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KR20190122739A - 컨쥬게이션을 위한 시스테인 변이된 항체 - Google Patents

컨쥬게이션을 위한 시스테인 변이된 항체 Download PDF

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KR20190122739A
KR20190122739A KR1020197027963A KR20197027963A KR20190122739A KR 20190122739 A KR20190122739 A KR 20190122739A KR 1020197027963 A KR1020197027963 A KR 1020197027963A KR 20197027963 A KR20197027963 A KR 20197027963A KR 20190122739 A KR20190122739 A KR 20190122739A
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앤드류 와이트
크리스 레이스케
트래비스 비에첼
장고 서스만
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조슬린 레이스케
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시애틀 지네틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 EU 넘버링 위치 295번에서 및 임의적으로, EU 넘버링 위치 239번에서 시스테인을 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 제공한다. 이들 시스테인 잔기는 약물 또는 라벨에의 컨쥬게이션을 위한 부위를 제공한다. 둘 모두의 시스테인이 정상적인 헤테로다이머 항체 포맷에 존재하는 경우, 항체 분자 당 4개의 이러한 부위가 존재하며, 이는 항체의 1개 분자 대 4개 약물 또는 라벨의 화학양론을 허용한다. 위치 239번에 시스테인이 있거나 없이 위치 295번에서의 시스테인의 선택은 발현 용이성, 안정성 및 세포독성으로 인해 많은 다른 위치에서의 시스테인 대비 유리하다.

Description

컨쥬게이션을 위한 시스테인 변이된 항체
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2017년 2월 28일 출원된 62/465,129 및 2017년 9월 20일 출원된 62/561,151의 이익을 주장하며, 이들 각각은 모든 목적에 있어서 그 전체가 참조로 통합된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 참조로 통합된 2018년 2월 20일자로 작성된 59 kbyte의 508682-ST25로 명명된 txt 서열 목록을 포함한다.
배경
항체의 중쇄 불변 영역은 다양한 효과를 얻기 위해 수 많은 돌연변이를 일으켜왔다. 이러한 효과로는 이펙터 기능의 증가 또는 감소, 안정성 또는 반감기의 증가 또는 감소, 번역후 변형의 증가 또는 감소, 및 컨쥬게이션을 위한 부위 제공을 포함한다. S239C는 컨쥬게이션을 위한 부위로서 설명되어 왔지만, 이 자체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 항체에서 약물의 단지 2개 분자의 로딩을 허용한다. 컨쥬게이션을 위한 다른 부위는 컨쥬게이션 시약에의 접근성, 항체의 발현 및 글리코실화 패턴, 및 항체 약물 컨쥬게이트의 저장 안정성, 생체내 반감기 및 세포 독성에 따라 적합성이 다를 수 있다.
청구된 발명의 개요
본 발명은 EU 넘버링 위치 295번이 시스테인에 의해 점유되는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 융합 단백질을 제공한다. 임의적으로, 항체 또는 융합 단백질은 위치 295번의 시스테인을 통해 약물 또는 라벨에 컨쥬게이션된다. 임의적으로, EU 넘버링 위치 239번이 시스테인에 의해 점유된다. 임의적으로, 항체 또는 융합 단백질은 위치 295번 및 239번의 시스테인을 통해 약물 또는 라벨에 컨쥬게이션된다.
또 다른 구체예에서, 항체 또는 융합 단백질은 EU 넘버링 위치 294번의 시스테인을 통해 약물 또는 라벨에 컨쥬게이션된다. 임의적으로, EU 넘버링 위치 239번은 시스테인에 의해 점유된다.
본 발명은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 헤테로다이머로서의 항체를 추가로 제공하며, 여기에서 항체 중 하나의 분자는 두 중쇄 모두에서 위치 295번 및 239번의 시스테인에의 컨쥬게이션을 통해 약물의 4개 분자에 컨쥬게이션된다. 임의적으로, 불변 영역은 아이소형을 가지며, 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다.
본 발명은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 헤테로다이머로서의 항체를 추가로 제공하며, 여기에서 항체 중 하나의 분자는 두 중쇄 모두에서 위치 294번 및 239번의 시스테인에의 컨쥬게이션을 통해 약물의 4개 분자에 컨쥬게이션된다. 임의적으로, 불변 영역은 아이소형을 가지며, 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다.
일부 항체 또는 융합 단백질에서, 약물은 투불리신이다. 임의적으로, 약물은 약물은 글루쿠로니드 링커를 통해 항체에 컨쥬게이션된다. 임의적으로, 항체는 투불리신 및 글루쿠로니드 링커를 제공하는 하기 도시된 구조를 갖는 화합물에 컨쥬게이션된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
임의적으로, 약물은 MMAE, MMAF 또는 마이너 그루브 결합제, 또는 PBD이다. 임의적으로, C-말단 리신이 부재할 수 있는 경우, 중쇄 불변 영역은 SEQ ID NO. 5-12 중 임의의 서열을 갖는다.
임의적으로, 항체 또는 융합 단백질은 절단가능한 링커를 통해 약물에 컨쥬게이션된다.
본 발명은 상기 기술된 바와 같은 항체 또는 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 EU 넘버링 위치 239번이 시스테인에 의해 점유되는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 융합 단백질을 추가로 제공하며, 상기 시스테인은 투불리신 M에 컨쥬게이션된다.
본 발명은 EU 넘버링 위치 239번 및 295번이 시스테인에 의해 점유되는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 융합 단백질을 제공하는 방법을 추가로 제공한다. 방법은 항체 또는 융합 단백질을 인코딩하도록 조작된 세포를 배양하는 단계로서, 상기 항체 또는 융합 단백질이 발현되는 단계; 및 항체 또는 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함한다. 임의적으로, 방법은 위치 239번 및 295번의 시스테인을 통해 약물에 항체 또는 융합 단백질을 컨쥬게이션시키는 것을 추가로 포함한다. 임의적으로, 방법은 위치 239번 및 295번의 시스테인 사이에 디설파이드 결합의 형성을 억제하는 환원제와 항체를 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 임의적으로, 항체 또는 융합 단백질은 항체 또는 융합 단백질이 배양되는 배지에서 환원제를 포함시킴로써 환원제와 접촉된다. 임의적으로, 환원제는 디티오트레이톨, 베타-메르캅토에탄올 또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀이다. 임의적으로, 환원제는 0.1 내지 2 mM 농도의 디티오트레이톨이다.
도 1은 돌연변이 부위 및 글리칸 사슬의 상대적 위치를 예시하는 항체 구조의 모델을 보여준다.
도 2는 돌연변이의 도입이 변경된 글리칸 분포를 발생시킴을 보여준다.
도 3은 7일 동안 래트 혈장에 vcMMAE ADC를 처리한 후 말레이미드 안정성을 보여준다.
도 4는 7일 동안 래트 혈장에 투불리신 ADC를 처리한 후의 투불리신 안정성을 보여준다.
도 5는 노출 후 2개 돌연변이 부위에서 컨쥬게이션된 투불리신 ADC로 7일 동안 래트 혈장을 처리한 후의 투불리신 안정성을 보여준다.
도 6은 또한, 투불리신 안정성을 보여준다.
도 7은 이중 돌연변이를 갖는 ADC로 래트 혈장을 처리한 후의 세포독성의 차이를 보여준다.
도 8 및 9는 종양 이종이식 모델에서 다양한 항체 약물 컨쥬게이트를 비교한다.
도 10a는 전형적인 IgG1 글리코실화 패턴이며, 도 10b는 S239C 돌연변이 글리코실화 패턴이며, 도 10c는 Q295C 글리코실화 패턴이며, 도 10d는 S239C/Q295C 이중 돌연변이 글리코실화 패턴이다.
도 11: (상단) S239C/Q295C 돌연변이를 갖는 안정한 발현 mAb에 대한 글리코실화 패턴 (하단) S239C/Q295C 돌연변이를 갖는 일과성 발현 mAb.
도 12: (상단) S239C/E294C 변이체 mAb, (중간) S239C/Q295C 변이체 mAb 및 (하단) 야생형 글리칸의 글리칸 패턴의 PLRP-MS 분석.
도 13: 모 mAb에서 함께 공유적으로 결합된 H16 (S239C) (SEQ ID NO:21) 및 H19 (Q295C) (SEQ ID NO:22)를 보여주는 비-환원된 펩티드 맵.
도 14: S239C/Q295C 변이체를 이용하여 생성된 글리칸 및 세포 배지에서 다양한 DTT 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP) 농도를 비교하는 안정한 발현 데이터.
도 15: 유지된 1.2 mM 디티오트레이톨(DTT)에서 배양할 경우 일시적으로 발현된 S239C/Q295C 변이체의 글리칸 분석.
정의
분리된 항체 또는 ADC는 전형적으로 이의 생성 또는 정제로부터 발생하는 간섭 단백질 및 기타 오염물질의 적어도 50% w/w 순도이나, 항체가 과량의 약학적으로 허용되는 담체(들) 또는 이의 사용을 촉진시키기 위해 의도된 기타 비히클과 조합될 가능성을 배제하지 않는다. 때때로 항체 또는 ADC는 생성 또는 정제로부터의 간섭 단백질 및 오염물질의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95 또는 99% w/w 순도이다.
항체 단독 또는 ADC의 구성요소로서 이의 표적 항원에 대한 특이적 결합은 적어도 106, 107, 108, 109 또는 1010 M-1의 친화성을 의미한다. 특이적 결합은 크기에 있어서 검출가능하게 더 높으며, 적어도 하나의 비관련된 표적에 대해 발생하는 비-특이적 결합으로부터 구별가능하다. 특이적 결합은 특정 기능성 그룹 또는 특정 공간적 피트(fit)(예를 들어, 잠금 및 키(key) 유형) 사이의 결합 형성의 결과일 수 있는 반면, 비특이적 결합은 일반적으로 반 데르 발스 힘의 결과이다. 그러나, 특이적 결합은 모노클로날 항체가 하나 및 단지 하나의 표적에 결합한다는 것을 반드시 내포하지는 않는다.
기본 항체 구조 유닛은 서브유닛의 테트라머이다. 각 테트라머는 2개 쌍의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 각 쌍은 하나의 "경" 쇄(약 25 kDa) 및 하나의 "중" 쇄(약 50-70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노-말단부는 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 이러한 가변 영역은 초기에는 절단가능한 신호 펩티드에 연결되어 발현된다. 신호 펩티드가 없는 가변 영역은 종종 성숙 가변 영역으로서 불린다. 따라서, 예를 들어, 경쇄 성숙 가변 영역은 경쇄 신호 펩티드가 없는 경쇄 가변 영역이다. 각 사슬의 카르복시-말단 부분은 불변 영역을 규정한다. 중쇄 불변 영역은 이펙터 기능을 주로 담당한다.
경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되며, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서의 항체 아이소형을 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 합쳐지며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. (일반적으로 문헌 [Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7] 참조 (모든 목적에 있어서 이의 전문이 참조로 통합됨)).
각 경쇄/중쇄 쌍의 성숙 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 온전한 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이작용성 또는 이중특이적 항체 이외에, 두 결합 부위는 동일하다. 사슬 모두는 상보성 결정 영역 또는 CDR로 또한 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 합쳐진 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반적 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2개 사슬로부터의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 정렬되어, 특이적 에피토프에의 결합을 가능하게 한다. N-말단으로부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 둘 모두는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 배치는 카바트(Kabat)의 정의(Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)); 또는 문헌 [Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]; [Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)]에 따른다. 또한, 카바트는 상이한 중쇄 사이 또는 상이한 경쇄 사이의 상응하는 잔기가 동일한 번호로 정렬되는 널리 사용되는 넘버링 규칙(카바트 넘버링)을 제공한다.
용어 "항체"는 온전한 항체 및 이의 결합 단편을 포함한다. 전형적으로, 항체 단편은 이들이 별도의 중쇄, 경쇄 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, 디아바디, Dab, 나노바디 및 Fv를 포함하는 표적에의 특이적 결합에 대해 유도되는 온전한 항체와 경쟁한다. 단편은 재조합 DNA 기법에 의해 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분리에 의해 생성될 수 있다. 용어 "항체"는 또한 디아바디(호모다이머 Fv 단편) 또는 미니바디(VL-VH-CH3), 이중특이적 항체 또는 기타 등등을 포함한다. 이중특이적 또는 이작용성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 지닌 인공 하이브리드 항체이다(예를 들어, 문헌 [Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)] 참조). 용어 "항체"는 항체 그 자체(네이키드 항체) 또는 세포독성 또는 세포증식억제 약물에 컨쥬게이션된 항체를 포함한다.
용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 부위를 나타낸다. 에피토프는 하나 이상의 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 연속 아미노산 또는 비연속 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 변성 용매에 노출시 전형적으로 보유되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매로의 처리시 전형적으로 손실된다. 에피토프는 고유의 공간 입체형태에서 전형적으로 적어도 3개, 더욱 일반적으로, 적어도 5개 또는 8-10개 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 입체형태를 결정하는 방법은 예를 들어, x-선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)] 참조.
용어 "환자"는 예방학적 또는 치료학적 치료를 받는 인간 및 기타 포유동물 대상체를 포함한다.
보존적 또는 비보전적으로 아미노산 치환을 분류하는 목적에 있어서, 아미노산은 하기와 같이 그룹화된다: 그룹 I (소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; 그룹 II (중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III (산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV (염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V (사슬 방향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI (방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 부류의 아미노산 간의 치환을 포함한다. 비-보존적 치환은 이들 부류 중 한 부류의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환하는 것으로 이루어진다.
서열 동일성 백분율은 최대로 정렬된 서열을 이용하여 결정된다.
서열 동일성은 Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)에서 BESTFIT, FASTA 및 TFASTA와 같은 알고리즘을 사용하거나 디폴트 갭 파라미터(default gap parameter)를 사용하거나, 검토 및 최상의 정렬(즉, 비교 창에서 서열 유사성의 가장 높은 백분율을 유도함)에 의해 서열을 정렬시킴으로써 결정될 수 있다. 서열 동일성의 백분율은 비교 창에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 두 서열 모두에서 동일한 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교 창(즉, 창 크기)에서 갭을 계수하지 않은 매칭되지 않은 위치 및 매칭된 위치의 총수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 항체 서열은 동일한 번호의 위치를 차지하는 잔기가 정렬되도록 카바트 넘버링 관례에 의해 정렬한다. 대상 서열을 기준 서열과 비교하는 경우, 이를 정렬시킨 후, 대상 서열과 기준 서열 간의 서열 동일성 백분율은 대상 서열과 기준 서열 둘 모두에서 동일한 아미노산이 차지하는 위치의 수를 갭은 계수하지 않은 두 영역의 정렬된 위치의 총 수로 나누고, 100을 곱하여 백분율로 변환시킨 것이다.
하나 이상의 언급된 요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체를 포함하는 조성물은 단독의 또는 다른 성분과 조합된 항체를 함유할 수 있다.
값 범위의 지정은 범위 내의 또는 범위를 규정하는 모든 정수를 포함한다.
항체 이펙터 기능은 Ig의 Fc 도메인(들)으로 인한 기능을 지칭한다. 예를 들어, 이러한 기능은 항체-의존적 세포 세포독성, 항체-의존적 세포 포식작용 또는 보체-의존적 세포독성일 수 있다. 이러한 기능은 예를 들어, 식세포 활성 또는 용해 활성을 갖는 면역 세포 상의 Fc 수용체에 대한 Fc 이펙터 도메인(들)의 결합에 의해 또는 보체 시스템의 구성요소에 대한 Fc 이펙터 도메인(들)의 결합에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로, Fc-결합 세포 또는 보체 구성요소에 의해 매개된 효과(들)는 표적화된 세포의 억제 및/또는 고갈을 발생시킨다. 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체(FcR)-발현 세포를 모집하여 이들을 항체-코팅된 표적 세포와 병치시킬 수 있다. FcγRIII (CD16), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD64)를 포함하는 IgG에 대한 표면 FcR을 발현하는 세포는 IgG-코팅된 세포의 파괴를 위한 이펙터 세포로서 작용할 수 있다. 이러한 이펙터 세포는 단핵 세포, 대식세포, 자연 살해 (NK) 세포, 호중구 및 호산구를 포함한다. IgG에 의한 FcγR의 맞물림은 항체-의존성 세포 독성(ADCC) 또는 항체-의존성 세포 포식작용(ADCP)을 활성화시킨다. ADCC는 막 기공-형성 단백질 및 프로테아제의 분비를 통해 CD16+ 이펙터 세포에 의해 매개되는 반면, 포식작용은 CD32+ 및 CD64+ 이펙터 세포에 의해 매개된다(문헌 [Fundamental Immunology, 4th ed., Paul ed., Lippincott-Raven, N.Y., 1997, Chapters 3, 17 and 30; Uchida et al., 2004, J. Exp. Med. 199:1659-69; Akewanlop et al., 2001, Cancer Res. 61:4061-65; Watanabe et al., 1999, Breast Cancer Res. Treat. 53:199-207] 참조). ADCC 및 ADCP 외에도, 세포-결합 항체의 Fc 영역은 또한, 보체-의존적 세포독성(CDC)을 유도하기 위해 보체 고전 경로를 활성화시킬 수 있다. 보체 시스템의 C1q는 항원과 복합체를 형성할 때 항체의 Fc 영역에 결합한다. 세포-결합 항체에 대한 C1q의 결합은 C4 및 C2의 프로테아제 활성화와 관련된 일련의 사건을 개시하여 C3 전환효소를 생성할 수 있다. C3 전환효소에 의한 C3에서 C3b로의 절단은 C5b, C6, C7, C8 및 C9를 포함하는 말단 보체 구성요소의 활성화를 가능하게 한다. 종합적으로, 이들 단백질은 항체-코팅된 세포 상에 막-공격 복합체 기공을 형성한다. 이러한 기공은 세포 막 온전성을 파괴하여 표적 세포를 치사시킨다(문헌 [Immunobiology, 6th ed., Janeway et al., Garland Science, N. Y., 2005, Chapter 2] 참조).
"세포독성 효과"는 표적 세포의 고갈, 제거 및/또는 치사를 나타난다. "세포독성 제제"는 세포에 세포독성 효과를 갖는 제제를 나타낸다. 세포독성 제제는 항체에 컨쥬게이션될 수 있거나 항체와 조합되어 투여될 수 있다.
"세포증식억제 효과"는 세포 증식의 억제를 나타낸다. "세포증식 억제제"는 세포에 대한 세포증식억제 효과를 가져 세포의 특정 서브셋(subset)의 성장 및/또는 확장을 억제하는 제제를 지칭한다. 세포증식 억제제는 항체에 컨쥬게이션될 수 있거나 항체와 조합되어 투여될 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는"은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 승인가능하거나, 미국 약전 또는 동물 및 더욱 특히, 인간에 사용하기 위한 기타 일반적으로 인식된 약전에 기록됨을 의미한다. 용어 "약학적으로 양립가능한 성분"은 항체 또는 ADC와 조합되는 약학적으로 허용되는 희석제, 애쥬번트, 부형제 또는 비히클을 나타낸다.
문구 "약학적으로 허용되는 염"은 항체 또는 이의 컨쥬게이트 또는 항체와 투여되는 제제의 약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 염을 나타낸다. 예시적인 염은 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 니트레이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p 톨루엔설포네이트, 및 파모에이트(즉, 1,1' 메틸렌 비스-(2 하이드록시 3 나프토에이트)) 염을 포함한다. 약학적으로 허용되는 염은 또 다른 분자, 예컨대, 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 기타 반대이온의 내포를 포함할 수 있다. 반대이온은 모화합물 상의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 또한, 약학적으로 허용되는 염은 이의 구조에서 하나 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자가 약학적으로 허용되는 염의 일부인 경우는 다수의 반대 이온을 가질 수 있다. 따라서, 약학적으로 허용되는 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대이온을 가질 수 있다.
문맥으로부터 달리 명확해지지 않는 한, 용어 "약"은 명시된 값의 표준 편차 내 값을 포함한다.
인간화된 항체는 비-인간 "도너" 항체로부터의 CDR이 인간 "억셉터" 항체 서열에 이식된 유전적으로 조작된 항체이다(예를 들어, Queen, 미국 특허 번호 5,530,101 및 5,585,089; Winter, 미국 특허 번호 5,225,539, Carter, 미국 특허 번호 6,407,213, Adair, 미국 특허 번호 5,859,205 6,881,557, Foote, 미국 특허 번호 6,881,557 참조). 억셉터 항체 서열은 예를 들어, 성숙한 인간 항체 서열, 그러한 서열의 복합체, 인간 항체 서열의 컨센서스 서열, 또는 생식세포 영역 서열일 수 있다. 따라서, 인간화된 항체는 전체적으로 또는 실질적으로 도너 항체로부터 바람직하게는, 카바트에 의해 규정된 바와 같은 이의 CDR, 및 전체적으로 또는 실질적으로 인간 항체 서열로부터의 가변 영역 프레임워크 서열 및 존재하는 경우, 불변 영역을 갖는 항체이다. 나노바디 및 dAb를 제외한 인간화된 항체는 인간화된 중쇄 및 인간화된 경쇄를 포함한다. 인간화된 항체의 CDR은 (카바트에 의해 규정된 바와 같은) 상응하는 잔기의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 각각의 CDR 간에 동일할 때, 비-인간 항체의 상응하는 CDR로부터 실질적으로 비롯된다. 항체 사슬의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체 사슬의 불변 영역은 카바트에 의해 규정된 상응하는 잔기의 적어도 85, 90, 95 또는 100%가 동일할 경우, 실질적으로 각각 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역으로부터 비롯된다.
키메라 항체는 비-인간 항체(예를 들어, 마우스)의 경쇄 및 중쇄의 성숙 가변 영역이 인간 또는 비인간 영장류 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 조합된 항체이다. 이러한 항체는 마우스 항체의 결합 특이성을 실질적으로 또는 전체적으로 유지하며, 약 2/3 인간 또는 비-인간 영장류 서열이다.
베니어드(veneered) 항체는 비-인간 항체의 비-인간 가변 영역 프레임워크 잔기의 일부 및 CDR의 일부 및 일반적으로 전부를 보유하나, B- 또는 T-세포 에피토프에 기여할 수 있는 기타 가변 영역 프레임워크 잔기, 예를 들어, 노출된 잔기(Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991)는 인간 항체 서열의 상응하는 위치로부터의 잔기로 대체된 인간화된 항체의 유형이다. 결과는 CDR이 비-인간 항체로부터 전체적으로 또는 실질적으로 비롯되고, 비-인간 항체의 가변 영역 프레임워크는 치환에 의해 보다 인간과 유사하게 된 항체이다.
항체-약물 컨쥬게이트(ADC)는 약물에 컨쥬게이션된 항체를 포함한다. 약물은 약리학적 활성, 일반적으로 세포독성 또는 세포증식억제 활성을 갖는 것으로 알려지거나 의심되는 화합물이다.
항체 약물 컨쥬게이트의 항체 성분이 239번 및/또는 295번 위치 또는 239번 및/또는 294번 위치에서 시스테인을 포함한다고 하는 경우, 그 의미는 항체가 컨쥬게이트에서 약물에의 컨쥬게이션 전에 시스테인을 포함한다는 것이다. 컨쥬게이트에서, 시스테인은 이의 설프히드릴 기의 약물 또는 링커로의 결합을 통해 유도체화된다.
항체가 약물에 컨쥬게이션된다고 할때, 연결은 하나 이상의 연결 모이어티를 통해 간접적일 수 있거나 직접적일 수 있다.
상세한 설명
I. 일반적 사항
본 발명은 EU 넘버링 위치 294번 또는 295번에서 및 임의적으로, EU 넘버링 위치 239번에서 시스테인을 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 제공한다. 이들 시스테인 잔기는 약물 또는 라벨로의 컨쥬게이션을 위한 부위를 제공한다. 2개의 시스테인이 정상적인 헤테로다이머 항체 포맷에서 중쇄 당 존재하는 경우, 항체 분자 당 4개의 이러한 부위가 존재하며, 이는 항체의 1개 분자 대 4개의 약물 또는 라벨의 화학양론을 허용한다. 위치 239번에서 시스테인이 있거나 없이 위치 294번 또는 295번에서의 시스테인의 선택은 발현 용이성, 안정성 및 세포독성으로 인해 많은 다른 위치에서의 시스테인 대비 유리하다. 본 발명은 또한, 투불리신 M에 컨쥬게이션된 EU 넘버링 위치 295번에서 시스테인을 포함하는 변형된 중쇄 불변 영역을 제공한다.
239번, 294번 및 295번 위치에서의 시스테인은 PBD 또는 투불리신과 같은 소수성 약물로의 컨주게이션에 특히 유리하다. 본 발명의 실시가 메카니즘의 이해에 의존적이지 않지만, 그러한 컨쥬게이션 부위에 근접한 글리코실화는 이들의 안정성 및 반감기를 증가시키는 소수성 모이어티를 차폐시키는 것으로 여겨진다.
II. 중쇄 불변 영역
인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 예시적인 야생형 서열은 SEQ ID NO. 1-4로서 제공된다. 본 발명의 바람직한 불변 영역은 SEQ ID NO. 1, 2, 3 또는 4의 서열을 가지며, 단 295번 위치는 시스테인에 의해 점유되거나(각각 SEQ ID NO. 5-8), 295번 위치 및 239번 위치는 시스테인에 의해 점유된다(각각 SEQ ID NO. 9-12). 본 발명의 다른 바람직한 불변 영역은 SEQ ID NO: 1, 2, 3 또는 4의 서열을 가지며, 단 294번 위치는 시스테인에 의해 점유되거나(각각 SEQ ID NO: 13-16), 294번 및 239번 위치는 시스테인에 의해 점유된다(각각 SEQ ID NO. 17-20).
불변 영역은 CH1 도메인이 상위 힌지 영역으로서 전체가 누락될 수 있다는 점을 제외하고는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 치환, 결실 또는 내부 삽입에 의해 설계된 아이소형과 상이한 경우, 설계된 아이소형으로 간주된다. 설계된 SEQ ID NO.로부터의 변형은 하나 또는 수개의 천연 동종형 또는 동종이형 변형으로서, 보체-매개된 세포독성 또는 ADCC와 같은 이펙터 기능을 증가시키거나 감소시키거나(예를 들어, 문헌 [Winter et al., US Patent No. 5,624,821; Tso et al., US Patent No. 5,834,597; and Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006] 참조), 인간에서 반감기를 연장시키는 변형(예를 들어, 문헌 [Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004] 참조)을 나타낼 수 있으며, 이에 대한 예시적인 치환은 250번 위치의 Gln 및/또는 428번 위치의 Leu를 포함한다(EU 넘버링). 다른 변형은 N-X-S/T 모티프에서 N-연결된 글리코실화와 같은 번역 후 변형의 부위를 추가하거나 제거할 수 있다. 변형은 또한, 이중특이적 항체의 생성을 위한 상이한 중쇄 사이의 헤테로다이머의 형성을 촉진하기 위해 놉(knob)(즉, 하나 이상의 아미노산의 더 큰 아미노산으로의 대체) 또는 홀(즉, 하나 이상의 아미노산의 더 작은 아미노산으로의 대체)의 도입을 포함할 수 있다. 놉 및 홀 쌍을 형성하는 예시적인 치환은 각각 T336Y 및 Y407T이다(Ridgeway et al., Protein Engineering vol.9 no.7 pp.617-621, 1996). 불변 영역의 C-말단, 특히, 중쇄 상의 C-말단 리신으로부터의 하나 이상의 잔기는 번역후 변형의 결과로서 손실될 수 있다.
변형된 불변 영역 및 이러한 불변 영역이 혼입된 항체 또는 융합 단백질은 바람직하게는, 발현의 용이성, 안정성, 감소된 글리코실화, 컨쥬게이션에 대한 접근성, 및 실질적으로 변화되지 않은 이펙터 기능 및 항원에 대한 친화성을 특징으로 한다. 즉, 결합 친화성은 아이소형-매칭된 야생형 불변 영역을 갖는 적합한 대조군 항체 중 적어도 2 또는 3 배수 내에서 또는 실험 오차 내에서 전형적으로 동일하다. 이펙터 기능의 경우도 동일하다.
아이소형 매칭된 대조군과 비교하여 변형된 불변 영역 또는 변형된 불변 영역이 혼입된 항체 또는 융합 단백질의 면역원성은 투여된 항체에 대한 반응 항체의 발생을 집단 간에 비교함으로써 생체내에서 또는 유발시 T-세포 증식 또는 수상돌기 성숙으로부터 시험관내에서 평가될 수 있다(Gaitonde et al., Methods Mol. Biol. 2011;716:267-80). 변형된 불변 영역 또는 변형된 불변 영역이 혼입된 항체 또는 융합 단백질의 면역원성은 바람직하게는, 아이소형 매칭된 대조군과 현저하게 상이하지 않거나, 아이소형 매칭된 대조군보다 2, 3 또는 5배 초과로 악화되지 않는다.
III. 항체 및 융합 단백질
상기 기술된 변형된 중쇄 불변 영역은 항체 또는 융합 단백질 내로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 이가의 단일특이적 항체의 발현에 있어서, 변형된 중쇄 불변 영역은 중쇄 가변 영역에 융합되어 경쇄 가변 영역과 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄와 함께 발현된다. 중쇄 및 경쇄는 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 CH1 영역을 통해 서로 결합하여 헤테로다이머를 형성한다. 그 후, 2개의 헤테로다이머는 통상적인 항체의 경우에서와 같이 IgG 중쇄의 힌지, CH2 및 CH3 영역의 회합에 의해 짝을 지어 테트라머 유닛을 형성한다. 이중특이적 항체의 발현에 있어서, 변형된 중쇄 불변 영역은 상이한 표적 특이성의 2개의 중쇄 가변 영역 각각에 융합되어 발현된다. 중쇄는 공동-발현된 경쇄와 각각 어셈블리되고, 중쇄-경쇄 복합체는 두개 모두의 중쇄가 존재하는 헤테로다이머를 형성한다. 경쇄 가변 영역은 유닛 내에서 동일하거나(예를 들어, US 20100331527A1 참조) 상이할 수 있다.
변형된 불변 영역은 키메라, 인간화된, 베니어드(veneered) 또는 인간 항체를 포함하는 어떠한 유형의 조작된 항체에도 사용될 수 있다. 항체는 모노클로날 항체 또는 유전자 조작된 폴리클로날 항체 제조물일 수 있다(US 6,986,986 참조).
융합 단백질에 있어서, 이종성 폴리펩티드에 연결된 변형된 불변 영역이 발현된다. 융합 단백질에서 이종성 폴리펩티드는 면역글로불린 불변 영역에 자연적으로 연결되지 않는 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 전장 단백질 또는 이의 임의의 단편으로서, 전장 단백질에 의해 결합된 항원에 대한 특이적 결합을 보유하기에 충분한 길이의 단편일 수 있다. 예를 들어, 이종성 폴리펩티드는 수용체 세포외 도메인 또는 이에 대한 리간드일 수 있다. 이종성 폴리펩티드는 불변 영역의 N-말단에서 결합 영역을 제공하며, 때때로, 간단히 결합 영역으로 불린다. IgG CH1 영역은 융합 단백질에 대한 불변 영역에 전형적으로 포함되지 않는다. 힌지 영역 또는 이의 일부, 특히, 상위 힌지 영역은 때때로 생략되거나 합성 링커 펩티드에 의해 대체된다. 세포외 도메인이 본 발명의 변형된 중쇄 불변 영역과 조합될 수 있는 예시적인 수용체 단백질은 TNF-알파 수용체 ECD, LFA-3 ECD, CTLA-4 ECD, IL-1R1 ECD, TPO 모방체, VEGFR1 또는 VEGFR2 ECD를 포함한다.
IV. 항체 발현
항체 사슬 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 고체상 합성법, 중복되는 올리고뉴클레오티드 단편의 PCR 증폭 또는 존재하는 핵산의 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 제조될 수 있다. 이러한 핵산은 발현 벡터에서 발현된다. 벡터는 변형된 중쇄 불변 영역 및/또는 인간 경쇄 불변 영역을 인코딩하여 삽입된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 또는 이종성 폴리펩티드를 갖는 융합물로서 발현될 수 있도록 구성될 수 있다.
벡터에서 복제 기점 및 발현 조절 요소(프로모터, 인핸서, 신호 펩티드 및 기타 등등)는 다양한 세포 유형, 예컨대, 박테리아, 효모 또는 기타 진균, 곤충 세포 및 포유동물 세포에서 사용하기 위해 구성될 수 있다. 포유동물 세포가 본 발명의 항체 또는 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 세그먼트를 발현시키는데 바람직한 숙주이다(문헌 [Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)] 참조). 온전한 이종성 단백질을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 당업계에서 개발되었으며, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, HEK293 세포, L 세포 및 Sp2/0 및 NS0을 포함하는 비-항체-생성 골수종을 포함한다. 바람직하게는, 세포는 비인간 세포이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 융합 단백질은 모노클로날 세포주로부터 발현된다.
이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대, 복제 기점, 프로모터, 인핸서(Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), 및 필요한 처리 정보 부위 예컨대, 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 내인성 유전자, 사이토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마바이러스, 기타 등등으로부터 유래된 프로모터이다. 문헌 [Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)] 참조.
세포는 발현될 항체 또는 융합 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 벡터로 형질감염된다. 다중-사슬 항체에 있어서, 중쇄 및 경쇄는 동일한 또는 별도의 벡터에서 발현될 수 있다. 다중-특이적 복합체의 발현에 있어서, 복합체의 구성요소(즉, 상이한 항체 또는 융합 단백질)을 인코딩하는 DNA는 동일하거나 상이한 벡터에 존재할 수 있다.
항체 또는 융합 단백질 사슬은 발현되고, 신호 펩티드를 제거하도록 처리되고, 어셈블리되고, 숙주 세포로부터 분비된다. 항체 또는 융합 단백질은 통상적인 항체 정제 방법에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다. 하이브리드 불변 영역이 IgG 부분을 포함하는 경우, 정제는 친화성 시약으로서 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하는 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다. 통상적인 항체 정제 절차, 예컨대, 이온 교환 하이드록시아파타이트 크로마토그래프 또는 HPLC가 또한 사용될 수 있다(일반적으로, 문헌 [Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)] 참조).
일부 방법에서, 중쇄가 (a) 239번 및 (b) 294번 또는 295번 위치 둘 모두에서 시스테인을 포함하는 항체 또는 융합 단백질은 컨쥬게이션 전에 환원제로 처리되어 위치 239번 및 294번 또는 295번의 시스테인 사이에 디설파이드 결합, 특히, 분자내 디설파이드의 형성을 억제한다. 바람직하게는, 환원제는 항체 배양에 사용되는 배양 배지에 포함된다. 설프히드릴 결합을 보호하는데 적합한 환원제의 예는 디티오트레이톨, 베타메르캅토에탄올 또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 바람직한 환원제는 배양 배지에서 디티오트레이톨이다. 배양 배지에서 디티오트레이톨 또는 기타 환원제의 농도는 예를 들어, 0.1-5 mM, 또는 0.5-2.5 또는 0.9 내지 1.5 mM일 수 있다.
반대로, 환원제 없는 배지에서 배양되는 경우, 239번 및 294번 또는 295번 위치에서 시스테인을 갖는 항체 또는 융합 단백질은 GlcNac의 트리 및 테트라 안테나리 분지화 및/또는 하이퍼시알리화가 발생한다.
V. 항체 약물 컨쥬게이트
중쇄 불변 영역에 도힙된 시스테인 잔기는 약물로의 컨쥬게이션을 위한 부위, 특히, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)로서 세포독성 또는 세포증식 억제 모이어티를 제공한다. 네이키드 항체와 비교하여, ADC는 추가적인 메카니즘, 특히, 항체에 커플링된 독성 모이어티의 세포 내부로의 전달을 제공하며, 이에 의해 세포를 치사시키거나 그렇지 않으면 세포의 증식을 억제한다. 현재 4개의 ADC가 판매된다: 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin) (항-CD30 상표명: ADCETRIS®, Seattle Genetics and Millennium/Takeda에 의해 판매), 트라스투주맙 엠탄신(trastuzumab emtansine) (항-HER2, 상표명: Kadcyla®, Genentech and Roche에 의해 판매), 이노투주맙 오조가미신(inotuzumab ozogamicin) (항-CD22, 상표명: Besponsa, Pfizer에 의해 판매) 및 겜투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin) (항-CD33, 상표명: Mylotarg, Pfizer에 의해 판매). 많은 다른 ADC는 다양한 개발 단계에 있다.
약물을 항체에 컨쥬게이션시키기 위한 기법은 널리 공지되어 있다(예를 들어, Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Dekker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985); and Thorpe et al., 1982, Immunol . Rev. 62:119-58 참조. 또한, 예를 들어, WO 89/12624 참조).
시스테인은 자유 설피드릴기를 함유하며, 이는 아민보다 더욱 친핵성이며, 일반적으로 단백질에서 가장 반응성인 작용기이다. 대부분의 아민과는 달리, 설프히드릴은 일반적으로 중성 pH에서 반응성이며, 따라서, 아민의 존재하에 선택적으로 다른 분자에 커플링될 수 있다. 이러한 선택성은 설프히드릴 기를 커플링 항체에 대한 선택 링커로 만든다. 분자 항체 당 분자 약물의 평균 수는 종종 1, 2, 3 또는 4개이다.
약물은 (예를 들어, 가수분해, 항체 분해 또는 절단 제제에 의해) 항체로부터 절단되지 않는 한, 이의 활성을 감소시키는 방식으로 컨쥬게이션될 수 있다. 이러한 약물은 컨쥬게이트가 (예를 들어, 리소좀 환경에서 또는 카베올라(caveolear) 환경에서 pH 민감성 또는 프로테아제 민감성에 의해 또는 예를 들어, 엔도솜 환경에서) 표적 세포에 의해 내재화될 때 항체로부터 절단되도록 표적 세포의 세포내 환경에서는 절단에 민감하나 세포외 환경에서는 실질적으로 민감하지 않은 절단가능한 링커를 갖는 항체에 부착된다.
전형적으로, ADC는 약물과 항체 사이의 링커 영역을 포함한다. 링커는 링커의 절단이 세포내 환경에서 (예를 들어, 리소좀 또는 엔도솜 또는 카베올라 내에서) 항체로부터 약물을 방출시키도록 세포내 환경에서 절단가능할 수 있다. 링커는 예를 들어, 리소좀 또는 엔도솜 프로테아제를 포함하는 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단된 펩티딜 링커일 수 있다. 전형적으로, 펩티딜 링커는 적어도 2개의 아미노산 길이 또는 적어도 3개의 아미노산 길이이다. 절단 제제는 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Dubowchik and Walker, 1999, Pharm . Therapeutics 83:67-123] 참조). 표적 세포에 존재하는 효소에 의해 절단가능한 펩티딜 링커가 가장 전형적이다. 예를 들어, 암성 조직에서 고도로 발현되는 티올-의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단가능한 펩티딜 링커가 사용될 수 있다(예를 들어, Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 펩티드를 포함하는 링커). 기타 이러한 링커는 예를 들어, US 6,214,345에 기술되어 있다. 세포내 프로테아제에 의해 절단가능한 예시적인 펩티딜 링커는 Val-Cit 링커 또는 Phe-Lys 디펩티드를 포함한다 (예를 들어, Val-Cit 링커를 갖는 독소루비신의 합성을 기술하고 있는 US 6,214,345 참조). 약물의 세포내 프로테아제 방출을 이용하는 한 이점은 제제가 컨쥬게이션될 때 전형적으로 약화되며, 컨쥬게이트의 혈청 안정성이 전형적으로 높다는 점이다.
절단가능한 링커는 pH-민감성일 수 있으며, 즉, 특정 pH 값에서 가수분해에 민감하다. 전형적으로, pH-민감성 링커는 산성 조건하에서 가수분해가능하다. 예를 들어, 리소좀(예를 들어, 하이드라존, 세미카르바존, 티오세미카르바존, 시스-아코니틱 아미드, 오르토에스테르, 아세탈, 케탈, 또는 기타 등등)에서 가수분해 가능한 산-불안정성 링커가 사용될 수 있다. (예를 들어, US 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm . Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol . Chem . 264:14653-14661 참조). 이러한 링커는 중성 pH 조건, 예컨대, 혈액에서의 pH 조건하에서 비교적 안정적이나, pH 5.5 또는 5.0 미만, 대략 리소좀의 pH에서는 불안정하다. 이러한 가수분해가능한 링커의 한 예는 티오에테르 링커이다(예를 들어, 아실히드라존 결합을 통해 약물에 부착된 티오에테르(예를 들어, US 5,622,929 참조)).
기타 링커는 환원 조건에서 절단가능하다(예를 들어, 디설파이드 링커). 디설파이드 링커는 SATA (N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트), SPDP (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 및 SMPT (N-숙신이미딜-옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔)를 사용하여 형성될 수 있는 것들을 포함한다. (예를 들어, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates : Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987 참조. 또한, 미국 특허 번호 4,880,935 참조.)
링커는 또한 말로네이트 링커(Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), 말레이미도벤조일 링커(Lau et al., 1995, Bioorg - Med - Chem. 3(10):1299-1304), 또는 3'-N-아미드 유사체(Lau et al., 1995, Bioorg - Med - Chem. 3(10):1305-12)일 수 있다.
링커는 또한, 비-절단가능한 링커, 예컨대, 약물에 직접적으로 부착되는 말레이미도-알킬렌- 또는 말레이미드-아릴 링커일 수 있다. 활성 약물-링커는 항체 분해에 의해 방출된다.
링커는 항체 상에 존재하는 기에 반응성인 작용기를 포함하는 것이다. 예를 들어, 링커는 링커의 황 원자와 항체의 황 원자 간의 디설파이드 결합을 통해 항체에 연결될 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 스트레쳐 유닛(stretcher unit)의 말레이미드 기를 통해 항체의 황 원자와의 결합을 형성할 수 있다. 황 원자는 사슬간 디설파이드의 시스테인 잔기 또는 항체내에 도입된 시스테인 잔기로부터 비롯될 수 있다.
항체에 컨쥬게이션시키는데 유용한 부류의 세포독성 제제는 예를 들어, 안티투불린 제제, DNA 마이너 그루브 결합 제제, DNA 복제 억제제, 화학요법 민감제, 피롤로벤조디아제핀 다이머, 또는 기타 등등을 포함한다. 세포독성 제제의 기타 예시적인 부류는 안트라사이클린, 오리스타틴, 캠프토테신, 두오카르마이신, 에토포시드, 매이탄시노이드 및 빈카 알칼로이드를 포함한다. 일부 예시적인 세포독성 제제는 오리스타틴(예를 들어, 오리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE), DNA 마이너 그루브 결합제(예를 들어, 에네다인(enediyne) 및 렉시트롭신(lexitropsin)), 두오카르마이신, 탁산(예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀), 빈카 알칼로이드, 독소루비신, 모르폴리노-독소루비신, 및 시아노모르폴리노-독소루비신을 포함한다.
세포독성 제제는 예를 들어, 독소루비신, 파클리탁셀, 멜팔란, 빈카 알칼로이드, 메토트렉세이트, 미토마이신 C 또는 에토포시드와 같은 화학요법제일 수 있다. 제제는 또한, CC-1065 유사체, 칼케아미신, 매이탄신, 돌라스타틴 10의 유사체, 리족신, 또는 팔리톡신일 수 있다.
세포독성 제제는 또한 오리스타틴일 수 있다. 오리스타틴은 오리스타틴 E 유도체, 예를 들어, 오리스타틴 E와 케토산 사이에 형성된 에스테르일 수 있다. 예를 들어, 오리스타틴 E는 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응하여 각각 AEB 및 AEVB를 생성할 수 있다. 다른 전형적인 오리스타틴은 오리스타틴 페닐알라닌 페닐렌디아민(AFP), 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF) 및 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE)를 포함한다. 다양한 오리스타틴의 합성 및 구조는 예를 들어, US 2005-0238649 및 US2006-0074008에 기술되어 있다.
세포독성 제제는 DNA 마이너 그루브 결합제일 수 있다. (예를 들어, US 6,130,237 참조). 예를 들어, 마이너 그루브 결합제는 CBI 화합물 또는 에네다인(enediyne)(예를 들어, 칼케아미신)일 수 있다. 또 다른 부류의 마이너 그루브 결합제는 피롤로벤조디아제핀(PBD) 다이머이다. PBD는 이들의 N10-C11 이민/카르비놀아민 모이어티를 통한 DNA의 마이너 그루브 내에서 구아닌 잔기의 C2-아미노 위치의 공유 결합을 통해 이들의 생물학적 활성을 발휘한다. 예시적인 항체-약물 컨쥬게이트는 PBD 기반 항체-약물 컨쥬게이트, 즉, 약물 성분이 PBD 약물인 항체-약물 컨쥬게이트를 포함한다.
PBD는 하기의 일반적 구조를 갖는다:
Figure pct00003
이들은 이들의 방향족 A 고리 및 피롤로 C 고리 둘 모두에서 치환기의 수, 유형 및 위치에 있어서 및 C 고리의 포화 정도에 있어서 상이하다. B-고리에서, N10-C11 위치에서 이민(N=C), 카르비놀아민(NH-CH(OH)) 또는 카르비놀아민 메틸 에테르(NH-CH(OMe))가 존재하며, 이는 DNA 알킬화를 담당하는 친전자성 중심이다. 공지된 천연 생성물 모두는 키랄 C11a 위치에서 (S)-배위를 가지며, 이는 C 고리로부터 A 고리 방향으로 볼때 우회전으로 꼬아져 있다. 이는 B-형태 DNA의 마이너 그루브를 갖는 이소헬릭시티에 대한 적절한 삼차원 형상을 제공하여, 결합 부위에서 꼭 맞게된다. 마이너 그루브에서 부가물을 형성하는 PBD의 능력은 이들이 DNA 프로세싱을 방해하여 항종양 제제로서의 이들의 사용을 가능하게 한다.
이러한 분자의 생물학적 활성은 가요성 알킬렌 링커를 통해 이들의 C8/C'-하이드록실 작용기를 거쳐 2개의 PBD 유닛을 함께 합침으로써 강화될 수 있다. PBD 다이머는 팔린드로믹 5'-Pu-GATC-Py-3' 가닥간의 가교와 같은 서열-선택성 DNA 병변을 형성하는 것으로 여겨지며, 이는 주로 이들의 생물학적 활성을 담당하는 것으로 여겨진다.
일부 구체예에서, PBD 기반 항체-약물 컨쥬게이트는 항체에 연결된 PBD 다이머를 포함한다. PBD 다이머를 형성하는 모노머는 동일하거나 상이할 수 있으며, 즉, 대칭 또는 비대칭일 수 있다. PBD 다이머는 링커로의 컨쥬게이션에 적합한 임의의 위치에서 항체에 연결될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, PBD 다이머는 화합물을 항체에 연결시키기 위한 앵커를 제공하는 C2 위치에서 치환기를 가질 것이다. 대안적인 구체예에서, PBD 다이머의 N10 위치는 화합물을 항체에 연결시키기 위한 앵커를 제공할 것이다.
전형적으로, PBD 기반 항체-약물 컨쥬게이트는 원발성 암의 항원에 결합하는 항체와 PBD 약물 사이의 링커를 포함한다. 링커는 절단가능한 유닛(예를 들어, 효소에 대한 표적 기질인 아미노산 또는 아미노산의 연속 서열) 또는 비-절단가능한 링커(예를 들어, 항체의 분해에 의해 방출된 링커)를 포함할 수 있다. 링커는 항체에의 연결을 위한 말레이미드 기, 예를 들어, 말레이미도카프로일을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 링커는 예를 들어, p-아미노벤질 알콜(PAB) 유닛과 같은 자가-침착성 기를 추가로 포함한다.
컨쥬게이트로서 사용하기 위한 예시적인 PBD 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 국제 출원 WO 2011/130613에 기술되어 있으며, 하기와 같으며, 여기에서 물결선은 링커에의 부착 부위를 나타낸다:
Figure pct00004
예시적인 링커는 하기와 같으며, 여기에서 물결선은 약물에의 부착 부위를 나타내며, 항체는 말레이미드 기를 통해 연결된다:
Figure pct00005
.
예시적인 PBD 기반 항체-약물 컨쥬게이트는 하기 도시된 바와 같은 항체-약물 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하며, 여기에서, Ab는 본원에 기술된 바와 같은 항체이다:
Figure pct00006
약물 로딩은 항체 당 약물-링커 분자의 수 p로 나타낸다.
세포독성 제제 또는 세포증식 억제제는 항-투불린 제제일 수 있다. 항-투불린 제제의 예는 탁산(예를 들어, Taxol® (파클리탁셀), Taxotere® (도세탁셀)), T67 (Tularik), 빈카 알킬로이드 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 비노렐빈(vinorelbine)), 및 오리스타틴 (예를 들어, 오리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB)을 포함한다. 예시적인 오리스타틴은 화학식 III-XIII로 하기 도시되어 있다. 기타 적합한 안티투불린 제제는 예를 들어, 바카틴 유도체, 탁산 유사체(예를 들어, 에포틸론 A 및 B), 노코다졸, 콜키신 및 콜시미드, 에스트라무스틴, 크립토피신, 세마도틴, 매이탄시노이드, 콤브레타스타틴, 디스코데르몰리드 및 엘레우테로빈을 포함한다.
세포독성 제제는 항-투불린 제제의 또 다른 군인 매이탄시노이드일 수 있다. 예를 들어, 매이탄시노이드는 매이탄신 또는 약물 링커 예컨대, DM-1 또는 DM-4를 함유하는 매이탄신일 수 있다(ImmunoGen, Inc.; 또한, Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131 참조).
예시적인 항체 약물 컨쥬게이트는 하기와 같은 vcMMAE 및 mcMMAF 항체 약물 컨쥬게이트를 포함하며, 여기에서, p는 약물 로딩을 나타내며, 전형적으로, 1 내지 4의 범위, 바람직하게는, 2 또는 4이며, Ab는 항체이다:
Figure pct00007
항체로의 컨쥬게이션을 위한 기타 세포독성 제제는 투불리신 및 이의 유사체이며, 이는 하기 예시된 바와 같은 항-부툴린 제제의 또 다른 군이다.
일부 양태에서, 이들 세포독성 제제는 베타-글루쿠로니드링커를 통해 항체에 컨쥬게이션된다. 글루쿠로니드 링커는 프로테아제 절단가능한 링커에 대한 친수성 대안물, 예컨대, 발린-시트룰린 및 발린 알라닌이며, 세포내 베타 글루쿠로니다제를 활용하여 약물 방출을 개시한다.
295번 또는 294번 및 239번 위치의 이중 시스테인 변이체는 특히, 소수성 약물에 대한 배위에 적합한데, 컨쥬게이션의 부위가 소수성 약물을 차폐시키기 위해 제공되는 글리칸 잔기에 근접하기 때문이다. 이들 세포독성 제제에 부착된 투불리신 및 글루쿠로니드 링커는 WO2016040684에 더욱 자세히 기술되어 있다.
이중 시스테인 잔기에 대한 구성을 위한 글루쿠로니드-연결된 투불리신 약물 링커 화합물의 비제한적 예는 (하기) 화합물 8 및 9로서 제공되며, 여기에서, 투불리신 약물 유닛은 투불리신 M 또는 데스메틸 투불리신 M이다. 투불리신 M은 또한 하기로서 공지되어 있다:
(αS,γR)-γ-[[[2-[(1R,3R)-1-(아세틸옥시)-4-메틸-3-[메틸[(2S,3S)-3-메틸-2-[[[(2R)-1-메틸-2-피페리디닐]카르보닐]아미노]-1-옥소펜틸]아미노]펜틸]-4-티아졸릴]카르보닐]아미노]-α-메틸-벤젠펜탄산으로서, 이는 CAS 번호 936691-46-2를 갖는다.
Figure pct00008
Figure pct00009
글루쿠로니드 링커에 연결된 투불리신 M의 에테르 변이체는 상기 도시되어 있다.
WO20160404684에 상세히 기재되고, 특히 본원에 참조로 통합된 글루쿠로니드-기반 투불리신 약물 링커 화합물 8 및 이의 투불리신 에스테르 및 에테르 변이체의 제조 방법은 하기 반응식에 의해 예시된다:
Figure pct00010
mDPR(Boc)-OH로서, 이의 활성화된 에스테르 mDPR(BOC)-OSu 및 mDPR(BOC)-OPFF로 전환되는 mDPR(Boc)-OH의 제조는 문헌 [Nature Biotech, 2014, 32, 1059-1062]에 기술되어 있으며, 이의 절차는 특별히 본원에 참조로서 통합되며, 글루쿠로니드 중간체로서, 투불리신 M의 4차화를 위해 브롬화되는 글루쿠로니드 중간체의 제조는 문헌 [Molecular Cancer Therapeutics 15, 938-945 (2016)]에 기술되어 있으며, 이의 절차는 특별히 본원에 참조로 통합된다.
투부발린 잔기의 아세테이트 기가 투불리신 Mep 잔기의 3차 아민 질소에 이러한 질소 원자의 4차화를 통해 글루쿠로니드 링커가 부착된 에테르 또는 또 다른 에스테르 기에 의해 대체되며, 상기 기술된 것과 같은 약물 링커 화합물로부터 제조될 수 있는 투불리신 M 및 이의 유사체의 항체 약물 컨쥬게이트가 하기와 같이 예시된다:
Figure pct00011
상기 식에서, R2A는 -C(=O)R2B이며, 여기에서, R2B는 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, 3-메틸-프로프-1-일, 3,3-디메틸-프로프-1-일 또는 비닐이거나, R2A는 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, 프로프-2-엔-1-일 또는 2-메틸-프로프-2-엔-1-일이며, R7B는 -H 또는 -OH이며, p는 약물 로딩을 나타내며, 전형적으로, 1 내지 4 범위이며, 일부 양태에서, 2 또는 4이며, Ab는 항체이고, S는 시스테인 295 또는 시스테인 239로부터의 황원자이다.
항체 또는 융합 단백질은 또한, 295번 위치 및 임의적으로, 239번 위치를 점유하는 시스테인을 통해 효소, 크로모포어 또는 형광 라벨과 같은 검출 가능한 마커에 컨쥬게이션될 수 있다.
약물 또는 라벨에 컨쥬게이션될 뿐만 아니라, 항체는 또한, 항체 결합을 억제하는 억제성 또는 차폐 도메인에 부착된 절단가능한 링커를 통해 연결될 수 있다(예를 들어, WO2003/068934, WO2004/009638, WO 2009/025846, WO2101/081173 및 WO2014103973 참조). 링커는 특정 조직 또는 병상에 특이적인 효소에 의해 절단되어, 항체가 요망되는 위치에서 우선적으로 활성화될 수 있도록 설계될 수 있다. 차폐 모이어티는 항체의 결합 부위에 직접적으로 결합함으로써 작동할 수 있거나 입체 장애를 통해 간접적으로 작동할 수 있다.
VI. 표적
일부 이러한 항체는 암 세포 항원, 바람직하게는, 항체 결합시 세포 내부에서 내재화가능한 세포 표면 상의 항원에 대해 면역특이적이다. 항체가 지시될 수 있는 표적은 암 세포 상의 수용체 및 이들의 리간드 또는 카운터-수용체를 포함한다(예를 들어, CD3, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD40, CD44, CD47, CD52, CD70, CD79a, CD123, Her-2, EphA2, GPC3 림프구 결합 항원 1, VEGF 또는 VEGFR, CTLA-4, LIV-1, 넥틴-4, CD74 및 SLTRK-6).
본 방법의 적용에 적합한 시중의 항체 및 이들의 표적의 일부 예는 브렌툭시맙(brentuximab) 또는 브렌툭시맙 베도틴, CD30, 알렘투주맙(alemtuzumab), CD52, 리툭시맙, CD20, 트라스투주맙(trastuzumab) Her/neu, 니모투주맙(nimotuzumab), 세툭시맙(cetuximab), EGFR, 베바시주맙(bevacizumab), VEGF, 팔리비주맙(palivizumab), RSV, 압식시맙(abciximab), GpIIb/IIIa, 인플릭시맙(infliximab), 아달리무맙(adalimumab), 세르톨리주맙(certolizumab), 골리무맙(golimumab) TNF-알파, 바실릭시맙(baciliximab), 다클리주맙(daclizumab), IL-2, 오말리주맙(omalizumab), IgE, 겜투주맙(gemtuzumab) 또는 바다스툭시맙(vadastuximab), CD33, 나탈리주맙(natalizumab), VLA-4, 베돌리주맙(vedolizumab) 알파4베타7, 벨리무맙(belimumab), BAFF, 오텔릭시주맙(otelixizumab), 테플리주맙(teplizumab) CD3, 오파투무맙(ofatumumab), 아크렐리주맙(ocrelizumab) CD20, 에프라투주맙(epratuzumab) CD22, 알렘투주무맙(alemtuzumumab) CD52, 에쿨리주맙(eculizumab) C5, 카나키무맙(canakimumab) IL-1베타, 메폴리주맙(mepolizumab) IL-5, 레슬리주맙(reslizumab), 토실리주맙(tocilizumab) IL-6R, 우스테키누맙(ustekinumab), 브리아키누맙(briakinumab) IL-12, 23, hBU12 (CD19) (US20120294853), 인간화된 1F6 또는 2F12 (CD70) (US20120294863), BR2-14a 및 BR2-22a (LIV-1) (WO2012078688)를 포함한다. 예시적인 항체의 일부 서열은 서열 목록에 제공된다.
VII. 약학적 조성물 및 치료 방법
상기 기술된 방법에 따라 생성된 항체 약물 컨쥬게이트는 치료하고자 하는 질병, 예컨대, 암, 자가면역 질환 또는 상기 논의된 증상 중 임의의 증상을 포함하는 감염의 발병을 지연시키고/거나, 이의 중증도를 감소시키고/거나 추가의 악화를 억제하고/거나 이의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 호전시키는 투여량, 투여 경로 및 투여 빈도를 의미하는 효과적인 요법으로 투여된다. 환자가 상기 질병으로부터 이미 고통받고 있다면, 요법은 치료학적 유효 요법으로서 언급될 수 있다. 환자가 일반적인 집단에 비해 질병의 위험이 높아졌으나, 아직 증상이 나타나지 않은 경우, 요법은 예방학적 유효 요법으로서 언급될 수 있다. 일부 경우에, 치료학적 또는 예방학적 유효성은 개별 환자의 과거 경험 또는 과거 대조군과 비교하여 동일 환자에서 관찰될 수 있다. 다른 경우에, 치료학적 또는 예방학적 유효성은 비처리된 환자의 대조군 집단과 비교하여 처리된 환자의 집단에서의 임상전 또는 임상 시험에서 입증될 수 있다.
항체 약물 컨쥬게이트에 대한 예시적인 투여량은 0.001 mg/kg 내지 100 mg/kg, 5 mg-50 mg/kg, 10 mg-25 mg/kg, 1 mg/kg 내지 7.5 mg/kg, 또는 2 mg/kg 내지 7.5 mg/kg, 또는 3 mg/kg 내지 7.5 mg/kg 대상체 체중, 또는 0.1-20, 또는 0.5-5 mg/kg 체중 (예를 들어, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/kg) 또는 고정된 투여량으로서 10-15000, 200-15000 또는 500-10,000 mg이다. 예를 들어, 오리스타틴 또는 투불리신에 컨쥬게이션된 이의 활성 모노클로날 항체 약물 컨쥬게이트에 대한 예시적인 투여량은 1 mg/kg 내지 7.5 mg/kg, 또는 2 mg/kg 내지 7.5 mg/kg 또는 3 mg/kg 내지 7.5 mg/kg 대상체 체중, 또는 0.1-20, 또는 0.5-5 mg/kg 체중(예를 들어, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/kg) 또는 고정된 투여량으로서 10-1500 또는 200-1500 mg이다. 예를 들어, PBD에 컨쥬게이션된 이의 고도로 활성인 모노클로날 항체 약물 컨쥬게이트의 예시적인 투여량은 1.0 μg/kg 내지 1.0 mg/kg, 또는 1.0 μg/kg 내지 500.0 μg/kg 대상체 체중이다.
일부 방법에서, 환자에게 매 2, 3 또는 4주마다 ADC가 투여된다. 치료가 예방학적 또는 치료학적이든지, 장애가 급성 또는 만성이든지, 투여량은 특히 투여 빈도, 환자의 상태 및 존재하는 경우 이전 치료에 대한 반응에 의존적이다. 투여량은 또한 결합, 이펙터 기능 또는 세포독성 감소에 의존적이다.
투여는 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 경막내, 복강내, 국소, 비내 또는 근육내일 수 있다. 투여는 또한, 예컨대, 종양 내로 직접적으로 국소화될 수 있다. 정맥내 또는 피하 투여에 의한 전신 순환 내로의 투여가 바람직하다. 정맥내 투여는 예를 들어, 30-90min과 같은 기간에 걸친 주입에 의해 또는 단일 볼루스 주사에 의한 것일 수 있다.
투여 빈도는 다른 요인들 중에서도 순환에서 항체의 반감기, 환자 상태 및 투여 경로에 의존적이다. 빈도는 환자의 상태 변화 또는 치료 중인 암의 진행에 따라 매일, 매주, 매달, 분기별 또는 불규칙한 간격일 수 있다. 정맥내 투여를 위한 예시적인 빈도는 연속 치료 과정에 걸쳐 주 2회 내지 분기별이지만, 더 많거나 적은 빈도의 투여가 또한 가능하다. 정맥내 투여를 위한 기타 예시적 빈도는 연속 치료 과정에 걸쳐 매주 1회 또는 매 4주마다 3회이지만, 더 많거나 적은 빈도의 투여가 또한 가능하다. 피하 투여에 있어서, 예시적인 투여 빈도는 매일 내지 매달이지만, 더 많거나 적은 빈도 투여가 또한 가능하다.
투여되는 투여 수는 질병의 성질(예를 들어, 급성 또는 만성 증상을 나타내는지의 여부) 및 치료에 대한 장애의 반응에 의존적이다. 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화에 있어서, 1 내지 10회의 투여가 종종 충분하다. 때때로, 임의적으로 분할된 형태의 단일 볼루스 투여가 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화에 충분하다. 치료는 급성 장애 또는 급성 악화의 재발에 대해 반복될 수 있다. 만성 장애에 있어서, 항체는 적어도 1, 5 또는 10년 또는 환자의 수명 동안 정기적 간격으로, 예를 들어, 매주, 격주, 매달, 분기별, 6개월 마다 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위한 약학적 조성물은 바람직하게는, 멸균성이며, 실질적으로 등장성(240-360 mOsm/kg)이며, GMP 조건하에 제조된다. 약학적 조성물은 단위 투여량 형태(즉, 단일 투여용 투여량)로 제공될 수 있다. 약학적 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 제형화될 수 있다. 제형화는 선택된 투여 경로에 의존적이다. 주사의 경우, 항체는 수성 용액, 바람직하게는, 생리학적으로 양립가능한 완충액, 예컨대, 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리학적 염수 또는 아세테이트 완충액(주사 부위에서 불편함을 감소시키기 위한)에서 제형화될 수 있다. 용액은 제형화제, 예컨대, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균 발열물질-비함유 물과의 구성을 위해 동결건조된 형태로 존재할 수 있다. 액체 제형 중 항체 농도는 예를 들어, 1-100 mg/ml, 예컨대, 10 mg/ml일 수 있다.
본 발명의 항체로의 처리는 화학요법, 방사선, 줄기 세포 처리, 수술, 항-바이러스제, 항생제, 면역 억제제 또는 자극제, 또는 치료할 장애에 대해 유효한 기타 치료와 조합될 수 있다. 암 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 ADC와 투여될 수 있는 다른 제제의 유용한 부류는 예를 들어, 암성 세포 상에서 발현된 다른 수용체에 대한 항체, 안티투불린 제제(예를 들어, 오리스타틴), DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제(예를 들어, 플라티넘 복합체, 예컨대, 시스-플라틴, 모노(플라티넘), 비스(플라티넘) 및 트리-핵 플라티넘 복합체 및 카르보플라틴), 안트라사이클린, 항생제, 항엽산제, 항대사물질, 화학요법 민감제, 두오카르마이신, 에토포시드, 플루오르화된 피리미딘, 이온운반제, 렉시트롭신, 니트로소우레아, 플라티놀, 사전-형성 화합물, 퓨린 항대사물질, 퓨로마이신, 방사선 민감제, 스테로이드, 탁산, 토포아이소머라제 억제제, 빈카 알칼로이드, 및 기타 등등을 포함한다.
항체로의 처리는 특히, 항체가 없는 동일한 처리(예를 들어, 화학요법)와 비교하여, 특히, 재발되거나 난치성인 경우의 종양을 갖는 환자의 중간 무진행 생존 기간 또는 전체 생존 기간을 적어도 30% 또는 40%, 바람직하게는, 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100% 또는 그 초과만큼 증가시킬 수 있다. 또한 또는 대안적으로, 항체를 포함하는 처리(예를 들어, 표준 화학요법)는 항체를 갖지 않는 동일한 처리(예를 들어, 화학요법)와 비교하여, 종양을 갖는 환자의 완전한 반응율, 부분 반응율 또는 객관적 반응율(완전 + 부분)을 적어도 30% 또는 40%, 바람직하게는, 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100%만큼 증가시킬 수 있다.
전형적으로, 임상 시험(예를 들어, 단계 II, 단계 II/III 또는 단계 III 시험)에서, 표준 요법 단독으로 (또는 플라세보와 함께) 처리된 대조군 환자와 비교하여, 표준 요법과 항체로 처리된 환자의 중간 무진행 생존율 및/또는 반응율에서 상기 언급된 증가는 예를 들어, p = 0.05 또는 0.01 또는 심지어 0.001 수준으로 통계적으로 유의하다. 완전 및 부분 반응율은 예를 들어, 국립 암 연구소 및/또는 식품 의약청에 의해 기록되거나 승인된 바와 같이 암의 임상 시험에 일반적으로 사용되는 객관적 기준에 의해 결정된다.
이해를 명료하게 하기 위해 본 발명이 상세히 기술되었으나, 특정 변형이 첨부된 청구범위 내에서 실시될 수 있다. 본 출원에 인용된 모든 간행문, 수탁 번호, 웹 사이트, 특허 문헌 및 기타 등등은 각각 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 모든 목적에 있어서 그 전문이 본원에 참조로 통합된다. 다른 정보가 다른 시점의 인용문과 관련되는 한도 내에서, 본 출원의 유효 출원일 현재의 정보를 의미한다. 유효 출원일은 해당 수탁 번호를 공개한 최초 우선 출원의 날짜이다. 문맥으로부터 달리 명백해지지 않는 한, 본 발명의 임의의 요소, 구체예, 단계, 특징 또는 양태는 임의의 다른 것과 조합되어 수행될 수 있다.
실시예
항체 발현 및 정제
IgG1 Fc 돌연변이를 함유하는 DNA 스트링을 깁슨 어셈블리(Gibson Assembly)를 사용하여 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 시스테인 돌연변이 플라스미드를 상응하는 경쇄와 함께 프라스타일 CHO-S 세포 내로 형질감염시키고, 생성된 상청액을 9일 후 채취하였다. 중쇄에서 시스테인 돌연변이를 함유하는 항체를 Mab 선택 단백질 A 친화성 칼럼에 의해 정제하였다.
글리칸 분석
시스테인 조작된 항체를 역상(RP) UPLC-MS를 사용하여 질량 및 글리칸 함량에 대해 평가하였다. DTT를 사용하여 항체를 환원시키고, 그 후, 탈글리코실화된 처리(PNG아제)의 존재 및 부재하에 분석하였다.
말레이미드 및 투불리신 안정성 검정
말레이미드 가수분해 및 안정성을 평가하기 위해, 시스테인 조작된 항체를 vcMMAE를 사용하여 컨쥬게이션시키고, 그 후, 0, 4 및 7일 동안 래트 혈장에서 인큐베이션하였다. ADC를 항-인간 포획 수지를 사용하여 혈장으로부터 정제하고, DTT로 환원시키고, 그 후, RP UPLC-MS를 사용하여 분석하였다. 말레이미드 가수분해를, 중쇄 함유 약물을 분석하고, 18 달톤의 질량 첨가를 평가함으로써 확인하였다. 말레이미드 안정성을 각 시점에서 DAR(약물 항체 비)을 비교함으로써 평가하였다. 약물 손실은 1317 달톤의 손실로서 측정되었으며, t=0에서 총 약물을 기준으로 하여 남아있는 총 약물의 백분율로서 계산하였다.
투불리신 안정성을 평가하기 위해, 시스테인 변이된 항체를 투불리신 M을 사용하여 컨쥬게이션시키고, 그 후, 0, 4 및 7일 동안 래트 혈장에서 인큐베이션하였다. ADC를 항-인간 포획 수지를 사용하여 혈장으로부터 정제하고, 환원시키고, 그 후, RP UPLC-MS를 사용하여 분석하였다. 투불리신 아세테이트 가수분해를, 중쇄 함유 약물을 분석하고, 42 달톤의 질량 손실을 평가함으로써 확인하였다.
세포 배양
Hep3B, HepG2 및 Huh7 세포를 ATCC로부터 수득하였다. JHH-7 세포를 크리에이티브 바이오어레이(Creative Bioarray)로부터 각각 수득하였다. Hep3B 및 HepG2 세포를 5% CO2를 지닌 37℃ 습화된 인큐베이터에서 10% FBS를 함유하는 EMEM에서 성장시켰다. Huh7 세포를 5% CO2를 지닌 37℃ 습화된 인큐베이터에서 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 성장시켰다. JHH-7 세포를 5% CO2를 지닌 37℃ 습화된 인큐베이터에서 10% FBS를 함유하는 윌리암스-E(Williams-E)에서 성장시켰다.
시험관내 세포독성
검정은 384-웰 조직 배양물 처리 플레이트에서 수행하고, 세포 생존력을 CellTiter Glo® (Promega)를 사용하여 평가하였다. 1250 Hep3B, HepG2, 또는 Huh7, 또는 1500 JHH-7 세포/웰을 40μL의 적절한 배지에서 플레이팅하였다. 플레이팅 후 24시간째에, 세포를 적절한 농도의 지시된 시험 물품으로 10μL 처리하였다. 투여 후 96시간째에, 10μL의 CellTiter Glo를 각 웰에 첨가하고, 총 발광을 Envision 다중-라벨 플레이트 판독기(PerkinElmer)로 측정하였다. 평균 생존력 퍼센트 및 표준 편차는 대조군 비히클 처리된 세포 대비 4배로 계산되었다.
생체내 항종양 활성
동물 연구는 동물 실험 윤리 위원회 프로토콜에 따라 수행하였다. 2.5 x 106 Hep3B 또는 5 x 105 JHH-7 세포를 무흉선 누드 마우스에서 피하 이식하였다. 종양 성장을 양쪽 버니어 캘리퍼(bilateral vernier caliper) 측정을 이용하여 연구 과정에 걸쳐 모니터링하고, 평균 종양 부피는 식 (0.5 x [길이 x 폭2])을 사용하여 계산하였다. 종양이 대략 100 mm3에 도달할 경우, 마우스를 지시된 처리군으로 무작위 배정하고, 200 μL 단일 용량의 적절한 처리제로 복강내 투여하였다. Hep3B 연구에 있어서, 각 처리군은 5 마리 마우스로 구성되었다. JHH-7 연구에 있어서, 각 처리군은 6마리 마우스로 구성되었다. 종양을 주 당 2회 측정하고, 종양이 1000 mm3에 도달할 경우, 동물을 희생시켰다.
결과
20개 돌연변이가 도 1에 도시된 바와 같이 위치 297번에서 글리칸 사슬에의 물리적 근접성에 기초하여 컨쥬게이션을 위한 잠재적 부위로서 선택되었다. 글리칸 사슬이 컨쥬게이션 부위에 연결된 소수성 약물을 차폐시키기 위해 제공될 수 있는 것으로 여겨졌다. 14개 돌연변이는 성공적으로 발현되고 컨쥬게이션되었다. 8개 돌연변이는 이중 돌연변이체로서 S239C와 조합되도록 선택하였다. 이중 돌연변이를 발현시키고 컨쥬게이션하였다.
도 2는 다른 돌연변이를 위한 글리칸의 분포를 보여준다. 주로 G0의 글리칸 분포와 더 적은 양의 G1, G2 등이 바람직하다. 따라서, A295C의 글리칸 분포가 유리한 반면(K246C, Q294C, Y296C, V303C, K334C, I336C 및 S337C 자체), R301C, F243C, V262C, V264C, S267C는 그렇지 않다.
투불리신에 컨쥬게이션된 항체를 37℃에서 7일 동안 래트 혈장에 적셨다. 그 후, ADC를 정제하고, 질량 분광법을 이용하여 약물 분해에 대해 평가하였다. 미정제 혈장 혼합물을 효능 손실에 대한 시험관내 세포독성 검정을 이용하여 평가하였다.
도 3은 Q295C가 말레이미드 링커의 중간 안정성을 나타낸다는 것을 보여준다. S239C는 평가된 돌연변이의 가장 큰 말레이미드 안정성을 보여주었다.
도 4는 Q295C가 또한, 투불리신 약물의 중간 안정성을 나타낸다는 것을 보여준다. 또한, S239C는 평가된 돌연변이의 가장 큰 안정성을 보여주었다.
도 5는 하나의 돌연변이가 S239C인 수개의 이중 돌연변이 조합물의 투불리신 안정성을 보여준다. Q295C는 시험한 다른 돌연변이와 비교하여 중간 안정성을 보였다. 그러나, S239C Q295C 이중 돌연변이의 안정성은 도 6의 막대로 대표되는 개별 돌연변이의 안정성으로부터 예상되는 것보다 컸다.
도 7은 2개의 암 세포주에 대한 다양한 이중 돌연변이 조합 단일의 세포독성을 보여준다. S239C Q295C 이중 돌연변이체는 중간 세포독성을 보였다.
S239C, Q295C 이중 돌연변이의 세포독성은 하기와 같이 동일한 항체의 다양한 다른 컨쥬게이트를 갖는 마우스 이종이식 모델에서 비교하였다:
4830(8) [AT] 1 mg/kg
5937(4) 2 mg/kg
S239C K246C-5937(4) 2 mg/kg
S239C K290C-5937(4) 2 mg/kg
S239C K295C-5937(4) 2 mg/kg
S239C V303C-5937(4) 2 mg/kg
S239C K246C V303C-5937(6) 1.33 mg/kg
S239C K246C V303C-6242(6) 1.33 mg/kg
S239C K246C V303C-6238(6) 1.33 mg/kg
S239C K246C V303C K295C-5937(8) 1 mg/kg
1-6183(8) 1 mg/kg
용량은 약물 로딩의 화학양론에 무관하게 동일한 몰의 약물 전달을 보여주었다.
도 8은 투불리신에 컨쥬게이션된 S239C Q295C 이중 돌연변이체가 종양 Hep3B-8 상의 종양 성장의 가장 큰 억제를 나타냈었음을 보여준다. 도 9는 JHH7-E 종양 세포주에 대해 동일한 결론을 보여준다.
이중 돌연변이의 글리칸 분석
단일 점 돌연변이 S239C 또는 Q295C를 함유하는 항체는 기준 글리코실화 패턴을 함유한다(도 10a-d). 돌연변이 S239C 및 Q295C 쌍은 N-연결된 글리칸을 갖는 이상(abnormality)을 발생시킨다. 이러한 비정상 글리칸(표 1)은 하이퍼시알리화 뿐만 아니라, GlcNac의 트리 및 테트라 안테나리 분지를 포함한다. 이러한 글리코실화 패턴은 두 일시적(도 10d) 및 안정한(도 11) CHO 세포 생산 기법을 사용하여 보존됨을 보여주었다. 또한, S239C와 E294C의 쌍은 또한, 이러한 유사한 글리코실화 패턴을 입증한다(도 12).
비-환원된 RP-MS 및 비-환원된 펩티드 맵핑에 의한 이러한 분자의 분석(도 13)은 N-연결된 글리칸에 매우 근접한 조작된 시스테인 부위의 사슬내 디설파이드 스태플링을 입증한다. 이러한 항체의 통상적인 환원 및 재산화는 이러한 스태플링을 제거하며, 잔존하는 비정상 글리칸과의 컨쥬게이션에 이용가능한 조작된 부위를 남겨둔다.
DTT(디티오트레이톨)를 이용한 세포 배양
이중 돌연변이 S239C 및 Q295C를 함유하는 항체를 환원 조건하에 일시적으로 발현시켰다. DTT, TCEP 및 베타-메르캅토에탄올(BME)을 세포 배지 중 0.1, 1.0 및 1.2 mM의 총 농도로 환원제로서 사용하였다(도 14). 이러한 단백질의 글리칸 패턴의 분석은 배지의 일부로서 DTT를 사용하는 경우, 글리칸 복잡성의 감소를 나타낸다(도 15). DTT의 농도 증가는 시알릴화 감소는 물론 글리칸의 트리 및 테트라 안테나리 분지와 관련이 있다. 이러한 환원 조건에서 발현된 항체는 SEC에 의해 모노머인 것으로 보이며, 모항체와 유사한 결합을 갖는다. 이러한 항체의 환원 및 산화는 모항체와 같이 컨쥬게이션에 이용가능한 조작된 부위를 남겨둔다.
S239C/Q295C 항체의 글리코실화 패턴은 세포 발현 시스템의 영향을 받지 않았다. 글리코실화 패턴은 항체가 안정한 형질감염된 세포주 vs 일시적으로 형질감염된 세포주에서 발현될 경우 본질적으로 동등하였다. 예를 들어, 하기 표 1 참조.
Figure pct00012
표 1: S239C/Q295C 돌연변이체의 일과성 발현 대 안정한 발현의 글리이코실화 분석
서열 목록
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Figure pct00017
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SEQUENCE LISTING <110> Seattle Genetics, Inc. Waight, Andrew Leiske, Chris Biechele, Travis Sussman, Django Burke, Patrick Leiske, Jocelyn <120> Cysteine Mutated Antibodies For Conjugation <130> 057762-508682 <150> US 62/465,129 <151> 2017-02-28 <150> US 62/561,151 <151> 2017-09-20 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 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His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Cys Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 14 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 14 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Cys Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 15 <211> 377 <212> 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Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Cys 210 215 220 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 16 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 16 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Cys Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 17 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 17 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Cys Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Cys Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 18 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 18 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Cys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Cys Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 19 <211> 377 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 19 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Cys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Cys 210 215 220 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 20 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 20 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Cys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Cys Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 21 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 21 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 15 Cys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 <210> 22 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthesized <400> 22 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Cys Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 20 25

Claims (20)

  1. EU 넘버링 위치 295번이 시스테인에 의해 점유되는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 위치 295번의 시스테인을 통해 약물 또는 라벨에 컨쥬게이션되는 항체 또는 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, EU 넘버링 위치 239번이 시스테인에 의해 점유되는 항체 또는 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 위치 295번 및 239번의 시스테인을 통해 약물 또는 라벨에 컨쥬게이션되는 항체 또는 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 헤테로다이머이며, 여기에서 항체 중 하나의 분자는 두 중쇄 모두에서 위치 295번 및 239번의 시스테인에의 컨쥬게이션을 통해 약물의 4개 분자에 컨쥬게이션되는, 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 불변 영역이 아이소형을 가지며, 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 항체 또는 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 약물이 투불리신인 항체 또는 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 약물이 글루쿠로니드 링커를 통해 항체 또는 융합 단백질에 컨쥬게이션되는 항체 또는 융합 단백질.
  9. 제7항에 있어서, 항체 또는 융합 단백질이 투불리신 및 글루쿠로니드 링커를 제공하는 하기 도시된 구조를 갖는 화합물에 컨쥬게이션되는 항체 또는 융합 단백질:
    Figure pct00019
    .
  10. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 약물이 MMAE, MMAF 또는 마이너 그루브 결합제인 항체 또는 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, C-말단 리신이 부재할 수 있는 경우, 중쇄 불변 영역이 SEQ ID NO. 5-12 중 임의의 서열을 갖는 항체 또는 융합 단백질.
  12. 제1항에 있어서, 항체가 절단가능한 링커를 통해 약물에 컨쥬게이션되는 항체 또는 융합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항의 항체 또는 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물.
  14. EU 넘버링 위치 239번이 시스테인에 의해 점유되는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 융합 단백질로서, 상기 시스테인이 투불리신 M에 컨쥬게이션되는 항체 또는 융합 단백질.
  15. EU 넘버링 위치 239번 및 295번이 시스테인에 의해 점유되는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체 또는 융합 단백질을 생성하는 방법으로서, 상기 방법이
    상기 항체 또는 융합 단백질을 인코딩하도록 조작된 세포를 배양하는 단계로서, 상기 항체 또는 융합 단백질이 발현되는 단계; 및
    상기 항체 또는 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 위치 239번 및 295번의 시스테인을 통해 약물에 항체 또는 융합 단백질을 컨쥬게이션시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 위치 239번 및 295번의 시스테인 사이에 디설파이드 결합의 형성을 억제하는 환원제와 항체 또는 융합 단백질을 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 항체 또는 융합 단백질이 배양되는 배지에 환원제를 포함시킴으로써 항체 또는 융합 단백질이 환원제와 접촉되는 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 환원제가 디티오트레이톨, 베타-메르캅토에탄올 또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 환원제가 0.1 내지 2 mM 농도의 디티오트레이톨인 방법.
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