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CN117858883A - GalNAc单体和GalNAc寡核苷酸缀合物 - Google Patents

GalNAc单体和GalNAc寡核苷酸缀合物 Download PDF

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CN117858883A
CN117858883A CN202280055652.8A CN202280055652A CN117858883A CN 117858883 A CN117858883 A CN 117858883A CN 202280055652 A CN202280055652 A CN 202280055652A CN 117858883 A CN117858883 A CN 117858883A
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CN
China
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galnac
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oligonucleotide
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CN202280055652.8A
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林溪
韩秉元
俞斌坤
杨宾霞
刘裕玲
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Original Assignee
Lerner Biopharmaceutical Private Ltd
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Abstract

GalNAc单体和使用所述GalNAc单体制备的GalNAc寡核苷酸缀合物，例如，携带GalNAc的核酸，例如可用于调节靶基因表达的sa‑RNAs和siRNAs。

Description

GalNAc单体和GalNAc寡核苷酸缀合物
本申请要求2021年8月9日提交的GB 2111456.6的优先权，出于所有目的，其内容和要素通过引用并入本发明。
技术领域
本发明涉及GalNAc单体，进一步涉及使用所述GalNAc单体制备的GalNAc寡核苷酸缀合物，例如，携带GalNAc的核酸，例如可用于调节靶基因表达的sa-RNAs和siRNAs。
背景技术
寡核苷酸作为治疗剂具有巨大的潜力。虽然仅包含天然分子砌块分子砌块的序列已经发现了显著的实用性，但寡核苷酸合成领域的创新意味着寡核苷酸本身已经经过了各种修饰。化学修饰可以提高寡核苷酸的活性和/或提供天然存在的寡核苷酸中不存在的特性。这些方法通常涉及提供成为寡核苷酸的组成部分的修饰的分子砌块分子砌块。
在用于构建衍生合成寡核苷酸的分子砌块的领域中，各种结构模体是已知的。其中包括亚磷酰胺试剂，其已被描述在RNA生产的许多出版物中。
例如，来自申请人AM Chemicals LLC的专利US10781175 B2描述了用于制备合成寡核苷酸的非核苷固体载体和亚磷酸酰胺分子砌块，所述合成寡核苷酸包含至少一个与实际感兴趣的配体缀合的非核苷部分。所述合成的寡核苷酸被描述为具有有用的特性，例如蛋白质结合、特异性受体结合和诱导免疫反应。
来自申请人Alnylam Pharmaceuticals股份有限公司的专利US 8828956 B2和US8106022B2描述了用于治疗用途的包括碳水化合物缀合物的RNAi试剂，特别是靶向肝实质细胞或肝炎病毒基因。
来自申请人Alnylam Pharmaceuticals股份有限公司的专利US10131907 B2描述了用于治疗应用的包含至少一个抑制细胞(特别是肝细胞)中基因表达活性的半乳糖基部分的RNAi试剂。
来自申请人Mina Therapeutics Limited的专利申请WO 2021/032777A1描述了包含至少一种GalNAc单体的GalNAc部分，以及包含GalNAc片段和寡核苷酸(如小激活RNAs(saRNAs)或小抑制RNAs(siRNAs))的GalNAc寡核苷酸缀合物。所述GalNAc寡核苷酸缀合物被描述为可用于调节靶基因的表达。
Hofmeister等人描述了吗啉-GalNAc部分。吗啉被胸腺嘧啶取代，并被描述为ASGPR靶向剂。
尽管取得了这些进展，但本领域仍需要用于合成治疗性寡核苷酸的进一步修饰的分子砌块。本发明是考虑到这一需要而设计的。
发明概述
本发明提供了适用于合成寡核苷酸的GalNAc单体，例如，携带GalNAc的核酸，例如sa-RNAs和siRNAs，以及包含所述单体的GalNAc-寡核苷酸缀合物。单体和缀合物在本文中统称为“化合物”。因此，应理解，如结构中所定义的R1可以是适合于寡核苷酸合成(单体)中的衍生化和/或反应的部分，或者可以是连接寡核苷酸链的键。
在第一方面，本发明可以提供式1、式2或式3的化合物或其药学上可接受的盐；
其中
R1是O-PN(C1-4烷基)2OCH2CH2CN、OH、连接寡核苷酸的亚磷酰胺键、或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸键连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；
R2是H或保护基团；
每个R3独立地为C1-4烷基、OC1-4烷基、C1-4卤代烷基、OC1-4卤代烷基或H；
R4是H、OH、OC1-4烷基或卤素；
L为-(W-Y)k-W-X-；
k是0到5；
每个W独立地为L1或L2；
每个L1是(CH2)n，其中n独立地为1至25；
每个L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m独立地为1-24，并且Het独立地为杂原子；
X是键、Het、-CH2-、-CO-、*O-CH2-CO、*-(Het)CH2C≡C-或*-CH2C≡C-，其中*如果存在表示与W的连接点；和
每个Y独立地为CONZ、O-CH2-CONZ、NZCO、SO2NZ、O-H2SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基；并且其中
GalNAc可以被保护，也可以未被保护。
在一些实施方案中，X是键、Het、-CH2-、-CO-、*-(Het)CH2C≡C-或*-CH2C≡C-，其中*如果存在表示与W的连接点；和
每个Y独立地为CONZ、NZCO、SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基。
在所述化合物为式1、式2或式3的一些实施方案中，
L是选自-L1-X-、-L1-Y-L1-X-、-L1-Y-L2-X-、-L2-X-、L2-Y-L1-X-或-L2-Y-L2-X-的连接子；
L1是(CH2)n，其中n为1至25；
L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m为1-12，并且Het为杂原子；
X是键、Het、-CH2-、-CO-、*-(Het)CH2C≡C-或*-CH2C≡C-；和
Y为CONZ、NZCO、SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基。
在所述化合物为式1、式2或式3的一些实施方案中，
L是选自-L1-X-、-L1-Y-L1-X-、-L1-Y-L2-X-、-L2-X-、L2-Y-L1-X-或-L2-Y-L2-X-的连接子；
L1是(CH2)n，其中n为2至25；
L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m为1-12，并且Het为杂原子；
X是键、Het、-CH2-、-CO-、*O-CH2-CO、*-(Het)CH2C≡C-或*-CH2C≡C-；和
Y为CONZ、O-CH2-CONZ、NZCO、SO2NZ、O-H2SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基。
在一些实施方案中，所述化合物为式1化合物或其药学上可接受的盐，
其中
R1是O-PN(C1-4烷基)2OCH2CH2CN、OH、连接寡核苷酸的亚磷酰胺键、或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸键连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；
R2是H或保护基团；
每个R3独立地为C1-4烷基、OC1-4烷基、C1-4卤代烷基、OC1-4卤代烷基或H；
R4是H、OH、OC1-4烷基或卤素；
L为-(W-Y)k-W-X-；
k是0到5；
每个W独立地为L1或L2；
每个L1是(CH2)n，其中n独立地为1至25；
每个L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m独立地为1-24，并且Het独立地为杂原子；
X是键、Het、-CH2-、-CO-或*O-CH2-CO，例如，键、Het、-CH2-、-CO-；和
每个Y独立地为CONZ、O-CH2-CONZ、NZCO、SO2NZ、O-H2SO2NZ或NZSO2，例如，CONZ、NZCO、SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基；
并且其中GalNAc可以被保护，也可以未被保护。
在一些实施方案中，所述化合物为式2化合物或其药学上可接受的盐，
其中
R1是O-PN(C1-4烷基)2OCH2CH2CN、OH、连接寡核苷酸的亚磷酰胺键、或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸键连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；
R2是H或保护基团；
每个R3独立地为C1-4烷基、OC1-4烷基、C1-4卤代烷基、OC1-4卤代烷基或H；
R4是H、OH、OC1-4烷基或卤素；
L为-(W-Y)k-W-X-；
k是0到5；
每个W独立地为L1或L2；
每个L1是(CH2)n，其中n独立地为1至25；
每个L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m独立地为1-24，并且Het独立地为杂原子；
X是键、Het、-CH2-、-CO-或*O-CH2-CO，例如，键、Het、-CH2-、-CO-；和
每个Y独立地为CONZ、O-CH2-CONZ、NZCO、SO2NZ、O-H2SO2NZ或NZSO2，例如，CONZ、NZCO、SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基；
并且其中GalNAc可以被保护，也可以未被保护。
在一些实施方案中，所述化合物为式3a化合物或其药学上可接受的盐，
其中，
R1是O-PN(C1-4烷基)2OCH2CH2CN、OH、连接寡核苷酸的亚磷酰胺键、或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸键连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；
R2是H或保护基团；
每个R3独立地为C1-4烷基、OC1-4烷基、C1-4卤代烷基、OC1-4卤代烷基或H；
R4是H、OH、OC1-4烷基或卤素；
L为-(W-Y)k-W-X-；
k是0到5；
每个W独立地为L1或L2；
每个L1是(CH2)n，其中n独立地为1至25；
每个L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m独立地为1-24，并且Het独立地为杂原子；
X是键、Het、-CH2-、-CO-或*O-CH2-CO，例如，键、Het、-CH2-、-CO-；和
每个Y独立地为CONZ、O-CH2-CONZ、NZCO、SO2NZ、O-H2SO2NZ或NZSO2，例如，CONZ、NZCO、SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基；
并且其中GalNAc可以被保护，也可以未被保护。
在所述化合物为式1、式2或式3a的一些实施方案中，
L是选自-L1-X-、-L1-Y-L1-X-、-L1-Y-L2-X-、-L2-X-、L2-Y-L1-X-或-L2-Y-L2-X-的连接子；
L1是(CH2)n，其中n为2至25；
L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m为1-12，并且Het为杂原子；
X是键、Het、-CH2-、-CO-或*O-CH2-CO，例如，键、Het、-CH2-、-CO-；和
每个Y独立地为CONZ、O-CH2-CONZ、NZCO、SO2NZ、O-H2SO2NZ或NZSO2，例如，CONZ、NZCO、SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基。
在另一个方面，本发明可以提供一种寡核苷酸，其包含或由任何前述权利要求中定义的化合物制备。适当地，所述寡核苷酸包含衍生自所述单体的一个或多个残基，优选两个或三个，更优选三个。在一些实施方案中，所述残基在序列中相邻排列，例如在3’端。本发明包括链中其他位置的一个或多个残基。
在提供本发明时，发明人注意到以下挑战：1.通过在修饰的亚磷酰胺分子砌块中具有较少阻碍的亚磷酰胺部分来提高偶联效率；2.通过在亚磷酰胺分子砌块的前体合成中引入较少的立体异构体来简化生产过程；3.通过调节具有刚性或柔性磷酸二酯键的DNA或RNA双链体的稳定性来实现最佳治疗效果。
描述
本文所述的化合物是GalNAc单体和包含这种单体的寡核苷酸。本文所述的GalNAc单体可用于合成具有GalNAc部分的寡核苷酸。换言之，它们可以用作寡核苷酸合成中的修饰分子砌块，例如反义寡核苷酸(ASOs)、小激活RNAs(saRNAs)或小抑制RNAs(siRNAs)。
本文所述的GalNAc单体可以提高合成这种寡核苷酸的产量。额外地或可选择地，本文所述的GalNAc单体可以简化合成这些寡核苷酸的生产工艺。本文提供的结构可以使具有不同稳定性的寡核苷酸达到最佳治疗效果。
化合物
在一些情况下，所述化合物选自下式：
表1
应当理解，在适当的情况下，所述化合物包括其药学上可接受的盐、水合物和溶剂化物。
GalNAc
GalNAc(IUPAC名称N-乙酰半乳糖胺)是半乳糖的氨基糖衍生物。它被用作反义、saRNA和siRNA肝脏治疗中的靶向配体。
在本文所述的单体和缀合物中，所述GalNAc通过C1连接。本领域技术人员将理解，按照糖化学中的常规，α-和β-立体化学是可能的。这两种立体化学都是可设想的。在一些实施方案中，使用的是α-立体化学。在一些实施方案中，如本文所举例说明的，则使用β-立体化学。
在寡核苷酸和寡核苷酸缀合物的合成过程中，所述GalNAc可以被保护，例如用乙酰基。因此，应当理解，本文中使用的术语GalNAc既指具有所示游离羟基的结构，也指这些羟基被合适的保护基团保护的结构。
也就是说，除非另有规定，否则本文所述的式中所写的GalNAc可以是如下所示的部分，其中P是氢或保护基(例如乙酰基)。
通常，在R1为O-PN(C1-4烷基)2OCH2CH2CN、OH或聚苯乙烯珠或LCAA-CPG的结构中，GalNAc是被保护的，这样GalNAc在形成寡核苷酸或寡核苷酸缀合物的反应中是被保护的。例如，GalNAc可以被乙酰基完全保护。也就是说，每个P可以是保护基团，例如乙酰基。
在R1是连接寡核苷酸的亚磷酰胺键的结构中，所述GalNAc可以如上所述被保护(例如，在合成后立即保护)，或者可以不被保护，如这类最终产物的正常情况。也就是说，每个P可以是氢。
R1基团
R1表示用于将单体连接到寡核苷酸链的化学部分、前体基团或连接寡核苷酸链的连接点。如本发明所讨论的，优选亚磷酰胺。因此，在单体单元中，R1适宜为O-PN(C1-4烷基)2OCH2CH2CN，其中所述烷基可以是直链或支链的，优选异丙基。
例如，R1可以是
在一些实施方案中，R1是OH，所述游离羟基适合与例如氯代亚磷酰胺(如2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺)反应。
在一些实施方案中，R1是连接寡核苷酸的亚磷酰胺键。
在一些实施方案中，R1是长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)，其通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸键连接。
R2基团
本发明的单体可以包括在合成步骤中受到保护的羟基。应当理解，本发明既包括这些游离羟基，也包括其受保护的形式。
因此，R2可以是保护基或H。
在一些情况下，R2选自Tr、MMTr、DMTr或TMTr保护基团。Tr是三苯甲基。MMTr为4’-甲氧基三苯甲基。DMTr是二甲氧基三苯甲基(IUPAC名称为双-(4-甲氧基苯基)-苯基甲基)。TMTr是4’,4’,4-三甲氧基三苯甲基。它们是广泛用于保护核苷中5’-羟基的保护基团，特别是在寡核苷酸合成中。本领域技术人员将理解，可以使用其他合适的保护基团。
R3基团
在存在的情况下，每个R3可以是H或合适的取代基。合适地，R3是C1-4烷基、OC1-4烷基、C1-4卤代烷基、OC1-4卤代烷基或H。
在一些实施方案中，R3是甲基、甲氧基或H。在一些实施方案中，R3为H。
R4基团
本发明的单体可以包括常用于寡核苷酸单体的取代基。这表示为R4。因此R4可以是取代基或H。
合适的R4取代基包括羟基、OC1-4烷基(优选OMe)和卤素(优选F)。
连接子
通式包括连接子。本文统称为L。连接子可以相同也可以不同。例如，对于本文所述的不同式，不同的连接子可能是优选的，并且当式中存在不止一个连接子时，这些连接子可以相同或不同。
适当地，当所述化合物是式1、式2或式3化合物时，
L是-(W-Y)k-W-X-；
其中
k是0到5；
每个W独立地为L1或L2；
每个L1是(CH2)n，其中n独立地为1至25；
每个L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m为1-24，并且Het为杂原子；
X是键、Het、-CH2-、-CO-、*O-CH2-CO、*-(Het)CH2C≡C-或*-CH2C≡C-，其中*如果存在表示与W的连接点；和
每个Y独立地为CONZ、O-CH2-CONZ、NZCO、SO2NZ、O-H2SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基。
在一些实施方案中，
k是0到5；
每个W独立地为L1或L2；
每个L1是(CH2)n，其中n独立地为1至25；
每个L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m为1-24，并且Het为杂原子；
X是键、Het、-CH2-、-CO-、*-(Het)CH2C≡C-或*-CH2C≡C-，其中*如果存在表示与W的连接点；和
每个Y独立地为CONZ、NZCO、SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基。
在一些实施方案中，k是0到2。在一些实施方案中，k是0或1。
在一些实施方案中，L是-L1-X-、-L1-Y-L1-X-、-L1-Y-L2-X-、-L2-X-、L2-Y-L1-X-、-L2-Y-L2-X-或-L1-Y-L2-X-。
在一些实施方案中，L是-L1-X-、-L1-Y-L1-X-、-L1-Y-L2-X-、-L2-X-、L2-Y-L1-X-或-L2-Y-L2-X-；
其中
每个L1是(CH2)n，其中n为2至25；
每个L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m为1-12，并且Het为杂原子；
X是键、Het、-CH2-、-CO-、*O-CH2-CO、*-(Het)CH2C≡C-或*-CH2C≡C-，例如，键、杂原子(Het)、-CH2-、-CO-、*-(Het)CH2C≡C-或*-CH2C≡C-；和
每个Y为CONZ、O-CH2-CONZ、NZCO、SO2NZ、O-H2SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基，例如，Y是CONZ、NZCO、SO2NZ或NZSO2。
在一些实施方案中，L是-L1-X-、-L1-Y-L1-X-、-L1-Y-L2-X-、-L2-X-、L2-Y-L1-X-或-L2-Y-L2-X-；
每个L1是(CH2)n，其中n为2至10；
每个L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m为1-5，并且Het为杂原子；
X是键、-CH2-、-CO-、*O-CH2-CO、*-OCH2C≡C-或*-CH2C≡C-，例如，键、-CH2-、-CO-、-O-、*-OCH2C≡C-或*-CH2C≡C-；和
Y为CONZ或O-CH2-CONZ，例如，O-CH2-CONZ，其中Z为H、C1-4烷基或保护基。
在一些实施方案中，L是-L1-X-、-L1-Y-L1-X-、-L1-Y-L2-X-、-L2-X-、L2-Y-L1-X-或-L2-Y-L2-X-；
每个L1是(CH2)n，其中n为2至10；
每个L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m为1-5；
X是键、-CO-、*O-CH2-CO、*-OCH2C≡C-或*-CH2C≡C-，例如，键、-CO-、-O-、*-OCH2C≡C-或*-CH2C≡C-；和
Y为CONZ或O-CH2-CONZ，例如，O-CH2-CONZ，其中Z为H、C1-4烷基或保护基。
适当地，当所述化合物是式1、式2或式3a化合物时，
L是-(W-Y)k-W-X-；
其中
k是0到5；
每个W独立地为L1或L2；
每个L1是(CH2)n，其中n独立地为1至25；
每个L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m为1-24，并且Het为杂原子；
X是键、杂原子(Het)、-CH2-、*O-CH2-CO或-CO-，例如，键、杂原子(Het)、-CH2-或-CO-；和
每个Y独立地为CONZ、O-CH2-CONZ、NZCO、SO2NZ、O-H2SO2NZ或NZSO2，例如CONZ、NZCO、SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基。
在一些实施方案中，k是0到2。在一些实施方案中，k是0或1。
在一些实施方案中，L是-L1-X-、-L1-Y-L1-X-、-L1-Y-L2-X-、-L2-X-、L2-Y-L1-X-、-L2-Y-L2-X-或-L1-Y-L2-X-。
在一些实施方案中，L是-L1-X-、-L1-Y-L1-X-、-L1-Y-L2-X-、-L2-X-、L2-Y-L1-X-或-L2-Y-L2-X-；
其中
每个L1是(CH2)n，其中n为2至25；
每个L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m为1-12，并且Het为杂原子；
X是键、Het、-CH2-、*O-CH2-CO或-CO-，例如，键、Het、-CH2-或-CO-；和
每个Y为CONZ、O-CH2-CONZ、NZCO、SO2NZ、O-H2SO2NZ或NZSO2，例如，CONZ、NZCO、SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基。
在一些实施方案中，L是-L1-X-、-L1-Y-L1-X-、-L1-Y-L2-X-、-L2-X-、L2-Y-L1-X-或-L2-Y-L2-X-；
每个L1是(CH2)n，其中n为2至10；
每个L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m为1-5；
X是键、-CO-、*O-CH2-CO或-O-，例如，键、-CO-或-O-；和
Y为CONZ或O-CH2-CONZ，例如，O-CH2-CONZ，其中Z为H、C1-4烷基或保护基。
应当理解，在连接子连接到GalNAc的情况下，排列是GalNAc-L-。应当理解，在连接子连接到R1的情况下，排列为R1-L。也就是说，连接子的方向应读作GalNAc-L1-X-、GalNAc-L1-Y-L1-X-、GalNAc-L1-Y-L2-X-、GalNAc-L2-X-、GalNAc-L2-Y-L1-X-、GalNAc-L2-Y-L2-X-、R1-L1-X-、R1-L1-Y-L1-X-、R1-L1-Y-L2-X-、R1-L2-X-、R1-L2-Y-L1-X-、R1-L2-Y-L2-X-等。
在一些实施方案中，连接子L选自-L1-X-、-L1-Y-L1-X-和-L1-Y-L2-X-。
连接子
L1
L1是(CH2)n。也就是说，其中存在的L1是亚烷基链。任选地，所述亚烷基链可以任选地被一个或多个选自卤素(例如F或Cl)、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、OC1-4烷基和OC1-4卤代烷基的取代基取代。
n是1到25。也就是说，所述亚烷基链包含1至25个碳原子。在一些实施方案中，n为2至25。也就是说，所述亚烷基链包含2至25个碳原子。在一些实施方案中，n为2至10。也就是说，所述亚烷基链包含2至10个碳原子。在一些实施方案中，n是2；所述亚烷基链是亚乙基。在一些实施方案中，n为3至10。在一些实施例中，n为8至10。在一些实施方案中，n为3至6。
在一些实施方案中，n为4至9。在一些实施方案中，n是4，也就是说，所述亚烷基链是亚丁基。在一些实施方案中，n是5，也就是说，所述亚烷基链是亚戊基。在一些实施方案中，n是6，也就是说，所述亚烷基链是亚己基。在一些实施方案中，n是7，也就是说，所述亚烷基链是亚庚基。在一些实施方案中，n是8，也就是说，所述亚烷基链是亚辛基。在一些实施方案中，n是9，也就是说，所述亚烷基链是亚壬基。
L2
L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，即，其中存在的L2是(HetCH2CH2)链，m是1-24，并且Het是杂原子，这样连接子除了前导亚乙基之外还包括1-24个重复的(HetCH2CH2)单元。杂原子上的其他价态(如果存在)可以被H或C1-4烷基占据，优选H。示例性杂原子包括O、S和N(例如，NH)。
在一些实施方案中，m为1至12。在一些实施方案中，Het是氧原子。
其中m是1并且Het是氧原子，L2是-CH2CH2OCH2CH2-；其中m为2，Het为氧原子，L2为-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，等等。在一些实施方案中，m为1、2、3或4。在一些实施方案中，m是1、2或3。在一些实施方案中，m是1或2。在一些实施例中，m是2。
X基团
在一些实施方案中，X是-CO-。换言之，连接子通过酰基连接。在一些实施方案中，所述连接子是-L1-CO-，例如戊酰基(-CO(CH2)4-)或癸酰基(-CO(CH2)9)。
在一些实施方案中，X是键。换言之，所述连接子可以适当地连接到L1或L2的前导CH2。例如，连接子可以是-L1-、-L1-Y-L1-、-L1-Y-L2-、-L2-、-L2-Y-L1-或L2-Y-L2-。在一些实施方案中，所述连接子是-L1-，例如亚乙基。
在一些实施方案中，X是杂原子(Het)。杂原子上的其他价态(如果存在)可以被H或C1-4烷基占据，优选H。示例性杂原子包括O、S和N(例如，NH)。在一些优选实施例中，X是-O-。
在一些实施方案中，X是*-(Het)CH2C≡C-，其中*是连接W的连接点。杂原子上的其他价态(如果存在)可以被H或C1-4烷基占据，优选H。示例性杂原子包括O、S和N(例如，NH)。在一些优选的实施方案中，X是*-OCH2C≡C-。
在一些实施方案中，X是*-CH2C≡C-，其中*是连接W的连接点。换句话说，连接子通过亚丙基连接。在一些实施方案中，连接子是-L1-CH2C≡C-。
在一些实施方案中，X是-CH2-。
在一些实施方案中，X是*O-CH2-CO。应理解，在式L2-X的单元中，X为*O-CH2-CO可能是合适的，因为合成路线包括氧化PEG链的末端醇。
Y基团
每个Y独立地为CONZ、O-CH2-CONZ、NZCO、SO2NZ、O-H2SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基。在一些实施方案中，Y是CONZ或SO2NZ，其中Z为H、C1-4烷基(例如，甲基)或保护基。
类似地，应当理解，在式L2-Y的单元中，Y是O-CH2-CONZ或O-CH2SO2NZ可能是合适的，因为合成路线包括氧化PEG链的末端醇。
在存在多于一个Y的一些实施方案中，每个Y是相同的。在一些实施例中，Y是CONZ，换言之，Y提供可任选地被保护的酰胺键。合适的氮保护基团是本领域已知的，包括苄基(Bn)。在一些实施方案中，Z是H、Bn或C1-4烷基。
在一些实施方案中，Y是CONH。即所述连接子选自-L1-CNH-L1-X-、L1-CONH-L2-X、-L2-CONH-L1-X-和-L2-CONH-L2-X-；优选-L1-CONH-L1-X-和L1-CONH-L2-X-；更优选L1-CONH-L2-X-。
在一个优选实施方案中，所述连接子是-(CH2)4-CONH-CH2CH2OCH2CH2-；即所述连接子是L1-Y-L2-X-，L1存在并且n是4，Y是CONH，L2存在并且m是1，并且X是键。
在一个优选的实施方案中，所述连接子是(CH2)5-CONH-(CH2)4-CO-；即连接子是-L1-Y-L1-X-，其中X是-CO-，Y是CONH，两个L1链都存在，并且一个n是4，另一个n为5。
在一个优选实施方案中，所述连接子是-(CH2)4-CONH-CH2CH2-(OCH2CH2)2-CONH-(CH2)5-；即所述连接子是-L1-Y-L2-Y-L1-X-，其中X是键，每个Y是CONH，第一个L1的n是4，第二个L1的n是5，并且m是2。
在一个优选实施方案中，所述连接子是(CH2)4-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)-O-(CH2)C≡C-；即所述连接子是L1-Y-L2-X-，L1存在并且n是4，Y是CONH，L2存在并且m是1，并且X是*-O(CH2)C≡C-。
一些优选的连接子
在一些实施方案中，所述连接子L是-L1-Y-L1-X-(例如k是1和W都是L1)，其中X是-CO-，Y是CONH，一个n是4，另一个n为5。即所述连接子是-(CH2)4-CONH-(CH2)5-CO-[连接子1]。
在一些实施方案中，所述连接子L是-L1-Y-L2-X-(例如k是1，一个W是L1，另一个W是L2)，其中n是4，Y是CONH，m是4，Het是O，并且X是-CO-。即所述连接子是-(CH2)4-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)4-CO-[连接子2]。
在一些实施方案中，所述连接子L是-L1-X-(例如k是0和W是L1)，其中n是9，和X是-CO-。即所述连接子是-(CH2)5-CO-[连接子3]。
在一些实施方案中，所述连接子L是-L1-Y-L2-X-(例如k是1，一个W是L1，另一个W是L2)，其中n是4，Y是CONH，m是1，Het是O，并且X是-O-CH2-CO。即所述连接子是-(CH2)4-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CO-[连接子4]。
在一些实施方案中，所述连接子L是-L2-X-(例如k是0和W是L2)，其中m是3，Het是O，并且X是-O-CH2-CO-。即所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)3-O-CH2-CO-[连接子5]。
在一些实施方案中，所述连接子L是-L2-Y-L1-X-(例如k是1，一个W是L2，另一个W是L1)，其中m是1，Het是O，Y是O-CH2-CONH(即，Z是H)，n是5，并且X是-CO-。即所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CONH-(CH2)5-CO-[连接子6]。
在一些实施方案中，所述连接子L是-(L1-Y)2-L1-X-(例如k是2，3个W都是L1)，其中一个n是4，另一个n是3和最后一个n是1，一个Y是CONH(即，Z是H)，并且另一个Y是NHCO(即，Z是H)，并且X是-CH2C≡C-。即所述连接子是-(CH2)4-CONH-(CH2)3-NHCO-CH2-CH2C≡C-[连接子7]。
在一些实施方案中，所述连接子L是-(L1-Y)2-L1-X-(例如k是2，3个W都是L1)，其中一个n是4，另一个n是3和最后一个n是4，一个Y是CONH(即，Z是H)，并且另一个Y是NHCO(即，Z是H)，并且X是键。即所述连接子是-(CH2)4-CONH-(CH2)3-NHCO-(CH2)4-[连接子7-氢化]。
在一些实施方案中，所述连接子L是-L2-Y-L2-X-(例如k是1，两个W都是L2)，其中一个m是1，另一个m是1，两个Het都是O，Y是O-CH2-CONH(即，Z是H)，并且X是-OCH2C≡C-(即，Het是O)。即所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)-OCH2C≡C-[连接子8]。
在一些实施方案中，所述连接子L是-L2-Y-L2-X-(例如k是1，两个W都是L2)，其中一个m是1，另一个m是2，两个Het是O，Y是O-CH2-CONH(即，Z是H)，并且X是-CH2-。即所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)2-CH2-[连接子8-氢化]。
在一些实施方案中，所述连接子L是-L2-Y-L1-Y-L1-X-(例如k是2，一个W是L2，另外两个W是L1)，其中m是1，一个Y是O-CH2-CONH(即，Z是H)，另一个Y是NHCO(即，Z是H)，一个n是3，另一个n是1，并且X是-CH2C≡C-。即所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CONH-(CH2)3-NHCO-CH2-CH2C≡C-[连接子9]。
在一些实施方案中，所述连接子L是-L2-Y-L1-Y-L1-X-(例如k是2，一个W是L2，并且另外两个W是L1)，其中m是1，一个Y是O-CH2-CONH(即，Z是H)，另一个Y是NHCO(即，Z是H)，一个n是3，另一个n是4，并且X是键。即所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CONH-(CH2)3-NHCO-(CH2)4-[连接子9-氢化]。
在一些实施方案中，所述连接子L是-L1-Y-L2-X-(例如k是1，一个W是L1，另一个W是L2)，其中n是4，Y是CONH(即，Z是H)，m是1，并且X是-OCH2C≡C-。即所述连接子是-(CH2)4-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)-OCH2C≡C-[连接子10]。
在一些实施方案中，所述连接子L是-L1-Y-L2-X-(例如k是1，一个W是L1，另一个W是L2)，其中n是4，Y是CONH(即，Z是H)，m是2，并且X是-CH2-。即所述连接子是-(CH2)4-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)2-CH2-[连接子10-氢化]。
式1
在一些实施方案中，所述化合物为式1的化合物。适当地，两个连接子是不同的，并且可以区分为La和Lb，如式1a所示。在一些实施方案中，立体化学如式1b所示。
优选地，La是式-L1-X-的连接子，任选地其中n是2并且X是氧原子。也就是说，La是-(亚乙基)O-，并且取代基是R1-(亚乙基)O-。
也就是说，所述化合物可以是下式的化合物：
在一些替代实施方案中，La是L2，任选地其中m是1或2，优选1。
优选地，Lb是式-L1-X-的连接子，任选地其中n是4并且X是-CO-。也就是说，Lb是-(亚丁基)CO-。
也就是说，所述化合物可以是下式的化合物：
在一些实施方案中，本发明提供下式的单体(GalNAc单体1)：
也就是说，R1是O-PN(iPr)2OCH2CH2CN；R2是DMTr；第一连接子(La)是-L1-X-，其中n＝2并且X是氧原子；并且所述第二连接子(Lb)是-L1-X-，其中X是-CO-并且n是4；并且GalNAc被乙酰基保护(即P是Ac)。
式2
在一些实施方案中，所述化合物是式2化合物。
优选地，每个R3独立地为甲基、甲氧基或H。更优选地，R3为H。
在一些实施方案中，所述化合物是式2a或2b的化合物：
优选地，所述连接子是-L1-X-，其中X是-CO-。也就是说，所述连接子通过酰胺键连接到核心基序的胺上。在一些实施方案中，n为8至10。在一些实施方案中，n是9；也就是说，所述连接子是癸酰基。
在一些实施方案中，所述连接子是-L1-Y-L1-X-，其中X是-CO-，Y是CONZ。也就是说，所述连接子通过酰胺键连接到核心基序的胺上。在一些实施方案中，L1基团可以具有不同的n值。在一些实施方案中，每个n独立地为4或5。在一些实施方案中，所述连接子是-(CH2)5-Y-(CH2)4-X-，例如-(CH2)5-CONH-(CH2)4-CO-。
在一些实施方案中，本发明提供下式的单体(GalNAc单体2)：
也就是说，R1是O-PN(iPr)2OCH2CH2CN；R2是DMTr；两个R3都是H；所述连接子是-L1-X-，其中X是-CO-，n是9，并且GalNAc被乙酰基保护(即，P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供式2的化合物，其中R1是连接寡核苷酸的磷酰胺键或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；R2是OH、DMTr)；两个R3都是H；所述连接子L是-L1-Y-L1-X-(这样k是1并且两个W都是L1)，其中X是-CO-，Y是CONH，一个n是4另一个n为5(即，连接子是-(CH2)4-CONH-(CH2)5-CO-)[连接子1]，并且GalNAc被乙酰基保护(即，P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供下式的单体(GalNAc单体4)：
也就是说，R1是O-PN(iPr)2OCH2CH2CN；R2是DMTr；两个R3都是H；所述连接子是-L1-Y-L1-X-，其中X是-CO-，Y是CONH，一个n是4，另一个n为5(即，所述连接子是-(CH2)5-CONH-(CH2)4-CO-)，并且GalNAc被乙酰基保护(即，P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供式2的化合物，其中R1是连接寡核苷酸的亚磷酰胺键或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；R2是OH或DMTr；两个R3都是H；所述连接子L是-L1-Y-L2-X-(这样k是1，一个W是L1，另一个W为L2)，其中n是4，Y是CONH，m是4，Het是O，X是-CO-(即，所述连接子是-(CH2)4-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)4-CO-[连接子2])，并且GalNAc被乙酰基保护(即，P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供式2的化合物，其中R1是连接寡核苷酸的亚磷酰胺键或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)的；R2是OH或DMTr；两个R3都是H；所述连接子L是-L1-X-(这样k是0，并且W是L1)，其中n是9，X是-CO-(即，所述连接子是-(CH2)9-CO-[连接子3])，并且GalNAc被乙酰基保护(即，P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供式2的化合物，其中R1是连接寡核苷酸的亚磷酰胺键或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；R2是OH或DMTr，两个R3都是H，所述连接子L是-L1-Y-L2-X-(这样k是1，一个W是L1，另一个W为L2)，其中n是4，Y是CONH，m是1，Het是O，X是-O-CH2-CO(即，所述连接子是-(CH2)4-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CO-[Linker4])，并且GalNAc被乙酰基保护(即，P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供式2的化合物，其中R1是连接寡核苷酸的亚磷酰胺键或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；R2是OH或DMTr；两个R3都是H；所述连接子L是-L2-X-(这样k是0，并且W是L2)，其中m是3，Het是O，X是O-CH2-CO(即连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)3-O-CH2-CO-[连接子5])，并且GalNAc被乙酰基保护(即P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供式2的化合物，其中R1是连接寡核苷酸的亚磷酰胺键或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；R2是OH或DMTr；两个R3都是H；所述连接子L是-L2-Y-L1-X-(这样k是1，一个W是L2，另一个W是L1)，其中m是1，Het是O，Y是O-CH2-CONH(即，Z是H)，n是5，并且X是-CO-(即所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CONH-(CH2)5-CO-[连接子6])，并且GalNAc被乙酰基保护(即P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供式2的化合物，其中R1是连接寡核苷酸的亚磷酰胺键或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)的磷酰胺键；R2是OH或DMTr；两个R3都是H；所述连接子L是-(L1-Y)2-L1-X-(这样k是2，3个W都是L1)，其中一个n是4，另一个n是3和最后一个n是1，一个Y是CONH(即，Z是H)，另一个Y是NHCO(即，Z是H)，并且X是-CH2C≡C-(即所述连接子是-(CH2)4-CONH-(CH2)3-NHCO-CH2-CH2C≡C-[连接子7])，并且GalNAc被乙酰基保护(即P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供式2的化合物，其中R1是连接寡核苷酸的亚磷酰胺键或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；R2是OH或DMTr；两个R3都是H；所述连接子L是-(L1-Y)2-L1-X-(这样k是2，3个W都是L1)，其中一个n是4，另一个n是3和最后一个n是4，一个Y是CONH(即，Z是H)，并且另一个Y是NHCO(即，Z是H)，并且X是键(即所述连接子是-(CH2)4-CONH-(CH2)3-NHCO-(CH2)4-[连接子7-氢化])，并且GalNAc被乙酰基保护(即P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供式2的化合物，其中R1是连接寡核苷酸的亚磷酰胺键或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；R2是OH或DMTr；两个R3都是H；所述连接子L是-L2-Y-L2-X-(这样k是1，两个W是L2)，其中一个m是1，另一个m是1，两个Het是O，Y是OCH2-CONH(即，Z是H)，并且X是-OCH2C≡C-(即，Het是O)(即所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)-OCH2C≡C-[连接子8])，并且GalNAc被乙酰基保护(即P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供式2的化合物，其中R1是连接寡核苷酸的亚磷酰胺键或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；R2是OH或DMTr；两个R3都是H；所述连接子L是-L2-Y-L2-X-(这样k是1，两个W都是L2)，其中一个m是1，另一个m是2，两个Het是O，Y是O-CH2-CONH(即，Z是H)，并且X是-CH2-(即所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)2-CH2-[连接子8-氢化])，并且GalNAc被乙酰基保护(即P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供式2的化合物，其中R1是与寡核苷酸的亚磷酰胺键或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；R2是OH或DMTr；两个R3都是H；所述连接子L是-L2-Y-L1-Y-L1-X-(这样k是1，一个W是L2，另2个W是L1)，其中m是1，一个Y是O-CH2-CONH(即，Z是H)，另一个Y是NHCO(即，Z是H)，一个n是3，另一个n是1，并且X是-CH2C＝C-(即所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CONH-(CH2)3-NHCO-CH2-CH2C＝C-[连接子9])，并且GalNAc被乙酰基保护(即P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供式2的化合物，其中R1是连接寡核苷酸的亚磷酰胺键或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；R2是OH或DMTr；两个R3都是H；所述连接子L是-L2-Y-L1-Y-L1-X-(这样k是2，一个W是L2，另外两个W是L1)，其中m是1，一个Y是O-CH2-CONH(即，Z是H)，另一个Y是NHCO(即，Z是H)，一个n是3，另一个n是4，并且X是键(即所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CONH-(CH2)3-NHCO-(CH2)4-[连接子9-氢化])，并且GalNAc被乙酰基保护(即P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供式2的化合物，其中R1是连接寡核苷酸的亚磷酰胺键或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；R2是OH或DMTr；两个R3都是H；所述连接子L是-L1-Y-L2-X-(这样k是1，一个W是L1，另一个W是L2)，其中n是4，Y是CONH(即，Z是H)，m是1，并且X是-OCH2C≡C-(即所述连接子是-(CH2)4-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)2-OCH2C≡C-[连接子10])，并且GalNAc被乙酰基保护(即P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供式2的化合物，其中R1是连接寡核苷酸的亚磷酰胺键或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；R2是OH或DMTr；两个R3都是H；所述连接子L是-L1-Y-L2-X-(这样k是1，一个W是L1，另一个W是L2)，其中一个n是4，Y是CONH(即，Z是H)，m是2，并且X是-CH2-(即所述连接子是-(CH2)4-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)1-CH2-)，并且GalNAc被乙酰基保护(即P是Ac)。
式3
在一些实施方案中，所述化合物为式3化合物。
优选地，R4是H、OH、OC1-4烷基或卤素。更优选地，R4是H。
优选地，X是*-OCH2C≡C-，其中*表示与W的连接点。在一些实施方案中，所述连接子是L1-Y-L2-X-，例如-L1-Y-L2-OCH2C≡C-(也就是说，X是*-OCH2C≡C-)。在一些实施方案中，Y是CONH。在一些实施方案中，n是4，Y是CONH，并且m是1。
在一些实施方案中，所述化合物为式3a化合物。
优选地，X是氧原子。在一些实施方案中，所述连接子是-L1-Y-L2-X-，例如-L1-Y-L2-O-(即，X是氧原子)。在一些实施方案中，Y是CONH。在一些实施方案中，n是4，Y是CONH，并且m是1。
在一些实施方案中，所述连接子是-(CH2)4-CONH-(CH2)5-CO-[连接子1]。
在一些实施方案中，所述连接子是-(CH2)4-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)4-CO-[连接子2]。
在一些实施方案中，所述连接子是-(CH2)9-CO-[连接子3]。
在一些实施方案中，所述连接子是-(CH2)4-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CO-[连接子4]。
在一些实施方案中，所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)3-O-CH2-CO-[连接子5]。
在一些实施方案中，所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CONH-(CH2)5-CO-[连接子6]。
在一些实施方案中，所述连接子是-(CH2)4-CONH-(CH2)3-NHCO-CH2-CH2C≡C-[连接子7]。
在一些实施方案中，所述连接子是-(CH2)4-CONH-(CH2)3-NHCO-(CH2)4-[连接子7-氢化]。
在一些实施方案中，所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)-OCH2C≡C-[连接子8]。
在一些实施方案中，所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)2-CH2-[连接子8-氢化]。
在一些实施方案中，所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CONH-(CH2)3-NHCO-CH2-CH2C≡C-[连接子9]。
在一些实施方案中，所述连接子是-CH2CH2(OCH2CH2)-O-CH2-CONH-(CH2)3-NHCO-(CH2)4-[连接子9-氢化]。
在一些实施方案中，所述连接子是-(CH2)4-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)-OCH2C≡C-[连接子10]。
在一些实施方案中，所述连接子是-(CH2)4-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)2-CH2-[连接子10-氢化]。
在一些实施方案中，本发明提供下式单体(GalNAc单体3)：
在式3中，R1是O-PN(iPr)2OCH2CH2CN；R2是DMTr；R4是H，所述连接子L是-L1-Y-L2-X-，其中n是4，Y是CONH，m是1，并且X是*-OCH2C≡C-；并且GalNAc被乙酰基保护(即P是Ac)。在式3a中，R1是O-PN(iPr)2OCH2CH2CN；R2是DMTr；R4是H，所述连接子L是-L1-Y-L2-X-，其中n是4，Y是CONH，m是1，并且X是氧原子；并且GalNAc被乙酰基保护(即P是Ac)。
在一些实施方案中，本发明提供下式单体(GalNAc单体5)：
在式3中，R1是O-PN(iPr)2OCH2CH2CN；R2是DMTr；R4是H，所述连接子L是-L1-Y-L2-X-，其中n是4，Y是CONH，m是2，并且X是-CH2-；并且GalNAc被乙酰基保护(即P是Ac)。即，L2是-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-。
抑制性核酸
本发明公开的方面和实施方案涉及抑制性核酸。如本文所用，“抑制性核酸”是指能够减少或阻止一种或多种给定靶基因/蛋白质的基因和/或蛋白质表达的核酸。术语“单体残基”是指结合在寡核苷酸链的一个或多个位置的单体单元。在下面的结构中，波浪线表示寡核苷酸链内的连接点或寡核苷酸链的末端(如果合适的话)。
因此，包含至少一个根据本发明的GalNAc单体残基的寡核苷酸可以是抑制性核酸。
在其他实施方案中，包含至少一个根据本发明的GalNAc单体残基的寡核苷酸可以是小激活RNA(saRNA)。
适当地，所述寡核苷酸可以包括相邻的GalNAc单体残基。在一些实施方案中，所述寡核苷酸优选包括两个，或更优选三个相邻的单体残基。应当理解，所述单体残基可以位于链内的任何点。在一些优选的实施方案中，所述单体残基位于寡核苷酸的3’端或其附近。在一些实施方案中，所述单体残基位于寡核苷酸的5’端或其附近。
在一些实施方案中，本发明提供了一种寡核苷酸(例如抑制性核酸)，其包含至少一种式中的单体残基：
任选地包含所述单体残基的三个拷贝；即式(A)、(B)或(C)的单体的三个拷贝。适当地，所述拷贝是连续的。换言之，所述寡核苷酸包括三个相邻的单体残基，所述单体残基选自式(A)、(B)或(C)中的一个。在一些实施方案中，X为O。在一些实施例中，X是S。本文示例性的寡核苷酸和siRNA包含三个式(A)的单体残基，其中分别地X为O、X为S和X为S。本文示例性的其它寡核苷酸和siRNA包含三个式(B)的单体残基，其中分别地X为O、X为S和X为S。本文示例性的其它寡核苷酸和siRNA包含三个式(C)的单体残基，其中分别地X为O、X为S和X为S。所述单体残基可以位于寡核苷酸的3’端。或者，所述单体残基可以位于寡核苷酸的5’端或链上另一点。
根据本发明的抑制性核酸可以包括或由DNA和/或RNA和/或其他类型的寡核苷酸组成。抑制性核酸可以包括寡核苷酸糖磷酸主链的变化，以减少/防止RNAse H降解，例如硫代磷酸键、磷酸二酰胺键，例如磷酸二酰胺吗啉(PMO)，并且可以包括例如肽核酸(PNAs)、锁核酸(LNAs)、甲氧基乙基核苷酸修饰，例如2’O-甲基(2’OMe)和2’-O-40甲氧基乙基(MOE)核糖修饰和/或5’-甲基胞嘧啶修饰。
抑制性核酸可以是单链的(例如反义寡核苷酸)。抑制性核酸可以是双链的，也可以包含双链区(如siRNA、shRNA等)。抑制性核酸可以包含双链和单链区(例如，shRNA和pre-miRNA，它们在发夹结构的茎区中是双链的，在发夹结构环区中是单链的)。
在一些实施方案中，抑制性核酸是小干扰RNA(siRNA)。如本文所用，“siRNA”是指长度在17-30(例如20-27，例如～21)个碱基对之间的双链RNA分子，其能够参与RNA干扰(RNAi)途径以靶向降解靶RNA。双链siRNA分子可以作为具有高度互补性的RNA链的核酸复合物形成。双链siRNA分子中与靶核苷酸序列具有互补性的链(即反义核酸)可以称为“引导”链，而另一条链(有义链)可以称为‘乘客’链。siRNA的结构和功能描述于例如Kim和Rossi，生物技术，2008年4月；44(5):613-616.在一些实施方案中，siRNA分子包括引导链上的不对称3’悬垂，例如包含一个或两个核苷酸(例如“UU”3’悬垂)。
在一个方面，根据本发明的抑制性核酸适合于减少PCSK9的基因和/或蛋白质表达。应当理解，在抑制性核酸被描述为减少PCSK9的基因表达的情况下，旨在抑制编码PCSK9基因的表达。也就是说，本文中抑制PCSK9基因表达指的是抑制PCSK9表达。
PCSK9代表前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型。
PCSK9的结构和功能在例如Sobati等人，Adv Pharm Bull.(2020)10(4):502-511和Urban等人，Am Coll Cardiol(2013)62(16):1401-1408中描述，其全部内容通过引用并入本文。
在本说明书中，提及“PCSK9”包括：人PCSK9同种型1、人PCSK9-同种型1的同源物(即由非人动物的基因组编码)及其变体。在一些实施方案中，根据本发明的PCSK9包含或由与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有70％或更大的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成，优选75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的一个。
在一些实施方案中，根据本发明的抑制性核酸是用于减少PCSK9的基因和/或蛋白质表达的siRNA(即抗PCSK9的siRNA)。在一些实施方案中，根据本发明的抑制性核酸包括英克西兰的核苷酸序列。英克西兰是一种抗PCSK9的合成siRNA，例如在Fitzgerald等人，NEJM(2017)376(1):41-51和WO 2014/089313A1中描述(这两个文献都通过引用整体并入本文)。英克西兰的靶核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。英克西兰的反义核酸的核苷酸序列(即引导链的核苷酸序列)如SEQ ID NO:2所示，有义链的核苷酸序列(即乘客链的核苷酸序列)如SEQ ID NO:1所示。英克西兰的引导和/或乘客链分别包括如SEQ ID NO:4和3所示的修饰。
因此，在本公开的一些方面和实施方案中，所述抑制性核酸包含SEQ ID NO:2中所述的核苷酸序列和/或SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列。适当地，在本公开的一些方面和实施方案中，抑制性核酸包含SEQ ID NO:4中所述的核苷酸序列和/或SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所示抑制性核酸包含SEQ ID NO:8中所示的核苷酸序列，并且优选地进一步包含SEQ ID NO:4中所述的核苷酸序列。在一些实施方案中，所示抑制性核酸包含SEQ ID NO:9中所述的核苷酸序列，并且优选地进一步包含SEQ ID NO:4中所述的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述抑制性核酸包含SEQ ID NO:10中所述的核苷酸序列，并且优选地进一步包含SEQ ID NO:4中所示的核苷酸序列。
PCSK9在肝细胞、肾间充质细胞、肠回肠、结肠上皮细胞和胚胎脑中的端脑神经元中表达。PCSK9已被证实在调节胆固醇稳态中发挥核心作用，通过增强肝脏低密度脂蛋白受体(LDLR)的内体和溶酶体降解，导致血清低密度脂素胆固醇(LDL-C)浓度增加。如S127R和F216L等功能获得突变与常染色体显性高胆固醇血症有关，而功能丧失突变与血浆低密度脂蛋白胆固醇水平低和心血管疾病风险降低有关。
PCSK9在内质网中的Q152和S153之间自催化裂解，形成14kDa前结构域和63kDa成熟蛋白。前结构域与成熟蛋白的催化结构域保持紧密联系，阻断底物结合位点。在ER之后，PCSK9通过细胞外或细胞内途径进行。在细胞外途径中，PCSK9通过高尔基体网络从细胞分泌，并与细胞外LDLR结合。PCSK9:LDLR复合物通过网格蛋白介导的内吞作用被细胞内化，并被输送到内体，导致LDLR降解。在细胞内途径中，PCSK9与LDLR一起被分选到溶酶体，导致LDLR降解。
PCSK9已被证明通过PCSK9的催化结构域和LDLR的EGF样重复同源结构域之间的相互作用与LDLR结合。研究表明，PCSK9催化结构域的失活不会抑制LDLR的降解，这表明分泌的PCSK9是LDLR降解的伴侣，而不是催化酶。
血浆LDL-C主要通过LDL受体(LDLR)途径清除。LDLR:LDL-C途径和PCSK9在其调节中的作用如Gu和Zhang J Biomed Res.(2015)29(5):356-361所述，全文通过引用并入本文。
抑制性核酸减少PCSK9的表达已被证明是降低血清LDL-C水平的有效治疗方法，从而用于治疗和预防高胆固醇血症和相关疾病(例如心血管疾病)。参见Raal等人《英国医学杂志》(2020)382(16):1520-1530，Ray等人《新英格兰医学杂志》(2020)382:1507-1119和Stoekenbroek等人《未来心脏病学》(2018)14(6):433-442，其全部内容通过引用并入本文。在欧盟，所述抑制性核酸英克西兰被批准用于治疗血脂异常和高胆固醇血症。
治疗和预防应用
本文所述的抑制性核酸、核酸、表达载体、细胞和组合物可用于治疗和预防方法。
本发明提供了本文所述的用于药物治疗或预防方法的抑制性核酸、核酸、表达载体或组合物。还提供了本文所述的抑制性核酸、核酸、表达载体或组合物在制备治疗或预防疾病或病症的药物中的用途。还提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法，包括给受试者施用治疗或预防有效量的本文所述的抑制性核酸、核酸、表达载体或组合物。
术语“病症”、“疾病”和“病症”可以互换使用，指的是身体部位、器官或系统的病理问题，其特征可能是一组可识别的体征或症状。
受试者
根据本发明的各个方面的受试者可以是任何动物或人类。治疗和预防应用可以用于人类或动物(兽医用途)。要用本文所述的治疗物质治疗的受试者可以是需要治疗的受试者。受试者优选为哺乳动物，更优选为人类。所述受试者可以是非人类哺乳动物，但更优选是人类。所述受试者可能是男性或女性。受试者可能是一名患者。
受试者可能已被诊断患有本文所述的疾病或病症，可能被怀疑患有这种疾病/病症，或者可能有发展/感染这种疾病/病症的风险。在根据本发明的实施方案中，可以根据基于这种疾病/病症的某些标志物的表征的方法来选择受试者进行治疗。
试剂盒
在本发明的一些方面中，提供了部分试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒可以具有至少一个容器，所述容器具有预定量的本文所述的抑制性核酸、核酸、表达载体、细胞或组合物。
在一些实施方案中，所述试剂盒可以包括用于生产本文所述的抑制性核酸、核酸、表达载体、细胞或组合物的材料。
所述试剂盒可以提供抑制性核酸、核酸、表达载体、细胞或组合物以及患者施用的说明书，以便治疗特定的疾病/病症。
在一些实施方案中，所述试剂盒可以进一步包括具有预定量的另一种治疗剂(例如，如本文所述)的至少一个容器。在这样的实施方案中，所述试剂盒还可以包括第二药物或药物组合物，使得这两种药物或药物组成可以同时或单独施用，从而它们提供针对特定疾病或病症的联合治疗。
根据本发明的试剂盒可以包括使用说明书，例如以说明书或传单的形式。说明书可以包括用于执行本文所描述的方法中的任何一种或多种方法的方案。
***
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这种组合是明显不允许或明确避免的。
此处使用的章节标题仅用于组织目的，不得解释为限制所述主题。
现在将通过示例的方式，参考附图说明本公开的各方面和实施方案。进一步的方面和实施方案对本领域技术人员来说将是显而易见的。本文中提及的所有文件通过引用并入本文。
在整个说明书中，包括随后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则“包含”一词以及诸如“包括”和“含有”的变体将被理解为意味着包括所述完整物、步骤或完整物或步骤的组，而不排除任何其他完整物、步骤、完整物或步骤的组。
必须注意的是，在说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。范围在本文中可以表示为从“大约”一个特定值和/或到“大约”另一特定值。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定的值。类似地，当值被表示为近似值时，通过使用先行词“约”，将理解为特定值形成另一个实施方案。
在本文公开核酸序列的情况下，也明确考虑其反向互补。
本文所述的方法可以在体外或体内进行。在一些实施方案中，本文所述的方法在体外进行。术语“体外”旨在涵盖使用培养细胞的实验，而术语“体内”旨在涵盖完整的多细胞生物体的实验。
附图说明
现在将参考附图讨论说明本发明原理的实施方案和实验。
图1.(ptGal)3-siRNA缀合物在基于转染的条件下的IC50。IC50曲线分别显示(ptGal)3-siRNA、triGal-siRNA和Leqvio的PCSK9蛋白敲除功效。这三种缀合物具有相同的siRNA序列，即英克西兰的乘客链序列。TriGal siRNA代表内部合成的英克西兰，是临床级的英克西兰。
图2.(tGal)3-siRNA缀合物在基于转染的条件下的IC50。IC50曲线分别显示(tGal)3-siRNA和triGal-siRNA的PCSK9蛋白敲除功效。这两种缀合物具有相同的siRNA序列，即英克西兰的乘客链序列。TriGal siRNA代表内部合成的英克西兰。
图3.(gGal)3-siRNA缀合物在基于转染的条件下的IC50。IC50曲线分别显示(gGal)3-siRNA和triGal-siRNA的PCSK9蛋白敲除功效。这两种缀合物具有相同的siRNA序列，即英克西兰的乘客链序列。TriGal siRNA代表内部合成的英克西兰。
图4.使用(ptGal)3-siRNA缀合物的体内PCSK9敲除。A)图显示在hPCSK9-KI小鼠体内所述siRNA对PCSK9蛋白减少的效力和持续时间。通过皮下注射以2mg/kg的单次剂量施用siRNA。用ELISA法测定hPCSK9蛋白血清水平。B)图显示不同时间点(siRNA注射前第2天、注射前第1天和注射后第5天、第11天、第15天、第22天、第29天、第43天和第49天)hPCSK9平均水平。
图5.使用(tGal)3-siRNA缀合物的体内PCSK9敲除。A)图显示在hPCSK9-KI小鼠体内所述siRNA对PCSK9蛋白减少的功效和持续时间。通过皮下注射以2mg/kg的单次剂量施用siRNA。用ELISA法测定hPCSK9蛋白血清水平。B)图显示不同时间点(siRNA注射前第13天、注射前第8天和注射后第4天、第11天、第18天、第25天和第32天)hPCSK9平均水平。
图6.使用(gGal)3-siRNA缀合物的体内PCSK9敲除。A)图显示在hPCSK9-KI小鼠体内所述siRNA对PCSK9蛋白减少的功效和持续时间。通过皮下注射以2mg/kg的单次剂量施用siRNA。用ELISA法测定hPCSK9蛋白血清水平。B)图显示不同时间点(siRNA注射前第9天、注射前第3天和注射后第4天、第11天、第15天、第22天、第29天、第43天和第49天)hPCSK9平均水平。
图7A至7C.根据本发明制备的GalNAc寡核苷酸缀合物。
图8A至8C.根据本发明制备的GalNAc-siRNA缀合物。
实施例
在以下实施例中，本发明人描述了GalNAc连接子、GalNAc单体前体、GalNA酰胺单体、GalNAc固体载体和GalNAc-siRNA缀合物的合成。
GalNAc-连接子
GalNAc连接子是用于合成本文所述的GalNAc单体前体的中间体化合物。
GalNAc-连接子1
GalNAc连接子酸1可以如方案1中所示合成。过酰化的GalNAc与TMSOTf反应以除去C-1乙酸酯基团，并且所得的氧鎓离子被-NHAc基团的分子内环化捕获。使用TMSOTf和分子筛将醇连接在C-1位置。使用高碘酸钠和氯化钌(III)将末端烯烃氧化裂解并氧化成羧酸。将得到的羧酸与末端胺偶联以形成GalNAc连接子酸1。
方案1–GalNAc连接子酸1的合成
GalNAc-连接子2
本发明人假定GalNAc连接子酸2可以如方案2中所示合成。
过酰化的GalNAc与TMSOTf反应以除去C-1乙酸酯基团，并且所得的氧鎓离子被-NHAc基团的分子内环化捕获。使用TMSOTf和分子筛将醇连接在C-1位置。使用高碘酸钠和氯化钌(III)将末端烯烃氧化裂解并氧化成羧酸。将得到的羧酸与末端胺偶联以形成GalNAc连接子酸2。
方案2–GalNAc连接子酸2的合成
GalNAc-连接子3
本发明人假定GalNAc连接子酸3可以如方案3中所示合成。
过酰化的GalNAc与TMSOTf反应以除去C-1乙酸酯基团，并且所得的氧鎓离子被-NHAc基团的分子内环化捕获。使用TMSOTf和分子筛将醇连接在C-1位置。使用高碘酸钠和氯化钌(III)将末端烯烃氧化裂解并氧化成羧酸。将得到的羧酸与末端胺偶联以形成GalNAc连接子酸3。
方案3–GalNAc连接子酸3的合成
本文公开的其它GalNAc连接子前体包括GalNAc连接子4至10。这些如下所示，并且可以根据实施例2至8中描述的方法合成：
GalNAc-连接子4
GalNAc-连接子5
GalNAc-连接子6
GalNAc-连接子7
GalNAc-连接子8
GalNAc-连接子9
GalNAc-连接子10
方案4–GalNAc连接子10的合成
GalNAc单体前体
GalNAc单体前体是用于合成本文所述的GalNAc酰胺单体和GalNAc固体载体的中间体化合物。
GalNAc单体前体1(来自GalNAc连接子1)
GalNAc单体前体2(来自GalNAc连接子4)
GalNAc单体前体3(来自GalNAc连接子5)
GalNAc单体前体4(来自GalNAc连接子6)
GalNAc单体前体5(来自GalNAc连接子10)
GalNAc单体前体6(来自GalNAc连接子10)
GalNAc单体前体7(来自GalNAc连接子7)
方案5–GalNAc单体前体7的合成
GalNAc单体前体8(来自GalNAc连接子8)
方案6–GalNAc单体前体8的合成
GalNAc单体前体9(来自GalNAc连接子9)
方案7–GalNAc单体前体9的合成
GalNAc酰胺单体
下文提供了本文所述的GalNAc酰胺单体的一般合成路线。基于以下建议的路线，其他路线和试剂对本领域技术人员来说可能是显而易见的。例如，应理解的是，如以下方案8中所述的亚磷酸化方案在本领域是众所周知的。如上所述的GalNAc单体前体可通过如实施例中所示的亚磷酸化方案容易地转化为相应的GalNAc酰胺单体。
方案8–GalNAc酰胺单体的一般合成路线
GalNAc酰胺单体1
本发明人假定GalNAc单体1可以如方案9中所示合成。
过酰化的呋喃核糖与三氟化硼二乙醚和醇反应，使醇连接在C-1位置。用K2CO3和甲醇对所有剩余的乙酰基进行脱保护。伯羟基用DMTrCl和吡啶保护。剩余的1,2-二醇用高碘酸钠氧化裂解，然后用氨和三乙酰氧基硼氢化钠进行还原胺化以合成吗啉基部分。将GalNAc连接子酸与吗啉基部分的氮偶联，并使用氢化作用除去苄基。最后，游离羟基通过DCI与磷酸二酰胺偶联，形成GalNAc单体1。
方案9–GalNAc单体1的合成
GalNAc酰胺单体2
本发明人假定GalNAc酰胺单体2可以如方案10中所示合成。
方案10–GalNAc单体2的合成
GalNAc酰胺单体3(ptGal亚磷酰胺)
可以如方案11中所示合成GalNAc酰胺单体3(ptGal亚磷酰胺)。
方案11–GalNAc单体3(ptGal亚磷酰胺)的合成
GalNAc酰胺单体5(tGal亚磷酰胺)
GalNAc酰胺单体6(tGal亚磷酰胺)
GalNAc固体载体
下文提供了本文所述GalNAc单体的一般合成路线。基于以下建议的路线，其他路线和试剂对本领域技术人员来说可能是显而易见的。GalNAc单体前体与琥珀酸酐反应，得到的琥珀酸与氨基官能化的固体载体(例如可控孔玻璃(CPG)或聚苯乙烯)偶联。在用乙酸酐封端和洗涤后，可以获得GalNAc固体载体，并且可以通过去除的DMTr阴离子的UV评估来评估其负载量。如上所述的GalNAc单体前体可以通过如实施例中所示的负载方案容易地转化为相应的GalNAc固体载体。
可控孔玻璃或聚苯乙烯
GalNAc固体载体1(gGal CPG)
可孔玻璃或聚苯乙烯
GalNAc固体载体2(ptGal CPG)
GalNAc固体载体3(tGal CPG)
GalNAc缀合寡核苷酸与siRNA合成
GalNAc缀合寡核苷酸可以通过寡核苷酸合成器使用如上所述的GalNAc酰胺单体和/或GalNAc固体载体以及市售的酰胺单体或固体载体的核苷酸来合成。例如，可以使用三个酰胺单体或固体负载单体和酰胺单体的组合来连接三个GalNAc部分。
在裂解和脱保护之后，可以获得粗的GalNAc缀合寡核苷酸。根据下游应用，可以使用不同的纯化技术来纯化GalNAc缀合寡核苷酸。通过退火到互补序列，可以获得GalNAc缀合双链体(例如GalNAc siRNA)。
GalNAc缀合的寡核苷酸1((gGal)3-oligo)如图7A所示。
GalNAc缀合的寡核苷酸2((ptGal)3-oligo)如图7B所示。
GalNAc缀合的寡核苷酸3((tGal)3-oligo)如图7C所示。
GalNAc缀合的siRNA1((gGal)3-siRNA)如图8A所示。
GalNAc缀合的siRNA2((ptGal)3-siRNA)如图8B所示。
GalNAc缀合的siRNA3((tGal)3-siRNA)如图8C所示。
实施例1-GalNAc连接子1的合成与表征
根据方案12合成GalNAc连接子1。以下段落描述了逐步反应过程。
方案12–GalNAc连接子1的合成
将五乙酸半乳糖胺(30g，77.0mmol)溶于1,2-二氯乙烷(200mL)中，并在分子筛上搅拌30分钟。在室温下加入三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯(15.3mL，18.8mmol)，并在50℃下搅拌2小时。将反应冷却至0℃，并用三乙胺(43.0mL，308mmol)缓慢猝灭，然后在0℃下搅拌15分钟，在室温下搅拌15min。过滤反应混合物，用二氯甲烷(3×150mL)洗涤过滤器。滤液用饱和碳酸氢钠水溶液(3×150mL)洗涤，然后用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到化合物1(25.3g，76.9mmol，100％)，无需进一步纯化即可使用。
将化合物1(25.3g，76.9mmol)和5-己烯-1-醇(12.0mL，100mmol)溶于1,2-二氯甲烷(200mL)中，然后在分子筛上搅拌30分钟。在室温下加入三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯(7.0mL，38.5mmol)，并在室温下搅拌1.5小时。将反应冷却至0℃，用二氯甲烷(150mL)稀释并用饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)猝灭。分离各层，并用二氯甲烷(2×150mL)萃取水相。将合并的有机提取物用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过柱色谱法(0％->20％->50％->70％乙酸乙酯/己烷)纯化，得到浅黄色固体的化合物2(25.6g，59.6mmol，77％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.82(d,J＝9.2Hz,1H),5.79(ddt,J＝16.9,10.2,6.6Hz,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,1H),5.05–4.92(m,3H),4.48(d,J＝8.4Hz,1H),4.09–3.98(m,3H),3.87(dt,J＝11.3,8.9Hz,1H),3.71(dt,J＝9.9,6.0Hz,1H),3.42(dt,J＝10.0,6.4Hz,1H),2.10(s,3H),2.05–1.97(m,2H),2.00(s,3H),1.89(s,3H),1.76(s,3H),1.53–1.43(m,2H),1.41–1.30(m,2H).
将化合物2(32.8g，76.4mmol)溶于二氯甲烷(100ml)、乙腈(100ml)和水(160mL)的混合物中。向溶液中加入偏碘酸钠(65.3克，306mmol)和氯化钌(III)(316mg，1.53mmol)。将反应在室温下搅拌1.5小时，使用水浴来控制任何放热。再加入一部分偏碘酸钠(16.3g，76.4mmol)，将反应物在室温下搅拌1小时。过滤反应物，用二氯甲烷(3×200mL)洗涤过滤器，并用饱和碳酸氢钠水溶液(160mL)猝灭，检查水相达到pH 8-9。分离各层，用DCM(2×100mL)洗涤水相，然后用4N盐酸水溶液(～50mL)酸化至pH 3–4，并用DCM(8×200mL)萃取。将合并的有机提取物用Na2SO4干燥，过滤并蒸发，得到白色泡沫状化合物3(28.2g，63.0mmol，82％)，无需进一步纯化即可使用。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.00(s,1H),7.82(d,J＝9.2Hz,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,1H),4.96(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.49(d,J＝8.4Hz,1H),4.06–3.98(m,3H),3.88(dt,J＝11.3,8.9Hz,1H),3.76–3.66(m,1H),3.44–3.39(m,1H),2.23–2.14(m,2H),2.10(s,3H),2.00(s,3H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.56–1.43(m,4H).
将化合物3(10.2g，22.8mmol)溶于四氢呋喃(150mL)中，并在室温下加入1,1’-羰基二咪唑(4.81g，29.6mmol)。将反应物在40℃下搅拌1.5小时，然后用溶于1M碳酸钠水溶液(34.2mL，34.2mmol)中的6-氨基己酸(4.49g，34.2mol)溶液处理。将反应物在40℃下搅拌1.5小时，然后冷却至0℃，用乙酸乙酯(150mL)稀释，并用4M HCl(35mL)小心猝灭。分离各层，并用乙酸乙酯(4×100mL)萃取水相。将合并的有机提取物用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到白色泡沫状化合物4(12.7g，22.6mmol，99％)，无需进一步纯化即可使用。
实施例2-GalNAc连接子4的合成与表征
将Boc酸(16.6g，63.0mmol)、碳酸氢钾(22.6g，164mmol)和丙酮(242mL)混合，得到悬浮液。加入苄基溴(9.75mL，82.0mmol)，烧瓶在氩气气氛下于60℃下搅拌16小时。通过硅藻土垫过滤反应物，用二氯甲烷(2×50mL)洗涤并浓缩。粗产物通过柱色谱法(0％->50％乙酸乙酯/己烷)纯化，得到化合物32，无需进一步纯化即可使用。
用盐酸(4.0M在二恶烷中，63mL，252mmol)处理化合物32。将反应混合物在室温下搅拌16小时，然后浓缩成残留物。残留物用甲基叔丁基醚(2×50mL)洗涤，得到吸湿性固体化合物33(17.5g，60.4mmol，96％)，无需进一步纯化即可使用。
将化合物33(18.2g，40.8mmol)溶于二氯甲烷(154mL)中，然后依次加入HATU(15.5g，40.8mmol)、三乙胺(17.0mL，122.4mmol)和GalNAc酸(11.8g，40.8mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜，然后倒入柠檬酸水溶液(10％w/v，100mL)中。分离各层，并用二氯甲烷(2×50mL)萃取水相。合并的有机提取物用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过柱色谱法(0％->4％甲醇/乙酸乙酯)纯化，得到白色固体化合物34(24.9g，36.5mmol，89％)。
将化合物34(11.8g，17.3mmol)溶于甲醇(64mL)中，并加入钯-碳(10wt％，1.84g，1.73mmol)。将反应物在氢气气氛(1atm)下搅拌3小时。混合物经硅藻土过滤，用甲醇(2×50mL)洗涤，并在高真空下干燥，得到稠黄色油状物的化合物35(9.43g，15.9mmol，92％)。
实施例3-GalNAc连接子5的合成与表征
在室温下将PEG酸(20.0g，79.3mmol)和碳酸氢钾(9.52g，95.1mmol)溶于DMF(159mL)中。加入苄基溴(11.3mL，95.1mmol)，将反应物在室温下搅拌16小时。在真空中除去挥发物，残留物溶于二氯甲烷(150mL)中，过滤以除去任何不溶性物质。粗产物通过柱色谱法(0％->10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到化合物29(22.4g，65.4mmol，82％)，为稠黄色油状物。
将化合物29(19.8g，57.8mmol)和五乙酸半乳糖胺(17.3g，44.4mmol)溶于1,2-二氯乙烷(170mL)中。加入三氟甲磺酸钪(III)(1.53g，3.11mmol)，将反应物在90℃下搅拌16小时。将反应物冷却至室温，并在剧烈搅拌下倒入饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)中。分离各层，并用二氯甲烷(3×100mL)萃取水相。合并的有机提取物用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过柱色谱(0％->10％甲醇/二氯甲烷)纯化，并通过反相柱色谱(10％->50％乙腈/水)进一步纯化，得到白色泡沫的化合物30(8.08g，12.0mol，27％)。
将化合物30(8.08g，12.0mmol)溶于甲醇(60mL)中，并加入碳-钯(10wt％，1.92g，1.80mmol)。将反应物在氢气气氛(1atm)下搅拌2小时。混合物经硅藻土过滤并浓缩成半固体。残留物通过反相柱色谱法(10％->50％乙腈/水)纯化，得到白色泡沫状化合物31(6.95g，11.9mol，99％)。
1H NMR(300MHz,dmso)δ7.77(d,J＝9.2Hz,1H),5.19(d,J＝3.5Hz,1H),4.95(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.54(d,J＝8.5Hz,1H),4.00(d,J＝6.9Hz,5H),3.94–3.70(m,2H),3.64–3.44(m,15H),2.09(s,3H),1.98(s,3H),1.87(s,3H),1.76(s,3H)，未观察到羧酸质子。
实施例4-GalNAc连接子6的合成与表征
将Boc酸(25.0g，108mmol)、碳酸钾(8.47g，61.3mmol)和DMF(400mL)混合，得到悬浮液。加入苄基溴(2.90g，108mmol)，烧瓶在氩气气氛下于60℃下搅拌16小时。将反应物过滤并浓缩，然后将残留物溶于乙酸乙酯(500mL)中。有机相依次用5％柠檬酸溶液(2×250mL)、水(250mL)和盐水(250mL)洗涤，然后用硫酸钠干燥，过滤并浓缩成浅黄色油状物(30.81g，88.7％)，无需进一步纯化即可使用。
用盐酸(4.0M在二恶烷中，100mL，400mmol)处理来自上述的浅黄色油状物。将反应混合物在室温下搅拌3小时，然后浓缩成残留物。将残留物与水(100mL)混合并蒸发，得到吸湿性固体化合物25(26.4g，107％)，无需进一步纯化即可使用。
将化合物25(20.0g，40.5mmol)溶于二氯甲烷(300mL)中，然后依次加入HATU(16.9g，44.4mmol)、三乙胺(17.0mL，122.0mmol)和GalNAc酸(10.4g，40.4mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜，然后浓缩成残留物。粗产物通过柱色谱法(0％->10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到白色固体(22.3g)。通过反相柱色谱法(120g C18柱，洗脱梯度10％->60％乙腈/水)进一步纯化。将纯馏分汇集并冷冻干燥，得到化合物27，其为无定形白色固体(14.3g，20.5mmol，50％)。
将化合物27(14.3，20.5mmol)溶于甲醇(200mL)中，并加入碳-钯(10wt％，2.18g，2.05mmol)。将反应物在氢气气氛(1atm)下搅拌3小时。混合物经硅藻土过滤并浓缩成半固体。将残余物冷冻干燥，得到化合物28，其为无定形白色固体(12.1g，20.0mmol，98％)。
1H NMR(300MHz,dmso)δ11.92(s,1H),7.82(d,J＝9.2Hz,1H),7.68(t,J＝5.9Hz,1H),5.19(d,J＝3.4Hz,1H),4.95(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.54(d,J＝8.5Hz,1H),4.04–3.95(m,3H),3.94–3.71(m,4H),3.64–3.43(m,7H),3.11–2.99(m,2H),2.16(t,J＝7.3Hz,2H),2.08(s,3H),1.98(s,3H),1.87(s,3H),1.75(s,3H),1.54–1.31(m,4H),1.29–1.17(m,2H)。
实施例5-GalNAc连接子7的合成与表征
在室温下将4-戊烯酸(50g，0.510mol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(117.4g，0.612mol)和4-(二甲基氨基)吡啶(15.6g，0.128mol)溶于二氯甲烷(1300mL)中。将三乙胺(213mL，1.53mol)加入到反应混合物中，然后加入N-Boc-1,3-丙二胺(88.8g，0.51mol)。将反应物在室温下搅拌16小时，然后倒入水(1.5L)中。分离各层，并用二氯甲烷(2×800mL)萃取水相。合并的有机提取物用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过柱色谱法(2％->5％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到化合物18(91.5g，0.360mol，71％)，为稠黄色油状物。
将化合物18(51.8g，0.204mol)溶于二氯甲烷(500mL)中，并加入盐酸(4.0M在二恶烷中，500mL，2.0mol)。将反应物在室温下搅拌30分钟，然后真空浓缩以除去挥发物。残留物用甲基叔丁基醚(2×50mL)洗涤，得到化合物19(43.6g，0.283mol，112％)，为稠油状物。将产物溶解在吡啶(204mL)中以制备1.0M的化合物19的吡啶溶液。
将化合物3(17.0g，38.0mmol)溶于二氯甲烷(190mL)中，然后在室温下依次加入HBTU(14.4g，38.mmol)、DIEA(20mL，114mmol)和化合物19的吡啶溶液(41.8mL，41.8mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时，然后倒入饱和NaHCO3水溶液(150mL)中。分离各层，并依次用10％柠檬酸(100mL)和盐水(150mL)洗涤有机相。有机相用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过柱色谱法(0％->10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到白色泡沫状化合物20(7.61g，13.0mol，71％)。
1H NMR(300MHz,dmso)δ7.88(t,J＝5.6Hz,1H),7.83(d,J＝9.2Hz,1H),7.73(t,J＝5.7Hz,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,1H),4.97(dd,J＝11.3,3.3Hz,1H),4.48(dd,J＝8.5,1.1Hz,1H),4.06–4.00(m,3H),3.87(q,J＝9.4Hz,1H),3.71(dd,J＝10.4,5.4Hz,1H),3.42(q,J＝5.5Hz,1H),3.04(q,J＝6.4Hz,4H),2.76(td,J＝2.5,1.1Hz,1H),2.40–2.30(m,2H),2.30–2.19(m,2H),2.11(d,J＝1.1Hz,3H),2.03(d,J＝7.3Hz,2H),2.00(d,J＝1.1Hz,3H),1.89(d,J＝1.1Hz,3H),1.78(d,J＝1.1Hz,3H),1.58–1.39(m,6H)。
实施例6-GalNAc连接子8的合成与表征
将化合物21(4.85g，10.2mmol)溶于二氯甲烷(18mL)、乙腈(18mL)和水(27mL)的混合物中。向该溶液中加入偏碘酸钠(11.6g，54.1mmol)和氯化钌(III)(63.4mg，0.3mmol)。将反应在室温下搅拌3小时，使用水浴来控制任何放热。过滤反应物，用乙腈(2×20mL)和水(2×20ml)洗涤过滤器。将滤液真空浓缩以除去挥发物，然后用盐酸水溶液(1.0M)酸化水性残留物，直到pH为2，并用二氯甲烷(4×75mL)萃取。合并的有机提取物用硫代硫酸钠水溶液(100mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，蒸发，得到白色泡沫状化合物22(3.57g，7.24mmol，71％)，无需进一步纯化即可使用。
将化合物22(10.0g，20.2mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中，然后依次加入HATU(8.47g，22.3mmol)、三乙胺(8.47毫升，60.7mmol)和炔基胺(2.90g，20.2mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜，然后浓缩成残留物。粗产物通过柱色谱法(0％->10％甲醇/(1:1乙酸乙酯:二氯甲烷))纯化，得到白色固体(7.4g)。通过反相柱色谱法(120g C18柱，洗脱梯度10％->60％B乙腈/水)进一步纯化。将纯馏分汇集并冷冻干燥，得到无定形白色固体化合物23(5.76g，9.31mmol，46％)。
1H NMR(300MHz,dmso)δ7.83(d,J＝9.2Hz,1H),7.69(t,J＝5.8Hz,1H),5.22(d,J＝3.4Hz,1H),4.98(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.56(d,J＝8.5Hz,1H),4.14(dd,J＝2.4,0.7Hz,2H),4.06–4.00(m,3H),3.95–3.75(m,3H),3.65–3.50(m,11H),3.47–3.40(m,3H),3.32–3.21(m,3H),2.11(s,3H),2.00(s,3H),1.90(s,3H),1.78(s,3H).
实施例7-GalNAc连接子9的合成与表征
将化合物22(10.3g，20.8mmol)溶于二氯甲烷(100mL)中，然后依次加入HATU(8.71g，22.9mmol)、三乙胺(8.69mL，62.4mmol)和炔基胺(3.21g，20.80mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜，然后浓缩成残留物。粗产物通过柱色谱法(0％->10％甲醇/(1:1乙酸乙酯:二氯甲烷))纯化，得到白色固体(4.8g)。通过反相柱色谱法(120g C18柱，洗脱梯度10％->60％B乙腈/水)进一步纯化。将纯馏分汇集并冷冻干燥，得到无定形白色固体的化合物24(3.60g，5.72mmol，28％)。
1H NMR(300MHz,dmso)δ7.89(t,J＝5.7Hz,1H),7.84(d,J＝9.2Hz,1H),7.74(t,J＝6.0Hz,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,1H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.56(d,J＝8.5Hz,1H),4.07–3.99(m,3H),3.95–3.73(m,4H),3.66–3.46(m,7H),3.17–2.98(m,4H),2.76(t,J＝2.6Hz,1H),2.41–2.31(m,2H),2.31–2.19(m,2H),2.10(s,3H),2.00(s,3H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.53(p,J＝6.9Hz,2H)。
实施例8-GalNAc连接子10的合成与表征
将化合物3(28.2g，63.0mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(1.93g，12.6mmol)溶于二氯甲烷(300mL)中，并冷却至0℃。向该溶液中依次加入二异丙基乙胺(13.2mL，75.6mmol)、2-[2-(2-丙炔氧基)乙氧基]乙胺(9.4mL，66.2mmol)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(36.3g，189mmol)，然后将反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物冷却至0℃，并用饱和氯化铵水溶液(150mL)淬灭。分离各层，并用二氯甲烷(3×150mL)萃取水相。合并的有机提取物用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过柱色谱法(0％->5％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到化合物11(33.7g，58.8mmol，93％)，为稠黄色油状物。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.85–7.78(m,2H),5.21(d,J＝3.4Hz,1H),4.96(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.48(d,J＝8.4Hz,1H),4.14(d,J＝2.4Hz,2H),4.06–3.99(m,3H),3.87(dt,J＝11.3,8.9Hz,1H),3.70(dt,J＝9.5,5.6Hz,1H),3.59–3.48(m,4H),3.44–3.36(m,4H),3.18(q,J＝5.8Hz,2H),2.10(s,3H),2.05(t,J＝7.0Hz,2H),2.00(s,3H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.54–1.38(m,4H)。
实施例9-GalNAc单体前体1的合成与表征
将化合物4(5.0g，8.92mmol)和1-羟基苯并三唑水合物(683mg，4.46mmol)溶于二氯甲烷(80mL)中，然后将反应混合物冷却至0℃。
依次加入二异丙基乙胺(3.4mL，19.6mmol)、4-戊烯-1-胺盐酸盐(1.09g，8.92mmol)和N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(5.13g，26.8mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15小时，然后用二氯甲烷(120mL)稀释并用氯化铵水溶液(60mL)淬灭。分离各层，并用二氯甲烷(3×50mL)萃取水相。合并的有机提取物用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过柱色谱法(3％->5％->10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到白色泡沫状化合物5(4.90g，7.81mmol，88％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.82(d,J＝9.3Hz,1H),7.74(t,J＝5.6Hz,1H),7.70(t,J＝5.6Hz,1H),5.80(ddt,J＝16.9,10.2,6.6Hz,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,1H),5.01(ddt,J＝17.2,2.3,1.6Hz,1H),4.98–4.93(m,2H),4.48(d,J＝8.5Hz,1H),4.08–3.98(m,3H),3.87(dt,J＝11.3,8.9Hz,1H),3.70(dt,J＝9.8,5.7Hz,1H),3.39(dt,J＝9.8,6.1Hz,1H),3.06–2.95(m,4H),2.10(s,3H),2.06–1.96(m,6H),2.00(s,3H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.53–1.31(m,10H),1.26–1.15(m,2H)。
将化合物5(3.00g，4.78mmol)溶于叔丁醇/水(1:1，50mL)中，并冷却至0℃。加入柠檬酸(918mg，4.78mmol)和4-甲基吗啉N-氧化物(599mg，5.11mmol)，然后加入二水合锇(VI)酸钾(18mg，0.048mmol。将反应物在0℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌14小时。将反应混合物在减压下浓缩，然后与乙腈(4×40mL)共沸，并在真空下干燥，得到化合物6，其无需进一步纯化即可使用。
将化合物6(3.16g，4.78mmol，假定)与吡啶(2×40mL)共沸并溶解在吡啶(45mL)中，然后在0℃下加入4,4’-二甲氧基三苯基甲基氯(1.70g，5.01mmol)。将反应物在室温下搅拌1小时(1530-1630)，然后用MeOH(1mL)淬灭并减压浓缩。粗产物通过柱色谱法(2％->3％->4％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到白色泡沫状化合物7(4.00g，4.15mmol，两步87％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.82(d,J＝9.2Hz,1H),7.74–7.66(m,2H),7.44–7.36(m,2H),7.34–7.17(m,7H),6.92–6.84(m,4H),5.21(d,J＝3.4Hz,1H),4.96(dd,J＝11.2,3.5Hz,1H),4.66(d,J＝5.4Hz,1H),4.48(d,J＝8.5Hz,1H),4.08–3.97(m,3H),3.87(dt,J＝11.3,8.9Hz,1H),3.73(s,6H),3.74–3.65(m,1H),3.64–3.54(m,1H),3.45–3.36(m,1H),3.04–2.94(m,4H),2.90(dd,J＝9.0,5.7Hz,1H),2.73(dd,J＝9.0,5.6Hz,1H),2.10(s,3H),2.06–1.96(m,4H),1.99(s,3H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.55–1.14(m,14H)。
实施例10-GalNAc单体前体2的合成与表征
将化合物35(3.0g，5.06mmol)和胺(0.646g，5.32mmol)溶于二氯甲烷(50mL)中，并冷却至0℃。依次加入DIPEA(1.940mL，11.14mmol)、HOBt.H2O(0.388g，2.53mmol)和EDC(2.911g，15.19mmol)。将反应混合物加热至室温并搅拌2.5小时。然后用二氯甲烷(50mL)稀释反应混合物，并用NH4Cl水溶液(50mL)淬灭。分离各层，并用二氯甲烷(3×50mL)萃取水相。将合并的有机提取物用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过柱色谱法(3％->5％->10％MeOH/DCM)纯化，得到白色泡沫状化合物36(3.37g，5.11mmol，100％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.82(ddt,J＝16.9,10.2,6.6Hz,2H),7.69(t,J＝6.0Hz,1H),5.82(dd,J＝6.6,0.1Hz,1H),5.22(d,J＝3.4Hz,1H),5.06–5.00(m,1H),4.99–4.93(m,2H),4.49(d,J＝8.5Hz,1H),4.07–3.99(m,3H),3.88(dt,J＝11.1,8.9Hz,1H),3.86(s,2H),3.71(dt,J＝9.3,5.6Hz,1H),3.61–3.51(m,4H),3.46–3.36(m,3H),3.25–3.16(m,2H),3.19–3.06(m,2H),2.11(s,3H),2.09–1.97(m,7H),1.90(s,3H),1.78(s,3H),1.57–1.39(m,6H)。
将化合物36(3.34g，5.06mmol)溶于tBuOH/水(1:1，50mL)中，并冷却至0℃。加入柠檬酸(973mg，5.06mmol)和NMO(635mg，5.42mmol)，然后加入K2OsO4.2H2O(19mg，0.051mmol)。将反应升温至室温并搅拌15小时。用NaHCO3水溶液(30mL)萃取反应混合物，然后用25％甲醇/二氯甲烷混合物(50mL×4)萃取，在真空下干燥2小时，得到化合物37，无需进一步纯化即可使用。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.84–7.77(m,2H),7.65(t,J＝5.9Hz,1H),5.22(d,J＝3.4Hz,1H),4.97(dd,J＝11.3,3.5Hz,1H),4.49(d,J＝8.4Hz,1H),4.43(t,J＝5.6Hz,1H),4.40(d,J＝5.0Hz,1H),4.08–3.98(m,3H),3.92–3.82(m,3H),3.71(dt,J＝9.7,5.7Hz,1H),3.61–3.51(m,4H),3.46–3.37(m,4H),3.30–3.17(m,4H),3.10(q,J＝6.7Hz,2H),2.11(s,3H),2.07(t,J＝7.1Hz,2H),2.00(s,3H),1.90(s,3H),1.78(s,3H),1.61–1.35(m,8H)。
将化合物37(3.08g，4.44mmol，假定)与吡啶(2×30mL)共沸，并用氩气吹扫。然后将化合物37溶于吡啶(45mL)中并冷却至0℃，然后加入DMTrCl(1.58g，4.66mmol)。然后使反应升温至室温并搅拌1小时。用甲醇(5mL)淬灭反应并减压浓缩。然后用NaHCO3(50mL)萃取反应物，并用二氯甲烷(3×50mL)洗涤。粗产物通过柱色谱法(0％->2％->3％->5％甲醇/1％三乙胺在二氯甲烷中)纯化，得到白色泡沫状化合物38(3.64g，3.65mmol，两步82％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.85–7.78(m,2H),7.66(t,J＝5.9Hz,1H),7.44–7.37(m,2H),7.35–7.18(m,7H),6.92–6.85(m,4H),5.22(d,J＝3.5Hz,1H),4.97(dd,J＝11.3,3.5Hz,1H),4.68(d,J＝5.4Hz,1H),4.49(d,J＝8.5Hz,1H),4.06–3.98(m,3H),3.93–3.80(m,3H),3.74(s,7H),3.66–3.50(m,5H),3.44–3.37(m,3H),3.19(q,J＝5.8Hz,2H),3.09(q,J＝6.5Hz,2H),2.91(dd,J＝9.0,5.6Hz,1H),2.78–2.69(m,1H),2.10(s,3H),2.06(t,J＝7.1Hz,2H),2.00(s,3H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.58–1.33(m,7H),1.30–1.19(m,1H)。
实施例11-GalNAc单体前体3的合成与表征
将化合物31(4.1g，7.05mmol)和胺(0.90g，7.40mmol)溶于二氯甲烷(70mL)中，并将反应混合物冷却至0℃。依次加入DIPEA(2.70mL，15.51mmol)、HOBt.H2O(0.540g，3.52mmol)和EDC(4.05g，21.15mmol)。然后将反应混合物冷却至0℃，用二氯甲烷(50mL)稀释，并用NH4Cl水溶液(50mL)淬灭，然后用二氯甲烷(3×70ml)萃取。然后将有机层合并，并用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过柱色谱法(3％->5％->10％->50％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到白色泡沫状化合物39(4.48g，6.91mmol，98％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.79(d,J＝9.2Hz,1H),7.70–7.63(m,1H),5.81(ddt,J＝16.9,10.2,6.6Hz,1H),5.22(d,J＝3.4Hz,1H),5.07–4.92(m,3H),4.56(d,J＝8.5Hz,1H),4.07–4.00(m,3H),3.93–3.84(m,3H),3.78(ddd,J＝10.9,5.4,3.9Hz,1H),3.65–3.45(m,15H),3.16–3.07(m,2H),2.11(s,3H),2.05–1.97(m,5H),1.90(s,3H),1.78(s,3H),1.57–1.45(m,2H).
将化合物39(4.48g，6.91mmol)溶于tBuOH/水(1:1，70mL)中，并冷却至0℃。加入柠檬酸(1.327g，6.91mmol)和NMO(0.866g，7.39mmol)，然后加入K2OsO4·2H2O(25mg，0.069mmol)。将反应升温至室温并搅拌15小时。用NaHCO3水溶液(40mL)萃取反应混合物，然后用25％甲醇/二氯甲烷混合物(50mL×4)萃取，在真空下干燥2小时，得到化合物40，无需进一步纯化即可使用。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.80(d,J＝9.2Hz,1H),7.66(t,J＝5.9Hz,1H),5.22(d,J＝3.4Hz,1H),4.98(dd,J＝11.2,3.5Hz,1H),4.56(d,J＝8.5Hz,1H),4.45(t,J＝5.5Hz,1H),4.41(d,J＝4.9Hz,1H),4.07–4.00(m,3H),3.90(dt,J＝11.1,8.9Hz,1H),3.86(s,2H),3.79(ddd,J＝10.9,5.4,3.9Hz,1H),3.62–3.46(m,15H),3.42–3.35(m,1H),3.30–3.18(m,2H),3.10(q,J＝6.7Hz,2H),2.11(s,3H),2.01(s,3H),1.90(s,3H),1.78(s,3H),1.61–1.49(m,1H),1.49–1.34(m,2H),1.27–1.12(m,1H)。
将化合物40(4.79g，7.02mmol，假设)与吡啶(10mL)共沸，并用氩气吹扫。然后将化合物40溶于吡啶(10mL)中并冷却至0℃，然后加入DMTrCl(2.50g，7.37mmol)。然后使反应升温至室温并搅拌1小时。用甲醇(5mL)淬灭反应物并减压浓缩。然后用NaHCO3(50mL)萃取反应物，并用二氯甲烷(3×50mL)洗涤。粗产物通过柱色谱法(0％->2％->3％->5％甲醇/1％三乙胺在二氯甲烷中)纯化，得到白色泡沫状化合物41(4.06g，4.12mmol，两步58.7％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.80(d,J＝9.2Hz,1H),7.65(t,J＝5.9Hz,1H),7.44–7.37(m,2H),7.35–7.16(m,7H),6.93–6.84(m,4H),5.22(d,J＝3.4Hz,1H),4.98(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.67(d,J＝5.3Hz,1H),4.56(d,J＝8.5Hz,1H),4.08–3.99(m,3H),3.94–3.87(m,1H),3.85(s,2H),3.83–3.70(m,7H),3.63–3.43(m,16H),3.09(q,J＝6.3Hz,2H),2.91(dd,J＝9.0,5.6Hz,1H),2.74(dd,J＝9.0,5.7Hz,1H),2.11(s,3H),2.00(s,3H),1.90(s,3H),1.78(s,3H),1.56–1.44(m,2H),1.43–1.32(m,1H),1.30–1.19(m,1H)。
实施例12-GalNAc单体前体4的合成与表征
将化合物28(2.3g，3.79mmol)和胺(0.484g，3.98mmol)溶于二氯甲烷(40mL)中，并将反应混合物冷却至0℃。然后依次加入DIPEA(1.45mL，8.34mmol)、HOBt.H2O(0.29g，1.90mmol)和EDC(2.18g，11.37mmol)。然后使反应混合物升温至室温并搅拌15小时。然后将反应混合物冷却至0℃并用二氯甲烷(40mL)稀释，并用NH4Cl水溶液(40mL)淬灭，然后用二氯甲烷(3×40mL)萃取。然后将有机层合并并用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过柱色谱法(3％->5％->10％MeOH/DCM)纯化，得到橙色液体的化合物42(2.77g，4.11mmol，99.8％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.83(d,J＝9.2Hz,1H),7.75(t,J＝5.6Hz,1H),7.67(t,J＝5.9Hz,1H),5.80(ddt,J＝16.9,10.2,6.6Hz,1H),5.22(d,J＝3.4Hz,1H),5.07–4.92(m,3H),4.57(d,J＝8.5Hz,1H),4.09–3.99(m,3H),3.95–3.86(m,1H),3.85(s,2H),3.80(ddd,J＝10.3,5.1,3.4Hz,1H),3.66–3.48(m,7H),3.13–2.98(m,4H),2.11(s,3H),2.07–1.97(m,7H),1.90(s,3H),1.78(s,3H),1.45(ddt,J＝20.4,14.8,7.1Hz,6H),1.27–1.15(m,2H)。
将化合物42(1.85g，2.75mmol)溶于tBuOH/水(1:1，15mL)中，并冷却至0℃。加入柠檬酸(528mg，2.75mmol)和NMO(345mg，2.94mmol)，然后加入K2OsO4.2H2O(10mg，0.027mmol)。将反应物在0℃下搅拌，并在15小时内缓慢升温至室温。将反应混合物减压浓缩，然后与乙腈(4×40mL)共沸，并在真空下干燥2小时，得到化合物43，其无需进一步纯化即可使用。
将化合物43(1.12g，1.59mmol，假定)与吡啶(2×30mL)共沸，并用氩气吹扫。然后将化合物43溶于吡啶(30mL)中并冷却至0℃，然后加入DMTrCl(0.56g，1.67mmol)。反应物在室温下搅拌1小时。反应物用甲醇(1mL)淬灭，减压浓缩，真空干燥过夜。粗产物通过柱色谱法(0％->2％->3％->5％MeOH/DCM)纯化，得到白色泡沫状化合物44(0.81g，0.80mmol，两步29％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.83(d,J＝9.2Hz,1H),7.71(t,J＝5.6Hz,1H),7.66(t,J＝5.9Hz,1H),7.45–7.37(m,2H),7.35–7.18(m,7H),6.93–6.84(m,4H),5.22(d,J＝3.4Hz,1H),4.99(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.67(d,J＝5.4Hz,1H),4.57(d,J＝8.5Hz,1H),4.08–3.99(m,3H),3.90(dt,J＝11.0,8.8Hz,1H),3.85(s,2H),3.80(ddd,J＝10.6,5.3,3.8Hz,1H),3.74(s,6H),3.65–3.48(m,8H),3.07(q,J＝6.8Hz,2H),3.00(q,J＝6.3Hz,2H),2.91(dd,J＝9.0,5.7Hz,1H),2.74(dd,J＝9.0,5.6Hz,1H),2.11(s,3H),2.06–1.98(m,5H),1.90(s,3H),1.78(s,3H),1.53–1.15(m,10H).
实施例13-GalNAc单体前体5的合成与表征
将化合物11(29.4g，51.4mmol)和5-碘脱氧尿苷(14.0g，39.5mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(160mL)中，并通过用氩气喷射脱气30分钟。加入三乙胺(27.6mL，114mmol)并恢复脱气10分钟。依次加入碘化铜(I)(753mg，3.95mmol，)和四(三苯基膦)钯(0)(1.83g，1.58mmol)，然后将反应物在氩气下室温搅拌24小时。在减压下除去溶剂，并通过柱色谱法(0->7％->10％甲醇/二氯甲烷)纯化粗产物，得到呈琥珀色泡沫状的化合物12(24.8g，31.0mmol，78％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.64(s,1H),8.25(s,1H),7.87–7.78(m,2H),6.11(t,J＝6.6Hz,1H),5.24(d,J＝4.3Hz,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,1H),5.12(t,J＝5.0Hz,1H),4.96(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.48(d,J＝8.4Hz,1H),4.33(s,2H),4.27–4.19(m,1H),4.07–3.98(m,3H),3.87(dt,J＝11.2,8.9Hz,1H),3.80(q,J＝3.3Hz,1H),3.70(dt,J＝9.5,5.7Hz,1H),3.65–3.50(m,6H),3.45–3.36(m,3H),3.22–3.15(m,2H),2.16–2.11(m,2H),2.10(s,3H),2.05(t,J＝7.0Hz,2H),2.00(s,3H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.54–1.39(m,4H).
将化合物12(26.8g，33.6mmol)与吡啶(2×50mL)共沸，并在氩气气氛下溶解于吡啶(150mL)中。将溶液冷却至0℃，然后加入4,4-二甲氧基三苯甲基氯化物(13.6g，40.3mmol)。将反应物在室温下搅拌1小时，然后用MeOH(20mL)淬灭并减压浓缩。粗产物通过柱色谱法(2％->5％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到白色泡沫状化合物13(29.1g，26.4mmol，79％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.63(s,1H),7.98(s,1H),7.84–7.76(m,2H),7.43–7.35(m,2H),7.35–7.26(m,6H),7.26–7.18(m,1H),6.93–6.84(m,4H),6.11(t,J＝6.6Hz,1H),5.33(d,J＝4.5Hz,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,1H),4.96(dd,J＝11.3,3.4Hz,1H),4.48(d,J＝8.5Hz,1H),4.30–4.22(m,1H),4.13(d,J＝16.1Hz,1H),4.08(d,J＝16.0Hz,1H),4.05–3.99(m,3H),3.94–3.89(m,1H),3.86(dt,J＝11.1,8.8Hz,1H),3.73(s,6H),3.73–3.66(m,1H),3.46–3.32(m,7H),3.26–3.08(m,4H),2.28(dt,J＝13.3,6.6Hz,1H),2.19(ddd,J＝13.4,6.3,3.6Hz,1H),2.10(s,3H),2.05(t,J＝7.0Hz,2H),1.99(s,3H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.54–1.37(m,4H).
实施例14-GalNAc单体前体6的合成与表征
将化合物12(1.57g，1.97mmol)溶于MeOH(20mL)中，随后加入Pd/C(10wt％，628mg，0.590mmol)。将反应物在氢气气氛(40psi)下室温搅拌24小时。反应混合物经硅藻土垫过滤并减压浓缩，得到黄色泡沫状化合物15(1.50g，1.87mmol，95％)，无需进一步纯化即可使用。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ11.29(s,1H),7.88–7.79(m,2H),7.68(s,1H),6.17(t,J＝6.8Hz,1H),5.26(dd,J＝4.2,0.9Hz,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,1H),5.05(t,J＝5.0Hz,1H),4.96(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.47(d,J＝8.5Hz,1H),4.27–4.21(m,1H),4.05–3.99(m,3H),3.97–3.81(m,1H),3.80–3.65(m,2H),3.64–3.28(m,10H),3.22–3.12(m,3H),2.28–2.13(m,2H),2.13–2.02(m,7H),2.00(s,3H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.74–1.57(m,2H),1.55–1.35(m,4H).
将化合物15(1.40g，1.74mmol)与吡啶(2×10mL)共沸，并在氩气气氛下溶解于吡啶(10mL)中。将溶液冷却至0℃，然后加入4,4-二甲氧基三苯甲基氯化物(620mg，1.83mmol)。将反应物在室温下搅拌1小时，然后用MeOH(2mL)淬灭并减压浓缩。粗产物通过柱色谱法(2％->5％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到白色泡沫状化合物16(1.0g，0.905mmol，52％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.33(s,1H),7.84–7.74(m,2H),7.42–7.36(m,3H),7.35–7.28(m,2H),7.27–7.20(m,5H),6.93–6.84(m,4H),6.20(t,J＝6.8Hz,1H),5.33(d,J＝4.6Hz,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,1H),4.96(dd,J＝11.3,3.4Hz,1H),4.48(d,J＝8.4Hz,1H),4.30(dq,J＝7.9,4.1Hz,1H),4.07–3.97(m,3H),3.93–3.81(m,2H),3.78–3.65(m,7H),3.46–3.35(m,7H),3.23–3.10(m,6H),2.29–2.20(m,1H),2.20–2.12(m,1H),2.10(s,3H),2.04(t,J＝7.1Hz,2H),1.99(s,3H),1.97–1.81(m,5H),1.77(s,3H),1.54–1.37(m,6H).
实施例15-GalNAc酰胺单体3(ptGal亚磷酰胺单体)的合成与表征
将化合物13(20.8g，18.9mmol)与二氯甲烷(2×50mL)共沸并干燥过夜，然后溶解在无水二氯甲烷(190mL)中并冷却至0℃。将2-氰基乙基N,N,N’,N’-四异丙基磷二酰胺(7.2mL，22.7mmol)和4,5-二氰基咪唑(2.23g，18.9mmol)加入反应混合物中，并在0℃下搅拌2小时。反应物用二氯甲烷(500mL)稀释，依次用碳酸氢钠水溶液(2×100mL)和盐水(1×100mL)洗涤，然后用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过柱色谱法(0％->5％->7％甲醇/乙酸乙酯)纯化，得到白色泡沫状的化合物14–ptGal亚磷酰胺单体(20.2g，15.5mmol，82％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.71(s,1H),8.02(d,J＝1.2Hz,1H),7.84–7.78(m,2H),7.44–7.36(m,2H),7.36–7.18(m,7H),6.92–6.83(m,4H),6.10(dt,J＝9.1,6.7Hz,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,1H),4.96(dd,J＝11.2,3.5Hz,1H),4.51–4.45(m,1H),4.20–4.06(m,2H),4.06–3.98(m,5H),3.87(dt,J＝11.3,8.9Hz,1H),3.78–3.65(m,8H),3.65–3.44(m,3H),3.44–3.33(m,8H),3.29–3.22(m,1H),3.21–3.12(m,2H),2.76(t,J＝5.9Hz,1H),2.64(t,J＝5.9Hz,1H),2.47–2.28(m,2H),2.10(s,3H),2.05(t,J＝7.0Hz,2H),2.01–1.97(m,3H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.53–1.38(m,4H),1.15–1.06(m,9H),0.97(d,J＝6.8Hz,3H).
31P NMR(162MHz,DMSO)δ147.54,147.15.
实施例16-GalNAc酰胺单体5(tGal亚磷酰胺单体)的合成与表征
将化合物16(1.0g，0.905mmol)与二氯甲烷(2×10mL)共沸并干燥过夜，然后溶解在无水二氯甲烷(10mL)中并冷却至0℃。将2-氰基乙基N,N,N’,N’-四异丙基磷二酰胺(0.34mL，1.09mmol)和4,5-二氰基咪唑(107mg，0.905mmol)加入反应混合物中，并在0℃下搅拌2小时。反应混合物用二氯甲烷(70mL)稀释，依次用碳酸氢钠水溶液(2×15mL)和盐水(1×15mL)洗涤，然后用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过柱色谱法(2％->5％甲醇/乙酸乙酯)纯化，得到白色泡沫状化合物17–tGal亚磷酰胺单体(1.0g，0.766mmol，84％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.35(s,1H),7.88–7.72(m,2H),7.45–7.35(m,3H),7.34–7.27(m,2H),7.27–7.20(m,5H),6.92–6.83(m,4H),6.19(td,J＝6.8,3.3Hz,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,1H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.58–4.50(m,1H),4.48(d,J＝8.5Hz,1H),4.08–3.96(m,4H),3.87(dt,J＝11.1,8.9Hz,1H),3.79–3.65(m,8H),3.65–3.45(m,4H),3.44–3.38(m,4H),3.31–3.18(m,4H),3.20–3.11(m,4H),2.76(t,J＝5.9Hz,1H),2.64(t,J＝5.9Hz,1H),2.43–2.23(m,2H),2.10(s,3H),2.04(t,J＝7.1Hz,2H),2.01–1.91(m,5H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.45(d,J＝6.2Hz,6H),1.15–1.06(m,9H),0.97(d,J＝6.8Hz,3H).
实施例17-GalNAc酰胺单体6(gGal亚磷酰胺单体)的合成与表征
将化合物7(1.85g，1.92mmol)与乙腈(2×20mL)共沸，然后溶解于无水二氯甲烷(20mL)中并冷却至0℃。在此温度下加入2-氰基乙基N,N,N’,N’-四异丙基磷二酰胺(868mg，2.88mmol)，然后加入4,5-二氰基咪唑(227mg，1.92mmol)。将反应物在0℃下搅拌1.5小时，然后用二氯甲烷(40mL)稀释，并用碳酸氢钠水溶液(10mL)猝灭。分离各层，用二氯甲烷(3×20mL)萃取水相。合并的有机提取物用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过柱色谱法(3％->5％甲醇/乙酸乙酯)纯化，得到白色泡沫状的化合物8-gGal亚磷酰胺单体(1.6g，1.37mmol，72％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.82(d,J＝9.2Hz,1H),7.75–7.65(m,2H),7.44–7.36(m,2H),7.35–7.17(m,7H),6.92–6.82(m,4H),5.21(d,J＝3.4Hz,1H),4.96(dd,J＝11.2,3.5Hz,1H),4.48(d,J＝8.5Hz,1H),4.05–3.98(m,3H),3.97–3.82(m,2H),3.77–3.47(m,10H),3.41(dd,J＝11.1,5.1Hz,2H),3.10–2.78(m,6H),2.75(t,J＝5.9Hz,1H),2.58(dt,J＝6.8,5.1Hz,1H),2.10(s,3H),2.05–1.96(m,7H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.53–1.28(m,12H),1.24–1.03(m,11H),1.00(d,J＝6.7Hz,3H).31P NMR(162MHz,DMSO)δ147.53,147.51.
实施例18-GalNAc固体载体1的合成与表征
在室温下将化合物7(350mg，0.363mmol)溶于二氯甲烷(7mL)中，然后依次加入琥珀酸酐(73mg，0.726mmol)、4-二甲氨基吡啶(89mg，0.726mmol)和三乙胺(0.3mL，2.18mmol)。将反应物在室温下搅拌64小时，然后真空浓缩至干。粗产物通过柱色谱法(0->20％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到白色泡沫状的化合物9(386mg，0.363mmol)。
在室温下将化合物9(386mg，0.363mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，然后向反应混合物中加入LCAA CPG(2.7g，0.221mmol，氨基含量82umol/g)、N,N-二异丙基乙胺(0.116mL，0.664mmol)和N,N,N’,N’-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(126mg，0.332mmol)。将反应物在室温下静置24小时，偶尔轻轻旋转以确保均匀性。过滤收集CPG，并在过滤器上用二氯甲烷(3×10mL)洗涤，然后真空干燥16小时。
CPG用Cap A(乙酸酐在四氢呋喃和吡啶中，5mL)和Cap B(N-甲基咪唑在乙腈和吡啶中的，5mL)的混合物处理，并在室温下静置2小时，偶尔轻轻旋转以确保均匀性。过滤收集gGal-CPG(化合物10)，并在过滤器上用二氯甲烷(5×10mL)洗涤，然后真空干燥16小时。
实施例19-GalNAc缀合的寡核苷酸1((gGal)3-oligo)和GalNAc缀合的siRNA1((g Gal)3-siRNA)的合成和表征
在MerMade 48合成器上使用尿苷、胸苷、4-N-乙酰胞苷、6-N-苯甲酰基腺苷和2-N-异丁酰基鸟苷的市售的5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯基)-2’-脱氧-、5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯基)-2’-脱氧-2’-氟-和5’-O(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-甲基-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基)磷酰胺单体，使用标准固相寡核苷酸合成和脱保护方案合成反义链。在有义链合成中，分别使用GalNAc CPG和GalNAc酰胺单体。反义链和有义链是英克西兰的那些，分别对应于SEQ ID NO:4和8。
英克西兰是一种抗PCSK9的合成siRNA，并且例如在Fitzgerald等人，NEJM(2017)376(1):41-51和WO 2014/089313A1中描述(这两个文献通过引用整体并入本文)。siRNA的有义链与三元N-乙酰半乳糖胺(triGalNAc)配体缀合。抑制性核酸英克西兰(品牌名：)抑制PCSK9的基因表达，并在欧盟被批准用于治疗血脂异常和高胆固醇血症。
首先在gGal CPG上进行固相合成，在两个反应循环中依次与gGal亚磷酰胺偶联，然后进行标准的寡核苷酸合成。利用0.1M DDTT在吡啶中通过亚磷酸盐的氧化引入硫代磷酸键。在55℃下用甲胺水溶液裂解和脱保护4小时后，获得粗态的(gGal)3-oligo(GalNAc缀合的寡核苷酸1)，并通过阴离子交换高效液相色谱(IEX-HPLC)进一步纯化。将纯馏分合并、浓缩和脱盐。通过LCMS证实了纯化的寡核苷酸的完整性。包含缀合在与英克西兰有义链匹配的寡核苷酸3’端的(gGal)3的缀合物的LC/UV色谱图和去卷积质谱显示：保留时间＝5.927分钟，目标质量＝8678.2Da，观察质量＝8676.8Da，质量误差＝-1.4Da(-0.016％)，％估计纯度＝64.62％。
将等摩尔量的互补有义链和反义链混合并通过加热至95℃退火，然后缓慢冷却以获得所需的(gGal)3-siRNA(GalNAc缀合的siRNA 1)。(gGal)3-siRNA缀合物：包含英克西兰的双链siRNA序列和与3'有义链缀合的(gGal)3的缀合物具有8.975分钟的保留时间和96.8％的％峰面积。
实施例20-GalNAc缀合的寡核苷酸2((ptGal)3-oligo)和GalNAc缀合的siRNA 2 ((pt Gal)3-siRNA)的合成和表征
在MerMade 48合成器上使用尿苷、胸苷、4-N-乙酰胞苷、6-N-苯甲酰腺苷和2-N-异丁酰基鸟苷的市售的5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯基)-2’-脱氧-、5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯基)-2’-脱氧-2’-氟-和5’-O(4,4’-二甲基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基)磷酰胺单体，使用标准固相寡核苷酸合成和脱保护方案合成反义链。在有义链合成中，分别使用GalNAc CPG和GalNAc酰胺单体。反义链和有义链是英克西兰的那些，分别对应于SEQID NO:4和9。
首先在通用载体上进行固相合成，在三个反应循环中依次与ptGal亚磷酰胺偶联，然后进行标准的寡核苷酸合成。利用0.1M DDTT在吡啶中通过亚磷酸盐的氧化引入硫代磷酸键。在55℃下用甲胺水溶液裂解和脱保护4小时后，获得粗态的(ptGal)3-oligo(GalNAc缀合的寡核苷酸2)，并通过阴离子交换高效液相色谱(IEX-HPLC)进一步纯化。将纯馏分合并、浓缩和脱盐。通过LCMS证实了纯化的寡核苷酸的完整性。包含缀合在与英克西兰有义链匹配的寡核苷酸3’端的(ptGal)3的缀合物的LC/UV色谱图和去卷积质谱显示：保留时间＝5.817分钟，目标质量＝9089.1Da，观察质量＝9089.6Da，质量误差＝0.5Da(0.006％)，％估计纯度＝91.96％。
将等摩尔量的互补有义链和反义链混合并通过加热至95℃退火，然后缓慢冷却以获得所需的(ptGal)3-siRNA(GalNAc缀合的siRNA 2)。包含英克西兰的双链siRNA序列和与3'有义链缀合的(ptGal)3的缀合物的保留时间＝8.936分钟，％峰面积＝95.4％。
实施例21-GalNAc缀合的寡核苷酸3((tGal)3-oligo)和GalNAc缀合的siRNA 3((t Gal)3siRNA)的合成和表征
在MerMade 48合成器上使用尿苷、胸苷、4-N-乙酰胞苷、6-N-苯甲酰基腺苷和2-N-异丁酰基鸟苷的市售的5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯基)-2’-脱氧-、5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯基)-2’-脱氧-2’-氟-和5’-O(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-甲基-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基)磷酰胺单体，使用标准固相寡核苷酸合成和脱保护方案合成反义链。在有义链合成中，分别使用GalNAc CPG和GalNAc酰胺单体。反义链和有义链是英克西兰的那些，分别对应于SEQ ID NO:4和10。
首先在通用载体上进行固相合成，在三个反应循环中依次与tGal亚磷酰胺偶联，然后进行标准的寡核苷酸合成。利用0.1M DDTT在吡啶中通过亚磷酸盐的氧化引入硫代磷酸键。在55℃下用甲胺水溶液裂解和脱保护4小时后，获得粗态的(tGal)3-oligo(GalNAc缀合的寡核苷酸3)，并通过阴离子交换高效液相色谱(IEX-HPLC)进一步纯化。将纯馏分合并、浓缩和脱盐。通过LCMS证实了纯化的寡核苷酸的完整性。
包含缀合在与英克西兰有义链匹配的寡核苷酸3’端的(tGal)3的缀合物的LC/UV色谱图和去卷积质谱显示：保留时间＝5.905分钟，目标质量＝990.6Da，观察质量＝9098.7Da，质量误差＝-1.9Da(-0.021％)，％估计纯度＝89.34％。
将等摩尔量的互补有义链和反义链混合并通过加热至95℃退火，然后缓慢冷却以获得所需的(tGal)3-siRNA(GalNAc缀合的siRNA 3)。包含英克西兰的双链siRNA序列和与3'有义链缀合的(tGal)3的缀合物的保留时间＝8.898分钟，％峰面积＝96.1％。
实施例22-GalNAc单体siRNA缀合物对PCSK9抑制作用的体外评价
如下评价实施例19至21的(ptGal)3-siRNA,(tGal)3-siRNA和(gGal)3-siRNA在体外抑制PCSK9的蛋白质表达的能力。
人肝细胞癌HuH7细胞系(Cellosaurus登录号：CVCL_0336)在37℃和5％ CO2的湿润培养箱中用补充有10％FBS、1％丙酮酸钠和1％PenStrep的DMEM高糖培养。
所测试的siRNA为(ptGal)3-siRNA、(tGal)3-siRNA、(gGal)3-siRNA、临床级英克西兰和内部合成的英克西兰(triGalNAc-siRNA)。使用RNAimax将工作浓度为10nM、1nM、0.5nM、0.25nM、0.125nM、0.0625nM、0.03125nM、0.015625nM、0.003125nM和0.000625nM的siRNA转染到HuH-7细胞中。转染后3天，通过ELISA测定上清液中的PCSK9蛋白。基于PCSK9蛋白的表达确定IC50值。
结果如图1、图2和图3所示。
(ptGal)3-siRNA显示出与临床级英克西兰(以销售)和内部合成的英克西兰(标记为triGal-siRNA)相似的IC50值(p>0.05)。(图1)。
(tGal)3-siRNA显示出与临床分级英克西兰(以销售)相似的IC50值(p>0.05)(图2)。
(gGal)3-siRNA有效抑制PCSK9的基因表达，其IC50为0.1483nM，低于本实验中测定的英克西兰(以销售)的IC50(图3)。
靶向PCSK9的寡核苷酸缀合物((ptGal)3-siRNA、(tGal)3-siRNA、(gGal)3-siRNA)能够在体外有效地敲低PCSK9，并且在某些情况下具有比triGalNAc缀合的英克西兰更大的效力。
实施例23-GalNAc单体-siRNA缀合物对PCSK9抑制作用的体内评价
测试了(ptGal)3-siRNA、(tGal)3-siRNA和(gGal)3-siRNA在hPCSK9敲除小鼠中减少PCSK9蛋白产生的能力。
通过皮下注射以2mg/kg的单次剂量给予siRNA。用ELISA法测定hPCSK9蛋白血清水平。在(ptGal)3-siRNA注射后49天、tGal-siRNA注射后48天和(gGal)3-siRNA注射前32天测定siRNA对PCSK9蛋白减少的影响。将每种siRNA与进行比较，在(gGal)3-siRNA的情况下，也与未缀合的siRNA进行比较。使用具有英克西兰寡核苷酸序列但不携带任何GalNAc部分的未缀合的siRNA作为阴性对照。
图4A-4B、5A-5B和6A-6B显示了以2mg/kg给药时siRNA的体内功效和持续时间。根据本发明的GalNAc缀合物产生的hPCSK9蛋白敲除功效与的功效相似，因为在功效和持续时间方面没有观察到统计学上的显著差异。正如预期的那样，未缀合的siRNA不能调节hPSK9的产生，因为它不能到达肝细胞。
靶向PCSK9的寡核苷酸缀合物((ptGal)3-siRNA、(tGal)3-siRNA、(gGal)3-siRNA)能够被递送到肝细胞中，因此在体内有效地降低hPCSK9蛋白的产生。
本发明人还观察到在用寡核苷酸缀合物((ptGal)3-siRNA、(tGal)3-siRNA、(gGal)3-siRNA)处理的hPCSK9敲除小鼠中没有肝毒性。
序列表
在上表的序列中，G＝鸟苷-3'-磷酸，C＝胞苷-3'-磷酸，U＝尿苷-3'-磷酸，T＝胸苷-3'-磷酸，A＝腺苷-3'-磷酸，dA＝脱氧腺苷-3'-磷酸，dT＝脱氧胸苷-3'-磷酸，dU＝脱氧尿苷-3'-磷酸，mU＝2'-O-甲基尿苷-3'磷酸，mA＝2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸，mG＝2'-O-甲基鸟苷-3'-磷酸，mC＝2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸，(mU)ps＝2'-O-甲基尿苷-3'-硫代磷酸，(mA)ps＝2'-O-甲基腺苷-3'-硫代磷酸，(mG)ps＝2'-O-甲基鸟苷-3'-硫代磷酸，(mC)ps＝2'-O-甲基胞苷-3'-硫代磷酸，fU＝2'-氟尿苷-3'-磷酸，fA＝2'-氟腺苷-3'-磷酸，fG＝2'-氟鸟苷-3'-磷酸，fC＝2'-氟胞苷-3'-磷酸，(fC)ps＝2'-氟胞苷-3'-硫代磷酸，(fG)ps＝2'-氟鸟苷-3'-硫代磷酸，(fA)ps＝2'-氟腺苷-3'-硫代磷酸，(fU)ps＝2'-氟尿苷-3'-硫代磷酸，ps＝3'-硫代磷酸，(TriGal)＝三触角型N-乙酰半乳糖胺，(gGal)＝式2单体，例如式(C)单体，(ptGal)＝式3a单体，例如式(A)单体，(tGal)＝式3单体，例如式(B)单体。
参考文献
为了更全面地描述和公开本发明以及本发明所涉及的现有技术状态，上面引用了许多出版物。下文提供了这些参考文献的完整引文。这些参考文献中的每一个的全部内容都并入此文。
US 8106022 B2
US 10781175 B2
US 10131907 B2
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WO 2021/032777 A1
Hofmeister,A等人.医学化学杂志.2021,64,6838-6855.

Claims (21)

1.一种式3所示化合物：
或其药学上可接受的盐；
其中
R1是O-PN(C1-4烷基)2OCH2CH2CN、OH、连接寡核苷酸的亚磷酰胺键、或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸键连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；
R2是H或保护基团；
R4是H、OH、OC1-4烷基或卤素；
L为-(W-Y)k-W-X-；
k是0到5；
每个W独立地为L1或L2；
每个L1是(CH2)n，其中n独立地为1至25；
每个L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m独立地为1-24，并且Het独立地为杂原子；
X是键、Het、-CH2-、-CO-、*O-CH2-CO、*-(Het)CH2C≡C-或*-CH2C≡C-，其中*如果存在表示与W的连接点；和
每个Y独立地为CONZ、O-CH2-CONZ、NZCO、SO2NZ、O-H2SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基；并且其中
GalNAc可以被保护，也可以未被保护。
2.一种式2所示化合物
或其药学上可接受的盐；
其中
R1是O-PN(C1-4烷基)2OCH2CH2CN、OH、连接寡核苷酸的亚磷酰胺键、或通过琥珀酸、二甘醇或氢醌-O,O’-二乙酸键连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)；
R2是H或保护基团；
每个R3独立地为C1-4烷基、OC1-4烷基、C1-4卤代烷基、OC1-4卤代烷基或H；
L为-(W-Y)k-W-X-；
k是0到5；
每个W独立地为L1或L2；
每个L1是(CH2)n，其中n独立地为1至25；
每个L2是CH2CH2(HetCH2CH2)m，其中m独立地为1-24，并且Het独立地为杂原子；
X是键、Het、-CH2-、-CO-、*O-CH2-CO、*-(Het)CH2C≡C-或*-CH2C≡C-，其中*如果存在表示与W的连接点；和
每个Y独立地为CONZ、O-CH2-CONZ、NZCO、SO2NZ、O-H2SO2NZ或NZSO2，其中Z为H、C1-4烷基或保护基；并且其中
GalNAc可以被保护，也可以未被保护。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，每个R3，如果存在，为H。
4.如前述任一项权利要求所述的化合物，其特征在于，所述化合物是用于寡核苷酸合成的单体，并且R1是
5.如前述任一项权利要求所述的化合物，其特征在于，
L是-L1-X-、-L1-Y-L1-X-、-L1-Y-L2-X-、-L2-X-、L2-Y-L1-X-或-L2-Y-L2-X-；
其中，
每个L1是(CH2)n，其中n独立地为2至10；
每个L2是CH2CH2(OCH2CH2)m，其中m独立地为1-5；
X是键、-CH2-、-CO-、-O-、*-(Het)CH2C≡C-或*-CH2C≡C-，其中*如果存在表示与W的连接点；和
每个Y为CONZ，其中Z为H、C1-4烷基或保护基。
6.如前述任一项权利要求所述的化合物，其特征在于，每个L1，如果存在，n独立地为4-9。
7.如前述任一项权利要求所述的化合物，其特征在于，每个L2，如果存在，Het为-O-。
8.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，m是1、2、3或4，任选地m是1、2或3。
9.如权利要求2或其任一项从属权利要求所述的化合物，其特征在于，X是-CO-。
10.如权利要求1和4-8任一项所述的化合物，其特征在于，X是-O-。
11.如前述任一项权利要求所述的化合物，其特征在于，L(或Lb，如果存在)为-(CH2)2O-、-(CH2)4-CO-、-(CH2)9-CO-、-(CH2)4-CONH-CH2CH2OCH2CH2-、-(CH2)5-CONH-(CH2)4-CO-、-(CH2)4-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)-O-或-(CH2)4-CONH-CH2CH2(OCH2CH2)-O-(CH2)C≡C-。
12.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自：
和，当所述化合物含有炔键，所述键被完全氢化的相应化合物；
及其药学上可接受的盐。
13.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自：
和，当所述化合物含有炔键时，所述键被完全氢化的相应化合物；
及其盐。
14.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1是通过琥珀酸键连接的聚苯乙烯珠或长链烷基胺控孔玻璃(LCAA-CPG)，并且任选地所述化合物选自：
其中所述圆圈表示LCAA-CPG或聚苯乙烯珠及其盐；
以及，当所述化合物含有炔键时，所述键被完全氢化的相应化合物。
15.一种寡核苷酸，其包含如前述任何权利要求中定义的化合物或使用如前述任何权利要求中定义的化合物制备。
16.一种寡核苷酸，其包含至少一种下式的单体残基：
(A)
(B)
(C)
其中，X是S或O。
17.如权利要求16所述的寡核苷酸，其任选地在3’端，包含下式单体残基的三个连续拷贝：
(A)
(B)或
(C)
其中，X是S或O。
18.如权利要求16或17所述的寡核苷酸，其特征在于，X是S。
19.一种选自图7所示的寡核苷酸，其特征在于，波浪线表示寡核苷酸链。
20.如权利要求15-18任一项所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸是抑制性核酸，任选地siRNA。
21.一种选自图8所示的siRNA，其特征在于，波浪线表示RNA链。
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