[go: up one dir, main page]

KR20200003031A - 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염 - Google Patents

올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염 Download PDF

Info

Publication number
KR20200003031A
KR20200003031A KR1020197034961A KR20197034961A KR20200003031A KR 20200003031 A KR20200003031 A KR 20200003031A KR 1020197034961 A KR1020197034961 A KR 1020197034961A KR 20197034961 A KR20197034961 A KR 20197034961A KR 20200003031 A KR20200003031 A KR 20200003031A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
oligonucleotide
compound
cyclic
base
modified
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020197034961A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102677783B1 (ko
Inventor
쥰이치로 야마모토
후미카즈 시노하라
도시마사 하루모토
마사카즈 홈마
겐지 하기와라
Original Assignee
쿄와 기린 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 쿄와 기린 가부시키가이샤 filed Critical 쿄와 기린 가부시키가이샤
Publication of KR20200003031A publication Critical patent/KR20200003031A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102677783B1 publication Critical patent/KR102677783B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/532—Closed or circular
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/02—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C12Y204/02008—Hypoxanthine phosphoribosyltransferase (2.4.2.8)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은, 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염으로서, 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드가 상호 상보적인 염기 서열을 가지고, 이 상보적인 염기 서열의 수소 결합을 통해 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드가 복합체를 형성하고 있는 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염 등 및 그의 제조 방법을 제공한다.

Description

올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염
본 발명은 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 생체 내의 효소에 의한 분해에 대하여 내성이 향상된 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염에 관한 것이다.
단쇄 간섭성 RNA(small interfering RNA, 이하 siRNA)는, RNA 간섭(RNA interference, 이하 RNAi)에 관여하고 있고, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 가이드로서의 기능을 갖는 RNA이다(비특허문헌 1). siRNA는 메신저 RNA(mRNA)의 절단을 통해, 그 mRNA가 발현을 담당하는 단백질의 발현을 선택적으로 억제(넉다운)할 수 있으므로, 의약으로의 응용이 기대되고 있다(비특허문헌 2).
siRNA의 의약품으로의 응용을 위한 과제로서, 생체내 불안정성, 즉, 뉴클레아제로 분해되기 쉽다는 것을 들 수 있다.
뉴클레아제에 의한 분해에 대하여 내성을 향상시키기 위해서, 특허문헌 1에는 1본쇄를 환형화한 핵산 또는 덤벨형 핵산이 개시되어 있다. 이 핵산에 있어서는, RNA 말단이 없기 때문에, 뉴클레아제에 의한 분해를 받기 어렵다는 특징이 있다.
또한 특허문헌 2에는, 세포 내에서 개환하도록 디자인된, 상호 상보적인 서열을 갖는 2개의 환형 핵산을 세포에 함께 투여함으로써, 세포 내에서 siRNA를 구축하는 것이 개시되어 있다.
특허문헌 1 : 일본 특허공개 2008-278784호 공보 특허문헌 2 : 일본 특허공개 2014-143923호 공보
비특허문헌 1 : 네이처(Nature), 제411권, 제6836호, 494-498 페이지(2001년) 비특허문헌 2 : 네이처 리뷰스 캔서(Nature Reviews Cancer), 제11권, 59-67 페이지(2011년)
그러나, 특허문헌 1이나 2에 개시된 환형 핵산에 있어서는, 뉴클레아제에 대한 안정성의 향상은 보고되어 있지만, 유전자의 사이렌싱에 관한 정보는 적어, 강한 넉다운 활성을 갖는 환형화된 핵산에 대한 요망은 강하다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 뉴클레아제에 대한 내성을 가지면서 또한 강한 넉다운 활성을 갖는 신규의 올리고뉴클레오티드 유도체를 제공하는 데에 있다.
본 발명은 이하의 실시형태를 포함한다.
[1]
환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염으로서,
환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드가 상호 상보적인 염기 서열을 가지고, 이 상보적인 염기 서열의 수소 결합을 통해 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드가 복합체를 형성하고 있는, 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[2]
환형 올리고뉴클레오티드가 10∼40의 염기 길이를 갖는 [1]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[3]
환형 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 [1] 또는 [2]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[4]
환형 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 2'- 수식 뉴클레오티드를 포함하는 [1]∼[3]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[4-1]
2'- 수식 뉴클레오티드가, 리보오스의 2'-OH기가 -OR, -R, -R'OR, -SH, -SR, -NH2, -NHR, -NR2, -N3, -CN, -F, -Cl, -Br 및 -I(R은 알킬 또는 아릴, 바람직하게는 탄소수 1∼6의 알킬이고, R'은 알킬렌, 바람직하게는 탄소수 1∼6의 알킬렌이고, -NR2의 2개의 R은 동일하더라도 다르더라도 좋다)로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기로 치환된 2'- 수식 뉴클레오티드인 [4]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[4-2]
2'- 수식 뉴클레오티드가, 리보오스의 2'-OH기가 -F, 메톡시기 및 에톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기로 치환된 2'- 수식 뉴클레오티드인 [4]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[4-3]
2'- 수식 뉴클레오티드가, 리보오스의 2'-OH기가 2-(메톡시)에톡시기, 3-아미노프로폭시기, 2-[(N,N-디메틸아미노)옥시]에톡시기, 3-(N,N-디메틸아미노)프로폭시기, 2-[2-(N,N-디메틸아미노)에톡시]에톡시기, 2-(메틸아미노)-2-옥소에톡시기, 2-(N-메틸카르바모일)에톡시기 및 2-시아노에톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기로 치환된 2'- 수식 뉴클레오티드인 [4]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[5]
환형 올리고뉴클레오티드의 염기 길이가, 선형 올리고뉴클레오티드의 염기 길이와 동일하거나 또는 선형 올리고뉴클레오티드의 염기 길이보다도 긴 [1]∼[4-3]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[6]
환형 올리고뉴클레오티드가 식 1로 표시되는 [1]∼[5]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
식 1:
Figure pct00001
(식 중,
L1 및 L2는 링커를 나타내고,
n1 및 n2는 각각 독립적으로 0∼10의 정수를 나타내고,
M은 세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조를 포함하는 부분을 나타내고,
X는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.)
[6-1-1]
환형 올리고뉴클레오티드가 10∼40의 염기 길이를 갖는 [6]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[6-1-2]
환형 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 [6] 또는 [6-1-1]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[6-1-3]
환형 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 2'- 수식 뉴클레오티드를 포함하는 [6]∼[6-1-2]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[6-2-1]
세포 내의 환경이 세포 내에 존재하는 효소인 [6]∼[6-1-3]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[6-2-2]
세포 내의 환경이 세포 내의 pH인 [6]∼[6-1-3]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[6-2-3]
n1 및 n2가 각각 독립적으로 0∼8의 정수인 [6]∼[6-2-2]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[7]
세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조가 -S-S-, -S-C(O)- 또는 -C(O)-S-인 [6]∼[6-2-3]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8]
M이 식 3-1∼식 3-6으로 이루어지는 군에서 선택되는 [6]∼[7]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
Figure pct00002
(식 중,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R1 및 R2는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R3 및 R4는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
n5∼n8은 각각 독립적으로 0∼10의 정수를 나타내고,
n9 및 n10은 각각 독립적으로 1∼4의 정수를 나타내고,
Y1∼Y4는 각각 독립적으로 결합, -NR5-, -O- 또는 -S-를 나타내고,
R5는 수소 원자, C1-C3 알킬 또는 C2-C4 알카노일을 나타낸다.)
Figure pct00003
(식 중,
R1' 및 R2'는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R1' 및 R2'는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
R3' 및 R4'는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R3' 및 R4'는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
R5' 및 R6'은 결합하는 탄소 원자마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬이고,
n5' 및 n6'은 각각 독립적으로 1∼10의 정수를 나타낸다.)
[8-1-1]
M이 식 3-1인 [8]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-1-2]
R1∼R4가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬인 [8-1-1]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-1-3]
Y3 및 Y4가 결합 또는 -O-인 [8-1-1] 또는 [8-1-2]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-1-4]
n5 및 n7의 합계가 0∼5의 정수인 [8-1-1]∼[8-1-3]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-1-5]
n6 및 n8의 합계가 0∼5의 정수인 [8-1-1]∼[8-1-4]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-2-1]
M이 식 3-2인 [8]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-2-2]
Y1 및 Y2가 각각 독립적으로 결합 또는 -O-인 [8-2-1]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-2-3]
Y3 및 Y4가 결합인 [8-2-1] 또는 [8-2-2]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-2-4]
n5 및 n7의 합계 그리고 n6 및 n8의 합계가 0인 [8-2-1]∼[8-2-3]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-2-5]
n9가, Y1이 -O-인 경우 2이고, Y1이 결합인 경우 3인 [8-2-1]∼[8-2-4]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-2-6]
n10이, Y2가 -O-인 경우 2이고, Y2가 결합인 경우 3인 [8-2-1]∼[8-2-5]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-3-1]
M이 식 3-3인 [8]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-3-2]
R3 및 R4가 수소인 [8-3-1]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-3-3]
Y1이 결합 또는 -O-인 [8-3-1] 또는 [8-3-2]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-3-4]
Y3 및 Y4가 결합인 [8-3-1]∼[8-3-3]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-3-5]
n5 및 n7의 합계가 0인 [8-3-1]∼[8-3-4]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-3-6]
n6 및 n8의 합계가 5인 [8-3-1]∼[8-3-5]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-3-7]
n9가, Y1이 -O-인 경우 2이고, Y1이 결합인 경우 3인 [8-3-1]∼[8-3-6]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-4-1]
M이 식 3-4인 [8]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-4-2]
R1 및 R2가 수소 원자인 [8-4-1]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-4-3]
Y2가 결합 또는 -O-인 [8-4-1] 또는 [8-4-2]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-4-4]
Y3 및 Y4가 결합인 [8-4-1]∼[8-4-3]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-4-5]
n5 및 n7의 합계가 5인 [8-4-1]∼[8-4-4]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-4-6]
n6 및 n8의 합계가 0인 [8-4-1]∼[8-4-5]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-4-7]
n10이, Y2가 -O-인 경우 2이고, Y2가 결합인 경우 3인 [8-4-1]∼[8-4-6]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-5-1]
M이 식 3-5인 [8]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-5-2]
R1' 및 R2'가 수소 원자인 [8-5-1]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-5-3]
R3' 및 R4'가 수소 원자인 [8-5-1] 또는 [8-5-2]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-5-4]
R5'가, 결합하는 탄소 원자마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸인 [8-5-1]∼[8-5-3]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-5-5]
R6'이 수소 원자인 [8-5-1]∼[8-5-4]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-5-6]
n5'가 2인 [8-5-1]∼[8-5-5]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-5-7]
n6'이 2인 [8-5-1]∼[8-5-6]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-6-1]
M이 식 3-6인 [8]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-6-2]
R1' 및 R2'가 수소 원자인 [8-6-1]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-6-3]
R3' 및 R4'가 수소 원자인 [8-6-1] 또는 [8-6-2]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-6-4]
R5'가, 결합하는 탄소 원자마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸인 [8-6-1]∼[8-6-3]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-6-5]
R6'이 수소 원자인 [8-6-1]∼[8-6-4]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-6-6]
n5'가 2인 [8-6-1]∼[8-6-5]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-6-7]
n6'이 2인 [8-6-1]∼[8-6-6]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8-7]
M이 2∼6의 아미노산 잔기를 포함하는 부분인 [6]∼[7]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8A]
L1 및 L2가 각각 독립적으로 식 2-1∼식 2-4로 이루어지는 군에서 선택되는 [6]∼[8-7]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
Figure pct00004
(식 중,
n3 및 n4는 각각 독립적으로 1∼15의 정수를 나타내고,
Ak는 치환기를 갖고 있어도 좋은 C2-C22 알킬렌을 나타내고,
Base는 수소 원자, 치환기를 갖고 있어도 좋은 아데니닐, 치환기를 갖고 있어도 좋은 구아니닐, 치환기를 갖고 있어도 좋은 시토시닐, 치환기를 갖고 있어도 좋은 티미닐 또는 치환기를 갖고 있어도 좋은 우라시닐을 나타내고,
Q는 수소 원자, 히드록시기, 할로겐, 또는 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1-C4 알킬옥시기를 나타내고,
Z는 산소 원자 또는 황 원자를 나타낸다.)
[8A-1-1]
한쪽의 Z가 산소 원자이고, 다른 쪽의 Z가 황 원자인 [8A]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8A-1-2]
치환기를 갖고 있어도 좋은 C2-C22 알킬렌에 있어서의 치환기가, 치환기를 갖고 있어도 좋은 아릴기, 치환기를 갖고 있어도 좋은 아미노기 및 치환기를 갖고 있어도 좋은 알콕시기로 이루어지는 군에서 선택되는 [8A] 또는 [8A-1-1]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8A-1-3]
치환기를 갖고 있어도 좋은 아릴기가 이하의 구조로 표시되는 [8A-1-2]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
Figure pct00005
[8A-1-4]
치환기를 갖고 있어도 좋은 아미노기가 이하의 구조로 표시되는 [8A-1-2]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
Figure pct00006
[8A-1-5]
치환기를 갖고 있어도 좋은 알콕시기가 이하의 구조로 표시되는 [8A-1-2]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
Figure pct00007
[8A-1-6]
n4가 1∼3의 정수인 [8A]∼[8A-1-5]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8A-1-7]
Base가 치환기를 갖고 있어도 좋은 우라시닐인 [8A]∼[8A-1-6]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8A-1-8]
치환기를 갖고 있어도 좋은 우라시닐이 이하의 구조로 표시되는 [8A-1-7]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
Figure pct00008
[8A-1-9]
Q가 수소 원자 또는 C1-C4 알킬옥시기인 [8A]∼[8A-1-8]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8A-1-10]
n3이 3인 [8A]∼[8A-1-9]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8A-2-1]
L1이 식 2-1인 [8A]∼[8A-1-10]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8A-2-2]
L1이 식 2-2인 [8A]∼[8A-1-10]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8A-2-3]
L1이 식 2-3인 [8A]∼[8A-1-10]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8A-2-4]
L1이 식 2-4인 [8A]∼[8A-1-10]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8A-3-1]
L2가 식 2-1인 [8A]∼[8A-2-4]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8A-3-2]
L2가 식 2-2인 [8A]∼[8A-2-4]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8A-3-3]
L2가 식 2-3인 [8A]∼[8A-2-4]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[8A-3-4]
L2가 식 2-4인 [8A]∼[8A-2-4]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[9]
적어도 하나의 표적화 화합물을 갖는 [6]∼[8A-3-4]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[10]
표적화 화합물이 L1 및 L2의 적어도 하나에 결합하고 있는 [9]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[11]
표적화 화합물이 콜레스테롤, 토코페롤, 도코사헥사엔산, 미리스틴산, 팔미틴산 및 N-아세틸-D-갈락토사민으로 이루어지는 군에서 선택되는 [9] 또는 [10]에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
[12]
[1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염을 포함하는 의약 조성물.
[13]
정맥내 투여 또는 피하 투여되는 [12]에 기재한 의약 조성물.
[14]
[1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염, 또는 [12] 혹은 [13]에 기재한 의약 조성물을, 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 또는 예방 방법.
[15]
[1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염을 포함하는, RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현억제제.
[16]
적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 식 4로 표시되는 환형 올리고뉴클레오티드.
식 4:
Figure pct00009
(식 중,
L3 및 L4는 링커를 나타내고,
m1 및 m2는 각각 독립적으로 0∼10의 정수를 나타내고,
M2는 세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조를 포함하는 부분을 나타내고,
X2는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.)
[16-1-1]
15∼40의 염기 길이를 갖는 [16]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[16-1-2]
적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 [16] 또는 [16-1-1]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[16-1-3]
적어도 하나의 2'- 수식 뉴클레오티드를 포함하는 [16]∼[16-1-2]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[16-2-1]
세포 내의 환경이 세포 내에 존재하는 효소인 [16]∼[16-1-3]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[16-2-2]
세포 내의 환경이 세포 내의 pH인 [16]∼[16-1-3]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[16-2-3]
m1 및 m2가 각각 독립적으로 0∼8의 정수인 [16]∼[16-2-2]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[17]
세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조가 -S-S-, -S-C(O)- 또는 -C(O)-S-인 [16]∼[16-2-3]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18]
M2가 식 6-1∼식 6-6으로 이루어지는 군에서 선택되는 [16]∼[17]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
Figure pct00010
(식 중,
R1a 및 R2a는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R1a 및 R2a는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
R3a 및 R4a는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R3a 및 R4a는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
n5a∼n8a는 각각 독립적으로 0∼10의 정수를 나타내고,
n9a 및 n10a는 각각 독립적으로 1∼4의 정수를 나타내고,
Y1a∼Y4a는 각각 독립적으로 결합, -NR5a-, -O- 또는 -S-를 나타내고,
R5a는 수소 원자, C1-C3 알킬 또는 C2-C4 알카노일을 나타낸다.)
Figure pct00011
(식 중,
R1a' 및 R2a'는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R1a' 및 R2a'는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
R3a' 및 R4a'는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R3a' 및 R4a'는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
R5a' 및 R6a'는 결합하는 탄소 원자마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬이고,
n5a' 및 n6a'은 각각 독립적으로 1∼10의 정수를 나타낸다.)
[18-1-1]
M2가 식 6-1인 [18]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-1-2]
R1a∼R4a가 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬인 [18-1-1]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-1-3]
Y3a 및 Y4a가 결합 또는 -O-인 [18-1-1] 또는 [18-1-2]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-1-4]
n5a 및 n7a의 합계가 0∼5의 정수인 [18-1-1]∼[18-1-3]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-1-5]
n6a 및 n8a의 합계가 0∼5의 정수인 [18-1-1]∼[18-1-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-2-1]
M2가 식 6-2인 [18]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-2-2]
Y1a 및 Y2a가 각각 독립적으로 결합 또는 -O-인 [18-2-1]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-2-3]
Y3a 및 Y4a가 결합인 [18-2-1] 또는 [18-2-2]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-2-4]
n5a 및 n7a의 합계 그리고 n6a 및 n8a의 합계가 0인 [18-2-1]∼[18-2-3]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-2-5]
n9a가, Y1a가 -O-인 경우 2이고, Y1a가 결합인 경우 3인 [18-2-1]∼[18-2-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-2-6]
n10a가, Y2a가 -O-인 경우 2이고, Y2a가 결합인 경우 3인 [18-2-1]∼[18-2-5]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-3-1]
M2가 식 6-3인 [18]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-3-2]
R3a 및 R4a가 수소인 [18-3-1]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-3-3]
Y1a가 결합 또는 -O-인 [18-3-1] 또는 [18-3-2]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-3-4]
Y3a 및 Y4a가 결합인 [18-3-1]∼[18-3-3]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-3-5]
n5a 및 n7a의 합계가 0인 [18-3-1]∼[18-3-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-3-6]
n6a 및 n8a의 합계가 5인 [18-3-1]∼[18-3-5]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-3-7]
n9a가, Y1a가 -O-인 경우 2이고, Y1a가 결합인 경우 3인 [18-3-1]∼[18-3-6]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-4-1]
M2가 식 6-4인 [18]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-4-2]
R1a 및 R2a가 수소 원자인 [18-4-1]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-4-3]
Y2a가 결합 또는 -O-인 [18-4-1] 또는 [18-4-2]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-4-4]
Y3a 및 Y4a가 결합인 [18-4-1]∼[18-4-3]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-4-5]
n5a 및 n7a의 합계가 5인 [18-4-1]∼[18-4-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-4-6]
n6a 및 n8a의 합계가 0인 [18-4-1]∼[18-4-5]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-4-7]
n10a가, Y2a가 -O-인 경우 2이고, Y2a가 결합인 경우 3인 [18-4-1]∼[18-4-6]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-5-1]
M2가 식 6-5인 [18]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-5-2]
R1a' 및 R2a'가 수소 원자인 [18-5-1]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-5-3]
R3a' 및 R4a'가 수소 원자인 [18-5-1] 또는 [18-5-2]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-5-4]
R5a'가, 결합하는 탄소 원자마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸인 [18-5-1]∼[18-5-3]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-5-5]
R6a'가 수소 원자인 [18-5-1]∼[18-5-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-5-6]
n5a'가 2인 [18-5-1]∼[18-5-5]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-5-7]
n6a'가 2인 [18-5-1]∼[18-5-6]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-6-1]
M2가 식 6-6인 [18]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-6-2]
R1a' 및 R2a'가 수소 원자인 [18-6-1]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-6-3]
R3a' 및 R4a'가 수소 원자인 [18-6-1] 또는 [18-6-2]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-6-4]
R5a'가, 결합하는 탄소 원자마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸인 [18-6-1]∼[18-6-3]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-6-5]
R6a'가 수소 원자인 [18-6-1]∼[18-6-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-6-6]
n5a'가 2인 [18-6-1]∼[18-6-5]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-6-7]
n6a'가 2인 [18-6-1]∼[18-6-6]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18-7]
M2가 2∼6의 아미노산 잔기를 포함하는 부분인 [16]∼[17]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18A]
L3 및 L4가 각각 독립적으로 식 5-1∼식 5-4로 이루어지는 군에서 선택되는 [16]∼[18-7]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
Figure pct00012
(식 중,
n3a 및 n4a는 각각 독립적으로 1∼15의 정수를 나타내고,
Ak'는 치환기를 갖고 있어도 좋은 C2-C22 알킬렌기를 나타내고,
Base'는 수소 원자, 치환기를 갖고 있어도 좋은 아데니닐, 치환기를 갖고 있어도 좋은 구아니닐, 치환기를 갖고 있어도 좋은 시토시닐, 치환기를 갖고 있어도 좋은 티미닐 또는 치환기를 갖고 있어도 좋은 우라시닐을 나타내고,
Qa는 수소 원자, 히드록시기, 할로겐, 또는 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1-C4 알킬옥시기를 나타내고,
Za는 산소 원자 또는 황 원자를 나타낸다.)
[18A-1-1]
한쪽의 Za가 산소 원자이고, 다른 쪽의 Za가 황 원자인 [18A]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18A-1-2]
치환기를 갖고 있어도 좋은 C2-C22 알킬렌에 있어서의 치환기가, 치환기를 갖고 있어도 좋은 아릴기, 치환기를 갖고 있어도 좋은 아미노기 및 치환기를 갖고 있어도 좋은 알콕시기로 이루어지는 군에서 선택되는 [18A] 또는 [18A-1-1]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18A-1-3]
치환기를 갖고 있어도 좋은 아릴기가 이하의 구조로 표시되는 [18A-1-2]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
Figure pct00013
[18A-1-4]
치환기를 갖고 있어도 좋은 아미노기가 이하의 구조로 표시되는 [18A-1-2]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
Figure pct00014
[18A-1-5]
치환기를 갖고 있어도 좋은 알콕시기가 이하의 구조로 표시되는 [18A-1-2]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
Figure pct00015
[18A-1-6]
n4a가 1∼3의 정수인 [18A]∼[18A-1-5]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18A-1-7]
Base'가 치환기를 갖고 있어도 좋은 우라시닐인 [18A]∼[18A-1-6]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18A-1-8]
치환기를 갖고 있어도 좋은 우라시닐이 이하의 구조로 표시되는 [18A-1-7]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
Figure pct00016
[18A-1-9]
Qa가 수소 원자 또는 C1-C4 알킬옥시기인 [18A]∼[18A-1-8]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18A-1-10]
n3a가 3인 [18A]∼[18A-1-9]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18A-2-1]
L3이 식 5-1인 [18A]∼[18A-1-10]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18A-2-2]
L3이 식 5-2인 [18A]∼[18A-1-10]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18A-2-3]
L3이 식 5-3인 [18A]∼[18A-1-10]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18A-2-4]
L3이 식 5-4인 [18A]∼[18A-1-10]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18A-3-1]
L4가 식 5-1인 [18A]∼[18A-2-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18A-3-2]
L4가 식 5-2인 [18A]∼[18A-2-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18A-3-3]
L4가 식 5-3인 [18A]∼[18A-2-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[18A-3-4]
L4가 식 5-4인 [18A]∼[18A-2-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[19]
식 7로 표시되는, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 선형 올리고뉴클레오티드.
식 7:
Figure pct00017
(식 중,
X2, L3, L4, m1 및 m2는 [16], [16-2-3] 및 [18A]∼[18A-3-4]의 어느 하나에서 정의한 것과 같고,
W1 및 W2는, 상호 반응하여, 세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조를 형성하는 작용기를 포함하거나 발생시키는 부분이다.)
[19-1]
세포 내의 환경이 세포 내에 존재하는 효소인 [19]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[19-2]
세포 내의 환경이 세포 내의 pH인 [19]에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드.
[20]
세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조가 -S-S-, -S-C(O)- 또는 -C(O)-S-인 [19]∼[19-2]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드.
[21]
W1 및 W2가 각각 독립적으로 -A1-S-S-A2 또는 -B1-COO-B2이고(단, W1 및 W2가 동시에 -B1-COO-B2인 경우를 제외한다),
A1 및 B1이 각각 독립적으로 치환기를 갖고 있어도 좋은 C2-C10 알킬렌이고,
A2는 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1-C10 알킬이고,
B2는 수소 원자, 또는 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1-C6 알킬인 [19]∼[20]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드.
[22]
[19]∼[21]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드를 포함하는, RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현억제제.
[23]
[19]∼[21]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드를 고리화하는 것을 포함하는 [16]∼[18A-2-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드의 제조 방법.
[24]
[16]∼[18A-2-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드를, 이 환형 올리고뉴클레오티드와 상보적인 염기 서열을 갖는 선형 올리고뉴클레오티드와 수소 결합을 통해 복합화시키는 것을 포함하는 [1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염의 제조 방법.
본 발명은 또한 이하의 실시형태를 포함한다.
[25-1]
질환의 치료에 사용하기 위한 [1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염, [16]∼[18A-3-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드, 또는 [19]∼[21]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드.
[25-2]
표적 유전자의 발현 억제에 사용하기 위한 [1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염, [16]∼[18A-3-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드, 또는 [19]∼[21]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드.
[26-1]
질환의 치료에 사용하기 위한 [1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염, [16]∼[18A-3-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드, 또는 [19]∼[21]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 의약 조성물.
[26-2]
표적 유전자의 발현 억제에 사용하기 위한 [1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염, [16]∼[18A-3-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드, 또는 [19]∼[21]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 의약 조성물.
[27-1]
질환을 치료하기 위한 [1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염, [16]∼[18A-3-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드, 또는 [19]∼[21]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드의 용도.
[27-2]
표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 [1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염, [16]∼[18A-3-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드, 또는 [19]∼[21]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드의 용도.
[28-1]
질환의 치료용 의약의 제조에 있어서의 [1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염, [16]∼[18A-3-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드, 또는 [19]∼[21]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드의 용도.
[28-2]
표적 유전자의 발현 억제용 의약의 제조에 있어서의 [1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염, [16]∼[18A-3-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드, 또는 [19]∼[21]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드의 용도.
[29-1]
질환의 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 [1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염, [16]∼[18A-3-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드, 또는 [19]∼[21]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드.
[29-2]
표적 유전자의 발현 억제용 의약의 제조에 사용하기 위한 [1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염, [16]∼[18A-3-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드, 또는 [19]∼[21]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드.
[30-1]
유효량의 [1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염, [16]∼[18A-3-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드, 또는 [19]∼[21]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드를, 그 필요가 있는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법.
[30-2]
유효량의 [1]∼[11]의 어느 하나에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염, [16]∼[18A-3-4]의 어느 하나에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드, 또는 [19]∼[21]의 어느 하나에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드를, 그 필요가 있는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 표적 유전자의 발현 억제 방법.
본 발명에 의하면, 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 내성을 가지면서 또한 강한 넉다운 활성을 갖는 신규의 올리고뉴클레오티드 유도체를 제공할 수 있다.
도 1은 마우스 초대 간세포 내에서의 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1) 표적의 화합물 1 및 화합물 2에 의한 넉다운 활성을 도시한다. HPRT1_dsRNA1 및 HPRT1_dsRNA2 그리고 화합물 1 및 2를, 각각 1 μmoL/L, 0.3 μmoL/L, 0.1 μmoL/L 및 0.03 μmol/L의 농도에 있어서, 마우스 초대 간세포에 첨가했을 때의 시험 결과를 나타내고, Medium은 siRNA 미도입군(컨트롤군)의 시험 결과를 나타낸다. 종축은, Medium(컨트롤군)의 HPRT1의 mRNA량을 1로 했을 때의 상기 각 siRNA 도입 검체의 HPRT1의 mRNA량의 상대적인 비율을, n수를 3으로 한 평균±표준편차로 나타낸다. HPRT1_dsRNA1 및 HPRT1_dsRNA2는 각각 화합물 1 및 화합물 2에 대한 음성 대조군이다.
도 2는 마우스 초대 간세포 내에서의 비투엠(B2M) 표적의 화합물 3에 의한 넉다운 활성을 도시한다. B2M_dsRNA 및 화합물 3을, 각각 1 μmoL/L, 0.3 μmoL/L, 0.1 μmoL/L 및 0.03 μmol/L의 농도에 있어서, 마우스 초대 간세포에 첨가했을 때의 시험 결과를 나타내고, Medium은 siRNA 미도입군(컨트롤군)에서의 시험 결과를 나타낸다. 종축은, Medium(컨트롤군)의 B2M의 mRNA량을 1로 했을 때의 상기 각 siRNA 도입 검체의 B2M의 mRNA량의 상대적인 비율을, n수를 3으로 한 평균±표준편차로 나타낸다. B2M_dsRNA는 화합물 3에 대한 음성 대조군이다.
도 3은 마우스 초대 간세포 내에서의 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1) 표적의 화합물 4 및 화합물 5에 의한 넉다운 활성을 도시한다. HPRT1_dsRNA3 및 HPRT1_dsRNA4 그리고 화합물 4 및 5를, 각각 1 μmoL/L, 0.3 μmoL/L, 0.1 μmoL/L 및 0.03 μmol/L의 농도에 있어서, 마우스 초대 간세포에 첨가했을 때의 시험 결과를 나타내고, Medium은 siRNA 미도입군(컨트롤군)에서의 시험 결과를 나타낸다. 종축은, Medium(컨트롤군)의 HPRT1의 mRNA량을 1로 했을 때의 상기 각 siRNA 도입 검체의 HPRT1의 mRNA량의 상대적인 비율을, n수를 3으로 한 평균±표준편차로 나타낸다. HPRT1_dsRNA3 및 HPRT1_dsRNA4는 각각 화합물 4 및 화합물 5에 대한 음성 대조군이다.
도 4는 마우스 초대 간세포 내에서의 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1) 표적의 화합물 6에 의한 넉다운 활성을 도시한다. HPRT1_dsRNA5 및 화합물 6을, 각각 0.3 μmoL/L, 0.1 μmoL/L, 0.03 μmol/L 및 0.01 μmol/L의 농도에 있어서, 마우스 초대 간세포에 첨가했을 때의 시험 결과를 나타내고, Medium은 siRNA 미도입군(컨트롤군)에서의 시험 결과를 나타낸다. 종축은, Medium(컨트롤군)의 HPRT1의 mRNA량을 1로 했을 때의 상기 각 siRNA 도입 검체의 HPRT1의 mRNA량의 상대적인 비율을, n수를 3으로 한 평균±표준편차로 나타낸다. HPRT1_dsRNA5는 화합물 6에 대한 음성 대조군이다.
도 5는 헬라(HeLa) 세포 내에서의 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1) 표적의 화합물 6에 의한 넉다운 활성을 도시한다. HPRT1_dsRNA5 및 화합물 6을, 각각 3 μmoL/L, 1 μmoL/L, 0.3 μmol/L 및 0.1 μmol/L의 농도에 있어서, HeLa 세포에 첨가했을 때의 시험 결과를 나타내고, Medium은 siRNA 미도입군(음성 대조군)에서의 시험 결과를 나타낸다. 종축은, Medium군(음성 대조군)의 HPRT1의 mRNA량을 1로 했을 때의 상기 각 siRNA 도입 검체의 HPRT1의 mRNA량의 상대적인 비율을, n수를 3으로 한 평균±표준편차로 나타낸 것이다. HPRT1_dsRNA5는 화합물 6에 대한 음성 대조군으로서 이용하고 있다.
도 6은 헵지투(HepG2) 세포 내에서의 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1) 표적의 화합물 6에 의한 넉다운 활성을 도시한다. HPRT1_dsRNA5 및 화합물 6을, 각각 3 μmoL/L, 1 μmoL/L, 0.3 μmol/L 및 0.1 μmol/L의 농도에 있어서, HepG2 세포에 첨가했을 때의 시험 결과를 나타내고, Medium은 siRNA 미도입군(컨트롤군)에서의 시험 결과를 나타낸다. 종축은, Medium(컨트롤군)의 HPRT1의 mRNA량을 1로 했을 때의 상기 각 siRNA 도입 검체의 HPRT1의 mRNA량의 상대적인 비율을, n수를 3으로 한 평균±표준편차로 나타낸다. HPRT1_dsRNA5는 화합물 6에 대한 음성 대조군이다.
도 7은 휴에이치세븐(HuH-7) 세포 내에서의 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1) 표적의 화합물 6에 의한 넉다운 활성을 도시한다. HPRT1_dsRNA5 및 화합물 6을, 각각 3 μmoL/L, 1 μmoL/L, 0.3 μmol/L 및 0.1 μmol/L의 농도에 있어서, HuH-7 세포에 첨가했을 때의 시험 결과를 나타내고, Medium은 siRNA 미도입군(컨트롤군)에서의 시험 결과를 나타낸다. 종축은, Medium(컨트롤군)의 HPRT1의 mRNA량을 1로 했을 때의 상기 각 siRNA 도입 검체의 HPRT1의 mRNA량의 상대적인 비율을, n수를 3으로 한 평균±표준편차로 나타낸다. HPRT1_dsRNA5는 화합물 6에 대한 음성 대조군이다.
도 8은 로우 264.7 세포(RAW264.7) 내에서의 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1) 표적의 화합물 6에 의한 넉다운 활성을 도시한다. HPRT1_dsRNA5 및 화합물 6을, 각각 3 μmoL/L, 1 μmoL/L, 0.3 μmol/L 및 0.1 μmol/L의 농도에 있어서, RAW264.7 세포에 첨가했을 때의 시험 결과를 나타내고, Medium은 siRNA 미도입군(컨트롤군)에서의 시험 결과를 나타낸다. 종축은, Medium(컨트롤군)의 HPRT1의 mRNA량을 1로 했을 때의 상기 각 siRNA 도입 검체의 HPRT1의 mRNA량의 상대적인 비율을, n수를 3으로 한 평균±표준편차로 나타낸다. HPRT1_dsRNA5는 화합물 6에 대한 음성 대조군이다.
도 9는 래트 혈청 내에서의 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1) 표적의 화합물 6의 안티센스쇄의 잔존률을 도시한다. 횡축은, HPRT1_dsRNA5 및 화합물 6을 래트 혈청에 첨가하기 시작하고 나서의 시간을 반응 시간으로서 나타낸다. 종축은, 반응 시작 시의 안티센스쇄량을 100%로 했을 때의, 각 시간에 있어서의 상대적인 잔존률을, n수를 3으로 한 평균±표준편차로 나타낸다. HPRT1_dsRNA5는 화합물 6에 대한 음성 대조군으로서 이용하고 있다.
도 10은 엑소뉴클레아제 함유 용액 내에서의 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1) 표적의 화합물 6의 안티센스쇄의 잔존률을 도시한다. 횡축은, HPRT1_dsRNA5 및 화합물 6을 엑소뉴클레아제 함유 용액에 첨가하기 시작하고 나서의 시간을 반응 시간으로서 나타낸다. 종축은, 반응 시작 시의 안티센스쇄량을 100%로 했을 때의, 각 시간에 있어서의 상대적인 잔존률을, n수를 3으로 한 평균±표준편차로 나타낸다. HPRT1_dsRNA5는 화합물 6에 대한 음성 대조군이다.
도 11은 마우스 초대 간세포 내에서의 포스파타아제 앤드 텐신 호몰로그 딜리티드 프롬 크로모좀 10(PTEN) 표적의 화합물 7 및 팩터 9(Factor9) 표적의 화합물 8에 의한 넉다운 활성을 도시한다.
도 12는 헬라 세포 내에서의 HPRT1 표적의 각 화합물에 의한 넉다운 활성을 도시한다.
도 13은 헬라 세포 내에서의 HPRT1 표적의 각 화합물에 의한 넉다운 활성을 도시한다.
도 14는 헬라 세포 내에서의 HPRT1 표적의 각 화합물에 의한 넉다운 활성을 도시한다.
도 15는 헬라 세포 내에서의 HPRT1 표적의 각 화합물에 의한 넉다운 활성을 도시한다.
도 16은 헬라 세포 내에서의 HPRT1 표적의 각 화합물에 의한 넉다운 활성을 도시한다.
도 17은 헬라 세포 내에서의 HPRT1 표적의 각 화합물에 의한 넉다운 활성을 도시한다.
도 18은 헬라 세포 내에서의 HPRT1 표적의 화합물 47에 의한 넉다운 활성을 도시한다.
도 19는 마우스 초대 간세포 내에서의 HPRT1 표적의 화합물 48 및 49의 넉다운 활성을 도시한다.
도 20은 마우스 초대 간세포 내에서의 B2M 표적의 화합물 50의 넉다운 활성을 도시한다.
도 21은 헬라 세포 내에서의 HPRT1 표적의 화합물 51에 의한 넉다운 활성을 도시한다.
도 22는 마우스 초대 간세포 내에서의 PTEN 표적의 화합물 52 및 Factor9 표적의 화합물 53에 의한 넉다운 활성을 도시한다.
<올리고뉴클레오티드 유도체>
본 발명은, 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드가 상호 상보적인 염기 서열을 가지며, 이 상보적인 염기 서열의 수소 결합을 통해 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드가 복합체를 형성하고 있는 올리고뉴클레오티드 유도체에 관한 것이다. 본 명세서에서는, 본 발명에 있어서의 올리고뉴클레오티드 유도체를 핵산 복합체라고도 한다.
본 발명에서는, 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드가 이용되지만, 환형인지 선형인지를 막론하고, 올리고뉴클레오티드로서는, 뉴클레오티드의 중합체이면 어떠한 분자라도 좋으며, 예컨대 데옥시리보뉴클레오티드의 중합체인 DNA, 리보뉴클레오티드의 중합체인 RNA, DNA와 RNA의 중합체인 키메라 핵산을 들 수 있다.
올리고뉴클레오티드로서는, 뉴클레오티드의 중합체에 있어서, 전부 또는 일부의 뉴클레오티드 대신에 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자를 포함하고 있어도 좋고, DNA, RNA 및 키메라 핵산에 있어서, 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드나 리보뉴클레오티드 등의 뉴클레오티드가 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자로 치환된 뉴클레오티드의 중합체라도 좋다. RNA 중의 우라실(U)은, DNA에 있어서는 티민(T)으로 일의적으로 바꿔 읽을 수 있다.
올리고뉴클레오티드를 구성하는 뉴클레오티드 중, 모든 뉴클레오티드가 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자라도 좋고, 일부의 뉴클레오티드가 뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자라도 좋다.
뉴클레오티드와 동등한 기능을 갖는 분자로서는, 예컨대 뉴클레오티드에 수식을 실시한 뉴클레오티드 유도체를 들 수 있다.
뉴클레오티드 유도체를 이용함으로써, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 DNA 또는 RNA와 비교하여, 뉴클레아제 내성을 향상 혹은 안정화시킬 수 있다, 상보쇄 핵산과의 어피니티를 올릴 수 있고/거나 세포 투과성을 올릴 수 있다고 한 이점이 있다.
뉴클레오티드 유도체로서는, 예컨대 당부(糖部) 수식 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합 수식 뉴클레오티드, 염기 수식 뉴클레오티드, 그리고 당부, 인산디에스테르 결합 및 염기의 2개 이상이 동시에 수식된 뉴클레오티드를 들 수 있다.
당부 수식 뉴클레오티드로서는, 뉴클레오티드의 당의 화학 구조의 일부 혹은 전부에 대하여, 임의의 치환기로 수식 혹은 치환한 것, 또는 임의의 원자로 치환한 것이라면 어떠한 것이라도 좋지만, 2'- 수식 뉴클레오티드가 바람직하게 이용된다.
2'- 수식 뉴클레오티드로서는, 예컨대 리보오스의 2'-OH기가 -OR, -R, -R'OR, -SH, -SR, -NH2, -NHR, -NR2, -N3(아지드), -CN(시아노), -F, -Cl, -Br 및 -I로 이루어지는 군(R은 알킬 또는 아릴, 바람직하게는 탄소수 1∼6의 알킬이고, R'는 알킬렌, 바람직하게는 탄소수 1∼6의 알킬렌이고, -NR2의 2개의 R은 동일하더라도 다르더라도 좋다)에서 선택되는 치환기로 치환된 2'- 수식 뉴클레오티드를 들 수 있다.
2'- 수식 뉴클레오티드로서는, 리보오스의 2'-OH기가 -F, 메톡시기 및 에톡시기로 치환된 2'- 수식 뉴클레오티드가 바람직하게 이용된다.
2'- 수식 뉴클레오티드로서는, 리보오스의 2'-OH기가 2-(메톡시)에톡시기, 3-아미노프로폭시기, 2-[(N,N-디메틸아미노)옥시]에톡시기, 3-(N,N-디메틸아미노)프로폭시기, 2-[2-(N,N-디메틸아미노)에톡시]에톡시기, 2-(메틸아미노)-2-옥소에톡시기, 2-(N-메틸카르바모일)에톡시기 및 2-시아노에톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기로 치환된 2'- 수식 뉴클레오티드 등도 들 수 있다.
당부 수식 뉴클레오티드의 다른 양태로서, 당부에 가교 구조를 도입함으로써 2개의 환형 구조를 갖는 가교 구조형 인공 핵산(Bridged Nucleic Acid)(BNA)도 적합하게 이용된다.
당부 수식 뉴클레오티드는, 예컨대 2' 위치의 산소 원자와 4' 위치의 탄소 원자가 메틸렌을 통해 가교한 잠금 인공 핵산(Locked Nucleic Acid)(LNA)[Tetrahedron Letters, 38, 873(1997) 및 Tetrahedron, 54, 3607(1998)], 에틸렌 가교 구조형 인공 핵산(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)], 구속 에틸(cEt)[The Journal of Organic Chemistry 75, 1569(2010)], 아미도-가교 핵산(AmNA) [Chem Bio Chem 13, 2513(2012)] 및 2'-O,4'-c-스피로시클로프로필렌 가교 핵산(scpBNA)[Chem. Commun., 51, 9737(2015)] 등을 들 수 있다.
당부 수식 뉴클레오티드로서는, 펩티드 핵산(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)], 옥시펩티드 핵산(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653(2001)], 펩티드 리보 핵산(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900(2000)] 등도 들 수 있다.
인산디에스테르 결합 수식 뉴클레오티드로서는, 뉴클레오티드의 인산디에스테르 결합의 화학 구조의 일부 혹은 전부에 대하여, 임의의 치환기로 수식 혹은 치환한 것, 또는 임의의 원자로 치환한 것이라면 어떠한 것이라도 좋다.
인산디에스테르 결합 수식 뉴클레오티드로서는, 예컨대 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합이 포스포로디티오에이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합이 알킬포스포네이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합이 포스포르아미데이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드 등을 들 수 있고, 바람직하게는 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 뉴클레오티드를 들 수 있다.
염기 수식 뉴클레오티드로서는, 뉴클레오티드의 염기의 화학 구조의 일부 혹은 전부에 대하여, 임의의 치환기로 수식 혹은 치환한 것, 또는 임의의 원자로 치환한 것이라면 어떠한 것이라도 좋다.
염기 수식 뉴클레오티드로서는, 예컨대 염기 내의 산소 원자가 황 원자로 치환된 뉴클레오티드, 수소 원자가 탄소수 1∼6인 알킬기, 할로겐기로 치환된 뉴클레오티드, 메틸기가 수소 원자, 히드록시메틸기, 탄소수 2∼6의 알킬기로 치환된 뉴클레오티드, 아미노기가 탄소수 1∼6인 알킬기, 탄소수 1∼6인 알카노일기, 옥소기, 히드록시기 등으로 치환된 뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
염기 수식 뉴클레오티드로서는, 예컨대 시토신(C)이 5-메틸시토신(5-mC)으로 치환된 뉴클레오티드도 들 수 있다.
뉴클레오티드 유도체에 있어서의 환형 올리고뉴클레오티드 또는 선형 올리고뉴클레오티드에 있어서, 올리고뉴클레오티드 부분에, 당부 수식 뉴클레오티드, 인산디에스테르 결합 수식 뉴클레오티드 및 염기 수식 뉴클레오티드로서 설명한 치환을 2개 이상을 동시에 갖고 있어도 좋다.
표적 유전자의 mRNA, 바람직하게는, 인간 표적 유전자의 mRNA의 일부의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 안티센스쇄라고 하고, 안티센스쇄의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 센스쇄라고 한다. 센스쇄는 안티센스쇄와 쌍을 이뤄 이중쇄를 형성할 수 있다.
센스쇄로서는, 표적 유전자의 mRNA, 바람직하게는 인간 표적 유전자의 mRNA의 일부의 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 그 자체를 이용하여도 좋다.
본 발명에 있어서의 환형 올리고뉴클레오티드는, 안티센스쇄 또는 센스쇄의 어느 쪽을 포함하고 있어도 좋지만, 환형 올리고뉴클레오티드가 센스쇄를 포함하는 것이 바람직하다. 환형 올리고뉴클레오티드가 안티센스쇄를 포함하는 경우, 선형 뉴클레오티드는 센스쇄를 포함하는 것이 바람직하고, 환형 올리고뉴클레오티드가 센스쇄를 포함하는 경우, 선형 뉴클레오티드는 안티센스쇄를 포함하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 유도체에 있어서는, 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드가 상호 상보적인 염기 서열을 가지고, 이 상보적인 염기 서열의 수소 결합을 통해 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드가 복합체를 형성한다.
본 발명에 있어서의 올리고뉴클레오티드 유도체는, 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드가 복합체를 형성함으로써, 뉴클레아제에 대한 내성을 갖는다. 핵산 복합체에 있어서는, 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드가 상호 갖는 상보적인 염기 서열 부분에 있어서, 전부 또는 일부가 이중쇄를 형성하고 있어도 좋다.
또한 본 발명에서는, 환형 올리고뉴클레오티드가 세포 내에서 절단되는 구조를 가짐으로써, 소정의 세포에 송달된 후, 절단되어, 선형 2본쇄 올리고뉴클레오티드로 변환된다. 선형 2본쇄 올리고뉴클레오티드는 통상 RNA 유도형 사이렌싱 복합체(RISC)라고 불리는 세포내 단백질과 복합체를 형성한 후, RISC에 의한 표적 mRNA 절단을 야기함으로써 강한 넉다운 활성을 보인다고 생각된다.
본 발명에서는, 안티센스쇄 및 센스쇄라고 하는 경우에, 안티센스쇄는 표적유전자의 mRNA의 일부의 염기 서열에 대하여 상보적이고, 센스쇄는 안티센스쇄에 상보적이다.
또한 본 발명에서는, 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오가 상호 상보적인 염기 서열을 갖는다.
본 명세서에 있어서 「상보적」이란, 한쪽의 올리고뉴클레오티드 및 다른 쪽의 올리고뉴클레오티드에 있어서, 각각이 갖는 염기 서열이 완전히 상보하는 경우뿐만 아니라, 상기 염기 서열 사이에서 30% 이하의, 20% 이하의 또는 10% 이하의 미스매치 염기를 가질 수 있다.
한쪽의 올리고뉴클레오티드와 다른 쪽의 올리고뉴클레오티드는, 서로가 갖는 상보적인 염기 서열에 있어서, 1∼8개, 바람직하게는 1∼6개, 1∼4개, 1∼3개, 그 중에서도 2개 또는 1개의 미스매치 염기를 갖고 있어도 좋다.
본 명세서에서는, 예컨대 한쪽의 올리고뉴클레오티드에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 다른 쪽의 올리고뉴클레오티드는, 완전히 상보하는 염기 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 염기의 치환, 부가 및/또는 결실된 염기 서열을 갖고 있어도 좋다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 유도체에 있어서, 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드가 갖는 상호 상보적인 염기 서열은, 통상 15∼27 염기쌍이며, 15∼25 염기쌍이 바람직하고, 19∼23 염기쌍이 보다 바람직하다.
환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드에 있어서의 상기 상보적인 염기 서열에 있어서 수소 결합을 형성하고 있으면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 환형 올리고뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드에 있어서의 염기와 선형 올리고뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드에 있어서의 염기가 각각 수소 결합을 형성하도록 대향하고 있으면 되며, 염기쌍을 형성하고 있더라도 미스매치라도 좋다.
환형 올리고뉴클레오티드 및 선형 올리고뉴클레오티드의 한쪽이 안티센스쇄를 갖는 경우, 안티센스쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드에 있어서, 통상 15∼27 염기쌍의 상호 상보적인 염기 서열에 더하여, 그 염기 서열의 3' 말단에 있어서, 1∼7의 염기 길이의, 바람직하게는 2∼4의 염기 길이의, 보다 바람직하게는 2 염기 길이의 염기 서열을 갖고 있어도 좋다.
본 발명에서 이용되는 환형 올리고뉴클레오티드는, 올리고뉴클레오티드와, 환형화시키기 위한 생체 내에서 절단되는 화학 구조만을 갖고 있어도 좋고, 올리고뉴클레오티드와 생체 내에서 절단되는 화학 구조를 링커를 통해 결합시켜, 올리고뉴클레오티드를 환형화시키더라도 좋다.
환형 올리고뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드는, 뉴클레오티드만으로 이루어진 올리고뉴클레오티드라도 좋고, 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고뉴클레오티드라도 좋고, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체 이외의 수식을 받은 올리고뉴클레오티드라도 좋다.
환형 올리고뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드는 15∼80의 염기 길이의 염기 서열을 갖는 것이 바람직하고, 15∼40의 염기 길이의 염기 서열을 갖는 것이 보다 바람직하고, 15∼30의 염기 길이의 염기 서열을 갖는 것이 보다 더욱 바람직하다.
본 발명에서 이용되는 선형 올리고뉴클레오티드는, 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 선형이란 선형 올리고뉴클레오티드 전체의 구조가 직선형의 1본쇄 구조임을 의미한다.
선형 올리고뉴클레오티드는, 뉴클레오티드만으로 이루어진 올리고뉴클레오티드라도 좋고, 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고뉴클레오티드라도 좋고, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체 이외의 수식을 받은 올리고뉴클레오티드라도 좋다.
선형 올리고뉴클레오티드는, 15∼80의 염기 길이의 염기 서열을 갖는 것이 바람직하고, 15∼40의 염기 길이의 염기 서열을 갖는 것이 보다 바람직하고, 19∼30의 염기 길이의 염기 서열을 갖는 것이 더욱 바람직하고, 19∼25의 염기 길이의 염기 서열을 갖는 것이 보다 더욱 바람직하다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 유도체에 있어서는, 환형 올리고뉴클레오티드의 염기 길이가, 선형 올리고뉴클레오티드의 염기 길이와 동일하거나, 또는 선형 올리고뉴클레오티드의 염기 길이보다도 긴 것이 바람직하다.
환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드는, 각각에서 적합한 15∼80의 염기 길이의 염기 서열에 있어서, 길이로서는, 환형 올리고뉴클레오티드에 있어서의 올리고뉴클레오티드 부분의 염기 길이가 선형 올리고뉴클레오티드의 염기 길이보다도 1∼10 염기 긴 것이 바람직하고, 2∼8 염기 긴 것이 보다 바람직하고, 4∼6 염기 긴 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서의 환형 올리고뉴클레오티드는 식 1로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다.
식 1:
Figure pct00018
(식 1 중, L1 및 L2는 링커를 나타내고, n1 및 n2는 각각 독립적으로 0∼10의 정수를 나타내고, M은 세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조를 포함하는 부분을 나타내고, X는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.)
세포 내의 환경으로서는, 예컨대 세포 내에 존재하는 효소, 세포 내의 pH 등을 들 수 있다.
식 1에 있어서, n1 및 n2는 각각 독립적으로 0∼8의 정수, 0∼6의 정수, 0∼4의 정수, 1∼8의 정수, 2∼8의 정수, 3∼8의 정수 또는 4∼8의 정수라도 좋다.
식 1에 있어서, n1 및 n2가 함께 0인 경우, L1과 L2는 존재하지 않고서 식 1-1에 나타내는 환형 올리고뉴클레오티드를 구성한다.
식 1-1:
Figure pct00019
(식 1-1 중, M 및 X는 식 1과 동의이다.)
L1 및 L2가 존재하지 않는 경우, X인 올리고뉴클레오티드의 5' 말단과 3' 말단에서, 각각 M과 결합하는 것이 바람직하다.
L1은 X인 올리고뉴클레오티드의 5' 말단과 M을 연결하는 구조라면 특별히 한정되는 것은 아니며, 올리고뉴클레오티드의 합성에 있어서 5' 말단이나 3' 말단을 수식하기 위해서 이용되는 공지된 구조를 채용하여도 좋다.
L1 및 L2는 각각 존재하는 경우, X와, 또한 M과, 포스포디에스테르 결합, 포스포로티오에이트 결합 또는 포스포로디티오에이트 결합에 의해 연결되어 있는 것이 바람직하다.
L1 및 L2로서는, 동일한 구조라도 다른 구조라도 좋다.
또한 L1 및 L2로서는, n1 및 n2가 각각 2 이상의 정수인 경우에는, 그 반복 구조는, 동일 구조로 이루어져 있어도 좋고, 다른 구조가 연결되는 구조라도 좋다.
식 1에 있어서의 M은, 세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조를 포함하는 부분을 나타낸다.
세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조로서는 예컨대 표 1에 나타내는 구조가 알려져 있다.
Figure pct00020
M에 있어서의 세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조로서는 -S-S-, -C(O)-S, -S-C(O)-가 바람직하다.
M은 식 3-1∼식 3-6으로 이루어지는 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
Figure pct00021
(식 중,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R1 및 R2는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R3 및 R4는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
n5∼n8은 각각 독립적으로 0∼10의 정수를 나타내고,
n9 및 n10은 각각 독립적으로 1∼4의 정수를 나타내고,
Y1∼Y4는 각각 독립적으로 결합, -NR5-, -O- 또는 -S-를 나타내고,
R5는 수소 원자, C1-C3 알킬 또는 C2-C4 알카노일을 나타낸다.)
Figure pct00022
(식 중,
R1' 및 R2'는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R1' 및 R2'는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
R3' 및 R4'는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R3' 및 R4'는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
R5' 및 R6'는 결합하는 탄소 원자마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬이고,
n5' 및 n6'은 각각 독립적으로 1∼10의 정수를 나타낸다.)
식 3-1에 있어서, R1∼R4는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬인 것이 바람직하다.
식 3-1에 있어서, Y3 및 Y4는 결합 또는 -O-인 것이 바람직하다.
식 3-1에 있어서, n5 및 n7의 합계는 0∼5의 정수인 것이 바람직하다.
식 3-1에 있어서, n6 및 n8의 합계는 0∼5의 정수인 것이 바람직하다.
식 3-2에 있어서, Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 결합 또는 -O-인 것이 바람직하다.
식 3-2에 있어서, Y3 및 Y4는 결합인 것이 바람직하다.
식 3-2에 있어서, n5 및 n7의 합계 그리고 n6 및 n8의 합계는 0인 것이 바람직하다.
식 3-2에 있어서, n9는 Y1이 -O-인 경우 2인 것이 바람직하고, Y1이 결합인 경우 3인 것이 바람직하다.
식 3-2에 있어서, n10은 Y2가 -O-인 경우 2인 것이 바람직하고, Y2가 결합인 경우 3인 것이 바람직하다.
식 3-3에 있어서, R3 및 R4는 수소인 것이 바람직하다.
식 3-3에 있어서, Y1은 결합 또는 -O-인 것이 바람직하다.
식 3-3에 있어서, Y3 및 Y4는 결합인 것이 바람직하다.
식 3-3에 있어서, n5 및 n7의 합계는 0인 것이 바람직하다.
식 3-3에 있어서, n6 및 n8의 합계는 5인 것이 바람직하다.
식 3-3에 있어서, n9는 Y1이 -O-인 경우 2인 것이 바람직하고, Y1이 결합인 경우 3인 것이 바람직하다.
식 3-4에 있어서, R1 및 R2는 수소 원자인 것이 바람직하다.
식 3-4에 있어서, Y2는 결합 또는 -O-인 것이 바람직하다.
식 3-4에 있어서, Y3 및 Y4는 결합인 것이 바람직하다.
식 3-4에 있어서, n5 및 n7의 합계는 5인 것이 바람직하다.
식 3-4에 있어서, n6 및 n8의 합계는 0인 것이 바람직하다.
식 3-4에 있어서, n10은 Y2가 -O-인 경우 2인 것이 바람직하고, Y2가 결합인 경우 3인 것이 바람직하다.
식 3-5에 있어서, R1' 및 R2'는 수소 원자인 것이 바람직하다.
식 3-5에 있어서, R3' 및 R4'는 수소 원자인 것이 바람직하다.
식 3-5에 있어서, R5'는 결합하는 탄소 원자마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸인 것이 바람직하다.
식 3-5에 있어서, R6'은 수소 원자인 것이 바람직하다.
식 3-5에 있어서, n5'는 2인 것이 바람직하다.
식 3-5에 있어서, n6'은 2인 것이 바람직하다.
식 3-6에 있어서, R1' 및 R2'는 수소 원자인 것이 바람직하다.
식 3-6에 있어서, R3' 및 R4'는 수소 원자인 것이 바람직하다.
식 3-6에 있어서, R5'는 결합하는 탄소 원자마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 메틸인 것이 바람직하다.
식 3-6에 있어서, R6'은 수소 원자인 것이 바람직하다.
식 3-6에 있어서, n5'는 2인 것이 바람직하다.
식 3-6에 있어서, n6'은 2인 것이 바람직하다.
C1-C3 알킬로서는, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 시클로프로필을 들 수 있다.
C2-C4 알카노일로서는, C1-C3 알킬이 카르보닐기와 결합한 구조이며, C2-C4 알카노일에 있어서의 C1-C3 알킬 부분으로서는 상기와 동의이다.
탄소수 3∼6의 고리로서는, 예컨대 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실을 들 수 있다.
M은 2∼6의 아미노산 잔기를 포함하는 부분이라도 좋다.
L1 및 L2의 구조는 특별히 한정되는 것은 아니지만, L1 및 L2로서 예컨대 식 2-1∼식 2-4의 구조를 들 수 있다.
Figure pct00023
(식 중,
n3 및 n4는 각각 독립적으로 1∼15의 정수를 나타내고,
Ak는 치환기를 갖고 있어도 좋은 C2-C22 알킬렌을 나타내고,
Base는 수소 원자, 치환기를 갖고 있어도 좋은 아데니닐, 치환기를 갖고 있어도 좋은 구아니닐, 치환기를 갖고 있어도 좋은 시토시닐, 치환기를 갖고 있어도 좋은 티미닐 또는 치환기를 갖고 있어도 좋은 우라시닐을 나타내고,
Q는 수소 원자, 히드록시기, 할로겐, 또는 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1-C4알킬옥시기를 나타내고,
Z는 산소 원자 또는 황 원자를 나타낸다.)
식 2-1∼식 2-4에 있어서, 한쪽의 Z가 산소 원자이고, 다른 쪽의 Z가 황 원자인 것이 바람직하다.
식 2-1의 Ak에 있어서, C2-C22 알킬렌에 대한 치환기로서는, 예컨대 치환기를 갖고 있어도 좋은 아릴기, 치환기를 갖고 있어도 좋은 아미노기, 치환기를 갖고 있어도 좋은 알콕시기를 들 수 있다.
치환기를 갖고 있어도 좋은 아릴기로서는 예컨대 이하의 구조를 들 수 있다.
Figure pct00024
치환기를 갖고 있어도 좋은 아미노기로서는 예컨대 이하의 구조를 들 수 있다.
Figure pct00025
치환기를 갖고 있어도 좋은 알콕시기로서는 예컨대 이하의 구조를 들 수 있다.
Figure pct00026
식 2-2에 있어서, n4는 1∼12의 정수, 1∼9의 정수, 1∼6의 정수 또는 1∼3의 정수라도 좋다.
식 2-3에 있어서, Base는 치환기를 갖고 있어도 좋은 우라시닐인 것이 바람직하다. 치환기를 갖고 있어도 좋은 우라시닐로서는 예컨대 이하의 구조를 들 수 있다.
Figure pct00027
식 2-3에 있어서, Q는 수소 원자, 또는 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1-C4 알킬옥시기인 것이 바람직하고, 수소 원자, 또는 C1-C4 알킬옥시기인 것이 보다 바람직하다.
식 2-4에 있어서, n3은 1∼12의 정수, 1∼9의 정수, 1∼6의 정수, 1∼3의 정수 또는 3이라도 좋다.
식 2-1∼2-4에 있어서, Z-의 카운터 이온으로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 프로톤(H+), 금속 이온, 암모늄 이온 등을 들 수 있다.
금속 이온으로서는, 예컨대 나트륨 이온, 칼륨 이온 등의 알칼리 금속 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온 등의 알칼리 토류 금속 이온, 알루미늄 이온, 아연 이온 등을 들 수 있다.
암모늄 이온으로서는, 예컨대 암모늄 이온, 테트라메틸암모늄 이온 등을 들 수 있다.
식 3-1∼식 3-6에 있어서의 검은 동그라미는, L1 및 L2가 존재하는 경우, 각각 L1 및 L2에 포함되는 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 결합에 의해 연결되는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 식 3-1∼식 3-6에 있어서의 검은 동그라미는, 적합한 L1 및 L2의 구조로서 나타내어지는 식 2-1∼2-4로 표시되는 구조에 있어서의 P(인 원자)에 결합하는 O(산소 원자)로부터의 검은 동그라미로서 표시되는 결합수와 결합한다.
본 명세서에서는, L1 및 L2가 존재하는 경우, 식 3-1∼식 3-6으로 표시되는 구조에 있어서의 검은 동그라미는, 각각 위쪽에 기재된 검은 동그라미가 L1과의 결합수를 나타내고, 아래쪽에 기재된 검은 동그라미가 L2와의 결합수를 나타낸다.
또한, 식 2-1∼식 2-4으로 표시되는 구조에 있어서의 탄소 원자로부터의 검은 동그라미로서 표시되는 결합수는, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 존재하는, 바람직하게는 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 결합과의 결합수임을 의미한다.
본 발명에서는, X와 L1, X와 L2가 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 결합에 의해 연결되어 있는 경우(환형 올리고뉴클레오티드가 L1 또는 L2를 포함하지 않고, M과 X가 직접 연결하는 경우도 포함한다), 상기 결합에 관련한 포스포디에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 결합에서 유래하는 구조는, 올리고뉴클레오티드가 갖는 구조라고 이해된다.
또한 본 발명에서는, 선형 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 및/또는 3' 말단이 인산기 혹은 티오인산기로 수식되어 있어도 좋다.
본 발명에 있어서, 올리고뉴클레오티드 유도체의 염으로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 산 부가염, 금속염, 암모늄염, 유기 아민 부가염, 아미노산 부가염 등을 들 수 있다.
산 부가염으로서는, 예컨대 염산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염, 아세트산염, 말레산염, 푸마르산염, 시트르산염, 메탄술폰산염 등의 유기산염 등을 들 수 있다.
금속염으로서는, 예컨대 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 마그네슘염, 칼슘염 등의 알칼리 토류 금속염, 알루미늄염, 아연염 등을 들 수 있다.
암모늄염으로서는, 예컨대 암모늄염, 테트라메틸암모늄염 등을 들 수 있다.
유기 아민 부가염으로서는, 예컨대 모르폴린, 피페리딘 등의 유기 아민과의 염을 들 수 있고, 아미노산 부가염으로서는, 예컨대 리신, 글리신, 페닐알라닌 등의 아미노산과의 염을 들 수 있다.
본 발명에서는, 환형 올리고뉴클레오티드 및/또는 선형 올리고뉴클레오티드의 적절한 부위에 표적화 화합물이 부가되어 있어도 좋다. 표적화 화합물은, 표적 세포에서 발현하고 있는 수용체에 결합할 수 있는 화합물에서 유래하는 기를 의미한다. 본 발명에서는, 올리고뉴클레오티드의 표적 세포가 되는 표적화 화합물을 선택하면 된다. 표적화 화합물은, L1 및 L2의 적어도 하나에 결합하고 있는 것이 바람직하다. 표적화 화합물로서는, 예컨대 콜레스테롤, 토코페롤, 도코사헥사엔산, 미리스틴산, 팔미틴산, N-아세틸-D-갈락토사민을 들 수 있다. 표적화 화합물로서는, 간세포에 매우 고발현하고 있는 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 결합할 수 있는 당 리간드로서 N-아세틸-D-갈락토사민(GalNAc)을 이용한 리간드-핵산 복합체가 복수 보고되어 있다(예컨대 저널 오브 아메리칸 케미컬 소사이어티(Journal of American Chemical Society), 2014년, 제136권, p 16958∼16961, 국제공개공보 2017/131236호 등).
표적화 화합물이 결합한, L1 및 L2의 구조로서는 예컨대 하기 식 8 또는 식 9를 들 수 있다.
식 8:
Figure pct00028
(식 중, Z는 상기와 동의이다.)
<환형 올리고뉴클레오티드>
본 발명은, 상기 올리고뉴클레오티드 유도체에 포함되는 환형 올리고뉴클레오티드 자체도 대상으로 한다. 환형 올리고뉴클레오티드는, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 식 4로 표시된다.
식 4:
Figure pct00029
(식 중,
L3 및 L4는 링커를 나타내고,
m1 및 m2는 0∼10의 정수를 나타내고,
M2는 세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조를 포함하는 부분을 나타내고,
X2는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.)
식 4에 있어서, m1 및 m2가 함께 0인 경우, L3과 L4는 존재하지 않고서 식 4-1에 나타내는 환형 올리고뉴클레오티드를 구성한다.
식 4-1:
Figure pct00030
(식 4-1 중, M2 및 X2는 식 4와 동의이다.)
L3 및 L4가 존재하지 않는 경우, X2인 올리고뉴클레오티드의 5' 말단과 3' 말단에서, 각각 M2와 결합하는 것이 바람직하다.
식 4로 표시되는 환형 올리고뉴클레오티드의 바람직한 양태는, 식 1, 식 2-1∼식 2-4 및 식 3-1∼식 3-6에 관해서 설명한 것과 같으며, 식 4에 있어서의 L3, L4, m1, m2, M2 및 X2가 각각 식 1에 있어서의 L1, L2, n1, n2, M 및 X에 대응한다.
<선형 올리고뉴클레오티드>
본 발명은, 상기 환형 올리고뉴클레오티드의 전구체인, 식 7로 표시되는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 선형 올리고뉴클레오티드도 대상으로 한다. 선형 올리고뉴클레오티드 자체도 넉다운 활성을 갖는다.
식 7:
Figure pct00031
(식 중,
X2, L3, L4, m1 및 m2는 식 4에 관해서 정의한 것과 같고,
W1 및 W2는, 상호 반응하여, 세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조를 형성하는 작용기를 포함하거나 발생시키는 부분이다.)
세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조는 식 1에 있어서의 M에 관해서 설명한 것과 같다.
W1 및 W2는 각각 독립적으로 -A1-S-S-A2 또는 -B1-COO-B2인 것이 바람직하다(단, W1 및 W2가 동시에 -B1-COO-B2인 경우를 제외한다).
A1 및 B1은 각각 독립적으로 치환기를 갖고 있어도 좋은 C2-C10 알킬렌인 것이 바람직하다.
A2는 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1-C10 알킬인 것이 바람직하고, 이 치환기로서는 히드록실기가 바람직하다.
B2는 수소 원자, 또는 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1-C6 알킬인 것이 바람직하다.
<올리고뉴클레오티드 유도체의 제조 방법>
상기 올리고뉴클레오티드 유도체는, 예컨대 식 7로 표시되는 선형 올리고뉴클레오티드를 고리화하여, 식 4로 표시되는 환형 올리고뉴클레오티드를 형성하는 공정; 식 4로 표시되는 환형 올리고뉴클레오티드를, 상기 환형 올리고뉴클레오티드와 상보적인 염기 서열을 갖는 선형 올리고뉴클레오티드와, 수소 결합을 통해 복합화시키는 공정;을 포함하는 방법에 의해서 제조할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 유도체의 제조 방법의 일례를 나타낸다.
선형 올리고뉴클레오티드는 공지된 화학 합성법에 의해 제조할 수 있으며, 이러한 화학 합성법으로서, 예컨대 포스포르아미다이트법, 포스포로티오에이트법, 포스포트리에스테르법, CEM법(Nucleic Acids Research, 35, 3287(2007)을 참조) 등을 들 수 있다.
구체적으로는, 선형 올리고뉴클레오티드는, ABI3900 하이스루풋 핵산 합성기(어플라이드바이오시스템즈사 제조)에 의해 합성할 수 있다.
환형 올리고뉴클레오티드는, 구체적으로는 실시예에 기재한 방법을 참조하여, 적절하게 L1, L2 및 M에 상당하는 구조에 해당하는 시약을 채용하여 합성할 수 있다. 환형 올리고뉴클레오티드에 있어서의 올리고뉴클레오티드 부분은, 선형 올리고뉴클레오티드와 같은 방법에 의해 제조할 수 있다.
또한, 고상법(固相法)을 이용함으로써, 고상 상에서 L1, L2 및 M에 상당하는 구조를 구축하고, 그 후 M에 있어서의 세포 내에서 절단되는 구조를 화학적으로 구축시키며 또한 올리고뉴클레오티드를 환형화시킬 수 있다.
고상법에 이용하기 위한 고상 시약이나 아미다이트는, 시판 제품으로서 또는 공지된 방법(바이오콘쥬게이트 케미스트리(Bioconjugate Chem.), 제20권, 6호, 1065-1094 페이지, 2009년) 혹은 그것에 준하는 방법으로 얻을 수 있다.
아울러, 이하의 방법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, 이하에 나타내는 제조법에 있어서, 정의한 기가 상기 제조법의 조건 하에서 변화되거나 또는 상기 제조법을 실시하는 데 부적절한 경우, 유기 합성 화학에서 상용되는 보호기의 도입 및 제거 방법[예컨대 프로텍티브 그룹스 인 오가닉 신세시스 제3판(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition), 그린(T. W. Greene) 저, John Wiley & Sons Inc.(1999년) 등에 기재된 방법] 등을 이용함으로써 목적 화합물을 제조할 수 있다. 또한, 필요에 따라서 치환기 도입 등의 반응 공정의 순서를 바꿀 수도 있다.
<고상 시약의 제조법 A>
Figure pct00032
(식 중, R3, R4, Y4, n6 및 n8은 각각 상기와 동의이고, m1은 2∼20의 정수를 나타내고, E는 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자, 트리플루오로메탄술포닐옥시, 메탄술포닐옥시, 벤젠술포닐옥시, ρ-톨루엔술포닐옥시, 2-니트로벤젠술포닐옥시 등의 탈리기를 나타내고, T는 수소 원자 또는 니트로기를 나타내고, Ac는 아세틸기를 나타내고, DMTr은 디메톡시트리틸기를 나타내고, Po는 CPG(controlled pore glass; 조절 공극 유리)나, 폴리머 등의 고상 시약을 나타낸다.)
공정 1
화합물(A2)은, 화합물(A1)과 1 당량 이상의 p,p'-디메톡시트리틸클로리드를, 피리딘 용매 중, 필요에 따라서 공용매의 존재 하에, 0℃부터 용매의 비점 사이의 온도에서, 5분간∼100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
공용매로서는, 예컨대 메탄올, 에탄올, 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 톨루엔, 아세트산에틸, 아세토니트릴, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산, N,N-디메틸포름아미드(DMF), N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 물 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용된다.
화합물(A1)은 시판 제품으로서 또는 공지된 방법(예컨대, 제4판 실험화학강좌 19 「유기 화합물의 합성 I」 마루젠(1992년) 및 제4판 실험화학강좌 20 「유기 화합물의 합성 II」, 마루젠(1992년)) 혹은 그것에 준한 방법으로 얻을 수 있다.
공정 2
화합물(A3)은, 화합물(A2)과, 1 당량 이상의 할로겐화 시약 또는 술포닐화 시약을, 용매 중, 1 당량 이상의 염기 존재 하에, -20℃와 사용하는 용매의 비점 사이의 온도에서, 5분간∼24시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
할로겐화 시약 및 술포닐화 시약으로서는, 염화티오닐, 염화술푸릴, 삼염화인, 오염화인, 옥시염화인, 삼브롬화인, 브롬화수소, 요오드화수소, 메탄술포닐클로리드(MsCl), 메탄술폰산무수물, p-톨루엔술포닐클로리드(TsCl), o-니트로벤젠술포닐클로리드(NsCl), 트리풀메탄술폰산무수물 등을 들 수 있다.
용매로서는, 예컨대 메탄올, 에탄올, 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 톨루엔, 아세트산에틸, 아세토니트릴, 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 1,2-디메톡시에탄, 디옥산, N,N-디메틸포름아미드(DMF), N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 피리딘, 물 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용된다.
염기로서는, 예컨대 탄산세슘, 탄산칼륨, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 나트륨메톡시드, 칼륨 tert-부톡시드, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린, 피리딘, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센(DBU), N,N-디메틸-4-아미노피리딘(DMAP) 등을 들 수 있다.
공정 3
화합물(A4)은, 화합물(A3)과 1 당량 이상의 티오아세트산 또는 티오아세트산S-칼륨염을, 용매 중, 필요에 따라서 0.01∼30 당량의 첨가제의 존재 하에, 실온과 사용하는 용매의 비점 사이의 온도에서, 5분간부터 100시간 반응함으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
첨가제로서는 예컨대 요오드화나트륨, 요오드화칼륨, 요오드화테트라부틸암모늄(TBAI), 염화테트라부틸암모늄, 18-크라운-6-에테르 등을 들 수 있다.
공정 4
화합물(A5)은, 화합물(A4)을, 무용매로 또는 용매 중, 1∼100 당량의 1급 또는 2급 아민 존재 하에, 실온과 사용하는 용매 사이의 온도에서, 5분간∼100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
1급 아민으로서는 예컨대 메틸아민, 에틸아민 등을 들 수 있다. 2급 아민으로서는 예컨대 디에틸아민, 디이소프로필아민, 피페리딘 등을 들 수 있다.
공정 5
화합물(A7)은, 화합물(A5)과 1 당량 이상의 화합물(A6)을, 용매 중, 필요에 따라서 염기 존재 하에, 실온과 사용하는 용매의 비점 사이의 온도에서, 5분간∼100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로서는 공정 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
화합물(A6)은 하기 공정 5-1에 의해 제조할 수 있다.
Figure pct00033
(식 중, m1 및 T는 상기와 동의이다)
화합물(A10)은 시판 제품으로서 얻을 수 있다.
공정 6
화합물(A8)은, 화합물(A7)과 1 당량 이상의 숙신산무수물을, 용매 중, 1 당량 이상의 염기 존재 하에, 실온과 사용하는 용매의 비점 사이의 온도에서, 5분간∼100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로서는 공정 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
공정 7
화합물(A9)은, 화합물(A8)과 말단이 아미노화된 고상 시약을, 무용매로 또는 용매 중, 1∼50 당량의 염기, 축합제 및 필요에 따라서 0.01∼30 당량의 첨가제의 존재 하에, 실온과 사용하는 용매의 비점 사이의 온도에서, 5분간∼200시간 반응한 후에 고상 시약을 한 번 단리하고, 또한 무수아세트산/피리딘의 혼합 용액으로 실온∼200℃의 온도에서 5분간∼100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로서는 공정 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
축합제로서는, 예컨대 1,3-디시클로헥산카르보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(EDC), N,N'-카르보닐디이미다졸(CDI), N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC), 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스파이트, (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스파이트, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스파이트(HATU), O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스파이트(HBTU), 요오드화 2-클로로-1-메틸피리디늄 등을 들 수 있다.
첨가제로서는 예컨대 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) 등을 들 수 있다.
아미노화된 고상 시약으로서는, 예컨대 장쇄 알킬아민 세공성 유리(LCAA-CPG) 등을 들 수 있고, 이들은 시판 제품으로서 얻을 수 있다.
화합물(A5)은 하기 공정 8에 의해서도 제조할 수 있다.
Figure pct00034
(식 중, R3, R4, Y4, n6, n8 및 DMTr는 각각 상기와 동의이다}
화합물(A5)은, 화합물(A11)을 이용하여, 공정 1과 같은 방법으로 제조할 수 있다.
화합물(A11)은 시판 제품으로서 또는 공지된 방법(예컨대 바이오콘쥬게이트 케미스트리(Bioconjugate Chem.), 제22권, 4호, 717-727 페이지, 2011년, 제4판 실험화학강좌 24 「유기 화합물의 합성 VI」 마루젠(1992년)) 혹은 그것에 준한 방법으로 얻을 수 있다.
화합물(A11) 중, R4가 수소, n6이 1, n8이 1 및 Y4가 결합인 화합물(A11-a)은 다음 방법으로 제조할 수 있다.
Figure pct00035
(식 중, R3 및 Ac는 상기와 동의이다.)
공정 9
화합물(A13)은 화합물(A12)을 이용하여 공정 3과 같은 방법으로 제조할 수 있다.
화합물(A12)은 시판 제품으로서 얻을 수 있다.
공정 10
화합물(A11-a)은, 화합물(A13)과 환원제를, 용매 중, -20℃와 사용하는 용매의 비점 사이의 온도에서, 5분간∼100시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
환원제로서는, 수소화붕소리튬(LiBH4), 수소화붕소나트륨(NaBH4), 수소화시아노붕소나트륨(NaBH3CN), 수소화트리에틸붕소리튬(LiBHEt3), 수소화알루미늄리튬(LAH), 수소화디이소부틸알루미늄(DIBAL) 등을 들 수 있다.
용매로서는 공정 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
화합물(A7)은 하기 방법에 의해서도 제조할 수 있다.
Figure pct00036
(식 중, R3, R4, Y4, E, n6, n8, m1 및 DMTr은 각각 상기와 동의이고, Ts는 p-톨루엔술포닐기를 나타낸다.)
공정 5-2
화합물(A4')은, 화합물(A3)을 이용하여, 용매 중, 1∼100 당량의 p-톨루엔티오술폰산칼륨 존재 하, 필요에 따라서 첨가제 존재 하에, 0℃와 사용하는 용매의 비점 사이의 온도에서, 5분간부터 48시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
첨가제로서는 공정 3에서 예시한 것을 들 수 있다.
공정 5-3
화합물(A7)은, 화합물(A4')과 화합물(A10)을 이용하여, 공정 5와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
<고상 시약의 제조법 B>
Figure pct00037
(식 중, Y2, Y4, n6, n8, n10, m1, DMTr, Ac 및 Po는 각각 상기와 동의이다.)
화합물(B9)은, 화합물(A1)과 화합물(A4)을 각각 화합물(B1)과 화합물(B4)로 변경하는 것 이외에는, 고상 시약의 제조법 A와 동일한 방법으로 제조할 수 있다.
화합물(B1)은 시판 제품으로서 또는 공지된 방법(예컨대 제4판 실험화학강좌 19 「유기 화합물의 합성 I」 마루젠(1992년) 및 제4판 실험화학강좌 20 「유기 화합물의 합성 II」, 마루젠(1992년)) 혹은 그것에 준한 방법으로 얻을 수 있다.
화합물(B4) 중, Y2가 결합, n6이 0, n8이 0, Y4가 결합인 (B4-a)는 다음 방법으로 제조할 수 있다.
Figure pct00038
(식 중, n10'은 1∼3의 정수를 나타내고, Ac 및 DMTr은 각각 상기와 동의이다.)
공정 11
화합물(B11)은, 화합물(B10)을 이용하여, 제조법 A 공정 3과 같은 식으로 제조할 수 있다.
화합물(B10)은 시판 제품으로서 또는 공지된 방법(예컨대 제4판 실험화학강좌 21 「유기 화합물의 합성 III」 마루젠(1992년) 및 저널 오브 오가닉 케미스트리(J. Org. Chem.), 제38권, 14호, 2576-2578 페이지, 1973년) 혹은 그것에 준한 방법으로 얻을 수 있다.
공정 12
화합물(B12)은, 화합물(B11)을 이용하여, 제조법 A 공정 10과 같은 식으로 제조할 수 있다.
공정 13
화합물(B4-a)은, 화합물(B12)을 이용하여, 제조법 A 공정 1과 같은 식으로 제조할 수 있다.
<표적화 화합물을 갖는 고상 시약의 제조 방법 C>
Figure pct00039
(식 중, m1 및 Po는 상기와 동의이고, M1 및 M2는 각각 -COOH, -NHRa, -OH, -N3, -C≡CH 또는 -SH를 나타내고, G는 -C(O)-NRa-, -NRa-C(O)-, -C(O)-S-, -S-C(O)-, 트리아졸디일을 나타내고, Ra는 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내고, Linker1, Linker2, Linker3, Linker4는 링커를 나타내고, Scaffold는 -Linker1-OH, -Linker2-OH, -Linker3-M1을 치환기로서 갖는 구조를 나타내고, Ligand는 표적화 화합물을 나타낸다.)
Scaffold는 -Linker1-OH, -Linker2-OH, -Linker3-M1을 치환기로서 갖는 구조라면 특별히 한정되지 않는다.
공정 14
화합물(C3)은, 화합물(C1)과 화합물(C2)을 이용하여, 용매 중, 1∼50 당량의 염기, 1 당량 이상의 축합제 및 필요에 따라서 0.01∼30 당량의 첨가제의 존재 하에, 0℃와 사용하는 용매의 비점 사이의 온도에서 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 공정 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
염기로서는 공정 2에서 예시한 것을 들 수 있다.
축합제로서는 공정 7에서 예시한 것을 들 수 있다.
첨가제로서는 공정 7에서 예시한 것을 들 수 있다.
화합물(C1)은, 2개의 -OH기와 표적화 화합물과의 결합 구조 M1을 동일 분자 내에 갖는 것이라면 어느 것이라도 좋고, 시판 제품으로서 또는 공지된 방법(예컨대 국제공개공보 2015/006740호 및 국제공개공보 2015/105083호에 해당하는 구조가 개시되어 있다.) 혹은 그것에 준한 방법으로 얻을 수 있다.
화합물(C2)은, 표적화 화합물, 링커 및 Scaffold와의 결합 구조 M2를 동일 분자 내에 갖는 것이라면 어느 것이라도 좋고, 시판 제품으로서 또는 공지된 방법(예컨대 테라퓨틱 딜리버리(Therapeutic Delivery), 제4권, 791-809 페이지(2013년)), 혹은 그것에 준한 방법으로 얻을 수 있다.
화합물(C3) 중, G가 트리아졸디일인 경우, 화합물(C1)의 M1은 -N3 또는 -C≡CH이고, 화합물(C2)의 M2는 -N3 또는 -C≡CH이고(단 M1 및 M2는 동시에 -N3 또는 -C≡CH가 아니다), 화합물(C1)과 화합물(C2)을 이용하여, 용매 중, 0.01∼10 당량의 금속 촉매 및 0.01∼10 당량의 환원제 존재 하에, 필요에 따라서 0.01 당량∼10 당량의 반응 촉진제를 가하여, 0℃와 사용하는 용매의 비점 사이의 온도에서, 5분간부터 48시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
금속 촉매로서는, 예컨대 황산구리(II)오수화물, 브롬화구리(I), 펜타메틸시클로펜타디에닐비스(트리페닐포스핀)루테늄(II)염화물 등을 들 수 있다.
환원제로서는, 아스코르빈산나트륨, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP) 등을 들 수 있다.
반응촉진제로서는, 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민(TBTA), 트리스(2-벤조이미다졸릴메틸)아민((BimH)3) 등을 들 수 있다.
공정 15∼공정 19
화합물(C4)은, 화합물(C3)을 이용하여, 공정 1∼5와 같은 방법이나 또는 공정 1, 공정 2, 공정 5-2 및 공정 5-3과 같은 방법으로 제조할 수 있다.
공정 20 및 공정 21
화합물(C5)은, 화합물(C4)을 이용하여, 공정 6 및 공정 7과 같은 방법으로 제조할 수 있다.
<아미다이트의 제조법 D>
Figure pct00040
(식 중, R1, R2, Y3, n5, n7, m1, T, DMTr은 각각 상기와 동의이고, Xa는 염소 원자, 브롬 원자 또는 요오드 원자를 나타내고, Rc는 예컨대 2-시아노에틸 등의 염기 처리에 의해 제거할 수 있는 보호기를 나타내고, Rd는 치환기를 갖더라도 좋은 C1-C3 알킬을 나타낸다.)
공정 22
화합물(D1)은, 화합물(A6)을 이용하여, 공정 1과 같은 방법으로 제조할 수 있다.
공정 23
화합물(D3)은, 화합물(D1) 및 화합물(D2)을 이용하여, 공정 5와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
화합물(D2)은, 시판 제품으로서 또는 화합물(A11)의 제조 방법에 준한 방법으로 얻을 수 있다.
공정 24
화합물(D6)은, 화합물(D3)을 이용하여, 용매 중, 화합물(D4)과 염기 존재 하에, 0℃와 이용하는 용매의 비점 사이의 온도에서, 10초간부터 24시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는, 예컨대 디클로로메탄, 아세토니트릴, 톨루엔, 아세트산에틸, THF, 1,4-디옥산, DMF, NMP 등을 들 수 있으며, 이들을 단독으로 또는 혼합하여 이용된다.
염기로서는, 예컨대 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 피리딘 등을 들 수 있으며, 이들을 단독으로 또는 혼합하여 이용된다.
또한 화합물(D6)은, 용매 중, 화합물(D3)과 화합물(D5)을, 반응촉진제 존재 하에, 0℃와 이용하는 용매의 비점 사이의 온도에서, 10초간부터 24시간 반응시킴으로써도 제조할 수 있다.
용매로서는 예컨대 아세토니트릴, THF 등을 들 수 있으며, 이들을 단독으로 또는 혼합하여 이용된다.
반응촉진제로서는, 1H-테트라졸, 4,5-디시아노이미다졸, 5-에틸티오테트라졸, 5-벤질티오테트라졸 등을 들 수 있다.
화합물(D4) 및 화합물(D5)은 시판 제품으로서 얻을 수 있다.
<아미다이트의 제조법 E>
Figure pct00041
(식 중, Y1, Y3, n5, n7, n9, m1, T, DMTr, Xa, Rc 및 Rd는 상기와 동의이다.)
공정 23f 및 공정 24f
화합물(F6)은, 화합물(D2) 대신에 화합물(F2)을 사용하는 것 이외에는, 공정 23 및 공정 24와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
화합물(F2)은 시판 제품으로서 또는 화합물(A11)의 제조 방법에 준한 방법으로 얻을 수 있다.
<아미다이트의 제조법 F>
Figure pct00042
(식 중, DMTr, Xa, Rc, Rd는 상기와 동의이고, PG는 보호기를 나타내고, m2는 1-10의 정수를 나타내고, Rx는 천연 또는 비천연의 α-아미노산 잔기가 갖는 치환기를 나타내고, Linker5는 히드록실기와 카르복실기를 잇는 링커를 나타낸다.)
공정 25
화합물(G2)은, 아미노기가 적절한 보호기로 보호된 α-아미노산(G1)과 p-아미노벤질알코올을 이용하여, 공정 14와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
p-아미노벤질알코올 및 화합물(G1)은 시판 제품으로서 얻을 수 있다.
얻어진 (G2)에 대하여, 아미노기의 탈보호와 이어지는 화합물(G1)과의 축합 반응을 반복하여 행함으로써, 원하는 m2의 값으로 조정된 화합물(G2)을 제조할 수 있다.
아미노기의 탈보호는, 유기 합성 화학에서 상용되는 방법[예컨대 프로텍티브 그룹스 인 오가닉 신세시스 제3판(Protective Groups In Organic Synthesis, Third Edition), 그린(T. W. Greene) 저, John Wiley & Sons Inc.(1999년) 등에 기재된 방법 등]을 적절하게 이용할 수 있다.
공정 26
화합물(G3)은, 화합물(G2)을 이용하여, 공정 1과 같은 방법으로 제조할 수 있다.
공정 27
화합물(G4)은, 상술한 유기 합성 화학에서 상용되는 아미노기의 탈보호를 적절하게 이용함으로써 제조할 수 있다.
공정 28
화합물(G6)은, 화합물(G4)과 화합물(G5)을 이용하여 공정 14와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
화합물(G5)은 히드록실기와 카르복실기를 동일 분자 내에 갖는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 시판 제품으로서 얻을 수 있다.
공정 29
화합물(G7)은 화합물(G6)을 이용하여 공정 24와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조를 포함하는 부분 M이 -S-S-를 포함하는 경우, 이하의 방법으로 환형 올리고뉴클레오티드를 제조할 수 있다.
<환형 올리고뉴클레오티드의 제조법 G>
Figure pct00043
(식 중, X는 상기와 동의이고, Linker5와 Linker6은 링커를 나타내고, 식 중의 대상(帶狀) 구조는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.)
공정 30
조건 a
화합물(H2)은, 화합물(H1)과 1 당량 이상의 염기 존재 하에, 필요에 따라서0.1 당량 이상의 첨가제를 가하여, -20℃와 사용하는 용매의 비점 사이의 온도에서, 5분간부터 120시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는, 예컨대 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란, 디옥산, N,N-디메틸포름아미드(DMF), N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 피리딘, 물, PBS, 시트르산 완충 용액, 트리스 완충 용액 등을 들 수 있고, 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용된다.
염기로서는, 예컨대 탄산세슘, 탄산칼륨, 탄산수소나트륨, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센(DBU) 등을 들 수 있다.
첨가제로서는 요소, 염화마그네슘, 염화칼륨 등을 들 수 있다.
조건 b
화합물(H2)은, 화합물(H1)을 용매에 용해하고, 1 당량 이상의 2-(메톡시티오)-3-니트로피리딘(Npys-OMe)(고쿠산카가쿠사 제조)을 가하여, -20℃와 사용하는 용매의 비점 사이의 온도에서, 5분간부터 120시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 조건 a에 기재한 것을 들 수 있다.
조건 c
화합물(H2)은, 화합물(H1)을 용매에 용해하고, 1 당량 이상의 KSH-OMe(Npys-OMe-CHEMMATRIX Regin)(고쿠산카가쿠사 제조)를 가하여, -20℃와 사용하는 용매의 비점 사이의 온도에서, 5분간부터 120시간 반응시킴으로써 제조할 수 있다.
용매로서는 조건 a에 기재한 것을 들 수 있다.
화합물(H1)은, 시판되는 시약, 또는 상기 제조 방법에서 기재한 고상 시약 및 아미다이트 시약을 사용하여, 공지된 화학 합성법 또는 그것에 준한 방법을 이용함으로써 제조할 수 있다.
공지된 올리고뉴클레오티드의 화학 합성법으로서는 예컨대 이하에 기재하는 방법을 들 수 있다.
(i) 테트라헤드론(Tetrahedron, 제48권, 제12호, 2223-2311 페이지(1992);
(ii) 커런트 프로토콜스 인 뉴클레익 애시드 케미스트리(Current Protocols in Nucleic Acids Chemistry), John Wiley & Sons(2000∼2017);
(iii) 프로토콜스 포 올리고뉴클레오티드스 앤드 아날로그스(Protocols for Oligonucleotides and Analogs), Human Press(1993);
(iv) 케미스트리 앤드 바이올로지 오브 아티피셜 뉴클레익 애시드(Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids), Wiley-VCH(2012);
올리고뉴클레오티드의 정제는, C18 역상 컬럼 혹은 음이온 교환 컬럼, 바람직하게는 2개의 컬럼의 조합을 이용하여 정제할 수 있다.
정제 후의 올리고뉴클레오티드의 순도는, 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상으로 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 올리고뉴클레오티드 유도체를 제조하는데, 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드가 상보적인 염기 서열에 있어서 수소 결합을 형성하도록 통상의 어닐링 반응에 의해 행할 수 있다.
적합하게는, 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드를, 예컨대 완충 용액 내에서 등량이 되도록 혼합하여, 예컨대 60∼95℃에서 1∼15분간 정치하고, 그 후, 실온까지 서서히 온도를 내림으로써 올리고뉴클레오티드 유도체를 제조할 수 있다. 그 후, 통상의 방법에 의해 올리고뉴클레오티드 유도체의 염으로 할 수도 있다.
본 발명의 의약 조성물은 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염을 포함한다. 본 발명의 의약 조성물은, 핵산 복합체로서 투여되고, 표적 세포에 인식되어, 세포 내에 도입된다.
세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조를 갖는 환형 올리고뉴클레오티드의 경우, 올리고뉴클레오티드 이외의 구조에 있어서 세포 내에서 절단되어, 선형2본쇄 올리고뉴클레오티드로 변환된다. 선형 2본쇄 올리고뉴클레오티드는 통상 RNA 유도형 사이렌싱 복합체(RISC)라고 불리는 복합체에 받아들여지고, 표적 mRNA를 절단하여 표적 유전자의 발현을 저하 또는 정지시킴으로써 억제하여, 표적 유전자와 관련한 질환의 치료에 이용할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염은, RNA 간섭을 이용한 표적 유전자의 발현억제제로서 이용할 수 있다. 또한, 식 7로 표시되는 선형 올리고뉴클레오티드도 RNA 간섭을 이용한 표적 유전자의 발현억제제로서 이용할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 유도체 혹은 그 염, 또는 본 발명의 의약품을 치료제 또는 예방제로서 사용하는 경우, 투여 경로로서는, 치료 시에 가장 효과적인 투여 경로를 사용하는 것이 바람직하며, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 정맥내 투여, 피하 투여, 수강내(髓腔內) 투여, 기관내 투여, 점안 투여, 안내 투여, 피부상 투여, 경구 투여 및 근육내 투여 등을 들 수 있고, 바람직하게는 정맥내 투여 또는 피하 투여이다.
투여량은, 투여 대상의 질환 상태나 연령, 투여 경로 등에 따라서 다르지만, 예컨대 안티센스쇄로 환산한 1일 투여량이 0.1 μg∼1000 mg이 되도록 투여하면 되며, 1일 투여량이 1∼100 mg이 되도록 투여하는 것이 보다 바람직하다.
의약 조성물로서의 적당한 제제로서는, 예컨대 주사제를 들 수 있고, 조제한 액제를 그대로 예컨대 주사제 등의 형태로서 이용하는 것도 가능하지만, 상기 액제로부터, 예컨대 여과, 원심분리 등에 의해서 용매를 제거하여 사용할 수도, 상기 액제를 동결 건조하여 사용하고/거나 예컨대 만니톨, 락토오스, 트레할로오스, 말토오스 혹은 글리신 등의 부형제를 가한 액제를 동결 건조하여 사용할 수도 있다.
주사제의 경우, 액제 또는 용매를 제거 또는 동결 건조한 제제에, 예컨대 물, 산, 알칼리, 다양한 완충액, 생리식염수 또는 아미노산 수액 등을 혼합하여 주사제를 조제하는 것이 바람직하다. 또한, 예컨대 시트르산, 아스코르빈산, 시스테인 혹은 에틸렌디아민사아세트산(EDTA) 등의 항산화제, 또는 글리세린, 포도당 혹은 염화나트륨 등의 등장화제 등을 첨가하여 주사제를 조제하는 것도 가능하다. 또한, 예컨대 글리세린 등의 동결보존제를 가하여 동결 보존할 수도 있다.
본 발명에서는, 올리고뉴클레오티드 유도체를, 또는 그 염 형태로 혹은 의약 조성물에 함유시켜, 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하여, 생체 내에 있어서, 표적 유전자의 발현을 저하 또는 정지시킴으로써 억제하여, 표적 유전자에 관련된 질환의 치료 또는 예방 방법도 제공한다.
본 발명의 환형 올리고뉴클레오티드의 구체예를 표 2∼표 6에 나타낸다. 단, 본 발명의 환형 올리고뉴클레오티드 및 그것을 이용한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염은, 이들에 한정되는 것이 아니다. 표 중의 대상 구조는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
실시예
이어서, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아니다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 유도체는, 하기 스킴 1에 나타내는 합성 경로에 따라서 합성했다.
스킴 1
Figure pct00049
(식 중, Po는 상기와 동의이다)
실시예 1 HPRT1을 표적으로 하는 HPRT1_csRNA1(화합물 Ie)은 이하의 공정에 따라서 합성했다.
공정 1
시판되는 2'-OMe-A-CE 포스포르아미다이트, 2'-OMe-G-CE 포스포르아미다이트, 2'-OMe-C-CE 포스포르아미다이트, 2'-OMe-U-CE 포스포르아미다이트, 2'-F-A-CE 포스포르아미다이트, 2'-F-G-CE 포스포르아미다이트, 2'-F-Ac-C-CE 포스포르아미다이트, 2'-F-U-CE 포스포르아미다이트, 티올-수식제 C6 S-S(이상 9 시약 전부 Glen Research사로부터 입수)를, 각각 0.1 mol/L 아세토니트릴 용액이 되도록 조제했다. 고상 시약으로서 3'-티올-수식제 C3 S-S CPG(화합물 Ia, Glen Research사)와 조제한 포스포르아미다이트 아세토니트릴 용액을 각각 사용하여, 핵산 합성을 행함으로써, 조생성물로서 화합물 Ib를 취득했다. 뉴클레오티드의 신장 공정에 액티베이터 42(SAFC-PROLIGO사)를 이용하고, 반응 시간은 10분간으로 했다. 핵산 합성 장치는 진디자인사 제조 nS-8을 이용했다.
공정 2
공정 1에서 얻어진 조생성물 Ib에 트리클로로아세트산을 반응시켜, 트리틸기를 탈보호했다. 그 후, 28% 암모니아 수용액과 40% 메틸아민 수용액을 등량 혼합한 시약으로 처리하여, 고상 시약으로부터 잘라냈다. 얻어진 조생성물을 역상 액체 크로마토그래피(Waters, Xbridge(등록상표) C18, 4.6 mm x 250 mm, A액: 0.1% 아세트산트리에틸암모늄 완충액, B액: 아세토니트릴에 의한 그래디언트)에 의해 정제하여, 화합물 Ic를 취득했다.
ESI-MS 이론치 8775 실측치 8778
공정 3
공정 2에서 얻어진 화합물 Ic(45 nmol)을, 트리스 완충액 중, 50 mmol/L의 디티오트레이톨(DTT)을 가하여, 실온에서 18시간 정치했다. 반응액을 NAP-10 column(GE헬스케어사 제조, product No. 17-0854-01)로 정제하여, 화합물 Id(1.5 mL)를 취득했다.
공정 4
공정 3d에서 얻어진 화합물 Id의 수용액(1.5 mL)에, 종농도(終濃度)로 화합물 Id가 70 μmol/L, NaCl이 150 mmol/L, 트리에틸아민이 8 mol%가 되도록 5 mol/L NaCl, 트리에틸아민 및 물을 첨가했다. 그 후, 55℃에서 18시간 정치했다. 반응액을 감압 하에 농축하고, 역상 액체 크로마토그래피(Waters, Xbridge(등록상표) C18, 4.6 mm x 250 mm, A액: 0.1% 아세트산트리에틸암모늄 완충액, B액: 아세토니트릴에 의한 그래디언트)에 의해 정제하여, 화합물 Ie(18 nmol, 2 공정 수율 40%)을 취득했다.
ESI-MS 이론치 8551 실측치 8850
공정 5
공정 4에서 얻어진 화합물 Ie와, 별도로 핵산 합성 장치에 의해 조제한 올리고뉴클레오티드 HPRT1_asRNA1를 등량 혼합하여, 시트르산 완충액에 용해한 후, 85℃에서 5분간 정치했다. 그 후, 서서히 온도를 내림으로써 화합물 1을 취득했다.
화합물 1이 복합체를 형성하고 있는 것을 동정하기 위해서, 통상의 siRNA의 동정과 같은 식으로 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC) 분석 및 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(PAGE) 분석을 실시했다.
SEC 분석의 측정 조건
컬럼: TOSOH G2000SWXL(5 ㎛, 7.8 mmI.D.×30 cm)
용매: 1 X PBS 버퍼(나카라이테스크사 제조)
유속: 1 mL/ min
그래디언트, 시간: 아이소크라틱(isocratic), 20 min
컬럼 온도: 25℃
검출 파장: 260 nm
인젝션량: 200 pmol/1 샘플
(참고문헌: Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 136(2017) 55-65.)
PAGE 분석의 측정 조건
겔: 멀티겔 II 미니 10/20(13W)(414893, 코스모바이오)
로딩 버퍼: GelPilot(R) DNA Loading Dye, 5X(239901, Qiagen)
마커: DynaMarker(등록상표) dsRNA Easy Load(DM185, BDL)
전기영동조: AE-6500(ATTO)
영동 조건: 150 V, 200 mA, 20.0 W, 60 min
영동 용매: 1 X TAE 버퍼
겔 염색 시약: SYBR(등록상표) Green II 핵산 겔 염색(50522, Lonza)
실시예 2
핵산 서열을 표 7에 기재한 HPRT1_csRNA2 및 HPRT1_asRNA2로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 2를 취득했다.
실시예 3
핵산 서열을 표 7에 기재한 B2M_csRNA 및 B2M_asRNA로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 3을 얻었다.
실시예 4
핵산 서열을 표 8에 기재한 HPRT1_csRNA3 및 HPRT1_asRNA3으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 4를 얻었다.
실시예 5
핵산 서열을 표 8에 기재한 HPRT1_csRNA4 및 HPRT1_asRNA4로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 5를 얻었다.
실시예 6
핵산 서열을 표 8에 기재한 HPRT1_csRNA5 및 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 6을 얻었다.
이하의 표 중에 있어서, 「Name」란에서는, 상단이 핵산 복합체로서의 명칭을 나타내고, 하단이 핵산 복합체를 구성하는, 환형 올리고뉴클레오티드/선형 올리고뉴클레오티드 또는 센스쇄/안티센스쇄의 명칭을 나타낸다. 「서열」란에서는, 상단이 환형 올리고뉴클레오티드 또는 센스쇄를 나타내고, 하단이 선형 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스쇄를 나타낸다.
실시예 1∼6에 있어서의 올리고뉴클레오티드 유도체 및 음성 대조군으로서의 올리고뉴클레오티드의 염기 서열을 표 7 및 표 8에 나타낸다.
표 7 및 표 8에 있어서의 약호 등은 이하와 같다.
말단의 V는 결합수를 나타내고, V에 인접하는 S 원자가 결합하여 -S-S-가 되고, 환형 구조임을 나타낸다.
SC6=-(CH2)6-S-
C3S=-(CH2)3-S-
p=인산화
^=포스포로티오에이트 수식
m=2'-OMe 수식
f=2'-F 수식
각 실시예에 있어서의 환형 올리고뉴클레오티드 Ie 및 그 전전구체의 화합물 Ic의 분자량을 표 9에 나타낸다. 분자량의 측정은 ESI-MS(아질렌트테크놀로지사 제조, 1200 시리즈)에 의해 통상의 방법에 기초하여 행했다.
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
실시예 7
핵산 서열을 표 10에 기재한 PTEN_csRNA1 및 PTEN_asRNA2로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 7을 취득했다.
실시예 8
핵산 서열을 표 10에 기재한 Factor9_csRNA1 및 Factor9_asRNA2로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 8을 취득했다.
실시예 9
핵산 서열을 표 11에 기재한 HPRT1_csRNA6 및 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 9를 취득했다.
실시예 10
핵산 서열을 표 12에 기재한 HPRT1_csRNA15 및 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 10을 취득했다.
실시예 11
핵산 서열을 표 12에 기재한 HPRT1_csRNA16 및 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 11을 취득했다.
실시예 12
핵산 서열을 표 14에 기재한 HPRT1_csRNA23 및 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 12를 취득했다.
실시예 13
핵산 서열을 표 14에 기재한 HPRT1_csRNA24 및 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 13을 취득했다.
실시예 14(환형 올리고뉴클레오티드 B와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 아미다이트에, 스페이서 포스포르아미다이트 C3(Glen Research사)를 추가하여 공정 1을 행하고 또한 실시예 1의 공정 4를 이하의 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 14를 합성했다.
스킴 1의 화합물 Id에 대응하는 14d의 수용액(1.5 mL)에, 종농도로 화합물 14d가 100μmol/L, NaCl이 150 mmol/L, 탄산수소나트륨이 5 wt%가 되도록 5 mol/L NaCl 수용액, 탄산수소나트륨 및 물을 첨가했다. 그 후, 65℃에서 48시간 정치했다. 반응액을 감압 하에 농축하고, 역상 액체 크로마토그래피(Waters, Xbridge(등록상표) C18, 4.6 mm x 250 mm, A액: 0.1% 아세트산트리에틸암모늄 완충액, B액: 아세토니트릴에 의한 그래디언트)에 의해 정제하여, 화합물 14e(2 공정 수율 47%)을 취득했다.
실시예 15(환형 올리고뉴클레오티드 C와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 아미다이트에, DMT-에탄-디올 포스포르아미다이트(ChemGenes사)를 추가하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 15를 합성했다.
실시예 16(환형 올리고뉴클레오티드 D와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 아미다이트에, 스페이서 포스포르아미다이트 9(Glen Research사)를 추가하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 16을 합성했다.
실시예 17(환형 올리고뉴클레오티드 E와 그 환형 siRNA)
핵산 서열을 표 11에 기재한 HPRT1_csRNA10 및 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 15와 동일한 방법으로 화합물 17을 합성했다.
실시예 18(환형 올리고뉴클레오티드 E와 그 환형 siRNA)
핵산 서열을 표 12에 기재한 HPRT1_csRNA17 및 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 15와 동일한 방법으로 화합물 18을 합성했다.
실시예 19(환형 올리고뉴클레오티드 F와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 아미다이트에 d스페이서 CE 포스포르아미다이트(Glen Research사)를 추가하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 19를 합성했다.
실시예 20(환형 올리고뉴클레오티드 G와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 아미다이트에 PC 링커 포스포르아미다이트(Glen Research사)를 추가하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 20을 합성했다.
실시예 21(환형 올리고뉴클레오티드 H와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 아미다이트에 아미노-수식제 C6 dT(Glen Research사)를 추가하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 21을 합성했다.
실시예 22(환형 올리고뉴클레오티드 I과 그 환형 siRNA)
핵산 서열을 표 11에 기재한 HPRT1_csRNA14 및 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 15와 동일한 방법으로 화합물 22를 합성했다.
실시예 23(환형 올리고뉴클레오티드 I과 그 환형 siRNA)
핵산 서열을 표 12에 기재한 HPRT1_csRNA18 및 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 15와 동일한 방법으로 화합물 23을 합성했다.
실시예 24(환형 올리고뉴클레오티드 J와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 아미다이트에 2'-OMe-U-티오포스포르아미다이트(Glen Research사)를 추가하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 24를 합성했다.
실시예 25(환형 올리고뉴클레오티드 K와 그 환형 siRNA)
핵산 서열을 표 13에 기재한 HPRT1_csRNA20 및 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 24와 동일한 방법으로 화합물 25를 합성했다.
실시예 26(환형 올리고뉴클레오티드 L과 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 아미다이트에 스페이서 C12 CE 포스포르아미다이트(Glen Research사)를 추가하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 26을 합성했다.
실시예 27(환형 올리고뉴클레오티드 M과 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 아미다이트에 참고예 1에서 합성한 아미다이트 Rf3을 추가하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 27을 합성했다.
실시예 28(환형 올리고뉴클레오티드 N과 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 아미다이트에 PC 스페이서 포스포르아미다이트(Glen Research사)를 추가하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 28을 합성했다.
실시예 29(환형 올리고뉴클레오티드 O와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 아미다이트에 PC 스페이서 포스포르아미다이트(Glen Research사)를 추가하고, 실시예 1의 공정 4를 이하의 방법으로 변경했다.
스킴 1의 화합물 Id에 대응하는 29d의 수용액(1.5 mL)에, 종농도로 화합물 29d가 100 μmol/L, NaCl이 2 mol/L, 탄산수소나트륨이 5 wt%가 되도록, 5 mol/L NaCl 수용액, 탄산수소나트륨 및 물을 첨가했다. 그 후, 65℃에서 72시간 정치했다. 반응액을 감압 하에 농축하고, 역상 액체 크로마토그래피(Waters, Xbridge(등록상표) C18, 4.6 mm x 250 mm, A액: 0.1% 아세트산트리에틸암모늄 완충액, B액: 아세토니트릴에 의한 그래디언트) 및 사이즈 배제 크로마토그래피(도소, TSKgel G2000SWXL, 7.8 mm X 300 mm, 1 XPBS 아이소크라틱)에 의해 정제하여, 화합물 29e(2 공정 수율 20%)을 취득했다.
그 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 29를 합성했다.
실시예 30(환형 올리고뉴클레오티드 P와 그 환형 siRNA)
핵산 서열을 표 16에 기재한 HPRT1_csRNA34 및 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 15와 동일한 방법으로 화합물 30을 합성했다.
실시예 31(환형 올리고뉴클레오티드 Q와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 아미다이트에 아미노-수식제 세리놀 포스포르아미다이트(Glen Research사)를 추가하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 31을 합성했다.
실시예 32(환형 올리고뉴클레오티드 R과 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 아미다이트에 Fmoc-아미노-DMT C-7 CE 포스포르아미다이트(Chem Genes사)를 추가하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 32를 합성했다.
실시예 33(환형 올리고뉴클레오티드 S와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 아미다이트에 알킨-수식제 세리놀 포스포르아미다이트(Glen Research사)를 추가하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 33을 합성했다.
실시예 34(환형 올리고뉴클레오티드 T와 그 환형 siRNA)
핵산 서열을 표 16에 기재한 HPRT1_csRNA37 및 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 33과 동일한 방법으로 화합물 34를 합성했다.
실시예 35(환형 올리고뉴클레오티드 U와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 고상 시약인 3'-티올-수식제 C3 S-S CPG를 참고예 2에서 합성한 수식 CPG Rf12로 변경하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 35를 합성했다.
실시예 36(환형 올리고뉴클레오티드 V와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 고상 시약인 3'-티올-수식제 C3 S-S CPG를 참고예 3에서 합성한 수식 CPG Rf21로 변경하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 36을 합성했다.
실시예 37(환형 올리고뉴클레오티드 W와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 티올-수식제 C6 S-S를 참고예 6에서 합성한 아미다이트 Rf41로 변경하고, 고상 시약의 3'-티올-수식제 C3 S-S CPG를 참고예 2에서 합성한 수식 CPG Rf12로 변경하고, 실시예 1의 공정 4를 이하의 방법으로 변경했다.
스킴 1의 화합물 Id에 대응하는 37d의 수용액(1.5 mL)에, 종농도로 화합물 37d가 100 μmol/L, NaCl이 2 mol/L, 트리에틸아민이 5 vol%가 되도록 5 mol/L NaCl 수용액, 트리에틸아민 및 물을 첨가했다. 그 후, 65℃에서 72시간 정치했다. 반응액을, 역상 액체 크로마토그래피(Waters, Xbridge(등록상표) C18, 4.6 mm x 250 mm, A액: 0.1% 아세트산트리에틸암모늄 완충액, B액: 아세토니트릴에 의한 그래디언트) 및 사이즈 배제 크로마토그래피(도소, TSKgel G2000SWXL, 7.8 mm X 300 mm, 1 XPBS 아이소크라틱)에 의해 정제하여, 화합물 37e(2 공정 수율 16%)을 취득했다.
그 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 37을 합성했다.
실시예 38(환형 올리고뉴클레오티드 X와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 티올-수식제 C6 S-S를 참고예 7에서 합성한 아미다이트 Rf46으로 변경하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 38을 합성했다.
실시예 39(환형 올리고뉴클레오티드 Y와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 고상 시약인 3'-티올-수식제 C3 S-S CPG를 참고예 4에서 합성한 수식 CPG Rf29로 변경하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 39를 합성했다.
실시예 40(환형 올리고뉴클레오티드 Z와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 고상 시약인 3'-티올-수식제 C3 S-S CPG를 참고예 5에서 합성할 수 있는 수식 CPG Rf37로 변경하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 40을 합성할 수 있다.
실시예 41(환형 올리고뉴클레오티드 AA와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 고상 시약인 3'-티올-수식제 C3 S-S CPG를 DMT-C6 디설파이드 lcaa CPG 500Å(ChemGenes사)로 변경하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 41을 합성했다.
실시예 42(환형 올리고뉴클레오티드 AB와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 티올-수식제 C6 S-S를 5'-티오-dI CEP(Berry & Associates사)로 변경하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 42를 합성했다.
실시예 43(환형 올리고뉴클레오티드 AC와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 티올-수식제 C6 S-S를 티올-수식제-oxa-C6-S-S CEP(Berry & Associates사)로 변경하고, 공정 4를 실시예 14에 기재한 방법으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 43을 합성했다.
실시예 44(환형 올리고뉴클레오티드 AD와 그 환형 siRNA)
화합물 44는 이하의 스킴 2에 따라서 합성했다.
스킴 2
Figure pct00053
(식 중, Po는 상기와 동의이다.)
공정 1
실시예 1의 공정 1에 기재한 티올-수식제 C6 S-S를 5'-카르복시-수식제 C5(Glen Research사)로 변경한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 1과 같은 식으로 44b의 조생성물을 얻었다.
공정 2
실시예 1의 공정 2와 같은 식으로 화합물 44c를 얻었다.
ESI-MS 이론치 9208 실측치 9207
공정 3
공정 2에서 얻어진 화합물 44c(100 nmol)을 Rnase Free 물 200 uL에 용해하고, 별도 조제한 30 mmol/L 트리스(2-카르복시에틸)포스핀염산염(TCEP·HCl)/10 mmol/L 트리에틸아민아세트산 완충액을 200 uL 가하고, 실온에서 12시간 정치했다. 반응액 후, 화합물 44d의 조생성물(400 uL)을 취득하여, 그대로 다음 공정에 이용했다.
ESI-MS 이론치 9117 실측치 9118
공정 4
공정 3에서 얻어진 화합물 44d의 반응액(400 uL)에, 종농도로 화합물 44d가 100 μmol/L, NaCl이 450 mmol/L가 되도록 5 mol/L NaCl 및 물을 첨가했다. 그 후, 60℃에서 48시간 정치했다. 반응액을, 역상 액체 크로마토그래피(Waters, XBridge(등록상표) C18, 4.6 mm x 250 mm, A액: 0.1% 아세트산트리에틸암모늄 완충액, B액: 아세토니트릴에 의한 그래디언트)에 의해 정제하여, 화합물 44e(15 nmol, 2 공정 수율 15%)을 취득했다.
ESI-MS 이론치 9100 실측치 9102
공정 5
핵산 서열을 표 8에 기재한 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 5와 동일한 방법으로 화합물 44를 취득했다.
실시예 45(환형 올리고뉴클레오티드 AE와 그 환형 siRNA)
실시예 1의 공정 1에 기재한 고상 시약인 3'-티올-수식제 C3 S-S CPG를 참고예 9에서 합성한 수식 CPG Rf59로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 화합물 45를 합성했다.
실시예 46(환형 올리고뉴클레오티드 AF와 그 환형 siRNA)
화합물 46은 이하의 스킴 3에 따라서 합성할 수 있다.
스킴 3
Figure pct00054
(식 중, Po는 상기와 동의이다.)
공정 1
실시예 1의 공정 1에 기재한 티올-수식제 C6 S-S를 5'-헥시닐 포스포르아미다이트(Glen Research사)로 변경하고, 고상 시약인 3'-티올-수식제 C3 S-S CPG를 아지드-수식된 CPG(화합물(46a), PRIMETECH사)로 변경하고, 참고예 10에서 합성한 디펩티드아미다이트 Rf65를 사용한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 1과 같은 식으로 46b의 조생성물을 얻을 수 있다.
공정 2
공정 1에서 얻어진 조생성물 46b에 28% 암모니아 수용액과 40% 메틸아민 수용액을 등량 혼합한 시약으로 처리하고, 고상 시약으로부터 잘라내어 얻어진 조생성물을 역상 액체 크로마토그래피(Waters, XBridge(등록상표) C18, 4.6 mm x 250 mm, A액: 0.1% 아세트산트리에틸암모늄 완충액, B액: 아세토니트릴에 의한 그래디언트)에 의해 정제하여, 화합물 46c을 얻을 수 있다.
공정 3
공정 2에서 얻어진 화합물(46c)을 이용하여, 저널 오브 오가닉 케미스트리(Journal of Organic Chemistry), 제73권, 287∼290 페이지, 2008년에 기재된 방법 혹은 그것에 준한 합성법에 의해 화합물 46d를 얻을 수 있다.
공정 4
핵산 서열을 표 8에 기재한 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 5와 동일한 방법으로 화합물 46을 얻을 수 있다.
실시예 47(환형 올리고뉴클레오티드 AG와 그 환형 siRNA)
화합물 47은 이하의 스킴 4에 따라서 합성할 수 있다.
스킴 4
Figure pct00055
(식 중, Po는 상기와 동의이다.)
공정 1
실시예 1의 공정 1에 기재한 티올-수식제 C6 S-S를 5'-헥시닐 포스포르아미다이트(Glen Research사)로 변경하고, 고상 시약인 3'-티올-수식제 C3 S-S CPG를 아지드-수식된 CPG(화합물 46a, PRIMETECH사)로 변경한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 1과 같은 식으로 47b의 조생성물을 얻었다.
공정 2
공정 1에서 얻어진 조생성물 47b에 28% 암모니아 수용액과 40% 메틸아민 수용액을 등량 혼합한 시약으로 처리하고, 고상 시약으로부터 잘라내어 얻어진 조생성물을 역상 액체 크로마토그래피(Waters, Xbridge(등록상표) C18, 4.6 mm x 250 mm, A액: 0.1% 아세트산트리에틸암모늄 완충액, B액: 아세토니트릴에 의한 그래디언트)에 의해 정제하여, 화합물 47c를 얻었다.
공정 3
공정 2에서 얻어진 화합물 47c(70 nmol)을, 1.5 mL 샘플 튜브에 각 10 nmol이 되도록 7 분할하고, 종농도로 화합물 47c가 50 μmol/L, NaCl이 200 mmol/L가 되도록 5 mol/L NaCl 및 물을 첨가했다. 그 후, Cu wire(10∼20 가닥, 와코쥰야꾸고교 제조)를 각 튜브에 가하고, 미리 80℃로 따뜻하게 한 히트 블록에 넣어 3분간 정치하고, 가열을 끊고 실온으로 될 때까지 정치했다. 각 튜브의 반응액을 통합하여, NAP-10 컬럼(GE헬스케어 제조)으로 간이 정제를 행한 후, 역상 액체 크로마토그래피(Waters, Xbridge(등록상표) C18, 4.6 mm x 250 mm, A액: 0.1% 아세트산트리에틸암모늄 완충액, B액: 아세토니트릴에 의한 그래디언트)에 의해 정제하여, 화합물 47d(27.4 nmol, 수율 39%)을 취득했다.
ESI-MS 이론치 9235 실측치 9234
공정 4
핵산 서열을 표 8에 기재한 HPRT1_asRNA5로 변경한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 5와 동일한 방법으로 화합물 47을 취득했다.
실시예 7∼46의 올리고뉴클레오티드 유도체 및 음성 대조군으로서의 올리고뉴클레오티드의 염기 서열 및 그 분자량을 표 10∼표 19에 나타낸다. 각 실시예에 있어서, 상단은 환형 올리고뉴클레오티드를 나타내고, 하단은 선형 뉴클레오티드를 나타낸다. 표에서 「환형 구조」의 각 알파벳은, 그 서열이 표 2∼표 6에 있어서 기재되어 있는 「환형 구조」의 각 알파벳에 대응한 환형 구조를 취하는 것을 나타낸다. 각 음성 대조군에 있어서, 상단은 센스쇄를 나타내고, 하단은 안티센스쇄를 나타낸다.
표 10∼표 19에 있어서의 약호 등은 이하와 같다.
양 말단의 V는, 각각이 결합하여, 표에서 「환형 구조」에 나타낸 알파벳에 대응하는 환형 구조임을 나타낸다.
p=인산화
^=포스포로티오에이트 수식
m=2'-OMe 수식
f=2'-F 수식
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
참고예 1
아미다이트 Rf3의 합성
Figure pct00066
공정 1:
시판되는 헥사데칸-1,16-디올 Rf1(5.24 g, 20.3 mmol)을 탈수피리딘(82 mL) 에 현탁시키고, 4,4'-디메톡시트리틸클로리드(5.72 g, 16.9 mmol)를 가하여 실온에서 2시간 30분간 교반했다. 반응 종료 후, 디클로로메탄, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 가하여 켄치했다. 유기층을 물, 포화식염수로 1회 세정하고, 무수황산나트륨으로 건조했다. 용매를 감압 유거하여, 황백색 고체로서 조생성물(15.7 g)을 취득했다. 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피(야마젠 하이플래시 컬럼 3 L, 전개 용매: n-헵탄/아세트산에틸(2% 트리에틸아민)=90/10→70/30→50/50)로 4회 정제했다. 용매를 감압 유거한 후, 아세토니트릴 공비함으로써 16-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)헥사데칸-1-올 Rf2(4.25 g, 7.13 mmol, 5.9 wt% 아세토니트릴)를 황색 오일로서 얻었다.(수율 42%)
ESI-MS(m/z): 584[M+Na].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.43(d, J=7.2Hz, 2H), 7.33-7.16(m, 7H), 6.84-6.81(m, 4H), 3.78(s, 6H), 3.64(q, J=6.4Hz, 2H), 3.02(t, J=6.4Hz, 2H), 1.64-1.53(m, 4H), 1.42-1.20(m, 24H).
공정 2:
아르곤 분위기 하, 20 mL 가지플라스크에, 화합물 Rf2(3.00 g, 5.35 mmol) 을 탈수디클로로메탄(41 mL)에 용해했다. 빙욕 하에서 N,N-디이소프로필에틸아민(4.67 mL, 26.7 mmol), 2-시아노에틸디이소프로필클로로포스포르아미다이트(1.90 g, 8.02 mmol)를 첨가하여, 실온에서 1시간 교반했다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 가하여 켄치한 후, 디클로로메탄으로 2회 추출했다. 하나로 합쳐진 유기층을 물로 세정한 후, 무수황산나트륨으로 건조했다. 용매를 감압 유거함으로써 조생성물(6.45 g)을 백색 오일로서 얻었다. 조생성물을 컬럼 크로마토그래피(야마젠 NH 컬럼 L, 전개 용매: n-헵탄/아세트산에틸=90/10→70/30→50/50)로 정제함으로써, 16-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)헥사데실(2-시아노에틸)디이소프로필포스포르아미다이트 Rf3(3.78 g, 4.09 mmol)를 무색 오일로서 얻었다.(수율 77%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.45-7.43(m, 2H), 7.43-7.25(m, 6H), 7.21-7.19(m, 1H), 6.84-6.81(m, 4H), 3.90-3.80(m, 2H), 3.79(s, 6H), 3.68-3.55(m, 4H), 3.02(t, J=6.8Hz, 2H), 2.64(t, J=6.4Hz, 2H), 1.64-1.56(m, 4H), 1.35-1.24(m, 24H), 1.18(dd, J=4.0, 6.8Hz, 12H).
31P-NMR(CDCl3, 162MHz) δ(ppm): 147.8
참고예 2
수식 CPG Rf12의 합성
Figure pct00067
(식 중, Po는 상기와 동의이다.)
또한, 화합물 Rf9는 이하의 공정 7-1에 의해서 합성했다.
Figure pct00068
공정 3:
시판되는 부탄-1,3-디올 Rf4(1.0 g, 11.1 mmol)를 이용하여, 참고예 1의 공정 1과 같은 식으로 4-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)부탄-2-올 Rf5(4.00 g, 9.51 mmol, 2.7 wt% 아세트산에틸, 4.3 wt% n-헵탄)를 담황색 오일로서 얻었다.(수율 86%)
ESI-MS(m/z): 415.0(M+Na).
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.42(d, J=7.2Hz, 2H), 7.32-7.19(m, 7H), 6.83(d, J=8.8Hz, 4H), 4.00-3.95(m, 1H), 3.79(s, 6H), 3.38-3.19(m, 2H), 2.95(d, J=2.8Hz, 1H), 1.83-1.66(m, 2H), 1.16(d, J=6.4Hz, 3H).
공정 4:
아르곤 분위기 하의 300 mL 플라스크에, 공정 3에서 얻어진 화합물 Rf5(4.00 g, 10.2 mmol), 탈수디클로로메탄(50 mL)을 가했다. 빙냉 하, 트리에틸아민(2.84 mL, 20.4 mmol), 메탄술포닐클로리드(1.20 mL, 15.3 mmol)를 첨가하여, 실온에서 1시간 교반했다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 클로로포름을 가하여 분액했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조하고, 용매를 감압 농축함으로써, 4-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)부탄-2-일 메탄술포네이트 Rf6을 포함하는 조생성물(5.30 g)을 귤색 오일로서 얻었다. 얻어진 조생성물은 그대로 다음 공정에 이용했다.(수율: quant.)
ESI-MS(m/z): 493[M+Na].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.40(d, J=7.6Hz, 2H), 7.31-7.20(m, 7H), 6.82(d, J=9.2Hz, 4H), 5.04-5.00(m, 1H), 3.79(s, 6H), 3.23-3.14(m, 2H), 2.75(s, 3H), 1.97-1.88(m, 2H), 1.43(d, J=6.4Hz, 3H).
공정 5:
200 mL 콜벤에, 공정 4에서 얻어진 화합물 Rf6을 포함하는 조생성물(5.30 g), 탈수N,N-디메틸포름아미드(96 mL)를 가하여, 현탁시켰다. 티오아세트산칼륨(5.14 g, 45.1 mmol), 요오드화나트륨(0.170 g, 1.13 mmol)을 첨가하여, 50℃에서 3시간 교반했다. 반응 종료 후, 물을 가하여, n-헵탄/아세트산에틸(1/1)로 2회 추출했다. 하나로 합쳐진 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시켜, 용매를 감압 농축함으로써, 귤색 오일로서 조생성물(4.57 g)을 얻었다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(야마젠 하이플래시 컬럼 L, 전개 용매: n-헵탄/아세트산에틸=100/0→90/10→80/20)로 정제함으로써, S-(4-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)부탄-2-일)에탄티오에이트 Rf7(3.98 g, 7.83 mmol, 11.3 wt% 아세트산에틸)을 귤색 오일로서 얻었다.(2 단계 수율 70%)
ESI-MS(m/z): 473.2[M+Na].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.44-7.42(m, 2H), 7.33-7.18(m, 7H), 6.82(d, J=8.8Hz, 4H), 3.79(s, 6H), 3.76-3.71(m, 1H), 3.18-3.07(m, 2H), 2.26(s, 3H), 1.90-1.79(m, 2H), 1.25(d, J=7.2Hz, 3H).
공정 6:
아르곤 분위기 하의 30 mL 플라스크에, 공정 5에서 얻어진 화합물 Rf7(400 mg, 0.888 mmol), 탈수메탄올(3.6 mL)을 가하여 용해했다. 40% 메틸아민/메탄올 용액(870 μL)을 첨가하여, 1시간 교반했다. 반응 종료 후, 용매를 감압 농축함으로써 귤색 오일로서 조생성물(430 mg)을 얻었다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(야마젠 하이플래시 컬럼 M, 전개 용매: n-헵탄/아세트산에틸=90/10→70/30)로 정제함으로써, 4-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)부탄-2-티올 Rf8(324 mg, 0.717 mmol, 9.5 wt% 아세트산에틸)을 무색 오일로서 얻었다.(수율 81%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.44-7.42(m, 2H), 7.33-7.20(m, 7H), 6.82(d, J=8.8Hz, 4H), 3.79(s, 6H), 3.25-3.15(m, 3H), 1.91-1.72(m, 2H), 1.44(d, J=6.4Hz,, 1H), 1.29(d, J=3.6Hz, 3H).
공정 7-1:
아르곤 분위기 하, 100 mL 플라스크에 2,2'-디피리딜디술피드(5.00 g, 22.7 mmol)를 탈수메탄올(33 mL)에 용해하고, 시판되는 3-머캅토프로판-1-올 Rf13(1.39 g, 15.1 mmol)을 가하여, 실온에서 4시간 교반했다. 반응 종료 후, 용매를 감압 농축함으로써, 황색 오일의 조생성물(6.40 g)을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(야마젠 하이플래시 컬럼 L, 전개 용매: n-헵탄/아세트산에틸=90/10→70/30→50/50→30/70)로 2회 정제함으로써, 3-(피리딘-2-일디술파닐)프로판-1-올 Rf9(2.20 g, 10.9 mmol)를 무색 오일로서 얻었다.(수율 72%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 8.48-8.46(m, 1H), 7.66-7.61(m, 2H), 7.14-7.09(m, 1H), 3.81(t, J=6.0Hz, 2H), 2.98(t, J=4.8Hz, 2H), 2.41(br, 1H), 1.99-1.92(m, 2H).
공정 7-2:
아르곤 분위기 하의 50 mL 플라스크에, 공정 6에서 얻어진 화합물 Rf8(480 mg, 1.18 mmol), 탈수메탄올(12 mL)을 가하여, 현탁시켰다. 이 혼합액에 공정 7-1에서 얻어진 화합물 Rf9(710 mg, 3.52 mmol), 트리에틸아민(491 μL, 3.52 mmol)을 첨가하여, 실온에서 2시간 교반했다. 반응 종료 후, 용매를 감압 농축하여, 조생성물(1.29 g)을 황색 오일로서 얻었다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피(야마젠 하이플래시 컬럼 M, 전개 용매: n-헵탄/아세트산에틸=90/10→70/30→50/50)로 정제함으로써, 3-((4-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)부탄-2-일)디술파닐)프로판-1-올 Rf10(492 mg, 0.839 mmol, 15.0 wt% 아세트산에틸)을 무색 오일로서 얻었다.(수율 62%)
ESI-MS(m/z): 521.3[M+Na].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.43(d, J=7.9Hz, 2H), 7.33-7.20(m, 7H), 6.83(d, J=8.4Hz, 4H), 3.79(s, 6H), 3.71(br, 2H), 3.24-3.03(m, 3H), 2.73(t, J=7.2Hz, 2H), 2.02-1.95(m, 1H), 1.88(quin, J=6.8Hz, 2H), 1.78-1.69(m, 1H), 1.28-1.23(m, 3H).
공정 8:
아르곤 분위기 하의 50 mL 플라스크에, 공정 7에서 얻어진 화합물 Rf10(492 mg, 0.987 mmol), 탈수디클로로메탄(10 mL)을 가하여, 용해했다. 이 용액에 트리에틸아민(2.75 μL, 1.97 mmol), 무수숙신산(150 mg, 1.48 mmol)을 가하여, 실온에서 2시간 교반했다. 반응 종료 후, 용매를 감압 농축하여, 조생성물(1.20 g)을 황색 오일로서 얻었다. 얻어진 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(야마젠 하이플래시 컬럼 M, 전개 용매: 클로로포름/메탄올(1% 트리에틸아민)=100/0→98/2→95/5→90/10→80/20)로 정제한 후, 아세토니트릴로 공비함으로써, 4-(3-((4-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)부탄-2-일)디술파닐)프로폭시)-4-옥소부탄산 Rf11(630 mg, 0.863 mmol, 18.0 wt% 트리에틸아민(1.3 eq.))을 담백색 오일로서 얻었다.(수율 87%)
ESI-MS(m/z): 597[M-H].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.42(d, J=7.6Hz, 2H), 7.32-7.20(m, 7H), 6.82(d, J=8.8Hz, 4H), 4.12(t, J=6.0Hz, 2H), 3.79(s, 6H), 3.23-3.02(m, 3H), 2.67(d, J=7.6Hz, 2H), 2.61-2.50(m, 4H), 2.01-1.93(m, 3H), 1.76-1.68(m, 1H), 1.30-1.28(m, 3H).
공정 9:
CPG 레진(LCAA 조절 공극 유리, 2.20 g)에 탈수아세토니트릴(8.0 mL)을 가하고, 또한 디이소프로필카르보디이미드(52 μL, 334 μmol)와 1-히드록시벤조트리아졸(5.42 mg, 40 μmol)을 가하여 마개를 꼭 닫고서 실온에서 10분간 진탕 교반했다. 공정 8에서 얻어진 화합물 Rf11(81 mg (6.6 wt%, 트리에틸아민(1.3 eq.), 111 μmol)을 탈수피리딘(0.67 mL)과 무수아세토니트릴(2.0 mL)의 혼합 용매에 녹이고, CPG 레진의 용액에 가하여 마개를 꼭 닫고서 실온에서 34시간 20분간 진탕 교반했다. 또한 디이소프로필카르보디이미드(52 μL, 334 μmol)와 1-히드록시벤조트리아졸(5.42 mg, 40 μmol)을 가하여 마개를 꼭 닫고서 실온에서 19시간 40분간 진탕 교반했다. 또한 디이소프로필카르보디이미드(52 μL, 334 μmol)와 1-히드록시벤조트리아졸(5.42 mg, 40 μmol)을 가하여 마개를 꼭 닫고서 실온에서 16시간50분간 진탕 교반했다. CPG 용액에 용액을 여과하여 제외한 후, CPG 레진을 염화메틸렌→아세토니트릴→염화메틸렌의 순으로 세정하고, 아르곤 가스를 통과시켜 건조하여, 수식 CPG 레진(1.75 g)을 얻었다. 얻어진 CPG 레진의 일부분(12.0 mg)을 2 wt% 트리클로로아세트산-염화메틸렌 용액(25 mL)으로 처리하여, 흡광도를 측정했다.(흡광도(503 nm)=2.051, 로딩 56.4 μmol/g, 로딩의 계산 방법은 Current Protocol in Nucleic Acid Chemistry, Unit 3.2.14에 따랐다)
이 조작을 동량의 CPG 레진 2.20 g 을 이용하여 추가로 2 배치(batch) 행함으로써 수식 CPG 레진(1.85 g(로딩 55.0 μmol/g), 1.87 g, (로딩 57.4 μmol/g))을 각각 취득했다.
얻어진 CPG 레진(1.75 g)에 N-메틸이미다졸/테트라히드로푸란=1/5.25의 혼합액(22.0 mL)과 무수아세트산/2,6-루티딘/테트라히드로푸란=1/1/8의 혼합 용액(21.9 mL)을 가하여, 실온에서 16시간 진탕 교반했다. 용액을 여과하여 제외한 후, CPG 레진을 염화메틸렌→아세토니트릴→염화메틸렌의 순으로 세정하고, 아르곤 가스를 통과시켜 건조함으로써 수식 CPG Rf12(1.64 g)를 얻었다. 얻어진 CPG 레진의 일부분(12.5 mg)을 2 wt% 트리클로로아세트산-염화메틸렌 용액(25 mL)으로 처리하여, 흡광도를 측정했다.(흡광도(503 nm)=2.117, 로딩 55.9 μmol/g).
참고예 3
수식 CPG Rf21의 합성
Figure pct00069
(식 중, Po는 상기와 동의이다.)
공정 10:
아르곤 분위기 하, 시판되는 트랜스-2-펜테날 Rf14(500 mg, 5.94 mmol)를 탈수테트라히드로푸란(3.0 mL)에 용해했다. 이 용액에 티오아세트산(635 μL, 8.92 mmol)을 가하여, 실온에서 3시간 교반했다. 반응 종료 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 가하여 켄치하고, 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 포화식염수로 세정하고, 유기층을 무수황산나트륨으로 건조한 후, 감압 하에 농축함으로써 S-(1-옥소펜탄-3-일)에탄티오에이트 Rf15(875 mg)를 황색 오일로서 얻었다.(수율 86%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 9.70(t, J=2.0Hz, 1H), 3.92-3.86(m, 1H), 2.74-2.71(m, 2H), 2.33(s, 3H), 1.77-1.62(m, 2H), 0.98(t, J=7.2Hz, 3H).
공정 11:
아르곤 분위기 하, 에탄올/물=4/1(20 mL)의 혼합 용액에, 빙욕 하에서 수소화붕소나트륨(340 mg, 8.91 mmol), 공정 10에서 얻어진 화합물 Rf15(875 mg, 5.94 mmol)를 가하여, 실온에서 40분간 교반했다. 반응 종료 후, 포화 염화암모늄 수용액을 가하여, 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 포화식염수로 세정하여, 무수황산나트륨으로 건조했다. 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피(야마젠 하이플래시 컬럼 L, 전개 용매: n-헵탄/아세트산에틸=90/10→50/50)로 정제함으로써, 3-머캅토펜탄-1-올 Rf16(160 mg)을 무색 오일로서 얻었다.(수율 21%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 3.89-3.78(m, 2H), 2.93-2.85(m, 1H), 2.05-1.94(m, 1H), 1.79-1.50(m, 4H), 1.38(d, J=8.4Hz, 1H), 1.02(t, J=7.2Hz, 3H).
공정 12:
공정 11에서 얻어진 화합물 Rf16(160 mg, 1.33 mmol)을 이용하여, 참고예 2의 공정 7-1과 같은 식으로 3-(피리딘-2-일디술파닐)펜탄-1-올 Rf17(250 mg)을 무색 오일로서 얻었다.(수율 79%)
ESI-MS(m/z): 230[M+H].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 8.47(d, J=4.4Hz, 1H), 7.62-7.51(m, 2H), 7.13-7.10(m, 1H), 4.13-4.01(m, 1H), 3.85-3.77(m, 2H), 3.08-3.01(m, 1H), 2.00-1.91(m, 1H), 1.82-1.66(m, 3H), 1.02(t, J=8.0Hz, 3H).
공정 13:
공정 12에서 얻어진 화합물 Rf17(250 mg, 1.09 mmol)을 이용하여, 참고예 1의 공정 1과 같은 식으로 2-((1-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)펜탄-3-일)디술파닐)피리딘 Rf18(333 mg)을 무색 오일로서 얻었다.(수율 51%)
ESI-MS(m/z): 570[M+K].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 8.40(d, J=4.8Hz, 1H), 7.65(d, J=7.6Hz, 1H), 7.51(t, J=7.6Hz, 1H), 7.41(d, J=7.6Hz, 2H), 7.31-7.25(m, 6H), 7.22-7.20(m, 1H), 7.30(t, J=7.6Hz, 1H), 6.81(d, J=8.8Hz, 4H), 3.79(s, 6H), 3.24-3.14(m, 2H), 2.99(quin, J=6.4Hz, 1H), 1.89(q, J=6.0Hz, 2H), 1.65-1.57(m, 2H), 0.96(t, J=8.8Hz, 3H).
공정 14:
공정 13에서 얻어진 화합물 Rf18(333 mg, 0.626 mmol)을 탈수메탄올(5.0 mL)에 용해했다. 이 용액에 시판되는 3-머캅토1-프로판올 Rf13(43 μL, 0.501 mmol)을 가하여, 실온에서 1시간 교반했다. 원료가 남아 있었기 때문에, 화합물 Rf13(11 μL, 0.128 mmol)을 가하고 또한 실온에서 3시간 교반했다. 반응 종료 후, 반응 용액을 농축하여, 조생성물을 황색 오일로서(0.69 g) 얻었다. 얻어진 조생성물을 컬럼 크로마토그래피(야마젠 하이플래시 컬럼 M, 전개 용매: n-헵탄/아세트산에틸(2% 트리에틸아민)=95/5→80/20→70/30)로 정제함으로써, 3-((1-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)펜탄-3-일)디술파닐)프로판-1-올 Rf19(215 mg)를 무색 오일로서 얻었다.(수율 57%)
ESI-MS(m/z): 552[M+K].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.42(d, J=7.2Hz, 1H), 7.33-7.20(m, 7H), 6.82(d, J=8.8Hz, 4H), 3.79(s, 6H), 3.69(q, J=5.6Hz, 2H), 3.20(dt, J=2.4, 7.2Hz, 2H), 2.81(quin, J=6.4Hz, 1H), 2.68(t, J=7.2Hz, 2H), 1.94-1.83(m, 4H), 1.63-1.57(m, 2H), 1.35(t, J=5.6Hz, 1H), 0.968(t, J=8.0Hz, 3H).
공정 15:
공정 14에서 얻어진 화합물 Rf19(215 mg, 0.354 mmol)를 이용하여, 참고예 2의 공정 8과 같은 식으로 4-(3-((1-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)펜탄-3-일)디술파닐)프로폭시)-4-옥소부탄산 Rf20(210 mg, 6.6 wt% 트리에틸아민(0.43 eq.))을 무색 오일로서 얻었다.(수율 90%)
ESI-MS(m/z): 612[M-H].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.41(d, J=7.6Hz, 2H), 7.32-7.20(m, 7H), 6.82(d, J=9.2Hz, 4H), 4.13(t, J=6.0Hz, 2H), 3.79(s, 6H), 3.21-3.17(m, 2H), 2.83-2.77(m, 1H), 2.64-2.57(m, 6H), 1.98-1.85(m, 4H), 1.64-1.56(m, 2H), 0.962(t, J=6.8Hz, 3H).
공정 16:
공정 15에서 얻어진 화합물 Rf20(61 mg, 0.1 mmol)과 CPG 레진(LCAA 조절 공극 유리, 2.20 g)을 이용하여, 참고예 2의 공정 9과 같은 식으로 수식 CPG Rf21(2.10 g)을 얻었다. 얻어진 CPG 레진의 일부분(24.3 mg)을 2 wt% 트리클로로아세트산-염화메틸렌 용액(25 mL)으로 처리하여 흡광도를 측정했다.(흡광도(503 nm)=2.490, 로딩 33.7 μmol/g)
참고예 4
수식 CPG Rf29의 합성
Figure pct00070
(식 중, Po는 상기와 동의이다.)
공정 17:
시판되는 2-시클로헥센-1-온 Rf22(5.00 g, 52 mmol)를 이용하여, 참고예 3의 공정 10과 같은 식으로 S-(3-옥소시클로헥실)에탄티오에이트 Rf23(8.83 g, 49.0 mmol, 4.4 wt% 아세트산에틸)을 귤색 오일로서 얻었다.(수율 94%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 3.89-3.82(m, 1H), 2.72(dd, J=3.2, 14.4Hz, 1H), 2.49-2.29(m, 3H), 2.32(s, 3H), 2.13(br, 1H), 2.09-1.99(m, 1H), 1.89-1.75(m, 2H).
공정 18:
아르곤 분위기 하의 500 mL 콜벤에, 탈수테트라히드로푸란(100 mL)을 가했다. 빙냉 하에서 수소화알루미늄리튬(1.95 g, 51.3 mmol)을 가한 후, 염빙욕(鹽氷浴) 하에서 공정 17에서 얻어진 화합물 Rf23(8.83 g, 51.3 mmol)을 20분 걸쳐 첨가했다. 첨가 후, 빙욕 하(내부 온도 21℃)에서 1시간 교반했다. 반응 종료 후, 빙냉 하(내부 온도 5∼10℃)에서 포화 염화암모늄 수용액을 가하고 켄치하여, 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 물, 포화식염수로 세정하여, 무수황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 유거함으로써 귤색 오일로서 조생성물(7.18 g)을 얻었다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피(야마젠 하이플래시 컬럼 3 L, 전개 용매: n-헵탄/아세트산에틸=80/20→70/30→50/50)로 정제함으로써, S-(3-히드록시시클로헥실)에탄티오에이트 Rf24(5.81 g, 30.0 mmol, 10 wt% 아세트산에틸)를 귤색 오일로서 얻었다.(수율 59%)
ESI-MS(m/z): 197.9[M+Na].
공정 19:
공정 18에서 얻어진 화합물 Rf24(2.90 g, 16.6 mmol)를 이용하여, 참고예 1의 공정 1과 같은 식으로 S-(3-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)시클로헥실)에탄티오에이트 Rf25(1.70 g, 3.44 mmol, 3.5 wt% 아세토니트릴)를 무색 아모르퍼스로서 얻었다.(수율 21%)
ESI-MS(m/z): 499.1[M+Na].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.53-7.47(m, 2H), 7.42-7.35(m, 4H), 7.30-7.17(m, 3H), 6.83-6.80(m, 4H), 3.79(s, 6H), 3.46-3.41(m, 1H), 3.16-3.10(m, 1H), 2.24(s, 3H), 1.74(br, 1H), 1.62-1.56(s, 2H), 1.38-1.04(m, 5H).
공정 20:
공정 19에서 얻어진 화합물 Rf25(1.70 g, 3.57 mmol)를 이용하여, 참고예 2의 공정 6과 같은 식으로 3-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)시클로헥산-1-티올 Rf26(1.41 g, 2.80 mmol, 13.7 wt% 아세트산에틸)을 무색 오일로서 얻었다.(수율 78%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.45-7.47(m, 2H), 7.39-7.36(m, 4H), 7.29-7.18(m, 3H), 6.83-6.80(m, 4H), 3.79(s, 6H), 3.36-3.29(m, 1H), 2.47-2.38(m, 1H), 1.85-1.71(m, 2H), 1.60-1.50(m, 1H), 1.43(d, J=7.2Hz, 1H), 1.31-1.05(m, 4H), 1.18-0.90(m, 1H).
공정 21:
공정 20에서 얻어진 화합물 Rf26(780 mg, 3.87 mmol)을 이용하여, 참고예 2의 공정 7-2와 같은 식으로 3-((3-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)시클로헥실)디술파닐)프로판-1-올 Rf27(457 mg, 0.785 mmol, 9.8 wt% 아세트산에틸)을 무색 오일로서 얻었다.(수율 41%)
ESI-MS(m/z): 564.6[M+K].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.51-7.48(m, 2H), 7.41-7.37(m, 4H), 7.30-7.18(m, 3H), 6.84-6.80(m, 4H), 3.79(s, 6H), 3.75-3.69(m, 2H), 3.40-3.32(m, 1H), 2.70-2.61(m, 2H), 2.39-2.31(m, 1H), 1.96-1.80(m, 2H), 1.69-1.43(m, 4H), 1.28-0.983(m, 4H).
공정 22:
공정 21에서 얻어진 화합물 Rf27(215 mg, 0.354 mmol)을 이용하여, 참고예 2의 공정 8과 같은 식으로 4-(3-((3-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)시클로헥실)디술파닐)프로폭시)-4-옥소부탄산 Rf28(227 mg, 0.360 mmol, 7.2 wt% 트리에틸아민(0.53 eq.))을 무색 오일로서 얻었다.(수율 35%)
ESI-MS(m/z): 623[M-H].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.53-7.47(m, 2H), 7.42-7.35(m, 4H), 7.30-7.18(m, 3H), 6.85-6.79(m, 4H), 4.16-4.10(m, 2H), 3.79(s, 6H), 3.40-3.30(m, 1H), 3.02-2.96(m, 1H), 2.63-2.56(m, 6H), 2.41-2.30(m, 1H), 2.01-1.90(m, 2H), 1.84-1.78(m, 1H), 1.70-1.58(m, 2H), 1.45-1.39(m, 1H), 1.28-0.96(m, 4H).
공정 23:
공정 22에서 얻어진 화합물 Rf28(42.8 mg, 68.5 μmol)과 CPG 레진(LCAA 조절 공극 유리, 1.20 g)을 이용하여, 참고예 2의 공정 9와 같은 식으로 수식 CPG Rf29(1.08 g)를 얻었다. 얻어진 CPG 레진의 일부분(14.9 mg)을 2 wt% 트리클로로아세트산-염화메틸렌 용액(25 mL)으로 처리하여 흡광도를 측정했다.(흡광도(503 nm)=2.146, 로딩 47.3 μmol/g).
참고예 5
수식 CPG Rf37의 합성
Figure pct00071
(식 중, Po는 상기와 동의이다.)
시판되는 2H-피란-3(6H)-온을 이용하여, 참고예 4와 같은 합성법에 의해 수식 CPG Rf37은 합성할 수 있다.
참고예 6
아미다이트 Rf41의 합성
Figure pct00072
공정 24:
참고예 2의 공정 7-1에서 얻어진 화합물 Rf9(1.32 g, 6.56 mmol)를 이용하여, 참고예 1의 공정 1과 같은 식으로 2-((3-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)프로필)디술파닐)피리딘 Rf38(2.96 g)을 무색 오일로서 얻었다.(수율 90%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 8.45-8.44(m, 1H), 7.69(d, J=0.8Hz, 1H), 7.67-7.58(m, 1H), 7.42-7.40(m, 2H), 7.31-7.25(m, 6H), 7.22-7.16(m, 1H), 7.08-7.04(m, 1H), 6.84-6.79(m, 4H), 3.78(s, 6H), 3.15(t, J=6.0Hz, 2H), 2.93(t, J=7.6Hz, 2H), 2.00-1.96(m, 2H).
공정 25:
공정 24에서 얻어진 화합물 Rf38(2.49 g, 4.94 mmol)과 시판되는 3-머캅토부탄-1-올 Rf39(787 mg, 7.42 mmol)를 이용하여, 참고예 2의 공정 7-2와 같은 식으로 3-((3-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)프로필)디술파닐)부탄-1-올 Rf40(1.86 g)을 무색 오일로서 얻었다.(수율 67%)
ESI-MS(m/z): 521.7[M+Na].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.44-7.41(m, 2H), 7.33-7.26(m, 6H), 7.22-7.19(m, 1H), 6.84-6.80(m, 4H), 3.83-3.68(m, 2H), 3.79(s, 6H), 3.15(t, J=6.4Hz, 2H), 3.02-2.94(m, 1H), 2.80(t, J=6.8Hz, 2H), 2.60(t, J=6.4Hz, 1H), 2.01-1.92(m, 2H), 1.80-1.71(m, 1H), 1.41(t, J=5.6Hz, 1H), 1.34(d, J=6.8Hz, 3H).
공정 26:
공정 25에서 얻어진 화합물 Rf40(380 mg, 0.762 mmol)을 이용하여, 참고예 1의 공정 2와 같은 식으로 3-((3-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)프로필)디술파닐)부틸(2-시아노에틸)디이소프로필포스포르아미다이트 Rf41(230 mg, 0.300 mmol, 8.9 wt% AcOEt)을 무색 오일로서 얻었다.(수율 39%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.40-7.41(m, 2H), 7.32-7.26(m, 6H), 7.22-7.20(m, 1H), 6.84-6.79(m, 4H), 3.86-3.53(m, 4H), 3.80(s, 6H), 3.55-3.61(m, 2H), 3.18-3.13(m, 2H) , 3.00-2.94(m, 1H), 2.81-2.58(m, 4H), 2.01-1.74(m, 4H), 1.34(dd, 1.2, 6.8Hz, 3H), 1.29-1.22(m, 2H), 1.17(dt, J=1.2, 4.8Hz, 10H)
31P-NMR(CDCl3, 162MHz) δ(ppm): 148.3
참고예 7
아미다이트 Rf46의 합성
Figure pct00073
공정 27:
2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘)(5.95 g, 19.2 mmol)을 탈수N,N-디메틸포름아미드(118 mL)에 용해하고, 시판되는 3-머캅토프로판-1-올 Rf13(1.18 g, 12.8 mmol)을 가한 후, 실온에서 4시간 교반했다. 반응 용액에 물을 가하여, 이소프로필에테르로 추출한 후, 유기층에 물을 가하여, 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 포화식염수로 세정한 후, 무수황산나트륨으로 건조하여, 감압 하에 농축함으로써, 황색 고체의 조생성물(7.01 g)을 얻었다. 얻어진 조생성물을 n-헵탄/아세트산에틸=50/50으로 현탁 세정을 행하여, 귤색 고체의 조생성물(4.98 g)을 얻었다. 조생성물을 컬럼 크로마토그래피(실리카량: 90 g, 전개 용매: n-헵탄/아세트산에틸=2/1→ 1/1(1% 트리에틸아민))로 정제함으로써, 3-((5-니트로피리딘-2-일)디술파닐)프로판-1-올 Rf42(2.09 g)를 황색 오일로서 얻었다.(수율 66%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 9.28(d, J=1.6Hz, 1H), 8.41(dd, J=2.4, 8.8Hz, 1H), 7.89(d, J=8.8Hz, 1H), 3.79(t, J=5.6Hz, 2H), 2.99(t, J=8.8Hz, 2H), 2.00-1.94(m, 2H).
공정 28:
공정 27에서 얻어진 화합물 Rf42(1.97 g, 8.00 mmol)를 이용하여, 참고예 1의 공정 1과 같은 식으로 2-((3-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)프로필)디술파닐)-5-니트로피리딘 Rf43(3.99 g)을 옅은 황색 오일로서 얻었다.(수율 91%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 9.24(d, J=1.6Hz, 1H), 8.3(dd, J=2.8, 8.8Hz, 1H), 7.85(d, J=8.8Hz, 1H), 7.41-7.38(m, 2H), 7.31-7.16(m, 7H), 6.84-6.80(m, 4H), 3.79(s, 6H), 3.18(t, J=6.0Hz, 2H), 2.78(t, J=7.2Hz, 2H), 1.97(quin, J=7.2Hz, 2H).
공정 29:
공정 28에서 얻어진 화합물 Rf43(4.13 g, 7.53 mmol)과 시판되는 3-머캅토-3-메틸부탄-1-올 Rf44(1.36 g, 11.3 mmol)를 이용하여, 참고예 2의 공정 7-2와 같은 식으로 3-((3-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)프로필)디술파닐)-3-메틸부탄-1-올 Rf45(3.72 g, 6.98 mmol)를 무색 액체로서 얻었다.(수율 93%)
ESI-MS(m/z): 535.0[M+Na].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.34-7.40(m, 2H), 7.33-7.26(m, 6H), 7.22-7.18(m, 1H), 6.84-6.80(m, 4H), 3.79(s, 6H), 3.79-3.75(m, 2H), 3.14(t, J=6.4Hz, 2H), 2.82(t, J=7.2Hz, 2H), 1.96-1.86(m, 4H), 1.44(br, 1H), 1.32(s, 6H).
공정 30:
공정 29에서 얻어진 화합물 Rf45(1.00 g, 1.95 mmol)를 이용하여, 참고예 1의 공정 2와 같은 식으로 3-((3-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)프로필)디술파닐)-3-메틸부틸(2-시아노에틸)디이소프로필포스포르아미다이트 Rf46(1.15 g, 1.46 mmol)를 무색 오일로서 얻었다.(수율 75%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.43-7.41(m, 2H), 7.32-7.28(m, 6H), 7.22-7.18(m, 1H), 6.84-6.80(m, 4H), 3.86-3.69(m, 4H), 3.79(s, 6H), 3.63-3.56(m, 2H), 3.14(t, J=6.0Hz, 2H), 2.81(t, J=7.6Hz, 2H), 2.61(t, J=6.4Hz, 2H), 1.94(quin, J=7.6Hz, 4H), 1.32(s, 6H), 1.18(dd, J=4.8, 6.8Hz, 12H).
31P-NMR(CDCl3, 162MHz) δ(ppm): 147.9
참고예 8
카르복실산트리에틸아민염 Rf54의 합성
Figure pct00074
공정 31:
시판되는 2-(히드록시메틸)-2-메틸프로판-1,3-디올 Rf47(3.00 g, 25.0 mmol)을 이용하여, 참고예 1의 공정 1과 같은 식으로 2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-2-메틸프로판-1,3-디올 Rf48(4.88 g, 5.4 wt% 아세트산에틸을 포함한다, 10.9 mmol)을 담황색 아모르퍼스로서 얻었다.(수율 44%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.43-7.41(m, 2H), 7.34-7.19(m, 7H), 6.85-6.82(m, 4H), 3.79(s, 6H), 3.69(d, J=11.2Hz, 2H), 3.58(d, J=11.2Hz, 2H), 3.14(s, 2H), 2.32(br, 2H), 0.834(s, 3H).
공정 32:
아르곤 분위기 하, 공정 31에서 얻어진 화합물 Rf48(4.88 g, 5.4 wt% 아세트산에틸을 포함한다, 10.9 mmol)을 무수테트라히드로푸란(50 mL)에 녹여, 빙냉했다. 수소화나트륨(미네랄 오일 중 60%, 436 mg, 10.9 mmol)과 요오드화나트륨(168 mg, 1.12 mmol), 1,4-디브로모부탄 Rf49(1.29 ml, 10.9 mmol)를 순차 가하여 빙냉 하에서 100분간 교반했다. 아이스 배스를 벗기고, 점진적으로 실온까지 승온하면서 17시간 교반했다. 반응이 30% 정도밖에 진행되지 않았기 때문에, 반응액을 다시 빙냉하고, 수소화나트륨(미네랄 오일 중 60%, 436 mg, 10.9 mmol)과 1,4-디브로모부탄 Rf49(1.29 ml, 10.9 mmol)를 가했다. 곧바로 아이스 배스를 벗기고, 점진적으로 실온까지 승온하면서 3시간 교반했다. 원료가 남아 있었지만, 반응액을 빙냉하고, 포화염화암모늄수(50 mL)를 천천히 가하여 켄치했다. 더 물(50 mL)을 가한 후, 아세트산에틸(0.15 L)로 추출했다. 유기층을 물(50 mL)로 세정하고, 또한 포화식염수(50 mL)로 세정했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 감압 하에 농축함으로써 황색 액체의 조성적체(粗成績體)를 얻었다. 얻어진 조성적체를 컬럼 크로마토그래피(야마젠 하이플래시 컬럼 3 L, 전개 용매: n-헵탄/아세트산에틸=100/0→0/100)로 정제함으로써, 3-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)-2-((4-브로모부톡시)메틸)-2-메틸프로판-1-올 Rf50(3.24 g, 12 wt% 아세트산에틸을 포함한다, 5.09 mmol)을 무색 점성 액체로서 얻었다.(수율 47%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.43-7.41(m, 2H), 7.32-7.16(m, 7H), 6.85-6.82(m, 4H), 3.79(s, 6H), 3.55-3.38(m, 6H), 3.08(q, J=10.8Hz, 2H), 2.70(t, J=6.0Hz, 1H), 1.91-1.84(m, 2H), 1.72-1.65(m, 2H), 1.23(br, 2H), 0.884(s, 3H).
공정 33:
아르곤 분위기 하, 공정 32에서 얻어진 화합물 Rf50(1.00 g, 12 wt% 아세트산에틸을 포함한다, 1.58 mmol)을 무수N,N-디메틸포름아미드(18 mL)에 녹이고, 요오드화나트륨(134 mg, 0.897 mmol)과 아지드화나트륨(233 mg, 3.59 mmol)을 가하여 실온에서 8시간 교반했다. 반응액을 빙냉하여, 물(20 mL)을 가했다. n-헵탄/아세트산에틸=1/1의 혼합 용매(50 mL)로 추출하여, 물로 2회 세정했다(50 mL x 2). 유기층을 무수황산나트륨으로 건조 후, 감압 하에 농축함으로써, 조성적체(0.89 g)를 무색 점성 액체로서 얻었다. 얻어진 조성적체를 컬럼 크로마토그래피(야마젠 하이플래시 컬럼 M, 전개 용매: n-헵탄/아세트산에틸=100/0→30/70)로 정제함으로써, 3-(4-아지드부톡시)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-2-메틸프로판-1-올 Rf51(720 mg, 4.3 wt% 아세트산에틸을 포함한다, 1.33 mmol)을 무색 액체로서 얻었다.(수율 84%)
ESI-MS(m/z): 542[M+Na].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.43-7.41(m, 2H), 7.32-7.16(m, 7H), 6.84-6.81(m, 4H), 3.79(s, 6H), 3.55-3.40(m, 6H), 3.28-3.25(m, 2H), 3.08(q, J=11.2Hz, 2H), 1.63-1.57(m, 4H), 0.882(s, 3H).
공정 34:
아르곤 분위기 하, 공정 33에서 얻어진 화합물 Rf51(1.00 g, 1.92 mmol)을 탈수염화메틸렌(10 mL)에 녹이고, 용액을 빙욕으로 냉각하여(내부 온도 5℃), 2,6-루티딘(1.21 mL, 10.4 mmol)과 트리플루오로메탄술폰산무수물(0.39 ml, 2.31 mmol)을 가하여 빙욕으로 냉각하면서 1시간 교반했다. 얼음물(0.10 L)을 가하여 켄치하고, 아세트산에틸(0.20 L)로 추출했다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조하여, 감압 하에 농축함으로써, 조성적체(1.25 g)를 적색 액체로서 얻었다.
조성적체를 탈수N,N-디메틸포름아미드(10 mL)에 녹이고, 18-크라운-6(1.22 g, 4.60 mmol), p-톨루엔티오술폰산칼륨(0.87 g, 3.84 mmol)을 가하여 마개를 꼭 닫고서 실온에서 20시간 교반했다. 물(0.10 L)을 가하여 켄치하고, 헵탄/아세트산에틸=1/1의 용매로 2회 추출했다(0.15 L x 2). 유기층을 물(0.10 L)로 세정하여, 무수황산나트륨으로 건조했다. 감압 하에 농축함으로써 조성적체(1.35 g)를 얻었다. 얻어진 조성적체를 컬럼 크로마토그래피(야마젠 하이플래시 컬럼 L, 전개 용매: n-헵탄/아세트산에틸=100/0→80/20)로 정제함으로써, S-(3-(4-아지드부톡시)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-2-메틸프로필)4-메틸벤젠벤젠술포노티오에이트 Rf52(1.07 g, 1.55 mmol)를 황색 액체로서 얻었다.(2 단계 수율 81%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.78-7.75(m, 2H), 7.38-7.33(m, 2H), 7.29-7.18(m, 9H), 6.85-6.78(m, 4H), 3.80(s, 6H), 3.31(t, J=5.6Hz, 2H), 3.25-3.17(m, 4H), 3.70(d, J=2.0Hz, 2H), 2.88(q, J=8.8Hz, 2H), 2.42(s, 3H), 1.59-1.52(m, 4H), 0.879(s, 3H).
공정 35:
공정 34에서 얻어진 화합물 Rf52(1.05 g, 1.52 mmol)와 시판되는 3-머캅토프로판-1-올 Rf13(0.16 mL, 1.83 mmol)을 이용하여, 참고예 2의 공정 7-2와 같은 식으로 3-((3-(4-아지드부톡시)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-2-메틸프로필)디술파닐)프로판-1-올 Rf53(858 mg, 1.37 mmol)을 무색 액체로서 얻었다.(수율 90%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.43-7.40(m, 2H), 7.32-7.18(m, 7H), 6.84-6.80(m, 4H), 3.79(s, 6H), 3.72(q, J=6.0Hz, 2H), 3.39(t, J=7.2Hz, 2H), 3.34(dd, J=5.6, 14.0Hz, 2H), 3.26(t, J=6.4Hz, 2H), 2.97(q, J=7.2Hz, 2H), 2.91(dd, J=5.6, 18.0Hz, 2H), 2.75(t, J=8.8Hz, 2H), 1.92(quin, J=5.6Hz, 2H), 1.63-1.58(m, 4H), 1.44(br, 1H), 0.999(s, 3H).
공정 36:
공정 35에서 얻어진 화합물 Rf53(300 mg, 0.480 mmol)을 이용하여, 참고예 2의 공정 8과 같은 식으로 4-(3-((3-(4-아지드부톡시)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-2-메틸프로필)디술파닐)프로폭시)-4-옥소부탄산 트리에틸아민염 Rf54(373 mg, 0.432 mmol)를 무색 액체로서 얻었다.(수율 90%)
ESI-MS(m/z): 725.0[M-H].
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.43-7.41(m, 2H), 7.31-7.18(m, 7H), 6.84-6.80(m, 4H), 4.14(t, 6.4Hz, 2H), 3.79(s, 6H), 3.39-3.24(m, 6H), 2.97(q, J=7.2Hz, 2H), 2.92-2.85(m, 2H), 2.69(t, J=7.2Hz, 2H), 2.61-2.50(m, 4H), 1.98(quin, J=6.4Hz, 2H), 1.62-1.57(m, 4H), 0.990(s, 3H).
참고예 9
수식 CPG Rf59의 합성
Figure pct00075
(식 중, Po는 상기와 동의이다.)
공정 37:
시판되는 3,6,9,12-테트라옥사펜타데카-14-인-1-아민 Rf55(75.0 mg, 0.324 mmol)를 탈수염화메틸렌(3.0 mL)에 녹이고, 클로로포름산콜레스테롤 Rf56(582 mg, 1.30 mmol)과 트리에틸아민(294 μL, 2.11 mmol)을 가하여 마개를 꼭 닫고서 실온에서 2시간 10분간 교반했다. 반응액에 메탄올(10 mL)을 가하여 실온에서 5분간 교반함으로써 켄치하고, 감압 하에 농축함으로써 조성적체(1.97 g)를 얻었다. 얻어진 조성적체를 컬럼 크로마토그래피(야마젠 하이플래시 컬럼 M, 전개 용매: n-헵탄/아세트산에틸=100/0→60/40)로 정제함으로써 (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일(3,6,9,12-테트라옥사펜타데카-14-인-1-일)카바메이트 Rf57(129 mg, 0.201 mmol)을 무색 점조성 액체로서 얻었다.(수율 62%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 5.37(d, J=5.2Hz, 1H), 5.17(br, 1H), 4.50(br, 1H), 4.21(d, J=2.4Hz, 2H), 3.73-3.60(m, 12H), 3.55(t, J=5.2Hz, 2H), 3.36(br, 2H), 2.43(t, J=2.4Hz, 1H), 2.39-2.24(m, 2H), 2.04-1.78(m, 5H), 1.59-0.939(m, 21H), 1.00(s, 3H), 0.911(d, J=6.4Hz, 3H),(dd, J=2.0, 6.4Hz, 6H), 0.675(s, 3H).
공정 38:
공정 37에서 얻어진 화합물 Rf57(73 mg, 0.114 mmol)과 참고예 8에서 얻어진 카르복실산트리에틸아민염 Rf54(110 mg, 0.137 mmol)를 메탄올(2.0 mL)에 녹이고, 트리스[(1-벤질-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸]아민(TBTA)(12.0 mg, 0.023 mmol), 아스코르빈산나트륨(4.50 mg, 0.023 mmol), 황산구리(II)(1.80 mg, 0.011 mmol)의 디메틸술폭시드/물=1/1(2.0 mL) 용액을 가하여 마개를 꼭 닫고서 실온에서 15분간 교반했다. 메탄올(2 mL), 물(1 mL), 디메틸술폭시드(1 mL)를 더 가하여, 10분 동안에 한 번 초음파 진동으로 불용성물을 현탁시키면서 실온에서 1시간 15분 교반했다. 물(50 mL)을 가하여 켄치하고, 염화메틸렌으로 2회 추출하여(80 mL x 2), 무수황산나트륨으로 건조했다. 감압 하에 농축함으로써 조성적체(548 mg)를 얻었다. 얻어진 조성적체를 컬럼 크로마토그래피(야마젠 하이플래시 컬럼 M, 전개 용매: 클로로포름(1% TEA)/메탄올=100/0→85/15)로 정제한 후, 컬럼 취득물을 아세토니트릴에 용해하여 동결 건조를 행함으로써 4-(3-((3-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)-2-((4-(4-(1-(((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-디메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일)옥시)-1-옥소-5,8,11,14-테트라옥사-2-아자펜타데칸-15-일)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부톡시)메틸)-2-메틸프로필)디술파닐)프로폭시)-4-옥소부탄산 Rf58(144 mg, 98.0 mmol)을 트리에틸아민 3.8 wt%(0.55 eq.), 디메틸술폭시드 3.2 wt%를 함유하는 무색 점조성 액체로서 얻었다.(수율 86%)
ESI-MS(m/z): 미검출.
1H-NMR(CDCl3, 400MHz) δ(ppm): 7.57(s, 1H), 7.42-7.40(m, 2H), 7.31-7.17(m, 7H), 6.83-6.79(m, 4H), 5.36(d, J=5.2Hz, 1H), 5.25(br, 1H), 4.69(s, 2H), 4.49(br, 1H), 4.15(t, J=6.4Hz, 2H), 3.79(s, 6H), 3.71-3.59(m, 12H), 3.55-3.53(m, 2H), 3.40-3.36(m, 8H), 3.03-2.86(m, 4H), 2.67(t, J=7.2Hz, 2H), 2.60(s, 4H), 2.36-2.23(m, 2H), 2.02-1.78(m, 9H), 1.60-0.852(m, 24H), 0.997(s, 6H), 0.911(d, J=6.4Hz, 3H), 0.863(dd, J=2.0, 6.8Hz, 6H), 0.672(s, 3H).
공정 39:
공정 38에서 얻어진 화합물 Rf58(64 mg, 44 μmol)과 CPG 레진(LCAA 조절 공극 유리, 1.10 g)을 이용하여, 참고예 2의 공정 9와 같은 식으로 수식 CPG Rf59(1.05 g)를 얻었다. 얻어진 CPG 레진의 일부분(8.67 mg)을 2 wt% 트리클로로아세트산-염화메틸렌 용액(25 mL)으로 처리하여 흡광도를 측정했다.(흡광도(503 nm)=1.065, 로딩 40.4 μmol/g).
참고예 10
디펩티드아미다이트 Rf65의 합성
Figure pct00076
시판되는 Fmoc-Val-Cit-PAB[(9H플루오렌-9-일)메틸((S)-1-(((S)-1-((4-(히드록시메틸)페닐)아미노)-1-옥소-5-우레이도펜탄-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카바메이트] Rf60을 이용하고, 공정 40은 참고예 1의 공정 1과 같은 합성법에 의해, 공정 41은 유기 합성 화학에서 상용되는 방법[예컨대, 프로텍티브 그룹스 인 오가닉 신세시스 제3판(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition),그린(T. W. Greene) 저, John Wiley & Sons Inc.(1999년) 등에 기재된 방법 등]에 의해, 공정 42는 저널 오브 메디시널 케미스트리(Journal of Medicinal Chemistry), 제48권, 6229∼6235 페이지, 2005년에 기재된 방법 혹은 그것에 준한 합성법에 의해, 공정 43은 참고예 1의 공정 2와 같은 합성법에 의해, 디펩티드아미다이트 Rf65는 합성할 수 있다.
실시예 48
선형 siRNA(화합물 48)의 합성
실시예 1의 공정 2에서 얻어진 화합물 Ic와, 별도로 핵산 합성 장치에 의해 조제한 올리고뉴클레오티드 HPRT1_asRNA1을 등량 혼합하여, 시트르산 완충액에 용해한 후, 85℃에서 5분간 정치했다. 그 후, 서서히 온도를 내림으로써 화합물 48을 취득했다.
실시예 49
선형 siRNA(화합물 49)의 합성
실시예 2의 공정 2에서 얻어진 화합물 2c와, 별도로 핵산 합성 장치에 의해 조제한 올리고뉴클레오티드 HPRT1_asRNA1을 이용하여, 실시예 48과 같은 식으로 화합물 49를 취득했다.
실시예 50
선형 siRNA(화합물 50)의 합성
실시예 3의 공정 2에서 얻어진 화합물 3c와, 별도로 핵산 합성 장치에 의해 조제한 올리고뉴클레오티드 B2M_asRNA1을 이용하여, 실시예 48과 같은 식으로 화합물 50을 취득했다.
실시예 51
유사 링커 구비 선형 siRNA(화합물 51)의 합성
실시예 6의 공정 2에서 얻어진 화합물 6c와, 별도로 핵산 합성 장치에 의해 조제한 올리고뉴클레오티드 HPRT1_asRNA5를 이용하여, 실시예 48과 같은 식으로 화합물 51을 취득했다.
실시예 52
선형 siRNA(화합물 52)의 합성
실시예 7의 공정 2에서 얻어진 화합물 7c와, 별도로 핵산 합성 장치에 의해 조제한 올리고뉴클레오티드 PTEN_asRNA2를 이용하여, 실시예 48과 같은 식으로 화합물 52를 취득했다.
실시예 53
선형 siRNA(화합물 53)의 합성
실시예 8의 공정 2에서 얻어진 화합물 8c와, 별도로 핵산 합성 장치에 의해 조제한 올리고뉴클레오티드 Factor9_asRNA2를 이용하여, 실시예 48과 같은 식으로 화합물 53을 취득했다.
실시예 48∼53의 올리고뉴클레오티드 유도체 및 음성 대조군의 염기 서열, 그리고 그 분자량을 표 20∼표 23에 나타낸다. 각 실시예에 있어서, 상단은 센스쇄를 나타내고, 하단은 안티센스쇄를 나타낸다.
표 20∼표 23에 있어서의 약호 등은 이하와 같다.
C6CSSC6=CH3-(CH2)5-S-S-(CH2)6-
C3SSC3=CH3-(CH2)2-S-S-(CH2)3-
p=인산화
^=포스포로티오에이트 수식
m=2'-OMe 수식
f=2'-F 수식
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
시험예 1: 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1)을 표적으로 한 환형 siRNA의 마우스 초대 간세포에 대한 mRNA 넉다운
윌리엄 이 메디움(William's E Medium, 페놀 레드 없음, Life technologies사 제조, A1217601) 500 mL에 첨가제(초대 간세포 해동 및 플레이팅 보충제, ThermoFisher사 제조, CM3000)를 가함으로써 마우스 초대 간세포의 파종용 배지를 조제했다. 또한, Williams' Medium E(페놀 레드 없음) 500 mL에 첨가제(간세포 유지 보충제, ThermoFisher사 제조, CM4000)를 가함으로써 마우스 초대 간세포의 인큐베이션용 배지를 조제했다.
동결 시판 마우스 초대 간세포(Mouse (CD-1) Cryopreserved Hepatocytes, Plateable Male, Invitrogen사 제조, MSCP10)를 37℃의 탕욕으로 융해한 후, 10 mL의 파종용 배지에 현탁했다. 현탁한 세포를 원심, 상청을 제거한 후, 배지로 1.25×105 세포/mL가 되도록 희석했다.
피험 샘플로서는 화합물 1 및 화합물 2를 이용하고, 비교 대조로서 HPRT1_dsRNA1 및 HPRT1_dsRNA2를 마련했다. 최종 농도는 1 μmol/L, 0.3 μmol/L, 0.1 μmol/L, 0.03 μmol/L의 4점, N=3으로 실시했다.
핵산 복합체 용액의 희석에 관해서는 이하의 수순으로 행했다. 핵산 복합체 용액을 옵티멤(Opti-MEM(R) I Reduced Serum Medium, Life technologies사 제조, 31985-070) 및 시트르산 완충액(20 mM Citrate(pH7), 150 mM NaCl)으로 희석했다. Collagen I 코트 96 웰 평저(平底) 플레이트(BD사 제조, 356407)에 희석한 핵산 복합체 용액을 20 μL씩 첨가하고, 음성 대조군에는 핵산이 포함되지 않는 희석 용액을 20 μL씩 첨가했다. 각 웰에 세포 용액을 80 μL 첨가하여, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 배양한 후에 RNA 추출에 제공했다.
RNA를 포함하는 세포 용해액의 조제에는 슈퍼프렙 셀 라이시스 키트(SuperPrep(등록상표) Cell Lysis & RT Kit, qPCR용, TOYOBO사 제조, SCQ-101)를 이용하고, 동 키트 부속의 알티 키트(RT Kit, qPCR용)를 이용하여, 키트에 첨부된 설명서에 따라서 역전사 반응을 행하여, cDNA를 작성했다.
이 cDNA를 PCR 반응의 주형에 이용하고, QuantStudio 12K Flex 리얼타임 PCR 시스템(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을 이용하여, 태크맨 프로브(Taqman probe)법에 의해 HPRT1의 유전자 및 대조로서 Actin β(이하 ACTB라고 기재)의 유전자를 PCR 반응시켜 mRNA 증폭량을 각각 측정하고, ACTB의 mRNA 증폭량을 내부 대조로 하여 HPRT1의 mRNA의 준정량치를 산출했다. 또한, 음성 대조군에 있어서의 HPRT1 및 ACTB의 mRNA 증폭량을 마찬가지로 각각 측정하여, HPRT1의 mRNA의 준정량치를 산출했다.
HPRT1 유전자의 측정에는 태크맨 프로브 Mm0154399_m1(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을, ACTB 유전자의 측정에는 Mm00607939_s1(어플라이드바이오시스템즈사 제조)를 이용하고, 반응 시약에는 TaqMan Gene Expression Master Mix(어플라이드바이오시스템즈사 제조, 4369542)를 이용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서 실시했다.
siRNA 도입 검체의 표적 mRNA량은, 음성 대조군(siRNA 미도입군)에 있어서의 HPRT1의 mRNA량을 1로 했을 때의 상대적인 비율로서 산출했다. 그 mRNA량의 상대적인 비율을 평균±표준편차로 나타낸 결과를 도 1에 도시한다.
본 결과로부터, 피험 샘플(화합물 1 및 화합물 2)이 비교 대조(HPRT1_dsRNA1 및 HPRT1_dsRNA2)와 비교하여, 강한 넉다운 효과를 보이는 것을 확인했다.
시험예 2: 베타2-매크로글로불린(B2M)을 표적으로 한 환형 siRNA의 마우스 초대 간세포에 대한 mRNA 넉다운
윌리엄 이 메디움(William's E Medium, 페놀 레드 없음, Life technologies사 제조, A1217601) 500 mL에 첨가제(초대 간세포 해동 및 플레이팅 보충제, ThermoFisher사 제조, CM3000)를 가함으로써 마우스 초대 간세포의 파종용 배지를 조제했다. 또한, 윌리엄 이 메디움 500 mL에 첨가제(간세포 유지 보충제, ThermoFisher사 제조, CM4000)를 가함으로써 마우스 초대 간세포의 인큐베이션용 배지를 조제했다.
동결 시판 마우스 초대 간세포(Mouse (CD-1) Cryopreserved Hepatocytes, Plateable Male, Invitrogen사 제조, MSCP10)를 37℃의 탕욕으로 융해한 후, 10 mL의 파종용 배지에 현탁했다. 현탁한 세포를 원심, 상청을 제거한 후, 배지로 1.25×105 세포/mL가 되도록 희석했다.
피험 샘플로서는 화합물 3을 이용하고, 비교 대조로서 B2M_dsRNA를 마련했다. 최종 농도는 1 μmol/L, 0.3 μmol/L, 0.1 μmol/L, 0.03 μmol/L의 4점, N=3으로 실시했다.
핵산 복합체 용액의 희석에 관해서는 이하의 수순으로 행했다. 핵산 복합체 용액을 옵티멤(Opti-MEM(R) I Reduced Serum Medium, Life technologies사 제조, 31985-070) 및 시트르산 완충액(20 mM Citrate(pH7), 150 mM NaCl)으로 희석했다. Collagen I 코트 96 웰 평저 플레이트(BD사 제조, 356407)에 희석한 핵산 복합체 용액을 20 μL씩 첨가하고, 음성 대조군에는 핵산이 포함되지 않는 희석 용액을 20 μL씩 첨가했다. 각 웰에 세포 용액을 80 μL 첨가하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 6시간 배양했다. 그 후, 상청을 제거하고, 각 웰에 100 μL씩 인큐베이션용 배지를 첨가하여, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 18시간 배양한 후, RNA 추출에 제공했다.
RNA를 포함하는 세포 용해액의 조제에는 슈퍼프렙 셀 라이시스 키트(SuperPrep(등록상표) Cell Lysis & RT Kit, qPCR용, TOYOBO사 제조, SCQ-101)를 이용하고, 동 키트 부속의 알티 키트(RT Kit, qPCR용)를 이용하여, 키트에 첨부된 설명서에 따라서 역전사 반응을 행하여, cDNA를 작성했다.
이 cDNA를 PCR 반응의 주형에 이용하고, QuantStudio 12K Flex 리얼타임 PCR 시스템(어플라이드바이오시스템즈사 제조)를 이용하여, 태크맨 프로브(Taqman probe)법에 의해 B2M의 유전자 및 대조로서 Actin β(이하 ACTB라고 기재)의 유전자를 PCR 반응시켜 mRNA 증폭량을 각각 측정하고, ACTB의 mRNA 증폭량을 내부 대조로 하여 B2M의 mRNA의 준정량치를 산출했다. 또한, 음성 대조군에 있어서의 B2M 및 ACTB의 mRNA 증폭량을 같은 식으로 각각 측정하여, B2M의 mRNA의 준정량치를 산출했다.
B2M 유전자의 측정에는 태크맨 프로브 Mm00437762_m1(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을, ACTB 유전자의 측정에는 Mm00607939_s1(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을 이용하고, 반응 시약에는 TaqMan Gene Expression Master Mix(어플라이드바이오시스템즈사 제조, 4369542)를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라서 실시했다.
siRNA 도입 검체의 표적 mRNA량은, 음성 대조군(siRNA 미도입군)에 있어서의 B2M의 mRNA량을 1로 했을 때의 상대적인 비율로서 산출했다. 그 mRNA량의 상대적인 비율을 평균±표준편차로 나타낸 결과를 도 2에 도시한다.
본 결과로부터, 피험 샘플 화합물 3이 비교 대조 B2M_dsRNA과 비교하여, 강한 넉다운 효과를 보이는 것을 확인했다.
시험예 3: 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1)을 표적으로 한 환형 siRNA의 마우스 초대 간세포에 대한 mRNA 넉다운
윌리엄 이 메디움(William's E Medium, 페놀 레드 없음, Life technologies사 제조, A1217601) 500 mL에 첨가제(초대 간세포 해동 및 플레이팅 보충제, ThermoFisher사 제조, CM3000)를 가함으로써 마우스 초대 간세포의 파종용 배지를 조제했다. 또한, 윌리엄 이 메디움 500 mL에 첨가제(간세포 유지 보충제, ThermoFisher사 제조, CM4000)를 가함으로써 마우스 초대 간세포의 인큐베이션용 배지를 조제했다.
동결 시판 마우스 초대 간세포(Mouse (CD-1) Cryopreserved Hepatocytes, Plateable Male, Invitrogen사 제조, MSCP10)를 37℃의 탕욕으로 융해한 후, 10 mL의 파종용 배지에 현탁했다. 현탁한 세포를 원심, 상청을 제거한 후, 배지로 1.25×105 세포/mL가 되도록 희석했다.
피험 샘플로서는 화합물 4 및 화합물 5를 이용하고, 비교 대조로서 HPRT1_dsRNA3 및 HPRT1_dsRNA4를 마련했다. 최종 농도는 1 μmol/L, 0.3 μmol/L, 0.1 μmol/L, 0.03 μmol/L의 4점, N=3으로 실시했다.
핵산 복합체 용액의 희석에 관해서는 이하의 수순으로 행했다. 핵산 복합체 용액을 옵티멤(Opti-MEM(R) I Reduced Serum Medium, Life technologies사 제조, 31985-070) 및 시트르산 완충액(20 mM Citrate(pH7), 150 mM NaCl)으로 희석했다. Collagen I 코트 96 웰 평저 플레이트(BD사 제조, 356407)에 희석한 핵산 복합체 용액을 20 μL씩 첨가하고, 음성 대조군에는 핵산이 포함되지 않는 희석 용액을 20 μL씩 첨가했다. 각 웰에 세포 용액을 80 μL 첨가하여, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 6시간 배양했다. 그 후, 상청을 제거하고, 각 웰에 100 μL씩 인큐베이션용 배지를 첨가하여, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 18시간 배양한 후, RNA 추출에 제공했다.
RNA를 포함하는 세포 용해액의 조제에는 슈퍼프렙 셀 라이시스 키트(SuperPrep(등록상표) Cell Lysis & RT Kit, qPCR용, TOYOBO사 제조, SCQ-101)를 이용하고, 동 키트 부속의 알티 키트(RT Kit, qPCR용)를 이용하여, 키트에 첨부된 설명서에 따라서 역전사 반응을 행하여, cDNA를 작성했다.
이 cDNA를 PCR 반응의 주형에 이용하고, QuantStudio 12K Flex 리얼타임 PCR 시스템(어플라이드바이오시스템즈사 제조)를 이용하여, 태크맨 프로브(Taqman probe)법에 의해 HPRT1의 유전자 및 대조로서 Actin β(이하 ACTB라고 기재)의 유전자를 PCR 반응시켜 mRNA 증폭량을 각각 측정하고, ACTB의 mRNA 증폭량을 내부 대조로 하여 HPRT1의 mRNA의 준정량치를 산출했다. 또한, 음성 대조군에 있어서의 HPRT1 및 ACTB의 mRNA 증폭량을 같은 식으로 각각 측정하여, HPRT1의 mRNA의 준정량치를 산출했다.
HPRT1 유전자의 측정에는 태크맨 프로브 Mm0154399_m1(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을, ACTB 유전자의 측정에는 Mm00607939_s1(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을 이용하고, 반응 시약에는 TaqMan Gene Expression Master Mix(어플라이드바이오시스템즈사 제조, 4369542)를 이용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서 실시했다.
siRNA 도입 검체의 표적 mRNA량은, 음성 대조군(siRNA 미도입군)에 있어서의 HPRT1의 mRNA량을 1로 했을 때의 상대적인 비율로서 산출했다. 그 mRNA량의 상대적인 비율을 평균±표준편차로 나타낸 결과를 도 3에 도시한다.
본 결과로부터, 피험 샘플(화합물 3 및 화합물 4)이 비교 대조(HPRT1_dsRNA3 및 HPRT1_dsRNA4)와 비교하여, 강한 넉다운 효과를 보이는 것을 확인했다.
시험예 4: 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1)을 표적으로 한 환형 siRNA의 마우스 초대 간세포에 대한 mRNA 넉다운
피검 샘플을 화합물 6으로 변경하고, 비교 대조를 HPRT1_dsRNA5로 변경한 것 이외에, 시험예 3과 같은 수법으로 실시했다. 시험 결과를 도 4에 도시한다.
본 결과로부터, 피험 샘플(화합물 6)이 비교 대조(HPRT1_dsRNA5)와 비교하여 강한 넉다운 효과를 보이는 것을 확인했다.
시험예 5: 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1)을 표적으로 한 환형 siRNA의 헬라(HeLa) 세포에 대한 mRNA 넉다운
헬라(HeLa) 세포를 10% 소태아 혈청 함유 알피엠아이 1640 배지(RPMI1640 Medium, Life technologies, A10491-01) 내에 현탁하고, 1 웰당 2000∼3000 세포가 되도록 100 μL의 세포 현탁액을 배양 플레이트(Nunc 96 마이크로 웰 플레이트, 167008)의 각 웰에 파종하여, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 배양했다.
피험 샘플로서는 화합물 6을 이용하고, 비교 대조로서 HPRT1_dsRNA5를 마련했다. 최종 농도는 1 μmol/L, 0.3 μmol/L, 0.1 μmol/L, 0.03 μmol/L의 4점, N=3으로 실시했다. 핵산 복합체 용액의 희석에 관해서는 이하의 수순으로 행했다. 핵산 복합체 용액을 옵티멤(Opti-MEM(R) I Reduced Serum Medium, Life technologies사 제조, 31985-070) 및 시트르산 완충액(20 mM Citrate(pH7), 150 mM NaCl)으로 희석했다.
세포가 배양되어 있는 플레이트로부터 상청을 제거하여, 80 μL의 혈청 함유 배지를 첨가했다. 또한 핵산 복합체 용액을 20 μL씩 첨가하고, 음성 대조군에는 핵산이 포함되지 않는 희석 용액을 20 μL씩 첨가했다. 그 후, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 96시간 배양했다.
RNA의 회수, cDNA의 조제에 관해서는 시험예 1과 같은 수법으로 실시했다. 얻어진 cDNA를 PCR 반응의 주형에 이용하고, QuantStudio 12K Flex 리얼타임 PCR 시스템(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을 이용하여, 태크맨 프로브(Taqman probe)법에 의해 HPRT1의 유전자 및 대조로서 Actin β(이하 ACTB와 기재)의 유전자를 PCR 반응시켜 mRNA 증폭량을 각각 측정하고, ACTB의 mRNA 증폭량을 내부 대조로 하여 HPRT1의 mRNA의 준정량치를 산출했다. 또한, 음성 대조군에 있어서의 HPRT1 및 ACTB의 mRNA 증폭량을 같은 식으로 각각 측정하여, HPRT1의 mRNA의 준정량치를 산출했다.
HPRT1 유전자의 측정에는 태크맨 프로브 Hs02800695_m1(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을, ACTB 유전자의 측정에는 Hs01060665_g1(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을 이용하고, 반응 시약에는 TaqMan Gene Expression Master Mix(어플라이드바이오시스템즈사 제조, 4369542)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라서 실시했다.
siRNA 도입 검체의 표적 mRNA량은, 음성 대조군(siRNA 미도입군)에 있어서의 HPRT1의 mRNA량을 1로 했을 때의 상대적인 비율로서 산출했다. 그 mRNA량의 상대적인 비율을 평균±표준편차로 나타낸 결과를 도 5에 나타낸다.
본 결과로부터, 피험 샘플(화합물 6)이 비교 대조(HPRT1_dsRNA5)와 비교하여 강한 넉다운 효과를 보이는 것을 확인했다.
시험예 6: 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1)을 표적으로 한 환형 siRNA의 인간 간암 유래 세포 헵지투(HepG2) 세포에 대한 mRNA 넉다운
헵지투(HepG2) 세포를 10% 소태아 혈청 함유 멤 배지(MEM, Gibco, 11095-080) 내에 현탁하고, 1 웰당 2000∼3000 세포가 되도록 100 μL의 세포 현탁액을 배양 플레이트(Nunc 96 마이크로 웰 플레이트, 167008)의 각 웰에 파종하여, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 배양했다.
핵산의 첨가, RNA의 회수, cDNA의 조제에 관해서는 시험예 5와 같은 수법으로 실시했다. 얻어진 cDNA를 PCR 반응의 주형에 이용하고, QuantStudio 12K Flex 리얼타임 PCR 시스템(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을 이용하여, 태크맨 프로브(Taqman probe)법에 의해 HPRT1의 유전자 및 대조로서 갭디에이치(GAPDH)의 유전자를 PCR 반응시켜 mRNA 증폭량을 각각 측정하고, GAPDH의 mRNA 증폭량을 내부 대조로 하여 HPRT1의 mRNA의 준정량치를 산출했다. 또한, 음성 대조군에 있어서의 HPRT1 및 GAPDH의 mRNA 증폭량을 같은 식으로 각각 측정하여, HPRT1의 mRNA의 준정량치를 산출했다.
HPRT1 유전자의 측정에는 태크맨 프로브 Hs02800695_m1(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을, GAPDH 유전자의 측정에는 Hs02758991_g1(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을 이용하고, 반응 시약에는 TaqMan Gene Expression Master Mix(어플라이드바이오시스템즈사 제조, 4369542)를 이용하여, 첨부된 프로토콜에 따라서 실시했다.
siRNA 도입 검체의 표적 mRNA량은, 음성 대조군(siRNA 미도입군)에 있어서의 HPRT1의 mRNA량을 1로 했을 때의 상대적인 비율로서 산출했다. 그 mRNA량의 상대적인 비율을 평균±표준편차로 나타낸 결과를 도 6에 도시한다.
본 결과로부터, 피험 샘플(화합물 6)이 비교 대조(HPRT1_dsRNA5)와 비교하여 강한 넉다운 효과를 보이는 것을 확인했다.
시험예 7: 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1)을 표적으로 한 환형 siRNA의 인간 간암 유래 세포 휴이에이치세븐(HuH-7) 세포에 대한 mRNA 넉다운
휴이에이치세븐(HuH-7) 세포를 10% 소태아 혈청 함유 디멤 배지(DMEM(Higl-Glc), nacalai tesque, 08458-16) 내에 현탁하고, 1 웰당 2000∼3000 세포가 되도록 100 μL의 세포 현탁액을 배양 플레이트(Nunc 96 마이크로 웰 플레이트, 167008)의 각 웰에 파종하여, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 배양했다.
핵산의 첨가, RNA의 회수, cDNA의 조제, PCR 반응에 관해서는 시험예 6과 같은 수법으로 실시했다. 시험 결과를 도 7에 도시한다.
본 결과로부터, 피험 샘플(화합물 6)이 비교 대조(HPRT1_dsRNA5)와 비교하여 강한 넉다운 효과를 보이는 것을 확인했다.
시험예 8: 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1)을 표적으로 한 환형 siRNA의 마우스 매크로파지 모양 세포 로우 264.7(RAW264.7) 세포에 대한 mRNA 넉다운
로우 264.7(RAW264.7) 세포를 10% 소태아 혈청 함유 알피엠아이 1640 배지(RPMI1640 Medium, Life technologies, A10491-01) 내에 현탁하고, 1 웰당 2000∼3000 세포가 되도록 100 μL의 세포 현탁액을 배양 플레이트(Nunc 96 마이크로 웰 플레이트, 167008)의 각 웰에 파종하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 배양했다.
핵산의 첨가, RNA의 회수, cDNA의 조제에 관해서는 시험예 6과 같은 수법으로 실시했다. 얻어진 cDNA를 PCR 반응의 주형에 이용하고, QuantStudio 12K Flex 리얼타임 PCR 시스템(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을 이용하여, 태크맨 프로브(Taqman probe)법에 의해 HPRT1의 유전자 및 대조로서 비투엠(B2M)의 유전자를 PCR 반응시켜 mRNA 증폭량을 각각 측정하고, B2M의 mRNA 증폭량을 내부 대조로 하여 HPRT1의 mRNA의 준정량치를 산출했다. 또한, 음성 대조군에 있어서의 HPRT1 및 B2M의 mRNA 증폭량을 같은 식으로 각각 측정하여, HPRT1의 mRNA의 준정량치를 산출했다.
HPRT1 유전자의 측정에는 태크맨 프로브 Mm01545399_m1(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을, B2M 유전자의 측정에는 Mm00437762_m1(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을 이용하고, 반응 시약에는 TaqMan Gene Expression Master Mix(어플라이드바이오시스템즈사 제조, 4369542)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라서 실시했다.
siRNA 도입 검체의 표적 mRNA량은, 음성 대조군(siRNA 미도입군)에 있어서의 HPRT1의 mRNA량을 1로 했을 때의 상대적인 비율로서 산출했다. 그 mRNA량의 상대적인 비율을 평균±표준편차로 나타낸 결과를 도 8에 도시한다.
본 결과로부터, 피험 샘플(화합물 6)이 비교 대조(HPRT1_dsRNA5)와 비교하여 강한 넉다운 효과를 보이는 것을 확인했다.
시험예 9: 혈청 내에서의 핵산의 안정성 평가
시트르산 완충액(20 mM Citrate(pH 7), 150 mM NaCl)으로 100 μM로 조제된 핵산 용액과 래트 혈청(Cedarlane, CL7000-50)을 1대9의 비율로 혼합하여, 37℃에서 소정 시간 정치했다.
얻어진 샘플로부터, 태크맨 마이크로알엔에이 리버스 트랜스크립션 키트(TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit, Life technologies, 4366596)에 첨부된 프로토콜에 따라서 siRNA의 안티센스쇄에 상보적인 cDNA를 조제했다(RT 프라이머 서열: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCCTATGTCTG 서열 번호: 71). 이 cDNA를 PCR 반응의 주형에 이용하고, QuantStudio 12K Flex 리얼타임 PCR 시스템(어플라이드바이오시스템즈사 제조)을 이용하여, 태크맨 프로브(Taqman probe)법에 의해 혈청 중에 잔존하는 siRNA 안티센스쇄의 잔존량을 산출했다(포워드 프라이머 서열: CGCGCGCGATAAAATCTACAG 서열 번호: 72, 리버스 프라이머 서열: GTGCAGGGTCCGAGGT 서열 번호: 73, 태크맨 프로브 서열: CTGGATACGACTCCTA 서열 번호: 74). 혈청과의 상호작용 시작 시의 농도를 100%로 하여 소정 시간 정치한 후의 잔존률에 관해서, 상대적인 비율을 평균±표준편차로 나타낸 결과를 도 9에 도시한다.
혈청과의 상호작용 28일 후에 있어서의 안티센스쇄의 잔존률은, 대조 샘플인 HPRT1_dsRNA5와 비교하여 피험 샘플의 화합물 6 쪽이 많아, 혈청 내에서의 안정성이 향상되었음이 확인되었다.
시험예 10: 핵산 분해 효소 내에서의 핵산의 안정성 평가
핵산 분해 효소(크로탈루스 아다만테우스(Crotalus adamanteus) 독의 포스포디에스테라제 I, Sigme-Aldrich, P3243-1VL)를 반응용 버퍼(50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 8 mM MgCl2)로 용해하여 1.2 U/mL로 조제했다. 시트르산 완충액(20 mM Citrate(pH 7), 150 mM NaCl)으로 20 μM로 조제된 핵산 용액과 반응용 버퍼로 100배 희석한 핵산 분해 효소 용액을 1대9의 비율로 혼합하여, 소정 시간 37℃에서 정치했다. 그 후, 95℃에서 10분간 가열하여, 반응을 종료시켰다.
cDNA의 조제, PCR 반응에 관해서는, 시험예 9와 같은 수법에 의해 실시하여, 핵산 분해 효소와의 상호작용 시작 시의 농도를 100%로 하여 소정 시간 정치한 후의 안티센스쇄의 잔존률에 관해서, 상대적인 비율을 평균±표준편차로 나타낸 결과를 도 10에 도시한다.
핵산 분해 효소와의 상호작용 24 시간 후에 있어서의 안티센스쇄의 잔존률은, 대조 샘플인 선형 올리고HPRT1_dsRNA5와 비교하여 피험 샘플의 화합물 6 쪽이 많아, 핵산 분해 효소 내에서의 안정성이 높다는 것이 확인되었다.
시험예 11: 포스파타아제 앤드 텐신 호몰로그 딜리티드 프롬 크로모좀 10(PTEN) 및 팩터 9(Factor9)를 표적으로 한 환형 siRNA의 마우스 초대 간세포에 대한 mRNA 넉다운
피검 샘플을 화합물 7 및 화합물 8로, 음성 대조군을 PTEN_dsRNA1 및 Factor9_dsRNA1로 변경한 것 이외에는, 시험예 3과 같은 수법으로 실시했다. 시험 결과를 도 11에 도시한다.
시험예 12: 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1)을 표적으로 한 환형 siRNA의 헬라(HeLa) 세포에 대한 mRNA 넉다운 2
피검 샘플을 화합물 9∼26, 28∼35, 38, 39, 41∼44 및 47로 변경한 것 이외에는, 시험예 5와 같은 수법으로 실시했다. 시험 결과를 도 12∼도 18에 도시한다.
시험예 13: 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1)을 표적으로 한 화합물 48 및 49의 마우스 초대 간세포에 대한 mRNA 넉다운
피험 샘플을 화합물 48 및 49로 변경한 것 이외에는, 시험예 1과 같은 수법으로 실시했다. 시험 결과를 도 19에 도시한다.
시험예 14: 베타2-매크로글로불린(B2M)을 표적으로 한 화합물 50의 마우스 초대 간세포에 대한 mRNA 넉다운
피험 샘플을 화합물 50으로 변경한 것 이외에는, 시험예 2와 같은 수법으로 실시했다. 시험 결과를 도 20에 도시한다.
시험예 15: 히포크산틴-구아닌포스포리보실트랜스페라아제 1(HPRT1)을 표적으로 한 화합물 51의 헬라(HeLa) 세포에 대한 mRNA 넉다운
피검 샘플을 화합물 51로 변경한 것 이외에는 시험예 5와 같은 수법으로 실시했다. 시험 결과를 도 21에 도시한다.
시험예 16: 포스파타아제 앤드 텐신 호몰로그 딜리티드 프롬 크로모좀 10(PTEN)을 표적으로 한 화합물 52 및 팩터 9(Factor9)를 표적으로 한 화합물 53의 마우스 초대 간세포에 대한 mRNA 넉다운
피검 샘플을 화합물 52 및 화합물 53으로 변경한 것 이외에는 시험예 3과 같은 수법으로 실시했다. 시험 결과를 도 22에 나타낸다.
시험예 17: HPRT1을 표적으로 한 환형 siRNA의 인비보(in vivo) 마우스 mRNA 넉다운 시험
실시예 6에서 합성한 화합물 6 및 그 음성 대조인 HPRT1_dsRNA5에 관해서, 이하의 방법에 의해 인비보 평가 시험을 실시했다. 또한 각 합성 핵산은, 시험에 맞춰 인산 완충화 생리식염수(DPBS)(나카라이테스크사 제조)로 희석하여 이용했다. 마우스(BALB/cA, 닛폰구레아로부터 입수)를 순화 사육한 후, 각 핵산을 20 mg/kg 또는 5 mg/kg씩 마우스에게 정맥내 투여했다. 또한, 컨트롤군으로서는 DPBS만을 마우스에게 정맥내 투여했다. 투여로부터 3일 후에 동물을 안락사시키고, 대퇴사두근 및 간장을 채취하여 액체 질소로 동결 보존했다. 각 동결 샘플을 트리졸(등록상표) 알엔에이 아이솔레이션 리젠츠(TRIzol RNA isolation reagents)(라이프테크놀로지즈사(Life Technologies)사 제조, 카탈로그 번호 15596026) 및 마그나퓨어 96(MagNA Pure 96)(로슈라이프사이엔스사 제조)을 이용하여, 제품에 첨부된 설명서에 기재된 방법에 따라서, 전체 RNA의 회수를 행했다. 또한 트랜스크립터 퍼스트 스트랜드 시디엔에이 신세시스 키트(transcriptor first strand cdna synthesis kit, 로슈사(Roche사) 제조, 카탈로그 번호 04897030001)를 이용하여, 제품에 첨부된 설명서에 기재된 방법에 따라서, 얻어진 전체 RNA를 주형으로 하는 역전사 반응에 의한 cDNA를 제작했다.
얻어진 cDNA를 주형으로 하여, 태크맨(등록상표) 진 익스프레션 앗세이즈 프로브(Gene Expression Assay's probe, 어플라이드바이오시스템즈사 제조)를 프로브로 하고, 퀀트스타지오 12케이 플렉스 리얼타임 피시알 시스템(quantstudio 12k flex real-time PCR system, ABI사 제조)을 이용하여, 첨부된 사용설명서에 기재된 방법에 따라서 PCR 반응시킴으로써, HPRT1 유전자 및 GAPDH 유전자를 PCR 반응시켜 mRNA 증폭량을 각각 측정하고, GAPDH의 증폭량을 내부 대조로 하여 HPRT1의 mRNA의 준정량치를 산출했다. 같은 식으로 측정한 컨트롤군에 있어서의 HPRT1의 mRNA의 준정량치를 1로 하여, 각 합성 핵산 투여군의 HPRT1의 mRNA의 준정량치로부터 각 합성 핵산 투여군의 Hprt의 mRNA의 발현률을 구했다. 얻어진 HPRT1의 mRNA의 발현 억제율을 표 24에 나타낸다.
Figure pct00081
표 24로부터 분명한 것과 같이, 본 발명의 화합물은, 대퇴사두근 및 간장에 있어서의 HPRT1 유전자의 발현을, HPRT1_dsRNA5와 비교하여 강하게 억제했다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염을 포유동물에게 투여하여, 생체 내에 있어서 각종 관련된 질환을 치료할 수 있다.
서열 번호 1: 표 7 및 20의 음성 대조군 1 및 2에 있어서의 HPRT1_ssRNA1.
서열 번호 2: 표 8의 음성 대조군 4에 있어서의 HPRT1_ssRNA2.
서열 번호 3: 표 8, 18 및 22의 음성 대조군 6에 있어서의 HPRT1_ssRNA3.
서열 번호 4: 표 12의 음성 대조군 9에 있어서의 HPRT1_ssRNA4.
서열 번호 5: 표 20의 실시예 48에 있어서의 HPRT1_ssRNA5.
서열 번호 6: 표 20의 실시예 49에 있어서의 HPRT1_ssRNA6.
서열 번호 7: 표 22의 실시예 51에 있어서의 HPRT1_ssRNA7.
서열 번호 8: 표 7, 17 및 20의 음성 대조군 1, 그리고 실시예 1, 2, 45, 48 및 49에 있어서의 HPRT1_asRNA1.
서열 번호 9: 표 7의 음성 대조군 2에 있어서의 HPRT1_asRNA2.
서열 번호 10: 표 8의 음성 대조군 4, 그리고 실시예 4 및 5에 있어서의 HPRT1_asRNA3.
서열 번호 11: 표 8의 음성 대조군 5에 있어서의 HPRT1_asRNA4.
서열 번호 12: 표 8, 11∼19 및 22의 음성 대조군 6 및 9, 그리고 실시예 6, 9∼44, 46, 47 및 51에 있어서의 HPRT1_asRNA5.
서열 번호 13: 표 7 및 11∼13의 실시예 1, 10, 11 및 18∼24에 있어서의 HPRT1_csRNA1.
서열 번호 14: 표 7 및 13∼15의 실시예 2, 12, 13, 25, 26, 32, 35, 38, 39, 41 및 44에 있어서의 HPRT1_csRNA2.
서열 번호 15: 표 8 및 15∼17의 실시예 4, 27∼34, 36, 42 및 43에 있어서의 HPRT1_csRNA3.
서열 번호 16: 표 8 및 17∼19의 실시예 5, 37, 40 및 45∼47에 있어서의 HPRT1_csRNA4.
서열 번호 17: 표 8의 실시예 6에 있어서의 HPRT1_csRNA5.
서열 번호 18: 표 11의 실시예 9에 있어서의 HPRT1_csRNA6.
서열 번호 19: 표 11의 실시예 14에 있어서의 HPRT1_csRNA7.
서열 번호 20: 표 11의 실시예 15에 있어서의 HPRT1_csRNA8.
서열 번호 21: 표 11의 실시예 16에 있어서의 HPRT1_csRNA9.
서열 번호 22: 표 11의 실시예 17에 있어서의 HPRT1_csRNA10.
서열 번호 23: 표 11의 실시예 19에 있어서의 HPRT1_csRNA11.
서열 번호 24: 표 11의 실시예 20에 있어서의 HPRT1_csRNA12.
서열 번호 25: 표 11의 실시예 21에 있어서의 HPRT1_csRNA13.
서열 번호 26: 표 11의 실시예 22에 있어서의 HPRT1_csRNA14.
서열 번호 27: 표 12의 실시예 10에 있어서의 HPRT1_csRNA15.
서열 번호 28: 표 12의 실시예 11에 있어서의 HPRT1_csRNA16.
서열 번호 29: 표 12의 실시예 18에 있어서의 HPRT1_csRNA17.
서열 번호 30: 표 12의 실시예 23에 있어서의 HPRT1_csRNA18.
서열 번호 31: 표 13의 실시예 24에 있어서의 HPRT1_csRNA19.
서열 번호 32: 표 13의 실시예 25에 있어서의 HPRT1_csRNA20.
서열 번호 33: 표 13의 실시예 26에 있어서의 HPRT1_csRNA21.
서열 번호 34: 표 13의 실시예 35에 있어서의 HPRT1_csRNA22.
서열 번호 35: 표 14의 실시예 12에 있어서의 HPRT1_csRNA23.
서열 번호 36: 표 14의 실시예 13에 있어서의 HPRT1_csRNA24.
서열 번호 37: 표 14의 실시예 32에 있어서의 HPRT1_csRNA25.
서열 번호 38: 표 14의 실시예 41에 있어서의 HPRT1_csRNA26.
서열 번호 39: 표 14의 실시예 44에 있어서의 HPRT1_csRNA27.
서열 번호 40: 표 15의 실시예 38에 있어서의 HPRT1_csRNA28.
서열 번호 41: 표 15의 실시예 39에 있어서의 HPRT1_csRNA29.
서열 번호 42: 표 15의 실시예 42에 있어서의 HPRT1_csRNA30.
서열 번호 43: 표 15의 실시예 43에 있어서의 HPRT1_csRNA31.
서열 번호 44: 표 16의 실시예 28에 있어서의 HPRT1_csRNA32.
서열 번호 45: 표 16의 실시예 29에 있어서의 HPRT1_csRNA33.
서열 번호 46: 표 16의 실시예 30에 있어서의 HPRT1_csRNA34.
서열 번호 47: 표 16의 실시예 31에 있어서의 HPRT1_csRNA35.
서열 번호 48: 표 16의 실시예 33에 있어서의 HPRT1_csRNA36.
서열 번호 49: 표 16의 실시예 34에 있어서의 HPRT1_csRNA37.
서열 번호 50: 표 17의 실시예 27에 있어서의 HPRT1_csRNA38.
서열 번호 51: 표 17의 실시예 36에 있어서의 HPRT1_csRNA39.
서열 번호 52: 표 17의 실시예 37에 있어서의 HPRT1_csRNA40.
서열 번호 53: 표 17의 실시예 45에 있어서의 HPRT1_csRNA41.
서열 번호 54: 표 18의 실시예 47에 있어서의 HPRT1_csRNA42.
서열 번호 55: 표 19의 실시예 40에 있어서의 HPRT1_csRNA43.
서열 번호 56: 표 19의 실시예 46에 있어서의 HPRT1_csRNA44.
서열 번호 57: 표 10 및 23의 음성 대조군 7에 있어서의 PTEN_ssRNA1.
서열 번호 58: 표 23의 실시예 52에 있어서의 PTEN_ssRNA2.
서열 번호 59: 표 10 및 23의 음성 대조군 7에 있어서의 PTEN_asRNA1.
서열 번호 60: 표 10 및 23의 실시예 7 및 52에 있어서의 PTEN_asRNA2.
서열 번호 61: 표 10의 실시예 7에 있어서의 PTEN_csRNA1.
서열 번호 62: 표 10 및 23의 음성 대조군 8에 있어서의 Factor9_ssRNA1.
서열 번호 63: 표 23의 실시예 53에 있어서의 Factor9_ssRNA2.
서열 번호 64: 표 10 및 23의 음성 대조군 8에 있어서의 Factor9_asRNA1.
서열 번호 65: 표 10 및 23의 실시예 8 및 53에 있어서의 Factor9_asRNA2.
서열 번호 66: 표 10의 실시예 8에 있어서의 Factor9_csRNA1.
서열 번호 67: 표 7 및 21의 음성 대조군 3에 있어서의 B2M_ssRNA1.
서열 번호 68: 표 21의 실시예 50에 있어서의 B2M_ssRNA2.
서열 번호 69: 표 7 및 21의 음성 대조군 3, 그리고 실시예 3 및 50에 있어서의 B2M_asRNA1.
서열 번호 70: 표 7의 실시예 3에 있어서의 B2M_csRNA1.
서열 번호 71: 시험예 9에 있어서의 RT 프라이머.
서열 번호 72: 시험예 9에 있어서의 포워드 프라이머.
서열 번호 73: 시험예 9에 있어서의 리버스 프라이머.
서열 번호 74: 시험예 9에 있어서의 태크맨 프로브.
SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. <120> nucleotide derivative and salt thereof <130> K1635AJP0002 <150> JP 2017-090613 <151> 2017-04-28 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_ssRNA1 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 1 aagccagacu uuguuggauu u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_ssRNA2 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 2 uccuaugacu guagauuuua u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_ssRNA3 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 3 uccuaugacu guagauuuua u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_ssRNA4 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 4 uccuaugacu guagauuuua u 21 <210> 5 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_ssRNA5 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 5 auauaagcca gacuuuguug gauuu 25 <210> 6 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_ssRNA6 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 6 ggauauaagc cagacuuugu uggauuu 27 <210> 7 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_ssRNA7 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 7 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_asRNA1 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxyuridine <400> 8 aaauccaaca aagucuggcu u 21 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_asRNA2 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <400> 9 aaauccaaca aagucuggcu ua 22 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_asRNA3 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxyadenosine <400> 10 auaaaaucua cagucauagg a 21 <210> 11 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_asRNA4 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-methoxyuridine <400> 11 auaaaaucua cagucauagg aau 23 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_asRNA5 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxyadenosine <400> 12 auaaaaucua cagucauagg a 21 <210> 13 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA1 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 13 auauaagcca gacuuuguug gauuu 25 <210> 14 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA2 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 14 ggauauaagc cagacuuugu uggauuu 27 <210> 15 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA3 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 15 ccauuccuau gacuguagau uuuau 25 <210> 16 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA4 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 16 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 17 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA5 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 17 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 18 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRT1_csRNA6 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 18 uuuuauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 19 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA7 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 19 auuccuauga cuguagauuu uau 23 <210> 20 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA8 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 20 uuccuaugac uguagauuuu au 22 <210> 21 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA9 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 21 auuccuauga cuguagauuu uau 23 <210> 22 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA10 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 22 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 23 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA11 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 23 uccauuccua ugacuguaga uuuuau 26 <210> 24 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA12 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 24 uccauuccua ugacuguaga uuuuau 26 <210> 25 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA13 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 25 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 26 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA14 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 26 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 27 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA15 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 27 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 28 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA16 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 28 uuuuauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 29 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA17 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 29 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 30 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA18 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 30 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 31 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA19 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 31 uuauuccuau gacuguagau uuuau 25 <210> 32 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA20 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 32 auuccuauga cuguagauuu uau 23 <210> 33 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA21 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 33 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 34 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA22 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 34 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 35 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA23 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (28)..(28) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (29)..(29) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (31)..(31) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (32)..(32) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (33)..(33) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (33)..(34) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (34)..(34) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (35)..(35) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 35 agugauagau ccauuccuau gacuguagau uuuau 35 <210> 36 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA24 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 36 gacuguagau uuuau 15 <210> 37 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA25 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 37 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 38 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA26 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 38 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 39 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA27 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 39 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 40 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA28 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 40 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 41 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA29 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 41 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 42 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA30 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 42 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 43 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA31 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 43 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 44 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA32 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 44 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 45 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA33 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 45 auuccuauga cuguagauuu uau 23 <210> 46 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA34 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 46 auuccuauga cuguagauuu uau 23 <210> 47 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA35 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 47 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 48 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA36 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 48 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 49 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA37 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 49 auuccuauga cuguagauuu uau 23 <210> 50 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA38 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 50 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 51 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA39 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 51 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 52 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA40 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 52 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 53 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA41 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 53 ggauauaagc cagacuuugu uggauuu 27 <210> 54 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA42 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 54 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 55 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA43 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 55 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 56 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT1_csRNA44 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <400> 56 auccauuccu augacuguag auuuuau 27 <210> 57 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTEN_ssRNA1 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <400> 57 accugaucau uauagauaa 19 <210> 58 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTEN_ssRNA2 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <400> 58 gacaaugaac cugaucauua uagauaa 27 <210> 59 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTEN_asRNA1 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxyadenosine <400> 59 uuaucuauaa ugaucaggua a 21 <210> 60 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTEN_asRNA2 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxycytidine <400> 60 uuaucuauaa ugaucagguu c 21 <210> 61 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTEN_csRNA1 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <400> 61 gacaaugaac cugaucauua uagauaa 27 <210> 62 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor9_ssRNA1 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <400> 62 uggaagcagu auguugaugg a 21 <210> 63 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor9_ssRNA2 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <400> 63 gaauuuugga agcaguaugu ugaugga 27 <210> 64 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor9_asRNA1 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-methoxyadenosine <400> 64 uccaucaaca uacugcuucc aaa 23 <210> 65 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor9_asRNA2 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxyadenosine <400> 65 uccaucaaca uacugcuucc a 21 <210> 66 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor9_csRNA1 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <400> 66 gaauuuugga agcaguaugu ugaugga 27 <210> 67 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M_ssRNA1 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxyuridine <400> 67 aggacugguc uuucuauauc u 21 <210> 68 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BM2_ssRNA2 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-methoxyuridine <400> 68 agcaaggacu ggucuuucua uaucu 25 <210> 69 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M_asRNA1 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxyuridine <400> 69 agauauagaa agaccagucc u 21 <210> 70 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M_csRNA1 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> 2'-methoxyadenosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-methoxyguanosine <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-methoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluorouridine <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> 2'-deoxy-2'-fluoroadenosine <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> 2'-methoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> 2'-deoxy-2'-fluorocytidine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> 5'-phosphorothioated <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> 2'-methoxyuridine <400> 70 agcaaggacu ggucuuucua uaucu 25 <210> 71 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer <400> 71 gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactcctat gtctg 55 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 72 cgcgcgcgat aaaatctaca g 21 <210> 73 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 73 gtgcagggtc cgaggt 16 <210> 74 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan probe <400> 74 ctggatacga ctccta 16

Claims (24)

  1. 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염으로서,
    환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드가 상호 상보적인 염기 서열을 가지고, 이 상보적인 염기 서열의 수소 결합을 통해 환형 올리고뉴클레오티드와 선형 올리고뉴클레오티드가 복합체를 형성하고 있는, 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
  2. 제1항에 있어서, 환형 올리고뉴클레오티드가 10∼40의 염기 길이를 갖는 것인 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 환형 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 환형 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 2'- 수식 뉴클레오티드를 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 환형 올리고뉴클레오티드의 염기 길이가 선형 올리고뉴클레오티드의 염기 길이와 동일하거나 또는 선형 올리고뉴클레오티드의 염기 길이보다도 긴 것인 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 환형 올리고뉴클레오티드가 식 1로 표시되는 것인 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
    식 1:
    Figure pct00082

    (식 중,
    L1 및 L2는 링커를 나타내고,
    n1 및 n2는 각각 독립적으로 0∼10의 정수를 나타내고,
    M은 세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조를 포함하는 부분을 나타내고,
    X는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.)
  7. 제6항에 있어서, 세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조가 -S-S-, -S-C(O)- 또는 -C(O)-S-인 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, M이 식 3-1∼식 3-6으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
    Figure pct00083

    (식 중,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R1 및 R2는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R3 및 R4는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
    n5∼n8은 각각 독립적으로 0∼10의 정수를 나타내고,
    n9 및 n10은 각각 독립적으로 1∼4의 정수를 나타내고,
    Y1∼Y4는 각각 독립적으로 결합, -NR5-, -O- 또는 -S-를 나타내고,
    R5는 수소 원자, C1-C3 알킬 또는 C2-C4 알카노일을 나타낸다.)
    Figure pct00084

    (식 중,
    R1' 및 R2'는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R1' 및 R2'는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
    R3' 및 R4'는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R3' 및 R4'는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
    R5' 및 R6'은 결합하는 탄소 원자마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬이고,
    n5' 및 n6'은 각각 독립적으로 1∼10의 정수를 나타낸다.)
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 표적화 화합물을 갖는 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
  10. 제9항에 있어서, 표적화 화합물이 L1 및 L2의 적어도 하나에 결합하고 있는 것인 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 표적화 화합물이 콜레스테롤, 토코페롤, 도코사헥사엔산, 미리스틴산, 팔미틴산 및 N-아세틸-D-갈락토사민으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염을 포함하는 의약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 정맥내 투여 또는 피하 투여되는 의약 조성물.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염, 또는 제12항 또는 제13항에 기재한 의약 조성물을, 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 또는 예방 방법.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염을 포함하는, RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현억제제.
  16. 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 식 4로 표시되는 환형 올리고뉴클레오티드.
    식 4:
    Figure pct00085

    (식 중,
    L3 및 L4는 링커를 나타내고,
    m1 및 m2는 각각 독립적으로 0∼10의 정수를 나타내고,
    M2는 세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조를 포함하는 부분을 나타내고,
    X2는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.)
  17. 제16항에 있어서, 세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조가 -S-S-, -S-C(O)- 또는 -C(O)-S-인 환형 올리고뉴클레오티드.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, M2가 식 6-1∼식 6-6으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 환형 올리고뉴클레오티드.
    Figure pct00086

    (식 중,
    R1a 및 R2a는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R1a 및 R2a는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
    R3a 및 R4a는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R3a 및 R4a는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
    n5a∼n8a는 각각 독립적으로 0∼10의 정수를 나타내고,
    n9a 및 n10a는 각각 독립적으로 1∼4의 정수를 나타내고,
    Y1a∼Y4a는 각각 독립적으로 결합, -NR5a-, -O- 또는 -S-를 나타내고,
    R5a는 수소 원자, C1-C3 알킬 또는 C2-C4 알카노일을 나타낸다.)
    Figure pct00087

    (식 중,
    R1a' 및 R2a'는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R1a' 및 R2a'는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
    R3a' 및 R4a'는 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬을 나타내거나, 또는 R3a' 및 R4a'는 이들이 결합하는 탄소 원자와 더불어 탄소수 3∼6의 고리를 형성하고,
    R5a' 및 R6a'는 결합하는 탄소 원자마다 각각 독립적으로 수소 원자 또는 C1-C3 알킬이고,
    n5a' 및 n6a'은 각각 독립적으로 1∼10의 정수를 나타낸다.)
  19. 식 7로 표시되는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 선형 올리고뉴클레오티드.
    식 7:
    Figure pct00088

    (식 중,
    X2, L3, L4, m1 및 m2는 제16항에서 정의한 것과 같고,
    W1 및 W2는, 상호 반응하여, 세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조를 형성하는 작용기를 포함하거나 발생시키는 부분이다.)
  20. 제19항에 있어서, 세포 내의 환경에 의해서 절단되는 화학 구조가 -S-S-, -S-C(O)- 또는 -C(O)-S-인 선형 올리고뉴클레오티드.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, W1 및 W2가 각각 독립적으로 -A1-S-S-A2 또는 -B1-COO-B2이고(단, W1 및 W2가 동시에 -B1-COO-B2인 경우를 제외한다),
    A1 및 B1이 각각 독립적으로 치환기를 갖고 있어도 좋은 C2-C10 알킬렌이고,
    A2는 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1-C10 알킬이고,
    B2는 수소 원자, 또는 치환기를 갖고 있어도 좋은 C1-C6 알킬인 선형 올리고뉴클레오티드.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드를 포함하는, RNA 간섭(RNAi)을 이용한 표적 유전자의 발현억제제.
  23. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재한 선형 올리고뉴클레오티드를 고리화하는 것을 포함하는, 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드의 제조 방법.
  24. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재한 환형 올리고뉴클레오티드를, 그 환형 올리고뉴클레오티드와 상보적인 염기 서열을 갖는 선형 올리고뉴클레오티드와, 수소 결합을 통해 복합화시키는 것을 포함하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재한 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염의 제조 방법.
KR1020197034961A 2017-04-28 2018-05-01 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염 Active KR102677783B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017090613 2017-04-28
JPJP-P-2017-090613 2017-04-28
PCT/JP2018/017462 WO2018199340A1 (ja) 2017-04-28 2018-05-01 オリゴヌクレオチド誘導体またはその塩

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200003031A true KR20200003031A (ko) 2020-01-08
KR102677783B1 KR102677783B1 (ko) 2024-06-21

Family

ID=63918397

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197034961A Active KR102677783B1 (ko) 2017-04-28 2018-05-01 올리고뉴클레오티드 유도체 또는 그 염

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20210108207A1 (ko)
EP (1) EP3617314B1 (ko)
JP (2) JP7680183B2 (ko)
KR (1) KR102677783B1 (ko)
CN (1) CN110603330B (ko)
AU (1) AU2018259859B2 (ko)
CA (1) CA3061322A1 (ko)
ES (1) ES2942575T3 (ko)
WO (1) WO2018199340A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230257745A1 (en) * 2020-07-10 2023-08-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Circular siRNAs

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003072705A2 (en) * 2002-02-20 2003-09-04 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of cyclin d1 gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
JP2008278784A (ja) 2007-05-09 2008-11-20 Institute Of Physical & Chemical Research １本鎖環状ｒｎａおよびその製造方法
WO2013129663A1 (ja) * 2012-03-02 2013-09-06 独立行政法人理化学研究所 機能性核酸分子の構築法、および当該方法に用いる核酸組合せ物
JP2014143923A (ja) 2013-01-25 2014-08-14 Institute Of Physical & Chemical Research 機能性核酸分子の構築法
WO2014134029A1 (en) * 2013-02-26 2014-09-04 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acid particles, methods and use thereof

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5683874A (en) * 1991-03-27 1997-11-04 Research Corporation Technologies, Inc. Single-stranded circular oligonucleotides capable of forming a triplex with a target sequence
US5714320A (en) * 1993-04-15 1998-02-03 University Of Rochester Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides
US5801154A (en) * 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
AU2001286268B2 (en) * 2000-09-19 2006-04-27 Takara Bio Inc. Method of forming complex
EP2514758B2 (en) * 2004-03-15 2021-06-23 City of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
EP2121923A1 (en) * 2007-03-02 2009-11-25 MDRNA, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting erbb family gene expression and uses thereof
EP2157982B1 (en) * 2007-05-04 2014-12-17 Marina Biotech, Inc. Amino acid lipids and uses thereof
CA2739046A1 (en) * 2008-10-16 2010-04-22 Marina Biotech, Inc. Process and compositions for liposomal and effective delivery of nucleic acids
EP2419537B1 (en) * 2009-04-13 2014-01-29 Somagenics, Inc. Methods and compositions for detection of small rnas
SG11201502954TA (en) * 2012-07-16 2015-05-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Rnai pharmaceutical composition for suppressing expression of kras gene
US9701689B2 (en) * 2012-11-30 2017-07-11 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Substituted pyridines and pyridazines as CCR10 receptor inhibitors
EP2931319B1 (en) * 2012-12-13 2019-08-21 ModernaTX, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
CA2917161C (en) 2013-07-11 2023-12-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide-ligand conjugates and process for their preparation
JP6482475B2 (ja) 2014-01-07 2019-03-13 レナセラピューティクス株式会社 アンチセンスオリゴヌクレオチド及び糖誘導体を含む二本鎖オリゴヌクレオチド
EP3153172A4 (en) * 2014-06-04 2018-01-17 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Ckap5-gene-silencing rnai pharmaceutical composition
US20180207197A1 (en) * 2015-06-26 2018-07-26 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Oligonucleotide derivative
EP3409780B1 (en) 2016-01-29 2021-01-20 Kyowa Kirin Co., Ltd. Nucleic acid complex

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003072705A2 (en) * 2002-02-20 2003-09-04 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of cyclin d1 gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
JP2008278784A (ja) 2007-05-09 2008-11-20 Institute Of Physical & Chemical Research １本鎖環状ｒｎａおよびその製造方法
WO2013129663A1 (ja) * 2012-03-02 2013-09-06 独立行政法人理化学研究所 機能性核酸分子の構築法、および当該方法に用いる核酸組合せ物
JP2014143923A (ja) 2013-01-25 2014-08-14 Institute Of Physical & Chemical Research 機能性核酸分子の構築法
WO2014134029A1 (en) * 2013-02-26 2014-09-04 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acid particles, methods and use thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
비특허문헌 1 : 네이처(Nature), 제411권, 제6836호, 494-498 페이지(2001년)
비특허문헌 2 : 네이처 리뷰스 캔서(Nature Reviews Cancer), 제11권, 59-67 페이지(2011년)

Also Published As

Publication number Publication date
EP3617314B1 (en) 2023-02-15
EP3617314A4 (en) 2020-12-02
CN110603330A (zh) 2019-12-20
AU2018259859B2 (en) 2024-02-15
WO2018199340A1 (ja) 2018-11-01
JP7602734B2 (ja) 2024-12-19
CN110603330B (zh) 2023-09-05
AU2018259859A1 (en) 2019-12-12
EP3617314A1 (en) 2020-03-04
CA3061322A1 (en) 2019-10-23
JPWO2018199340A1 (ja) 2020-03-12
US20210108207A1 (en) 2021-04-15
JP7680183B2 (ja) 2025-05-20
ES2942575T3 (es) 2023-06-02
JP2023063434A (ja) 2023-05-09
KR102677783B1 (ko) 2024-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111164091B (zh) 寡核苷酸组合物及其使用方法
CA2936712A1 (en) Chiral design
WO2019182037A1 (ja) 毒性が低減されたアンチセンスオリゴヌクレオチド
AU2011337658A1 (en) Modified single-strand polynucleotide
KR20230119637A (ko) 폴리-모르폴리노 올리고뉴클레오티드 갭머
CA3120580A1 (en) Rnai agents for inhibiting expression of hif-2 alpha (epas1), compositions thereof, and methods of use
CN117858883A (zh) GalNAc单体和GalNAc寡核苷酸缀合物
WO2024140101A1 (zh) 修饰的双链寡核苷酸分子、修饰的双链寡核苷酸缀合物及其用途
JP7602734B2 (ja) オリゴヌクレオチド誘導体またはその塩
TW202237848A (zh) 靶向ｔａｕ之寡核苷酸缺口體
KR20250024813A (ko) 치료제를 cns 조직으로 전달하기 위한 지질 접합체
WO2021167029A1 (ja) 架橋型ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチド
EP3927826A1 (en) Phosphonoacetate gapmer oligonucleotides
JP7231147B2 (ja) Ｒｎａ導入試薬及びその利用
HK40017224A (en) Oligonucleotide derivative or salt thereof
HK40017224B (en) Oligonucleotide derivative or salt thereof
US20220073916A1 (en) Novel phosphoramidites
JP2025522880A (ja) 環状ジスルフィド修飾リン酸ベースのオリゴヌクレオチドプロドラッグ
NZ724764A (en) Oligonucleotide compositions and methods of making the same

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20191126

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
AMND Amendment
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20210430

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20230309

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20240108

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20230309

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
PX0901 Re-examination

Patent event code: PX09011S01I

Patent event date: 20240108

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX09012R01I

Patent event date: 20230810

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX09012R01I

Patent event date: 20210430

Comment text: Amendment to Specification, etc.

PX0701 Decision of registration after re-examination

Patent event date: 20240422

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PX07013S01D

Patent event date: 20240327

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20240108

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX07011S01I

Patent event date: 20230810

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20210430

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20240619

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20240619

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration