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CN119137154A - 抗叶酸受体α抗体及使用方法 - Google Patents

抗叶酸受体α抗体及使用方法 Download PDF

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CN119137154A
CN119137154A CN202380037567.3A CN202380037567A CN119137154A CN 119137154 A CN119137154 A CN 119137154A CN 202380037567 A CN202380037567 A CN 202380037567A CN 119137154 A CN119137154 A CN 119137154A
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seq
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nos
group
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R·H·戴维斯
S·D·巴恩舍尔
D·厄洛塞夫
S·S·康
P·W·Y·陈
S·达斯
A·埃尔南德斯·洛加斯
R·W·格内
A·G·H·扬
S·O·劳恩
D·崔
D·鲍曼
B·卡拉维特
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Enzymatic British Columbia Ltd
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Abstract

结合人叶酸受体α(FRα或FOLR1)的抗体构建体和包含缀合至药物诸如细胞毒素或免疫调节剂的抗FRα抗体构建体的抗体‑药物缀合物(ADC)，以及它们例如在癌症的治疗或诊断中作为治疗剂或诊断剂的用途。

Description

抗叶酸受体α抗体及使用方法
技术领域
本公开涉及抗体治疗剂领域，并且尤其涉及靶向人叶酸受体α(hFRα)的抗体。
背景技术
叶酸受体α(FRα)是由FOLR1编码的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的细胞表面蛋白，并且是高亲和力FR家族成员之一，该家族还包括FRβ(FOLR2)、FRγ(FOLR3)和FRδ(FOLR4)。FRα已经被鉴定为高度相关的癌症疗法靶标，因为它在多种癌症(包括卵巢癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、子宫内膜癌、间皮瘤和肺癌)中过表达，在非恶性组织中具有极少表达。
目前正在进行涉及FRα靶向剂在癌症治疗中的若干临床研究，这些剂包括抗FRα抗体、法妥珠单抗(farletuzumab)和FRα靶向抗体-药物缀合物(ADC)、索米妥昔单抗(mirvetuximab soravtansine)(ImmunoGen,Inc.)、MORAb-202(Eisai Inc.)和STRO-002(Sutro Biopharma,Inc.)。
提供该背景信息的目的是使申请人相信的已知信息与本公开可能相关。不一定旨在承认，也不应该解释为，任何前述信息构成了针对所要求保护的发明的现有技术。
发明内容
本文描述了抗FRα抗体及使用方法。本公开的一个方面涉及一种包含特异性结合人叶酸受体α(hFRα)的抗原结合结构域的抗体构建体，其中所述抗体构建体与特异性结合hFRα内包含SEQ ID NO:15的氨基酸残基E120、D121、R123、T124、S125和Y126的表位的参考抗体竞争结合hFRα。
本公开的另一个方面涉及一种包含抗原结合结构域的抗体构建体，所述抗原结合结构域特异性结合人叶酸受体α(hFRα)内包含SEQ ID NO:15的氨基酸残基E120、D121、R123、T124、S125和Y126的表位。
本公开的另一个方面涉及一种包含特异性结合人叶酸受体α(hFRα)的抗原结合结构域的抗体构建体，所述抗原结合结构域包含重链CDR氨基酸序列(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链CDR氨基酸序列(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述重链CDR氨基酸序列包含如SEQ ID NO:3、4和5中所示的序列，所述轻链CDR氨基酸序列包含如SEQ ID NO:6、7和8中所示的序列。
本公开的另一个方面涉及一种包含可操作地连接至IgG Fc区的两个抗原结合结构域的抗体构建体，其中所述抗原结合结构域中的每一个均特异性结合人叶酸受体α(hFRα)并且包含：
(a)如SEQ ID NO:39中所示的VL氨基酸序列和如SEQ ID NO:19中所示的VH氨基酸序列；或
(b)如SEQ ID NO:124中所示的VL氨基酸序列和如SEQ ID NO:91中所示的VH氨基酸序列；或
(c)如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列和
(i)如SEQ ID NO:50中所示的VH氨基酸序列，或
(ii)如SEQ ID NO:54中所示的VH氨基酸序列，或
(iii)如SEQ ID NO:57中所示的VH氨基酸序列，或
(iv)如SEQ ID NO:61中所示的VH氨基酸序列，或
(v)如SEQ ID NO:76中所示的VH氨基酸序列，或
(vi)如SEQ ID NO:79中所示的VH氨基酸序列，或
(vii)如SEQ ID NO:82中所示的VH氨基酸序列，或
(viii)如SEQ ID NO:85中所示的VH氨基酸序列，或
(ix)如SEQ ID NO:88中所示的VH氨基酸序列，或
(x)如SEQ ID NO:106中所示的VH氨基酸序列；或
(d)如SEQ ID NO:130中所示的VL氨基酸序列和
(i)如SEQ ID NO:99中所示的VH氨基酸序列，或
(ii)如SEQ ID NO:106中所示的VH氨基酸序列，或
(iii)如SEQ ID NO:113中所示的VH氨基酸序列，或
(iv)如SEQ ID NO:116中所示的VH氨基酸序列，或
(v)如SEQ ID NO:133中所示的VH氨基酸序列，或
(vi)如SEQ ID NO:136中所示的VH氨基酸序列；或
(e)如SEQ ID NO:119中所示的VL氨基酸序列和
(i)如SEQ ID NO:106中所示的VH氨基酸序列，或
(ii)如SEQ ID NO:116中所示的VH氨基酸序列。
本公开的另一个方面涉及一种多核苷酸或一组多核苷酸，其编码如本文所述的抗FRα抗体构建体。
本公开的另一个方面涉及一种表达载体或一组表达载体，其包含编码如本文所述的抗FRα抗体构建体的多核苷酸或一组多核苷酸。本公开的另一个方面涉及一种包含所述表达载体或一组表达载体的宿主细胞。
本公开的另一个方面涉及一种抗体-药物缀合物，其包含缀合至一个或多个药物部分的如本文所述的抗FRα抗体构建体。
本公开的另一个方面涉及具有通式I的抗体-药物缀合物：
A-(L-(D)m)n (I)其中：
A是如本文所述的抗FRα抗体构建体；
L是接头；
D是药物部分；
m介于1和约8之间，并且
n为1和约12。
本公开的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的抗FRα抗体构建体或如本文所述的抗体-药物缀合物和药学上可接受的载剂或稀释剂。
本公开的另一个方面涉及如本文所述的抗FRα抗体构建体或如本文所述的抗体-药物缀合物，其用于疗法中，例如用于癌症的治疗中。
本公开的另一个方面涉及如本文所述的抗FRα抗体构建体或如本文所述的抗体-药物缀合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
本公开的另一个方面涉及一种抑制FRα阳性肿瘤细胞生长的方法，其包括使所述细胞与如本文所述的抗FRα抗体构建体或如本文所述的抗体-药物缀合物接触。
本公开的另一个方面涉及一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的抗FRα抗体构建体或如本文所述的抗体-药物缀合物。
附图说明
图1A示出了移植到人VH框架(IGHV3-23*01)(SEQ ID NO:155)上的嵌合抗体v23924的兔重链可变结构域CDR的序列，并且图1B示出了移植到人VL框架(IGKVI-39*01)(SEQ ID NO:156)上的嵌合抗体v23924的兔轻链可变结构域CDR的序列。CDR以AbM定义指定并以粗斜体字体标记。
图2A-图2D示出了如通过电泳和UPLC-SEC分析的，纯化的亲本嵌合变体v23924和纯化的代表性人源化变体v30384的图谱。图2A和图2C示出了亲本嵌合变体v23924(2A)和纯化的代表性人源化变体v30384(2C)在制备型SEC纯化后(prep-SEC后)或在蛋白A纯化后(pA后)在非还原(NR)和还原(R)条件下的电泳图谱，图2B和图2D示出了制备型SEC纯化后亲本嵌合变体v23924(2B)和蛋白A纯化后纯化的代表性人源化变体v30384(2D)的UPLC-SEC图谱。
图3A和图3B描绘了亲本嵌合变体v23924(3A)和纯化的代表性人源化变体v30384(3B)的生物层干涉测量(BLI)传感图。
图4A-图4D描绘了代表性人源化变体v30384(4A，主峰扩展视图在4B中)和v31422(4C，主峰扩展视图在4D中)的完整LC/MS图谱。
图5A和图5B示出了孵育6小时后(5A)和孵育24小时后(5B)通过流式细胞术测定的，在FRα表达细胞系IGROV-1中嵌合抗体v23924、代表性人源化变体v30384和靶向FRα的抗体索米妥昔单抗和法妥珠单抗在各种浓度下受体介导的内化能力。抗RSV抗体帕利珠单抗作为阴性对照被包括在内。
图6A和图6B示出了孵育6小时后(6A)和孵育24小时后(6B)通过流式细胞术测定的，在FRα表达细胞系OVCAR-3中嵌合抗FRα抗体v23924、代表性人源化变体v30384和靶向FRα的抗体索米妥昔单抗和法妥珠单抗在各种浓度下受体介导的内化能力。抗RSV抗体帕利珠单抗作为阴性对照被包括在内。
图7示出了通过胃蛋白酶消化hFRα产生的肽对hFRα序列(SEQ ID NO:15)的覆盖。序列下方的每个条表示肽。
图8A和图8B示出了通过胃蛋白酶消化hFRα产生的肽的氢/氘交换质谱(HDX-MS)动力学的汇总图(8A)和差异图(8B)：hFOLR1(hFRα)对比hFOLR1-v23924复合物。
图9A-图9C示出了1小时氢/氘交换质谱(HDX-MS)后肽119-126(WEDCRTSY)(SEQ IDNO:152)的酰胺氘化水平：hFOLR1(9A)对比hFOLR1-v23924复合物(9B)，以及差异图(9C)。
图10A和图10B示出了如在5小时和24小时孵育期后通过流式细胞术测定的，在FRα表达细胞系IGROV-1(10A)和JEG-3(10B)中亲本人源化抗体变体v30384和代表性的亲和力成熟变体v35356的受体介导的内化能力。帕利珠单抗作为非靶向对照被包括在内。
图11A-图11D示出了通过质谱法评估的代表性ADC在细胞系JEG-3(11A)、Caov-3(11B)、H2110(11C)和HEC-1-A(11D)中的细胞内有效载荷递送能力。ADC是人源化抗体变体v30384和亲和力成熟变体v35356，各自缀合至药物-接头DL1。
图12A-图12H示出了在异种移植物模型中评估的缀合至药物-接头DL1或DL7的嵌合抗FRα抗体v23924的体内抗肿瘤活性：CTG-0848PDX(12A)、OV90 CDX(12B)、OVCAR-3CDX(12C)、LXFA737 PDX(12D)、JEG3 CDX(12E)、HCC1954 CDX(12F)、SKOV3 CDX(12G)和KB CDX(12H)。对照ADC是缀合至药物-接头DL1或DL6的v17717(具有HetFc的索米妥昔单抗Fab)。
图13示出了以4mg/kg或9mg/kg施用的包含各自缀合至药物-接头DL1的嵌合抗体v23924或人源化变体v30384或v30399的ADC在中/高水平表达FRα的OVCAR3卵巢癌模型中的体内抗肿瘤活性。
图14A-图14E示出了如在异种移植物模型中评估的，以所示剂量施用的包含缀合至药物-接头DL1或DL8的人源化变体v30384的ADC的体内抗肿瘤活性：H2110 CDX(14A)、SKOV3 CDX(14B和14C)、IGROV-1CDX(14D)和LXFA737 PDX(14E)。对照ADC是缀合至药物-接头DL6的v17717(具有HetFc的索米妥昔单抗Fab)；缀合至药物-接头DL6的v17716(具有HomoFc的索米妥昔单抗Fab)，以及对于H2110 CDX，缀合至药物-接头DL4的v31629(法妥珠单抗)。
图15A-图15D示出了在异种移植物模型中以所示剂量施用的包含缀合至药物-接头DL5的人源化变体v30384的ADC的体内抗肿瘤活性：OV90(15A)、H2110(15B)和OVCAR-3(15C和15D)。
图16A-图16H示出了药代动力学分析的结果，指示取自用包含各种抗FRα抗体的ADC治疗的动物的血清中血清IgG或ADC随时间变化的浓度；在OV90模型(16A)、OVCAR-3模型(16B)、LXFA737模型(16C)、JEG3模型(16D)或SKOV-3模型(16E)中是缀合至药物-接头DL1的嵌合抗FRα抗体v23924；在H2110模型(16F)中是缀合至药物-接头DL1的人源化变体v30384，以及在OV90模型(16G)或H2100模型(16H)中是缀合至药物-接头DL5的人源化变体v30384。
图17呈现了示出如由IMGT、Chothia、Kabat、Contact和AbM定义限定的代表性抗FRα抗体的CDR序列的表。
图18呈现了示出代表性抗FRα抗体的VH和VL序列的表。
图19示出了包含缀合至药物-接头DL1的人源化抗体v30384的ADC和包含缀合至药物-接头DL1的亲和力成熟变体v35356的ADC在细胞系中的细胞生长抑制(细胞毒性)能力：KB-HeLa(19A)、IGROV-1(19B)、JEG-3(19C)、SKOV-3(19D)和MDA-MB-468(19E)。
图20A-图20D示出在4小时(20A)、24小时(20B)、48小时(20C)和96小时(20D)抗FRα人源化抗体变体v36675与索米妥昔单抗和阴性对照帕利珠单抗相比在JEG-3细胞球状体中的穿透。
图21A和图21B示出了对于20μg/mL的抗FRα人源化抗体变体v36675(21A)和1μg/mL的对照抗体(利妥昔单抗生物仿制药)(21B)使用Retrogenix细胞微阵列技术针对特异性脱靶结合相互作用进行筛选的固定细胞确认筛选图像。
图22示出在H2110细胞中评估的嵌合抗FRα抗体v23294与抗FRα抗体索米妥昔单抗和法妥珠单抗之间的竞争结合。
图23示出了如在5小时孵育期后通过流式细胞术测定的，在FRα表达细胞系IGROV-1中人源化变体v30384与双互补位抗FRα抗体B5327A(v36264)和抗FRα抗体索米妥昔单抗(v17716)相比的受体介导的内化能力。
图24示出了在96小时时与双互补位抗FRα抗体B5327A(v36264)和抗FRα抗体索米妥昔单抗(v17716)相比，抗FRα人源化抗体变体v36675在JEG-3细胞球状体中的穿透。
具体实施方式
本公开涉及结合人叶酸受体α(FRα；本文也称为FOLR1)，但不显示与叶酸受体β(FOLR2)、γ(FOLR3)或δ(FOLR4)的显著结合的抗体构建体。在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体也能够结合食蟹猴FRα。
本公开还涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含缀合至药物诸如细胞毒素或免疫调节剂的如本文所述的抗FRα抗体构建体。本公开的抗FRα抗体构建体和ADC可用作例如治疗剂或诊断剂。本公开的某些方面涉及抗FRα抗体构建体和ADC例如在治疗癌症中的治疗方法和用途。一些方面涉及抗FRα抗体构建体和ADC例如在癌症的诊断或分析中的诊断方法和用途。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
如本文所用，术语“约”是指与给定值相差大约+/-10％的变化。应当理解，无论是否特别提及，此类变化总是包括在本文提供的任何给定值中。
当在本文中结合术语“包含”一起使用时，词语“一个/种”的使用可意指“一个/种”，但它也符合“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义。
如本文所用，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”及其语法变型是包括性的或开放式的，并且不排除附加的、未列举的要素和/或方法步骤。当在本文中结合组合物、用途或方法一起使用时，术语“基本上由……组成”表示可以存在附加的要素和/或方法步骤，但是这些附加不会实质性影响所列举的组合物、方法或用途起作用的方式。术语“由……组成”在本文中与组合物、用途或方法组合使用时不包括另外的元素和/或方法步骤的存在。本文描述为包含某些要素和/或步骤的组合物、用途或方法也可以在某些实施方案中基本上由那些要素和/或步骤组成，而在其他实施方案中由那些要素和/或步骤组成，无论是否具体提及了这些实施方案。
“互补决定区”或“CDR”是有助于抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“框架”区(FR)可以帮助维持CDR的正确构象以促进抗原结合区与抗原之间的结合。从N端到C端，抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。三个重链CDR在本文中称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，三个轻链CDR称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR为抗体与抗原或表位的结合提供了大多数接触残基。通常，需要三个重链CDR和三个轻链CDR来结合抗原。然而，在一些情况下，甚至单个可变结构域也可以赋予抗原结合特异性。此外，如本领域已知的，在一些情况下，抗原结合也可通过最少一个或多个选自VH和/或VL结构域的CDR(例如HCDR3)的组合而发生。
CDR序列的许多不同定义是常用的，包括Kabat等人(1983,Sequences ofProteins of Immunological Interest,NIH Publication No.369-847,Bethesda,MD)、Chothia等人(1987,J Mol Biol,196:901-917)描述的那些，以及IMGT、AbM(University ofBath)和Contact(MacCallum等人，1996,J Mol Biol,262(5):732-745)定义。例如，根据Kabat、Chothia、IMGT、AbM和Contact的CDR定义在下表1中提供。因此，对于本领域技术人员显而易见的是，CDR的确切编号和放置可以基于所采用的编号系统而不同。然而，应当理解，本文对VH的公开包括对如任何已知编号系统定义的相关(固有)重链CDR(HCDR)的公开。类似地，本文对VL的公开包括对如任何已知编号系统定义的相关(固有)轻链CDR(LCDR)的公开。
表1：通用CDR定义1
1Kabat或Chothia编号系统可用于除使用Chothia编号的Contact之外的所有定义的HCDR2、HCDR3和轻链CDR。
2使用kabat编号。划定Chothia和IMGT CDR-H1环的末端的Kabat编号方案中的位置根据环的长度而变化，因为Kabat将那些CDR定义之外的插入置于位置35A和35B。然而，IMGT和Chothia CDR-H1环可以使用Chothia编号明确定义。使用Chothia编号的CDR-H1定义：Kabat H31-H35、Chothia H26-H32、AbM H26-H35、IMGT H26-H33、Contact H30-H35。
在两个或更多个多核苷酸或多肽序列的背景下，术语“同一(的)”是指两个或更多个相同的序列或子序列。当对序列进行比较和比对以在比较窗口上或在指定区域上获得如使用本领域普通技术人员已知的常用序列比较算法中的一种或通过人工比对和目视检查所测量的最大一致性时，如果该序列具有一定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(例如，在指定区域内具有约80％、约85％、约90％、约95％或约98％同一性)，则该序列是“实质同一的”。对于序列比较，通常将测试序列与指定的参考序列比较。在使用序列比较算法时，把测试序列和参考序列输入到计算机中，如有必要，则指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定可替代参数。然后该序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
“比较窗口”是指包含连续氨基酸或核苷酸位置的序列的区段，所述连续氨基酸或核苷酸位置可以是例如约10至600个连续氨基酸或核苷酸位置，或约10至约200个、或约10至约150个连续氨基酸或核苷酸位置，在所述连续氨基酸或核苷酸位置上，在两个序列最佳比对后，可将测试序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域普通技术人员已知的。用于比较的最佳序列比对可以例如通过以下来实施：Smith&Waterman,1970,Adv.Appl.Math.,2:482c的局部同源算法；Needleman&Wunsch,1970,J.Mol.Biol.,48:443的同源比对算法；Pearson&Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444的相似性检索方法；或这些算法的计算机化实现(例如，Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA或TFASTA)，或人工比对和目视检查(参见，例如Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,(1995年增补),Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。适合于确定序列同一性百分比的可用算法的示例是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述于Altschul等人,1997,Nuc.Acids Res.,25:3389-3402和Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.,215:403-410。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心的网站(National Center for Biotechnology Information,NCBI)公开获得。
如本文所用，术语“受试者”是指动物，在一些实施方案中是指哺乳动物，其是治疗、观察或实验的对象。所述动物可以是人、非人灵长类动物、伴侣动物(例如狗、猫等)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、马等)或实验室动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、非人灵长类动物等)。在某些实施方案中，受试者是人。
预期本文所述讨论的任何实施方案均可通过本发明公开的任何方法、用途或组合物来实施，反之亦然。
结合本文公开的一个实施方案描述的特定特征、结构和/或特性可以与结合本文公开的另一个实施方案描述的特征、结构和/或特性以任何合适的方式组合以提供一个或多个其他实施方案。
还应理解的是，在一个实施方案中对特征的肯定陈述是在另一个实施方案中排除所述特征的基础。例如，在为给定实施方案或权利要求提出选项列表的情况下，应当理解，可以从该列表中删除一个或多个选项，并且缩短的列表可以形成替代实施方案，而不管此种替代实施方案是否被具体提及。
抗FRα抗体构建体
本公开涉及特异性结合人FRα(hFRα)的抗体构建体。在这个背景下，术语“抗体构建体”是指包含一个或多个抗原结合结构域的多肽或一组多肽，其中所述一个或多个抗原结合结构域中的每一个特异性结合表位或抗原。当抗体构建体包含两个或更多个抗原结合结构域时，每个抗原结合结构域可以结合相同的表位或抗原(即抗体构建体是单特异性的)或它们可以结合不同的表位或抗原(即抗体构建体是双特异性的或多特异性的)。抗体构建体还可以包含支架，并且所述一个或多个抗原结合结构域可以融合或共价连接至支架，任选地经由接头连接，如本文所述。
根据本公开，抗FRα抗体构建体包含至少一个特异性结合hFRα的抗原结合结构域。“特异性结合”hFRα意指抗体构建体结合hFRα但不表现出与人叶酸受体β(FOLR2)、γ(FOLR3)或δ(FOLR4)中的任一种的显著结合。在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体能够结合来自一个或多个非人物种的FRα。在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体能够结合食蟹猴FRα。
人FRα也称为“人叶酸受体1”或“FOLR1”。来自各种来源的hFRα的蛋白质序列是本领域已知的，并且可容易地从公众可访问的数据库(诸如GenBank或UniProtKB)获得。hFRα序列的示例包括例如根据NCBI参考号P15328、AAX29268.1、AAX37119.1、NP_057937.1和NP_057936.1提供的那些。表2中以SEQ ID NO:1(NCBI参考序列：NP_057936.1)提供示例性的hFRα蛋白质序列。表2中还提供了示例性的食蟹猴FRα蛋白质序列(SEQ ID NO:2；NCBI参考序列：XP_005579002.2)。
表2：人和食蟹猴FRα蛋白质序列
抗原结合结构域与靶抗原或表位的特异性结合可例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离振子共振(SPR)技术(采用例如BIAcore仪器)(Liljeblad等人,2000,Glyco J,17:323-329)、流式细胞术或传统结合测定(Heeley,2002,Endocr Res,28:217-229)来测量。在某些实施方案中，特异性结合可定义为例如如通过ELISA或流式细胞术测量的与非靶蛋白(诸如FOLR2、FOLR3或FOLR4)的结合程度小于与hFRα的结合的约10％。在某些实施方案中，抗体构建体对FRα的特异性结合可通过解离常数(KD)<1μΜ，例如<500nM、<250nM、<100nM、<50nM或<10nM来定义。在某些实施方案中，抗体构建体对特定抗原或表位的特异性结合可以通过解离常数(KD)为10-6M或更小，例如10-7M或更小或10-8M来定义。在一些实施方案中，抗体构建体对特定抗原或表位的特异性结合可以通过解离常数(KD)介于10-6M与10-9M之间，例如介于10-7M与10-9M之间来定义。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体显示出比参考抗体索米妥昔单抗(huMovl9或huFR107)和法妥珠单抗(MORAb-003)更高的向FRα表达细胞中的内化。
抗体内化可以使用本领域已知的方法测量，例如，通过根据Schmidt,M.等人，2008,Cancer Immunol.Immunother.,57:1879-1890中详述的方案的直接内化法，或使用市售荧光染料诸如pHAb染料(Promega Corporation,Madison,WI)、pHrodo iFL和深红染料(ThermoFisher Scientific Corporation,Waltham,MA)及 Fabfluor-pH抗体标记试剂(Sartorius AG,Germany)，和分析技术诸如显微镜检查、FACS、高含量成像或其他基于板的测定。
在某些实施方案中，当在相同测试条件下内化到FRα表达细胞中的抗FRα抗体构建体的量是内化到相同FRα表达细胞中的参考抗体的量的至少1.2倍时，认为抗FRα抗体构建体比相应参考抗体(索米妥昔单抗或法妥珠单抗)展示出向FRα表达细胞更高的内化。在某些实施方案中，使用适当的荧光染料和高含量成像测定内化抗体的量。在一些实施方案中，测定高水平表达FRα的细胞中内化抗体的量。在一些实施方案中，测定IGROV-1细胞或以与IGROV-1细胞相似的水平表达FRα的细胞中内化抗体的量。在一些实施方案中，在6小时孵育期后测定内化抗体的量。在一些实施方案中，在24小时孵育期后测定内化抗体的量。
在某些实施方案中，当在相同测试条件下内化到FRα表达细胞中的抗FRα抗体构建体的量是内化到相同FRα表达细胞中的参考抗体的量的至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或2.0倍时，认为抗FRα抗体构建体比相应参考抗体(索米妥昔单抗或法妥珠单抗)展示出向FRα表达细胞更高的内化。在某些实施方案中，使用适当的荧光染料和高含量成像测定内化抗体的量。在一些实施方案中，测定高水平表达FRα的细胞中内化抗体的量。在一些实施方案中，测定IGROV-1细胞或以与IGROV-1细胞相似的水平表达FRα的细胞中内化抗体的量。在一些实施方案中，在6小时孵育期后测定内化抗体的量。在一些实施方案中，在24小时孵育期后测定内化抗体的量。
抗原结合结构域
本公开的抗FRα抗体构建体包含至少一个能够结合hFRα的抗原结合结构域。所述至少一个能够结合hFRα的抗原结合结构域通常是基于免疫球蛋白的结合结构域，诸如抗原结合抗体片段。抗原结合抗体片段的示例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、单链Fab(scFab)、单链Fv(scFv)和单结构域抗体(sdAb)。
“Fab片段”含有轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)以及轻链和重链的可变结构域(分别为VL和VH)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于其在重链CH1结构域的羧基端添加了几个氨基酸残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab片段也可以是单链Fab分子，即其中Fab轻链和Fab重链通过肽接头连接形成单一肽链的Fab分子。例如，Fab轻链的C端可以与单链Fab分子中Fab重链的N端连接。
“scFv”在单一多肽链中包含抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。scFv可以任选地在VH和VL结构域之间进一步包含多肽接头，从而使scFv能够形成抗原结合所需的结构。例如，scFv可以包括通过多肽接头从C端连接至VH的N端的VL。可替代地，scFv可包含通过多肽接头通过其C端与VL的N端连接的VH(参见在The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies中，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag,NewYork，第269-315页(1994)中Pluckthun中的综述)。
“sdAb”格式是指单个免疫球蛋白结构域。sdAb可以是例如骆驼来源的。骆驼抗体缺乏轻链，并且它们的抗原结合位点由称为“VHH”的单一结构域组成。sdAb包含形成抗原结合位点的三个CDR/高变环CDR1、CDR2和CDR3。sdAb相当稳定且易于表达，例如表达为与抗体Fc链的融合体(参见，例如，Harmsen&De Haard,2007,Appl.Microbiol Biotechnol.,77(1):13-22)。
在其中抗FRα抗体构建体包含两个或更多个抗原结合结构域的那些实施方案中，每个附加抗原结合结构域可独立地为基于免疫球蛋白的结构域(诸如抗原结合抗体片段)或非基于免疫球蛋白的结构域(诸如非基于免疫球蛋白的抗体模拟物)，或能够特异性结合其靶标(例如，天然或工程化配体)的其他多肽或小分子。非基于免疫球蛋白的抗体模拟形式包括例如anticalin、fynomer、affimer、alphabody、DARPin和avimer。
本公开在本文中描述了特异性结合hFRα的抗体(变体v23924)以及该抗体的代表性人源化型式(变体v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425和v31426)和该抗体的代表性亲和力成熟型式(变体v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168和v36675)的鉴定(参见实施例和序列表)。使用图7所示的hFRα序列(SEQ ID NO:15)进行表位作图，确定变体v23924结合的hFRα蛋白内的表位包含SEQ ID NO:15的氨基酸残基E120、D121、R123、T124、S125和Y126(参见实施例13)。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体所包含的所述至少一个结合hFRα的抗原结合结构域结合hFRα蛋白内包含SEQ ID NO:15的氨基酸残基E120、D121、R123、T124、S125和Y126表位。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体结合的hFRα表位是包含SEQID NO:15的氨基酸残基E120、D121、R123、T124、S125和Y126的非线性(或不连续)表位。在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含与结合hFRα蛋白内包含氨基酸残基E120、D121、R123、T124、S125和Y126的表位的抗体竞争结合hFRα的抗原结合结构域。在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含与本文所述的抗体v23924竞争结合hFRα的抗原结合结构域。
可以使用本领域已知的竞争测定来确定抗体构建体是否与结合hFRα蛋白内包含氨基酸残基E120、D121、R123、T124、S125和Y126的表位的抗体或与抗体v23924竞争结合hFRα。例如，首先使结合hFRα蛋白质内包含氨基酸残基E120、D121、R123、T124、S125和Y126的表位的抗体或抗体v23924(参考抗体)在饱和条件下结合hFRα，然后测量测试抗体构建体结合hFRα的能力。如果测试抗体构建体能够与参考抗体同时结合hFRα，则认为测试抗体构建体与参考抗体结合不同的表位。相反地，如果测试抗体构建体不能与参考抗体同时结合hFRα，则认为测试抗体构建体结合与参考抗体结合的表位相同的表位、重叠的表位或与参考抗体结合的表位紧密接近的表位。也可以运行竞争测定，其中参考抗体和测试抗体的结合顺序颠倒，即，首先使测试抗体在饱和条件下结合hFRα，然后测量参考抗体构建体结合hFRα的能力。
此类竞争测定可以使用诸如ELISA、放射免疫测定、表面等离振子共振(SPR)、生物层干涉测量法、流式细胞术等技术进行。“与参考抗体竞争的抗体”是指在竞争测定中阻断参考抗体与其表位结合50％或更多的抗体。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含至少一个特异性结合hFRα的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含基于本文所述的抗体变体v23924的CDR的一组CDR。抗体v23924的CDR序列和该抗体的代表性人源化或亲和力成熟型式示于图17。对来自亲本和亲和力成熟的抗FRα抗体的CDR序列的分析鉴定了如通过IMGT、Chothia、Kabat、Contact或AbM编号系统中的任一种定义的每个CDR中存在的最小氨基酸序列。这些氨基酸序列由表3中提供的最小共有CDR序列表示。基于通过AbM编号系统定义的CDR序列的这些CDR共有序列的扩展型式示于表4中。
表3：抗FRα抗体的最小CDR共有序列
表4：基于AbM编号系统的抗FRα抗体的CDR共有序列
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有重链CDR氨基酸序列(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链CDR氨基酸序列(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述重链CDR氨基酸序列包含如SEQ ID NO:3、4和5中所示的序列，所述轻链CDR氨基酸序列包含如SEQ ID NO:6、7和8中所示的序列。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有：
(i)如SEQ ID NO:3中所示的HCDR1氨基酸序列；如SEQ ID NO:4中所示的HCDR2氨基酸序列；和如SEQ ID NO:5中所示的HCDR3氨基酸序列，其中X2为L并且X3为A，或X2为H并且X3为P，以及
(ii)如SEQ ID NO:6中所示的LCDR1氨基酸序列，其中X4为G并且X5为D，或X4为W并且X5为Y；如SEQ ID NO:7中所示的LCDR2氨基酸序列；和如SEQ ID NO:8中所示的LCDR3氨基酸序列，其中X6为S，X7为N，X8为V并且X9为D，或X6为W，X7为H，X8为I并且X9为L。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有重链CDR氨基酸序列(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链CDR氨基酸序列(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述重链CDR氨基酸序列包含如SEQ ID NO:9、10和11中所示的序列，所述轻链CDR氨基酸序列包含如SEQ ID NO:12、13和14中所示的序列。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有：
(i)如SEQ ID NO:9中所示的HCDR1氨基酸序列；如SEQ ID NO:10中所示的HCDR2氨基酸序列，其中X11为S或A并且X12为V，或X11为S并且X12为L；和如SEQ ID NO:11中所示的HCDR3氨基酸序列，其中X13为L并且X14为A，或X13为H并且X14为P，以及
(ii)如SEQ ID NO:12中所示的LCDR1氨基酸序列，其中X15为R或Q，X16为G并且X17为D，或X15为R，X16为W并且X17为Y；如SEQ ID NO:13中所示的LCDR2氨基酸序列；和如SEQ IDNO:14中所示的LCDR3氨基酸序列，其中X18为S，X19为N，X20为V并且X21为D，或X18为W，X19为H，X20为I并且X21为L。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有：
(i)HCDR1氨基酸序列，其选自变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的HCDR1氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的HCDR2氨基酸序列；和HCDR3氨基酸序列，其选自变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的HCDR3氨基酸序列，以及
(ii)LCDR1氨基酸序列，其选自变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的LCDR1氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的LCDR2氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的LCDR3氨基酸序列，
其中CDR氨基酸序列如IMGT、Chothia、Kabat、Contact或AbM编号系统中的任一种所定义(参见图17)。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有重链CDR氨基酸序列(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链CDR氨基酸序列(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述重链CDR氨基酸序列选自如通过IMGT、Chothia、Kabat、Contact或AbM编号系统中的任一种定义的变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的重链CDR氨基酸序列(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述轻链CDR氨基酸序列选自如通过IMGT、Chothia、Kabat、Contact或AbM编号系统中的任一种定义的变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的轻链CDR氨基酸序列(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含如通过IMGT、Chothia、Kabat、Contact或AbM编号系统中的任一种定义的变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的重链CDR氨基酸序列(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链CDR氨基酸序列(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的VH结构域的CDR序列。在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的VL结构域的CDR序列。图18提供了v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168和v36675的VH和VL序列。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含选自变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的VH氨基酸序列的VH氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含选自变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的VL氨基酸序列的VL氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含VH氨基酸序列和VL氨基酸序列，所述VH氨基酸序列和VL氨基酸序列选自变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的VH和VL氨基酸序列。
本领域技术人员将理解，可以将有限数目的氨基酸取代引入已知抗体的CDR序列或VH或VL序列中，而抗体不丧失其结合其靶标的能力。可以通过计算机建模或通过本领域已知的技术诸如丙氨酸扫描来鉴定候选氨基酸取代，并通过标准技术测试所得变体的结合活性。因此，在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含与变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的一组CDR具有90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或100％序列同一性的一组CDR(即重链HCDR1、HCDR2和HCDR3以及轻链LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中序列同一性％是在所有六个CDR中计算的，并且其中抗原结合结构域保持结合hFRα的能力。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的一组CDR序列的变体，其中所述变体在该组CDR间包含1至10个氨基酸取代(即所述CDR可通过多达10个氨基酸取代进行修饰，其中所述6个CDR的任何组合被修饰)，并且其中所述抗原结合结构域保持结合hFRα的能力。在一些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的一组CDR序列组的变体，其中所述变体在该组CDR中包含1至7个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代、1至4个氨基酸取代、1至3个氨基酸取代、1至2个氨基酸取代或1个氨基酸取代，并且其中抗原结合结构域保持结合hFRα的能力。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含与变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的VH序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的VH序列，其中所述抗原结合结构域保持结合hFRα的能力。在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含与变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者的VL序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的VL序列，其中所述抗原结合结构域保持结合hFRα的能力。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有：
(i)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28、31、92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、27、29、32、51、58、100、101、102、103、109、137、138或139中任一个所示的氨基酸序列；和HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25、30、107、108或110中任一个所示的氨基酸序列，以及
(ii)LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、43、45、65、125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42、47、120或121中任一个所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含具有如SEQ ID NO:19、50、54、57、61、76、79、82、85、88、91、99、106、113、116、133或136中任一个所示的序列的VH结构域的CDR序列。在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO:39、64、119、124或130中任一个所示的序列的VL结构域的CDR序列。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有：
(a)LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、43或45中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42或47中任一个所示的氨基酸序列；以及HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、27、29或32中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；
(b)LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42或47中任一个所示的氨基酸序列；以及HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或51中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；
(c)LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、45或65中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42或47中任一个所示的氨基酸序列；以及
(i)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或51中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；或
(ii)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或58中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；或
(iii)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:24、100、101、102或103中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；或
(d)LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；以及
(i)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:24、100、101、102或103中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；或
(ii)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:107、108或110中任一个所示的氨基酸序列；或
(iii)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；或
(iv)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:107、108或110中任一个所示的氨基酸序列；或
(v)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；或
(vi)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、137、138或139中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；或
(e)LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、45或65中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；以及
(i)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:107、108或110中任一个所示的氨基酸序列；或
(ii)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:107、108或110中任一个所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有：
(a)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、27、29或32中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、43或45中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42或47中任一个所示的氨基酸序列；或
(b)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或51中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、45或65中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42或47中任一个所示的氨基酸序列；或
(c)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或58中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、45或65中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42或47中任一个所示的氨基酸序列；或
(d)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或51中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42或47中任一个所示的氨基酸序列；或
(e)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:24、100、101、102或103中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；或
(f)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:107、108或110中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、45或65中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42或47中任一个所示的氨基酸序列；或
(g)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:107、108或110中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、45或65中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；或
(h)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:107、108或110中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；或
(i)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；或
(j)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:107、108或110中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、45或65中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；或
(k)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:107、108或110中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；或
(l)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；或
(m)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、137、138或139中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含选自如SEQ ID NO:19、50、54、57、61、76、79、82、85、88、91、99、106、113、116、133或136中任一个所示的VH氨基酸序列的VH氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含选自如SEQ IDNO:39、64、119、124或130中任一个所示的VL氨基酸序列的VL氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含选自如SEQ ID NO:19、50、54、57、61、76、79、82、85、88、91、99、106、113、116、133或136中任一个所示的VH氨基酸序列的VH氨基酸序列和选自如SEQ ID NO:39、64、119、124或130中任一个所示的VL氨基酸序列的VL氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：
(a)如SEQ ID NO:39中所示的VL氨基酸序列和如SEQ ID NO:19中所示的VH氨基酸序列；或
(b)如SEQ ID NO:124中所示的VL氨基酸序列和如SEQ ID NO:91中所示的VH氨基酸序列；或
(c)如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列和
(i)如SEQ ID NO:50中所示的VH氨基酸序列，或
(ii)如SEQ ID NO:54中所示的VH氨基酸序列，或
(iii)如SEQ ID NO:57中所示的VH氨基酸序列，或
(iv)如SEQ ID NO:61中所示的VH氨基酸序列，或
(v)如SEQ ID NO:76中所示的VH氨基酸序列，或
(vi)如SEQ ID NO:79中所示的VH氨基酸序列，或
(vii)如SEQ ID NO:82中所示的VH氨基酸序列，或
(viii)如SEQ ID NO:85中所示的VH氨基酸序列，或
(ix)如SEQ ID NO:88中所示的VH氨基酸序列，或
(x)如SEQ ID NO:106中所示的VH氨基酸序列；或
(d)如SEQ ID NO:130中所示的VL氨基酸序列和
(i)如SEQ ID NO:99中所示的VH氨基酸序列，或
(ii)如SEQ ID NO:106中所示的VH氨基酸序列，或
(iii)如SEQ ID NO:113中所示的VH氨基酸序列，或
(iv)如SEQ ID NO:116中所示的VH氨基酸序列，或
(v)如SEQ ID NO:133中所示的VH氨基酸序列，或
(vi)如SEQ ID NO:136中所示的VH氨基酸序列；或
(e)如SEQ ID NO:119中所示的VL氨基酸序列和
(i)如SEQ ID NO:106中所示的VH氨基酸序列，或
(ii)如SEQ ID NO:116中所示的VH氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含如下抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：
(i)如SEQ ID NO:19中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:39中所示的VL氨基酸序列，或
(ii)如SEQ ID NO:50中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(iii)如SEQ ID NO:54中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(iv)如SEQ ID NO:57中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(v)如SEQ ID NO:61中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(vi)如SEQ ID NO:76中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(vii)如SEQ ID NO:79中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(viii)如SEQ ID NO:82中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(ix)如SEQ ID NO:85中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(x)如SEQ ID NO:88中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(xi)如SEQ ID NO:91中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:124中所示的VL氨基酸序列，或
(xii)如SEQ ID NO:99中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:130中所示的VL氨基酸序列，或
(xiii)如SEQ ID NO:106中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(xiv)如SEQ ID NO:106中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:119中所示的VL氨基酸序列，或
(xv)如SEQ ID NO:106中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:130中所示的VL氨基酸序列，或
(xvi)如SEQ ID NO:113中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:130中所示的VL氨基酸序列，或
(xvii)如SEQ ID NO:116中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:119中所示的VL氨基酸序列，或
(xviii)如SEQ ID NO:116中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:130中所示的VL氨基酸序列，或
(xix)如SEQ ID NO:133中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:130中所示的VL氨基酸序列，或
(xx)如SEQ ID NO:136中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:130中所示的VL氨基酸序列。
格式
本公开的抗FRα抗体构建体可具有各种格式。抗FRα抗体构建体的最小组分是结合hFRα的抗原结合结构域。抗FRα抗体构建体还可任选地包含一个或多个附加抗原结合结构域和/或支架。在其中抗FRα抗体构建体包含两个或更多个抗原结合结构域的那些实施方案中，每个附加抗原结合结构域可结合hFRα内的相同表位，可结合hFRα内的不同表位，或者可结合不同抗原。因此，抗FRα抗体构建体可以是例如单特异性、双互补位、双特异性或多特异性的。
在某些实施方案中，抗FRα抗体构建体包含至少一个结合hFRα的抗原结合结构域和支架，其中抗原结合结构域可操作地连接至支架。如本文所用，术语“可操作地连接”意指所描述的组分处于容许以其预期方式起作用的关系。下面描述了合适支架的示例。
在某些实施方案中，抗FRα抗体构建体包含任选地可操作地连接至支架的两个抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体可包含三个或四个抗原结合结构域和任选地支架。在这些格式中，当包含支架时，至少第一抗原结合结构域可操作地连接至支架，并且剩余的抗原结合结构域可以各自独立地可操作地连接至支架或第一抗原结合结构域，或者当存在多于两个抗原结合结构域时，可操作地连接至另一个抗原结合结构域。
缺乏支架的抗FRα抗体构建体可包含适当格式的单个抗原结合结构域，诸如sdAb，或者它们可包含任选地通过一个或多个接头可操作地连接的两个或更多个抗原结合结构域。在此类抗FRα抗体构建体中，抗原结合结构域可以呈scFv、Fab、sdAb或其组合的格式。例如，使用scFv作为抗原结合结构域，可以构建诸如串联scFv的格式((scFv)2或taFv)，其中scFv通过柔性接头连接在一起。scFv也可用于构建双抗体格式，其包含通过短接头(通常长度为约5个氨基酸)连接的两个scFv。受限制的接头长度导致scFv以头尾方式二聚化。在任何前述形式中，scFv可通过包含结构域间二硫键而进一步稳定化。例如，可以通过在每条链中引入附加半胱氨酸残基(例如，在VH的位置44和VL的位置100)在VL和VH之间引入二硫键(参见，例如，Fitzgerald等人，1997,Protein Engineering,10:1221-1225)，或者可以在两个VH之间引入二硫键以提供具有DART格式的构建体(参见，例如，Johnson等人,2010,JMol.Biol.,399:436-449)。
类似地，在一些实施方案中，可以采用包含两个通过合适的接头连接在一起的sdAb(诸如VH或VHH)的形式。缺乏支架的抗FRα抗体构建体格式的其他示例包括基于Fab片段的那些，例如Fab2和F(ab’)2格式，其中Fab片段通过接头或IgG铰链区连接。
也可采用不同小时的抗原结合结构域的组合以产生替代的无支架格式。例如，scFv或sdAb可以与Fab片段的轻链和重链中的一者或两者的C端融合，从而产生二价(Fab-scFv/sdAb)构建体。
在某些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以是基于免疫球蛋白(Ig)的抗体格式。在某些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以基于IgG类免疫球蛋白，例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以基于IgG1免疫球蛋白。在本公开的背景下，当抗FRα抗体构建体基于指定的免疫球蛋白同种型时，意指抗FRα抗体构建体包含指定的免疫球蛋白同种型的恒定区的全部或一部分。例如，基于给定Ig同种型的抗FRα抗体构建体可包含可操作地连接至Ig支架的至少一个抗原结合结构域，其中所述支架包含来自给定同种型的Fc区和任选地来自相同或不同同种型的Ig铰链区。应理解，在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体还可包含同种型和/或亚类的杂合体。还应当理解，可以任选地修饰Fc区和/或铰链区以赋予一种或多种本领域已知的期望功能特性。
在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以源自来自不同物种的两种或更多种免疫球蛋白，例如，抗FRα抗体构建体可以是嵌合抗体或人源化抗体。术语“嵌合抗体”和“人源化抗体”通常都是指组合来自一个以上物种的免疫球蛋白区或结构域的抗体。
“嵌合抗体”通常包含至少一个来自非人抗体诸如兔或啮齿动物(例如，鼠类)抗体的可变结构域，和至少一个来自人抗体的恒定结构域。嵌合抗体的人恒定结构域不需要具有与它替代的非人恒定结构域相同的同种型。嵌合抗体在例如Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-55以及美国专利号4,816,567中有讨论。
“人源化抗体”是含有源自非人抗体的最小序列的一类嵌合抗体。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的高变区(CDR)的残基被对靶抗原具有期望特异性和亲和力的来自非人物种(供体抗体)的高变区(CDR)的残基替代，所述非人物种诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。这种用于创建人源化抗体的技术常常被称为“CDR移植”。
在一些情况下，可以对人源化抗体进行附加修饰以进一步改进抗体性能。例如，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替代，或者人源化抗体可以包含在接受者抗体或供体抗体中没有发现的残基。一般而言，人源化抗体中的可变结构域将包含来自非人免疫球蛋白的所有或几乎所有高变区以及来自人免疫球蛋白序列的所有或几乎所有FR。人源化抗体在例如Jones等人,1986,Nature,321:522-525；Riechmann等人,1988,Nature,332:323-329，及Presta,1992,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596中有更详细的描述。
许多方法在本领域中已知用于选择在其中移植非人CDR的最适当的人框架。早期方法使用充分表征的人抗体的有限子集，与提供CDR的非人抗体的序列同一性无关(“固定框架”方法)。最近的方法已采用与提供CDR的非人抗体的可变区具有高氨基酸序列同一性的可变区(“同源匹配”或“最佳适配”方法)。替代的方法是从来自几种不同人抗体的每个轻链或重链可变区内选择框架序列的片段。在一些情况下，CDR移植可能导致移植的分子对其靶抗原的亲和力部分或完全丧失。在此类情况下，可以通过将一些人来源的残基回复突变为相应的非人残基来恢复亲和力。通过这些方法制备人源化抗体的方法在本领域是众所周知的(参见，例如，Tsurushita&Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells,533-545,Elsevier Science(USA)；Jones等人,1986,Nature,321:522-525；Riechmann等人,1988,Nature,332:323-329；Presta等人,1997,Cancer Res,57(20):4593-4599)。
可替代地，或除了这些传统方法之外，可以采用更新的技术来进一步降低CDR移植的人源化抗体的免疫原性。例如，可以采用基于人种系序列或共有序列的框架作为受体人框架而不是具有体细胞突变的人框架。另一种旨在降低非人CDR的潜在免疫原性的技术是仅移植特异性决定残基(SDR)。在这种方法中，仅将抗原结合活性所需的最少CDR残基(“SDR”)移植到人种系框架中。该方法改善了人源化抗体的“人性”(即与人种系序列的相似性)，因此可有助于降低可变区的免疫原性风险。这些技术已描述于各种出版物中(参见，例如Almagro&Fransson,2008,Front Biosci,13:1619-1633；Tan,等人,2002,JImmunol,169:1119-1125；Hwang,等人,2005,Methods,36:35-42；Pelat,等人,2008,J Mol Biol,384:1400-1407；Tamura,等人,2000,J Immunol,164:1432-1441；Gonzales,等人,2004,MolImmunol,1:863-872,以及Kashmiri,等人,2005,Methods,36:25-34)。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含人源化抗体序列，例如一个或多个人源化可变结构域。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以是人源化抗体。本文描述了基于抗FRα抗体v23924的人源化抗体的非限制性示例(v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425和v31426；参见实施例和序列表)。
支
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体包含可操作地连接至支架的一个或多个抗原结合结构域。抗原结合结构域可以是上述形式中的一种或组合(例如scFv、Fab和/或sdAb)。合适支架的示例在下文中更详细地描述并且包括但不限于免疫球蛋白Fc区、白蛋白、白蛋白类似物和衍生物、异二聚体化肽(诸如亮氨酸拉链、源自Jun和Fos的形成异二聚体的“拉链”肽、IgG CH1和CL结构域或barnase-barstar毒素)、细胞因子、趋化因子或生长因子。其他示例包括基于IBC Pharmaceuticals,Inc.和Immunomedics,Inc.开发的DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)技术的抗体(参见例如，Chang等人,2007,Clin.Cancer Res.,13:5586s-5591s)。
支架可以是肽、多肽、聚合物、纳米颗粒或其他化学实体。当支架是多肽时，抗FRα抗体构建体的每个抗原结合结构域可以连接至多肽支架的N端或C端。在某些实施方案中还考虑了包含多肽支架的抗FRα抗体构建体，其中一个或多个抗原结合结构域连接至除N端或C端以外的区域，例如，经由有或无接头的氨基酸侧链连接。
在其中抗FRα抗体构建体包含为肽或多肽的支架的实施方案中，抗原结合结构域可通过遗传融合或化学缀合连接至支架。通常，当支架是肽或多肽时，抗原结合结构域通过遗传融合连接至支架。在一些实施方案中，在支架是聚合物或纳米颗粒的情况下，抗原结合结构域可以通过化学缀合连接至支架。
在本领域中已知许多蛋白质结构域，其包含两个不同多肽的选择性配对，并且可用于形成支架。示例是选择性配对在一起的亮氨酸拉链结构域，诸如Fos和Jun(Kostelny等人,J Immunol,148:1547-53(1992)；Wranik等人,J.Biol.Chem.,287:43331-43339(2012))。其他选择性配对的分子对包括例如barnase-barstar对(Deyev等人,NatBiotechnol,21:1486-1492(2003))、DNA链对(Chaudri等人,FEBS Letters,450(1–2):23-26(1999))和分裂荧光蛋白对(国际专利申请公布号WO 2011/135040)。
蛋白质支架的其他示例包括免疫球蛋白Fc区、白蛋白、白蛋白类似物和衍生物、毒素、细胞因子、趋化因子和生长因子。已经描述了与抗原结合部分组合使用蛋白质支架(参见，例如，Müller等人,2007,J.Biol.Chem.,282:12650-12660；McDonaugh等人,2012,Mol.Cancer Ther.,11:582-593；Vallera等人,2005,Clin.Cancer Res.,11:3879-3888；Song等人,2006,Biotech.Appl.Biochem.,45:147-154和美国专利申请公布号2009/0285816)。
例如，已经证实将诸如scFv、双抗体或单链双抗体之类的抗原结合部分与白蛋白融合可以改善抗原结合部分的血清半衰期(Müller等人，同上)。抗原结合部分可以任选地经由接头融合在白蛋白的N端和/或C端。
已经描述了异源多聚体形式的白蛋白衍生物，其包含通过白蛋白分段而获得的两种转运蛋白多肽，使得转运蛋白多肽自组装形成似天然白蛋白(参见国际专利申请公布号WO 2012/116453和WO 2014/012082)。由于白蛋白分段，异源多聚体包括四个末端，因此可以任选地经由接头与多达四个不同的抗原结合部分融合。
在某些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以包含蛋白质支架。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以包含基于免疫球蛋白Fc区、白蛋白或白蛋白类似物或衍生物的蛋白质支架。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以包含基于免疫球蛋白Fc区(例如IgG Fc区)的蛋白质支架。
Fc区
如本文所用的术语“Fc区”、“Fc”或“Fc结构域”是指含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中所述。
在某些实施方案中，本公开的抗FRα抗体构建体可以包含基于免疫球蛋白Fc区的支架。Fc区可以是二聚的并且由两个Fc多肽组成，或者可替代地，Fc区可以由单个多肽组成。
在二聚Fc的情形中，“Fc多肽”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽之一，即包含能够稳定自缔合的免疫球蛋白重链的一个或多个C端恒定区的多肽。当提及形成二聚Fc区的多肽时，术语“第一Fc多肽”和“第二Fc多肽”可以互换使用，条件是Fc区包含一个第一Fc多肽和一个第二Fc多肽。
Fc区可包含CH3结构域或其可包含CH3和CH2结构域两者。例如，在某些实施方案中，二聚IgG Fc区的Fc多肽可包含IgG CH2结构域序列和IgG CH3结构域序列。在此类实施方案中，CH3结构域包含两个CH3序列，即来自二聚Fc区的两个Fc多肽中的每一个各一个，并且CH2结构域包含两个CH2序列，即来自二聚Fc区的两个Fc多肽中的每一个各一个。
在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以包含基于IgG Fc区的支架。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以包含基于人IgG Fc区的支架。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以包含基于IgG1 Fc区的支架。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以包含基于人IgG1 Fc区的支架。
在某些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以包含基于IgG Fc区的支架，所述IgG Fc区为同型二聚体Fc区，包含第一Fc多肽和第二Fc多肽，各自包含CH3序列和任选地CH2序列，并且其中第一和第二Fc多肽的氨基酸序列相同。
在某些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以包含基于IgG Fc区的支架，所述IgG Fc区为异二聚体Fc区，包含第一Fc多肽和第二Fc多肽，各自包含CH3序列和任选地CH2序列，并且其中第一和第二Fc多肽的氨基酸序列不同。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以包含基于Fc区的支架，所述Fc区包含两个CH3序列，其中至少一个CH3序列包含一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以包含基于Fc区的支架，所述Fc区包含两个CH3序列和两个CH2序列，其中至少一个CH2序列包含一个或多个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以包含含有经修饰的CH3结构域的异二聚体Fc区，其中经修饰的CH3结构域是含有一个或多个不对称氨基酸修饰的不对称修饰的CH3结构域。如本文所用，“不对称氨基酸修饰”是指这样的修饰，诸如取代或插入，其中第一CH3或CH2序列上特定位置处的氨基酸与第二CH3或CH2序列上相同位置处的氨基酸不同。这些不对称氨基酸修饰可以是在每个序列上相同的相应氨基酸位置处的两个氨基酸中仅一个的修饰，或在第一和第二CH3或CH2序列的每一个上相同的相应位置上的两个氨基酸的不同修饰的结果。异二聚体Fc的第一和第二CH3或CH2序列中的每一个可以包含一个或多于一个不对称氨基酸修饰。
在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体可包含含有经修饰的CH3结构域的异二聚体Fc，其中经修饰的CH3结构域包含促进异二聚体Fc形成超过同型二聚体Fc形成的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述氨基酸修饰中的一个或多个氨基酸修饰是不对称氨基酸修饰。
可对Fc的CH3结构域进行的以便促进异源二聚Fc的形成的氨基酸修饰是本领域已知的，并且包括例如国际公布号WO 96/027011(“杵-臼”)、Gunasekaran等人,2010,J BiolChem,285,19637-46(“静电操纵”)、Davis等人,2010,Prot Eng Des Sel,23(4):195-202(链交换工程化结构域(SEED)技术)和Labrijn等人,2013,Proc Natl Acad Sci USA,110(13):5145-50(Fab臂交换)中描述的那些氨基酸修饰。其他示例包括使正负设计策略组合以产生稳定的不对称的经修饰的Fc区的方法，如国际公布号WO 2012/058768和WO 2013/063702中描述的。在某些实施方案中，抗FRα抗体构建体可包含基于经修饰的Fc区的支架，如国际公布号WO 2012/058768或WO 2013/063702中所述。
表5提供了人IgG1 Fc序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)，其对应于全长人IgG1重链的氨基酸231至447。CH3序列包含全长人IgG1重链的氨基酸341-447。表5中还示出了促进异二聚体Fc形成的CH3结构域氨基酸修饰，如国际专利申请公布号WO 2012/058768和WO2013/063702中所述。
在某些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以包含具有经修饰的CH3结构域的异二聚体Fc支架，所述经修饰的CH3结构域包含变体1、变体2、变体3、变体4或变体5中任一者的修饰，如表5中所示。
表5：促进异二聚体形成的人IgG1 Fc序列1和CH3结构域氨基酸修饰
1位置231-447的序列(EU编号)
在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体可以包含基于Fc区的支架，所述Fc区包含两个CH3序列和两个CH2序列，其中至少一个CH2序列包含一个或多个氨基酸修饰。CH2结构域中的修饰可以影响Fc受体(FcR)与Fc的结合，诸如FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体。
在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体包含基于具有经修饰的CH2结构域的IgG Fc的支架，其中CH2结构域的修饰导致与FcγRI、FcγRII和FcγRIII受体中的一种或多种的结合改变。
对CH2结构域的选择性改变Fc对不同Fcγ受体的亲和力的多种氨基酸修饰是本领域已知的。导致结合增加的氨基酸修饰和导致结合减少的氨基酸修饰可各自用于某些适应症。例如，增加Fc对FcγRIIIa(一种活化性受体)的结合亲和力可引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)增加，这转而引起靶细胞的裂解增加。降低与FcγRIIb(一种抑制性受体)的结合在一些情况下同样可能是有益的。在某些适应症中，可能需要降低或消除ADCC和补体介导的细胞毒性(CDC)。在此类情况下，包含导致与FcγRIIb的结合增加的氨基酸修饰或降低或消除Fc区与所有Fcγ受体的结合的氨基酸修饰的经修饰的CH2结构域(“敲除”变体)可能是有用的。
改变Fcγ受体对Fc的结合的对所述CH2结构域的氨基酸修饰的示例包括但不限于以下：S298A/E333A/K334A和S298A/E333A/K334A/K326A(对FcγRIIIa的亲和力增加)(Lu,等人,2011,J Immunol Methods,365(1-2):132-41)；F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L(对FcγRIIIa的亲和力增加)(Stavenhagen,等人,2007,Cancer Res,67(18):8882-90)；F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(对FcγRIIIa的亲和力增加)(Nordstrom JL,等人,2011,Breast Cancer Res,13(6):R123)；F243L(对FcγRIIIa的亲和力增加)(Stewart,等人,2011,Protein Eng Des Sel.,24(9):671-8)；S298A/E333A/K334A(对FcγRIIIa的亲和力增加)(Shields,等人,2001,J Biol Chem,276(9):6591-604)；S239D/I332E/A330L和S239D/I332E(对FcγRIIIa的亲和力增加)(Lazar,等人,2006,Proc Natl Acad Sci USA,103(11):4005-10),以及S239D/S267E和S267E/L328F(对FcγRIIb的亲和力增加)(Chu,等人,2008,Mol Immunol,45(15):3926-33)。在国际公布号WO 2021/232162中描述了改变FcγRIIb对Fc的结合的对CH2结构域的各种氨基酸修饰。影响Fc与Fcγ受体的结合的另外的修饰描述于Therapeutic Antibody Engineering(Strohl&Strohl,Woodhead Publishingseries in Biomedicine No 11,ISBN 1 907568 37 9,2012年10月,第283页)。
在某些实施方案中，抗FRα抗体构建体包含基于具有经修饰的CH2结构域的IgG Fc的支架，其中经修饰的CH2结构域包含引起Fc区与所有Fcγ受体的结合减少或消除的一个或多个氨基酸修饰(即“敲除”变体)。
各种出版物描述已被用于工程改造抗体以产生“敲除”变体的策略(参见，例如，Strohl,2009,Curr Opin Biotech 20:685-691,以及Strohl&Strohl,“Antibody Fcengineering for optimal antibody performance”In Therapeutic AntibodyEngineering,Cambridge:Woodhead Publishing,2012,第225-249页)。这些策略包括通过糖基化修饰、使用IgG2/IgG4支架或在Fc的铰链或CH2结构域中引入突变来降低效应功能(也参见美国专利公布号2011/0212087、国际公布号WO 2006/105338、美国专利公布号2012/0225058、美国专利公布号2012/0251531和Strop等人,2012,J.Mol.Biol.,420:204-219)。
可以引入铰链或CH2结构域以产生“敲除”变体的突变的示例包括氨基酸修饰L234A/L235A和L234A/L235A/D265S。
在某些实施方案中，本文所述的抗FRα抗体构建体可包含基于IgG Fc的支架，其中天然糖基化已被修饰。如本领域已知的，Fc的糖基可以进行修饰以增加或降低效应功能。例如，位置297处的保守天冬酰胺残基突变为丙氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸(即N297A、Q、K或H)导致产生缺乏所有效应功能的非糖基化Fc(Bolt等人,1993,Eur.J.Immunol.,23:403-411；Tao&Morrison,1989,J.Immunol.,143:2595-2601)。
相反，从重链N297连接的寡糖中去除岩藻糖已被证明基于改进的与FcγRIIIa的结合增强ADCC(参见，例如，Shields等人,2002,J Biol Chem.,277:26733-26740,以及Niwa等人,2005,J.Immunol.Methods,306:151-160)。此类低岩藻糖抗体可以例如在以下细胞中产生：缺乏岩藻糖基转移酶(FUT8)的敲除型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Yamane-Ohnuki等人,2004,Biotechnol.Bioeng.,87:614-622)；将岩藻糖连接至N297连接的碳水化合物的能力降低的变体CHO细胞系Lec 13中(国际公布号WO 03/035835)，或产生无岩藻糖基化抗体的其他细胞(参见例如Li等人,2006,Nat Biotechnol,24:210-215；Shields等人,2002,ibid，及Shinkawa等人,2003,J.Biol.Chem.,278:3466-3473)。另外，国际公布号WO 2009/135181描述了在抗体生产期间向培养基中添加岩藻糖类似物以抑制岩藻糖掺入抗体上的碳水化合物中。
在Fc糖基化位点(N297)上产生含少量或不含岩藻糖的抗体的其他方法是本领域熟知的。例如，技术(ProBioGen AG)(参见von Horsten等人,2010,Glycobiology,20(12):1607-1618和美国专利号8,409,572)。
其他糖基化变体包括那些具有二等分寡糖的变体，例如，其中与抗体的Fc区连接的双触角寡糖被N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)二等分的变体。此类糖基化变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能(参见，例如，国际公布号WO 2003/011878、美国专利号6,602,684和美国专利申请公布号US 2005/0123546)。有用的糖基化变体还包括在连接到Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的那些变体，其可具有改善的CDC功能(参见，例如，国际公布号WO 1997/030087、WO 1998/58964和WO 1999/22764)。
在某些实施方案中，抗FRα抗体构建体具有全尺寸抗体(FSA)的格式。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体具有IgG FSA格式，例如IgG1 FSA。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体是包含第一重链序列(H1)、第二重链序列(H2)、第一轻链序列(L1)和第二轻链序列(L2)的FSA。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体是具有同型二聚体Fc的单特异性FSA并且包含H1、H2、L1和L2序列，其中H1和H2具有相同的氨基酸序列，并且L1和L2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体是具有异二聚体Fc的单特异性FSA并且包含H1、H2、L1和L2序列，其中H1和H2具有不同的氨基酸序列，并且L1和L2具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗FRα抗体构建体是具有异二聚体Fc的双特异性或双互补位FSA并且包含H1、H2、L1和L2序列，其中H1和H2具有不同的氨基酸序列，并且L1和L2具有不同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗FRα抗体构建体是具有一组H1、H2、L1和L2序列的FSA，所述H1、H2、L1和L2序列包含如表A和表B中针对变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者所示的H1、H2、L1和L2氨基酸序列。如本领域已知的，抗体重链序列在某些细胞系中或从某些表达载体的表达可导致在一条或两条重链上包含C端赖氨酸残基。因此，本公开的某些实施方案涉及作为FSA的抗FRα抗体构建体，所述FSA具有一组H1、H2、L1和L2序列，其包含如表A和表B中针对变体v23924、v30618、v30384、v30389、v30394、v30399、v31422、v31423、v31424、v31425、v31426、v35305、v35342、v35347、v35348、v35350、v35354、v35356、v35358、v36167、v36168或v36675中任一者所示的H1、H2、L1和L2氨基酸序列，其中H1和H2序列中的一者或两者包含C端赖氨酸(参见，例如，SEQ ID NO:157)。
抗FRα抗体构建体的制备
本文所述的抗FRα抗体构建体可以使用本领域已知的标准重组方法产生(参见例如美国专利号4,816,567和“Antibodies:A Laboratory Manual,”第2版,Greenfield编辑,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,2014)。
通常，为了重组产生抗体构建体，产生编码抗FRα抗体构建体的多核苷酸或一组多核苷酸，并将其插入一个或多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。编码抗FRα抗体构建体的多核苷酸可通过本领域已知的标准方法产生(参见，例如，Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1994年和更新，及“Antibodies:A Laboratory Manual,”第2版,Greenfield编辑,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York,2014)。如本领域技术人员所理解的，表达抗FRα抗体构建体所需的多核苷酸的数目将取决于构建体的格式，包括抗体构建体是否包含支架。例如，当抗FRα抗体构建体是具有同型二聚体Fc的mAb格式时，将需要两个各自编码一条多肽链的多核苷酸，而当抗FRα抗体构建体是具有异二聚体Fc的mAb格式时，将需要三个各自编码一条多肽链的多核苷酸。当需要多个多核苷酸时，它们可以掺入到一个载体或一个以上的载体中。
通常，为了表达，将多核苷酸或一组多核苷酸与一个或多个调控元件，诸如转录元件一起掺入一个或多个表达载体中，所述调控元件是多核苷酸有效转录所需的。此类调控元件的示例包括但不限于启动子、增强子、终止子和多腺苷酸化信号。本领域技术人员将理解，调控元件的选择取决于选择用于表达抗体构建体的宿主细胞，并且此类调控元件可以源自多种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫基因。表达载体可以任选地进一步含有异源核酸序列，其利于表达或纯化所表达的蛋白质。示例包括但不限于信号肽和亲和标签，诸如金属亲和标签、组氨酸标签、抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白编码序列、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)编码序列和生物素编码序列。表达载体可以是染色体外载体或整合载体。
用于克隆或表达抗FRα抗体构建体的合适宿主细胞包括本领域已知的各种原核或真核细胞。真核宿主细胞包括例如哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞和酵母细胞(诸如酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)细胞)。原核宿主细胞包括，例如，大肠杆菌、杀鲑气单胞菌或枯草芽孢杆菌细胞。
在某些实施方案中，抗FRα抗体构建体可在细菌中产生，尤其是当不需要糖基化和Fc效应功能时，如例如在美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523；以及在Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷,第245-254卷,B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,N.J.,2003中所述。
在某些实施方案中，真核微生物诸如丝状真菌或酵母可以是合适的表达宿主细胞，尤其是其糖基化途径已经“人源化”导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体构建体的真菌和酵母菌株(参见，例如，Gerngross,2004,Nat.Biotech.22:1409-1414，及Li等人,2006,Nat.Biotech.24:210-215)。
用于表达糖基化抗FRα抗体构建体的合适宿主细胞通常是真核细胞。例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429描述了用于在转基因植物中产生抗原结合构建体的PLANTIBODIESTM技术。适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系对于表达抗体构建体特别有用。示例包括但不限于由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系、人胚肾(HEK)系293或293细胞(参见，例如Graham等人,1977,J.Gen Virol.,36:59)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞托利TM4细胞(参见，例如Mather,1980,Biol Reprod,23:243-251)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌(HeLa)细胞、犬肾细胞(MDCK)、水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)、TRI细胞(参见，例如Mather等人,1982,Annals N.Y.Acad Sci,383:44-68)、MRC 5细胞、FS4细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括DHFR-CHO细胞，参见Urlaub等人,1980,Proc Natl Acad SciUSA,77:4216)和骨髓瘤细胞系(诸如Y0、NS0和Sp2/0)。在Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology，第248卷,第255-268页(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,N.J.,2003)中综述了适于产生抗体构建体的示例性哺乳动物宿主细胞系。
在某些实施方案中，宿主细胞可以是瞬时或稳定的高等真核细胞系，诸如哺乳动物细胞系。在一些实施方案中，宿主细胞可以是哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、NS0或COS细胞系，或源自这些细胞系中的任一种的细胞系。在一些实施方案中，宿主细胞可以是允许抗体构建体成熟糖基化的稳定细胞系。
可以使用常规方法培养包含编码抗FRα抗体构建体的表达载体的宿主细胞以产生抗FRα抗体构建体。可替代地，在一些实施方案中，包含编码抗FRα抗体构建体的表达载体的宿主细胞可治疗性或预防性地用于将抗FRα抗体构建体递送至受试者，或者可将多核苷酸或表达载体离体施用于来自受试者的细胞，然后将细胞返回至受试者的身体。
通常，抗FRα抗体构建体在表达后纯化。可以用本领域技术人员已知的多种方式分离或纯化蛋白质(参见，例如，Protein Purification:Principles and Practice，第3版，Scopes,Springer-Verlag,NY,1994)。标准的纯化方法包括色谱技术，包括离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、分级色谱法或凝胶过滤和反相色谱法，在大气压或高压下使用诸如FPLC和HPLC的系统进行。另外的纯化方法包括电泳、免疫、沉淀、透析和色谱聚焦技术。超滤和渗滤技术与蛋白质浓缩的联合也是有用的。如本领域众所周知的，多种天然蛋白质结合Fc和抗体，并且这些蛋白质可用于纯化某些抗体构建体。例如，细菌蛋白质A和G与Fc区结合。同样，所述细菌蛋白L与一些抗体的Fab区结合。纯化也可以通过特定的融合配偶体进行。例如，如果采用GST融合物，可使用谷胱甘肽树脂纯化抗体，如果采用His标签，则可以使用Ni+2亲和色谱纯化抗体，或者如果使用Flag标签，则可以使用固定化抗Flag抗体纯化抗体。所必需的纯化程度将根据抗FRα抗体构建体的使用而变化。在一些情况下，可能没必要纯化。
在某些实施方案中，抗FRα抗体构建体是基本上纯的。术语“基本上纯的”(或“基本上纯化的”)在提及本文所述的抗FRα抗体构建体使用时，意指该抗体构建体基本上或本质上不含如在其天然存在的环境(诸如天然细胞，或在重组产生的构建体的情况下是宿主细胞)中发现的通常与蛋白质伴随或相互作用的组分。在某些实施方案中，基本上纯的抗FRα抗体构建体是具有少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％或少于约5％(按干重计)的污染蛋白质的蛋白质制剂。
本公开的某些实施方案涉及制备抗FRα抗体构建体的方法，所述方法包括在适于表达所述抗FRα抗体构建体的条件下培养已经引入编码所述抗FRα抗体构建体的一种或多种多核苷酸或编码所述抗FRα抗体构建体的一种或多种表达载体的宿主细胞，以及任选地从所述宿主细胞(或从宿主细胞培养基)回收所述抗FRα抗体构建体。
翻译后修饰
在某些实施方案中，本文所述的抗FRα抗体构建体可以包含一个或多个翻译后修饰。此类翻译后修饰可发生在体内，或在从宿主细胞分离抗FRα抗体构建体后发生在体外。
翻译后修饰包括如本领域已知的各种修饰(参见，例如，Proteins-Structure andMolecular Properties,第2版,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York,1993；Post-Translational Covalent Modification of Proteins,B.C.Johnson编,Academic Press,New York,第1-12页,1983；Seifter等人,1990,Meth.Enzymol.,182:626-646,以及Rattan等人,1992,Ann.N.Y.Acad.Sci.,663:48-62)。在抗FRα抗体构建体包含一个或多个翻译后修饰的那些实施方案中，所述构建体可以在一个或几个位点包含相同类型的修饰，或其可以在不同位点包含不同修饰。
翻译后修饰的示例包括糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护基团/阻断基团进行的衍生化，甲酰化，氧化，还原，蛋白水解切割，或由溴化氰、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶或NaBH4进行的特异性化学切割。
翻译后修饰的其他示例包括例如N连接或O连接碳水化合物链的添加或去除、N连接或O连接碳水化合物链的化学修饰、N端或C端的处理、化学部分与氨基酸主链的连接以及由原核宿主细胞表达产生的N端甲硫氨酸残基的添加或缺失。翻译后修饰也可包括用可检测标记(诸如酶标记、荧光标记、发光标记、同位素标记或亲和标记)修饰，以允许检测和分离蛋白质。合适的酶标记的示例包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合体的示例包括但不限于抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合适的荧光材料的示例包括但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白。发光材料的示例包括鲁米诺(luminol)和生物发光材料诸如荧光素酶、萤光素和水母发光蛋白(aequorin)。合适的放射性材料的示例包括碘、碳、硫、氚、铟、锝、铊、镓、钯，钼、氙和氟。
翻译后修饰的另外的实例包括乙酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联体的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、γ-羧基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、聚乙二醇化、异戊烯化、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸化、转移-RNA介导的向蛋白质添加氨基酸诸如精氨酸化和泛素化。
多核苷酸、载体和宿主细胞
本公开的某些实施方案涉及编码本文所述的抗FRα抗体构建体的分离的多核苷酸或一组多核苷酸。在这个背景下的多核苷酸可编码抗FRα抗体构建体的全部或部分。
术语“核酸”、“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且指代任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物)的多聚性形式。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。
“编码”给定多肽的多核苷酸是当置于适当调节序列的控制下时在体内转录(在DNA的情况下)或翻译(在mRNA的情况下)成多肽的多核苷酸。编码序列的边界由在5'(氨基)末端的起始密码子和在3'(羧基)末端的翻译终止密码子来确定。转录终止序列可位于编码序列的3’处。
本公开的某些实施方案涉及包含一种或多种编码本文所述的抗FRα抗体构建体的多核苷酸的载体(诸如表达载体)。该一种或多种多核苷酸可被包含在单一载体中，或者包含在多于一种载体中。在一些实施方案中，多核苷酸被包含在多顺反子载体中。
本公开的某些实施方案涉及包含编码本文所述的抗FRα抗体构建体的多核苷酸或包含所述多核苷酸的一种或多种载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
抗体-药物缀合物
本公开的某些实施方案涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含缀合至一个或多个药物部分(诸如细胞毒素或免疫调节剂)的如本文所述的抗FRα抗体构建体。
通常，在ADC中，所述抗FRα抗体构建体经由接头缀合至药物部分，所述接头可以是可裂解接头或非可裂解接头。所述抗FRα抗体构建体可以缀合至单个药物分子，或者它可以缀合至多个药物分子。缀合至单个抗FRα抗体构建体的药物分子的数目由药物与抗体的比率(DAR)限定。在某些实施方案中，在本公开的ADC中，DAR在约1至约12、或约2至约12、或约2至约8的范围内。
在某些实施方案中，包含抗FRα抗体构建体的ADC具有通式I：
A-(L-(D)m)n (I)
其中A是如本文所述的抗FRα抗体构建体；L是接头；D是药物部分；m在1和约8之间，并且n在1和约12之间。
在式I的某些实施方案中，m在1和6之间。在一些实施方案中，m为1或2。在一些实施方案中，n在约1和约8之间，例如在约2和约8之间。
已知可用作细胞毒性或免疫调节性ADC有效载荷的各种化合物可在包含所述抗FRα抗体构建体的ADC中用作药物部分。实例包括但不限于美登木素生物碱和美登木素生物碱类似物、苯二氮和吡咯并苯二氮倍癌霉素(诸如CC-1065)及其类似物、卡奇霉素和卡奇霉素类似物、奥瑞他汀(auristatin)和奥瑞他汀类似物、哈米特林(hemiasterlin)和哈米特林类似物、微管溶素(tubulysin)和微管溶素类似物、鹅膏毒素(amatoxin)和鹅膏毒素类似物、喜树碱(camptothecin)和喜树碱类似物、艾日布林(eribulin)、TLR激动剂(诸如TLR7和/或TLR8激动剂)或STING激动剂。
在某些实施方案中，本公开的ADC所包含的药物部分是奥瑞他汀或奥瑞他汀类似物、哈米特林或哈米特林类似物、喜树碱或喜树碱类似物、或艾日布林。
通常，在本公开的ADC中，所述药物部分通过接头与所述抗FRα抗体构建体连接。接头是能够将一个或多个药物分子连接至所述抗体构建体的双官能或多官能部分。在一些实施方案中，所述接头可以是双官能的(或单价的)，使得它将单个药物分子连接到所述抗体构建体上的单个位点。在一些实施方案中，所述接头可以是多官能的(或多价的)，使得它将一个以上的药物分子连接到所述抗体构建体上的单个位点。在一些实施方案中，多官能接头也可用于将一个药物分子连接到所述抗体构建体上的一个以上位点。
接头与抗FRα抗体构建体的连接可以多种方式实现，诸如通过表面赖氨酸，与氧化的碳水化合物的还原偶合，或通过还原链间二硫连键而释放的半胱氨酸残基。可替代地，接头与抗FRα抗体构建体的连接可以通过以下方式实现：修饰抗体构建体以包括附加的半胱氨酸残基(参见，例如，美国专利号7,521,541；8,455,622和9,000,130)或提供反应性柄的非天然氨基酸，诸如硒代甲硫氨酸、对乙酰苯丙氨酸、甲酰甘氨酸或对叠氮甲基-L-苯丙氨酸以允许位点特异性缀合(参见例如Hofer等人,2009,Biochemistry,48:12047-12057；Axup等人,2012,PNAS,109:16101-16106；Wu等人,2009,PNAS,106:3000-3005；Zimmerman等人,2014,Bioconj.Chem.,25:351-361)。另一种选择是使用GlycoConnectTM技术(SynaffixBV,Nijmegen,Netherlands)，该技术涉及抗体聚糖的酶法重塑以允许接头通过无金属点击化学连接(参见，例如欧洲专利号EP 2 911 699)。
接头通常包括能够与抗原结合构建体上的一个或多个靶基反应的官能团，和一个或多个能够与药物部分上的靶基反应的官能团。合适的官能团是本领域已知的并且包括例如Bioconjugate Techniques(G.T.Hermanson,2013,Academic Press)中描述的那些官能团。与游离半胱氨酸或硫醇反应的官能团的非限制性实例包括马来酰亚胺、卤代乙酰胺、卤代乙酰基、活化酯(诸如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯)、酸酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。在这种情况下，也可使用“自稳定”马来酰亚胺，诸如Lyon等人,2014,Nat.Biotechnol.,32:1059-1062中所述的那些。用于与表面赖氨酸和胺反应的官能团的非限制性实例包括活化酯(诸如N-羟基琥珀酰胺(NHS)酯和磺基-NHS酯)、亚氨酸酯(诸如Traut试剂)、异硫氰酸酯、醛和酸酐(诸如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA))。其他示例包括使用琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TSTU)或苯并三唑-1-基-氧基三吡咯磷六氟磷酸盐(PyBOP)以将羧酸转化成活化酯，然后活化酯可与胺反应。能够与抗体构建体或药物部分上的亲电子基团(诸如醛或酮羰基)反应的官能团的非限制性实例包括酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、羧酸肼和芳酰肼。
在某些实施方案中，可以使用包括允许抗体结合构建体上的两个链间半胱氨酸桥接的官能团的接头，诸如ThioBridgeTM接头(Badescu等人,2014,Bioconjug.Chem.,25:1124–1136)、二硫代马来酰亚胺(DTM)接头(Behrens等人,2015,Mol.Pharm.,12:3986–3998)、基于二硫代芳基(TCEP)哒嗪二酮的接头(Lee等人,2016,Chem.Sci.,7:799-802)或基于二溴哒嗪二酮的接头(Maruani等人,2015,Nat.Commun.,6:6645)。
用于将药物连接至抗体的多种接头是本领域已知的，包括基于腙、二硫键和肽的接头。接头可以是可裂解的或非可裂解的。可裂解接头通常易于在细胞内条件下裂解，例如通过溶酶体过程裂解。示例包括蛋白酶敏感的、酸敏感的或还原敏感的接头。相反，非可裂解接头依赖于细胞中抗体的降解，这通常导致氨基酸-接头-药物部分的释放。
可用于某些实施方案的可裂解接头的实例是可被细胞内蛋白酶诸如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶裂解的含肽接头。实例包括含二肽的接头，诸如包含二肽Val-Cit、Phe-Lys、Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Arg、Ala-Phe、Val-Ala、Met-Lys、Asn-Lys、Ile-Pro、Ile-Val、Asp-Val、His-Val、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Val-(D)Asp、NorVal-(D)Asp、Ala-(D)Asp、Me3Lys-Pro、PhenylGly-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Pro-(D)Lys或Met-(D)Lys的那些接头；含三肽的接头，诸如包含三肽Met-Cit-Val、Gly-Cit-Val、(D)Phe-Phe-Lys或(D)Ala-Phe-Lys的那些接头，以及含四肽的接头，诸如包含四肽Gly-Phe-Leu-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly或Ala-Leu-Ala-Leu的那些接头。
另外的有用的可裂解接头包括含二硫键的接头和在特定pH或pH范围内可水解的接头，诸如腙接头。含二硫键的接头的实例包括但不限于N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)。含二硫键的接头可任选地包括另外的基团，以在二硫键附近提供空间位阻，以便改善接头的细胞外稳定性，例如，包含偕二甲基。包含具有这些官能性的组合的接头也可能有用，例如，包含腙和二硫键两者的接头是本领域已知的。
可裂解接头的另一个实例是包含β-葡糖苷酸的接头，该接头可被β-葡糖苷酸酶(一种存在于溶酶体和肿瘤间质中的酶)裂解(参见，例如，De Graaf等人,2002,Curr.Pharm.Des.,8:1391–1403)。
可裂解接头可任选地还包含一个或多个附加官能团，诸如自分解(self-immolative)/自消除基团、延伸段或亲水部分。
可用于接头的自分解和自消除基团包括例如对-氨基苄基(PAB)和对-氨基苄氧基羰基(PABC)基团，甲基化乙二胺(MED)和半缩醛基团。自分解基团的其他实例包括但不限于：在电子特性上类似于PABC或PABE基团的芳族化合物，诸如杂环衍生物，例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物，如美国专利号7,375,078中所述。其他实例包括在酰胺键水解时进行环化的基团，诸如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等人,1995,ChemistryBiology,2:223-227)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等人,1990,J.Org.Chem.,55:5867-5877)。单独或组合的自分解/自消除基团通常包括在基于肽的接头中，但也可包括在其他类型的接头中。在一些实施方案中，所述接头可以包括一个或多个自分解/自消除基团，例如PABC基团、PABE基团，或PABC或PABE基团和MED的组合。
可用于ADC的接头中的延伸段包括例如亚烷基和基于脂族酸、二酸、胺或二胺的延伸段，诸如二甘醇酸酯、丙二酸酯、己酸酯和己酰胺。其他延伸段包括例如基于甘氨酸的延伸段和聚乙二醇(PEG)或单甲氧基聚乙二醇(mPEG)延伸段。PEG和mPEG延伸段也起亲水部分的作用，并且与疏水药物一起可特别有用，但是在一些实施方案中也考虑了它们在与其他药物的接头中的用途。
在某些实施方案中，延伸段可具有以下结构之一：
其中：
R为H或C1-C6烷基；
t为2与10之间的整数，并且
u为1与10之间的整数。
在一些实施方案中，在式I的ADC中，接头L是具有式II的可裂解接头：
其中：
Z是将接头与抗FRα抗体构建体A上的靶基团连接的连接基团；
Str为延伸段；
AA1和AA2各自独立地是氨基酸，其中AA1-[AA2]r形成蛋白酶裂解位点；
X是自分解基团；
q是0或1；
r是1、2或3；
s是0、1或2；
#是与所述抗FRα抗体构建体A的连接点，并且
％是与所述药物部分D的连接点。
在一些实施方案中，在式(II)的接头中：
Z是其中#是与A的连接点，并且*是与接头的其余部分的连接点。
在一些实施方案中，在式(II)的接头中，Str选自：
其中：
R为H或C1-C6烷基；
t为2与10之间的整数，并且
u为1与10之间的整数。
在一些实施方案中，式I的ADC可包含含二硫键的接头。在一些实施方案中，在式I的ADC中，接头L是具有式III的可裂解接头：
其中：
Z是将接头与抗FRα抗体构建体A上的靶基团连接的连接基团；
Q为-(CH2)p-或-(CH2CH2O)q-，其中p和q各自独立地为1与10之间的整数；
每个R独立地为H或C1-C6烷基；
n为1、2或3；
#是与所述抗FRα抗体构建体A的连接点，并且
％是与所述药物部分D的连接点。
在一些实施方案中，式I的ADC可包含含b-葡糖苷酸的接头。
各种非可裂解接头在本领域中是已知的，用于将药物与抗体连接，并且在某些实施方案中可用于本公开的ADC中。非可裂解接头的实例包括具有用于与抗体反应的N-琥珀酰亚胺酯或N-磺基琥珀酰亚胺酯部分，以及用于与药物反应的基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基的部分(或反之亦然)的接头。此类非可裂解接头的实例是基于磺基琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯(磺基SMCC)。磺基-SMCC缀合通常经由与巯基(硫醇，-SH)反应的马来酰亚胺基团发生，而磺基-NHS酯对伯胺具有反应性。此类接头的其他非限制性示例包括基于N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(“长链”SMCC或LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、m-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰氨基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)和N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)。其他实例包括那些包含基于卤代乙酰基的官能团，诸如N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)的接头。
包含如本文所述的抗FRα抗体构建体的ADC可以通过本领域已知的若干途径之一，采用标准有机化学反应、条件和试剂来制备(参见例如，Bioconjugate Techniques(G.T.Hermanson,2013,Academic Press)。例如，缀合可通过以下方式实现：(1)使抗体构建体的官能团与二价接头试剂反应，以经由共价键形成抗体-接头中间体A-L，接着与活化的药物部分D反应；或(2)药物部分的官能团与接头试剂反应，以经由共价键形成药物-接头中间体D-L，接着与抗体构建体的官能团反应。缀合方法(1)和(2)可与多种抗体构建体、药物部分和接头一起用于制备本文所述的ADC。
各种制备的接头、接头组分和药物是可商购的或者可使用标准合成有机化学技术制备(参见，例如，March’s Advanced Organic Chemistry(Smith和March,2006，第六版，Wiley)；Toki等人,2002,J.Org.Chem.,67:1866-1872；Frisch等人,1997,Bioconj.Chem.,7:180-186；Bioconjugate Techniques(G.T.Hermanson,2013,Academic Press)和Antibody-Drug Conjugates:Methods in Molecular Biology(Ducry(编辑),2013,Springer))。此外，许多适于与所选抗体构建体反应的预先形成的药物-接头也可商购获得，例如，包含DM1、DM4、MMAE、MMAF或倍癌霉素SA的药物-接头可从Creative BioLabs(Shirley,NY)商购获得。各种抗体药物缀合服务也可从诸如Lonza Inc.(Allendale,NJ)、Abzena PLC(Cambridge,UK)、ADC Biotechnology(St.Asaph、UK)、Baxter BioPharmaSolutions(Baxter Healthcare Corporation,Deerfield,IL)和Piramal PharmaSolutions(Grangemouth,UK)的公司商购获得。
ADC一旦制备，就可以通过标准技术诸如色谱法(例如，HPLC、尺寸排阻、吸附、离子交换和/或亲和力捕获)、透析和/或切向流过滤来纯化。
使用方法
本公开的某些方面涉及抗FRα抗体构建体和ADC的治疗或诊断用途。FRα在多种癌症中过表达，因此本公开的某些实施方案涉及将抗FRα抗体构建体和ADC用于FRα阳性癌症的治疗或诊断中的方法。
某些实施方案涉及抑制FRα阳性肿瘤细胞生长的方法，其包括使所述细胞与本文所述的抗FRα抗体构建体或ADC接触。所述细胞可以是在体外或在体内。在某些实施方案中，所述抗FRα抗体构建体和ADC可用于治疗受试者的FRα阳性癌症或肿瘤的方法中。
过表达FRα的癌症通常是实体瘤。实例包括但不限于卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌(诸如非小细胞肺癌(NSCLC))、间皮瘤、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌(TNBC))、结肠直肠癌、胆道癌、胰腺癌和食道癌。本公开的某些实施方案涉及用如本文所述的抗FRα抗体构建体或ADC治疗FRα阳性癌症的方法，其中所述癌症是卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌(诸如非小细胞肺癌(NSCLC))、间皮瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、胆道癌、胰腺癌或食道癌。在一些实施方案中，本文所述的抗FRα抗体构建体或ADC可用于治疗三阴性乳腺癌(TNBC)。
FRα阳性癌症的治疗可引起以下的一种或多种：缓解症状，缩小肿瘤大小，抑制肿瘤生长，减少所述疾病的一种或多种直接或间接的病理后果，防止转移，降低疾病进展速率，改进或减轻疾病状态，改善存活期，增加无进展存活期，缓解和/或改善预后。
在某些实施方案中，当用于治疗癌症时，所述抗FRα抗体构建体或ADC可以全身施用于待治疗的受试者，例如通过推注或连续输注到受试者的血流中。在某些实施方案中，当用于治疗癌症时，所述抗FRα抗体构建体或ADC可以在待治疗的部位局部施用于受试者。
预期所述抗FRα抗体构建体或ADC可单独使用或与一种或多种通常用于治疗癌症的已知化学治疗剂或免疫治疗剂组合使用。所述抗FRα抗体构建体或ADC与标准化学治疗剂或免疫治疗剂的组合可用于改善化学治疗剂或免疫治疗剂的功效，并且因此可改善标准癌症疗法。这种应用在对标准治疗没有应答的抗药性癌症的治疗中可能很重要。当连同一种或多种已知的化学治疗剂或免疫治疗剂一起使用时，所述抗FRα抗体构建体或ADC可以在施用所述化学治疗剂或免疫治疗剂之前或之后施用，或者它们可以同时施用。
待施用的抗FRα抗体构建体或ADC的剂量不受限定限制，但其将是治疗有效量。“治疗有效量”是指当向受试者施用时足以实现对特定适应症的治疗的本文所述的抗FRα抗体构建体或ADC的量。就癌症治疗而言治疗有效量的抗FRα抗体构建体或ADC可以例如具有以下效果中的一种或多种：减少癌细胞数目、减小肿瘤大小、抑制癌细胞浸润到周围器官中、抑制肿瘤转移、抑制肿瘤生长；增加存活时间和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。对于癌症疗法，可替代地可以例如通过评估疾病进展时间(TTP)和/或和/或测定应答率(RR)来测量功效。
某些实施方案涉及使用本文所述的抗FRα抗体构建体检测生物样品(诸如包含细胞或组织的样品)中FRα的存在的方法。在一些实施方案中，所述生物样品可以取自患者，例如已知或怀疑患有癌症的患者。一些实施方案涉及检测生物样品中FRα的存在的方法，其包括使所述样品与本文所述的抗FRα抗体构建体接触。
某些实施方案涉及使用本文所述的抗FRα抗体构建体诊断与FRα表达增加相关的病症(诸如癌症)的方法。诊断方法可以是将所述抗FRα抗体构建体施用于所述受试者的体内方法，或者可以是将取自所述受试者的样品与所述抗FRα抗体构建体接触的体外方法。对于体内方法，施用可以是全身的或局部的。
在检测FRα的存在或诊断与FRα的表达增加相关的病症的方法中，所述抗FRα抗体构建体可以用本领域已知的可检测标记，诸如荧光、发光、发色、化学发光、放射性或酶标记来标记。
药物组合物
对于治疗用途，所述抗FRα抗体构建体和ADC可以以包含所述抗FRα抗体构建体或ADC和药学上可接受的载剂或稀释剂的药物组合物的形式提供。所述组合物可以使用熟知且容易获得的成分通过已知程序制备。
可将药物组合物配制成用于通过例如肠胃外、口服(包括例如经颊或舌下)、局部、直肠或阴道途径，或通过吸入或喷雾施用于受试者。“肠胃外”施用可以是皮下注射或皮内、关节内、静脉内、肌内、血管内、胸骨内或鞘内注射或输注。药物组合物通常将配制成适于施用于受试者的形式，例如糖浆剂、酏剂、片剂、糖锭剂、锭剂、硬胶囊或软胶囊、丸剂、栓剂、油性或水性悬浮液、可分散性粉剂或粒剂、乳液、注射剂或溶液。药物组合物可以作为单位剂量制剂提供。
在某些实施方案中，包含所述抗FRα抗体构建体或ADC的药物组合物可以配制用于通过输注或以单位剂量可注射形式(例如作为冻干制剂或水溶液)肠胃外施用。
药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下通常对受者无毒。此类载体的示例包括但不限于：缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，诸如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质诸如血清白蛋白或明胶；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子诸如钠离子；金属络合物诸如Zn-蛋白质络合物；和非离子型表面活性剂诸如聚乙二醇(PEG)。
在某些实施方案中，包含所述抗FRα抗体构建体或ADC的药物组合物可以是无菌可注射水性或油性溶液或悬浮液的形式。可使用本领域已知的合适的分散剂或润湿剂和/或助悬剂配制此类悬浮液。无菌注射溶液或悬浮液可包含无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的抗FRα抗体构建体或ADC。可采用的可接受的稀释剂和溶剂包括例如1,3-丁二醇、水、林格氏溶液或等渗氯化钠溶液。另外，可采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此，可采用各种温和的不挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。另外，诸如油酸的脂肪酸在可注射制剂中获得使用。佐剂，诸如局部麻醉剂、防腐剂和/或缓冲剂也可以包含在可注射溶液或悬浮液中。
在某些实施方案中，包含所述抗FRα抗体构建体或ADC的药物组合物可以配制用于静脉内施用于受试者，例如人。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包含增溶剂和/或局部麻醉剂，诸如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，将成分分开提供或以单位剂型混合在一起，例如，作为干燥的冻干粉或无水浓缩物在指示活性剂的量的密闭容器(诸如安瓿或小药囊)中提供。当该组合物需通过输注施用时，它可以用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶分配。当通过注射施用组合物时，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便可以在施用之前将成分混合。
其他药物组合物和制备药物组合物的方法是本领域已知的，并且例如在“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”(原名“RemingtonsPharmaceutical Sciences”)；Gennaro,A.,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA(2000)中进行了描述。
药物方剂盒
某些实施方案涉及包含如本文所述的抗FRα抗体构建体或ADC的药物试剂盒。
所述试剂盒通常将包括容纳所述抗FRα抗体构建体或ADC的容器和在所述容器上或随附所述容器的标签和/或包装说明书。标签或包装说明书含有通常在治疗产品的商业包装中包括的说明，提供了关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。标签或包装说明书还可包括管制药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，该公告反映了该制造机构对人或动物施用的使用或销售的批准。在一些实施方案中，容器可具有无菌入口。例如，容器可以是静脉溶液袋或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶。
除了容纳所述抗FRα抗体构建体或ADC的容器之外，所述试剂盒可以任选地包括一个或多个另外的包含试剂盒的其他组分的容器。例如，药学上可接受的缓冲剂(诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer’s solution)或葡萄糖溶液)、其他缓冲剂或稀释剂。
合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和静脉内溶液袋等。所述容器可由各种材料诸如玻璃或塑料制成。在适当的情况下，试剂盒的一种或多种组分可以是冻干的或以干燥形式(诸如粉末或颗粒)提供，并且试剂盒可以另外含有用于复原冻干或干燥组分的合适溶剂。
试剂盒还可包括从商业和使用者观点来看合乎需要的其他材料，诸如过滤器、针头和注射器。
提供以下实施例是为了说明的目的而非意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
概述
生物测定：在细胞系和CDX模型中FRα的表达水平是在内部使用研究级IHC测定评估的并指定相对表达水平(高/中/低或强/中等/弱)。使用存档肿瘤样品类似地对PDX模型进行评估。
实施例1：抗叶酸受体α抗体的制备
如下所述通过用人FRα抗原使兔免疫，产生特异性结合叶酸受体α(FRα)的抗体，分离并测序。
1.1免疫
在用可溶性HIS标记的人叶酸受体1抗原(FRα-HIS)(ACROBiosystems,Newark,DE；目录号FO1-H82E2)免疫的兔中产生FRα的抗体。简言之，将两只新西兰白兔用初级加强免疫，所述初级加强由200μg的FRα-HIS抗原混合明矾(5mg/次注射)/CpG(10μg/次注射)组成，沿兔背体的3个部位(0.333mL/个部位)皮下施用。在这些之后用与明矾(5mg/次注射)/CpG(10μg/次注射)混合的100μg FRα-HIS抗原进行4次免疫。每次免疫间隔14天。在第四次免疫之前对动物放血进行血清学分析。
1.2用于收获的动物的选择
使用表达人FRα的CHO细胞通过流式细胞术测定抗人FRα抗体滴度。简言之，根据制造商对LipofectamineTM 2000的说明(Thermo Fisher Scientific Corp.,Waltham,MA)，用编码人FRα的基于pTT5的表达质粒(National Research Council of Canada)瞬时转染CHO细胞。将以1:400开始并以1:2连续稀释11个点的免疫兔血清的稀释液与50,000个瞬时表达人FRα的CHO细胞孵育30分钟。然后洗涤样品，用缀合至Alexa Fluor-647的山羊抗兔二抗(Jackson Immuno Research Labs,West Grove,PA)通过流式细胞术检测抗体结合。通过鉴定显示为背景至少2倍的荧光信号的最高稀释样品来测定滴度。
1.3B细胞的回收和抗人FRα抗体的发现
处死所需滴度高于100,000的经过免疫的兔，并收获脾脏。通过在FACS缓冲液(PBS，2％v/v FBS)中研磨来解离淋巴样细胞，以使细胞从组织中释放。将细胞沉淀，然后在5mL的Pharm LyseTM(Becton,Dickinson&Co.,Franklin Lakes,NJ)中悬浮1分钟以裂解红细胞。添加等体积的FACS缓冲液以中和Pharm LyseTM并将所得淋巴细胞样品沉淀并重悬于FACS缓冲液中。
然后用山羊抗兔IgG Alexa Fluor-647(Jackson Immuno Research Labs,WestGrove,PA)对淋巴细胞悬浮液进行染色以鉴定IgG+B细胞。染色30分钟后，在FACSAriaTM(Becton,Dickinson&Co.,Franklin Lakes,NJ)上分选IgG+B细胞并计数。使用选定淋巴细胞抗体方法(SLAM)(Babcook等人,1996,Proc Natl Acad Sci USA,93(15):7843–7848)，将B细胞以从单个细胞多至50个细胞的不同密度接种在384孔板中，在培养物中扩增7天，并收获上清液用于检测抗人FRα抗体。将384孔板储存在-80℃下。
通过ELISA筛选上清液中的人FRα特异性单克隆抗体。用25μL/孔的在PBS中的人FRα-HIS(2μg/mL)包被384孔ELISA板，然后在4℃下孵育过夜。孵育后，将板用水洗涤两次，添加90μL/孔封闭缓冲液(2％脱脂乳，PBS)并将板在室温下孵育1小时。孵育后，洗涤板并添加12.5μL/孔的含抗体的上清液+12.5μL封闭缓冲液及阳性对照和阴性对照，并将板在室温下孵育2小时。
孵育后，洗涤板，向每个孔中添加25μL的0.4μg/mL山羊抗兔IgG Fc-HRP检测抗体(Jackson Immuno Research Labs,West Grove,PA)，并将板在室温下孵育1小时。孵育后，洗涤板并添加25μL四甲基联苯胺(TMB)，使板显色约10分钟(直到阴性对照孔开始显示信号)。然后向每个孔中添加25μL终止溶液(1N HCL)，并在SynergyTM H1微量板(BioTekInstruments,Winooski,VT)上在450nm波长下读板。
1.4对抗人FRα抗体测序
使用RNeasy(Qiagen,Hilden,Germany)根据制造商的方案从含有具有所需特征的抗体的孔中提取总RNA。将得到的总RNA作为模板使用SuperScriptTM III(Thermo FisherScientific Corp.,Waltham,MA)和oligo-dT20(Integrated DNA Technologies,Inc.,Coralville,IA)从mRNA转录cDNA。随后用RNA酶H(New England Biolabs,Ipswich,MA)处理cDNA。使用从Babcook等人,1996,Proc Natl Acad Sci USA,93(15):7843–7848和vonBoehmer等人,2016,Nat Protoc.,11(10):1908修改的引物和方法，以cDNA作为核酸模板进行重链和轻链抗体编码序列的初始PCR。使用Zero BluntTM TOPOTM PCR克隆试剂盒(ThermoFisher Scientific Corp.,Waltham,MA)将PCR产物克隆到pCRTOPO4中，并转化到细胞(Lucigen Corporation,Middleton,WI)。对抗生素抗性克隆进行Sanger测序并分析独特的抗体编码序列。
然后使用V区段家族和J区段家族特异性引物对这些独特序列进行后续PCR反应。将得到的扩增子克隆到基于pTT5的表达质粒(National Research Council of Canada)中。在HEK293-6E细胞(National Research Council of Canada)中以所有可能的组合共表达来自单孔样品的独特重链序列和轻链序列，以确定正确的重链和轻链配对。测定产生的抗体与在HEK293细胞上瞬时表达的抗原的结合。
1.5嵌合抗体的产生
将抗体可变区的编码序列框内克隆到huIgG1表达载体和huCK表达载体(基于pTT5载体)中。huIgG1恒定区始于丙氨酸Kabat-118，并且huCK恒定区始于精氨酸Kabat-108。在特异性结合测定中证实了所得重组嵌合抗体的活性，并且发现其与亲本抗体同等。
实施例2：抗FRα抗体的人源化
选择如实施例1中所述产生的嵌合抗人FRα(抗hFRα)之一即变体v23924用于人源化。v23924的CDR序列提供于表2.1中，VH和VL序列提供于表2.2中。如下所述进行人源化。
表2.1：抗hFRα抗体v23924的CDR序列
表2.2：抗hFRα抗体v23924的VH和VL序列
2.1人源化
将v23924的兔VH和VL序列与相应的人种系序列进行序列比对，鉴定出IGHV3-23*01和IGKVI-39*01是最接近以及最常见的人种系序列。将根据AbM定义的CDR序列(参见表2.1)移植到这些选择的人种系序列的框架上，如图1所示。包括在所得序列中被判断可能对保持对抗原hFRα的结合亲和力很重要的位置处对兔残基的回复突变，产生若干人源化序列，其中产生的序列大部分构建在先前序列上，并且其中第一人源化序列含有最小数目的回复突变。如AbM方法所定义的，没有变体修饰亲本抗体的CDR。
该过程在两个循环中进行，其中第一个循环(“循环1”)产生六个可变重链人源化序列和五个可变轻链人源化序列。第二个循环(“循环2”)扩增为另外5个可变重链人源化序列，以追求人源化抗体对hFRα更接近的亲本样亲和力。组装含有人源化重链可变结构域(VH)和hIgG1重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2、CH3)的完整重链序列，以及含有人源化轻链可变结构域(VL)和人κ轻链恒定结构域(κCL)的完整轻链序列。然后组装单克隆抗体(mAb)变体，使得在循环1中，每条人源化重链与每条人源化轻链配对以提供30种人源化变体，并且在循环2中，另外的人源化重链与选择的人源化轻链配对，得到另外15种人源化变体，总共45种人源化变体有待用实验方法评价。
2.2人源化抗体的产生
45种人源化mAb构建体中的每一种，以及亲本v23924 mAb构建体以全尺寸抗体(FSA)格式产生，所述全尺寸抗体(FSA)格式含有两条相同的全长重链(亲本v23924和15种人源化变体)，产生同型二聚体Fc区(HomoFc)，或含有在CH3区包含互补突变以驱动独有重链配对的异二聚体全长重链(30种人源化变体)，产生异二聚体Fc区(HetFc)。还产生了含有HetFc而不是HomoFc的v23924型式(变体v30618)。所有构建体都包括两条个相同的κ轻链。
HomoFc区所包含的两条相同的全长重链含有IGHG1*01的人CH1-铰链-CH2-CH3结构域序列(SEQ ID NO:146；参见表2.3)。HetFc区所包含的异二聚体全长重链(HetFc-A和HetFc-B)含有IGHG1*01的人CH1-铰链-CH2-CH3结构域序列，在Fc区中具有以下突变：
HetFc-A：T350V_L351Y_F405A_Y407V
HetFc-B：T350V_T366L_K392L_T394W
HetFc-A(SEQ ID NO:148)和HetFc-B(SEQ ID NO:149)的序列提供于表2.3中。对于所有构建体，使用IGKC*01的人κCL序列(SEQ ID NO:147；参见表2.3)。
表2.3：HomoFc和HetFc序列
将来自循环1的每个人源化VH结构域序列附加到IGHG1*01的人CH1-铰链-CH2-CH3(HetFc-A和HetFc-B)结构域序列以提供十二个人源化全重链序列(六个人源化VH x2)。将兔VH和来自循环2的另外五个人源化VH结构域序列中的每一个附加到IGHG1*01的人CH1-铰链-CH2-CH3结构域序列，以提供亲本兔-人嵌合全重链序列和五个另外的人源化全重链序列。将每个VL结构域序列附加到IGKC*01的人κCL序列以提供五个人源化轻链序列。将所有序列反向翻译成DNA，针对哺乳动物表达进行密码子优化，并基因合成。
将包含信号肽的重链载体插入片段(人工设计的序列：MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(SEQ ID NO:150)(Barash等人,2002,Biochem and Biophys Res.Comm.,294:835–842))和终止于CH3结构域的残基G446(EU编号)处的重链克隆连接到pTT5载体中以产生重链表达载体。将包含相同信号肽的轻链载体插入片段连接到pTT5载体中以产生轻链表达载体。对所得重链和轻链表达载体进行测序以确认编码DNA的正确阅读框和序列。
每种人源化抗体变体的重链和轻链在200ml CHO-3E7细胞培养物中表达。简言之，在37℃下在补充有4mM谷氨酰胺(GE Life Sciences,Marlborough,MA)和0.1％ PluronicaF-68(Gibco/Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)的FreeStyleTM F17培养基(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)中培养CHO-3E7细胞，密度为1.7-2x 106个细胞/ml，活力>95％。使用(Polyscience,Inc.,Philadelphia,PA)，用总共200ug DNA(100ug抗体DNA和100ug的GFP/AKT/填充片段DNA)，以DNA:PEI比率1:4(w/w)转染总体积200ml的CHO-3E7细胞+1x抗生素/抗真菌剂(GE Life Sciences,Marlborough,MA)。添加DNA-PEI混合物二十四小时后，将0.5mM丙戊酸(最终浓度)+1％w/v胰蛋白胨(最终浓度)添加到细胞中，然后将其转移至32℃并在收获前再孵育6天。
以分批模式或使用1mL HiTrapTM MabSelectTM SuReTM柱(Cytiva,Marlborough,MA)进行蛋白A纯化。在分批模式中，将澄清的上清液样品与mAb Select SuReTM树脂(GEHealthcare,Chicago,IL)分批孵育，用NaOH原位清洁(CIP'd)并在杜氏PBS(DPBS)中平衡。将树脂倒入CIP’d柱中，用DPBS洗涤该柱。在两种纯化模式中，用100mM柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)洗脱蛋白质。通过添加10％(v/v)1M HEPES(pH约10.6-10.7)对洗脱级分进行pH调节，得到6-7的最终pH。将样品缓冲液交换到DPBS中。基于280nm处的吸光度(A280 nm)定量蛋白质。在蛋白A纯化后，将亲本兔-人抗体嵌合体变体(v23924和v30618)在Superdex200Increase 10/30柱(GE Healthcare,Chicago,IL)上在DPBS流动相中通过制备型SEC色谱法进一步纯化。
纯化后，使用高通量蛋白表达测定和Caliper GXII或GXII Touch HT(Perkin Elmer,Waltham,MA)在非还原和还原条件下通过电泳评估样品的纯度。根据HTProtein Express 用户指南第2版执行程序，并进行了以下修改。将2μl或5μl的抗体样品(浓度范围5-2000ng/μl)连同7μl的HT蛋白质表达样品缓冲液(Perkin Elmer，目录号760328)一起添加到96孔板(BioRad,Hercules,CA)中的单独孔中。然后使抗体样品在70℃下变性15分钟。仪器使用HT蛋白质表达芯片(HT Protein Express Chip)(Perkin Elmer,Waltham,MA)和Ab-200测定设置进行操作。
45种人源化抗体变体和亲本嵌合抗体v23924的产量(蛋白A纯化后)范围为约9-17mg(或45-85mg/L)。图2A和图2C示出了亲本嵌合抗体v23924和代表性人源化变体v30384的Caliper电泳结果。正如从图2可以看出，对于代表性的人源化抗体样品，非还原(NR)和还原(R)Caliper反映了对应于全尺寸抗体和完整重链和轻链的单一种类。其他人源化变体也是这种情况。
2.3人源化抗体的质量评估
在蛋白A纯化后和在亲本嵌合体抗体v23924的制备性SEC纯化后，通过UPLC-SEC评估人源化抗体变体的物种均一性。
使用设置为30℃且安装在具有光电二极管阵列(PDA)检测器的Waters AcquityUPLCTM H-Class Bio系统上的Waters Acquity BEH200 SEC柱(2.5mL，4.6x 150mm，不锈钢，1.7μm颗粒)(Waters LTD,Mississauga,ON)进行UPLC-SEC。流动相为含有0.02％吐温20的杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(pH 7.4)，并且流速为0.4ml/min。每次注射的总运行时间为7分钟，总流动相体积为2.8mL。通过在210-500nm范围内的UV吸光度监测洗脱，并在280nm下提取色谱图。使用Waters 3软件，采用Apex TrackTM进行峰积分并检测肩部特征。
图2B和图2D分别示出亲本嵌合抗体v23924(SEC纯化后)和代表性人源化抗体v30384(蛋白A纯化后)的UPLC-SEC图谱。代表性人源化抗体样品的UPLC-SEC图谱反映出与亲本嵌合抗体样品同等的高物种均一性。来自其余人源化抗体变体的样品具有与代表性人源化抗体样品所示相似的特征。
实施例3：人源化抗体与hFRα的结合
3.1人源化抗体对于hFRα的亲和力评估
为了确定人源化过程是否影响人源化变体对其靶标的亲和力，如下通过生物层干涉测量法(BLI)评估45种纯化的人源化抗体变体结合hFRα抗原的能力。
使用RED96系统(ForteBio,Fremont,CA)通过循环以下步骤评估hFRα抗原结合：在200秒内将抗体(0.9μg/mL)装载到抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器上；基线稳定60秒；在跨越预期KD的多个相关浓度下与重组His标记的人FRα(ACROBiosystems,Newark,DE)的缔合400-500秒；记录解离500-1000秒；在进行下一抗体之前，通过在10mM甘氨酸pH1.5(15秒)和测定缓冲液(1秒)之间循环3次进行再生。使用的测定缓冲液是补充有0.06％吐温20并且在一些情况下还补充有1％ BSA的KB缓冲液(动力学缓冲液，由PBS(pH 7.4)、0.1％BSA、0.02％吐温20、0.05％叠氮化钠组成)。该实验在30℃下以1000rpm的振荡速度进行。
使用数据分析软件9.0(ForteBio,Fremont CA)进行数据分析。将减去参考的结合曲线与1:1相互作用模型全局拟合以产生结合动力学参数kon、koff和解离常数KD。
发现45种人源化抗体变体中有九种以范围为约63nM至210nM的KD值结合hFRα(参见表3.1)。确定亲本嵌合体抗体(v23924)的KD为27nM。表现出与hFRα结合的人源化抗体变体的特征在于与亲本嵌合体抗体相比亲和力降低约2倍至约8倍。正如从表3.1可以看出，所有成功的人源化变体共有相同的可变轻链(4L)，但在可变重链组成上不同。成功的人源化变体的轻链和重链序列提供于表3.2中。图3示出了亲本嵌合抗体v23924和代表性人源化抗体v30384的BLI传感图。
表3.1：通过对人源化变体的抗原结合评估
1 HetFc＝异二聚体Fc区；HomoFc＝同型二聚体Fc区(参见实施例2)
2 n＝2
表3.2：人源化VH和VL链的氨基算序列
3.2人源化抗体对于hFRα的亲合力评估
如下所述，通过表面等离子体共振(SPR)评估对亲本和FSA格式的选择的人源化变体的抗原结合的亲合力。
用于测定亲本嵌合抗体(v23924)和人源化变体的hFRα亲和力和亲合力的SPR测定在25℃的温度下在BiacoreTM T200 SPR系统上用PBS-T(PBS+0.05％(v/v)吐温20)运行缓冲液(添加有0.5M EDTA储备溶液以达到3.4mM最终浓度)进行。CM5系列S传感器芯片、BiacoreTM胺偶联试剂盒(NHS、EDC和1M乙醇胺)和10mM乙酸钠缓冲液购自GE HealthcareLife Science(Mississauga,ON,Canada)。具有0.05％吐温20的PBS运行缓冲液(PBST)购自Teknova Inc.(Hollister,CA)。重组人FRα购自ACRObiosystems(Newark,DE)。
筛选与hFRα抗原结合的变体分两步进行：将hFRα捕获到表面上，接着注射3至5种浓度的变体。hFRα表面是在CM5系列S传感器芯片上通过如制造商(GE Healthcare LifeScience,Mississauga,ON,Canada)所述的标准胺偶联方法制备的。对于5至200RU范围的共振单位(RU)，使用BiacoreTM T200固定化向导与胺偶联方法进行hFRα的固定化。使用多循环动力学，用空白缓冲液对照以300nM开始的3至5个浓度的两倍稀释系列的样品以50uL/min注射180秒，具有600秒解离相，产生一组具有缓冲液空白参考的传感图。通过以30uL/min一次脉冲10mM甘氨酸/HCl(pH 1.5)持续30秒使hFRα表面再生以准备用于下一注射循环。使用BiacoreTM T200评价软件v3.0.分析减去空白的传感图。然后将减去空白的传感图与1:1Langmuir结合模型拟合。
结果示于表3.3中。常规二价抗体格式(FSA)的亲本抗体(v23924)和两种人源化变体(v30384和v30399)均展示出与hFRα抗原结合的亲合力。即，在中等-低抗原密度下与单臂抗体(OAA)格式相比，在FSA中获得的KD值在亲本样品的情况下为约1/17且在人源化样品的情况下为约1/27-1/39，在高抗原密度下其分别进一步降低到约1/108和约1/116-1/181。
表3.3：通过SPR对选定的人源化变体的亲合力评估
1OAA＝单臂抗体，FSA＝全尺寸抗体；OAA抗体样品是相应FSA样品的等效物并且以与实施例2中描述的FSA样品类似的方式产生。
2n＝2
实施例4：人源化抗FRα抗体的纯度
在蛋白A纯化(实施例2)和非变性去糖基化后，使用质谱法评估来自实施例3的人源化抗体变体的表观纯度。
由于抗体变体样品仅含有Fc N-连接的聚糖，样品仅用N-糖苷酶F(PNGase-F)处理。将经过纯化的样品用PNGase F如下去糖基化：在50mM Tris-HCl(pH 7.0)中的0.1UPNGase F/μg抗体，在37℃下孵育过夜，最终蛋白质浓度为0.48mg/mL。去糖基化之后，在进行LC-MS分析之前，将样品储存在4℃下。
使用与LTQ-OrbitrapTM XL质谱仪(ThermoFisher,Waltham,MA)联接的Agilent1100HPLC系统(调节用于较大蛋白质(>50kDa)的最佳检测)，经由Ion Max电喷雾源，通过完整LC-MS分析去糖基化的蛋白质样品。将样品注射到2.1x 30mm Poros R2反相柱(AppliedBiosystems Corp.,Waltham,MA)上，并使用由递增浓度(20％-90％)的乙腈组成的0.1％甲酸水溶液/乙腈(脱气)线性梯度进行分解。将柱加热至82.5℃，并将溶剂在柱前加热至80℃，以改善蛋白质峰形。锥孔电压(来源片段化设置)是大约40V，FT分辨率设置是7,500并且扫描范围是m/z 400-4,000。使用去糖基化的IgG标准(Waters IgG标准)以及去糖基化的mAb标准混合物(25:75的半尺寸:全尺寸抗体)，针对IgG样品分析对LC-MS系统进行评估。对于每个LC-MS分析，对跨越抗体峰(通常3.6-4.1分钟)获得的质谱求和，并使用MassLynxTM数据分析软件(Waters,Milford,MA)的MaxEnt 1模块将整个多电荷离子包膜(m/z 1,200-4,000)去卷积成分子量图谱。每个样品中的每种抗体种类的表观量由所得分子量图谱中的峰高确定。
结果示于表4.1中。几乎所有人源化变体都是高纯度的，范围为约89％-100％所需种类，仅v30389显示较低纯度(82.6％)。四种变体v30384、v30389、v30394和v30399的纯度与其余变体的纯度相比稍低是由于这些变体包含导致存在一些半抗体的异二聚体CH3区(参见实施例2)。图4描绘了两种代表性的人源化变体v30384和v31422的LC/MS图谱。在所有样品的LC/MS图谱中，观察到约+266Da的侧峰，这可能是分析的假象。
表4.1：通过LC/MS测定的人源化变体的纯度
变体 所需种类％
v30384 93.2
v30389 82.6
v30394 89.1
v30399 91.8
v31422 100
v31423 100
v31424 100
v31425 100
v31426 100
实施例5：人源化抗FRα抗体的热稳定性
如下所述通过差示扫描量热法(DSC)评估人源化抗体变体的热稳定性。
在PBS中的主要在0.4mg/mL浓度下的400μL纯化样品用于利用VP-毛细管DSC(GEHealthcare,Chicago,IL)进行DSC分析。在每次DSC运行开始时，进行5次缓冲液空白注射以稳定基线，并且在每次样品注射前布置缓冲液注射以进行参考。利用低反馈、8秒过滤器、3分钟预扫描恒温器和70psi氮气压力，以60℃/h的速率从20℃至100℃扫描每个样品。对所得的热谱图进行参考并使用Origin 7软件(OriginLab Corporation,Northampton,MA)进行分析，以确定作为热稳定性指标的解链温度(Tm)。
对人源化变体测定的Fab Tm值示于表5.1中。与亲本抗体v23924(Fab Tm为约72℃)相比，所有人源化变体表现出增加的热稳定性，其中Fab Tm值在约81-84℃的范围内。在人源化变体中，v30394显示出最高的热稳定性。
表5.1：人源化变体的热稳定性
变体 Fab Tm(℃)
v23924(亲本) 72.1
v30384 81.7
v30389 80.7
v30394 84.4
v30399 83.4
v31422 82.6
v31423 83.0
v31424 81.3
v31425 82.4
v31426 81.9
实施例6：人源化抗FRα抗体的等电点测定
如下所述通过毛细管等电聚焦(cIEF)测定人源化抗体变体的等电点。
使用CE-UV Agilent 7100毛细管电泳(CE)系统进行cIEF。将5ug(或最大2.5uL)样品施加到毛细管(两性电解质范围为3.0-10.0)。使用pI标准物混合物，4.1、4.22、5.5、7.0和10.0用于系统适用性试验，4.1和10.0用于样品分析。对于所有CE运行使用配备设定为6℃的外部水浴、检测器过滤器组件(280nm)和9巴外部压力的Agilent 7100 CE系统。在两端分别在距检测窗8.5cm和24.5cm的距离处切割中性包被的毛细管(碳氟化合物)，配备绿色对准接口并装配到Agilent毛细管盒中。每天一次，如下调节毛细血管：用350mM乙酸在3.5巴下高压冲洗5分钟，用水冲洗2分钟并用cIEF凝胶冲洗5分钟。在每次运行之前，如下调节毛细管：用4.3M尿素溶液在3.5巴下高压冲洗3分钟并用水冲洗2分钟。通过施加2巴高压100秒，接着进行入口电极和出口电极水浸泡来注入样品。在25kV下用200mM磷酸作为阳极电解液和300mM NaOH作为阴极电解液进行聚焦10分钟。使用化学动员，将出口小瓶更换为350mM乙酸并施加30kV持续30分钟。每次运行后，在3.5巴下用水进行高压冲洗2分钟。使用Agilent OpenLAB Intelligent Reporting A.01.06.111软件获得峰RT和电泳图的手动积分。将原始数据(信号与保留时间)输出到CVS文件中并在Microsoft Excel中计算主要同工型pI、pI范围和质量中心的pI(基于内部pI标准物)。
结果示于表6.1。对大多数人源化变体的主要同工型测定的pI值范围为7.78至7.97，其中一个变体的pI为8.25(v31426)，全部落入治疗抗体的典型范围内并且与亲本嵌合抗体v23924(pI为7.65)的pI值相对同等。
表6.1：人源化变体的等电点
变体 pI(主要同工型)
v23924(亲本) 7.65
v30384 7.79
v30389 7.78
v30394 7.89
v30399 7.89
v31422 7.93
v31423 7.94
v31424 7.97
v31425 7.93
v31426 8.25
实施例7：抗FRα抗体的色谱分析
通过如下所述的疏水相互作用色谱(HIC)和尺寸排阻色谱(SEC)来分析亲本和人源化变体。
7.1 HIC分析
如Antibody Drug Conjugates,Methods in Molecular Biology，2013，第1045卷，第275-284页，L.Ducry编辑中所述，通过HIC评估抗体的亲水性/疏水性。在室温下，使用用5倍柱体积的缓冲液A(1.5M(NH4)2SO4、25mM NaH2PO4，pH 6.95)预平衡的Butyl-NPR柱(2.5μm，4.6x 35mm，TOSOH Bioscience GmbH,Griesheim,Germany)在AgilentInfinity II 1290HPLC上进行实验。通常，将浓度为2mg/mL至3mg/mL的20mg至30mg样品加载到具有95％缓冲液A和5％缓冲液B(75％25mM PO4 3-加25％异丙醇，pH 6.95)的柱上，并使用表7.1中所示的梯度以0.5mL/min运行15分钟。使用提供完全基线至基线积分的适当参数对HIC色谱图进行积分。
表7.1：HIC溶剂梯度
时间(分钟) 缓冲液A％ 缓冲液B％
0 95 5
0.1 95 5
5 80 20
9.5 65 35
11.5 50 50
12.5 5 95
13.5 5 95
12.6 95 5
15 95 5
7.2 SEC分析
在室温下，使用具有Advance Bio SEC柱(2.7μm，7.8×150mm)的AgilentInfinity II 1260HPLC进行分析型SEC，所述柱用5倍柱体积的流动相A(150mM Na2PO4，pH6.95)平衡。通常，将浓度为2-3mg/mL的20-30mg样品以1mL/min等静压洗脱7分钟并在A280下监测吸光度。对色谱图进行积分，以提供各峰的完整基线-基线积分，部分分离峰之间的分离位置合理。基于对照曲妥珠单抗的SEC图谱，将对应于IgG的主要组分的峰(大约保留时间3.3分钟)报告为单体。在3.3分钟之前出现的任何峰被指定为高分子量种类(HMWS)，并且在3.3分钟之后出现的任何峰被指定为低分子量种类(LMWS)，排除溶剂峰(超过5.2分钟)。
7.3结果
亲本和人源化变体的HIC保留时间(HIC-RT)和SEC单体％的汇总提供于表7.2中。总之，HIC和SEC显示所有人源化变体的有利的生物物理行为。亲本嵌合抗体v23924在HIC梯度上在6.5分钟洗脱，而所有人源化变体在6.0-6.7分钟之间洗脱。SEC图谱显示对于所有人源化变体＞90％单体，其中变体v30389具有最低的单体％(94％)。所有这些变体具有<5％HMWS和<5％LMWS。
表7.2：亲本和人源化抗FRα抗体的HIC和SEC分析
*无先前Prep-SEC
实施例8：附加稳定性研究
为了进一步研究人源化抗体变体的稳定性，进行了40℃稳定性和酸稳定性研究，其中如在实施例2中所述，通过Caliper和UPLC-SEC在特定时间点表征样品，并且在40℃稳定性研究的情况下另外分别如实施例6和实施例3中所述，通过cIEF和Octet抗原结合表征样品。曲妥珠单抗在这些研究中用作对照。
选择的人源化变体(v30389、v30394、v30399、v31423和v31424)在约1mg/ml样品浓度下在PBS pH 7.4缓冲液中经历持续14天的40℃稳定性研究。在时间点0、5、7、11和14天表征样品。在25℃下在不同样品浓度下将样品缓冲交换为pH 3.6的乙酸盐缓冲液持续1小时后进行酸稳定性研究，其中在时间点0、15、30和60分钟进行表征。另外，在PBS(pH7.4)中以约1mg/ml样品浓度进行冻融(从-80℃至室温)，冻融构成每个循环30分钟的三个循环。
结果示于表8.1。在研究中没有鉴定人源化变体稳定性的显著问题。如通过Caliper和UPLC-SEC测定，冻融和酸稳定性研究未揭示样品组成在研究过程中有任何变化。40℃稳定性研究显示随研究进行Caliper和UPLC-SEC图谱的微小变化(具体地，出现一些量的低分子量种类，范围为约10％-17％)。未观察到抗原结合亲和力的变化。cIEF揭示了相对于主要同工型，更具酸性的种类的预期小幅增加。
表8.1：人源化变体在40℃、酸稳定性和冻融研究中的稳定性评估
1曲妥珠单抗对照
2Err＝误差基线
实施例9：抗FRα抗体的功能表征-FRα特异性
通过流式细胞术和ELISA评估亲本嵌合抗体v23924与FRα(FOLR1)、FOLR2、FOLR3和FOLR4的结合交叉反应性。使用HEK293转染的细胞通过流式细胞术评估FRα、FOLR2和FOLR4结合。通过ELISA评估FOLR3结合，因为FOLR3是可溶性蛋白质。对照抗FOLR2(小鼠抗人FOLR2；Nordic BioSite AB,Sweden；目录号AFC-4544-2)、抗FOLR3(小鼠抗人FOLR3；LS Bio,Seattle,WA；目录号LS-C125621)和抗FOLR4(小鼠抗His DyLightTM 650；NovusBiologicals,Littleton,CO；目录号NBP2-31055C)抗体包括在这些实验中。
FRα、FOLR2和FOLR4结合：简言之，将HEK293-6e细胞转染约24小时以瞬时表达人FRα(目录号13420)、FOLR2(目录号13481)和FOLR4(目录号13483)(全部来自GenScriptBiotech,Piscataway,NJ)，每1百万个细胞1ug DNA。转染后，将50,000个细胞接种在V形底96孔板中，并与50nM一抗在标准培养条件下孵育45分钟。孵育后，洗涤细胞并用抗人IgG FcAF647缀合物(Jackson Immuno Research Labs,West Grove,PA；目录号109-605-098)在室温(RT)下染色45分钟。孵育和洗涤后，在BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD Biosciences,Franklin Lake,NJ)上通过流式细胞术检测荧光，每孔收集1,000个最小事件。
FOLR3结合：在37℃用商业纯化的FOLR3蛋白(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN；目录号5319-FR)包被ELISA 96孔板1小时。在室温下用PBS(pH 7.4)中的1％的乳将板封闭1小时。封闭后，在室温下以7nM添加一抗，保持1小时。然后在室温下以0.4μg/ml添加HRP缀合的二抗(Jackson Immuno Research Labs,West Grove,PA；目录号109-035-098)，保持1小时。使用四甲基联苯胺(TMB)使板显色并使用HCl终止反应。使用SynergyTM H1酶标仪(BioTek Instruments,Winooski,VT)在450nm下读取吸光度。
结果
结果示于表9.1和表9.2中。
通过流式细胞术或ELISA，抗FRα、抗FOLR2、抗FOLR3和抗FOLR4对照抗体显示与相应靶蛋白的预期结合。通过流式细胞术，使用FlowJoTM v8软件(BD Biosciences,FranklinLake,NJ)对活的单细胞群体进行设门，并测定该群体中每种抗体的AF647 GeoMean和阳性结合％。对于ELISA，与阴性对照吸光度信号相比，使用原始吸光度值确定抗FOLR3和v23924抗体的阳性结合％。v23924显示与人FRα的预期结合，而未表现出与FOLR2、FOLR3或FOLR4的结合交叉反应性，指示FRα特异性。
表9.1：通过流式细胞术评估的与FRα、FOLR2和FOLR4的结合
表9.2：通过ELISA评估的与FOLR3的结合
抗体 吸光度450nm 结合％
v23924 0.29 8.9
抗FRα对照 0.24 7.4
抗FOLR3对照 3.27 100.0
人IgG 0.15 4.5
实施例10：抗FRα抗体的功能表征-与食蟹猴FRα的结合
如下所述使用经过转染的CHO-S细胞，通过流式细胞术评估亲本嵌合抗体v23924对与人和食蟹猴FRα的交叉反应性。帕利珠单抗(抗RSV)(v22277)用作阴性对照。
简言之，将CHO-S细胞转染约24小时以瞬时表达人或食蟹猴FRα，每1百万个细胞1ug DNA。转染后，将细胞以50,000个细胞/孔接种在V形底96孔板中，并在4℃下用抗体处理24小时以防止内化。孵育后，洗涤细胞并用抗人IgG Fc AF647缀合物(Jackson ImmunoResearch Labs,West Grove,PA；目录号109-605-098)在4℃下染色30分钟。孵育和洗涤后，在BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD Biosciences,Franklin Lake,NJ)上通过流式细胞术检测荧光。
结果如表10.1所示。v23924在CHO-S转染的细胞上显示与人和食蟹猴FRα同等的结合，在人FRα和食蟹猴FRα转染的细胞上表观Kd值分别为83.89pM和121.60pM。正如预期的，未观察到对照v22277的结合。
表10.1：与食蟹猴FRα的结合
实施例11：抗FRα抗体的功能表征-细胞结合
如下所述，通过流式细胞术在JEG-3和HEC-1-A内源性FRα表达细胞系上评估亲本嵌合抗体v23924和代表性的人源化变体v30384的细胞上结合能力。
简言之，将细胞以50,000个细胞/孔接种在V形底96孔板中，并在4℃下用抗体处理24小时以防止内化。孵育后，洗涤细胞并用抗人IgG Fc AF647缀合物(Jackson ImmunoResearch Labs,West Grove,PA；目录号109-605-098)在4℃下染色30分钟。孵育和洗涤后，在BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD Biosciences,Franklin Lake,NJ)上通过流式细胞术检测荧光，每个孔收集1,000个最小事件。使用GraphPad Prism版本9(GraphPad Software,San Diego,CA)绘制活细胞群体中的AF647/APC-A GeoMean(荧光信号几何平均值，与抗人AF647结合成比例)。
结果如表11.1所示。嵌合(v23924)和人源化(v30384)抗体在JEG-3和HEC-1-A细胞系(分别为高和中等内源性FRα表达)中均产生同等的表观Kd和Bmax值。
表11.1：细胞结合
实施例12：抗FRα抗体的功能表征-内化
亲本嵌合抗体v23924和代表性的人源化变体v30384在FRα表达细胞系(IGROV-1和OVCAR-3)中的受体介导的内化能力通过如下所述的高含量成像测定。靶向FRα的抗体索米妥昔单抗和法妥珠单抗用作阳性对照，帕利珠单抗(抗RSV)(v22277)用作阴性对照。
简言之，将抗体通过与抗人IgG Fc Fab片段pHAb染料缀合物(PromegaCorporation,Madison,WI；目录号G9841)(每个Fab片段约3个染料分子)，以5:1摩尔过量在4℃下偶联24小时而进行荧光标记。在96孔板中接种细胞并在37℃下在5％ CO2中孵育过夜。第二天将偶联的抗体添加至细胞并在37℃下孵育6-24小时以允许内化。孵育后，用染料循环紫(Dye Cycle Violet)(ThermoFisher Scientific Corporation,Waltham,MA；目录号V35003)对细胞染色以进行活细胞鉴定并使用CellInsightTM CX5高含量筛选(HCS)平台(ThermoFisher Scientific Corporation,Waltham,MA)，通过高含量成像分析活细胞中的内化荧光。使用GraphPad Prism版本9(GraphPad Software,San Diego,CA)绘制嵌合抗体v23924的重影荧光(fold-over fluorescence)。
结果
结果如图5A和图5B(IGROV-1细胞)及图6A和图6B(OVCAR-3细胞)所示。嵌合抗体v23924和人源化变体v30384在IGROV-1细胞(高FRα)和OVCAR-3细胞(中等FRα)中均显示同等的内化水平。在IGROV-1和OVCAR细胞中，在所有测试浓度(25至1nM)和时间点(6小时和24小时)，与索米妥昔单抗和法妥珠单抗阳性对照相比，嵌合抗体v23924和人源化变体v30384显示增加的内化。例如，在IGROV-1细胞中孵育6小时后，人源化变体v30384在25nM下分别显示与索米妥昔单抗和法妥珠单抗相比内化荧光增加3.3倍和6.1倍，并且在5nM下分别显示与索米妥昔单抗和法妥珠单抗相比内化荧光增加2.6和19.1倍(图5A)。类似地，在IGROV-1细胞中孵育24小时后，人源化变体v30384在25nM下分别显示与索米妥昔单抗和法妥珠单抗相比内化荧光增加2.1倍和3.9倍，并且在5nM下分别显示与索米妥昔单抗和法妥珠单抗相比内化荧光增加1.9和4.7倍(图5B)。
实施例13：表位作图
在人FRα抗原(hFRα)上亲本嵌合抗体v23924的高分辨率表位作图如下所述，通过氢/氘交换质谱法(HDX-MS)在NovoAb Bioanalytics Inc.(Victoria,BC.Canada)进行。
13.1 HDX-MS的样品制备
冻干的hFRα购自ACROBiosystems(Newark,DE；目录号：FO1-H5229)并溶解至2.5mg/ml的浓度。通过将hFRα与亲本嵌合抗体v23924以2:1的摩尔比混合来制备抗原-抗体复合物。所有样品的pH为7.4并且是澄清的(没有观察到沉淀)。对于肽鉴定，在pH 2.4的2M胍存在下用100mM的三-(2-羧乙基)膦(TCEP)还原浓度为10μM的hFRα，然后用胃蛋白酶以1:1的酶与蛋白质摩尔比消化。通过将蛋白质样品与D2O缓冲液以2:8(v/v)的比率混合来引发HDX。将所得溶液在26℃下孵育，并且在20秒、7分钟、1小时和4小时取出等分试样，并且通过添加含有4M胍的200mM TCEP溶液立即淬灭。将这些样品在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下。在LC-MS实验期间，将蛋白质等分试样快速解冻并保持在冰上进行还原2分钟，然后在0℃下用胃蛋白酶消化2分钟。
13.2 LC-MS和LC-MS/MS
在LC-MS实验中，将每种样品的20μL等分试样立即注入C18分析柱中，并使用Dionex UHPLC系统(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)以100μL/min的流速通过反相液相色谱法分离。将UHPLC系统与配备有加热电喷雾电离(HESI)II源的ThermoScientific Orbitrap FusionTM质谱仪联接。将柱、附件、注射器和溶剂输送管线嵌入冰桶中以使H/D反向交换最小化。将用于注射的注射器在冰上冷却。流动相为0.1％甲酸(A)和100％乙腈/0.1％甲酸(B)，通过13分钟梯度分离肽。MS调查扫描在m/z 300-1600范围内进行，质量分辨率为120,000 FWHM。通过使用校准混合物(Calmix；ThermoFisher ScientificCorporation,Waltham,MA)将Orbitrap检测器校准到误差<3ppm。在电子转移解离(ETD)实验中，在50毫秒内将荧蒽自由基阴离子引入离子阱中。在Orbitrap中使用150-2000m/z的扫描范围检测碰撞诱导解离(CID)和ETD碎片离子。
对于数据分析，使用Proteome DiscovererTM软件套件(Thermo Fisher Scientific)处理自底向上的LC-MS/MS原始数据。将生成的峰列表提交至内部Mascot 2.2服务器，并针对hFRα的序列进行搜索。这样鉴定的肽用于HDX数据分析。使用XcaliburTM软件(ThermoFisher Scientific Corporation,Waltham,MA)处理ETD数据，并使用ProteinProspector(可从加州大学旧金山分校网站在线获得；http://prospector.ucsf.edu)针对hFRα的序列搜索产生的ETD峰列表。还对匹配的离子进行检查并通过手动检查进行确认。肽的质量偏移和各酰胺的氘化状态基于H/D交换之前和之后它们的质心m/z值确定。将所有HDX数据相对于100％ D2O含量作归一化(所有时间点缓冲液中80％ D交换)。通过比较获取的氘的数目与每个肽中所含的酰胺氢的总数获得氘掺入百分比值。基于ETD片段的氘摄取计算酰胺水平氘化信息。
13.3结果
蛋白质序列覆盖和肽鉴定
蛋白质二硫键的存在对基于肽的HDX-MS分析中胃蛋白酶消化模式和效率具有显著影响。由于hFRα和抗体v23924均含有多个二硫桥，因此首先开发了用于快速蛋白质二硫化物还原和胃蛋白酶消化的优化方案。还原时间和消化时间各自优化为2分钟，并且这些条件适用于hFRα和hFRα-v23924复合物两者。这样鉴定的肽覆盖100％的抗原序列(参见图7)。
肽水平HDX的比较
将来自hFRα和v23924复合物的肽的氘掺入水平对比HDX时间(20秒、7分钟、1小时和4小时)作图。结果汇总并示于图8中。大多数肽在抗体结合之前和之后具有相同的氘摄取行为(图8A)，表明v23924抗体的结合位点(表位)是相当局部化的。在图8B所示的差异图中，三种肽(14、15和16号)在v23924结合后显示氘摄取的显著降低，指示它们处于表位区中。这些肽的序列分别是WWEDCRTSY(118-126)(SEQ ID NO:151)、WEDCRTSY(119-126)(SEQ IDNO:152)和WEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGF(119-142)(SEQ ID NO:153)。
氨基酸水平的表位测定
尽管这三种表位肽在序列上不同，但它们的HDX差异是相同的(图8)，并且它们都含有序列WEDCRTSY(119-126)(SEQ ID NO:152)。这指示在最短的肽119-126中包括所有表位残基。在同一区域中观察到多个差异肽，提供了该蛋白质的这个区域是v23924抗体的结合位点的进一步确认。为了进一步定位HDX差异并将表位精确定位至单个氨基酸，使用ETD对肽119-126进行MSMS。选择1小时的HDX时间点，因为这产生最大的差异。ETD片段提供单残基分辨率。计算并比较hFRα和v23924复合物之间每种氨基酸的氘化水平(图9)。基于差异图的结果，确定表位残基为SEQ ID NO:15的E120、D121、R123、T124、S125和Y126(即表位序列为：EDRTSY；SEQ ID NO:154)。
实施例14：抗FRα抗体的亲和力成熟
使用HuTargTM系统(Innovative Targeting Solutions,Vancouver,BC,Canada)，使人源化抗体v30384(参见实施例3)亲和力成熟。将遗传重组应用于人源化变体v30384的可变区，并使用下一代测序(NGS)鉴定高亲和力突变体。
14.1文库质粒库的设计
人源化变体v30384可变结构域的CDR环散布有RAG1/2重组信号序列(RSS)。这些可变结构域在Integrated DNA Technologies,Inc.(Coralville,IA)合成并克隆到质粒E951(Innovative Targeting Solutions,Vancouver,BC,Canada)中。
14.2 HuTargTM文库产生
根据Innovative Targeting System的方案进行以下步骤。将基于E951的质粒库整合到HuTargTM细胞中，并诱导RAG1/2表达48小时。选择在用PE缀合的山羊抗人κ轻链抗体(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA；目录号206009)染色后所示，显示出成功重组抗体的HuTargTM细胞进行进一步研究。
14.3基于FACS选择亲和力突变体
在BD FACSAriaTM流式细胞仪(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)上对HuTargTM细胞进行多轮基于FACS的分选，每轮使用减少量的生物素化可溶性HIS标记的FRα抗原(FRα-HIS；ACROBiosystems Newark,DE；目录号FO1-H82E2)，用与AlexaFluor-647(Thermo Fisher Scientific Corp.,Waltham,MA；目录号S11223)缀合的链霉抗生物素蛋白检测。将表现出与生物素化FRα-HIS的结合增加的HuTargTM细胞直接分选至RNAzol RT(Sigma-Aldrich,St.Louis,MI；目录号R4533)中准备用于下一代测序。
14.4亲和力突变体的下一代测序
按照制造商的说明从在RNAzol中裂解的细胞中分离总RNA。然后用ezDNaseTM(Thermo Fisher Scientific Corp.,Waltham,MA；目录号11766051)消化RNA，并使用SuperscriptTM IV(Thermo Fisher Scientific Corp.,Waltham,MA；目录号18090010)和基因特异性引物转录cDNA。将VH和VK结构域靶向进行PCR扩增，并用 UltraTM DNA文库制备试剂盒(New England Biolabs,Ipswich,MA；目录号E7370L)进行分子条形码化。汇集样品并在Illumina MiSeqTM测序仪上用500-循环试剂盒，使用v2化学(Illumina,SanDiego,CA；目录号MS-102-2003)运行。进行序列分析以鉴定VH和VK序列内表现出赋予亲和力增加的高可能性的突变。
14.5亲和力突变体的重组表达
将编码突变VH和VK结构域的DNA序列合成为“小基因(MiniGenes)”(IntegratedTechnologies,Inc.,Coralville,IA)并克隆到表达载体中，以提供分别编码完整人IgG1重链和人κ轻链的表达质粒。将表达质粒彼此矩阵化以使每个重链质粒与每个轻链质粒配对。该矩阵在Expi293TM细胞(Thermo Fisher Scientific Corp.,Waltham,MA；目录号A14635)中根据制造商说明重组表达以产生64个样品。
14.6亲和力突变体的评价
用归一化浓度的人源化变体v30384或亲和力成熟抗体包被蛋白G颗粒(Spherotech Inc.,Lake Forest,IL)。将可溶性人FRα稀释至极限抗原浓度，并与抗体包被的珠粒一起孵育。分别使用AlexaFluor-647缀合的链霉抗生物素蛋白和AlexaFluor-488缀合的山羊抗人IgG Fcy(两者均来自Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)检测FRα抗原结合和抗体捕获。在BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)上通过流式细胞术分析样品。分析每个样品的FRα结合和抗体捕获的几何平均值。将抗体捕获以FRα与针对亲和力成熟抗体的亲和力等级人源化变体v30384的结合作归一化。
通过测量珠粒上捕获的抗体与抗体捕获的抗原量的比率进行单点亲和力分级。使用1.9nM的人FRα浓度，变体v30384结合是最小的(是背景的3x)，而大多数突变的变体表现出较高的结合比。在64个突变变体中，3个变体显示结合比增加4倍，10个变体显示等同的结合比。
实施例15：亲和力成熟抗体对FRα的亲和力评估
实施例14中描述的10种亲和力成熟变体在中国药明生物技术有限公司(WuXiBiologics(Hong Kong)Limited)，经由在CHO-K1细胞中瞬时转染和亲和力捕获纯化，以全尺寸抗体(FSA)格式产生，其中后续精制步骤(必要时)主要涉及制备型SEC或CEX色谱法，通过HPLC-SEC得到大于97％的样品纯度。FSA格式类似于亲本人源化变体v30384，除了这些变体包含HomoFc而不是HetFc。使用如实施例3中所述的RED96系统表征10种亲和力成熟变体与hFRα的结合。
结果
结果如表15.1所示。亲和力成熟在获得对hFRα的亲和力显著高于亲本人源化抗体v30384(KD 1.27E-07M)的人源化变体方面是成功的，亲和力提高范围为约12至58倍。对于变体v35348观察到2.2E-09M的最低KD。确定亲和力的增大主要通过降低解离常数来实现。
表15.1：亲和力成熟变体的亲和力评估
*n＝2
实施例16：亲和力成熟抗体的色谱分析
如实施例7中所述，通过疏水相互作用色谱法(HIC)和尺寸排阻色谱法(SEC)分析来自实施例15的十种亲和力成熟变体。结果示于表16.1。抗体的亲和力成熟导致疏水性/亲水性的变化，如变量HIC-RT所证明的。所有情况下的抗体单体含量均高于97％并且与HIC-RT不相关。
表16.1：亲和力成熟的抗FRα抗体的HIC和SEC分析
实施例17：亲和力成熟抗体的功能表征-细胞结合
如实施例11所述，通过流式细胞术在IGROV-1和JEG-3内源性FRα表达细胞系上评估代表性的亲和力成熟变体v35356的细胞上结合能力。
结果
结果如表17.1所示。亲本人源化变体v30384和亲和力成熟变体v35356在IGROV-1和JEG-3细胞系(分别为高和中等内源性FRα表达)中均产生同等的表观Kd和Bmax值。
表17.1：细胞结合
实施例18：亲和力成熟抗体的功能表征-内化
亲本人源化变体v30384和代表性的亲和力成熟变体v35356在FRα表达细胞系(IGROV-1和JEG-3)中的受体介导的内化能力通过如下所述的流式细胞术测定。帕利珠单抗(抗RSV)(v22277)用作阴性对照。
简言之，将抗体通过与Fab-AF488抗人IgG Fc标记试剂(Jackson ImmunoResearch Labs,West Grove,PA；目录号109-547-008)以1:1摩尔比在4℃下偶联24小时来进行荧光标记。在48孔板中接种细胞并在37℃下在5％ CO2中孵育过夜。第二天将偶联的抗体添加至细胞并在37℃下孵育24小时以允许内化。孵育后，将细胞解离，洗涤并使用100nM的抗488抗体在4℃下孵育45分钟将表面AF488荧光淬灭。在BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD Biosciences,Franklin Lake,NJ)上通过流式细胞术分析所有样品的淬灭AF488荧光(内化荧光)，每孔收集1,000个最小事件。使用GraphPad Prism版本9(GraphPad Software,San Diego,CA)绘制活细胞群体中的AF488/FITC-AGeoMean。
结果
结果示于图10中。亲本人源化变体v30384和亲和力成熟变体v35356当以20nM施用时，在暴露5小时和24小时时在IGROV-1(图10(A))和JEG-3(图10(B))细胞中显示出同等内化。
实施例19：抗体-药物缀合物的制备-半胱氨酸缀合
以各种药物与抗体比率(DAR)制备包含缀合至含有马来酰亚胺的药物接头的嵌合亲本抗体v23924、人源化抗体变体或亲和力成熟抗体变体的抗体-药物缀合物(ADC)。下面提供了示例性方案。采用的药物-接头列于表19.1中。制备的ADC和采用的缀合条件汇总于表19.2中。
19.1通过链间二硫键的部分还原缀合v23924(DAR 4)
将嵌合抗体v23924(25mg)的溶液(5.14mL)用5mM DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)在PBS(pH 7.4)中的溶液稀释至3.57mg/mL，并向该溶液中添加10mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)(1.78当量，31μL)。在37℃水浴中孵育2小时后，添加呈20mM DMSO储备溶液形式的药物-接头DL1(10当量，87μL)。通过移液将缀合反应充分混合，并使反应在冰上进行至多1小时，接着用20mM N-乙酰基半胱氨酸的水性储备液(9当量，78μL)淬灭过量的药物-接头30分钟，然后从小分子中纯化ADC。还使用相同的缀合程序以DAR 4将v23924缀合至药物-接头DL2和DL3。
19.2链间二硫键完全还原后缀合v23924(DAR 10)
用5mM DTPA在PBS(pH 7.4)中的溶液将嵌合抗体v23924(15mg)的溶液(3.1mL)稀释至3.57mg/mL。添加10mM TCEP(18当量，188μL)并将反应混合物在37℃水浴中孵育3小时，然后使用用PBS pH 7.4预平衡的10mL 40kD ZebaTM旋转脱盐柱(Thermo FisherScientific,Waltham,MA)去除过量的TCEP。将完全还原的抗体与药物-接头DL1的20mMDMSO储备液(18当量，94μL)在冰上缀合长达1小时，接着用20mM N-乙酰基半胱氨酸的水性储备液(12当量，63μL)淬灭过量的药物-接头30分钟，然后从小分子中纯化ADC。
19.3通过链间二硫键的部分还原綴合v30384(DAR 4)
用5mM DTPA在PBS(pH 7.4)中的溶液将人源化抗体变体v30384(10mg)的溶液(2.1mL)稀释至3.52mg/mL。添加1mM TCEP(2.37当量，164.5μL)并且将反应混合物在37℃水浴中孵育2小时，之后在冰上缀合至药物-接头DL1的20mM DMSO储备液(10当量，34.7μL)至多1小时，接着用N-乙酰基半胱氨酸的20mM水性储备液(9当量，31.2μL)淬灭过量的药物-接头30分钟，然后从小分子中纯化ADC。
19.4链间二硫键完全还原后缀合v30384(DAR 8)
用5mM DTPA在PBS(pH 7.4)中的溶液将人源化抗体变体v30384(20mg)的溶液(958.3μL)稀释至5mg/mL。添加10mM TCEP(12当量，167μL)并将反应混合物在37℃水浴中孵育3小时，然后使用用10mM乙酸钠(pH 5.5)预平衡的10mL 40kD ZebaTM旋转脱盐柱(ThermoFisher Scientific,Waltham，MA)去除过量的TCEP。将完全还原的抗体与药物-接头DL5的10mM DMSO储备液(15当量，208μL)在10％ DMSO(体积/体积)的存在下，在室温下在黑暗中连续搅拌下缀合长达2小时，接着用10mM N-乙酰基半胱氨酸的水性储备液(20当量，274μL)淬灭过量的药物-接头30分钟，然后从小分子中纯化ADC。
表19.1：用于制备半胱氨酸缀合的ADC的药物-接头
药物-接头 接头1 有效载荷
DL1 MTvc 化合物11
DL2 MTvc 化合物21
DL3 MCvc-PABC MMAE
DL4 MCvc-PABC 艾日布林
DL5 MC-GGFG Dxd
DL7 MTvk 化合物21
1以下所示的结构。
MTvc：
MCvcPABC：
MC-GGFG：
MTvk：
化合物1：
(参见国际专利申请公开号WO 2016/041082)化合物2：
(参见国际专利申请公开号WO 2014/144871)
表19.2：半胱氨算缀合的ADC制备的汇总
1参见实施例2
2变体v36675与v30384相同，但包含HomoFc而不是HetFc
实施例20：抗体-药物缀合物的制备-赖氨酸缀合
包含分别以3.3或4的靶DAR缀合至药物-接头DL6或DL8(参见表20.1)的人源化抗体变体v30384的抗体-药物缀合物(ADC)如下所述制备并汇总于表20.2中。
DL6：使人源化抗体v30384(1mg)的溶液(207μL)与药物-接头DL6(14当量，9.7μL)在PBS pH 7.4中的10mM DMSO储备液反应。通过移液将缀合反应充分混合，并使反应在室温下进行长达17小时。
DL8：将人源化抗体v30384(30mg)的溶液(5.9mL)与药物-接头DL8(9.5当量，99μL)在PBS pH 7.4中的20mM DMSO储备液反应。通过移液将缀合反应充分混合，并使反应在室温下进行长达18小时。
表20.2：用于制备赖氨酸缀合的ADC的药物-接头
药物-接头 接头1 有效载荷
DL6 sSPDB DM4
DL8 NHS-ADvc 化合物12
1以下所示的结构。
2参见表19.1的脚注
sSPDB：
NHS-ADvc：
表20.2：赖氨酸缀合的ADC制备的汇总
*参见实施例2
实施例21：ADC的纯化和表征
使用用PBS(pH 7.4)或10mM乙酸钠(pH 5.5)预平衡的适当大小的40kD ZebaTM旋转脱盐柱(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)纯化如实施例19和实施例20中所述制备的ADC。将以>1mg规模产生的ADC无菌过滤(0.22μm)。
将纯化的ADC储存在4℃，并使用280nm处的吸光度或使用二辛可宁酸(BCA)测定参考由曲妥珠单抗1mg/mL生成的标准曲线分析总蛋白质含量。还如下所述通过HPLC-HIC、SEC、CE-SDS和RP-HPLC-MS表征ADC。ADC的平均DAR和DAR分布是从HIC和LC-MS数据得到的。使用ToxinSensorTM单一测试试剂盒(Genescript BioTech,Piscataway,NJ；目录号L00450)评估内毒素水平，其中阈值设定为0.5EU/mg。通过RP-HPLC-MS评估残留游离药物和药物-接头水平(％FD)，并基于以下等式计算，其中阈值设定为1摩尔％DAR：
测定的ADC的生物物理特性汇总于表21.4中。
21.1通过HIC测定半胱氨酸缀合的ADC的DAR
如Antibody Drug Conjugates,Methods in Molecular Biology，2013，第1045卷，第275-284页.L.Ducry编辑中所述，通过HIC评估平均DAR。使用用5倍柱体积的缓冲液A(1.5M(NH4)2SO4、25mM NaH2PO4，pH＝6.95)预平衡的 Butyl-NPR柱(2.5μm，4.6x35mm，TOSOH Bioscience GmbH,Griesheim,Germany)并且在室温下，在Agilent InfinityII 1290HPLC(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)上进行实验。通常，将浓度为2-3mg/mL的20-30μg样品装载到具有95％缓冲液A和5％缓冲液B(75％25mM NaH2PO4加25％异丙醇，pH 6.95)的柱上，并使用表21.1中所示的梯度以0.5mL/min运行15分钟。使用提供每个峰的完整的基线-基线积分的适当参数对HIC色谱图进行积分，接着对显示出合理分离的各峰进行积分。作为参考，在相同梯度上运行非缀合的裸抗体，以获得DAR＝0的物质的HIC保留时间。
表21.1：HIC梯度
时间(分钟) 缓冲液A％ 缓冲液B％
0 95 5
0.1 95 5
5 80 20
9.5 65 35
11.5 50 50
12.5 5 95
13.5 5 95
12.6 95 5
15 95 5
21.2通过RP-HPLC-MS测定赖氨酸缀合的ADC的DAR
在室温下使用Endo S将ADC样品去糖基化1小时并注射到与Agilent6545四极飞行时间(Q-TOF)质谱仪耦合的Agilent 1290Infinity II LC(Agilent Technologies,SantaClara,CA)上。使用PLRP-S柱(8uM,50×2.1mm)以0.3ml/min的流速使用表21.2中所示的梯度分离蛋白质物质。缓冲液A：在水中的0.1％甲酸(FA)、0.025％三氟醋酸(TFA)和10％异丙醇(IPA)。缓冲液B：在乙腈(ACN)中的0.1％ FA和10％ IPA。
表21.2：RP-HPLC-MS梯度
时间(分钟) 缓冲液A％ 缓冲液B％
0 80 20
20 60 40
22 10 90
22.5 1 99
24 1 99
MS源条件示于表21.3并且采集参数如下：
模式：MS；质量范围：500至7000m/z；采集速率：1光谱/s和1000ms/光谱，3354瞬态/光谱。
表21.3：MS源条件
气体温度：300℃ VCap：5000V
干燥气体：13l/min 喷嘴电压：2000V
雾化器：45psig 碎裂器：170V
鞘气温度：400℃ 截取锥：65V
鞘气流量：12l/min Oct RF Vpp：750V
采用使用MassHunter软件(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)的定性分析进行去卷积和数据分析。去卷积参数如下：
去卷积算法：最大熵；质量范围：70000-160000；质量步骤：1.0；所用的有限m/z范围：1000-7000；减去基线：7.0；加合：质子；同位素宽度：自动；高度过滤器：峰值信噪比>＝30.0；最大峰数：由高度100限定。
使用以下等式由去卷积光谱计算平均DAR：
21.3 ADC的SEC-HPLC分析
在室温下，使用具有Advance Bio SEC柱(2.7μm，7.8×150mm；AgilentTechnologies)的Agilent Infinity II 1260HPLC(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)进行分析型SEC，所述柱用5倍柱体积的缓冲液(150mM Na2PO4，pH 6.95)平衡。通常，将浓度为2-3mg/mL的20-30μg样品以1mL/min等静压洗脱7分钟并在A280下监测吸光度。对色谱图进行积分，以提供各峰的完整基线-基线积分，部分分离峰之间的分离位置合理。基于未修饰的嵌合抗体v23924的SEC图谱，将对应于IgG的主要组分的峰(大约保留时间3.3分钟)报告为单体。在3.3分钟之前出现的任何峰被指定为高分子量种类(HMWS)，并且在3.3分钟之后出现的任何峰被指定为低分子量种类(LMWS)，排除溶剂峰(超过5.2分钟)。
21.4 ADC的CE-SDS分析
首先将所有样品稀释至1mg/mL，然后按照制造商的方案(Protein Express AssayLabChipTM；PerkinElmer,Inc.,Waltham,MA)在96孔PCR板中制备样品。简言之，在存在(还原)或不存在(非还原)400mM二硫苏糖醇(DTT)的情况下，将2μg ADC与7uL ProteinExpress缓冲液混合，随后在95℃下热变性5分钟。然后在数据采集之前将样品以1:2的比率稀释于dH2O中。每次CE-SDS运行后，使用LabChipTM Reviewer(PerkinElmer,Inc.,Waltham,MA)分析凝胶和相应的电泳图谱。
表21.4：ADC的生物物理特性
1对于药物-接头(DL)的细节，参见实施例19和实施例20
2ND＝未测定
3小规模制备，未测定％FD和内毒素
4大规模制备
实施例22：ADC的体外细胞毒性
在如下所述的一组FRα表达细胞系中测定包含各自缀合至药物-接头DL1的人源化变体v30384或亲和力成熟变体v35356的ADC的细胞生长抑制(细胞毒性)能力(参见实施例19)。
简言之，以1,000个细胞/孔的密度将细胞接种在384孔板中并用在完全细胞生长培养基中生成的供试品滴定来处理。将经过处理的细胞在标准培养条件(37℃/5％ CO2)下孵育4天。孵育后，将试剂(Promega Corporation,Madison,WI；目录号G7570)掺入所有孔中，并使用SynergyTM H1酶标仪(BioTek Instruments,Winooski,VT)测量对应于每个孔中存在的ATP的发光。基于空白孔(未添加供试品，仅空白培养基)，使用ATP测量RLU值(相对光单位)计算％细胞毒性值并使用GraphPad Prism 9软件(GraphPadSoftware,San Diego,CA)对供试品浓度作图。
结果
结果示于表22.1和图19中。包含人源化变体v30384的ADC和包含亲和力成熟变体v35356的ADC在FRα表达细胞KB-Hela、IGROV-1、JEG-3和SKOV-3中显示出同等的体外细胞毒性。在FRα阴性MDA-MB-468细胞系中，ADC均未显示出任何非特异性细胞毒性。
表22.1：体外细胞毒性
实施例23：细胞内有效载荷的释放和定量
使用如下所述的质谱法评估代表性ADC在细胞系JEG-3(高FRα)、Caov-3(中等FRα)、HEC-1-A(中等FRα)和H2110(中等/低FRα)中的细胞内有效载荷递送能力。测试的ADC包含人源化变体v30384或亲和力成熟变体v35356，其各自缀合至药物-接头DL1(参见实施例19)。
简言之，将细胞以80,000个细胞/孔接种在12孔板中，并在标准培养条件下用各种浓度的ADC处理24小时。孵育后，使用PBS(pH 7.4)洗涤细胞，收集，计数并在-80℃下冷冻。解冻后，使用纯乙腈裂解细胞。将细胞裂解物上清液注射到与Agilent 6470三重四极杆(QQQ)质谱仪耦合的Agilent 1290Infinity II LC(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)中，并使用已知浓度的游离有效载荷标准品定量细胞裂解物样品中的游离有效载荷(化合物1)。
结果结果示于图11中。在高FRα表达细胞系JEG-3中，两种ADC显示出同等的细胞内有效载荷(化合物1)递送。在较低FRα表达细胞系Caov-3、H2110和HEC-1-A中，与包含亲本人源化变体v30384的ADC相比，包含亲和力成熟变体v35356的ADC在24小时显示出较高的有效载荷递送。
实施例24：体内功效研究-嵌合抗FRα抗体ADC
如下所述，在表达不同水平FRα的多种异种移植物模型中评估缀合至药物-接头DL1或DL7的亲本嵌合抗体v23924的体内抗肿瘤活性。评估包含已知的FRα靶向抗体索米妥昔单抗的对照ADC的活性用于比较。对照ADC是缀合至药物-接头DL1的v17717(具有HetFc的索米妥昔单抗Fab)和缀合至药物-接头DL6的v17717。对于统计分析，采用线性混合效应模型对对数转换的肿瘤体积进行拟合，然后对平均增长率相等的零假设进行F-检验，并进行事后成对比较。
每个异种移植物研究中使用的ADC、异种移植物模型、剂量和研究持续时间汇总于表24.1中。对于每个异种移植物研究，每周两次测量动物的肿瘤体积和体重。
表24.1：研究参数
对于CTG-0848PDX模型，将肿瘤片段皮下植入雌性裸鼠体内。当平均肿瘤体积达到约100-250mm3时，按肿瘤大小将动物匹配并分配到治疗组中(每组n＝5)，并在第0天用如表24.1中所示的单一IV剂量的ADC治疗。
对于OV90模型，将肿瘤细胞悬浮液(0.1ml 50％ 中的1×107个细胞)皮下植入雌性CB.17SCID小鼠体内。当平均肿瘤体积达到100-150mm3时，将动物分组(每组n＝9)，并在研究第1天用如表24.1所示的单一IV剂量的ADC治疗。
对于OVCAR3模型，将肿瘤片段(约1mm3)皮下植入雌性CB.17SCID小鼠体内。当平均肿瘤体积达到约100-150mm3时，将动物分组(每组n＝8)，并在研究第1天用如表24.1所示的单一IV剂量的ADC治疗。
对于LXFA737 PDX模型，将肿瘤片段(3-4mm边缘长度)皮下植入雌性裸鼠体内。当平均肿瘤体积达到约80-200mm3时，将动物分组(每组n＝6)，并在研究第0天用如表24.1所示的单一IV剂量的ADC治疗。
对于JEG3 CDX模型，将肿瘤细胞悬浮液(0.1ml 50％ 中的1×107个细胞)皮下植入NOD/SCID小鼠体内。当平均肿瘤体积达到约100mm3时，将动物分组(每组n＝5)，并在研究第0天用单一IV剂量的ADC治疗，如表24.1所示。
对于HCC1954 CDX模型，将肿瘤细胞悬浮液(0.1ml 50％ 中的5×106个细胞)皮下植入裸鼠体内。当平均肿瘤体积达到约150mm3时，将动物分组(每组n＝5)，并在研究第0天用如表24.1所示的单一IV剂量的ADC治疗。
对于SKOV3 CDX模型，将肿瘤细胞悬浮液(0.1ml 50％ 中的1×107个细胞)皮下植入裸鼠体内。当平均肿瘤体积达到约170mm3时，将动物分组(每组n＝5)，并在研究第0天用单一IV剂量的ADC治疗，如表24.1所示。
对于KB CDX模型，将肿瘤细胞悬浮液(0.1ml PBS中的3×106个细胞)皮下植入裸鼠体内。当平均肿瘤体积达到约100-150mm3时，将动物分组(每组n＝5)，并在研究第1天用单一IV剂量的ADC治疗，如表24.1所示。
对于除HCC1954和KB CDX模型外的所有模型，如实施例28所述在多个时间点收集血清用于药代动力学分析。
结果
结果示于图12中。
在CTG-0848PDX模型中，当以5mg/kg和10mg/kg给药时，v23924-DL1引起肿瘤生长的持续消退(图12A)。在OV90模型中，当以9mg/kg和18mg/kg给药时，v23924-DL1引起肿瘤生长速率的中等抑制(图12B)，但这与媒介物对照(混合效应模型)在统计学上没有显著差异。在OVCAR3模型中，当以9mg/kg给药时，v23924-DL1和v17717-DL6两者均引起统计学上显著的肿瘤生长速率抑制(p<0.001混合效应模型)。v23924-DL1引起持续的肿瘤消退，具有比v17717-DL6显著更强的肿瘤生长速率抑制(p<0.001)(图12C)。
在LXFA737 PDX模型中，当以5mg/kg给药时，v23924-DL1、v17717-DL6和v17717-DL1分别引起198％、144％和165％的肿瘤生长速率抑制(每种肿瘤生长速率显著不同于对照，p<0.001)(图12D)。在JEG3 CDX模型中，当以3mg/kg给药时，v23924-DL1、v17717-DL6和v17717-DL1引起肿瘤短暂消退，肿瘤生长速率抑制分别为132％、148％和139％的(每种肿瘤生长速率显著不同于对照，p<0.001)(图12E)。在HCC1954 CDX模型中，当以10mg/kg给药时，v23924-DL1、v17717-DL6和v17717-DL1引起肿瘤短暂消退，肿瘤生长速率抑制分别为287％、278％和242％的(每种肿瘤生长速率显著不同于对照，p<0.01)(图12F)。
在SKOV3 CDX模型中，当以10mg/kg给药时，v23924-DL1、v17716-DL6和v17717-DL1引起肿瘤短暂消退，肿瘤生长速率抑制分别为287％、243％和278％(每种肿瘤生长速率显著不同于对照，p<0.01)(图12G)。在KB CDX模型中，当以5mg/kg给药时，v23924-DL1、v23924-DL7和v17717-DL6分别引起289％、171％和-1％的肿瘤生长速率抑制，两种v23924ADC显著优于媒介物对照和v17717-DL6(p<0.01)。当以10mg/kg给药时，所有ADC在该模型中引起肿瘤持续消退(图12H)。
实施例25：体内功效研究-嵌合和人源化抗FRα抗体ADC
如下所述，在表达中/高水平FRα的OVCAR3卵巢癌模型中评估缀合至药物-接头DL1(参见实施例19)的嵌合抗体v23924及人源化变体v30384和v30399(参见实施例3)的体内抗肿瘤活性。对于统计分析，采用线性混合效应模型对对数转换的肿瘤体积进行拟合，然后对平均增长率相等的零假设进行F-检验，并进行事后成对比较。
将肿瘤片段(约1mm3)皮下植入雌性CB.17SCID小鼠体内。当平均肿瘤体积达到约100-150mm3时，将动物分组(每组n＝8)，并在研究第1天用单一IV剂量的4mg/kg或9mg/kgADC治疗。每周两次测量肿瘤体积和体重，研究持续时间60天。
结果
结果示于图13中。当以4mg/kg给药时，v23924-DL1及人源化v30384-DL1和v30399-DL1引起类似的肿瘤消退，接着再生长。当以9mg/kg给药时，所有ADC引起肿瘤持续消退。
实施例26：体内功效研究-人源化抗FRα抗体ADC#1
如下所述，在表达不同水平FRα的多个异种移植物模型中评估缀合至药物-接头DL1或DL8(参见实施例19和实施例20)的人源化变体v30384(参见实施例3)的体内抗肿瘤活性。在所选模型中评估包含已知的FRα靶向抗体索米妥昔单抗的对照ADC的活性用于比较。对照ADC是缀合至药物-接头DL6的v17717(具有HetFc的索米妥昔单抗Fab)(v17717-DL6)和缀合至药物-接头DL6的v17716(具有HomoFc的索米妥昔单抗Fab)(v17716-DL6)。在H2110CDX模型中，还包括缀合至药物-接头DL4的v31629(法妥珠单抗)(v31629-DL4)作为对照。对于统计分析，采用线性混合效应模型对对数转换的肿瘤体积进行拟合，然后对平均增长率相等的零假设进行F-检验，并进行事后成对比较。
在每个异种移植物研究中使用的ADC、异种移植物模型、剂量和研究持续时间汇总于表26.1中。对于每个异种移植研究，每周两次测量动物的肿瘤体积和体重。
表26.1：研究参数
对于H2110 CDX模型，将肿瘤细胞悬浮液(0.1ml 50％ 中的1×107个细胞)皮下植入CB.17SCID小鼠体内。当平均肿瘤体积达到约155mm3时，将动物分组(每组n＝8)，并在研究第0天用单一IV剂量的ADC治疗，如表26.1所示。如实施例28所述，在多个时间点收集血清用于药代动力学分析。
对于SKOV3 CDX模型，将肿瘤细胞悬浮液(0.1ml 50％ 中的1×107个细胞)皮下植入裸鼠体内。当平均肿瘤体积达到约175mm3时，将动物分组(重复剂量组每组n＝9，单剂量组n＝7)并在研究第0天开始根据如表26.1中所示的剂量水平和时间表用ADC治疗。如实施例28所述，在多个时间点收集血清用于药代动力学分析。
对于IGROV-1模型，将肿瘤细胞悬浮液(0.1ml 50％ 中的1×107个细胞)皮下植入雌性裸鼠体内。当平均肿瘤体积达到约100-150mm3时，将动物分组(每组n＝12)，并根据如表26.1中所示的剂量水平和时间表用ADC治疗。
对于LXFA737 CDX模型，将肿瘤片段(3-4mm边缘长度)皮下植入裸鼠体内。当平均肿瘤体积达到约100mm3时，将动物分组(每组n＝10)，并在研究第0天用单一IV剂量的ADC治疗，如表26.1所示。
结果
结果示于图14中。
在H2110 CDX模型中，当以1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg给药时，v30384-DL1和v17716-DL6两者在浅表剂量应答中均引起较小至中等的肿瘤生长抑制，但这些在统计学上不显著(图14A)。以2.5mg/kg给药的v31629-DL4引起与v17716-DL6和v30384-DL1同等的对肿瘤生长速率的较小抑制。
在SKOV3 CDX模型中，单次施用8mg/kg的v30384-DL1、v30384-DL8和v17716-DL6分别引起203％、178％和232％的对肿瘤生长速率的显著抑制(p<0.01)，其中v17716-DL6对肿瘤生长速率的抑制中等但统计学上显著更强(p<0.01)(图14B)。与单剂量施用相比，重复给药(v30384-DL1每10天一次，总共4剂；v17716-DL6每15天一次，总共3剂)对肿瘤生长具有较小影响(图14C)。
在IGROV-1模型中，当以8mg/kg给药时，与对照相比，v30384-DL1(每10天一次，总共4剂)和v17716-DL6(每15天一次，总共3剂)引起对肿瘤生长的显著抑制(p<0.001)。当以4mg/kg给药时，与对照相比，仅v30384-DL1(每10天一次，总共4剂)引起对肿瘤生长的显著抑制(p<0.001)。在4mg/kg和8mg/kg剂量水平下，v30384-DL1引起比v17716-DL6显著更强的肿瘤生长速率抑制(分别为p<0.001和p＝0.014)(图14D)。
在LXFA737 CDX模型中，当以8mg/kg给药时，v30384-DL8和v17716-DL6分别引起154％和313％的对肿瘤生长速率的显著抑制(p<0.01)。在4mg/kg(132％和21％)和8mg/kg(313％和154％)剂量水平下，与v30384-DL8相比，v17716-DL6引起显著更强的肿瘤生长速率抑制(p<0.01)(图14E)。
实施例27：体内功效研究-人源化抗FRα抗体ADC#2
如下所述，在表达不同水平FRα的多个异种移植物模型中评估缀合至药物-接头DL5(参见实施例19)的人源化变体v30384(参见实施例3)的体内抗肿瘤活性。对于统计分析，采用线性混合效应模型对对数转换的肿瘤体积进行拟合，然后对平均增长率相等的零假设进行F-检验，并进行事后成对比较。
每个异种移植物研究中使用的ADC、异种移植物模型、剂量和研究持续时间汇总于表27.1中。对于每个异种移植物研究，每周两次测量动物的肿瘤体积和体重。
表27.1：研究参数
异种移植物模型 癌症类型 FRα表达 剂量水平mg/kg 研究持续时间
OV90 卵巢癌 中 1、3、10 61天
H2110 肺癌 中/低 0.3、1、3、10 28天
OVCAR3 卵巢癌 中/高 0.25、0.75、1.5、3 61天
OVCAR3 卵巢癌 中/高 6 61天
对于OV90 CDX模型，将肿瘤细胞悬浮液(0.1ml 50％ 中的1×107个细胞)皮下植入CB.17SCID小鼠体内。当平均肿瘤体积达到约100-150mm3时，将动物分组(每组n＝6)，并在研究第1天用单一IV剂量的ADC治疗，如表27.1所示。
对于H2110 CDX模型，将肿瘤细胞悬浮液(0.1ml 50％ 中的1×107个细胞)皮下植入CB.17SCID小鼠体内。当平均肿瘤体积达到约150mm3时，将动物分组(每组n＝5)，并用如表27.1所示的单一IV剂量的ADC治疗。
对于OVCAR3 CDX模型，将肿瘤片段(约1mm3)皮下植入CB.17SCID小鼠体内。当平均肿瘤体积达到约100-150mm3时，将动物分组(每组n＝5)，并在研究第1天用单一IV剂量的ADC治疗，如表27.1所示。
对于每种模型，如实施例28所述在多个时间点收集血清用于药代动力学分析。
结果
结果示于图15中。在所有三种模型中，v30384-DL5在测试的剂量下产生剂量应答。
在OV90 CDX模型中，v30384-DL5在1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg下产生剂量应答(在3mg/kg和10mg/kg剂量水平下对肿瘤生长速率的抑制分别为25％、47％和185％，是显著的(p<0.01))(图15A)。在H2110 CDX模型中，v30384-DL5在0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg剂量水平下产生剂量应答(图15B)。在OVCAR3 CDX模型中，v30384-DL5在0.25mg/kg、0.75mg/kg、1.5mg/kg和3mg/kg剂量水平下产生剂量应答，其中较高剂量组导致持续消退，在给药后约5周再生长(图15C)。在OVCAR3 CDX模型的另一项研究中，v30384-DL5以6mg/kg给药，导致持久消退(图15D)。
实施例28：药代动力学研究
从实施例24、26和27中描述的异种移植物研究的子集中，如所述那样收集血清并如下所述分析所评估的ADC的药代动力学(PK)。总之，在免疫受损的荷瘤小鼠中的这些研究证明基于v30384的ADC具有有利的PK特性。
通过384孔板ELISA从小鼠血清测量供试品(总抗体和/或完整ADC)浓度。为了检测来自用基于嵌合v23924、人源化v30384及对比物v17717和v17716的ADC给药的小鼠的血清中的总IgG，用山羊抗人IgG Fc捕获抗体(Jackson Immuno Research Laboratories,WestGrove,PA)包被ELISA板。对于DL1完整ADC的ELISA，使用兔抗化合物1捕获抗体。对于DL6完整ADC的ELISA，使用小鼠抗DM1/4捕获抗体(Levena Biopharma,San Diego,CA)。封闭后施加血清样品，接着施加检测抗体：缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG F(ab’)2(Jackson Immuno Research Laboratories,West Grove,PA)。在施加3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)和HCl淬灭后测量450nm处的吸光度。参照标准(GraphPad Prism软件(GraphPadSoftware,San Diego,CA))测定浓度。
结果示于图16中。多项研究的分析证明v23924-DL1和v17717-DL1各自的总IgG和ADC PK同等，具有典型的抗体样延长暴露(参见图16A-图16F)。v17717-DL6和v17716-DL6ADC PK一致地证明与它们相应的总IgG PK相比更低的暴露和更大的清除率。
v30384-DL5在OV90模型中证明跨1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg剂量成比例的PK(图16G)。在H2110模型中，v30384-DL5在10mg/kg下表现出延长的暴露和在较低剂量下更大的清除率(图16H)。
实施例29：多细胞肿瘤球状中抗FRα抗体的穿透
根据下述方法评估抗FRα抗体穿透FRα表达细胞系球状体的能力。球状体提供具有不同细胞群体分层的细胞的三维组织以及从外部到内部区域的不同梯度的形成。细胞信号传导在球状体中比在二维细胞培养物中更复杂。由于这些特征，球状体具有再现药物抗性和代谢适应性的潜力。
将人源化变体v36675的球状体穿透能力与索米妥昔单抗(v17716)和非FRα靶向对照帕利珠单抗(抗RSV)(v22277)进行比较。变体v36675与变体v30384相同，但包含HomoFc而不是HetFc。所用细胞系为高FRα表达性JEG-3(胎盘绒毛膜癌)。
将抗体通过与靶向抗人IgG Fc的Fab片段AF488缀合物(Jackson ImmunoResearch Labs,West Grove,PA；目录号109-547-008)以1:1摩尔比在PBS(pH7.4)(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA；目录号10010-023)中在4℃下偶联24小时而进行荧光标记。
用TrypLETM表达酶(1X)(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)从培养容器中分离JEG-3细胞，并使用MX高通量自动化细胞计数器(Nexcelom BioscienceLLC,Lawrence,MA)进行计数。将细胞在完全生长培养基(补充有10％胎牛血清的最小必需培养基(两者均来自Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA))中稀释并以3,000个细胞/孔接种到96孔CellCarrier Spheroid超低附着板(Perkin Elmer,Waltham,MA)中，离心并在标准培养条件下孵育3天以允许球状体形成和生长。
球状体形成后，以25nM的最终浓度将Fab-AF488偶联抗体添加到球状体中，并在标准培养条件下孵育4-96小时。孵育后，通过添加100μL完全生长培养基并从孔中取出100μL培养基来去除过量的抗体，总共洗涤三次。用1μM Hoechst 33342(Thermo FisherScientific,Waltham,MA)和100nM抗Alexa Fluor 488抗体(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA；目录号A-11094)的溶液处理球状体，并在37℃/5％ CO2下孵育2小时。
使用具有共聚焦获取和10×放大倍数空气物镜的Operetta CLSTM高含量分析系统(Perkin Elmer,Waltham,MA)进行成像。获取间隔15μm的15个平面的Z堆叠，并且选择具有代表球状体中心切片的最大直径的切片用于2D分析。使用4.5软件(PerkinElmer,Waltham,MA)进行图像分析。简言之，通过在Hoechst 33342阳性物体周围对每孔一个球状体施加掩模来进行球状体鉴定。将球状体区域分成同心条带的亚区，每个亚区占球状体区域的10％面积。定量每个亚区条带内的平均AF488荧光，通过减去内部10％平均AF488荧光进行校正，并使用GraphPad Prism版本9(GraphPad Software,San Diego,CA)绘图。
结果
结果汇总在表29.1和图20中。通过每个亚区条带处的AF488强度和通过距在评估的所有时间点从球状体边缘到可检测到AF488荧光处的距离，人源化抗体变体v36675显示出比索米妥昔单抗更大程度的穿透到JEG-3球状体中。在评估的所有时间点，与两种抗FRα抗体相比，非结合性对照帕利珠单抗在整个球状体中显示更少的AF488信号。
实施例30：抗FRα抗体的特异性评估
使用Retrogenix细胞微阵列技术(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)针对以下抗FRα抗体的任何特异性脱靶结合相互作用进行筛选：人源化变体v36675和亲和力成熟变体v35356。
Retrogenix细胞微阵列技术通过对代表6,300多种人蛋白的cDNA克隆文库筛选结合的测试配体，鉴定与细胞表面受体和分泌性蛋白质的相互作用。这些蛋白质包括质膜单体、异二聚体(通过单独亚基的共表达形成)和分泌性蛋白质(用惰性细胞膜系链表达)。将每个cDNA一式两份点样到专门的载玻片上并用HEK293细胞覆盖。这些细胞变成反向转染的，产生各自过表达不同的单个蛋白质(或异二聚体复合物)的细胞簇。
该研究在查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)进行，由三个阶段组成：预筛选、文库筛选和确认筛选。首先进行预筛选以确定用于文库筛选的测试抗体的合适浓度(即观察到与固定的未转染的HEK293细胞低水平背景结合和与过表达FRα的细胞强烈结合的浓度)。在文库筛选阶段，筛选测试抗体作为针对单独表达约6,300种人蛋白质的固定HEK293细胞的库。在确认筛选阶段，使用固定的和活的HEK293细胞，单独用每种测试抗体再表达和再测试每个文库命中。
在所有三个阶段中，用表达载体单独对载玻片点样，所述表达载体编码ZsGreen1(用于评估转染效率)和(1)在预筛选阶段中：人FRα或对照受体(EGFR和CD20)；(2)在文库筛选阶段中：在多个微阵列载玻片(“载玻片组”)上单独一式两份排列的上述蛋白质文库，其中针对每个载玻片组筛选两个重复载玻片；或(3)在确认筛选阶段中：在文库筛选中鉴定的蛋白质命中或一式两份排列的对照受体(EGFR和CD20)。
在预筛选阶段，将2、5或20μg/mL的每种选定抗体、1μg/mL的对照抗体(结合CD20的利妥昔单抗生物仿制药)或PBS添加到细胞固定后的载玻片中。在文库筛选阶段，在细胞固定后，将两种抗体(20μg/mL的变体v36675和5μg/mL的变体v35356)的库添加到每张载玻片上。在确认筛选阶段，在没有固定的情况下(活细胞；每次处理n＝1张载玻片)和在细胞固定后(每次处理n＝2张载玻片)，用单独的抗体处理载玻片：20μg/mL的变体v36675、5μg/mL的变体v35356或1μg/mL的对照抗体(利妥昔单抗生物仿制药)，或无供试品。
使用647标记的抗人IgG H+L(AF647抗hIgG H+L)检测结合，接着进行荧光成像。使用ImageQuantTM软件(版本8.2；GE Healthcare,Chicago,IL)分析荧光图像并定量。将蛋白质命中定义为显示与背景水平相比增加的信号的重复斑点，并使用在ImageQuantTM软件上网格化的图像通过目视检查鉴定。由两位有经验的科学家基于重复斑点的强度通过目视检查将命中分类为强、中、弱或非常弱。
结果
在文库筛选中鉴定的大多数初始命中(斑点强度范围从非常弱到强)被确认为变体v36675和变体v35356的确认筛选中的命中。然而，除了反映与FRα的预期强烈相互作用的命中之外，认为其他命中是非特异性的，因为这些命中1)对于对照抗体(利妥昔单抗生物仿制药)也被观察到，因为它们包括FcgR受体(由于Fc结构域介导的相互作用产生的信号)或2)包括被检测抗体识别的各种免疫球蛋白。
对于人源化变体v36675，没有鉴定到其他相互作用(参见图21)，指示变体v36675对其主要靶标FRα具有高特异性。对于该变体与异二聚体FCGR3A+CD247观察到的弱相互作用在对照中没有观察到(比较图21A和图21B)，认为其强度不足以作为命中。
对于亲和力成熟的变体v35356，在文库筛选中检测到蛋白质COL6A2同工型2C2A的弱强度信号。在固定细胞筛选而非活细胞筛选中确认“命中”，指示观察到的不一致可能是固定假象所引起的。
实施例31：竞争测定
如下通过流式细胞术在中等FRα表达肿瘤细胞系H2110中评估亲本嵌合抗体v23924与抗FRα抗体索米妥昔单抗(v17716)和法妥珠单抗(v31629)之间与FRα靶标的竞争结合。
简言之，用Alexa Fluor 647(AF647；ThermoFisher Scientific,Waltham,MA；目录号A20006)根据制造商的说明在细胞处理之前对抗体进行荧光标记。将肿瘤细胞以50,000个细胞/孔接种在V形底96孔板中，并在4℃下用未标记的抗体处理1小时以防止内化。孵育后，洗涤细胞并在4℃下添加荧光标记的抗体1小时。孵育和洗涤后，在BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BD Biosciences,Franklin Lake,NJ)上通过流式细胞术检测荧光，其中每个孔收集1,000个最小事件。使用活细胞群体中的AF647/APC-A GeoMean(荧光信号几何平均值，与抗人AF647结合成比例)计算相对于未处理对照的竞争结合％，并使用GraphPadPrism版本9(GraphPad Software,San Diego,CA)对数据进行绘图。
结果
结果如图22和表31.1所示。发现在H2110细胞系中嵌合抗体v23924与法妥珠单抗竞争FRα结合，在两个结合方向上产生接近100％的竞争结合(一抗法妥珠单抗和荧光标记的二抗变体v23924，以及一抗变体v23924和荧光标记的二抗法妥珠单抗)。发现嵌合抗体v23924在H2110细胞系中不与索米妥昔单抗竞争FRα结合。这些抗体在两个结合方向上均显示低水平的竞争％。相反，法妥珠单抗显示与索米妥昔单抗的竞争结合。因此嵌合抗体v23924展示出不同于索米妥昔单抗和法妥珠单抗的结合特征。
表31.1：在H2110细胞上与法妥珠单抗和索米妥昔单抗的竞争结合
实施例32：抗FRα抗体的附加功能表征
使用表达FRα的肿瘤细胞系，通过细胞结合、抗原介导的抗体内化、抗体向肿瘤细胞球状体的穿透和球状体的3D细胞生长抑制，与双互补位抗FRα抗体B5327A(IMGN151；v36264)和抗FRα抗体索米妥昔单抗(v17716)比较来评估人源化抗体变体v30384(HetFc)或v36675(HomoFc)的功能活性。
32.1细胞结合
在表达FRα的内源肿瘤细胞系IGROV-1(卵巢腺癌；FRα-高)中按照与实施例11中描述的相同通用程序，通过流式细胞术评估人源化抗体变体v30384(HetFc)、v36264(B5327A)和v17716(索米妥昔单抗)结合表达FRα的肿瘤细胞系的能力。
结果示于表32.1中。人源化变体v30384和索米妥昔单抗(v17716)展示出类似的细胞上结合能力，具有同等的Bmax值(分别为16,599和19,505强度几何平均值)和表观Kd值(分别为0.43nM和0.69nM)。与其他两种抗体(26,267强度几何平均值)相比，双互补位抗体B5327A(v36264)展示出增加的Bmax，如双互补位抗体所预期的。
表32.1抗FRα抗体在IGROV-1细胞系上的细胞结合
样品 Bmax Kd(nM) 斜率(h)
v30384 16,599 0.43 1.2
v36264(B5327A) 26,267 0.70 1.4
v17716(索米妥昔单抗) 19,505 0.69 1.4
32.2内化
人源化抗体变体v30384(HetFc)、v36264(B5327A)和v17716(索米妥昔单抗)的受体介导的内化能力如下通过流式细胞术通过到表达FRα的内源肿瘤细胞系IGROV-1(卵巢腺癌)中的摄取来评估。
通过与抗人IgG Fc Fab片段AF488缀合物(Jackson Immuno Research Labs,WestGrove,PA；Cat.No.109-547-008)以1:1摩尔比在PBS pH 7.4(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA；目录号10010-023)中在4℃下偶联24小时对抗体进行荧光标记。将细胞以50,000个细胞/孔接种在48孔板中并在标准培养条件(37℃/5％ CO2)下孵育过夜以允许附着。第二天将偶联的抗体以25nM添加到细胞中，并在标准培养条件下孵育5小时以允许内化。孵育后，将细胞解离、洗涤，并使用抗AF488抗体(Life Technologies,Carlsbad,CA；目录号A-11094)以100nM在4℃下淬灭表面AF488荧光30分钟。在BD LSRFortessaTM细胞分析仪(BDBiosciences,Franklin Lake,NJ)上通过流式细胞术检测淬灭的AF488荧光(内化荧光)，每孔收集1,000个最小事件。使用FlowJoTM 10.8.1版(BD Biosciences,Franklin Lake,NJ)计算活的单细胞群体的AF488/FITC-A GeoMean(荧光信号几何平均值，与抗人Fab AF488标记成比例)，并使用GraphPad Prism 9版(GraphPad Software,San Diego,CA)作图。
结果示于图23中。在将IGROV-1细胞与25nM测试抗体一起孵育5小时后，人源化抗体变体v30384显示出与双互补位抗体v36264(是v30384的1.1倍)同等的内化荧光，而索米妥昔单抗(v17716)显示出明显较低程度的内化荧光(是v30384的0.5倍)。
32.3抗体向3D球状体中的穿透
人源化抗体变体v36675(HomoFc)、v36264(B5327A)和v17716(索米妥昔单抗)穿透FRα表达细胞系球状体的能力通过用荧光标记的抗体按照与实施例29中描述的相同通用程序处理由高FRα表达细胞系JEG-3(胎盘绒毛膜癌)形成的球状体来评估。
结果示于图24中。在JEG-3球状体与25nM荧光标记的抗体一起孵育96小时后，人源化抗体变体v36675从第二层向内显示出比双互补位抗体B5327A(v36264)或索米妥昔单抗(v17716)更大的荧光强度，指示v36675在所有层更大程度的细胞摄取和穿透到球状体中的总体更大的距离。相反，在最外层上，双互补位抗体B5327A(v36264)显示出比v36675或v17716更大的荧光强度，指示抗体在球状体表面上积聚。
32.4 3D球状体生长抑制
如下在表达FRα的IGROV-1(卵巢腺癌)和JEG-3(胎盘绒毛膜癌)细胞系中评估各自缀合至药物-接头DL1的人源化抗体变体v30384(HetFc)、v36264(B5327A)和v17716(索米妥昔单抗)的3D细胞毒性能力。
简言之，将细胞以3,000个细胞/孔接种在Ultra-Low Attachment 384孔板(Corning,New York,NY)中，离心，并在标准培养条件下培养3天以允许球状体形成和生长。然后用在细胞生长培养基中生成的供试品滴定来处理球状体。将球状体在标准培养条件下孵育6天。孵育后，将3D试剂(Promega Corporation,Madison,WI)添加到所有孔中。在室温下将板在黑暗中孵育1小时，并使用BioTek Cytation 5细胞成像多模式读数器(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)进行发光定量。基于空白孔(未添加供试品)计算百分比细胞毒性值，并使用GraphPad Prism 9软件(GraphPad Software,SanDiego,CA)对供试品浓度作图。通过GraphPad Prism 9基于非线性回归log(激动剂)对比应答、可变斜率(四个参数)计算EC50值。
结果示于表32.2中。针对IGROV-1球状体，所有三种抗体-药物缀合物(ADC)均展示出同等的细胞生长抑制能力。针对JEG-3球状体，v30384-DL1在效力上类似于v17716-DL1(EC50分别为0.18nM和0.17nM)，而双互补位ADC即v36264-DL1展示出略低的效力(0.35nM)。
表32.4 3D体外细胞生长抑制
本说明书中提及的所有专利、专利申请、出版物和数据库条目的公开内容特此明确地通过引用整体并入，其并入程度就如同明确单独地指出每个单独的专利、专利申请、出版物和数据库条目通过引用并入一样。
对于本领域技术人员而言将显而易见的本文描述的特定实施方案的修改意图包括在以下权利要求书的范围内。
序列表
表A：变体的克隆编号
表B:克隆序列

Claims (44)

1.一种包含特异性结合人叶酸受体α(hFRα)的抗原结合结构域的抗体构建体，其中所述抗体构建体与特异性结合hFRα内包含SEQ ID NO:15的氨基酸残基E120、D121、R123、T124、S125和Y126的表位的参考抗体竞争结合hFRα。
2.根据权利要求1所述的抗体构建体，其中所述表位是不连续表位。
3.根据权利要求1或2所述的抗体构建体，其中所述参考抗体包含HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、27、29或32中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ IDNO:40、43或45中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42或47中任一个所示的氨基酸序列。
4.一种包含抗原结合结构域的抗体构建体，所述抗原结合结构域特异性结合人叶酸受体α(hFRα)内包含SEQ ID NO:15的氨基酸残基E120、D121、R123、T124、S125和Y126的表位。
5.根据权利要求4所述的抗体构建体，其中所述表位是不连续表位。
6.一种包含特异性结合人叶酸受体α(hFRα)的抗原结合结构域的抗体构建体，所述抗原结合结构域包含重链CDR氨基酸序列(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链CDR氨基酸序列(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述重链CDR氨基酸序列包含如SEQ ID NO:3、4和5中所示的序列，所述轻链CDR氨基酸序列包含如SEQ ID NO:6、7和8中所示的序列。
7.根据权利要求4或6所述的抗体构建体，其中所述抗原结合结构域包含具有如SEQ IDNO:19、50、54、57、61、76、79、82、85、88、91、99、106、113、116、133或136中任一个所示的序列的VH结构域的CDR序列。
8.根据权利要求4、6和7中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗原结合结构域包含具有如SEQ ID NO:39、64、119、124或130中任一个所示的序列的VL结构域的CDR序列。
9.根据权利要求4或6的抗体构建体，其中所述抗原结合结构域包含：
(i)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28、31、92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、27、29、32、51、58、100、101、102、103、109、137、138或139中任一个所示的氨基酸序列；和HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25、30、107、108或110中任一个所示的氨基酸序列，以及
(ii)LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、43、45、65、125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42、47、120或121中任一个所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求4或6的抗体构建体，其中所述抗原结合结构域包含：
(a)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、27、29或32中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、43或45中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42或47中任一个所示的氨基酸序列；或
(b)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或51中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、45或65中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42或47中任一个所示的氨基酸序列；或
(c)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或58中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、45或65中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42或47中任一个所示的氨基酸序列；或
(d)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或51中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42或47中任一个所示的氨基酸序列；或
(e)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:24、100、101、102或103中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；或
(f)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:107、108或110中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、45或65中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:42或47中任一个所示的氨基酸序列；或
(g)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:107、108或110中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、45或65中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；或
(h)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:107、108或110中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；或
(i)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；或
(j)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:107、108或110中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:40、45或65中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；或
(k)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:107、108或110中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；或
(l)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:20、23、26、28或31中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、29、32或109中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列；或
(m)HCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:92、93、94、95或96中任一个所示的氨基酸序列；HCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:21、24、137、138或139中任一个所示的氨基酸序列；HCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:22、25或30中任一个所示的氨基酸序列；LCDR1氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:125、126或127中任一个所示的氨基酸序列；LCDR2氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:41、44或46中任一个所示的氨基酸序列；和LCDR3氨基酸序列，其选自如SEQ ID NO:120或121中任一个所示的氨基酸序列。
11.根据权利要求4或6所述的抗体构建体，其中所述抗原结合结构域包含选自如SEQID NO:19、50、54、57、61、76、79、82、85、88、91、99、106、113、116、133或136中任一个所示的VH氨基酸序列的VH氨基酸序列。
12.根据权利要求4、6和11中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗原结合结构域包含选自如SEQ ID NO:39、64、119、124或130中任一个所示的VL氨基酸序列的VL氨基酸序列。
13.根据权利要求4或6的抗体构建体，其中所述抗原结合结构域包含：
(i)如SEQ ID NO:19中所示的VH氨基酸和如SEQ ID NO:39中所示的VL氨基酸序列，或
(ii)如SEQ ID NO:50中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(iii)如SEQ ID NO:54中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(iv)如SEQ ID NO:57中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(v)如SEQ ID NO:61中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(vi)如SEQ ID NO:76中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(vii)如SEQ ID NO:79中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(viii)如SEQ ID NO:82中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(ix)如SEQ ID NO:85中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(x)如SEQ ID NO:88中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(xi)如SEQ ID NO:91中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:124中所示的VL氨基酸序列，或
(xii)如SEQ ID NO:99中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:130中所示的VL氨基酸序列，或
(xiii)如SEQ ID NO:106中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列，或
(xiv)如SEQ ID NO:106中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:119中所示的VL氨基酸序列，或
(xv)如SEQ ID NO:106中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:130中所示的VL氨基酸序列，或
(xvi)如SEQ ID NO:113中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:130中所示的VL氨基酸序列，或
(xvii)如SEQ ID NO:116中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:119中所示的VL氨基酸序列，或
(xviii)如SEQ ID NO:116中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:130中所示的VL氨基酸序列，或
(xix)如SEQ ID NO:133中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:130中所示的VL氨基酸序列，或
(xx)如SEQ ID NO:136中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:130中所示的VL氨基酸序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体构建体，其还包含支架，其中所述抗原结合结构域可操作地连接至所述支架。
15.根据权利要求14所述的抗体构建体，其中所述支架包含IgG Fc区。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体构建体，其中所述抗体构建体还包含第二抗原结合结构域。
17.根据权利要求16所述的抗体构建体，其中所述第二抗原结合结构域特异性结合hFRα。
18.根据权利要求16所述的抗体构建体，其中所述第二抗原结合结构域结合除hFRα以外的抗原。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的抗体构建体，其还包含一个或多个附加抗原结合结构域。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的抗体构建体，其还包含支架，其中至少一个抗原结合结构域可操作地连接至所述支架。
21.根据权利要求20所述的抗体构建体，其中所述支架包含IgG Fc区。
22.一种包含可操作地连接至IgG Fc区的两个抗原结合结构域的抗体构建体，其中所述抗原结合结构域中的每一个均特异性结合人叶酸受体α(hFRα)并且包含：
(a)如SEQ ID NO:39中所示的VL氨基酸序列和如SEQ ID NO:19中所示的VH氨基酸序列；或
(b)如SEQ ID NO:124中所示的VL氨基酸序列和如SEQ ID NO:91中所示的VH氨基酸序列；或
(c)如SEQ ID NO:64中所示的VL氨基酸序列和
(i)如SEQ ID NO:50中所示的VH氨基酸序列，或
(ii)如SEQ ID NO:54中所示的VH氨基酸序列，或
(iii)如SEQ ID NO:57中所示的VH氨基酸序列，或
(iv)如SEQ ID NO:61中所示的VH氨基酸序列，或
(v)如SEQ ID NO:76中所示的VH氨基酸序列，或
(vi)如SEQ ID NO:79中所示的VH氨基酸序列，或
(vii)如SEQ ID NO:82中所示的VH氨基酸序列，或
(viii)如SEQ ID NO:85中所示的VH氨基酸序列，或
(ix)如SEQ ID NO:88中所示的VH氨基酸序列，或
(x)如SEQ ID NO:106中所示的VH氨基酸序列；或
(d)如SEQ ID NO:130中所示的VL氨基酸序列和
(i)如SEQ ID NO:99中所示的VH氨基酸序列，或
(ii)如SEQ ID NO:106中所示的VH氨基酸序列，或
(iii)如SEQ ID NO:113中所示的VH氨基酸序列，或
(iv)如SEQ ID NO:116中所示的VH氨基酸序列，或
(v)如SEQ ID NO:133中所示的VH氨基酸序列，或
(vi)如SEQ ID NO:136中所示的VH氨基酸序列；或
(e)如SEQ ID NO:119中所示的VL氨基酸序列和
(i)如SEQ ID NO:106中所示的VH氨基酸序列，或
(ii)如SEQ ID NO:116中所示的VH氨基酸序列。
23.一种多核苷酸或一组多核苷酸，其编码根据权利要求1至22中任一项所述的抗体构建体。
24.一种表达载体或一组表达载体，其包含根据权利要求23所述的多核苷酸或一组多核苷酸。
25.一种宿主细胞，其包含根据权利要求24所述的表达载体或一组表达载体。
26.一种抗体-药物缀合物，其包含与一个或多个药物部分缀合的根据权利要求1至22中任一项所述的抗体构建体。
27.根据权利要求26所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体缀合物与1至约8个药物部分缀合。
28.一种具有通式I的抗体-药物缀合物：
A-(L-(D)m)n (I)
其中：
A是根据权利要求1至22中任一项所述的抗体构建体；
L是接头；
D是药物部分；
m介于1和约8之间，并且
n为1和约12。
29.根据权利要求28所述的抗体-药物缀合物，其中m为1或2。
30.根据权利要求28或29所述的抗体-药物缀合物，其中n介于约2和约8之间。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述药物部分是美登木素生物碱、美登木素生物碱类似物、苯二氮、吡咯并苯二氮、倍癌霉素、卡奇霉素、卡奇霉素类似物、奥瑞他汀、奥瑞他汀类似物、哈米特林、哈米特林类似物、微管溶素、微管溶素类似物、鹅膏毒素、鹅膏毒素类似物、喜树碱、喜树碱类似物、艾日布林、TLR激动剂或STING激动剂。
32.根据权利要求26至30中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述药物部分是奥瑞他汀、奥瑞他汀类似物、哈米特林、哈米特林类似物、喜树碱、喜树碱类似物或艾日布林。
33.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至22中任一项所述的抗体构建体和药学上可接受的载剂或稀释剂。
34.一种药物组合物，其包含根据权利要求26至32中任一项所述的抗体-药物缀合物和药学上可接受的载剂或稀释剂。
35.根据权利要求1至22中任一项所述的抗体构建体，其用于疗法。
36.根据权利要求35所述使用的抗体构建体，其中所述疗法包括癌症的治疗。
37.根据权利要求26至32中任一项所述的抗体-药物缀合物，其用于疗法。
38.根据权利要求37所述使用的抗体-药物缀合物，其中所述疗法包括癌症的治疗。
39.根据权利要求1至22中任一项所述的抗体构建体在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
40.根据权利要求26至32中任一项所述的抗体-药物缀合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
41.一种抑制FRα阳性肿瘤细胞生长的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求1至22中任一项所述的抗体构建体接触。
42.一种抑制FRα阳性肿瘤细胞生长的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求26至32中任一项所述的抗体-药物缀合物接触。
43.一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至22中任一项所述的抗体构建体。
44.一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求26至32中任一项所述的抗体-药物缀合物。
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