 단백질" 또는 "CAP"로도 표시됨)에 치료 약물을 커플링시킴으로써 유의하게 증가될 수 있을 것으로 가설을 세웠다. 이 고정 개념은 약물의 효능을 증가시킬 뿐만 아니라 독성 및 부작용을 감소시킴으로써 병에 걸린 관절에 대한 작동 특이성을 증가시켜, 가능한 유용한 약물의 수를 넓힌다. 본 발명자들은 관절 내 연골에 영향을 미치는 다양한 장애에서 아그레칸이 심하게 글리코실화되고 분해됨에도 불구하고, 아그레칸 결합제가 이러한 앵커로서 잠재적으로 기능할 수 있다고 추가로 가설을 세웠다. 또한, 약물이 병원에 들어가기 전에 요구되는 다양한 동물 모델에서의 비용 및 광범위한 시험의 관점에서, 이러한 아그레칸 결합제는 우선적으로 광범위한 교차 반응성을 가져야 하며, 예컨대, 아그레칸 결합제는 다양한 종의 아그레칸에 결합해야 한다. 다양한 독창적인 면역화, 스크리닝 및 특성화 방법을 사용하여, 본 발명자들은 우수한 선택성, 안정성 및/또는 특이성 특징을 갖는 다수의 아그레칸 결합제를 확인할 수 있었고, 이는 관절에서 연장된 보유 및 활성을 가능하게 하였다.
일 양태에서 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물, 본 발명에 따른 ISV, 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 및/또는 본 발명에 따른 구조체에 관한 것이다.
일 양태에서 본 발명은 관절로부터 조성물, 폴리펩타이드 또는 구조체의 유출을 감소 및/또는 억제시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 적어도 하나의 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 구조체, 또는 본 발명에 따른 조성물의 약학적 유효량을 이를 필요로 하는 사람에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명에서, 용어 "유출을 감소 및/또는 억제시키는 것"은 관절 내에서 외부로 조성물, 폴리펩타이드 또는 구조체의 외향 흐름(outward flow)을 감소 및/또는 억제시키는 것을 의미한다. 바람직하게는, 유출은 본 발명의 아그레칸 결합제, 예컨대, 아그레칸에 결합하는 ISV(들)가 존재하지 않는 동일한 조건 하에 관절에서 전술한 조성물, 폴리펩타이드 또는 구조체의 유출과 비교하여, 적어도 10%, 예컨대 적어도 20%, 30%, 40% 또는 50% 또는 심지어 그 초과, 예컨대 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%로 감소 및/또는 억제된다.
본 발명의 아그레칸 결합제는 연골에 영향을 미치는 다양한 질환, 예컨대 관절증 및 연골이영양증, 관절염 질환, 예컨대 골관절염, 류마티스성 관절염, 통풍성 관절염, 건선성 관절염, 외상성 파열 또는 박리, 연골무형성증, 갈비연골염, 척추골단골간단이형성증, 추간판 탈출증, 요추간판 퇴행 질환, 퇴행성 관절 질환, 및 재발성 다발성연골염(본원에서 "아그레칸 관련 질환"으로 일반적으로 표시됨)에서 사용될 수 있는 것으로 예상된다.
일 양태에서, 본 발명은 아그레칸 관련 질환, 예컨대, 관절증 및 연골이영양증, 관절염 질환, 예컨대 골관절염, 류마티스성 관절염, 통풍성 관절염, 건선성 관절염, 외상성 파열 또는 박리, 연골무형성증, 갈비연골염, 척추골단골간단이형성증, 추간판 탈출증, 요추간판 퇴행 질환, 퇴행성 관절 질환, 및 재발성 다발성연골염을 예방 또는 치료하는 데 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물, ISV, 폴리펩타이드, 및/또는 구조체에 관한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 관절증 및 연골이영양증, 관절염 질환, 예컨대 골관절염, 류마티스성 관절염, 통풍성 관절염, 건선성 관절염, 외상성 파열 또는 박리, 연골무형성증, 갈비연골염, 척추골단골간단이형성증, 추간판 탈출증, 요추간판 퇴행 질환, 퇴행성 관절 질환, 및 재발성 다발성연골염을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명에 따른 적어도 조성물, ISV, 폴리펩타이드, 또는 구조체의 약학적 유효량을 이를 필요로 하는 사람에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 관절증 및 연골이영양증, 관절염 질환, 예컨대 골관절염, 류마티스성 관절염, 통풍성 관절염, 건선성 관절염, 외상성 파열 또는 박리, 연골무형성증, 갈비연골염, 척추골단골간단이형성증, 추간판 탈출증, 요추간판 퇴행 질환, 퇴행성 관절 질환, 및 재발성 다발성연골염을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 ISV, 폴리펩타이드, 조성물 또는 구조체의 용도에 관한 것이다.
아그레칸에 결합함으로써, 본 발명의 아그레칸 결합제는 아그레칸을 분해하는 데 있어서 세린프로테아제 패밀리의 구성원, 카텝신, 매트릭스 메탈로-프로테이나제(MMP)/매트릭신 또는 ADAMTS(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs), 바람직하게는 MMP8, MMP13, MMP19, MMP20, ADAMTS5(아그레카나제-2), ADAMTS4(아그레카나제-1) 및/또는 ADAMTS11의 활성을 감소시키거나 억제할 수 있을 것으로 예상된다.
따라서, 일 양태에서 본 발명은 아그레칸을 분해하는 데 있어서 세린프로테아제 패밀리의 구성원, 카텝신, 매트릭스 메탈로-프로테이나제(MMP)/매트릭신 또는 ADAMTS(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs), 바람직하게는 MMP8, MMP13, MMP19, MMP20, ADAMTS5(아그레카나제-2), ADAMTS4(아그레카나제-1) 및/또는 ADAMTS11의 활성을 감소시키거나 억제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명에 따른 적어도 ISV, 폴리펩타이드, 구조체 또는 조성물의 약학적 유효량을 이를 필요로 하는 사람에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "예방 및/또는 치료"는 질환을 예방 및/또는 치료하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 일반적으로 질환의 개시를 억제하는 것, 질환의 진행을 늦추거나 역전시키는 것, 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 개시를 예방하거나 늦추는 것, 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 감소시키고/거나 완화하는 것, 질환 및/또는 이와 관련된 임의의 증상의 중증도 및/또는 지속시간을 감소시키는 것 및/또는 질환 및/또는 이와 관련된 임의의 증상의 중증도의 추가 증가를 예방하는 것, 질환에 의해 유발된 임의의 생리학적 손상을 예방, 감소 또는 역전시키는 것, 및 일반적으로 치료되는 환자에게 유익한 임의의 약리학적 행위를 포함한다.
치료될 대상은 임의의 온혈 동물일 수 있지만, 특히 포유동물, 및 보다 특히 인간이다. 당업자에게 명백할 바와 같이, 치료될 대상은 특히 본원에 언급된 질환, 장애 및 병태를 겪고 있거나, 이의 위험에 있는 사람일 것이다.
일반적으로, 치료 요법은 본 발명의 하나 이상의 ISV, 폴리펩타이드, 화합물 및/또는 구조체, 또는 이를 포함하는 하나 이상의 조성물을 하나 이상의 약학적 유효량 또는 용량으로 투여하는 것을 포함할 것이다. 투여될 특정 양(들) 또는 용량은 또한 상기 인용된 인자에 기초하여 임상의에 의해 결정될 수 있다.
일반적으로, 치료될 특정 질환, 장애 또는 병태, 사용될 본 발명의 특정 ISV, 폴리펩타이드, 화합물 및/또는 구조체의 효능, 특정 투여 경로 및 사용된 특정 약학적 제제 또는 조성물에 따라, 임상의는 적합한 일일 용량을 결정할 수 있을 것이다.
일반적으로, 상기 방법에서, 본 발명의 ISV, 폴리펩타이드, 화합물 및/또는 구조체가 사용될 것이다. 그러나 본 발명의 둘 이상의 ISV, 폴리펩타이드 및/또는 구조체를 조합하여 사용하는 것은 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명의 ISV, 폴리펩타이드 및/또는 구조체는 1종 이상의 추가의 약학적 활성 화합물 또는 원리와 조합되어, 즉, 조합 치료 요법으로서 사용될 수 있고, 이는 상승적 효과를 야기하거나 야기하지 않을 수 있다.
또한, 임상의는 상기 인용된 인자 및 그의 전문적인 판단에 기초하여, 이러한 추가 화합물 또는 원리뿐만 아니라 적합한 조합 치료 요법을 선택할 수 있을 것이다.
특히, 본 발명의 ISV, 폴리펩타이드 및/또는 구조체는 본원에 인용된 질환, 장애 및 병태의 예방 및/또는 치료를 위해 사용되거나 사용될 수 있는 다른 약학적 활성 화합물 또는 원리와 조합되어 사용될 수 있고, 그 결과 상승적 효과가 수득되거나 수득되지 않을 수 있다. 이러한 화합물 및 원리뿐만 아니라 이를 투여하기 위한 경로, 방법 및 약학적 제제 또는 조성물의 예는 임상의에게 명백할 것이다.
둘 이상의 물질 또는 원리가 조합 치료 요법의 일부로서 사용되는 경우, 이들은 본질적으로 동일한 시간 또는 상이한 시간에(예컨대, 본질적으로 동시에, 연속적으로, 또는 교대 요법에 따라) 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 물질 또는 원리가 동일한 투여 경로를 통해 동시에 투여되는 경우, 이들은 당업자에게 명백한 바와 같이 상이한 약학적 제제 또는 조성물로서 또는 조합된 약학적 제제 또는 조성물의 부분으로서 투여될 수 있다.
또한, 둘 이상의 활성 물질 또는 원리가 조합된 치료 요법의 부분으로서 사용되는 경우, 각각의 물질 또는 원리는 화합물 또는 원리가 단독으로 사용될 때 사용된 것과 동일한 양 및 동일한 요법에 따라 투여될 수 있으며, 이러한 조합된 사용은 상승적 효과를 초래하거나 초래하지 않을 수 있다. 그러나, 둘 이상의 활성 물질 또는 원리의 조합된 사용이 상승적 효과를 초래하는 경우, 원하는 치료 작용을 여전히 달성하면서 투여되는 물질 또는 원리 중 하나 이상 또는 모두의 양을 감소시키는 것이 또한 가능할 수 있다. 이것은 예를 들어 원하는 약학적 또는 치료적 효과를 여전히 얻으면서 이들이 통상적인 양으로 사용될 때 하나 이상의 물질 또는 원리의 사용과 관련된 임의의 원치 않는 부작용을 피하거나, 제한하거나, 감소시키는데 유용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 치료 요법의 효과는, 임상의에게 명백한 바와 같이, 관련된 질환, 장애 또는 병태에 대해 자체 공지된 임의의 방식으로 결정되고/거나 계속될 수 있다. 임상의는 또한 적절한 경우 그리고 경우에 따라 원하는 치료 효과를 달성하기 위해, 원치 않는 부작용을 피하거나, 제한하거나, 감소시키기 위해, 및/또는 한편으로는 원하는 치료적 효과를 달성하는 것과 다른 한편으로는 원치 않는 부작용을 피하거나, 제한하거나, 감소시키는 것 사이에 적절한 균형을 달성하기 위해, 특정 치료 요법을 변경하거나 변형시킬 수 있을 것이다.
일반적으로, 치료 요법은 원하는 치료적 효과가 달성될 때까지 및/또는 원하는 치료적 효과가 유지되는 동안 계속될 것이다. 또한, 이것은 임상의에 의해 결정될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 적어도 아그레칸 관련 질환의 예방 및/또는 치료를 위한; 및/또는 본원에 언급된 하나 이상의 치료 방법에서 사용하기 위한 약학 조성물의 제조에 있어서 본 발명의 ISV, 폴리펩타이드, 화합물 및/ 구조체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 아그레칸을 조절함으로써, 예컨대, 아그레칸 분해를 억제함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조에 있어서 본 발명의 ISV, 폴리펩타이드, 화합물 및/또는 구조체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 ISV, 폴리펩타이드, 화합물 및/또는 구조체를 환자에게 투여함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환, 장애 또는 병태의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물에 제조에 있어서 본 발명의 ISV, 폴리펩타이드, 화합물 및/또는 구조체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 적어도 하나의 아그레칸 관련 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 ISV, 폴리펩타이드, 화합물 및/또는 구조체 또는 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
치료될 대상은 임의의 온혈 동물일 수 있지만, 특히 포유동물, 및 보다 특히 인간이다. 수의학 적용에서, 치료될 대상은 상업적 목적을 위해 사육되거나 애완동물로서 키워진 임의의 동물을 포함한다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 치료될 대상은 특히 본원에 언급된 질환, 장애 및 병태를 겪고 있거나 이의 위험에 있는 사람일 것이다.
또한, 이러한 약학 조성물에서, 본 발명의 하나 이상의 ISV, 폴리펩타이드, 화합물 및/또는 구조체, 또는 이를 코딩하는 뉴클레오타이드, 및/또는 이를 포함하는 약학 조성물은 또한 하나 이상의 다른 활성 원리, 예컨대 본원에 언급된 것과 적합하게 조합될 수 있다.
본 발명은 또한 시험관내에서(예컨대, 시험관내 또는 세포 분석에서) 또는 생체내에서(예컨대, 단일 세포 또는 다세포 유기체에서, 및 특히 포유동물에서, 및 보다 특히 인간, 예컨대 본 발명의 질환, 장애 또는 병태의 위험에 있거나 이를 겪고 있는 인간에서) 사용하기 위한 조성물(예컨대, 비제한적으로, 본원에 추가로 기재된 바와 같은 약학 조성물 또는 제제)에 관한 것이다.
치료에 관한 언급은 달리 명시적으로 나타내지 않는 한 확립된 증상의 치료 및 예방적 치료 모두를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
서열은 WIPO 표준 ST.25에 따라 설명의 본문 및 별도의 서열 목록에 개시되어 있다. 특정 번호로 지정된 서열번호는 설명의 본문 및 별도의 서열 목록에서 동일해야 한다. 예로서, 서열번호: 1은 설명의 본문 및 별도의 서열 목록 모두에서 동일한 서열을 정의해야 한다. 설명의 본문에서의 서열 정의 및 별도의 서열 목록 사이에 불일치가 있는 경우(예컨대, 설명의 본문의 서열번호: 1이 별도의 서열 목록의 서열번호: 2에 잘못 대응되는 경우), 출원에서의 특정 서열에 대한 언급, 특히 특정 구현예의 특정 서열에 대한 언급은, 별도의 서열 목록이 아니라 출원의 본문에서의 서열을 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 다시 말하면, 설명의 본문 및 서열 목록에서의 서열 정의/지정 사이의 불일치는 별도의 서열 목록을 설명, 실시예, 도면 및 청구범위를 포함하는 출원의 본문에 개시된 서열 및 이들의 지정으로 정정함으로써 해결된다.
본 발명은 다음의 비제한적인 바람직한 양태, 실시예 및 도면에 의해 추가로 설명될 것이다.
본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌(문헌 참조, 발행된 특허, 공개된 특허 출원, 및 공동 계류중인 특허 출원 포함)의 전체 내용은, 특히 상기 언급된 교시를 위해, 참고로 본원에 명시적으로 포함된다.
실시예
실시예
1
아그레칸을
이용한 라마의 면역화,
중쇄
단독 항체 단편 레퍼토리의 클로닝 및
파아지의
제조
본 발명자들은 OA의 동물 모델의 목적이 증상 및 질환 진행을 검출 및 조절할 기회를 확인하고 새로운 요법을 개발할 수 있도록 관절 손상의 규모 및 진행을 제어가능하게 재현하는 것임을 깨달았다. 이상적인 동물 모델은 상대적으로 비용이 낮으며, 단시간 내에 차이를 검출하기에 충분히 큰 크기의 효과를 갖는 재현가능한 질환 진행을 나타낸다. 모델이 말기 퇴행으로 너무 빠르게 진행되면, OA 병리생리학(pathophysiology)을 대표하는 중간 시점을 얻을 수 없고, 이 정보가 없으면, 잠재적인 개입의 미묘한 효과를 놓칠 수 있다. OA가 기계적 및 생화학적 과정의 결과인 말기 표현형임을 인식하여, 동물 모델은 이들 인자가 제어된 환경에서 연구될 수 있게 한다(Teeple et al. 2013 AAPS J. 15: 438-446 참고).
동물 모델의 최종 목표는 인간 질환을 재현하는 것이다(Cohen-Solal et al. 2013 Bonekey Rep. 2: 422 참고). 인간 OA에서의 프로파일의 이질성을 고려할 때, 많은 모델이 필요하다. 이들은 자발적이거나 유도된다. 이들 대부분은 노화, 기계적 스트레스(수술), 화학적 결함(효소) 또는 유전적 인자와 같은 OA의 발달에 유리한 하나의 인자에 초점을 맞춘다. 이들 모두는 중증도, 병변의 국소화 및 병인의 측면에서 상이하다. 그러나, OA를 발달시키는 모든 측면을 다루는 동물 모델은 없다.
따라서, 상이한 동물 모델뿐만 아니라 궁극적으로 인간 환자에서 유용하기 위해, CAP-결합제는 바람직하게는 광범위한 교차 반응성을 가지며, 예컨대, 둘 이상의 종의 아그레칸에 결합한다. 바람직하게는, 아그레칸 결합제는 인간 아그레칸뿐만 아니라 개 아그레칸, 소 아그레칸, 랫트 아그레칸, 돼지 아그레칸, 마우스 아그레칸, 토끼 아그레칸, 시노몰구스 아그레칸 및/또는 레서스 아그레칸 중 하나 이상에 결합한다.
더욱이, 본 발명자들은 아그레칸의 분해가 C-말단 영역 내에서 개시되는 것으로 보인다는 것을 깨달았다. G3 도메인이 없는 아그레칸 분자의 집단은 또한 노화에 따라 증가한다. 관절염과 관련된 연골 변성의 주요 특징은 G1 및 G2 도메인 사이의 구간(interglobular) 영역 내에서 단백질분해 절단으로 인한 아그레칸의 손실이다. 따라서, 바람직하게는, 아그레칸 결합제는 아그레칸의 N-말단 영역, 즉, CS 또는 G3 도메인 이외의 영역, 예컨대 G1-IGD-G2 영역, 또는 G1-도메인, IGD, 또는 G2 도메인에 결합한다. 가장 바람직하게는, 아그레칸 결합제는 연골세포 및 ECM에 존재하는 G1 도메인에 결합할 것이다.
1.1 면역화
5마리의 라마를 재조합(rec) 인간 아그레칸(G1-IGD-G2 도메인, R&D Systems # 1220-PG)(실시예 1.2 참고)으로 면역화시켰다. 항원 투여 후 혈청 샘플을 채취하고, 역가를 ELISA에 의해 인간 재조합 아그레칸 G1-IGD-G2에 대해 결정하였다. 모든 라마는 특정 혈청 역가를 생성하였다.
1.2 일차 스크리닝
RNA를 PBL(일차 혈액 림프구)로부터 추출하고 RT-PCR을 위한 주형으로 사용하여 ISV를 코딩하는 유전자 단편을 증폭시켰다. 이들 단편을 His6- 및 FLAG3-태그와 융합된 ISV를 디스플레이하는 파아지 입자의 생산을 가능하게 하는 파아지미드(phagemid) 벡터 pAX212 내로 클로닝하였다. 파아지를 표준 프로토콜(Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual 1st Edition, Brian K. Kay, Jill Winter, John McCafferty, Academic Press, 1996 참고)에 따라 제조하고 보관하였다.
파아지 디스플레이 선택을 5개의 면역 라이브러리 및 2개의 합성 ISV 라이브러리로 수행하였다. 라이브러리를 재조합 인간 및 (바이오틴-)랫트 아그레칸 G1-IGD-G2 도메인, 전장 추출된 소 아그레칸 또는 온전한 소 연골의 상이한 조합에 대해 2 내지 3회 농축시켰다. 선택 출력물로부터의 개별 클론을 ELISA에서 인간 G1-IGD-G2 도메인에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다(ISV를 발현하는 E. coli 세포로부터의 주변세포질 추출물을 사용하여). 542개의 ELISA-양성 클론의 시퀀싱은 144개의 고유한 ISV 서열을 확인하였다. ISV를 종 교차 반응성에 대해 평가하고 ELISA에 의해 개별 인간 G1, IGD 및 G2 도메인에의 결합에 대해 맵핑하였다. 몇몇 ISV만이 재조합 인간, 랫트, 개 및 소 아그레칸 G1-IGD-G2와 유사한 결합 수준을 나타내었다. 제한된 종 교차 반응성은 특히 G1 도메인 결합제에 대해 명백하였고, 이에 대해 특히 소 및 개 아그레칸에의 결합은 불량하였다. 더 많은 종 교차반응성 G1 도메인 결합 ISV를 확인하기 위해, 소 G1-IGD-G2, 개 G1-IGD-G2 및 인간 G1 도메인에 대한 파아지 디스플레이 선택을 수행하였다. 인간, 시노몰구스, 랫트, 개 및 소 G1-IGD-G2에의 결합에 대해 ELISA에서 스크리닝된 1245개의 클론 중에서, 15개의 신규한 종 교차반응성 ISV만이 확인되었고, 이중 9개가 G1-도메인에 맵핑될 수 있었다.
총 19개의 고유한 클론이 추가 특성화를 위한 '리드 패널(Lead panel)'로서 사용되었다. 이 리드 패널에 대한 도메인-맵핑 및 종 교차 반응성 데이터의 개요가 표 1.2에 제공되어 있다.
1.3 G1
결합제
G1-결합제의 CDR의 서열 가변성을 클론 114F08에 대해 결정하였다. 클론 114F08의 CDR의 아미노산 서열을 참조로서 사용하였고, 이에 대한 모든 다른 클론(G1-결합제)의 CDR을 비교하였고, 이는 하기 표 1.3A, 1.3B 및 1.3C에 도시되어 있다(CDR1은 카바트 위치 26에서 시작하고, CDR2는 카바트 위치 50에서 시작하며, CDR3은 카바트 위치 95에서 시작함).
표 1.3A
표 1.3B
표 1.3C
1.4 G1-
IGD
-G2 결합제
G1-IGD-G2(GIG) 결합제의 CDR의 서열 가변성을 클론 604F02에 대해 결정하였다. 클론 604F02의 CDR의 아미노산 서열을 참조로서 사용하였고, 이에 대한 모든 다른 클론(GIG 결합제)의 CDR을 비교하였고, 이는 하기 표 1.4A, 1.4B 및 1.4C에 도시되어 있다(CDR1은 카바트 위치 26에서 시작하고, CDR2는 카바트 위치 50에서 시작하며, CDR3은 카바트 위치 95에서 시작함).
표 1.4A
표 1.4B
표 1.4C
1.5 G2 결합제
G2-결합제의 CDR의 서열 가변성을 클론 601D02에 대해 결정하였다. 클론 601D02의 CDR의 아미노산 서열을 참조로서 사용하였고, 이에 대한 모든 다른 클론(G2 결합제)의 CDR을 비교하였고, 이는 하기 표 1.5A, 1.5B 및 1.5C에 도시되어 있다(CDR1은 카바트 위치 26에서 시작하고, CDR2는 카바트 위치 50에서 시작하며, CDR3은 카바트 위치 95에서 시작함).
표 1.5A
표 1.5B
표 1.5C
1.6
ISV의
서열 최적화
다양한 ISV를 서열 최적화 과정에 적용하였다. 서열 최적화는 모 ISV 서열이 돌연변이되는 과정이다. 이 과정은 ISV(i) 및 넉아웃 번역 후 변형(ii)뿐만 아니라 잠재적인 기존 항체에 대한 에피토프(iii)의 인간화를 포함한다.
(i) 인간화 목적을 위해, 모 ISV 서열은 돌연변이되어 인간 IGHV3-IGHJ 생식계열 공통(consensus) 서열과 더 동일한 ISV 서열을 생성한다. ISV 및 인간 IGHV3-IGHJ 생식계열 공통 사이의 상이한 프레임워크 영역(이른바 특징 잔기 제외) 내의 특정 아미노산은 단백질 구조, 활성 및 안정성이 온전하게 유지되는 방식으로 인간 대응물로 변경된다. 소수의 특징 잔기는 ISV의 안정성, 활성 및 친화도에 중요한 것으로 알려져 있으므로 돌연변이되지 않는다.
(ii) CDR에 존재하고 이에 대해 번역 후 변형(PTM)에 민감하다는 실험적 증거가 있는 아미노산은 단백질 구조, 활성 및 안정성은 온전하게 유지되면서 PTM 부위가 불활성화되는 방식으로 변경된다.
(iii) ISV의 서열은 단백질 구조, 활성 및 안정성에 영향을 미치지 않으면서 임의의 자연 발생 기존 항체의 결합을 최소화하고 치료-긴급 면역원성 반응을 유발할 가능성을 감소시키도록 최적화된다.
서열 최적화된 포맷된 ISV의 생성을 위해, 표준 프로토콜에 따라, ISV 빌딩을 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 태그가 없는 단백질로서 생산하고, 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 통해 정제한 후, 탈염시켰다.
다양한 서열 최적화된 포맷된 ISV가 표 A-1 및 A-2에 나타나 있다.
실시예
2 리드 패널(정제된
ISV
) -
아그레칸의
특성화
일차 스크리닝, ELISA를 통한 결합의 초기 평가, 오프-속도 및 종 교차 반응성의 결정 후, 리드 패널의 ISA를 추가 특성화에 적용하였다.
2.1 ALB26을 이용한 아그레칸 리드 패널 ( n=19)의 포맷팅
임상적 사용을 위한 분자의 최종 포맷은 1개 또는 2개의 아그레칸 결합 ISV("고정물질") 및 또한 치료 작용 방식을 갖는 1개, 2개 이상의 ISV 또는 다른 모이어티를 포함할 것으로 예상된다. 따라서, 19개의 선택된 클론을 1가 또는 2가 포맷으로 ALB26(CAP-ALB26 또는 ALB26-CAP-CAP)에 융합시키고, P. 파스토리스에서 발현시켰다. ALB26은 CDR1에 2개의 돌연변이를 갖는 ALB11(알부민 결합 ISV)의 변이체이며, 이는 상이한 종으로부터의 알부민에의 결합을 완전히 폐지한다. 아그레칸 결합제를 포함하는 최종 폴리펩타이드 포맷의 크기를 모방하기 위해 ALB26에의 융합을 수행하였다. 임의의 이론에 구속되지 않고, 본 발명자들은 pI가 연골 침투 및 보유에 영향을 미칠 수 있다는 가설을 세웠다. 음성 대조군, 또는 '더미(dummy)'로서, 2가 ALB26(C01010030)을 사용하였다.
2.2
생체외
소 연골 보유
연골 보유를 평가하기 위한 확립된 분석이 없으므로, 본 발명자들은 소 연골을 사용하는 신뢰할 수 있고 재현가능한 생체외 연골 보유 분석을 개발하였다.
소 뼈는 전형적으로 지역 도축장에서 수집하였다. 연골을 ~1 mm 두께 스트립으로 뼈를 잘라내고 생검 절단기(biopsy cutter)로 3 mm의 직경을 갖는 원형 디스크로 추가로 절단하였다. 연골 디스크를 신선한 연골로부터 우선적으로 채취하였다.
나노바디를 연골에 비교적 짧게 노출시킨 후(관절 내 주사시 예상될 수 있음), 연장된 기간 동안 연골에 보유될 ISV의 능력을 결정하였다. 분석은 전형적으로 3 mm 소 디스크(~10 mg 습윤 중량)의 생체외 연골을 10 μg/mL 나노바디(100 μL)와 밤새 배양한 후, 최대 5일 동안 세척하였다(PBS/0.1% BSA/0.1% NaN3/100 mM NaCl). 이후, 결합된(보유된) 나노바디를 SDS 함유 SDS-PAGE 샘플 방출액(LDS 샘플 방출액 Invitrogen)에서 연골로부터 방출시키고 웨스턴 블롯(WB)에 의해 분석하였다. 분석을 전형적으로 나노바디 샘플당 4개의 연골 디스크로 수행하였고; 2개의 디스크를 나노바디 배양 직후(t0)에 분석하여 결합된 나노바디의 초기 양을 결정하였고; 2개의 디스크를 세척 후(t1-5일)에 분석하였다. 보유 정도를 t1-5일 및 t0에 검출된 나노바디의 양의 비율로서 정의하였다. 분석의 처리량을 증가시키기 위해, 이 비율의 결정을 웨스턴 블롯의 육안 검사에 의해 수행하였고, 이는 0-6의 스코어를 생성하였으며, 여기서 0은 보유 안됨이고 6은 완전 보유이다.
결과의 요약이 표 2.2에 나타나 있다.
9개의 구조체는 연골에서 매우 잘 보유된 것으로 밝혀졌다(스코어 5-6). 이 '상위-9'는 재조합 G1, G2 또는 G1-IGD-G2 도메인 모두에 결합하는 아그레칸 결합 모이어티에 대한 1가 및 2가 구조체 모두를 포함하였다. 14개의 구조체는 중간 보유를 나타내었고(스코어 <5 내지 2), 5개의 구조체는 이 분석에서 검출가능하지만 낮은 보유를 나타내었다(스코어 <2 내지 1). 1개를 제외한 모든 아그레칸 구조체가 8 내지 9 초과 범위의 pI 값을 가지고 있었음에 주목한다.
2.3
에피토프
비닝
(binning)
에피토프-비닝을 위해, 정제된 ALB26-융합된 나노바디 구조체를 경쟁 ELISA에서 FLAG-태그와 융합된 나노바디의 동일한 세트에 대해 스크리닝하였다.
요약하면, 분석 설정은 다음과 같았다. 단클론 파아지 ELISA를 1 μM 정제된 나노바디(또는 5 μg/mL mAb)와 함께 또는 없이 파아지의 절반-포화 희석에서 배양하였다. 정제된 나노바디(또는 mAb)의 존재 및 부존재시의 450 nm에서의 흡광도 사이의 비율을 사용하여 나노바디가 오버랩핑 또는 비오버랩핑 에피토프를 인식하였는지 여부를 결정하였다.
생성된 에피토프 빈이 표 2.2(상기)에 나타나 있다. 에피토프 빈 2 및 3에서의 구조체(G1-도메인 상)는 생체외 소 연골 보유 분석에서 낮은 연골 보유 스코어(0-1)를 가지고 있었다. 그러나, ELISA 및 소 연골 보유에 의해 측정할 때 소 아그레칸 G1-IGD-G2에의 결합 사이에는 직접적인 상관관계가 없는 것으로 보인다. 임의의 이론에 구속되지 않으면서, 본 발명자들은 이들 에피토프가 천연 연골 조직에서 쉽게 접근가능하지 않을 수 있다고 가설을 세웠다.
빈에 속하는 클론의 CDR의 서열 가변성이 아래와 위에 도시되어 있다(즉, 참조 화합물로서 604F02을 갖는 빈 8; 표 1.4A-C).
114F08에 대한 에피토프 빈 4의 G1-결합제의 서열 가변성이 하기 표 2.3A, 2.3B 및 2.3C에 도시되어 있다. 클론 114F08의 CDR의 아미노산 서열을 참조로서 사용하였고, 이에 대해 모든 다른 클론(에피토프 빈 4 결합제)의 CDR을 비교하였다(CDR1은 카바트 위치 26에서 시작하고, CDR2는 카바트 위치 50에서 시작하며, CDR3은 카바트 위치 95에서 시작함).
표 2.3A(114F08)
표 2.3B(114F08)
표 2.3C(114F08)
608A05에 대한 에피토프 빈 1의 G1-결합제의 서열 가변성이 하기 표 2.3D, 2.3E 및 2.3F에 도시되어 있다. 클론 608A05의 CDR의 아미노산 서열을 참조로서 사용하였고, 이에 대해 모든 다른 클론(에피토프 빈 1 결합제)의 CDR을 비교하였다(CDR1은 카바트 위치 26에서 시작하고, CDR2는 카바트 위치 50에서 시작하며, CDR3은 카바트 위치 95에서 시작함).
표 2.3D(608A05)
표 2.3E(608A05)
표 2.3F(608A05)
2.4 결합 특징 - ELISA 및
SPR
생체외 소 연골 보유 및 에피토프 비닝 데이터에 기초하여, 상이한 에피토프 빈으로부터의 일부 예시적인 구조체를 추가 특성화를 위해 선택하였다. G2-도메인에 대한 결합제는 이전에 규정된 이유로 인해 이 단계에서는 추가 특성화로부터 제외하였다.
선택된 구조체를 ELISA에서 인간, 시노몰구스, 랫트, 개 및 소 아그레칸으로부터의 재조합 G1-IGD-G2 영역에 대해 특성화하여 이들의 종 교차 반응성을 결정하였고, 재조합 인간 뉴로칸 및 브레비칸에 대해 특성화하여 선택성을 결정하였다. 결정된 EC50 값이 표 2.4A에 열거되어 있다.
오프-속도를 결정하기 위해 SPR(ProteOn) 실험을 "1가" 아그레칸-ALB26 포맷에 대해 수행하였다. 나노바디와 아그레칸 표면과의 상호작용은 이질적인 것으로 나타났다. 이질성은 재결합 사건, 고정된 아그레칸의 이종 집단 및/또는 이종 글리코실화 패턴 때문일 수 있다. 결과적으로, 계산된 오프-속도만이 나타난다. 전반적으로, 해리 동역학은 나노바디를 포함하는 아그레칸에 대해 빠른 것으로 보인다(표 2.4B).
실시예
3 1가
리드 구조체 -
아그레칸의
생물물리학적 특성화
모든 선택된 구조체가 조합 여부에 관계없이 다양한 유리한 특징을 입증하였으므로, ISV 114F08 및 604F02 및 이들의 상응하는 ALB26-포맷(C010100054, -118 및 -094)을 추가 특성화를 위한 리드 패널을 나타내는 예시적인 구조체로서 사용하였다.
3.1 E.
콜리
및 P.
파스토리스에서
1가 114F08 및
604F02의
발현
생물물리학적 특성화를 위해, 1가 나노바디 114F08 및 604F02를 E. 콜리 및/또는 P. 파스토리스에서 FLAG3-His6-태그를 이용하여 발현시키고 표준 프로토콜(예컨대, Maussang et al. 2013 J Biol Chem 288(41): 29562-72)에 따라 정제하였다.
3.2 114F08 및
604F02의
pI
,
Tm
및 분석적 SEC
열 이동 분석(Thermal shift assy, TSA)을 위해, 5 μL 정제된 1가 나노바디(800 μg/ml)를 10 μL 완충액(3.5 내지 9 범위의 상이한 pH로 완충된, 100 mM 포스페이트, 100 mM 보레이트, 100 mM 시트레이트, 115 mM NaCl)에서 5 μL의 형광 프로브 사이프로 오렌지(Sypro Orange)(Invitrogen, S6551)(최종 농도 10 x)와 함께 배양하였다. 샘플을 LightCycler 480II 기계(Roche)에서, 4.4℃/초의 속도로 37에서 99℃까지 가열한 후, 0.03℃/초의 속도로 37℃로 냉각시켰다. 열 유도 언폴딩(heat-induced unfolding)시, 단백질의 소수성 패치가 노출되고, 여기에 사이프로 오렌지가 결합하여 형광 강도를 증가시킨다(Ex/Em = 465/580 nm). 형광 강도 곡선의 1차 미분의 변곡점은 본질적으로 문헌[Ericsson et al. 2006(Anals of Biochemistry, 357: 289-298)]에 따라 용융 온도(Tm)의 척도로서 작용한다.
분석적 크기 배제 크로마토그래피(Analytical SEC) 실험을 이동상으로서 10 mM 포스페이트, 300 mM Arg-HCl, pH 6.0을 사용하여 Biosep-SEC-3(Agilent) 컬럼과 조합된 Ultimate 3000 기계(Dionex)에서 수행하였다. 8 μg의 나노바디 샘플(d-PBS에서 0.5 mg/mL)을 주입하였다.
2개의 아그레칸 ISV의 등전점은 비교적 염기성이다. 서열은 표 A-1)에 나타나 있다. 용융 온도는 114F08의 경우 61.0℃이고 604F02의 경우 70.0℃인 것으로 결정되었다. 클론 중 어느 것도 분석적 SEC에 의해 결정된 바와 같이 응집 또는 다량체화의 징후를 나타내지 않았다.
따라서, 긍정적인 기능적 특성 다음으로, ISV는 유리한 생물물리학적 특성을 입증한다.
3.3 114F08
패밀리
구성원
114F08의 패밀리 구성원의 CDR의 서열 가변성이 하기 표 3.3A, 3.3B 및 3.3C에 도시되어 있다. 클론 114F08의 CDR의 아미노산 서열을 참조로서 사용하였고, 이에 대해 모든 다른 클론(114F08 패밀리 구성원)의 CDR을 비교하였다(CDR1은 카바트 위치 26에서 시작하고, CDR2는 카바트 위치 50에서 시작하며, CDR3은 카바트 위치 95에서 시작함).
표 3.3A
표 3.3B
표 3.3C
실시예
4 다양한 종의 연골에 대한
생체외
결합
예시적인 CAP 포함 폴리펩타이드(본원에서 "CAP 포함 구조체" 또는 "구조체"로도 지칭됨)는 소 생체외 연골 보유 분석에서 재조합/추출된 인간 단백질 및 소 연골에 결합하는 것으로 나타났다. 이러한 예시적인 CAP 포함 구조체가 또한 다른 종으로부터의 연골에 결합한다는 것을 입증하기 위해, 소 연골로 상기 시작된 실험을 본질적으로 인간 연골 및 랫트 연골로 반복하였다.
4.1
생체외
인간 연골에의 결합
예시적인 CAP 포함 구조체가 또한 인간 연골에 결합한다는 것을 확인하기 위해, 선택된 구조체를 냉동된 인간 연골 칩(chip)을 사용하여 생체외 연골 결합 분석에서 시험하였다. 결합을 30분 세척 후에 웨스턴 블롯에 의해 결정하였다.
결과가 표 4.1에 요약되어 있다.
모든 구조체는 더미 구조체보다 인간 연골에 더 잘 결합한 것으로 밝혀졌다.
4.2
생체외
랫트
연골에의 결합
랫트 생체내 모델에서 구조체의 시험을 용이하게 하기 위해, 랫트 연골에의 결합을 평가하였다. 따라서, 분석을 온전한 연골을 갖는 랫트의 대퇴골(femur)을 사용하여 설정하였다. 예시적인 구조체 C010100054, -118, 및 -094를 랫트 연골과 밤새 배양한 다음, 30분 세척하고, 결합된 구조체를 방출시킨 후, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
결과가 표 4.2에 나타나 있다.
시험된 모든 구조체는 랫트 연골에 잘 결합하는 것으로 나타났다.
실시예
5 조직 특이성
본 발명의 구조체가 시험관내 및 생체외 모두에서 아그레칸에 특이적으로 결합한다는 것이 상기에서 입증되었다. 또한, 이들 구조체는 또한 관절 내의 다른 조직에는 결합하지 않거나 거의 결합하지 않으면서, 바람직하게는 관절의 연골에 결합해야 한다.
활막, 힘줄, 근외막 및 반월상 연골에 대한 예시적인 CAP 포함 구조체의 결합을 생체외 연골 결합 분석과 동일한 설정을 사용하여 평가하였다. 구조체와 밤새 배양한 후 조직의 간단한 세척(30분) 후에 구조체 방출 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
결과가 표 5에 요약되어 있다.
결과는 CAP 결합제가 관절에서 발견되는 다른 조직보다 반월상 연골을 포함하는 연골 조직에 대해 우선적인 결합을 나타낸다는 것으로 보여준다.
실시예
6 소
활액에서의
나노바디
안정성
환자 편의성 및 안전성을 포함하는 다양한 이유로, 구조체는 활막에서 더 오랫동안 안정한 상태를 유지되는 것이 바람직하다.
따라서, 활액(SF)에서의 예시적인 ALB26-융합된 CAP 구조체의 안정성을 37℃에서 최대 7일 동안 비관절염 소 SF에서 구조체를 배양함으로써 평가하였다.
결과가 표 6에 요약되어 있다.
임의의 구조체의 분해가 검출되지 않았다.
실시예
7 IL-
1α
-자극된 외식 연골에서의 보유
이 시점까지, CAP 포함 나노바디의 연골 결합 및 보유를 다루는 모든 실험은 건강한(비관절염) 생체외 연골에서 수행되었다. 관절염 연골은 분해된 콜라겐 및 아그레칸을 특징으로 한다. 따라서, 이들 단백질의 분해가 발생한 연골에서 아그레칸-결합제의 결합 및 보유를 평가하는 것이 적합하다. 이를 위해, 분해를 유도하기 위해 연골이 자극된 연골 외식 분석에서 예시적인 ALB26-융합된 CAP 구조체를 시험하였다.
요약하면, 예시적인 CAP 포함 구조체를 IL-1α 및 온코스타틴 M과 함께 또는 없이 배양된 소 연골 외식편과 함께 밤새(ON) 배양한 후, 매일 배지를 교환(세척)하면서 5일간 배양하였다. IL-1α 및 온코스타틴 M은 주로 실험 6일 이내에 분해를 유도한다. 연골 외식편을 WB에 의해 구조체 결합 및 보유에 대해 분석하였다. 2개의 독립적인 실험을 수행하였다(실험 A 및 실험 B).
웨스턴 블롯의 결과가 표 7.1에 도시되어 있다.
자극된 연골 외식편에서 CAP 포함 구조체 보유의 결과가 표 7.2에 요약되어 있다.
결과는 구조체 C01010054("054" 또는 "54") 및 C01010045("045" 또는 "45")가 비자극된 연골과 비교하여 5일의 세척 후 자극된 연골에서 감소된 보유를 갖는 반면, 구조체 C01010118("118") 및 C01010094("094" 또는 "94")는 자극에 대해 거의 민감성을 나타내지 않았음을 보여준다.
또한, G2 아그레칸 도메인에 대한 결합(C01010045에 의해 예시된 바와 같음)은 다른 도메인에 대한 결합보다 더 감소된 것으로 보이며, 이는 아그레칸 분해가 C-말단으로부터 진행된다는 가설과 일치할 것이다.
실시예
8
ADAMTS5
-CAP GAG-방출 분석
연골 조직에서 프로테아제 억제 나노바디의 효능에 대한 연골 고정 모이어티 CAP의 가능한 영향을 다루기 위해, 예시적인 CAP 구조체를 ISV를 차단하는 ADAMTS5(ATS5)와 융합하고 GAG(글리코사미노글리칸)-방출 연골 외식편 분석에서 시험하였다.
GAG-방출 연골 외식편 분석에서 구조체를 시험하기 전에, 시험관내 연골 결합 및 ADAMTS5 억제 특성을 확인하였다. 후자의 경우, ADAMTS5 ISV의 효소 차단 기능이 시험관내의 임의의 CAP-융합 구조체에서 손상되지 않았음을 나타내는 효소적 펩타이드 분석을 수행하였다.
GAG-방출 분석에서, 소 연골 외식편을 IL-1α 및 온코스타틴 M(ADAMTS5의 유도를 위해) 및 구조체의 용량 범위의 존재하에 5일 동안 배양한 후, 배양 상층액에서 방출된 GAG 함량을 정량하였다.
시험된 구조체 및 GAG-방출 분석의 결과가 표 8에 요약되어 있다.
결과는 ADAMTS5 억제제에 고정 암(CAP-ISV 구조체)을 부가하는 것이 여전히 GAG-방출의 효율적인 억제를 허용하였음을 보여준다.
실시예
9 CAP-구조체의
생체내
바이오이미징
예시적인 아그레칸 CAP 구조체의 시험관내 및 생체외 특성화와 병행하여, 보유 특성을 확인하기 위해 몇 가지 ALB26-융합 구조체에 대해 생체내 생체분포(in vivo bio-distribution)를 결정하였다.
9.1
ALB26
-CAP 구조체의 생체분포 연구
나노바디를 125I(125I-SIB의 라이신 커플링을 통해)로 표지하였다. 구조체를 건강한 랫트의 무릎 관절에 주사하였다. 주사 후 최대 4주 동안 상이한 시점에 관절의 자기방사법(autoradiography) 이미지를 생성하였다. 이들 이미지는 생체내 환경에서 구조체의 보유 및 조직(연골) 특이성을 평가하게 해 주었다.
대표적인 이미지가 도 1에 나타나 있다.
결과로부터, 모든 구조체가 연골에 특이적인 결합을 나타낸 것으로 결론 내릴 수 있다. '1가' 및 '2가' 아그레칸 결합제 모두에 대해 명확한 염색이 - 주사 후 4주에도 - 관찰되었다.
9.2
ALB26
-CAP 구조체의
MARG
상기 기재된 생체분포 연구(실시예 9.1)는 ALB26-CAP 구조체의 연골에서의 특이적인 보유를 입증하였다. 그러나, 이미지의 해상도가 연골 내로의 침투 깊이의 조사를 허용하지 않았다. 이미징의 해상도를 높여 연골 내로의 침투를 평가할 수 있도록, MARG(Micro-Auto-Radio-Graphy)를 사용하였다.
연구된 예시적인 구조체가 표 9.2A에 열거되어 있다. 이 연구를 위해, 나노바디를 3H으로 표지하고(3H-NSP(N-석신이미딜 프로피오네이트)의 라이신 커플링을 통해), 그룹당 8마리의 랫트로, 건강한 랫트 관절 및 골관절염(전방십자인대(anterior cruciate ligament)의 절단을 통해 외과적으로 유도됨) 랫트 관절 내로 주사하였다. 주사 후 7 내지 14일에, 랫트를 희생시키고, 주사된 건강한 관절 및 OA 유도된 관절을 MARG를 위해 처리하였다.
대표적인 MARG 이미지가 도 2에 나타나 있다.
모든 아그레칸 결합제는 일반적으로 건강한 연골 내로의 침투를 나타내었다. 구조체 626은 때때로 또한 표면 상에 약간 더 강한 염색을 나타내었다. 수술받은 무릎에서 다양한 정도의 연골 염색 및 침투가 관찰되었다: 1가 구조체 054에서는 염색이 관찰되지 않았고; 1가 구조체 094에서는 염색이 존재하지 않거나 약한 반면, 2가 구조체 626은 비록 다양한 침투 깊이를 갖긴 했지만 다소 더 일관된 염색을 야기하였다(표 9.2B 참고)
실시예
10
생체내
랫트
MMT
DMOAD는
통계적 유의한 효과를
입증하였다
본 발명의 CAP 결합제의 생체내 효능을 추가로 입증하기 위해, 랫트에서 외과적으로 유도된 내측 반월상 연골 파열(Medial Meniscal Tear, MMT) 모델을 사용하였다. 요약하면, 본 발명의 CAP 결합제를 항-MMP13 ISV("0754" 또는 "C010100754"로 지정됨) 또는 항-ADAMTS5 ISV("0954" 또는 "C010100954"로 지정됨)에 커플링하였다. 랫트를 한쪽 무릎에서 수술하여 OA 유사 증상을 유도하였다. 수술 후 3일에 IA 주사에 의해 치료를 시작하였다. 조직병리학을 수술 후 42일에 수행하였다. 탐색적 바이오마커 분석을 위해 중간 및 말기 혈청 샘플을 취하였다. 내측 및 총 실질적인 연골 변성 폭뿐만 아니라 연골 변성의 백분율 감소를 결정하였다. 그룹당 20마리의 동물을 사용하였다.
내측 경골(medial tibia)에서의 나노바디에 의한 연골 분해의 억제가 도 3에 나타나 있다.
결과는 연골 폭이 비히클과 비교하여 42일 후 ADAMTS5-CAP 구조체 및 MMP13-CAP 구조체에 의해 실질적으로 감소되었음을 입증한다. 이러한 결과는 CAP-모이어티가 (a) 항-MMP13 ISV(0754) 또는 항-ADAMTS5 ISV(0954)의 활성에 부정적인 영향을 미치지 않으며; (b) 관절에서 연장된 시간 연장 동안 이들 구조체의 보유를 가능하게 한다는 것을 시사한다.
실시예
11 건강한
랫트
및 골관절염
랫트에서
CAP 결합제의 보유는
생체내에서
유사하다
건강한 랫트에서의 연골 보유 연구에서 본 발명의 폴리펩타이드가 관절 내(I.A.) 주사 후 최대 112일까지 연골에서 측정될 수 있음이 입증되었다(데이터는 나타내지 않음). 연골 조성물은 전신 순환에서 연골 결합 및 흡수에 영향을 미칠 수 있으므로, 본 발명의 폴리펩타이드의 약동학을 시간에 따른 폴리펩타이드의 혈청 수준에 따라 생체내에서 병에 걸린 골관절염 랫트 및 건강한 랫트에서 비교하였다.
특히, 랫트에서 외과적으로 유도된 내측 반월상 연골 파열(MMT) 모델을 일부 변형하여 실시예 10에 기재된 바와 같이 사용하였다. 요약하면, 본 발명의 폴리펩타이드를 항-MMP13 ISV 및 항-ADAMTS5 ISV에 커플링시켜, MMP13-ADAMTS5-CAP-CAP 구조체("0949" 또는 "C010100949" 나노바디로 지정됨)를 생성하였다. 랫트를 한쪽 무릎에서 수술하여 OA 유사 증상을 유도하였다(OA-군). 각 치료군(건강한 및 OA)은 15마리의 동물로 구성되었고, 7일(건강한) 또는 수술 후 7일(MMT)에 400 μg/30μl 나노바디의 단일 I.A. 주사를 받았다. 혈청 샘플을 0일, 7일(0시간 = 투여전 샘플), 8일(최대 24시간까지 치료 후 상이한 시간에), 9일(치료 후 48시간), 10일(치료 후 3일), 4일(치료 후 7일), 21일(치료 후 14일) 및 42일(치료 후 35일)에 마취된 랫트로부터 수집하였다. 수집된 혈청 샘플을 전기화학발광(ECL) 기반의 총 PK 분석 포맷 후 비구획 분석에서 폴리펩타이드 농도를 결정하는 데 사용하였다.
건강한 랫트 및 OA 랫트의 혈청에서의 폴리펩타이드의 보유가 도 4에 나타나 있다.
결과는 건강한 랫트 및 OA 랫트에서 폴리펩타이드의 혈청 농도에서 명백한 차이가 관찰될 수 없다는 것을 입증한다. 이들 결과는 연골 분해가 본 발명의 폴리펩타이드의 약동학에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.
표 A-
1: 1가
아그레칸
결합제의 아미노산 서열("ID"는 본원에 사용된 서열번호를 지칭함)
표 A-2:
CDR
및
프레임워크에
대한 서열, 및 식 1에 제공된 바람직한 조합, 즉 FR1-
CDR1
-FR2-
CDR2
-FR3-
CDR3
-FR4(하기 용어: "ID"는 주어진 서열번호를 지칭함)
표 B: 다양한 종으로부터의
아그레칸
서열 및 기타("ID"는 본원에 사용된 서열번호를 지칭함)
표 C: 혈청 알부민 결합
ISV
서열("ID"는 본원에 사용된 서열번호를 지칭함)
표 D: 링커 서열("ID"는 본원에 사용된 서열번호를 지칭함)
표 E-1: 표시된 치료적
ISV
및 표시된 아그레칸 결합
ISV를
포함하는
폴리펩타이드
/구조체
표 E-2
표시된 치료적
ISV
및 표시된 2개의 아그레칸 결합
ISV를
포함하는 폴리펩타이드/구조체
SEQUENCE LISTING
<110> Ablynx NV
<120> Aggrecan binding Immunoglobulins
<130> 206 379
<150> US 62/514,180
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<160> 172
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nanobody Sequence
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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50 55 60
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<223> Nanobody Sequence
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FR3
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Ser Gly Val Gly Glu Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Arg Glu Gly
1175 1180 1185
Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro
1190 1195 1200
Ser Gly Glu Gly Pro Glu Ala Phe Ala Ser Gly Val Glu Asp Leu
1205 1210 1215
Ser Ile Leu Pro Ser Gly Glu Gly Pro Glu Ala Ser Ala Ser Gly
1220 1225 1230
Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Arg Glu Gly Leu Glu
1235 1240 1245
Thr Ser Thr Ser Gly Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly
1250 1255 1260
Arg Glu Gly Leu Glu Thr Ser Thr Ser Gly Val Gly Asp Leu Ser
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Gly Leu Pro Ser Gly Glu Gly Pro Glu Ala Ser Ala Ser Gly Ile
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Gly Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Arg Glu Gly Leu Glu Thr
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Ser Ser Ser Gly Val Glu Asp His Pro Glu Thr Ser Ala Ser Gly
1310 1315 1320
Val Glu Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Val Glu Gly His Pro
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Glu Thr Ser Ala Ser Gly Val Glu Asp Leu Ser Asp Leu Ser Ser
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Gly Gly Glu Gly Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Ala Glu Asp Leu
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Ser Gly Phe Pro Ser Gly Lys Glu Asp Leu Ile Gly Ser Ala Ser
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Gly Ala Leu Asp Phe Gly Arg Ile Pro Ser Gly Thr Leu Gly Ser
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Glu Tyr Ser Gly Val Asp Phe Gly Ser Gly Pro Ile Ser Gly Leu
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Pro Asp Phe Ser Gly Leu Pro Ser Gly Phe Pro Thr Ile Ser Leu
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Val Asp Thr Thr Leu Val Glu Val Ile Thr Thr Thr Ser Ala Ser
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Glu Leu Glu Gly Arg Gly Thr Ile Gly Ile Ser Gly Ala Gly Glu
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Thr Ser Gly Leu Pro Val Ser Glu Leu Asp Ile Ser Gly Ala Val
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Ser Gly Leu Pro Ser Gly Ala Glu Leu Ser Gly Gln Ala Ser Gly
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Gly Gln Pro Ser Gly Phe Pro Asp Ile Ser Gly Gly Thr Ser Gly
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Leu Phe Glu Val Ser Gly Gln Pro Ser Gly Phe Ser Gly Glu Thr
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Ser Gly Val Thr Glu Leu Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Gln Pro Asp
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Val Ser Gly Glu Ala Ser Gly Val Pro Ser Gly Ser Gly Gln Pro
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Ser Gly Ile Pro Asp Leu Val Ser Ser Thr Met Ser Gly Ser Gly
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Glu Ser Ser Gly Ile Thr Phe Val Asp Thr Ser Leu Val Glu Val
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Thr Pro Thr Thr Phe Lys Glu Lys Lys Arg Leu Gly Ser Val Glu
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Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Asp Leu Ser Gly Ala Ser
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Ala Asp Val Glu Gly Ala Ser Gly Leu Gly Val Ser Gly Gly Thr
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Ser Ala Phe Pro Glu Ala Pro Arg Glu Gly Ser Ala Thr Pro Glu
1955 1960 1965
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<213> Bos taurus
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1160 1165 1170
Leu Pro Ser Gly Glu Gly Pro Glu Val Ser Ala Ser Gly Val Glu
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1190 1195 1200
Ser Gly Val Glu Asp Ile Ser Ile Leu Pro Ser Gly Glu Gly Pro
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Glu Val Ser Ala Ser Gly Val Glu Asp Leu Ser Val Leu Pro Ser
1220 1225 1230
Gly Glu Gly His Leu Glu Ile Ser Thr Ser Gly Val Glu Asp Leu
1235 1240 1245
Ser Val Leu Pro Ser Gly Glu Gly His Leu Glu Thr Ser Ser Gly
1250 1255 1260
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Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Arg Glu Gly Leu Glu Ile
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Ser Ala Ser Gly Ala Gly Asp Leu Ser Gly Leu Thr Ser Gly Lys
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1985 1990 1995
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Ser Ser Pro Cys Leu Asn Gly Ala Thr Cys Val Asp Ala Ile Asp
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2135 2140 2145
Glu Ile Gln Lys Leu Cys Glu Glu Gly Trp Thr Lys Phe Gln Gly
2150 2155 2160
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2165 2170 2175
Glu Ser Gln Cys Arg Lys Gln Gln Ser His Leu Ser Ser Ile Val
2180 2185 2190
Thr Pro Glu Glu Gln Glu Phe Val Asn Asn Asn Ala Gln Asp Tyr
2195 2200 2205
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2210 2215 2220
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2225 2230 2235
Gln Pro Asp Asn Phe Phe Ala Thr Gly Glu Asp Cys Val Val Met
2240 2245 2250
Ile Trp His Glu Lys Gly Glu Trp Asn Asp Val Pro Cys Asn Tyr
2255 2260 2265
Gln Leu Pro Phe Thr Cys Lys Lys Gly Thr Val Ala Cys Gly Glu
2270 2275 2280
Pro Pro Val Val Glu His Ala Arg Ile Phe Gly Gln Lys Lys Asp
2285 2290 2295
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2300 2305 2310
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2315 2320 2325
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2360
<210> 128
<211> 2124
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 128
Met Thr Thr Leu Leu Leu Val Phe Val Thr Leu Arg Val Ile Ala Ala
1 5 10 15
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145 150 155 160
Ser Thr Arg Tyr Thr Leu Asp Phe Asp Arg Ala Gln Arg Ala Cys Leu
165 170 175
Gln Asn Ser Ala Ile Ile Ala Thr Pro Glu Gln Leu Gln Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Asp Gly Phe His Gln Cys Asp Ala Gly Trp Leu Ala Asp Gln Thr
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Val Arg Tyr Pro Ile His Thr Pro Arg Glu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
210 215 220
Asp Glu Phe Pro Gly Val Arg Thr Tyr Gly Ile Arg Asp Thr Asn Glu
225 230 235 240
Thr Tyr Asp Val Tyr Cys Phe Ala Glu Glu Met Glu Gly Glu Val Phe
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Tyr Ala Thr Ser Pro Glu Lys Phe Thr Phe Gln Glu Ala Ala Asn Glu
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Cys Arg Thr Val Gly Ala Arg Leu Ala Thr Thr Gly Gln Leu Tyr Leu
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Arg Ser Val Arg Tyr Pro Ile Ser Lys Ala Arg Pro Asn Cys Gly Gly
305 310 315 320
Asn Leu Leu Gly Val Arg Thr Val Tyr Leu His Ala Asn Gln Thr Gly
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Tyr Pro Asp Pro Ser Ser Arg Tyr Asp Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Glu
340 345 350
Asp Phe Val Asp Ile Pro Glu Asn Phe Phe Gly Val Gly Gly Glu Glu
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370 375 380
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465 470 475 480
Pro Arg Leu Pro Gly Gly Val Val Phe His Tyr Arg Pro Gly Ser Thr
485 490 495
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530 535 540
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545 550 555 560
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625 630 635 640
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645 650 655
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<220>
<221> VARIANT
<222> (45)..(45)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> VARIANT
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> VARIANT
<222> (146)..(146)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 129
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<213> Mus musculus
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Ala Ser Gly Ala Leu Asp Phe Gly Lys Leu Pro Pro Gly Thr Leu
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Gly Ser Gly Gln Thr Pro Glu Val Asn Gly Phe Pro Ser Gly Phe
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Ser Gly Glu Tyr Ser Gly Ala Asp Ile Gly Ser Gly Pro Ser Ser
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Gly Leu Pro Asp Phe Ser Gly Leu Pro Ser Gly Phe Pro Thr Val
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Ser Leu Val Asp Ser Thr Leu Val Glu Val Ile Thr Ala Thr Thr
1280 1285 1290
Ser Ser Glu Leu Glu Gly Arg Gly Thr Ile Gly Ile Ser Gly Ser
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Gly Glu Val Ser Gly Leu Pro Leu Gly Glu Leu Asp Ser Ser Ala
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Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Thr Glu Leu Ser Gly Gln Ala
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Ser Gly Ser Pro Asp Ser Ser Gly Glu Thr Ser Gly Phe Phe Asp
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Ser Gly Gln Ser Ser Gly Ile Thr Ser Val Ser Gly Glu Thr Ser
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Gly Ile Ser Asp Leu Ser Gly Gln Pro Ser Gly Phe Pro Val Phe
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Ser Gly Thr Ala Thr Arg Thr Pro Asp Leu Ala Ser Gly Thr Ile
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Ser Gly Ser Gly Glu Ser Ser Gly Ile Thr Phe Val Asp Thr Ser
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Gly Ser Val Glu Leu Ser Gly Phe Pro Ser Gly Glu Thr Glu Leu
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Ala Ile Asp Ser Ser Gly Leu Thr Ser Pro Thr Pro Glu Phe Ser
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Gly Leu Pro Ser Gly Val Ala Glu Val Ser Gly Glu Phe Ser Gly
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Gly Leu Val Ser Gly Phe Pro Thr Val Ser Leu Val Asp Arg Thr
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Leu Val Glu Ser Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ala Gln Glu Ala Gly
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Glu Gly Pro Ser Gly Ile Leu Glu Phe Ser Gly Ala His Ser Gly
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Ser Pro Tyr Phe Ser Gly Asp Phe Ser Ser Thr Thr Asp Val Ser
1640 1645 1650
Gly Glu Ser Ile Ala Ala Thr Thr Gly Ser Gly Glu Ser Ser Gly
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Thr Tyr Thr Pro Arg Leu Phe Glu Ala Ser Gly Asp Ala Ser Ala
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Ser Gly Asp Leu Gly Gly Ala Val Thr Asn Phe Pro Gly Ser Gly
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1985 1990 1995
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<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 131
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2090 2095 2100
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2105 2110 2115
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<210> 132
<211> 2266
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 132
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Cys Arg Arg Leu Gly Ala Arg Leu Ala Thr Thr Gly Gln Leu Tyr Leu
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Pro Ala Cys Gly Gly Asp Lys Pro Gly Val Arg Thr Val Tyr Leu Tyr
645 650 655
Pro Asn Gln Thr Gly Leu Pro Asp Pro Leu Ser Arg His His Ala Phe
660 665 670
Cys Phe Arg Gly Val Ser Ala Val Pro Ser Pro Gly Glu Glu Glu Gly
675 680 685
Gly Thr Pro Thr Ser Pro Ser Gly Val Glu Asp Trp Ile Ala Thr Gln
690 695 700
Val Val Pro Gly Val Ala Ala Val Pro Val Glu Glu Glu Thr Thr Ala
705 710 715 720
Val Pro Leu Gly Glu Thr Thr Ala Ile Leu Glu Phe Thr Thr Glu Pro
725 730 735
Glu Asn Gln Thr Glu Trp Glu Pro Ala Tyr Thr Pro Met Gly Thr Ser
740 745 750
Pro Leu Pro Gly Ile Leu Pro Thr Trp Pro Pro Thr Gly Thr Ala Thr
755 760 765
Glu Glu Ser Thr Glu Gly Pro Ser Ala Thr Glu Val Leu Thr Ala Ser
770 775 780
Lys Glu Pro Ser Pro Pro Glu Val Pro Phe Pro Ser Glu Glu Pro Ser
785 790 795 800
Pro Ser Glu Glu Pro Phe Pro Ser Val Arg Pro Phe Pro Ser Val Glu
805 810 815
Pro Ser Pro Ser Glu Glu Pro Phe Pro Ser Val Glu Pro Ser Pro Ser
820 825 830
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835 840 845
Pro Ser Trp Thr Glu Leu Pro Gly Ser Gly Glu Glu Ser Gly Ala Pro
850 855 860
Asp Val Ser Gly Asp Phe Ile Gly Ser Gly Asp Val Ser Gly His Leu
865 870 875 880
Asp Phe Ser Gly Gln Leu Ser Gly Asp Arg Ile Ser Gly Leu Pro Ser
885 890 895
Gly Asp Leu Asp Ser Ser Gly Leu Thr Ser Thr Val Gly Ser Gly Leu
900 905 910
Pro Val Asp Ser Gly Leu Ala Ser Gly Asp Glu Glu Arg Ile Glu Trp
915 920 925
Ser Ser Thr Pro Thr Val Gly Glu Leu Pro Ser Gly Ala Glu Ile Leu
930 935 940
Glu Gly Ser Ala Ser Glu Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly
945 950 955 960
Asp Val Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu
965 970 975
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980 985 990
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Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ser
1010 1015 1020
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1025 1030 1035
Val Leu Glu Thr Thr Ala Ser Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu
1040 1045 1050
Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Ser Gly Val Glu Asp
1055 1060 1065
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1070 1075 1080
Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu
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Thr Thr Ala Ser Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly
1100 1105 1110
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Ser Ala Ser Gly Val Gly Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Gly
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Glu Val Leu Glu Ile Ser Ala Ser Gly Val Gly Asp Leu Ser Gly
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Leu Pro Ser Gly Gly Glu Gly Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Val
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1295 1300 1305
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1310 1315 1320
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1370 1375 1380
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1400 1405 1410
Ser Glu Leu Asp Ile Ser Gly Glu Ala Ser Gly Leu Pro Ser Gly
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1430 1435 1440
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1445 1450 1455
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1460 1465 1470
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Gln Pro Ser Gly Leu Pro Gly Phe Ser Gly Ala Thr Ser Gly Val
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Pro Asp Leu Val Ser Gly Ala Thr Ser Gly Ser Gly Glu Ser Ser
1550 1555 1560
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1565 1570 1575
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1730 1735 1740
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1760 1765 1770
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1790 1795 1800
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1805 1810 1815
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1820 1825 1830
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1955 1960 1965
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1970 1975 1980
Thr His Thr Ala Glu Thr Ala Thr Ser Pro Thr Asp Ala Ser Ile
1985 1990 1995
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2000 2005 2010
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2015 2020 2025
Cys Val Asp Ala Ile Asp Ser Phe Thr Cys Leu Cys Leu Pro Ser
2030 2035 2040
Tyr Gly Gly Asp Leu Cys Glu Ile Asp Gln Glu Val Cys Glu Glu
2045 2050 2055
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2060 2065 2070
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2075 2080 2085
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2090 2095 2100
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2105 2110 2115
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2120 2125 2130
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2210 2215 2220
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2225 2230 2235
Cys Thr Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Arg Arg Leu Gln Lys Arg Ser
2240 2245 2250
Ser Arg His Pro Arg Arg Ser Arg Pro Ser Thr Ala His
2255 2260 2265
<210> 133
<211> 2167
<212> PRT
<213> Macaca mulatta
<220>
<221> VARIANT
<222> (1910)..(1915)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 133
Met Thr Thr Leu Leu Trp Val Phe Val Thr Leu Arg Val Ile Ala Ala
1 5 10 15
Ala Val Thr Val Glu Thr Ser Asp His Asp Asn Ser Leu Ser Val Ser
20 25 30
Ile Pro Gln Pro Ser Pro Leu Arg Val Leu Leu Gly Thr Ser Leu Thr
35 40 45
Ile Pro Cys Tyr Phe Ile Asp Pro Met His Pro Val Thr Thr Ala Pro
50 55 60
Ser Thr Ala Pro Leu Ala Pro Arg Ile Lys Trp Ser Arg Val Ser Lys
65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Thr Arg Tyr Thr Leu Asp Phe Asp Arg Ala Gln Arg Ala Cys Leu
165 170 175
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Glu Asp Gly Phe His Gln Cys Asp Ala Gly Trp Leu Ala Asp Gln Thr
195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
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Cys Arg Arg Leu Gly Ala Arg Leu Ala Thr Thr Gly Gln Leu Tyr Leu
275 280 285
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305 310 315 320
Asn Leu Leu Gly Val Arg Thr Val Tyr Leu His Ala Asn Gln Thr Gly
325 330 335
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485 490 495
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500 505 510
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530 535 540
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565 570 575
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595 600 605
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625 630 635 640
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675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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820 825 830
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835 840 845
Pro Ser Trp Thr Glu Leu Pro Gly Ser Gly Glu Glu Ser Gly Ala Pro
850 855 860
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865 870 875 880
Asp Phe Ser Gly Gln Leu Ser Gly Asp Arg Ile Ser Gly Leu Pro Ser
885 890 895
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900 905 910
Pro Val Asp Ser Gly Leu Ala Ser Gly Asp Glu Glu Arg Ile Glu Trp
915 920 925
Ser Ser Thr Pro Thr Val Gly Glu Leu Pro Ser Gly Ala Glu Ile Leu
930 935 940
Glu Gly Ser Ala Ser Glu Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly
945 950 955 960
Asp Val Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu
965 970 975
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1040 1045 1050
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1055 1060 1065
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1070 1075 1080
Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu
1085 1090 1095
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1100 1105 1110
Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Ser Gly Val Gly Asp Leu Gly Gly
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Leu Pro Ser Gly Gly Glu Gly Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Val
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Lys Leu Pro Ser Gly Thr Leu Gly Ser Gly Gln Ala Pro Glu Thr
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Ser Gly Leu Pro Ser Gly Phe Ser Gly Glu Tyr Ser Gly Val Asp
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Leu Gly Ser Gly Pro Pro Ser Gly Leu Pro Asp Phe Ser Gly Leu
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Gly Ala Thr Ser Gly Ser Gly Glu Ser Ser Asp Ile Thr Phe Val
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1550 1555 1560
Glu Gly Leu Gly Ser Val Glu Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu
1565 1570 1575
Ala Asp Leu Ser Gly Arg Ser Gly Met Val Asp Val Ser Gly Gln
1580 1585 1590
Phe Ser Gly Thr Val Asp Ser Ser Gly Phe Thr Ser Gln Thr Pro
1595 1600 1605
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Ser Ser Gly Ala Glu Thr Gly Ser Ser Leu Pro Ser Gly Ala Tyr
1625 1630 1635
Tyr Gly Ser Glu Leu Pro Ser Gly Phe Pro Thr Val Ser Leu Val
1640 1645 1650
Asp Arg Thr Leu Val Glu Ser Val Thr Gln Ala Pro Thr Ala Gln
1655 1660 1665
Glu Ala Gly Glu Gly Pro Pro Gly Ile Leu Glu Leu Ser Gly Thr
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Gly Ser Gly Val Glu Val Ser Ser Val Pro Glu Ser Ser Ser Glu
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2030 2035 2040
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His Glu Lys Gly Glu Trp Asn Asp Val Pro Cys Asn Tyr His Leu
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115
<210> 147
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nanobody Sequence
<400> 147
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly
115
<210> 148
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nanobody Sequence
<400> 148
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly
115
<210> 149
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nanobody Sequence
<400> 149
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 150
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nanobody Sequence
<400> 150
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210> 151
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nanobody Sequence
<400> 151
Ser Phe Gly Met Ser
1 5
<210> 152
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nanobody Sequence
<400> 152
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 153
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nanobody Sequence
<400> 153
Gly Gly Ser Leu Ser Arg
1 5
<210> 154
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 154
Ala Ala Ala
1
<210> 155
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 155
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 156
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 156
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 157
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 158
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 159
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 161
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 161
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 162
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 162
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
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<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 163
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 164
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 164
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 165
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 165
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 166
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 166
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 167
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 167
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 168
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 168
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
1 5 10 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20
<210> 169
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 169
Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 170
<211> 62
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker Sequence
<400> 170
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 171
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nanobody Sequence
<400> 171
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Lys Ser Ala
115
<210> 172
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> myc tag
<400> 172
Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala
1 5 10 15
Ala
Claims (90)
- 아그레칸(Aggrecan)에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV).
- 제1항에 있어서, 상기 ISV는 인간 아그레칸[서열번호: 125]에 특이적으로 결합하는 것인 ISV.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 ISV는 개 아그레칸(서열번호: 126), 소 아그레칸(서열번호: 127), 랫트 아그레칸(서열번호: 128); 돼지(코어) 아그레칸(서열번호: 129); 마우스 아그레칸(서열번호: 130), 토끼 아그레칸(서열번호: 131); 시노몰구스 아그레칸(서열번호: 132) 및/또는 레서스 아그레칸(서열번호: 133)에 특이적으로 결합하는 것인 ISV.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 뉴로칸(Neurocan)(서열번호: 134) 및/또는 브레비칸(Brevican)(서열번호: 135)에 실질적으로 결합하지 않는 것인 ISV.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, ISV는 아그레칸에의 결합에 대해 뉴로칸 및/또는 브레비칸보다 10배 초과, 100배 초과, 바람직하게는 1000배 초과의 선택성을 갖는 것인 ISV.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 바람직하게는 연골(cartilage) 및/또는 반월상 연골(meniscus)과 같은 연골 조직에 결합하는 것인 ISV.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 37℃에서 활액(SF)에서 적어도 7일, 예컨대 14일, 21일, 1개월, 2개월 또는 심지어 3개월의 안정성을 갖는 것인 ISV.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 연골 보유 분석(cartilage retention assay)에서 적어도 2, 예컨대 적어도 3, 4, 5 또는 6 RU의 연골 보유를 갖는 것인 ISV.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 적어도 5 μm, 예컨대 적어도 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm 또는 심지어 그 초과로 연골 내로 침투하는 것인 ISV.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된(camelized) VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열로 본질적으로 구성되는 것인 ISV.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 본질적으로 구성되며, 여기서
- CDR1은 서열번호: 24, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 및 109로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- CDR2는 서열번호: 42, 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 및 110으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
- CDR3은 서열번호: 60, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 및 111로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 아그레칸의 G1 도메인에 결합하는 것인 ISV.
- 제12항에 있어서, 상기 ISV는 8 초과의 pI를 갖는 것인 ISV.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 ISV는 2 * 10-2 s-1 미만의 koff를 갖는 것인 ISV.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 1 * 10-6 M 미만의 EC50을 갖는 것인 ISV.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 본질적으로 구성되며, 여기서
i) CDR1은
a) 서열번호: 24, 20, 또는 21; 또는
b) 서열번호: 24의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 2에서 S는 R, F, I, 또는 T로 변경되었고/거나;
- 위치 3에서 T는 I로 변경되었고/거나;
- 위치 5에서 I는 S로 변경되었고/거나;
- 위치 6에서 I는 S, T, 또는 M으로 변경되었고/거나;
- 위치 7에서 N은 Y, 또는 R로 변경되었고/거나;
- 위치 8에서 V는 A, Y, T, 또는 G로 변경되었고/거나;
- 위치 9에서 V는 M으로 변경되었고/거나;
- 위치 10에서 R은 G, K, 또는 A로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
ii) CDR2는
c) 서열번호: 42, 38, 또는 39; 또는
d) 서열번호: 42의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 1에서 T는 A, 또는 G로 변경되었고/거나;
- S 또는 N이 위치 3과 위치 4 사이에 삽입되고/거나(위치 2a 표 1.3B);
- 위치 3에서 S는 R, W, N, 또는 T로 변경되었고/거나;
- 위치 4에서 S는 T 또는 G로 변경되었고/거나;
- 위치 5에서 G는 S로 변경되었고/거나;
- 위치 6에서 G는 S, 또는 R로 변경되었고/거나;
- 위치 7에서 N은 S, T, 또는 R로 변경되었고/거나;
- 위치 8에서 A는 T로 변경되었고/거나;
- 위치 9에서 N은 D 또는 Y로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
iii) CDR3은
e) 서열번호: 60, 56 또는 57; 또는
f) 서열번호: 60의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 1에서 P는 G, R, D, 또는 E로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 2에서 T는 R, L, P, 또는 V로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 3에서 T는 M, S, 또는 R로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 4에서 H는 D, Y, G, 또는 T로 변경되었고/거나;
- 위치 5에서 Y는 F, V, T 또는 G로 변경되었고/거나;
- 위치 6에서 G는 L, D, S, Y, 또는 W로 변경되었고/거나;
- R, T, Y 또는 V가 위치 6과 위치 7 사이에 삽입되고/거나(위치 6a 표 1.3C);
- 위치 7에서 G는 P, 또는 S로 변경되었고/거나;
- 위치 8에서 V는 G, T, H, R, L, 또는 Y로 변경되었고/거나;
- 위치 9에서 Y는 R, A, S, D 또는 G로 변경되었고/거나;
- 위치 10에서 Y는 N, E, G, W, 또는 S로 변경되었고/거나;
- W가 위치 10과 위치 11 사이에 삽입되고/거나(위치 10a 표 1.3C);
- 위치 11에서 G는 S, K, 또는 Y로 변경되었고/거나;
- 위치 12에서 P는 E, 또는 D로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 13에서 Y는 L로 변경되었거나 부재인 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는
- CDR1은 서열번호: 24, 20, 21, 25, 27, 29, 31, 34, 35, 36, 37 및 109로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- CDR2는 서열번호: 42, 38, 39, 43, 45, 47, 49, 50, 53, 54, 55, 및 110으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- CDR3은 서열번호: 60, 56, 57, 61, 63, 65, 67, 71, 72, 73, 74, 및 111로 이루어진 군으로부터 선택되는 ISV의 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제17항에 있어서, 상기 ISV는
- CDR1은 서열번호: 24이고, CDR2는 서열번호: 42이며, CDR3은 서열번호: 60이고;
- CDR1은 서열번호: 20이고, CDR2는 서열번호: 38이며, CDR3은 서열번호: 56이고;
- CDR1은 서열번호: 21이고, CDR2는 서열번호: 39이며, CDR3은 서열번호: 57이고;
- CDR1은 서열번호: 25이고, CDR2는 서열번호: 43이며, CDR3은 서열번호: 61이고;
- CDR1은 서열번호: 27이고, CDR2는 서열번호: 45이며, CDR3은 서열번호: 63이고;
- CDR1은 서열번호: 29이고, CDR2는 서열번호: 47이며, CDR3은 서열번호: 65이고;
- CDR1은 서열번호: 31이고, CDR2는 서열번호: 49이며, CDR3은 서열번호: 67이고;
- CDR1은 서열번호: 34이고, CDR2는 서열번호: 50이며, CDR3은 서열번호: 71이고;
- CDR1은 서열번호: 35이고, CDR2는 서열번호: 53이며, CDR3은 서열번호: 72이고;
- CDR1은 서열번호: 36이고, CDR2는 서열번호: 54이며, CDR3은 서열번호: 73이고;
- CDR1은 서열번호: 37이고, CDR2는 서열번호: 55이며, CDR3은 서열번호: 74인 ISV의 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 본질적으로 구성되고, 여기서
i) CDR1은
a) 서열번호: 24 및 109; 또는
b) 서열번호: 24의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 7에서 N은 S로 변경되었고/거나;
- 위치 9에서 V는 M으로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
ii) CDR2는
c) 서열번호: 42 및 110; 또는
d) 서열번호: 42의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 1에서 T는 A로 변경되었고/거나;
- 위치 3에서 S는 R로 변경되었고/거나;
- 위치 4에서 S는 T로 변경되었고/거나;
- 위치 8에서 A는 T로 변경되었고/거나;
- 위치 9에서 N은 D로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
iii) CDR3은
e) 서열번호: 60 및 111; 또는
f) 서열번호: 60의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 4에서 H는 R로 변경되었고/거나;
- 위치 8에서 V는 D로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는
- CDR1은 서열번호: 24 및 109로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- CDR2는 서열번호: 42 및 110으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
- CDR3은 서열번호: 60 및 111로 이루어진 군으로부터 선택되는 ISV의 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 에피토프 빈(epitope bin) 1 또는 에피토프 빈 4에 속하는 것인 ISV.
- 제21항에 있어서, 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 본질적으로 구성되고, 여기서
i) CDR1은
a) 서열번호: 36; 및
b) 서열번호: 36의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 3에서 T는 S로 변경되었고/거나;
- 위치 6에서 T는 S로 변경되었고/거나;
- 위치 8에서 T는 A로 변경되었고/거나;
- 위치 9에서 M은 V로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
ii) CDR2는
c) 서열번호: 54; 및
d) 서열번호: 54의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 1에서 A는 I로 변경되었고/거나;
- 위치 4에서 W는 R로 변경되었고/거나;
- 위치 7에서 G는 R로 변경되었고/거나;
- 위치 8에서 T는 S로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
iii) CDR3은
e) 서열번호: 73; 및
f) 서열번호: 73의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 1에서 R은 G로 변경되었고/거나;
- 위치 2에서 P는 R 또는 L로 변경되었고/거나;
- 위치 3에서 R은 L 또는 S로 변경되었고/거나;
- 위치 5에서 Y는 R로 변경되었고/거나;
- 위치 6에서 Y는 S 또는 A로 변경되었고/거나;
- 위치 7에서 Y는 T로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 8에서 S는 P로 변경되었고/거나;
- 위치 9에서 L은 H 또는 R로 변경되었고/거나;
- 위치 10에서 Y는 P 또는 A로 변경되었고/거나;
- 위치 11에서 S는 A 또는 Y로 변경되었고/거나;
- 위치 12에서 Y는 D로 변경되었고/거나;
- 위치 13에서 D는 F로 변경되었고/거나;
- 위치 14에서 Y는 G로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 14 뒤에, S가 삽입된 것인 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제22항에 있어서, 상기 ISV는
- CDR1은 서열번호: 20, 29, 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- CDR2는 서열번호: 38, 47, 및 54로 이루어진 군으로부터 선택되며;
- CDR3은 서열번호: 56, 65, 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ISV의 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 ISV는 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열이 아그레칸의 G1 도메인에 결합하는 것을 교차 차단하는 것인 ISV.
- 아그레칸의 G1-도메인의 에피토프 빈 1에 결합하고, 제22항 또는 제23항에 따른 ISV와 아그레칸의 G1 도메인에의 결합에 대해 경쟁하는, ISV, 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열.
- 제21항에 있어서, 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 본질적으로 구성되고, 여기서
i) CDR1은
a) 서열번호: 24; 및
b) 서열번호: 24의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 2에서 S는 I 또는 F로 변경되었고/거나;
- 위치 5에서 I는 S로 변경되었고/거나;
- 위치 6에서 I는 S 또는 M으로 변경되었고/거나;
- 위치 7에서 N은 R 또는 Y로 변경되었고/거나;
- 위치 8에서 V는 A 또는 Y로 변경되었고/거나;
- 위치 9에서 V는 M으로 변경되었고/거나;
- 위치 10에서 R은 K로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
ii) CDR2는
c) 서열번호: 42; 및
d) 서열번호: 42의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 1에서 T는 A 또는 G로 변경되었고/거나;
- N이 위치 2와 위치 3 사이에 삽입되고/거나(위치 2a 표 2.3B);
- 위치 7에서 N은 R로 변경되었고/거나;
- 위치 8에서 A는 T로 변경되었고/거나;
- 위치 9에서 N은 D로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
iii) CDR3은
e) 서열번호: 60; 및
f) 서열번호: 60의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 1에서 P는 부재이고/거나;
- 위치 2에서 T는 R로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 3에서 T는 M으로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 4에서 H는 D 또는 Y로 변경되었고/거나;
- 위치 5에서 Y는 F 또는 V로 변경되었고/거나;
- 위치 6에서 G는 L 또는 D로 변경되었고/거나;
- 위치 8에서 V는 G 또는 T로 변경되었고/거나;
- 위치 9에서 Y는 R로 변경되었고/거나;
- 위치 10에서 Y는 N 또는 E로 변경되었고/거나;
- 위치 11에서 G는 S 또는 K로 변경되었고/거나;
- 위치 12에서 P는 E로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 13에서 Y는 L로 변경되었거나 부재인 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제26항에 있어서, 상기 ISV는
- CDR1은 서열번호: 24, 25, 및 27로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- CDR2는 서열번호: 42, 43, 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되며;
- CDR3은 서열번호: 60, 61, 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ISV의 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 ISV는 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열이 아그레칸의 G1 도메인에 결합하는 것을 교차 차단하는 것인 ISV.
- 아그레칸의 G1-도메인의 에피토프 빈 4에 결합하고, 제26항 또는 제27항에 따른 ISV와 아그레칸의 G1 도메인에의 결합에 대해 경쟁하는, ISV, 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 서열번호: 5, 1, 2, 6, 8, 10, 12, 16, 17, 18, 및 19를 갖는 ISV, 및 서열번호: 5, 1, 2, 6, 8, 10, 12, 16, 17, 18, 및 19 중 어느 하나와 80% 초과, 예컨대 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 ISV로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 ISV.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 아그레칸의 G1-IGD-G2 도메인에 결합하는 것인 ISV.
- 제31항에 있어서, 상기 ISV는 8 초과의 pI를 갖는 것인 ISV.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 ISV는 2*10-2 s-1 미만의 Koff를 갖는 것인 ISV.
- 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 1*10-6 M 미만의 EC50을 갖는 것인 ISV.
- 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
i) CDR1은
a) 서열번호: 32, 30 및 23; 및
b) 서열번호: 32의 아미노산 서열과 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 2에서 R은 L로 변경되었고/거나;
- 위치 6에서 S는 T로 변경되었고/거나;
- 위치 8에서 T는 A로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
ii) CDR2는
c) 서열번호: 50, 41, 48 및 51; 및
d) 서열번호: 50의 아미노산 서열과 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 7에서 G는 S 또는 R로 변경되었고/거나;
- 위치 8에서 R은 T로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
iii) CDR3은
e) 서열번호: 68, 59, 66 및 69; 및
f) 서열번호: 68의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 4에서 R은 V, 또는 P로 변경되었고/거나;
- 위치 6에서 A는 Y로 변경되었고/거나;
- 위치 7에서 S는 T로 변경되었고/거나;
- 위치 8에서 S는 부재이고/거나;
- 위치 9에서 N은 P로 변경되었고/거나;
- 위치 10에서 R은 T 또는 L로 변경되었고/거나;
- 위치 11에서 G는 E로 변경되었고/거나;
- 위치 12에서 L은 T 또는 V로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는
- CDR1은 서열번호: 32, 30 및 23으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- CDR2는 서열번호: 50, 41, 48 및 51로 이루어진 군으로부터 선택되며;
- CDR3은 서열번호: 68, 59, 66 및 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 ISV의 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제36항에 있어서, 상기 ISV는
- CDR1은 서열번호: 32이고, CDR2는 서열번호: 50이며, CDR3은 서열번호: 68이고;
- CDR1은 서열번호: 32이고, CDR2는 서열번호: 51이며, CDR3은 서열번호: 69이고;
- CDR1은 서열번호: 30이고, CDR2는 서열번호: 48이며, CDR3은 서열번호: 66이고;
- CDR1은 서열번호: 23이고, CDR2는 서열번호: 41이며, CDR3은 서열번호: 59인 ISV의 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 서열번호: 13, 4, 11 및 14를 갖는 ISV, 및 서열번호: 13, 4, 11 및 14 중 어느 것과 80% 초과, 예컨대 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 ISV로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 ISV.
- 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열이 아그레칸의 G1-IGD-G2 도메인에 결합하는 것을 교차 차단하는 것인 ISV.
- 아그레칸의 G1-IGD-G2 도메인에 결합하고, 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 ISV와 아그레칸의 G1-IGD-G2 도메인에의 결합에 대해 경쟁하는, ISV, 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 아그레칸의 G2 도메인에 결합하는 것인 ISV.
- 제41항에 있어서, 상기 ISV는 8 초과의 pI를 갖는 것인 ISV.
- 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 ISV는 2 * 10-2 s-1 미만의 koff를 갖는 것인 ISV.
- 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 1 * 10-6 M 미만의 EC50을 갖는 것인 ISV.
- 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
i) CDR1은
a) 서열번호: 28; 및
b) 서열번호: 28의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 1에서 G는 R로 변경되었고/거나;
- 위치 2에서 P는 S 또는 R로 변경되었고/거나;
- 위치 3에서 T는 I로 변경되었고/거나;
- 위치 5에서 S는 N으로 변경되었고/거나;
- 위치 6에서 R은 N, M, 또는 S로 변경되었고/거나;
- 위치 7에서 Y는 R로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 8에서 A는 F로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 10에서 G는 Y로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
ii) CDR2는
c) 서열번호: 46; 및
d) 서열번호: 46의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 1에서 A는 S, 또는 Y로 변경되었고/거나;
- 위치 4에서 W는 L로 변경되었고/거나;
- 위치 5에서 S는 N으로 변경되었고/거나;
- 위치 6에서 S는 부재이고/거나;
- 위치 7에서 G는 부재이고/거나;
- 위치 8에서 G는 A로 변경되었고/거나;
- 위치 9에서 R은 S, D, 또는 T로 변경되었고/거나;
- 위치 11에서 Y는 N 또는 R로 변경된 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나;
iii) CDR3은
e) 서열번호: 64; 및
f) 서열번호: 64의 아미노산 서열과 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산(들) 차이를 갖는 아미노산 서열로서,
- 위치 1에서 A는 R, 또는 F로 변경되었고/거나;
- 위치 2에서 R은 I, 또는 L로 변경되었고/거나;
- 위치 3에서 I는 H, 또는 Q로 변경되었고/거나;
- 위치 4에서 P는 G, 또는 N으로 변경되었고/거나;
- 위치 5에서 V는 S로 변경되었고/거나;
- 위치 6에서 R은 G, N, 또는 F로 변경되었고/거나;
- 위치 7에서 T는 R, W, 또는 Y로 변경되었고/거나;
- 위치 8에서 Y는 R, 또는 S로 변경되었거나, 부재이고/거나;
- 위치 9에서 T는 S로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 10에서 S는 E, K로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 11에서 E는 N, A로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 12에서 W는 D로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 13에서 N은 D로 변경되었거나 부재이고/거나;
- 위치 14에서 Y는 부재이고/거나;
- D 및/또는 N은 서열번호: 64의 위치 14 뒤에 부가되는 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는
- CDR1은 서열번호: 28, 22, 26, 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
- CDR2는 서열번호: 46, 40, 44, 및 52로 이루어진 군으로부터 선택되며;
- CDR3은 서열번호: 64, 58, 62, 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ISV의 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제46항에 있어서, 상기 ISV는
- CDR1은 서열번호: 28이고, CDR2는 서열번호: 46이며, CDR3은 서열번호: 64이고;
- CDR1은 서열번호: 22이고, CDR2는 서열번호: 40이며, CDR3은 서열번호: 58이고;
- CDR1은 서열번호: 26이고, CDR2는 서열번호: 44이며, CDR3은 서열번호: 62이고;
- CDR1은 서열번호: 33이고, CDR2는 서열번호: 52이며, CDR3은 서열번호: 70인 ISV의 군으로부터 선택되는 것인 ISV. - 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 서열번호: 9, 3, 7 및 15를 갖는 ISV, 및 서열번호: 9, 3, 7 및 15 중 어느 하나와 80% 초과, 예컨대 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 ISV로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 ISV.
- 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열이 아그레칸의 G2 도메인에 결합하는 것을 교차 차단하는 것인 ISV.
- 아그레칸의 G2-도메인에 결합하고, 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 ISV와 아그레칸의 G2 도메인에의 결합에 대해 경쟁하는, ISV 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, dAb, dAb로서 사용하기에 적합한 면역글로불린, 나노바디, VHH 서열, 인간화된 VHH 서열, 낙타화된 VH 서열, 또는 친화도 성숙에 의해 수득된 VHH 서열.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 서열번호: 1-19 및 114-118 및 서열번호: 1-19 및 114-118 중 어느 하나와 80% 초과, 예컨대 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 ISV로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 ISV.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 ISV, 및 가능하게는 제2 ISV, 가능하게는 제3 ISV, 및 가능하게는 제4 ISV를 포함하는 폴리펩타이드.
- 제52항에 있어서, 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 적어도 2개의 ISV, 및 가능하게는 제3 ISV, 및 가능하게는 제4 ISV를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
- 제53항에 있어서, 상기 적어도 2개의 ISV는 동일하거나 상이할 수 있는 것인 폴리펩타이드.
- 제54항에 있어서, 상기 적어도 2개의 ISV는 독립적으로 서열번호: 1-19 및 114-118로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.
- 제55항에 있어서, 상기 적어도 2개의 ISV는 서열번호: 5, 6, 8 및 114-117로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.
- 제55항에 있어서, 상기 적어도 2개의 ISV는 서열번호: 13 및 118로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.
- 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 추가 ISV를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
- 제58항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가 ISV는 세린프로테아제 패밀리의 구성원, 카텝신, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)/매트릭신 또는 트롬보스폰딘 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs; ADAMTS), 바람직하게는 MMP8, MMP13, MMP19, MMP20, ADAMTS5(아그레카나제-2), ADAMTS4(아그레카나제-1) 및/또는 ADAMTS11에 결합하는 것인 폴리펩타이드.
- 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가 ISV는 활성을 보유하는 것인 폴리펩타이드.
- 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가 ISV는 세린프로테아제 패밀리의 구성원, 카텝신, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)/매트릭신 또는 트롬보스폰딘 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS), 바람직하게는 MMP8, MMP13, MMP19, MMP20, ADAMTS5(아그레카나제-2), ADAMTS4(아그레카나제-1) 및/또는 ADAMTS11의 활성을 억제하는 것인 폴리펩타이드.
- 제52항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 37℃에서 활액(SF)에서 적어도 7일, 예컨대 적어도 14일, 21일, 1개월, 2개월 또는 심지어 3개월의 안정성을 갖는 것인 폴리펩타이드.
- 제52항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 연골 보유 분석에서 적어도 2, 예컨대 적어도 3, 4, 5 또는 6 RU의 연골 보유를 갖는 것인 폴리펩타이드.
- 제52항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 적어도 5 μm, 예컨대 적어도 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm 또는 심지어 그 초과로 연골 내로 침투하는 것인 폴리펩타이드.
- 제52항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 혈청 단백질 결합 모이어티 또는 혈청 단백질을 추가로 포함하는 것인 폴리펩타이드.
- 제65항에 있어서, 상기 혈청 단백질 결합 모이어티는 혈청 알부민에 결합하는 것인 폴리펩타이드.
- 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 혈청 단백질 결합 모이어티는 혈청 알부민 결합 ISV인 폴리펩타이드.
- 제67항에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 ISV는 4개의 프레임워크 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 본질적으로 구성되고, 여기서 CDR1은 SFGMS이고, CDR2는 SISGSGSDTLYADSVKG이며, CDR3은 GGSLSR인 폴리펩타이드.
- 제68항에 있어서, 상기 혈청 알부민 결합 ISV는 Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb135, Alb11, Alb11(S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82-GGG를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
- 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 혈청 단백질 결합 모이어티는 비항체 기반 폴리펩타이드인 폴리펩타이드.
- 제52항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, PEG를 추가로 포함하는 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ISV는 서로 직접 연결되거나 링커를 통해 연결되는 것인 폴리펩타이드.
- 제52항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 ISV 및/또는 제2 ISV 및/또는 가능하게는 제3 ISV 및/또는 가능하게는 제4 ISV 및/또는 가능하게는 상기 혈청 알부민 결합 ISV는 링커(들)를 통해 연결되는 것인 폴리펩타이드.
- 제72항 또는 제73항에 있어서, 상기 링커는 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS 및 35GS의 링커로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.
- 제52항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는, 각각, 표 E-1 및 표 E-2에 표시된 표적에 결합하는 ISV 및 표시된 아그레칸에 결합하는 1개 또는 2개의 ISV를 포함하는 폴리펩타이드 및/또는 구조체의 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 ISV 또는 제52항 내지 제75항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 포함하거나 이것으로 본질적으로 구성되고, 선택적으로 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결된, 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 선택적으로 추가로 포함하는 구조체.
- 제76항에 있어서, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 폴리에틸렌 글리콜 분자, 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 구조체.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 ISV, 제52항 내지 제75항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 또는 제76항 또는 제77항에 따른 구조체를 코딩하는 핵산.
- 제78항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
- 제78항에 따른 핵산, 또는 제79항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 또는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 ISV 또는 제52항 내지 제75항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서, 적어도
a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서, 제78항에 따른 핵산을 발현시키는 단계; 그 후 선택적으로
b) 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 ISV, 또는 제52항 내지 제75항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 단리 및/또는 정제하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 ISV, 제52항 내지 제75항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 제76항 또는 제77항에 따른 구조체, 또는 제78항에 따른 핵산을 포함하는 조성물.
- 제82항에 있어서, 약학 조성물인 조성물.
- 제83항에 있어서, 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 보조제를 추가로 포함하고, 선택적으로 1종 이상의 추가의 약학적 활성 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 포함하는 조성물.
- 의약으로서 사용하기 위한, 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 ISV, 제52항 내지 제75항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 제76항 또는 제77항에 따른 구조체.
- 제85항에 있어서, 관절증(arthropathy) 및 연골이영양증(chondrodystrophy), 관절염 질환(arthritic disease), 예컨대 골관절염(osteoarthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 통풍성 관절염(gouty arthritis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 외상성 파열(traumatic rupture) 또는 분리(detachment), 연골무형성증(achondroplasia), 갈비연골염(costo-chondritis), 척추골단골간단이형성증(Spondyloepimetaphyseal dysplasia), 추간판 탈출증(spinal disc herniation), 요추간판 퇴행 질환(lumbar disk degeneration disease), 퇴행성 관절 질환(degenerative joint disease), 및 재발성 다발성연골염(relapsing polychondritis)을 예방 또는 치료하는 데 사용하기 위한 것인 조성물, ISV, 폴리펩타이드, 또는 구조체.
- 관절증 및 연골이영양증, 관절염 질환, 예컨대 골관절염, 류마티스성 관절염, 통풍성 관절염, 건선성 관절염, 외상성 파열 또는 박리, 연골무형성증, 갈비연골염, 척추골단골간단이형성증, 추간판 탈출증, 요추간판 퇴행 질환, 퇴행성 관절 질환, 및 재발성 다발성연골염을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 제85항에 따른 적어도 조성물, ISV, 폴리펩타이드, 또는 화합물 또는 구조체의 약학적 유효량을 이를 필요로 하는 사람에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 연골 조직으로부터의 화합물의 유출을 감소 및/또는 억제하는 방법으로서, 제52항 내지 제75항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드, 제76항 또는 제77항에 따른 구조체, 또는 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 약학적 유효량을 이를 필요로 하는 사람에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- ADAMTS5 활성 및/또는 MMP13 활성을 억제 및/또는 차단하는 방법으로서, 제52항 내지 제75항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드, 제76항 또는 제77항에 따른 구조체, 또는 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 약학적 유효량을 이를 필요로 하는 사람에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 관절증 및 연골이영양증, 관절염 질환, 예컨대 골관절염, 류마티스성 관절염, 통풍성 관절염, 건선성 관절염, 외상성 파열 또는 박리, 연골무형성증, 갈비연골염, 척추골단골간단이형성증, 추간판 탈출증, 요추간판 퇴행 질환, 퇴행성 관절 질환, 및 재발성 다발성연골염을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물의 제조에 있어서의 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 ISV, 제52항 내지 제75항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 제76항 또는 제77항에 따른 구조체, 또는 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
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