KR20190033962A

KR20190033962A - 미생물을 이용하여 단독유화가 가능한 복합발효유화제 제조 방법 및 그 조성물

Info

Publication number: KR20190033962A
Application number: KR1020170122755A
Authority: KR
Inventors: 김광년; 이재광; 박소영
Original assignee: 주식회사 유나이티드엑티브
Priority date: 2017-09-22
Filing date: 2017-09-22
Publication date: 2019-04-01
Anticipated expiration: 2037-09-22
Also published as: KR102283331B1

Abstract

본 발명에 따르면, Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P)에 의하여 생산되는 발효유화제를 제공함으로써, 주로 글리세로 글리코리피드(glycero glycolipid), 글리코리피드(glycolipid), 글리세로리피드(glyerolipid)가 포함되어있으며, 그외 다양한 대사산물이 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명은 복합발효유화제로써 수상과 유상에서 자기회합 에멀젼(self-aseembly emulsion) 형성능을 가지고 있고, 마이셀(micelle)의 표면이 조밀하게 결합되기 때문에 단독 유화가 가능하다. 또한, 천연 유화제로써 피부에 자극이 없으며, 제형 안전성이 높은 화장품 조성물 및 피부 외용제를 제공할 수 있다.

Description

미생물을 이용하여 단독유화가 가능한 복합발효유화제 제조 방법 및 그 조성물{FERMENTED EMULSIFIER USING MICROORGANISM AND PREPARATION THEREOF}

본 발명은 Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P) 미생물에 의해 생산되는 발효유화제 제조에 관한 것으로, 단독 유화가 가능하고, 자기 회합 에멀젼 형성능, 피부 안전성, 제형 안정성이 높은 천연 유화제이다. 또한, 이를 이용한 피부 외용제 또는 화장료 조성물 제조에 관한 것이다.

유화제는 서로 다른 두 액체의 계면에 흡착하여 계면장력을 저하시켜 두 상을 서로 잘 섞이게 한다. 구조적인 특징은 비극성 꼬리(non-polar)부분은 친유성을 가지는 알킬(alkyl)기, 극성 머리(polar)부분은 친수성을 갖는 물질로 구성되어 있다.

유화제는 합성유화제, 천연유화제가 있으며, 이 중 천연유화제의 일종으로 효모, 곰팡이, 세균 등 미생물에 의해 생산되는 미생물 유래 유화제가 있다. 미생물에 의해 생산되는 유화제는 양친매성을 띄는 물질로 화장품, 식품, 의약품, 세제 등의 다양한 산업에 이용될 수 있다. 미생물 유래 유화제는 기존의 화학 합성 유화제에 비하여 독성이 낮고, 극한 조건에 대해 안정성이 클 뿐만 아니라, 생분해가 가능하여 매우 환경 친화적이다.

미생물이 생산하는 유화제의 종류로는 크게 당지질(glycolipids), 인지질(phospholipid)과 지방산(fatty acids), 지단백질(lipopeptides and lipoproteins), 고분자 생물유화제(polymeric surfactants)로 나누어진다.

이러한 미생물이 생산하는 유화제 중에서 글리세로 글리코리피드(glycero glycolipids), 글리코리피드(glycolipids), 글리세로리피드(glycerolipids) 등을 포함한 복합발효유화제를 개발하고자 하였다.

글리세로 글리코리피드(glycero glycolipids)는 글리세라이드(glyceride)를 골격으로 한 당지질로 모노 갈락토실디아실글리세롤(mono galactosyl diglyceride), 디갈락토실디아실글리세롤(digalactosyl diglyceride)로 갈락토오스(galactose)와 1개 또는 2개의 지방산이 글리세롤로 이루어져 있다. 지방산은 주로 불포화 지방산으로 오메가 3가 주된 것이다. 이러한 형태의 당지질은 고등동물, 광합성 세균 등에 광범위하게 분포되어 있고, 식물이나 미생물의 당지질은 특이하게 가지고 있다. 이 화합물은 양친매성을 띄므로, 다양한 구조적 및 화학적 기능을 가지고 있다.

글리코리피드(glycolipids)는 탄수화물과 긴 사슬 지방산이나 수산 지방산의 조합으로 이루어져 있다. 그 중 미생물에 의해서 생산되는 글리코리피드의 대표적인 종류로는 트레할로스 리피드(trehalose lipid), 람노리피드(rhamnolipids), 소포로리피드(sophorolipids), 만노실에리스리톨 리피드(mannosylerythritol lipid) 등이 있다.

글리세로리피드(glycerolipids)는 지질대사과정에서 글리세롤(glycerol)의 인산화(phosphorylation)와 아실화(acylation)에 의해 합성되며, 모노아실글리세롤(monoacylglycerol), 디아실글리세롤(diacylglycerol), 트리아실글레세롤(triacylglycerol)로 이루어진다. 이 중 디아실글리세롤(diacylglycerol)은 모노글리세롤(monoglycerol)과 함께 주로 식품 유화제로 널리 이용되고 있다. 트리아실글리세롤(triacylglycerol)은 중성지방으로 체내 저장지방으로 축적된다.

이러한 미생물 유래 유화제는 여러 대사산물이 존재하기 때문에 합성 유화제에서 찾아 볼 수 없는 구조적 및 화학적인 새로운 조합으로 우수한 유화활성 및 다양한 잠재적 기능이 있을 수 있다. 그러나 이러한 장점에도, 산업적으로는 합성 유화제에 의존하고 있는 실정이다. 즉, 가장 근본적인 이유는 합성 유화제가 미생물 유래 유화제와 같은 천연 유화제에 비하여 가격이 저렴한 데 있다.

따라서, 본 발명은 미생물이 생산하는 여러가지 대사산물이 포함된 복합발효유화제를 개발하고, 대량 생산하여 산업적 이용가치를 높이고자 하였다.

본 발명은 상기의 문제점을 개선하고자 Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P) 미생물로부터 생산되는 천연 유화제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 대부분 글리세로 글리코리피드(glycero glycolipid), 글리세로리피드(glycerolipids), 글리코리피드(glycolipids) 등이 포함된 복합 발효유화제이며, 그 외 다양한 대사산물이 포함할 수 있는 발효유화제를 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은 단독유화가 가능하며, 자기 회합 에멀젼 형성능이 있는 천연유화제이며, 피부 안전성 및 제형 안정성을 가지는 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은

미생물에 의해 생산되는 발효유화제이되,

상기 미생물이 Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P)인 것인 미생물을 이용한 단독유화가 가능한 복합발효유화제를 제공한다.

일구현예에 따르면, 상기 발효유화제는 Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P)로부터 생산된 당지질계 대사산물이며, 상기 당지질계 대사산물은 글리세로 글리코리피드(glycero glycolipid)를 포함할 수 있다.

또한, 상기 당지질계 대사산물은 글리코리피드(glycolipid) 및 글리세로리피드(glycerolipids)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면,

Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P) 미생물을 배지에 배양시키는 1차 종균발효 단계;

상기 1차 종균발효물을 계대배양시키는 2차 종균발효 단계;

상기 2차 종균발효물 및 오일을 발효시키는 1차 본 발효 단계 및

상기 1차 본 발효물을 발효시키는 2차 본 발효 단계를 포함하는 것인, 미생물을 이용하여 단독유화가 가능한 복합발효유화제 제조 방법 및 그 조성물을 제공한다.

일구현예에 따르면, 상기 2차 본 발효 단계 후 발효물을 정치시켜 상층과 하층을 분리하여 하층을 폐기하고, MgSO₄를 첨가하여 교반 후 원심분리하여 미생물 및 수분이 제거된 발효물을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 1차 종균발효 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract), 말트 추출물(malt extract), 펩톤(peptone) 및 글루코스(glucose)를 포함할 수 있다.

또한, 상기 2차 종균발효 단계에서 사용하는 배지는 글리세린(glycerin)을 포함할 수 있다.

또한, 상기 1차 및 2차 본 발효 단계에서 사용하는 배지는 글리세린(glycerin), 글루탐산 나트륨(sodium glutamate), 구연산 나트륨(sodium citrate), 이스트 추출물(yeast extract), KH₂PO₄, MgCl₂, MnCl₂ 및 오일을 포함할 수 있다.

또한, 상기 1차 및 2차 종균발효 단계가 15 내지 30℃의 호기 조건에서 10 내지 30시간 발효시키는 것이고,

상기 1차 및 2차 본 발효 단계가 20 내지 40℃의 호기 조건에서 80 내지 150시간 발효시키는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 발효유화제를 포함하는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

기타 본 발명의 구현예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.

본 발명은 Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P) 미생물을 이용하여 글리세로 글리코리피드(glycero glycolipid) 외 2종이 포함된 발효 유화제를 생산함으로써 단독 유화가 가능한 천연 유화제를 제공할 수 있다.

또한, 천연 유화제를 제공함으로써 피부자극이 없고, 제형 안정성이 높은 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 실시예에 따른 발효유화제의 사진이다.
도 2는 실시예의 TLC 분석 결과 사진이다.
도 3은 시험 제제를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4는 시험 제제의 마이셀 모식도이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예를 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

이하, 본 발명의 구현예에 따른 미생물을 이용한 발효유화제 및 제조 방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에 따른 미생물을 이용한 발효유화제는 미생물에 의해 생산되는 것이며, 구체적으로는 Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P) 미생물에 의해 생산되는 당지질계 대사산물을 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 당지질계 대사산물은 글리세로 글리코리피드(glycero glycolipid)를 포함할 수 있다. 또한, 일구현예에 따르면, 상기 당지질계 대사산물은 글리코리피드(glycolipid) 및 글리세로리피드(glycerolipids)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

칸디다 봄비콜라(Candida bombicola)는 유화물질을 생성할 수 있는 미생물로, 계면활성제와 같은 첨가제의 사용이 없이도 오일에 대한 유화율 및 혼화율을 향상시키는 데에 중요한 역할을 함으로써, 피부 흡수력 및 제형 안정성 등을 향상시킬 수 있으므로, 친환경적이며 세포에 독성을 최소화할 수 있다.

본 발명에 따른 미생물을 이용한 발효유화제 제조방법은 1차 종균발효 단계, 2차 종균발효 단계, 1차 본 발효 단계 및 2차 본 발효 단계를 포함한다.

구체적으로, 본 발명은

상기 1차 종균발효물을 계대배양시키는 2차 종균발효 단계;

상기 1차 본 발효물을 발효시키는 2차 본 발효 단계를 포함하는 것인 미생물을 이용한 발효유화제 제조방법을 제공한다.

일구현예에 따르면, 상기 오일은 식물성 오일을 사용할 수 있으며, 구체적으로 예를 들어 쌀눈오일, 올리브오일, 코코넛오일, 팜오일, 포도 씨 오일, 피마자 오일, 호호바 오일, 동백 오일, 해바라기 씨 오일, 살구 씨 오일, 미강 오일, 쌀겨 오일, 마카다미아넛 오일, 홍화씨 오일, 달맞이꽃 종자 오일, 스윗 아몬드 오일, 아보카도 오일, 헤이즐넛 오일, 콩기름, 옥수수 오일, 채종유, 윗점 오일, 녹차 씨 오일, 시어버터, 코코아 버터 오일, 망고 버터, 쿠쿠이넛 오일, 보리지 오일, 캐롯 씨드 오일, 카렌듈라 오일, 대마 씨 오일, 로즈 힙 오일, 님 오일, 아르간 오일 등을 포함할 수 있으며, 예를 들어 하나 이상의 오일을 혼합하여 사용할 수도 있다.

일구현예에 따르면, 상기 2차 본 발효 단계 후 정제공정 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 수분 및 미생물의 제거를 위하여, 2차 본 발효 후 발효물을 정치시켜 상층에 위치하는 소수성 부분(발효물)과 하층에 위치하는 친수성 부분(배지 및 불순물)을 분리하여 하층을 폐기하고, MgSO₄를 첨가하여 교반한 후 원심분리기를 이용하여 잔존 불순물 및 미생물을 제거할 수 있다.

또한, 상기 2차 본 발효 후 발효물의 지방산 및 불순물의 정제를 위하여, 크로마토그라피(chromatography) 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 친화크로마토그라피 컬럼(affinity chromatography column)에 규산마그네슘(magnesium silicate)을 충진제로 사용하여 지방산 및 불순물 등을 흡착, 여과시킬 수 있다. 단, 발효물은 50~60℃까지 가온시켜 사용한다.

일구현예에 따르면, 상기 1차 종균발효는 이스트 추출물(yeast extract), 말트 추출물(malt extract), 펩톤(peptone), 글루코스(glucose) 및 우레아(urea)를 포함하는 배지에 Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P) 미생물을 접종하여 15 내지 30℃의 호기 조건에서 10 내지 30시간 동안 발효시키는 것일 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 2차 종균발효는 상기 1차 종균발효 배지조성에서 글루코스(glucose)를 글리세린(glycerin)으로 대체한 배양액을 사용하여 상기 1차 발효물을 15 내지 30℃의 호기 조건에서 10 내지 30시간 동안 발효시키는 것일 수 있다.

일구현예에 따르면, 본 발명의 본 발효 단계는 탄소원, 예를 들어 글리세린 등을 최소화하여 오일을 이용하는 대사산물 생성에 집중하도록 배지조건을 변경할 수 있다. 즉, 미생물이 탄소원 대신 식물성 오일을 탄소원으로 이용함으로써 유화성분의 생산율을 향상시키도록 유도할 수 있다.

구체적으로, 1차 본 발효는 글리세린(glycerin), 글루탐산 나트륨(sodium glutamate), 구연산 나트륨(sodium citrate), 이스트 추출물(yeast extract), KH₂PO₄, MgCl₂, MnCl₂및 오일을 포함하는 배양액을 사용하여 20 내지 40℃의 호기 조건에서 80 내지 150시간 동안 발효시키는 것일 수 있다.

또한, 2차 본 발효는 상기 1차 본 발효 배지 조성에서 오일의 함량을 5 내지 20배, 예를 들어 7 내지 15배 증가시킨 것을 제외하고 1차 본 발효 단계와 동일하게 진행할 수 있다.

본 발명에 따르면, 미생물에 의해 생산되는 대사산물을 이용하여 발효유화제를 생성함으로써 계면활성제, 유화제 등의 합성 첨가물이 없이도 용이하게 유화력, 흡수력, 제형 안정성 등을 개선시킬 수 있다. 또한, 세포에 독성을 최소화하여 인체에 무해한 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예

실시예 1: 발효유화제 제조

1차 종균발효

Candida bombicola UA-06 (KCTC18592P)균주를 배지 1L에 접종하여 25℃, 300rpm, 1NL/min(1vvm)의 호기적인 조건에서 24시간 동안 1차 종균발효를 진행하였다. 사용한 배지는 미생물의 균체성장 및 대사과정을 최적화하기 위하여 Yeast extract 3g/L, Malt extract 3g/L, Peptone 5g/L, Glucose 10g/L, Urea 1g/L, 증류수 978g/L 조성으로 하였다.

2차 종균발효

상기 1차 종균발효 배지 조성에서 Glucose 10g/L를 Glycerin 20g/L로 대체한 것을 제외하고 1차 종균발효 배지와 동일한 조성의 배양액 10L에 25℃, 300rpm, 10NL/min(1vvm)의 호기적인 조건으로 하여 24시간 동안 2차 종균발효를 진행하였다.

1차 본 발효

상기 2차 종균발효 배양액을 glycerin 30g/L, Sodium glutamate 5g/L, Sodium citrate 1g/L, Yeast extract 2g/L, KH₂PO₄ 7g/L, MgCl₂ 0.5g/L, MnCl₂ 0.2g/L, 증류수 904.3g/L, 쌀눈오일 50g/L 조성의 배양액 100L로 30℃, 300rpm, 100NL/min(1vvm)의 호기적인 조건에서 약 96시간 동안 1차 본 발효를 진행하였다.

2차 본 발효

상기 1차 종균발효 배양액을 glycerin 10g/L, Sodium glutamate 20g/L, Sodium citrate 5g/L, Yeast extract 2g/L, KH₂PO₄ 7g/L, MgCl₂ 0.5g/L, MnCl₂ 0.2g/L, 증류수 455.3g/L, 쌀눈오일 500g/L 조성의 배양액 100L로 25℃, 300rpm, 100NL/min(1vvm)의 호기적인 조건에서 약 120시간 동안 2차 본 발효를 진행하였다.

정제

수분 및 미생물 등을 제거하기 위하여, 상기 본 발효 후 발효물을 정치시켜 상층(발효물)과 하층(배지 및 불순물)으로 분리한 후, 하층을 모두 폐기하였고, 수분을 제거하기 위하여 MgSO₄ 20g/L를 첨가하여 교반하였다. 교반 2시간 후 연속형 원심분리기 장비를 이용하여 미생물 균체, MgSO₄, 상층에 잔존해 있던 불순물을 제거하였고, MgSO₄에 의해 수분을 제거하였다. 또한, 상기 수분이 제거된 발효물을 60~70℃까지 가온시켜 규산마그네슘(magnesium silicate)으로 충진한 친화크로마토그라피 컬럼(affinity chromatography column)에 사용하여 지방산 및 불순물 등을 흡착, 여과하여 최종적으로 발효유화제를 수득하였다.

수득한 실시예 1의 사진은 도 1에 나타내었다.

실시예 2: 외용 에센셜 토너 제조

하기 표 1의 조성에 따라 외용 에센셜 토너를 제조하였다. 구체적으로, 하기 표 1의 1번 원료에 2 내지 6번 원료를 순차적으로 투입하고, 교반하여 60℃로 가열 및 용해시켰다. 그리고 7 내지 9번 원료를 별도의 용기에 넣고, 60℃로 가열하여 용해시킨 후 상기 1 내지 6번 원료 반응 용기에 투입하여 교반하였다. 그 후 10번 원료를 투입 및 교반하고, 30℃까지 냉각시켰다.

구분	원료	중량 (%)
1	정제수	67.92
2	1% 카르복실비닐폴리머 수용액	0.05
3	글리세린	5.00
4	디프로필렌글라이콜	10.00
5	방부제	0.40
6	잔탄검	0.08
7	실시예 1	0.50
8	부틸렌 글라이콜	8.00
9	글리세린	8.00
10	트리에탄올아민	0.05
합계		100

실시예 3: 외용 마스크팩 에센스 제조

하기 표 2의 조성에 따라 외용 마스크팩 에센스를 제조하였다. 구체적으로, 하기 표 2의 1번 원료에 2 내지 5번 원료를 순차적으로 투입하고, 교반하여 60℃로 가열 및 용해시켰다. 그리고 6 및 7번 원료를 별도의 용기에 넣고, 60℃로 가열하여 용해시킨 후 상기 1 내지 5번 원료 반응 용기에 투입하여 교반하였다. 그 후 8 및 9번 원료를 투입 및 혼합하여 30℃까지 냉각시키고, 숙성시켰다.

구분	원료	중량 (%)
1	정제수	74.52
2	글리세린	5.00
3	디프로필렌글라이콜	10.00
4	잔탄검	0.08
5	방부제	0.30
6	실시예 1	0.10
7	부틸렌글라이콜	8.00
8	히알루로닉애씨드	1.00
9	베타인	1.00
합계		100

실시예 4: 외용 크림 제조

하기 표 3의 조성에 따라 외용 크림을 제조하였다. 구체적으로, 하기 표 3의 1번 원료에 2 내지 6번 원료를 순차적으로 투입하고, 교반하여 70℃로 가열 및 용해시켰다. 그리고 7 내지 9번 원료를 별도의 용기에 넣고, 70℃로 가열하여 용해시킨 후 상기 1 내지 6번 원료 반응 용기에 투입하여 유화시켰다. 그 후 10번 원료를 투입하여 균일하게 용해 및 혼합시키고 30℃까지 냉각시켰다.

구분	원료	중량 (%)
1	정제수	58.60
2	1% 카르복실비닐폴리머 수용액	0.20
3	글리세린	10.00
4	부틸렌글라이콜	8.00
5	방부제	0.40
6	잔탄검	0.10
7	실시예 1	20.00
8	세테아릴알코올	1.50
9	스테아릭애씨드	1.00
10	트리에탄올아민	0.20
합계		100

실험예

실험예 1: TLC (Thin Layer Chromatography) 성분분석

실리카겔 TLC플레이트(TLC Silica gel 60, Merck; 5cmx6.5cm)에 20% 발효유화제를 1 ul 점적하고 hexane, di-ethyl ether, acetic acid (7:3:0.1, v/v)를 포함한 이동상으로 약 10분간 전개하였다. 자연 건조된 플레이트에 클로로폼(chloroform), 메탄올(methanol), 아세톤(acetone) (12:0.5:0.2, v/v)을 포함하는 이동상으로 약 5분간 2차 전개하였다. 자연 건조된 플레이트에 에탄올과 혼합된 10% 황산을 분무하고 100℃에서 가열하여 스팟을 시각화하였다. 그 결과 8개의 스팟(A 내지 H)이 발색되었으며, 결과는 하기 도 2에 나타내었다.

실험예 2: 발효유화제 구성물질 분석

실험예 1의 TLC 실험을 통하여 각각의 스팟을 연필로 연하게 표시한 뒤 칼로 긁어내어 시료를 수득하였다. 수득한 시료는 메탄올에 용해시킨 후 종이필터를 이용하여 실리카와 시료를 분리하였다. 그리고 분리한 시료는 알칼리로 가수분해하여(비누화반응) 친수기와 소수기 부분을 분리하고 발효유화제 구조 내에서 정보를 얻고자 하였다. 친수기 부분은 당과 글리세롤을 분석하였고, 소수기 부분은 지질성분을 분석하였다.

당과 지질은 발색법으로 검출여부를 확인하였고, 글리세롤은 비색법으로 확인하였다. 당의 검출여부는 비알시약(orcinol ferric chloride)으로 양성반응, 안트론(anthrone)으로 음성반응을 판단하였으며, 지질은 로다민6G을 사용하여 양성반응으로 대사산물 구성성분을 확인하였다.

더욱 상세하게, 글리세롤 측정은 비누화 반응에 의해 분해된 글리세롤을 sodium periodate와 반응하여 포름알데히드를 생성하는데, 이때 포름알데히드는 아세틸 아세톤과 반응하여 3,5-diacetyl-1,4-dihydrolutidine이라는 황색물질을 형성한다. 이때 생성되는 화합물의 양은 시료 내 글리세롤의 양에 비례하므로 이를 410nm에서 측정하였다.

각각의 시료에 대한 글리세롤의 함량과 당, 지질 검출 여부는 하기 표 4에 나타내었다. 그 결과, A, B, G 시료는 글리세롤과 지질을 포함한 글리세로리피드(glycerolipids) 물질임을 확인하였고, C, E, F 시료는 글리세롤과 당, 지질이 포함된 글리세로 글리코리피드(glycero glycolipids) 물질임을 확인하였다. 또한, D 시료는 당과 지질이 포함된 글리코리피드(glycolipids) 물질임을 확인하였다. 그 외 H 시료는 극성이 가장 낮은 물질로 확인되어 잔존하는 트리글리세롤(triglycerol)임을 확인하였다.

구분	Glycerol		당	지질
구분	농도(mg/kg)	AU(410nm)	반응결과	반응결과
A	14.7	0.12	-	+
B	211.9	0.830	-	+
C	135	0.540	+	+
D	-	-	-	+
E	50	0.258	+	+
F	234.7	0.912	+	+
G	103.6	0.440	-	+
H	-	-	-	+

실험예 3: 자기회합에멀젼(self-assembly emulsion)형성능

실시예 1에 따른 발효유화제에 대한 유화력을 측정하기 위하여 하기 표 5와 같은 조성의 시험 제제를 제조하였다. 하기 표 5의 1번 원료에 2번 원료를 투입 및 교반하여 70℃로 가열하였다. 그리고 3 및 4번 원료를 별도 용기에 넣고, 70℃로 가열하여 용해시킨 후 상기 1 내지 2번 원료 반응 용기에 투입하여 호모믹서로 3500rpm에서 5분간 유화시켰다. 그 후 30℃까지 냉각하여 현미경으로 유화활성을 관찰하였다. 그 결과는 하기 도 3에 나타내었고, 유화액 내 마이셀 형성 모식도를 도 4에 나타내었다.

표 5의 시험 제제에 대한 유화활성을 현미경으로 100배와 400배로 관찰한 결과 마이셀 입자의 밀도가 높으며, 마이셀이 균일하게 잘 형성되어 표면장력을 저하시키는 것을 관찰할 수 있었다. 일반적으로 유화액의 안정성 평가는 유화액 내 마이셀 입자크기 및 밀도에 의해 결정되며, 마이셀의 크기가 커질수록 침전 속도가 빨라져 유화 안정도가 떨어지게 된다. 따라서, 본 발명은 자기회합에멀젼(self-assembly emulsion)성질을 갖는 유화제로써 단독 유화제가 가능함을 나타내었다.

번호	원료	중량 (%)
1	정제수	81.00
2	부틸렌글라이콜	10.00
3	스쿠알란	3.00
4	실시예 1	6.00
합계		100

실험예 4: 안정성 평가

실시예 4에 따른 시험 제제에 대한 제형 안정성 평가를 하기 위하여, 가혹조건 1개월, 일반조건 6개월 동안 물성변화를 관찰하였다.

가혹조건에서의 평가 결과는 표 6에, 일반조건에서의 평가 결과는 표 7에 나타내었다. 그 결과 실시예 4(크림제형)는 가혹조건인 저온(-5℃), 순환형(-5℃~40℃/12hr), 고온(50℃)에서 제조 당일과 1개월동안 보관했을 때의 pH, 색상, 점도, 분리도, 취에 대한 변화는 없었으며, 일반 조건인 25℃, 상온(15℃~25℃)에서의 제조당일과 1개월, 6개월동안 보관했을 때의 pH, 색상, 점도, 분리도, 취에 대한 변화는 없는 것으로 나타내었다. 따라서, 본 발명은 화장품 제형에 대한 안정성이 우수한 것을 나타내었으며, 이로써 미생물 유래 복합 발효 유화제로써 화장품 조성물로 사용하기에 용이할 수 있다.

구분	-5℃		순환 (-5℃~40℃/12hr)		50℃
구분	1일	1개월	1일	1개월	1일	1개월
pH (25℃)	6.34	6.42	6.34	6.53	6.34	6.53
색	엷은 노란	엷은 노란	엷은 노란	엷은 노란	엷은 노란	엷은 노란
점도(25℃)	40,190	43,790	40,190	43,720	40,190	39,290
분리도	없음	없음	없음	없음	없음	없음
입자크기변화	없음	없음	없음	없음	없음	없음
특이취	특이취	특이취	특이취	특이취	특이취	특이취

구분	25℃			상온(15~25℃)
구분	1일	3개월	6개월	1일	3개월	6개월
pH (25℃)	6.34	6.42	6.43	6.34	6.46	6.52
색	엷은 노란	엷은 노란	엷은 노란	엷은 노란	엷은 노란	엷은 노란
점도(25℃)	40,190	42,290	42,890	40,290	41,290	42,810
분리도	없음	없음	없음	없음	없음	없음
입자크기변화	없음	없음	없음	없음	없음	없음
특이취	특이취	특이취	특이취	특이취	특이취	특이취

표 6 및 7에 나타난 바와 같이, 보관조건 및 시간에 따라 pH, 색상, 점도, 분리도, 취 등의 변화가 없는 것으로 보아 본 발명에 따른 유화제가 안정도를 유지함을 확인하였다.

실험예 5: 피부자극 시험

본 발명에 따른 실시예 1의 피부 자극 여부를 평가하고자 피부 일차 자극평가를 실시하였다. 평가 기관은 (주)대한피부과학연구소로 의뢰하여 진행하였다. 피험자 31명을 선정하여 등 부위에 24시간 첩포한 후 첩포 제거 30분, 24시간, 48시간에 각각 일차 피부자극 유무를 피부과 전문의가 판정하였다. 피부 반응 판정은 국제접촉피부염학회(ICDRG)기준 및 미국화장품협회(PCPC)의 기준에 의거하였으며, 그 결과는 표 8에 나타내었다.

표 8에 나타난 바와 같이, 각 피험자들의 피부반응 점수를 이용하여 자극 지수를 산출한 결과 0.011점으로 본 발명의 실시예 1에 따른 발효유화제를 무자극 물질로 판단하였다.

상기 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따르면, 미생물의 발효에 있어서 탄소원을 최소화하는 대신 오일을 이용함으로써 대사산물의 생산을 향상시켜 유화성분의 생산율을 최대화할 수 있음을 확인할 수 있다. 또한, 피부에 대한 자극을 최소화하면서 제제에 안정성을 부여할 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 또한, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

미생물에 의해 생산되는 발효유화제이되,
상기 미생물이 Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P)인 것인, 미생물을 이용하여 단독유화가 가능한 복합발효유화제.
제1항에 있어서,
상기 발효유화제가 Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P)로부터 생산된 당지질계 대사산물이며, 상기 당지질계 대사산물이 글리세로 글리코리피드(glycero glycolipid)를 포함하는 것인, 복합발효유화제.
제2항에 있어서,
상기 당지질계 대사산물이 글리코리피드(glycolipid) 및 글리세로리피드(glycerolipids)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것인, 복합발효유화제.
Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P) 미생물을 배지에 배양시키는 1차 종균발효 단계;
상기 1차 종균발효물을 계대배양시키는 2차 종균발효 단계;
상기 2차 종균발효물 및 오일을 발효시키는 1차 본 발효 단계 및
상기 1차 본 발효물을 발효시키는 2차 본 발효 단계를 포함하는 것인, 미생물을 이용하여 단독유화가 가능한 복합발효유화제 제조 방법.
제4항에 있어서,
상기 2차 본 발효 단계 후 발효물을 정치시켜 상층과 하층을 분리하여 하층을 폐기하고, MgSO₄를 첨가하여 교반 후 원심분리하여 미생물 및 수분이 제거된 발효물을 회수하는 단계를 더 포함하는 것인, 복합발효유화제 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 1차 종균발효 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물(yeast extract), 말트 추출물(malt extract), 펩톤(peptone), 글루코스(glucose) 및 우레아(urea)를 포함하는 것인, 복합발효유화제 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 2차 종균발효 단계에서 사용하는 배지가 글리세린(glycerin)을 포함하는 것인, 복합발효유화제 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 1차 및 2차 본 발효 단계에서 사용하는 배지가 글리세린(glycerin), 글루탐산 나트륨(sodium glutamate), 구연산 나트륨(sodium citrate), 이스트 추출물(yeast extract), KH₂PO₄, MgCl₂, MnCl₂및 오일을 포함하는 것인, 복합발효유화제 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 1차 및 2차 종균발효 단계가 15 내지 30℃의 호기 조건에서 10 내지 30시간 발효시키는 것이고,
상기 1차 및 2차 본 발효 단계가 20 내지 40℃의 호기 조건에서 80 내지 150시간 발효시키는 것인, 복합발효유화제 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 복합발효유화제를 함유하는 화장료 조성물.