CN117624266A - 一种肝靶向化合物及其寡核苷酸缀合物、偶联方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种肝靶向化合物及其寡核苷酸缀合物、偶联方法及应用。本发明提供的肝靶向化合物具有式(I)所示的结构。本发明还提供了该化合物与相应的寡核苷酸偶联形成的缀合物，其具有式(II)所示结构，该寡核苷酸缀合物可用于调控肝细胞中的基因表达，进一步用于制备预防和/或治疗相关疾病的药物。该缀合物能够特异性靶向肝细胞，在保持所递送的寡核苷酸高度稳定的同时，还具有优良的递送效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种肝靶向化合物及其寡核苷酸缀合物、偶联方法及应用。
背景技术
寡核苷酸化合物在医学上有重要的治疗应用，具体治疗应用中，可选择仅在特定组织或位置表达寡核苷酸及其类似物，从而针对特定靶点处的相关疾病进行治疗。利用RNA干扰技术，可以设计合适的siRNA，特异性的靶向产生某种蛋白的目标mRNA使其降解，从而达到抑制相关蛋白生成，治疗疾病的目的。采用靶向载体缀合siRNA，利用载体与特定细胞膜表面受体结合，使其缀合的siRNA通过内吞进入细胞内，是一种广泛使用的药物递送方式。去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)在肝细胞表面特异性表达，半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺等糖分子对ASGPR具有高亲和性。文献J.Am.Chem.Soc.2014,136,49,16958-16961.报道了一系列使用二价或三价胺基半乳糖分子簇(GalNAc)的化合物，可以有效递送RNA至肝细胞。
不同载体化合物的结构会显著影响递送的siRNA在体内的活性，更高的递送效率意味着更低的siRNA给药剂量和更低的毒副作用。
因此，本领域仍有开发载体化合物的需求，以期达到更高的递送效率。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明设计合成了一系列新型的四价、六价的载体化合物，这些化合物大多具有对称性结构，可以被更简便的合成出来，同时也具有更高的递送效率。
本发明第一方面提供一种肝靶向化合物，具有式(Ⅰ)所示的结构：
其中，R为对哺乳动物肝脏表面去唾液酸糖蛋白受体具有亲和力的配体基团，所述配体基团中含有羟基和胺基，且所述羟基、胺基部分或全部可被乙酰基保护，R1为氧、硫、硒、亚甲基中的任意一种，优选为亚甲基；R2为羟基保护基；n1为1-5的整数，优选1；n2为4-10的整数，优选4；M+为阳离子。
进一步，R具有如下结构：
其中，R4为氧、硫、硒、亚甲基中的任意一种，优选氧原子；R3为含N-乙酰半乳糖胺类肝靶向化合物，n3为1-5的整数，优选1；n4为1-8的整数，优选1、2、3、4、5。
进一步，所述R3具有如下结构：
其中，R5为含N-乙酰半乳糖胺类肝靶向化合物，R6为氧、硫、硒、亚甲基中的任意一种，优选亚甲基；n5为1-6的整数，优选1；n6为1-8的整数，优选1。
进一步，R5为N-乙酰基半乳糖胺化合物，具有如下结构：
其中，R7为氢、乙酰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基，优选乙酰基。
进一步，M+选自氢离子、铵离子、有机胺离子、碱金属离子或碱土金属离子中的任意一种，优选为氢离子；
R2选自三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4，4’-双甲氧基三苯甲基、4，4’，4”-三甲氧基三苯甲基中的任意一种，优选为4，4’-双甲氧基三苯甲基(DMTr)。
进一步，所述肝靶向化合物具有以下结构：
本发明第二方面提供上述肝靶向化合物与寡核苷酸偶联的方法，包括以下步骤：
(1)将式(I)化合物连接于固相载体上，所述固相载体为表面为羟基或胺基的高分子聚合物载体；
(2)连接于固相载体的化合物(Ⅰ)通过脱保护工序脱去羟基保护基，在偶联反应条件下，将脱去羟基保护基的化合物与核苷酸单体接触，连接上第一个核苷酸；
(3)通过亚磷酰胺固相合成方法合成所述寡核苷酸；
(4)将所述寡核苷酸与所述固相载体切割，分离纯化，退火，得到寡核苷酸缀合物。
本发明第三方面提供一种寡核苷酸缀合物，具有式(II)所示的结构：
其中，R、R1、n1、n2如上述式(I)肝靶向化合物中所定义；Nu代表功能性寡核苷酸；表示基团通过共价键连接的位点。
进一步，所述寡核苷酸缀合物具有以下结构：
进一步，所述功能性寡核苷酸为单链寡核苷酸或者双链寡核苷酸。
进一步，所述功能性寡核苷酸选自小干扰RNA(siRNA)、微小RNA、核酸适配体、反义核酸、mRNA片段中的任意一种。
进一步，所述功能性寡核苷酸为单链寡核苷酸，式(Ⅱ)中的P连接到所述单链寡核苷酸的末端；优选地，式(Ⅱ)中的P连接到所述单链寡核苷酸的3’末端。
进一步，所述功能性寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含正义链(又称SS链)和反义链(又称AS链)，式(Ⅱ)中的P连接到所述正义链的3’末端。
进一步，所述双链寡核苷酸为siRNA。
可选的，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立的为修饰或未修饰的核苷酸，所述siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链和反义链包含19-23个核苷酸并且至少部分反向互补形成双链区，所述反义链与靶mRNA中的一段核苷酸序列至少部分反向互补，所述靶mRNA是指在肝细胞中异常表达的基因对应的mRNA；可选的，所述靶mRNA选自以下基因对应的mRNA中的一种：ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、HBV、TTR和AGT。
本文中使用的术语“反向互补”具有本领域技术人员周知的含义，即在双链核苷酸分子中，一条链的碱基与另一条链上的碱基以互补的方式配对。例如，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)或者尿嘧啶(U)相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(C)始终与嘧啶碱基(G)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤碱基和一个嘧啶碱基。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此互补的，可以从其互补链的序列推断出该链的序列。
式(Ⅱ)所述的寡核苷酸缀合物，其中，正义链或反义链中至少一个核苷酸为经过化学修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基。化学修饰的核苷酸，例如，核苷酸的核糖基2’位的羟基被氟取代或者被非氟官能团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。其他对于核苷酸的化学修饰可参见文献J.Med.Chem.2016,59,21,9645–9667.的报道。
本发明还提供了提供式(I)化合物以及式(Ⅱ)寡核苷酸缀合物的制备方法。
式(Ⅰ)化合物可通过常规的取代反应、酯化反应、酰胺化反应来制备，有多种缩合剂可用于酰胺化反应的制备，本领域技术人员可容易的参考文献例如Org.ProcessRes.Dev.2022,26,1562-1689.进行此类化合物的合成。
式(Ⅱ)化合物可通过本领域技术人员熟知的固相合成方法制备。固相合成通过脱保护、偶联、氧化、盖帽工序，循环往复延长核苷酸序列如下：
在一些具体的实施例中，式(Ⅰ)化合物连接至siRNA正义链的3’端，本发明的siRNA缀合物的制备方法包括：
(1)式(Ⅰ)化合物连接于固相载体上，固相载体可使用表面为羟基或胺基的高分子聚合物载体；
(2)连接于固相载体的化合物(Ⅰ)通过脱保护工序脱去DMTr保护基；在偶联反应条件下，使其与核苷酸单体接触，连接上第一个核苷酸；
(3)按照3’至5’的方向，通过亚磷酰胺固相合成方法合成siRNA的正义链；
(4)通过亚磷酰胺固相合成方法，合成siRNA的反义链；
(5)将正义链或反义链与固相载体切割，分离纯化得到核酸的正义链或反义链，经退火，获得siRNA缀合物，即式(Ⅱ)对应的化合物。
本发明的第四方面提供上述寡核苷酸缀合物在制备用于治疗和/或预防由肝细胞中特定基因表达所引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
其中，所述寡核苷酸药物中的寡核苷酸的特定靶点基因选自ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、HBV、TTR和AGT中的一种。这些靶点对应的疾病选自慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病和血脂异常；可选的，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
本发明式(Ⅰ)化合物制备式(Ⅱ)缀合物，式(Ⅱ)缀合物通过结构中的对哺乳动物肝脏细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体具有特异性亲和力的N-乙酰半乳糖胺配体，实现将治疗性寡核苷酸递送至肝细胞内部，以达到治疗疾病的目的，在保持所递送的寡核苷酸高度稳定的同时，还具有优良的递送效率。
附图说明
图1为缀合物Ⅱ-1a～Ⅱ-5a对肝脏TTR mRNA的抑制水平；
图2为缀合物Ⅱ-6a～Ⅱ-10a对肝脏TTR mRNA的抑制水平；
图3为缀合物Ⅱ-1b’～Ⅱ-5b’对血清中ANGPTL3蛋白的抑制水平；
图4为缀合物Ⅱ-6b’～Ⅱ-10b’对血清中ANGPTL3蛋白的抑制水平。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。虽然本发明的描述将结合较佳实施例一起介绍，但这并不代表此发明的特征仅限于该实施方式。恰恰相反，结合实施方式作发明介绍的目的是为了覆盖基于本发明的权利要求而有可能延伸出的其它选择或改造。为了提供对本发明的深度了解，以下描述中将包含许多具体的细节。本发明也可以不使用这些细节实施。此外，为了避免混乱或模糊本发明的重点，有些具体细节将在描述中被省略。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1：肝靶向化合物的合成
实施例1.1-1.10中所涉及的原料采用如下工艺制备：
化合物6的合成：
合成路线如下：
步骤1：化合物3的合成
反应瓶中加入化合物1(30g，0.329moL，1.0eq)，DMSO 100mL，NaOH水溶液(1.32gNaOH溶于6.5mL水中，0.033moL，0.1eq)，加完后降温至5℃，滴加化合物2(98.9g，0.771moL，2.3eq)。缓慢升温至15-25℃，反应4h。反应液降温至10℃，加入水240mL，乙酸乙酯200mL，搅拌分液。水相用乙酸乙酯萃取三次(150mL×3)，合并乙酸乙酯相，饱和氯化钠溶液洗涤两次(100mL×2)。乙酸乙酯减压脱溶剂，得到102.7g粗品。硅胶柱层析(洗脱剂100％乙酸乙酯)，得到45.5g油状物化合物3，收率39.8％。
步骤2：化合物5的合成
反应瓶中加入化合物3(25.00g，0.072moL，1.0eq)，四氢呋喃75mL，碳酸钠水溶液(8.39g碳酸钠溶于100mL水，0.079moL，1.1eq)，水150mL，氮气保护下，降温至10℃，滴加化合物4(15.96g，0.094moL，1.3eq)。升温至20-25℃，搅拌反应20h。加入乙酸乙酯200mL，搅拌分层，水相用乙酸乙酯萃取两次(200mL×2)，合并乙酸乙酯相，饱和氯化钠水溶液洗涤三次(100mL×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到粗品37.0g。过硅胶柱(洗脱剂石油醚：乙酸乙酯＝90：10)，得到29.0g化合物5，收率83.7％。
步骤3：化合物6的合成
反应瓶中加入化合物5(15.16g，0.031moL，1.0eq)，甲酸182mL，氮气保护下，冰浴反应1h，升温至20-25℃反应8h。反应液浓缩，加入水30mL，二氯甲烷90mL，搅拌分液，二氯甲烷相用水洗涤两次(30mL×2)。二氯甲烷相加入水60mL，碳酸钠水溶液调pH至8-9，分液取水相，水相二氯甲烷洗涤两次(30mL×2)。水相加入二氯甲烷90mL，盐酸调pH至1-2，搅拌分液。水相用二氯甲烷萃取三次(30mL×2)，合并二氯甲烷相，减压浓缩，得到9.7g化合物6，收率83.7％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.60(s,2H),7.39-7.28(m,5H),5.36-5.21(m,1H),5.09(s,2H),3.99-3.83(m,1H),3.70(t,J＝6.2Hz,4H),3.63-3.51(m,2H),3.46(dd,J＝9.3,6.0Hz,2H),2.58(t,J＝6.2Hz,4H),1.26(t,J＝7.1Hz,1H).
化合物12的合成：
合成路线如下：
步骤1：化合物8的合成
反应瓶中加入化合物6(10.00g，0.027moL，1.0eq)，二氯甲烷200mL，N,N-二异丙基乙胺12.25g(0.095moL，3.5eq)。15-20℃下，加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)21.62g，(0.057moL，2.1eq)，搅拌10min，滴加化合物7(10.38g化合物7溶于40mL二氯甲烷，0.060moL，2.2eq)，升温至20-25℃，搅拌反应2h。反应液中加入饱和氯化钠溶液150mL，搅拌0.5h，过滤，除去析出的固体。滤液分出二氯甲烷层，依次用水(150mL×1)、1N HCl(150mL×1)、水(150mL×1)、5％碳酸氢钠水溶液(150mL×1)、水(150mL×3)洗涤，得到二氯甲烷层，浓缩至干。加入乙酸乙酯200mL，升温溶解，降至20-25℃析出固体。过滤，乙酸乙酯淋洗，固体40-50℃干燥8h，得到15.16g化合物8，收率82.2％。
步骤2：化合物9的合成
反应瓶中加入化合物8(6.13g，0.009moL，1.0eq)，冰浴下，加入甲酸122mL，升温至20-25℃，搅拌反应18h。将反应液浓缩干，加入饱和氯化钠溶液60mL，二氯甲烷洗涤两次(30mL×2)。水相再加入二氯甲烷50mL，用40％氢氧化钠调pH＝13，水相用二氯甲烷提取三次(100mL×3)。合并二氯甲烷相，用饱和氯化钠洗涤两次(30mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干，得到4.00g化合物9，收率92.3％。
步骤3：化合物11的合成
反应瓶中，加入化合物10(3.34g，0.0075moL，1.8eq)，二氯甲烷80mL，溶解后，加入N,N-二异丙基乙胺1.98g(0.0015moL，3.7eq)，HATU 3.16g(0.0083moL，2.0eq)，20-25℃搅拌反应1h。滴加化合物9(2.00g化合物9溶于20mL DMF，0.0042moL，1.0eq)，20-25℃搅拌反应15h。过滤除去不溶物，加入120mL二氯甲烷，用水洗涤五次(50mL×5)。二氯甲烷相浓缩干，加入150mL乙酸乙酯结晶，过滤。得到的固体加入20mL DCM溶解，加入100mL乙酸乙酯析晶，过滤，得到固体。重复上述结晶操作三次，得到固体2.86g，即化合物11，收率51.4％。
步骤4：化合物12的合成
反应瓶中，加入化合物11(1.74g，0.0013moL，1.0eq)，水30mL，10％ Pd/C0.765g，真空/氢气置换三次，氢气氛围下，0-5℃搅拌反应1h。过滤，2mL水淋洗滤饼，滤液中加入固体氯化钠至饱和，N,N-二异丙基乙胺调pH＝9左右，二氯甲烷萃取三次(40mL×3)。二氯甲烷相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干，得到0.77g化合物12，收率49.6％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92-7.78(m,4H),7.72(dt,J＝7.2,4.2Hz,2H),5.21(d,J＝3.4Hz,2H),4.96(dd,J＝11.2,3.4Hz,2H),4.48(d,J＝8.5Hz,2H),4.03(d,J＝3.7Hz,6H),3.87(dt,J＝11.1,8.9Hz,2H),3.71(dd,J＝10.7,5.4Hz,3H),3.57(s,17H),3.03(p,J＝6.4Hz,8H),2.36-2.20(m,4H),2.10(s,6H),2.02(d,J＝17.4Hz,10H),1.89(s,6H),1.77(s,6H),1.58-1.38(m,12H).
化合物17的合成：
合成路线如下：
步骤1：化合物15的合成
反应瓶中，加入化合物13(58.639g,240mmoL),1-羟基苯并三唑(HOBT，35.673g,264mmoL)，二氯甲烷(1.5L)。氩气保护，然后降温至0℃。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，55.593g，290mmoL)加入到反应中，反应逐渐由浑浊变澄清，在0℃下反应1h。化合物14(44.24g，288mmoL)加入到反应体系，随后三乙胺(60.714g,600mmoL)滴加到反应中。自然升至室温反应过夜。向反应中加入稀盐酸(1N,1L)和饱和食盐水(1L)，搅拌过滤除去不溶物。分液，水相用二氯甲烷(1L)萃取一次，合并有机相用饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。残余物甲基叔丁醚(1.8L)加热至回流溶解，冷却析晶，过滤，滤饼用甲基叔丁醚洗涤，烘干得61.8g化合物15，收率75％。
步骤2：化合物17的合成
反应瓶中加入化合物15(23.08g,67.2mmoL)，三乙胺(10.18g,100.8mmoL)，无水二氯甲烷(450mL)，氩气保护。搅拌下继续加入4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(DMTrCl，23.45g，69.2mmoL)，反应逐渐由橙红色变浅黄。室温下反应5h。停止反应，反应液浓缩至干。加入400mL四氢呋喃溶解，搅拌下加入氢氧化锂的水溶液(5.63g溶于30mL水)，加完后室温搅拌过夜。加入150mL水，静置分液。上层有机相用饱和盐水洗(200mL×2)，无水硫酸钠干燥，脱溶剂。残余物加入260mL二氯甲烷溶解，滴加520mL甲基叔丁基醚，析出固体，过滤，烘干，得28.80g白色粉末化合物17，两步收率67.2％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.32-7.22(m,4H),7.21-7.11(m,5H),6.83(ddd,J＝8.9,6.1,2.4Hz,4H),4.40-4.23(m,1H),4.10(dq,J＝10.4,4.9Hz,1H),3.69(s,6H),3.53(dd,J＝10.6,5.1Hz,1H),3.41(dd,J＝12.0,3.8Hz,1H),3.24-3.07(m,1H),2.99-2.88(m,1H),2.66-2.50(m,1H),2.37-2.08(m,2H),2.04-1.88(m,1H),1.81(td,J＝7.4,2.3Hz,3H),1.50-1.32(m,4H),1.17(d,J＝3.9Hz,12H).
化合物22的合成：
合成路线如下：
步骤1：化合物21的合成
反应瓶中加入化合物7(191.66g，1100mmoL)、戊内酯20(100.12g，1000mmoL)，搅拌，升温至55℃反应12h，得淡黄色油状粗品290.0g。加入1.2L二氯甲烷，500g水，40g氢氧化钠，室温搅拌水解12h除去多次打开戊内酯环的杂质。分液，有机相水洗至中性(500mL×2)。有机相用10％柠檬酸洗涤(500mL×2)除去过量的化合物7。有机相水洗至中性(500mL×2)，无水硫酸钠干燥，减压脱除溶剂。油状物加入1L异丙醚搅拌，有固体析出，过滤，异丙醚淋洗，干燥，得到白色固体258.0g化合物21，收率94.0％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.72(t,J＝5.7Hz,1H),6.74(t,J＝5.8Hz,1H),4.34(t,J＝5.2Hz,1H),3.37(td,J＝6.5,5.2Hz,2H),3.01(td,J＝7.0,5.7Hz,2H),2.90(q,J＝6.6Hz,2H),2.03(t,J＝7.4Hz,2H),1.55-1.43(m,4H),1.37(s,11H).
步骤2：化合物19的合成
化合物18(101.23g，260.00mmoL)加入反应瓶中，加入分子筛干燥后的二氯甲烷300mL，搅拌下滴加三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf，69.35g，312.00mmoL)。滴毕，氩气保护下，反应12h。向反应液中缓慢加入三乙胺78.00g，搅拌1h。减压脱除溶剂和三乙胺得红棕色油状化合物19粗品168.00g，直接投入下步反应。
步骤3：化合物22的合成
反应瓶中加入化合物19粗品85.61g(上一步未纯化的粗品)，分子筛干燥的二氯乙烷500mL，化合物21(71.33g，250mmoL)，搅拌0.5h。滴加TMSOTf11.11g(50mmoL)，室温反应12h。反应液中加入碳酸氢钠21.0g，水500mL，分液。有机相水洗(500mL×1)，10％柠檬酸洗涤(800mL×2)，水洗(500mL×1)，无水硫酸钠干燥，减压脱溶剂得到油状物150.0g。加入450mL乙酸乙酯溶解，加入1.35L异丙醚，搅拌有固体析出，过滤，异丙醚淋洗，干燥，得到103.0g淡黄色固体化合物22。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.80(d,J＝9.2Hz,1H),7.70(t,J＝5.7Hz,1H),6.74(t,J＝5.8Hz,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,1H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.48(d,J＝8.4Hz,1H),4.08-3.98(m,3H),3.87(dt,J＝11.3,8.8Hz,1H),3.70(dt,J＝9.6,5.6Hz,1H),3.41(dt,J＝9.6,6.0Hz,1H),3.01(q,J＝6.6Hz,2H),2.90(q,J＝6.6Hz,2H),2.10(s,3H),2.03(t,J＝7.0Hz,2H),2.00(s,3H),1.89(s,3H),1.77(s,3H),1.47(h,J＝7.3Hz,6H),1.37(s,9H).
化合物26的合成：
合成路线如下：
步骤1：化合物23的合成
反应瓶中加入化合物22(4000mg，6.63mmoL)，二氯甲烷30mL，搅拌溶解，滴加盐酸的1,4-二氧六环溶液10mL(4moL/L)。滴毕室温反应2h，减压脱除溶剂得到淡黄色油状液体3336mg，即化合物23，收率99.5％。
步骤2：化合物25的合成
反应瓶中加入化合物23(3336mg，6.63mmoL)，化合物24(1019mg，3.23mmoL)，N,N-二异丙基乙胺1669mg(12.91mmoL)，二氯甲烷80mL。搅拌溶解，加入HATU 3684mg(9.69mmoL)，室温反应18h。反应液中加入80mL饱和食盐水和40mL二氯甲烷，分液。有机相饱和食盐水洗涤(40mL×2)，无水硫酸钠干燥，脱溶剂。硅胶柱层析(洗脱液二氯甲烷/甲醇＝97/3～90/10)，得到淡黄色固体2910mg，即化合物25，收率：70.1％。
步骤3：化合物26的合成
反应瓶中加入化合物25(1214mg，0.46mmoL)，二氯甲烷50mL，搅拌溶解后加入100mg钯碳，氢气置换三次，常压室温反应20h。过滤，滤液中加入无水硫酸钠干燥，脱溶剂，得到类白色固体869mg，即化合物26，收率：75.4％。
化合物29的合成：
合成路线如下：
步骤1：化合物28的合成
反应瓶中加入化合物27(5-溴戊酸甲酯8.58g，43.99mmoL)，苄胺1.89g(17.6mmoL)，无水乙醇30mL，无水碳酸钾7.3g(52.8mmoL)，碘化钾1.02g(6.16mmoL)。80℃搅拌12h。减压脱除溶剂，加水30mL，二氯甲烷30mL搅拌静置分层，分出有机相。水相二氯甲烷萃取3次(20mL×3)，合并有机相，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩脱溶剂后得到浅黄色油状粗品。硅胶柱层析(洗脱液石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得产品4.31g，即化合物28，收率73％。ESI-MS(m/z):336.3[M+H]+.
步骤2：化合物29的合成
反应瓶中加入化合物28(4.2g，12.49mmoL)，乙醇10mL，氢氧化钠2.0g(50.0mmoL)，40℃反应2h。减压脱除溶剂乙醇，加水20mL，水相二氯甲烷洗涤2次(20mL×2)，水相用1N盐酸调pH至2-3，加入固体氯化钠至饱和，二氯甲烷萃取。合并有机相，脱除溶剂得到黄色油状液体2.95g，即化合物29，收率77％。ESI-MS(m/z):308.3[M+H]+.
化合物32的合成：
合成路线如下：
步骤1：化合物31的合成
反应瓶中加入化合物30(7.33g，35.0mmoL)，苄胺1.5g(14.0mmoL)，无水乙醇30mL，碳酸钾5.8g(42.0mmoL)，碘化钾1.16g(7.0mmoL)。80℃反应12h。减压脱除溶剂，加水30mL，二氯甲烷30mL搅拌静置分层，分出有机相。水相二氯甲烷萃取3次(20mL×3)，合并有机相，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩脱溶剂后得到浅黄色油状粗品。硅胶柱层析(洗脱液石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到4.22g化合物31，收率73％。ESI-MS(m/z):364.3[M+H]+.
步骤2：化合物32的合成
反应瓶加入化合物31(4.2g，11.62mmoL)，乙醇10mL，氢氧化钠1.86g(46.48mmoL)，40℃反应2h。减压脱除溶剂，加水20mL溶解，水相二氯甲烷洗涤(20mL×2)。水相用1N盐酸调pH至2-3，加入固体氯化钠至饱和，二氯甲烷萃取产品多次，合并有机相，减压脱除溶剂得到化合物32，为黄色油状液体，3.03g，收率78％。ESI-MS(m/z):336.3[M+H]+；334.3[M-H]-.
实施例1.1：化合物Ⅰ-1的合成
合成路线如下：
步骤1：化合物34的合成
反应瓶中加入化合物33(10.0g，75mmoL)，水100mL，氢氧化钠水溶液(12.0g溶于50mL水，300mmoL)。0-5℃，滴加苄氧羰酰氯4(19.6g，112.7mmoL)。加毕，升温至15-20℃反应2h。加入二氯甲烷100mL，搅拌分层，水相用二氯甲烷洗涤两次(100mL×2)。水相加入二氯甲烷200mL，用盐酸调pH至1-2，搅拌分层，水相用二氯甲烷萃取三次(100mL×3)，合并有机相。有机相饱和氯化钠溶液洗涤两次(80mL×2)，无水硫酸钠干燥，脱溶剂，得到24.6g化合物34。
步骤2：化合物35的合成
氮气保护下，反应瓶中加入化合物34(300mg，1.122mmoL)，二氯甲烷40mL，HATU939mg(2.468mmoL)，N,N-二异丙基乙胺580mg(溶于20mL二氯甲烷，4.488mmoL)，20-25℃反应1h。滴加化合物12(2800mg溶于20mL二氯甲烷，2.32mmoL)，20-25℃反应1h。补加HATU120mg，N,N-二异丙基乙胺65mg，20-25℃继续反应2h。向反应液中加入二氯甲烷90mL，饱和氯化钠溶液洗涤四次(60mL×4)，有机相无水硫酸钠干燥，脱溶剂。加入40mL二氯甲烷溶清，升温至35℃，滴加200mL乙酸乙酯，有固体析出，降温至15℃，过滤，得到的固体，再次重复以上结晶操作，得到固体2.50g，即化合物35，收率84.3％。
步骤3：化合物36的合成
反应瓶中加入化合物35(2.40g，0.908mmoL)，96mL水，10％ Pd/C 0.96g，氢气/真空置换三次，氢气氛围下，0-5℃搅拌反应2-3h。过滤，滤饼用20mL水淋洗，加入氯化钠固体饱和，用二氯甲烷提取五次(80mL×5)，无水硫酸钠干燥，脱溶剂，得到2.1g化合物36，收率92.2％。
步骤4：化合物37的合成
氮气保护下，反应瓶中加入化合物17(356mg，0.446mmoL)，HATU 219mg(0.574mmoL)，4-吡咯烷基吡啶95mg(0.638mmoL)，乙腈30mL，30-35℃搅拌2h。加入化合物36(800mg溶于15mL乙腈，0.319mmoL)。40-45℃搅拌反应18h。降至20-25℃，过滤，滤液浓缩至干，加入120mL二氯甲烷，用15％氯化钠溶液洗涤三次(40mL×3)，无水硫酸钠干燥，脱溶剂。加入40mL二氯甲烷溶解，30℃滴加200mL乙酸乙酯，有固体慢慢析出，降温至10-15℃，搅拌0.5h，过滤，乙酸乙酯淋洗，得到固体0.78g，即化合物37，收率78.3％。
步骤5：化合物I-1的合成
反应瓶中加入化合物37(350mg，0.112mmoL)，二氯甲烷20mL，三乙胺342mg(3.379mmoL)，DMAP 220mg(1.800mmoL)，丁二酸酐90mg(1.139mmoL)，20-25℃搅拌反应20h。反应液中加入150mL二氯甲烷，15％氯化钠溶液洗涤三次(30mL×3)。有机相无水硫酸钠干燥，脱溶剂。加入10mL二氯甲烷，25-30℃滴加乙酸乙酯50mL，有固体析出，降温至15℃，过滤，得到370mg粗品Ⅰ-1。粗品Ⅰ-1制备液相分离纯化得到Ⅰ-1 190mg。HPLC纯度96.80％。ESI-HRMS(m/z):3222.3824[M-H]-.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.62(d,J＝8.4Hz,1H),8.11(d,J＝7.9Hz,1H),7.85(dddd,J＝24.9,18.8,11.2,5.2Hz,12H),7.37-7.25(m,4H),7.24-7.12(m,5H),6.92-6.80(m,4H),5.35(s,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,4H),4.97(dd,J＝11.2,3.2Hz,4H),4.50(d,J＝8.4Hz,4H),4.19(s,1H),4.02(q,J＝6.3,5.3Hz,13H),3.98(d,J＝8.7Hz,2H),3.95-3.82(m,8H),3.73(s,7H),3.69(dd,J＝10.3,4.9Hz,5H),3.56(d,J＝6.4Hz,8H),3.42-3.38(m,9H),3.37-3.33(m,9H),3.07-2.99(m,17H),2.48-2.13(m,18H),2.10(s,12H),2.04(t,J＝7.0Hz,9H),1.99(s,12H),1.88(s,12H),1.77(s,12H),1.59-1.35(m,28H),1.22(d,J＝10.8Hz,12H).
分离纯化条件为：
色谱柱：waters X-Bridge C18，19*250mm，40μm；
流动相A：碳酸氢铵溶液，pH＝8-9；流动相B：乙腈；
流速20mL/min；
进样体积3.000μL；
梯度：时间(流动相B％)：0min(5％)，5min(5％)，8min(30％)，30min(60％)，40min(95％)，45min(95％)。
注：化合物Ⅰ-1～Ⅰ-10均使用此分离纯化条件制备，后续不再赘述。
实施例1.2：化合物I-2的合成
合成路线如下：
步骤1：化合物39的合成
反应瓶中加入氢氧化钠795mg(19.86mmoL)，水30mL。溶解后在0～5℃下加入化合物38(800mg，4.96mmoL)。向反应液中滴加化合物4(1100mg，45mmoL)，加毕室温反应6h。过滤，60mL二氯甲烷分两次洗涤水相。用1N HCl溶液调节水相pH至2-3，90mL甲基异丁基甲酮分三次萃取水相。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，脱溶剂，得到白色固体化合物39945mg，收率：64.5％。
步骤2：化合物40的合成
反应瓶中依次加入化合物12(3972mg，3.29mmoL)，化合物39(389mg，1.32mmoL)，N,N-二异丙基乙胺681mg(5.27mmoL)，二氯甲烷150mL。20-30℃下，加入HATU 1502mg(3.95mmoL)，反应16h。向反应液中加入80mL饱和食盐水和60mL二氯甲烷，分液。有机相饱和食盐水洗涤(80mL×2)，无水硫酸钠干燥，脱除溶剂。加入10mL二氯甲烷溶解，滴加250mL乙酸乙酯，有固体析出，过滤，干燥，得到白色固体化合物40 3041mg，收率86.4％。
步骤3：化合物41的合成
反应瓶中加入化合物40(3041mg，1.14mmoL)，水200mL，10％ Pd/C 300mg。氢气置换三次，氢气环境下室温反应16h。过滤，脱溶剂，得到类白色固体化合物41 2610mg，收率：90.2％。
步骤4：化合物I-2的合成
反应瓶中依次加入化合物41(1000mg，0.39mmoL)，化合物17(277mg，0.43mmoL)，DMAP 193mg(1.58mmoL)，二氯甲烷150mL。室温下加入HATU 450mg(1.18mmoL)，反应5h。得到的化合物42反应液，继续加入丁二酸酐592mg(5.91mmoL)，DMAP 722mg(5.91mmoL)，三乙胺798mg(7.88mmoL)，二氯甲烷30mL，室温反应30h。向反应液中加入80mL饱和食盐水和60mL二氯甲烷，分液。有机相无水硫酸钠干燥，脱除溶剂，得到类白色固体835mg，即Ⅰ-2粗品，收率65.2％。Ⅰ-2粗品制备液相分离纯化得到白色固体Ⅰ-2 560mg。HPLC纯度99.86％。ESI-HRMS(m/z):3250.4038[M-H]-.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.98-7.72(m,14H),7.25(dddt,J＝43.0,9.0,5.9,2.8Hz,9H),6.87(ddd,J＝8.8,5.5,2.3Hz,4H),5.35(s,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,4H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,4H),4.49(d,J＝8.5Hz,4H),4.19(s,1H),4.02(q,J＝4.0Hz,12H),3.87(dt,J＝11.1,9.0Hz,6H),3.79-3.66(m,11H),3.56(t,J＝6.4Hz,8H),3.51-3.39(m,8H),3.36(d,J＝10.0Hz,8H),3.30(s,4H),3.03(p,J＝6.3Hz,16H),2.48-2.14(m,22H),2.10(s,12H),2.04(t,J＝7.1Hz,8H),1.99(s,12H),1.89(s,12H),1.77(s,12H),1.48(dp,J＝18.2,7.0Hz,28H),1.22(s,12H).
实施例1.3：化合物I-3的合成
合成路线如下：
步骤1：化合物44的合成
反应瓶中加入化合物43(500mg，2.64mmoL)，水30mL，氢氧化钠水溶液(537mg氢氧化钠溶于1.5mL水，13.43mmoL)。0-10℃下，滴加化合物4(680mg，3.98mmoL)，反应2h。反应液中加入10mL水，二氯甲烷洗涤五次(15mL×5)，水相用1N盐酸水溶液调pH至1-2，有固体析出。用二氯甲烷提取一次(20mL×1)。水相加入固体氯化钠至饱和，二氯甲烷提取四次(15mL×4)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，脱溶剂，得到0.80g化合物44，收率93.7％。
步骤2：化合物45的合成
氮气保护下，反应瓶中加入化合物44(200mg，0.618mmoL)，二氯甲烷20mL，HATU518mg(1.361mmoL)，N,N-二异丙基乙胺320mg(2.474mmoL)，20-25℃搅拌1h。滴加化合物12(1530mg溶于20mL二氯甲烷，1.268mmoL)，20-25℃搅拌3h。向反应液中加入二氯甲烷100mL，用15％氯化钠溶液洗涤四次(50mL×4)，二氯甲烷相用无水硫酸钠干燥。脱除溶剂，加入30mL二氯甲烷溶清，25-30℃，滴加150mL乙酸乙酯，有固体析出，降温至15℃，过滤，得到固体1.35g，即化合物45，收率80.9％。
步骤3：化合物46的合成
反应瓶中加入化合物45(1.41g，0.522mmoL)，水120mL，10％ Pd/C 0.96g。氢气/真空置换三次，氢气氛围下，0-5℃搅拌反应15h。过滤，滤饼10mL水淋洗，加入氯化钠固体至饱和，二氯甲烷提取四次(100mL×4)，无水硫酸钠干燥有机相，脱除溶剂，得到0.99g化合物46，收率73.9％。
步骤4：化合物47的合成
氮气保护下，反应瓶中加入化合物17(235mg，0.349mmoL)，HATU 157mg(0.412mmoL)，N,N-二异丙基乙胺103mg(0.793mmoL)，二氯甲烷40mL，20-25℃搅拌2h。滴加化合物46(814mg溶于30mL二氯甲烷，0.317mmoL)。20-25℃搅拌反应2h，过滤，滤液用15％氯化钠溶液洗涤四次(30mL×4)，二氯甲烷相无水硫酸钠干燥，脱除溶剂。加入25mL二氯甲烷溶解，25-30℃下，滴加150mL乙酸乙酯，有固体慢慢析出，降温至15-20℃，过滤。得到的固体加入二氯甲烷溶解，无水硫酸钠干燥，脱除溶剂，得到0.942g化合物47，收率93.4％。
步骤5：化合物I-3的合成
反应瓶中加入化合物47(315mg，0.099mmoL)，DMAP 275mg(2.25mmoL)，三乙胺304mg(3.00mmoL)，二氯甲烷15mL。搅拌溶清后，加入丁二酸酐151mg(1.5mmoL)，20-25℃搅拌反应20h。向反应液中加入50mL二氯甲烷，15％氯化钠溶液洗涤两次(25mL×2)，二氯甲烷相无水硫酸钠干燥，脱除溶剂。加入10mL二氯甲烷，25-30℃滴加乙酸乙酯75mL，有固体析出，降温至15℃，过滤，得到410mg粗品Ⅰ-3。粗品Ⅰ-3制备液相分离纯化得到Ⅰ-3 228mg。HPLC纯度99.58％。ESI-HRMS(m/z):3278.4379[M-H]-.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.90(q,J＝42.0,38.6Hz,14H),7.25(d,J＝45.8Hz,9H),6.87(s,4H),5.21(s,4H),4.98(d,J＝9.3Hz,4H),4.61-4.38(m,4H),4.20(s,1H),4.02(s,12H),3.95-3.81(m,6H),3.73(s,11H),3.56(s,9H),3.39(s,8H),3.31(s,8H),3.19(s,5H),3.03(s,17H),2.26(q,J＝27.7,25.9Hz,18H),2.13-1.94(m,36H),1.88(s,12H),1.77(s,12H),1.66(d,J＝28.3Hz,4H),1.48(s,28H),1.23(s,12H).
实施例1.4：化合物I-4的合成
合成路线如下：
步骤1：化合物48的合成
反应瓶中加入化合物29(0.318g，1.04mmoL)，二氯甲烷10mL，N,N-二异丙基乙胺0.535g(4.14mmoL)，HATU 0.827g(2.17mmoL)，室温反应1h。反应体系加入化合物12(2.500g，2.07mmoL，溶于20mL二氯甲烷)，室温反应2h。向反应液中加入饱和氯化钠水溶液50mL，分液。水相二氯甲烷萃取3次(50mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，脱溶剂。加入二氯甲烷15mL溶解，滴加乙酸乙酯200mL，有固体析出。过滤，干燥得到固体化合物48 2.7g，收率97％。
步骤2：化合物49的合成
反应瓶中加入化合物48(2.95g，1.1mmoL)，水30mL，10％ Pd/C 1.48g，氢气置换三次，室温下反应2h。过滤，反应液中加入氯化钠固体至饱和，二氯甲烷萃取(50mL×3)。合并有机相，无水硫酸钠干燥，脱溶剂得到灰白色固体2.65g，即化合物49，收率93％。
步骤3：化合物I-4的合成
化合物17(582mg，0.91mmoL)，化合物49(1.82g，0.70mmoL)，HATU 400mg(1.05mmoL)，DMAP 343mg(2.81mmoL)二氯甲烷50mL，加入反应瓶。室温搅拌反应5h，得到含有化合物50的反应液。向化合物50的反应液中继续加入丁二酸酐1.05g(10.52mmoL)，DMAP1.71g(14.03mmoL)，三乙胺2.13g(21.04mmoL)，二氯甲烷20mL。室温反应12h。向反应液中加入饱和食盐水50mL，二氯甲烷50mL，分液。水相二氯甲烷萃取(50mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，脱除溶剂。加入二氯甲烷20mL溶解，滴加乙酸乙酯300mL，有固体析出，过滤，干燥得到化合物Ⅰ-4粗品1.5g。取620mgⅠ-4粗品经制备液相分离纯化得到380mg白色固体Ⅰ-4。HPLC纯度99.83％。ESI-HRMS(m/z):3306.4686[M-H]-.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.15-7.85(m,13H),7.75(d,J＝40.5Hz,3H),7.25(d,J＝46.4Hz,10H),6.87(s,4H),5.31(s,1H),5.20(s,4H),4.98(d,J＝10.7Hz,4H),4.51(d,J＝8.0Hz,4H),4.02(s,12H),3.95-3.82(m,7H),3.73(s,6H),3.69(s,5H),3.55(s,9H),3.39(s,13H),3.19(s,8H),3.02(s,17H),2.67(s,1H),2.40-2.14(m,19H),2.09(s,13H),2.04(d,J＝7.1Hz,10H),1.98(s,12H),1.88(s,12H),1.77(s,12H),1.62-1.31(m,36H),1.22(s,12H).
实施例1.5：化合物I-5的合成
步骤1：化合物51的合成
反应瓶中加入化合物32(0.176g，0.53mmoL)，二氯甲烷10mL，N,N-二异丙基乙胺0.272g(2.10mmoL)，HATU 0.440g(1.16mmoL)，室温反应1h。继续加入化合物12(1.270g，1.05mmoL，溶于10mL二氯甲烷)，室温反应2h。加入20mL饱和食盐水，分液。水相二氯甲烷萃取(30mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压脱除溶剂。加入10mL二氯甲烷溶解，滴加乙酸乙酯150mL，有固体析出，过滤，干燥，得到固体化合物51 1.35g，收率95％。
步骤2：化合物52的合成
化合物51(1.0g，0.37mmoL)，水10mL，10％ Pd/C 0.5g加入反应瓶。氢气置换三次，氢气氛围下，室温反应2h。过滤，滤液加入氯化钠固体至饱和。二氯甲烷萃取(50mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，脱除溶剂得到浅灰色固体870mg，即化合物52，收率90％。
步骤3：化合物53的合成
化合物17(234mg，0.37mmoL)，化合物52(644mg，0.25mmoL)，HATU 159mg(0.42mmoL)，DMAP 120mg(0.98mmoL)，二氯甲烷20mL加入反应瓶中，室温搅拌反应5h。得到含有化合物53的反应液，不做处理继续进行下一步反应。
步骤4：化合物I-5的合成
化合物53的反应液中继续加入丁二酸酐367mg(3.68mmoL)，DMAP 598mg(4.90mmoL)，二氯甲烷10mL，三乙胺743mg(7.35mmoL)，室温反应过夜。向反应液中加入饱和食盐水20mL，二氯甲烷30mL，分液。水相二氯甲烷萃取(30mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，脱溶剂。加入二氯甲烷10mL溶解，滴加乙酸乙酯200mL，搅拌有固体析出，过滤，干燥得到灰白色固体750mg，即Ⅰ-5粗品。Ⅰ-5粗品经制备液相分离纯化得到150mgⅠ-5。HPLC纯度99.73％。ESI-HRMS(m/z):3334.4572[M-H]-.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.90-7.79(m,8H),7.75(d,J＝5.6Hz,4H),7.70-7.60(m,3H),7.36-7.25(m,5H),7.25-7.14(m,6H),6.91-6.82(m,4H),5.35(s,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,4H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,4H),4.49(d,J＝8.4Hz,4H),4.01(d,J＝6.0Hz,12H),3.96-3.82(m,7H),3.77(d,J＝6.5Hz,1H),3.73(s,6H),3.72-3.66(m,4H),3.56(t,J＝6.3Hz,9H),3.52-3.33(m,12H),3.17(s,8H),3.07-2.98(m,17H),2.46(s,2H),2.45-2.22(m,14H),2.21(s,2H),2.15(s,3H),2.10(s,12H),2.04(t,J＝6.8Hz,9H),1.99(s,12H),1.89(s,12H),1.77(s,12H),1.49(dd,J＝13.8,7.0Hz,36H),1.22(s,16H).
实施例1.6：化合物I-6的合成
合成路线如下：
步骤1：化合物54的合成
反应瓶中加入化合物6(0.10g，0.27mmoL)，HATU 0.20g(0.54mmoL)，N,N-二异丙基乙胺0.14g(溶于5mL二氯甲烷，1.08mmoL)，20-25℃搅拌0.5h。滴加化合物12(0.81g溶于5mL二氯甲烷，0.68mmoL)，20-25℃搅拌反应1h。向反应液中加入20mL二氯甲烷，饱和食盐水洗涤有机相(10mL×4)。二氯甲烷相脱除溶剂，加入2mL二氯甲烷溶解，滴加30mL乙酸乙酯，有固体析出。过滤得到化合物54 0.31g，收率41.8％。
步骤2：化合物55的合成
化合物54(0.58g，0.21mmoL)，水30mL，10％ Pd/C 0.23g加入反应瓶，氢气/真空置换三次，氢气氛围下，于0-5℃搅拌反应3h。过滤，滤饼用2mL水淋洗，冷冻干燥，得到0.46g化合物55，收率83.8％。
步骤3：化合物56的合成
反应瓶中加入化合物17(220mg，0.28mmoL)，HATU 115mg(0.30mmoL)，二氯甲烷10mL，N,N-二异丙基乙胺104mg(溶于10mL二氯甲烷，0.80mmoL)，20-25℃搅拌1h。加入化合物55(600mg溶于10mL二氯甲烷，0.23mmoL)，20-25℃搅拌反应2h。向反应液加入10mL二氯甲烷，饱和氯化钠溶液洗涤两次(15mL×2)，得到二氯甲烷溶液浓缩干。加入9mL二氯甲烷溶解，滴加50mL乙酸乙酯，有固体慢慢析出，搅拌0.5h，过滤，得到的固体40℃真空干燥20h，得到0.61g化合物56，收率82.8％。
步骤4：化合物I-6的合成
反应瓶中加入化合物56(290mg，0.090mmoL)，DMAP 110mg(0.90mmoL)，三乙胺136mg(溶于10mL二氯甲烷，1.35mmoL)，二氯甲烷10mL。继续加入丁二酸酐90mg(0.90mmoL)，20-25℃搅拌反应42h。向反应液中加入150mL二氯甲烷，用10％氯化钠溶液洗涤四次(120mL×4)。二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，浓缩干，加入乙酸乙酯打浆，过滤，干燥，得到230mg粗品化合物Ⅰ-6。Ⅰ-6粗品经制备液相分离纯化得到143mgⅠ-6。HPLC纯度98.84％。ESI-HRMS(m/z):1685.7938[M/2+Na]+.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.86(t,J＝10.7Hz,8H),7.78(s,6H),7.65(s,1H),7.27(s,4H),7.16(d,J＝7.1Hz,5H),6.83(d,J＝7.1Hz,4H),5.18(s,4H),4.93(d,J＝14.6Hz,4H),4.51-4.39(m,4H),3.99(d,J＝3.7Hz,12H),3.93-3.78(m,7H),3.69(s,11H),3.53(s,12H),3.41-3.29(m,12H),3.24(s,9H),2.99(s,17H),2.40(s,3H),2.27(d,J＝12.3Hz,14H),2.15(s,2H),2.08-1.92(m,36H),1.85(s,12H),1.73(s,12H),1.43(dd,J＝20.9,9.7Hz,28H),1.19(d,J＝10.9Hz,12H).
实施例1.7：化合物I-7的合成
合成路线如下：
步骤1：化合物58的合成
反应瓶中加入化合物57(5.0g，27.6mmoL)，四氢呋喃50mL，水50mL。加入碳酸钠11.7g(110.4mmoL)，水30mL。冰水浴下，滴加化合物4(6.12g溶于20mL四氢呋喃，35.9mmoL)，室温搅拌12h。脱除四氢呋喃，加入50mL二氯甲烷，水相二氯甲烷洗涤(50mL×2)。水相1N盐酸调节pH至4-5，乙酸乙酯萃取水相(50mL×3)。合并有机相，无水硫酸钠干燥，脱溶剂得到白色固体化合物58 8.70g，收率98％。
步骤2：化合物59的合成
化合物58(0.40g，1.27mmoL)，二氯甲烷50mL，N,N-二异丙基乙胺0.66g(5.08mmoL)，HATU 1.06g(2.79mmoL)加入反应瓶，室温搅拌1h。滴加化合物12(3.22g溶于20mL二氯甲烷，2.66mmoL)，室温反应2h。向反应液中加入饱和氯化钠溶液50mL，分液，取有机相。水相二氯甲烷萃取三次(50mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，脱除溶剂。加入乙腈50mL，溶解，室温搅拌有固体析出，过滤，干燥，得到固体化合物59 2.28g，收率66.7％。
步骤3：化合物60的合成
化合物59(2.18g，0.81mmoL)，水20mL，10％ Pd/C 1.1g加入反应瓶，氢气置换三次，氢气氛围下，室温反应3h。过滤，反应液加入氯化钠固体至饱和，二氯甲烷萃取(30mL×3)。合并有机相，无水硫酸钠干燥，脱除溶剂得到固体化合物60 1.97g，收率95.2％。
步骤4：化合物61的合成
化合物17(199mg，0.31mmoL)，化合物60(500mg，0.20mmoL)，HATU 148mg(0.39mmoL)，二氯甲烷15mL，4-甲基吡啶73mg(0.78mmoL)加入反应瓶。室温搅拌过夜。向反应液中加入饱和氯化钠溶液20mL，二氯甲烷30mL，分液。水相二氯甲烷萃取(30mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，脱除溶剂。加入二氯甲烷6mL溶解，滴加60mL乙酸乙酯，有固体析出，过滤，干燥，得到固体化合物61 800mg，收率75％。
步骤5：化合物I-7的合成
化合物61(765mg，0.24mmoL)，DMAP 595mg(4.82mmoL)，二氯甲烷20mL，三乙胺731mg(7.24mmoL)，丁二酸酐366mg(3.62mmoL)加入反应瓶中，室温搅拌过夜。向反应液中加入饱和氯化钠溶液20mL，二氯甲烷30mL，分液。水相二氯甲烷萃取(30mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，脱除溶剂。加入二氯甲烷10mL溶解，滴加乙酸乙酯120mL，有固体析出。过滤，干燥得到粗品化合物Ⅰ-7 600mg。Ⅰ-7粗品经制备液相分离纯化得到265mgⅠ-7。HPLC纯度99.85％。ESI-HRMS(m/z):3270.3871[M-H]-.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.35(d,J＝10.6Hz,1H),8.35(d,J＝7.3Hz,2H),8.21(s,2H),7.92(d,J＝5.5Hz,1H),7.89-7.78(m,8H),7.72(t,J＝5.5Hz,4H),7.38-7.26(m,4H),7.25-7.15(m,5H),6.86(dd,J＝8.9,3.1Hz,4H),5.34(s,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,4H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,4H),4.49(d,J＝8.5Hz,4H),4.26-4.16(m,3H),4.02(q,J＝6.2,5.3Hz,12H),3.87(dt,J＝11.0,8.9Hz,4H),3.80-3.73(m,2H),3.73(s,6H),3.72-3.65(m,5H),3.61(t,J＝6.4Hz,8H),3.51-3.37(m,17H),3.04-2.96(m,17H),2.46(d,J＝6.3Hz,2H),2.36(dt,J＝37.0,6.4Hz,14H),2.21-2.14(m,2H),2.10(s,12H),2.03(t,J＝6.9Hz,8H),1.99(s,12H),1.89(s,12H),1.77(s,12H),1.62-1.38(m,28H),1.24(s,12H).
实施例1.8：化合物I-8的合成
合成路线如下：
步骤1：化合物62的合成
反应瓶中加入化合物26(1334mg，1.16mmoL)，化合物6(206mg，0.56mmoL)，N,N-二异丙基乙胺288mg(2.23mmoL)，二氯甲烷150mL，搅拌溶解。分批加入HATU 635mg(1.67mmoL)，室温反应17h。向反应液中加入80mL饱和氯化钠溶液，40mL二氯甲烷，分液。有机相饱和氯化钠溶液洗涤(100mL×2)，无水硫酸钠干燥，脱除溶剂。加入5mL二氯甲烷溶解，滴加125mL乙酸乙酯，有固体析出。过滤，干燥得到化合物62 1214mg，收率87.3％。
步骤2：化合物63的合成
化合物62 1214mg，二氯甲烷50mL，10％ Pd/C 100mg加入反应瓶，氢气置换三次，氢气氛围下，室温反应20h。过滤，无水硫酸钠干燥滤液，脱除溶剂得到类白色固体869mg，即化合物63，收率75.4％。
步骤3：化合物64的合成
化合物63(389mg，0.16mmoL)，化合物17(114mg，0.18mmoL)，DMAP 76mg(0.62mmoL)，二氯甲烷20mL，HATU 178mg(0.47mmoL)，室温反应2h。向反应液中加入饱和氯化钠溶液30mL，二氯甲烷20mL，分液。有机相饱和氯化钠溶液洗涤(40mL×2)，无水硫酸钠干燥，减压脱除溶剂。加入二氯甲烷3mL溶解，滴加75mL乙酸乙酯，有固体析出。过滤，干燥得到白色固体423mg，即化合物64，收率87.2％。
步骤4：化合物I-8的合成
反应瓶中加入丁二酸酐204mg(2.04mmoL)，DMAP 249mg(2.04mmoL)，三乙胺275mg(2.71mmoL)，二氯甲烷15mL，化合物64 423mg，室温反应24h。反应液中加入饱和氯化钠溶液15mL，二氯甲烷30mL，分液。有机相无水硫酸钠干燥，减压脱除溶剂得到固体412mg，即粗品Ⅰ-8。Ⅰ-8粗品经制备液相分离纯化得到218mgⅠ-8。HPLC纯度99.14％。ESI-HRMS(m/z):3216.3034[M-H]-.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.23(s,2H),8.55(t,J＝6.6Hz,4H),8.17(s,4H),7.92(d,J＝5.3Hz,2H),7.80(dd,J＝10.8,7.4Hz,8H),7.61(d,J＝8.0Hz,1H),7.34-7.16(m,9H),6.86(ddd,J＝9.0,5.0,2.4Hz,4H),5.35(s,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,4H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,4H),4.49(d,J＝8.5Hz,4H),4.18(s,1H),4.06-3.99(m,12H),3.96(d,J＝5.9Hz,1H),3.91-3.83(m,4H),3.77-3.64(m,15H),3.58-3.43(m,4H),3.41-3.37(m,8H),3.24-2.97(m,16H),2.51-2.49(m,8H),2.08(d,J＝15.8Hz,26H),1.99(s,12H),1.88(s,12H),1.77(s,12H),1.64(p,J＝7.0Hz,8H),1.46(dp,J＝22.5,8.0Hz,20H),1.19(d,J＝34.7Hz,12H).
实施例1.9：化合物I-9的合成
合成路线如下：
步骤1：化合物66的合成
反应瓶中加入化合物65(115mg，0.244mmoL)，HATU 305mg(0.802mmoL)，N,N-二异丙基乙胺190mg(1.47mmoL)，二氯甲烷10mL，室温搅拌1h。滴加化合物12(926mg溶于10mL二氯甲烷，0.767mmoL)，室温反应2h。向反应液中加入二氯甲烷20mL，饱和氯化钠溶液洗涤(10mL×2)。二氯甲烷相无水硫酸钠干燥，脱除溶剂。残余物加入二氯甲烷10mL溶解，滴加乙酸乙酯100mL，有固体析出。过滤，干燥得到固体化合物66 0.92g，收率93.5％。
步骤2：化合物67的合成
化合物66(0.92g，0.2285mmoL)，水100mL，10％ Pd/C 0.46g加入反应瓶。氢气置换三次，氢气氛围下，室温反应15h。过滤，滤液中加入氯化钠固体至饱和，二氯甲烷萃取(60mL×4)。有机相无水硫酸钠干燥，脱除溶剂，得到化合物67 0.68g，收率76.4％。
步骤3：化合物68的合成
化合物17(214mg，0.268mmoL)，HATU 129mg(0.34mmoL)，4-吡咯烷基吡啶56mg(0.378mmoL)，乙腈20mL，室温反应2h。升温至35-40℃，滴加化合物67(700mg溶于20mL乙腈，0.179mmoL)，35-40℃反应10h。过滤，滤液脱除溶剂。加入二氯甲烷100mL，饱和氯化钠溶液洗涤(30mL×3)。有机相无水硫酸钠干燥，脱除溶剂。残余物加入二氯甲烷15mL溶解，滴加乙酸乙酯100mL，有固体析出。过滤，干燥，得到固体化合物0.77g，即化合物68，收率95.2％。
步骤4：化合物I-9的合成
化合物68(700mg，0.155mmoL)，DMAP 426mg(3.487mmoL)，二氯甲烷40mL，三乙胺470mg(4.65mmoL)，丁二酸酐232mg(2.325mmoL)，20-25℃搅拌反应18h。向反应液中加入70mL二氯甲烷，饱和氯化钠溶液洗涤(40mL×1)。二氯甲烷相无水硫酸钠干燥，脱除溶剂。残余物加入二氯甲烷15mL溶解，滴加乙酸乙酯100mL，有固体析出。过滤，干燥得到679mg粗品化合物Ⅰ-9。Ⅰ-9粗品经制备液相分离纯化得到278mgⅠ-9。HPLC纯度96.05％。ESI-HRMS(m/z):4614.7440[M-H]-；2329.5134[M/2+Na]+.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.09(d,J＝6.5Hz,1H),7.99-7.66(m,22H),7.37-7.26(m,4H),7.24-7.14(m,5H),6.97(s,1H),6.91-6.80(m,4H),6.58(d,J＝6.5Hz,1H),5.35(s,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,6H),4.97(dd,J＝11.2,3.4Hz,6H),4.49(d,J＝8.5Hz,6H),4.19(d,J＝3.6Hz,1H),4.02(q,J＝6.2,5.3Hz,18H),3.95-3.83(m,9H),3.73(s,6H),3.71-3.67(m,5H),3.56(t,J＝6.4Hz,25H),3.44-3.36(m,24H),3.03(p,J＝6.2Hz,25H),2.94(s,2H),2.47-2.37(m,4H),2.29(t,J＝6.4Hz,18H),2.24-2.17(m,3H),2.12-1.96(m,52H),1.89(s,18H),1.77(s,18H),1.49(td,J＝16.7,15.1,6.2Hz,40H),1.21(s,12H).
实施例1.10：化合物I-10的合成
合成路线如下：
步骤1：化合物70的合成
反应瓶中加入化合物69(1100mg，0.57mmoL)，DMF 30mL，10％ Pd/C200mg。氢气置换三次，氢气氛围下室温反应6h。过滤，脱除溶剂，得到类白色固体985mg，即化合物70，收率96.3％。
步骤2：化合物71的合成
化合物70(985mg，0.55mmoL)，化合物6(92mg，0.25mmoL)，N,N-二异丙基乙胺129mg(0.99mmoL)，DMF 30mL，HATU 286mg(0.75mmoL)，室温反应17h。向反应液中加入40mL饱和氯化钠溶液，60mL二氯甲烷，分液。有机相饱和氯化钠溶液洗涤(40mL×2)，无水硫酸钠干燥，脱除溶剂。残余物加入二氯甲烷5mL溶解，滴加125mL乙酸乙酯，有固体析出。过滤，干燥，得到类白色固体化合物71 790mg，收率81.2％。
步骤3：化合物72的合成
化合物71(790mg，0.20mmoL)，DMF 30mL，10％ Pd/C 80mg加入反应瓶。氢气置换三次，氢气氛围下，室温反应6h。过滤，脱除溶剂，得到类白色固体化合物72 771mg，收率101.0％。
步骤4：化合物73的合成
化合物72(771mg，0.20mmoL)，化合物17(143mg，0.20mmoL)，N,N-二异丙基乙胺100mg(0.82mmoL)，二氯甲烷40mL，HATU 233mg(0.61mmoL)，室温搅拌反应2h。向反应液中加入饱和氯化钠溶液40mL，二氯甲烷50mL，分液。有机相饱和氯化钠溶液洗涤(40mL×2)，无水硫酸钠干燥，脱除溶剂。残余物加入二氯甲烷3mL溶解，滴加乙酸乙酯75mL，有固体析出。过滤，干燥得到白色固体778mg，即化合物73，收率86.9％。
步骤5：化合物I-10的合成
丁二酸酐266mg(2.65mmoL)，DMAP 324mg(2.65mmoL)，三乙胺359mg(3.54mmoL)，二氯甲烷40mL，化合物73 778mg(0.18mmoL)加入反应瓶中，室温反应24h。向反应液中加入饱和氯化钠溶液40mL，二氯甲烷40mL，分液。有机相无水硫酸钠干燥，脱除溶剂，得到灰白色固体711mg，即化合物Ⅰ-10粗品，收率89.4％。Ⅰ-10粗品经制备液相分离纯化得到277mgⅠ-10。HPLC纯度97.83％。ESI-HRMS(m/z):4499.6808[M-H]-.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.91-7.65(m,19H),7.34-7.12(m,11H),6.87(ddd,J＝9.0,5.2,2.3Hz,4H),5.35(s,1H),5.21(d,J＝3.4Hz,6H),4.97(dd,J＝11.2,3.5Hz,6H),4.49(d,J＝8.4Hz,6H),4.20(s,1H),4.02(q,J＝4.0Hz,18H),3.87(dt,J＝11.0,8.9Hz,6H),3.71(d,J＝16.8Hz,12H),3.55(d,J＝6.3Hz,16H),3.47(d,J＝42.4Hz,16H),3.41-3.33(m,12H),3.03(t,J＝6.0Hz,25H),2.48-2.11(m,26H),2.10(s,18H),2.04(t,J＝7.1Hz,12H),1.99(s,18H),1.89(s,18H),1.77(s,18H),1.48(dt,J＝20.0,7.0Hz,40H),1.21(s,12H).
实施例2：化合物I-x(x＝1～10)固相载体的合成
以化合物I-1固相载体合成为例，反应式如下：
将化合物I-1(40mg，12.4μmoL)加入10mL DMF中，继续加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐56.4mg(148.8μmoL)，N,N-二异丙基乙胺32.0mg(248.0μmoL)。反应体系中加入胺基修饰的固相载体(CPG-NH2)1.6g，25℃振荡反应24h。反应完成后过滤。残余物用乙腈洗涤，二氯甲烷洗涤。继续加入20％乙酸酐/80％乙腈溶液，25℃振荡反应24h，反应完成后过滤。滤饼依次用乙腈洗涤，二氯甲烷洗涤，得到固相载体目标产物I-1-CPG，即Ⅰ-1固相载体，测得I-1的载量为30.77μmoL/g。
依照此法依次合成固相载体I-2-CPG，I-3-CPG，I-4-CPG，I-5-CPG，I-6-CPG，I-7-CPG，I-8-CPG，I-9-CPG，I-10-CPG，目标GalNAc分子载量分别为40.38μmoL/g，37.25μmoL/g，33.10μmoL/g，30.28μmoL/g，33.77μmoL/g，28.80μmoL/g，30.53μmoL/g，42.45μmoL/g，48.37μmoL/g。
实施例3：靶向小鼠TTR基因的siRNA缀合物的制备与活性测试
合成靶向小鼠TTR基因的siRNA，SS链3’末端链接半乳糖分子簇(式Ⅰ-x,x＝1～10化合物)。
SS链(5’-3’)：asasc agu GuU CUu gcu cua uaa
AS链(5’-3’)：usUsa uaG agc aag aAc Acu guus usu
siRNA合成所需核苷单体原料2’-O-甲基等核苷亚磷酰胺单体购自上海兆维科技发展有限公司。3％二氯乙酸作为脱保护剂，0.25M 5-乙硫基-1H-四唑乙腈溶液作为活化剂，N,N-二甲基-N'-(3-硫代-3H-1,2,4-二硫唑-5-基)甲脒的吡啶溶液作为硫化试剂，0.05M碘/吡啶/水溶液作为氧化剂，20％乙酸酐乙腈溶液为盖帽剂A，20％乙腈/N-甲基咪唑/吡啶溶液为盖帽剂B，以上相关合成试剂均购自苏州柯乐玛生物技术有限公司。每条RNA单链采用亚磷酰胺固相合成，以I-x-CPG,x＝1～10为起始，使用DNA合成仪根据合成程序连接核苷亚磷酰胺单体。每个核苷单体连接时包括脱保护、偶联、氧化或硫化、盖帽四步反应。
固相合成完成后，寡核苷酸采用28％氨水在55℃条件下氨解16h。将上清液浓缩蒸干，使用Resource 15Q色谱柱纯化，通过溴化钠溶液梯度洗脱，并使用3％三氟乙酸溶液脱除DMTr，纯化获得寡核苷酸链。收集洗脱液，采用葡聚糖凝胶G25凝胶柱进行脱盐，获得的寡核苷酸链收集后冻干，离子对色谱检测纯度，高分辨质谱分析目标产物分子量。紫外定量所得到的单链寡核苷酸，按等摩尔比互补配对，溶于水中，按常规退火方法形成双链siRNA，即Ⅱ-xa,x＝1-10，调整至实验所需浓度备用。表1为Ⅱ-xa，x＝1-10的SS链和AS链的结构。
表1Ⅱ-xa，x＝1-10的SS链和AS链的结构
备注：小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2’-氟修饰的核苷酸，小写字母a、g、c、u为2’-OMe修饰核苷酸，小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间通过硫代磷酸二酯键连接。
实施例4：小鼠体内对TTR mRNA表达的抑制
采用8周龄的C57BL/6小鼠(集萃药康，SPF，雌性)，随机分组。第0天，在小鼠肩颈部皮肤，给予0.9mg/kg各siRNA缀合物，同时，给予生理盐水作为对照组。分别在0、7、14、21、28天、35天，每组安乐死3只小鼠，取肝脏组织样本。使用实时荧光PCR法检测小鼠肝组织TTR的mRNA表达水平。采用RNAeasy Mini试剂盒(Qiagen，货号74104)提取肝总RNA，根据HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kits(Thermo Fisher，货号：4368814)逆转录得到cDNA进行RT-PCR。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为内参基因，按照表2所示RT-PCR方法，分别采用小鼠TTR和GAPDH的Taqman探针引物(表3)检测mRNA表达量。采用2^(-ΔΔCt)法计算小鼠TTR mRNA表达量，并计算siRNA缀合物Ⅱ-xa,x＝1-10对TTR mRNA的抑制效果。
表2实时荧光定量PCR条件
表3检测引物序列
图1为缀合物Ⅱ-1a～Ⅱ-5a对肝脏TTR mRNA的抑制水平，图2为缀合物Ⅱ-6a～Ⅱ-10a对肝脏TTR mRNA的抑制水平，对照组TTR mRNA表达率为100％。由图1、图2可见，载体化合物Ⅰ-1～Ⅰ-10均具备将寡核苷酸靶向递送至肝脏的能力，其对应的siRNA缀合物Ⅱ-1a～Ⅱ-10a均能有效降低肝TTR mRNA水平。尤其是载体化合物Ⅰ-3、Ⅰ-5、Ⅰ-8对应的的siRNA缀合物Ⅱ-3a、Ⅱ-5a、Ⅱ-8a可在长达35天时间里将TTR mRNA表达水平控制在20％以下。
实施例5：靶向小鼠ANGPTL3基因的siRNA缀合物的制备与活性测试合成靶向小鼠ANGPTL3基因的siRNA，SS链3’末端链接半乳糖分子簇(式Ⅰ-x,x＝1～10化合物)。
SS链(5’-3’)：csgsa aac CaA CUa uac gcu aca
AS链(5’-3’)：usGsu agC gua uag uUg Guu ucg usgs
siRNA合成所需核苷单体原料2’-O-甲基等核苷亚磷酰胺单体和试剂来源与实施例3相同。每条RNA单链采用亚磷酰胺固相合成，以I-x-CPG’,x＝1～10为起始，使用DNA合成仪根据合成程序连接核苷亚磷酰胺单体。每个核苷单体连接时包括脱保护、偶联、氧化或硫化、盖帽四步反应。
固相合成完成后，寡核苷酸采用28％氨水在55℃条件下氨解16h。将上清液浓缩蒸干，使用Resource 15Q色谱柱纯化，通过溴化钠溶液梯度洗脱，并使用3％三氟乙酸溶液脱除DMTr，纯化获得寡核苷酸链。收集洗脱液，采用葡聚糖凝胶G25凝胶柱进行脱盐，获得的寡核苷酸链收集后冻干，离子对色谱检测纯度，高分辨质谱分析目标产物分子量。紫外定量所得到的单链寡核苷酸，按等摩尔比互补配对，溶于水中，按常规退火方法形成双链siRNA，即Ⅱ-xb,x＝1-10，调整至实验所需浓度备用。表4为Ⅱ-xb’，x＝1-10的SS链和AS链的结构。
表4Ⅱ-xb’，x＝1-10的SS链和AS链的结构
备注：小写字母a、g、c、u为2’-OMe修饰核苷酸，小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间通过硫代磷酸二酯键连接。
实施例6：ELISA测定ANGPTL3蛋白含量
为了评价靶向小鼠ANGPTL3基因的siRNA缀合物体内活性，使用6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠，随机分为11组，每组6只。在第-1天14小时禁食后获得给药前血清样品；第0天在各组小鼠肩颈部皮肤单次皮下给予1mg/kg的ANGPTL3 siRNA缀合物，同时，给予生理盐水作为对照组。在第7、14、21、28、35天收集血清样品，每次收集前14小时将小鼠禁食。血清中的ANGPTL3蛋白含量通过Mouse ANGPTL3 ELISA Kit进行检测(Solarbio，货号SEKM-0202)。
对于各组动物的ANGPTL3蛋白水平进行标准化，即在某一时间对于各动物的ANGPTL3蛋白含量除以该动物给药前(在第1天)的ANGPTL3蛋白含量以确定“标准化至治疗前”的表达比，然后将实验组各动物“标准化至治疗前”的表达比除以对照组所有小鼠的“标准化至治疗前”的表达比的平均值，以保证各动物的ANGPTL3蛋白含量标准化至对照组。
实施例7：血清中ANGPTL3蛋白表达水平
标准化后的ANGPTL3蛋白含量结果如图3-4所示，图3为缀合物Ⅱ-1b’～Ⅱ-5b’对血清中ANGPTL3蛋白的抑制水平，图4为缀合物Ⅱ-6b’～Ⅱ-10b’对血清中ANGPTL3蛋白的抑制水平，对照组ANGPTL3蛋白表达量为100％。由图3、图4可见，载体化合物Ⅰ-1’～Ⅰ-10’均具备将寡核苷酸靶向递送至肝脏的能力，其对应的siRNA缀合物Ⅱ-1b’～Ⅱ-10b’均能有效降低血清中ANGPTL3蛋白水平。尤其是载体化合物Ⅰ-3、Ⅰ-5、Ⅰ-8对应的siRNA缀合物Ⅱ-3b’、Ⅱ-5b’、Ⅱ-8b’可在长达35天时间里将ANGPTL3蛋白水平控制在50％以下。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种肝靶向化合物，其特征在于，具有式(Ⅰ)所示的结构：
其中，R为对哺乳动物肝脏表面去唾液酸糖蛋白受体具有亲和力的配体基团，所述配体基团中含有羟基和胺基，且所述羟基、胺基部分或全部可被乙酰基保护，R1为氧、硫、硒、亚甲基中的的任意一种，R2为羟基保护基，n1为1-5的整数，n2为4-10的整数，M+为阳离子。
2.根据权利要求1所述的肝靶向化合物，其特征在于，R具有如下结构的任意一种：
其中，R4为氧、硫、硒、亚甲基中的任意一种，R3为含N-乙酰半乳糖胺类肝靶向化合物，n3为1-5的整数，n4为1-8的整数。
3.根据权利要求2所述的肝靶向化合物，其特征在于，R3具有如下结构：
其中，R5为含N-乙酰半乳糖胺类肝靶向化合物，R6为氧、硫、硒、亚甲基中的任意一种，n5为1-6的整数，n6为1-8的整数。
4.根据权利要求3所述的肝靶向化合物，其特征在于，R5为N-乙酰基半乳糖胺类肝靶向化合物，具有如下结构的任意一种：
其中，R7为氢、乙酰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的肝靶向化合物，其特征在于，M+选自氢离子、铵离子、有机胺离子、碱金属离子或碱土金属离子中的任意一种；
R2选自三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4，4’-双甲氧基三苯甲基、4，4’，4”-三甲氧基三苯甲基中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的肝靶向化合物，其特征在于，具有以下结构的任意一种：
7.一种使权利要求1-6中任一项所述的肝靶向化合物与寡核苷酸偶联的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将式(I)化合物连接于固相载体上，所述固相载体为表面为羟基或胺基的高分子聚合物载体；
(2)连接于固相载体的化合物(Ⅰ)通过脱保护工序脱去羟基保护基，在偶联反应条件下，将脱去羟基保护基的化合物与核苷酸单体接触，连接上第一个核苷酸；
(3)通过亚磷酰胺固相合成方法合成所述寡核苷酸；
(4)将所述寡核苷酸与所述固相载体切割，分离纯化，退火，得到寡核苷酸缀合物。
8.一种寡核苷酸缀合物，其特征在于，具有式(II)所示的结构：
其中，R、R1、n1、n2如权利要求1-4中任一项的式(I)肝靶向化合物中所定义；Nu代表功能性寡核苷酸；表示基团通过共价键连接的位点。
9.根据权利要求8所述的寡核苷酸缀合物，其特征在于，具有以下结构中的任意一种：
10.根据权利要求8所述的寡核苷酸缀合物，其特征在于，所述功能性寡核苷酸为单链寡核苷酸，式(Ⅱ)中的P连接到所述单链寡核苷酸的末端；或，所述功能性寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，式(Ⅱ)中的P连接到所述正义链的3’末端。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的寡核苷酸缀合物在制备用于治疗和/或预防由肝细胞中特定基因表达所引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
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- 2023-10-19 CN CN202311361153.4A patent/CN117624266A/zh active Pending
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2024
- 2024-10-16 WO PCT/CN2024/125127 patent/WO2025082371A1/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2025082371A1 (zh) * | 2023-10-19 | 2025-04-24 | 弘亮(上海)生物医药科技有限公司 | 一种肝靶向化合物及其寡核苷酸缀合物、偶联方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2025082371A1 (zh) | 2025-04-24 |
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