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KR20190051037A - 항-pd-1 항체 - Google Patents

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KR20190051037A
KR20190051037A KR1020197010711A KR20197010711A KR20190051037A KR 20190051037 A KR20190051037 A KR 20190051037A KR 1020197010711 A KR1020197010711 A KR 1020197010711A KR 20197010711 A KR20197010711 A KR 20197010711A KR 20190051037 A KR20190051037 A KR 20190051037A
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antibody
ser
amino acid
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cancer
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KR1020197010711A
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웨이동 지앙
페이후아 린
치링 청
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상하이 헨리우스 바이오테크, 인크.
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Abstract

항-PD-1 항체 및 그의 항원 결합 단편이 제공된다. 또한, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산 분자, 관련 발현 벡터 및 숙주 세포가 제공된다. 항-PD-1 항체 및 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법이 제공된다. 또한, 관련된 약학 조성물 및 대상체를 치료하기 위한 그의 용도가 제공된다.

Description

항-PD-1 항체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 PCT 국제 출원은 2016년 9월 16일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/395,832호에 대한 이익 및 우선권을 주장한다. 이 PCT 국제 출원은 또한 2017년 6월 14일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/519,590호에 대한 이익 및 우선권을 주장한다. 이들 각각의 출원의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포멧으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 이에 의해 그 전문이 참고 인용된다. 2017년 9월 19일 생성된 상기 ASCII 카피는 000020_000004PCT-LF_SL.txt로 명명되고 크기는 40,346 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 항-PD-1 항체 및 인간 암의 치료에서의 그의 사용 방법에 관한 것이다.
프로그램된 사멸-1(PD-1)은 활성화된 T 및 B 세포에 의해 발현되는 주요 면역 체크포인트 수용체로서, 면역억제를 매개한다. PD-1은 CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 및 BTLA를 포함하는 CD28 수용체 패밀리의 구성원이다. 항원 제시 세포 및 많은 인간 암에서 발현되는, PD-1에 대한 2개의 세포 표면 당단백질 리간드인 프로그램된 사멸 리간드-1(PD-L1) 및 프로그램된 사멸 리간드-2(PD-L2)가 확인되었고, 이들은 PD-1에 결합할 때 T 세포 활성화 및 사이토카인 분비를 하향조절하는 것으로 밝혀졌다(Freeman et al., 2000; Latchman et al., 2001). CTLA-4와는 달리, PD-1은 활성화된 T 세포가 종양 및/또는 기질 세포에 의해 발현되는 면역억제성 PD-L1(B7-H1) 및 PD-L2(B7-DC) 리간드를 접할 수 있는 말초 조직에서 주로 기능한다(Flies et al., 2011; Topalian et al., 2012a). PD-1/PD-L1 상호작용의 억제는 전임상 모델에서 강력한 항종양 활성을 매개하고(미국 특허 제8,008,449호 및 제7,943,743호), 암을 치료하기 위한 PD-1/PD-L1 상호작용의 Ab 억제제의 사용이 임상 시험에 도입되었다(Brahmer et al., 2010; Flies et al., 2011; Topalian et al., 2012b; Brahmer et al., 2012).
PD-1에 대해 작용하는 항암 치료제의 개발에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 이러한 필요성 및 다른 필요성을 충족시킨다.
발명의 개요
본 발명은 항-PD-1 항체 및/또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 (1) 아미노산 서열 KASQDVTTAVA(서열 번호 9)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASTRHT(서열 번호 10)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYTIPWT(서열 번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄(LC) 가변 도메인 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FTFSNYGMS(서열 번호 12)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNIY(서열 번호 13)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 VSYYYGIDF(서열 번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄(HC) 가변 도메인 서열을 포함하는 키메라 항-PD-1 항체 c1G4 및/또는 인간화된 항-PD-1 h1G4이다.
본 발명은 또한 인간화된 h1G4 항-PD-1 항체에 대한 친화도 성숙 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 성숙 항-PD-1 항체(예를 들어, 항-PD-1 항체, 33B)는 (1) 아미노산 서열 KASTDVTTAVA(서열 번호 15)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASLRHT(서열 번호 16)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYGIPWT(서열 번호 17)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄(LC) 가변 도메인 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FRFSNYGMS(서열 번호 18)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNAY(서열 번호 19)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 TSYYYGIDF(서열 번호 20)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄(HC) 가변 도메인 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 성숙 항-PD-1 항체(예를 들어, 항-PD-1 항체, 66E)는 (1) 아미노산 서열 KAKQDVTTAVA(서열 번호 21)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASTRHT(서열 번호 10)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYWIPWT(서열 번호 22)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄(LC) 가변 도메인 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FTFSNYGMS(서열 번호 12)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNIY(서열 번호 13)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 VSYYYGIDL(서열 번호 23)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄(HC) 가변 도메인 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 성숙 항-PD-1 항체(예를 들어, 항-PD-1 항체, 711D)는 (1) 아미노산 서열 KASQDVTNAVA(서열 번호 24)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASTRHT(서열 번호 10)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYTIPWT(서열 번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄(LC) 가변 도메인 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FTFSNYGMS(서열 번호 12)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNIY(서열 번호 13)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 SSYYYGIDL(서열 번호 25)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄(HC) 가변 도메인 서열을 포함한다.
본원에서 언급되는 CDR의 서열은 하기 표 1에 제시된다.
<표 1>
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 (1) 서열 번호 9, 21 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (2) 서열 번호 10 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; (3) 서열 번호 11, 17, 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄(LC) 가변 도메인 서열, 및 (1) 서열 번호 12 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (2) 서열 번호 13 또는 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 서열 번호 14, 20, 23 및 25로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄(HC) 가변 도메인 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열 및 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 인간화된 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된) 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG의 Fc 서열을 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된) 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab)'2, 단일쇄 Fv(scFv), Fv 단편, 디아바디(diabody) 및 선형 항체를 포함한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된) 일부 실시양태에서, 항체는 다중 특이적 항체이다.
상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된) 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 치료제에 접합된다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된) 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표지에 접합된다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된) 일부 실시양태에서, 표지는 방사성 동위원소, 형광 염료 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된) 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 또한, 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된 바와 같은) 핵산 분자를 코딩하는 발현 벡터가 제공된다. 본 발명은 또한 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따라 (또는 이에 적용된 바와 같이) 세포를 배양하는 단계 및 세포 배양물로부터 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 항체 생산 방법을 제공한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 CHO 세포이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 세포는 안정한 포유동물 세포주이다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 안정한 포유동물 세포주는 CHO 세포주이다.
본 발명은 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된 바와 같은) 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된 바와 같은) 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 샘플에 접촉시키고, PD-1 단백질에 결합한 항-PD-1 항체를 검출함으로써, 환자로부터의 샘플에서 PD-1 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 면역 조직화학적 검정(IHC) 또는 ELISA 검정에 사용된다.
또한, 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된 바와 같은) 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 암을 치료하는 방법이 제공된다. 또한, 암 치료에 사용하기 위한, 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된 바와 같은) 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물이 제공된다. 암을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된 바와 같은) 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도가 제공된다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 암은 흑색종, 두경부암, 요로상피암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암, TNBC), 위암, 전형적 호지킨 림프종(cHL), 비호지킨 림프종 원발성 종격동 B 세포 림프종(NHL PMBCL), 중피종, 난소암, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암 및 비소세포 폐암(NSCLC), 식도암, 비인두 암종(NPC), 담도암, 결직장암, 자궁경부암, 갑상선암, 및 타액선암으로부터 선택된다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 대상체에게 항신생물제, 화학요법제, 성장 억제제 및 세포독성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제가 추가로 투여된다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 대상체에게 방사선 요법이 추가로 실시된다. 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태에 따른 (또는 이에 적용된 바와 같은) 일부 실시양태에서, 대상체에게 VEGF, VEGFR2, 또는 EGFR에 대한 치료 항체가 추가로 투여된다.
도 1a-1b. PD-1 재조합 단백질에 대한 c1G4의 결합. 도 1a는 항-PD-1 항체 c1G4 및 참조된 항-PD-1의 PD-1-His에 대한 결합을 비교하기 위해 수행된 ELISA의 결과를 보여준다. 도 1b는 항-PD-1 항체 c1G4 및 참조된 항-PD-1의 PD-1-AP에 대한 결합을 비교하기 위해 수행된 제2 세트의 ELISA의 결과를 보여준다. 데이터는 c1G4 및 참조된 항-PD-1이 PD-1-His와 PD-1-AP 둘 모두에 결합할 수 있음을 나타낸다.
도 2a-2b. c1G4의 PD-1 리간드에 대한 결합의 차단 및 경쟁. 도 2a PD-L1 및 PD-1의 결합을 차단하기 위해 항-PD-1 항체 c1G4 및 참조된 항-PD-1의 능력을 비교하기 위해 수행된 ELISA의 결과를 보여준다. c1G4와 참조된 항-PD-1 둘 모두는 PD-L1의 PD-1에 대한 결합을 차단하는 것으로 밝혀졌다. 도 2b는 PD-1-His에 대한 결합을 위해 참조된 항-PD-1과 경쟁하는 항-PD-1 항체 c1G4의 능력을 결정하기 위해 수행된 ELISA의 결과를 보여준다. 데이터는 c1G4와 참조된 항-PD-1 둘 모두가 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단할 수 있고, c1G4는 PD-1-His에 대한 결합을 위해 항-PD-1 ref와 경쟁할 수 있음을 나타낸다.
도 3a-3b. PD-1 발현 CHO-S 세포에 대한 c1G4의 결합. CHO-S 세포(도 3a) 및 PD-1 형질감염된 CHO-S 세포(도 3b)에 대한 c1G4 항체의 결합을 유동 세포 계측에 의해 시험하였다. 참조된 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체를 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다. 데이터는 c1G4가 인간 PD-1로 형질감염된 CHO 세포에 결합하지만, 형질감염되지 않은 CHO 세포에는 결합하지 않음을 나타낸다.
도 4. 선택된 c1G4 항체에 의한 PD-1에 대한 리간드 결합의 차단. 항-PD-1 c1G4는 유동 세포 계측 검정을 사용하여 PD-1을 발현하는 CHO-S 세포에 대한 리간드 PD-L1의 결합을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. 참조된 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체를 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다. 항-PD-1 모노클로날 항체 c1G4는 염색의 평균 형광 강도(MFI)로 측정한 바와 같이, PD-1 형질감염된 CHO-S 세포에 대한 PD-L1의 결합을 차단하였다. 이들 데이터는 항-PD-1 c1G4가 세포 표면 PD-1에 대한 PD-L1 리간드의 결합을 차단한다는 것을 입증한다.
도 5a-5b. 혼합 백혈구 반응(MLR)에서 사이토카인 생성에 대한 항-PD-1 c1G4의 효과. 인간 PD-1에 대한 모노클로날 항체 c1G4는 혼합 백혈구 반응 검정에서 IFN-γ 분비 및 IL-2 분비를 촉진한다. 참조된 항-PD-1 및 아바스틴(Avastin)(항-VEGF)을 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다. 도 5a는 농도 의존성 IL-2 분비를 보여주는 막대 그래프를 도시한 것이고, 도 5b는 농도 의존성 IFN-γ 분비를 보여주는 막대 그래프를 도시한 것이다.
도 6. 혼합 백혈구 반응(MLR)에서의 T 세포 증식에 대한 항-PD-1 c1G4의 효과. 인간 PD-1에 대한 모노클로날 항체 c1G4는 혼합 백혈구 반응 검정에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 촉진한다. 참조된 항-PD-1 및 아바스틴(항-VEGF)을 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다. 도 6a는 다양한 항체 농도에서의 CD4+ T 세포 증식을 보여주는 막대 그래프를 도시한 것이고, 도 6b는 다양한 항체 농도에서의 CD8+ T 세포 증식을 보여주는 막대 그래프를 도시한 것이다.
도 7. c1G4 항체의 종양 성장 억제 활성. 마우스(n=4/군)에게 인간 결장암 세포주 HT29 및 새로 단리된 인간 PBMC(암세포:PBMC = 2:1)의 혼합물을 피하 이식하였다. 항-PD-1 항체를 제1일부터 매주 2회 마우스에게 복강 내로 주사하였다. 종양 성장 곡선을 도 7a에 제시하였다. 제28일에서의 개별적인 종양 부피를 도 7b에 나타내었다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다.
도 8. c1G4 및 h1G4의 서열 정렬. 도 8a는 c1G4, 인간화된 h1G4, 인간 생식계열 경쇄 가변 영역 IGKV1-39*01, 및 니볼루맙(Nivolumab)(NIV)의 경쇄의 아미노산 서열 정렬을 보여준다(순서대로 각각 서열 번호 27-30). 도 8b는 c1G4, 인간화된 h1G4, 인간 생식계열 중쇄 가변 영역 IGHV3-11*04, 및 니볼루맙(NIV)의 중쇄의 아미노산 서열 정렬을 보여준다(순서대로 각각 서열 번호 31-34). 인간화를 위해 c1G4로부터 이식된 CDR(상보성 결정 영역)은 밑줄이 쳐진 굵은 글씨로 표시하였다.
도 9. PD-1을 발현하는 CHO-S 세포에 대한 인간화된 항-PD-1 항체의 결합. 세포 표면 상의 PD-1에 대한 인간화된 h1G4 및 원래의 c1G4 항체의 결합을 유동 세포 계측으로 시험하였다. 참조된 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체를 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다.
도 10. 인간화된 h1G4 항체에 의한 PD-1에 대한 리간드 결합의 차단. 인간화된 항-PD-1 h1G4는 유동 세포 계측을 사용하여 PD-1을 발현하는 CHO-S 세포에 대한 리간드 PD-L1의 결합을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. 참조된 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체를 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다. c1G4 및 h1G4 둘 모두는 염색의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정된 바와 같이, PD-1로 형질감염된 CHO-S 세포에 대한 PD-L1의 결합을 차단하였다.
도 11a-11d는 인간(도 11a), 사이노몰거스 원숭이(도 11b), 마우스(도 11c), 및 래트(도 11d) PD-1 단백질에 대한 h1G4의 종 교차반응성을 도시한 것이다. 모든 데이터 점은 삼중 실험의 평균 ± SD이다.
도 12. 활성화된 인간 T 세포에 대한 인간화된 항-PD-1 항체의 결합. 인간 T 세포에 대한 인간화된 h1G4의 결합은 유동 세포 계측에 의해 시험되었다. 참조된 항-PD-1 항체 및 아바스틴(항-VEGF)을 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다.
도 13. 혼합 백혈구 반응(MLR)에서 사이토카인 생산에 대한 h1G4의 효과. 인간 PD-1에 대한 인간화된 항체 h1G4는 혼합 백혈구 반응 검정에서 IFN-γ 분비 및 IL-2 분비를 촉진한다. 참조된 항-PD-1 항체 및 아바스틴(항-VEGF)을 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다. 도 13a는 농도 의존성 IL-2 분비를 보여주는 막대 그래프를 도시한 것이고, 도 14b는 농도 의존성 IFN-γ 분비를 보여주는 막대 그래프를 도시한 것이다.
도 14. 혼합 백혈구 반응(MLR)에서의 T 세포 증식에 대한 h1G4의 효과. 인간 PD-1에 대한 인간화된 항체 h1G4는 혼합 백혈구 반응 검정에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 촉진한다. 참조된 항-PD-1 항체 및 아바스틴(항-VEGF)을 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다. 도 14a는 다양한 항체 농도에서의 CD4+ T 세포 증식을 보여주는 막대 그래프를 도시한 것이고, 도 14b는 다양한 항체 농도에서의 CD8+ T 세포 증식을 보여주는 막대 그래프를 도시한 것이다.
도 15. HT29/PBMC 이종이식 모델에서 h1G4 항체의 종양 성장 억제 활성. 마우스(n=4/군)에게 인간 결장암 세포주 HT29 및 새로 단리된 인간 PBMC(암세포:PBMC = 3:1)의 혼합물을 피하 이식하였다. 항-PD-1 항체를 제1일부터 매주 2회 마우스에게 복강 내로 주사하였다. 종양 성장 곡선을 도 15a에 제시하였다. 제21일에서의 개별적인 종양 부피를 도 15b에 나타내었다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다.
도 16은 NCI-H292/PBMC 이종이식 모델에서 h1G4 항체의 종양 성장 억제 활성. 마우스(n=4/군)에게 인간 NSCLC 세포주 NCI-H292 및 새로 단리된 인간 PBMC(암세포:PBMC = 3:1)의 혼합물을 피하 이식하였다. 항-PD-1 항체를 제1일부터 매주 2회 마우스에게 복강 내로 주사하였다. 종양 성장 곡선을 도 16a에 제시하였다. 제25일에서의 개별적인 종양 부피를 도 16b에 나타내었다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다.
도 17. hPD1 KI 마우스에서 h1G4 항체의 종양 성장 억제 활성. 인간 PD-1 녹-인(knock-in)(hPD1 KI) 마우스(n=4/군)에게 MC38-huPD-L1(인간 PD-L1로 형질감염된 MC38) 세포를 피하 이식하였다. 항체 치료는 종양 부피가 약 75 mm3에 도달했을 때 시작하였다. 항-PD-1 항체를 매주 2회 마우스에게 복강 내로 주사하였다. 모든 데이터 점은 평균 ± SD이다.
도 18. 인간화된 NSG 마우스에서 삼중 음성 유방암(TNBC) 세포주 이종이식 모델에서 h1G4의 효능 연구. 인간화된 NSG 마우스(n=9/군)에게 MDA-MB-231 세포를 피하 접종하였다. 항체 치료는 종양 부피가 약 60-150 mm3에 도달했을 때 시작하였다. 투여 일수는 화살표로 표시하였다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다.
도 19. 혼합 백혈구 반응(MLR)에서 사이토카인 생성에 대한 인간 항-PD-1 항체의 효과. 인간 PD-1에 대한 인간 모노클로날 항체는 혼합 백혈구 반응 검정에서 IFN-γ 분비 및 IL-2 분비를 촉진한다. 참조된 항-PD-1 및 아바스틴(항-VEGF)을 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다. 도 19a는 농도 의존성 IL-2 분비를 보여주는 막대 그래프를 도시한 것이고, 도 19b는 농도 의존성 IFN-γ 분비를 보여주는 막대 그래프를 도시한 것이다.
도 20. HT29/PBMC 이종이식 모델에서 인간 항-PD-1 항체의 종양 성장 억제 활성. 마우스(n=4/군)에게 인간 결장암 세포주 HT29 및 새로 단리된 인간 PBMC(암세포:PBMC = 3:1)의 혼합물을 피하 이식하였다. 항-PD-1 항체를 제1일부터 매주 2회 마우스에게 복강 내로 주사하였다. 종양 부피를 매주 2회 측정하였다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다.
도 21. HT29/PBMC 이종이식 모델에서 항-PD-1 및 항-VEGF 모노클로날 항체의 조합. 마우스(n=4/군)에게 인간 결장암 세포주 HT29 및 새로 단리된 인간 PBMC(암세포:PBMC = 3:1)의 혼합물을 피하 이식하였다. 항-PD-1 mAb, 항-VEGF mAb(HLX04) 또는 항-PD-1 mAb + 항-VEGF mAb를 마우스에게 복강 내로 주사하였다. 투여 일수는 화살표로 표시하였다. 종양 부피는 매주 2회 측정하였다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다.
도 22. NSCLC 이종이식 마우스 모델에서 항-PD-1 mAb + 항-VEGF mAb의 종양 성장 억제 활성. 마우스(n=4/군)에게 인간 NSCLC 세포 NCI-H292 및 새로 단리된 인간 PBMC(암세포:PBMC = 3:1)의 혼합물을 피하 이식하였다. 항-PD-1(h1G4) 및 항-VEGF(HLXO4) 항체를 제1일부터 매주 2회 마우스에게 복강 내로 주사하였다. 종양 성장 곡선을 도 22a에 제시하였다. 제21일에서의 개별적인 종양 부피를 도 22b에 나타내었다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다.
도 23. NSCLC 이종이식 마우스 모델에서 항-PD-1 mAb + 항-VEGFR2 mAb의 종양 성장 억제 활성. 마우스(n=4/군)에게 인간 NSCLC 세포 NCI-H292 및 새로 단리된 인간 PBMC(암세포:PBMC = 3:1)의 혼합물을 피하 이식하였다. 항-PD-1(h1G4) 및 항-VEGFR2(HLX06) 항체를 제1일부터 매주 2회 마우스에게 복강 내로 주사하였다. 종양 성장 곡선을 도 23a에 제시하였다. 제21일에서의 개별적인 종양 부피를 도 23b에 나타내었다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다.
도 24. NSCLC 이종이식 마우스 모델에서 항-PD-1 mAb + 항-EGFR mAb의 종양 성장 억제 활성. 마우스(n=4/군)에게 인간 NSCLC 세포 NCI-H292 및 새로 단리된 인간 PBMC(암세포:PBMC = 3:1)의 혼합물을 피하 이식하였다. 항-PD-1(HLX10) 및 항-EGFR(HLX07) 항체를 제1일부터 매주 2회 마우스에게 복강 내로 주사하였다. 종양 성장 곡선을 도 24a에 제시하였다. 제21일에서의 개별적인 종양 부피를 도 24b에 나타내었다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다.
도 25. HT-29(KRASWT, BRAFV600E) 이종이식 마우스 모델에서 항-PD-1 mAb + 항-EGFR mAb의 종양 성장 억제 활성. 마우스(n=5/군)에게 인간 결장암 세포 HT-29 및 새로 단리된 인간 PBMC(암세포:PBMC = 3:1)의 혼합물을 피하 이식하였다. 항-PD-1(HLX10) 및 항-EGFR(HLX07) 항체를 제1일부터 매주 2회 마우스에게 복강 내로 주사하였다. 종양 성장 곡선을 도 25a에 제시하였다. 제21일에서의 개별적인 종양 부피를 도 25b에 나타내었다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 신규한 항-PD-1 항체 및/또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명자들은 놀랍게도, 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체, 예를 들어 키메라 c1G4 및 인간화된 h1G4 항체, 및 이들의 친화도 성숙 항체, 예를 들어 33B, 66E 및 711D가 T 세포에 의한 IL-2 및 IFNγ의 분비, 및 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식을 향상시킨다는 것을 밝혀내었다. 또한, 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체는 암 치료에 사용되는, FDA에 의해 승인된 인간화된 IgG4 항-PD-1 모노클로날 항체인 OPDIVO®(니볼루맙)와 비교하여 향상된 효능 및/또는 항종양 활성을 보인다.
또한, 면역 접합체, 본원에서 설명되는 신규한 항-PD-1 항체를 코딩하는 핵산, 및 조성물(예를 들어, 약학 조성물)이 제공된다. 본 발명은 또한 샘플(예를 들어, 생체 내 또는 생체 외 샘플)에서 PD-1을 검출하기 위해 신규한 항-PD-1 항체를 사용하는 방법, 암을 치료하는데 사용하기 위한 상기 항체를 포함하는 조성물, 및 암 치료용 의약의 제조에서의 상기 항체의 용도를 제공한다.
정의
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하기"는 임상 결과를 비롯하여 유익한 또는 목적하는 임상 결과를 얻기 위한 접근 방식이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익한 또는 목적하는 임상 결과는 다음 중 하나 이상을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 질환으로 인한 하나 이상의 증상의 경감, 질환의 범위의 감소, 질환의 안정화(예를 들어, 질환의 악화의 예방 또는 지연), 질환 확산(예를 들어, 전이)의 예방 또는 지연, 질환 재발의 예방 또는 지연, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 완화, 질환의 퇴행(부분적인 또는 전체적인) 제공, 질환 치료에 필요한 하나 이상의 다른 약물의 투여량 감소, 질환의 진행 지연, 삶의 질의 향상 또는 개선, 체중 증가, 및/또는 생을 연장. 또한, "치료"에 포함되는 것은 암의 병리학적 결과(예를 들어, 종양 부피)의 감소이다. 본원에서 제공되는 방법은 이들 치료 측면 중 임의의 하나 이상을 고려한다.
"재발생", "재발" 또는 "재발된"이라는 용어는 질환의 소멸을 임상적으로 평가한 후 암 또는 질환이 다시 발생하는 것을 의미한다. 원격 전이 또는 국소 재발생의 진단은 재발로 간주할 수 있다.
"불응성" 또는 "내성"이라는 용어는 치료에 반응하지 않은 암 또는 질환을 의미한다.
"보조 요법"은 1차 요법, 대체로 수술 후 받는 치료를 나타낸다. 암 또는 질환에 대한 보조 요법은 면역 요법, 화학요법, 방사선 요법 또는 호르몬 요법을 포함할 수 있다.
"유지 요법"이라는 용어는 선행 치료의 효과를 유지하는데 도움을 주기 위해 시행되는 예정된 재치료를 의미한다. 유지 요법은 질병 진행과 무관하게 암을 완화 상태로 유지하거나 특정 요법에 대한 반응을 연장하는 것을 돕기 위해 종종 시행된다.
용어 "침습성 암"은 암이 시작된 조직의 층을 넘어 정상적인 주변 조직으로 확산하는 암을 의미한다. 침습성 암은 전이성일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
"비침습성 암"은 매우 초기의 암 또는 기원 조직을 넘어 확산하지 않은 암을 의미한다.
종양학에서 "무진행 생존"이라는 용어는 암이 성장하지 않는, 치료 동안 또는 치료 후의 기간을 의미한다. 무진행 생존에는 환자가 완전한 반응 또는 부분 반응을 보인 시간뿐만 아니라, 환자가 안정한 질환을 경험한 시간이 포함된다.
종양학에서 "진행성 질환"이라는 용어는 종양의 덩어리가 커지거나 확산하기 때문에 치료가 시작된 이후 종양이 20% 초과의 수준으로 성장하는 것을 나타낼 수 있다.
"장애"는 항체를 사용한 치료가 효과를 보일 수 있는 임의의 병태이다. 예를 들면, 포유동물은 비정상적인 PD-1 활성으로 고통받거나 그에 대한 예방을 필요로 한다. 여기에는 포유동물이 해당 장애에 쉽게 걸리게 하는 병리적 상태를 비롯한 만성 및 급성 장애 또는 질환이 포함된다. 본원에서 치료할 장애의 비제한적인 예는 암(예를 들어, 두경부암, 인후암, 결직장암, 폐암 등)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 나타낸다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 천연 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고/하거나 본 발명의 생물학적 활성 또는 면역학적 활성을 보이는 한, 예를 들어, 단일 모노클로날 항체(아고니스트, 길항제 및 중화 항체 포함), 다중 에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 폴리클로날 항체, 단일쇄 항-항체 및 항체의 단편(아래 참조)을 포괄적으로 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 항체는 올리고머 형태의 표적 단백질, 예를 들면, 삼량체 형태에 결합한다. 다른 실시양태에 따르면, 항체는 단백질에 특이적으로 결합하고, 이 결합은 본 발명의 모노클로날 항체(예를 들어, 본 발명의 기탁된 항체 등)에 의해 억제될 수 있다. 항체의 "기능적 단편 또는 유사체"라는 어구는 그가 참조되는 항체와 공통적인 정성적 생물학적 활성을 갖는 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 기능적 단편 또는 유사체는 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있는 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 PD-1이 세포 증식을 유도하는 능력을 방지하거나 실질적으로 감소시킬 수 있다.
"단리된 항체"는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리되고/되거나 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해할 수 있는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 결정시에 항체의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과로, (2) 회전컵 서열결정기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시(Coomassie) 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
기본적인 4 사슬 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 이루어진 이종사량체 당단백질이다(IgM 항체는 J 사슬로 불리는 추가의 폴리펩티드와 함께 기본적인 이종사량체 단위 5개로 이루어지고, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 함유하는 반면, 분비된 IgA 항체는 중합하여 J 사슬과 함께 기본적인 4 사슬 단위 2-5개를 포함하는 다가 조립체를 형성할 수 있다). IgG의 경우에, 4 사슬 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 사슬은 하나의 공유 디술피드 결합에 의해 H 사슬에 연결되는 한편, 2개의 H 사슬은 H 사슬 이소형에 따라 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적으로 이격된 사슬 내 디술피드 가교를 갖는다. 각각의 H 사슬은 N 말단에 가변 도메인(VH), 이어서 각각의 α 및 γ 사슬에 대한 3개의 불변 도메인(CH) 및 μ 및 ε 이소형에 대한 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 사슬은 N 말단에 가변 도메인(VL), 이어서 그의 다른 말단부에 불변 도메인(CL)을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성한다고 생각된다. VH와 VL의 페어링은 단일 항원 결합 부위를 함께 형성한다. 상이한 클래스의 항체의 구조 및 특성에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6]을 참조한다.
임의의 척추동물 종으로부터의 L 사슬은 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파 및 람다로 불리는 2개의 명백하게 구별되는 유형 중의 하나로 지정될 수 있다. 그의 중쇄의 불변 도메인(CH)의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스 또는 이소형으로 지정될 수 있다. 다음과 같은 5가지 클래스의 면역글로불린이 존재한다: 각각 α, δ, γ, ε 및 μ로 지정된 중쇄를 갖는 Ig, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. γ 및 α 클래스는 CH 서열 및 기능의 비교적 작은 차이를 기초로 하여 하위클래스로 추가로 나누어지고, 예를 들어, 인간은 다음과 같은 하위클래스를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 분절의 서열이 항체 사이에서 크게 상이하다는 사실을 의미한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 규정한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 110개 아미노산 길이에 걸쳐 균등하게 분포되어 있지 않다. 그 대신, V 영역은 길이가 각각 9-12개 아미노산인 "초가변 영역"이라 불리는 극단적인 가변성의 보다 짧은 영역으로 분리된, 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 상대적으로 변하지 않는 스트레치로 이루어진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 주로 베타-시트 배열을 채택하는 4개의 FR을 각각 포함하고, 이것은 루프 연결을 형성하고 일부 경우에 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된다. 각각의 사슬의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하여 함께 유지되고, 다른 사슬의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비연속적인 항원 조합 부위를 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 특정 영역은 문헌 [Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); 및 MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]에 기재되어 있으며, 여기서 제시되는 정의들은 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 하위세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이식된 항체 또는 그의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 상기 언급된 참고문헌에 의해 규정되는 CDR을 포함하는 아미노산 잔기가 비교를 위해 하기 표 2에 제시된다.
<표 2>
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본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득한 항체를 지칭하고, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 더욱이, 상이한 결정기(에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 유도된다. 이들의 특이성 이외에, 모노클로날 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 임의의 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에서 유용한 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al. Nature. 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나 또는 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 만들 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제4,816,567호 참조). "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)] 및 하기 실시예에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 본 발명의 생물학적 활성을 보이는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 사슬(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 및 이러한 항체의 단편을 포함한다(미국 특허 제4,816,567호 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조). 관심 있는 키메라 항체는 비인간 영장류(예를 들어, 구세계 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다.
"무손상" 항체는 항원 결합 부위뿐만 아니라, CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인 인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예를 들어, 사람 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(미국 특허 제5,641,870호의 실시예 2; 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]] 참조); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다. "선형 항체"라는 표현은 일반적으로 문헌 [Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)]에 기재된 항체를 의미한다. 간단히 설명하면, 이들 항체는 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 분절(VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이성 또는 단일특이성일 수 있다.
항체를 파파인으로 소화하면, "Fab" 단편이라고 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편(이 명칭은 쉽게 결정화하는 능력을 반영함)을 생성시킨다. Fab 단편은 H 사슬의 가변 영역 도메인(VH)과 함께 L 사슬 전체 및 1개의 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)으로 이루어진다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합에 대해 1가이고, 즉, 단일 항원 결합 부위를 갖는다. 항체를 펩신으로 처리하면, 2가의 항원 결합 활성을 갖는 2개의 디술피드 연결된 Fab 단편에 대략 상응하고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 하나의 큰 F(ab')2 단편을 생성한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 추가된다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는, Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
Fc 단편은 디술피드에 의해 함께 결합되어 있는 H 사슬 둘 모두의 카르복시 말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역 내의 서열에 의해 결정되고, 이 영역은 또한 특정 세포 유형 상에서 발견되는 Fc 수용체(FcR)에 의해 인식되는 부분이다.
"변이체 Fc 영역"은 본원에서 정의된 바와 같은 적어도 1개의 "아미노산 변형"에 의해 천연 서열 Fc 영역과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교해서 적어도 1개의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 한 실시양태에서, 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 적어도 약 80%의 상동성, 적어도 약 85%의 상동성, 적어도 약 90%의 상동성, 적어도 약 95%의 상동성 또는 적어도 약 99%의 상동성을 가질 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에서의 변이체 Fc 영역은 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 상동성, 적어도 약 85%의 상동성, 적어도 약 90%의 상동성, 적어도 약 95%의 상동성 또는 적어도 약 99%의 상동성을 가질 것이다.
용어 "Fc 영역 함유 폴리펩티드"는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 면역어드헤신(본원의 다른 곳에서의 정의 참조)과 같은 폴리펩티드를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 리신(EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 정제 동안 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는, 항체를 비롯한 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 폴리펩티드 집단, K447 잔기가 제거되지 않는 폴리펩티드 집단, 또는 K447 잔기가 존재하거나 존재하지 않는 폴리펩티드들의 혼합물을 갖는 폴리펩티드 집단을 포함할 수 있다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에서 기인한 생물학적 활성을 지칭하며, 항체 이소형에 따라 다양하다. 항체 이펙터 기능의 예는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체의 하향조절; 및 B 세포 활성화. "천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. Fc 서열의 예는 예를 들어 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 기재된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 강한 비공유 회합 상태의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들 2개 도메인이 폴딩되어 6개의 초가변 루프(H 및 L 사슬로부터 각각 3개의 루프)가 형성되는데, 상기 루프는 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에게 항원 결합 특이성을 부여한다.
그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 종종 전체 결합 부위보다는 낮은 친화도이지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"sFv"또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 사슬로 연결되어 있는 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH와 VL 도메인 사이에 추가로 포함한다. sFv에 관해서는 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 VH 도메인 및 VL 도메인 사이의 짧은 링커(약 5-10개의 잔기)로 sFv 단편(이전 단락 참조)을 구축함으로써 V 도메인의 사슬내 페어링이 아닌 사슬간 페어링을 달성하여 2가 단편, 즉, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편을 생성하도록 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 디아바디는 2개의 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 사슬에 존재하는 2개의 "교차" sFv 단편의 이종이량체이다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"인간화된" 형태의 비인간(예를 들어, 설치류) 항체는 비인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수여자의 초가변 영역의 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화도 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수여자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 대체된다.
또한, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 보다 개량하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 선택적으로 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
폴리펩티드 또는 항체 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 비율(%)" 또는 "상동성 비율"은 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하여 서열을 정렬한 후, 비교되는 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 본원에서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 비율을 결정하기 위한 정렬은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 비교될 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬 측정에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유이고, 그 소스 코드는 미국 저작권청(미국 20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되었고, 미국 저작권 등록 번호 제TXU510087호로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크.(미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)로부터 공개적으로 입수 가능하다. ALIGN-2 프로그램은 유닉스(UNIX) 운영 체제, 바람직하게는 디지털 유닉스 V4.0D에서 사용되도록 컴파일해야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며, 변하지 않는다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하는데 사용된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것(감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위클래스의 수용체의 대립유전자 변이체 및 선택적으로 스플라이싱된 형태를 비롯한 상기 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 그의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM)를 함유한다(문헌 [M. Daёron, Annu . Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)] 참조). 이 용어는 FcγRIIIA-Phe158, FcγRIIA-Val158, FcγRIIA-R131 및/또는 FcγRIIA-H131과 같은 FcγRIIIA 동종이인자형과 같은 동종이인자형을 포함한다. FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin . Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토되어 있다. 추후로 확인될 것을 포함하는 다른 FcR이 본원에서 용어 "FcR"에 포함된다. 이 용어는 모체의 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체, 즉 FcRn을 또한 포함한다.
용어 "FcRn"은 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 나타낸다. FcRn은 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 구조적으로 유사하고, β2-마이크로글로불린에 비공유 결합된 α-사슬로 이루어진다. 신생아 Fc 수용체인 FcRn의 다중 기능은 문헌 [Ghetie and Ward (2000) Annu . Rev. Immunol . 18, 739-766]에 검토되어 있다. FcRn은 모체로부터 태아로의 면역글로불린 IgG의 수동 전달 및 혈청 IgG 수준의 조절에서 일정 역할을 수행한다. FcRn은 세포 내에서 및 세포를 가로질러 무손상 형태의 음세포작용된 IgG에 결합하여 수송하고 이를 디폴트 분해 경로로부터 구제하는 샐비지 수용체로서 작용할 수 있다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH1 도메인"("H1" 도메인의 "C1"로도 지칭됨)은 통상적으로 대략 아미노산 118로부터 대략 아미노산 215(EU 넘버링 시스템)까지 이어진다.
"힌지 영역"은 일반적으로 인간 IgG1의 Glu216으로부터 Pro230에 이르는 것으로 정의된다(Burton, Molec . Immunol .22:161-206 (1985)). 다른 IgG 이소형의 힌지 영역은 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫 번째 및 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 배치하여 IgG1 서열과 정렬될 수 있다.
Fc 영역의 "하부 힌지 영역"은 통상 힌지 영역의 바로 C 말단에 있는 잔기의 스트레치, 즉 Fc 영역의 잔기 233 내지 239로서 통상 정의된다. 이전의 보고에서, FcR 결합은 일반적으로 IgG Fc 영역의 하부 힌지 영역 내의 아미노산 잔기에 의한 것이었다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"("H2" 도메인의 "C2"로도 지칭됨)은 통상적으로 대략 아미노산 231로부터 대략 아미노산 340까지 이어진다. CH2 도메인은 또 다른 도메인과 밀접하게 페어링되지 않는다는 점에서 특유한 것이다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 사슬이 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 놓인다. 탄수화물이 도메인-도메인 페어링에 대한 대안을 제공하고 CH2 도메인의 안정화를 도울 수 있는 것으로 추측되었다(Burton, Molec Immunol. 22:161-206 (1985)].
"CH3 도메인"("C2" 또는 "H3" 도메인으로도 지칭됨)은 Fc 영역에서 CH2 도메인의 C-말단에 있는 잔기의 스트레치(즉, 항체 서열의 대략 아미노산 잔기 341에서 C-말단 단부, 전형적으로 IgG의 아미노산 잔기 446 또는 447)를 포함한다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 필요로 하고, 예를 들어 본원에서 개시되는 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"C1q"는 면역글로불린의 Fc 영역에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드이다. C1q는 2개의 세린 프로테아제, 즉 C1r 및 C1s와 함께 보체 의존성 세포독성(CDC) 경로의 첫 번째 성분인 복합체 C1을 형성한다. 인간 C1q는 예를 들어 퀴델(Quidel, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
용어 "결합 도메인"은 다른 분자에 결합하는 폴리펩티드의 영역을 의미한다. FcR의 경우에, 결합 도메인은 Fc 영역의 결합을 담당하는 그의 폴리펩티드 사슬(예를 들어, 그의 알파 사슬)의 부분을 포함할 수 있다. 하나의 유용한 결합 도메인은 FcR 알파 사슬의 세포 외 도메인이다.
FcR 결합 친화도 또는 ADCC 활성이 "변경된" 변이체 IgG Fc를 갖는 항체는 모 폴리펩티드 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 향상된 또는 감소된 FcR 결합 활성(예를 들어, FcγR 또는 FcRn) 및/또는 ADCC 활성을 갖는 것이다. FcR에 대한 "증가된 결합을 나타내는" 변이체 Fc는 모 폴리펩티드 또는 천연 서열 IgG Fc보다 더 높은 친화도(예를 들어, 더 낮은 겉보기 Kd 또는 IC50 값)로 적어도 1개의 FcR에 결합한다. 일부 실시양태에 따르면, 모 폴리펩티드와 비교하여 결합의 개선은 약 3배, 바람직하게는 약 5배, 10배, 25배, 50배, 60배, 100배, 150배, 200배, 최대 500배, 또는 약 25% 내지 1000%의 결합 개선이다. FcR에 대한 "감소된 결합을 나타내는" 폴리펩티드 변이체는 모 폴리펩티드보다 더 낮은 친화도(예를 들어, 더 높은 겉보기 Kd 또는 더 높은 IC50 값)로 적어도 1개의 FcR에 결합한다. 모 폴리펩티드와 비교하여 결합의 감소는 약 40% 또는 그 초과의 결합 감소일 수 있다.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포(예를 들어, 자연 킬러(NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포로 하여금 항원 보유 표적 세포에 특이적으로 결합한 후에 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "무장"하고 이러한 사멸에 절대적으로 요구된다. ADCC를 매개하기 위한 1차 세포인 NK 세포는 단지 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호 또는 하기 실시예에 기재된 것과 같은 시험관 내 ADCC 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 및 자연 킬러(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 기재된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
야생형 IgG Fc를 갖는 폴리펩티드 또는 모 폴리펩티드보다 더 효과적으로 인간 이펙터 세포의 존재 하에서 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 매개하거나 "증가된 ADCC를 나타내는" 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는, 검정에서 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 및 야생형 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 (또는 모 폴리펩티드)의 양이 본질적으로 동일한 경우에 시험관 내에서 또는 생체 내에서 ADCC를 실질적으로 보다 효과적으로 매개하는 것이다. 일반적으로, 이러한 변이체는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 시험관 내 ADCC 검정, 예를 들어, 예를 들어 동물 모델 등에서 ADCC 활성을 결정하기 위한 검정 또는 방법을 사용하여 확인될 것이다. 일부 실시양태에서, 바람직한 변이체는 야생형 Fc (또는 모 폴리펩티드)보다 약 5배 내지 약 100배, 예를 들어 약 25 내지 약 50배 더 효과적으로 ADCC를 매개한다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전형적 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분(C1q)이 그의 동족 항원에 결합된 항체(적절한 하위클래스의)에 결합하는 것에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다. Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고 C1q 결합 능력이 증가 또는 감소된 폴리펩티드 변이체가 미국 특허 제6,194,551B1호 및 WO99/51642에 기재되어 있다. 이들 특허 공개의 내용은 본원에 참조로 구체적으로 포함된다. 또한, 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000)]을 참조한다.
본원에서 개시되는 항-PD-1 항체 (또는 이의 단편) 또는 조성물의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 실험적으로 및 언급된 목적과 관련된 알려진 방법으로 결정될 수 있다. 용어 "치료 유효량"은 포유동물(환자로도 언급됨)에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 효과적인, 본원에서 개시된 바와 같은 항-PD-1 항체 (또는 이의 단편) 또는 조성물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 본원에서 개시되는 바와 같은 항-PD-1 항체 (또는 이의 단편) 또는 조성물의 치료 유효량은 암세포의 수를 감소시키고/시키거나; 종양 크기 또는 중량을 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 장기 내로 침윤되는 것을 억제하고/하거나(즉, 어느 정도 둔화시키고 바람직하게는 정지시킴); 종양 전이를 억제하고/하거나(즉, 어느 정도 둔화시키고 바람직하게는 정지시킴); 종양 성장을 어느 정도 억제하고/하거나; 암과 연관된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 본원에서 개시되는 바와 같은 항-PD-1 항체 (또는 이의 단편) 또는 조성물이 존재하는 암세포의 성장을 방지하고/하거나 사멸시킬 수 있는 정도까지, 이는 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량은 성장 억제량이다. 또 다른 실시양태에서, 치료 유효량은 환자의 생존을 연장하는 양이다. 또 다른 실시양태에서, 치료 유효량은 환자의 무진행 생존을 개선하는 양이다.
본 발명의 본원에서 개시되는 항-PD-1 항체 (또는 이의 단편) 또는 조성물의 "성장 억제량"은 생체 외에서 또는 생체 내에서 세포, 특히 종양, 예를 들어, 암세포의 성장을 억제할 수 있는 양이다. 신생물 세포 성장을 억제하기 위한 본 발명의 폴리펩티드, 항체, 길항제 또는 조성물의 "성장 억제량"은 실험적으로 및 공지된 방법 또는 본원에서 제공되는 실시예에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 항-PD-1 항체 (또는 이의 단편) 또는 조성물의 "세포 독성량"은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포, 특히 종양, 예를 들어 암세포의 파괴를 일으킬 수 있는 양이다. 신생물 세포 성장을 억제하기 위한 본 발명의 항-PD-1 항체 (또는 이의 단편) 또는 조성물의 "세포 독성량"은 실험적으로 및 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 항-PD-1 항체 (또는 이의 단편) 또는 조성물의 "성장 억제량"은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포, 특히 종양, 예를 들어 암세포의 성장을 억제할 수 있는 양이다. 신생물 세포 성장을 억제하기 위한 본 발명의 항-PD-1 항체 (또는 이의 단편) 또는 조성물의 "성장 억제량"은 실험적으로 및 공지된 방법 또는 본원에서 제공되는 실시예에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 상용성인"은 생물학적으로 또는 다른 측면에서 바람직하지 않은 것이 아닌 물질을 의미하며, 예를 들어 물질은 어떠한 유의한 바람직하지 않은 생물학적 효과도 야기하지 않으면서 또는 물질이 함유된 조성물의 다른 성분 중 어느 것과도 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 환자에게 투여되는 약학 조성물 내로 혼입될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 바람직하게는 독성학적 및 제조 시험의 요구 기준을 충족하고/하거나, 미국 식품 의약국(FDA)에 의해 작성된 불활성 성분 지침(Inactive Ingredient Guide)에 포함된다.
"검출"이라는 용어는 물질의 존재 또는 부재를 결정하거나 물질(예를 들어, PD-1)의 양을 정량하는 것을 포함한다. 따라서, 이 용어는 정성적 및 정량적 결정을 위한 본 발명의 물질, 조성물 및 방법의 사용을 의미한다. 일반적으로, 검출에 사용되는 특정 기술은 본 발명의 실시에 중요하지 않다.
예를 들어, 본 발명에 따른 "검출"은 PD-1 유전자 산물, mRNA 분자 또는 PD-1 폴리펩티드의 존재 또는 부재; PD-1 폴리펩티드 수준 또는 표적에 결합된 양의 변화; PD-1 폴리펩티드의 생물학적 기능/활성의 변화를 관찰하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, "검출"은 야생형 PD-1 수준(예를 들어, mRNA 또는 폴리펩티드 수준)을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 검출에는 대조군과 비교할 때 10%와 90% 사이의 임의의 값 또는 30%와 60% 사이의 임의의 값 또는 100% 초과의 값의 변화(증가 또는 감소)를 정량하는 것이 포함될 수 있다. 검출은 2배 이상 10배 이하 중의 임의의 값, 또는 그 초과, 예를 들어 100배의 변화를 정량하는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 사용될 때 "표지"라는 용어는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합된 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체로 단독으로 검출 가능하거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
본원에서 값 또는 파라미터에 대해 언급되는 "약"은 본 기술 분야에서 통상의 기술자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 나타낸다. 본원에서 "약" 값 또는 파라미터의 언급은 해당 값 또는 파라미터 자체에 관한 측면을 포함한다(그리고, 설명한다). 예를 들어, "약 X"를 언급하는 설명은 "X"에 대한 설명을 포함한다.
본원에서 설명되는 본 발명의 측면 및 실시양태는 그 측면 및 실시양태를 "포함하는", 이로 "이루어지는" 및 이로 "본질적으로 이루어지는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
특허 출원 및 간행물을 비롯하여 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
항-PD-1 항체
본 발명은 PD-1 수용체(PD-1)에 결합하는 신규한 항체의 확인에 기초한다. 항-PD-1 항체는 다양한 치료 및 진단 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, PD-1 항체는 예를 들어 흑색종, NSCLC, 두경부암, 요로상피암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암, TNBC), 위암, 전형적 호지킨 림프종(cHL), 비호지킨 림프종 원발성 종격동 B 세포 림프종(NHL PMBCL), 중피종, 난소암, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암), 식도암, 비인두 암종(NPC), 담도암, 결직장암, 자궁경부암, 갑상선암을 비롯한, 비정상적인 PD-1 발현 또는 비정상적인 PD-1 활성을 특징으로 하는 질환을 치료할 때 단독으로 또는 다른 약제와 조합하여 사용될 수 있다. 또한, 본원에서 제공되는 항체는 항-PD-1 항체를 환자에게 투여하고 환자로부터의 샘플에서 PD-1 단백질에 결합된 항-PD-1 항체를 검출함으로써(예를 들어, 생체 내에서 또는 생체 외에서), 또는 항-PD-1 항체를 환자로부터의 샘플과 접촉시키고 PD-1 단백질에 결합된 항-PD-1 항체를 정성적으로 또는 정량적으로 검출함으로써 환자 또는 환자 샘플에서 PD-1 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1 및 CD279(분화 클러스터 279)로도 알려짐)은 인간에서 PDCD1 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. PD-1은 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하고 T 세포 및 프로-B 세포 상에서 발현되는 세포 표면 수용체이다. PD-1은 2개의 리간드, 즉 PD-L1 및 PD-L2에 결합한다. 면역 체크포인트로서 기능하는 PD-1은 T-세포의 활성화를 방지함으로써 면역계를 하향조절하는데 있어서 중요한 역할을 하고, 이것은 다시 자가면역을 감소시키고, 자가내성을 증진시킨다. PD-1의 억제 효과는 조절 T 세포(서프레서 T 세포)에서 아폽토시스를 감소시킴과 동시에, 림프절에서 항원 특이적 T-세포에서 아폽토시스(프로그램된 세포 사멸)를 증진시키는 이중 메카니즘을 통해 달성된다.
항-PD-1 항체는 충분한 친화도 및 특이성으로 PD-1에 결합하는 항체이다. 바람직하게는, 본원에서 제공되는 항-PD-1 항체 (또는 그의 항원 결합 단편)는 PD-1 활성이 관여하는 질환 또는 병태를 표적화하고 저해하는 치료제로서 사용될 수 있다. 항-PD-1 항체는 대체로 다른 면역글로불린 수퍼패밀리에 결합하지 않는다. 바람직하게는, 항-PD-1 항체는 재조합 인간화 항-PD-1 모노클로날 항체이다.
한 실시양태에 따르면, 항-PD-1 항체는 본원에서 개시되는 항체 중 임의의 하나의 CDR, 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 (1) 아미노산 서열 KASQDVTTAVA(서열 번호 9)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASTRHT(서열 번호 10)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYTIPWT(서열 번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄(LC) 가변 도메인 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FTFSNYGMS(서열 번호 12)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNIY(서열 번호 13)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 VSYYYGIDF(서열 번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄(HC) 가변 도메인 서열을 포함하는 키메라 항-PD-1 항체 c1G4 및/또는 인간화된 항-PD-1 h1G4이다. 일부 실시양태에서, 변이체는 서열 번호 9-14 중 하나 이상의 서열에 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개의 아미노산 치환을 포함한다.
c1G4 및 h1G4의 경쇄 및 중쇄의 전장 아미노산 및 뉴클레오티드 서열 및 그의 CDR 서열은 하기 서열 목록에 제공된다.
또한, 본 발명에 의해 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 제공된다.
또한, 본 발명에 의해 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 제공된다.
본 발명은 인간화된 h1G4 항-PD-1 항체에 대한 친화도 성숙 항체를 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 성숙 항-PD-1 항체(예를 들어, 항-PD-1 항체, 33B)는 (1) 아미노산 서열 KASTDVTTAVA(서열 번호 15)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASLRHT(서열 번호 16)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYGIPWT(서열 번호 17)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄(LC) 가변 도메인 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FRFSNYGMS(서열 번호 18)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNAY(서열 번호 19)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 TSYYYGIDF(서열 번호 20)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄(HC) 가변 도메인 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 성숙 항-PD-1 항체(예를 들어, 항-PD-1 항체, 66E)는 (1) 아미노산 서열 KAKQDVTTAVA(서열 번호 21)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASTRHT(서열 번호 10)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYWIPWT(서열 번호 22)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄(LC) 가변 도메인 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FTFSNYGMS(서열 번호 12)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNIY(서열 번호 13)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 VSYYYGIDL(서열 번호 23)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄(HC) 가변 도메인 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 성숙 항-PD-1 항체(예를 들어, 항-PD-1 항체, 711D)는 (1) 아미노산 서열 KASQDVTNAVA(서열 번호 24)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASTRHT(서열 번호 10)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYTIPWT(서열 번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄(LC) 가변 도메인 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FTFSNYGMS(서열 번호 12)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNIY(서열 번호 13)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 SSYYYGIDL(서열 번호 25)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄(HC) 가변 도메인 서열을 포함한다.
중쇄 및 경쇄 가변 도메인 및 CDR은 다수의 항-PD-1 항체를 생성하기 위해 모든 가능한 쌍의 조합으로 조합된다.
특정 실시양태에서, 아미노산 치환(들)은 보존적 아미노산 치환(들)이다. 특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는다. 예를 들어, PD-1 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본원에서 제시되는 바와 같은 보존적 치환)이 이루어질 수 있다. 항-PD-1 항체 변이체의 결합 친화도는 하기 실시예에 기재된 방법을 사용하여 평가할 수 있다.
보존적 치환은 "보존적 치환"이라는 표제 하에 표 3에 제시된다. 실질적인 변화는 "예시적인 치환"이라는 표제 하에 표 3에서 제공되며, 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 아래에서 더 설명된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입될 수 있으며, 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 PD-1 결합, 면역원성 감소, 또는 ADCC 또는 CDC 개선에 대해 생성물을 스크리닝할 수 있다.
<표 3> 보존적 치환
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비보존적 치환은 이들 클래스 중 한 클래스의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙 항체이며, 예를 들어 본원에서 설명되는 것과 같은 파지 디스플레이에 기초한 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간단히 설명하면, 하나 이상의 CDR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체는 파지 상에 디스플레이되고 특정 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 변경(예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선하기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟"에서, 즉, 체세포 성숙 과정 동안 고빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩되는 잔기(예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol . Biol . 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 SDR(a-CDR)에서 이루어질 수 있으며, 생성되는 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터 구축되고 재선택하는 것에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에 기재되어 있다.
친화도 성숙의 일부 실시양태에서, 다양성은 임의의 다양한 방법(예를 들어, 오류 빈발 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드 지시된 돌연변이 유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서, 라이브러리는 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 모이어티 변이체를 확인하기 위해 스크리닝된다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 여러 HVR 잔기(예를 들어, 한 번에 4-6개의 잔기)가 무작위화된 HVR 지시된 접근법을 수반한다. 항원 결합에 수반되는 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 (1) 서열 번호 9, 21 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (2) 서열 번호 10 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; (3) 서열 번호 11, 17, 22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL) 서열, 및 (1) 서열 번호 12 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (2) 서열 번호 13 또는 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 서열 번호 14, 20, 23 및 25로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열(VH)을 포함한다.
중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 다수의 항-PD-1 항체를 생성하기 위해 모든 가능한 쌍의 조합으로 조합된다.
특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 항체 배치 내에서 차이를 야기할 수 있는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 N-글리코실화 모티프가 결여되어 변경된 기능, 면역원성 또는 안정성을 유도할 수 있다. 항체 글리코실화를 분석하는 방법은 크로마토그래피(예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 또는 액체 크로마토그래피), 질량 분광법(예를 들어, 전기분무 이온화 질량 분광법) 및 모세관 전기영동-소듐 도데 실 술페이트를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Jung et al. (2011) Curr Op Biotechnol . 22(6):858-67; Cummings RD, Etzler ME. Antibodies and Lectins in Glycan Analysis. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 45; Mulloy B, Hart GW, Stanley P. Structural Analysis of Glycans. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 47; Leymarie, et al. (2012) Anal Chem. 84(7): 3040-3048; Fernandez (2005) European Biopharmaceutical Review. pp 106-110; 및 Raju, T. (2013) Methods Mol Biol. 988: 169-180]에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 PD-1의 상동체에 대한 결합 친화도보다 더 강한 PD-1에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일반적으로, 항-PD-1 항체는 PD-1에 "특이적으로 결합"하지만(즉, 약 1 x 10-7 M 이하, 바람직하게는 약 1 x 10-8 M 이하, 가장 바람직하게는 약 1 x 10-9 M 이하의 결합 친화도(Kd) 값을 갖지만), PD-1에 대한 그의 결합 친화도보다 적어도 약 50배, 또는 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1000배 더 약한 PD-1 패밀리의 구성원에 대한 결합 친화도를 갖는다. PD-1에 특이적으로 결합하는 항-PD-1 항체는 상기 정의된 바와 같은 다양한 유형의 임의의 항체일 수 있지만, 바람직하게는 인간화 또는 인간 항체이다.
일부 실시양태에서, 비표적 단백질에 대한 항-PD-L1 항체의 결합 정도는 ELISA, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석 또는 방사성 면역침전법(RIA)에 의해 결정시 PD-1에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 예를 들어, 특이적 결합은 분자의 결합을, 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과량의 비표지된 표적과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이 경우, 표지된 표적의 프로브에 대한 결합이 과량의 비표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제되면, 특이적 결합이 나타난다. 본원에서 사용되는 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합" 또는 이에 "특이적으로 결합하다" 또는 이에 "특이적인"은 예를 들어 표적에 대해 적어도 약 10-4 M, 대안적으로 적어도 약 10-5 M, 대안적으로 적어도 약 10-6 M, 대안적으로 적어도 약 10-7 M, 대안적으로 적어도 약 10-8 M, 대안적으로 적어도 약 10-9 M, 대안적으로 적어도 약 10-10 M, 대안적으로 적어도 약 10-11 M, 대안적으로 적어도 약 10-12 M 또는 그 초과의 Kd를 갖는 분자에 의해 제시될 수 있다. 한 실시양태에서, 용어 "특이적인 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 대해 실질적으로 결합하지 않으면서 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 결합을 지칭한다.
항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)은 종양 세포에 대한 치료 항체의 작용 메커니즘이다. ADCC는 그의 막 표면 항원이 특이적인 항체(예를 들어, 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체와 같은)에 의해 결합된 표적 세포(예를 들어, 암세포)를 면역계의 이펙터 세포가 능동적으로 분해하는 세포 매개 면역 방어이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 예를 들어 실시예에서 설명되는 검정에 의해 제시되는 바와 같이, OPDIVO® 또는 니볼루맙과 유사한 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 이펙터 기능을 보인다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체의 ADCC 이펙터 기능 활성은 OPDIVO®(니볼루맙)의 ADCC 이펙터 기능 활성의 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 100%, 또는 100% 초과(예를 들어, 약 105%, 약 106%, 약 107%, 약 108%, 약 109%, 약 110%, 약 111%, 약 112%, 약 113%, 약 114%, 약 115%, 약 116%, 약 117%, 약 118%, 약 119%, 약 120%, 약 121%, 약 122%, 약 123%, 약 124%, 약 125%, 또는 약 130%)(이들 값 사이의 임의의 범위 포함)이다.
특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 OPDIVO®와 유사한 PD-1에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 특정 실시양태에서, PD-1에 대한 결합은 실시예에서 설명되는 바와 같이 ELISA에 의해 입증된다. 예를 들어, PD-1에 대한 항-PD-1의 결합 친화도는 PD-1에 대한 OPDIVO®(니볼루맙)의 결합 친화도보다 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 100% 초과의 수준(예를 들어, 약 105%, 약 106%, 약 107%, 약 108%, 약 109%, 약 110%, 약 111%, 약 112%, 약 113%, 약 114%, 약 115%, 약 116%, 약 117%, 약 118%, 약 119%, 약 120%, 약 121%, 약 122%, 약 123%, 약 124%, 약 125% 또는 약 125% 초과)으로 더 높다.
특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 0.1 pM 내지 200 pM(0.2 nM), 예를 들어 약 0.1 pM, 약 0.25 pM, 약 0.5 pM, 약 0.75 pM, 약 1 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 20 pM, 약 30 pM, 약 40 pM, 약 50 pM, 약 60 pM, 약 70 pM, 약 80 pM, 약 90 pM, 약 100 pM, 약 110 pM, 약 120 pM, 약 130 pM, 약 140 pM, 약 150 pM, 약 160 pM, 약 170 pM, 약 180 pM, 약 190 pM 또는 약 190 pM 초과(이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 Kd로 인간 PD-1에 결합한다. 특정 실시양태에서, PD-1에 대한 항-PD-1 항체의 결합 친화도는 PD-1에 대한 OPDIVO®(니볼루맙)의 결합 친화도보다 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 또는 약 100% 초과의 수준(예를 들어, 약 105%, 약 110%, 약 120% 또는 약 130%)으로 더 높다. 특정 실시양태에서, PD-1에 대한 항-PD-1의 결합 친화도는 OPDIVO®(니볼루맙)의 결합 친화도보다 약 1.1배, 약 1.2배, 약 1.3배, 약 1.4배, 약 1.5배, 약 1.6배, 약 1.7배, 약 1.8배, 약 1.9배, 약 2배, 약 2.25배, 약 2.5배, 약 2.75배, 약 3배, 약 3.25배, 약 3.5배, 약 3.75배, 약 4배, 약 4.2배, 약 4.5배, 약 4.75배 또는 약 4.75배 초과의 수준으로 더 높다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항-PD-1 항체는 OPDIVO®와 비교할 때 연장된 생체 내 반감기를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체의 생체 내 반감기는 OPDIVO®의 생체 내 반감기보다 더 짧지 않다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항-PD-1 항체는 OPDIVO®(니볼루맙) 또는 그의 바이오시밀러와 유사한 약동학적 특성을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항-PD-1 항체는 OPDIVO®(니볼루맙) 또는 그의 바이오시밀러의 혈청 농도-시간 프로파일의 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 95% 초과(예를 들어, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과)(이들 값 사이의 임의의 범위 포함)인 AUC(곡선 하 면적)를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 항체는 인간 IgG, 예를 들어, 인간 IgG1 또는 인간 IgG4의 Fc 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Fc 서열은 종종 Fc 수용체(FcR)에 대한 그의 결합과 관련된 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC) 이펙터 기능이 결여되도록 변경되거나 변화되었다. 이펙터 기능을 변경할 수 있는 Fc 서열에 대한 변화 또는 돌연변이의 많은 예가 존재한다. 예를 들어, WO 00/42072 및 문헌 [Shields et al. J Biol. Chem . 9(2): 6591-6604 (2001)]에는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 이들 간행물의 내용은 본원에 참고로 구체적으로 포함된다. 항체는 Fab, Fab', F(ab)'2, 단일쇄 Fv(scFv), Fv 단편; 디아바디 및 선형 항체를 포함한다. 또한, 항체는 PD-1에 결합하지만, 하나 이상의 다른 표적에 결합하여 그 기능을 억제하는 다중 특이적 항체일 수 있다. 항체는 치료제(예를 들어, 세포독성제, 방사성 동위원소 및 화학치료제) 또는 영상화(예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 염료 및 효소)에 의해 환자 샘플에서 또는 생체 내에서 PD-1을 검출하기 위한 표지에 접합될 수 있다. 다른 변형은 본원에서 제공되는 항-PD-1 항체에 대한 독소의 접합을 포함한다.
항-PD-1 항체를 코딩하는 핵산 분자, 본원에서 설명되는 CDR 및/또는 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 세포가 또한 고려된다. 이들 항체는 본원에서 설명되는 치료에 및 환자 샘플에서(예를 들어, FACS, 면역 조직화학(IHC), ELISA 검정을 통해) 또는 환자에서 PD-1 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
모노클로날 항체
모노클로날 항체는 예를 들어 하이브리도마 방법, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기재된 것을 사용하여 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호)을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 본원에서 하기 실시예에서 설명되는 방법에 의해 생산될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 햄스터, 마우스, 또는 다른 적절한 숙주 동물은 전형적으로 면역화제로 면역화되어 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 생성한다. 대안적으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다.
면역화제는 전형적으로 폴리펩티드 또는 관심 단백질의 융합 단백질 또는 상기 단백질을 포함하는 조성물을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 요망되는 경우에 말초 혈액 림프구("PBL")가 사용되거나, 또는 비인간 포유동물 공급원이 요망되는 경우에 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서 림프구는 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화 세포주와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE, New York: Academic Press, 1986, pp. 59-103). 불멸화 세포주는 통상적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소, 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우에, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 HGPRT 결핍 세포의 성장을 방지하는 하이포크산틴, 아미노프테린, 및 티미딘("HAT 배지")을 포함할 것이다.
바람직한 불멸화 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생산 세포에 의한 항체의 안정한 높은 수준의 발현을 지지하고, 배지, 예를 들어 HAT 배지에 감수성인 세포주이다. 보다 바람직한 불멸화 세포주는 예를 들어 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center) 및 미국 버지니아주 매너서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수할 수 있는 뮤린 골수종 세포주이다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 문헌에 기재되었다(Kozbor, J. Immunol ., 133:3001 (1984); Brodeur et al. MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987, pp. 51-63).
이어서, 하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지는 폴리펩티드에 대해 작용하는 모노클로날 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해 또는 시험관 내 결합 검정, 예를 들어 방사성 면역검정(RIA) 또는 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 이러한 기술 및 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson and Pollard, Anal. Biochem ., 107:220 (1980)]의 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다.
목적하는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론은 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝될 수 있고, 표준 방법에 의해 성장될 수 있다(Goding, 상기 문헌). 이 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 둘베코(Dulbecco) 변형 이글 배지 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 포유동물에서 복수로서 생체 내에서 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 배양 배지 또는 복수액으로부터 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 단리되거나 정제될 수 있다.
모노클로날 항체는 또한 재조합 DNA 방법, 예를 들어 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것에 의해 제조될 수 있다. 본원에서 제공되는 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열결정될 수 있다. 본원에서 제공되는 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로서 기능한다. 단리된 후, DNA는 발현 벡터 내에 도입될 수 있고, 이는 이어서 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예를 들어 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포 내로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성할 수 있게 한다. DNA는 또한 예를 들어 상동 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환하거나(미국 특허 제4,816,567호; [Morrison et al., 상기 문헌]) 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유 연결함으로써 변형될 수 있다. 이러한 비면역글로불린 폴리펩티드로 본원에서 제공되는 항체의 불변 도메인이 치환될 수 있거나, 또는 본원에서 제공되는 항체의 하나의 항원 조합 부위의 가변 도메인이 치환되어 키메라 2가 항체를 생성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 항-PD-1 항체는 안정한 포유동물 세포주에 의해 발현된다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 항-PD-1 항체는 약 2.0 g/l, 약 2.5 g/l, 약 3.0 g/l, 약 3.5 g/l, 약 4.0 g/l, 약 4.5 g/l, 약 5.0 g/l, 약 5.5 g/l, 약 6 g/l, 약 6.5 g/l, 약 7.0 g/l, 또는 약 7.0 g/l 초과(이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 역가로 안정한 포유동물 세포주에서 발현된다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 항-PD-1 항체가 발현되는 안정한 포유동물 세포주는 CHO 세포주이다.
특정 실시양태에서, 항체는 1가 항체이다. 1가 항체를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 수반한다. 중쇄는 일반적으로 중쇄 가교결합이 방지되도록 Fc 영역 내의 임의의 위치에서 말단절단된다. 대안적으로, 관련 시스테인 잔기는 가교결합이 방지되도록 또 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.
시험관 내 방법이 또한 1가 항체를 제조하는데 적합하다. 항체의 단편, 특히 Fab 단편을 생성하기 위한 항체의 절단은 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 달성될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
인간 및 인간화 항체
항체는 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 인간화 형태의 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체는 전형적으로 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 그의 단편(예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)이다. 인간화 항체는 수여자의 CDR로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는, 비인간 종, 예를 들어 마우스, 래트, 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기(공여자 항체)에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수여자 항체)을 포함한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 인간화 항체는 또한 수여자 항체에서 및 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 수 있으며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화 항체는 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다(Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)).
일반적으로, 인간화 항체는 비인간인 공급원으로부터 그 내로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 전형적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취해지는 "도입" 잔기로 종종 지칭된다. 일부 실시양태에 따르면, 인간화는 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료의 방법(Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))에 따라, 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 항체(미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
인간화에 대한 대안으로 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화시에 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역(JH) 유전자의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 초래한다고 문헌에 기재되어 있다. 이러한 생식계열 돌연변이체 마우스에 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 옮기면 항원 챌린지시에 인간 항체가 생성될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al. PNAS USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al. Year in Immunol ., 7:33 (1993)]; 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,591,669호; 제5,545,807호; 및 WO 97/17852를 참조한다.
대안적으로, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스 내로 도입함으로써 제조될 수 있다. 챌린지시에, 유전자 재배열, 조립, 및 항체 레퍼토리를 포함하는 모든 관점에서 인간에서 관찰되는 것과 밀접하게 유사한 인간 항체 생산이 관찰된다. 이 접근법은 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호, 및 문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol ., 13: 65-93 (1995)]에 기재되어 있다.
대안적으로, 파지 디스플레이 기술(McCafferty et al., Nature 348:552-553 1990)을 이용하여 면역화되지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생산할 수 있다. 이러한 기술의 한 실시양태에 따라, 항체 V 도메인 서열을 섬유상 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 외피 단백질 유전자 내에 인 프레임으로 클로닝하고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로서 디스플레이한다. 파지 디스플레이는 예를 들어 하기 실시예 섹션에서 설명되거나 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]에서 고찰된 다양한 포맷으로 수행할 수 있다. V-유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소규모 무작위 조합 라이브러리로부터의 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 면역화하지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 구축할 수 있고, 다양한 항원(자가 항원 포함) 어레이에 대한 항체는 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라서 단리될 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호를 참조한다.
상기한 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관 내에서 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다(미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조).
인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다(Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol., 222: 581 (1991)). 콜(Cole) 등 및 뵈르너(Boerner) 등의 기술이 인간 모노클로날 항체의 제조에 또한 이용 가능하다(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) 및 Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)).
다중 특이적 항체
다중 특이적 항체는 2종 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다(예를 들어, 이중 특이적 항체는 적어도 2개의 항원에 대해 결합 특이성을 갖는다). 예를 들어, 결합 특이성 중 하나는 a5~1 단백질에 대한 것일 수 있고, 다른 하나는 다른 항원에 대한 것일 수 있다. 한 바람직한 실시양태에 따르면, 다른 항원은 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛이다. 예를 들어, 세포 표면 단백질은 자연 킬러(NK) 세포 수용체 일 수 있다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 본 발명의 이중 특이적 항체는 PD-1 및 예를 들어 제2 세포 표면 수용체 둘 모두에 결합할 수 있다.
이중 특이적 항체를 제조하는 적합한 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현에 기초하고, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이들 하이브리도마(콰드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하며, 이 중 단지 하나의 항체 분자만 정확한 이중 특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 통상적으로 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 달성된다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO , 10: 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
원하는 결합 특이성(항체-항원 조합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인에 의해 이루어진다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)이 적어도 하나의 융합체에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 및 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 내로 동시에 형질감염시킨다. 이중 특이적 항체의 생성에 대한 보다 상세한 내용은 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology , 121: 210 (1986)]을 참조한다.
이중 특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양물로부터 직접 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 문헌에서 설명되었다. 예를 들어, 이중 특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되었다(Kostelny et al., J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결하였다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성한 후, 이를 재산화시켜 항체 이종이량체를 형성하였다. 이 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., PNAS USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 다른 메카니즘을 제공하였다. 상기 단편은 동일한 사슬 상에서 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 1개 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하게 되고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하는 다른 전략도 보고된 바 있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.
2가 초과의 결합가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중 특이적 항체를 제조할 수 있다(Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)).
이종접합체 항체
이종접합체 항체는 2개의 공유 연결된 항체로 이루어진다. 그러한 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원치 않는 세포에 대해 표적화하기 위해(미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해 제안되었다(WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 0308936). 항체는 가교결합제를 사용하는 것을 비롯하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관 내에서 제조될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 이용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트 및, 예를 들어 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 것을 포함한다.
이펙터 기능 조작
예를 들어 암 치료시에 항체의 효과를 향상시키기 위해 본원에서 제공되는 항체를 이펙터 기능에 대해 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)이 Fc 영역 내에 도입되어, 상기 영역 내에 사슬간 디술피드 결합이 형성될 수 있다. 이와 같이 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체 매개 세포 사멸 및 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp Med . 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, J. Immunol ., 148: 2918-2922 (1992)]을 참조한다. 또한, 항종양 활성이 향상된 동종이량체 항체는 문헌 [Wolff et al., Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 이종이관능성 가교결합제를 사용하여 제조할 수도 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 조작할 수 있고, 이에 의해 항체의 보체 용해 및 ADCC 능력이 증진될 수 있다. 문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)]을 참조한다.
Fc 영역 서열에서의 돌연변이 또는 변경은 FcR 결합(예를 들어, FcγR, FcRn)을 개선하기 위해 이루어질 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 본 발명의 항체는 천연 IgG 또는 모 항체와 비교하여 ADCC, CDC 및 개선된 FcRn 결합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변경된 이펙터 기능을 갖는다. 몇 가지의 유용한 특정 돌연변이의 예는 예를 들어 문헌 [Shields, RL et al. (2001) JBC 276(6)6591-6604; Presta, L.G., (2002) Biochemical Society Transactions 30(4):487-490]; 및 WO 00/42072에 기재되어 있다.
한 실시양태에 따르면, Fc 수용체 돌연변이는 Fc 영역의 238, 239, 246, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 및 439로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에서의 치환이고, 여기서 Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 EU 넘버링 시스템에 따른다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체 돌연변이는 D265A 치환이다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체 돌연변이는 N297A 치환이다. 추가의 적절한 돌연변이는 미국 특허 제7,332,581호에 제시되어 있다.
면역접합체
본 발명은 또한 화학치료제, 독소(예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 접합체)와 같은 세포독성제에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 방사성 접합된 항체의 생산을 위한 다양한 방사성 핵종이 이용 가능하다. 그 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re를 포함한다. 상기 면역접합체의 생성에 유용한 예시적인 화학요법제는 본원의 다른 곳에 기재된 것들을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항-PD-1 항체는 메이탄신, 메이탄시노이드 또는 칼리케아미신에 접합된다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항-PD-1 항체는 메이탄시노이드 DM1에 접합된다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체(예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들어 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14 표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 대한 방사성 뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이팅제이다. 예를 들어, WO94/11026을 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 종양 사전-표적화에 이용하기 위한 "수용체"(예를 들어, 스트렙타비딘)에 접합될 수 있고, 여기서 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 후에, 제거제를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환계로부터 제거하고, 이어서 세포독성제(예를 들어, 방사성 뉴클레오티드)에 접합된 "리간드"(예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
공유 변형
항-PD-1 항체 및 그의 단편의 공유 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 공유 변형의 한 유형은 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 유도체화제로 유도체화하는 것은 예를 들어 항체 정제 방법에 사용하기 위해 폴리펩티드를 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 가교결합시키는데 유용하며, 그 역도 가능하다. 일반적으로 사용되는 가교결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 디숙신이미딜 에스테르, 예를 들어 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 이관능성 말레이미드, 예를 들어 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄, 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트를 포함한다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카복실기의 아미드화를 포함한다.
폴리펩티드의 또 다른 유형의 공유 변형은 폴리펩티드를 미국 특허 제4,640,835호, 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 제시된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 연결시키는 단계를 포함한다.
키메라 분자
본 발명의 항-PD-1 항체 및/또는 그의 단편은 또한 유리할 경우, 또 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열(예를 들어, 면역어드헤신 또는 펩티바디)에 융합된 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.
한 실시양태에서, 이러한 키메라 분자는 예를 들어 인간 면역 결핍 바이러스 TAT 단백질의 단백질 전달 도메인을 사용하여 다양한 조직으로, 보다 특히 뇌 혈액 장벽을 통해 전달하기 위해 폴리펩티드를 표적화하는 단백질 전달 도메인과 폴리펩티드의 융합체를 포함한다(Schwarze et al., 1999, Science 285: 1569-72).
또 다른 실시양태에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 폴리펩티드의 아미노 말단 또는 카르복실 말단에 위치한다. 이러한 에피토프 태그 부착된 형태의 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 제공하면, 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또 다른 유형의 친화도 매트릭스를 사용하는 친화도 정제에 의해 폴리펩티드를 용이하게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들 각각의 항체는 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 그 예는 다음을 포함한다: 폴리-히스티딘(poly-His) 또는 폴리-히스티딘-글리신(poly-His-gly) 태그; 독감 HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5(Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; c-myc 태그 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체(Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그 및 그의 항체(Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)). 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드(Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)); KT3 에피토프 펩티드(Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)), α-튜불린 에피토프 펩티드(Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)) 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그(Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990))를 포함한다.
대안적인 실시양태에서, 키메라 분자는 폴리펩티드와 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역과의 융합체를 포함할 수 있다. 2가 형태의 키메라 분자(예를 들어, "면역어드헤신")의 경우, 그러한 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역에 있을 수 있다. 본 발명의 Ig 융합체는 Ig 분자 내의 적어도 하나의 가변 영역 대신에 인간의 대략 또는 단지 잔기 94-243, 잔기 33-53 또는 잔기 33-52를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 면역글로불린 융합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 면역글로불린 융합체의 생산에 대해서는, 1995년 6월 27일자로 등록된 미국 특허 제5,428,130호를 또한 참조한다.
면역리포솜
본원에서 개시되는 항체는 또한 면역리포솜으로서 제제화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포솜은 문헌 [Epstein et al., PNAS USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., PNAS USA, 77: 4030(1980)] 및 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 기재된 바와 같이 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 향상된 리포솜은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG 유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 소정의 공극 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경의 리포솜을 생성한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술피드 교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al., J. Biol . Chem ., 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포솜에 접합될 수 있다. 또한, 항신생물제, 성장 억제제 또는 화학치료제(예를 들어, 독소루비신)가 선택적으로 리포솜 내에 함유된다. 문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)]을 참조한다.
항-PD-1 항체를 이용한 치료
본원에서 제공되는 항-PD-1 항체 및/또는 그의 단편 및/또는 조성물은 예를 들어 암(예를 들어, 두경부암, 인후암, 결직장암, 폐암 등)을 포함하는 비정상적인 PD-1 활성을 수반하는 질환 및 장애를 치료하기 위해 대상체(예를 들어, 사람과 같은 포유동물)에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 암(예를 들어, 흑색종, NSCLC, 두경부암, 요로상피암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암, TNBC), 위암, 전형적 호지킨 림프종(cHL), 비호지킨 림프종 원발성 종격동 B 세포 림프종(NHL PMBCL), 중피종, 난소암, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암), 식도암, 비인두 암종(NPC), 담도암, 결직장암, 자궁경부암, 갑상선암)을 치료하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체 (또는 그의 단편)을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 암(예를 들어, 흑색종, NSCLC, 두경부암, 요로상피암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암, TNBC), 위암, 전형적 호지킨 림프종(cHL), 비호지킨 림프종 원발성 종격동 B 세포 림프종(NHL PMBCL), 중피종, 난소암, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암), 식도암, 비인두 암종(NPC), 담도암, 결직장암, 자궁경부암, 갑상선암)을 치료할 때 사용하기 위한, 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체 (또는 그의 단편)을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 암(예를 들어, 흑색종, NSCLC, 두경부암, 요로상피암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암, TNBC), 위암, 전형적 호지킨 림프종(cHL), 비호지킨 림프종 원발성 종격동 B 세포 림프종(NHL PMBCL), 중피종, 난소암, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암), 식도암, 비인두 암종(NPC), 담도암, 결직장암, 자궁경부암, 갑상선암)을 치료할 때 사용하기 위한, 본원에서 제공되는 항-PD-1 항체 (또는 그의 단편)을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 치료되는 대상체는 포유동물(예를 들어, 비이간 영장류, 래트, 마우스, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 등)이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 임상 환자, 임상 시험 지원자, 실험 동물 등이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 암(예를 들어, 흑색종, NSCLC, 두경부암, 요로상피암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암, TNBC), 위암, 전형적 호지킨 림프종(cHL), 비호지킨 림프종 원발성 종격동 B 세포 림프종(NHL PMBCL), 중피종, 난소암, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암), 식도암, 비인두 암종(NPC), 담도암, 결직장암, 자궁경부암, 갑상선암)을 갖고 있거나 가질 위험이 있거나, 또는 비정상적인 PD-1 발현 또는 활성을 갖는 암 또는 임의의 다른 질환으로 진단될 위험이 있는 것으로 의심되는 대상체이다.
암(예를 들어, 흑색종, NSCLC, 두경부암, 요로상피암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암, TNBC), 위암, 전형적 호지킨 림프종(cHL), 비호지킨 림프종 원발성 종격동 B 세포 림프종(NHL PMBCL), 중피종, 난소암, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암), 식도암, 비인두 암종(NPC), 담도암, 결직장암, 자궁경부암, 갑상선암), 또는 비정상적인 PD-1 활성을 보이는 임의의 다른 질환을 진단하고 이들 질환을 임상적으로 설명하기 위한 많은 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 그러한 방법은 예를 들어 면역 조직화학법, PCR, 형광 계내 혼성(FISH)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 비정상적인 PD-1 활성 또는 발현을 진단하는 방법에 관한 추가적인 세부 사항은 예를 들어 문헌 [Gupta et al. (2009) Mod Pathol . 22(1): 128-133; Lopez-Rios et al. (2013) J Clin Pathol . 66(5): 381-385; Ellison et al. (2013) J Clin Pathol 66(2): 79-89; 및 Guha et al. (2013) PLoS ONE 8(6): e67782]에 기재되어 있다.
투여는 예를 들어 정맥 내, 근육 내 또는 피하를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 실시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항-PD-1 항체 (또는 그의 단편) 및/또는 조성물은 비정상적인 PD-1 활성을 수반하는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 제2, 제3 또는 제4 약제(예를 들어, 항신생물제, 성장 억제제, 세포독성제 또는 화학치료제)와 조합하여 투여된다. 상기 약제는 예를 들어 도세탁셀, 게피티닙, FOLFIRI(이리노테칸, 5-플루오로우라실 및 류코보린), 이리노테칸, 시스플라틴, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 베바치주맙(항-VEGF 항체), FOLFOX-4, 주입 플루오로우라실, 류코보린 및 옥살리플라틴, 아파티닙, 겜시타빈, 카페시타빈, 페메트렉세드, 티반티닙, 에베롤리무스, CpG-ODN, 라파마이신, 레날리도미드, 베무라페닙, 엔도스타틴, 라파티닙, PX-866, 임프라임(Imprime) PGG 및 엘로티닙을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 (또는 그의 단편)는 추가의 약제에 접합된다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항-PD-1 항체(및/또는 그의 단편) 및/또는 조성물은 방사선 요법, 수술, 화학요법 및/또는 표적 요법과 같은 하나 이상의 추가의 요법과 조합하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항-PD-1 항체 (또는 그의 단편) 및/또는 조성물은 방사선 요법과 조합하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항-PD-1 항체(및 그의 단편) 및/또는 조성물의 조합물 및 방사선 요법은 흑색종, NSCLC, 두경부암, 요로상피암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암, TNBC), 위암, 전형적 호지킨 림프종(cHL), 비호지킨 림프종 원발성 종격동 B 세포 림프종(NHL PMBCL), 중피종, 난소암, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암), 식도암, 비인두 암종(NPC), 담도암, 결직장암, 자궁경부암, 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 치료하기 위해 사용된다.
치료되는 적응증 및 관련 기술 분야의 통상의 의사가 잘 알고 있는 투여와 관련된 인자에 따라, 본원에서 제공되는 항-PD-1 항체 또는 이의 단편은 독성 및 부작용을 최소화하면서 해당 적응증의 치료에 효능을 보이는 투여량으로 투여될 것이다. 암(예를 들어, 흑색종, NSCLC, 두경부암, 요로상피암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암, TNBC), 위암, 전형적 호지킨 림프종(cHL), 비호지킨 림프종 원발성 종격동 B 세포 림프종(NHL PMBCL), 중피종, 난소암, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암), 식도암, 비인두 암종(NPC), 담도암, 결직장암, 자궁경부암, 갑상선암)의 치료를 위해, 전형적인 용량은 예를 들어 0.001 내지 1000 ㎍의 범위일 수 있지만; 상기 예시적인 범위보다 낮거나 높은 투여량은 본 발명의 범위 내에 있다. 일일 투여량은 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg(총 체중)(예를 들어, 약 5 ㎍/kg, 약 10 ㎍/kg, 약 100 ㎍/kg, 약 500 ㎍/kg, 약 1 mg/kg, 약 50 mg/kg, 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의해 규정되는 범위), 바람직하게는 약 0.3 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg(총 체중)(예를 들어, 약 0.5 ㎍/kg, 약 1 ㎍/kg, 약 50 ㎍, 약 150 ㎍/kg, 약 300 ㎍/kg, 약 750 ㎍/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의해 규정되는 범위), 보다 바람직하게는 약 1 ㎍/kg 내지 1 mg/kg(총 체중)(예를 들어, 약 3 ㎍/kg, 약 15 ㎍/kg, 약 75 ㎍/kg, 약 300 ㎍/kg, 약 900 ㎍/kg, 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의해 규정되는 범위), 훨씬 더 바람직하게는 약 0.5 내지 10 mg/kg(총 체중)/일(예를 들어, 약 2 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 9 mg/kg 또는 상기 값 사이의 임의의 범위를 포함하는 상기 값 중 임의의 2개에 의해 규정되는 범위)일 수 있다. 상기한 바와 같이, 치료 또는 예방 효능은 치료된 환자의 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 병태에 따라 수일 또는 더 긴 기간에 걸친 반복 투여의 경우, 원하는 질환의 증상이 억제될 때까지 치료를 반복한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있고, 본 발명의 범위 내에 있다. 목적하는 투여량은 조성물의 단일 볼루스 투여, 조성물의 다중 볼루스 투여, 또는 조성물의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
항-PD-1 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학 조성물은 1일 1회, 2회, 3회 또는 4회 투여될 수 있다. 조성물은 또한 매일보다 덜 빈번하게, 예를 들어 주 6회, 주 5회, 주 4회, 주 3회, 주 2회, 주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 매월 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 또는 6개월마다 1회 투여될 수 있다. 조성물은 또한 일정 기간에 걸쳐 사용하기 위해 조성물을 점진적으로 방출하고 조성물을 덜 빈번하게, 예를 들어 1개월에 1회, 2-6개월마다 1회, 1년마다 1회, 또는 심지어 단일 투여에 의해 투여될 수 있도록 허용하는, 임플란트와 같은 지속 방출 제제로 투여될 수 있다. 지속 방출 장치(예를 들어, 펠렛, 나노입자, 미세입자, 나노구체, 미소구체 등)는 주사에 의해 투여될 수 있다.
항체 (또는 그의 단편)는 단일 일일 용량으로 투여될 수 있거나, 또는 총 1일 용량은 매일 2, 3 또는 4회의 분할 투여량으로 투여될 수 있다. 조성물은 또한 매일보다 덜 빈번하게, 예를 들어 주 6회, 주 5회, 주 4회, 주 3회, 주 2회, 주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 매월 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 또는 6개월마다 1회 투여될 수 있다. 항체 (또는 그의 단편)는 또한 일정 기간에 걸쳐 사용하기 위해 조성물을 점진적으로 방출하고 조성물을 덜 빈번하게, 예를 들어 1개월에 1회, 2-6개월마다 1회, 1년마다 1회, 또는 심지어 단일 투여에 의해 투여될 수 있도록 허용하는, 임플란트와 같은 지속 방출 제제로 투여될 수 있다. 지속 방출 장치(예를 들어, 펠렛, 나노입자, 미세입자, 나노구체, 미소구체 등)는 주사에 의해 투여되거나 또는 다양한 위치에 수술에 의해 이식될 수 있다.
암 치료는 비제한적인 예를 들어, 종양 퇴행, 종양 무게 또는 크기 수축, 진행까지의 시간, 생존 기간, 무진행 생존율, 총 반응률, 반응 지속 기간, 삶의 질, 단백질 발현 및/또는 활성에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어 방사선 영상화를 통한 반응의 측정을 비롯하여 요법의 효능을 결정하기 위한 접근법이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료 효능은 식 100-(T/C x 100)을 사용하여 계산된 종양 성장 억제율(% TGI)로서 측정되고, 여기서 T는 치료된 종양의 상대적인 평균 종양 부피이고, C는 치료되지 않은 종양의 상대적인 평균 종양 부피이다. 특정 실시양태에서, % TGI는 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 또는 95% 초과이다. 특정 실시양태에서, 항-PD-1의 % TGI는 OPDIVO®의 % TGI와 동일하거나 이보다 더 크고, 예를 들어 OPDIVO®의 % TGI보다 약 1.1배, 약 1.2배, 약 1.3배, 약 1.4배, 약 1.5배, 약 1.6배, 약 1.7배, 약 1.8배, 약 1.9배, 약 2배, 약 2.1배, 약 2.2배, 약 2.3배, 약 2.4배, 약 2.5배, 약 2.6배, 약 2.7배(이들 값 사이의 임의의 범위 포함), 또는 약 2.7배 초과보다 더 크다.
약학 제제
항-PD-1 항체 (또는 이의 단편)는 투여에 적합하도록 적합한 담체 또는 부형제와 함께 제제화될 수 있다. 항체의 적합한 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체 (또는 그의 단편)를 선택적인 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 수득된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수여자에게 비독성이고, 이는 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 예시적인 항체 제제는 명백하게 본원에 참조로 포함된 WO98/56418에 기재되어 있다. 피하 투여에 적합한 동결건조된 제제는 WO97/04801에 기재되어 있다. 이러한 동결건조 제제는 적합한 희석제를 사용하여 높은 단백질 농도로 재구성될 수 있고, 재구성된 제제는 본원에서 치료될 포유동물에게 피하로 투여될 수 있다.
본원의 제제는 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 악영향을 미치지 않는 보완 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 항신생물제, 성장 억제제, 세포독성제 또는 화학치료제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 적절하게 조합하여 존재한다. 그러한 다른 약제의 유효량은 제제에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 따라 결정된다. 이들은 일반적으로 본원에서 설명되는 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로 또는 이전에 사용된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다. 활성 성분은 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 상기 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다. 지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 길항제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사 가능 미소구체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
리포펙틴 또는 리포솜은 본 발명의 폴리펩티드 및 항체 (또는 그의 단편) 또는 조성물을 세포 내로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성되고/되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marasco et al., PNAS USA, 90: 7889-7893(1993)]을 참조한다.
활성 성분은 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 상기 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences]에 개시되어 있다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 항체 (또는 그의 단편)을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 루프론 데포™(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사 가능 미소구체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일을 초과하여 분자를 방출할 수 있는 반면, 특정 히드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 항체가 장시간 동안 신체에 남아있으면, 이들은 37℃에서 수분에 노출된 결과로 변성 또는 응집되어 생물학적 활성의 상실 및 가능하게는 면역원성의 변화를 유발할 수 있다. 수반된 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 제어, 적절한 첨가제의 사용 및 특정 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 제제는 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 약 0.5 mg/ml 초과, 약 1 mg/ml 초과, 약 2 mg/ml 초과, 약 3 mg/ml 초과, 약 4 mg/ml 초과, 약 5 mg/ml 초과, 약 6 mg/ml 초과, 약 7 mg/ml 초과, 약 8 mg/ml 초과, 약 9 mg/ml 초과, 약 10 mg/ml 초과, 약 11 mg/ml 초과, 약 12 mg/ml 초과, 약 13 mg/ml 초과, 약 14 mg/ml 초과, 약 15 mg/ml 초과, 약 16 mg/ml 초과, 약 17 mg/ml 초과, 약 18 mg/ml 초과, 약 19 mg/ml 초과, 약 20 mg/ml 초과, 약 21 mg/ml 초과, 약 22 mg/ml 초과, 약 23 mg/ml 초과, 약 24 mg/ml 초과, 약 25 mg/ml 초과, 약 26 mg/ml 초과, 약 27 mg/ml 초과, 약 28 mg/ml 초과, 약 29 mg/ml 초과, 또는 약 30 mg/ml 초과(이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 농도로 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 시트레이트, NaCl, 아세테이트, 숙시네이트, 글리신, 폴리소르베이트 80(트윈 80) 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 완충제에서 제제화된다(예를 들어, 약 0.5 mg/ml 초과, 약 1 mg/ml 초과, 약 5 mg/ml 초과, 약 10 mg/ml 초과, 약 15 mg/ml 초과, 약 20 mg/ml 초과, 또는 약 25 mg/ml 초과(이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 농도로). 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 100 mM 내지 약 150 mM 글리신을 포함하는 완충제에서 제제화된다(예를 들어, 약 0.5 mg/ml 초과, 약 1 mg/ml 초과, 약 5 mg/ml 초과, 약 10 mg/ml 초과, 약 15 mg/ml 초과, 약 20 mg/ml 초과, 또는 약 25 mg/ml 초과(이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 농도로). 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 50 mM 내지 약 100 mM NaCl을 포함하는 완충제에서 제제화된다. 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 10 mM 내지 약 50 mM 아세테이트를 포함하는 완충제에서 제제화된다(예를 들어, 약 mg/ml 초과, 약 1 mg/ml 초과, 약 5 mg/ml 초과, 약 10 mg/ml 초과, 약 15 mg/ml 초과, 약 20 mg/ml 초과, 또는 약 25 mg/ml 초과(이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 농도로). 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 10 mM 내지 약 50 mM 숙시네이트를 포함하는 완충제에서 제제화된다. 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 0.005% 내지 약 0.02% 폴리소르베이트 80을 포함하는 완충제에서 제제화된다(예를 들어, 약 0.5 mg/ml 초과, 약 1 mg/ml 초과, 약 5 mg/ml 초과, 약 10 mg/ml 초과, 약 15 mg/ml 초과, 약 20 mg/ml 초과, 또는 약 25 mg/ml 초과(이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 농도로). 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 약 5.1 내지 5.6의 pH를 갖는 완충제에서 제제화된다. 특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 10 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신 및 0.01% 폴리소르베이트 80을 포함하는 완충제에서 제제화되며, 제제의 pH는 5.5이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 설명되는 PD-1 항체를 (예를 들어, 약 0.5 mg/ml 초과, 약 1 mg/ml 초과, 약 5 mg/ml 초과, 약 10 mg/ml 초과, 약 15 mg/ml 초과, 약 20 mg/ml 초과, 또는 약 25 mg/ml 초과(이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 농도로) 포함하는 제제(예를 들어, 10 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신 및 0.01% 폴리소르베이트 80을 포함하는 완충제를 포함하고 pH가 5.5인 제제)는 실온에서(예를 들어 약 20-25℃에서) 약 0.5주, 1.0주, 1.5주, 2.0주, 2.5주, 3.5주, 4.0주, 4.5주 또는 5.0주(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 설명되는 PD-1 항체를 (예를 들어, 약 0.5 mg/ml 초과, 약 1 mg/ml 초과, 약 5 mg/ml 초과, 약 10 mg/ml 초과, 약 15 mg/ml 초과, 약 20 mg/ml 초과, 또는 약 25 mg/ml 초과(이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 농도로) 포함하는 제제(예를 들어, 10 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신 및 0.01% 폴리소르베이트 80을 포함하는 완충제를 포함하고 pH가 5.5인 제제)는 가속 조건(예를 들어, 약 37℃에서의 보관) 하에 약 0.5주, 1.0주, 1.5주, 2.0주, 2.5주, 3.5주, 4.0주, 4.5주 또는 5.0주(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 동안 안정하다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 물리적 및 화학적 불안정성에 상응하는 잠재적인 단편화 및 응집을 검출하기 위해 단백질 안정성 연구에 널리 사용되는 잘 알려져 있는 방법이다. 특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제는 SEC를 사용하여 측정한 초기 고분자량 종 %에 비해, 37℃에서 1주 후에 고분자량 종(HMWS)의 약 1.6%, 1.4%, 1.2%, 1.0%, 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2% 또는 0.1%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 미만의 증가를 보인다. 특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제는 SEC를 사용하여 측정한 초기 고분자량 종 %에 비해, 37℃에서 2주 후에 고분자량 종의 약 2.0%, 1.8%, 1.6%, 1.4%, 1.2%, 1.0%, 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2% 또는 0.1%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 미만의 증가를 보인다. 특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-EFGR 항체를 포함하는 제제는 SEC를 사용하여 측정한 초기 고분자량 종 %에 비해, 37℃에서 4주 후에 고분자량 종의 약 3.3%, 3.2%, 3.1%, 3.0%, 2.9%, 2.8%, 2.7%, 2.6%, 2.5%, 2.4%, 2.2%, 2.0%, 1.8%, 1.6%, 1.4%, 1.2%, 1.0%, 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2% 또는 0.1%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 미만의 증가를 보인다.
특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제는 SEC를 사용하여 측정한 초기 저분자량 종 %에 비해, 37℃에서 1주 후에 저분자량 종(LMWS)의 약 1.6%, 1.4%, 1.2%, 1.0%, 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2% 또는 0.1%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 미만의 증가를 보인다. 특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제는 SEC를 사용하여 측정한 초기 저분자량 종 %에 비해, 37℃에서 2주 후에 저분자량 종의 약 2.0%, 1.8%, 1.6%, 1.4%, 1.2%, 1.0%, 0.8%, %, 0.4%, 0.2% 또는 0.1%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 미만의 증가를 보인다. 특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제는 SEC를 사용하여 측정한 초기 저분자량 종 %에 비해, 37℃에서 4주 후에 저분자량 종의 약 2.4%, 2.2%, 2.0%, 1.8%, 1.6%, 1.4%, 1.2%, 1.0%, 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2% 또는 0.1%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 미만의 증가를 보인다.
특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제는 SEC를 사용하여 측정한 초기 단량체 %에 비해, 37℃에서 1주 후에 단량체의 약 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 또는 3.5%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 이하의 감소를 보인다. 특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제는 SEC를 사용하여 측정한 초기 단량체 %에 비해, 37℃에서 2주 후에 단량체의 약 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2.0%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 또는 3.5%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 이하의 감소를 보인다. 특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-EFGR 항체를 포함하는 제제는 SEC를 사용하여 측정한 초기 단량체 %에 비해, 37℃에서 2주 후에 단량체의 약 0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2.0%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 또는 3.5%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 이하의 감소를 보인다.
양이온 교환 크로마토그래피(CEX)는 탈아미드화 또는 산화와 같은 단백질 분해 현상을 검출하기 위한, 잘 알려져 있고 널리 사용되는 도구이다(Moorhouse et al., 1997) J. Pharm. Biomed. Anal. 16, 593-603). 분해 생성물은 일반적으로 산성 또는 염기성 종으로 지칭된다. 산성 종은 CEX의 주 피크보다 일찍 용리되는 변이형인 반면, 염기성 종은 CEX의 주 피크보다 늦게 용리되는 변이형이다. 특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제의 산성 피크 분획은 CEX를 사용하여 측정시에, 37℃에서 1주 후에 전체 단백질의 약 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% 또는 15%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 이하이다. 특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제의 산성 피크 분획은 CEX를 사용하여 측정시에, 37℃에서 2주 후에 전체 단백질의 약 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17% 또는 18%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 이하이다. 특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제의 산성 피크 분획은 CEX를 사용하여 측정시에, 37℃에서 2주 후에 전체 단백질의 약 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 또는 27%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 이하이다.
특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제의 염기성 피크 분획은 CEX를 사용하여 측정시에, 37℃에서 1주 후에 전체 단백질의 약 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 또는 46%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 이하이다. 특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제의 염기성 피크 분획은 CEX를 사용하여 측정시에, 37℃에서 2주 후에 전체 단백질의 약 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 또는 46%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 이하이다. 특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제의 염기성 피크 분획은 CEX를 사용하여 측정시에, 37℃에서 4주 후에 전체 단백질의 약 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 또는 46%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 이하이다.
특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제의 주 피크 분획은 CEX를 사용하여 측정시에, 37℃에서 1주 후에 전체 단백질의 약 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 또는 46%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 이하이다. 특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제의 염기성 피크 분획은 CEX를 사용하여 측정시에, 37℃에서 2주 후에 전체 단백질의 약 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 또는 46%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 이하이다. 특정 실시양태에서, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체를 포함하는 제제의 염기성 피크 분획은 CEX를 사용하여 측정시에, 37℃에서 4주 후에 전체 단백질의 약 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 또는 46%(이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 이하이다.
생체 내 투여에 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이것은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
항-PD-1 항체를 이용한 진단 및 영상화 방법
PD-1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 표지된 항-PD-1 항체, 그의 단편 및 그의 유도체 및 유사체는 PD-1의 발현, 비정상적인 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 및/또는 장애를 검출, 진단 또는 모니터링하기 위한 진단 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 항-PD-1 항체 (또는 그의 단편)는 계내, 생체 내, 생체 외 및 시험관 내 진단 검정 또는 영상화 검정에서 사용될 수 있다. PD-1 폴리펩티드의 발현을 검출하는 방법은 (a) 본 발명의 하나 이상의 항체를 사용하여 개체의 세포(예를 들어, 조직) 또는 체액에서 폴리펩티드의 발현을 검정하는 단계, 및 (b) 상기 유전자의 발현 수준을 표준 유전자 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 표준 유전자 발현 수준에 비해 검정된 유전자 발현 수준의 증가 또는 감소는 비정상적인 발현을 나타낸다.
본원에서 제공되는 추가의 실시양태는 동물(예를 들어, 사람과 같은 포유동물)에서 PD-1의 발현 또는 비정상적인 발현과 관련된 질환 또는 장애를 진단하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 포유동물에서 PD-1 분자를 검출하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 진단은 (a) 표지된 항-PD-1 항체 (또는 그의 단편)의 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계; (b) 표지된 항-PD-1 항체 (또는 그의 단편)가 PD-1 분자가 발현되는 대상체의 부위에 우선적으로 집중되도록(및 결합되지 않은 표지된 분자가 배경 수준으로 청소되도록) 투여 후에 일정 시간 간격 동안 기다리는 단계; (c) 배경 수준을 결정하는 단계; 및 (d) 대상체에서 표지된 분자를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 배경 수준을 초과하는 표지된 분자의 검출은 대상체가 PD-1의 발현 또는 비정상적인 발현과 관련된 특정 질환 또는 장애를 갖는다는 것을 나타낸다. 배경 수준은 검출된 표지된 분자의 양을 특정 시스템에 대해 이전에 결정된 표준 값과 비교하는 것을 포함하는 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 제공되는 항-PD-1 항체 (또는 그의 단편)는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 전형적인 면역조직학적 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 단백질 수준을 검정하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Jalkanen, et al., J. Cell. Biol . 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol . 105:3087-3096 (1987)] 참조). 단백질 유전자 발현을 검출하는데 유용한 다른 항체 기반 방법은 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA) 및 방사성 면역검정(RIA)과 같은 면역검정을 포함한다. 적합한 항체 검정 표지는 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 효소 표지, 예를 들어 글루코스 옥시다제; 방사성 동위원소, 예를 들어 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(115mIn, 113mIn, 112In, 111In), 및 테크네튬(99Tc, 99mTc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 제논(133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru; 루미놀; 및 형광 표지, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민, 및 비오틴을 포함한다.
관련 기술 분야에 공지된 기술은 본원에서 제공되는 표지된 항체 (또는 그의 단편)에 적용될 수 있다. 이러한 기술은 이관능성 접합제의 사용을 포함하고, 이로 제한되지 않는다(예를 들어, 미국 특허 제5,756,065호, 제5,714,631호, 제5,696,239호, 제5,652,361호, 제5,505,931호, 제5,489,425호, 제5,435,990호, 제5,428,139호, 제5,342,604호, 제5,274,119호, 제4,994,560호 및 제5,808,003호 참조).
대안적으로, 또는 추가로, 세포에서 PD-1 폴리펩티드 코딩 핵산 또는 mRNA의 수준을, 예를 들어, PD-1 코딩 핵산 또는 이의 상보체에 상응하는 핵산 기재 프로브를 사용하는 형광 계내 혼성화(FISH; 1998년 10월 공개된 W098/45479 참조), 서던 블로팅, 노던 블로팅 또는 실시간 정량적 PCR(RT-PCR)과 같은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술을 통해 측정할 수 있다. 또한, 예를 들어 항체 기반 검정을 사용하여 생물학적 유체, 예를 들어 혈청에서 누출(shed) 항원을 측정함으로써 PD-1 과다발현을 연구할 수 있다(예를 들어, 1990년 6월 12일 등록된 미국 특허 제4,933,294호, 1991년 4월 8일 공개된 WO91/05264; 1995년 3월 28일 등록된 미국 특허 제5,401,638호 및 [Sias et al., J. Immunol . Methods 132:73-80 (1990)] 참조). 상기 검정과는 별도로, 다양한 생체 내 및 생체 외 검정이 숙련된 기술자에게 이용 가능하다. 예를 들어, 방사성 동위원소와 같은 검출 가능한 표지로 선택적으로 표지된 항체에 포유동물의 체내 세포를 노출시킬 수 있고, 세포에 대한 항체의 결합은 예를 들어 방사능에 대한 외부 스캐닝에 의해 또는 이전에 항체에 노출된 포유동물로부터 채취한 샘플(예를 들어, 생검 또는 다른 생물학적 샘플)을 분석함으로써 평가될 수 있다.
제조품 및 키트
본원에서 제공되는 또 다른 실시양태는 암, 예를 들어 예를 들어 흑색종, NSCLC, 두경부암, 요로상피암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암, TNBC), 위암, 전형적 호지킨 림프종(cHL), 비호지킨 림프종 원발성 종격동 B 세포 림프종(NHL PMBCL), 중피종, 난소암, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암), 식도암, 비인두 암종(NPC), 담도암, 결직장암, 자궁경부암, 갑상선암 및 타액선암의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조품이다. 제조품은 용기 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 병태를 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 본원에서 설명되는 항-PD-1 항체 (또는 그의 단편)이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용된다는 것을 나타낸다. 라벨 또는 포장 삽입물은 항체 조성물을 환자에게 투여하는 것에 대한 지침을 추가로 포함할 것이다. 본원에서 설명되는 조합 요법을 포함하는 제조품 및 키트가 또한 고려된다.
포장 삽입물은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 치료 제품의 상업용 포장물에 통상적으로 포함되는 지침을 지칭한다. 한 실시양태에서, 포장 삽입물은 조성물이 암(예를 들어 두경부암, 폐암 또는 결직장암)을 치료하기 위해 사용된다는 것을 나타낸다.
추가로, 제조품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들어 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
다양한 목적, 예를 들어 환자에서 PD-1의 단리 또는 검출을 위해 유용하며, 선택적으로 제조품과 조합하여 사용할 수 있는 키트도 제공된다. PD-1의 단리 및 정제를 위해, 키트는 비드(예를 들어, 세파로스(SEPHAROSE)TM 비드)에 커플링된, 본원에서 제공되는 항-PD-1 항체 (또는 그의 단편)를 함유할 수 있다. 시험관 내에서, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 PD-1의 검출 및 정량을 위한 항체 (또는 그의 단편)를 함유하는 키트를 제공할 수 있다. 제조품과 마찬가지로, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 예를 들어, 용기는 본원에서 제공되는 적어도 하나의 항-PD-1 항체를 포함하는 조성물을 수용한다. 예를 들어 희석제 및 완충제, 대조군 항체를 함유하는 추가의 용기가 포함될 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물의 설명뿐만 아니라, 의도된 시험관 내 또는 진단 용도에 대한 지침을 제공할 수 있다.
실시예
실시예 1
항-PD1 항체 항체의 개발
항-PD-1 항체의 개발은 다음과 같이 요약된다. 양성 항-PD-1 항체 클론은 PD-1(정제된 재조합 6xHis 태그 부착된 PD-1_ECD 항원(서열 번호 26에 개시된 "6xHis")) 면역화된 마우스로부터 구축된 하이브리도마로부터 생성된 Fab 파지 라이브러리의 스크리닝에 의해 확인되었다. 클론을 특성화하기 위해 아래에서 보다 상세히 설명되는 시험관 내 기능 검정을 수행하였다.
간략히 설명하면, 하이브리도마 클론의 연속 희석액을 실온에서 1시간 동안 PD1-His 단백질 코팅 플레이트와 함께 인큐베이팅하고, PD1 결합 활성을 450 nm에서 모니터링하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 포스페이트 완충 염수(PBS) 중 5% 우유로 차단하고, 하이브리도마 희석액을 첨가하기 전에 PBS-트윈 20(PBST)로 세척하였다. 하이브리도마 클론과 함께 인큐베이팅한 후, 플레이트를 PBST로 세척하고, 실온에서 1시간 동안 1:4000 항-마우스 IGG-HRP와 함께 인큐베이팅하고, PBST로 세척하고, 테트라메틸벤지딘(TMB)으로 발색시키고, 마지막으로 H2SO4를 사용하여 반응을 중지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
유동 세포 계측은 클론 ID 번호 11, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 27 및 28이 PD-1에 결합할 수 있음을 보여주었다. PD-1 결합을 평가하기 위한 유동 세포 계측 조건은 1) 4E+05 PD-1 발현 CHO-S 세포를 PBS(2% FBS)로 2회 세척하는 단계; 2) 하이브리도마 상청액을 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅하는 단계; 3) 세포를 500 x g에서 5분 동안 원심분리하는 단계; 4) PBS(2% FBS)로 2회 세척하는 단계; 5) 1:150 희석된 염소 항-인간 IgG-FITC를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅하는 단계; 6) 세포를 PBS(2% FBS)로 2회 세척하는 단계; 및 7) 50 ㎕의 1x PBS에 세포를 현탁하고, 유동 세포 계측에 의해 분석하는 단계를 포함한다.
유동 세포 계측을 사용하여 PD-L1과 PD1 사이의 결합을 차단하는 하이브리도마 상청액의 능력을 평가하였다. 그 결과는 클론 #11이 참조된 항-PD-1 항체, 예를 들어 니볼루맙과 동등하게 결합을 차단하였음을 보여주었다. 수행된 유동 세포 계측 결합 검정은 1) 샘플당 4E+05 세포를 PBS(2% FBS)로 2회 세척하는 단계; 2) 8 ㎍/ml 비오틴-PDL1 및 하이브리도마 상청액을 부피비 1:1로 혼합하는 단계, 3) 단계 2의 혼합물 60 ㎕을 세포에 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅하는 단계; 4) 세포를 PBS(2% FBS)로 2회 세척하는 단계; 5) 세포를 4℃에서 30분 동안 아비딘-FITC(1:65로 희석)와 함께 배양하는 단계; 및 6) 세포를 PBS(2% FBS)로 2회 세척하는 단계를 포함한다.
하나의 양성 PD-1 콜로니(c1G4)가 SS320 적격 세포에서 확인되었다. c1G4 클론의 특성 및 서열은 아래에서 제공된다.
실시예 2
인간화된 항-PD-1 항체 1G4(h1G4)의 생성
인간 생식계열 경쇄 가변 영역 IGKV1-39*01 및 인간 생식계열 중쇄 가변 영역 IGHV3-11*04를 사용하여 인간화된 항-PD-1 항체 1G4(h1G4)를 생성하였다. 간략히 설명하면, 인간화는 키메라 c1G4의 경쇄 및 중쇄로부터의 CDR 잔기를 인간 면역글로불린의 유사한 경쇄 및 중쇄 프레임워크에 이식함으로써 수행하였다. CDR 이식된 인간화 항체의 라이브러리는 그의 항원에 대한 친화도를 향상시키기 위해 추가의 시험관 내 파지 디스플레이 기반 친화도 성숙을 위해 생성될 수 있다.
c1G4 및 h1G4에 대한 서열 정렬은 도 8a 및 8b에 도시된다. 도 8a는 키메라 c1G4, 인간화된 h1G4, 인간 생식계열 경쇄 가변 영역 IGKV1-39*01, 및 니볼루맙(NIV)의 경쇄의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 도 8b는 키메라 c1G4, 인간화된 h1G4, 인간 생식계열 중쇄 가변 영역 IGHV3-11*04, 및 니볼루맙(NIV)의 중쇄의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 인간화를 위해 c1G4로부터 이식된 CDR(상보성 결정 영역)은 밑줄이 쳐진 굵은 글씨로 표시하였다.
실시예 3
c1G4 및 h1G4의 평형 해리 상수(KD)의 결정
결합 친화도 및 동역학은 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 측정하였다. 항-인간 IgG Fc는 먼저 센서 칩 상에 고정한 다음, Rmax ~ 150 RU로 참조된 항-PD-1 항체, c1G4 및 h1G4를 포획하였다. 실험은 25℃에서 수행하였고, 58.8 nM 내지 7.35 nM의 PD-1-His의 연속 희석액을 0.1%(w/v) BSA가 보충된 HBS-P + 완충제 내의 포획된 항체 상에 통과시키면서 측정하였다. 모든 데이터는 평가 소프트웨어로 분석되었고, 곡선은 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델을 사용하여 피팅하였다.
계산된 친화도(KD)과 함께 회합 및 해리 동역학은 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정되었다. 항-PD-1 ref와는 대조적으로, c1G4 및 h1G4에 대한 친화도의 개선을 또한 하기 표 4에 나타내었다. 데이터는 이중으로 수행된 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
<표 4>
Figure pct00004
실시예 4
키메라 c1G4 및 인간화된 h1G4 항체의 결합 특성
PD-1 재조합 단백질에 대한 c1G4의 결합
ELISA 검정을 수행하여 PD-1에 대한 키메라 c1G4 및 참조된 항-PD-1 항체의 결합을 평가하였다. 키메라 c1G4 및 참조된 항-PD-1의 연속 희석액을 미량역가(microtiter) 접시의 웰에서 PD-1-His로 포획하였다. 각각의 웰 내의 포획된 항체의 양을 항-인간 IgG Fc-HRP-접합된 2차 항체를 사용하여 정량하였다. HRP-접합된 2차 항체를 웰에 첨가하고, 인큐베이팅한 후, 과량의 2차 항체를 세척 제거하였다. TMB를 웰에 첨가하고, 인큐베이팅한 후, 반응을 중지시키고, 450 nm에서의 흡광도의 증가를 모니터링함으로써 HRP 활성을 측정하였다. 항-PD-1 항체 키메라 c1G4 및 참조된 항-PD-1 항체의 PD-1-His에 대한 결합을 비교하기 위해 수행된 ELISA의 결과를 도 1a에 나타내었다.
도 1b는 항-PD-1 항체 키메라 c1G4 및 참조된 항-PD-1의 PD-1-AP에 대한 결합을 비교하기 위해 수행된 제2 세트의 ELISA의 결과를 보여준다. 키메라 c1G4 및 참조된 항-PD-1 항체의 연속 희석액을 미량역가 접시의 웰에서 항-인간 IgG Fc 항체로 포획하였다. 각각의 웰 내의 포획된 항체의 양을 AP-접합된 PD-1을 사용하여 정량하였다. 인큐베이팅 후에, 과량의 PD-1-AP를 세척 제거하였다. 알칼리성 포스파타제 기질을 웰에 첨가하고, 인큐베이팅 후, 반응을 중지시키고, 405 nm에서의 흡광도의 증가를 모니터링함으로써 AP 활성을 측정하였다.
결과는 키메라 c1G4 및 참조된 항-PD-1 항체가 PD-1-His 및 PD-1-AP 둘 모두에 결합할 수 있음을 나타낸다.
c1G4의 PD-1 리간드에 대한 결합의 차단 및 경쟁
키메라 c1G4 및 참조된 항-PD-1 항체의 연속 희석액을 실온에서 2시간 동안 PD-L1-AP와 함께 인큐베이팅하였다. 각각의 항체:항원 혼합물을 미량역가 접시의 PD-1-His-코팅된 웰에 첨가하였다. 인큐베이팅 및 세척 후에, pNPP를 웰에 첨가하고, 결합된 PD-L1-AP의 검출을 위해 1시간 동안 인큐베이팅하였다. AP 활성은 405 nm에서의 흡광도의 증가를 모니터링함으로써 측정되었다. 도 2a는 항-PD-1 항체 키메라 c1G4 및 참조된 항-PD-1 항체가 PD-L1 및 PD-1의 결합을 차단하는 능력을 비교하기 위해 수행된 ELISA의 결과를 보여준다. 키메라 c1G4 및 참조된 항-PD-1 항체 둘 모두가 PD-L1의 PD-1에 대한 결합을 차단하는 것으로 밝혀졌다.
도 2b는 PD-1-His에 대한 결합을 위해 참조된 항-PD-1 항체와 경쟁하는 항-PD-1 항체 키메라 c1G4의 능력을 결정하기 위해 수행된 ELISA의 결과를 보여준다. 키메라 c1G4 및 참조된 항-PD-1 항체의 연속 희석액을 고정된 농도의 PD-1-His(0.1 ㎍/ml)와 실온에서 2시간 동안 예비 혼합한 후, 고정 농도의 참조된 항-PD-1(4 ㎍/ml) 코팅된 플레이트에 결합시켰다. 각각의 웰 내의 결합된 PD-1-His의 양을 항-His-HRP- 접합된 2차 항체를 사용하여 정량하였다. 인큐베이팅 후, 과량의 2차 항체를 세척 제거하였다. TMB를 웰에 첨가하고, 인큐베이팅 후에 반응을 중지시키고, 450 nm에서의 흡광도의 증가를 모니터링함으로써 HRP 활성을 측정하였다. 고정된 농도의 PD-1-His(0.1 ㎍/ml)을 NIV(4 ㎍/ml) 코팅된 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하고, 키메라 c1G4 및 참조된 항-PD-1 항체의 연속 희석액을 웰에 첨가하였다. 인큐베이팅 및 세척 후에, 각각의 웰 내의 결합된 PD-1-His의 양을 항-His-HRP- 접합된 2차 항체를 사용하여 정량하였다.
이들 데이터는 키메라 c1G4 및 참조된 항-PD-1 항체 둘 모두가 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단할 수 있고, 키메라 c1G4가 PD-1-His에 결합하기 위해 항-PD-1 ref와 경쟁할 수 있음을 나타낸다
PD-1 발현 CHO -S 세포에 대한 c1G4 및 h1G4의 결합
세포 표면에서 재조합 인간 PD-1을 발현하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주를 개발하여 유동 세포 계측에 의한 PD-1 인간 모노클로날 항체의 특이성을 결정하였다. CHO 세포를 PD-1의 트랜스멤브레인 형태를 코딩하는 전장 cDNA를 함유하는 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. c1G4 및 h1G4 항-PD-1 모노클로날 항체의 결합은 형질감염된 세포를 FACS 완충제(1% FBS를 함유하는 PBS)에서 연속 희석된 항-PD-1 모노클로날 항체와 함께 인큐베이팅함으로써 평가하였다. 세포를 유동 완충제로 세척하고, 비오틴 표지된 토끼 항-인간 IgG Fcγ Ab 및 스트렙타비딘-PE를 사용하여 결합을 검출하였다. 유동 세포 계측은 사이토믹스(Cytomics) FC 500(Beckman Coulter Inc.)을 사용하여 수행되었다.
도 3a 및 3b는 유동 세포 계측에 의해 CHO-S 세포(도 3a) 및 PD-1로 형질감염된 CHO-S 세포(도 3b)에 대한 c1G4 항체의 결합을 제공한다. 참조된 항-PD-1 항체 및 항-PD-L1 항체를 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다. 결과는 c1G4가 PD-1로 형질감염된 CHO 세포에는 결합하지만 인간 PD-1로 형질감염되지 않은 CHO 세포에는 결합하지 않음을 나타낸다.
세포 표면 상의 PD-1에 대한 인간화된 h1G4 및 원래의 c1G4 항체의 결합 특성을 도 9에 나타내었다.
선택된 c1G4 및 hIg4 항체에 의한 PD-1에 대한 리간드 결합의 차단
항-PD-1 c1G4 및 h1G4를 유동 세포 계측을 사용하여 PD-1을 발현하는 CHO-S 세포에 대한 리간드 PD-L1의 결합을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. 항-PD-1 항체 및 항-PD-L1 항체를 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다. PD-1을 발현하는 CHO-S 세포를 FACS 완충제(1% FBS 함유 PBS)에 현탁하였다. 다양한 농도의 c1G4 및 h1G4 항-PD-1 항체, 참조된 항-PD-1 항체 및 항-PD-L1 항체를 세포 현탁액에 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 결합되지 않은 항체를 세척 제거하고, 비오틴 표지된 PD-L1-Fc 융합 단백질을 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 세척한 후, 스트렙타비딘-PE로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 유동 세포 계측 분석은 사이토믹스 FC 500(Beckman Coulter Inc.)을 사용하여 수행하였다.
항-PD-1 모노클로날 항체 c1G4는 염색의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정시에 PD-1로 형질감염된 CHO-S 세포에 대한 PD-L1의 결합을 차단하였다. 이들 데이터는 염색의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정시에, c1G4 및 h1G4 둘 모두가 PD-1로 형질감염된 CHO-S 세포에 대한 PD-L1의 결합을 차단한다는 것을 입증한다(도 4 및 도 10).
활성화된 인간 T 세포에 대한 인간화된 항-PD-1 항체의 결합
인간 T 세포는 MagniSort™ 인간 T 세포 농축 키트(eBioscience)를 사용하여 PBMC로부터 단리하였다. 단리된 T 세포는 PD-1 발현을 자극하기 위해 5 ㎍/ml 파이토헤마글루티닌(PHA)에 의해 3일 동안 활성화하였다. 활성화된 T 세포를 모으고, 4℃에서 20분 동안 인간 Fc 차단제(eBioscience)와 함께 FACS 완충제(2% FBS 함유 PBS)에서 인큐베이팅하였다.
항-PD-1 모노클로날 항체의 결합은 활성화된 T 세포를 FACS 완충제에서 연속 희석된 항-PD-1 모노클로날 항체와 함께 인큐베이팅함으로써 평가하였다. 세포를 유동 완충제로 세척하고, FITC 표지된 토끼 항-인간 IgG Fcγ Ab를 사용하여 결합을 검출하였다. 유동 세포 계측 분석은 사이토믹스 FC 500(Beckman Coulter Inc.)을 사용하여 수행되었다. 참조된 항-PD-1 항체 및 아바스틴(항-VEGF)을 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다
인간화된 항-PD-1 항체 h1G4를 활성화된 인간 T 세포에 결합시킨 결과를 도 12에 나타내었다.
실시예 5
혼합 백혈구 반응(MLR)에서 사이토카인 생산에 대한 항-PD-1 c1G4 및 h1G4의 효과
림프구 이펙터 세포로의 PD-1 경로를 차단하는 효과를 입증하기 위해 혼합된 백혈구 반응을 이용하였다. 검정에서 T 세포를 항-PD-1 항체의 존재 또는 부재 하에 증식, IFN-감마 분비 및 IL-2 분비에 대해 시험하였다.
인간 T 세포는 Lympho-kwik T(One Lamda, Inc.)를 사용하여 PBMC로부터 정제하였다. 단리된 T 세포를 PBS에 현탁하고, 10분 동안 실온에서 1 μM의 CFSE로 표지하였다. 완전한 배지(10% FBS 함유 RPMI-1640)로 세포를 세척한 후, CFSE-표지된 T 세포를 1E6/세포의 농도로 완전한 배지에 현탁하였다.
동종이계(allogeneic) 수지상 세포는 PBMC로부터 생성되었다. 단리된 PBMC를 200 U/ml의 재조합 인간 IL-3(eBioscience)와 함께 밤새 인큐베이팅하여 단핵구/대식세포 집단을 플레이트에 부착시켰다. 비부착성 세포를 제거하고, 플레이트를 완전한 배지로 2회 세척하였다. 이어서, 플레이트 상의 세포를 200 U/ml의 인간 IL-4(eBioscience) 및 200 U/ml의 인간 GM-CSF(eBioscience)를 함유하는 완전한 배지에서 6일 동안 배양하였다. 단핵구 유래 수지상 세포는 제6일에 배양물에 TNF-알파(100 U/ml)를 첨가하고 밤새 인큐베이팅하여 성숙시켰다. 성숙 DC를 트립신으로 처리하고, 수거하고, 1E5/세포의 농도로 완전한 배지에 현탁하였다.
각각의 반응물은 총 부피 200 ㎕에 105개의 CFSE 표지된 T 세포 및 104개의 동종이계 수지상 세포를 함유하였다. 항-PD-1 모노클로날 항체 c1G4 또는 h1G4를 각 항체에 상이한 항체 농도로 첨가하였다. 항체 부재 또는 항-VEGF 항체(Avastin)를 음성 대조군으로 사용하였다. 참조된 항-PD-1 항체를 양성 대조군으로 사용하였다. 세포를 37℃에서 5일 동안 배양하였다. 제5일 후에, 사이토카인 측정을 위해 각각의 배양물로부터 100 ㎕의 배지를 취하였다. 사이토카인의 수준은 인간 IFN-γ 또는 IL-2 ELISA MAX™ 딜럭스(Deluxe) 키트(BioLegend)를 사용하여 측정하였다. 세포를 수거하고, 유동 세포 계측에 의해 T 세포 증식에 대해 분석하였다.
도 5a는 인간 PD-1에 대한 모노클로날 항체 c1G4에 의해 촉진된 농도 의존성 IL-2 분비를 도시한 것이고, 도 5b는 인간 PD-1에 대한 모노클로날 항체 c1G4에 의한 농도 의존성 IFN-γ 분비를 도시한 것이다.
도 13a는 인간 PD-1에 대한 모노클로날 항체 h1G4에 의해 촉진된 농도 의존성 IL-2 분비를 도시한 것이고, 도 13b는 인간 PD-1에 대한 모노클로날 항체 h1G4에 의한 농도 의존성 IFN-γ 분비를 도시한 것이다.
인간 PD-1에 대한 모노클로날 항체 c1G4는 혼합 백혈구 반응 검정에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 촉진한다. 도 6a는 다양한 농도의 c1G4 항체에서의 CD4+ T 세포 증식을 도시한 것이고, 도 6b는 다양한 농도의 c1G4 항체에서의 CD8+ T 세포 증식을 도시한 것이다. 도 14a는 다양한 농도의 h1G4 항체에서의 CD4+ T 세포 증식을 도시한 것이고, 도 14b는 다양한 농도의 h1G4 항체에서의 CD8+ T 세포 증식을 도시한 것이다.
요약하면, 이들 결과는 항-PD-1 모노클로날 항체 c1G4 및 h1G4가 T 세포 증식, IFN-감마 분비 및 IL-2 분비를 촉진한다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 음성 대조군 항체를 함유하는 배양물은 T 세포 증식, IFN-감마 또는 IL-2 분비의 증가를 나타내지 않았다.
실시예 6
c1G4 및 h1G4 항체의 종양 성장 억제 활성
항-인간 PD-1 항체의 생체 내 활성을 면역손상 NOD/SCID(비-비만성 당뇨병/중증 복합 면역결핍) 마우스를 사용하는 이종이식 마우스 모델에서 조사하였다. 암세포 및 단리된 인간 PBMC를 피하 투여 직전에 표시된 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 혼합하였다. 각각의 마우스에게 암세포와 인간 PBMC의 혼합물을 양측면에 접종하였다. 4마리의 마우스를 각각의 실험군에 배정하였다. 시험 물질의 첫 번째 용량은 암/이펙터 세포의 이식 후 1일 이내에 복강 내로 투여하였다. 마우스에게 3-4주 동안 시험 물질을 1주일에 2회 투여하였다. 종양의 형성은 각각의 동물에서 1주일에 2회 관찰하였다. 종양은 캘리퍼스로 측정하였고, 종양 부피(V)는 다음 식을 사용하여 계산하였다: V(mm3) = 0.5 x (길이(mm) x 폭(mm) x 폭(mm)/2).
HT29/PBMC 이종이식 모델에서 c1G4 또는 h1G4 항체를 사용한 종양 성장 곡선을 각각 도 7a 및 도 15a에 나타내었다. HT29/PBMC 이종이식 모델에서 c1G4 사용시의 제28일 또는 h1G4 사용시의 제21일에서의 개별적인 종양 부피를 각각 도 7b 및 15b에 제시하였다. 또한, NCI-H292/PBMC에서 h1G4 항체를 사용한 종양 성장 곡선을 도 16a에 나타내었다. h1G4 항체 사용시의 제25일에서의 개별적인 종양 부피를 도 16b에 제시하였다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다.
또한, HT29/PBMC 이종이식 모델에서 항-PD-1 및 항-VEGF 모노클로날 항체의 조합 요법이 또한 연구되었다. 항-PD-1 및 항-VEGF의 조합에 의해 향상된 종양 억제를 나타내는 데이터가 도 21에 제시된다.
실시예 7
h1G4의 종 교차반응성
재조합 인간, 래트, 마우스, 및 사이노몰거스 원숭이 PD-1 융합 단백질을 시노 바이올로지칼 인크.(Sino Biological Inc.)로부터 구입하였다. PD-1/Fc(웰당 9 ng)를 4℃에서 밤새 인큐베이팅함으로써 96웰 검정 플레이트에 고정하였다. 비특이적 결합 부위는 PBS 중 5% 탈지유를 사용하여 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척한 후, 표시된 농도의 참조된 항-PD-1(양성 대조군) 및 HLX01(음성 대조군)을 고정된 단백질과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척한 후, PBS 중에서 1/10,000으로 희석한 퍼옥시다제 표지된 염소 항-인간 IgG F(ab)'2(Jackson ImmunoResearch Laboratories)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 세척 후, 플레이트를 TMB(eBioscience)를 사용하여 발색시켰다. 흡광도는 Vmax 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)에 의해 450 nm의 파장에서 판독되었다.
도 11a-11d는 인간(도 11a), 사이노몰거스 원숭이(도 11b), 마우스(도 11c) 및 래트(도 11d) PD-1 단백질에 대한 h1G4의 종 교차반응성을 보여준다.
실시예 8
h1G4 항체의 종양 성장 억제 활성
hPD1 KI 마우스에서 h1G4 항체의 종양 성장 억제 활성
항-인간 PD-1 항체의 생체 내 활성을 인간 PD-1 녹-인 C57BL/6 마우스(hPD1 KI 마우스)에서 조사하였다. 마우스에게 인간 PD-L1로 형질감염된 마우스 결장암 세포(마우스당 1E6 세포)를 피하 접종하였다. 항체 치료는 종양 부피가 약 75 mm3에 도달할 때(제9일) 시작되었다. 치료 전에 각각의 실험군에게 4마리의 동물을 배정하였다. 동물에게 항-PD-1 항체를 3-4주 동안 1주일에 2회 투여하였다. 종양의 형성은 각각의 동물에서 1주일에 2회 관찰하였다. 종양은 캘리퍼스로 측정하였고, 종양 부피(V)는 다음 식을 사용하여 계산하였다: V(mm3) = 0.5 x (길이(mm) x 폭(mm) x 폭(mm)/2). hPD1 KI 마우스에서의 h1G4 항체의 종양 성장 억제 활성을 도 17에 나타내었다.
인간화된 NSG 마우스에서 삼중 음성 유방암( TNBC ) 세포주 이종이식 모델에서 h1G4의 효능 연구
인간화된 NSG 마우스(NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ)에 MDA-MB-231(인간 삼중 음성 유방암 세포주)을 피하 접종하였다. 종양 부피가 ~60-150 mm3에 도달할 때 마우스를 표에 따른 종양 부피를 기준으로 하여 3개의 군(n=9/군)으로 무작위로 분류하였다. 마우스에게 h1G4를 7일마다 1회, 즉 연구 제0일, 7일, 14일, 21일 및 28일에 복강 내로 투여하였다. 키트루다(항-PD-1)를 5일마다 1회, 즉 연구 제0일, 5일, 10일, 15일 및 20일에 복강 내로 주사하였다. 종양의 형성은 각각의 동물에서 3-4일마다 관찰하였다. 종양은 캘리퍼스로 측정하였고, 종양 부피(V)는 다음 식을 사용하여 계산하였다: V(mm3) = 0.5 x (길이(mm) x 폭(mm) x 폭(mm)/2). 도 18은 인간화된 NSG 마우스에서 삼중 음성 유방암(TNBC) 세포주 이종이식 모델에서 h1G4의 효능 연구를 보여준다.
실시예 9
친화도 성숙 항-PD-1 항체 33B, 66E 및 711D의 평형 해리 상수(KD) 결정
인간화된 항-PD-1 항체 h1G4를 개선된 결합 성능을 갖는 클론을 생성하기 위한 시험관 내 파지 디스플레이 기반 친화도 성숙 실험에 사용하였다. h1G4의 CDR-L1/CDR-L3/CDR-H3(3개의 CDR에 초점을 맞춤) 및 CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3(6개의 CDR에 초점을 맞춤) 핵산 라이브러리 둘 모두를 PCR을 통해 생성하고, 파지 디스플레이 벡터에 클로닝하고, 이. 콜라이(E. coli) TGI 또는 SS320 세포 내로 형질전환시켜 파지 라이브러리를 생성하였다. 두 라이브러리에 대한 스트렙타비딘 코팅된 자성 다이나비즈(Dynabeads)® M-280(Thermo Fisher Scientific #11205D)에 커플링된 비오티닐화된 PD-1-His로 3회 패닝한 후, 3개의 Fab 클론, 즉 33B, 66E 및 711D를 ELISA를 통해 스크리닝하였다. 추가의 동역학적 특성은 전장 IgG 33B, 66E 및 711D를 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)(도 9에 대해 상기 설명된 바와 같은 동일한 SPR 방법 참조)에 의해 측정하였고, 참조된 항-PD-1 항체와 동등하거나 그보다 우수한 결합 성능을 갖는 것으로 밝혀졌다.
표 5는 h1G4와 비교하여 파지 디스플레이 기반 친화도 성숙으로부터 스크리닝된 33B, 66E 및 711D의 CDR의 아미노산 서열을 보여준다.
<표 5>
Figure pct00005
표 6은 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정된 33B, 66E 및 711D의 계산된 친화도(KD)와 함께 회합 및 해리 동역학을 보여준다. 참조된 항-PD-1 항체와 대조적으로, 항-PD-1 항체의 친화도 개선이 또한 표 6에 제시되었다. 데이터는 이중으로 수행된 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
<표 6>
Figure pct00006
실시예 10
친화도 성숙 항체의 기능
혼합 백혈구 반응(MLR)에서 사이토카인 생산에 대한 인간 항-PD-1 항체(33B, 66E 및 711D)의 효과
상기 설명된 바와 동일한 방법을 통해, 본 연구는 66E 및 711D와 같은 인간 PD-1에 대한 인간 모노클로날 항체가 혼합 백혈구 반응 검정에서 IFN-γ 분비 및 IL-2 분비를 촉진한다는 것을 보여준다. 참조된 항-PD-1 항체 및 아바스틴(항-VEGF)을 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다. 도 19a는 친화도 성숙 항체에 의한 농도 의존성 IL-2 분비를 보여주고, 도 19b는 친화도 성숙 항체에 의한 농도 의존성 IFN-γ 분비를 보여준다.
HT29/ PBMC 이종이식 모델에서 인간 항-PD-1 항체의 종양 성장 억제 활성
상기 설명된 바와 동일한 방법을 통해, 마우스(n=4/군)에게 인간 결장암 세포주 HT29와 새로 단리된 인간 PBMC(암세포:PBMC = 3:1)의 혼합물을 피하 이식하였다. 항-PD-1 항체를 제1일부터 주 2회로 마우스의 복강 내로 주사하였다. 종양의 부피를 주 2회 측정하였다. HT29/PBMC 이종이식 모델에서 인간 친화도 성숙 항-PD-1 항체의 종양 성장 억제 활성을 도 20에 나타내었다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다.
실시예 11
PD-1 조합 요법
항-인간 PD-1 및 다른 치료 항체를 사용한 조합 요법의 생체 내 활성을 면역손상 NOD/SCID(비-비만성 당뇨병/중증 복합 면역결핍) 마우스를 사용하는 이종이식 마우스 모델에서 조사하였다. 암세포 및 단리된 인간 PBMC를 피하 투여 직전에 표시된 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 혼합하였다. 각각의 마우스에게 암세포와 인간 PBMC의 혼합물을 양측면에 접종하였다. 4 또는 5마리의 동물을 각각의 실험군에 배정하였다. 시험 물질의 첫 번째 용량은 암/이펙터 세포의 이식 후 1일에 복강 내로 투여하였다. 동물에게 3-4주 동안 시험 물질을 1주일에 2회 투여하였다. 종양의 형성은 각각의 동물에서 1주일에 2회 관찰하였다. 종양은 캘리퍼스로 측정하였고, 종양 부피(V)는 다음 식을 사용하여 계산하였다:
V(mm3) = 0.5 x (길이(mm) x 폭(mm) x 폭(mm)/2).
NSCLC 이종이식 마우스 모델에서 항-PD-1 mAb + 항- VEGF mAb의 종양 성장 억제 활성
본 연구에서, 마우스(n=4/군)에게 인간 NSCLC 세포인 NCI-H292와 새로 단리된 인간 PBMC(암세포:PBMC = 3:1)의 혼합물을 피하 이식하였다. 항-PD-1(h1G4) 및 항-VEGF(HLX04) 항체를 제1일부터 일주일에 2회 마우스의 복강 내로 주사하였다. 종양 성장 곡선을 도 22a에 나타내었다. 제21일에서의 개별적인 종양 부피를 도 22b에 나타내었다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다. 이러한 데이터는 항-VEGF mAb인 HLX04와 조합한 항-PD-1 mAb인 h1G4가 NCI-H292 이종이식편의 종양 성장을 단독으로 사용된 것보다 더 효과적으로 억제함을 보여준다.
다른 연구에서, 마우스(n=4/군)에게 인간 NSCLC 세포인 NCI-H292와 새로 단리된 인간 PBMC(암세포:PBMC = 3:1)의 혼합물을 피하 이식하였다. 항-PD-1(h1G4) 및 항-VEGFR2(HLX06) 항체를 제1일부터 일주일에 2회 마우스의 복강 내로 주사하였다. 종양 성장 곡선을 도 23a에 나타내었다. 제21일에서의 개별적인 종양 부피를 도 23b에 나타내었다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다. 이러한 데이터는 항-VEGFR2 mAb인 HLX06과 조합한 항-PD-1 mAb인 h1G4가 NCI-H292 이종이식편의 종양 성장을 단독으로 사용된 것보다 더 효과적으로 억제함을 보여준다.
NSCLC 이종이식 마우스 모델에서 항-PD-1 mAb + 항- EGFR mAb의 종양 성장 억제 활성
상기 설명된 바와 동일한 방법을 통해, 마우스(n=4/군)에게 인간 NSCLC 세포인 NCI-H292와 새로 단리된 인간 PBMC(암세포:PBMC = 3:1)의 혼합물을 피하 이식하였다. 항-PD-1(HLX10) 및 항-EGFR(HLX07) 항체를 제1일부터 일주일에 2회 마우스의 복강 내로 주사하였다. 종양 성장 곡선을 도 24a에 나타내었다. 제21일에서의 개별적인 종양 부피를 도 24b에 나타내었다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다. 이러한 데이터는 항-EGFR mAb인 HLX07과 조합한 항-PD-1 mAb인 HLX10(h1G4)가 NCI-H292 이종이식편의 종양 성장을 단독으로 사용된 것보다 더 효과적으로 억제함을 나타낸다.
또한, 마우스(n=5/군)에게 인간 결장암 세포인 HT-29와 새로 단리된 인간 PBMC(암세포:PBMC = 3:1)의 혼합물을 피하 이식하였다. 항-PD-1(HLX10) 및 항-EGFR(HLX07) 항체를 제1일부터 일주일에 2회 마우스의 복강 내로 주사하였다. 종양 성장 곡선을 도 25a에 나타내었다. 제21일에서의 개별적인 종양 부피를 도 25b에 나타내었다. 모든 데이터 점은 평균 ± SEM이다.
이러한 데이터는 항-EGFR mAb인 HLX07과 조합한 항-PD-1 mAb인 HLX10(h1G4)이 BRAF 돌연변이체 HT-29 이종이식편의 종양 성장을 단독으로 사용된 것보다 더 효과적으로 억제함을 나타낸다. HLX10 + HLX07 처리는 HLX07 처리 단독보다 종양 성장을 약간 더 크게 억제한다. HLX10 + HLX07 처리 및 HLX07 처리 단독의 평균 종양 성장 억제율은 각각 47% 및 28%이었다.
상기 실시예는 단지 설명을 위해 제공되는 것으로, 본 발명의 범위를 어떤 식 으로든 제한하는 것이 아니다. 본원에서 제시되고 설명된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형은 상기 설명으로부터 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이며, 첨부된 청구항의 범위 내에 속할 것이다.
실시양태의 목록
본 발명에 의해 제공되는 실시양태는 다음을 포함하고, 이로 제한되지 않는다:
1. (1) 아미노산 서열 KASQDVTTAVA(서열 번호 9)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASTRHT(서열 번호 10)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYTIPWT(서열 번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL) 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FTFSNYGMS(서열 번호 12)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNIY(서열 번호 13)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 VSYYYGIDF(서열 번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
2. (1) 아미노산 서열 KASTDVTTAVA(서열 번호 15)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASLRHT(서열 번호 16)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYGIPWT(서열 번호 17)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL) 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FRFSNYGMS(서열 번호 18)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNAY(서열 번호 19)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 TSYYYGIDF(서열 번호 20)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 성숙 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
3. (1) 아미노산 서열 KAKQDVTTAVA(서열 번호 21)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASTRHT(서열 번호 10)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYWIPWT(서열 번호 22)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL) 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FTFSNYGMS(서열 번호 12)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNIY(서열 번호 13)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 VSYYYGIDL(서열 번호 23)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 성숙 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
4. (1) 아미노산 서열 KASQDVTNAVA(서열 번호 24)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASTRHT(서열 번호 10)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYTIPWT(서열 번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL) 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FTFSNYGMS(서열 번호 12)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNIY(서열 번호 13)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 SSYYYGIDL(서열 번호 25)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 성숙 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab)'2, 단일쇄 Fv(scFv), Fv 단편, 디아바디 및 선형 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체가 다중 특이적 항체인 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 치료제에 접합된 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 표지에 접합된 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
9. 실시양태 8에 있어서, 표지가 방사성 동위원소, 형광 염료 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
10. 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 따른 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
11. 실시양태 10의 핵산 분자를 코딩하는 발현 벡터.
12. 실시양태 11의 발현 벡터를 포함하는 세포.
13. 실시양태 12의 세포를 배양하고 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생산하는 방법.
14. 실시양태 1 내지 9 중 어느 한 실시양태에 따른 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
15. 실시양태 1 내지 9 중 어느 한 실시양태에 따른 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 환자로부터의 샘플에 접촉시키고 PD-1 단백질에 결합된 항-PD-1 항체를 검출함으로써 상기 샘플에서 PD-1 단백질을 검출하는 방법.
16. 실시양태 15에 있어서, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 면역 조직화학적 검정(IHC) 또는 ELISA 검정에 사용하는 것인 방법.
17. 유효량의 실시양태 14의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
18. 실시양태 17에 있어서, 암이 흑색종, NSCLC, 두경부암, 요로상피암, 삼중 음성 유방암(TNBC), 위암, 전형적 호지킨 림프종(cHL), 비호지킨 림프종 원발성 종격동 B 세포 림프종(NHL PMBCL), 중피종, 난소암, 폐암, 식도암, 비인두 암종(NPC), 담도암, 결직장암, 유방암, 자궁경부암, 갑상선암 및 타액선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
19. 실시양태 18에 있어서, 대상체에게 항신생물제, 화학치료제, 성장 억제제 및 세포독성제로 이루어진 군으로부터 선택된 치료제를 추가로 투여하는 것인 방법.
20. 실시양태 19에 있어서, 대상체에게 방사선 요법을 추가로 실시하는 것인 방법.
21. 실시양태 18에 있어서, 대상체에게 VEGF, VEGFR2 또는 EGFR에 대한 치료 항체를 추가로 투여하는 것인 방법.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
SEQUENCE LISTING <110> HENLIX, INC. HENLIX BIOTECH CO., LTD. <120> ANTI-PD-1 ANTIBODIES <130> 000020.000004PCT-LF <140> PCT/US2017/050851 <141> 2017-09-09 <150> 62/519,590 <151> 2017-06-14 <150> 62/395,832 <151> 2016-09-16 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 cagctcgagg atattgtgat gacccagtct cacaaattca tgtccacatc agtaggagac 60 agggtcagca tcacctgcaa ggccagtcag gatgtgacta ctgctgtagc ctggtatcaa 120 caaaaaccag ggcaatctcc taaactactg atttactggg catccacccg gcacactgga 180 gtccctgatc gcttcacagg cagtggatct gggacagatt atactctcac catcaacagt 240 gtgcaggctg aagacctggc actttattac tgtcagcaac attacactat tccgtggacg 300 ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa cgtactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360 ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540 accctgacgc 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160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 3 <211> 1329 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 gaagtgatgt tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcatgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatggca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga gcctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtagtaa catctactat 180 ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgttc 240 ctgcaaatga gcggtctgag gtctgaggac acggccctgt attactgtgt atcgtattac 300 tatggaatag acttctgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcggc ctccaccaag 360 ggcccatcgg tcttcccgct agcaccctgc tccaggagca cctccgagag cacagccgcc 420 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cgaagaccta cacctgcaac 600 gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagtccaa atatggtccc 660 ccatgcccac catgcccagc acctgagttc ctggggggac catcagtctt cctgttcccc 720 ccaaaaccca aggacactct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 780 gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg 840 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 900 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 960 aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1020 gagccacagg tgtacaccct gcccccatcc caggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1080 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1140 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1200 ttcctctaca gcaggctaac cgtggacaag agcaggtggc aggaggggaa tgtcttctca 1260 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtct 1320 ctgggtaaa 1329 <210> 4 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 340 345 350 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 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cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 6 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Ile Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser 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actctactcc 540 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cgaagaccta cacctgcaac 600 gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagtccaa atatggtccc 660 ccatgcccac catgcccagc acctgagttc ctggggggac catcagtctt cctgttcccc 720 ccaaaaccca aggacactct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 780 gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg 840 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 900 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 960 aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1020 gagccacagg tgtacaccct gcccccatcc caggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1080 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1140 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1200 ttcctctaca gcaggctaac cgtggacaag agcaggtggc aggaggggaa tgtcttctca 1260 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtct 1320 ctgggtaaa 1329 <210> 8 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Lys Thr Tyr 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Gly Gly Gly Ser Asn Ile Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Val Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Phe 1 5 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Lys Ala Ser Thr Asp Val Thr Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Trp Ala Ser Leu Arg His Thr 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Gln Gln His Tyr Gly Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Phe Arg Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Ala Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Thr Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Phe 1 5 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Lys Ala Lys Gln Asp Val Thr Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Gln Gln His Tyr Trp Ile Pro Trp Thr 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Val Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Leu 1 5 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Asn Ala Val Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Ser Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ile Asp Leu 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 26 His His His His His His 1 5 <210> 27 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 27 Gln Leu Glu Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr 1 5 10 15 Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 20 25 30 Thr Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg 50 55 60 Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser 65 70 75 80 Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr 85 90 95 Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser 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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 355 360 365 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 370 375 380 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 385 390 <210> 33 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 34 <211> 389 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 115 120 125 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 145 150 155 160 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 165 170 175 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 180 185 190 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 195 200 205 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 210 215 220 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 225 230 235 240 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 245 250 255 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 260 265 270 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 275 280 285 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 290 295 300 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 305 310 315 320 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 325 330 335 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 340 345 350 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 355 360 365 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 370 375 380 Leu Ser Leu Gly Lys 385

Claims (21)

  1. (1) 아미노산 서열 KASQDVTTAVA(서열 번호 9)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASTRHT(서열 번호 10)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYTIPWT(서열 번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL) 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FTFSNYGMS(서열 번호 12)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNIY(서열 번호 13)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 VSYYYGIDF(서열 번호 14)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 (1) 아미노산 서열 KASTDVTTAVA(서열 번호 15)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASLRHT(서열 번호 16)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYGIPWT(서열 번호 17)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL) 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FRFSNYGMS(서열 번호 18)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNAY(서열 번호 19)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 TSYYYGIDF(서열 번호 20)를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 친화도 성숙 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 항-PD-1 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 (1) 아미노산 서열 KAKQDVTTAVA(서열 번호 21)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASTRHT(서열 번호 10)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYWIPWT(서열 번호 22)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL) 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FTFSNYGMS(서열 번호 12)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNIY(서열 번호 13)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 VSYYYGIDL(서열 번호 23)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 친화도 성숙 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 항-PD-1 항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체가 (1) 아미노산 서열 KASQDVTNAVA(서열 번호 24)를 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 WASTRHT(서열 번호 10)를 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 QQHYTIPWT(서열 번호 11)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL) 서열, 및 (1) 아미노산 서열 FTFSNYGMS(서열 번호 12)를 포함하는 CDR-H1; (2) 아미노산 서열 TISGGGSNIY(서열 번호 13)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 SSYYYGIDL(서열 번호 25)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 친화도 성숙 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 항-PD-1 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab)'2, 단일쇄 Fv(scFv), Fv 단편, 디아바디 및 선형 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 다중 특이적 항체인 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제에 접합된 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 표지에 접합된 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, 표지가 방사성 동위원소, 형광 염료 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  11. 제10항의 핵산 분자를 코딩하는 발현 벡터.
  12. 제11항의 발현 벡터를 포함하는 세포.
  13. 제12항의 세포를 배양하고 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 생산하는 방법.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 환자로부터의 샘플에 접촉시키고 PD-1 단백질에 결합된 항-PD-1 항체를 검출함으로써 상기 샘플에서 PD-1 단백질을 검출하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 면역 조직화학적 검정(IHC) 또는 ELISA 검정에 사용하는 것인 방법.
  17. 유효량의 제14항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 암이 흑색종, NSCLC, 두경부암, 요로상피암, 삼중 음성 유방암(TNBC), 위암, 전형적 호지킨 림프종(cHL), 비호지킨 림프종 원발성 종격동 B 세포 림프종(NHL PMBCL), 중피종, 난소암, 폐암, 식도암, 비인두 암종(NPC), 담도암, 결직장암, 유방암, 자궁경부암, 갑상선암 및 타액선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 대상체에게 항신생물제, 화학치료제, 성장 억제제 및 세포독성제로 이루어진 군으로부터 선택된 치료제를 추가로 투여하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 대상체에게 방사선 요법을 추가로 실시하는 것인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 대상체에게 VEGF, VEGFR2 또는 EGFR에 대한 치료 항체를 추가로 투여하는 것인 방법.
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