KR20190133233A - 항체-약물 접합체를 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항체-약물 접합체(ADC)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특별히, 이러한 방법은 정전기적 상호작용을 통한 항체 생물분자 및 이온 교환 담체의 조합을 주로 이용하여 ADC 약물의 고체 상 제조를 실현한다. 용리 조건은, 약물-대-항체 커플링 비(DAR)를 조절하고, 중합체-커플링된 약물을 분리하며, 커플링 반응에 사용되는 약물의 양을 감소시키고, ADC 약물의 목표하는 치료학적 효과를 증진시키기 위해 최적화된다. 제조 방법은 더 적은 단계, 간단한 조작, 및 프로그래밍이 가능한 조절을 특징으로 하면서, 산업적 규모-확장 생산을 용이하게 하고, 또한 제조 공정에서 환원제 및 유기 용매를 전혀 보유하지 않게 하며, 약물 안전성을 상당히 향상시키고, 생산 비용을 감소시킨다.
Description
본 발명은 2017년 3월 30일자로 출원된 중국 특허 출원 제CN201710202043.1호, 2017년 4월 11일자로 출원된 중국 특허 출원 제CN201710233373.7호 및 2017년 5월 16일자로 출원된 중국 특허 출원 제CN201710342257.9호를 우선권 주장한다. 이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용된다.
본 발명은 항체-약물 접합체를 제조하는 방법에 관한 것이고, 특별히 담체로서 이온 교환 칼럼을 사용하여 항체-약물 접합체(ADC)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
ADC 약물을 제조하기 위한 종래의 커플링 방법은 라이신 커플링, 경쇄-및-중쇄 쇄간 환원적 디설파이드 가교 커플링 및 자리-지정된 커플링을 포함한다[벡(Beck A), 라이허트(Reichert JM)의 문헌 "항체-약물 접합체: 현재와 미래(Antibody-drug conjugates: Present and future); MAbs, 2014, 6: 15-17"; 맥콤스(McCombs JR), 오웬(Owen SC)의 문헌 "항체-약물 접합체: 연결기, 페이로드 및 접합 화학의 고안 및 선택(Antibody-drug conjugates: design and selection of linker, payload and conjugation chemistry). The AAPS journal, 2015, 17: 339-351"]. 라이신 커플링 플랫폼 기술은 이작용성 기 가교결합 시약을 이용하여, 항체의 라이신 잔기를 무작위적으로 변형시킨 다음, 독성 소분자, 예컨대 메이탄신(maytansin) 유도체 DM1, DM4 등의 머캅토 기와 반응시켜 커플링을 달성한다. 이미 시판되고 있는 T-DM1[카드사일라(Kadcyla)]이 이러한 기술을 채택한다. 경쇄-및-중쇄 쇄간 환원적 디설파이드 가교 커플링은 항체의 경쇄와 중쇄 사이의 디설파이드 가교를 환원시켜 시스테인 잔기를 생산하고, 이어서 폴리펩티드-가교결합기가 함유된 독소, 예컨대 아플리시아톡신(aplysiatoxin) 유도체 메틸라우리스타틴 E(MMAE: Methylauristatin E) 또는 커플링을 위한 기타 유사체와 반응시킴으로써 달성된다. 이미 시판되고 있는 ADC 약물 아드세트리스(Adcetris)는 이러한 기술을 채택한다. 자리-지정된 커플링은, 주로 새로운 아미노산, 예컨대 시스테인을 도입함으로써 아미노산 서열을 변형시켜, 독성의 소분자가 항체에 지정되어 결합되도록 한다. 이러한 기법은 현재 개발 초기 단계에 있다[파노우스키(Panowski S) 등의 문헌 "암 치료법을 위한 자리-지정된 항체-약물 접합체(Site-directed antibody-drug conjugates for cancer therapy). MAbs. Taylor & Francis, 2014, 6: 34-45"]. 현재, 시판되는 ADC 약물은 주로 라이신 커플링 및 경쇄-및-중쇄 쇄간 환원적 디설파이드 가교 무작위 커플링에 기초한다. 이들 두 방법에 의해 수득된 ADC 약물은 단일클론성 항체에 커플링되는 약물의 수에 크게 차이가 있으므로, 약물의 이종성을 초래하고, 이는 ADC 회분식 생산의 일관성에 대한 큰 어려움이다[왕(Wang L) 등의 문헌 "질량 분석에 의한 메이탄시노이드-단일클론성 항체 면역접합체, huN901-DM1의 구조적 특징(Structural characterization of the maytansinoid-monoclonal antibody immunoconjugate, huN901-DM1, by mass spectrometry). Protein science, 2005, 14: 2436-2446"]. 약물 독소-항체 커플링 비(DAR)는 각각의 항체에 커플링된 독성 약물 소분자의 평균 수를 나타낸다. 연구에 따르면, 항체에 커플링된 독성 분자의 수는 ADC의 중합화, 결합 항원의 활성, 혈액 순환시 소거, 및 ADC의 활성 및 내인성에 영향을 준다. 너무 낮은 DAR 값은 그의 활성을 감소시키는 반면, 너무 높은 DAR 값은 혈액 순환시 ADC 약물의 반감기 및 내인성을 감소시킬 것이고, 이는 항원으로의 ADC 약물의 효과적인 결합을 손상시킬 것이다. 한편, 약물의 효능은 또한 DAR 값의 증가에 의해 감소될 수 있다[햄블레트(Hamblett KJ) 등의 문헌 "단일클론성 항체-약물 접합체의 항종양 활성에 대한 약물 적재 효과(Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody-drug conjugate). Clin Cancer Res, 2004, 10: 7063-7070"]. 현재 시판되는 ADC 약물의 경우, 이상적인 DAR 값은 2 내지 4로 조절되어야 한다.
신규한 ADC 약물의 개발이 전례없는 성공을 달성하였지만, 이러한 기법은 여전히 더욱 개발될 필요가 있다. 이들 중에서, 전통적인 공정은 너무 많은 커플링 단계 및 복잡한 조작을 포함하고, 이는 환경 오염을 일으킬 수 있다. 이는 또한 유기 용매의 부가 및 교반을 수반하는데, 이는 피할수 없이 항체 단백질 사이에서의 충돌 및 가교결합 화합물과 중합체의 생산을 유도한다. 게다가, 다양한 유기 용매를 완전히 제거하는 것이 어렵고, 이는 ADC 약물의 면역원성 및 기타 부작용을 일으킬 수 있고, 이로써 이의 신속한 개발을 제한한다. 또한, DAR 값은 또한 ADC 약물의 제조시 핵심적인 품질 관리 매개변수이고, 이는 또한 커플링 및 정제 공정에 대한 연구를 필요로 한다. DAR 값은 회분식 생산의 일관성 및 안정성을 확보하는 목표 범위내에서 조절되고, 부산물 응집의 함량은 조절되고 가능한한 많이 제거되어야 한다.
특허(제CN104208719A호)는 DAR 값 및 중합체를 양이온 교환 크로마토그래피 정제에 의해 조절하지만, 이 특허는 단지 정제 및 분리 수단을 제공하였을 뿐, 이는 ADC 생산 공정의 복잡성을 바꾸지 않았을 뿐만 아니라 다양한 유기 용매를 완전히 제거할 수도 없었다.
공정의 변형에 있어서, UK의 에반스(Evans)는 ADC의 고체 상 제조를 발명하였다(제CN105579066A호). 그는 친화도 충전제 단백질 A 수지를 고정제로서 사용하고, 단일클론성 항체를 수지에 대한 그의 친화도를 통해 단백질 A에 결합시킨 다음, 단일클론성 항체를 각각 가교결합기 또는 독소와 반응시켰다. 이러한 연구는 생산 단계를 감소시켰지만, 단백질 A 친화도 충전제의 불량한 알칼리 내성 및 높은 비용으로 인해, 생산에서의 이러한 기술의 확산 및 적용은 크게 제한되었다.
특허 제CN101087611A호(이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용됨)는 말레이미드 기, 머캅토 기 및 할로아세틸 기를 포함하는 가교결합기에 의해 항체를 DM1, DM3, DM4에 커플링시키는 방법을 개시하고; 여기서 말레이미드 기는 SMCC, LC-SMCC, KMUA, GMBS, EMCS, MBS, AMAS, SMPH, SMPB 및 PMPI로부터 선택된다. 할로아세틸 기는 SIAB, SIA, SBA 및 SBAP로부터 선택된다.
특허 제CN106029083A호(이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용됨)는 티오에테르 결합을 경유하여 MMAE, MMAF를 항체에 직접 커플링시키는 가수분해된 석신이미드 고리(또는 석신산)를 개시한다.
특허 제CN106467575A호(이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용됨)는 자리-지정된 커플링에 의한 독소, 예컨대 MMAE, MMAF, PBD, SN-38 및 Dox로의 항체의 커플링을 개시한다.
출원인의 선행 특허 출원 제WO2016/127790A1호 및 제WO2015/113476호는 신규 독소 분자 및 접합체를 포함하고, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용된다. 출원인의 선행 특허 출원 제CN106188293A호는 c-Met 항체 접합체 및 이의 제조 방법을 개시한다. 출원인의 선행 특허 출원(제CN201610526367.6호)은 EGFR 항체-약물 접합체 및 이의 제조 방법을 제공한다.
그러므로, 생산 단계를 줄이고 비용을 감소시킬 뿐만 아니라, 유기 시약의 제거를 용이하게 하고 DAR 값의 조절성을 향상시키는 신규 방법은 ADC 약물 합성을 위한 중요한 실제적 의의를 가질 것이다.
본 발명은 항원-결합 단백질-약물 접합체(ADC)를 제조하는 방법을 제공하고, 이는 정전기적 상호작용을 통한 항체 생물분자 및 이온 교환 담체의 조합을 이용함으로써 ADC 약물의 고체 상 제조를 실현한다. 용리 조건은, 약물-대-항체 커플링 비(DAR)를 조절하고, 중합체-커플링된 약물을 분리하며, 커플링 반응에 사용되는 약물의 양을 감소시키고, ADC 약물의 목표하는 치료학적 효과를 증진시키기 위해 최적화된다. 제조 방법은 더 적은 단계, 간단한 조작 및 프로그래밍이 가능한 조절을 특징으로 하면서, 산업적 규모-확장 생산을 용이하게 하고, 제조 공정에서 환원제 및 유기 용매를 전혀 보유하지 않게 하며, 약물 안전성을 상당히 향상시키고, 생산 비용을 감소시킨다. 제조 방법은 항원-결합 단백질을 이온 교환 담체 상에서 고정화하는 단계, 및 커플링에 의해 약물을 고정화된 항원-결합 단백질에 연결하는 단계를 포함하고, 커플링 생성물은 이온 교환 담체로부터 용리되고, 용리액은 수집된다. 항원-결합 단백질-약물 접합체는 특히 항체-약물 접합체일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 기술적 해결책은
1) 항원-결합 단백질을 이온 교환 담체 상에 고정화하여 고정화된 항원-결합 단백질을 형성하는 단계;
2) 고정화된 항원-결합 단백질을 약물과 접촉시켜 항원-결합 단백질-약물 접합체를 형성하는 단계; 및
3) 항원-결합 단백질-약물 접합체를 이온 교환 담체로부터 용리시키는 단계를 포함하는, 항원-결합 단백질-약물 접합체(ADC)를 제조하는 방법이다.
바람직하게는, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
1) 항원-결합 단백질을 이온 교환 담체 상에 고정화하여 고정화된 항원-결합 단백질을 형성하는 단계;
2) 고정화된 항원-결합 단백질을 커플링 반응을 위해 약물과 접촉시켜 항원-결합 단백질-약물 접합체를 형성하고; 커플링 반응을 수행하여 고정화된 항원-결합 단백질을 약물에 커플링시키는 단계; 및
3) 항원-결합 단백질-약물 접합체를 이온 교환 담체로부터 용리시키는 단계.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 항원-결합 단백질은 인간화된 항체, 뮤린 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 단일 쇄 항체 및 이중특이성 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 항원-결합 단백질은 또한, 제한되지 않지만, Fab, F(ab')2 및 scFv 단편으로부터 선택되는 항원-결합 단편일 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 항원-결합 단백질은 바람직하게는 항체로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 단일클론성 항체이다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 이온 교환 담체는, 제한되지 않지만, 이온 교환 수지, 이온 교환 막 및 이온 교환 섬유로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 이온 교환 수지이다. 이온 교환 담체는 양이온 교환 담체 또는 음이온 교환 담체로부터 선택되고, 바람직하게는 양이온 교환 담체이고, 더욱 바람직하게는 강한 양이온 교환 담체이고, 이온 교환 담체 교환기 또는 반응 리간드는 고도로 산성인 반응 리간드로부터 선택되고, 바람직하게는 설폰산 기(-SO3H)이다. 이온 교환 담체에 사용되는 매트릭스는, 제한되지 않지만, 소수성 고분자량 중합체로부터 선택되는, 예컨대 폴리스티렌 및 폴리메타크릴레이트, 바람직하게는 폴리메타크릴레이트인 소수성 매트릭스; 및 제한되지 않지만, 친수성 중합체로부터 선택되는, 예컨대 아가로스 또는 덱스트란, 바람직하게는 아가로스인 친수성 매트릭스를 포함하고; 이온 교환 담체에 사용되는 매트릭스는 중성 매트릭스의 중합체를 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, "이온 교환 담체" 및 "담체"는 상호교환적으로 사용될 수 있고 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 단계 2)에서 커플링 반응은 항원-결합 단백질 및 약물이 친핵성 기와 친전자성 기 사이의 상호작용에 의해 연결되도록 하고; 친핵성 기는 항원-결합 단백질 또는 약물로부터, 바람직하게는 항원-결합 단백질로부터 유래하고; 친전자성 기는 임의적으로 항원-결합 단백질 또는 약물로부터, 바람직하게는 약물로부터 유래된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 친핵성 기는 머캅토, 하이드록실 기, 아미노 기, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트 및 아릴 하이드라지드 기로 구성된 군으로부터 선택되되,
친핵성 기가 약물로부터 유래할 때, 친핵성 기는 바람직하게는 머캅토 기여야 하고; 친핵성 기가 항원-결합 단백질로부터 유래할 때, 친핵성 기는 바람직하게는 아미노 기(예를 들어 본 발명의 실시태양 2), 머캅토 기(예를 들어 본 발명의 실시태양 9) 또는 하이드록실 기이고; 아미노 기는 더욱 바람직하게는 N-말단 아미노 기, 측쇄 아미노 기, 또는 글리코실화 항원-결합 단백질에서 당류의 아미노 기이고; 하이드록실 기는 더욱 바람직하게는 글리코실화 항원-결합 단백질에서 당류의 하이드록실 기이고, 머캅토 기는 더욱 바람직하게는 티올 측쇄이고, 가장 바람직하게는 시스테인의 티올 측쇄여야 한다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 머캅토는 항체의 분열 환원에 의해 생산된 연결기로부터 유래하고, 아미노 기는 분열 환원을 겪지 않는 항체의 그 자신의 연결기로부터 유래된다.
본 발명의 한 바람직한 실시태양에서, 친전자성 기는 활성 에스테르, 하이드로카빌 할라이드, 벤질 할라이드, 알데하이드, 케톤, 카복실 기 및 말레이미드 기로 구성된 군으로부터 선택되되,
친전자성 기가 항원-결합 단백질로부터 유래할 때, 친전자성 기는 바람직하게는 알데하이드, 케톤, 카복실 기 또는 말레이미드 기로부터 유래하고, 더욱 바람직하게는 말레이미드 기이고; 친전자성 기가 약물로부터 유래할 때, 친전자성 기는 바람직하게는 활성 에스테르, 하이드로카빌 할라이드 또는 말레이미드 기이고, 더욱 바람직하게는 말레이미드 기이고; 활성 에스테르는 바람직하게는 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포메이트 또는 산 할라이드이고, 하이드로카빌 할라이드는 바람직하게는 할로아세트아미드이다.
본 발명의 한 바람직한 실시태양에서, 친전자성 기는 약물 그 자체로부터 또는 약물의 변형으로부터 유래된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 커플링 반응은 라이신 커플링, 경쇄-및-중쇄 쇄간 환원적 디설파이드 가교 커플링 또는 자리-지정된 커플링, 바람직하게는 라이신 커플링, 경쇄-및-중쇄 쇄간 환원적 디설파이드 가교 커플링으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명에 기재된 경쇄-및-중쇄 쇄간 환원적 디설파이드 가교 커플링은 경쇄와 중쇄 사이의 환원적 디설파이드 가교 커플링을 포함하고, 또한 중쇄 사이의 환원적 디설파이드 가교 커플링을 포함한다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 단계 1)의 항원-결합 단백질의 전도율은 이온 교환 담체와 접촉시키기 이전에 5 mS/cm 미만으로 조정된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 단계 1)의 항원-결합 단백질은 pH가 5.5 내지 7.0, 바람직하게는 6.3인 완충액에서 이온 교환 담체 상에 고정화되고, 완충액은 인산염 완충액, 아세트산염 완충액, 시트르산염 완충액 및 석신산염 완충액으로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 인산염 완충액이다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 단계 2)에 기재된 커플링 반응에서, 0.2 내지 2 ㎖/분의 유량으로 이온 교환 담체를 통해 약물을 느리게 유동시킴으로써 약물 대 항원-결합 단백질의 몰 비가 6 : 1 미만의 양으로 조절된다. 반응 온도는 실온이고, 이는 10 내지 37℃의 값이고; 온도 값은 정수 또는 소수이고, 비제한적 실시태양에서 바람직하게는 20 내지 25℃이고; 산업적 생산을 위한 통상적인 온도는 25℃이다. 더 높은 온도는 중합체의 형성을 증가시킬 것이다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 단계 3)의 용리는 상이한 염 농도를 갖는 완충액을 사용하는 단계식 용리를 포함하고, 완충액은 5.0 내지 6.5, 바람직하게는 5.5의 pH를 갖는다. 완충액은 인산염 완충액, 아세트산염 완충액, 시트르산염 완충액, 석신산염 완충액, 바람직하게는 시트르산염 완충액으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 단계식 용리는 용리의 제1 단계 및 용리의 제2 단계를 포함하고, 제1 단계 용리의 염 농도는 100 내지 140 mM, 바람직하게는 110 mM이고, 제2 단계 용리의 염 농도는 150 내지 200 mM, 바람직하게는 180 mM이다.
본 발명은 또한 항원-결합 단백질-약물 접합체(ADC)를 제조하기 위한 최적화된 방법에 관한 것으로, 이는 항원-결합 단백질을 가교결합기에 결합시켜 친핵성 기를 생산함을 포함한다. 본 발명에서 예시적인 실시태양은 실시태양 2, 3, 4, 5 및 6이고;
1) 항원-결합 단백질을 이온 교환 담체 상에 고정화하여 고정화된 항원-결합 단백질을 형성하는 단계;
2) 고정화된 항원-결합 단백질을 커플링 반응을 위해 약물과 접촉시켜 항원-결합 단백질-약물 접합체를 형성하는 단계; 및
3) 항원-결합 단백질-약물 접합체를 이온 교환 담체로부터 용리시키는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 단계 1)은
a) 항원-결합 단백질을 가교결합기에 결합시켜 변형된 항원-결합 단백질을 수득하는 단계;
b) 변형된 항원-결합 단백질을 이온 교환 담체 상에 고정화하여 고정화된 항원-결합 단백질을 형성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 항원-결합 단백질을 가교결합기에 결합시키기 위한 온도는 20 내지 40℃이다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 항원-결합 단백질의 가교결합기로의 결합은 pH가 4.0 내지 5.5, 바람직하게는 4.3인 완충액에서 실행되고; 완충액은 바람직하게는 아세트산염 완충액, 더욱 바람직하게는 아세토니트릴을 함유한 아세트산염 완충액이다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 단계 1)은 추가로 단계 c를 포함한다:
c. 보호제거제를 첨가하는 단계(이러한 보호제거제는 바람직하게는 NH2OH·HCl임).
본 발명은 또한 항원-결합 단백질-약물 접합체(ADC)를 제조하기 위한 또 다른 최적화된 방법에 관한 것이고, 이는 항원-결합 단백질을 환원시켜 친핵성 기를 생산함을 포함하고, 본 발명에서 이의 예시적인 실시태양은 실시태양 9이다. 이 방법은
1) 항원-결합 단백질을 이온 교환 담체 상에 고정화하여 고정화된 항원-결합 단백질을 형성하는 단계;
2) 고정화된 항원-결합 단백질을 커플링 반응을 위해 약물과 접촉시켜 항원-결합 단백질-약물 접합체를 형성하는 단계;
3) 항원-결합 단백질-약물 접합체를 이온 교환 담체로부터 용리시키는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 단계 1)은 다음을 포함한다:
A. 항원-결합 단백질을 이온 교환 담체 상에 고정화하여 고정화된 항원-결합 단백질을 형성하는 단계;
B. 환원제를 첨가함으로써 고정화된 항원-결합 단백질의 디설파이드 가교를 환원시켜 머캅토(약물과의 커플링을 위한 친핵성 기 티올)를 생산하는 단계.
여기서 환원제는 바람직하게는 TCEP, DTT, 머캅토에틸아민 및 Ac-Cys로 구성된 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 TCEP이다. 환원제는 항체의 몰 농도의 4 내지 8배의 양, 바람직하게는 항체의 몰 농도의 6배의 양으로 사용된다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 단계 B에서 환원 반응의 온도는 25 내지 45℃, 바람직하게는 40℃이다.
본 발명에서, 약물은 독소(예를 들어, 세균, 곰팡이, 식물 또는 동물로부터 유래된 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편), 화학치료제, 성장 저해제, 튜불린(tubulin) 저해제, 항생제, 방사성동위원소, 핵산분해 효소 및 기타 세포독성제를 포함하고; 약물은 종양세포의 미세소관을 저해하거나 DNA를 분열시킴으로써 종양을 제거할 수 있을 필요가 있으며; 독소는, 제한되지 않지만, 소분자 약물, 예컨대 캄프토테신(camptothecin) 유도체, 칼리케아미신(calicheamicin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴(auristatin), 트리코테센(trichothecene), 및 이들 약물의 세포독성적으로 활성화된 단편을 포함하고; 약물은 메이탄시노이드의 유도체, 바람직하게는 DM1, DM3 및 DM4로 구성된 군으로부터 선택되거나; 또한 아우리스타틴 유도체, 바람직하게는 MMAE 및 MMAF로부터 선택될 수 있거나; 캄프토테신 알칼로이드, 바람직하게는 CPT, 10-하이드록시-CPT, CPT-11[이리노테칸(irinotecan)], SN-38 및 토포테칸(topotecan), 더욱 바람직하게는 SN-38로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 항원-결합 단백질은 HER2, HER3, CD33, VEGF, VEGFR, VEGFR-2, CD152, CD40, TNF, IL-1, IL-5, IL-17, IL-6R, IL-1, IL-2R, BLYS, OX40L, CTLA4, PCSK9, EGFR, c-Met, CD2, CD3, CD11a, CD19, CD30, CD38, CD20, CD52, CD60, CD80, CD86, TNF-α, IL-12, IL-17, IL-23, IL-6, IL-1β, RSVF, IgE, RANK, BLyS, α4β7, PD-1, CCR4, SLAMF7, GD2, CD21, CD79b, IL20Rα, 브레비칸(brevican), CD22, CD79a, CD72, IGF-1R 및 RANKL로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드에 결합한다.
본 발명의 방법에서, 항원-결합 단백질은 추가로 후미라(Humira)[아달리무맙(adalimumab)], 아바스틴(Avastin)[베바시주맙(bevacizumab)], 에르비툭스(Erbitux)[세툭시맙(cetuximab)], 헤르셉틴(Herceptin)[트라스투주맙(Trastuzumab)], 페르제타(Perjeta)[페르투주맙(Pertuzumab)], 벡티빅스(Vectibix)[파니비주맙(Panibizumab)], 테랄록(Theraloc)[네투주맙(Netuzumab)], 예르보이(Yervoy)[이필리무맙(Ipilimumab)], 옵디보(Opdivo)[나볼루맙(Navolumab)], 루센티스(Lucentis)[라니비주맙(Ranibizumab)], 엔브렐(Enbrel)[에나셉트(Enacept)], 마이오신트(Myoscint)[임시로맙 펜테테이트(Imciromab pentetate)], 프로스타신트(ProstaScint)[카프로맙 펜데티드(Capromab pendetide)], 레미카데(Remicade)[인플릭시맙(Infliximab)], 레오프로(ReoPro)[압식시맙(Abciximab)], 리툭산(Rituxan)[리툭시맙(rituximab)], 시물렉트(Simulect)[바실릭시맙(Basiliximab)], 시나기스(Synagis)[팔리비주맙(Palivizumab)], 베를루마(Verluma)[노페투모맙(Nofetumomab)], 졸레어(Xolair)[오말리주맙(Omalizumab)], 제나팍스(Zenapax)[다클리주맙(Daclizumab)], 심지아(Cimzia)[세르톨리주맙(certolizumab)], 제발린(Zevalin)[이브리투모맙(Ibritumomab)], 오르토클론(Orthoclone)[모롬모납(Morommonab)], 파노렉스(Panorex)[에드레콜로맙(Edrecolomab)], 마일로타르그(Mylotarg)[겜투주맙(Gemtuzumab)], 솔리리스(Soliris)[에쿨리주맙(Eculizumab)], CNTO1275[우스테키누맙(ustekinumab)], 아메바이브(Amevive)[알레파셉트(Alefacept)], 랍티바(Raptiva)[에팔리주맙(Efalizumab)], 티사브리(Tysabri)[나탈리주맙(Natalizumab)], 악템라(Actemra)[토실리주맙(Tocilizumab)], 오렌시아(Orencia)[아바타셉트(Abatacept)], 아르칼리스트(Arcalyst)[릴로나셉(Rilonacep)], 스텔라라(Stelara)[우스테키누맙(Ustekinumab)], 레모밥(Removab)[카투막소맙(Catumaxomab)], 심포니(Simponi)[골리무맙(Golimumab)], 일라리스(Ilaris)[카나키누맙(Canakinumab)], 아르체라(Arzerra)[오파투무맙(Ofatumumab)], 프롤리아(Prolia)[데노수맙(Denosumab)], 벤리스타(Benlysta)[벨리무맙(Belimumab)], 눌로직스(Nulojix)[벨라타셉트(Belatacept)], 에일레아(Eylea)[아플리베르셉트(Aflibercept)], 캄파트(Campath)[알렘투주맙(Alemtuzumab)], CEA-스캔(Scan) 아르시투모맙(arcitumomab)(fab 단편), 포텔리게오(Poteligeo)[모가물리주맙(mogamulizumab)], 아브트락스(Abthrax)[락시바쿠맙(Raxibacumab)], 가자이바(Gazyva)[오비누투주맙(Obinutuzumab)], 랑 무(Lang Mu)[콘베르셉트(Conbercept)], 사이람자(Cyramza)[라무시루맙(Ramucirumab)], 실반트(Sylvant)[실툭시맙(Siltuximab)], 엔티비오(Entyvio)[베돌리주맙(Vedolizumab)], 키트루다(Keytruda)[펨브롤리주맙(Pembrolizumab)], 블린사이토(Blincyto)[블리나투모맙(Blinatumomab)], 코센틱스(Cosentyx)[세쿠키누맙(Secukinumab)], 우니툭신(Unituxin)[디누툭시맙(Dinutuximab)], 다르잘렉스(Darzalex)[다라투무맙(Daratumumab)], 프랄루엔트(Praluent)[알리로쿠맙(Alirocumab)], 레파타(Repatha)[에볼로쿠맙(Evolocumab)], 포르트라차(Portrazza)[네시투무맙(Necitumumab)], 엠플리시티(Empliciti)[엘로투주맙(Elotuzumab)], 누칼라(Nucala)[메폴리주맙(Mepolizumab)], 프락스빈드(Praxbind)[이다루시주맙(Idarucizumab)], 벡사르(Bexxar)[토시투모맙(Tositumomab) 및 I131 토시투모맙]로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 항원-결합 단백질은 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택되고, 바람직하게는 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 이들의 변이체의 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 및 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 이들의 변이체의 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역을 포함하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호 1의 경쇄 및 서열 번호 2의 중쇄를 포함한다.
mAb001-LCDR1: RSSQNIVHSNGNTYLD 서열 번호 5
mAb001-LCDR2: KVSNRFS 서열 번호 6
mAb001-LCDR3: FQYSHVPWT 서열 번호 7
mAb001-HCDR1: NYYIY 서열 번호 8
mAb001-HCDR2: GINPTSGGSNFNEKFKT 서열 번호 9
mAb001-HCDR3: QGLWFDSDGRGFDF 서열 번호 10
mAb001 경쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 제시된다:
mAb001 중쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 2에 제시된다:
다른 실시태양에서, 항원-결합 단백질은 항-c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 각각 서열 번호 11 또는 서열 번호 17, 서열 번호 12, 서열 번호 13 및 이의 변이체의 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 바람직하게는 서열 번호 17의 LCDR1, 및 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 이의 변이체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역을 포함하고; 더욱 바람직하게는 서열 번호 3의 경쇄 및 서열 번호 4의 중쇄를 포함한다.
mAb002-LCDR1: RANKSVSTSTYNYLH 서열 번호 11
mAb002-LCDR2: LASNLAS 서열 번호 12
mAb002-LCDR3: QHSRDLPPT 서열 번호 13
mAb002-HCDR1: NYGVH 서열 번호 14
mAb002-HCDR2: VIWSGGSTNYAAAFVS 서열 번호 15
mAb002-HCDR3: NHDNPYNYAMDY 서열 번호 16
최적화된 mAb002-LCDR1: RADKSVSTSTYNYLH 서열 번호 17
mAb002 경쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 3에 제시된다:
mAb002 경쇄의 아미노산 서열은 서열 번호 4에 제시된다:
본 발명의 방법에서, 약물은 변형된 또는 변형되지 않은 약물이고, 바람직하게는 변형된 약물이며; 항원-결합 단백질은 변형된 또는 변형되지 않은 항원-결합 단백질이고, 바람직하게는 변형된 단백질이다. 약물과 항원-결합 단백질 사이의 커플링은 친전자성 기와 친핵성 기의 상호작용, 또는 친핵성 기와 친전자성 기 사이의 상호작용에 의해 형성된다. 약물 및 항원-결합 단백질을 변형시키기 위한 화학 약품은 가교결합기를 비롯하여 상기 기재된 두가지 종류의 기를 형성할 수 있는 임의의 물질일 수 있고, 이로 인해 항원-결합 단백질과 약물 사이에 효과적인 연결기가 형성되어 ADC 약물을 생성할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 연결기는 항원-결합 단백질 및 약물을 효과적으로 연결시킬 수 있고, 합성된 ADC 약물은 임의의 독성 및 부작용 없이 인체에서 자가-파괴될 수 있으며, 종양 세포 상에서 약물의 효과적인 세포독성 효과를 부여한다.
ADC 약물을 사용하는 치료에서, 연결기는 중요한 역할을 하고, 이는 혈류에서 약물의 안정성을 확보할 뿐만 아니라, 종양 세포에서 약물의 신속하고 효율적인 방출을 보장한다. 현재 연결기의 두가지 주요 유형, 즉 분열성 및 비분열성 연결기가 ADC 약물에 사용되었다. 이탈가능한 연결기를 사용할 경우, ADC는 세포 엔도솜 또는 리소좀에서의 산 가수분해 또는 특이적 프로테아제 분열에 의해 독소 약물을 방출하고; 비분열성 연결기를 사용할 경우, 세포내로 이입되는(endocytosed) ADC는 소분자 약물을 방출하기 위해 소화되고 분해될 필요가 있다. 분열성 연결기는 산성 조건하에 분열되는 하이드라존 연결기, 환원 물질, 예컨대 글루타티온의 작용하에 가수분해되는 디설파이드 가교 연결기, 프로테아제-가수분해되는 폴리펩티드 연결기(Val-Cit, Phe-Lys) 및 β-글루코시드 연결기 등을 포함하고; 비분열성 연결기는 주로 티오에테르 결합을 형성할 수 있는 연결기 등을 포함한다. 상기 기재된 분열성 연결기 및 비분열성 연결기 둘 다, 바람직하게는 비분열성 연결기가 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다.
본 발명의 방법에서, 연결기를 형성하기 위해 사용되는 가교결합기는 동종이작용성 가교결합기이고, 바람직하게는 아미노-아미노 가교결합기이며(이는 양쪽 단부에서 2개의 동일한 활성화 반응기를 가짐), 주로 N-하이드록시석신이미드 에스테르 및 이미도에스테르이고(이는 단백질의 표면 상에서 염기성 아미노산의 유리 1급 아민과 반응할 수 있음), 예를 들어 석신이미드의 디석신이미딜 글루타레이트(DSG), 또는 이미데이트, 예컨대 디석신이미딜 3,3'-디티오디프로피오네이트(DSP), 디메틸 3,3'-디티오비스프로피오닌이미데이트(DTBP) 등일 수 있다.
이는 또한 양쪽 단부에 2개의 상이한 활성화 반응기를 갖는 이종이작용성 가교결합기일 수 있고, 이는 상이한 유형의 다른 기와 반응할 수 있고, 주로 N-하이드록시석신이미드-말레이미드 및 N-하이드록시석신이미드-디머캅토피리딘, 예컨대 N-하이드록시석신이미드-말레이미드의 SMCC, LC-SMCC, KMUA, GMBS, EMCS, MBS, AMAS, SMPH, SMPB 및 PMPI, N-석신이미드 3-(2-피리딘디티오)프로피오네이트(SPDP), N-하이드록시석신이미드-디머캅토피리딘의 4-석신이미딜옥시카보닐-알파-메틸-알파(2-피리딜디티오) 톨루엔(SMPT)을 포함할 수 있다.
이는 또한 또 다른 이종이작용성 가교결합기, 즉, 카복시-아미노 가교결합기일 수 있고, 이는 주로 C-말단에서의 산성 아미노산의 카복실 기와 N-말단에서의 염기성 아미노산의 1차 암모니아의 커플링을 위한 카보디이미드이다. 가교결합기는 카복실 기와 카보디이미드의 부가 생성물 중간체를 형성할 수 있고, 이어서 아미노 기와 반응하여 아미드 결합을 형성한다. 이는 주로 디사이클로헥실카보디이미드(DCC), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)를 포함한다.
이는 또한 할로아세틸 기를 갖는 또 다른 이종이작용성 가교결합기일 수 있고, 주로 SIAB, SIA, SBA 및 SBAP를 포함한다.
본 발명에서, 이온 교환 담체에 의해 항체-약물 접합체를 제조하기 위한 특정 방법은 항체 및 약물의 조합을 위해 당분야의 숙련가에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하여 몇몇 경로에 의해 달성될 수 있고; (1) 항체와 가교결합기의 반응을 공유 결합을 통해 수행하여 친핵성 기 또는 친전자성 기를 갖는 항체-가교결합기 결합 생성물을 형성하고, 이후 약물의 친전자성 기 또는 친핵성 기와 반응시키는 단계; (2) 약물과 가교결합기의 반응을 공유 결합을 통해 수행하여 친핵성 기 또는 친전자성 기를 갖는 약물-가교결합기 결합 생성물을 형성하고, 이후 항체의 친전자성 기 또는 친핵성 기와 반응시키는 단계; 및 (3) 항체를 변형시켜 친핵성 기를 형성하고, 이후 친전자성 기를 갖는 약물에 결합시키는 단계를 포함한다. 상기 항체 및 약물의 친핵성 기 또는 친전자성 기는 어떠한 제한없이 화학 약품 또는 가교결합기의 변형에 의해 임의적으로 생산될 수 있다.
본 발명의 항원-결합 단백질의 친핵성 기로는, 제한되지 않지만, 머캅토, 하이드록시 기, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트 및 아릴 하이드라지드 기, 바람직하게는 머캅토가 포함되고; 항원-결합 단백질의 친핵성 기는 가교결합기 또는 약물의 친전자성 기과 반응할 수 있어서 공유 결합을 형성하고, 가교결합기 또는 약물의 친전자성 기는 활성 에스테르, 하이드로카빌 할라이드, 벤질 할라이드, 알데하이드, 케톤, 카복실 기 및 말레이미드 기로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 하이드로카빌 할라이드 또는 말레이미드 기이고, 더욱 바람직하게는 말레이미드 기이고; 활성 에스테르는 바람직하게는 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로겐화된 포메이트, 산 할라이드이고, 하이드로카빌 할라이드는 바람직하게는 할로아세트아미드이다. 또는 항원-결합 단백질은 알데하이드, 케톤, 카복실 기 및 말레이미드 기로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 말레이미드 기인 친전자성 기를 갖고; 여기서 약물은 머캅토, 하이드록시 기, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트 및 아릴 하이드라지드 기로 구성된 군으로부터 선택되는 친핵성 기를 갖고; 상기 기재된 항원-결합 단백질 및 약물은 조합되어 ADC를 형성한다.
본 발명의 항원-결합 단백질의 친핵성 기는 또한 N-말단 아미노 기, 측쇄 아미노 기, 머캅토 측쇄 기, 글리코실화된 항원-결합 단백질에서 당류의 하이드록실 기 또는 아미노 기로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 머캅토 측쇄 기이며, 더욱 바람직하게는 시스테인의 머캅토이다. 여기서 약물은 활성 에스테르, 하이드로카빌 할라이드, 벤질 할라이드, 알데하이드, 케톤, 카복실 기 및 말레이미드 기로 구성된 군으로부터 선택되는 친전자성 기, 바람직하게는 하이드로카빌 할라이드, 말레이미드 기, 더욱 바람직하게는 말레이미드 기를 갖고; 활성 에스테르는 바람직하게는 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포메이트, 산 할라이드이고, 하이드로카빌 할라이드는 바람직하게는 할로아세트아미드이다.
본 발명에서 항체를 약물과 커플링시키기 위한 방법은 라이신 커플링 또는 경쇄-및-중쇄 쇄간 환원적 디설파이드 가교 무작위 커플링 방법, 또는 자리-지정된 커플링 방법을 채택할 수 있고; 상이한 커플링 방법은 항체 그 자체에 대해 선택적이지 않다.
몇몇 실시태양에서, 약물은 하기 화학식 Dr의 화합물, 및 이의 호변이성체, 메소화합물, 라세미체, 거울상이성체, 부분입체이성체, 및 이의 혼합물, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택되고:
[화학식 Dr]
상기 식에서,
R 및 R1 내지 R7은 수소 원자, 할로겐, 하이드록실 기, 시아노 기, 알킬 기, 알콕시 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R8 내지 R11중 하나 이상은 할로겐, 알케닐, 알킬 및 사이클로알킬로 구성된 군으로부터 선택되고, 나머지가 수소 원자이거나,
R8 내지 R11중 임의의 2개는 사이클로알킬 기를 형성하고, 나머지 2개의 기는 수소 원자, 알킬 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R14는 아릴 및 헤테로아릴로부터 선택되고, 아릴 또는 헤테로아릴은 임의적으로 수소 원자, 할로겐, 하이드록실 기, 알킬 기, 알콕시 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되는 치환기에 의해 추가로 치환되고;
R12 및 R13은 수소 원자, 알킬 기 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시태양에서, 화학식 Dr의 화합물은 항원-결합 단백질에 결합하기 이전에 변형되고, 바람직하게는 변형 후 친전자성 기를 갖고, 이후 친핵성 기를 갖는 항원-결합 단백질과 반응하여 ADC를 형성하고; 친전자성 기는 바람직하게는 말레이미드 기 또는 할로아세틸 기이고, 더욱 바람직하게는 말레이미드 기이고, 친핵성 기는 바람직하게는 머캅토 기이다.
몇몇 실시태양에서, 화학식 Dr의 화합물은 항원-결합 단백질에 결합하기 이전에 변형되고, 바람직하게는 변형 후 친핵성 기를 갖고, 이후 친전자성 기를 갖는 항원-결합 단백질과 반응하여 ADC를 형성하고; 친핵성 기는 머캅토이고, 항원-결합 단백질의 친전자성 기는 바람직하게는 말레이미드 기 또는 할로겐화된 아세틸 기이다.
몇몇 바람직한 실시태양에서, 약물은 하기 화학식 I의 화합물로부터 선택된다:
[화학식 I]
몇몇 바람직한 실시태양에서, 화학식 I의 화합물은 항원-결합 단백질에 결합하기 이전에 변형되고, 바람직하게는 변형 후 친전자성 기를 갖고, 이후 친핵성 기를 갖는 항원-결합 단백질과 반응하여 ADC를 형성하고; 친전자성 기는 바람직하게는 말레이미드 기 또는 할로아세틸 기이고, 더욱 바람직하게는 말레이미드 기이고, 바람직하게는 머캅토 기이다.
몇몇 실시태양에서, 화학식 I의 화합물은 항원-결합 단백질에 결합하기 이전에 변형되고, 바람직하게는 변형 후 친핵성 기를 갖고, 이후 친전자성 기를 갖는 항원-결합 단백질과 반응하여 ADC를 형성하고; 친핵성 기는 머캅토이고, 항원-결합 단백질의 친전자성 기는 바람직하게는 말레이미드 기 또는 할로겐화된 아세틸 기이다.
다른 실시태양에서, 변형된 약물은 하기 화학식 L1-Dr의 화합물로부터 선택된다:
[화학식 L1-Dr]
상기 식에서
L1 구조는 
; 바람직하게는 MC; 
이고;
구체적으로 
이고;
n은 2 내지 6, 바람직하게는 2 내지 5이고;
R, R2 내지 R7은 수소 원자, 할로겐, 하이드록실 기, 시아노 기, 알킬 기, 알콕시 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R8 내지 R11중 하나 이상은 할로겐, 알케닐, 알킬 및 사이클로알킬로 구성된 군으로부터 선택되고, 나머지는 수소 원자이거나,
R8 내지 R11중 임의의 2개는 사이클로알킬 기를 형성하고, 나머지 2개의 기는 임의적으로 수소 원자, 알킬 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R14는 아릴 및 헤테로아릴로부터 선택되고, 아릴 또는 헤테로아릴이 임의적으로 수소 원자, 할로겐, 하이드록실 기, 알킬 기, 알콕시 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되는 치환기에 의해 추가로 치환된다.
다른 바람직한 실시태양에서, 약물은 하기 화학식 II의 화합물로부터 선택된다:
[화학식 II]
본 발명의 방법에서, ADC 약물의 고체 상 제조는 바람직하게는 라이신 커플링 방법을 사용하여 항원-결합 단백질을 이온 교환 담체에 의해 고정화함으로써 실현되고, 항체는 가교결합기를 사용함으로써 변형되고, 이후 약물과 조합되어 ADC를 형성한다. 변형은 임의적으로 항원-결합 단백질이 이온 교환 담체 상에 고정화되기 이전 또는 이후의 변형, 바람직하게는 항원-결합 단백질이 이온 교환 담체 상에 고정화되기 이전의 변형을 포함한다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 단계 1)에서의 항원-결합 단백질은 임의적으로 변형된 항원-결합 단백질 또는 변형되지 않은 항원-결합 단백질이고, 바람직하게는 변형된 항원-결합 단백질이며; 변형된 항원-결합 단백질은 임의적으로 항원-결합 단백질을 화학적 시약 또는 가교결합기에 결합시키고, 바람직하게는 변형된 항원-결합 단백질은 가교결합기에 결합되고; 단계 2)에서의 약물은 임의적으로 변형되거나 변형되지 않고, 바람직하게는 변형된다.
몇몇 실시태양에서, 항원-결합 단백질은 항원-결합 단백질이 이온 교환 담체에 결합하기 이전에 가교결합기에 의해 변형된 후, 변형된 항원-결합 단백질이 이온 교환 담체에 고정화되고, 이후에 약물에 결합하여 ADC를 형성한다.
하나의 실시태양에서, 가교결합기는 하기 화학식 L2의 화합물을 갖는다:
[화학식 L2]
상기 식에서,
T는 H, 3급-부틸, 아세틸, n-프로피오닐, 이소프로피오닐, 트리페닐메틸, 메톡시메틸 및 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸로부터 선택되고, 바람직하게는 H 또는 아세틸이고;
R15는 수소 원자, 할로겐, 하이드록실 기, 시아노 기, 알킬 기, 알콕시 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R16은 알킬, 사이클로알킬 및 헤테로환족으로 구성된 군으로부터 선택되고;
m은 0 내지 5, 바람직하게는 1 내지 3이다.
여기서 약물은 활성 에스테르, 하이드로카빌 할라이드, 벤질 할라이드, 알데하이드, 케톤, 카복실 기 및 말레이미드 기로 구성된 군으로부터 선택되는 친전자성 기를 갖고, 바람직하게는 하이드로카빌 할라이드 또는 말레이미드 기이며, 더욱 바람직하게는 말레이미드 기이고; 활성 에스테르는 바람직하게는 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포메이트 또는 산 할라이드이고, 하이드로카빌 할라이드는 바람직하게는 할로아세트아미드이다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 변형된 약물은 화학식 L1-Dr의 화합물로부터 선택된다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 약물은 화학식 II의 화합물로부터 선택된다.
또 다른 실시태양에서, 가교결합기는 말레이미드 기 또는 할로아세틸 기의 작용부분(moiety)을 갖고; 말레이미드 기를 갖는 가교결합기는 바람직하게는 SMCC, LC-SMCC, KMUA, GMBS, EMCS, MBS, AMAS, SMPH, SMPB 및 PMPI로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 SMCC이며; 여기서 할로아세틸 기의 작용부분을 갖는 가교결합기는 바람직하게는 SIAB, SIA, SBA 및 SBAP로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 SIAB이며; 약물은 바람직하게는 머캅토 기, 하이드록시 기, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트 및 아릴 하이드라지드 기로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 머캅토 기인 친핵성 기를 갖는다.
본 발명의 방법에서, 머캅토 기는 또한 항체의 쇄간 디설파이드 가교, 즉, 시스테인 가교를 환원시킴으로써 형성될 수 있고, 이어서 친전자성 기를 갖는 약물과 반응시켜 ADC를 형성하고; 약물은 그 자신의 친전자성 기 또는 화학 약품에 의해 변형된 친전자성 기를 가질 수 있거나, 가교결합기에 의해 변형된 친전자성 기를 가질 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 환원제는 이온 교환 담체 상에 고정화된 항원-결합 단백질을 환원시키기 위해 첨가되고; 환원제는 바람직하게는, 제한되지 않지만, 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP), 디티오트레이톨(DTT), 머캅토에틸아민, 아세틸시스테인(Ac-Cys), 더욱 바람직하게는 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)이고; 약물은 바람직하게는 활성 에스테르, 하이드로카빌 할라이드, 벤질 할라이드, 알데하이드, 케톤, 카복실 기 및 말레이미드 기로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 하이드로카빌 할라이드 또는 말레이미드 기이고, 더욱 바람직하게는 말레이미드 기인 친전자성 기를 갖는다. 활성 에스테르는 바람직하게는 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포메이트 및 산 할라이드이고, 하이드로카빌 할라이드는 바람직하게는 할로아세트아미드이며; 약물 그 자체는 그 자신의 친전자성 기 또는 가교결합기에 의해 변형된 친전자성 기를 갖고, 변형은 화학적 시약 또는 가교결합기에 의한 변형을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 환원제는 트리(2-카보닐에틸)포스핀(TCEP)으로부터 선택되고, 약물은 가교결합기에 의해 변형된 친전자성 기를 갖고, 가교결합기는 말레이미드 기를 포함하고, 말레이미드 기를 포함하는 가교결합기는 바람직하게는 SMCC, LC-SMCC, KMUA, GMBS, EMCS, MBS, AMAS, SMPH, SMPB 및 PMPI로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 SMCC이다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 환원제는 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)으로부터 선택되고, 가교결합기는 할로아세틸 기의 작용부분을 갖고; 할로아세틸 기의 작용부분을 갖는 가교결합기는 바람직하게는 SIAB, SIA, SBA 및 SBAP로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 SIAB이다.
또 다른 실시태양에서, 환원제는 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)으로부터 선택되고, 약물은 화학 약품에 의해 변형된 친전자성 기를 갖고, 이는 화학식 Dr의 화합물로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 약물은 화학식 I의 화합물로부터 선택된다.
또 다른 실시태양에서, 환원제는 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)으로부터 선택되고, 친전자성 기를 갖는 약물은 화학식 L1-Dr의 화합물로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 약물은 화학식 II의 화합물로부터 선택된다.
본 발명에서 항원-결합 단백질이 약물과 상호작용하는 기는 주로 머캅토 기 및 말레이미드(또는 할로겐화된 아세틸 기)이고, 이는 비분열성 연결기에 속하는 티오에테르 결합의 구조를 형성한다. 표적 연결기를 형성하기 위해, 가교결합기가 항원-결합 단백질 또는 약물을 변형시키기 위해 사용될 수 있고, 이후 반응성 기와 반응하여 항체-약물 접합체를 형성한다. 항원-결합 단백질을 약물에 안정하게 연결시킬 수 있는 임의의 가교결합기는 본 발명에 사용하기에 적합하다. 약물이 부착되는 항원-결합 단백질의 위치는 상호교환가능하고, 티오에테르 결합의 형성은 또한 할로겐화된 아세틸 기를 유리 머캅토 기와 반응시킴으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 이온 교환 담체를 사용하여 ADC를 제조하는 방법은 하기 단계를 포함한다: 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체)을 가교결합기에 의해 변형시키는 단계, 및 항원-결합 단백질을 이온 교환 담체 상에 고정시켜 고정화된 항원-결합 단백질을 형성하는 단계; 고정화된 항원-결합 단백질을 약물과 접촉시켜 항원-결합 단백질-약물 접합체를 형성하는 단계; 및 항원-결합 단백질-약물 접합체를 이온 교환 담체로부터 용리시키는 단계.
하나의 실시태양에서, 가교결합기는 하기 화학식 L3의 화합물로부터 선택되고, 항원-결합 단백질은 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 이들의 변이체의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 및 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 이들의 변이체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역을 포함하고, 약물은 화학식 II의 화합물로부터 선택된다:
[화학식 L3]
하나의 바람직한 실시태양에서, 가교결합기는 화학식 L3의 화합물로부터 선택되고, 항원-결합 단백질은 서열 번호 1의 경쇄, 및 서열 번호 2의 중쇄를 포함하고, 약물은 화학식 II의 화합물의 화합물로부터 선택된다.
또 다른 실시태양에서, 가교결합기는 화학식 L3의 화합물로부터 선택되고, 항원-결합 단백질은 서열 번호 11 또는 서열 번호 17, 서열 번호 12, 서열 번호 13 및 이들의 변이체의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 바람직하게는 서열 번호 17의 LCDR1, 및 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 이들의 변이체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역를 포함하고, 약물은 화학식 II의 화합물로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 가교결합기는 화학식 L3의 화합물로부터 선택되고, 항원-결합 단백질은 서열 번호 3의 경쇄, 및 서열 번호 4의 중쇄를 포함하고, 약물은 화학식 II의 화합물로부터 선택된다.
바람직한 실시태양은 (i) 라이신 커플링의 기작 및 환원제의 기능을 이용하여 라이신을 가교결합기에 의해 변형시킴으로써, 가교결합기의 단부에서 항체의 라이신 측쇄의 아미노 기를 알데하이드 기에 의해 환원적 아미노화를 수행하여 항체-가교결합기 접합체를 형성하고, 유리 가교결합기를 제거하는 단계; (ii) 양이온 교환 칼럼을 평형화시키고, 칼럼을 가교결합기에 의해 세정하고, 재평형화시킨 후, 항체-가교결합기 접합체를 이온 교환 칼럼 상으로 적재시키고, 3회 세정하는 단계; (iii) 가교결합기의 말단을 보호제거하는 단계; 및 (iv) 평형화시키고, 독소를 이온 교환 칼럼 상으로 적재한 후, 2차로 세정하고, 2차로 용리시키고, 재생하는 단계를 포함한다.
본 발명의 ADC를 제조하는 추가적인 방법에서, 항원-결합 단백질은 쇄간 디설파이드 가교를 환원시키는 방법에 의해 약물에 커플링된다. 항원-결합 단백질이 이온 교환 담체 상에 고정화된 후, 환원제를 첨가하는 단계가 실행되어 항원-결합 단백질의 유리 머캅토 기로의 디설파이드 가교를 환원시키고, 이는 말레이미드 기 또는 할로겐화된 아세틸 기를 갖는 약물과 반응하여 티오에테르-연결된 ADC 약물을 형성한다.
또 다른 실시태양에서, 가교결합기는 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)으로부터 선택되고, 항원-결합 단백질은 서열 번호 5 또는 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 이들의 변이체의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 및 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 이들의 변이체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역을 포함하고, 약물은 화학식 II의 화합물로부터 선택된다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 가교결합기는 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)으로부터 선택되고, 항원-결합 단백질은 서열 번호 1의 경쇄 및 서열 번호 2의 중쇄를 포함하고, 약물은 화학식 II의 화합물로부터 선택된다.
또 다른 실시태양에서, 가교결합기는 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)으로부터 선택되고, 항원-결합 단백질은 서열 번호 11 또는 서열 번호 17, 서열 번호 12, 서열 번호 13 및 이들의 변이체의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 바람직하게는 서열 번호 17의 LCDR1, 및 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 이들의 변이체의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역을 포함하고, 약물은 화학식 II의 화합물로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 가교결합기는 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)으로부터 선택되고, 항원-결합 단백질은 서열 번호 3의 경쇄 및 서열 번호 4의 중쇄를 포함하고, 약물은 화학식 II의 화합물로부터 선택된다.
바람직한 실시태양은 (i) 쇄간 디설파이드 가교 커플링 전략 및 고정화된 담체로서 양이온 교환 수지를 이용하고, 칼럼을 평형화시키고, 항체 샘플을 적재한 후, 세정하고, 환원제를 첨가함으로써 항체의 쇄간 디설파이드 가교를 환원시키는 단계; (ii) 독소를 이온 교환 칼럼 상으로 적재한 후, 2차로 세정하고, 2차로 용리시키고, 재생시키는 단계를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 항체의 쇄간 디설파이드 가교를 환원제에 의해 환원시키기 위한 반응 온도는 25 내지 45℃, 바람직하게는 40℃이다.
본 발명의 모든 실시태양에서, 항원-결합 단백질이 담체에 결합된 후, 10℃ 내지 37℃, 바람직하게는 25℃의 온도에서 항온처리되고, 이러한 값은 정수 또는 분수이고, 이의 온도는 비제한적인 실시태양에서 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃ 또는 37℃일 수 있다.
추가로, 항원-결합 단백질의 담체로의 결합은 pH가 5.5 내지 7.0, 바람직하게는 6.3인 완충액에서 실행되고, 완충액으로는, 제한되지 않지만, 인산염 완충액, 아세트산염 완충액, 시트르산염 완충액, 석신산염 완충액, 바람직하게는 인산염 완충액이 포함된다.
추가로, 항원-결합 단백질을 담체 상으로 적재할 경우, 최적화된 적재 유량은 0.1 내지 0.5 ㎖/분으로 조절되고, 이는 특정 실험에서 사용되는 이온 교환 담체의 양에 따라 조정된다.
추가로, 항원-결합 단백질을 이온 교환 담체 상으로 적재하기 이전에 항원-결합 단백질 용액의 전도율을 5 mS/cm의 범위내로 조정하는 것은 필수적이다.
추가로, 이온 교환 담체 상에 고정화된 항원-결합 단백질의 약물로의 커플링은 이온 교환 칼럼 상에서 실행된다. 반응에 사용되는 약물의 양을 감소시키기 위해, 약물은 이온 교환 담체 상으로 느린 유량에서 적재되고; 약물 대 항원-결합 단백질의 몰 비는 6, 5, 4, 3, 2, 1이고, 바람직하게는 6이며, 바람직한 유량은 0.2 ㎖/분이다.
추가로, 항원 결합 단백질 및 약물 접합체는 결합 후 이온 교환 담체로부터 용리될 필요가 있고, 완충액의 pH는 5.0 내지 6.5이고, 바람직하게는 5.5이며; 완충액으로는, 제한되지 않지만, 인산염 완충액, 아세트산염 완충액, 시트르산염 완충액 및 석신산염 완충액이 포함되고, 바람직하게는 시트르산염 완충액이고; 완충액의 농도는 10 내지 50 mM이고, 바람직하게는 20 mM이다.
추가로, 단리된 합성 ADC 약물이 다량의 중합체 항체를 함유하도록 만들기 위해, 단계식 용리 방법이 이용되었다. 용리 공정에 사용된 시트르산염 완충액은 NaCl을 포함하고, 제1 용리 단계를 위해 제조된 용리 완충액중 NaCl의 농도는 100 내지 140 mM이고, 바람직하게는 110 mM이다.
추가로, 제2 용리 단계를 위해 제조된 용리 완충액에서, 완충액은 150 내지 200 mM NaCl, 바람직하게는 180 mM NaCl을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 항원-결합 단백질의 가교결합기로의 결합은 20℃ 내지 40℃의 온도에서 실행되고, 이러한 값은 정수 또는 분수이고, 이의 온도는 비제한적인 실시태양에서 바람직하게는 20℃, 22℃, 24℃, 28℃, 32℃, 36℃이고, 더욱 바람직하게는 28℃이며, 특정 실시태양에서 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃ 또는 40℃일 수 있다.
추가로, 항원-결합 단백질의 가교결합기로의 결합은 pH가 4.0 내지 5.5, 바람직하게는 4.3인 완충액에서 실행되고; 완충액은 바람직하게는 아세트산염 완충액이고, 더욱 바람직하게는 아세트산염 완충액은 아세토니트릴을 포함한다.
추가로, 보호기를 갖는 가교결합기의 경우, 항원 단백질에 결합된 이후, 가교결합기의 보호기는 제거될 필요가 있고, 이로써 가교결합기가 약물에 결합할 수 있도록 하고; 보호제거제는, 제한되지 않지만 NH2OH·HCl을 포함할 수 있고, 보호제거제의 농도는 10 내지 50 mM의 범위이고, 바람직하게는 20 mM이다.
본 발명의 방법에서, 항원-결합 단백질의 담체로의 결합, 항원-결합 단백질의 약물로의 결합, 및 항원-결합 단백질 및 약물 커플링 생성물의 용리는 이온 교환 칼럼 상에서 실행된다.
본 발명의 방법에서, 세정 단계가 임의적으로 포함될 수 있고, 이온 교환 칼럼은 매트릭스에 소수성 약물이 결합하여 ADC 약물의 용리를 어렵게 만드는 것을 방지하기 위해 이온 교환 충전제 매트릭스의 소수성을 차단하는 가교결합기가 함유된 완충액으로 세정되고; 만일 친수성 이온 교환 충전제 매트릭스, 예컨대 아가로스(agarose)가 사용된다면, 매트릭스는 항체의 표면 상의 라이신 잔기와 반응함으로써 약물과 항체가 커플링되는 것을 차단할 것이다. 따라서, 라이신 커플링의 전략하에, 소수성 매트릭스의 이온 교환 충전제가 바람직하다.
본 발명을 더욱 잘 이해하기 위해, 특정한 기술적 및 과학적 용어가 아래에 구체적으로 정의된다. 본 발명 어디에서도 달리 명백히 규정되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 다른 기술적 및 과학적 용어는 당분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
용어 "인간화된 항체" 또는 "인간화된 항체"는, 또한 본원에서 CDR-그래프팅된 항체 또는 항체들의 인간화로서 지칭되고, 이는 마우스 CDR 서열의 인간 항체 가변 영역 골격구조로의 그래프팅을 지칭하고, 즉 상이한 유형의 인간 생식계열 항체 골격구조 서열에 의해 생산된 항체이다.
용어 "뮤린 항체"는 당분야의 지식 및 기술에 따라 마우스를 사용하여 제조된 항-인간 단일클론성 항체이다. 제조 동안, 시험 대상에 항원이 주사되고, 이어서 원하는 서열 또는 작용 특성을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마가 단리된다. 뮤린 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 추가로 뮤린 κ, λ 쇄 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 포함하거나, 추가로 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
용어 "인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 라이브러리 또는 기타 인간 항체 코딩 서열을 사용하여 비-인간 유래된 항체로부터 유래된 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 지칭한다. "인간 항체"의 이러한 정의는 특별히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 제외한다.
용어 "키메라성 항체"는 뮤린 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 융합시킴으로서 수득된 항체이고, 이는 뮤린 항체에 의해 유도된 면역 반응을 완화시킬 수 있다. 키메라성 항체를 작성하기 위해, 뮤린-특이적 단일클론성 항체를 분비하는 하이브리도마를 우선 작성하고, 이후 가변 영역 유전자를 마우스 하이브리도마 세포로부터 수득한 다음 재조합 발현을 위해 인간 항체의 불변 영역 유전자내로 클로닝한다.
용어 "단일-쇄 항체"는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 15 내지 20개 아미노산의 짧은 펩티드를 통해 연결시킴으로써 형성된 항체를 지칭한다. 단일-쇄 항체는 유전자 조작 기법을 사용하여 대장균(Escherichia coli)에서 발현된 인공적인 합성 항체이고, 이는 완전 항체의 단지 1개의 쇄를 함유한다.
본 발명의 "항체"는 원하는 생물 활성을 나타내는 항체의 임의의 형태를 지칭한다. 이와 같이, 이는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로, 제한되지 않지만, 전장 항체, 항체 결합 단편 또는 유도체를 포함한다. 항체의 공급원은, 제한되지 않지만, 단일클론성 항체, 다중클론성 항체, 유전자 조작된 항체(예를 들어, 이중특이성 항체)를 포함한다.
용어 "Fab 단편"은 완전한 경쇄, 및 중쇄의 VH 및 CH1 작용성 영역으로 구성된 단편을 지칭한다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 디설파이드 가교를 형성할 수 없다.
용어 "Fab' 단편"은 경쇄, 및 중쇄의 VH 및 CH1 작용성 영역을 포함하고, 추가로 CH1 및 CH2 도메인 사이의 영역을 포함하는데, 이는 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 쇄간 디설파이드 가교를 형성하여 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
용어 "F(ab')2 단편"은, 쇄간 디설파이드 가교가 2개의 중쇄 사이에 형성되도록, CH1 및 CH2 도메인 사이에 부분적 불변 영역을 함유하는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 이와 같이, F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이의 디설파이드 가교에 의해 함께 연결된 2개의 Fab' 단편으로 구성된다.
용어 "scFv 단편"은 유전자 조작 방법에 의해 생산된 단일-쇄 가변 영역(ScFv)을 지칭하고, 이는 가요성 폴리펩티드에 의해 함께 연결된 VH 및 VL 영역을 포함하는 Fv-유형 단편이다.
용어 "항원-결합 단백질"은 표적 세포와 회합된 항원 또는 수용체를 인식하거나 이에 결합할 수 있는 거대분자 화합물이다. 항원-결합 단백질의 기능은, 항원-결합 단백질, 예컨대 제한되지 않지만 단백질 호르몬, 렉틴(lectin), 성장 인자, 항체 또는 표적 세포에 결합할 수 있는 기타 분자, 바람직하게는 항체에 결합하는 표적 세포 집단에 약물을 제시하는 것이다.
본 발명의 항체는 단일클론성 항체 또는 mAb를 지칭하고, 이는 단일 클론의 세포 균주로부터 수득된 항체를 지칭하며; 세포 균주는, 제한되지 않지만, 진핵 세포 균주, 원핵 세포 균주 또는 파아지 클론성 세포 균주이다. 단일클론성 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들어, 하이브리도마 기법, 재조합 기법, 파아지 디스플레이(phage display) 기법, 합성 기법(예를 들어, CDR-그래프팅), 또는 기타 선행기술을 사용하는 재조합에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 항체는 면역글로불린을 지칭하고, 이는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄가 쇄간 디설파이드 가교에 의해 연결되는 테트라펩티드 쇄 구조물이다. 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 상이한 조성 및 배열 순서를 가져서, 그의 항원성이 또한 상이하다. 따라서, 면역글로불린은 5가지 부류, 또는 이소타입(isotype), 즉 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 분류될 수 있고, 상응하는 중쇄는 각각 μ 쇄, δ 쇄, γ 쇄, α 쇄 및 ε 쇄이다. Ig의 동일한 부류는 힌지 영역의 아미노산 조성 및 중쇄 디설파이드 가교의 수 및 위치에서의 차이에 따라 상이한 하위부류로 나눠질 수 있다. 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 분류될 수 있다. 경쇄는 불변 영역 사이의 차이에 따라서 κ 쇄 또는 λ 쇄로 분류된다. Ig의 5가지 부류에서, Ig의 각각의 부류는 κ 쇄 또는 λ 쇄를 가질 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄의 N-말단 부근의 약 110개 아미노산의 서열은 크게 다르고 가변 영역(V 영역)으로 명명되며; C-말단 부근의 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정하고 불변 영역(C 영역)으로 명명된다. 가변 영역은 3개의 초가변 영역(HVR) 및 4개의 상대적으로 보전된 골격구조 영역(FR)을 포함한다. 3개의 초가변 영역은 항체의 특이성을 결정하고, 또한 상보성 결정 영역(CDR)으로서 공지되어 있다. 각각의 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 중쇄 가변 영역(HCVR)은 3개의 CDR 영역 및 4개의 FR 영역으로 구성되고, 이는 아미노 말단에서 카복시 말단으로 순차적으로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 경쇄의 3개의 CDR 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭하고; 중쇄의 3개의 CDR 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭한다. 본 발명에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 LCVR 영역 및 HCVR 영역의 CDR 아미노산 잔기의 수 및 위치는 공지된 카밧(Kabat) 넘버링 규칙(LCDR1-3, HCDE2-3), 또는 카밧 및 코티아(chothia) 넘버링 규칙(HCDR1)에 따른다.
"임의적" 또는 "임의적으로"는, 필수적이지는 않지만, 후속적으로 기재된 사건 또는 환경이 발생할 수 있음을 의미하고, 이러한 기재는 그 사건 또는 환경이 발생하거나 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, "임의적으로 1 내지 3개의 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는"은 항체 중쇄 가변 영역의 특별한 서열이, 필수적이지는 않지만, 존재할 수 있음을 의미한다.
용어 "가교결합기"는 소분자 화합물의 한 부류, 즉 양쪽 단부에서 또는 분자 구조에서 특별한 기(아미노, 카복실, 티올 등)에 대해 2개 이상의 반응성 단부를 갖는 분자를 지칭하고, 이는 2개의 또는 복수개의 다른 분자와 커플링될 수 있다. 반응에 참여하는 다양한 분자는 가교결합기에 공유 결합하여 신규 분자를 형성한다.
용어 "연결기"는 항원-결합 단백질을 약물에 공유적으로 부착시키는 원자의 공유 결합 또는 쇄를 포함하는 화학 모듈(chemical module)을 지칭한다. 화학 모듈은 변형된 항원-결합 단백질을 약물의 변형된 작용부분에 연결시킴으로써 형성된다.
용어 "전도율"은 2개의 전극 사이에 전기 전류를 전도시키는 수용액의 능력을 지칭한다. 일반적으로, 전도율 또는 비전도율은 물질의 전도 전류의 측정값이다. 용액에서, 전류는 이온 수송을 통해 흐른다. 따라서, 수용액에 존재하는 이온의 수가 증가함에 따라, 용액은 더 높은 전도율을 가질 것이다. 전도율은 mmhos(mS/cm)로 측정되고, 용액의 전도율은 본원에서 이온 농도를 변경시킴으로써 바뀔 수 있다. 예를 들어, 용액중 이온성 부형제의 농도는 원하는 전도율을 달성하기 위해 달라질 수 있다.
용어 "약물"은 독소(예를 들어, 세균, 곰팡이, 식물 또는 동물로부터 유래된 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편), 화학치료제, 성장 저해제, 튜불린 저해제, 항생제, 방사성동위원소, 및 핵산분해 효소 및 기타 세포독성제를 지칭한다.
용어 "독소"는 세포의 성장 또는 증식에 해로운 영향을 줄 수 있는 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "튜불린 저해제"는, 튜불린의 중합을 저해하거나 튜불린의 중합을 촉진시킴으로써 세포의 유사분열 과정을 방해하고, 이로써 항-종양 효과를 부여하는 화합물의 부류를 지칭한다. 이의 비제한적 실시태양은 메이탄시노이드, 칼리케아미신, 탁산(taxane), 빈크리스틴(vincristine), 콜키신(colchicine), 돌라스타틴/알루라틴(aluratin)을 포함하고, 바람직하게는 메이탄시노이드 또는 돌라스타틴/아우리스타틴이다.
메이탄시노이드는 당분야에 잘 공지되어 있고, 공지된 방법에 따라 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나 유전자 조작 기법에 의해 생산될 수 있다[유(Yu) 등의 문헌 "악티노신네마 프레티오숨으로부터의 메이탄시노이드 항종양제 안사미토신의 생합성 유전자 클러스터(The biosynthetic gene cluster of maytansinoid antitumor agent ansamitocin from Actinosynnema pretiosum). PNAS, 2002, 99: 7968-7973"]. 메이탄시놀(maytansinol) 및 메이탄시놀의 유사체는 또한 공지된 방법에 따라 합성적으로 제조될 수 있다. 메이탄시노이드 알칼로이드 약물 모듈의 비제한적 실시태양은 DM1; DM3; 및 DM4를 포함하고, 국제 특허출원 공개공보 제WO2016/127790A1호에 개시된 바와 같다.
아우리스타틴은 화학 구조식을 갖는 완전한 합성 약물이고, 이는 그의 물질적 특성 및 약물 특성을 최적화하기 위해 변형시키는 것이 상대적으로 용이하다. 항체와의 커플링을 위해 사용되는 아우리스타틴 유도체는 주로 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 및 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF)를 포함하고, 전자는 천연 튜불린 폴리머라아제 저해제 돌라스타틴-10으로부터 유래하는, 2-아미노-1-페닐프로필-1-올을 C-말단에 첨가함으로써 합성된 합성 펜타펩티드이다. 다양한 인간 종양 세포주에 대한 MMAE의 저해 활성은 1 나노몰 미만이다. MMAE의 세포독성 활성을 감소시키기 위해, MMAF는 돌라스타틴-10의 C-말단에 페닐알라닌을 첨가함으로써 개발되었다. 카복실 기의 구조적 도입으로 인해, MMAF는 불량한 세포막 투과성을 갖고, 이에 따라 세포에 대한 그의 생물활성은 크게 감소된다. 그러나, 항체와의 커플링 이후 세포에 대한 저해 활성은 크게 증가하였다(US 특허 제7,750,116호).
CPT는 캄프토테신의 약어이고, 본원에서 CPT는 캄프토테신 그 자체, 또는 캄프토테신의 유사체 또는 유도체를 표시하기 위해 사용된다. 제시된 숫자 및 문자 A 내지 E에 의해 표지화된 고리를 갖는 캄프토테신 및 그의 몇몇 유사체의 구조는 하기 화학식으로 제공된다.
CPT: R1=R2=R3=H
10-하이드록시-CPT: R1=OH; R2=R3=H
이리노테칸(Irinotecan) CPT-11: R1=
; R2=에틸；R3=H
SN-38: R1=OH; R2=에틸; R3=H
토포테칸: R1=OH; R2=H; R3=CH-N(CH3)2
본원에 사용될 경우, "항체-약물 접합체"는 "ADC"로서 상호교환가능하게 지칭된다.
본 발명에서 용어 "유리 머캅토 기"는 황 원자를 함유하는 구조적 기를 의미하고, 주로 약물 또는 독소에서의 머캅토 기, 항원-결합 단백질의 디설파이드 가교의 환원 이후에 노출된 머캅토 기, 또는 항원-결합 단백질의 라이신 또는 시스테인 상의 머캅토 기를 지칭한다.
용어 "티오에테르 결합"은 화학식 -S-를 갖는 구조적 결합의 한 부류를 지칭한다.
용어 "환원제"는 산화환원 반응에서 전자를 소실하거나 전자 이탈을 갖는 물질이다. 환원제 그 자체는 또한 넓은 의미로 항산화제이고, 이는 환원성을 갖고 산화될 것이며, 그의 생성물은 산화 생성물로 지칭된다. 본 발명의 한 실시태양에서, 환원제는 RA로 표시되고, 환원제의 비제한적 실시태양은 H2, 탄소(C), 일산화 탄소(CO), 환원된 철 분말(Fe), 아연 분말(Zn), 알칼리 금속(대체적으로 Li, Na, K), 기타 활성 금속(예컨대 Mg, Al, Ca, La 등), 염화 제1주석(SnCl2), 옥살산, 붕수소화 칼륨(KBH4), 붕수소화 나트륨(NaBH4), 나트륨 시아노보로하이드리드(NaCNBH3), 나트륨 트리아세톡시보로하이드리드((CH3COO)3BHNa), 리튬 알루미늄 하이드리드(LiAlH4), 차아인산, 차아인산 나트륨, 티오황산 나트륨(Na2S2O3), 트리스(2-카복실에틸)포스핀(TCEP), 디티오트레이톨(DTT), 머캅토에틸아민, 아세틸시스테인(Ac-Cys)을 포함한다.
본 발명에서 "양이온 교환 담체"는 산성 교환기를 함유하는 담체를 의미하고, 강산 유형의 양이온 교환 담체 및 약산 유형의 양이온 교환 담체를 포함한다. 양이온 교환 담체는 담체 형태의 양이온 교환 수지, 양이온 교환 막, 양이온 교환 섬유를 포함하고, 바람직하게는 양이온 교환 수지이다. 강산 유형 양이온 교환 담체는 주로 강한 산성 반응성 기, 예컨대 설폰산 기(-SO3H)를 함유하고, 이러한 이온 교환 담체는 모든 양이온을 교환할 수 있다. 약산 유형 양이온 교환 담체는 약한 반응성 기, 예컨대 카복실 기(-COOH 기), 포스페이트 기 등을 함유하고, 이러한 이온 교환 담체는 단지 약염기에서 양이온, 예컨대 Ca2+ 및 Mg2+를 교환할 수 있는 반면, 강한 염기에서 이온, 예컨대 Na+, K+ 등은 교환될 수 없다. 강산 양이온 교환 수지의 비제한적 실시태양은 밀리포어 프락토겔(Millpore Fractogel) SO3; 밀리포어 에쉬무노(Millpore Eshmuno) S; 밀리포어 에쉬무노 CPX; GE 캅토(Capto) S 임팩트(Impact); GE SP 세파로스 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow); 하이트랩(HiTrap)(상표명) 캅토 S 임팩트이다. 약산 양이온 교환 수지의 비제한적 실시태양은 밀리포어 EMD COO-; GE CM 세파로스 패스트 플로우이다.
용어 "알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자의 선형 또는 분지형 기를 포함하는 포화된 지방족 탄화수소 라디칼을 지칭하고, 바람직하게는 알킬 기는 1 내지 12개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유한다. 비제한적 실시태양은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 3급-부틸, 2급-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, n-헥실, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2,3-디메틸부틸, n-헵틸, 2-메틸헥실, 3-메틸헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실, 2,3-디메틸펜틸, 2,4-디메틸펜틸, 2,2-디메틸펜틸, 3,3-디메틸펜틸, 2-에틸펜틸, 3-에틸펜틸, n-옥틸, 2,3-디메틸헥실, 2,4-디메틸헥실, 2,5-디메틸헥실, 2,2-디메틸헥실, 3,3-디메틸헥실, 4,4-디메틸헥실, 2-에틸헥실, 3-에틸헥실, 4-에틸헥실, 2-메틸-2-에틸펜틸, 2-메틸-3-에틸펜틸, n-데실, 2-메틸-2-에틸헥실, 2-메틸-3-에틸헥실, 2,2-디에틸펜틸, n-데실, 3,3-디에틸헥실, 2,2-디에틸헥실 및 이의 다양한 분지형 이성체를 포함한다. 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킬 기가 더욱 바람직하고, 비제한적 실시태양은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 3급-부틸, 2급-부틸 염기, n-펜틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, n-헥실, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2,3-디메틸부틸 등을 포함한다. 알킬 기는 치환되거나 치환되지 않을 수 있고, 치환될 경우, 치환기는 부착을 위한 임의의 이용가능한 자리에서 치환될 수 있고, 하나 이상이 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 플루오레닐, 하이드록시, 니트로, 시아노, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 고리 알콕시, 헤테로사이클로알콕시, 사이클로알킬티오, 헤테로사이클로알킬티오 및 옥소로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다.
용어 "사이클로알킬"은 3 내지 20개의 탄소 원자, 바람직하게는 3 내지 12개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 3 내지 10개의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 3 내지 8개의 탄소 원자를 함유하는 포화되거나 부분적으로 불포화된 일환식 또는 다환식의 환형 탄화수소 치환기를 지칭한다. 일환식 사이클로알킬 기의 비제한적 실시태양은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 사이클로헥사디에닐, 사이클로헵틸, 사이클로헵타트리에닐, 사이클로옥틸 등을 포함한다. 다환식 사이클로알킬 기는 스피로(spiro) 고리, 축합 고리 및 가교화 고리의 사이클로알킬 기를 포함한다.
용어 "헤테로사이클릴"은 3 내지 20개의 고리 원자를 함유하는 포화되거나 부분적으로 불포화된 알환식 또는 다환식의 환형 탄화수소 치환기를 지칭하고, 1개 이상의 고리 원자는 질소, 산소 또는 S(O)m(여기서 m은 0 내지 2의 정수임)으로부터 선택되는 헤테로 원자이지만, -OO-, -OS- 또는 -SS-의 고리 작용부분을 제외하고, 나머지 고리 원자는 탄소이다. 이는 바람직하게는 3 내지 12개의 고리 원자를 함유하고, 이중 1 내지 4개는 헤테로 원자이며; 더욱 바람직하게는, 3 내지 10개의 고리 원자를 함유하는 사이클로알킬 기 고리이다. 일환식 헤테로환족 기의 비제한적 실시태양은 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모폴리닐, 티오모폴리닐, 호모피페라지닐 등을 포함한다. 다환식 헤테로환족 기는 스피로 고리, 축합 고리, 및 가교화 고리의 헤테로환족 기를 포함한다.
헤테로사이클릴 고리는 아릴, 헤테로아릴 또는 사이클로알킬 고리에 축합될 수 있고, 모 구조에 연결된 고리는 헤테로환족 기이다. 이의 비제한적 실시태양은 다음을 포함한다:
헤테로환족 기는 임의적으로 치환되거나 치환되지 않을 수 있고, 치환될 경우, 치환기는 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬 설파닐, 알킬아미노, 할로겐, 플루오레닐, 하이드록시, 니트로, 시아노, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알콕시, 헤테로사이클로알콕시, 사이클로알킬티오, 헤테로사이클로알킬티오 및 옥소중 하나 이상으로부터 독립적으로 선택된다
용어 "아릴"은 접합체된 π-전자 시스템을 갖는 6 내지 14개, 바람직하게는 6 내지 10개 탄소 원자의 모든-탄소 일환식 또는 축합된 다환식 고리(즉, 인접한 탄소 원자 쌍을 공유하는 고리)를 지칭하고, 예컨대 페닐 및 나프틸이고, 바람직하게는 페닐이다. 아릴 고리는 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬 고리에 축합될 수 있고, 모 구조에 부착된 고리는 아릴 고리이다. 이의 비제한적 실시태양은 다음을 포함한다:
아릴 기는 치환되거나 치환되지 않을 수 있고, 치환될 경우, 치환기는 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 플루오레닐, 하이드록시, 니트로, 시아노, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알콕시, 헤테로사이클로알콕시, 사이클로알킬티오 및 헤테로사이클로알킬티오로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기이다.
용어 "헤테로아릴"은 1 내지 4개의 헤테로원자, 및 5 내지 14개의 고리 원자를 함유하는 헤테로방향족 시스템을 지칭하고, 헤테로원자는 산소, 황 및 질소로 구성된 군으로부터 선택된다. 헤테로아릴 기는 바람직하게는 5 내지 10-원이고, 더욱 바람직하게는 5 또는 6-원이며, 예컨대 푸릴, 티에닐, 피리딜, 피롤릴, N-알킬피롤릴, 피리미디닐, 피라지닐, 이미다졸릴, 테트라졸릴 등이다. 헤테로아릴 고리는 아릴, 헤테로환족 또는 사이클로알킬 고리에 축합될 수 있고, 여기서 모 구조에 연결되는 고리는 헤테로아릴 고리이고, 이의 비제한적 실시태양은 다음과 같다:
헤테로아릴 기는 임의적으로 치환되거나 치환되지 않을 수 있고, 치환될 경우, 치환기는 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 플루오레닐, 하이드록시, 니트로, 시아노, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알콕시, 헤테로사이클로알콕시, 사이클로알킬티오 및 헤테로사이클로알킬티오로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기이다.
용어 "알콕시"는 -O-(알킬) 및 -O-(치환되지 않은 사이클로알킬)을 지칭하고, 알킬 또는 사이클로알킬은 상기 정의된 바와 같다. 알콕시 기의 비제한적 실시태양은 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 사이클로프로폭시, 사이클로부톡시, 사이클로펜틸옥시 또는 사이클로헥실옥시를 포함한다. 알콕시 기는 임의적으로 치환되거나 치환되지 않을 수 있고, 치환될 경우, 치환기는 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 플루오레닐, 하이드록시, 니트로, 시아노, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알콕시, 헤테로사이클로알콕시, 사이클로알킬티오 및 헤테로사이클로알킬티오로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기이다.
용어 "알킬아미노"는 -N-(알킬) 및 -N-(치환되지 않은 사이클로알킬)을 지칭하고, 알킬 또는 사이클로알킬은 상기 정의된 바와 같다. 알킬아미노 기의 비제한적 실시태양은 메틸아미노, 에틸아미노, 프로필아미노, 부틸아미노, 사이클로프로필아미노, 사이클로부틸아미노, 사이클로펜틸아미노 또는 사이클로헥실아미노를 포함한다. 알킬아미노 기는 임의적으로 치환되거나 치환되지 않을 수 있고, 치환될 경우, 치환기는 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 플루오레닐, 하이드록시, 니트로, 시아노, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알콕시, 헤테로사이클로알콕시, 사이클로알킬티오 및 헤테로사이클로알킬티오로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기이다.
용어 "결합"은 "-"에 의해 표시되는 공유 결합을 지칭한다.
용어 "하이드록시"는 -OH 기를 지칭한다.
용어 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도를 의미한다.
용어 "카복실레이트 기"는 -C(O)O(알킬 또는 사이클로알킬)을 지칭하고, 여기서 알킬 또는 사이클로알킬은 상기 정의된 바와 같다. "임의적" 또는 "임의적으로"는, 필수적이지는 않지만, 후속적으로 기재된 사건 또는 환경이 발생할 수 있음을 의미하고, 이러한 기재는 그 사건 또는 환경이 발생하거나 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, "임의적으로 알킬 기에 의해 치환된 헤테로환족 기"는, 필수적이지는 않지만, 알킬 기가 존재할 수 있음을 의미하고, 이러한 기재는 헤테로환족 기가 알킬 기에 의해 치환되는 경우 및 헤테로환족 기가 알킬 기에 의해 치환되지 않는 경우를 포함한다.
"치환된"은, 서로 독립적으로, 상응하는 수의 치환기에 의해 치환된, 기에서 1개 이상의 수소 원자, 바람직하게는 5개 이하, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개의 수소 원자를 지칭한다. 치환기는 단지 그들의 가능한 화학적 위치에만 존재하는 것은 말할 필요도 없고, 당분야의 숙련가라면 과도한 노력을 들이지 않고 가능하거나 가능하지 않은 치환을 결정할 수 있을 것이다(실험 또는 이론에 의함). 예를 들어, 유리 수소를 갖는 아미노 기 또는 하이드록실 기는 불포화(예를 들어, 올레핀계) 결합을 갖는 탄소 원자와 조합될 경우 불안정할 수 있다.
약어
MMAE = 모노메틸 아우리스타틴 E(MW718)
MMAF = 약물의 C-말단에서 페닐알라닌을 갖는 아우리스타틴 E(MMAE)의 변이체(MW731.5)
DM1 = N(2')-데아세틸-N(2')-(3-머캅토-1-옥시프로필)-메이탄신
DM3 = N(2')-데아세틸-N2-(4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신
DM4 = N(2')-데아세틸-N2-(4-머캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)-메이탄신
SMCC = 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트
LC-SMCC = 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트)
KMUA = κ-말레이미드 운데카노산 N-석신이미딜 에스테르
GMBS = γ-말레이미드 부티르산 N-석신이미딜 에스테르
EMCS = ε-말레이미도 카프로산 N-하이드록시석신이미드 에스테르
MBS = m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르
AMAS = N-(α-말레이미도아세테이트)-석신이미딜 에스테르
SMPH = 석신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트
SMPB = N-석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트
PMPI = N-(p-말레이미도페닐)이소시아네이트
SIAB = N-석신이미딜-4-(요오도아세틸)-아미노벤조에이트
SIA = N-석신이미딜 요오도아세테이트
SBA = N-석신이미딜 브로모아세테이트
SBAP = N-석신이미딜 3-(브로모아세틸아미노)프로피오네이트
본 발명의 화합물을 합성하는 방법
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 기술적 해결책을 채택한다:
해결책 1
본 발명은 또한 화학식 ADC-1의 제조 방법을 제공하고, 여기서 단계는 상기 단계 1)에서의 a 단계(실시태양 2에서와 같음), b 단계(실시태양 4에서와 같음), c 단계(실시태양 5에서와 같음), 및 단계 2) 및 단계 3)(실시태양 6에서와 같음)을 포함하고; 세부사항은 다음과 같다:
본원에 기재된 mAb는 본 발명의 항원-결합 단백질이고, L1-Dr 및 L2의 정의는 화학식 L2 및 화학식 L1-Dr에서 정의된 바와 같다.
본 발명에 의해 제조된 화학식 ADC-1의 비제한적 실시태양은 다음과 같다:
본원에 기재된 mAb는 실시태양 2에 기재된 EGFR 항체 및 실시태양 11에 기재된 c-Met 항체이다.
해결책 2
본 발명은 또한 화학식 ADC-2의 제조 방법을 제공하고(예시적인 실시태양, 예컨대 실시태양 9 참조), 여기서 단계는 상기 단계 1)에서의 A 단계, B 단계, 및 단계 2) 및 단계 3)을 포함하고; 세부사항은 다음과 같다:
mAb는 본 발명의 항원-결합 단백질이고, 항원-결합 단백질은 단계 1)에서의 단계 A에 의해 이온 담체 상에 고정화되고, 환원 반응을 추가로 실행하여 약물과 반응하고; L1-Dr의 정의는 화학식 L1-Dr에서 기재된 바와 같다.
본 발명에 의해 제조된 화학식 ADC-2의 비제한적 실시태양은 다음과 같다:
본원에 기재된 mAb는 실시태양 9에 기재된 EGFR 항체 및 실시태양 11에 기재된 c-Met 항체이다.
본 발명의 유리한 효과는 다음과 같다:
1. 본 발명에서, 생물분자의 고정화는 항체 생물분자와 이온 교환 수지 사이의 정전기적 상호작용에 의해 실현되고, 이로써 커플링 공정 동안 상호 충돌에 의해 야기되는 생물분자의 응집을 방지한다.
2. 본 발명의 공정 단계는 조작하기에 간단하고 편리하다. 이는 계획적 조절을 실현하고, 인간 오류를 방지하며, 생산 효율을 향상시킨다.
3. 생물분자, 예컨대 항체를 고정화함으로써, 유기 용매가 전혀 보유되지 않고, 약물의 부작용이 감소된다.
4. 용리 조건을 최적화함으로써, DAR 값(약물 항체 결합 비)은 필요한 범위내에서 효과적으로 조절될 수 있는 한편, 중합체를 함유한 항체-접합체화 약물은 분리되고 제거될 수 있다.
5. 생산 공정 조건은 온화하여, 생물분자, 예컨대 항체로의 기계적 손상을 방지하고, 항체의 완전성을 보장한다.
6. 조작 동안 독성 소분자의 농도 및 사용량, 및 인체에 대한 독성 및 환경 오염은 본 발명의 방법에 의해 감소될 수 있다.
7. 항체 정제 공정에서 양이온 정제 단계가 제거될 수 있고, 정제 효율이 개선될 수 있다.
8. 이온 교환 담체에 의한 ADC 약물의 합성은 생산 비용을 감소시키면서도 다량의 샘플을 취급한다. 충전제 1 리터 각각이 무려 50 g의 생물분자, 예컨대 항체를 취급할 수 있을 것으로 예상되고, 이는 회분식 규모-확장 생산에 도움이 된다.
도 1은 항체 및 가교결합기에 대한 반응식을 도시한다.
도 2는 가교결합기 대 항체의 몰 비가 LAR 값에 미치는 영향을 도시한다.
도 3은 가교결합기 말단 보호기에 대한 제거 반응식을 도시한다.
도 4는 독소의 결찰 및 항체-약물 접합체의 용리에 대한 흐름도를 도시한다.
도 5는 EGFR 항체-약물 접합체의 단계식 용리 크로마토그램을 도시한다.
도 6은 EGFR 항체 쇄간 디설파이드 가교 커플링에 의해 수득된 ADC의 단계식 용리 크로마토그램을 도시한다.
도 7은 라이신 커플링을 사용하여 용리된 항체-약물 접합체에 대한 SEC 분석 결과를 도시한다: (A) 항체-가교결합기의 분석표; (B) 용리 피크 A의 분석표; (C) 용리 피크 B의 분석표; (D) 용리 피크 C의 분석표.
도 8은 가교결합기로의 항체 결합에 대한 질량 분석을 도시한다.
도 9는 EGFR 항체-약물 접합체에 대한 질량 분석을 도시한다.
도 10은 EGFR 항체의 쇄간 디설파이드 가교 커플링에 대한 HIC 분석을 도시한다.
도 11은 c-Met 항체의 ADC 약물 커플링 결과에 대한 분석을 도시한다: (A) 라이신 커플링 결과에 대한 질량 분석; (B) 쇄간 디설파이드 가교 환원적 커플링에 대한 HIC 다이어그램.
도 2는 가교결합기 대 항체의 몰 비가 LAR 값에 미치는 영향을 도시한다.
도 3은 가교결합기 말단 보호기에 대한 제거 반응식을 도시한다.
도 4는 독소의 결찰 및 항체-약물 접합체의 용리에 대한 흐름도를 도시한다.
도 5는 EGFR 항체-약물 접합체의 단계식 용리 크로마토그램을 도시한다.
도 6은 EGFR 항체 쇄간 디설파이드 가교 커플링에 의해 수득된 ADC의 단계식 용리 크로마토그램을 도시한다.
도 7은 라이신 커플링을 사용하여 용리된 항체-약물 접합체에 대한 SEC 분석 결과를 도시한다: (A) 항체-가교결합기의 분석표; (B) 용리 피크 A의 분석표; (C) 용리 피크 B의 분석표; (D) 용리 피크 C의 분석표.
도 8은 가교결합기로의 항체 결합에 대한 질량 분석을 도시한다.
도 9는 EGFR 항체-약물 접합체에 대한 질량 분석을 도시한다.
도 10은 EGFR 항체의 쇄간 디설파이드 가교 커플링에 대한 HIC 분석을 도시한다.
도 11은 c-Met 항체의 ADC 약물 커플링 결과에 대한 분석을 도시한다: (A) 라이신 커플링 결과에 대한 질량 분석; (B) 쇄간 디설파이드 가교 환원적 커플링에 대한 HIC 다이어그램.
본 개시내용은 기재된 특정 실시태양에 의해 범주가 제한되지 않고, 이는 개시내용의 개별 양태의 예시로서 의도되며, 본 발명의 취지 및 범주는 이에 제한되지 않는다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 실시태양에서 실험 방법은 일반적으로 생산에 우호적인 통상적인 조건에 따라서, 또는 원료 물질 및 상품의 제조업체에 의해 권고된 조건에 따라서 선택된다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용되는 시약은 상업적으로 입수가능하다.
실시태양
1.
EGFR
항체의 작성 및 발현
EGFR 항체 mAb001은 니모투주맙(nimotuzumab)의 점 돌연변이에 의해 수득된 IgG1-YTE 변형된 니모투주맙 변이체이다.
항체 VH/VK 유전자 단편을 PCR 작성하기 위해 프라이머를 고안하고, 이어서 발현 담체 pHr(신호 펩티드 및 불변 영역 유전자(CH1-FC/CL) 단편을 함유함)과 균일하게 재조합하여 전장 항체 발현 담체 VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr를 작성하였다. 플라스미드의 고유의 형태는 IgG1을 발현할 수 있고, 3중 자리 돌연변이를 포함하는 IgG1-YTE 항체, 즉, M258Y/S260T/T262E(YTE)를 점 돌연변이에 의해 수득하였다. 최종 EGFR 항체 mAb001 서열은 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 제시된다. 플라스미드를 서열분석에 의해 확인하고 당분야에 공지된 방법으로 단리시킨 후, 293 세포 일시적 발현을 수행하고, 이로써 단리 및 정제를 위해 목적하는 항체 단백질을 함유하는 배양 상청액을 수득하였다.
mAb001의 항체 서열은 다음과 같다:
mAb001 경쇄의 아미노산 서열: 서열 번호 1
mAb001 중쇄의 아미노산 서열: 서열 번호 2
주석: 2중 밑줄은 YTE 돌연변이 자리를 나타낸다.
mAb001 항체의 정제 및 분석:
상기 세포 배양 상청액을 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거한 다음, 단백질 A 칼럼 친화도 크로마토그래피에 적용하였다. A280 판독값이 기선으로 내려갈 때까지 칼럼을 PBS로 세정하였다. 목적하는 단백질을 100 mM 아세트산 나트륨 pH 3.0으로 용리시키고 1 M 트리스(Tris)-HCl에 의해 중화시켰다. 용리된 샘플을 적절히 농축시키고, PBS에 의해 균형화된 겔 크로마토그래피 칼럼 수퍼덱스(Superdex) 200(GE)을 사용하여 분자체에 의해 추가로 정제하고, 항체 단량체를 갖는 흡수 피크의 샘플을 수집하고 모았다. 샘플을 농축시키거나 샘플 완충액을 당분야에 공지된 한외여과 방법에 의해 대체하여 적합한 농도를 갖는 최종 샘플을 수득하였다.
실시태양 2. 단일클론성 항체 EGFR 항체 및 가교결합기의 환원적 아미노화 반응
라이신 커플링의 기작에 기초하여, 20 ㎎/㎖의 단일클론성 항체 mAb001의 저장 용액을 변형 완충액(100 mM 아세트산 + 10% 아세토니트릴, pH 4.3)으로 대체하고, 0.65 내지 1.7 mM 이작용성 가교결합기 3-아세틸 머캅토(ATPPA) 및 25 mM 환원제 나트륨 시아노보로하이드리드(NaBH3CN)를 첨가함으로써, 100 rpm에서 2 시간 동안 교반하에 라이신을 24 내지 36℃의 온도에서 변형시켰다. 단일클론성 항체 상의 아미노 기(-NH2)를 가교결합기의 단부에서 알데하이드 기에 의해 환원적으로 아미노화하여 중간체 I을 형성하였고, 반응식은 도 1에 제시되었다. 표 1에 제시된 바와 같이, LAR 값은 상이한 온도의 반응 조건하에 생산된 mAb-가교결합기의 양과 상이하였고, 여기서 가교결합기 대 항체의 몰 비는 6이다. 유리 가교결합기를 한외여과(UF) 시스템에 의해 제거하고, 중간체 I의 완충액을 새로운 완충액(20 mM 인산염 완충액, pH 6.3)으로 대체하고, 사용할 때까지 저장하였다. 도 2는 가교결합기 대 단일클론성 항체의 몰 비의 최적화를 제시한다. 가교결합기 대 단일클론성 항체의 비가 28℃의 온도에서 2 시간 동안 8:1로 조절될 경우, 생성물에서 가교결합기-단일클론성 항체의 커플링 비(LAR)는 약 3.5로 조절될 수 있다.
3-아세틸 머캅토(ATPPA)
[표 1]
mAb001 및 가교결합기의 결합에 대한 상이한 온도의 영향
실시태양 3. 이온 교환 칼럼을 위한 가교결합기 세정
라이신 커플링 전략에 의해 ADC를 합성하는 공정에서, 메르크 밀리포어(Merck Millipore)로부터의 1 ㎖의 양이온 교환 수지 프락토겔(등록상표) SO3M을 담체로서 사용하여 ADC를 합성하였다. 강한 소수성 매트릭스를 하기 단계에 따라서 가교결합기에 의해 차단하였다:
1) 평형: 5 칼럼 부피(CV)의 100 mM 아세트산염 완충액(5% 아세토니트릴, pH 4.3)을 1 ㎖의 양이온 교환 칼럼 밀리포어 SO3(M)을 통해 0.2 ㎖/분의 유량으로 유동시켰다.
2) 세정: 평형을 위해 650 mM 3-아세틸 머캅토(ATPPA) 용액을 상기 기재된 아세트산염 완충액에 의해 제조하고, 칼럼을 세정하고, 20 CV에 의해 0.2 ㎖/분의 유량으로 평형화시켰다.
실시태양 4. 가교결합기 및 이온 교환 칼럼에 연결되는 항체의 결합
1) 평형: 강한 양이온(-SO3) 교환가능한 수지를 매질로 사용할 경우, 5 CV의 평형 완충액을 사용하여 수지를 0.2 ㎖/분의 유량으로 세정하였다.
2) 적재: 중간체 I 용액의 전도율을 5 mS/cm내로 조절하고, pH를 1 M 시트르산 및 1 M 트리스에 의해 6.3으로 조정하고, 중간체 I 용액을 이온 교환 칼럼을 통해 0.2 ㎖/분의 유량으로 유동시키고, 이의 용량을 10 내지 50 ㎎/㎖로 조절하였다.
3) 세정: 칼럼을 3 CV의 평형 완충액에 의해 세정하였다.
4) 2차 세정: 이온 교환 칼럼 상에 축적된 이온을 3 CV의 반응 완충액(100 mM 아세트산염 완충액 + 5% 아세토니트릴, pH 4.3)에 의해 0.2 ㎖/분의 유량으로 철저히 제거하였다.
5) 3차 세정: 아세토니트릴을 5 CV의 평형 완충액에 의해 0.2 ㎖/분의 유량으로 제거하였다.
실시태양 5. 가교결합기의 말단에서의 보호제거
이온 교환 칼럼에 결합된 중간체 I은 말단 보호기를 갖는 가교결합기를 함유하고, 이의 말단 보호기는 중간체 I의 독소로의 후속적인 결합을 용이하게 하기 위해 보호제거제 하이드록실아민 하이드로클로라이드(NH2OH·HCl)에 의해 유리 머캅토기로 전환될 필요가 있다. 20 mM 하이드록실아민 하이드로클로라이드 용액을 평형 완충액에 의해 제조하고, 칼럼을 12 CV의 하이드록실아민 하이드로클로라이드 용액에 의해 0.2 ㎖/분의 유량으로 세정함으로써 가교결합기의 말단에서 설프하이드릴 기를 완전히 환원시켜 중간체 II를 형성하였다. 반응식은 도 3에 제시된다. 반응이 종료된 후, 칼럼을 5 CV의 평형 완충액에 의해 0.2 ㎖/분의 유량으로 직접적으로 세정하였다.
실시태양 6. 항체 및 독소의 커플링
본 실험에서 사용된 독소의 구조는 다음과 같다:
독소를 국제 특허출원 공개공보 제WO2016/127790A1호의 방법에 따라 제조할 수 있다. 독소를 커플링시키는 공정에서, 새로운 반응 완충액(20 mM 인산염 완충액 + 5% 아세토니트릴, pH 6.3)을 사용하여 40 CV의 10 mM 독소 용액을 제조하였다. 전체 공정을 위해 도 4를 참조한다.
1) 평형: 중간체 II가 결합된 이온 교환 칼럼을 총 5 CV의 새로운 완충액(20 mM 인산염 완충액 + 5% 아세토니트릴, pH 6.3)에 의해 0.2 ㎖/분의 유량으로 평형화시켰다.
2) 적재: 30 내지 50 CV의 10 mM 독소를 이온 교환 칼럼을 통해 0.2 ㎖/분의 유량으로 유동시키고 실온에서 반응시켰다.
3) 세정: 반응에서 결합되지 않은 독소를 5 CV의 완충액(20 mM 인산염 완충액 + 5% 아세토니트릴, pH 6.3)에 의해 0.2 ㎖/분의 유량으로 세정하였다.
4) 2차 세정: 잔여 아세토니트릴을 5 CV의 평형 완충액(100 mM 인산염 완충액, pH 6.3)에 의해 0.2 ㎖/분의 유량으로 세정하였다.
5) 용리: 15 CV의 용리 완충액(20 mM 시트르산 + 110 mM NaCl, pH 5.5)에 의해 0.2 ㎖/분의 유량으로 용리를 실행하였다.
6) 2차 용리: 또 다른 15 CV의 용리 완충액(20 mM 시트르산 + 180 mM NaCl, pH 5.5)을 사용하여, 0.2 ㎖/분의 조절된 유량에서 생산될 수 있는 중합체를 용리시켰다. 전체 용리 크로마토그래피는 도 5에 제시되고, 관련된 데이터 분석은 표 2에 제시된다.
7) 재생: 이온 교환 칼럼을 5 CV의 1 M NaOH에 의해 0.2 ㎖/분의 유량으로 재생시켰다.
결과로서, 본 발명에 의해 수득되는 예시된 ADC 구조는 다음과 같다:
[표 2]
상이한 스테이지에서의 피크의 용리에 대한 특징결정
실시태양 7. 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석 방법
ADC 약물의 제조에서, 단지 단일클론성 항체 및 독소의 접합체만이 엄밀히 치유력이 있다. ADC 약물에서 활성 구성성분들의 함량을 분석하기 위해, 워터스(Waters) X 브릿지(Brindge: 등록상표) BEH SEC 칼럼(PN: 186007640; SN: 01143613316121; 크기: 7.8 x 300 mm, 200 Å, 3.5 ㎛), 미리 패킹된 칼럼(PN: 186007638; SN: 01093616216101; 크기: 7.8 x 30 mm, 200 Å, 3.5 ㎛)을, 20 mM 황산 나트륨, 및 3%(v/v) 이소프로판올이 함유된 100 mM의 유동성의, pH 6.7 인산염 완충액과 함께 사용하였다. SEC 분석을 크로마토그래피 결과에서 상이한 용리 피크에 대해 수행하였다. 100 ㎍의 단백질을 주입하고, 280 nm에서의 흡광 피크를 0.5 ㎖/분의 유량으로 측정하였다. 결과는 도 7에 제시된다.
실시태양 8. 소분자 약물 독소 대 항체의 약물 독소-항체 커플링 비(DAR)에 대한 질량 분석
상기 양이온 교환 칼럼으로부터 용리된 ADC 약물(피크 A)을 워터스 제보(Waters Xevo) G2-XS Q-TOF[워터스 코포레이션(Waters Corporation), 미국 매사추세츠주 밀포드 소재]에 의해 양성 이온 ESI 방식으로 500 내지 5000 m/z의 범위에서 처리하였고, 탈글리코실화된 ADC 분자에 대한 질량 분석을 수득하였다. 각각, 탈용매화 기체 온도는 450℃였고, 기체 유량은 800 ℓ/시간이었으며, 이온 공급원 온도는 120℃였고, 모세관 전압은 3000 V였다. UNIFI 소프트웨어 버전 1.8에서 가장 높은 엔트로피 데콘볼루션(deconvolution) 알고리즘을 사용하여 원시 데이터를 제로-전하 질량 분석으로 전환시켰다. mAb001 항체, 가교결합기 및 독소의 분자량은 각각 147,458 Da, 132 Da 및 955 Da이다. 탈글리코실화된 ADC 분자의 적재량은 1 ㎍이고, 약물 독소-항체 커플링 비(DAR)는 다음과 같이 계산된다:
주석: DAR: 독소 대 항체의 커플링 비; Vn: n개의 약물 분자와 커플링된 항체의 피크 면적; n = 0, 1, 2, 3 ... (n≥0)
약물 독소-항체 커플링 비(DAR)는 ADC 약물의 효능을 위해 중요하고, 가교결합기-단일클론성 항체 비(LAR)는 후속적인 DAR에 직접적으로 영향을 준다. 도 8은 LAR 값이 3.58인, 가교결합기와 커플링된 EGFR 항체의 질량 분석이고, 도 9는 DAR 값이 2.59인, EGFR 항체의 ADC 약물에 대한 질량 분석이다.
실시태양 9. 단일클론성 EGFR 항체의 쇄간 디설파이드 가교의 환원 반응
쇄간 디설파이드 가교를 위한 커플링 전략은 라이신 커플링 기작과 상이하였다. EGFR 항체가 담체에 결합하기 이전에, 디설파이드 가교는 파괴되지 않고, 친수성 담체 매트릭스는 디설파이드 가교와 상호작용하지 않을 것이다. 그러므로, 1 ㎖의 GE의 양이온 교환 수지 하이트랩(상표명) 캅토 S 임팩트가 고정화된 담체로서 사용되고, 이의 매트릭스는 친수성 아가로스이다.
칼럼을 2 mM EDTA가 함유된 20 mM pH 6.3 인산염 완충액에 의해 0.2 ㎖/분의 유량으로 평형화시켰다. 이어서, 60 CV의 EGFR 단일클론성 항체 샘플을 동일한 유량으로 적재하였고, 적재물을 20 mg으로 조절하였다. 평형 완충액을 사용하여 세정을 지속하고 결합되지 않은 단일클론성 항체 또는 불순물을 제거하였다. 후속적으로 이온 교환 칼럼을 40℃의 절연 층 사이로 옮겼다(환원제 TCEP 및 EGFR 항체가 40℃에서 반응됨을 보장하기 위해). 항체의 6 배 몰 농도의 24 CV의 환원제 TCEP를 평형 완충액에 용해시키고, 칼럼을 통해 0.2 ㎖/분의 유량으로 천천히 유동시켰다. 환원 반응 직후, 이온 교환 칼럼을 절연 층 사이에서 꺼내어 실온에 두고(20 내지 25℃, 산업분야의 통상적 생산은 25℃에 의함), 약물을 첨가하고 고정화된 항원-결합 단백질과 접촉시켜, 약물과 환원된 머캅토 기의 반응이 실온에서 실행되도록 보장하였다. 잔여 환원제는 세정될 필요가 없고, 약물과 커플링되는 다음 단계에서 직접 세정되고 제거된다.
이러한 방법에 의해 수득된 ADC의 구조는 다음과 같다. 독소로의 결합 및 생성물의 용리는 실시태양 6에서와 유사하다. 용리 크로마토그래피는 도 6에 제시되고, 관련된 데이터 분석은 표 2에 제시된다.
실시태양 10. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
디설파이드 가교의 커플링 전략이 우선 EGFR 항체의 중쇄 사이 또는 중쇄와 경쇄 사이의 디설파이드 가교를 파괴할 필요가 있으므로, 중쇄 및 경쇄의 일련의 질량 분석 피크는 질량 분석에 의한 약물의 커플링 값을 분석할 경우 수득될 것이고, 이는 DAR 값에 대한 분석을 어렵게 만든다. 따라서, 본원에서는 항체 결합 약물의 강한 소수성에 따라서 HIC 분석에 의해 DAR 값을 결정하였다.
0.5 ㎖/분의 유량으로 12 분 이내의 0 내지 100% 완충액 A 및 B의 선형 구배를 갖는 TOSOH TSK-부틸 NPR 칼럼을 사용하여 소수성 크로마토그래피를 수행하였다. 여기서 완충액 A는 1.5 M 아세트산 암모늄, 및 25 mM 인산 나트륨, pH 6.95을 함유하고, 완충액 B는 25 mM 인산 나트륨, 25% IPA, pH 6.95를 함유한다. 용리 피크 면적의 280 nm에서의 흡광도를 통합함으로써 접합체의 약물-항체 커플링 비를 결정하였다. 도 10은 EGFR 항체의 디설파이드 가교의 무작위 커플링의 결과를 제시한다(DAR = 3.34). 본원에 사용된 방법은 특정한 다용도성을 갖고, 항체의 유형에 제한되지 않는다.
실시태양 11. c-Met 항체 약물 접합체의 제조
단일클론성 항체 적용 분야에서 본 발명의 다용도성을 확인하기 위해, 또 다른 항체인 c-Met 항체를 ADC 약물의 제조를 위해 선택하였다. 2개의 커플링 방법, 라이신 커플링 및 쇄간 디설파이드 가교 커플링 전략을 또한 이용하였고, 본원에 사용된 특정 실험 방법 및 독소는 상기 실시태양에서 제조된 EGFR 항체 약물 접합체와 유사하였다.
c-Met 항체 mAb002는 제CN106188293A호의 방법에 따라 제조된 인간화된 단일클론성 항체이다.
mAb002의 항체 서열은 다음과 같다:
mAb002 경쇄 아미노산 서열: 서열 번호 3
mAb002 중쇄 아미노산 서열: 서열 번호 4
도 11A에 제시된 바와 같이, MS를 사용하여 c-Met 항체 약물 접합체의 라이신 커플링의 결과를 분석하였다. 라이신 커플링 방법에 의해 수득된 c-Met 항체 ADC의 구조는 다음과 같다:
쇄간 디설파이드 가교의 커플링 동안, 환원제를 고유의 TCEP로부터의 DTT에 의해 대체하였고, DTT의 농도는 c-Met 항체의 몰 농도의 8배였다. 커플링 단계 및 다른 매개변수는 EGFR 항체의 경우와 유사하였다. 커플링된 생성물에 대한 HIC 분석은 도 11B에 제시된다. c-Met 항체 쇄 사이의 디설파이드 가교는 거의 완전히 파괴되었고, ADC 약물의 DAR은 4.85이었다. 쇄간 디설파이드 가교 환원적 커플링 c-Met 항체의 ADC 약물 구조는 다음과 같다:
SEQUENCE LISTING
<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD.
SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO., LTD
<120> METHOD FOR PREPARING ANTIBODY-DRUG CONJUGATE
<130> P184313590T
<140> PCT/CN2018/081080
<141> 2018-03-29
<150> CN201710202043.1
<151> 2017-03-30
<150> CN201710233373.7
<151> 2017-04-11
<150> CN201710342257.9
<151> 2017-05-16
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mAb001 Light chain amino acid sequence
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Tyr
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 2
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mAb001 Heavy chain amino acid sequence
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Thr Ser Gly Gly Ser Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Gly Leu Trp Phe Asp Ser Asp Gly Arg Gly Phe Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 3
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mAb002 Light chain amino acid sequence
<400> 3
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Asp Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Thr Tyr Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 4
<211> 446
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mAb002 Heavy chain amino acid sequence
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Ala Ala Phe Val
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn His Asp Asn Pro Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val
210 215 220
Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mAb001-LCDR1 Sequence
<400> 5
Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mAb001-LCDR2 Sequence
<400> 6
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mAb001-LCDR3 Sequence
<400> 7
Phe Gln Tyr Ser His Val Pro Trp Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mAb001-HCDR1 Sequence
<400> 8
Asn Tyr Tyr Ile Tyr
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mAb001-HCDR1 Sequence
<400> 9
Gly Ile Asn Pro Thr Ser Gly Gly Ser Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Thr
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mAb001-HCDR3 Sequence
<400> 10
Gln Gly Leu Trp Phe Asp Ser Asp Gly Arg Gly Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 11
Arg Ala Asn Lys Ser Val Ser Thr Ser Thr Tyr Asn Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 12
Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 13
Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 14
Asn Tyr Gly Val His
1 5
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 15
Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Ala Ala Phe Val Ser
1 5 10 15
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 16
Asn His Asp Asn Pro Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Optimized mAb002-LCDR1 Sequence
<400> 17
Arg Ala Asp Lys Ser Val Ser Thr Ser Thr Tyr Asn Tyr Leu His
1 5 10 15
Claims (34)
1) 항원-결합 단백질을 이온 교환 담체 상에 고정화하여 고정화된 항원-결합 단백질을 형성하는 단계;
2) 고정화된 항원-결합 단백질을 약물과 접촉시켜 항원-결합 단백질-약물 접합체를 형성하는 단계; 및
3) 항원-결합 단백질-약물 접합체를 이온 교환 담체로부터 용리시키는 단계
를 포함하는, 항원-결합 단백질-약물 접합체를 제조하는 방법.
2) 고정화된 항원-결합 단백질을 약물과 접촉시켜 항원-결합 단백질-약물 접합체를 형성하는 단계; 및
3) 항원-결합 단백질-약물 접합체를 이온 교환 담체로부터 용리시키는 단계
를 포함하는, 항원-결합 단백질-약물 접합체를 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
이온 교환 담체가 이온 교환 수지, 이온 교환 막 및 이온 교환 섬유로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 이온 교환 수지인, 방법.
이온 교환 담체가 이온 교환 수지, 이온 교환 막 및 이온 교환 섬유로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 이온 교환 수지인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
이온 교환 담체가 양이온 교환 담체이고, 양이온 교환 담체가 바람직하게는 강한 산성 반응 리간드를 함유하고, 강한 산성 반응 리간드가 바람직하게는 설포네이트인, 방법.
이온 교환 담체가 양이온 교환 담체이고, 양이온 교환 담체가 바람직하게는 강한 산성 반응 리간드를 함유하고, 강한 산성 반응 리간드가 바람직하게는 설포네이트인, 방법.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
단계 2)에서 고정화된 항원-결합 단백질이 약물에 커플링되고, 커플링 반응에 의해, 항원-결합 단백질 및 약물이 친핵성 기와 친전자성 기 사이의 상호작용을 통해 연결되고;
친핵성 기가 임의적으로 항원-결합 단백질 또는 약물로부터, 바람직하게는 항원-결합 단백질로부터 유래하고;
친전자성 기가 임의적으로 항원-결합 단백질 또는 약물로부터, 바람직하게는 약물로부터 유래하는, 방법.
단계 2)에서 고정화된 항원-결합 단백질이 약물에 커플링되고, 커플링 반응에 의해, 항원-결합 단백질 및 약물이 친핵성 기와 친전자성 기 사이의 상호작용을 통해 연결되고;
친핵성 기가 임의적으로 항원-결합 단백질 또는 약물로부터, 바람직하게는 항원-결합 단백질로부터 유래하고;
친전자성 기가 임의적으로 항원-결합 단백질 또는 약물로부터, 바람직하게는 약물로부터 유래하는, 방법.
제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
친핵성 기가 머캅토, 하이드록실 기, 아미노 기, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트 및 아릴 하이드라지드 기로 구성된 군으로부터 선택되되,
친핵성 기가 약물로부터 유래할 때, 친핵성 기가 바람직하게는 머캅토 기이고;
친핵성 기가 항원-결합 단백질로부터 유래할 때, 친핵성 기가 바람직하게는 아미노 기, 머캅토 기 또는 하이드록실 기이고; 아미노 기가 더욱 바람직하게는 N-말단 아미노 기, 측쇄 아미노 기, 또는 글리코실화 항원-결합 단백질에서 당류의 아미노 기이고; 하이드록실 기가 더욱 바람직하게는 글리코실화 항원-결합 단백질에서 당류의 하이드록실 기이고, 머캅토 기가 더욱 바람직하게는 티올 측쇄이고, 가장 바람직하게는 시스테인의 티올 측쇄인, 방법.
친핵성 기가 머캅토, 하이드록실 기, 아미노 기, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트 및 아릴 하이드라지드 기로 구성된 군으로부터 선택되되,
친핵성 기가 약물로부터 유래할 때, 친핵성 기가 바람직하게는 머캅토 기이고;
친핵성 기가 항원-결합 단백질로부터 유래할 때, 친핵성 기가 바람직하게는 아미노 기, 머캅토 기 또는 하이드록실 기이고; 아미노 기가 더욱 바람직하게는 N-말단 아미노 기, 측쇄 아미노 기, 또는 글리코실화 항원-결합 단백질에서 당류의 아미노 기이고; 하이드록실 기가 더욱 바람직하게는 글리코실화 항원-결합 단백질에서 당류의 하이드록실 기이고, 머캅토 기가 더욱 바람직하게는 티올 측쇄이고, 가장 바람직하게는 시스테인의 티올 측쇄인, 방법.
제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서,
항원-결합 단백질-약물 접합체가 분열성 연결기 및 비분열성 연결기로부터 선택되는 연결기에 의해 커플링되는, 방법.
항원-결합 단백질-약물 접합체가 분열성 연결기 및 비분열성 연결기로부터 선택되는 연결기에 의해 커플링되는, 방법.
제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서,
친전자성 기가 활성 에스테르, 하이드로카빌 할라이드, 벤질 할라이드, 알데하이드, 케톤, 카복실 기 및 말레이미드 기로 구성된 군으로부터 선택되되,
친전자성 기가 항원-결합 단백질로부터 유래할 때, 친전자성 기가 바람직하게는 알데하이드, 케톤, 카복실 기 또는 말레이미드 기로부터 유래하고, 더욱 바람직하게는 말레이미드 기이고;
친전자성 기가 약물로부터 유래할 때, 친전자성 기가 바람직하게는 활성 에스테르, 하이드로카빌 할라이드 또는 말레이미드 기이고, 더욱 바람직하게는 말레이미드 기이고; 활성 에스테르가 바람직하게는 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포메이트 또는 산 할라이드이고, 하이드로카빌 할라이드가 바람직하게는 할로아세트아미드인, 방법.
친전자성 기가 활성 에스테르, 하이드로카빌 할라이드, 벤질 할라이드, 알데하이드, 케톤, 카복실 기 및 말레이미드 기로 구성된 군으로부터 선택되되,
친전자성 기가 항원-결합 단백질로부터 유래할 때, 친전자성 기가 바람직하게는 알데하이드, 케톤, 카복실 기 또는 말레이미드 기로부터 유래하고, 더욱 바람직하게는 말레이미드 기이고;
친전자성 기가 약물로부터 유래할 때, 친전자성 기가 바람직하게는 활성 에스테르, 하이드로카빌 할라이드 또는 말레이미드 기이고, 더욱 바람직하게는 말레이미드 기이고; 활성 에스테르가 바람직하게는 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포메이트 또는 산 할라이드이고, 하이드로카빌 할라이드가 바람직하게는 할로아세트아미드인, 방법.
제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
친전자성 기가 약물 그 자체 또는 약물의 변형으로부터 유래하는, 방법.
친전자성 기가 약물 그 자체 또는 약물의 변형으로부터 유래하는, 방법.
제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서,
고정화된 항원-결합 단백질이 라이신 커플링, 경쇄-및-중쇄 쇄간 환원적 디설파이드 가교 커플링 및 자리-지정된 커플링으로 구성된 군으로부터 선택되는 커플링, 바람직하게는 라이신 커플링 또는 경쇄-및-중쇄 환원적 디설파이드 가교 커플링을 통해 약물에 커플링되는, 방법.
고정화된 항원-결합 단백질이 라이신 커플링, 경쇄-및-중쇄 쇄간 환원적 디설파이드 가교 커플링 및 자리-지정된 커플링으로 구성된 군으로부터 선택되는 커플링, 바람직하게는 라이신 커플링 또는 경쇄-및-중쇄 환원적 디설파이드 가교 커플링을 통해 약물에 커플링되는, 방법.
제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서,
단계 1)에서의 항원-결합 단백질이 임의적으로 변형된 항원-결합 단백질 및 변형되지 않은 항원-결합 단백질로부터 선택되고, 바람직하게는 변형된 항원-결합 단백질이고; 변형된 항원-결합 단백질이 임의적으로 화학적 시약 또는 가교결합기에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 가교결합기에 결합하는 변형된 항원-결합 단백질이고;
단계 2)에서의 약물이 임의적으로 변형되거나 변형되지 않고, 바람직하게는 변형되는, 방법.
단계 1)에서의 항원-결합 단백질이 임의적으로 변형된 항원-결합 단백질 및 변형되지 않은 항원-결합 단백질로부터 선택되고, 바람직하게는 변형된 항원-결합 단백질이고; 변형된 항원-결합 단백질이 임의적으로 화학적 시약 또는 가교결합기에 결합하는 항원-결합 단백질, 바람직하게는 가교결합기에 결합하는 변형된 항원-결합 단백질이고;
단계 2)에서의 약물이 임의적으로 변형되거나 변형되지 않고, 바람직하게는 변형되는, 방법.
제10항에 있어서,
가교결합기가 바람직하게는 하기 화학식 L2의 화합물을 갖는, 방법:
[화학식 L2]
상기 식에서,
T는 H, 3급-부틸, 아세틸, n-프로피오닐, 이소프로피오닐, 트리페닐메틸, 메톡시메틸 및 2-(트리메틸실릴) 에톡시메틸로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 H 또는 아세틸이고;
R15는 수소 원자, 할로겐, 하이드록실 기, 시아노 기, 알킬 기, 알콕시 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R16은 알킬, 사이클로알킬 및 헤테로환족으로 구성된 군으로부터 선택되고;
m은 0 내지 5, 바람직하게는 1 내지 3이다.
가교결합기가 바람직하게는 하기 화학식 L2의 화합물을 갖는, 방법:
[화학식 L2]
상기 식에서,
T는 H, 3급-부틸, 아세틸, n-프로피오닐, 이소프로피오닐, 트리페닐메틸, 메톡시메틸 및 2-(트리메틸실릴) 에톡시메틸로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 H 또는 아세틸이고;
R15는 수소 원자, 할로겐, 하이드록실 기, 시아노 기, 알킬 기, 알콕시 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R16은 알킬, 사이클로알킬 및 헤테로환족으로 구성된 군으로부터 선택되고;
m은 0 내지 5, 바람직하게는 1 내지 3이다.
제10항에 있어서,
화학식 L2로 표시되는 가교결합기가 하기 화학식 L3의 화합물인, 방법:
[화학식 L3]
화학식 L2로 표시되는 가교결합기가 하기 화학식 L3의 화합물인, 방법:
[화학식 L3]
제10항에 있어서,
가교결합기가 말레이미드 기 또는 할로아세틸 작용부분(moiety)을 갖고; 말레이미드 기를 갖는 가교결합기가 바람직하게는 SMCC, LC-SMCC, KMUA, GMBS, EMCS, MBS, AMAS, SMPH, SMPB 및 PMPI로 구성된 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 SMCC이고; 할로아세틸 작용부분을 갖는 가교결합기가 바람직하게는 SIAB, SIA, SBA 및 SBAP로 구성된 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 SIAB인, 방법.
가교결합기가 말레이미드 기 또는 할로아세틸 작용부분(moiety)을 갖고; 말레이미드 기를 갖는 가교결합기가 바람직하게는 SMCC, LC-SMCC, KMUA, GMBS, EMCS, MBS, AMAS, SMPH, SMPB 및 PMPI로 구성된 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 SMCC이고; 할로아세틸 작용부분을 갖는 가교결합기가 바람직하게는 SIAB, SIA, SBA 및 SBAP로 구성된 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 SIAB인, 방법.
제1항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서,
약물이 독소, 화학치료제, 성장 저해제, 튜불린(tubulin) 저해제, 항생제, 방사성동위원소 및 세포독성제로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
약물이 독소, 화학치료제, 성장 저해제, 튜불린(tubulin) 저해제, 항생제, 방사성동위원소 및 세포독성제로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서,
약물이 메이탄시노이드(maytansinnoid) 유도체, 아우리스타틴(auristatin) 유도체 및 캄프토테신(camptothecin) 알칼로이드로 구성된 군으로부터 선택되고; 메이탄시노이드 유도체가 바람직하게는 DM1, DM3 및 DM4로부터 선택되고; 아우리스타틴 유도체가 바람직하게는 MMAE 및 MMAF로부터 선택되고; 캄프토테신 알칼로이드가 바람직하게는 CPT, 10-하이드록시-CPT, CPT-11, SN-38 및 토포테칸(topotecan)으로 구성된 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 SN-38인, 방법.
약물이 메이탄시노이드(maytansinnoid) 유도체, 아우리스타틴(auristatin) 유도체 및 캄프토테신(camptothecin) 알칼로이드로 구성된 군으로부터 선택되고; 메이탄시노이드 유도체가 바람직하게는 DM1, DM3 및 DM4로부터 선택되고; 아우리스타틴 유도체가 바람직하게는 MMAE 및 MMAF로부터 선택되고; 캄프토테신 알칼로이드가 바람직하게는 CPT, 10-하이드록시-CPT, CPT-11, SN-38 및 토포테칸(topotecan)으로 구성된 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 SN-38인, 방법.
제1항 내지 제15항중 어느 한 항에 있어서,
약물이 하기 화학식 Dr로 표시되는 화합물, 이의 호변이성체, 메소화합물, 라세미체, 거울상이성체, 부분입체이성체 및 혼합물, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택되고:
[화학식 Dr]
[상기 식에서,
R 및 R1 내지 R7은 수소 원자, 할로겐, 하이드록실 기, 시아노 기, 알킬 기, 알콕시 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R8 내지 R11중 하나 이상은 할로겐, 알케닐, 알킬 및 사이클로알킬로 구성된 군으로부터 선택되고, 나머지는 수소 원자이거나,
R8 내지 R11중 임의의 2개는 사이클로알킬 기를 형성하고, 나머지 2개의 기는 수소 원자, 알킬 기 및 사이클로알킬 기로부터 선택되고;
R14는 아릴 및 헤테로아릴로부터 선택되고, 아릴 또는 헤테로아릴은 임의적으로 수소 원자, 할로겐, 하이드록실 기, 알킬 기, 알콕시 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되는 치환기에 의해 추가로 치환되고;
R12 및 R13은 수소 원자, 알킬 기 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택됨];
바람직하게는, 화학식 Dr이 하기 화학식 I의 화합물인, 방법:
[화학식 I]
약물이 하기 화학식 Dr로 표시되는 화합물, 이의 호변이성체, 메소화합물, 라세미체, 거울상이성체, 부분입체이성체 및 혼합물, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택되고:
[화학식 Dr]
[상기 식에서,
R 및 R1 내지 R7은 수소 원자, 할로겐, 하이드록실 기, 시아노 기, 알킬 기, 알콕시 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R8 내지 R11중 하나 이상은 할로겐, 알케닐, 알킬 및 사이클로알킬로 구성된 군으로부터 선택되고, 나머지는 수소 원자이거나,
R8 내지 R11중 임의의 2개는 사이클로알킬 기를 형성하고, 나머지 2개의 기는 수소 원자, 알킬 기 및 사이클로알킬 기로부터 선택되고;
R14는 아릴 및 헤테로아릴로부터 선택되고, 아릴 또는 헤테로아릴은 임의적으로 수소 원자, 할로겐, 하이드록실 기, 알킬 기, 알콕시 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되는 치환기에 의해 추가로 치환되고;
R12 및 R13은 수소 원자, 알킬 기 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택됨];
바람직하게는, 화학식 Dr이 하기 화학식 I의 화합물인, 방법:
[화학식 I]
제1항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서,
약물이 변형된 화합물이고, 바람직하게는 하기 화학식 L1-Dr의 화합물이고:
[화학식 L1-Dr]
[상기 식에서,
L1 구조는
이고; 바람직하게는 MC이고;
n은 2 내지 6이고, 바람직하게는 2 내지 5이고;
R 및 R2 내지 R7은 수소 원자, 할로겐, 하이드록실 기, 시아노 기, 알킬 기, 알콕시 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R8 내지 R11중 하나 이상은 할로겐, 알케닐, 알킬 및 사이클로알킬로 구성된 군으로부터 선택되고, 나머지는 수소 원자이거나,
R8 내지 R11중 임의의 2개는 사이클로알킬 기를 형성하고, 나머지 2개의 기는 수소 원자, 알킬 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R12 및 R13은 수소 원자, 알킬 기 및 할로겐으로부터 선택되고;
R14는 아릴 및 헤테로아릴로부터 선택되고, 아릴 또는 헤테로아릴은 임의적으로 수소 원자, 할로겐, 하이드록실 기, 알킬 기, 알콕시 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되는 치환기에 의해 추가로 치환됨];
더욱 바람직하게는, 화학식 L1-Dr이 하기 화학식 II로 표시되는 화합물인, 방법:
[화학식 II]
약물이 변형된 화합물이고, 바람직하게는 하기 화학식 L1-Dr의 화합물이고:
[화학식 L1-Dr]
[상기 식에서,
L1 구조는
n은 2 내지 6이고, 바람직하게는 2 내지 5이고;
R 및 R2 내지 R7은 수소 원자, 할로겐, 하이드록실 기, 시아노 기, 알킬 기, 알콕시 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R8 내지 R11중 하나 이상은 할로겐, 알케닐, 알킬 및 사이클로알킬로 구성된 군으로부터 선택되고, 나머지는 수소 원자이거나,
R8 내지 R11중 임의의 2개는 사이클로알킬 기를 형성하고, 나머지 2개의 기는 수소 원자, 알킬 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되고;
R12 및 R13은 수소 원자, 알킬 기 및 할로겐으로부터 선택되고;
R14는 아릴 및 헤테로아릴로부터 선택되고, 아릴 또는 헤테로아릴은 임의적으로 수소 원자, 할로겐, 하이드록실 기, 알킬 기, 알콕시 기 및 사이클로알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되는 치환기에 의해 추가로 치환됨];
더욱 바람직하게는, 화학식 L1-Dr이 하기 화학식 II로 표시되는 화합물인, 방법:
[화학식 II]
제1항에 있어서,
항원-결합 단백질이 인간화된 항체, 뮤린 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 단일 쇄 항체 및 이중특이성 항체로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 인간화된 항체인, 방법.
항원-결합 단백질이 인간화된 항체, 뮤린 항체, 인간 항체, 키메라성 항체, 단일 쇄 항체 및 이중특이성 항체로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 인간화된 항체인, 방법.
제1항에 있어서,
항원-결합 단백질이 단일클론성 항체, 또는 Fab, F(ab')2 및 scFv 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 항원 결합 단편인, 방법.
항원-결합 단백질이 단일클론성 항체, 또는 Fab, F(ab')2 및 scFv 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 항원 결합 단편인, 방법.
제1항 내지 제19항중 어느 한 항에 있어서,
항원-결합 단백질이 HER2, HER3, CD33, VEGF, VEGFR, VEGFR-2, CD152, CD40, TNF, IL-1, IL-5, IL-17, IL-6R, IL-1, IL-2R, BLYS, OX40L, CTLA4, PCSK9, EGFR, c-Met, CD2, CD3, CD11a, CD19, CD30, CD38, CD20, CD52, CD60, CD80, CD86, TNF-α, IL-12, IL-17, IL-23, IL-6, IL-1β, RSVF, IgE, RANK, BLyS, α4β7, PD-1, CCR4, SLAMF7, GD2, CD21, CD79b, IL20Rα, 단축소(短縮素), CD22, CD79a, CD72, IGF-1R, RANKL 및 이들의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드; 바람직하게는 EGFR, c-Met 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는, 방법.
항원-결합 단백질이 HER2, HER3, CD33, VEGF, VEGFR, VEGFR-2, CD152, CD40, TNF, IL-1, IL-5, IL-17, IL-6R, IL-1, IL-2R, BLYS, OX40L, CTLA4, PCSK9, EGFR, c-Met, CD2, CD3, CD11a, CD19, CD30, CD38, CD20, CD52, CD60, CD80, CD86, TNF-α, IL-12, IL-17, IL-23, IL-6, IL-1β, RSVF, IgE, RANK, BLyS, α4β7, PD-1, CCR4, SLAMF7, GD2, CD21, CD79b, IL20Rα, 단축소(短縮素), CD22, CD79a, CD72, IGF-1R, RANKL 및 이들의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드; 바람직하게는 EGFR, c-Met 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는, 방법.
제1항 내지 제20항중 어느 한 항에 있어서,
항원-결합 단백질이 후미라(Humira)[아달리무맙(adalimumab)], 아바스틴(Avastin)[베바시주맙(bevacizumab)], 에르비툭스(Erbitux)[세툭시맙(cetuximab)], 헤르셉틴(Herceptin)[트라스투주맙(Trastuzumab)], 페르제타(Perjeta)[페르투주맙(Pertuzumab)], 벡티빅스(Vectibix)[파니비주맙(Panibizumab)], 테랄록(Theraloc)[네투주맙(Netuzumab)], 예르보이(Yervoy)[이필리무맙(Ipilimumab)], 옵디보(Opdivo)[나볼루맙(Navolumab)], 루센티스(Lucentis)[라니비주맙(Ranibizumab)], 엔브렐(Enbrel)[에나셉트(Enacept)], 마이오신트(Myoscint)[임시로맙 펜테테이트(Imciromab pentetate)], 프로스타신트(ProstaScint)[카프로맙 펜데티드(Capromab pendetide)], 레미카데(Remicade)[인플릭시맙(Infliximab)], 레오프로(ReoPro)[압식시맙(Abciximab)], 리툭산(Rituxan)[리툭시맙(rituximab)], 시물렉트(Simulect)[바실릭시맙(Basiliximab)], 시나기스(Synagis)[팔리비주맙(Palivizumab)], 베를루마(Verluma)[노페투모맙(Nofetumomab)], 졸레어(Xolair)[오말리주맙(Omalizumab)], 제나팍스(Zenapax)[다클리주맙(Daclizumab)], 심지아(Cimzia)[세르톨리주맙(certolizumab)], 제발린(Zevalin)[이브리투모맙(Ibritumomab)], 오르토클론(Orthoclone)[모롬모납(Morommonab)], 파노렉스(Panorex)[에드레콜로맙(Edrecolomab)], 마일로타르그(Mylotarg)[겜투주맙(Gemtuzumab)], 솔리리스(Soliris)[에쿨리주맙(Eculizumab)], CNTO1275[우스테키누맙(ustekinumab)], 아메바이브(Amevive)[알레파셉트(Alefacept)], 랍티바(Raptiva)[에팔리주맙(Efalizumab)], 티사브리(Tysabri)[나탈리주맙(Natalizumab)], 악템라(Actemra)[토실리주맙(Tocilizumab)], 오렌시아(Orencia)[아바타셉트(Abatacept)], 아르칼리스트(Arcalyst)[릴로나셉(Rilonacep)], 스텔라라(Stelara)[우스테키누맙(Ustekinumab)], 레모밥(Removab)[카투막소맙(Catumaxomab)], 심포니(Simponi)[골리무맙(Golimumab)], 일라리스(Ilaris)[카나키누맙(Canakinumab)], 아르체라(Arzerra)[오파투무맙(Ofatumumab)], 프롤리아(Prolia)[데노수맙(Denosumab)], 벤리스타(Benlysta)[벨리무맙(Belimumab)], 눌로직스(Nulojix)[벨라타셉트(Belatacept)], 에일레아(Eylea)[아플리베르셉트(Aflibercept)], 캄파트(Campath)[알렘투주맙(Alemtuzumab)], CEA-스캔(Scan) 아르시투모맙(arcitumomab)(fab 단편), 포텔리게오(Poteligeo)[모가물리주맙(mogamulizumab)], 아브트락스(Abthrax)[락시바쿠맙(Raxibacumab)], 가자이바(Gazyva)[오비누투주맙(Obinutuzumab)], 랑 무(Lang Mu)[콘베르셉트(Conbercept)], 사이람자(Cyramza)[라무시루맙(Ramucirumab)], 실반트(Sylvant)[실툭시맙(Siltuximab)], 엔티비오(Entyvio)[베돌리주맙(Vedolizumab)], 키트루다(Keytruda)[펨브롤리주맙(Pembrolizumab)], 블린사이토(Blincyto)[블리나투모맙(Blinatumomab)], 코센틱스(Cosentyx)[세쿠키누맙(Secukinumab)], 우니툭신(Unituxin)[디누툭시맙(Dinutuximab)], 다르잘렉스(Darzalex)[다라투무맙(Daratumumab)], 프랄루엔트(Praluent)[알리로쿠맙(Alirocumab)], 레파타(Repatha)[에볼로쿠맙(Evolocumab)], 포르트라차(Portrazza)[네시투무맙(Necitumumab)], 엠플리시티(Empliciti)[엘로투주맙(Elotuzumab)], 누칼라(Nucala)[메폴리주맙(Mepolizumab)], 프락스빈드(Praxbind)[이다루시주맙(Idarucizumab)], 벡사르(Bexxar)[토시투모맙(Tositumomab) 및 I131 토시투모맙] 및 이들의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
항원-결합 단백질이 후미라(Humira)[아달리무맙(adalimumab)], 아바스틴(Avastin)[베바시주맙(bevacizumab)], 에르비툭스(Erbitux)[세툭시맙(cetuximab)], 헤르셉틴(Herceptin)[트라스투주맙(Trastuzumab)], 페르제타(Perjeta)[페르투주맙(Pertuzumab)], 벡티빅스(Vectibix)[파니비주맙(Panibizumab)], 테랄록(Theraloc)[네투주맙(Netuzumab)], 예르보이(Yervoy)[이필리무맙(Ipilimumab)], 옵디보(Opdivo)[나볼루맙(Navolumab)], 루센티스(Lucentis)[라니비주맙(Ranibizumab)], 엔브렐(Enbrel)[에나셉트(Enacept)], 마이오신트(Myoscint)[임시로맙 펜테테이트(Imciromab pentetate)], 프로스타신트(ProstaScint)[카프로맙 펜데티드(Capromab pendetide)], 레미카데(Remicade)[인플릭시맙(Infliximab)], 레오프로(ReoPro)[압식시맙(Abciximab)], 리툭산(Rituxan)[리툭시맙(rituximab)], 시물렉트(Simulect)[바실릭시맙(Basiliximab)], 시나기스(Synagis)[팔리비주맙(Palivizumab)], 베를루마(Verluma)[노페투모맙(Nofetumomab)], 졸레어(Xolair)[오말리주맙(Omalizumab)], 제나팍스(Zenapax)[다클리주맙(Daclizumab)], 심지아(Cimzia)[세르톨리주맙(certolizumab)], 제발린(Zevalin)[이브리투모맙(Ibritumomab)], 오르토클론(Orthoclone)[모롬모납(Morommonab)], 파노렉스(Panorex)[에드레콜로맙(Edrecolomab)], 마일로타르그(Mylotarg)[겜투주맙(Gemtuzumab)], 솔리리스(Soliris)[에쿨리주맙(Eculizumab)], CNTO1275[우스테키누맙(ustekinumab)], 아메바이브(Amevive)[알레파셉트(Alefacept)], 랍티바(Raptiva)[에팔리주맙(Efalizumab)], 티사브리(Tysabri)[나탈리주맙(Natalizumab)], 악템라(Actemra)[토실리주맙(Tocilizumab)], 오렌시아(Orencia)[아바타셉트(Abatacept)], 아르칼리스트(Arcalyst)[릴로나셉(Rilonacep)], 스텔라라(Stelara)[우스테키누맙(Ustekinumab)], 레모밥(Removab)[카투막소맙(Catumaxomab)], 심포니(Simponi)[골리무맙(Golimumab)], 일라리스(Ilaris)[카나키누맙(Canakinumab)], 아르체라(Arzerra)[오파투무맙(Ofatumumab)], 프롤리아(Prolia)[데노수맙(Denosumab)], 벤리스타(Benlysta)[벨리무맙(Belimumab)], 눌로직스(Nulojix)[벨라타셉트(Belatacept)], 에일레아(Eylea)[아플리베르셉트(Aflibercept)], 캄파트(Campath)[알렘투주맙(Alemtuzumab)], CEA-스캔(Scan) 아르시투모맙(arcitumomab)(fab 단편), 포텔리게오(Poteligeo)[모가물리주맙(mogamulizumab)], 아브트락스(Abthrax)[락시바쿠맙(Raxibacumab)], 가자이바(Gazyva)[오비누투주맙(Obinutuzumab)], 랑 무(Lang Mu)[콘베르셉트(Conbercept)], 사이람자(Cyramza)[라무시루맙(Ramucirumab)], 실반트(Sylvant)[실툭시맙(Siltuximab)], 엔티비오(Entyvio)[베돌리주맙(Vedolizumab)], 키트루다(Keytruda)[펨브롤리주맙(Pembrolizumab)], 블린사이토(Blincyto)[블리나투모맙(Blinatumomab)], 코센틱스(Cosentyx)[세쿠키누맙(Secukinumab)], 우니툭신(Unituxin)[디누툭시맙(Dinutuximab)], 다르잘렉스(Darzalex)[다라투무맙(Daratumumab)], 프랄루엔트(Praluent)[알리로쿠맙(Alirocumab)], 레파타(Repatha)[에볼로쿠맙(Evolocumab)], 포르트라차(Portrazza)[네시투무맙(Necitumumab)], 엠플리시티(Empliciti)[엘로투주맙(Elotuzumab)], 누칼라(Nucala)[메폴리주맙(Mepolizumab)], 프락스빈드(Praxbind)[이다루시주맙(Idarucizumab)], 벡사르(Bexxar)[토시투모맙(Tositumomab) 및 I131 토시투모맙] 및 이들의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제21항중 어느 한 항에 있어서,
항원-결합 단백질이 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 항-c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택되고;
항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 이들의 변이체의 LCDR1, LCDR2, LCDR3 영역, 및 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 이들의 변이체의 HCDR1, HCDR2, HCDR3 영역, 바람직하게는 서열 번호 1의 경쇄 및 서열 번호 2의 중쇄의 서열을 포함하고; 다르게는,
항-c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열 번호 11 또는 서열 번호 17, 서열 번호 12, 서열 번호 13 및 이들의 변이체의 LCDR1, LCDR2, LCDR3 영역, 바람직하게는 서열 번호 17의 LCDR1, 및 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 이의 변이체의 HCDR1, HCDR2, HCDR3 영역을 포함하고; c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 바람직하게는 서열 번호 3의 경쇄 및 서열 번호 4의 중쇄의 서열을 포함하는, 방법.
항원-결합 단백질이 항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 항-c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택되고;
항-EGFR 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 이들의 변이체의 LCDR1, LCDR2, LCDR3 영역, 및 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10 및 이들의 변이체의 HCDR1, HCDR2, HCDR3 영역, 바람직하게는 서열 번호 1의 경쇄 및 서열 번호 2의 중쇄의 서열을 포함하고; 다르게는,
항-c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열 번호 11 또는 서열 번호 17, 서열 번호 12, 서열 번호 13 및 이들의 변이체의 LCDR1, LCDR2, LCDR3 영역, 바람직하게는 서열 번호 17의 LCDR1, 및 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 이의 변이체의 HCDR1, HCDR2, HCDR3 영역을 포함하고; c-Met 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 바람직하게는 서열 번호 3의 경쇄 및 서열 번호 4의 중쇄의 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제22항중 어느 한 항에 있어서,
단계 1)의 항원-결합 단백질의 전도율을 이온 교환 담체와 접촉시키기 이전에 5 mS/cm 미만으로 조정하는 방법.
단계 1)의 항원-결합 단백질의 전도율을 이온 교환 담체와 접촉시키기 이전에 5 mS/cm 미만으로 조정하는 방법.
제1항 내지 제23항중 어느 한 항에 있어서,
단계 1)에 기재된 항원-결합 단백질을 pH가 5.5 내지 7.0, 바람직하게는 6.3인 완충액에서 이온 교환 담체 상에 고정화하는 방법.
단계 1)에 기재된 항원-결합 단백질을 pH가 5.5 내지 7.0, 바람직하게는 6.3인 완충액에서 이온 교환 담체 상에 고정화하는 방법.
제24항에 있어서,
완충액이 인산염 완충액, 아세트산염 완충액, 시트르산염 완충액 및 석신산염 완충액으로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 인산염 완충액인, 방법.
완충액이 인산염 완충액, 아세트산염 완충액, 시트르산염 완충액 및 석신산염 완충액으로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 인산염 완충액인, 방법.
제1항 내지 제25항중 어느 한 항에 있어서,
단계 2)의 고정화된 항원-결합 단백질을 약물에 커플링시키고, 이온 교환 담체를 통해 약물을 느리게 유동시킴으로써 약물 대 항원-결합 단백질의 몰 비를 6 : 1 미만의 양으로 조절하고 유량을 0.2 내지 2 ㎖/분으로 조절하여 커플링 반응을 실행하는 방법.
단계 2)의 고정화된 항원-결합 단백질을 약물에 커플링시키고, 이온 교환 담체를 통해 약물을 느리게 유동시킴으로써 약물 대 항원-결합 단백질의 몰 비를 6 : 1 미만의 양으로 조절하고 유량을 0.2 내지 2 ㎖/분으로 조절하여 커플링 반응을 실행하는 방법.
제1항 내지 제26항중 어느 한 항에 있어서,
단계 2)의 용리가 상이한 염 농도를 갖는 완충액을 사용하는 단계식 용리를 포함하고, 완충액의 pH가 5.0 내지 6.5, 바람직하게는 5.5인, 방법.
단계 2)의 용리가 상이한 염 농도를 갖는 완충액을 사용하는 단계식 용리를 포함하고, 완충액의 pH가 5.0 내지 6.5, 바람직하게는 5.5인, 방법.
제27항에 있어서,
완충액이 인산염 완충액, 아세트산염 완충액, 시트르산염 완충액 및 석신산염 완충액으로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 시트르산염 완충액인, 방법.
완충액이 인산염 완충액, 아세트산염 완충액, 시트르산염 완충액 및 석신산염 완충액으로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 시트르산염 완충액인, 방법.
제1항 내지 제28항중 어느 한 항에 있어서,
단계식 용리가 제1 단계 용리 및 제2 단계 용리를 포함하고, 제1 단계 용리의 염 농도가 100 내지 140 mM이고, 바람직하게는 110 mM이고, 제2 단계 용리의 염 농도가 150 내지 200 mM이고, 바람직하게는 180 mM인, 방법.
단계식 용리가 제1 단계 용리 및 제2 단계 용리를 포함하고, 제1 단계 용리의 염 농도가 100 내지 140 mM이고, 바람직하게는 110 mM이고, 제2 단계 용리의 염 농도가 150 내지 200 mM이고, 바람직하게는 180 mM인, 방법.
제1항 내지 제29항중 어느 한 항에 있어서,
단계 1)이
a) 항원-결합 단백질을 가교결합기에 결합시켜 변형된 항원-결합 단백질을 수득하는 단계;
b) 변형된 항원-결합 단백질을 이온 교환 담체 상에 고정화하여 고정화된 항원-결합 단백질을 형성하는 단계; 및
c) 보호제거제를 첨가하는 단계
를 포함하고, 보호제거제가 바람직하게는 NH2OH·HCl인, 방법.
단계 1)이
a) 항원-결합 단백질을 가교결합기에 결합시켜 변형된 항원-결합 단백질을 수득하는 단계;
b) 변형된 항원-결합 단백질을 이온 교환 담체 상에 고정화하여 고정화된 항원-결합 단백질을 형성하는 단계; 및
c) 보호제거제를 첨가하는 단계
를 포함하고, 보호제거제가 바람직하게는 NH2OH·HCl인, 방법.
제30항에 있어서,
항원-결합 단백질을 가교결합기에 20 내지 40℃의 온도에서 결합시키는 방법.
항원-결합 단백질을 가교결합기에 20 내지 40℃의 온도에서 결합시키는 방법.
제30항에 있어서,
항원-결합 단백질의 가교결합기로의 결합이 pH가 4.0 내지 5.5인 완충액에서, 바람직하게는 4.3의 pH에서 수행되고; 완충액이 바람직하게는 아세트산염 완충액이고, 더욱 바람직하게는 아세트산염 완충액이 아세토니트릴을 함유하는, 방법.
항원-결합 단백질의 가교결합기로의 결합이 pH가 4.0 내지 5.5인 완충액에서, 바람직하게는 4.3의 pH에서 수행되고; 완충액이 바람직하게는 아세트산염 완충액이고, 더욱 바람직하게는 아세트산염 완충액이 아세토니트릴을 함유하는, 방법.
제1항 내지 제29항중 어느 한 항에 있어서,
단계 1)이
A) 항원-결합 단백질을 이온 교환 담체 상에 고정화하여 고정화된 항원-결합 단백질을 형성하는 단계; 및
B) 환원제를 첨가하여 고정화된 항원-결합 단백질의 디설파이드 가교를 환원시키는 단계
를 포함하고, 환원제가 바람직하게는 TCEP, DTT, 머캅토에틸아민 및 Ac-Cys로 구성된 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 TCEP인, 방법.
단계 1)이
A) 항원-결합 단백질을 이온 교환 담체 상에 고정화하여 고정화된 항원-결합 단백질을 형성하는 단계; 및
B) 환원제를 첨가하여 고정화된 항원-결합 단백질의 디설파이드 가교를 환원시키는 단계
를 포함하고, 환원제가 바람직하게는 TCEP, DTT, 머캅토에틸아민 및 Ac-Cys로 구성된 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 TCEP인, 방법.
제33항에 있어서,
단계 B의 환원 반응을 25 내지 45℃, 바람직하게는 40℃의 온도에서 수행하는 방법.
단계 B의 환원 반응을 25 내지 45℃, 바람직하게는 40℃의 온도에서 수행하는 방법.
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